特許 6644678 ＣＴＬＡ−４およびＣＤ４０の両方に特異的に結合可能である二重特異性分子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6644678

(24)【登録日】2020年1月10日

(45)【発行日】2020年2月12日

(54)【発明の名称】ＣＴＬＡ−４およびＣＤ４０の両方に特異的に結合可能である二重特異性分子

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20200130BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20200130BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20200130BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20200130BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20200130BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20200130BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20200130BHJP

   C07K 14/705 20060101ALN20200130BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20200130BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20200130BHJP

【ＦＩ】

   C07K19/00ZNA

   C12N15/62 Z

   A61K38/17

   A61K39/395 N

   A61P35/00

   A61P35/02

   !C07K16/28

   !C07K14/705

   !C12N15/12

   !C12N15/13

【請求項の数】17

【全頁数】75

(21)【出願番号】特願2016-522480(P2016-522480)

(86)(22)【出願日】2014年6月25日

(65)【公表番号】特表2016-529215(P2016-529215A)

(43)【公表日】2016年9月23日

(86)【国際出願番号】EP2014063443

(87)【国際公開番号】WO2014207064

(87)【国際公開日】20141231

【審査請求日】2017年6月23日

(31)【優先権主張番号】1311487.1

(32)【優先日】2013年6月27日

(33)【優先権主張国】GB

(73)【特許権者】

【識別番号】515358311

【氏名又は名称】アリゲーター バイオサイエンス アーベー

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】エルマーク，ピーター

(72)【発明者】

【氏名】フレブリング，クリスティーナ

(72)【発明者】

【氏名】ノーレン，パー

【審査官】 宮岡 真衣

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１１／０６１４８７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／０９５４１２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１３／００３７６１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１３−０９９３３３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Peach R. et al.，J. Biol. Chem.，Vol.270, No.36(1995)，p.21181-21187

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １９／００

Ｃ０７Ｋ １４／７０５

Ｃ０７Ｋ １６／２８

Ｃ１２Ｎ １５／０９−１５／６２

Ａ６１Ｋ ３８／１７

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｐ ３５／００−３５／０２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＣＴＬＡ−４およびＣＤ４０の両方に特異的に結合可能であるポリペプチドであって、
前記ポリペプチドは、Ｂ１およびＢ２を含み、
Ｂ１は、ＣＤ４０に特異的な抗体、またはその抗原結合性断片であり、そしてＣＤ４０アゴニストであり、
Ｂ２は、ＣＴＬＡ−４に特異的なポリペプチド結合性ドメインであり、
ｉ）配列番号３のアミノ酸配列、
ｉｉ）配列番号３のＡ２４およびＰ２５を欠くアミノ酸配列、または
ｉｉｉ）前記結合性ドメインが、野生型ヒトＣＤ８６よりも高い親和性でヒトＣＴＬＡ−４と結合するという条件で、配列番号３のアミノ酸配列、もしくは配列番号３のＡ２４およびＰ２５を欠くアミノ酸配列と比較して少なくとも１つ（但し１０個以下）のアミノ酸が置換しているアミノ酸配列であって前記置換は、Ｆ３２Ｉ、Ｑ４８Ｌ、Ｓ４９Ｔ、Ｖ５４Ｉ、Ｖ６４Ｉ、Ｋ７４Ｉ／Ｒ、Ｓ７７Ａ、Ｈ７９Ｄ／Ｓ／Ａ、Ｋ１０３Ｅ、Ｌ１０７Ｉ／Ｆ／Ｒ、Ｉ１１１Ｖ、Ｔ１１８Ｓ、Ｍ１２０Ｌ、Ｉ１２１Ｖ、Ｒ１２２Ｋ／Ｎ、Ｑ１２５Ｅ、Ｎ１２７Ｓ／ＤおよびＡ１３４Ｔから選択されるアミノ酸配列
を含むか、またはそれらからなり、
前記配列番号３の位置のナンバリングは２４から始まる、
ポリペプチド。

【請求項2】

Ｂ１が、少なくとも１つの重鎖（Ｈ）および少なくとも１つの軽鎖（Ｌ）を含み、Ｂ２が、前記少なくとも１つの重鎖（Ｈ）または前記少なくとも１つの軽鎖（Ｌ）に結合している、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項3】

Ｂ１が、
− 少なくとも１つの重鎖（Ｈ）および少なくとも１つの軽鎖（Ｌ）を含み、Ｂ２が、前記重鎖もしくは前記軽鎖のいずれかに結合しており、またはＢ１が、
− ２つの同一の重鎖（Ｈ）および２つの同一の軽鎖（Ｌ）を含み、Ｂ２が、両方の重鎖もしくは両方の軽鎖に結合している、
請求項２に記載のポリペプチド。

【請求項4】

Ｎ−Ｃ方向に書かれた以下の式：
（ａ）Ｈ−（Ｘ）ｎ−Ｂ２、
（ｂ）Ｂ２−（Ｘ）ｎ−Ｈ、
（ｃ）Ｌ−（Ｘ）ｎ−Ｂ２、または
（ｄ）Ｂ２−（Ｘ）ｎ−Ｌ
（式中、Ｘはリンカーであり、ｎは０または１である）
により構成されるポリペプチド、
または式（ａ）から（ｄ）のうちのいずれか１つにより構成されるポリペプチドからなるポリペプチドを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項5】

Ｘが、アミノ酸配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＰ、ＮＦＳＱＰ、ＫＲＴＶＡまたは（ＳＧ）ｍを有し、式中、ｍ＝１から７であるペプチドである、請求項４に記載のポリペプチド。

【請求項6】

Ｂ２（ｉｉｉ）の前記アミノ酸配列における１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のアミノ酸が、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３のＡ２４およびＰ２５を欠くアミノ酸配列と比較して置換されている、請求項１から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項7】

Ｂ２の前記アミノ酸配列が、配列番号８、６、７および９から２４のうちのいずれかの１つから選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項8】

Ｂ１が、表Ａに示す抗体の３つの重鎖ＣＤＲ配列および表Ａに示す抗体の３つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のポリペプチドであって、前記重鎖ＣＤＲ配列および前記軽鎖ＣＤＲ配列は、同一の抗体由来である、ポリペプチド。

【請求項9】

Ｂ１が、ヒトＦｃ領域または前記領域のバリアントを含み、前記領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４領域である、請求項１から８のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項10】

配列番号５６および配列番号６１、
配列番号５７および配列番号６１、
配列番号５８および配列番号６２、
配列番号５９および配列番号６１、
配列番号６０および配列番号６１、
配列番号１１０および配列番号７０、
配列番号１１１および配列番号７２、
配列番号１１２および配列番号７４、
配列番号１１３および配列番号７６、
配列番号１１３および配列番号８０、または
配列番号１１４および配列番号７８
のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項１から９のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項11】

個体における疾患または状態を治療または予防するための方法における使用のための、請求項１から１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項12】

疾患または状態が癌である、請求項１１に記載のポリペプチド。

【請求項13】

前記方法が、前記ポリペプチドを全身にまたは局所に、たとえば腫瘍の部位にまたは腫瘍流入領域リンパ節内に投与することを含む、請求項１１に記載のポリペプチド。

【請求項14】

癌が、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、子宮頚癌、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、多発性骨髄腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病、黒色腫、膀胱癌、胃癌、頭頸部癌、肝臓癌、皮膚癌、リンパ腫またはグリア芽腫である、請求項１２または１３に記載のポリペプチド。

【請求項15】

請求項１から１０のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。

【請求項16】

追加の治療的部分にコンジュゲートしている、請求項１から１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項17】

請求項１から１０のいずれか一項に記載のポリペプチドおよび少なくとも１種の薬学的に許容される希釈剤または担体を含む組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＣＤ４０およびＣＴＬＡ−４の両方、特にヒトＣＤ４０およびヒトＣＴＬＡ−４の両方に特異的に結合する二重特異性分子に関する。

【背景技術】

【0002】

癌は、先進国世界における早死の主要な原因である。癌の免疫療法の目的は、腫瘍に対する身体による有効な免疫応答を開始することである。これは、たとえば、腫瘍抗原に対する寛容を破壊し、抗腫瘍免疫応答を増大させ、腫瘍部位における局所サイトカイン応答を刺激することにより達成されうる。長期持続性抗腫瘍免疫応答の重要なエフェクター細胞は、活性化腫瘍特異的エフェクターＴ細胞である。たとえば樹状細胞による、エフェクターＴ細胞の不完全な活性化は、非効率的な抗腫瘍応答をもたらすＴ細胞アネルギーを引き起こしうる一方で、樹状細胞による適切な誘導は、活性化エフェクターＴ細胞の強力な増殖を生じさせ、それにより腫瘍に対して免疫応答を再指示することができる。

【0003】

細胞表面ＣＤ４０受容体分子は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲ）のメンバーであり、先天性および適応的免疫応答の両方における主要調節因子である。それは、ヒト抗原提示細胞、特にＢ細胞、樹状細胞およびマクロファージ上ならびに正常細胞、たとえば線維芽細胞、平滑筋細胞、内皮細胞および上皮細胞上に発現する。さらにそれは、すべてのＢリンパ腫、固形腫瘍の３０〜７０％、黒色腫および癌腫を含む多様な腫瘍細胞上に発現する。

【0004】

ＣＤ１５４またはＣＤ４０Ｌと示されるＣＤ４０の天然リガンドは、成熟Ｔリンパ球上に主に発現する。ＣＤ４０Ｌ媒介性シグナル伝達は、免疫細胞活性化、増殖、ならびにサイトカインおよびケモカインの産生を含む、複数の生物学的事象を誘発する。したがって、ＣＤ４０受容体を介した刺激は、細胞および免疫機能を増強する。細胞媒介性免疫応答におけるその役割は、よく知られている。たとえば、ＣＤ４０刺激を介した樹状細胞の活性化は、エフェクターＴ細胞の活性化を誘導する。したがって、ＣＤ４０アゴニストでの処置は、免疫応答を再指示し、腫瘍に向けられるエフェクターＴ細胞を増殖する手段となりうる。

【0005】

いくつかの抗ＣＤ４０抗体について抗腫瘍効果が報告されており、複数の機序が同定されている。ＣＤ４０陰性腫瘍について、抗原提示細胞の活性化、特に腫瘍特異的細胞傷害性Ｔリンパ球およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）による活性の増加を伴う間接的効果が観察されている。ＣＤ４０陽性腫瘍について、ＣＤ４０抗体の腫瘍細胞への結合が細胞アポトーシスを誘導する、直接的な抗腫瘍性機構が観察されている。抗腫瘍活性のためのこれらの機構は、抗体媒介性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の増強をもたらす体液性応答の刺激により補完されうる。しかしながら、抗ＣＤ４０抗体の全身投与はまた、有害な副作用、たとえばショック症候群およびサイトカイン放出症候群と関連付けられる。

【0006】

Ｔ細胞受容体ＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞活性化の負の調節因子として役立ち、初期活性化後にＴ細胞表面上で上方制御される。抗原提示細胞が発現するＣＴＬＡ−４受容体のリガンドは、Ｂ７タンパク質である。Ｔ細胞活性化の上方制御の原因である対応するリガンド受容体ペアは、ＣＤ２８−Ｂ７である。ＣＤ２８を介したシグナル伝達は共刺激経路を構成し、ＭＨＣ複合体により提示される抗原ペプチドを認識するＴ細胞受容体を通じて、Ｔ細胞の活性化に続いて生じる。

【0007】

ＣＴＬＡ−４のＢ７−１および、またはＢ７−２リガンドとの相互作用を遮断することにより、免疫応答の通常のチェックポイントが除去されうる。臨床試験は、ＣＴＬＡ−４遮断が抗腫瘍効果をもたらすことを実証した。しかしながら、ＣＤ４０については、抗ＣＴＬＡ−４抗体の投与は毒性副作用と関連付けられる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

ＣＤ４０またはＣＴＬＡ−４のいずれかを標的とする、既存の単一特異性薬物に代わる代替案が必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは、２種の免疫調節受容体、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ４０を標的とする新規二重特異性結合分子を製造した。ＣＴＬＡ−４およびＣＤ４０は、好ましくはヒトのものであるが、他の哺乳動物、たとえば非ヒト霊長類またはマウスに由来するＣＴＬＡ−４および／またはＣＤ４０であってもよい。非ヒト霊長類は、たとえば、カニクイザルであってもよい。

【0010】

癌患者に観察される免疫応答の抑制は、腫瘍抗原に特異的なＴ細胞のＣＴＬＡ−４媒介性阻害を遮断することにより克服されうるのであり、同時に、ＣＤ４０を標的とすることは、ＣＤ４０を発現する樹状細胞、Ｂリンパ球およびマクロファージ細胞を増強する。これは、腫瘍に対する免疫応答をさらに促進する。

【0011】

本発明の二重特異性結合分子は、ＣＤ４０発現抗原提示細胞およびＣＴＬＡ−４発現Ｔ細胞を物理的に結合し、自然界には通常見出されない細胞−細胞シナプスを潜在的に創出することによる追加の治療効果を提供しうる。これは、殺腫瘍活性の即時発生のための非常に強力な免疫活性化をもたらす。本発明の二重特異性結合分子は、癌免疫療法において、ＣＴＬＡ−４またはＣＤ４０のいずれかを標的とする単一特異性薬物の組合せを含む治療レジメンよりも、高い強度および／または効率を示しうる。

【0012】

本発明の二重特異性結合分子は、ポリペプチドである。したがって、本発明は、ヒトＣＴＬＡ−４およびヒトＣＤ４０の両方に特異的に結合可能であるポリペプチドであって、前記結合分子は、Ｂ１およびＢ２を含み、
Ｂ１は、ヒトＣＤ４０に特異的な抗体、またはその抗原結合性断片であり、
Ｂ２は、（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列、または（ｉｉ）結合性ドメインが、野生型ヒトＣＤ８６よりも高い親和性でヒトＣＴＬＡ−４と結合するという条件で、配列番号３のアミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸が変化しているアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、ヒトＣＴＬＡ−４に特異的なポリペプチド結合性ドメインである。Ｂ１のＣＤ４０結合性ドメインおよびＢ２のＣＴＬＡ−４結合性ドメインは、本発明のポリペプチドにおける唯一の結合性ドメインであってもよい。

【0013】

個体における疾患または状態を治療または予防するための方法における使用のための本発明のポリペプチドがさらに提供される。

【0014】

個体における疾患または状態を治療または予防する方法であって、前記個体に本発明によるポリペプチドを投与し、それにより疾患または状態を治療または予防することを含む方法がさらに提供される。

【0015】

個体における疾患または状態を治療または予防するための医薬の製造における使用のための本発明のポリペプチドがさらに提供される。

【0016】

本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および前記ポリヌクレオチドを含むベクターまたは細胞がさらに提供される。本発明のポリペプチドを製造する方法であって、細胞において前記ポリヌクレオチドを発現させることを含む方法がさらに提供される。

