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特許6644433眼疾患治療用及び予防用徐放性医薬組成物

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6644433

(24)【登録日】2020年1月10日

(45)【発行日】2020年2月12日

(54)【発明の名称】眼疾患治療用及び予防用徐放性医薬組成物

(51)【国際特許分類】

C07J 63/00 20060101AFI20200130BHJP

C12N 15/53 20060101ALI20200130BHJP

C12N 9/02 20060101ALI20200130BHJP

C12N 1/21 20060101ALI20200130BHJP

C12P 33/06 20060101ALI20200130BHJP

A61K 31/277 20060101ALI20200130BHJP

A61P 1/16 20060101ALI20200130BHJP

A61P 9/00 20060101ALI20200130BHJP

A61P 11/00 20060101ALI20200130BHJP

A61P 11/06 20060101ALI20200130BHJP

A61P 13/02 20060101ALI20200130BHJP

A61P 13/12 20060101ALI20200130BHJP

A61P 21/00 20060101ALI20200130BHJP

A61P 25/00 20060101ALI20200130BHJP

A61P 25/14 20060101ALI20200130BHJP

A61P 25/16 20060101ALI20200130BHJP

A61P 25/28 20060101ALI20200130BHJP

A61P 27/02 20060101ALI20200130BHJP

A61P 27/06 20060101ALI20200130BHJP

A61P 27/12 20060101ALI20200130BHJP

C07J 71/00 20060101ALI20200130BHJP

C07J 75/00 20060101ALI20200130BHJP

A61P 9/10 20060101ALI20200130BHJP

A61P 43/00 20060101ALI20200130BHJP

【ＦＩ】

C07J63/00CSP

C12N15/53ZNA

C12N9/02

C12N1/21

C12P33/06 A

A61K31/277

A61P1/16

A61P9/00

A61P11/00

A61P11/06

A61P13/02 105

A61P13/12

A61P21/00

A61P25/00

A61P25/14

A61P25/16

A61P25/28

A61P27/02

A61P27/06

A61P27/12

C07J71/00

C07J75/00

A61P9/10

A61P43/00 105

【請求項の数】18

【全頁数】61

(21)【出願番号】特願2016-547465(P2016-547465)

(86)(22)【出願日】2015年9月9日

(86)【国際出願番号】JP2015075535

(87)【国際公開番号】WO2016039359

(87)【国際公開日】20160317

【審査請求日】2018年6月27日

(31)【優先権主張番号】特願2014-183854(P2014-183854)

(32)【優先日】2014年9月10日

(33)【優先権主張国】JP

【微生物の受託番号】NPMD NITE BP-01914

【微生物の受託番号】NPMD NITE BP-01915

【微生物の受託番号】NPMD NITE BP-01916

【微生物の受託番号】NPMD NITE BP-1486

(73)【特許権者】

【識別番号】307010166

【氏名又は名称】第一三共株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100146581

【弁理士】

【氏名又は名称】石橋公樹

(74)【代理人】

【識別番号】100113583

【弁理士】

【氏名又は名称】北野範子

(74)【代理人】

【識別番号】100161160

【弁理士】

【氏名又は名称】竹元利泰

(74)【代理人】

【識別番号】100119622

【弁理士】

【氏名又は名称】金原玲子

(72)【発明者】

【氏名】粕谷裕司

(72)【発明者】

【氏名】中神康裕

(72)【発明者】

【氏名】波田野恵美子

(72)【発明者】

【氏名】井上達也

(72)【発明者】

【氏名】吉田和弘

(72)【発明者】

【氏名】小森谷聡

(72)【発明者】

【氏名】村上曜子

(72)【発明者】

【氏名】岩崎優

(72)【発明者】

【氏名】坂本篤信

(72)【発明者】

【氏名】増田華代子

(72)【発明者】

【氏名】南雅子

(72)【発明者】

【氏名】飯塚真由美

(72)【発明者】

【氏名】小野泰典

(72)【発明者】

【氏名】大貫貴史

【審査官】金田康平

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１３／１８８８１８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Database GenBank [online], Accession No.AEN88225,，<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AEN88225>, 2014.01.31, [retrieved on 2015 Nov. 12], LIU L., DEF

【文献】 Database GenBank [online], Accession No.ADE70895，<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/ADE70895>, 2014.01.30, [retrieved on 2015 Nov. 12], EPPINGER M.

【文献】 Liming LIU，Complete Genome Sequence of the Industrial Strain Bacillus megaterium WSH-002，Journal of Bacteriology，２０１１年，Vol.193, No.22，Pages 6389-6390，ISSN 0021-8847

【文献】 Patric CHUA，Draft Genome Sequences of Two Cellulolytic Paenibacillus sp. Strains, MAEPY1 and MAEPY2, from Malays，Genome Announcements，２０１４年２月，Vol.2, Issue 1, e00065-14，Pages 1-2，ISSN 2169-8287

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｐ１／００−４１／００

Ｃ０７Ｊ１／００−７５／００

Ｃ１２Ｎ１５／００−１５／９０

Ｃ０７Ｋ１／００−１９／００

Ｃ１２Ｎ１／００− １／３８

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記式（Ｉ）：

【化1】

で表されるテルペノイド誘導体。

【請求項2】

下記式（１）：

【化2】

で表される化合物を基質とし、このものを請求項１に記載の化合物に変換しうるケトミウム属に属する変換菌と共に培地中で培養し、その培養物より請求項１に記載の化合物を採取することを特徴とする、請求項１に記載の化合物の製造方法。

【請求項3】

変換菌がケトミウム属に属するケトミウム・グロボーサム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍｇｌｏｂｏｓｕｍ）ＳＡＮＫ１０３１２株(受託番号ＮＩＴＥＢＰ−１４８６)である、請求項２に記載の化合物の製造方法。

【請求項4】

変換菌がケトミウム属に属するケトミウム・エスピー（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍｓｐ．）ＳＡＮＫ１１８６７株（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−０１９１６）である、請求項２に記載の化合物の製造方法。

【請求項5】

上記式（１）で表される化合物を基質とし、このものを下記式（ＩＩＩ）：

【化3】

で表されるテルペノイド誘導体に変換しうるケトミウム属に属するケトミウム・エスピー（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍｓｐ．）ＳＡＮＫ１１８６７株（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−０１９１６）と共に培地中で培養し、その培養物より式（ＩＩＩ）で表されるテルペノイド誘導体を採取することを特徴とする式（ＩＩＩ）で表されるテルペノイド誘導体の製造方法。

【請求項6】

上記式（１）の化合物から、有機過酸化物によるエポキシ化反応により、下記式（２）：

【化4】

で表される化合物を製造し、
次いで、式（２）で表される化合物を基質とし、このものを上記式（ＩＩＩ）で表されるテルペノイド誘導体に変換しうる変換菌と共に培地中で培養し、その培養物より上記式（ＩＩＩ）で表されるテルペノイド誘導体を採取することを特徴とし、当該変換菌が、バチルス属に属するバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ.）ＳＡＮＫ７０２１４株（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−０１９１４）又はバチルス属に属するバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＳＡＮＫ７０３１４株（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−０１９１５）である、上記式（ＩＩＩ）で表されるテルペノイド誘導体の製造方法。

【請求項7】

上記式（１）の化合物から、有機過酸化物によるエポキシ化反応により、下記式（２）：

【化5】

で表される化合物を製造し、
次いで、式（２）で表される化合物を基質とし、このものを上記式（ＩＩＩ）で表されるテルペノイド誘導体に変換しうる変換菌と共に培地中で培養し、その培養物より上記式（ＩＩＩ）で表されるテルペノイド誘導体を採取することを特徴とし、当該変換菌が、宿主に（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入することにより得られる形質転換体である、上記式（ＩＩＩ）で表されるテルペノイド誘導体の製造方法；
（ａ）配列番号５のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のタンパク質のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｄ）（ａ）又は（ｂ）のタンパク質のアミノ酸配列と９０％以上配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｅ）（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質。

【請求項8】

宿主が大腸菌又はバクテリアである、請求項７に記載の製造方法。

【請求項9】

バクテリアがバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、請求項８に記載の製造方法。

【請求項10】

下記（ｆ）〜（ｊ）の何れかに記載の塩基配列を有し、上記式（２）で表される基質化合物の水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｆ）配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｇ）配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｈ）（ｆ）の塩基配列からなるＤＮＡにおいて定義されたいずれかの塩基配列の相補配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
（ｉ）（ｆ）の塩基配列からなるＤＮＡにおいて定義されたいずれかの塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｊ）遺伝暗号の縮重のため、（ｆ）または（ｇ）の塩基配列からなるＤＮＡにおいて定義された塩基配列の相補配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしないが、（ｆ）項から（ｈ）項で定義された塩基配列と同じアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ。

【請求項11】

下記（ｋ）〜（ｎ）の何れかのアミノ酸配列を有し、上記式（２）で表される基質化合物の水酸化酵素活性を有するタンパク質、
（ｋ）配列番号５に記載のアミノ酸配列、
（ｌ）配列番号６に記載のアミノ酸配列、
（ｍ）（ｋ）または（ｌ）のアミノ酸配列において定義されたアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列、
（ｎ）（ｋ）のアミノ酸配列において定義されたアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。

【請求項12】

請求項１０に記載の塩基配列を担持する自立複製性または組み込み複製性の組み換えプラスミド。

【請求項13】

請求項１２に記載の組み換えプラスミドで宿主を形質転換した形質転換体。

【請求項14】

請求項１２に記載の組み換えプラスミドをバチルス・サチルスに形質転換した形質転換体バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＡＮＫ７０２１４Ｔ株。

【請求項15】

請求項１２に記載の組み換えプラスミドをバチルス・サチルスに形質転換した形質転換体バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＡＮＫ７０３１４Ｔ株。

【請求項16】

バチルス属に属するバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）ＳＡＮＫ７０２１４株（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−０１９１４）。

【請求項17】

バチルス属に属するバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＳＡＮＫ７０３１４株（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−０１９１５）。

【請求項18】

請求項１に記載されたテルペノイド誘導体を有効成分として含有する、
眼疾患（当該眼疾患は、アレルギー性結膜疾患、ウィルス性結膜炎、翼状片、角膜感染症、ドライアイ、角膜障害（角膜上皮障害、及び／又は、角膜内皮障害である）、ぶどう膜炎、ベーチェット病、糖尿病網膜症、網膜剥離、網膜静脈閉塞、中心性漿液性脈絡網膜症、加齢黄斑変性、糖尿病黄斑浮腫、黄斑疾患、網膜色素変性、緑内障、若しくは、白内障である）、
腎疾患（当該腎疾患は、急性腎炎、慢性腎炎、急性腎不全、慢性腎不全、ネフローゼ症候群、ＩｇＡ腎症、糖尿病腎症、痛風腎、腎硬化症、水腎症、尿細管間質性腎炎、冠動脈バイパス手術後の腎機能低下、若しくは、腎尿路感染症である）、
呼吸器疾患（当該呼吸器疾患は、気管支炎、肺炎、胸膜炎、慢性閉塞性肺疾患、急性肺障害（ａｃｕｔｅｌｕｎｇｉｎｊｕｒｙ：ＡＬＩ）、びまん性汎細気管支炎、肺気、若しくは、喘息である）、
肝疾患（当該肝疾患は、アルコール性脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝線維症、肝硬変、若しくは、肝移植に伴う肝機能障害である）、
脳疾患（当該脳疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症(ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃｌａｔｅｒａｌｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＡＬＳ）、脳梗塞、若しくは、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）である）、又は
心臓疾患（当該心臓疾患は、心筋梗塞である）
の予防用または治療用医薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２／ＡＲＥシグナル伝達経路の活性化能を有し、抗炎症作用、細胞保護作用に優れるテルペノイド誘導体を有効成分として含有し、酸化ストレスに起因する眼疾患の治療および予防に顕著な効果を示す医薬組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

エネルギー代謝の過程で生成する活性酸素種などが感知されると、抗酸化酵素群や解毒代謝酵素群など生体防御のシステムが発動する。Ｋｅａｐ１/Ｎｒｆ２/ＡＲＥシグナル伝達経路は、この生体防御のシステムの発動を制御している。

【0003】

Ｋｅａｐ１/Ｎｒｆ２/ＡＲＥシグナル伝達経路を活性化すると、その標的遺伝子であるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：ｑｕｉｎｏｎｅｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ-１（ＮＱＯ１）、ｈｅｍｅｏｘｙｇｅｎａｓｅ-１（ＨＯ−１）、γ-ｇｌｕｔａｍａｔｅｃｙｓｔｅｉｎｅｌｉｇａｓｅｃａｔａｌｙｔｉｃｓｕｂｕｎｉｔ（ＧＣＬＣ）等が誘導されることが知られている（非特許文献１）。ＮＱＯ１は異物代謝系第２相の酵素であり、解毒作用に重要である。ＨＯ−１およびＧＣＬＣは典型的な抗酸化酵素として知られている。これらの酵素量が増加あるいは活性化されると、細胞は毒物、酸化ストレス、炎症等に対して耐性となるため、このシグナル伝達経路を活性化する化合物は様々な疾患に対する治療薬になると考えられている（非特許文献２−５）。対象となる具体的な疾患の例は、以下に示す通りである。

【0004】

Ｎｒｆ２欠損マウスは、網膜虚血再灌流系で脆弱性を示すことが報告されている（非特許文献６）。そのため、眼疾患として、アレルギー性結膜疾患、ウィルス性結膜炎、翼状片、角膜感染症、角膜内皮障害、白内障、ぶどう膜炎、ベーチェット病、糖尿病網膜症、網膜剥離、網膜静脈閉塞、中心性漿液性脈絡網膜症、加齢黄斑変性、糖尿病黄斑浮腫、黄斑疾患、網膜色素変性、緑内障、白内障などへの適応が示唆されている（非特許文献７、８）。

【0005】

Ｎｒｆ２欠損マウスは、シスプラチン誘発腎毒性に脆弱性を示すことが報告されている（非特許文献９）。そのため、腎疾患として、急性腎炎、慢性腎炎、急性腎不全、慢性腎不全、ネフローゼ症候群、ＩｇＡ腎症、糖尿病腎症、痛風腎、腎硬化症、水腎症、尿細管間質性腎炎、腎尿路感染症などへの適応が示唆されている（非特許文献１０）。

【0006】

Ｎｒｆ２欠損マウスは、タバコ煙曝露に対して脆弱性を示すことが報告されている（非特許文献１１）。そのため、呼吸器疾患として、気管支炎、肺炎、胸膜炎、慢性閉塞性肺疾患、びまん性汎細気管支炎、肺気腫、喘息などへの適応が示唆されている。（非特許文献１２、１３）。

【0007】

Ｎｒｆ２欠損マウスは、メチオニン・コリン欠乏食給餌で非アルコール性脂肪性肝炎になりやすいことが報告されている（非特許文献１４）。そのため、肝疾患として、アルコール性脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝線維症、肝硬変などへの適応が示唆される（非特許文献２、１５）。

【0008】

また、Ｎｒｆ２活性化剤は、マウスで血糖低下作用を示すことが報告されており（非特許文献１６）、そのため、糖尿病およびその合併症（糖尿病網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害）などへの適応が示唆される。

【0009】

Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２／ＡＲＥシグナル伝達経路を活性化する物質として、ブロッコリースプラウトに含まれるスルフォラフェンやカレーのターメリックに含まれるクルクミンなどが、Ｎｒｆ２を活性化し、発ガン物質の解毒化を促進することが報告されている(非特許文献１７)。また、Ｈｏｎｄａらによって発見されたメチル２−シアノ−３,１２−ジオキソオレアン−１,９(１１)−ジエン−２８−酸を含む５員環のトリテルペノイド（非特許文献１８及び特許文献１−１０）は、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２／ＡＲＥシグナル伝達経路を活性化することが報告されており、それらの化合物では数種の抗炎症性タンパク質および抗酸化タンパク質（たとえばＮＱＯ１、ＨＯ−１、ＧＣＬＣ）の産生をもたらすことが報告されている(特許文献９)。

【0010】

一方、上記のような抗酸化作用を有する化合物の後部眼疾患における薬理効果を最大限引き出すとともに、患者への投与の負荷を軽減することを目的として、各種の基材を用い、ナノ粒子、マイクロスフェア、ロッドなど種々の形態の医薬組成物が考案されている。また、イオントフォレーシス、マイクロニードル等、など多様なＤＤＳ技術を活用した研究がなされている(非特許文献１９)。これは眼疾患領域において、薬物の患部移行性、滞留性・持続性の付与、ならびに有効性を得るための特殊な投与方法に対するニーズが極めて高いことを示している。素材としては、金属、非分解性プラスチック、生分解性プラスチック、形態としては、マイクロスフェア、ロッドなど種々の形態が考えられている。ポリ乳酸や乳酸グリコール酸共重合体は、優れた生体適合性および生分解性を有する基材である(非特許文献２０)。この基材を成分とする医薬品がいくつか存在することから、実用性が確立された基材であることが明らかである。また、インプラントとして、マイクロスフェアやロッドの形態は、硝子体内投与に適した形状である。

【0011】

しかしながら、このように後部眼疾患を予防、治療するための有効成分（薬物）および多様なＤＤＳ技術は考案されているものの、当該ＤＤＳ技術に適合する特性を有する薬物が見出されるのは極めて稀である。薬物とＤＤＳ技術の組み合わせとして、医薬品として上市された例はわずか数品目に限られ、眼疾患領域ではデキサメタゾンの埋め込み注射剤が存在するのみである。この困難な要因は種々あるが、多くの場合、１回の投与で持続が必要な期間、必要とされる十分な量の薬物を封入することが容易ではないという、投与量の不足に起因すると推測される。

【0012】

そこで、後部眼疾患に対する優れた予防および治療効果を有する化合物と、その化合物を有効成分として含有し、医療現場で受け入れられる長い投与間隔での予防および治療効果を発揮しうる、後部眼疾患のための医薬組成物の開発が望まれている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0013】

【特許文献1】ＷＯ９９／６５４７８

【特許文献2】ＷＯ２０１２／１２５４８８

【特許文献3】ＷＯ２０１１／１３０３０２

【特許文献4】ＷＯ２００９／１４６２１６

【特許文献5】ＷＯ２００９／１２９５４６

【特許文献6】ＷＯ２００９／１２９５４８

【特許文献7】ＷＯ２００９／０２３２３２

【特許文献8】ＷＯ２００４／０６４７２３

【特許文献9】ＷＯ２００９／０８９５４５

【特許文献10】ＷＯ２０１３／１８８８１８

【非特許文献】

【0014】

【非特許文献1】Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2012; 44: 1315−1320

【非特許文献2】Clin.Pharmacol.Ther.2012; 92: 340−348

【非特許文献3】Adv.Pharmacol.2012; 63: 43−79

【非特許文献4】Med.Res.Rev.2012; 32: 687−726

【非特許文献5】Mol.Aspects.Med.2011; 32: 234−246

【非特許文献6】Free Radic Biol.Med.2011; 51: 216−224

【非特許文献7】Front Biosci.（Elite Ed.）2012; 4: 141−115

【非特許文献8】Curr.Med.Chem.2011; 18: 931−942

【非特許文献9】J.Pharmacol.Exp.Ther. 2010; 335: 2−12

【非特許文献10】Int. J. Nephrol.2012; 321714

【非特許文献11】Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2009; 106: 250−255

【非特許文献12】Trends Mol. Med. 2011; 17: 363−371

【非特許文献13】Toxicol.Appl.Pharmacol.2010; 244: 43−56

【非特許文献14】Free Radic Biol.Med.2010; 48: 357−371

【非特許文献15】Ｊ.Nutr.Biochem.2012; 23: 1201−1206

【非特許文献16】Ｊ.Biol.Chem.2010; 285: 40581−40592

【非特許文献17】生化学２００９; ８１: ４４７−９

【非特許文献18】Bioorg. Med. Chem.Lett.，1998:8: 2711−2714

【非特許文献19】Drug Discovery Today 2011:16:1−8

【非特許文献20】Advanced Drug Dlivery Reviews 2013;65:104−120

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0015】

発明者らは、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２／ＡＲＥシグナル伝達経路を活性化し、後部眼疾患を予防および治療のために有用な化合物と、該化合物を有効成分とする医薬組成物について鋭意研究を行なった結果、特定のテルペノイド誘導体が、優れた抗炎症作用、細胞保護作用を有することを見出し、かつ、該化合物を有効成分として含有する特定の医薬組成物が医療現場で受け入れられる長い投与間隔での予防および治療効果を発揮しうることを見出し、本発明を完成した。

