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特許6644479がん治療のための併用療法としてのエリブリンとＳ−１（もしくは５−ＦＵ）の使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6644479
(24)【登録日】2020年1月10日
(45)【発行日】2020年2月12日
(54)【発明の名称】がん治療のための併用療法としてのエリブリンとＳ−１（もしくは５−ＦＵ）の使用
(51)【国際特許分類】
A61K 31/513 20060101AFI20200130BHJP
A61K 31/357 20060101ALI20200130BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20200130BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20200130BHJP
【ＦＩ】
A61K31/513
A61K31/357
A61P35/00
A61P43/00 121
A61P43/00 123
【請求項の数】26
【全頁数】20
(21)【出願番号】特願2015-104236(P2015-104236)
(22)【出願日】2015年5月22日
(65)【公開番号】特開2016-8215(P2016-8215A)
(43)【公開日】2016年1月18日
【審査請求日】2018年5月22日
(31)【優先権主張番号】62/016,241
(32)【優先日】2014年6月24日
(33)【優先権主張国】US
(73)【特許権者】
【識別番号】506137147
【氏名又は名称】エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社
(73)【特許権者】
【識別番号】000125347
【氏名又は名称】学校法人近畿大学
(74)【代理人】
【識別番号】100087642
【弁理士】
【氏名又は名称】古谷 聡
(74)【代理人】
【識別番号】100082946
【弁理士】
【氏名又は名称】大西 昭広
(74)【代理人】
【識別番号】100121061
【弁理士】
【氏名又は名称】西山 清春
(74)【代理人】
【識別番号】100195693
【弁理士】
【氏名又は名称】細井 玲
(72)【発明者】
【氏名】西尾 和人
(72)【発明者】
【氏名】寺嶋 雅人
(72)【発明者】
【氏名】坂井 和子
【審査官】
新熊 忠信
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第２０１４／０８７２３０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２０１３／１３７４３３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
北関東医学，２０１４年 ５月 １日，Vol.64, No.2，p.223-231
【文献】
British Journal of Cancer，２０１４年 ２月２５日，Vol.110，p.1497-1505
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ａ６１Ｋ ３１／００−３３／４４
Ａ６１Ｐ ３５／００
Ａ６１Ｐ ４３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
がんが進行するリスクを持つ対象を治療する際に使用するキットであって、キットが（ｉ）エリブリンもしくはそれらの医薬的に許容可能な塩、ならびに（ｉｉ）Ｓ−１もしくは５−ＦＵを含む、対象へと投与するためのキット。
【請求項2】
前記対象がヒトの患者である、請求項１に記載のキット。
【請求項3】
前記対象ががんと診断されているか、がんの治療中であるか、またはがんの治療後の回復期にある、請求項１もしくは２に記載のキット。
【請求項4】
前記がんが原発腫瘍である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項5】
前記がんが転移したものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項6】
前記がんが固形腫瘍である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項7】
前記がんが、乳がん、肺がん、卵巣がん、子宮内膜がん、胃がん、直腸がん、頭頸部がん、および膵がんからなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項8】
前記がんが乳がんである、請求項７に記載のキット。
【請求項9】
前記乳がんがトリプルネガティブ乳がんである、請求項８に記載のキット。
【請求項10】
前記がんがＥＭＴ陽性がんである、請求項１〜９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項11】
エリブリンの医薬的に許容可能な塩がエリブリンメシラートである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項12】
前記エリブリンもしくはそれらの医薬的に許容可能な塩が、静脈内注入によって投与される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項13】
前記静脈内注入が約１〜約２０分間である、請求項１２に記載のキット。
【請求項14】
前記静脈内注入が約２〜約５分間である、請求項１３に記載のキット。
【請求項15】
前記エリブリンもしくはそれらの医薬的に許容可能な塩が、約０．１ｍｇ／ｍ２〜約２０ｍｇ／ｍ２の範囲の量で投与される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項16】
前記エリブリンもしくはそれらの医薬的に許容可能な塩が、約１．１ｍｇ／ｍ２〜約１．４ｍｇ／ｍ２の範囲の量で投与される、請求項１５に記載のキット。
【請求項17】
前記エリブリンもしくはそれらの医薬的に許容可能な塩が、２１日のサイクルの１日目と８日目のそれぞれにおいて１回投与される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項18】
前記Ｓ−１が経口投与される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項19】
前記Ｓ−１が約５〜８０ｍｇ／ｍ２の範囲の量で投与される、請求項１８に記載のキット。
【請求項20】
前記Ｓ−１が約２５ｍｇ／ｍ２の量で投与される請求項１９に記載のキット。
【請求項21】
前記Ｓ−１が、２１日間、１日に２回投与される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項22】
前記エリブリンもしくはそれらの医薬的に許容可能な塩、ならびに前記Ｓ−１もしくは５−ＦＵが、実質的に同時に、もしくは連続的に投与される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項23】
前記エリブリンもしくはそれらの医薬的に許容可能な塩が前記Ｓ−１もしくは５−ＦＵより前に投与される、請求項２２に記載のキット。
【請求項24】
前記エリブリンもしくはそれらの医薬的に許容可能な塩、ならびにＳ−１もしくは５−ＦＵが単一の抗がん剤として投与される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項25】
前記治療が、（ｉ）がん細胞の数を減らし、（ｉｉ）腫瘍体積を減らし、（ｉｉｉ）腫瘍縮小率を増加させ、（ｉｖ）末梢器官へのがん細胞浸潤を減らすかもしくは遅らせ、（ｖ）腫瘍転移を減らすかもしくは遅らせ、（ｖｉ）腫瘍増殖を減らすかもしくは妨げ、（ｖｉｉ）がんの発生および／もしくはがんの再発を妨げるかもしくは遅らせ、ならびに／または無病生存時間もしくは腫瘍のない生存期間を延長させ、（ｖｉｉｉ）全体の生存期間を増加させ、（ｉｘ）治療の頻度を減らし、ならびに／または（ｘ）がんに関連した一つもしくはそれ以上の病状を緩和する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項26】
前記（ｉ）エリブリンもしくはそれらの医薬的に許容可能な塩、ならびに（ｉｉ）Ｓ−１もしくは５−ＦＵが剤形とされている、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