【0017】

本発明のポリペプチドおよび少なくとも１種の薬学的に許容される希釈剤または担体を含む組成物がさらに提供される。

【0018】

配列表の簡単な説明
配列番号１は、ヒトＣＴＬＡ−４のアミノ酸配列である（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＤ００６９８．１に対応する）。
配列番号２は、ヒトＣＤ２８のアミノ酸配列である（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ５１９４４．１に対応する）。
配列番号３は、Ｎ末端から２３個のアミノ酸のシグナル配列を除く、ヒト野生型ＣＤ８６の単量体細胞外ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号４は、Ｎ末端シグナル配列を含む、ヒト野生型ＣＤ８６の単量体細胞外および膜貫通ドメインのアミノ酸配列である。本明細書におけるアミノ酸位置のすべてのナンバリングは、Ｎ末端から始まる配列番号４における位置に基づく。したがって、配列番号３のＮ末端のアラニンは２４とナンバリングされる。
配列番号５は、Peach et al (Journal of Biological Chemistry 1995, vol 270(36), 21181-21187)に開示のヒトＣＤ８６の細胞外ドメインの変異体形態のアミノ酸配列である。野生型配列の位置７９のＨは、配列番号５の配列の対応する位置において、Ａで置換される。この変化は、本明細書においてＨ７９Ａと呼ばれる。本明細書において参照される他のアミノ酸置換全体を通じて、同じ命名法が使用される。位置のナンバリングは、上述のとおり配列番号４に基づく。
配列番号６から２４は、本発明の特定のタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号２５から４３はそれぞれ、配列番号６から２４のそれぞれのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号４４は、ヒトＣＤ８６の全長アミノ酸配列である（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢＫ４１９３１．１に対応する）。
配列番号４５は、ヒトＣＤ４０のアミノ酸配列である（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＨ１２４１９．１に対応する）。
配列番号４６から４９は、本発明のポリペプチドにおいて使用できる様々なリンカーである。
配列番号５０、５１および５２はそれぞれ、抗体Ａ２−５４の重鎖のＣＤＲ１、２および３のアミノ酸配列である。
配列番号５３、５４および５５はそれぞれ、抗体Ａ２−５４の軽鎖のＣＤＲ１、２および３のアミノ酸配列である。
配列番号５６から６０および１１０から１１４は、本発明の例示的ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号６１は、抗体Ａ２−５４の重鎖のアミノ酸配列である。
配列番号６２は、抗体Ａ２−５４の軽鎖のアミノ酸配列である。
配列番号６３は、配列番号６１をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号６４は、配列番号６２をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号６５から６９および１１５から１１９はそれぞれ、配列番号５６から６０および１１０から１１４をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６および８８は、本明細書に開示の抗体の重鎖のアミノ酸配列である。
配列番号７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７および８９は、本明細書に開示の抗体の軽鎖のアミノ酸配列である。
配列番号９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６および１０８は、本明細書に開示の抗体の重鎖配列をコードする核酸配列である。
配列番号９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７および１０９は、本明細書に開示の抗体の重鎖配列をコードする核酸配列である。
配列番号１２０は、マウスＣＴＬＡ−４のアミノ酸配列である（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０９７９３．１に対応する）。
配列番号１２１は、マウスＣＤ２８のアミノ酸配列である（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ３７３９５．１に対応する）。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】ＥＬＩＳＡ結合アッセイにより決定した、本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合性ドメインのＣＴＬＡ−４結合特性を示す図である。

【図2】ＥＬＩＳＡ阻害アッセイにより決定した、本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合性ドメインのＣＴＬＡ−４結合特性を示す図である。

【図3】本発明の例示的ポリペプチドの構造のスキーム図を示す図である。Ａは９５６／５３０および９５７／５３０、Ｂは９５９／５３０および９６０／５３０、Ｃは９５８／５３１である。抗ＣＤ４０抗体可変ドメインを黒、定常ドメインを白で塗っている。ＣＴＬＡ−４結合性ドメインを斜線で陰にしている。

【図4】本明細書に開示のヒト野生型ＣＤ８６アミノ酸配列のスキーム図を提供する図である。Ａは、Ｎ末端シグナル配列なしのヒトＣＤ８６の単量体可溶性細胞外ドメインのアミノ酸配列であり（配列番号３）、Ｂは、Ｎ末端シグナル配列を含む、ヒト野生型ＣＤ８６の単量体細胞外および膜貫通ドメインのアミノ酸配列であり（配列番号４）、Ｃは、ヒトＣＤ８６の全長アミノ酸配列である（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＢＫ４１９３１．１、配列番号４４）。Ａの配列は、太字で示す位置２４および２５のＮ末端のアラニンおよびプロリンを任意選択で欠いていてもよい。ＢおよびＣにおけるシグナル配列を下線で示す。アミノ酸位置のナンバリングは、Ｎ末端から始まる配列番号４および４４に基づく。

【図5】ＥＬＩＳＡ結合アッセイにより決定した、本発明の例示的ポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合特性を示す図である。

【図6】ＥＬＩＳＡ結合アッセイにより決定した、本発明の例示的ポリペプチドのＣＤ４０結合特性を示す図である。

【図7】ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＣＴＬＡ−４およびＣＤ４０の両方と同時に結合する本発明の例示的ポリペプチドの能力を示す図である。

【図8】表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して測定した、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ４０の両方と同時に結合する本発明の例示的ポリペプチドの能力を示す図である。

【図9】本発明の例示的ポリペプチドによる結合の結果としてのＣＤ４０発現およびＣＴＬＡ−４発現細胞間相互作用を示す、代表的なＦＡＣＳプロットである。

【図10】Ｂ細胞増殖により示される、免疫活性化を誘導する本発明の例示的ポリペプチドの能力を示す図である。本発明のポリペプチド９５７／５３０について、相乗効果が観察される。

【図11】本発明のポリペプチドがヒトおよびマウスＣＴＬＡ−４の両方について類似した強度の結合親和性を有することを実証する、阻害ＥＬＩＳＡの結果を示す図である。

【図12】ＥＬＩＳＡ結合アッセイにより決定した、本発明の例示的ポリペプチドのＣＤ４０結合特性を示す図である（Ａ〜Ｃ）。

【図13】ＥＬＩＳＡ結合アッセイにより決定した、本発明の例示的ポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合特性を示す図である（Ａ〜Ｆ）。

【図14】表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して測定した、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ４０の両方と同時に結合する本発明の例示的ポリペプチドの能力を示す図である。

【図15】本発明の例示的ポリペプチドのインビボ抗腫瘍効果を示す図である。対照に対する生存率の増加（上パネル）および腫瘍体積の減少（下パネル）を実証する。

【図16】本発明の例示的ポリペプチドでの処置が、インビボでの免疫記憶を確立したことを示す図である。あらかじめ処置したマウスは、対照に対する生存率が増加（上パネル）し、腫瘍体積が減少（下パネル）した。

【図17】本発明の例示的ポリペプチドが、対応する単一特異性抗体と比較して、Ｂ細胞増殖を誘導する効率を増加させたことを示す図である。ｙ軸は、本発明の各ポリペプチドについて、その対応する単一特異性抗体に対するＢ細胞増殖における平均倍率変化（mean fold change）を示す。

【図18】本発明の例示的ポリペプチドが、対応する単一特異性抗体と比較して、ヒトＰＢＭＣにおける免疫細胞の活性化を誘導する効率を増加させたことを示す図である。ｙ軸は、本発明の各ポリペプチドについて、その対応する単一特異性抗体に対するＩＬ２産生における平均倍率変化を示す。

【図19】ＣＤ８３発現（ｙ軸）の増加により示されるように、本発明の例示的ポリペプチドが、（トランスの）別の細胞集団上のＣＴＬＡ−４との同時架橋により増強される、ＣＤ４０を介したＢ細胞活性化を誘発することを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0020】

本開示の生成物および方法の異なる用途が、当技術分野における特定のニーズに合わせて調整されうることが理解されるべきである。本明細書において使用される用語法は、本発明の特定の実施形態を記述することのみを目的とし、限定を意図していないこともまた理解されるべきである。

【0021】

加えて、本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、特に内容上明示されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、たとえば、「阻害因子（an inhibitor）」への言及は、２つ以上のかかる阻害因子を含む、または、「オリゴヌクレオチド（an oligonucleotide）」への言及は、２つ以上のかかるオリゴヌクレオチドを含む、等といったことになる。

【0022】

「ポリペプチド」は、本明細書においてその最も広い意味で使用され、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸アナログ、または他のペプチド模倣物の化合物を指す。したがって、「ポリペプチド」という用語は、短いペプチド配列ならびにより長いポリペプチドおよびタンパク質も含む。本明細書において使用される「アミノ酸」という用語は、ＤまたはＬ光学異性体の両方を含む天然および／または非天然もしくは合成アミノ酸、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣物を指す。

【0023】

本明細書において上または下のいずれであっても引用される刊行物、特許および特許出願は、ここにそれらの全体が参照により組み込まれる。

【0024】

本発明部分Ｂ１のポリペプチド−ＣＤ４０に特異的な抗体
Ｂ１は、ヒトＣＤ４０に特異的な、抗体、またはその抗原結合性断片である。本明細書において言及される「抗体」という用語は、抗体全体およびそれらの任意の抗原結合性断片（すなわち、「抗原結合性部分」）または単鎖を含む。抗体は、ジスルフィド結合により相互に接続した少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、またはその抗原結合性部分を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略す）および重鎖定常領域を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略す）および軽鎖定常領域を含む。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合性ドメインを含有する。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域に散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに分割されうる。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（たとえばエフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介しうる。

【0025】

抗体の「抗原結合性断片」という用語は、抗原、たとえばＣＤ４０に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片により遂行できることが示されている。抗体の「抗原結合性部分」という用語に包含される結合性断片の例には、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片および単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。単鎖抗体、たとえばｓｃＦｖ、および重鎖抗体、たとえばＶＨＨ、およびラクダ抗体もまた、抗体の「抗原結合性部分」という用語に包含されることが意図される。これらの抗体断片は、当業者に知られている従来技術を使用して得られ、断片は完全な抗体と同様に有用性についてスクリーニングされてもよい。

【0026】

本発明のポリペプチドは、任意の抗ＣＤ４０抗体、またはその抗原結合性断片を組み込んでいてもよい。かかる抗ＣＤ４０抗体は、好適な手段により製造できる。たとえば、かかる抗体は、組換え手段により調製、発現、創出または単離でき、たとえば（ａ）目的の免疫グロブリン遺伝子のためのトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルである動物（たとえば、マウス）またはそれから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、（ｂ）目的の抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、たとえばトランスフェクトーマから単離された抗体、（ｃ）組換え、組合せ抗体ライブラリーから単離された抗体、および（ｄ）免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う任意の他の手段により調製、発現、創出または単離された抗体である。あるいは、非ヒト動物をＣＤ４０で免疫化すること、またはインビトロでヒトリンパ球をＣＤ４０で免疫化することを含む方法により、抗ＣＤ４０抗体を製造できる。

【0027】

抗体は、典型的には、少なくとも１つの重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）および少なくとも１つの軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含む。抗体は、Ｆｃ領域、好ましくはヒトＦｃ領域、または前記領域のバリアントを含みうる。Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４領域、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４領域であってもよい。Ｆｃ領域のバリアントは、典型的には、様々な親和性で、Ｆｃ受容体、たとえばＦｃガンマＲおよび／または新生仔Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）と結合し、ポリペプチドの機能および／または半減期の改善を提供する。半減期は、未変性Ｆｃ領域を含むポリペプチドの半減期に対して、増加しても減少してもよい。

【0028】

本発明のポリペプチドにおける組込みに好ましい抗体の重鎖および軽鎖アミノ酸配列を、表Ａに示す。各配列内で、ＣＤＲ配列を下線で示す。配列はすべて、左から右にＮからＣの方向に提示されている。したがって、各配列内を左から右に読んで、ＣＤＲ１は第１の下線配列、ＣＤＲ２は第２の下線配列、ＣＤＲ３は第３の下線配列である。定常ドメインをイタリックで示す。

【0029】

【表1-1】

【0030】

【表1-2】

【0031】

【表1-3】

【0032】

【表1-4】

【0033】

抗体Ａ２−５４の重鎖のＣＤＲもまた、配列番号５０、５１および５２に示す。軽鎖のＣＤＲもまた、配列番号５３、５４および５５に示す。Ａ２−５４の６つのＣＤＲすべてもまた、以下の表に示す。

【0034】

【表2】

【0035】

抗体は、表Ａに配列を示す重鎖のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、または任意のその断片もしくはバリアントを含んでいてもよい。抗体は、表Ａに配列を示す軽鎖のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、または任意のその断片もしくはバリアントを含んでいてもよい。前記重鎖または前記軽鎖の好ましい断片は、可変領域である。

【0036】

抗体は、表Ａに示す抗体のうちのいずれか１つの重鎖（またはその断片もしくはバリアント）および軽鎖（またはその断片もしくはバリアント）の両方を含んでいてもよい。

【0037】

抗体は、表Ａに示す重鎖または軽鎖アミノ酸配列のうちの１つの断片を含んでいてもよい。たとえば、本発明の抗体は、前記アミノ酸配列に由来する少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２０個または少なくとも２５個の連続するアミノ酸の断片を含んでいてもよい。かかる断片は、好ましくは、下に論じる機能のうちの１つまたは複数、たとえばＣＤ４０に結合する能力を保持する。

【0038】

抗体は、表Ａに示す軽鎖または重鎖配列のうちのいずれか１つに由来する１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＣＤＲ配列を含んでいてもよい。抗体は、表Ａに示すＣＤＲ配列から選択される１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ配列および、代わりにまたは加えて、１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ配列を含んでいてもよい。抗体は、表Ａに示す抗体のうちのいずれか１つの重鎖ＣＤＲ配列のうちの１つ、２つまたは３つすべて、および、代わりにまたは加えて、表Ａに示す同じ前記抗体の軽鎖ＣＤＲ配列のうちの１つ、２つまたは３つすべてを含んでいてもよい。本発明の抗体は、好ましくは、表Ａに示す抗体の６つのＣＤＲ配列すべてを含む。たとえば、本発明の抗体は、表Ａに示す抗体１１０７／１１４５の６つのＣＤＲ配列すべてを含んでいてもよい。

【0039】

あるいは抗体は、上述の特定の配列のうちの１つのバリアントであってもよく、またはそれを含んでいてもよい。たとえば、バリアントは、任意の上のアミノ酸配列の置換、欠失または付加バリアントであってもよい。

【0040】

バリアント抗体は、上で論じた特定の配列および断片からの１個、２個、３個、４個、５個、１０個まで、２０個まで、３０個までまたはそれを超えるアミノ酸置換および／または欠失を含んでいてもよい。「欠失」バリアントは、個々のアミノ酸の欠失、アミノ酸の小グループ、たとえば２個、３個、４個または５個のアミノ酸の欠失、またはより大きなアミノ酸領域の欠失、たとえば特定のアミノ酸ドメインもしくは他の特徴の欠失を含んでいてもよい。「置換」バリアントは、好ましくは、１つまたは複数のアミノ酸の、同数のアミノ酸との置換えおよび保存アミノ酸置換の生成を伴う。たとえば、アミノ酸は、類似の特性を有する代替アミノ酸、たとえば別の塩基性アミノ酸、別の酸性アミノ酸、別の中性アミノ酸、別の荷電アミノ酸、別の親水性アミノ酸、別の疎水性アミノ酸、別の極性アミノ酸、別の芳香族アミノ酸または別の脂肪族アミノ酸で置換されてもよい。好適な置換基を選択するために使用できる２０の主なアミノ酸のいくつかの特性は、以下のとおりである。