【課題を解決するための手段】

【0016】

すなわち、本発明は、
（１）下記式（Ｉ）：

【0017】

【化1】

【0018】

で表されるテルペノイド誘導体。

【0019】

（２）下記の物理化学的性状を有するテルペノイド誘導体：

１）物質の性状：無色粉末状物質２）分子式：Ｃ_３２Ｈ_４３ＮＯ_５
３）分子量：５２１（ＥＳＩマススペクトル法により測定）
４）高分解能ＬＣ−ＥＳＩマススペクトル法により測定した精密質量、［Ｍ＋Ｈ］^＋は次に示す通りである。
実測値：５２２．３２０６２
計算値：５２２．３２１４０
５）^１Ｈ−核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中でＴＭＳのシグナルを０．００ｐｐｍとして測定した^１Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、以下に示す通りである。
σ：０．９８（３Ｈ，ｓ），０．９９（３Ｈ，ｓ），１．００（３Ｈ，ｓ），１．１７（３Ｈ，ｓ），１．１８−１．２２（１Ｈ，ｍ），１．２５（３Ｈ，ｓ），１．２８−１．３０（１Ｈ，ｍ），１．３３（３Ｈ，ｓ），１．４９（３Ｈ，ｓ），１．５１−１．５５（１Ｈ，ｍ），１．６２−１．６６（１Ｈ，ｍ），１．６８−１．７１（１Ｈ，ｍ），１．６９−１．７２（１Ｈ，ｍ），１．７０−１．８０（２Ｈ，ｍ），１．７７−１．７９（１Ｈ，ｍ），１．７６−１．８２（２Ｈ，ｍ），１．８５−１．８９（２Ｈ，ｍ），２．９６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），３．０４（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，４．０Ｈｚ，１４．０Ｈｚ），３．４９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１１．５Ｈｚ），３．７１（３Ｈ，ｓ），５．９７（１Ｈ，ｓ），８．０３（１Ｈ，ｓ）ｐｐｍ
６）^１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中でＴＭＳのシグナルを０．００ｐｐｍとして測定した^１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、以下に示す通りである。
σ：１６．４（ｑ），１８．２（ｔ），２１．４（ｑ），２１．５（ｑ），２３．９（ｔ），２４．６（ｑ），２６．６（ｑ），２７．０（ｑ），２８．１（ｔ），２９．１（ｑ），３１．１（ｄ），３１．６（ｔ），３５．８（ｔ），３５．９（ｓ），４０．１（ｔ），４２．０（ｓ），４２．５（ｓ），４５．０（ｓ），４５．７（ｓ），４７．７（ｄ），４８．９（ｓ），４９．０（ｄ），５２．１（ｑ），７３．７（ｄ），１１４．３（ｓ），１１４．６（ｓ），１２４．０（ｄ），１６５．５（ｄ），１６８．５（ｓ），１７６．６（ｓ），１９６．５（ｓ），１９８．７（ｓ）ｐｐｍ
７）高速液体クロマトグラフィー：
カラム：ＵｎｉｓｏｎＵＫ−Ｃ１８
（直径４．６ｍｍ×長さ７５ｍｍ：インタクト（株）製）
溶媒：Ａ：０．０１％ギ酸含有１０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液
Ｂ：０．０１％ギ酸含有アセトニトリル
Ａ／Ｂ＝５／５で平衡化したのちＡ／Ｂ＝１／９まで７分間の直線グラジエント
流速：１．０ｍｌ／分
温度：４０℃
検出：紫外部吸収 λ２３０ｎｍ
保持時間：４．３分。

【0020】

（３）下記式（ＩＩ）：

【0021】

【化2】

【0022】

で表されるテルペノイド誘導体。

【0023】

（４）下記の物理化学的性状を有するテルペノイド誘導体：
１）物質の性状：無色粉末状物質
２）分子式：Ｃ_３２Ｈ_４３ＮＯ_６
３）分子量：５３７（ＥＳＩマススペクトル法により測定）
４）高分解能ＬＣ−ＥＳＩマススペクトル法により測定した精密質量、［Ｍ＋Ｈ］^＋は次に示す通りである。
実測値：５３８．３１４９６
計算値：５３８．３１６３１
５）^１Ｈ−核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中でＴＭＳのシグナルを０．００ｐｐｍとして測定した^１Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、以下に示す通りである。
σ：０．９６（３Ｈ，ｓ），１．０６（３Ｈ，ｓ），１．１１（３Ｈ，ｓ），１．１２（３Ｈ，ｓ），１．１９（３Ｈ，ｓ），１．２７（３Ｈ，ｓ），１．２８（３Ｈ，ｓ），１．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ），１．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ），１．５２−１．５９（２Ｈ，ｍ），１．６１−１．６５（２Ｈ，ｍ），１．６６−１．６９（１Ｈ，ｍ），１．６８−１．７５（１Ｈ，ｍ），１．７５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，１４．５Ｈｚ），１．８８（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝１４．５Ｈｚ），１．９８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，９．５Ｈｚ），２．０３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，１４．５Ｈｚ），２．３８（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，１４．０Ｈｚ，１４．０Ｈｚ），２．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ），３．１０（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝１３．５Ｈｚ），３．５３（１Ｈ，ｂｒｓ），３．６９（３Ｈ，ｓ），４．３４（１Ｈ，ｓ），６．０９（１Ｈ，ｓ）ｐｐｍ
６）^１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中でＴＭＳのシグナルを０．００ｐｐｍとして測定した^１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、以下に示す通りである。
σ：１８．３（ｔ），２１．０（ｑ），２１．３（ｑ），２２．８（ｑ），２３．９（ｑ），２４．０（ｑ），２５．７（ｔ），２７．４（ｑ），２８．０（ｑ），２８．７（ｔ），３０．０（ｔ），３１．４（ｔ），３１．５（ｄ），３５．２（ｓ），３８．９（ｔ），４０．９（ｓ），４２．１（ｓ），４２．６（ｄ），４５．１（ｓ），４５．５（ｓ），４７．０（ｓ），４９．５（ｄ），５２．０（ｑ），５３．２（ｓ），６９．１（ｄ），７４．８（ｄ），１１３．６（ｓ），１２４．８（ｄ），１６８．８（ｓ），１７７．６（ｓ），１９８．８（ｓ），２０２．４（ｓ）ｐｐｍ
７）高速液体クロマトグラフィー：
カラム：ＵｎｉｓｏｎＵＫ−Ｃ１８
（直径４．６ｍｍ×長さ７５ｍｍ：インタクト（株）製）
溶媒：Ａ：０．０１％ギ酸含有１０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液
Ｂ：０．０１％ギ酸含有アセトニトリル
Ａ／Ｂ＝５／５で平衡化したのちＡ／Ｂ＝１／９まで７分間の直線グラジエント
流速：１．０ｍｌ／分
温度：４０℃
検出：紫外部吸収 λ２３０ｎｍ
保持時間：５．４分。

【0024】

（５）下記式（１）：

【0025】

【化3】

【0026】

で表される化合物を基質とし、このものを上記（１）又は（２）に記載の化合物に変換しうるケトミウム属に属する変換菌と共に培地中で培養し、その培養物より上記（１）又は（２）に記載の化合物を採取することを特徴とする、上記（１）又は（２）に記載の化合物の製造方法。

【0027】

（６）変換菌がケトミウム属に属するケトミウム・グロボーサム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍｇｌｏｂｏｓｕｍ）ＳＡＮＫ１０３１２株(受託番号ＮＩＴＥＢＰ−１４８６)である、上記（５）に記載の化合物の製造方法、
（７）変換菌がケトミウム属に属するケトミウム・エスピー（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍｓｐ．）ＳＡＮＫ１１８６７株（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−０１９１６）である、上記（５）に記載の化合物の製造方法。

【0028】

（８）上記式（１）で表される化合物を基質とし、このものを下記式（ＩＩＩ）：

【0029】

【化4】

【0030】

【0031】

（９）上記式（１）の化合物から、有機過酸化物によるエポキシ化反応により、下記式（２）：

【0032】

【化5】

【0033】

で表される化合物を製造し、
次いで、式（２）で表される化合物を基質とし、このものを上記（３）若しくは（４）に記載の化合物、又は上記式（ＩＩＩ）で表されるテルペノイド誘導体に変換しうる変換菌と共に培地中で培養し、その培養物より上記（３）若しくは（４）に記載の化合物、又は上記式（ＩＩＩ）で表されるテルペノイド誘導体を採取することを特徴とする、上記（３）若しくは（４）に記載の化合物、又は上記式（ＩＩＩ）で表されるテルペノイド誘導体の製造方法。

【0034】

（１０）変換菌が、バチルス属に属するバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ.）ＳＡＮＫ７０２１４株（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−０１９１４）である、上記（９）に記載の製造方法、

（１１）変換菌が、バチルス属に属するバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＳＡＮＫ７０３１４株（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−０１９１５）である、上記（９）に記載の製造方法。（１２）変換菌が、宿主に（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入することにより得られる形質転換体である、上記（９）に記載の製造方法、
（ａ）配列番号５（図１１）のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号６（図１２）のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のタンパク質のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｄ）（ａ）又は（ｂ）のタンパク質のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｅ）（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質、
（１３）上記宿主が大腸菌又はバクテリアである、上記（１２）に記載の製造方法、
（１４）上記バクテリアがバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、上記（１３）に記載の製造方法。

【0035】

（１５）下記（ｆ）〜（ｊ）の何れかの塩基配列を有し、上記式（２）で表される基質化合物の水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
（ｆ）配列番号３（図９）に記載の塩基配列、
（ｇ）配列番号４（図１０）に記載の塩基配列、
（ｈ）（ｆ）または（ｇ）の塩基配列において定義されたいずれかの塩基配列の相補配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが有する塩基配列、
（ｉ）（ｆ）または（ｇ）の塩基配列において定義されたいずれかの塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列；
（ｊ）遺伝暗号の縮重のため、（ｆ）または（ｇ）の塩基配列において定義された塩基配列の相補配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしないが、（ｆ）項から（ｈ）項までのいずれかの項で定義された塩基配列と同じアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（１６）下記（ｋ）〜（ｎ）の何れかのアミノ酸配列を有し、式（２）で表される基質化合物の水酸化酵素活性を有するタンパク質、
（ｋ）配列番号５（図１１）に記載のアミノ酸配列、
（ｌ）配列番号６（図１２）に記載のアミノ酸配列、
（ｍ）（ｋ）または（ｌ）のアミノ酸配列において定義されたアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列、
（ｎ）（ｋ）または（ｌ）のアミノ酸配列において定義されたアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
（１７）上記（１５）記載の塩基配列を担持する自立複製性または組み込み複製性の組み換えプラスミド、
（１８）上記（１７）に記載の組み換えプラスミドで宿主を形質転換した形質転換体、
（１９）上記（１７）に記載の組み換えプラスミドをバチルス・サチルスに形質転換した形質転換体バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＡＮＫ７０２１４Ｔ株、
（２０）上記（１７）に記載の組み換えプラスミドをバチルス・サチルスに形質転換した形質転換体バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＡＮＫ７０３１４Ｔ株。

【0036】

（２１）バチルス属に属するバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）ＳＡＮＫ７０２１４株（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−０１９１４）、
（２２）バチルス属に属するバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＳＡＮＫ７０３１４株（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−０１９１５）。

【0037】

（２３）上記（１）乃至（４）のいずれか１項に記載されたテルペノイド誘導体を有効成分として含有する、
眼疾患（当該眼疾患は、アレルギー性結膜疾患、ウィルス性結膜炎、翼状片、角膜感染症、ドライアイ、角膜障害（角膜上皮障害、及び／又は、角膜内皮障害である）、ぶどう膜炎、ベーチェット病、糖尿病網膜症、網膜剥離、網膜静脈閉塞、中心性漿液性脈絡網膜症、加齢黄斑変性、糖尿病黄斑浮腫、黄斑疾患、網膜色素変性、緑内障、若しくは、白内障である）、
腎疾患（当該腎疾患は、急性腎炎、慢性腎炎、急性腎不全、慢性腎不全、ネフローゼ症候群、ＩｇＡ腎症、糖尿病腎症、痛風腎、腎硬化症、水腎症、尿細管間質性腎炎、冠動脈バイパス手術後の腎機能低下、若しくは、腎尿路感染症である）、
呼吸器疾患（当該呼吸器疾患は、気管支炎、肺炎、胸膜炎、慢性閉塞性肺疾患、急性肺障害（ａｃｕｔｅｌｕｎｇｉｎｊｕｒｙ：ＡＬＩ）、びまん性汎細気管支炎、肺気、若しくは、喘息である）、
肝疾患（当該肝疾患は、アルコール性脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝線維症、肝硬変、若しくは、肝移植に伴う肝機能障害である）、
脳疾患（当該脳疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症(ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃｌａｔｅｒａｌｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＡＬＳ）、脳梗塞、若しくは、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）である）、又は
心臓疾患（当該心臓疾患は、心筋梗塞である）
の予防用または治療用医薬。

【0038】

（２４）上記（１）乃至（４）のいずれか１項に記載されたテルペノイド誘導体、又は上記式（ＩＩＩ）で表されるテルペノイド誘導体を有効成分として含有し、生理的条件下、該テルペノイド誘導体を持続的に放出することにより、１週間以上、薬理作用を持続し、硝子体に投与可能な基材および硝子体に投与可能な形態を有する、眼疾患治療用または予防用の徐放性医薬組成物。

【0039】

（２５）上記式（ＩＩＩ）で表されるテルペノイド誘導体を有効成分として含有し、生理的条件下、該テルペノイド誘導体を持続的に放出することにより、１週間以上、薬理作用を持続し、硝子体に投与可能な基材および硝子体に投与可能な形態を有する、眼疾患治療用または予防用の徐放性医薬組成物。

【0040】

（２６）基材が生分解性高分子であることを特徴とする上記（２４）又は（２５）に記載の眼疾患治療用または予防用の徐放性医薬組成物、
（２７）基材がポリ乳酸、又は、乳酸グリコール酸共重合体であることを特徴とする上記（２４）又は（２５）に記載の、眼疾患治療用または予防用の徐放性医薬組成物。

【0041】

（２８）形態がマイクロスフェアであることを特徴とする上記（２４）乃至（２７）のいずれか１項に記載の、眼疾患治療用または予防用の徐放性医薬組成物、
（２９）形態がロッドであることを特徴とする上記（２４）乃至（２７）のいずれか１項に記載の、眼疾患治療用または予防用の徐放性医薬組成物。

【0042】

（３０）有効成分の含有率が５重量％乃至重量８０％であることを特徴とする上記（２４）乃至（２９）のいずれか１項に記載の、眼疾患治療用または予防用の徐放性医薬組成物、
（３１）有効成分の含有率が２０重量％乃至６０重量％であることを特徴とする上記（２４２）乃至（２９）のいずれか１項に記載の、眼疾患治療用または予防用の徐放性医薬組成物、
（３２）有効成分の含有率が２０重量％乃至６０重量％であり、生理的条件下、有効成分を持続的に放出することにより、１週間以上、薬理作用を持続し、基材がポリ乳酸又は乳酸グリコール酸であり、形状がマイクロスフェア又はまたはロッドであることを特徴とする上記（２４）又は（２５）に記載の、眼疾患治療用または予防用の徐放性医薬組成物。

【0043】

（３３）後部眼疾患が加齢黄斑変性である上記（２４）乃至（３２）のいずれか１項に記載の眼疾患治療用または予防用の徐放性医薬組成物、及び
（３４）後部眼疾患が糖尿病黄斑浮腫、及び／又は、網膜静脈閉塞である上記（２４）乃至（３２）のいずれか１項に記載の眼疾患治療用または予防用の徐放性医薬組成物
である。

【0044】

本発明のテルペノイド誘導体（Ｉ）、(ＩＩ)、（ＩＩＩ）（以下、これらの化合物をまとめて本発明のテルペノイド誘導体とも記す）は、溶媒和物になることがある。また、大気中に放置することにより、水分を吸収し、吸着水が付いたり、水和物になったりする場合がある。そのような溶媒和物や水和物も本発明に包含される。

【発明の効果】

【0045】

本発明のテルペノイド誘導体は、抗炎症作用、細胞保護作用に優れ、眼疾患、腎疾患、呼吸器疾患、肝疾患、糖尿病およびその合併症、特に、眼疾患の治療薬として有用である。

【0046】

本発明のテルペノイド誘導体を有効成分として含有する、本発明の徐放性医薬組成物は、１回の投与で１週間以上、薬効を持続することができる。本発明の徐放性医薬組成物は、後部眼疾患に対する予防及び治療を目的とする医療現場で受け入れられる長い投与間隔での効果を発揮し得るので、眼疾患治療用または予防用の徐放性医薬組成物として有用である。

【0047】

本発明の変換菌を用いた本発明の製造方法は、本発明のテルペノイド誘導体を基質から高変換率で合成することができる。

【図面の簡単な説明】

【0048】

【図1】テルペノイド誘導体（Ｉ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル

【図2】テルペノイド誘導体（Ｉ）の１Ｈ−１３ＣＨＳＱＣスペクトル

【図3】テルペノイド誘導体（Ｉ）の１Ｈ−１ＨＮＯＥＳＹスペクトル

【図4】テルペノイド誘導体（ＩＩ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル

【図5】テルペノイド誘導体（ＩＩ）の１Ｈ−１３ＣＨＳＱＣスペクトル

【図6】テルペノイド誘導体（ＩＩ）の１Ｈ−１ＨＮＯＥＳＹスペクトル

【図7】配列番号１：ＳＡＮＫ７０２１４の１６ＳｒＤＮＡの部分塩基配列

【図8】配列番号２：ＳＡＮＫ７０３１４の１６ＳｒＤＮＡの部分塩基配列

【図9】配列番号３：ＳＡＮＫ７０２１４の水酸化活性を有するタンパク質のＤＮＡ配列

【図10】配列番号４：ＳＡＮＫ７０３１４の水酸化活性を有するタンパク質のＤＮＡ配列

【図11】配列番号５：ＳＡＮＫ７０２１４株の水酸化活性を有するタンパク質のアミノ酸配列

【図12】配列番号６：ＳＡＮＫ７０３１４株の水酸化活性を有するタンパク質のアミノ酸配列

【図13】ＳＡＮＫ７０２１４およびＳＡＮＫ７０３１４の系統解析図

【発明を実施するための形態】

【0049】

本発明のテルペノイド誘導体は、特定の基質化合物を本発明のテルペノイド誘導体に変換する能力のある微生物［本発明において、変換菌（ｓｔｒａｉｎｆｏｒｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）という］の培養物から常法に従って単離・精製することが出来る。

【0050】

１．基質化合物
（１）本発明の式（Ｉ）で示されるテルペノイド誘導体（以下、テルペノイド誘導体（Ｉ）と記す）と式（ＩＩＩ）で示されるテルペノイド誘導体（以下、テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）と記す）を製造する際の基質として、下記式（１）により表される化合物を用いることができる。

【0051】

【化6】

【0052】

上記化合物は、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆ＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙＬｅｔｔｅｒｓ８（１９９８）２７１１-２７１４に、合成Ｓｃｈｅｍｅ２の中の化合物番号１７として記載されており、
Ｍｅｔｈｙｌ２−ｃｙａｎｏ−３，１２−ｄｉｏｘｏｏｌｅａｎａ−１，９−ｄｉｅｎ−２８−ｏａｔｅ（ＣＤＤＯ−Ｍｅ）とも記される。以下、上記基質化合物を、ＣＤＤＯ−Ｍｅとも記す。

【0053】

ＣＤＤＯ−Ｍｅは、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆ＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙＬｅｔｔｅｒｓ７（１９９７）１６２３−１６２８、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆ＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙＬｅｔｔｅｒｓ８（１９９８）２７１１−２７１４に記載の合成方法に準じて製造することができる。

【0054】

（２）本発明の式（ＩＩ）で示されるテルペノイド誘導体（以下、テルペノイド誘導体（ＩＩ）と記す）と式（ＩＩＩ）で示されるテルペノイド誘導体を製造する際の基質として、下記式（２）により表される化合物を用いることができる。

【0055】

【化7】

【0056】

上記式（２）で表される化合物は、ＣＤＤＯ−Ｍｅから、有機過酸化物によるエポキシ化反応により、製造することができる。有機過酸化物としては、特に限定されないが、例えば、過蟻酸、過酢酸、過安息香酸、３−クロロ過安息香酸を挙げることができ、好適には３−クロロ過安息香酸である。

【0057】

２．基質化合物から本発明のテルペノイド誘導体を製造するために用いる変換菌
（１）＜ＳＡＮＫ１０３１２株＞
基質化合物（１）から本発明のテルペノイド誘導体（Ｉ）又はテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）を製造するために使用する変換菌としては、特に限定されないが、好適には真菌であり、例えば、ケトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）属に属する真菌を挙げることができる。