がんは、特定の型の細胞による制御されない増殖によってそれぞれが特徴付けられるような、広範囲の疾患を記載するために使用される用語である。それは、そのような細胞を含む組織において始まり、そして診断時にがんが追加の組織のいずれに対しても拡散していない場合、例えば、外科手術、放射線治療、もしくは他の型の局所治療によって治療できる可能性がある。しかしながら、がんがその元の組織から転移したという証拠があるとき、治療のための異なるアプローチが典型的に適用される。実際、転移の度合いを確実性をもって決定するのが不可能であるため、いずれかの転移の証拠を検出した場合には、通常、治療に対する全身的なアプローチが企てられる。これらのアプローチは、がん細胞のような急速に分裂する細胞の増殖を阻害するような、化学療法薬の投与を含み得る。他のアプローチは、患者におけるがん性細胞に対する免疫反応が誘発されるか、または強化されるような、免疫療法の使用を含む。
【0002】
ハリコンドリンＢは、最初にカイメンＨａｌｉｃｈｏｎｄｒｉａ ｏｋａｄａｉより単離され、続けてＡｘｉｎｅｌｌａ ｓｐ．、Ｐｈａｋｅｌｌｉａ ｃａｒｔｅｒｉ、およびＬｉｓｓｏｄｅｎｄｏｒｙｘ ｓｐ．において見出された構造的に複雑な大環状化合物である。ハリコンドリンＢの完全な合成は１９９２年に刊行された（Ａｉｃｈｅｒらによる、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：３１６２〜３１６４、１９９２年）。ハリコンドリンＢは、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において、チューブリンの重合化、微小管重合、ベータＳ−チューブリンの架橋結合、ＧＴＰとビンブラスチンとのチューブリンへの結合、およびチューブリン依存性のＧＴＰ加水分解を阻害することが見出された。この分子はまた、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）とインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）において、抗がんの性質を持つことが示された。抗がん活性を持つハリコンドリンＢ類似体は米国特許６，２１４，８６５Ｂ１に記載される。
【0003】
エリブリンはハリコンドリンＢの合成類似化合物である。エリブリンはまた、ＥＲ−０８６５２６としても知られ、ＣＡＳ番号２５３１２８−４１−５と米国国立がん研究所の識別番号ＮＳＣ−７０７３８９とが割り当てられている。エリブリンのメシル酸塩（エリブリンメシラート。ハラヴェン（ＨＡＬＡＶＥＮ）（登録商標）の商品名により市販され、Ｅ７３８９としてもまた知られている）は、アジュバントの環境もしくは転移性の環境のいずれかにおけるアントラサイクリンおよびタキサンを含む必要がある、転移性疾患治療のための少なくとも２種類の化学療法投与計画を以前は受けていたような転移性乳がんの患者に対する治療について、２０１０年１１月にＦＤＡによる認可を受けた。
【0004】
エリブリンメシラートの化学名は、１１，１５：１８，２１：２４，２８−トリエポキシ−７，９−エタノ−１２，１５−メタノ−９Ｈ，１５Ｈ−フロ［３，２−ｉ］フロ［２’，３’：５，６］ピラノ［４，３−ｂ］［１，４］ジオキサシクロペンタコシン−５（４Ｈ）−オン，２−［（２Ｓ）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル］ヘキサコサヒドロ−３−メトキシ−２６−メチル−２０，２７−ビス（メチレン）−，（２Ｒ，３Ｒ，３ａＳ，７Ｒ，８ａＳ，９Ｓ，１０ａＲ，１１Ｓ，１２Ｒ，１３ａＲ，１３ｂＳ，１５Ｓ，１８Ｓ，２１Ｓ，２４Ｓ，２６Ｒ，２８Ｒ，２９ａＳ）−メタンスルホナート（塩）であり、以下のように描写し得る。【化1】
【0005】
Ｓ−１（日本国東京の大鵬薬品工業株式会社）は、１−（２−テトラヒドロフリル）−５−フルオロウラシル（テガフール、５−フルオロウラシル［５−ＦＵ］のプロドラッグ）からなる経口薬であるフルオロピリミジン誘導体であり、５−クロロ−２，４−ジヒドロキシピリミジン（ギメラシル）とオキソン酸カリウム（オテラシル）（Ｓｈｉｒａｓａｋａら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ，１９９６年、７（５）５４８〜５５７ページ）との２つの５−ＦＵ活性の調整剤と混合されている。Ｓ−１は、アジアとヨーロッパの多くの国において、胃がんの治療のためとして承認され（Ｓａｔｏｈら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ、２０１２年、１３（１３）１９４３〜１９５９ページ）、日本においては、いくつかの他のがんの治療のためとして承認されている（Ｓｈｉｒａｋａｔａ、Ｊｐｎ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ、２００９年、３９（１）２〜１５ページ）。フェーズＩＩ臨床試験において、Ｓ−１単剤療法は、転移性乳がんにおける耐性を持った毒性に対し高い有効性を示した（Ｓａｅｋら、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ、２００４年、１１（２）１９４〜２０２ページ）。さらに、日本乳がん学会の年次総会（２０１２年）において、Ｓ−１による１２ヶ月の追加の治療が、アントラサイクリンおよびタキサンによってあらかじめ治療されていたトリプルネガティブ乳がん（Ｔｒｉｐｌｅ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ：ＴＮＢＣ）の患者に対して、許容され得ることが報告された。Ｓ−１の成分の構造は、以下に示される。【化2】
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、エリブリンメシラートとＳ−１との併用が改善された（例えば相加的であるものや相乗的であるような）抗がん効果を示すという観察に基づく。それゆえ、本発明は、エリブリン（例えばエリブリンメシラート）とＳ−１（もしくは５−フルオロウラシル；５−ＦＵ）の併用によってがんを予防する方法およびがんを治療する方法によって特徴付けられる。用語「エリブリン」が本明細書において使用されるとき、文脈が他を示さない限り、エリブリンもしくはそれらの医薬的に許容可能な塩を指すものとして考えられるべきである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は、がんを持つか、またはがん進展のリスクのある対象（例えばヒトの患者）を治療する方法を提供する。該方法は、対象に、（ｉ）エリブリンもしくはそれらの医薬的に許容可能な塩（例えばエリブリンメシラート）を投与すること、ならびに（ｉｉ）Ｓ−１もしくは５−ＦＵを投与することを含む。
【0008】
対象はがんと診断されていてもよいし、がんの治療中であってもよいし、またがんの治療後の回復時であってもよい。がんは、任意選択で、原発腫瘍、転移、および／もしくは固形腫瘍であってよい。
【0009】
がんは、例えば乳がん（例えばトリプルネガティブ乳がん）、肺がん、卵巣がん、子宮内膜がん、胃がん、直腸がん、頭頸部がん、もしくは膵がんであってよく、任意選択でＥＭＴ−陽性がんであってもよい。
【0010】
エリブリンもしくはそれらの医薬的に許容可能な塩（例えばエリブリンメシラート）は、静脈内注入（例えば約２分間〜約５分間のような約１分間〜約２０分間）によって投与されてもよく、および／もしくは約０．１ｍｇ／ｍ２〜約２０ｍｇ／ｍ２（例えば１．１ｍｇ／ｍ２もしくは１．４ｍｇ／ｍ２）の範囲の量で投与されてもく、任意選択で２１日のサイクルの第１日目と第８日目のそれぞれの日に一度だけであってよい。
【0011】
Ｓ−１は、経口投与されてもよく、例えば約５〜８０ｍｇ／ｍ２の範囲の量（例えば約２５ｍｇ／ｍ２）であってよく、任意選択で２１日間に毎日２回であってよい。
【0012】
ある例において、エリブリンもしくはそれらの医薬的に許容可能な塩（例えばエリブリンメシラート）は、ならびにＳ−１（もしくは５−ＦＵ）は、実質的に同時に投与されるか、または連続的に投与され、他の例において、エリブリンもしくはそれらの医薬的に許容可能な塩（例えばエリブリンメシラート）は、Ｓ−１（もしくは５−ＦＵ）の投与前に投与されてもよい。
【0013】
さまざまな例において、エリブリンもしくはそれらの医薬的に許容可能な塩（例えばエリブリンメシラート）、およびＳ−１（もしくは５−ＦＵ）は、単一の抗がん剤として投与される。