【0041】

【表3】

【0042】

好ましい「誘導体」または「バリアント」には、天然アミノ酸の代わりに、配列に現れるアミノ酸がその構造類似体であるものが含まれる。配列に使用されるアミノ酸はまた、誘導体化または修飾、たとえば標識化されていてもよく、但し、抗体の機能が有意に悪影響を受けることはない。

【0043】

上述の誘導体およびバリアントは、抗体の合成中に、または、製造後修飾により、または、抗体が組換え形態であるときには、既知の技術である部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発、もしくは核酸の酵素的切断および／もしくは結合を使用して調製されてもよい。

【0044】

好ましくは、バリアント抗体は、本明細書に開示の抗体のＶ_ＬもしくはＶ_Ｈドメイン、またはその断片に対して６０％超、または７０％超、たとえば７５または８０％、好ましくは８５％超、たとえば９０または９５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を有する。このレベルのアミノ酸同一性は、関連する配列番号の配列の全長または配列の一部、たとえば全長ポリペプチドのサイズに応じて、２０個、３０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個またはそれを超えるアミノ酸にわたって見出されうる。

【0045】

アミノ酸配列との関連で、「配列同一性」は、以下のパラメータでＣｌｕｓｔａｌＷ（上のThompson et al., 1994）を使用して評価したときに表示値を有する配列を指す。

【0046】

ペアワイズアラインメントパラメータ−メソッド：アキュレート、マトリクス：ＰＡＭ、ギャップオープンペナルティ：１０．００、ギャップエクステンションペナルティ：０．１０、

【0047】

マルチプルアラインメントパラメータ−マトリクス：ＰＡＭ、ギャップオープンペナルティ：１０．００、ディレイに対する％同一性：３０、ペナライズエンドギャップ：オン、ギャップセパレーションディスタンス：０、ネガティブマトリクス：ｎｏ、ギャップエクステンションペナルティ：０．２０、残基特異的ギャップペナルティ：オン、親水性ギャップペナルティ：オン、親水性残基：ＧＰＳＮＤＱＥＫＲ。特定の残基における配列同一性は、単純に誘導体化された同一の残基を含むことが意図されている。

【0048】

したがって、本発明は、特定の重鎖および軽鎖アミノ酸配列、ならびに、これらの鎖の機能または活性を維持するそれらのバリアントおよび断片を有する抗体を提供する。

【0049】

したがって、抗体は、
（ａ）配列番号６１、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６もしくは８８のうちのいずれか１つの重鎖アミノ酸配列、
（ｂ）抗体がＣＤ４０に特異的に結合する能力を保持する、（ａ）の少なくとも７個のアミノ酸の断片、たとえば可変領域、または
（ｃ）抗体がＣＤ４０に特異的に結合する能力を保持する、（ａ）の配列に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有する（ａ）のバリアント
を含んでいてもよい。

【0050】

抗体は、
（ａ）配列番号６２、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７もしくは８９のうちのいずれか１つの軽鎖アミノ酸配列、
（ｂ）抗体がＣＤ４０に特異的に結合する能力を保持する、（ａ）の少なくとも７個のアミノ酸の断片、たとえば可変領域、または
（ｃ）抗体がＣＤ４０に特異的に結合する能力を保持する、（ａ）の配列に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有する（ａ）のバリアント
を含んでいてもよい。

【0051】

抗体は、本明細書に記載の任意の特定の抗体、断片およびバリアントと同じエピトープに結合してもよい。好ましくは、それは、表Ａに示す抗体、または表Ａに示す抗体の６つのＣＤＲすべてを有する抗体と同じエピトープに結合する。

【0052】

抗体、またはその抗原結合性断片は、一定の好ましい結合特性および機能効果を有し、それらを下でより詳細に説明する。前記抗体、またはその抗原結合性断片は、好ましくは、本発明のポリペプチドの一部として組み込まれるときに、これらの結合特性および機能効果を保持する。

【0053】

抗体は、好ましくは、ＣＤ４０に特異的に結合し、すなわち、それはＣＤ４０に結合するが、他の分子に結合しないか、またはより低い親和性で他の分子に結合する。本明細書において使用されるＣＤ４０という用語は、典型的には、ヒトＣＤ４０を指す。ヒトＣＤ４０の配列は、配列番号４５に記載されている。抗体は、他の哺乳動物に由来するＣＤ４０、たとえば非ヒト霊長類（たとえばカニクイザル）またはマウスに由来するＣＤ４０に対して、一定の結合親和性を有していてもよい。抗体は、好ましくは、細胞の表面上に局在するときに、ヒトＣＤ４０に結合する。

【0054】

抗体は、その自然状態でＣＤ４０、特に細胞の表面上に局在するＣＤ４０に結合する能力を有する。好ましくは、抗体はＣＤ４０に特異的に結合する。すなわち、本発明の抗体は、好ましくは、それが別の分子に結合するよりも大きな結合親和性でＣＤ４０に結合する。

【0055】

「細胞の表面上に局在する」によって、ＣＤ４０の１つまたは複数の領域が細胞表面の外面上に存在するように、ＣＤ４０が細胞と関連付けられることが意図される。たとえば、ＣＤ４０は、細胞原形質膜内に挿入（すなわち、膜貫通タンパク質として適応）され、１つまたは複数の領域が細胞外表面上に存在してもよい。これは、細胞によるＣＤ４０の発現の過程で生じうる。したがって、一実施形態において、「細胞の表面上に局在する」は、「細胞の表面上に発現する」を意味することもある。あるいは、ＣＤ４０は、細胞の外側にあって、共有結合性および／またはイオン性相互作用がそれを細胞表面の特定の領域（複数可）に局在させてもよい。

【0056】

抗体は、ＣＤ４０を発現する細胞の活性を調節してもよく、前記調節は、前記細胞の活性の増加または減少である。細胞は、典型的には、樹状細胞またはＢ細胞である。

【0057】

ＣＤ４０を介したシグナル伝達が生じるときに、専門のＡＰＣ、たとえば樹状細胞が活性化し、これは、免疫細胞活性化、増殖、ならびにサイトカインおよびケモカインの産生を含む、複数の生物学的事象を誘発する。ＣＤ４０と関連付けられる樹状細胞活性化を決定するための方法は、当技術分野において知られており（たとえば、Schonbeck et al., 2001, Cell Mol Life Sci., 58:40-43；van Kooten et al., 2000, J. Leuk., Biol., 67: 2-17に論じられている）、下でさらに記載する。

【0058】

組換えＣＤ４０Ｌまたは抗ＣＤ４０抗体によるヒトＢ細胞の刺激は、表面マーカー、たとえばＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＦａｓおよびＭＨＣ ＩＩの上方制御、可溶性サイトカイン、たとえばＩＬ−６、ＴＮＦ−γおよびＴＮＦ−αの分泌、ならびに同型凝集を誘導する。ＣＤ４０関連Ｂ細胞活性化を決定するための方法は、当技術分野において知られており、下でさらに記載する。

【0059】

樹状細胞およびＢ細胞の活性を調節する抗体の能力を決定するための方法およびアッセイは、当技術分野においてよく知られている。たとえば、樹状細胞の活性化は、細胞表面マーカー、たとえばＣＤ８６およびＣＤ８０のレベルを測定することにより、ならびに／またはＴ細胞からのＩＦＮγの抗ＣＤ４０抗体誘導性分泌を測定することにより評価でき、これらパラメータのいずれかの増加は活性化の増加を示し、減少は活性化の減少を表す。同様に、Ｂ細胞の活性化を調節する抗体の能力は、細胞表面マーカー（たとえばＣＤ８６）のレベルを測定することにより、ならびに／または抗ＣＤ４０抗体誘導性Ｂ細胞増殖を測定することにより評価でき、これらパラメータのいずれかの増加は活性化の増加を示し、減少は活性化の減少を表す。

【0060】

「結合活性」および「結合親和性」という用語は、抗体分子の、標的に結合するまたは結合しない傾向性を指すことが意図されている。結合親和性は、抗体およびその標的について解離定数（Ｋｄ）を決定することにより定量できる。同様に、抗体の、その標的に対する結合の特異性は、抗体および別の非標的分子に関する解離定数と比較した、抗体のその標的に対する比較解離定数（Ｋｄ）の観点から定義できる。

【0061】

典型的には、標的に関する抗体のＫｄは、他の非標的分子、たとえば無関係の物質または環境中の並存物質に関するＫｄの２分の１、好ましくは５分の１、より好ましくは１０分の１である。より好ましくは、Ｋｄは、５０倍分の１、より一層好ましくは１００分の１、さらに一層好ましくは２００分の１である。

【0062】

この解離定数の値は、よく知られている方法により直接的に決定でき、Caceci et al. (Byte 9:340-362, 1984)に記載の方法等により、複雑な混合物についてさえも計算できる。たとえば、Ｋｄは、二重フィルターニトロセルロースろ過結合アッセイ、たとえばWong & Lohman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5428-5432, 1993)により開示のものを使用して確立できる。リガンド、たとえば抗体の標的に対する結合能力を評価するための他の標準的アッセイが当技術分野において知られており、たとえば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ＲＩＡ、およびフローサイトメトリー解析が含まれる。抗体の結合動態（たとえば結合親和性）もまた、当技術分野において知られている標準的アッセイ、たとえばＢｉａｃｏｒｅ（商標）システム解析により評価できる。

【0063】

抗体の標的に対する結合が、その標的の別の既知のリガンド、たとえば別の抗体による標的への結合と比較される、競合結合アッセイを実施できる。５０％阻害が生じる濃度はＫｉとして知られている。理想的条件下で、ＫｉはＫｄと等しい。Ｋｉ値は、Ｋｄより低くなることは決してなく、したがって、Ｋｉの測定は、Ｋｄの上限を与えるために都合よく代替される。

【0064】

本発明の抗体は、好ましくは、別の非標的分子に結合する親和性の少なくとも２倍、１０倍、５０倍、１００倍またはそれを超える親和性で、その標的に結合可能である。

【0065】

抗体は、ヒト抗体であってもよい。本明細書において使用される「ヒト抗体」という用語は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことが意図されている。さらに、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域もまた、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（たとえば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発またはインビボでの体細胞変異により導入される変異）を含んでいてもよい。しかしながら、本明細書において使用される「ヒト抗体」という用語は、別の哺乳動物種、たとえばマウスの生殖系列に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列上に移植された抗体を含むことは意図されていない。

【0066】

本発明部分Ｂ２のポリペプチド−ＣＴＬＡ−４に特異的な結合性ドメイン
ＣＤ８６およびＣＤ８０は、本明細書において、Ｂ７タンパク質（それぞれＢ７−２およびＢ７−１）と呼ばれうる。これらのタンパク質は、抗原提示細胞上に発現し、Ｔ細胞受容体ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４と相互作用する。ＣＤ２８へのＢ７分子の結合は、Ｔ細胞活性化を促進する一方で、ＣＴＬＡ−４へのＢ７分子の結合は、Ｔ細胞の活性化のスイッチをオフにする。Ｂ７タンパク質とＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ−４との間の相互作用は、免疫活性化および調節において重要な役割を果たす共刺激シグナル伝達経路を構成する。したがって、Ｂ７分子は、経路の一部であり、免疫阻害を解き、それにより患者における免疫を増強するための操作が可能である。

【0067】

ＣＤ８６タンパク質は単量体であり、２つの細胞外免疫グロブリンスーパーファミリードメインからなる。ＣＤ８６の受容体結合性ドメインは、典型的なＩｇＶセット構造を有しており、一方で膜近接ドメインは、Ｃ１セット様構造を有する。ＣＤ８０およびＣＤ８６の構造は、それら自体で、またはＣＴＬＡ−４との複合体において決定されてきた。ＣＤ８０およびＣＤ８６分子上の接触残基は、可溶性細胞外ドメインにあり、ほとんどがベータシートに位置し、（ＣＤＲ様）ループには位置しない。

【0068】

配列番号３は、ヒト野生型ＣＤ８６の単量体可溶性細胞外ドメインのアミノ酸配列である。この野生型配列は、位置２４および２５のＮ末端のアラニンおよびプロリンを任意選択で欠いていてもよい。これらのアミノ酸はそれぞれ、本明細書においてＡ２４およびＰ２５と呼ばれうる。

【0069】

本発明のポリペプチドの部分Ｂ２は、ＣＴＬＡ−４に特異的なポリペプチド結合性ドメインである。前記結合性ドメインは、ＣＤ２８にもまた結合してもよい。本明細書において使用されるＣＴＬＡ−４という用語は、典型的にはヒトＣＴＬＡ−４を指し、本明細書において使用されるＣＤ２８という用語は、典型的にはヒトＣＤ２８を指す。ヒトＣＴＬＡ−４およびヒトＣＤ２８の配列はそれぞれ、配列番号１および２に記載されている。本発明のポリペプチドの部分Ｂ２は、他の哺乳動物に由来するＣＴＬＡ−４またはＣＤ２８、たとえば霊長類またはマウスＣＴＬＡ−４またはＣＤ２８に対して、一定の結合親和性を有していてもよい。

【0070】

本発明のポリペプチドの部分Ｂ２は、その自然状態でＣＴＬＡ−４、特に細胞の表面上に局在するＣＴＬＡ−４に結合する能力を有する。「細胞の表面上に局在する」によって、ＣＴＬＡ−４の１つまたは複数の領域が細胞表面の外面上に存在するように、ＣＴＬＡ−４が細胞と関連付けられることが意図される。たとえば、ＣＴＬＡ−４は、細胞原形質膜内に挿入（すなわち、膜貫通タンパク質として適応）され、１つまたは複数の領域が細胞外表面上に存在してもよい。これは、細胞によるＣＴＬＡ−４の発現の過程で生じうる。したがって、一実施形態において、「細胞の表面上に局在する」は、「細胞の表面上に発現する」を意味することもある。あるいは、ＣＴＬＡ−４は、細胞の外側にあって、共有結合性および／またはイオン性相互作用がそれを細胞表面の特定の領域（複数可）に局在させてもよい。

【0071】

本発明のポリペプチドの部分Ｂ２は、
（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列、または
（ｉｉ）前記結合性ドメインが、野生型ヒトＣＤ８６よりも高い親和性でヒトＣＴＬＡ−４と結合するという条件で、配列番号３のアミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸が変化しているアミノ酸配列
を含むか、またはそれらからなっていてもよい。換言すれば、Ｂ２は、（ｉ）ヒト野生型ＣＤ８６の単量体可溶性細胞外ドメイン、または（ｉｉ）ポリペプチドバリアントが、野生型ヒトＣＤ８６よりも高い親和性でヒトＣＴＬＡ−４と結合するという条件で、前記可溶性細胞外ドメインのポリペプチドバリアントを含むか、またはそれらからなる、ヒトＣＴＬＡ−４に特異的なポリペプチド結合性ドメインである。

【0072】

したがって、本発明のポリペプチドの部分Ｂ２は、ヒト野生型ＣＤ８６と同じ標的結合特性を有していてもよく、またはヒト野生型ＣＤ８６の標的結合特性と比較して異なる標的結合特性を有していてもよい。かかる特性を比較する目的のため、「ヒト野生型ＣＤ８６」は典型的には、前のセクションに記載したとおり、ヒト野生型ＣＤ８６の単量体可溶性細胞外ドメインを指す。