【0058】

ケトミウム属に属する真菌としては、好適には、ケトミウム・グロボーサム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍｇｌｏｂｏｓｕｍ）であり、より好適には、ケトミウム・グロボーサムＳＡＮＫ１０３１２株（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−１４８６）（この株を「ＳＡＮＫ１０３１２株」と記す）である。

【0059】

ＳＡＮＫ１０３１２株は、２０００年１１月に京都府の淡水から分離された。

【0060】

ＳＡＮＫ１０３１２株の菌株の同定のために利用した培地は以下の４種類であり、その組成は以下の通りである。
＜ＰＤＡ培地｛ポテトデキストロース寒天（ＰｏｔａｔｏＤｅｘｔｒｏｓｅＡｇａｒ））培地｝＞
ニッスイポテトデキストロース寒天培地（日水製薬（株）製）３９ｇ
蒸留水１０００ｍｌ
＜ＯＡ培地｛オートミール寒天（Ｏａｔｍｅａｌａｇａｒ）培地｝＞
オートミール抽出液＊１０００ｍｌ
寒天２０ｇ
＊３０ｇのオートミールに蒸留水を加えて２時間ほど煮出し、布でろ過して１０００ｍｌにフィルアップし作成した。
＜ＭＥＡ培地｛麦芽エキス寒天（Ｍａｌｔｅｘｔｒａｃｔａｇａｒ）培地｝＞
バクトマルトエキストラクト（Ｂｅｃｔｏｎ，ＤｉｃｋｉｎｓｏｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ製）３０ｇ
バクトソイトン（Ｂｅｃｔｏｎ，ＤｉｃｋｉｎｓｏｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ製）３ｇ
寒天１５ｇ
蒸留水１０００ｍｌ。
＜ＣＭＡ培地｛コーンミール寒天（ＣｏｒｎＭｅａｌＡｇａｒ）培地｝＞
コーンミールアガール「ニッスイ」（日水製薬（株）製）１７ｇ
蒸留水１０００ｍｌ。

【0061】

以下の記載において、色調の表示は「メチューン・ハンドブック・オブ・カラー」（Ｋｏｒｎｅｒｕｐ，Ａ．＆Ｗａｎｓｃｈｅｒ，Ｊ．Ｈ．１９７８．Ｍｅｔｈｕｅｎｈａｎｄｂｏｏｋｏｆｃｏｌｏｕｒ（３ｒｄ．ｅｄｉｔｉｏｎ）．ＥｒｙｅＭｅｔｈｕｅｎ，Ｌｏｎｄｏｎ）に従った。

【0062】

ＳＡＮＫ１０３１２株の菌学的性状は以下の通りである。

【0063】

ＳＡＮＫ１０３１２株を４種類の培地（ＰＤＡ培地、ＯＡ培地、ＣＭＡ培地、ＭＥＡ培地）に接種して、菌学的性状を観察した。

【0064】

ＳＡＮＫ１０３１２株のＰＤＡ培地での生育可能温度は９−３３℃で、特に１８−３１℃で旺盛に生育した。

【0065】

ＳＡＮＫ１０３１２株の菌学的性状は以下の通りである。

【0066】

ＯＡ培地でのコロニーは、２８℃、１０日の培養で直径８０ｍｍ以上である。コロニーは薄く、短い綿毛状の白色の菌糸からなり、灰黄色で、中央からやや離れたところは同心円状に灰茶色から黄茶色となる。コロニーの中心部の表面に小粒状の子のう果を密に形成し、暗緑色となる。裏面は淡黄色から茶橙色で、中心部ではオリーブ茶色で、中心部からやや離れたところは同心円状に暗茶色になる。

【0067】

ＭＥＡ培地でのコロニーは、２８℃、１０日の培養で直径８０ｍｍ以上である。コロニーは薄く、短い綿毛状の白色の菌糸からなり、茶橙色となる。分生子および子のう果は形成されない。裏面も同様となる。

【0068】

ＣＭＡ培地でのコロニーは、２８℃、１０日の培養で直径６０ｍｍとなる。コロニーは非常に薄く、菌糸が寒天表面に疎に生えるのみである。コロニーの表面の色はほぼ無色透明で、裏面も同様である。

【0069】

ＳＡＮＫ１０３１２株のＰＤＡ培地での生育可能温度は９−３３℃で、特に１８−３１℃で旺盛に生育する。

【0070】

ＳＡＮＫ１０３１２株のＯＡ培地での２８℃、１０日目の微細構造は以下のようになる。

【0071】

子のう果は暗茶色から黒色で、幅１７５−２４０μｍ、高さ２７５−４００μｍの亜球形から卵形をしており、壁は交錯菌糸組織からなり、頂部に孔口を持つ。側毛はまっすぐあるいはわずかに波形となり、淡オリーブ色で、直径３．５μｍ以下であり、子のう果の上部では頂毛と一体となる。頂毛は多数密生し、波形または先端に向かってゆるいコイル状にまき、全体に粗面で、隔壁を有し、先端は丸い。頂毛の幅は基部で３−４μｍであって、オリーブ色で、先端に向かって細まり淡色になる。子のうは棍棒形で、８胞子生である。子のう胞子はレモン形で、未熟な時は淡褐色で、成熟すると淡緑色から暗オリーブ茶色で、６．０−９．０×８．０−１１．０μｍになる。分生子は観察されない。

【0072】

以上のような菌学的特徴は、ＣｏｍｐｅｎｄｉｕｍｏｆＳｏｉｌＦｕｎｇｉ（Ｋ．Ｈ．Ｄｏｍｓｃｈ，Ｗ．ＧａｍｓａｎｄＴ．−Ｈ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ（２００７））に記載されているＣｈａｅｔｏｍｉｕｍｇｌｏｂｏｓｕｍＫｕｎｚｅの記載によく一致した。従って、本菌株をＣｈａｅｔｏｍｉｕｍｇｌｏｂｏｓｕｍと同定し、ＣｈａｅｔｏｍｉｕｍｇｌｏｂｏｓｕｍＳＡＮＫ１０３１２と命名した。

【0073】

ＳＡＮＫ１０３１２株は、２０１２年１２月１８日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に国際寄託され、受託番号ＮＩＴＥＢＰ−１４８６が付された。

【0074】

周知の通り、真菌類は自然界において、又は人工的な操作（例えば、紫外線照射、放射線照射、化学薬品処理等）により、変異を起こしやすく、本発明のＳＡＮＫ１０３１２株もそのような変異を起こし易いと推測される。本発明において、ＳＡＮＫ１０３１２株は、その全ての変異株を包含する。

【0075】

また、これらの変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組み換え、形質導入、形質転換等により得られたものも包含される。

【0076】

即ち、本発明のテルペノイド誘導体を生産するために使用する変換菌ＳＡＮＫ１０３１２、それらの変異株およびそれらと明確に区別されない菌株は全てＳＡＮＫ１０３１２株に包含される。

【0077】

（２）＜ＳＡＮＫ１１８６７株＞
基質化合物（１）から本発明のテルペノイド誘導体（Ｉ）又はテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）を製造するために使用する変換菌としては、特に限定されないが、好適には真菌であり、例えば、ケトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）属に属する真菌を挙げることができる。

【0078】

ケトミウム属に属する真菌としては、好適には、ケトミウム・エスピー（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍｓｐ.）であり、より好適には、ケトミウム・エスピーＳＡＮＫ１１８６７株（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−０１９１６）（この株を「ＳＡＮＫ１１８６７株」と記す）である。

【0079】

ＳＡＮＫ１１８６７株は、国内の土壌より分離された当社の保存株である。

【0080】

ＳＡＮＫ１１８６７株の菌株の同定のために、ＳＡＮＫ１０３１２株の菌株の同定のために用いた４種類の培地（ＰＤＡ培地、ＯＡ培地、ＭＥＡ培地、ＣＭＡ培地）を用いた。

【0081】

以下の記載において、色調の表示は「メチューン・ハンドブック・オブ・カラー」に従った。

【0082】

ＳＡＮＫ１１８６７株の菌学的性状は以下の通りである。

【0083】

ＳＡＮＫ１１８６７株を４種類の培地（ＰＤＡ培地、ＯＡ培地、ＣＭＡ培地、ＭＥＡ培地）に接種して、菌学的性状を観察した。

【0084】

ＳＡＮＫ１１８６７株のＰＤＡ培地での生育可能温度は５−３３℃で、特に１３−３１℃で旺盛に生育した。

【0085】

ＳＡＮＫ１１８６７株の菌学的性状は以下の通りである。
ＯＡ培地での２０℃、１０日のコロニーは、直径８０ｍｍ以上である。コロニーは薄く、短い綿毛状の白色の菌糸からなり、灰黄色となる。コロニーの中心部の表面に小粒状の子のう果を形成し暗緑色となる。裏面は表面と同色となる。

【0086】

ＭＥＡ培地での２０℃、１０日のコロニーは、直径８０ｍｍ以上である。コロニーは薄く、短い綿毛状の白色の菌糸からなり、茶橙色となる。分生子および子のう果は形成されない。裏面も同様となる。

【0087】

ＣＭＡ培地での２０℃、１０日のコロニーは、直径５２−５５ｍｍとなる。コロニーは非常に薄く、菌糸が寒天表面に疎に生えるのみである。コロニーの表面の色はほぼ無色透明で、裏面も同様である。

【0088】

ＳＡＮＫ１１８６７株のＯＡ培地での２０℃、１０日目の微細構造は以下のようになる。

【0089】

子のう果は暗茶色から黒色で、幅１４５−３５０μｍ、高さ２２５−６２５μｍの亜球形から卵形をしており、壁は交錯菌糸組織からなり、頂部に孔口を持つ。側毛はまっすぐあるいはわずかに波形となり、淡オリーブ色で、子のう果の上部では頂毛と一体となる。頂毛は多数密生し、波形または先端に向かってゆるいコイル状にまき、全体に粗面で、隔壁を有し、先端は丸い。頂毛の幅は基部で２．５−６．５μｍであって、オリーブ色で、先端に向かって細まり淡色になる。子のうは棍棒形で、８胞子生である。子のう胞子はレモン形で、未熟な時は淡褐色で、成熟すると淡緑色から暗オリーブ茶色で、８．５−１０．５×７．０−８．５μｍになる。分生子は観察されない。

【0090】

以上のような菌学的特徴は、ＣｏｍｐｅｎｄｉｕｍｏｆＳｏｉｌＦｕｎｇｉ（Ｋ．Ｈ．Ｄｏｍｓｃｈ，Ｗ．ＧａｍｓａｎｄＴ．−Ｈ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ（２００７））に記載されているＣｈａｅｔｏｍｉｕｍ属の記載によく一致した。従って、本菌株をＣｈａｅｔｏｍｉｕｍｓｐ．と同定し、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍｓｐ．ＳＡＮＫ１１８６７と命名した。

【0091】

ＳＡＮＫ１１８６７株は、２０１４年８月７日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に国際寄託され、受託番号ＮＩＴＥＢＰ−０１９１６が付与された。

【0092】

周知の通り、微生物は自然界において、又は人工的な操作（例えば、紫外線照射、放射線照射、化学薬品処理等）により、変異を起こしやすく、本発明のＳＡＮＫ１１８６７株もそのような変異を起こし易いと推測される。本発明において、ＳＡＮＫ１１８６７株は、その全ての変異株を包含する。

【0093】

また、これらの変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組み換え、形質導入、形質転換等により得られたものも包含される。

【0094】

即ち、本発明のテルペノイド誘導体を生産するために使用する変換菌ＳＡＮＫ１１８６７、それらの変異株およびそれらと明確に区別されない菌株は全てＳＡＮＫ１１８６７株に包含される。

【0095】

（３）＜ＳＡＮＫ７０２１４株＞
基質化合物（２）から本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩ）又はテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）を製造するために使用する変換菌としては、特に限定されないが、好適には、水酸化酵素活性を有する細菌であり、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌を挙げることができる。

【0096】

バチルス属に属する細菌として、好適には、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）であり、より好適には、バチルス・エスピーＳＡＮＫ７０２１４株（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−０１９１４）（以下、ＳＡＮＫ７０２１４と記す）である。

【0097】

ＳＡＮＫ７０２１４の１６ＳｒＤＮＡの部分塩基配列を配列番号１（図７）に示す。

【0098】

ＳＡＮＫ７０２１４株は、１９９７年９月に北海道で採取された淡水試料より分離された。

【0099】

ＳＡＮＫ７０２１４株の菌株の同定のために、菌の培養に利用した培地の組成は以下の通りである。
＜ＴＳＢ（ＰＥＡＲＬＣＯＲＥＴＲＹＰＴＯ−ＳＯＹＢＲＯＴＨ）寒天培地＞
ＰＥＡＲＬＣＯＲＥＴＲＹＰＴＯ−ＳＯＹＢＲＯＴＨ（栄研化学株式会社）３０ｇ
寒天１５ｇ
蒸留水１０００ｍｌ
（オートクレーブ前にｐＨ８．０に調製）。

【0100】

ＳＡＮＫ７０２１４株について以下に記載する。
［１］形態学的性状
ＴＳＢ培地（ｐＨ８．０）で２８℃、２４時間培養後の観察では、細胞が幅１μｍ、長さが４−５μｍの桿菌であり、運動をしない。
［２］培養学的性状
ＴＳＢ培地（ｐＨ８．０）で２８℃ 、２４時間培養後のコロニーの色調は半透明なクリームがかった白色で、鈍光を有する。コロニーの形状は円形で、中央に向けて凸レンズ状に隆起し、表面は平滑で、周辺は全縁である。
［３］生理学的性状
（１）カタラーゼ：＋
（２）生育温度：１４−３９℃
（３）グラム染色：陽性
（４）酸の生成（アピ５０ＣＨを使用）
エリスリトール：−
Ｄ−アラビノース：−
Ｌ−アラビノース：−
Ｄ−リボース：＋
Ｌ−キシロース：＋
メチル−β−Ｄ−キシロピラノシド：−
Ｄ−ガラクトース：−
Ｄ−マンノース：＋
Ｌ−ラムノース：＋
ズルシトール：−
イノシトール：−
Ｄ−ソルビトール：−
メチルα−Ｄ−マンノピラノシド：−
メチルα−Ｄ−グルコピラノシド：−
Ｎ−アセチルグルコサミン：−
アミグダリン：＋
サリシン：＋
Ｄ−ラクトース：−
Ｄ−メリビオース：−
Ｄ−メレジトース：−
Ｄ−ラフィノース：−
スターチ：−
グリコーゲン：−
キシリトール：−
ゲンチオビオース：＋
Ｄ−ツラノース：−
Ｄ−リキソース：−
Ｄ−タガトース：−
Ｄ−アラビトール：−
グルコン酸：−
２−ケト−グルコン酸：−
（５）生育ｐＨ
ｐＨ６：＋
ｐＨ７：＋
ｐＨ８：＋
ｐＨ９：＋
ｐＨ１０：＋
（６）ＮａＣｌ含有培地での生育
０％：＋
２％：＋
４％：＋
６％：＋
８％：＋
１０％：−
［４］遺伝学的性状
（１）Ｇ＋Ｃ含量：４０．８％
（２）１６ＳｒＤＮＡ解析：解読した塩基配列（１４７８ｂｐ：配列表の配列番号１）をＲｉｂｏｓｏｍａｌＤａｔａｂａｓｅＰｒｏｊｅｃｔ（ＲＤＰ）（Ｒｅｌｅａｓｅ１１、（Ｍａｒｃｈ７，２０１４にアップデート））に登録されている細菌の各種の基準株のデータと比較したところ、Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉＤＳＭ８７２２と相同性が最も高く、相同値は９９．５％であった。さらに、サイトウおよびネイらの近接結合法（ＳａｉｔｏｕＮ．，ａｎｄＭ．Ｎｅｉ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎ，４，ｐ４０６−４２５（１９８７））により系統解析し、図１３に示す結果を得た。

【0101】

以上の菌学的性状を有するＳＡＮＫ７０２１４株の同定を、バージーズ・マニュアル・オブ・システマチック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓＭａｎｕａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、３巻（２００９年刊行）を参考に行った。１６ＳｒＤＮＡの塩基配列の解析結果から、ＳＡＮＫ７０２１４株はＢ．ｇｉｂｓｏｎｉｉＤＳＭ８７２２と近い系統関係を示した。また、ＳＡＮＫ７０２１４株の形態学性状、培養学的性状、生理学的性状、遺伝学的性状はＢａｃｉｌｌｕｓ属のそれらと良く一致し、ＳＡＮＫ７０２１４株はＢａｃｉｌｌｕｓ属に属するものと同定された。ＳＡＮＫ７０２１４株と最も近縁な系統関係を示したＢ．ｇｉｂｓｏｎｉｉとは、Ｌ−アラビノース、Ｄ−ラクトース、Ｄ−メリビオース、Ｄ−メレジトース、Ｄ−ラフィノース、および、Ｄ−ツラノースの炭素源の利用性が異なっていた。また、ＳＡＮＫ７０２１４株は既知のＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌の種とは１６ＳｒＤＮＡの塩基配列から明確に区別できた。そこで、ＳＡＮＫ７０２１４株をＢａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＳＡＮＫ７０２１４と命名した。

【0102】

ＳＡＮＫ７０２１４株は、２０１４年８月７日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に国際寄託され、受託番号ＮＩＴＥＢＰ−０１９１４が付与された。

【0103】

周知の通り、微生物は自然界において、又は人工的な操作（例えば、紫外線照射、放射線照射、化学薬品処理等）により、変異を起こしやすく、本発明のＳＡＮＫ７０２１４株もそのような変異を起こし易いと推測される。本発明において、ＳＡＮＫ７０２１４株は、その全ての変異株を包含する。

【0104】

また、これらの変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組み換え、形質導入、形質転換等により得られたものも包含される。

【0105】

即ち、本発明のテルペノイド誘導体を生産するために使用する変換菌ＳＡＮＫ７０２１４株、それらの変異株およびそれらと明確に区別されない菌株は全てＳＡＮＫ７０２１４株に包含される。

【0106】

（４）＜ＳＡＮＫ７０３１４株＞
基質化合物（２）から本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩ）又はテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）を製造するために使用する変換菌として例示されるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌として、好適には、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＳＡＮＫ７０３１４株（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−０１９１５）（以下、ＳＡＮＫ７０３１４株と記す）を例示することもできる。

【0107】

ＳＡＮＫ７０３１４の１６ＳｒＤＮＡの部分塩基配列を配列番号２（図８）に示す。

【0108】

ＳＡＮＫ７０３１４は、２０１３年９月に沖縄県で採集された土壌試料より分離された。

【0109】

ＳＡＮＫ７０３１４株の菌株の同定のために、菌の培養に利用した培地の組成は以下の通りである。
＜ＮＡ（ＰＥＡＲＬＣＯＲＥＮＵＴＲＩＥＮＴＡＧＡＲ）培地＞
ＰＥＡＲＬＣＯＲＥＮＵＴＲＩＥＮＴＡＧＡＲ（栄研化学株式会社）３５ｇ
蒸留水１０００ｍｌ。

【0110】

ＳＡＮＫ７０３１４株について以下に記載する。
［１］形態学的性状
普通寒天培地（栄研化学製）で２８℃、２４時間培養後の観察では、細胞が幅１μｍ、長さが４−５μｍの桿菌であり、運動をしない。
［２］培養学的性状
普通寒天培地で２８℃、２４時間培養後のコロニーの色調は不透明なクリームがかった白色で、鈍光を有する。コロニーの形状は円形で、中央に向けて凸レンズ状に隆起し、表面は平滑で、周辺は全縁である。
［３］生理学的性状
（１）カタラーゼ：＋
（２）生育温度：１３−４６℃
（３）グラム染色：陽性
（４）炭素源の利用性（アピ５０ＣＨを使用）
グリセロール：＋
エリスリトール：−
Ｄ−アラビノース：−
Ｄ−リボース：＋
Ｌ−キシロース：−
Ｄ−アドニトール：−
メチル−β−Ｄ−キシロピラノシド：−
Ｄ−ガラクトース：＋
Ｄ−フルクトース：＋
Ｌ−ソルボース：−
Ｌ−ラムノース：−
ズルシトール：−
イノシトール：−
Ｄ−ソルビトール：−
メチルα−Ｄ−マンノピラノシド：−
Ｎ−アセチルグルコサミン：＋
アミグダリン：＋
アルブチン：＋
Ｄ−セロビオース：＋
Ｄ−マルトース：＋
Ｄ−ラクトース：−
Ｄ−メリビオース：＋
Ｄ−スクロース：＋
Ｄ−トレハロース：＋
イヌリン：−
Ｄ−メレジトース：＋
Ｄ−ラフィノース：＋
キシリトール：−
ゲンチオビオース：＋
Ｄ−ツラノース：＋
Ｄ−リキソース：−
Ｄ−タガトース：−
Ｄ−フコース：−
Ｌ−フコース：−
Ｄ−アラビトール：−
Ｌ−アラビトール：−
グルコン酸：−
２−ケト−グルコン酸：−
５−ケト−グルコン酸：−
（５）生育ｐＨ
ｐＨ６：＋
ｐＨ７：＋
ｐＨ８：＋
ｐＨ９：−
［４］遺伝学的性状
（１）Ｇ＋Ｃ含量：３８．０％
（２）１６ＳｒＤＮＡ解析：解読した塩基配列（１３８３ｂｐ：配列表の配列番号２）をＲｉｂｏｓｏｍａｌＤａｔａｂａｓｅＰｒｏｊｅｃｔ（ＲＤＰ）（Ｒｅｌｅａｓｅ１１、（Ｍａｒｃｈ７，２０１４にアップデート））に登録されている細菌の各種の基準株のデータと比較したところ、ＢａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍＩＡＭ１３４１８と最も高く、相同値は９９．９％であった。さらに、サイトウおよびネイらの近接結合法（ＳａｉｔｏｕＮ., ａｎｄＭ. Ｎｅｉ, ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎ, ４, ｐ４０６−４２５(１９８７)）により系統解析し、図１３に示す結果を得た。