【0014】
本発明の方法による治療は、（ｉ）がん細胞の数を減らし、（ｉｉ）腫瘍体積を減らし、（ｉｉｉ）腫瘍縮小率を増加させ、（ｉｖ）末梢器官へのがん細胞浸潤を減らすかもしくは遅らせ、（ｖ）腫瘍転移を減らすかもしくは遅らせ、（ｖｉ）腫瘍増殖を減らすかもしくは妨げ、（ｖｉｉ）がんの発生および／もしくはがんの再発を妨げるかもしくは遅らせ、ならびに／または無病生存時間もしくは腫瘍のない生存期間を延長させ、（ｖｉｉｉ）全体の生存期間を増加させ、（ｉｘ）治療の頻度を減らし、ならびに／または（ｘ）がんに関連した一つもしくはそれ以上の病状を緩和する。
【0015】
本発明はまた、対象（例えばヒトの患者）中の腫瘍（例えば本明細書中に列挙されるがん種を参照）のサイズを減少するための方法を含む。これらの方法は、対象に、（ｉ）エリブリンもしくはそれらの医薬的に許容可能な塩（例えばエリブリンメシラート）を投与することならびに（ｉｉ）Ｓ−１もしくは５−ＦＵを投与することを含む。これらの方法は、例えば、本明細書に記載される、薬剤の量および／もしくは投与計画の任意のものを使用して実施できる。
【0016】
本発明はまた、がん治療において使用するかもしくは腫瘍（例えば本明細書中に列挙されるがん種を参照）のサイズを減らすのに使用するためのキットを提供する。本発明のキットは、任意選択で剤形である、（ｉ）エリブリンもしくはそれらの医薬的に許容可能な塩（例えばエリブリンメシラート）、ならびに（ｉｉ）Ｓ−１もしくは５−ＦＵを含む。
【0017】
本発明の方法は、改善されたがんに対する効果を提供する。例えば、本明細書に記載される併用治療法は、例えば、当業者によって決定されるように、その効果が、個別に投与された薬剤の効果の合計よりも大きいような効果であるような相乗効果を得るのに利用できる。相加効果もまた有利である。
【0018】
本発明の他の特徴および利点もまた、以下の詳細な記載、図、および請求項から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1A】図１Ａは、５−ＦＵとエリブリンとの併用による４つのＴＮＢＣ細胞株への効果を示す。図１Ａは、ＴＮＢＣ細胞株に対する、５−ＦＵとエリブリンとの併用による７２時間の曝露のあとの増殖阻害効果を示す一連のグラフである。
【図1B】図１Ｂは、５−ＦＵとエリブリンとの併用による４つのＴＮＢＣ細胞株への効果を示す。図１Ｂは、正規化されたアイソボログラム解析を示す一連のグラフである。対角線は相加効果の直線である。実験の測定点はこの直線より下部、直線上、もしくは直線より上部に配置される点により表され、それぞれ相乗効果、相加効果、および拮抗作用を示す。直線の下の点および直線の左側の点は、相乗効果を示す。
【図2A-2E】図２Ａ〜Ｅは、ＴＧＦ−βへの５日間の曝露の後に、ＴＧＦ−βがＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞中にＥＭＴを誘導し、５−ＦＵへの感受性を減らすことを示す。図２Ａは、２．５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−βへの曝露の後のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の形態変化を示す一連の画像である。図２Ｂは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて測定されたＥ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、ビメンチン、およびＳｎａｉｌ２のｍＲＮＡの発現レベルを示すグラフである。ＧＡＰＤＨは、発現レベルを標準化するのに使用された。データは、３回の独立した実験の平均値±標準偏差を表す。対照に対して*Ｐ＜０．０５であった。図２Ｃは、Ｅ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、ビメンチンおよびＳｎａｉｌ２のウェスタンブロット解析を示す。β−アクチンが内部標準として用いられた。図２Ｄは、Ｅ−カドヘリンとビメンチンの免疫蛍光染色を示す。核がＤＡＰＩ処理により青色で示された。図２Ｅは、ＴＧＦ−β曝露されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞とＴＧＦ−β曝露されていないＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞とにおける５−ＦＵの細胞増殖阻害曲線を示すグラフである。
【図3A-3D】図３Ａ〜３Ｄは、５−ＦＵが、５日間の曝露の後に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞にＥＭＴを誘導することを示す。図３Ａは、１μＭ、３μＭ、もしくは１０μＭの５−ＦＵへの曝露の後のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における形態変化を示す一連の画像である。図３Ｂは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて測定された、Ｅ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、ビメンチン、およびＳｎａｉｌ２のｍＲＮＡ発現レベルを示す一連のグラフである。ＧＡＰＤＨが、発現レベルを標準化するために用いられた。示されるデータは３回の独立した実験の平均±ＳＤを表す。対照に対して*Ｐ＜０．０５であった。図３Ｃは、Ｅ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、ビメンチンおよびＳｎａｉｌ２のウェスタンブロット解析を示す。β−アクチンが内部標準として用いられた。図３Ｄは、Ｅ−カドヘリンとビメンチンの免疫蛍光染色を示す。核がＤＡＰＩ処理により青色で示された。
【図4A-4D】図４Ａ〜４Ｄは、エリブリンが、８日間の曝露の後に、ＭＸ−１細胞にＭＥＴを誘導することを示す。図４Ａは、１ｎＭ、３ｎＭ、もしくは１０ｎＭのエリブリンへの曝露の後のＭＸ−１細胞における形態変化を示す一連の画像である。図４Ｂは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて測定された、Ｅ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、ビメンチン、およびＳｎａｉｌ２のｍＲＮＡ発現レベルを示す一連のグラフである。ＧＡＰＤＨが、発現レベルを標準化するために用いられた。示されるデータは３回の独立した実験の平均±ＳＤを表す。対照に対して*Ｐ＜０．０５であった。図４Ｃは、Ｅ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、ビメンチンおよびＳｎａｉｌ２のウェスタンブロット解析を示す。β−アクチンが内部標準として用いられた。図４Ｄは、Ｅ−カドヘリン（赤色）とビメンチン（赤色）の免疫蛍光染色を示す。核がＤＡＰＩ処理により青色で示された。
【図5A-5D】図５Ａ〜５Ｄは、５−ＦＵによってＥＭＴ変化が誘導されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞においてエリブリンがＭＥＴを誘導することを示す。図５Ａは、５日間の５−ＦＵ処理と、さらに３日間のエリブリン処理の後のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における形態変化を示す一連の画像である。図５Ｂは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて測定された、Ｅ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、ビメンチン、およびＳｎａｉｌ２のｍＲＮＡ発現レベルを示す一連のグラフである。ＧＡＰＤＨが、発現レベルを標準化するために用いられた。示されるデータは３回の独立した実験の平均±ＳＤを表す。対照に対して*Ｐ＜０．０５であった。図５Ｃは、Ｅ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、ビメンチンおよびＳｎａｉｌ２のウェスタンブロット解析を示す。β−アクチンが内部標準として用いられた。図５Ｄは、Ｅ−カドヘリン（赤色）とビメンチン（赤色）の免疫蛍光染色を示す。核がＤＡＰＩ処理により青色で示された。