【0073】

ヒト野生型ＣＤ８６は、２つの標的、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８に特異的に結合する。したがって、本発明のポリペプチドの部分Ｂ２の結合特性は、これら標的のそれぞれに結合するポリペプチドの能力の個別の測定値として表すこともできる。たとえば、ヒト野生型ＣＤ８６の単量体細胞外ドメインのポリペプチドバリアントは、好ましくは、野生型ヒトＣＤ８６のＣＴＬＡ−４に対する結合親和性よりも高い結合親和性でＣＴＬＡ−４に結合する。かかるポリペプチドはまた、任意選択で、野生型ヒトＣＤ８６のＣＤ２８に対する結合親和性よりも低い結合親和性でＣＤ２８に結合してもよい。

【0074】

リガンドの標的に対する結合能力を評価するための標準的アッセイが当技術分野においてよく知られており、たとえば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ＲＩＡ、およびフローサイトメトリー解析が含まれる。ポリペプチドの結合動態（たとえば結合親和性）もまた、当技術分野において知られている標準的アッセイ、たとえば表面プラズモン共鳴解析（ＳＰＲ）により評価できる。

【0075】

「結合活性」および「結合親和性」という用語は、ポリペプチド分子の、標的に結合するまたは結合しない傾向性を指すことが意図されている。結合親和性は、ポリペプチドおよびその標的について解離定数（Ｋｄ）を決定することにより定量できる。より低いＫｄは、標的に対するより高い親和性を示す。同様に、ポリペプチドの、その標的に対する結合の特異性は、ポリペプチドおよび別の非標的分子に関する解離定数と比較した、ポリペプチドのその標的に対する比較解離定数（Ｋｄ）の観点から定義できる。

【0076】

解離定数Ｋｄの値は、よく知られている方法により直接的に決定でき、Caceci et al. (Byte 9:340-362, 1984)に記載の方法等により、複雑な混合物についてさえも計算できる。たとえば、Ｋｄは、二重フィルターニトロセルロースろ過結合アッセイ、たとえばWong & Lohman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5428-5432, 1993)により開示のものを使用して確立できる。ポリペプチドの標的に対する結合が、その標的の別の既知のリガンド、たとえば別のポリペプチドによる標的への結合と比較される、競合結合アッセイを実施できる。この場合、野生型ヒトＣＤ８６の可溶性細胞外ドメイン（任意選択で、ＮまたはＣ末端で検出可能ドメイン、たとえばＦｃドメインまたはＩｇドメインに連結している）は、好適な代替リガンドである。５０％阻害が生じる濃度はＫｉとして知られている。理想的条件下で、ＫｉはＫｄと等しい。Ｋｉ値は、Ｋｄより低くなることは決してなく、したがって、Ｋｉの測定は、Ｋｄの上限を与えるために都合よく代替される。

【0077】

結合親和性の代替的測定値には、ＥＣ５０またはＩＣ５０が含まれる。この文脈において、ＥＣ５０は、ポリペプチドが固定量の標的に対してその最大結合の５０％を達成する濃度を示す。ＩＣ５０は、ポリペプチドが固定量の標的に対する固定量の競合物の最大結合の５０％を阻害する濃度を示す。両方の場合において、より低いレベルのＥＣ５０またはＩＣ５０は、標的に対するより高い親和性を示す。リガンドのその標的に対するＥＣ５０およびＩＣ５０の値は両方とも、よく知られている方法、たとえばＥＬＩＳＡにより決定できる。ポリペプチドのＥＣ５０およびＩＣ５０を評価するのに好適なアッセイは、実施例に記載されている。

【0078】

本発明のポリペプチドの部分Ｂ２は、ＣＴＬＡ−４に特異的なポリペプチド結合性ドメインである。これは、それが好ましくは、別の分子に結合するよりも大きな結合親和性でＣＴＬＡ−４に結合することを意味する。部分Ｂ２は、好ましくは、野生型ヒトＣＤ８６のＣＴＬＡ−４に対する結合親和性と同じか、またはそれよりも高い結合親和性で、ＣＴＬＡ−４に結合する。

【0079】

好ましくは、本発明のポリペプチド部分Ｂ２のヒトＣＴＬＡ−４に対するＫｄは、野生型ヒトＣＤ８６のヒトＣＴＬＡ−４に関するＫｄの２分の１以下、２．５分の１以下、３分の１以下、３．５分の１以下、４分の１以下、４．５分の１以下、５分の１以下、５．５分の１以下、８分の１以下または１０分の１以下である。最も好ましくは、部分Ｂ２のヒトＣＴＬＡ−４に関するＫｄは、野生型ヒトＣＤ８６のヒトＣＴＬＡ−４に関するＫｄの５分の１以下または１０分の１以下であると考えられる。ポリペプチドのＣＴＬＡ−４に関するＫｄを決定するための好ましい方法は、たとえばＢｉａｃｏｒｅ（商標）システムを用いたＳＰＲ解析である。ポリペプチドのＳＰＲ解析に好適なプロトコルは、実施例に記載されている。

【0080】

好ましくは、本発明のポリペプチド部分Ｂ２のヒトＣＴＬＡ−４に対するＥＣ５０は、同条件下の野生型ヒトＣＤ８６のヒトＣＴＬＡ−４に関するＥＣ５０の３分の２以下、２分の１以下、３分の１以下、５分の１以下、１０分の１以下、１２分の１以下、１４分の１以下、１５分の１以下、１７分の１以下、２０分の１以下、２５分の１以下または５０分の１以下である。最も好ましくは、部分Ｂ２のヒトＣＴＬＡ−４に関するＥＣ５０は、同条件下の野生型ヒトＣＤ８６のヒトＣＴＬＡ−４に関するＥＣ５０の１０分の１以下または２５分の１以下である。ポリペプチドのＣＴＬＡ−４に関するＥＣ５０を決定するための好ましい方法は、ＥＬＩＳＡを介する。ポリペプチドのＥＣ５０の評価における使用のために好適なＥＬＩＳＡアッセイは、実施例に記載されている。

【0081】

好ましくは、ヒトＣＴＬＡ−４との結合について野生型ヒトＣＤ８６と競合するとき、本発明のポリペプチド部分Ｂ２のヒトＣＴＬＡ−４に関するＩＣ５０は、同条件下の野生型ヒトＣＤ８６のＩＣ５０の２分の１以下、３分の１以下、４分の１以下、５分の１以下、１０分の１以下、１３分の１以下、１５分の１以下、５０分の１以下、１００分の１以下、または３００分の１以下である。最も好ましくは、部分Ｂ２のＩＣ５０は、同条件下の野生型ヒトＣＤ８６のＩＣ５０の１０分の１以下または３００分の１以下である。本発明のポリペプチドのＩＣ５０を決定するための好ましい方法は、ＥＬＩＳＡを介する。本発明のポリペプチドのＩＣ５０の評価における使用のために好適なＥＬＩＳＡアッセイは、実施例に記載されている。

【0082】

本発明のポリペプチドの部分Ｂ２はまた、ＣＤ２８と特異的に結合してもよい。すなわち、部分Ｂ２は、それがＣＴＬＡ−４以外の別の分子に結合するよりも大きな結合親和性でＣＤ２８に結合してもよい。部分Ｂ２は、野生型ヒトＣＤ８６のヒトＣＤ２８に対する親和性よりも低い親和性でヒトＣＤ２８に結合してもよい。好ましくは、部分Ｂ２のヒトＣＤ２８に関するＫｄは、野生型ヒトＣＤ８６のヒトＣＤ２８に関するＫｄよりも少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍高い。

【0083】

本発明のポリペプチドの部分Ｂ２の結合特性はまた、２つの標的、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８に結合するポリペプチドの能力の相対的測定値として表することもできる。すなわち、部分Ｂ２の結合特性は、ＣＴＬＡ−４に結合するポリペプチドの能力に対する、ＣＤ２８に結合するその能力の相対的測定値として表することもできる。好ましくは、部分Ｂ２は、ＣＴＬＡ−４に対してＣＤ２８に結合するヒト野生型ＣＤ８６の相対的能力と比較して、ＣＴＬＡ−４に対してＣＤ２８に結合する相対的能力が増加する。

【0084】

同じパラメータ（たとえばＫｄ、ＥＣ５０）を使用して、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８の両方に対するポリペプチドの結合親和性が評価されるとき、各標的に対するポリペプチドの相対的結合能力は、各標的についてのパラメータの値の単純な比としてすることもできる。この比は、ポリペプチドの結合比または結合強度比と呼ばれうる。結合親和性を評価するために使用される多くのパラメータ（たとえばＫｄ、ＥＣ５０）について、より低い値がより高い親和性を示す。この場合には、ＣＴＬＡ−４に対するＣＤ２８の結合親和性の比は、好ましくは、以下の式により算出される単一の数値として表される。
結合比＝［ＣＤ２８に対する結合親和性］÷［ＣＴＬＡ−４に対する結合親和性］
あるいは、より高い値がより高い親和性を示すパラメータを使用して結合親和性が評価される場合、上の式の逆数が好ましい。いずれの文脈においても、本発明のポリペプチドの部分Ｂ２は、好ましくは、ヒト野生型ＣＤ８６よりも高い結合比を有する。所定のポリペプチドの結合比と別のポリペプチドの結合比との直接的な比較は、典型的には、結合親和性を評価して両方のポリペプチドの結合比を算出するために、同じパラメータが使用されることが必要であることが認められる。

【0085】

好ましくは、ポリペプチドの結合比は、ポリペプチドの各標的に対するＫｄを決定し、次に式［ＣＤ２８に対するＫｄ］÷［ＣＴＬＡ−４に対するＫｄ］により比を算出することにより算出される。この比は、ポリペプチドのＫｄ結合比と呼ばれうる。ポリペプチドの標的に対するＫｄを決定するための好ましい方法は、たとえばＢｉａｃｏｒｅ（商標）システムを用いたＳＰＲ解析である。本発明のポリペプチドのＳＰＲ解析のための好適なプロトコルは、実施例に記載されている。この方法により算出される本発明のポリペプチドの部分Ｂ２の結合比は、好ましくは、同じ方法により算出される野生型ヒトＣＤ８６の結合比よりも少なくとも２倍または少なくとも４倍高い。

【0086】

あるいは、ポリペプチドの結合比は、ポリペプチドの各標的に対するＥＣ５０を決定し、次に式［ＣＤ２８に対するＥＣ５０］÷［ＣＴＬＡ−４に対するＥＣ５０］により比を算出することにより算出されてもよい。この比は、ポリペプチドのＥＣ５０結合比と呼ばれうる。ポリペプチドの標的に対するＥＣ５０を決定するための好ましい方法は、ＥＬＩＳＡを介する。本発明のポリペプチドのＥＣ５０の評価における使用のための好適なＥＬＩＳＡアッセイは、実施例に記載されている。この方法により算出される本発明のポリペプチド部分Ｂ２の結合比は、同じ方法により算出される野生型ヒトＣＤ８６の結合比よりも少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍または少なくとも１０倍高い。

【0087】

本発明のポリペプチドの部分Ｂ２は、ＣＴＬＡ−４に結合するための別のポリペプチドと交差競合する（cross-compete）する能力を有する。たとえば、部分Ｂ２は、ＣＴＬＡ−４に結合するための配列番号６から２４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドと交差競合してもよい。かかる交差競合ポリペプチドは、標準的な結合アッセイにおいて同定されてもよい。たとえば、交差競合を実証するために、ＳＰＲ解析（たとえばＢｉａｃｏｒｅ（商標）システムを用いたもの）、ＥＬＩＳＡアッセイまたはフローサイトメトリーを使用できる。

【0088】

上の機能特性に加えて、本発明のポリペプチドの部分Ｂ２は、一定の好ましい構造特性を有する。Ｂ２は、（ｉ）ヒト野生型ＣＤ８６の単量体可溶性細胞外ドメイン、または（ｉｉ）ポリペプチドバリアントが、野生型ヒトＣＤ８６よりも高い親和性でヒトＣＴＬＡ−４と結合するという条件で、前記可溶性細胞外ドメインのポリペプチドバリアントを含むか、またはそれらからなるかのいずれかである。

【0089】

ヒト野生型ＣＤ８６の単量体可溶性細胞外ドメインのポリペプチドバリアントは、ヒト野生型ＣＤ８６のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列、具体的には、任意選択でＡ２４およびＰ２５を欠く、ヒト野生型ＣＤ８６の可溶性細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号３）を含むか、またはそれからなる。特に、バリアントは、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）と比較して少なくとも１つのアミノ酸が変化しているアミノ酸配列を含む。「変化している」により、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）と比較して少なくとも１つのアミノ酸が欠失しているか、挿入されているか、または置換されていることが意図されている。「欠失している」により、アミノ酸配列が１アミノ酸短くなるように、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）に存在する少なくとも１つのアミノ酸が除去されていることが意図されている。「挿入されている」により、アミノ酸配列が１アミノ酸長くなるように、少なくとも１つの追加のアミノ酸が配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）中に導入されていることが意図されている。「置換されている」により、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）の少なくとも１つのアミノ酸が、代替アミノ酸に置き換えられていることが意図されている。

【0090】

本明細書におけるアミノ酸は、下に記載するように、完全名、３文字の略号または１文字の略号で呼ばれうる。

【0091】

【表4】

【0092】

典型的には、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）と比較して、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個または９個のアミノ酸が変化している。典型的には、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）と比較して、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、２個または1個以下のアミノ酸が変化している。任意のこれらの下限が、任意のこれらの上限と組み合わされて、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）と比較して許容される変化の数の範囲を定義してもよいことが認められる。したがって、たとえば、本発明のポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）と比較して許容されるアミノ酸変化の数が、２から３、２から４、２から５、２から６、２から７、２から８、２から９、２から１０、３から４、３から５、３から６等の範囲である、アミノ酸配列を含んでいてもよい。

【0093】

配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）と比較して、少なくとも２個のアミノ酸が変化していることが特に好ましい。好ましくは、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）と比較して許容されるアミノ酸変化の数は、２から９、２から８または２から７の範囲である。

【0094】

上述の数および範囲は、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）と比較した欠失、挿入または置換の任意の組合せで達成できる。たとえば、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）と比較して、欠失のみ、挿入のみ、もしくは置換のみ、または欠失、挿入もしくは置換の任意の混合があってもよい。好ましくは、バリアントは、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）と比較して、すべての変化が置換であるアミノ酸配列を含む。すなわち、配列番号３の配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）と比較して、アミノ酸が欠失も挿入もされていない配列である。好ましいバリアントのアミノ酸配列において、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）と比較して、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、または８個のアミノ酸が置換されており、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）と比較して、アミノ酸が欠失も挿入もされていない。

【0095】

好ましくは、配列番号３の配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）と比較した変化は、配列番号３のＦＧループ領域（位置１１４から１２１）および／またはベータシート領域にある。ベータシート領域の鎖は、配列番号３に以下の位置を有する。すなわち、Ａ：２７〜３１、Ｂ：３６〜３７、Ｃ：５４〜５８、Ｃ’：６４〜６９、Ｃ’’：７２〜７４、Ｄ：８６〜８８、Ｅ：９５〜９７、Ｆ：１０７〜１１３、Ｇ：１２２〜１３３。