【0111】

以上の菌学的性状を有するＳＡＮＫ７０３１４株の同定を、バージーズ・マニュアル・オブ・システマチック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓＭａｎｕａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、３巻（２００９年刊行）を参考に行った。１６S ｒＤＮＡの塩基配列の解析結果から、ＳＡＮＫ７０３１４株はＢａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍＩＡＭ１３４１８と非常に近い系統関係を示した。また、ＳＡＮＫ７０３１４株の形態学性状、培養学的性状、生理学的性状、遺伝学的性状はＢａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍのそれらと良く一致した。そこで、ＳＡＮＫ７０３１４株をＢａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍと同定し、ＢａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍＳＡＮＫ７０３１４と命名した。

【0112】

ＳＡＮＫ７０３１４株は、２０１４年８月７日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に国際寄託され、受託番号ＮＩＴＥＢＰ−０１９１５が付与された。

【0113】

周知の通り、微生物は自然界において、又は人工的な操作（例えば、紫外線照射、放射線照射、化学薬品処理等）により、変異を起こしやすく、本発明のＳＡＮＫ７０３１４株もそのような変異を起こし易いと推測される。本発明において、ＳＡＮＫ７０３１４株は、その全ての変異株を包含する。

【0114】

また、これらの変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組み換え、形質導入、形質転換等により得られたものも包含される。

【0115】

即ち、本発明のテルペノイド誘導体を生産するために使用する変換菌ＳＡＮＫ７０３１４株、それらの変異株およびそれらと明確に区別されない菌株は全てＳＡＮＫ７０３１４株に包含される。

【0116】

（５）＜ＳＡＮＫ７０２１４の形質転換株、ＳＡＮＫ７０３１４の形質転換株＞
基質化合物（２）から本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）を製造するためには、上記微生物から基質化合物（２）の水酸化に関与すタンパク質をコードする塩基配列を決定し、本発明のタンパク質を発現した微生物を利用することができる。具体的には、ＳＡＮＫ７０２１４株およびＳＡＮＫ７０３１４株から基質化合物（２）を選択的に水酸化し、テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）に変換するタンパク質を決定し、該タンパク質を発現する微生物を基質化合物（２）に作用させることで、テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）を製造することができる。

【0117】

＜本発明のタンパク質＞
本発明のタンパク質は、該タンパク質をコードする遺伝子を取得し、利用することによって作成することができる。以下に本発明の遺伝子の取得方法、本発明のタンパク質の作成方法を具体的に記載する。

【0118】

＜本発明の遺伝子の取得方法＞
ＳＡＮＫ７０２１４株およびＳＡＮＫ７０３１４株より常法によりゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノムシークエンサーを用いて、全ゲノムを解析し、水酸化能を有するタンパク質を同定することで、本発明の遺伝子を取得することができる。

【0119】

本発明の水酸化酵素関連遺伝子の取得は、当業者らが一般に試みる手法では容易に解決できない問題点があった。基質化合物（２）からテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）へ変換する能力を有する微生物が属するＢａｃｉｌｌｕｓ属は、水酸化に関与する遺伝子を複数個ゲノム中に保有していると考えられている。また、水酸化に関与する酵素が正常に機能するには、これらの酵素に電子を供給するフェレドキシンや還元酵素が必要とされる。したがって、一般的な水酸化酵素の遺伝子のみを利用したサザンハイブリダイゼーションやデジェネレイトＰＣＲ法では、目的の水酸化酵素の取得は困難だと考えられた。そこで、次世代シークエンサーでゲノム解析し、これらの遺伝子を網羅的に解析することで、本発明に関与する水酸化酵素の遺伝子のコードする塩基配列をみいだした。

【0120】

こうして得られた本発明の基質化合物（２）の水酸化活性を有するタンパク質をコードする塩基配列は、下記の（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）または（ｊ）で示されるものである。
（ｆ）配列番号３（図９）に記載のＳＡＮＫ７０２１４の水酸化活性を有するタンパク質の塩基配列
（ｇ）配列番号４（図１０）に記載のＳＡＮＫ７０３１４の水酸化活性を有するタンパク質の塩基配列
（ｈ）（ｆ）または（ｇ）で示されるＤＮＡの改変体であって、（ｆ）または（ｇ）に示されるいずれかのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、基質化合物（２）の水酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉ）遺伝子暗号の縮重のため、（ｆ）または（ｇ）に示されるいずれのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしないが、（ｆ）または（ｇ）で示されるＤＮＡによりコードされる、タンパク質と同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｊ）（ｆ）で示されるＤＮＡの塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつ基質化合物（２）の水酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。

【0121】

（ｋ）本発明のＳＡＮＫ７０２１４株由来の基質化合物（２）の水酸化活性を有するタンパク質としては、以下に示すタンパク質が挙げられる。
・配列番号５（図１１）のアミノ酸配列を有するタンパク質
・配列番号５のタンパク質のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質、
・配列番号５のタンパク質のアミノ酸配列と９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質、
・配列番号５のタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質。

【0122】

（ｌ）本発明のＳＡＮＫ７０３１４株由来の基質化合物（２）の水酸化活性を有するタンパク質としては、以下に示すタンパク質が挙げられる。
・配列番号６（図１２）のアミノ酸配列を有するタンパク質、
・配列番号６のタンパク質のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質、
・配列番号６のタンパク質のアミノ酸配列と９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質、
・配列番号６のタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質。

【0123】

３．本発明の形質転換体
本発明の形質転換体は、宿主に前記（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）又は（ｊ）のタンパク質をコードする遺伝子を、通常の遺伝子工学的方法によって宿主に導入することによって得られる。具体的には、本発明の形質転換体をコードする遺伝子を宿主細胞中で発現させることのできる発現ベクターを調製し、これを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることにより作製できる。

【0124】

基質化合物（２）から本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）を製造するために使用する形質変換体としては、基質化合物（２）をテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）に水酸化するタンパク質を発現する形質変換体であり、特に限定されないが、、好適には、大腸菌を宿主として、（ｋ）あるいは（ｌ）を発現する形質転換体であり、より好適には、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓを宿主として、（ｋ）あるいは（ｌ）を発現する形質変換体であり、さらに好適にはＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＳＡＮＫ７０２１４Ｔ株（以下、ＳＡＮＫ７０２１２Ｔと記す）あるいは、ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＳＡＮＫ７０３１４Ｔ株（以下、ＳＡＮＫ７０３１４Ｔと記す）である。

【0125】

形質転換体の宿主としては特に限定されず、微生物、藻類、植物体、又は動物体を用いることができる。変換効率の観点から、宿主としては、微生物が好ましい。

【0126】

宿主として用いる微生物は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）が好ましく、枯草菌がより好ましい。

【0127】

発現ベクターの母体となるベクターとしては、基質化合物（２）の水酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単独でまたは、フェレドキシン機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡと一緒に、宿主に導入することができ、宿主細胞内で遺伝子を発現可能なベクターであればよい。例えば、導入する宿主の種類に応じたプロモーターやターミネーター等の発現調節領域を有するベクターであって、複製開始点や選択マーカー等を有するベクターを用いることができる。また、プラスミド等の染色体外で自立増殖・複製するベクターであってもよいし、染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。

【0128】

形質転換方法としては、宿主に目的遺伝子を導入しうる方法であれば特に限定されるものではない。例えば、カルシウムイオンを用いる方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，９３，１９２５（１９６７））、プロトプラスト形質転換法（ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＧｅｎｅｒａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９））、エレクトロポレーション法（ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ，５５，１３５（１９９０））又はＬＰ形質転換方法（Ｔ．Ａｋａｍａｔｓｕ及びＪ．Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ，ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７，１４６，ｐ．３５３−３５７；Ｔ．Ａｋａｍａｔｓｕ及びＨ．Ｔａｇｕｃｈｉ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１，６５，４，ｐ．８２３−８２９）等を用いることができる。

【0129】

また、目的遺伝子断片が導入された形質転換体の選択は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。例えば、ベクター由来の薬剤耐性遺伝子が、形質転換時に目的ＤＮＡ断片とともに宿主細胞中に導入された結果、形質転換体が獲得する薬剤耐性を指標に行うことができる。また、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法等によって、目的ＤＮＡ断片の導入を確認することもできる。

【0130】

４．培養法と精製法（本発明のテルペノイド誘導体の製造と精製）
上述の変換菌の培養は、一般に微生物の二次代謝産物の製造に使用されるような培地を用いて行なうことができる。そのような培地は、微生物が資化出来る炭素源、窒素源、無機塩、微量の生育因子、微量金属等を含有する。

【0131】

炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、マルトース、シュークロース、マンニトール、グリセリン、デキストリン、オート麦、ライ麦、デンプン、ジャガイモ、トウモロコシ粉、綿実油、糖蜜、クエン酸、酒石酸等が挙げられ、これらは単独又は併用して使用することができる。

【0132】

炭素源の添加量は、通常、培地量の１乃至１０重量％の範囲である。

【0133】

窒素源としては、通常、蛋白質およびその加水分解物を含有する物質または無機塩が使用される。

【0134】

このような窒素源としては、例えば、大豆粉、フスマ、落花生粉、綿実粉、カゼイン加水分解物、ファーマミン、魚粉、コーンスチープリカー、ペプトン、肉エキス、イースト、イーストエキス、マルトエキス、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等が挙げられ、これらは単独または併用して使用することができる。

【0135】

窒素源の添加量は、通常、培地量の０．２乃至１０重量％の範囲である。

【0136】

また、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、アンモニウム、カルシウム、リン酸、硫酸、塩酸、炭酸等のイオンを得ることのできる塩類を培地中に加えてもよい。

【0137】

さらに、菌の資化しうるビタミンＢ１、ビオチンのようなビタミン類、チアミンのような菌体増殖促進物質、マンガン、モリブデンのような金属の塩を培地に添加してもよい。

【0138】

また、液体培地の場合、培地の泡立ちを防ぐため、シリコンオイル、ポリアルキレングリコールエーテル、植物油、動物油、界面活性剤のような消泡剤を培地に添加してもよい。

【0139】

上述の変換菌の培養に用いる液体培地のｐＨは、菌株、本発明のテルペノイド誘導体のｐＨ安定性等に依存する。

【0140】

変換菌の培養温度は、菌株、本発明のテルペノイド誘導体の熱安定性等に依存する。変換菌がＳＡＮＫ１０３１２株の場合、好適には９乃至３３℃であり、より好適には２０乃至３５℃である。変換菌がＳＡＮＫ１１８６７株の場合、好適には５乃至３３℃であり、より好適には１３乃至３１℃である。変換菌がＳＡＮＫ７０２１４株の場合、好適には１４乃至３９℃であり、より好適には２０乃至３５℃である。ＳＡＮＫ７０３１４株の場合、好適には１３乃至４６℃であり、より好適には２０乃至４０℃である。変換菌がＳＡＮＫ７０２１４Ｔ株の場合、好適には５乃至５０℃であり、より好適には２７乃至３７℃である。ＳＡＮＫ７０３１４Ｔ株の場合、好適には５乃至５０℃であり、より好適には２７乃至３７℃である。

【0141】

上述の変換菌の培養方法としては、特に限定はなく、例えば、固形培地を用いた培養法、攪拌培養法、振とう培養法、通気培養法、通気攪拌培養法等を挙げることができ、好適には、攪拌培養法、振とう培養法、通気培養法、通気攪拌培養法であり、より好適には振とう培養法である。工業的スケールで培養するには、通気攪拌培養法がより好適である。

【0142】

変換菌の培養は、通常、変換菌を生やしたスラントを少量の培地に接種した種培養から始まり、必要に応じより大きな規模で種培養を再度行なった後、最終段階としてより大きな規模での本培養を行なうことによりなされる。

【0143】

上述の変換菌の小規模な培養を行なう場合、三角フラスコ等を用いて種培養を行い、必要に応じより大きな規模の種培養を再度行った後、三角フラスコ等を用いて本培養を行う。

【0144】

上述の変換菌の大規模な培養を行なう場合、攪拌装置及び通気装置を付けたジャーファーメンター又はタンクを用いることが好ましい。このような装置を用いれば、培地をジャーファーメンター又はタンクの中で調製及び滅菌することができる。この方法は、大規模な製造に適している。

【0145】

変換菌の基質添加後の培養時間は、菌株に依存する。変換菌がＳＡＮＫ１０３１２株の場合、好適には２乃至１４日であり、より好適には３乃至１０日である。変換菌がＳＡＮＫ１１８６７株の場合、好適には２乃至１４日であり、より好適には３乃至１０日である。変換菌がＳＡＮＫ７０２１４株の場合、好適には１乃至１０日であり、より好適には３乃至７日である。ＳＡＮＫ７０３１４株の場合、好適には１乃至１０日であり、より好適には１乃至７日である。変換菌がＳＡＮＫ７０２１４Ｔ株の場合、好適には１乃至１６８時間であり、より好適には２乃至２４時間である。ＳＡＮＫ７０３１４Ｔ株の場合、好適には１乃至１６８時間であり、より好適には８乃至９６時間である。

【0146】

培養終了後、得られた培養物、その中に含まれる菌体及び／又はその培養上清から、本発明のテルペノイド誘導体を抽出することができる。菌体及びその他の固形分と培養上清とを分離するためには、遠心分離法又は珪藻土をろ過助剤とするろ過法を使用することができる。

【0147】

本発明のテルペノイド誘導体の抽出にはこれらの化合物の物理化学的性状を利用することができる。培養ろ液又は培養上清中に存在する本発明のテルペノイド誘導体は、水と混和しない有機溶剤、例えば、酢酸エチル、クロロホルム、塩化エチレン、塩化メチレン、ブタノール、それら２つ以上の混合溶媒等により抽出することができる。菌体内に存在する本発明のテルペノイド誘導体は、５０乃至９０％の含水アセトン又は含水メタノールを用いて菌体から抽出し、有機溶媒を留去した後、培養ろ液又は培養上清中に存在する場合と同様に抽出することができる。全培養物中に存在する本発明のテルペノイド誘導体は、全培養物にアセトン又はメタノールを２０乃至８０％、好適には４０乃至６０％、より好適には５０％添加し、抽出することができる。抽出終了後、珪藻土をろ過助剤としてろ過し、得られた可溶物から、培養ろ液又は培養上清中に存在する場合と同様に抽出することができる。

【0148】

上述の抽出物からの本発明のテルペノイド誘導体を単離するための精製は、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトフラフィー（以下、ＨＰＬＣ）等の精製手段により行なうことができる。

【0149】

吸着クロマトグラフィーは、本発明のテルペノイド誘導体を含む上述の抽出液を吸着剤と接触させ、夾雑物を吸着させて取り除くか、又は本発明のテルペノイド誘導体を吸着させて夾雑物を除去した後、溶出させることにより行なう。吸着剤としては、例えば、活性炭、アンバーライトＸＡＤ−２、同ＸＡＤ−４、同ＸＡＤ−１６（以上、ローム・アンド・ハース社製）、ダイヤイオンＨＰ−２０、同ＨＰ−２１、同ＨＰ−２０ＳＳ、セパビーズＳＰ−２０７、同ＳＰ−８５０、同ＳＰ−７００（三菱化学（株）製）等を挙げることができる。吸着させた本発明のテルペノイド誘導体の溶出に使用する溶媒としては、例えば、メタノール、アセトン、ブタノ−ル、アセトニトリル等の有機溶媒およびこれらの水混液を挙げることができる。

【0150】

イオン交換クロマトグラフィーは、本発明のテルペノイド誘導体が中性物質として挙動することを利用して行なう。すなわち、本発明のテルペノイド誘導体を含む上述の抽出液を例えばイオン交換担体と接触させて不要物を該担体に吸着させ、本発明のテルペノイド誘導体を通過させる。イオン交換担体としては、ＤＥＡＥ−セファデックス、ＤＥＡＥ−セファロース、ＱＡＥ−セファデックス、ＣＭ−セファデックス、ＳＰ−セファデックス（以上、ＧＥヘルスケア社製）、ＤＥＡＥ−トヨパール、ＱＡＥ−トヨパール、ＣＭ−トヨパール、ＳＰ−トヨパール（東ソー（株）製）、デュオライトＡ１１３ＬＦ、同Ａ１１６、同Ａ３６８Ｓ、同Ａ３７５ＬＦ、同Ｃ２０Ｊ、同Ｃ４３３ＬＦ（ダイアモンド・シャムロック・ケミカル社製）、アンバーライトＩＲＡ−６７、同ＩＲＡ−９８、同ＩＲＡ４００Ｊ，同ＩＲＡ４５８ＲＦ、同ＩＲ１２０Ｂ、同ＩＲＣ７６、（ローム・アンド・ハース社製）、ダウエックス５０ＷＸ４、同ＨＣＲ−Ｓ、同１×４、同２２、６６、同ＳＢＲ−Ｐ（ダウ・ケミカル社製）等を挙げることができる。

【0151】

分配クロマトグラフィーに使用する担体としては、例えば、シリカゲル、ＴＳＫゲルトヨパールＨＷ−４０Ｆ（東ソー（株）製）、セファデックスＬＨ−２０（ＧＥヘルスケア社製）、セルロース（メルク社製）等を挙げることができる。

【0152】

逆相クロマトグラフィーに使用する担体としては、例えば、コスモシール１４０Ｃ１８（ナカライテスク（株）製）、ＯＤＳ−Ａ（株式会社ワイエムシィ製）等を挙げることができる。

【0153】

ＨＰＬＣに使用するカラムとしては、例えば、ショウデックスアサヒパックＯＤＰ５０−４Ｅ（昭和電工（株）製）、ＹＭＣパックＯＤＳ−Ａ（株式会社ワイエムシィ製）、カプセルパックＵＧ１２０（資生堂（株）製）、ＵｎｉｓｏｎＣ１８（インタクト（株）製）の如き逆相カラム等を挙げることができる。

【0154】

これらの精製手段を単独で、又は適宜組み合わせることにより、本発明のテルペノイド誘導体を単離することができる。必要なら同じ精製手段を反復してもよい。各精製手段の実施には、カラムクロマトグラフィー法、バッチクロマトグラフィー法、薄層クロマトグラフィー法等、精製に適した方法を選択することができる。

【0155】

得られた本発明のテルペノイド誘導体の立体構造は、原料化合物の立体構造に由来している。原料化合物にあらたに導入した置換基の立体は、核オーバーハウザー効果相関２次元ＮＭＲスペクトル（ＮＯＥＳＹ）を用いて決定した。

【0156】

例えば、前述の（２）に記載の物理化学的性状を有するテルペノイド誘導体（Ｉ）の立体構造は、原料化合物の立体構造と、（２）に記載の物理化学的性状、および、後述する実施例１に記載のＮＯＥＳＹの測定結果から決定した。

【0157】

同様に、前述の（４）に記載の物理化学的性状を有するテルペノイド誘導体（ＩＩ）の立体構造は、原料化合物の立体構造と、（４）に記載の物理化学的性状、よび、後述する実施例３に記載のＮＯＥＳＹの測定結果から決定した。

【0158】

５．本発明のテルペノイド誘導体を含有する医薬
上述の様にして精製された本発明のテルペノイド誘導体は、Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２／ＡＲＥシグナル伝達経路を活性化する作用を有し、抗炎症作用、細胞保護作用を有する。