【発明を実施するための形態】
【0020】
本発明は、エリブリンもしくはそれらの医薬的に許容可能な塩（例えばエリブリンメシラート）ならびにＳ−１（もしくは５−ＦＵ）の投与による、がんの予防およびがんの治療において使用する方法およびキットを提供する。本発明の方法によるエリブリンもしくはそれらの医薬的に許容可能な塩（例えばエリブリンメシラート）ならびにＳ−１（もしくは５−ＦＵ）の投与によるがんの治療は、（ｉ）がん細胞の数を減らし、（ｉｉ）腫瘍体積を減らし、（ｉｉｉ）腫瘍縮小率を増加させ、（ｉｖ）末梢器官へのがん細胞浸潤を減らすかもしくは遅らせ、（ｖ）腫瘍転移を減らすかもしくは遅らせ、（ｖｉ）腫瘍増殖を減らすかもしくは妨げ、（ｖｉｉ）がんの発生および／もしくはがんの再発を妨げるかもしくは遅らせ、ならびに／または無病生存時間もしくは腫瘍のない生存期間を延長させ、（ｖｉｉｉ）全体の生存期間を増加させ、（ｉｘ）治療の頻度を減らし、ならびに／または（ｘ）がんに関連した一つもしくはそれ以上の病状を緩和することができる。
【0021】
医薬組成物、投与量および方法エリブリンの合成方法は、例えば、米国特許第６，２１４，８６５号、米国特許第７，９８２，０６０号、米国特許第８，３５０，０６７号、および米国特許第８，０９３，４１０号に記載され、それらの各々は参照により本明細書に組み入れられる。上述のようにエリブリンメシラートは、市販され、ハラベン（ＨＡＬＡＶＥＮ、登録商標）として流通している。Ｓ−１（日本国東京の大鵬薬品工業株式会社）は、３つの有効成分：（ｉ）吸収後抗がん性物質５−ＦＵへと転換されるテガフール；（ｉｉ）生体による５−ＦＵの分解を防ぐ、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（ＤＰＤ）の阻害剤であるギメラシル；ならびに（ｉｉｉ）通常の消化管粘膜において５−ＦＵの活性を減少させる、オロテートホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＯＰＲＴ）阻害剤であるオテラシルの組み合わせである。Ｓ−１は、アジアおよび欧州においてはＴＥＹＳＵＮＯ（商標）として流通している。
【0022】
上述のように、本発明において、エリブリンは、任意選択で塩形態として使用することができる。使用される塩については特別な制限はなく、無機酸塩であっても有機酸塩であってもよい。例えば、塩は、メシル酸塩（例えばエリブリンメシラート）、塩酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、縮合リン酸塩（スーパーリン酸塩）、イソニコチン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酒石酸塩、パントテン酸塩、アスコルビン酸塩、琥珀酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、パモ酸塩（パモアート）などから選択され得る。さらに、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、ナトリウム、亜鉛、およびジエタノールアミンの塩を使用することも許容可能である。
【0023】
エリブリンおよびＳ−１（もしくは５−ＦＵ）を含む医薬組成物は、当技術分野（例えば上述の特許文献を参照できる）に公知の標準的な方法を用いて調製できる。典型的には、本発明において使用されるエリブリンおよびＳ−１（５−ＦＵ）は、別個の医薬組成物中に含まれるが、それらは、任意選択で単一の組成物中に含まれていてもよい。エリブリンおよび５−ＦＵは、典型的には、静脈内投与のための液体の形態で提供されるが、一方でＳ−１は、典型的には、経口投与のためのカプセルの形態で提供される。
【0024】
本発明において使用される医薬組成物は、例えば、所望の度合いの純度を持つ活性成分を、生理学的に許容可能な希釈剤、担体、賦形剤もしくは安定化剤（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎの「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第２０版）Ａ． Ｇｅｎｎａｒｏ編集、２０００年、ペンシルバニア州フィラデルフィア、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンスを参照）の中で混合するか、または溶解することによって調製できる。許容可能な希釈剤は、リン酸、クエン酸もしくは他の有機酸のような緩衝液、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、アスコルビン酸などの抗酸化剤、低分子（約１０残基未満）ポリペプチド、アルブミン、ゼラチンもしくはイムノグロブリンのようなたんぱく質、ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシンのようなアミノ酸、単糖類、二糖類もしくは、グルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む他の炭水化物、ＥＤＴＡのようなキレート剤、マンニトールもしくはソルビトールのような糖アルコール、ナトリウムのような塩形成対イオン、ならびに／もしくはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）のような界面活性剤、またはＰＥＧを任意選択で含む、水および生理食塩水を含む。
【0025】
上述の（および他の）製剤は、薬剤の非経口投与に用いることができる。このように、薬剤は静脈内、腫瘍内、腫瘍周縁、動脈内、皮内、膀胱内、眼内、筋肉内、皮内、腹腔内、肺、皮下および経皮の経路を含む経路によって投与できる。例えば、経粘膜、経皮、吸入、膣内、直腸、および経口の投与のような他の経路もまた使用できる。
【0026】
経口投与の形態のための組成物（例えばＳ−１を含む組成物）の調製において、例えば、水、グリコール、オイル、アルコール、香味剤、保存剤、着色剤のような通常の医薬のための媒体の任意のものを使用できる。さらに、例えば散剤、カプセル剤、および錠剤のような経口固体製剤の場合に、スターチ、砂糖、微結晶性セルロース、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤などのような担体もまた使用できる。具体例において、Ｓ−１の製剤においての使用のためのカプセル剤は、Ｓ−１ラクトース一水和物およびステアリン酸マグネシウムに加えて、ゼラチン、二酸化チタン（Ｅ１７１）、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクを含有するシェルより形成され得る。さらなる例として、Ｓ−１は、それぞれ２０ｍｇのテガフール、５．８ｍｇのギメラシル、および１５．８ｍｇのオテラシル（１９．６ｍｇのオテラシル一カリウムとして）、ならびに９３．６ｍｇのラクトース一水和物を含む硬カプセル剤へと製剤できる。この例における活性成分のモル比は１：０．４：１である。
【0027】
任意選択で、本発明の製剤は、医薬的に許容可能な保存剤を含む。ある実施態様において、保存剤の濃度は、０．１〜２．０％（典型的にｖ／ｖ）の範囲である。好適な保存剤は、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベンおよびプロピルパラベンのような医薬の技術分野において公知のものを含む。さらに、エリブリンおよび／もしくはＳ−１（もしくは５−ＦＵ）製剤は、任意選択で塩化ナトリウムのような医薬的に許容可能な塩を、例えば、生理学的な濃度で含み得る。このように、一例において、エリブリン（例えばエリブリンメシラート）は、０．９％塩化ナトリウム注射（ＵＳＰ）中に配合される。
【0028】
本発明の方法によって投与されるエリブリンとＳ−１（もしくは５−ＦＵ）との組成物の投与量は、対象となる疾患の型、送達方法の選択、患者の年齢、性別および体重、症状の重症度、ならびに他の要素に応じて著しく異なり得る。
【0029】