【0096】

最も好ましくは、配列番号３の配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）と比較した変化は、３２、４８、４９、５４、７４、７７、７９、１０３、１０７、１１１、１１８、１２０、１２１、１２２、１２５、１２７または１３４から選択される１つまたは複数の位置にある。本明細書におけるアミノ酸位置のすべてのナンバリングは、配列番号４においてＮ末端から始めてアミノ酸を数えることに基づく。したがって、配列番号３のＮ末端の最初の位置は２４とナンバリングされる（図４のスキーム図を参照のこと）。

【0097】

特に好ましい挿入には、位置１１６と１１７との間に挿入される単一の追加アミノ酸、および／または、位置１１８と１１９との間に挿入される単一の追加アミノ酸が含まれる。挿入されるアミノ酸は、好ましくは、チロシン（Ｙ）、セリン（Ｓ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）またはアスパラギン酸（Ｄ）である。

【0098】

特に好ましい置換は、位置１２２においてであり、これはアルギニン（Ｒ）である。本発明のポリペプチドは、好ましくは、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）と比較して、位置１２２が置換されているアミノ酸配列を含む。位置１２２における最も好ましい置換は、アルギニン（Ｒ）を、リジン（Ｋ）またはアスパラギン（Ｎ）と置き換えるものであり、好ましい順に並べている。この置換は、Ｒ１２２Ｋ／Ｎと呼ばれうる。

【0099】

他の好ましい置換は、位置１０７、１２１および１２５におけるものであり、これらはそれぞれ、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）およびグルタミン酸（Ｑ）である。位置１２２における置換に加えて、本発明のポリペプチドは、好ましくは、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠く前記配列）と比較して、位置１０７、１２１および１２５におけるアミノ酸のうちの少なくとも１つもまた置換されているアミノ酸配列を含む。本発明のポリペプチドのアミノ酸配列はまた、位置３２、４８、４９、５４、６４、７４、７７、７９、１０３、１１１、１１８、１２０、１２７および１３４のうちの１つまたは複数において置換されていてもよい。

【0100】

位置１０７における最も好ましい置換は、ロイシン（Ｌ）を、イソロイシン（Ｉ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはアルギニン（Ｒ）と置き換えるものであり、好ましい順に並べている。この置換は、Ｌ１０７Ｉ／Ｆ／Ｒと呼ばれうる。類似の表示法が本明細書に記載の他の置換のために使用される。位置１２１における最も好ましい置換は、イソロイシン（Ｉ）を、バリン（Ｖ）と置き換えるものである。この置換は、Ｉ１２１Ｖと呼ばれうる。位置１２５における最も好ましい置換は、グルタミン（Ｑ）を、グルタミン酸（Ｅ）と置き換えるものである。この置換は、Ｑ１２５Ｅと呼ばれうる。

【0101】

本発明のポリペプチドのアミノ酸配列において好ましくありうる他の置換は、以下を含む。すなわち、Ｆ３２Ｉ、Ｑ４８Ｌ、Ｓ４９Ｔ、Ｖ５４Ｉ、Ｖ６４Ｉ、Ｋ７４Ｉ／Ｒ、Ｓ７７Ａ、Ｈ７９Ｄ／Ｓ／Ａ、Ｋ１０３Ｅ、Ｉ１１１Ｖ、Ｔ１１８Ｓ、Ｍ１２０Ｌ、Ｎ１２７Ｓ／ＤおよびＡ１３４Ｔ。

【0102】

ヒト野生型ＣＤ８６の前記可溶性細胞外ドメインの特に好ましいバリアントは、配列番号６から２４の以下のアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含むか、またはそれからなる。

【0103】

【表5】

【0104】

配列番号６から１４に示すアミノ酸配列は、追加の残基ＡＰをＮ末端に任意選択で含んでいてもよい。配列番号１５から２４に示すアミノ酸配列は、残基ＡＰをＮ末端に任意選択で欠いていてもよい。いずれかの場合において、これらの残基は、配列番号３のＡ２４およびＰ２５に相当する。

【0105】

本発明のポリペプチドの部分Ｂ２は、ヒト野生型ＣＤ８６の前記可溶性細胞外ドメインの上述のバリアントの任意のものを含んでいてもよいか、またはそれからなっていてもよい。すなわち、本発明のポリペプチドの部分Ｂ２は、配列番号６から２４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含んでいてもよいか、またはそれからなっていてもよい。

【0106】

結合性ドメインは、たとえばＣＴＬＡ−４を発現する細胞、たとえばＴ細胞に投与されるとき、ＣＴＬＡ−４からのシグナル伝達を調節してもよい。好ましくは、結合性ドメインは、前記シグナル伝達を減少させ、すなわちそれを阻害または遮断し、それにより前記細胞の活性化を増加させる。薬剤（たとえば結合性ドメイン）の投与の結果としてのＣＴＬＡ−４シグナル伝達および細胞活性化における変化は、任意の好適な方法により決定されてもよい。好適な方法には、薬剤の存在下または好適な対照の存在下で、Ｔ細胞の表面上に発現するＣＴＬＡ−４に結合し、それを通じてシグナル伝達する（たとえばラージ細胞上の）膜結合性ＣＤ８６の能力のアッセイが含まれる。対照の存在下でのＴ細胞ＩＬ−２産生のレベルおよび／またはＴ細胞増殖に対する、薬剤の存在下でのＴ細胞ＩＬ−２産生のレベルの増加またはＴ細胞増殖の増加は、ＣＴＬＡ−４を通じたシグナル伝達の減少および細胞活性化の増加を示す。このタイプの典型的なアッセイは、ＵＳ２００８０２３３１２２の実施例９に開示されている。

【0107】

本発明のポリペプチド
本発明のポリペプチドは、ヒトＣＴＬＡ−４およびヒトＣＤ４０の両方に特異的に結合可能であり、Ｂ１およびＢ２を含み、
Ｂ１は、ヒトＣＤ４０に特異的な抗体、またはその抗原結合性断片であり、
Ｂ２は、
（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列、または
（ｉｉ）前記結合性ドメインが、野生型ヒトＣＤ８６よりも高い親和性でヒトＣＴＬＡ−４と結合するという条件で、配列番号３のアミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸が変化しているアミノ酸配列
を含むか、またはそれらからなる、ヒトＣＴＬＡ−４に特異的なポリペプチド結合性ドメインである。ＣＴＬＡ−４およびＣＤ４０の両方に特異的に結合可能であることにより、各部分について上述の定義により、部分Ｂ１がＣＤ４０に特異的に結合し、部分Ｂ２がＣＴＬＡ−４に特異的に結合することが意図されている。好ましくは、部分Ｂ１およびＢ２のそれぞれの標的に対する結合特性は、それらが本発明のポリペプチドの一部として存在するときに、別々の部分として存在するときの部分Ｂ１およびＢ２の前記特性と比較して、変化しないか、または実質的に変化しない。本発明のポリペプチドの一部として存在するときの部分Ｂ１およびＢ２の結合特性は、任意の好適なアッセイにより評価できる。特に、それぞれ別々の部分についての上述のアッセイはまた、それらが本発明のポリペプチドの一部として存在するときのＢ１およびＢ２にも適用されうる。本発明のポリペプチドの結合特性を評価するための好適なアッセイはまた、実施例に記載されている。

【0108】

本発明のポリペプチドの部分Ｂ１は、抗体、またはその抗原結合性断片であり、これは典型的には、少なくとも１つの重鎖（Ｈ）および／または少なくとも１つの軽鎖（Ｌ）を含む。本発明のポリペプチドの部分Ｂ２は、Ｂ１の任意の部分に結合していてもよいが、典型的には、前記少なくとも１つの重鎖（Ｈ）または少なくとも１つの軽鎖（Ｌ）に、好ましくはＮまたはＣ末端のいずれかにおいて結合していてもよい。本発明のポリペプチドの部分Ｂ２は、直接的にまたは任意の好適な結合分子（リンカー）を介して間接的に、そのように結合していてもよい。

【0109】

部分Ｂ１は、好ましくは、少なくとも１つの重鎖（Ｈ）および少なくとも１つの軽鎖（Ｌ）を含み、部分Ｂ２は、好ましくは、前記重鎖（Ｈ）または前記軽鎖（Ｌ）のいずれかのＮまたはＣ末端に結合している。Ｂ１の例示的抗体は、２つの同一の重鎖（Ｈ）および２つの同一の軽鎖（Ｌ）からなる。かかる抗体は、典型的には、２本のアームとして構成され、そのそれぞれが、ヘテロ二量体として連結した１つのＨおよび１つのＬを有し、２本のアームは、Ｈ鎖間のジスルフィド結合により連結している。したがって、抗体は、事実上、２つのＨ−Ｌヘテロ二量体から形成されるホモ二量体である。本発明のポリペプチドの部分Ｂ２は、かかる抗体の両方のＨ鎖もしくは両方のＬ鎖、または１つのＨ鎖のみ、もしくは１つのＬ鎖のみと結合していてもよい。

【0110】

したがって、あるいは本発明のポリペプチドは、ＣＴＬＡ−４に特異的な少なくとも１つのポリペプチド結合性ドメインが結合している抗ＣＤ４０抗体、またはその抗原結合性断片として記載されうるのであり、これは、ヒト野生型ＣＤ８６の単量体可溶性細胞外ドメインまたはそのバリアントを含むか、またはそれらからなる。Ｂ１およびＢ２の結合性ドメインは、本発明のポリペプチドの唯一の結合性ドメインであってもよい。

【0111】

本発明のポリペプチドは、Ｎ−Ｃ方向に書かれた以下の式：
（ａ）Ｈ−（Ｘ）ｎ−Ｂ２、
（ｂ）Ｂ２−（Ｘ）ｎ−Ｈ、
（ｃ）Ｌ−（Ｘ）ｎ−Ｂ２、または
（ｄ）Ｂ２−（Ｘ）ｎ−Ｌ
（式中、Ｈは抗体の（すなわちＢ１の）重鎖であり、Ｌは抗体の（すなわちＢ１の）軽鎖であり、Ｘはリンカーであり、ｎは０または１である）のうちのいずれか１つにより構成されるポリペプチドを含んでもよい。リンカー（Ｘ）がペプチドである場合、それは、典型的には、アミノ酸配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＰ、ＮＦＳＱＰ、ＫＲＴＶＡまたは（ＳＧ）ｍを有し、式中、ｍ＝１から７である。

【0112】

本発明はまた、式（ａ）から（ｄ）のうちのいずれかにより構成されるポリペプチドからなるポリペプチドを提供する。前記ポリペプチドは、単量体として提供されてもよく、多量体タンパク質、たとえば抗体の成分として存在していてもよい。前記ポリペプチドは、単離されていてもよい。かかるポリペプチドの例は、配列番号５６から６０および１１０から１１４として提供される。

【0113】

部分Ｂ２は、本発明のポリペプチドの任意の部分、またはリンカーに、任意の好適な手段により結合していてもよい。たとえば、ポリペプチドの様々な部分が、化学的結合により、たとえばペプチド結合で連結していてもよい。したがって、本発明のポリペプチドは、任意選択でペプチドリンカーにより連結している、Ｂ１（またはその構成部分）およびＢ２を含む融合タンパク質を含むか、またはそれからなってもよい。かかる融合タンパク質において、Ｂ１のＣＤ４０結合性ドメインおよびＢ２のＣＴＬＡ−４結合性ドメインは、唯一の結合性ドメインであってもよい。

【0114】

分子をポリペプチドに結合するための他の方法は、当技術分野において知られている。たとえば、カルボジイミド結合（Bauminger & Wilchek (1980) Methods Enzymol. 70, 151-159）を、ドキソルビシンを含む様々な薬剤を、抗体またはペプチドに結合するために使用できる。水溶性カルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）が、機能的部分を結合部分に結合するために特に有用である。さらなる例として、結合は、過ヨウ素酸ナトリウム酸化とそれに続く適切な反応物の還元的アルキル化により、またはグルタルアルデヒド架橋により達成できる。しかしながら、どの方法が選択されるかにかかわらず、部分Ｂ１およびＢ２が、本発明のポリペプチドの一部として存在するときに、好ましくは、それらの標的結合特性を保持または実質的に保持するかどうかの決定がなされるべきであることが認められる。

【0115】

本発明のポリペプチドを（直接的または間接的に）別の分子に結合するために、同じ技術が使用できる。他の分子は、治療剤または検出可能な標識でありうる。好適な治療剤には、細胞傷害性部分または薬物が含まれる。

【0116】

本発明のポリペプチドは、単離または実質的に単離された形態で提供できる。実質的に単離されていることにより、任意の周囲の媒体からの、完全ではないが実質的なポリペプチドの単離がありうることが意図されている。ポリペプチドは、それらの意図された使用に干渉しない担体または希釈剤と混合されていてもよく、それでも実質的に単離されているとみなされる。

【0117】

本発明の例示的ポリペプチドは、下に示す配列番号５６から６０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、またはそれからなっていてもよい。

【0118】

【表6-1】

【0119】

【表6-2】

【0120】

【表6-3】

【0121】

【表6-4】

【0122】

本発明のポリペプチドは、任意の好適な手段により製造できる。たとえば、ポリペプチドの全部または一部が、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む細胞により融合タンパク質として発現されていてもよい。

【0123】

あるいは、部分Ｂ１およびＢ２は、分離して製造でき、その後一緒に連結される。連結は、任意の好適な手段により、たとえば上述の化学的結合法およびリンカーを使用して達成できる。部分Ｂ１およびＢ２の分離製造は、任意の好適な手段により達成できる。たとえば、下でより詳細に説明するとおり、任意選択で別々の細胞における別々のヌクレオチドからの発現による。

【0124】

ポリヌクレオチド、ベクターおよび細胞
本発明はまた、本発明のポリペプチドの全部または一部をコードするポリヌクレオチドに関する。したがって、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載の任意のポリペプチド、またはＢ１の全部もしくは一部またはＢ２の全部もしくは一部をコードしていてもよい。「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において互換的に使用され、任意の長さの核酸の重合体形態、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらの類似体を指す。ポリヌクレオチドの非限定的な例には、遺伝子、遺伝子断片、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーが含まれる。本発明のポリヌクレオチドは、単離または実質的に単離された形態で提供できる。実質的に単離されていることにより、任意の周囲の媒体からの、完全ではないが実質的なポリペプチドの単離がありうることが意図されている。ポリヌクレオチドは、それらの意図された使用に干渉しない担体または希釈剤と混合されていてもよく、それでも実質的に単離されているとみなされる。

【0125】

選択されたポリペプチドを「コードする」核酸配列は、適切な調節配列の制御下に置かれたときに、インビボでポリペプチドに転写（ＤＮＡの場合）および翻訳（ｍＲＮＡの場合）される核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンにより決定される。本発明の目的のため、かかる核酸配列には、ウイルス、原核生物または真核生物ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ、ウイルスまたは原核生物ＤＮＡまたはＲＮＡに由来するゲノム配列、および合成ＤＮＡまでもが含まれうるが、これに限定されるものではない。転写終結配列は、コーディング配列の３’側に位置する。