【0159】

Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２／ＡＲＥシグナル伝達経路が活性化されると、その標的遺伝子であるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：ｑｕｉｎｏｎｅｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ-１ (ＮＱＯ１)、ｈｅｍｅｏｘｙｇｅｎａｓｅ-１ (ＨＯ−１)、γ-ｇｌｕｔａｍａｔｅｃｙｓｔｅｉｎｅｌｉｇａｓｅｃａｔａｌｙｔｉｃｓｕｂｕｎｉｔ（ＧＣＬＣ）等が誘導される（非特許文献１）。これらの酵素量が増加あるいは活性化されると、細胞は毒物、酸化ストレス、炎症等に対して耐性となるため、本発明のテルペノイド誘導体は、以下に示す眼疾患、腎疾患、肝疾患、糖尿病およびその合併症等の疾患の予防剤又は治療剤として有用である。

【0160】

眼疾患として、アレルギー性結膜疾患、ウィルス性結膜炎、翼状片、角膜感染症、ドライアイ、角膜障害（角膜上皮障害、及び／又は、角膜内皮障害である）、ぶどう膜炎、ベーチェット病、糖尿病網膜症、網膜剥離、網膜静脈閉塞（ＲｅｔｉｎａｌＶｅｉｎＯｃｃｌｕｓｉｏｎ：ＲＶＯ）、中心性漿液性脈絡網膜症、加齢黄斑変性（Ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄＭａｃｕｌａｒＤｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ＡＭＤ）、糖尿病黄斑浮腫（ＤｉａｂｅｔｉｃＭａｃｕｌａｒＥｄｅｍａ：ＤＭＥ）、黄斑疾患、網膜色素変性、緑内障、白内障などの疾患が例示される。

【0161】

腎疾患として、急性腎炎、慢性腎炎、急性腎不全、慢性腎不全、ネフローゼ症候群、ＩｇＡ腎症、糖尿病腎症、痛風腎、腎硬化症、水腎症、尿細管間質性腎炎、冠動脈バイパス手術後の腎機能低下、腎尿路感染症などの腎障害に起因する疾患が例示される。

【0162】

呼吸器疾患として、気管支炎、肺炎、胸膜炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣｈｒｏｎｉｃＯｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅＰｕｌｍｏｎａｒｙＤｉｓｅａｓｅ：ＣＯＰＤ）、急性肺障害（ａｃｕｔｅｌｕｎｇｉｎｊｕｒｙ：ＡＬＩ）、びまん性汎細気管支炎、肺気腫、喘息などが例示される。

【0163】

肝疾患として、アルコール性脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝線維症、肝硬変、肝移植に伴う肝機能障害などが例示される。

【0164】

脳疾患として、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃｌａｔｅｒａｌｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＡＬＳ）、脳梗塞、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＭＳ）などが例示される。

【0165】

心臓疾患として、心筋梗塞などが例示される。

【0166】

糖尿病およびその合併症として、糖尿病網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害が例示される。

【0167】

これらの疾患の中でも、特に、
眼疾患として、ドライアイ、角膜障害（角膜上皮障害、及び／又は、角膜内皮障害である）、ぶどう膜炎、糖尿病網膜症、網膜静脈閉塞、加齢黄斑変性、糖尿病黄斑浮腫、緑内障、
腎疾患として、糖尿病腎症が、
呼吸器疾患として、慢性閉塞性肺疾患、急性肺障害、
肝疾患として、非アルコール性脂肪性肝炎、肝移植に伴う肝機能障害、
脳疾患として、脳梗塞、多発性硬化症
の予防剤もしくは治療剤として有用である。

【0168】

これらの疾患の中でも、さらに、ドライアイの予防又は治療剤、角膜上皮、及び／又は、角膜内皮の障害の予防又は治療剤、加齢黄斑変性の予防又は治療剤、糖尿病黄斑浮腫、及び／又は、網膜静脈閉塞の予防又は治療剤、慢性閉塞性肺疾患の予防又は治療剤、脳梗塞の予防又は治療剤、多発性硬化症の予防又は治療剤として好適である。

【0169】

本発明のテルペノイド誘導体を医薬として用いる場合、種々の形態で投与され得る。その投与形態は、製剤、年齢、性別、疾患等に依存する。例えば、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤等は経口投与される。注射剤等は静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与、硝子体内投与、前房内投与、結膜下投与、テノン嚢投与又は腹腔内投与される。点眼剤は点眼投与される。眼軟膏剤は眼粘膜に使用する。坐剤は直腸内投与される。また、いずれの投与法も徐放性医薬組成物化して投与することもある。

【0170】

本発明のテルペノイド誘導体を眼疾患用の医薬として用いる場合、経口投与も考えうるが一般的には作用点に直接投与できる点眼投与、硝子体内投与、前房内投与、結膜下投与、テノン嚢投与が用いられることが多い。

【0171】

本発明のテルペノイド誘導体を有効成分として含有する各種医薬組成物は、常法に従い、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶解剤、矯味矯臭剤、コーティング剤等、医薬製剤分野において通常使用し得る公知の補助剤を用いて製造することができる。

【0172】

６．本発明のテルペノイド誘導体を有効成分とする眼疾患治療用及び／又は予防用徐放性医薬組成物
本発明のテルペノイド誘導体を有効成分とする眼疾患治療用及び／又は予防用徐放性医薬組成物（以下、本発明の徐放性医薬組成物とも記す）は、硝子体に投与可能な基材および硝子体に投与可能な形態を有し、眼内に直接投与される。

【0173】

医薬を眼内に直接投与する場合、患者への負担が大きい。本発明の徐放性医薬組成物は、生理的条件下、該テルペノイド誘導体を持続的に放出することにより、１週間以上、薬理作用を持続することができるので、投与回数を減らすことができ、患者の負担が低減されている。

【0174】

本発明の徐放性医薬組成物は、毒物、酸化ストレス、炎症等の抑制に関わる酵素を誘導し、その結果、網膜組織を保護し、後部眼疾患治療用または予防用の局所投与型徐放性医薬組成物として有用である。後部眼疾患としては、加齢黄斑変性、糖尿病黄斑浮腫、糖尿病網膜症などが挙げられる。

【0175】

本発明の徐放性医薬組成物の基材には、生分解性ポリマーを用いる。生分解性ポリマーとしては、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸グリコール酸共重合体が挙げられ、好ましくは、ポリ乳酸、又は、乳酸グリコール酸共重合体である。

【0176】

これらの生分解性ポリマーは、公知の製造方法に従って製造するか、または種々の分子量、共重合比率の市販品を利用することもできる（Ｊ．ＢｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓＮａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２０１２：３：２０８−２５２。ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＴｒｅｎｄｓｉｎＭａｔｅｒｉａｌｓＳｃｉｅｎｃｅ，Ｌａｓｋｏｖｓｋｉ，Ａ（Ｅｄ．）ｐｐ．４８９−５１２，ＩｎＴｅｃｈ，Ｒｉｊｅｋａ，２０１１）。

【0177】

本発明の徐放性医薬組成物の形態は、粉末化での徐放化を目指した粉末医薬組成物の他に、徐放化のために基材に本発明のテルペノイド誘導体を均一または粒子状に分散させて、ロッド状、シート状、フィルム状、ディスク状、又は、マイクロスフェアに成形した形態を含む。これらの中でも、マイクロスフェアまたはロッド状が、後部眼疾患治療用または予防用の徐放性医薬組成物の形態として好ましい。

【0178】

本発明の徐放性医薬組成物に含有される本発明のテルペノイド誘導体の量は、特に限定されないが、好適には５乃至８０重量％であり、より好適には２０乃至６０重量％である。

【0179】

本発明の徐放性医薬組成物の形態として、マイクロスフェアを製造する方法としては、例えば水中乾燥法（例えば、ｏ／ｗ法、ｗ／ｏ法、ｗ／ｏ／ｗ法等）、相分離法、噴霧乾燥（スプレードライ）法、超臨界流体による造粒法、これらに準ずる方法、又は、後述する実施例に記載した方法等が挙げられる（Ｒ．Ｔ．Ｌｉｇｇｉｎｓ，Ｈ．Ｍ．Ｂｕｒｔ／ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ２２２（２００１）１９−３３；Ｋ. Ａｎｄｒｅａｓｅｔａｌ. / ＡｃｔａＢｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ７（２０１１）１４８５−１４９５；Ｊ. Ｈｅｒｂｅｒｇｅｒｅｔａｌ. / ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓe ９０（２００３）１８１−１９５；Ａ.Ｊ. Ｔｈｏｔｅ, Ｒ.Ｂ. Ｇｕｐｔａ / Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, Ｂｉｏｌｏｇｙ, ａｎｄＭｅｄｉｃｉｎｅ１（２００５）８５− ９０）。

【0180】

本発明の徐放性医薬組成物の形態として、ロッド状、シート状、フィルム状、ディスク状、マイクロスフェア状等のポリマー・インプラントを製造する方法としては、成形するための溶媒として、適宜界面活性剤又は乳化剤を加え、有機溶媒を用いて、所望の形状又は構造に溶融押出、射出成型、圧縮成形（打錠を含む）又はローラー圧縮するなどの様々な技法を用いて、所望の形状の徐放性医薬組成物の内部コアに加工する方法が例示される。

【0181】

成形するために用いる有機溶媒としては、アセトン等の、ＦＤＡクラス３溶媒（毒性が低く、最小限の使用で残留溶媒を除去できる溶媒）に分類される有機溶媒を使用する。

【0182】

有機溶媒を使用せずに、本発明の徐放性医薬組成物の内部コアを加工する場合には、本発明のテルペノイド誘導体が、基材である生分解性ポリマーの全体又はポリマーの特定の部位だけにしっかりと混ぜ合わされ分散又は溶解するような条件下で行うことができる。

【0183】

７．本発明のテルペノイド誘導体の投与量、投与回数
本発明のテルペノイド誘導体の投与量は、症状、年齢などにより異なるが、局所投与の場合は、０．０００１μｇ／ｓｉｔｅ乃至１００μｇ／ｓｉｔｅが好ましい。全身投与の場合の投与量は、０．００００１ｍｇ／ｋｇ乃至１０ｍｇ／ｋｇが好ましい。

【0184】

本発明のテルペノイド誘導体を有効成分として含有する医薬の投与回数は、１日複数回、１日１回、又は数日に１回である。徐放性医薬組成物の場合は、１週間に１回、４週間に１回、３ヶ月に１回、又は６ヶ月に１回が目安である。

【0185】

次に、実施例、試験例及び医薬組成物とする例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【実施例】

【0186】

（実施例１）テルペノイド誘導体（Ｉ）、テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）の製造（変換菌：ＳＡＮＫ１０３１２株）

【0187】

【化8】

【0188】

。（１）ケトミウム属変換菌の培養
１００ｍｌ容の三角フラスコ４本に下記表１に示す組成の種培養培地を各々２０ｍｌずつ入れ、１２１℃にて２０分間滅菌した後、室温まで冷却し、ＳＡＮＫ１０３１２株の胞子懸濁液を１ｍｌ接種し、回転振とう培養機で２３℃、２１０ｒｐｍの条件下で２日間培養した。得られた培養液を、以下、「種培養液」という。

【0189】

（表１）
表１．ＳＡＮＫ１０３１２株の種培養培地の培地組成

グリセリン３０ｇ
グルコース３０ｇ
可溶性澱粉２０ｇ
大豆粉１０ｇ
ゼラチン２．５ｇ
イーストエキス（Ｄｉｆｃｏ）２．５ｇ
ＮＨ_４ＮＯ_３２．５ｇ
寒天３ｇ
消泡剤＊１０．１ｍｌ
水道水１０００ｍｌ

＊１ニッサン・ディスフォームＣＢ−４４２（日本油脂（株）製）
＊２ｐＨは無修正。

【0190】

５００ｍｌ容の三角フラスコ１３本に下記表２に示す組成の本培養培地を各々８０ｍｌずつ入れ、１２１℃にて２０分間滅菌した後、室温まで冷却し、上述のＳＡＮＫ１０３１２株の種培養液を無菌的に各４ｍｌ接種し、回転振とう培養機で２３℃、２１０ｒｐｍの条件下で２日間培養した。この培養液に１０ｍｇ／ｍｌの濃度でジメチルスルホキシドに溶解したＣＤＤＯ−Ｍｅの溶液を各々０．８ｍｌずつ添加し、再度回転振とう培養機で２３℃、２１０ｒｐｍで６日間培養を行った。

【0191】

（表２）
表２．本培養培地の培地組成

グリセリン３０ｇ
グルコース３０ｇ
可溶性澱粉２０ｇ
大豆粉１０ｇ
ゼラチン２．５ｇ
イーストエキス（Ｄｉｆｃｏ）２．５ｇ
ＮＨ_４ＮＯ_３２．５ｇ
消泡剤＊１０．１ｍｌ
水道水１０００ｍｌ

＊１ニッサン・ディスフォームＣＢ−４４２（日本油脂（株）製）
＊２ｐＨは無修正。

【0192】

（２）テルペノイド誘導体（Ｉ）、テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）の単離
本実施例におけるテルペノイド誘導体（Ｉ）、テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）の挙動は、以下に示す条件のＨＰＬＣでモニターした。

【0193】

カラム：ＵｎｉｓｏｎＵＫ−Ｃ１８
（直径４．６ｍｍ×長さ７５ｍｍ：インタクト（株）製）
溶媒：Ａ：０．０１％ギ酸を含む１０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液
Ｂ：０．０１％ギ酸を含むアセトニトリル
Ａ／Ｂ＝５／５で平衡化したのちＡ／Ｂ＝１／９まで７分間の直線グラジエント
流速：１．０ｍｌ／分
検出：紫外部吸収 λ２３０ｎｍ
保持時間：４．３分（テルペノイド誘導体（Ｉ））
４．９分（テルペノイド誘導体（ＩＩＩ））。

【0194】

（１）において得られた培養液１０４０ｍｌに等量のアセトンを添加し、室温で１時間静置後、菌体を吸引濾過によって取り除き、濾液２０００ｍｌを得た。この濾液に酢酸エチル１Ｌを添加し、液々分配することで目的化合物を含む有機層を得た。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶剤を留去することによって、テルペノイド誘導体（Ｉ）、テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）を含む粉末５４９．９ｍｇを得た。この粉末のうち２７５ｍｇをメタノール１．３７ｍｌに溶解し、そのうち０．２ｍｌを予め０．０１％ギ酸水溶液：０．０１％ギ酸含有アセトニトリル＝４５：５５の溶媒で平衡化したＨＰＬＣカラム（ＵｎｉｓｏｎＵＳ−Ｃ１８：直径２０ｍｍ×長さ１５０ｍｍ：インタクト（株）製）に供与し、０．０１％ギ酸水溶液：０．０１％ギ酸含有アセトニトリル＝４５：５５の溶媒で流速１８．０ｍｌ／分で溶出した。目的化合物の紫外部吸収を波長λ＝２３０ｎｍにて検出し、保持時間９．１分に現れるピーク（テルペノイド誘導体（Ｉ））、保持時間１２．３分に現れるピーク（テルペノイド誘導体（ＩＩＩ））を７回に分けて分取した。分取液を合併して、減圧濃縮して得られた懸濁液を凍結乾燥し、テルペノイド誘導体（Ｉ）を無色粉末として１．４ｍｇ、テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）を無色粉末として１６．２ｍｇ得た。

【0195】

得られた本発明のテルペノイド誘導体（Ｉ）の立体構造は、二次元核磁気共鳴スペクトル（ＮＯＥＳＹ）を用いて決定した。

【0196】

テルペノイド誘導体（Ｉ）は、二次元核磁気共鳴スペクトル（ＮＯＥＳＹ）において、１９位のβ-プロトンと２１位のβ-プロトンに相関が観察されたことから、立体構造を式（Ｉ）のように決定した。

【0197】

テルペノイド誘導体（Ｉ）の物理化学的性状の測定値
１）物質の性状：無色粉末状物質
２）分子式：Ｃ_３２Ｈ_４３ＮＯ_５
３）分子量：５２１（ＥＳＩマススペクトル法により測定）
４）高分解能ＬＣ−ＥＳＩマススペクトル法により測定した精密質量、［Ｍ＋Ｈ］^＋は次に示す通りである。
実測値：５２２．３２０６２
計算値：５２２．３２１４０
５）^１Ｈ−核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中でＴＭＳのシグナルを０．００ｐｐｍとして測定した^１Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、以下に示す通りである。
σ：０．９８（３Ｈ，ｓ），０．９９（３Ｈ，ｓ），１．００（３Ｈ，ｓ），１．１７（３Ｈ，ｓ），１．１８−１．２２（１Ｈ，ｍ），１．２５（３Ｈ，ｓ），１．２８−１．３０（１Ｈ，ｍ），１．３３（３Ｈ，ｓ），１．４９（３Ｈ，ｓ），１．５１−１．５５（１Ｈ，ｍ），１．６２−１．６６（１Ｈ，ｍ），１．６８−１．７１（１Ｈ，ｍ），１．６９−１．７２（１Ｈ，ｍ），１．７０−１．８０（２Ｈ，ｍ），１．７７−１．７９（１Ｈ，ｍ），１．７６−１．８２（２Ｈ，ｍ），１．８５−１．８９（２Ｈ，ｍ），２．９６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），３．０４（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，４．０Ｈｚ，１４．０Ｈｚ），３．４９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１１．５Ｈｚ），３．７１（３Ｈ，ｓ），５．９７（１Ｈ，ｓ），８．０３（１Ｈ，ｓ）ｐｐｍ
６）^１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中でＴＭＳのシグナルを０．００ｐｐｍとして測定した^１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、以下に示す通りである。
σ：１６．４（ｑ），１８．２（ｔ），２１．４（ｑ），２１．５（ｑ），２３．９（ｔ），２４．６（ｑ），２６．６（ｑ），２７．０（ｑ），２８．１（ｔ），２９．１（ｑ），３１．１（ｄ），３１．６（ｔ），３５．８（ｔ），３５．９（ｓ），４０．１（ｔ），４２．０（ｓ），４２．５（ｓ），４５．０（ｓ），４５．７（ｓ），４７．７（ｄ），４８．９（ｓ），４９．０（ｄ），５２．１（ｑ），７３．７（ｄ），１１４．３（ｓ），１１４．６（ｓ），１２４．０（ｄ），１６５．５（ｄ），１６８．５（ｓ），１７６．６（ｓ），１９６．５（ｓ），１９８．７（ｓ）ｐｐｍ
７）高速液体クロマトグラフィー：
カラム：ＵｎｉｓｏｎＵＫ−Ｃ１８
（直径４．６ｍｍ×長さ７５ｍｍ：インタクト（株）製）
溶媒：Ａ：０．０１％ギ酸含有１０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液
Ｂ：０．０１％ギ酸含有アセトニトリル
Ａ／Ｂ＝５／５で平衡化したのちＡ／Ｂ＝１／９まで７分間の直線グラジエント
流速：１．０ｍｌ／分
温度：４０℃
検出：紫外部吸収 λ２３０ｎｍ
保持時間：４．３分。

【0198】

８）テルペノイド誘導体（Ｉ）の１Ｈ−核磁気共鳴スペクトルを図１に、二次元核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ−１３ＣＨＳＱＣスペクトル）を図２に示す。１Ｈ−核磁気共鳴スペクトルと二次元核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ−１３ＣＨＳＱＣスペクトル）の解析の結果、各プロトンを以下のように帰属した。

【0199】

１９位のβ−プロトン：１．２８−１．３０ｐｐｍ（メチレン）
２１位のβ−プロトン：３．４９ｐｐｍ（メチン）
９）テルペノイド誘導体（Ｉ）の二次元核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ−１ＨＮＯＥＳＹスペクトル）を図３に示す。図３において、１９位のβ−プロトンと２１位のβ−プロトンに相関が認められることから、立体構造を（Ｉ）のように決定した。

【0200】

（実施例２）テルペノイド誘導体（Ｉ）、テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）の製造（変換菌：ＳＡＮＫ１１８６７株）
（１）ケトミウム属変換菌の培養
１００ｍｌ容の三角フラスコ１７６本に実施例１の表１に示す組成の種培養培地を各々２０ｍｌずつ入れ、１２１℃にて２０分間滅菌した後、室温まで冷却し、ＳＡＮＫ１１８６７株の胞子懸濁液を１ｍｌ接種し、回転振とう培養機で２３℃、２１０ｒｐｍの条件下で２日間培養した。得られた培養液を、以下、「種培養液」という。

【0201】

５００ｍｌ容の三角フラスコ５８３本に実施例１の表２に示す組成の本培養培地を各々８０ｍｌずつ入れ、１２１℃にて２０分間滅菌した後、室温まで冷却し、上述のＳＡＮＫ１１８６７株の種培養液を無菌的に各４ｍｌ接種し、回転振とう培養機で２３℃、２１０ｒｐｍの条件下で２日間培養した。この培養液に３０ｍｇ／ｍｌの濃度でジメチルスルホキシドに溶解したＣＤＤＯ−Ｍｅの溶液を各々０．８ｍｌずつ添加し、再度回転振とう培養機で２３℃、２１０ｒｐｍで６日間培養を行った。