エリブリン（例えばエリブリンメシラート）の毎日の投与量は、例えば０．００１ｍｇ／ｍ２〜約１００ｍｇ／ｍ２の範囲（例えば約０．１ｍｇ／ｍ２〜５０ｍｇ／ｍ２の範囲、もしくは約０．７ｍｇ／ｍ２〜約１．５ｍｇ／ｍ２の範囲、またはこれらの範囲内の任意の単一の量で（例えば１．４ｍｇ／ｍ２もしくは１．１ｍｇ／ｍ２））であってよい。エリブリンは、１日に１回、１週に１回、１月に１回、１年に１回で投与できるし、または１日に１回以上、１週に１回以上、１月に１回以上、１年に１回以上のエリブリンが投与されてもよい。例えば、一つの投与プロトコールにおいて、エリブリンは、２１日間のサイクルの１日目と８日目のそれぞれにおいて１回投与できる。より詳細には、エリブリン（例えばエリブリンメシラート）の推奨される投与量は、２１日間のサイクルの１日目と８日目における、２〜５分間にわたる１．４ｍｇ／ｍ２の静脈内投与である。軽度の肝障害（チャイルドピューＡ）の患者におけるエリブリン（例えばエリブリンメシラート）の推奨される投与量は、２１日間のサイクルの１日目と８日目における、２〜５分間にわたる１．１ｍｇ／ｍ２の静脈内投与であり、一方で、中等度の肝障害（チャイルドピューＢ）の患者におけるエリブリン（例えばエリブリンメシラート）の推奨される投与量は、２１日間のサイクルの１日目と８日目における、２〜５分間にわたる０．７ｍｇ／ｍ２の静脈内投与である。さらに、中等度の腎機能障害（３０〜５０ｍｌ／分のクレアチニンクリアランス）の患者におけるエリブリン（例えばエリブリンメシラート）の推奨される投与量は、２１日間のサイクルの１日目と８日目における、２〜５分間にわたる１．１ｍｇ／ｍ２の静脈内投与である。エリブリン（例えばエリブリンメシラート）のこれらの投与量もしくは他のより少ない投与量は、本発明の方法による併用療法の前後関係において任意選択で使用できる。
【0030】
Ｓ−１を、当技術分野における標準的なアプローチと投与計画とに従って投与することができる。Ｓ−１は、例えば、単一の投与量で、もしくは分割された投与量で、約５〜８０ｍｇ／ｍ２の範囲で１日当たり１回もしくは２回（例えば１０〜５０、１５〜４０、もしくは２０〜２５ｍｇ／ｍ２で１日当たり１回もしくは２回）で経口投与され得る。Ｓ−１は、１日に１回、１週に１回、１月に１回、１年に１回で投与できるし、または１日に１回以上、１週に１回以上、１月に１回以上、１年に１回以上のＳ−１が投与されてもよい。例えば、１回の投与プロトコールにおいて、Ｓ−１は、エリブリンによる治療（上述を参照）の最中に毎日２回投与でき、そして任意選択で、Ｓ−１投与はエリブリン治療計画を超えて継続できる。他の実施態様において、Ｓ−１は、２回目および後の投与量が、第１回および先行する投与量と比較して減少するような減少する段階的投与量で投与できる。例えば、Ｓ−１は、２１日の連続した日のあいだ、１日に２回（例えば朝と夜）、５〜８０ｍｇ／ｍ２の範囲（例えば、１０〜５０、１５〜４０もしくは２０〜２５ｍｇ／ｍ２）（テガフール含量で表される）で投与され、７日間の残りの日が続く（１回の治療サイクル）。この治療サイクルは４週ごとに繰り返し得る。
【0031】
５−ＦＵを、当技術分野における標準的なアプローチと投与計画とに従って投与することができる。例えば、４日間連続して１日１回１２ｍｇ／ｋｇであって１日の投与量が８００ｍｇ超えない範囲で静脈内に投与され得る。毒性が観察されない場合には、毒性が起こらない限り、６日目、８日目、１０日目、および１２日目に６ｍｇ／ｋｇが投与され、５日目、７日目、９日目、１１日目には治療が提供されない。治療のサイクルは１２日目の終了時に終了する。他の例において、リスクの低い患者、もしくは、十分な栄養状態にない患者は、３日間、６ｍｇ／ｋｇ／日が投与され得る。毒性が観察されない場合には、毒性が起こらない限り３ｍｇ／ｋｇが５日目、７日目および９日目に投与され得る。４日目、６日目、８日目には治療が提供されず、１日の投与量は４００ｍｇを超えない。
【0032】
エリブリンとＳ−１（もしくは５−ＦＵ）の組成物は、患者へと実質的に同時に、もしくは連続的にいずれか一方の順番で（例えばＳ−１（もしくは５−ＦＵ）の前にエリブリン投与またはその逆）投与され得る。一例において、エリブリンは、Ｓ−１（もしくは５−ＦＵ）の投与開始の前（例えば１〜１２時間前もしくは１〜３日前）に投与される。化学療法薬を投与するのに使用される多くの計画は、例えば、薬剤（複数の薬剤を含む）の投与の後に、患者が治療による有害な副作用から回復する期間である一定の期間の後（例えば１〜４週間）、同じ治療の反復が続く。それぞれの投与においてエリブリンとＳ−１（もしくは５−ＦＵ）の両方を用いることが望ましく、代替的には、治療のいくつか（もしくは治療のすべて）が、エリブリンのみもしくはＳ−１（もしくは５−ＦＵ）のみを含むことが望ましい。
【0033】
本発明に含まれる治療計画の具体的で非限定的な例として、２１日間のサイクルの１日目と８日目にエリブリン（例えば０．０１〜５ｍｇ／ｍ２、例えば１．１ｍｇ／ｍ２もしくは１．４ｍｇ／ｍ２）が、１〜２０分間にわたる（例えば２〜５分にわたる）静脈内注射によって患者へと投与され、一方で、Ｓ−１がこのサイクルの間において１日に２回（例えば、５〜８０、１０〜５０、１５〜４０、もしくは２０〜２５ｍｇ／ｍ２で１日当たり１回もしくは２回）投与される。この治療のコースは、許容され得るものであり、かつ効果的であると当業者によって決定されると、繰り返され得る（例えば、１〜８、２〜６、もしくは４〜５回）。
【0034】
本発明に含まれる治療計画の他の具体的で非限定的な例として、２１日間のサイクルの１日目と８日目にエリブリン（例えば０．０１〜５ｍｇ／ｍ２、例えば１．１ｍｇ／ｍ２もしくは１．４ｍｇ／ｍ２）が、１〜２０分間にわたる（例えば２〜５分にわたる）静脈内注射によって患者へと投与され、一方で、５−ＦＵ（１２ｍｇ／ｋｇもしくは６ｍｇ／ｋｇ）がこのサイクルの間の１〜４日目もしくは１〜３日目において１日に１回投与され、そして上に示される記載と一致して、６日目、８日目、１０日目および１２日目または５日目、７日目および９日目において、追加の投与量が投与される。この治療のコースは、許容され得るものであり、かつ効果的であると当業者によって決定されると、繰り返され得る（例えば、１〜８、２〜６、もしくは４〜５回）。
【0035】
上述の量および計画は、当業者によって適切に決定されるように、変化させ得る。併用によって投与される薬剤の量は、一つの特定の薬剤に対する全体の曝露を減ずる一方で、有益な効果（例えば相乗もしくは相加）を維持するために、当業者によって適切に決定されるように、例えば単剤療法において使用される量と比較して減らすことができる。また、治療サイクルの間に、当業者によって決定されるように、必要に応じて投与量の調整が実施され得る。
【0036】
エリブリンとＳ−１（もしくは５−ＦＵ）に加えて、本発明の方法はまた、一つもしくはそれ以上の治療薬の投与を含み得る。これらの薬の中で、免疫調節剤、化学療法剤／抗腫瘍剤、抗菌剤、抗生物質および抗炎症剤が好適である。他の例において、エリブリン（例えばエリブリンメシラート）およびＳ−１（もしくは５−ＦＵ）は、単一の治療薬（例えば単一の抗がん剤）として治療計画において使用できる。このように、本発明の方法は、（ｉ）エリブリンもしくはそれらの医薬的に許容可能な塩、および（ｉｉ）Ｓ−１（もしくは５−ＦＵ）を投与することからなり得る。
【0037】
本発明の方法は、治療のため（例えば進行の遅延もしくは進行の停止を含む）または対象（例えばヒトの患者）におけるがんを予防するため、ならびに／または腫瘍のサイズを減少されるために使用できる。対象は、がんと診断されていてもよく、がんを発症する危険があってもよく、がんの治療中でもよく、または、がんからの回復後の治療中でもよい。さらに、方法を、転移および／もしくは再発を治療するためにもしくは予防するために使用できる。治療は、化学療法単独であってもよいが、腫瘍を除去するかまたは腫瘍のサイズを減ずるための外科手順、放射線治療、免疫治療、および／もしくは除去療法と組み合わせる治療もまた想定される。
【0038】
本発明の方法は、例えば、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲストロン受容体（ＰＲ）、およびＨＥＲ２／ｎｅｕの過剰発現もしくはそれらの遺伝子増幅の欠如によって特徴付けられるトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）のような乳がんの治療に使用できる。さらに、本発明はまた、上皮間葉転換を示すマーカー（例えば、Ｅ−カドヘリン発現の減少および／もしくはＮ−カドヘリン、ビメンチンおよび／もしくはＳｎａｉｌ２の発現の増加、後述を参照）によって特徴付けられるＥＭＴ陽性のＴＮＢＣの治療に使用できる。本発明の方法によって治療できる他の型の乳がんは、例えば、ＥＲ陽性、ＰＲ陽性、および／もしくはＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性の乳がんを含む。さらに、本発明の方法によって治療される乳がんは、例えば、転移性乳がんおよび／もしくは炎症性乳がんであってよい。本発明の方法によって治療できる他の型のがんは肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、卵巣がん、子宮内膜がん、および胃がんを含み、それらは転移性であっても局所性であってもよい。さらに、ＥＭＴによって薬物耐性であると報告されるがん、ならびにＳ−１の承認適応症とされるがんは、本発明の方法によって治療され得る。そのようながんの例は、胃がん、直腸がん、頭頸部がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、および膵臓がんを含む。