【0126】

抗体の重鎖または軽鎖アミノ酸配列の例をコードする代表的なポリヌクレオチドは、下に記載の配列のうちのいずれか１つを含むか、またはそれからなっていてもよい。

【0127】

【表7-1】

【0128】

【表7-2】

【0129】

【表7-3】

【0130】

【表7-4】

【0131】

【表7-5】

【0132】

【表7-6】

【0133】

部分Ｂ２の例をコードする代表的なポリヌクレオチドは、下に記載の配列番号２５から４３のうちのいずれか１つを含むか、またはそれからなっていてもよい。

【0134】

【表8-1】

【0135】

【表8-2】

【0136】

【表8-3】

【0137】

配列番号５６から６０および１１０から１１４のポリペプチドをコードする代表的なポリヌクレオチドは、下に記載の配列番号６５から６９および１１５から１１９のうちのいずれか１つを含むか、またはそれからなっていてもよい

【0138】

【表9-1】

【0139】

【表9-2】

【0140】

【表9-3】

【0141】

【表9-4】

【0142】

【表9-5】

【0143】

【表9-6】

【0144】

【表9-7】

【0145】

あるいは、好適なポリヌクレオチド配列は、これらの特定のポリヌクレオチド配列のうちの１つのバリアントであってもよい。たとえば、バリアントは、任意の上の核酸配列の置換、欠失または付加バリアントであってもよい。バリアントポリヌクレオチドは、配列表に記載した配列からの１個、２個、３個、４個、５個、１０個まで、２０個まで、３０個まで、４０個まで、５０個まで、７５個までまたはそれを超える核酸置換および／または欠失を含んでいてもよい。

【0146】

好適なバリアントは、本明細書に開示の核酸配列のうちのいずれか１つのポリヌクレオチドと少なくとも７０％相同、好ましくは少なくとも８０または９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％それと相同であってもよい。好ましくは、これらのレベルの相同性および同一性が、少なくともポリヌクレオチドのコーディング領域に関して存在する。相同性の測定方法は、当技術分野においてよく知られており、本発明の文脈において、相同性は核酸同一性に基づき算出されることが当業者により理解される。かかる相同性は、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも３０個、たとえば少なくとも４０個、６０個、１００個、２００個またはそれを超える連続ヌクレオチドの領域にわたって存在していてもよい。かかる相同性は、未修飾ポリヌクレオチド配列の全長にわたって存在していてもよい。

【0147】

ポリヌクレオチド相同性または同一性の測定方法は、当技術分野において知られている。たとえば、ＵＷＧＣＧパッケージは、相同性を算出するために使用できるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（たとえばそのデフォルト設定で使用される）（Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395）。

【0148】

ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムもまた、相同性またはラインアップ配列（line up sequences）を算出するために（典型的にはそれらのデフォルト設定で）、たとえばAltschul S.F. (1993) J Mol Evol 36:290-300；Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10に記載のとおり使用できる。

【0149】

ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて誰でも入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列の同じ長さのワードとアラインしたときに、いくつかの正の閾値スコアＴと一致するかまたはそれを満たす、問い合わせ配列における長さＷの短いワードを同定することにより、高スコアリング配列ペア（ＨＳＰ）を同定することを伴う。Ｔは、近傍ワードスコア閾値（neighbourhood word score threshold）（Altschul et al、上に記載）と呼ばれる。これらの初期近傍ワードヒットは、それらを含有するＨＳＰを見つけるためのサーチを開始するためのシードとして働く。ワードヒットは、蓄積アラインメントスコアが増加しうる限り、各配列に沿って両方向に伸長される。各方向のワードヒットの伸長は、１つまたは複数の負のスコアリング残基アラインメントの蓄積により、蓄積アラインメントスコアが０以下になるとき、またはいずれかの配列の末端に到達するときに、停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは１１のワード長（w）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919を参照のこと）アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（E）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較をデフォルトとして使用する。

【0150】

ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２配列間の類似性の統計的解析を実施する。たとえば、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787を参照のこと。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の尺度の１つは、最小和確率（smallest sum probability）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然で生じる確率の指標を提供する。たとえば、配列が別の配列に類似するとみなされるのは、第１の配列を第２の配列と比較した最小和確率が、約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合である。

【0151】

ホモログは、関係するポリヌクレオチドにおける配列と、３個、５個、１０個、１５個、２０個またはそれを超えるよりも少ない変異（そのそれぞれが、置換、欠失または挿入であってもよい）で異なっていてもよい。これらの変異は、ホモログの、少なくとも３０個、たとえば少なくとも４０個、６０個または１００個を超える連続ヌクレオチドの領域にわたって測定されてもよい。

【0152】

一実施形態において、バリアント配列は、遺伝コードの冗長性ゆえに、配列表に記載の特定の配列から変化してもよい。ＤＮＡコードは、４つの主な核酸残基（Ａ、Ｔ、ＣおよびＧ）を有し、これらを、生物の遺伝子にコードされたアミノ酸、タンパク質を表す３文字のコドンを「つづる」ために使用する。ＤＮＡ分子に沿ったコドンの直線配列は、それらの遺伝子によりコードされたタンパク質におけるアミノ酸の直線配列に翻訳される。コードは高度に縮重しており、２０の天然アミノ酸をコードする６１個のコドンおよび「終止」シグナルを表す３つのコドンがある。したがって、ほとんどのアミノ酸が、２つ以上のコドンによりコードされており、実際のところいくつかは、４つ以上の異なるコドンによりコードされている。したがって、本発明のバリアントポリヌクレオチドは、同じポリペプチド配列を本発明の別のポリヌクレオチドとしてコードしうるが、同じアミノ酸をコードする異なるコドンの使用により、異なる核酸配列を有しうる。

【0153】

したがって、本発明のポリペプチドは、それをコードし、発現可能なポリヌクレオチドから製造できるか、またはその形態で送達できる。

【0154】

本発明のポリヌクレオチドは、例としてSambrook et al (1989, Molecular Cloning - a laboratory manual; Cold Spring Harbor Press)に記載のとおり、当技術分野においてよく知られている方法により合成できる。

【0155】

本発明の核酸分子は、挿入配列に作動可能に連結されている制御配列を含み、それゆえインビボでの本発明のポリペプチドの発現を可能にする、発現カセットの形態で提供できる。これらの発現カセットは今度は、典型的には、ベクター（たとえば、プラスミドまたは組換えウイルスベクター）内に提供される。かかる発現カセットは、宿主対象に直接投与できる。あるいは、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを、宿主対象に投与できる。好ましくは、ポリヌクレオチドは、遺伝子ベクターを使用して調製および／または投与される。好適なベクターは、十分量の遺伝情報を運搬可能であり、本発明のポリペプチドの発現を可能にする任意のベクターでありうる。

【0156】

したがって、本発明は、かかるポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。かかる発現ベクターは、分子生物学の分野における常法により構築され、たとえば、プラスミドＤＮＡおよび適切なイニシエーター、プロモーター、エンハンサーおよび他の要素、たとえば必要でありうるポリアデニル化シグナルの使用を伴いうるのであり、これらは、本発明のペプチドの発現を可能にするために正しい方向で配置される。他の好適なベクターは、当業者にとって明らかである。この点に関するさらなる例として、本発明者らはSambrook et al.を参照する。

【0157】

本発明はまた、本発明のポリペプチドを発現するように改変された細胞を含む。かかる細胞は、一過性の、または好ましくは安定的な高等真核細胞株、たとえば哺乳動物細胞もしくは昆虫細胞、下等真核細胞、たとえば酵母菌、または原核細胞、たとえば細菌細胞を含む。本発明のポリペプチドをコードするベクターまたは発現カセットの挿入により改変できる細胞の特定の例には、哺乳動物ＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＮＳ０およびＣＯＳ細胞が含まれる。好ましくは、選択される細胞株は、安定的であるだけでなく、ポリペプチドの成熟グリコシル化および細胞表面発現を可能にするものである。

【0158】

本発明のかかる細胞株は、本発明のポリペプチドを製造するために常法を使用して培養でき、本発明の抗体を対象に送達するために治療的または予防的に使用できる。あるいは、本発明のポリヌクレオチド、発現カセットまたはベクターを、エクスビボで対象に由来する細胞に投与し、その後細胞を対象の身体に戻すことができる。

【0159】

医薬製剤、治療的使用、および患者群
別の一態様において、本発明は、本明細書に記載の本発明の分子、たとえばポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターおよび細胞を含む組成物を提供する。たとえば、本発明は、１つまたは複数の本発明の分子、たとえば１つまたは複数の本発明のポリペプチドと、少なくとも１種の薬学的に許容される担体とを含む組成物を提供する。

【0160】

本明細書において使用される「薬学的に許容される担体」には、生理学的に適合性である、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等が含まれる。好ましくは、担体は、非経口、たとえば静脈内、筋内または皮下投与（たとえば注射または注入による）に好適である。投与経路に応じて、ポリペプチドを物質で被覆して、ポリペプチドを不活性化または変性させうる酸および他の自然条件の作用からポリペプチドを保護できる。

【0161】

好ましい薬学的に許容される担体には、水性担体または希釈剤が含まれる。本発明の組成物において用いることのできる好適な水性担体の例には、水、緩衝水および生理食塩水が含まれる。他の担体の例には、エタノール、ポリオール、（たとえばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、およびそれらの好適な混合物、植物油、たとえばオリーブ油、および注射可能な有機エステル、たとえばオレイン酸エチルが含まれる。たとえば、被覆剤、たとえばレシチンの使用、分散液の場合には必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持できる。多くの場合、組成物中に等張剤、たとえば、糖、多価アルコール、たとえばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。

【0162】

本発明の組成物は、薬学的に許容される抗酸化剤をさらに含んでいてもよい。これらの組成物は、補助剤、たとえば保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤をさらに含有していてもよい。微生物の存在の防止は、上の滅菌手順、ならびに、様々な抗菌剤および抗真菌剤、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等の含有の両方により確保できる。等張剤、たとえば糖、塩化ナトリウム等を組成物中に含むこともまた所望されてもよい。加えて、吸収を遅らせる薬剤、たとえばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの含有により、注射可能な医薬形態の持続的吸収がもたらされうる。

【0163】

治療組成物は、典型的には、製造および貯蔵の条件下で滅菌され、安定的でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高薬物濃度に好適な他の秩序立った構造として製剤化できる。

【0164】

滅菌注射可能溶液は、活性物質（たとえばポリペプチド）を必要な量で、上に挙げた成分の１つまたは組合せとともに適切な溶媒中に組み込むことにより調製でき、必要であれば、続けて滅菌精密ろ過できる。一般に、分散液は、基本の分散媒体および上に挙げたものからの必要な他の成分を含有する滅菌媒体中に活性物質を組み込むことにより調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合には、好適な調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、それらは、活性物質と任意の追加の所望の成分との粉末を、以前に滅菌ろ過したそれらの溶液からもたらす。

【0165】

特に好ましい組成物は、全身投与または局所投与のために製剤化される。局所投与は、腫瘍の部位においてであっても、腫瘍流入領域リンパ節内にであってもよい。組成物は、好ましくは、一定期間にわたる徐放のために製剤化できる。したがって、組成物は、マトリクス促進徐放において、またはその一部として提供できる。好ましい徐放マトリクスは、モンタニドまたはγ−ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）ナノ粒子を含んでいてもよい。任意選択で持続的な期間にわたる本発明のポリペプチドの局所放出は、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストの投与と関連付けられる潜在的な自己免疫副作用を減少させうる。

【0166】

本発明の組成物は、本発明のポリペプチドとともに追加の活性成分を含んでいてもよい。上述のとおり、本発明の組成物は、１つまたは複数の本発明のポリペプチドを含んでいてもよい。本発明の組成物は、追加の治療剤または予防剤をさらに含んでいてもよい。

【0167】

ポリペプチドまたは他の本発明の組成物および使用説明書を含むキットも本発明の範囲内である。キットは、１つまたは複数の追加の試薬、たとえば上で論じた追加の治療剤または予防剤をさらに含んでいてもよい。

【0168】

本発明によるポリペプチドは、治療または予防において使用されてもよい。治療用途において、ポリペプチドまたは組成物は、障害または状態にすでに罹患している対象に、状態または１つもしくは複数のその症状を治癒、緩和または部分的抑止するのに十分な量で投与される。かかる治療処置は、疾患症状の重症度の減少、または症状のない期間の頻度もしくは持続性の増加をもたらしうる。これを達成するのに適切な量は、「治療有効量」として定義される。予防用途において、ポリペプチドまたは組成物は、まだ障害または状態の症状を示していない対象に、症状の発症を予防するか、または遅滞させるのに十分な量で投与される。かかる量は、「予防有効量」として定義される。対象は、任意の好適な手段により、疾患または状態を発症するリスクのあるものとして同定されてもよい。

【0169】

特に、本発明のポリペプチドは、癌の治療または予防において有用でありうる。したがって、本発明は、癌の治療または予防における使用のための本発明のポリペプチドを提供する。本発明はまた、個体に本発明のポリペプチドを投与することを含む、癌を治療または予防する方法を提供する。本発明はまた、癌を治療または予防するための医薬の製造における使用のための本発明のポリペプチドを提供する。

【0170】

癌は、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、子宮頚癌、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、多発性骨髄腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病、黒色腫、膀胱癌、胃癌、頭頸部癌、肝臓癌、皮膚癌、リンパ腫またはグリア芽腫であってもよい。

【0171】

本発明のポリペプチド、または前記ポリペプチドを含む組成物は、１つまたは複数の投与経路を介して、当技術分野において知られている１つまたは複数の多様な方法を使用して投与できる。当業者により認められているとおり、投与の経路および／または方式は、所望の結果に応じて変化する。全身投与または局所投与が好ましい。局所投与は、腫瘍の部位においてであっても、腫瘍流入領域リンパ節内にであってもよい。本発明のポリペプチドまたは組成物のための好ましい投与方式には、注射または注入による、静脈内、筋内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口投与方法が含まれる。本明細書において使用される「非経口投与」という文言は、通常は注射による、腸内および局所投与以外の投与方式を意味する。あるいは、本発明のポリペプチドまたは組成物は、非経口でない方式、たとえば局所、表皮または粘膜投与方式を介して投与できる。

【0172】

本発明のポリペプチドの好適な用量は、熟練の医師により決定できる。本発明の医薬組成物における活性成分の実際の用量レベルは、特定の患者、組成物、および投与方式について、患者に対して毒性を有することなしに、所望の治療反応を達成するのに有効な活性成分の量を得るために変化しうる。選択される用量レベルは、用いられる特定のポリペプチドの活性、投与経路、投与時間、ポリペプチドの排出率、治療期間、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または物質、治療されている患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康状態および以前の病歴等、医療分野でよく知られている要因を含む、多様な薬物動態学的要因に依存すると考えられる。

【0173】

本発明のポリペプチドの好適な用量は、たとえば、治療される患者の体重１ｋｇ当たり約０．１μｇから約１００ｍｇの範囲であってもよい。たとえば、好適な用量は、１日当たり体重１ｋｇ当たり約１μｇから約１０ｍｇ、または１日当たり体重１ｋｇ当たり約１０ｇから約５ｍｇであってもよい。