【0202】

【0203】

【0204】

（１）において得られた培養液４２．６Ｌに等量のアセトンを添加し、よく撹拌したのち室温で一晩静置後、菌体を吸引濾過によって取り除き、濾液７８Ｌを得た。この濾液を、あらかじめアセトンで洗浄後、水で置換したセパビーズＳＰ２０７（２Ｌ：三菱化学（株）製）カラムに供与した。カラムをアセトン：水＝５：５の混合溶媒６Ｌ、次いでアセトン：水＝６：４の混合溶媒６Ｌで洗浄した後、アセトン：水＝７：３の混合溶媒６Ｌで溶出した。この目的化合物を含む溶出液に水１．２Lを加え、さらに酢酸エチル２．６Lを添加し、液々分配することで目的化合物を含む有機層を分離し、飽和食塩水で洗浄したのち、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮することによって、テルペノイド誘導体（Ｉ）、テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）を含む抽出物６．９２ｇを得た。この抽出物のうち１．５ｇをメタノール５ｍｌに溶解し、ＯＤＳ−Ａ（７．５ｇ：株式会社ワイエムシィ製）に吸着させたものをミニカラムに充填し、あらかじめアセトニトリル：０．０１％ギ酸入り水＝５５：４５の混合溶媒で平衡化したＯＤＳ−Ａ（１００ｇ：株式会社ワイエムシィ製）カラムに供与し、同混合溶媒で流速１５ｍｌ／分で溶出した。目的化合物の紫外部吸収を波長λ＝２３０ｎｍにて検出し、保持時間４２．０分に現れるピーク（テルペノイド誘導体（Ｉ））と、保持時間５０．０分に現れるピーク（テルペノイド誘導体（ＩＩＩ））を５回に分けて分取した。分取液をそれぞれまとめて減圧濃縮し、テルペノイド誘導体（Ｉ）の無色粉末１９２ｍｇと、テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）を含む薄黄色粉末２．４５ｇを得た。テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）を含む薄黄色粉末２．４５ｇは、アセトニトリル２ｍｌに溶解し、あらかじめアセトニトリル：水＝５５：４５の混合溶媒で置換したセパビーズＳＰ２０７ＳＳ（５００ｍｌ：三菱化学（株）製）カラムに供与した。カラムをアセトニトリル：水＝６０：４０の混合溶媒１７５０ｍｌで洗浄した後、アセトニトリル：水＝６５：３５の混合溶媒２３４０ｍｌで溶出した。溶出液のうちテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）を高純度に含む１２００ｍｌについて、減圧濃縮した後、凍結乾燥することで、テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）を２．１９ｇ得た。

【0205】

（実施例３）テルペノイド誘導体（ＩＩ）、テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）の製造（変換菌：ＳＡＮＫ７０２１４株）

【0206】

【化9】

【0207】

【化10】

【0208】

。

【0209】

（１）基質化合物（２）の合成

【0210】

【化11】

【0211】

ＣＤＤＯ−Ｍｅ（８．００ｇ，１５．８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（４０ｍｌ）に溶解し、氷冷下で３−クロロ過安息香酸（＞６５％）（５．０４ｇ，１９．０ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３時間攪拌した。反応液に、飽和重曹水（４０ｍｌ）を加え、同温で１５分間攪拌した。さらに、同混合物に１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液（４０ｍｌ）を加え、同温で５分間攪拌後、酢酸エチルで抽出した。分離した有機層を飽和食塩水で洗浄、硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝４：１，ｖ／ｖ）で精製し、白色アモルファス状固体として基質化合物（２）（８．１６ｇ，９９％）を得た。

【0212】

ＥＳＩ−ＭＳ；ｍ／ｚ：５２２（Ｍ＋＋１）．
１Ｈ−ＮＭＲ（４００MHｚ，ＣＤＣｌ３）δ：０．９１（３Ｈ，ｓ），１．０１（３Ｈ，ｓ），１．０８（３Ｈ，ｓ），１．１２（３Ｈ，ｓ），１．１９（３Ｈ，ｓ），１．２７（３Ｈ，ｓ），１．５５（３Ｈ，ｓ），１．１８−２．００（１５Ｈ，ｍ），２．９４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．９Hz），３．０５（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１３．８，３．７Ｈｚ），３．７０（３Ｈ，ｓ），４．３４（１Ｈ，ｓ），６．０７（１Ｈ，ｓ）．
高速液体クロマトグラフィー：
純度：９９．０％
カラム：コスモシール５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ
（直径６．０ｍｍ×長さ１５０ｍｍ：ナカライテスク（株）製）
溶媒：Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液
Ｂ：アセトニトリル
Ａ／Ｂ＝１５／８５のアイソクラティック
流速：１．０ｍｌ／分
温度：４０℃
検出：紫外部吸収 λ２５４ｎｍ
保持時間：９．６分。

【0213】

（２）バチルス属変換菌の培養
１００ｍｌ容の三角フラスコ２０本に下記表３に示す組成の種培養培地を各々２０ｍｌずつ入れ、１２１℃にて３０分間滅菌した後、室温まで冷却し、ＳＡＮＫ７０２１４株のコロニーを１白金耳接種して、回転振とう培養機で２８℃、２１０ｒｐｍの条件下で２４時間培養した。得られた培養液を、以下、「種培養液」という。

【0214】

（表３）
表３．ＳＡＮＫ７０２１４株の種培養培地の培地組成

グルコース５０ｇ
大豆粉１０ｇ
肉エキス４ｇ
ポリペプトン４ｇ
イーストエキス（Ｄｉｆｃｏ）１ｇ
ＣａＣＯ_３５ｇ
ＮａＣｌ２．５ｇ
消泡剤＊１０．５ｍｌ
イオン交換水１０００ｍｌ

＊１ニッサン・ディスフォームＣＢ−４４２（日本油脂（株）製）
＊２ｐＨは滅菌前に、ＮａＯＨまたはＨＣｌで７．２に調整。

【0215】

５００ｍｌ容の三角フラスコ３００本に上記表３に示す組成の本培養培地を各々８０ｍｌずつ入れ、１２１℃にて３０分間滅菌した後、室温まで冷却し、（１）で合成した基質化合物（２）の３０ｍｇ／ｍｌの濃度でジメチルスルホキシドに溶解した溶液を各々０．８ｍｌずつ添加した。この培地に、上述のＳＡＮＫ７０２１４株の種培養液を無菌的に各０．８ｍｌ接種し、回転振とう培養機で２８℃、２１０ｒｐｍの条件下で５日間培養した。

【0216】

（３）テルペノイド誘導体（ＩＩ）、テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）の単離
本実施例におけるテルペノイド誘導体（ＩＩ）、テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）の挙動は、以下に示す条件のＨＰＬＣでモニターした。

【0217】

カラム：ＵｎｉｓｏｎＵＫ−Ｃ１８
（直径４．６ｍｍ×長さ７５ｍｍ：インタクト（株）製）
溶媒：Ａ：０．０１％ギ酸を含む１０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液
Ｂ：０．０１％ギ酸を含むアセトニトリル
Ａ／Ｂ＝５／５で平衡化したのちＡ／Ｂ＝１／９まで７分間の直線グラジエント
流速：１．０ｍｌ／分
検出：紫外部吸収 λ２３０ｎｍ
保持時間：５．４分（テルペノイド誘導体（ＩＩ））
４．９分（テルペノイド誘導体（ＩＩＩ））。

【0218】

（２）において得られた培養液２２．８Ｌに等量のアセトンを添加し、よく撹拌したのち室温で一晩静置後、菌体をフィルタープレスによって取り除き、濾液４２Ｌを得た。この濾液を、あらかじめアセトンで洗浄後、水で置換したセパビーズＳＰ２０７（２Ｌ：三菱化学（株）製）カラムに供与した。カラムをアセトン：水＝５：５の混合溶媒１４Ｌ、次いでアセトン：水＝６：４の混合溶媒６Ｌで洗浄した後、アセトン：水＝７：３の混合溶媒７．２Ｌで溶出し、さらにアセトン：水＝８：２の混合溶媒８Ｌで溶出した。アセトン：水＝７：３の混合溶媒の溶出画分から目的化合物を含む溶出液４Ｌを回収し、そこへセパビーズＳＰ２０７ＳＳ（１６ｍｌ：三菱化学（株）製）を添加し、有機溶媒を留去して目的化合物を樹脂に吸着させた。その吸着物を、あらかじめアセトンで洗浄後、水で置換したセパビーズＳＰ２０７ＳＳ（３５０ｍｌ：三菱化学（株）製）カラムに供与した。カラムをアセトニトリル：水＝５０：５０の混合溶媒１２００ｍｌ、次いでアセトニトリル：水＝５５：４５の混合溶媒１０５０ｍｌで洗浄した後、アセトニトリル：水＝６０：４０の混合溶媒２９５０ｍｌで溶出した。溶出液のうちテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）を高純度に含む９２０ｍｌについて、有機溶媒を留去した後、凍結乾燥することで、テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）を１．５８ｇ得た。また、溶出液のうち、テルペノイド誘導体（ＩＩ）を含む５８０ｍｌについて有機溶媒を留去した後、凍結乾燥することでテルペノイド誘導体（ＩＩ）を含む粉末を１２０．７ｍｇ得た。この粉末のうち１０９ｍｇをジメチルスルホキシド１．０ｍｌに溶解し、そのうち０．３ｍｌを予め０．０１％ギ酸水溶液：０．０１％ギ酸含有アセトニトリル＝４５：５５の溶媒で平衡化したＨＰＬＣカラム（ＵｎｉｓｏｎＵＳ−Ｃ１８：直径２０ｍｍ×長さ１５０ｍｍ：インタクト（株）製）に供与し、０．０１％ギ酸水溶液：０．０１％ギ酸含有アセトニトリル＝４５：５５の溶媒で流速２０．０ｍｌ／分で溶出した。目的化合物の紫外部吸収を波長λ＝２３０ｎｍにて検出し、保持時間１３．６分に現れるピーク（テルペノイド誘導体（ＩＩ））を３回に分けて分取した。分取液を合併し、減圧濃縮して得られた懸濁液を凍結乾燥し、テルペノイド誘導体（ＩＩ）を無色粉末として４．５ｍｇ得た。

【0219】

得られた本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩ）の立体構造は、二次元核磁気共鳴スペクトル（ＮＯＥＳＹ）を用いて決定した。

【0220】

テルペノイド誘導体（ＩＩ）は、二次元核磁気共鳴スペクトル（ＮＯＥＳＹ）において、１９位のα-プロトンと２１位のα-プロトンに相関が観察されたことから、立体構造を式（ＩＩ）のように決定した。

【0221】

テルペノイド誘導体（ＩＩ）の物理化学的性状の測定値
１）物質の性状：無色粉末状物質
２）分子式：Ｃ_３２Ｈ_４３ＮＯ_６
３）分子量：５３７（ＥＳＩマススペクトル法により測定）
４）高分解能ＬＣ−ＥＳＩマススペクトル法により測定した精密質量、［Ｍ＋Ｈ］^＋は次に
示す通りである。
実測値：５３８．３１４９６
計算値：５３８．３１６３１
５）^１Ｈ−核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中でＴＭＳのシグナルを０．００ｐｐｍとして測定した^１Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、以下に示す通りである。
σ：０．９６（３Ｈ，ｓ），１．０６（３Ｈ，ｓ），１．１１（３Ｈ，ｓ），１．１２（３Ｈ，ｓ），１．１９（３Ｈ，ｓ），１．２７（３Ｈ，ｓ），１．２８（３Ｈ，ｓ），１．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ），１．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ），１．５２−１．５９（２Ｈ，ｍ），１．６１−１．６５（２Ｈ，ｍ），１．６６−１．６９（１Ｈ，ｍ），１．６８−１．７５（１Ｈ，ｍ），１．７５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，１４．５Ｈｚ），１．８８（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝１４．５Ｈｚ），１．９８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，９．５Ｈｚ），２．０３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，１４．５Ｈｚ），２．３８（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，１４．０Ｈｚ，１４．０Ｈｚ），２．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ），３．１０（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝１３．５Ｈｚ），３．５３（１Ｈ，ｂｒｓ），３．６９（３Ｈ，ｓ），４．３４（１Ｈ，ｓ），６．０９（１Ｈ，ｓ）ｐｐｍ
６）^１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中でＴＭＳのシグナルを０．００ｐｐｍとして測定した^１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、以下に示す通りである。
σ：１８．３（ｔ），２１．０（ｑ），２１．３（ｑ），２２．８（ｑ），２３．９（ｑ），２４．０（ｑ），２５．７（ｔ），２７．４（ｑ），２８．０（ｑ），２８．７（ｔ），３０．０（ｔ），３１．４（ｔ），３１．５（ｄ），３５．２（ｓ），３８．９（ｔ），４０．９（ｓ），４２．１（ｓ），４２．６（ｄ），４５．１（ｓ），４５．５（ｓ），４７．０（ｓ），４９．５（ｄ），５２．０（ｑ），５３．２（ｓ），６９．１（ｄ），７４．８（ｄ），１１３．６（ｓ），１２４．８（ｄ），１６８．８（ｓ），１７７．６（ｓ），１９８．８（ｓ），２０２．４（ｓ）ｐｐｍ
７）高速液体クロマトグラフィー：
カラム：ＵｎｉｓｏｎＵＫ−Ｃ１８
（直径４．６ｍｍ×長さ７５ｍｍ：インタクト（株）製）
溶媒：Ａ：０．０１％ギ酸含有１０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液
Ｂ：０．０１％ギ酸含有アセトニトリル
Ａ／Ｂ＝５／５で平衡化したのちＡ／Ｂ＝１／９まで７分間の直線グラジエント
流速：１．０ｍｌ／分
温度：４０℃
検出：紫外部吸収 λ２３０ｎｍ
保持時間：５．４分。

【0222】

８）テルペノイド誘導体（ＩＩ）の１Ｈ−核磁気共鳴スペクトルを図４に、二次元核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ−１３ＣＨＳＱＣスペクトル）を図５に示す。１Ｈ−核磁気共鳴スペクトルと二次元核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ−１３ＣＨＳＱＣスペクトル）の解析の結果、各プロトンを以下のように帰属した。

【0223】

１９位のα−プロトン：１．４７ｐｐｍ（メチレン）
２１位のα−プロトン：３．５３ｐｐｍ（メチン）
９）テルペノイド誘導体（ＩＩ）の二次元核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ−１ＨＮＯＥＳＹスペクトル）を図６に示す。図６において、１９位のα−プロトンと２１位のα−プロトンに相関が認められることから、立体構造を（ＩＩ）のように決定した。

【0224】

（実施例４）テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）の製造（変換菌：ＳＡＮＫ７０３１４株）
（１）バチルス属変換菌の培養
１００ｍｌ容の三角フラスコに種培養培地として以下に示すトリプトソイブイヨン培地（以下、ＴＳＢ培地とする）を２０ｍｌ入れ、１２１℃にて１５分間滅菌した後、室温まで冷却し、ＳＡＮＫ７０３１４株のコロニーを１白金耳接種して、回転振とう培養機で２８℃、２１０ｒｐｍの条件下で２４時間培養した。得られた培養液を、以下、「種培養液」という。
＜ＴＳＢ培地（トリプトソイブイヨン培地）＞
パールコアトリプトソイブイヨン培地栄研（栄研化学（株）製）３０ｇ
蒸留水１０００ｍｌ。

【0225】

５００ｍｌ容の三角フラスコに本培養培地としてＴＳＢ培地を１００ｍｌ入れ、１２１℃にて１５分間滅菌した後、室温まで冷却し、実施例３（１）に記載の方法で合成した基質化合物（２）を、濃度３０ｍｇ／ｍｌとなるようにジメチルスルホキシドに溶解した溶液を１．０ｍｌ添加した。この培地に、上述のＳＡＮＫ７０３１４株の種培養液を無菌的に１．０ｍｌ接種し、回転振とう培養機で３７℃、２１０ｒｐｍの条件下で３日間培養した。

【0226】

（２）テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）の単離
本実施例におけるテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）の挙動は、以下に示す条件のＨＰＬＣでモニターした。

【0227】

カラム：ＵｎｉｓｏｎＵＫ−Ｃ１８
（直径４．６ｍｍ×長さ７５ｍｍ：インタクト（株）製）
溶媒：Ａ：０．０１％ギ酸を含む１０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液
Ｂ：０．０１％ギ酸を含むアセトニトリル
Ａ／Ｂ＝５／５で平衡化したのちＡ／Ｂ＝１／９まで７分間の直線グラジエント
流速：１．０ｍｌ／分
検出：紫外部吸収 λ２３０ｎｍ
保持時間：４．９分（テルペノイド誘導体（ＩＩＩ））。

【0228】

（１）において得られた培養液を１００ｍｌにメスアップしたのち、アセトン１００ｍｌを添加し、室温で１時間静置した。そのうち１ｍｌをとり、１００００ｒｐｍ、１０分の遠心分離処理を行い、その上清を培養液抽出物とした。

【0229】

このようにして調整した培養液抽出物１０μｌを上記ＨＰＬＣ条件で溶出した。目的化合物の紫外部吸収を波長λ＝２３０ｎｍにて検出し、保持時間４．９分に現れるピーク（テルペノイド誘導体（ＩＩＩ））のピーク面積より基質化合物（２）に対する変換効率を算出したところ、テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）を３２％確認した。

【0230】

（実施例５）ＳＡＮＫ７０２１４の野性株からのクローニング
（１）Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＳＡＮＫ７０２１４株のゲノムＤＮＡサンプルの調製
５００ｍｌ容の三角フラスコに３％ＰＥＡＲＬＣＯＲＥＴＲＹＰＴＯ−ＳＯＹＢＲＯＴＨ（栄研化学株式会社製）（オートクレーブ前にｐＨ８．０に調製）（以下、ＴＳＢ培地（ｐＨ８．０）と示す）からなる培地を１００ｍｌ入れ、１２１℃にて１５分間滅菌した後、室温まで冷却し、ＳＡＮＫ７０２１４株を１白金耳接種し、２８℃、２１０ｒｐｍの条件で１５．５時間培養した。得られた培養液を種培養とした。５００ｍｌ容の三角フラスコに１００ｍｌのＴＳＢ培地（ｐＨ８．０）を１００ｍｌ入れ、１２１℃にて１５分間滅菌した後、室温まで冷却し、上述のＳＡＮＫ７０２１４株の種培養液を無菌的に１ｍｌ接種し、２８℃、２１０ｒｐｍの条件で８時間培養を行なった。得られた培養液４０ｍｌを５０ｍｌコニカルチューブに分注し、６，０００ｒｐｍ、１０分間遠心して菌体を回収し、ゲノムＤＮＡを調整した。

【0231】

（２）ゲノムシークエンスとＰ４５０遺伝子の同定
ゲノムシークエンスはＰａｃＢｉｏＲＳＩＩ（Ｐａｃｉｆｉｃｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）およびＭｉｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いて次世代天然物化学技術研究組合でおこなった。得られた配列は４．０Ｍｂｐ、ＧＣ含量は４０．８％であった。得られたゲノム配列はＢａｃｉｌｌｕｓｈａｌｏｄｕｒａｎｓを参照配列として、ＢＡＳｙｓＳｅｒｖｅｒ２（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂａｓｙｓ．ｃａ／ｓｅｒｖｅｒ２／ｂａｓｙｓ／ｃｇｉ／ｔｅｘｔ＿ｓｅａｒｃｈ．ｐｌ）を用いてアノテーション付けを行い、１個のＰ４５０と推測される塩基配列（ＳＡＮＫ７０２１４株の水酸化活性を有するタンパク質の塩基配列）を得た（配列番号３、図９）。得られた塩基配列は、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆ＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙＬｅｔｔｅｒｓ，２０１２１；２２（１）：６０６−６０９に記載されている３種類のｍｏｔｉｆを保持していた。そこで、基質化合物（２）を本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）に水酸化する活性を持つタンパク質（配列番号５、図１１）の遺伝子をクローニングした。