【0039】
本発明はまた、エリブリン（例えばエリブリンメシラート）の入った容器とＳ−１（もしくは５−ＦＵ）の入った容器とを含むキットを提供する。そのようなキット中のエリブリン（例えばエリブリンメシラート）およびＳ−１（もしくは５−ＦＵ）は、患者におけるがんを治療するのに十分な量でその必要性に応じて（例えば単一の投与に十分な量、もしくは複数の投与に必要な量）提供され得る。キットは、効果的な量の単一投与のためのエリブリン（例えばエリブリンメシラート）およびＳ−１（もしくは５−ＦＵ）の医薬組成物をそれぞれ含む容器を、複数個含み得る。任意選択で、医薬組成物を投与するために必要な器具および／もしくは機器もまたキット中に含み得る。さらに、キットは、がんを持つ患者をエリブリン（例えばエリブリンメシラート）およびＳ−１（もしくは５−ＦＵ）によって治療するための説明書もしくは投与スケジュールのような追加の構成要素を含み得る。
【0040】
本発明は、以下の例によって示されるが、それらは本発明を限定することを意図するものでは決してない。
【実施例】
【0041】
方法細胞株
この実験は４つのＴＮＢＣ細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＢＴ−５４９およびＭＸ−１）ならびに非ＴＮＢＣ細胞株（ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ）を用いて実施された。これらの細胞は、ＡＴＣＣ（米国メリーランド州ロックビル）もしくはＣＬＳ（ドイツ、エッペルハイム）から入手され、１０％胎児牛血清（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、米国ニューヨーク州グランドアイランド）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地（シグマ−アルドリッチ、米国ミズーリ州セントルイス）中で維持された。細胞は、３７℃において５％ＣＯ２の湿環境で、３〜４日ごとに継代して培養された。
【0042】
化合物Ｓ−１は、テガフールとギメラシルとオテラシルカリウム（ＴＣｌ、日本国東京）とを０．５％ＨＰＭＣ中で１：０．４：１のモル比で混合して調製された。インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）研究のための５−ＦＵはシグマ−アルドリッチより入手され、エリブリンはエーザイ社より提供された。これらの薬剤は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解された。
【0043】
インビトロ増殖阻害アッセイ細胞増殖は、標準的な３−（４，５−ジメチル−チアゾイル−２−イル）２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイ、および、既報の方法（Ｔａｎａｋａら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、２００９年、１２４（５）：１０７２〜１０８０ページ）を用いて調べられた。要約すると、細胞は、９６穴プレートに播種され、化合物に曝露されるまで２４時間培養された。細胞は、３７℃で７２時間、さまざまな濃度の５−ＦＵおよびエリブリンと共にインキュベートされた。実験は三重検定で実施された。
【0044】
インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での５−ＦＵとエリブリンとの併用効果併用効果を評価するために、正規化されたＥＤ５０アイソボログラムがＭＴＴアッセイを用いてプロットされた。アイソボログラム解析は、複数の薬剤の効果を分析するためにしばしば用いられる方法である（Ｓｔｅｅｌら、Ｉｎｔ Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｏｎｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｈｙｓ、１９７９年、５（１）、８５〜９１ページ；Ｋａｎｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、１９８８年、４８（２）、３５１〜３５６ページ）。さらに、併用指数（ＣＩ）（Ｃｈｏｕら、Ａｄｖ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ、１９８４年、２２、２７〜５５ページ）がそれぞれの混合比に対して以下の式
【数1】
〔式中、（Ｄａ）１および（Ｄａ）２は、ａ％の薬剤の効果（この実験ではａ＝５０）を達成するために必要な単剤の濃度であり、そして、（Ｄ）１および（Ｄ）２は、同じ効果を達成するために併用される５−ＦＵおよびエリブリンの濃度である。〕を用いて計算された。正規化されたアイソボログラムにおいて、対角線は相加効果の直線である。実験の測定点はこの直線より下部、直線上、もしくは直線より上部に配置される点により表され、それぞれ相乗効果、相加効果、および拮抗作用を示す。ＣＩ計算式は薬剤の併用の相加効果を決定し、相乗効果は予想される相加効果より大きいと定義され、拮抗効果は予想される相加効果よりも小さいと定義される。１未満、１、および１より大きいＣＩの値は、それぞれ、相乗効果、相加効果、および拮抗作用を示す。
【0045】
リアルタイム逆転写（ＲＴ）ＰＣＲ全ＲＮＡは、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＲＮＡ−ＰＣＲキット（アプライド・バイオサイエンス、米国カリフォルニア州）を用いてｃＤＮＡへと転換された。ｃＤＮＡは、Ｅ−カドヘリン特異的なオリゴヌクレオチドプライマー（フォワード５’−ＴＴＡＡＡＣＴＣＣＴＧＧＣＣＴＣＡＡＧＣＡＡＴＣ−３’およびリバース５’−ＴＣＣＴＡＴＣＴＴＧＧＧＣＡＡＡＧＣＡＡＣＴＧ−３’）、Ｎ−カドヘリン特異的なオリゴヌクレオチドプライマー（フォワード５’−ＣＧＡＡＴＧＧＡＴＧＡＡＡＡＧＡＣＣＣＡＴＣＣ−３’およびリバース５’−ＧＧＡＡＧＣＣＡＣＴＧＣＣＴＴＣＡＴＣＧＴＣＡＡ−３’）、ビメンチン特異的なオリゴヌクレオチドプライマー（フォワード５’−ＴＧＡＧＴＡＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＴＧＣＡＧ−３’およびリバース５’−ＴＡＧＣＡＧＣＴＴＣＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＴＴＣ−３’）、およびＳｎａｉｌ２特異的なオリゴヌクレオチドプライマー（フォワード５’−ＡＴＧＣＡＴＡＴＴＣＧＧＡＣＣＣＡＣＡＣＡＴＴＡＣ−３’およびリバース５’−ＡＧＡＴＴＴＧＡＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＣＴＣ−３’）を用いるＰＣＲ解析に用いられた。ＰＣＲは、サーマルサイクラーダイス（日本国大津市、タカラバイオ）を用いて、９５℃５分、ならびに９５℃５秒と６０℃１０秒とを５０サイクルという条件において実施された。プライマーはシグマ−アルドリッチもしくはタカラバイオより購入され、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ）と共に使用された。ＧＡＰＤＨは、それぞれのサンプルを標準化して比較するための内部標準として使用された。
【0046】