【0174】

投与計画は、最適な所望の反応（たとえば、治療反応）を提供するために調整されてもよい。たとえば、単回ボーラスを投与でき、複数回に分けられた用量を経時的に投与でき、または治療状況の要求に示されるとおり用量を比例的に減少または増加させることができる。投与の簡便性および用量の均一性のために、非経口組成物を用量単位形態で製剤することがとりわけ有利である。本明細書において使用される用量単位形態は、治療される対象のための単回用量に合わせて物理的に区分された単位を指し、各単位は、必要な医薬担体とともに所望の治療効果をもたらすよう算出された所定の量の活性化合物を含有する。

【0175】

ポリペプチドを、単回投与または複数回投与で投与できる。複数回投与は、同じまたは異なる経路を介して、同じまたは異なる部位に投与できる。あるいは、ポリペプチドは、上述の徐放製剤として投与でき、この場合には、より低い頻度の投与が必要である。用量および頻度は、患者におけるポリペプチドの半減期および所望の治療期間に応じて変化しうる。投与の用量および頻度はまた、処置が予防的か治療的かどうかに応じて変化しうる。予防的用途においては、相対的に低い用量を、相対的に低い頻度の間隔で長期間にわたり投与できる。治療的用途においては、相対的に高い用量を、たとえば患者が疾患の症状の部分または完全寛解を示すまで投与できる。

【0176】

２種以上の薬剤の併用投与が、数多くの異なる仕方で達成できる。一実施形態において、ポリペプチドおよび他の薬剤を単一の組成物において一緒に投与できる。別の一実施形態において、ポリペプチドおよび他の薬剤を、別々の組成物において併用療法の一部として投与できる。たとえば、調節因子を、他の薬剤の前、後、またはそれと同時に投与できる。

【0177】

本発明のポリペプチドまたは組成物は、ヒトＣＤ４０およびヒトＣＴＬＡ−４を発現する細胞集団の活性化を増加させる方法であって、前記細胞集団に、本発明のポリペプチドまたは組成物を、前記細胞と本発明のポリペプチドとの間の相互作用を許容するのに好適な条件下で投与することを含む方法においても使用されうる。細胞集団は、典型的には、ＣＴＬＡ−４を発現する少なくともいくつかの細胞、典型的にはＴ細胞、およびＣＤ４０を発現する少なくともいくつかの細胞、典型的には抗原提示細胞、たとえばＢ細胞を含む。この方法は、典型的には、エクスビボで実施される。

【0178】

本発明を、以下の実施例によりさらに例示するが、これらはさらに限定するものと解釈されるべきではない。本出願において引用されるすべての図およびすべての参考文献、特許および公開特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
実施例

【0179】

実施例１から４−部分Ｂ２のためのＣＤ８６のポリペプチドバリアントの開発

【実施例1】

【0180】

第１選択
イントロダクション
ポリペプチドバリアントの製造のための出発物質は、ヒトＣＤ８６の単量体可溶性細胞外結合性ドメインであった。すなわち、ヒトＣＤ８６のＣＴＬＡ−４結合性ドメインである。このドメインのアミノ酸配列およびＣＴＬＡ−４と複合したＣＤ８６の構造モデル（Schwartz et al; Nature 2001; 410(6828) p604-608）を、候補ポリペプチドの４つの異なる出発ファージディスプレイライブラリーを設計するために使用した。すなわち、ＡＬ−１０１４−０１、ＡＬ−１０１４−０２、ＡＬ−１０１４−０３およびＡＬ−１０１４−０４である。標準的プロトコルを使用し、候補ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を使用して、ファージディスプレイライブラリーを製造した。候補ポリペプチドのアミノ酸配列は、下に記載のとおり設計した。

【0181】

ライブラリー設計
ライブラリーＡＬ−１０１４−０１の設計の主目的は、ＣＴＬＡ−４との相互作用のための、ＣＤ８６の結合性ドメインの結合表面の増加を提供することであった。この目的のため、ＣＤ８６のＦＧループ（位置１１４から１２１、図４におけるナンバリング）における様々な残基を変異のため選択した。ＦＧループの伸長を可能にする２つの挿入もまた導入した。ＣＤ８６の野生型配列に対する位置および導入変異を、下の表１に要約した。各位置において許容される可変性が示される。表１に示すすべての可能な変異の組合せから生じるすべての可能なポリペプチドをコードするヌクレオチドを設計し、ＡＬ−１０１４−０１ファージディスプレイライブラリーを標準的プロトコルにより製造するために使用した。

【0182】

【表10】

【0183】

ライブラリーＡＬ−１０１４−０２において、ＣＴＬＡ−４に面するＣＤ８６の結合表面におけるアミノ酸位置が、野生型アミノ酸と非常に限定された数の相同残基との間で変化することを可能にし、ＣＤ８６のベータシート表面に最小限の構造摂動を導入した。ライブラリーＡＬ−１０１４−０２の位置および導入変異を、表２に示す。位置７９の変異は、ＣＤ８６のＣＴＬＡ−４に対する結合に好ましく寄与することが報告されており（Peach et al; Journal of Biological Chemistry 1995; 270 p21181-21187）、この位置もまたライブラリーにおいて変化することを可能にした。各位置において許容される可変性が示される。表２に示すすべての可能な変異の組合せから生じるすべての可能なポリペプチドをコードするヌクレオチドを設計し、ＡＬ−１０１４−０２ファージディスプレイライブラリーを標準的プロトコルにより製造するために使用した。表２はまた、対応するヌクレオチド配列において示された変異を表すのに使用されたＩＵＰＡＣ−ＩＵＢコードを示す。ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢコードは、典型的には、所定の位置における複数のヌクレオチドの可能性を定義するために使用され、ヌクレオチド配列において不完全に特定されている塩基のために認められている命名規則のセットに基づく（Biochem. J., 1985, 229, 281-286；Eur. J. Biochem., 1985, 150, 1-5; J. Biol. Chem., 1986, 261, 13-17；Mol. Biol. Evol., 1986, 3, 99-108；Nucl. Acids Res., 1985, 13, 3021-3030；Proc. Nat. Acad. Sci. (U. S.), 1986, 83, 4-8；およびBiochemical Nomenclature and Related Documents 2nd edition, Portland Press, 1992, pp 122-126を参照のこと）。これらの実験において使用されたＩＵＰＡＣ−ＩＵＢコードを下の表２に要約する。

【0184】

【表11】

【0185】

【表12】

【0186】

さらに２つのライブラリーを設計した。これら２つのライブラリーにおいて、ＣＤ８６のＩｇＧＶドメイン全体が、野生型ＣＤ８６をコードするヌクレオチド配列を取り上げ、変異バイアスを最小化するためにエラープローンＰＣＲ法セットアップを使用することにより、ランダム化された。得られた変異体ヌクレオチド配列を、ファージディスプレイライブラリーを標準的プロトコルにより製造するために使用した。

【0187】

３つの異なるランダム変異誘発ライブラリーを生成し、そのうち２つを選択した。ランダム化ラウンド２からＡＬ−１０１４−０３を取り上げ、ランダム化ラウンド３はＡＬ−１０１４−０４を提供した。

【0188】

ＡＬ−１０１４−１、ＡＬ−１０１４−２、ＡＬ−１０１４−３およびＡＬ−１０１４−０４を、ファージミドベクターへとクローニングすることにより製造し、標準的プロトコルによりファージストックを生成した。

【0189】

選択方略
本実施例において適用した選択方略は、６回のラウンド（Ｒ１からＲ６）からなり、これを表３に要約する。

【0190】

【表13】

【0191】

選択の第１ラウンド（Ｒ１）は、出発ライブラリーＡＬ−１０１４−０１、ＡＬ−１０１４−０２、ＡＬ−１０１４−０３およびＡＬ−１０１４−０４のメンバーを、ビオチン化ＣＴＬＡ４−Ｆｃγ（５０ｎＭ）へのバインダーのために富化した。機能的バインダーのための富化をシークエンシングにより確認した。

【0192】

Ｒ１からのアウトプットは、機能的バインダーのために富化された、各出発ライブラリーからのファージクローンのプールであった。ライブラリーＡＬ−１０１４−０３およびＡＬ−１０１４−０４からのアウトプットを、その後組み合わせて新しいライブラリーＡＬ−１０１４−０５とした。ライブラリーＡＬ−１０１４−０１、ＡＬ−１０１４−０２およびＡＬ−１０１４−０４からのアウトプットを、組み合わせて新しいライブラリーＡＬ−１０１４−０６とした。次に、ライブラリーＡＬ−１０１４−０５およびＡＬ−１０１４−０６のメンバーを、５回の追加スクリーニングラウンド（Ｒ２からＲ６）にかけて、ＣＴＬＡ−４への結合の増加およびＣＤ２８への結合の減少について選択した。

【0193】

追加の５回の選択ラウンドのための方略は、親和性、オンレート、オフレート、選択性、多量体化およびエピトープ維持の特性の改善を特に目的とした選択圧を適用するというものであった。

【0194】

親和性の増加についての選択は、各ラウンドの抗原濃度を下げることにより達成した。選択は、５０ｎＭ ＣＴＬＡ−４で始まり、５ｎＭに下げてこれをラウンドＲ２、Ｒ４およびＲ５で維持し、その後最終ラウンド（Ｒ６）でＣＴＬＡ−４濃度は２ｎＭであった。オンレートの増加についての選択は、ビオチン化ＣＴＬＡ−４でのインキュベーション時間を短縮することにより達成した。オフレートの減少についての選択は、洗浄ステップ中のストリンジェンシーを増加させることにより達成した。ＣＴＬＡ−４の選択性の増加（およびＣＤ２８への結合親和性の減少）についての選択は、過量の非ビオチン化ＣＤ２８−Ｆｃ中でインキュベートすることにより達成した（Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６において）。マウスＣＴＬＡ−４への結合親和性の維持は、選択抗原としてビオチン化マウスＣＴＬＡ−４をヒトＣＴＬＡ−４の代わりに使用したラウンド（Ｒ３）を含めることにより確保した。マウスＣＴＬＡ−４への親和性が維持されて、マウスモデルにおける概念実証実験を可能にすることを保証するために、このステップを含めた。結合力効果について選択することは、非ビオチン化ＣＴＬＡ−４を、ビオチン化ＣＴＬＡ−４でのインキュベーション開始の５分後に導入することにより回避した（Ｒ５およびＲ６において）。選択緩衝液への非ビオチン化Ｆｃγ（ＩｇＧ）の添加を、ＣＴＬＡ−４抗原のＦｃ融合部分へのバインダーを選択するのを回避するために実施した。

【0195】

温度感受性の減少および融点の潜在的増加が、増加した温度（６０℃）で選択ステップを導入することにより得られた（Ｒ４）。低ｐＨでの親和性の増加に、より低いｐＨでの選択ラウンドを導入することにより対処した（Ｒ６）。

【0196】

選択ラウンド後、Ｒ５およびＲ６からの個々のファージクローンを、従来の親和性ＥＬＩＳＡアッセイにおけるハイスループットスクリーニングにより解析した。アッセイは、ＣＴＬＡ−４またはＣＤ２８のいずれかに対するファージの結合を測定するサンドイッチＥＬＩＳＡであった。簡潔に述べると、９６ウェル平底高結合プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ＃６５５０７４）を、一晩４℃でインキュベートすることにより、ＣＴＬＡ４−Ｆｃγ（Ｏｒｅｎｃｉａ、Ａｐｏｔｅｋｅｔ）またはＣＤ２８−Ｆｃγ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ ３４２−ＣＤ）のいずれかでコーティングした。プレートを洗浄し（洗浄緩衝液：ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）Ｍｅｄｉｃａｇｏ＃０９−９４１０−１００）、次にＰＢＳＴ＋３％粉乳（Ｓｅｍｐｅｒ）中でブロッキングした。プレートを再び洗浄し、試料または対照をウェルに添加した。試料を１時間室温でインキュベートし、次に洗浄した。検出抗体、マウス抗Ｍ１３−ＨＲＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、＃２７−９４２１−０１）を添加し、その後ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ基質（Ｔｈｅｒｍｏ＃３７０６９）を使用してプレートを展開し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で検出した。

【実施例2】

【0197】

選択されたポリペプチドの発現およびリクローニング
実施例１から選択されたファージクローンを、標準的プロトコルにより、融合タンパク質フォーマット内にリクローニングし、各クローンをγ２／γ４ Ｆｃに融合した。融合タンパク質をＨＥＫ２９３細胞内で発現させた。細胞の培養上清を回収し、下に記載の方法によりＥＬＩＳＡおよびＢｉａｃｏｒｅ（商標）の両方を使用して発現した融合タンパク質をアッセイした。結果を表４に示し、これはまた各クローンに存在する変異を示す。ＥＬＩＳＡアッセイ（９０７）で最も性能の良いクローンは、野生型タンパク質ＣＤ８６よりもほぼ１０倍高いＥＣ５０結合比を有していた。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）アッセイ（９０４）で最も性能の良いクローンは、野生型タンパク質ＣＤ８６よりも４倍超高いＫｄ結合比を有していた。

【0198】

結合ＥＬＩＳＡ
９６ウェル平底高結合プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ＃６５５０７４）を、一晩４℃でインキュベートすることにより、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ＃３０Ｒ−ＣＤ１５２）またはＣＤ２８−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ ３４２−ＣＤ）のいずれかでコーティングした。プレートを洗浄し（洗浄緩衝液：ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）Ｍｅｄｉｃａｇｏ＃０９−９４１０−１００）、次にＰＢＳＴ＋３％ＢＳＡ（Ｍｅｒｃｋ、＃１．１２０１８．０１００）中でブロッキングした。プレートを再び洗浄し、試料または対照（１／５に連続希釈 ２００〜０．００１μｇ／ｍｌ）をウェルに添加した。試料を１時間室温でインキュベートし、次に洗浄した。検出抗体、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ、＃１０９−０３５−０９８）を添加し、その後ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ基質（Ｔｈｅｒｍｏ＃３７０６９）を使用してプレートを展開し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で検出した。ＥＣ５０値をＣＴＬＡ４およびＣＤ２８の両方について算出した。結合比（ＥＣ５０結合比＝［ＣＤ２８に対するＥＣ５０］÷［ＣＴＬＡ−４に対するＥＣ５０］）を、各ポリペプチドについて算出し、表４に示した。

【0199】

Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）
ＣＴＬＡ４−Ｆｃ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ＃３０Ｒ−ＣＤ１５２）またはＣＤ２８−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ ３４２−ＣＤ）を、従来のアミン結合を使用してＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーチップ、ＣＭ５に固定化した。ＣＤ８６変異体分子および対照（１／２に連続希釈 １００〜１．５ｎＭ）を、ＨＢｓ−Ｐ（ＧＥ、ＢＲ−１００３−６９）における結合について流速３０μｌ／ｍｌで解析した。会合が３分間、解離が１０分間続いた。５ｍＭ ＮａＯＨを３０秒間使用して再生を２度実施した。動態パラメータおよび親和性定数を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．１ソフトウェアを使用して算出した。結合比（Ｋｄ結合比＝［ＣＤ２８に対するＫｄ］÷［ＣＴＬＡ−４に対するＫｄ］）を、各ポリペプチドについて算出し、表４に示した。

【0200】

【表14】

【0201】

表５は、選択されたクローンのそれぞれにおける変異および位置を要約する。クローン９００、９０１、９０４、９０６、９０７、９０８、９１０、９１５および９３８についての完全アミノ酸配列をそれぞれ、配列番号６から１４として提供する。