【0232】

（３）大腸菌へのクローニング
ＳＡＮＫ７０２１４株のＰ４５０の塩基配列をＰＣＲで増幅するために、プライマーセットＦ１（ＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＧＴＣＡＴＧＣＴＧＣＧＡＡＣＧ）とＲ１（ＴＧＴＣＧＡＣＧＧＡＧＣＴＣＴＴＴＡＧＡＡＴＧＡＡＡＣＧＧＧＣＡＡＴＧ）を作製した。このプライマーセットを用いてＳＡＮＫ７０２１４を鋳型として、ＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ反応はＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘ（タカラバイオ社製）とＰＣＲ装置（タカラバイオ社製、ＴＰ３５０）を用い、変性を９８℃、１０秒間、アニーリングを５５℃、５秒間、伸長を７２℃、１０秒間行う３段階の反応を３０回繰り返した。その結果、約１．２ｋｂの長さのＤＮＡ断片が増幅された。得られたＳＡＮＫ７０２１４株の約１．２ｋｂのＤＮＡ断片はＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎｃｌｏｎｉｎｇ反応に備えて、ＣｌｏｎｉｎｇＥｎｈａｎｃｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）で処理した。クローニング用および発現用のベクターｐＥＴ２１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）をＰＣＲで増幅するために、プライマーセットＦ２（ＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣ）とＲ２（ＡＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣ）を作製した。このプライマーセットを用いてｐＥＴ２１ｂを鋳型として、ＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ反応はＰｒｉｍｅｓｔａｒｍａｘ（タカラバイオ社製）とＰＣＲ装置（タカラバイオ社製、ＴＰ６００）を用い、変性を９８℃、１０秒間、アニーリングを５５℃、５秒間、伸長を７２℃、６０秒間行う３段階の反応を３０回繰り返した。その結果、約５ｋｂの長さのＤＮＡ断片が増幅された。このＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、約５ｋｂのＤＮＡ断片を切り出して、ＭｏｎｏｆａｓＤＮＡ精製キットＩ（ジーエルサイエンス社製）によって回収した。回収したｐＥＴ２１ｂの約５ｋｂのＤＮＡ断片とあらかじめＣｌｏｎｉｎｇＥｎｈａｎｃｅｒ処理した約１．２ｋｂの長さのＤＮＡ断片はＩｎ−ＦｕｓｉｏｎＨＤＣｌｏｎｉｎｇｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結し、大腸菌ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社製）に形質転換した。その後、１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを含むＬＢ寒天培地で大腸菌を選択した。得られた形質転換大腸菌のコロニーを１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを含むＬＢ液体培地で培養した。増殖した大腸菌を回収し、ＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡの精製を行いＳＡＮＫ７０２１４株の水酸化活性を有するタンパク質の塩基配列を保持したプラスミド（ｐＥＴ−ＳＡＮＫ７０２１４−０１）を得た。

【0233】

（４）Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８株へのクローニング
Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８株へＳＡＮＫ７０２１４の水酸化活性を有するタンパク質の塩基配列を導入するために、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓと大腸菌とのシャトルベクターであるｐＨＴ０１（ＭｏＢｉＴｅｃ社製）へのリクローニングを行なった。

【0234】

ｐＥＴ−ＳＡＮＫ７０２１４−０１にクローニングしたＰ４５０の塩基配列をＰＣＲで増幅するために、プライマーセットＦ３（ＡＡＧＧＡＧＧＡＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＧＴＣＡＴＧＣＴＧＣＧＡＡＣＧＴＡＡ）とＲ３（ＧＡＣＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＡＡＴＧＡＡＡＣＧＧＧＣＡＡＴＧ）を作製した。このプライマーセットを用いてｐＥＴ−ＳＡＮＫ７０２１４−０１を鋳型として、ＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ反応はＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘ（タカラバイオ社製）とＰＣＲ装置（タカラバイオ社製、ＴＰ３５０）を用い、変性を９８℃、１０秒間、アニーリングを５５℃、５秒間、伸長を７２℃、１０秒間行う３段階の反応を３０回繰り返した。その結果、約１．２ｋｂの長さのＤＮＡ断片が増幅された。得られたＳＡＮＫ７０２１４の約１．２ｋｂのＤＮＡ断片はＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎｃｌｏｎｉｎｇ反応に備えて、ＣｌｏｎｉｎｇＥｎｈａｎｃｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）で処理した。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓと大腸菌とのシャトルベクターであるｐＨＴ０１（ＭｏＢｉＴｅｃ社製）をＰＣＲで増幅するために、プライマーセットＦ４（ＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＧＴＣＣＣＣＧ）とＲ４（ＧＧＡＴＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＴＴＡＡＴＴＧ）を作製した。このプライマーセットを用いてｐＨＴ０１を鋳型として、ＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ反応はＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘ（タカラバイオ社製）とＰＣＲ装置（タカラバイオ社製、ＴＰ３５０）を用い、変性を９８℃、１０秒間、アニーリングを５５℃、５秒間、伸長を７２℃、６０秒間行う３段階の反応を３０回繰り返した。その結果、約８ｋｂの長さのＤＮＡ断片が増幅された。このＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、約８ｋｂのＤＮＡ断片を切り出して、ＭｏｎｏｆａｓＤＮＡ精製キットＩ（ジーエルサイエンス社製）によって回収した。回収したｐＨＴ０１の約８ｋｂのＤＮＡ断片とあらかじめＣｌｏｎｉｎｇＥｎｈａｎｃｅｒ処理した約１．２ｋｂの長さのＤＮＡ断片はＩｎ−ＦｕｓｉｏｎＨＤＣｌｏｎｉｎｇｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結し、大腸菌ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社製）に形質転換した。その後、１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを含むＬＢ寒天培地で大腸菌を選択した。得られた形質転換大腸菌のコロニーを１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを含むＬＢ液体培地で培養した。増殖した大腸菌を回収し、ＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡの精製を行いＳＡＮＫ７０２１４の水酸化活性を有するタンパク質の塩基配列を保持したプラスミド（ｐＨＴ０１−ＳＡＮＫ７０２１４−０１）を得た。得られたｐＨＴ０１−ＳＡＮＫ７０２１４−０１をＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓへの形質転換のために大腸菌Ｃ６００（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製）に形質転換した。その後、１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを含むＬＢ寒天培地で大腸菌を選択した。得られた形質転換大腸菌のコロニーを１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを含むＬＢ液体培地で培養した。増殖した大腸菌を回収し、ＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡの精製を行いＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓへの形質転換するためのｐＨＴ０１−ＳＡＮＫ７０２１４−０１を得た。エレクトロポレーション法を持ちいて、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８株にｐＨＴ０１−ＳＡＮＫ７０２１４−０１を導入し、１００ μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地でＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓを選択した。ｐＨＴ０１−ＳＡＮＫ７０２１４−０１を保持したＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓを得た。これをＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＳＡＮＫ７０２１４Ｔとした。

【0235】

（実施例６）ＳＡＮＫ７０３１４の野性株からのクローニング
（１）ＢａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍＳＡＮＫ７０３１４株のゲノムＤＮＡサンプルの調製
ＳＡＮＫ７０２１４株の代わりにＳＡＮＫ７０３１４株を用い、ＳＡＮＫ７０３１４株の種培養液の培養時間を６時間とした以外は、実施例５と同じ方法で、ＳＡＮＫ７０３１４株のゲノムＤＮＡサンプルの調製を調整した。

【0236】

（２）ゲノムシークエンスとＰ４５０遺伝子の同定
ゲノムシークエンスはＰａｃＢｉｏＲＳＩＩ（Ｐａｃｉｆｉｃｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）およびＭｉｓｅｑ（ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いて行なった。得られた配列は５．４Ｍｂｐ、ＧＣ含量は３８．０％であった。得られたゲノム配列はＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍを参照配列として、ＢＡＳｙｓＳｅｒｖｅｒ２（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂａｓｙｓ．ｃａ／ｓｅｒｖｅｒ２／ｂａｓｙｓ／ｃｇｉ／ｔｅｘｔ＿ｓｅａｒｃｈ．ｐｌ）を用いてアノテーション付けを行い、６個のＰ４５０と推定される塩基配列（ＳＡＮＫ７０３１４の水酸化活性を有するタンパク質の塩基配列）を得た。得られたＰ４５０の塩基配列は、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆ＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙＬｅｔｔｅｒｓ，２０１２１；２２（１）：６０６−６０９に記載されている３種類のｍｏｔｉｆを保持していた。この中から基質化合物（２）を本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）に水酸化する活性を持つタンパク質（配列番号６、図１２）の遺伝子をクローニングした（配列番号４、図１０）。

【0237】

（３）大腸菌へのクローニング
ＳＡＮＫ７０３１４株のＰ４５０の塩基配列をＰＣＲで増幅するために、プライマーセットＦ５（ＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＣＣＧＡＡＡＧＡＧＡＡＡＡＣ）とＲ５（ＴＧＴＣＧＡＣＧＧＡＧＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＴＧＴＴＴＡＣＧＡＡＴＣＡ）を作製した。このプライマーセットを用いてＳＡＮＫ７０３１４株を鋳型として、ＰＣＲ反応を行なった。

【0238】

以下は、実施例５と同じ方法でＳＡＮＫ７０３１４の水酸化活性を有するタンパク質の塩基配列を保持したプラスミド（ｐＥＴ−ＳＡＮＫ７０３１４−０１）を得た。

【0239】

（４）Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８株へのクローニング
Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８株へＳＡＮＫ７０３１４の水酸化活性を有するタンパク質の塩基配列を導入するために、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓと大腸菌とのシャトルベクターであるｐＨＴ０１（ＭｏＢｉＴｅｃ社製）へのリクローニングを行なった。

【0240】

ｐＥＴ−ＳＡＮＫ７０３１４−０１にクローニングしたＰ４５０の塩基配列をＰＣＲで増幅するために、プライマーセットＦ６（ＡＡＧＧＡＧＧＡＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＡＡＣＣＧＡＡＡＧＡＧＡＡＡＡＣ）とＲ６（ＧＡＣＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＡＣＡＴＧＴＴＴＡＣＧＡＡＴＣＡＡＴＡＡＴＴＣ）を作製した。このプライマーセットを用いてｐＥＴ−ＳＡＮＫ７０２１４−０１を鋳型として、ＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ反応はＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘ（タカラバイオ社製）とＰＣＲ装置（タカラバイオ社製、ＴＰ３５０）を用い、変性を９８℃、１０秒間、アニーリングを５５℃、５秒間、伸長を７２℃、１０秒間行う３段階の反応を３０回繰り返した。その結果、約１．２ｋｂの長さのＤＮＡ断片が増幅された。得られたＳＡＮＫ７０３１４の約１．２ｋｂのＤＮＡ断片はＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎｃｌｏｎｉｎｇ反応に備えて、ＣｌｏｎｉｎｇＥｎｈａｎｃｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）で処理した。Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓと大腸菌とのシャトルベクターであるｐＨＴ０１（ＭｏＢｉＴｅｃ社製）をＰＣＲで増幅するために、プライマーセットＦ４（ＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＧＴＣＣＣＣＧ）とＲ４（ＧＧＡＴＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＴＴＡＡＴＴＧ）を利用した。このプライマーセットを用いてｐＨＴ０１を鋳型として、ＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ反応はＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘ（タカラバイオ社製）とＰＣＲ装置（タカラバイオ社製、ＴＰ３５０）を用い、変性を９８℃、１０秒間、アニーリングを５５℃、５秒間、伸長を７２℃、６０秒間行う３段階の反応を３０回繰り返した。その結果、約８ｋｂの長さのＤＮＡ断片が増幅された。このＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、約８ｋｂのＤＮＡ断片を切り出して、ＭｏｎｏｆａｓＤＮＡ精製キットＩ（ジーエルサイエンス社製）によって回収した。回収したｐＨＴ０１の約８ｋｂのＤＮＡ断片とあらかじめＣｌｏｎｉｎｇＥｎｈａｎｃｅｒ処理した約１．２ｋｂの長さのＤＮＡ断片はＩｎ−ＦｕｓｉｏｎＨＤＣｌｏｎｉｎｇｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結し、大腸菌ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社製）に形質転換した。その後、１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを含むＬＢ寒天培地で大腸菌を選択した。得られた形質転換大腸菌のコロニーを１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを含むＬＢ液体培地で培養した。増殖した大腸菌を回収し、ＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡの精製を行いＳＡＮＫ７０３１４の水酸化活性を有するタンパク質の塩基配列を保持したプラスミド（ｐＨＴ０１−ＳＡＮＫ７０３１４−０１）を得た。得られたｐＨＴ０１−ＳＡＮＫ７０３１４−０１をＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓへの形質転換のために大腸菌Ｃ６００（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製）に形質転換した。その後、１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを含むＬＢ寒天培地で大腸菌を選択した。得られた形質転換大腸菌のコロニーを１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを含むＬＢ液体培地で培養した。増殖した大腸菌を回収し、ＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡの精製を行いＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓへの形質転換するためのｐＨＴ０１−ＳＡＮＫ７０３１４−０１を得た。エレクトロポレーション法を用いて、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８株にｐＨＴ０１−ＳＡＮＫ７０３１４−０１を導入し、１００μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地でＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓを選択した。ｐＨＴ０１−ＳＡＮＫ７０３１４−０１を保持したＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓを得た。これをＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＳＡＮＫ７０３１４Ｔとした。

【0241】

（実施例７）テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）の製造（変換菌：ＳＡＮＫ７０２１４Ｔ株）
（１）ＳＡＮＫ７０２１４Ｔ株の培養
１００ｍｌ容の三角フラスコに下記表４に示す組成の種培養培地を２０ｍｌ入れ、１２１℃にて１５分間滅菌した後、室温まで冷却し、ＳＡＮＫ７０２１４Ｔ株のコロニーを１白金耳接種して、回転振とう培養機で３７℃、２１０ｒｐｍの条件下で２４時間培養した。得られた培養液を、以下、「種培養液」という。

【0242】

【表4】

＊ｐＨ無調整。

【0243】

５００ｍｌ容の三角フラスコに下記表５に示す組成の本培養培地−１を１００ｍｌ入れ、１２１℃にて３０分間滅菌した後、下記表６に示す組成の本培養培地−２を無菌的に加えて本培養培地とした。これに、上述のＳＡＮＫ７０２１４Ｔ株の種培養液を無菌的に１．０ｍｌ接種して、回転振とう培養機で３７℃、２１０ｒｐｍの条件下で２時間培養した。その後、ＩＰＴＧ（イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド）最終濃度として０．１ｍＭになるように添加し、回転振とう培養機で３７℃、２１０ｒｐｍの条件下で１時間培養したのち、実施例３（１）の方法で合成した基質化合物（２）の３０ｍｇ／ｍｌの濃度でジメチルスルホキシドに溶解した溶液を１．０ｍｌ添加して、回転振とう培養機で３７℃、２１０ｒｐｍの条件下で５時間培養した。

【0244】

【表5】

【0245】

（表６）
表６．本培養培地の培地組成−２

１００ｍＭ硫酸第一鉄１ｍｌ
８０ｍｇ／ｍｌ５−アミノレブリン酸１ｍｌ
２ｍｇ／ｍｌチミン１０ｍｌ
１００ｍｇ／ｍｌクロラムフェニコール１ｍｌ
。

【0246】

【0247】

カラム：ＵｎｉｓｏｎＵＫ−Ｃ１８
（直径４．６ｍｍ×長さ７５ｍｍ：インタクト（株）製）
溶媒：Ａ：０．０１％ギ酸を含む１０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液
Ｂ：０．０１％ギ酸を含むアセトニトリル
Ａ／Ｂ＝５／５で平衡化したのちＡ／Ｂ＝１／９まで７分間の直線グラジエント
流速：１．０ｍｌ／分
検出：紫外部吸収 λ２３０ｎｍ
保持時間：４．９分（テルペノイド誘導体（ＩＩＩ））。

【0248】

【0249】

このようにして調整した培養液抽出物１０μｌを上記ＨＰＬＣ条件で溶出した。目的化合物の紫外部吸収を波長λ＝２３０ｎｍにて検出し、保持時間４．９分に現れるピーク（テルペノイド誘導体（ＩＩＩ））のピーク面積より基質化合物（２）に対する変換効率を算出したところ、テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）を７７％確認した。
（１）ＳＡＮＫ７０３１４Ｔ株の培養
１００ｍｌ容の三角フラスコに実施例７の表４に示す組成の種培養培地を２０ｍｌ入れ、１２１℃にて１５分間滅菌した後、室温まで冷却し、ＳＡＮＫ７０３１４Ｔ株のコロニーを１白金耳接種して、回転振とう培養機で３７℃、２１０ｒｐｍの条件下で１０時間培養した。得られた培養液を、以下、「種培養液」という。

【0250】

５００ｍｌ容の三角フラスコに実施例７の表５に示す組成の本培養培地−１を１００ｍｌ入れ、１２１℃にて１５分間滅菌した後、上記表６に示す組成の本培養培地−２を無菌的に加えて本培養培地とした。これに、上述のＳＡＮＫ７０３１４Ｔ株の種培養液を無菌的に１．０ｍｌ接種して、回転振とう培養機で３７℃、２１０ｒｐｍの条件下で２時間培養した。その後、ＩＰＴＧを最終濃度として０．１ｍＭになるように添加し、回転振とう培養機で３７℃、２１０ｒｐｍの条件下で１時間培養したのち、実施例３（１）の方法で合成した基質化合物（２）の３０ｍｇ／ｍｌの濃度でジメチルスルホキシドに溶解した溶液を１．０ｍｌ添加して、回転振とう培養機で３７℃、２１０ｒｐｍの条件下で８４時間培養した。

【0251】

【0252】

カラム：ＵｎｉｓｏｎＵＫ−Ｃ１８
（直径４．６ｍｍ×長さ７５ｍｍ：インタクト（株）製）
溶媒：Ａ：０．０１％ギ酸を含む１０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液
Ｂ：０．０１％ギ酸を含むアセトニトリル
Ａ／Ｂ＝５／５で平衡化したのちＡ／Ｂ＝１／９まで７分間の直線グラジエント
流速：１．０ｍｌ／分
検出：紫外部吸収 λ２３０ｎｍ
保持時間：４．９分（テルペノイド誘導体（ＩＩＩ））。

【0253】

【0254】

このようにして調整した培養液抽出物１０μｌを上記ＨＰＬＣ条件で溶出した。目的化合物の紫外部吸収を波長λ＝２３０ｎｍにて検出し、保持時間４．９分に現れるピーク（テルペノイド誘導体（ＩＩＩ））のピーク面積よりＲＮＲ−００１４に対する変換効率を算出したところ、テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）を３９％確認した。

【0255】

（実施例９）徐放性医薬組成物・マイクロスフェアの製造
徐放性医薬組成物の有効成分として、本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）を使用した。基材としては、表７に示すポリ乳酸、及び、乳酸−グリコール酸共重合体（和光純薬工業（株）製）を用いた。

【0256】

【表7】

【0257】

薬物含有率１０重量％のマイクロスフェアについては、次の方法で製造した。ジクロロメタンに、基材と本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）を、それぞれの濃度が約１７％および約１．７％（ｗ／ｖ）となるように溶解させた。次いで、得られた溶液をさらに０．０５％ポリビニルアルコール水溶液中に加え、撹拌機を用いてｏ／ｗエマルションを形成させた。この際の水相体積は油相体積の約６．７倍であった。

【0258】

ｏ／ｗエマルションを形成する際の撹拌速度を適宜調整することにより、得られるマイクロスフェアの粒子径を制御した。例えば、回転数が速ければ得られるマイクロスフェアの粒子径は小さく、逆に回転速度が遅ければ粒子径が増大した。

【0259】

油相の溶媒の蒸発には水中乾燥法（ｏ／ｗ法）を採用し、マグネチックスターラーで撹拌しながら常圧で行った。このようにして得られたマイクロスフェアをろ過して分取した後、マイクロスフェアの表面に付着している乳化剤等を精製水等で数回繰り返し洗浄した後、再び、蒸留水（精製水）に分散して凍結乾燥し、目的のマイクロスフェアを得た。

【0260】

薬物含有率３０重量％のマイクロスフェアについては、次の方法で製造した。ジクロロメタンに、基材と本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）を、それぞれの濃度が約１２％および約５％（ｗ／ｖ）となるように溶解させた。次いで、得られた溶液をさらに０．０５％ポリビニルアルコール水溶液中に加え、撹拌機を用いてｏ／ｗエマルションを形成させた。この際の水相体積は油相体積の約６．７倍であった。

【0261】

得られたマイクロスフェアの平均粒子径の測定は、レーザー回折式粒子径分布測定装置（ＨＥＬＯＳ＆ＣＵＶＥＴＴＥ，ＳＹＭＰＡＴＥＣ）で行なった。測定結果を表８に示す。

【0262】

【表8】

【0263】

得られたマイクロスフェア中の、本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）の含有率（薬物含有マイクロスフェア中の薬物の重量分率）は以下の方法で測定した。

【0264】

製造したマイクロスフェア（約１ｍｇを正確に秤量した。）をジメチルスルホキシドに溶解させて正確に１ｍＬとし、この溶液に含まれる本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）の含有量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の測定値から算出し、次式に従って、マイクロスフェア中の本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）の含有率を算出した。