イムノブロッティングイムノブロット解析は、既報されるように実施された（Ｍａｅｇａｗａら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ２００９年、２９（４）、１１１１〜１１１７ページ）。細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄され、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭのフッ化ナトリウム、１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム、プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ、スイス国バーゼル、ロシュ・ダイアグノスティックス）およびホスファターゼ阻害剤カクテル（シグマ−アルドリッチ）を含むＬｙｓｉｓ Ａ緩衝液中でインキュベートすることによって溶解された。たんぱく質はＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離され、ＰＶＤＦメンブレン（イモビロン、米国マサチューセッツ州ビレリカ、ミリポア）へと転写された。０．０２％Ｔｗｅｅｎ ２０および５％脱脂乳を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）によってブロッキングされたのち、メンブレンのストリップは、抗Ｅ−カドヘリン抗体、抗Ｎ−カドヘリン抗体、抗ビメンチン抗体、もしくは抗Ｓｎａｉｌ２抗体へと曝露された。それらは、ＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧ抗体と共にインキュベートされ、たんぱく質はＥＣＬウェスタンブロッティング検出システム（英国バッキンガムシャー、ＧＥヘルスケア）を用いて可視化された。抗体はすべてセルシグナリング（米国マサチューセッツ州ビバリー）より購入された。
【0047】
免疫蛍光染色細胞の免疫蛍光染色は既報（Ｔａｍｕｒａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ、２０１０年、１０１（６）、１４０３〜１４０８ページ）に基づいて軽微な変更を加えて実施された。細胞は、６穴プレート中のカバースリップへと播種され、５−ＦＵ、エリブリンもしくはＴＧＦ−βへと曝露された。曝露の後、細胞はＰＢＳで２回洗浄され、４％のパラホルムアルデヒドで２０分間固定された。固定された細胞はＰＢＳで３回洗浄され、続けて１．５％ウシ血清アルブミンとともに１時間インキュベートされた。それらは、抗Ｅ−カドヘリン抗体もしくは抗ビメンチン抗体とともに４℃で一晩インキュベートされ、そしてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６抗ウサギＩｇＧ抗体（米国オレゴン州ユージーン、モレキュラープローブズ）とともに３０分インキュベートされた。最終的に、細胞はＤＡＰＩ（６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）で処理されて核が染色され、染色された細胞は、蛍光顕微鏡（ＩＸ７１、日本国東京、オリンパス）を用いて観察された。
【0048】
インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）増殖阻害アッセイメスのＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕマウス（５週齢、クレアジャパン）が無菌状態で維持され、滅菌の食料と水とが給餌された。５０％マトリゲルを含むＰＢＳ中のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（４×１０６生存細胞）がそれぞれのマウスに皮下注入された。細胞の接種の後３０日後、マウスはランダムに４群（対照、Ｓ−１、エリブリンおよびＳ−１とエリブリン併用、それぞれｎ＝３）に分けられ、処理が開始された。Ｓ−１は、１日目と１６日目に経口投与され、２．５％ＤＭＳＯを含む生理食塩水に溶解されたエリブリンは、１、５、９および１３日目に静脈内投与された。Ｓ−１とエリブリンの投与量は、それぞれ８．３ｍｇ／ｋｇと０．１ｍｇ／ｋｇであった。腫瘍体積は式［（幅）２×長さ」／２（ｍｍ３）を用いて見積もられた。Ｓ−１、エリブリン、ならびにＳ−１とエリブリンとの併用の抗腫瘍効果を評価するために腫瘍のサイズと体重とが週に２回測定された。抗腫瘍効果は％Ｔ／Ｃ（処理対対照）〔処理群の腫瘍体積を、対照群の腫瘍体積によって割り、そして１００をかける〕で表された。
【0049】
ヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）染色および免疫組織化学（ＩＨＣ）分析ホルマリン固定された腫瘍はパラフィン包埋された。ＨＥ染色、ならびに抗Ｅ−カドヘリン抗体（１：１００）および抗ビメンチン抗体（１：１００）を用いるＩＨＣにおいて４μｍの切片が用いられた。この切片において用いられる方法は、既報されている（Ｔａｍｕｒａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄ、２０１３年、２（２）、１４４〜１５４ページ）。
【0050】
統計解析ＳＤを計算するための、ならびにスチューデントのｔ検定を用いるサンプル間の有意差を試験するための統計解析は、マイクロソフトエクセル（マイクロソフト）を用いて実施された。０．０５未満のＰ値が有意差であるとみなされた。
【0051】
結果５−ＦＵおよびエリブリンに対するＴＮＢＣ細胞株の細胞感受性
ＴＮＢＣ細胞株および非ＮＮＢＣ細胞株に対する５−ＦＵおよびエリブリンの増殖阻害効果は、ＭＴＴアッセイを用いて調べられた。それらの細胞株に対する５−ＦＵおよびエリブリンのＩＣ５０は、それぞれ２．３〜１３．０μＭおよび０．４〜４．３μＭであった。ＴＮＢＣ細胞株と非ＴＮＢＣ細胞株の間の細胞感受性には、ＭＸ−１細胞以外では差異がなかった（表１）。ＭＸ−１細胞は、他の細胞株と比べて５−ＦＵに対して高い耐性（９２．４±３．７μＭ）を持っていた。
【0052】
【表1】
【0053】
インビトロ（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でのＴＮＢＣ細胞株に対する５−ＦＵとエリブリンとの併用効果５−ＦＵとエリブリンとの潜在的な併用効果を評価するため、正規化されたＥＤ５０アイソボログラムがプロットされ、ＣＩ値がＭＴＴアッセイを用いて測定された。５−ＦＵとエリブリンとの間の相乗的相互作用がＴＮＢＣ細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＭＸ−１）において観察された（図１Ａ）。さらにＣＩ値は顕著に１未満であり、すべての調べられた濃度において、イソボログラムは明確に相乗効果を見出した（表２および図１Ｂ）。ＢＴ−５４９細胞株において、相加効果が観察された。このように、ＴＮＢＣ細胞株において、５−ＦＵとエリブリンとの併用について、相乗効果と相加効果とを見出した。
【0054】
【表2】
【0055】
ＥＭＴ変化がＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の５−ＦＵへの感受性を減少させる我々は、５−ＦＵとエリブリンとの間の相乗相互作用の機構について分析した。いくつかの報告は、樹立された５−ＦＵ耐性細胞株がＥＭＴ変化を示すことを証明してきた（Ｔａｍｕｒａら、Ｃａｎｃｅ Ｍｅｄ、２０１３年、２（２）、１４４〜１５４ページ、ＦｏｕｌｋｅｓらＮ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、２０１０年、３６３（２０）、１９３８〜１９４８ページ）。我々は、ＥＭＴを試験することに着目した。第一に、我々は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＥＭＴ変化が５−ＦＵへの感受性を減少させ得るかどうかを検証した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞がＴＧＦ−β（２．５ｎｇ／ｍｌ）へと５日間曝露されると、ＥＭＴ様の形態変化が観察される（図２Ａ）。Ｅ−カドヘリンの減少した発現と、Ｎ−カドヘリン、ビメンチンおよびＳｎａｉｌ２の増加した発現が、ｍＲＮＡ発現レベルおよびタンパク発現レベルにおいて観察された（図２Ｂおよび図２Ｃ）。免疫蛍光染色は、Ｅ−カドヘリンとビメンチンにおけるこれらの変化を確認した（図２Ｄ）。図２Ｅは、これらの条件における、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の５−ＦＵへの細胞感受性を示す。ＴＧＦ−βに曝露された細胞は、ＴＧＦ−β曝露のない細胞（ＩＣ５０値１４．８±１．０μＭ）と比較して、５−ＦＵに対しておおよそ３倍の耐性を持ち、このときにＩＣ５０値は４４．７±５．８μＭである。これらの結果は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＥＭＴ変化は、５−ＦＵに対する細胞の感受性を減少させるということを示す。