【0265】

含有率（重量％）＝（本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）の含有量の測定値／マイクロスフェア量）×１００。

【0266】

ＨＰＬＣ条件は次の通りである。
＜ＨＰＬＣ条件＞
装置：クロマトグラフ（Ａｃｑｕｉｔｙ，Ｗａｔｅｒｓ）、ＵＶ検出器（Ａｃｑｕｉｔｙ，Ｗａｔｅｒｓ）、データ解析機器（Ｅｍｐｏｗｅｒ，Ｗａｔｅｒｓ）
ＨＰＬＣカラム: ＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＢＥＨＣ１８１．７ μｍ
(２．１ｍｍＩ.Ｄ. ｘ５０ｍｍ, Ｗａｔｅｒｓ)
分析時間：１４分
移動相Ａ：水：アセトニトリル：リン酸（９５ : ５ : ０．１）
移動相Ｂ：アセトニトリル：水：リン酸（９５ : ５ : ０．１）
流速：０．７５ｍＬ/分（表９にグラジエント条件を示す。）
カラム温度：４０℃付近一定温度
サンプル温度：２５℃付近一定温度
検出波長：ＵＶ−２４５ｎｍ。

【0267】

【表9】

【0268】

この方法で求められた薬物含有率は、マイクロスフェア製造時の基材と薬物の組成から算出される重量比の８５％乃至９５％と、ほぼ定量的であることが確認された。そこで、本発明では、組成物の表示では、便宜的に製造時の組成から算出される薬物含有率にて表記した。

【0269】

（実施例１０）徐放性医薬組成物・ロッド状インプラントの製造
基材がＰＬＡ−００２０で、本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）を１０重量％含有するマイクロスフェアを用いて、ロッド状インプラントを製造した。このマイクロスフェアは、約２００℃に加温することにより完全に融解することができた。融解したマイクロスフェアを金属筒内に満たし、放冷後に取り出して完全に冷却し、目的のロッド状インプラント（直径約１ｍｍ）を得た。

【0270】

得られたロッド状インプラントをジメチルスルホキシドに溶解させて正確に１ｍｇ／ｍＬとした。この溶液に含まれるテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）の含有量を実施例４と同様にして測定し、ロッド状インプラント中のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）の含有率を算出した。

【0271】

本実施例で用いた薬物含有率１０重量％のマイクロスフェアは、次の方法で製造した。ジクロロメタンに、基材と本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）を、それぞれの濃度が約１７％および約１．７％（ｗ／ｖ）となるように溶解させた。次いで、得られた溶液をさらに０．０５％ポリビニルアルコール水溶液中に加え、撹拌機を用いてｏ／ｗエマルションを形成させた。この際の水相体積は油相体積の約６．７倍であった。

【0272】

（試験例１）ＮＱＯ１アッセイ
Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞（マウス肝細胞株、ＡＴＣＣ社、カタログ番号ＣＲＬ−２０２６）を培養した（５％ＣＯ２、３７度）。非働化ＦＢＳを１０％含むＤＭＥＭ（ライフテクノロジー社、カタログ番号１１９６５−０９２）の培地を用いた。また、培地は終濃度でペニシリンを１００単位／ｍＬ、ストレプトマイシンを１００ｕｇ／ｍｇ含む。ＮＱＯ１アッセイは既報（ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ１９９８；１６９：３２８−、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ２００４；３８２：２４３−）に従って、実施した。

【0273】

Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞を１００００ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように９６ウェルプレートに播種した。培地量は１００ｕＬである。約２４時間後にテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）、テルペノイド誘導体（Ｉ）あるいはテルペノイド誘導体（ＩＩ）を含む培地に交換して、更に約４８時間培養した。溶解液（ＥＤＴＡを２ｍＭ、ジギトニンを０．８％含む溶液）、反応溶液（トリス塩酸を０．０２５Ｍ、アルブミンを０．０６７％、Ｔｗｅｅｎ−２０を０．０１％、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを２Ｕ／ｍＬ、フラビンアデニンジヌクレオチドを５μＭ、グルコース−６−リン酸を１μＭ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を３０μＭ、３−（４、５−ジメチル−２−チアゾリル）−２、５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を０．０３％、メナジオンを５０μＭ含む溶液）、停止液（ジクマロールを０．３ｍＭ、リン酸２水素カリウムを５ｍＭ含む溶液、ｐＨは７．４）を調製した。培地を除去後、溶解液を５０μＬ添加して、３７度で１０分間静置した。さらに、室温で１０分間振盪させた。

【0274】

溶液を２００ｕＬ添加して、室温で５分間静置した。停止液を５０μＬ添加して、４９０ｎｍの吸光度を測定した。

【0275】

試験結果をグラフパッド社のプリズム（Ｖｅｒ５）で解析して、ＮＱＯ１の活性を２倍に上昇させる濃度のＣＤ値（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｄｏｕｂｌｅＮＱＯ１ａｃｔｉｖｉｔｙ）を算出した。１群は３ウェルで、ＣＤ値はその平均値である。ＣＤ値は、テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）が１．０ｎＭ、テルペノイド誘導体（Ｉ）が０．３ｎＭ、テルペノイド誘導体（ＩＩ）が０．１ｎＭであった。

【0276】

（試験例２）テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）を含有するマイクロスフェアｉｎｖｉｔｒｏ薬物放出試験
実施例７に記載の方法で、本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）を１０重量％含有するマイクロスフェアを製造した。眼内灌流用液（オペガードＭＡ、千寿製薬社製）に界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ８０）を１ｗ／ｖ％となるように含有させ、このものに、本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）の濃度が５０μｇ／ｍＬになるようにマイクロスフェアを加え、３７℃に設定したインキュベーター中で攪拌した。インキュベーション開始後１、２、３および７日に、この混和溶液を遠心分離（３,７５０ｒｐｍ、１０分間）し、得られた上清２００μＬを５０％アセトニトリル８００μＬと混和して、本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）の溶出量をＨＰＬＣで測定した。ＨＰＬＣの条件は、実施例４に示した条件と同じである。

【0277】

本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）の溶出率（％）を、本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）がすべて溶出した場合の薬物濃度を１００％として算出した。

【0278】

算出結果を表１０に示す。これらより、試験を行なったいずれのマイクロスフェアも持続的に薬物を放出することが示された。

【0279】

【表10】

＊医薬組成物中のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）含有率を示す。

【0280】

（試験例３）テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）を含有するロッド状インプラントのｉｎｖｉｔｒｏ薬物放出試験
実施例８に記載の製造方法でロッド状インプラントを製造した。眼内灌流用液（オペガードＭＡ、千寿製薬社製）に界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ８０）を１ｗ／ｖ％となるように含有させ、このものに、本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）の濃度が５０μｇ／ｍＬになるようにロッド状インプラントを加え、３７℃に設定したインキュベーター中で攪拌した。インキュベーション開始後１、２、３、７、１４、２１および２８日にこの混和溶液を遠心分離（３,７５０ｒｐｍ、１０分間）し、得られた上清２００μＬを５０％アセトニトリル８００μＬと混和して本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）の溶出量をＨＰＬＣで測定した。ＨＰＬＣの条件は、実施例７に示した条件と同じである。溶出率の計算方法は、試験例２と同様である。

【0281】

算出結果を表１１に示す。これらより、基材ＰＬＧＡ−５０２０を基材とするロッド状インプラントは、持続的に薬物を放出することが示された。

【0282】

（表１１）
表１１．ロッド状インプラントからの本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）の累積溶出率（％）（テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）の含有率は１０重量％）

日数ＰＬＧＡ−５０２０
１０
２０
３０
７４
１５３０
２１６１
３０８４。

【0283】

（試験例４）テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）を含有するマイクロスフェアのウサギ眼内動態試験
本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）、本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）・ＰＬＡ−０００５［基材としてＰＬＡ−０００５を使用し、本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）とＰＬＡ−０００５の混合比を１：９として調整した］、本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）・ＰＬＡ−００２０［基材としてＰＬＡ−００２０を使用し、テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）とＰＬＡ−００２０の混合比を１：９として調整した。］、それぞれを用いて、溶媒は生食とし、テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）として３ｍＭとなるように懸濁液を調製した。

【0284】

この懸濁液５０ｕＬを白ウサギ（オリエンタル酵母株式会社、Ｋｂｌ：ＮＺＷ、雄性、８週齢）に硝子体内投与した。硝子体内投与後にウサギを安楽死させ、硝子体内液および網膜を採材し、それらに含まれるテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）の濃度を測定した。結果を表１３、１４に示す。下記表１２に示す数値は４眼の平均値と標準誤差を示す。各組織中の薬物濃度はＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法にて測定した。組織の前処理は、組織重量の１０倍量に値する精製水を希釈して、ホモジネートすることで測定サンプルを得た。得られたサンプルに内部標準溶液 (ＩＳ；Ｎｉｆｌｍｉｃａｃｉｄ)を含む水／アセトニトリル（１：１）溶液を加え薬物を抽出した後、フィルターろ過した溶液をＬＣ／ＭＳ／ＭＳに注入した。
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ条件は次の通りである。
<ＵＰＬＣ条件>：ＷａｔｅｒｓＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣ
分析カラム：ＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＢＥＨＣ１８１．７ μｍ
カラム温度：５０℃
移動相Ａ：９５％アセトニトリル（５ｍＭ酢酸アンモニウム）
移動相Ｂ：５％アセトニトリル（５ｍＭ酢酸アンモニウム）。

【0285】

（表１２）
表１２．グラジエント表

時間（分）移動相Ａ（％）移動相Ｂ（％）
０５９５
０．２５０５０
０．６９５５０
０．９９５５
１５９５
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ。

【0286】

<ＭＳ／ＭＳ条件>：分析装置ＡＰＩ４０００
Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎｍｏｄｅ：ＥＳＩ
Ｉｏｎｐｏｌａｒｉｔｙｍｏｄｅ：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
Ｍｏｎｉｔｏｒｉｏｎ
テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）（Ｐｕｒｅｃｕｒｓｏｒｉｏｎ（ｍ／ｚ）：５３８．５、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（ｍ／ｚ）：４６０）
ＩＳ（Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｉｏｎ（ｍ／ｚ）：２８３．２、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（ｍ／ｚ）：２６５）。

【0287】

【表13】

【0288】

（表１４）
表１４．本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）の網膜内濃度（ｕｇ／ｇ組織）

日数ＰＬＡ−００２０
０．２５０．８４±０．１１
１２．６６±２．８９
７０．０３±０．０２
１７０．２５±０．１５
２４０．１３±０．１１
２８０．０４±０．０２。

【0289】

以上より、生分解性ポリマーを基材として用いることで、本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）の硝子体及び網膜中濃度が有意に持続していることが確認できた。

【0290】

（試験例５）テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）を含有するロッド状インプラントのウサギ眼内薬物動態試験
本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）・ＰＬＧＡ−５０２０［基材としてＰＬＧＡ−５０２０を使用し、本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）とＰＬＧＡ−５０２０の混合比を１：９として調整した］からなるマイクロスフェアを製造し、このマイクロスフェアを用いて、溶媒は生食とし、テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）として３ｍＭとなるように懸濁液を調製した。

【0291】

この懸濁液５０ｕＬを白ウサギ（オリエンタル酵母株式会社、Ｋｂｌ：ＮＺＷ、雄性、８週齢）に硝子体内投与した。投与量は、マイクロスフェアとして８１０ｕｇ、本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）として８１ｕｇであった。

【0292】

また、テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）・ＰＬＧＡ−５０２０[基材としてＰＬＧＡ−５０２０を使用し、本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）とＰＬＧＡ−５０２０の混合比を１：９として製造した]からなるロッド状インプラントを製造し、ウサギの硝子体内に投与した。投与量は、ロッド状インプラントとして６．５ｍｇ、本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）として６５０ｕｇであった。

【0293】

硝子体内投与後にウサギを安楽死させ、硝子体内液を採材し、本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）の濃度を測定した。結果を表１５に示す。下記表１５に示す数値は、２眼の平均値を示す。ロッド状のインプラントとすることで２８日間、硝子体中に薬物が持続できることを確認した。更にマイクロスフェアと比較してロッド状のインプラントは有意にテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）の硝子体中濃度を持続できることがわかった。

【0294】

（表１５）
表１５．本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）の硝子体内濃度（ｎＭ）

日数マイクロスフェアロッド状インプラント
３９．４３．７
７０．０７．９
２１０．０８．６
２８０．０２．５。

【0295】

（試験例６）ウサギ網膜遺伝子に対するテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）マイクロスフェアの作用
Ｎｒｆ２標的遺伝子としてＮｑｏ１遺伝子の網膜中での変動を検証した。

【0296】

マイクロスフェア懸濁液５０ｕＬを白ウサギ（オリエンタル酵母株式会社、Ｋｂｌ：ＮＺＷ、雄性、８週齢）に硝子体内投与した。投与量は、マイクロスフェアとして８１０ｕｇ、本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）として８１ｕｇであった。抽出用キット（キアゲン社製、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ、カタログ番号７４１０６）を用いて、安楽死後のウサギから採材した網膜からｍＲＮＡを回収した。得られたｍＲＮＡから、ｃＤＮＡ合成キット（ＧＥヘルスケアライフサイエンス社製、Ｆｉｒｓｔ−ＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ）を用いてｃＤＮＡを作製した。得られたｃＤＮＡを試薬（アプライドバイオシステム社製、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＭａｓｔｅｒＭｉｘ（カタログ番号４３６９０１６））とプローブを用いて増幅させ、リアルタイム定量ＰＣＲをおこなった（アプライドバイオシステムズ社製、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲＨＴ７９００を使用）。硝子体内投与をしていない網膜でのＮｑｏ１遺伝子発現量を１とした時の変動を表１６に示す。下記表１６に示す数値は、２眼の平均値を示す。

【0297】

（表１６）
表１６．Ｎｑｏ１遺伝子の網膜内変動

日数ＰＬＡ−０００５ＰＬＡ−００２０
０．２５２．０１２．０５
１４．３９２．４７
７２．０８１．８９
１７１．２９１．５８
２４１．４７１．９１
２８１．５２２．０４
試験例３で、テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）の含有率が高く維持されることが確認されたＰＬＡ−００２０を基材とするほうが、ＰＬＡ−０００５を基材とするよりも、Ｎｒｆ２標的遺伝子が強く誘導されることがわかった。

【0298】

（試験例７）含有率変更時のウサギ網膜遺伝子に対するテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）マイクロスフェアの作用
マイクロスフェアに含有される化合物の割合を変化させて、Ｎｒｆ２標的遺伝子としてＮｑｏ１遺伝子の網膜中での変動を検証した。本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）・ＰＬＧＡ−５０２０［基材としてＰＬＧＡ−５０２０を使用し、本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）とＰＬＡ−０００５の混合比を１：９（１０重量％）あるいは３：７（３０重量％）として製造］を製造した。それぞれを用いて、溶媒は生理食塩液とし、テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）として３ｍＭとなるように懸濁液を調製した。この懸濁液５０ｕＬ中には、テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）が８１ｕｇ含まれることになる。

【0299】

この懸濁液５０ｕＬを白ウサギ（オリエンタル酵母株式会社、Ｋｂｌ：ＮＺＷ、雄性、８週齢）に硝子体内投与した。硝子体内投与後にウサギを安楽死させ、ウサギ網膜を採材し、リアルタイム定量ＰＣＲを行なって求めたＮｑｏ１遺伝子の網膜内変動を表１７に示す。下記表１７に示す数値は、４眼の平均値と標準誤差を示す。

【0300】

（表１７）
表１７．Ｎｑｏ１遺伝子の網膜内変動

時間１０重量％３０重量％
０１．０±０．０１．０±０．０
３１．３±０．６１．５±０．６
６１．８±０．４２．９±０．１
２４２．１±０．４１．４±０．３
テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）の含有率が高い医薬組成物でもＮｒｆ２標的遺伝子が誘導されることがわかった。

【0301】

また、硝子体液中でのテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）の濃度を表１８に示す。下記表１８に示す数値は、４眼の平均値と標準誤差を示す。

【0302】

（表１８）
表１８．本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）の硝子体内濃度（ｎＭ）

時間１０重量％３０重量％
００±００±０
３２１３±１５６１５２±１１１
６２２０±１６３４４０±４３８
２４５７±２７３７±４１。

【0303】

（試験例８）薬効発現に必要な濃度の算出
本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）を有効成分とする徐放性医薬組成物を硝子体に局所投与した際、薬効発現に必要な薬効濃度について検討を行った。Ｎｒｆ２の標的遺伝子であるＮｑｏ１は、その活性を２倍に誘導する濃度が指標として用いられている（ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ１９８８；１６９：３２８−）。これに倣い、ｉｎｖｉｖｏ網膜内でＮｒｆ２の標的遺伝子Ｈｍｏｘ１を２倍に誘導するテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）の濃度を指標として、ヒトでの薬物動態を検討した。

【0304】

本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）を１０重量％含み、基材としてＰＬＡ−００２０を用いて製造した徐放性医薬組成物を硝子体内投与した際の経時的なＨｍｏｘ１の誘導結果を表１９に示す。

【0305】

（表１９）
表１９．ＰＬＡ−００２０を基材するテルペノイド（ＩＩＩ）組成物（マイクロスフェア）硝子体内投与時のＮｑｏ１遺伝子の網膜内変動推移

日数ＰＬＡ−００２０
０．２５６．８９
１１１．２
７２．０８
１７１．８７
２４２．３５
２８１．９５。

【0306】

これより、当該徐放性医薬組成物の投与から２８日間、すなわち約１ヶ月間、約２倍以上のＨｍｏｘ１の誘導が維持されたことがわかる。

【0307】

次に、これらの誘導倍率を示すために必要な標的組織(網膜)中の薬物濃度について検討した。当該徐放性医薬組成物を硝子体内投与した際の網膜中薬物濃度推移を表２０に示す。

【0308】

（表２０）
表２０．テルペノイド誘導体（ＩＩＩ）の網膜内濃度（ｎＭ）

日数ＰＬＡ−００２０
０．２５１．５６
１９．４８
１７０．４６
２４０．２４
２８０．０７。

【0309】

このように、２倍以上のＨｍｏｘ１の誘導は本試験時において投与後２８日間、すなわち約１ヵ月後までの全ての時間で満足した。よって、本試験における最小網膜内薬物濃度、すなわち投与１ヵ月後の網膜内濃度（表１４から０．０７μＭ）以上であれば、薬効発現に必要なＨｍｏｘ１の誘導が得られることがわかった。

【0310】

１ヶ月間Ｈｍｏｘ１遺伝子を２倍誘導するために必要な投与量は、表１３より、本試験例で投与されたマイクロスフェア中薬物量である、８１μｇ／ｂｏｄｙであることが確認された。

【0311】

次に、本結果からヒトへの薬物投与量を予測した。硝子体内の容量はヒトで４ｍＬ、ウサギで１．５〜２．５ｍＬである（ＩｎｖｅｓｔＯｐｈｔｈａｌｍｏｌＶｉｓＳｃｉ２００７；４８：２２３０−）。よって、この約２倍の容量比で補正することにより、ウサギ硝子体内の薬物濃度からヒトへの外挿が可能と考えられる。表１３のデータを取得したときの薬物投与量８１μｇ／ｂｏｄｙ（ウサギ）であることから、臨床での望ましい薬効持続期間を１ヶ月とすると、必要な薬物投与量は、１６２μｇ／ｂｏｄｙと計算される。一方、ロッド状インプラント医薬組成物として製品化されているＯｚｕｄｅｘ（Ｒ）の薬物含有量は７００μｇである。（ＩｎｖｅｓｔＯｐｈｔｈａｌｍｏｌＶｉｓＳｃｉ２００１１；５２：８０−）。以上より、本発明のテルペノイド誘導体（ＩＩＩ）有効成分とする医薬組成物により、臨床で薬理効果を発現する薬物量を投与できると予測された。

【受託番号】

【0312】

ＮＩＴＥＢＰ−０１９１４
ＮＩＴＥＢＰ−０１９１５
ＮＩＴＥＢＰ−０１９１６

【配列表フリーテキスト】

【0313】

配列番号１：ＳＡＮＫ７０２１４の１６ＳｒＤＮＡの部分塩基配列
配列番号２：ＳＡＮＫ７０３１４の１６ＳｒＤＮＡの部分塩基配列
配列番号３：ＳＡＮＫ７０２１４の水酸化活性を有するタンパク質のＤＮＡ配列
配列番号４：ＳＡＮＫ７０３１４の水酸化活性を有するタンパク質のＤＮＡ配列
配列番号５：ＳＡＮＫ７０２１４株の水酸化活性を有するタンパク質のアミノ酸配列
配列番号６：ＳＡＮＫ７０３１４株の水酸化活性を有するタンパク質のアミノ酸配列

【図1】