【0056】
５−ＦＵは上皮間葉転換（ＥＭＴ）を誘導するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞が５−ＦＵ（１〜１０μＭ）で処理されると、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞が、ＥＭＴを起こす細胞の特徴的な性質である細胞の形状の伸長および細胞の拡散を含む、細胞の形態におけるＥＭＴ様変化を示すことを観察した（図３Ａ）。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロッティングは、５−ＦＵへの５日間の曝露ののち、用量依存的な様式で上皮系マーカー（Ｅ−カドヘリン）が減少する一方で、間葉系マーカー（Ｎ−カドヘリンおよびビメンチン）ならびにＥ−カドヘリンの転写を抑制するＳｎａｉｌ２の発現レベルが増加することを示している（図３Ｂおよび３Ｃ）。Ｅ−カドヘリンの減少した発現とビメンチンの増加した発現は、免疫蛍光染色（図３Ｄ）を用いても確認された。これらの結果は、５−ＦＵがＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＥＭＴを直接的に誘導し、そしてＥＭＴ変化が５−ＦＵに対する感受性を減少させ得ることを示す。
【0057】
エリブリンが間葉上皮転換（ＭＥＴ）を誘導する対照的に、間葉系の特徴を示すＭＸ−１細胞は、エリブリン（０．３〜３ｎＭ）への８日間の曝露ののち、ＥＭＴの逆のプロセスである、敷石状外観およびタイトな細胞−細胞ジャンクションを含むＭＥＴ形態変化を示した（図４Ａ）。これらの観察と合致して、Ｅ−カドヘリンの増加した発現と、Ｎ−カドヘリンおよびビメンチンの減少した発現、ならびに関連したＳｎａｉｌ２の減少した発現が、用量依存的な様式で検出された（図４Ｂおよび図４Ｃ）。免疫蛍光染色はまた、Ｅ−カドヘリンの増加した発現とビメンチンの減少した発現とを確かにした（図４Ｄ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において５−ＦＵが誘導したＥＭＴ変化をエリブリンが無効化するかどうかを調べるために、細胞が５−ＦＵに５日間あらかじめ曝露され、エリブリンへの曝露がその後に続いた。線維芽細胞様の形態から敷石状外観への形態変化が、４日間のエリブリン（０．３〜３ｎＭ）への曝露ののち観察された（図５Ａ）。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロッティングおよび免疫蛍光染色を用いて検出されるように、Ｅ−カドヘリンの増加した発現およびＮ−カドヘリン、ビメンチン、ならびにＳｎａｉｌ２の減少した発現が用量依存的な様式で観察された（図５Ｂ〜５Ｄ）。このように、５−ＦＵが誘導したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の表現型もまた、エリブリンによって無効化された。これらの結果は、エリブリンによるＭＥＴ誘導の作用が、５−ＦＵへの耐性を減少させることを示唆する。
【0058】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍異種移植モデルにおけるＳ−１とエリブリンとの併用効果インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）でのＳ−１とエリブリンとの併用効果を調べるために、我々はＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍異種移植モデルにおけるこれらの併用の抗腫瘍活性を調べた。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍を持つマウスが準備され、Ｓ−１（１〜１６日間、経口、８．３ｍｇ／ｋｇ）、エリブリン（Ｑ４Ｄ×４、静脈内投与、０．１ｍｇ／ｋｇ）、もしくはＳ−１とエリブリンとの併用によって、治療された。初期治療から３６日における４群（すなわち、対照、Ｓ−１、エリブリンおよびＳ−１とエリブリンとの併用）の平均腫瘍体積（ｍｍ３）は、それぞれ１９００±４７３、１０５５±１９７、９００±２３５および１９９±２６であった（図６Ａ、Ｓ−１単剤治療対Ｓ−１とエリブリンとの併用のＰ＝０．０１であり、エリブリン対Ｓ−１とエリブリンとの併用のＰ＝０．０４である）。Ｓ−１単剤もしくはエリブリン単剤は、腫瘍サイズを減少させ（それぞれＴ／Ｃ＝５５．５％、４７．４％）、そしてＳ−１とエリブリンとの併用はＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植の腫瘍サイズをより激しく減少させた（Ｔ／Ｃ＝１０．５％）。Ｓ−１もしくはエリブリンによる治療と関連する体重減少は、いずれの群においても観察されなかった（図６Ｂ）。さらに、我々は、異種移植モデルを用いて、エリブリンのＭＥＴ誘導活性を調べた。初期治療の後７日における上述の４群において免疫組織化学分析が実施された。結果として、Ｅ−カドヘリンの減少した発現とビメンチンの増加した発現とがＳ−１の治療の後に観察された。対照的に、Ｅ―カドヘリンの増加した発現とビメンチンの減少した発現とがＳ−１とエリブリンとの併用治療の後に観察された（図６Ｃ）。これらの結果は、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）の実験と一致した。
【0059】
結論ＴＮＢＣの患者に対しては、ホルモン受容体陽性かつＨＥＲ２−陽性の乳がんに対して可能であるような標的療法が存在しないため、現在では全身療法のみが可能である。初期治療における化学療法に対する高い奏効率が観察されるが、ＴＮＢＣ患者は、しばしば急速な疾患の進行を発現し、ＥＲ−陽性乳がんと比較してより短い全生存期間という結果になる（Ｆｏｕｌｋｅｓら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ２０１０年、３６３（２０）、１９３８〜１９４８ページ）。ＴＮＢＣに対する新規の療法および治療様式は必要である。
【0060】
Ｓ−１（５−ＦＵ）とエリブリンとの併用が、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｏｒｏ）においてＴＮＢＣ細胞株に対して相乗効果（３／４）もしくは相加効果（１／４）を発揮することを我々は証明した。相乗効果は、腫瘍を持つマウスモデルにおいてもまた証明された。インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）実験において、我々は、それぞれの薬剤にとっての最適な投与量およびスケジュールによるＳ−１およびエリブリンの抗腫瘍効果を分析した。併用は許容できるものであり、マウスにおいて、体重減少および下痢を含む顕著な毒性を示さずに注目すべき腫瘍縮小という結果を生じた。我々はまた、５−ＦＵがＴＮＢＣ細胞において直接的にＥＭＴ変化を誘導し、そしてこの５−ＦＵの作用は、獲得した耐性と関連するらしいということを観察し、そしてエリブリンが、ＴＮＢＣ細胞にＭＥＴ変化を誘導することによって５−ＦＵ誘導のＥＭＴを無効化することを観察した。それゆえ、併用療法は、ＥＭＴ陽性のＴＮＢＣのようながんの治療に対し有利に使用できる。
【0061】
他の態様本発明は、それらの具体的な実施態様と関連して記述されてきたが、更なる変更が可能であり、そして任意の変形を包含するものであり、そして本出願は、一般的に本発明の原理に従い、かつ本発明が関連し、そしてここに示される主要な特徴に適用し得る、当技術分野において既知の実施もしくは慣行的な実施の範囲に入る本開示からの発展を含む、本発明の変形、使用もしくは適用を意図する。
【0062】
本明細書で示されるすべての刊行物および特許刊行物は、それぞれの独立した刊行物もしくは特許刊行物が、そのすべての内容が参照により組み入れられるように具体的かつ個別的に示されるのと同程度に、本明細書に参照により組み入れられる。「ａ」および「ｔｈｅ」のように、本明細書における単数形の使用は、文脈がそうでないと示さない限りは対応する複数形のものを除外しない。同様に、複数形の使用は対応する単数形を示すことを除外しない。他の実施態様は、以下の請求項の範囲内に包含される。