【0202】

【表15】

【実施例3】

【0203】

拡張されたライブラリー多様性および反復選択およびスクリーニング。
ライブラリー製造
２つのさらなるライブラリーＡＬ−１０１４−１１およびＡＬ−１０１４−１２の出発物質は、実施例１および２において同定された６つのクローン、すなわち、９０１、９０４、９０６、９０７、９０８、９１５であった。リアセンブリＰＣＲステップ（reassembly PCR step）に含まれる変異オリゴでのエラープローンＰＣＲにより、ＷＯ２００２０４８３５１、ＷＯ２００３０９７３４、およびＷＯ２００７０５７６８２に記載のプロトコルに従い追加の多様性を生じた。適用されたオリゴは、ＣＤ８６分子のホットスポット領域における変異を含んでいた。各ライブラリーからおよそ２０個のクローンをシークエンシングした。２つのライブラリーは、組換えクローン、エラープローンＰＣＲ生成クローン、および変異オリゴの導入により製造されたクローンを含有していた。各クローンは、ＣＤ８６の野生型配列と比較して平均して３個〜１１個の変異を含有していた。

【0204】

選択方略
実施例１に記載の選択ラウンドＲ２からＲ６を、ライブラリーＡＬ−１０１４−１１およびＡＬ−１０１４−１２の両方に適用した。最後の２回のラウンドにおいて選択されたクローンをシークエンシングし、組換えおよび新規変異が得られたことを確認した。

【0205】

選択されたクローンの評価
最後の２回の選択ラウンドからのおよそ１２５０個のクローンを、ファージストックとして発現させ、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８との結合について、実施例１に記載の同じハイスループットスクリーニングＥＬＩＳＡにより解析した（データは示さず）。クローンをそれらのＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８との結合に基づき順位付けした。上位１０個のクローンを、ＣＴＬＡ−４への高い結合性およびＣＤ２８への低い結合性の基準に基づき選択した。これらクローンの配列を決定し、それぞれをＨＥＫ２９３細胞からガンマ２／ガンマ４融合として、実施例２に記載のとおり発現させた。

【0206】

表６は、上位１０個のクローンのそれぞれにおける変異および位置を要約する。クローン１０３８、１０３９、１０４０、１０４１、１０４２、１０４３、１０４４、１０４５、１０４６および１０４７についての完全アミノ酸配列をそれぞれ、配列番号１５から２４として提供する。

【0207】

【表16】

【実施例4】

【0208】

上位１０個のポリペプチドのさらなる評価
実施例３において選択された１０個のクローンそれぞれからのポリペプチドを、さらに以下のとおり特徴付けた。

【0209】

発現および精製
各クローンをコードするプラスミドを、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３−Ｔ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に標準的プロトコルによりトランスフェクトし、上清を６日目に回収した。ポリペプチドおよび対照を、プロテインＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ＃１７−０４０２−０１）を使用して親和性精製した。

【0210】

結合ＥＬＩＳＡ
実施例２に記載のプロトコルと同様に、９６ウェル平底高結合プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ＃６５５０７４）を、４℃で一晩インキュベートすることにより、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ＃３０Ｒ−ＣＤ１５２）またはＣＤ２８−Ｆｃ（Ｓｉｍｏｎ Ｄａｖｉｓ、オクスフォード大学の好意により提供）のいずれかでコーティングした。プレートを洗浄し（洗浄緩衝液：ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）Ｍｅｄｉｃａｇｏ＃０９−９４１０−１００）、次にＰＢＳＴ＋３％ＢＳＡ（Ｍｅｒｃｋ、＃１．１２０１８．０１００）中でブロッキングした。プレートを再び洗浄し、試料または対照（１／３に連続希釈 ５００００〜０００１ｎＭ）をウェルに添加した。試料を１時間室温でインキュベートし、次に洗浄した。検出抗体、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ、＃１０９−０３５−０９８）を添加し、その後ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ基質（Ｔｈｅｒｍｏ＃３７０６９）を使用してプレートを展開し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で検出した。

【0211】

ＣＴＬＡ−４結合ＥＬＩＳＡの結果を図１に示す。ＥＣ５０値を算出し、表７に示す。すべての分子は、野生型およびＨ７９Ａの両方よりも良好なＥＣ５０値を示し、２から６７倍の間の改善であった。ＣＤ２８の結合性は低すぎて検出できなかった（データは示さず）。

【0212】

【表17】

【0213】

阻害ＥＬＩＳＡ
９６ウェル平底高結合プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ＃６５５０７４）を４℃で一晩インキュベートすることにより、野生型ＣＤ２８−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ＃７６２５−Ｂ２）でコーティングした。プレートを洗浄し（洗浄緩衝液：ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）Ｍｅｄｉｃａｇｏ＃０９−９４１０−１００）、次にＰＢＳＴ＋３％ＢＳＡ（Ｍｅｒｃｋ、＃１．１２０１８．０１００）中でブロッキングした。試料（ＣＤ８６変異体または野生型タンパク質、１／４に連続希釈 ３００００から０．３ｎｇ／ｍｌ）をビオチン化ＣＴＬＡ４（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ＃３０Ｒ−ＣＤ１５２）で、室温で１時間インキュベートし、次に混合物をＥＬＩＳＡプレートのブロッキングされたウェルに添加した。検出をストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ＃２１１２６）で実施し、その後ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ基質（Ｔｈｅｒｍｏ＃３７０６９）を使用してプレートを展開し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で検出した。結果を表２に示す。ＩＣ５０値を算出し、表８に示す。すべての分子は、野生型およびＨ７９Ａの両方よりも良好なＩＣ５０値を示し、最良の変異体ＣＤ８６分子のＩＣは、野生型と比較して１００倍超改善した。

【0214】

【表18】

【0215】

Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）
実施例２におけるように、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ＃３０Ｒ−ＣＤ１５２）またはＣＤ２８−Ｆｃ（Ｓｉｍｏｎ Ｄａｖｉｓ、オクスフォード大学の好意により提供）のいずれかを、従来のアミン結合を使用してＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーチップ、ＣＭ５に固定化した。ＣＤ８６変異体分子および対照（１／３に連続希釈 １０００〜４ｎＭ）を、ＨＢｓ−Ｐ（ＧＥ、ＢＲ−１００３−６９）における結合について流速３０μｌ／ｍｌで解析した。会合が３分間、解離が１０分間続いた。５ｍＭ ＮａＯＨを３０秒間使用して再生を２度実施した。動態パラメータおよび親和性定数を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．１ソフトウェアを使用して算出した。

【0216】

ＣＴＬＡ−４に対するそれぞれの選択されたクローンおよび野生型ＣＤ８６のＣＴＬＡ−４の結果を表９に要約する。各クローンに存在する変異もまた示す。Peach et al (Journal of Biological Chemistry 1995, vol 270(36), 21181-21187)からのＨ７９Ａ変異のみを含むクローンもまた、比較のために含めた。ＣＤ２８の結果は示さない。なぜなら、ほとんどの場合、ＣＤ２８に対する親和性は弱すぎてこのプロトコルにより決定できなかったからである。しかしながら、それが決定できた場合には、選択されたＣＤ８６クローンのＣＤ２８に対する親和性は、ＣＴＬＡ−４に関するものの１００分の１以下である。

【0217】

選択されたクローンがマウスＣＴＬＡ−４にも結合することもまた決定した（データは示さず）。

【0218】

【表19】

【実施例5】

【0219】

例示的二重特異性分子のクローニングおよび構築
本発明による二重特異性ポリペプチドを、図３に示すスキーム図により、表Ａに記載のとおり製造した。

【0220】

【表20】

【0221】

変異ヒトＣＤ８６可変可溶性ドメイン（Ｂ２）、リンカー（Ｘ）および制限酵素部位をコードする配列を、インシリコで設計した。配列を、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ（エーバースベルク、ドイツ）から注文し、ＣＤ４０結合抗体（Ａ２−５４、Ellmark et al.,Immunology, 108, 452-457, 2003）の重鎖または軽鎖を含有するベクター内にクローニングした。次に、ベクターをＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、カールズバッド、米国）内に、製造者の指示に従いトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を培養して回収した。細胞によりもたらされた二重特異性構築物をプロテインＡカラム（ＨｉｓＴｒａｐプロテインＡ、ＧＥ Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ）上で、標準的方法により精製した。

【実施例6】

【0222】

例示的二重特異性分子の特徴付け
実施例５において製造されたポリペプチドの等電点を、ＧＰ−ＭＡＷソフトウェアを使用して決定し、下に示す。

【0223】

【表21】

【0224】

動的光散乱、ＤＬＳを、凝集作用を研究し、分子量を確認するために、標準的プロトコルにより使用した。１ｍｇ／ｍｌの濃度で試験された２つの代表的ポリペプチド、９５６／５３０および９５７／５３０については、凝集は観察されなかった。９５６／５３０および９５７／５３０について観察されたＭｗはそれぞれ、２６５ｋＤａおよび２８２ｋＤａであった。

【0225】

動的光散乱を、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＮａｎｏシリーズＺＥＮ１６００（ウースターシャー、英国）およびＭａｌｖｅｒｎ低容積クオーツバッチキュベット（ＺＥＮ２１１２）を製造者の指示に従い使用して測定した。Ｂｉｏｚｙｍ製２００μｌ滅菌およびダストフリーピペットチップ、カタログ番号７２０３２８を、各移動ステップで使用した。干渉するダスト粒子を、解析前に５分間、１３０００ｒｐｍでの試料の遠心分離により除去した。

【実施例7】

【0226】

例示的二重特異性分子の二重結合特異性の実証
ＣＴＬＡ−４への結合
実施例５においてもたらされたポリペプチドのＣＴＬＡ−４への結合を、標準的結合ＥＬＩＳＡにより評価した。簡潔に述べると、９６ウェル平底高結合プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ＃６５５０７４）を４℃で一晩インキュベートすることにより、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ＃３０Ｒ−ＣＤ１５２）でコーティングした。プレートを洗浄し（洗浄緩衝液：ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）Ｍｅｄｉｃａｇｏ＃０９−９４１０−１００）、次にＰＢＳＴ＋３％ＢＳＡ（Ｍｅｒｃｋ、＃１．１２０１８．０１００）中でブロッキングした。プレートを再び洗浄し、試料または対照（１／に連続希釈 ５００００〜０００１ｎＭ）をウェルに添加した。ＣＤ４０のための単一特異性抗体（５３０／５３１：Ａ２−５４）を対照として使用した。試料を１時間室温でインキュベートし、次に洗浄した。検出抗体、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ、＃１０９−０３５−０９８）を添加し、その後ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ基質（Ｔｈｅｒｍｏ＃３７０６９）を使用してプレートを展開し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で検出した。結果を図５に示す。図５Ａにおいて、異なる濃度の二重特異性分子の、ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングされたＣＴＬＡ−４に対する結合が示される。図５Ｂにおいて、１つの固定濃度（１００ｎｇ／ｍｌ）の二重特異性分子の、ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングされたＣＴＬＡ−４に対する結合が示される。二重特異性分子は、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合する。

【0227】

ＣＤ４０への結合
実施例５においてもたらされたポリペプチドのＣＤ４０への結合を、標準的結合ＥＬＩＳＡにより評価した。簡潔に述べると、９６ウェル平底高結合プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ＃６５５０７４）を４℃で一晩インキュベートすることにより、ＣＤ４０−Ｆｃ（Ａｎｃｅｌｌ＃５０４−８２０）でコーティングした。プレートを洗浄し（洗浄緩衝液：ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）Ｍｅｄｉｃａｇｏ＃０９−９４１０−１００）、次にＰＢＳＴ＋３％ＢＳＡ（Ｍｅｒｃｋ、＃１．１２０１８．０１００）中でブロッキングした。プレートを再び洗浄し、試料または対照（１／２に連続希釈、０．２μｇ／ｍｌで開始）をウェルに添加した。アミノ酸配列配列番号８の単離ポリペプチド（可溶性ＣＴＬＡ−４結合性ドメイン参照番号９０４）を対照として使用した。なぜならそれは、ＣＴＬＡ−４のみに特異的に結合するからである。

【0228】

試料を１時間室温でインキュベートし、次に洗浄した。検出抗体、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ、＃１０９−０３５−０９８）を添加し、その後ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ基質（Ｔｈｅｒｍｏ＃３７０６９）を使用してプレートを展開し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で検出した。結果を図６に示す。図６Ａにおいて、異なる濃度の二重特異性分子の、ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングされたＣＤ４０に対する結合が示される。図６Ｂにおいて、１つの固定濃度（１００ｎｇ／ｍｌ）の二重特異性分子の、ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングされたＣＤ４０に対する結合が示される。二重特異性分子は、ＣＤ４０に特異的に結合する。

【0229】

ＣＤ４０およびＣＴＬＡ−４に対する二重結合
実施例５において製造されたポリペプチドの、ＣＤ４０およびＣＴＬＡ−４の両方に対する同時結合を評価するために、二重ＥＬＩＳＡを開発した。簡潔に述べると、９６ウェル平底高結合プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ＃６５５０７４）を４℃で一晩インキュベートすることにより、ＣＤ４０−Ｆｃ（Ａｎｃｅｌｌ＃５０４−８２０）でコーティングした。プレートを洗浄し（洗浄緩衝液：ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）Ｍｅｄｉｃａｇｏ＃０９−９４１０−１００）、次にＰＢＳＴ＋３％ＢＳＡ（Ｍｅｒｃｋ、＃１．１２０１８．０１００）中でブロッキングした。プレートを再び洗浄し、試料（９５７／５３０、９５６／５３０）または対照（０．２μｇ／ｍｌ）をウェルに添加した。単一特異性抗ＣＤ４０抗体を対照として使用した（Ａ２−５４）。試料を１時間室温でインキュベートし、次に洗浄した。次に、ビオチン化ＣＴＬＡ４−Ｆｃ（Ｏｒｅｎｃｉａ、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍａｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）（１／４に連続希釈 ３．４〜２１５ｎＭ）を添加した。次にストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ＃２１１２６）を添加し、その後ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ基質（Ｔｈｅｒｍｏ＃３７０６９）を使用してプレートを展開し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で検出した。結果を図７に示し、これは、二重特異性分子が２つの抗原に同時に結合することを実証する。

【0230】

表面プラズモン共鳴解析
ＣＴＬＡ−４およびＣＤ４０に同時に結合する二重特異性分子の能力を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）解析によりさらに確認した。ＣＤ４０−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ＃１４９３−ＣＤ）を、従来のアミン結合を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅセンサーチップ、ＣＭ５に固定化した。０．５μＭ二重特異性構築物（９５７／５３０）を、固定化ＣＤ４０上に３分間注射し、解離を３分間続けた。２．１７μＭのＣＴＬＡ４−Ｆｃ（Ｏｒｅｎｃｉａ、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍａｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）を、ＣＤ４０二重特異性複合体上に３分間注射し、解離段階を３分間続けた。１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．７を使用して、チップを最後に再生した。Ｂｉａｃｏｒｅ３０００機器を、製造者のプロトコルにより使用した。結果を図８に示す。黒線は、二重特異性分子９５７／５３０のＣＤ４０に対する結合（時間７５秒）、および、可溶性ＣＴＬＡ−４の注射時（時間４００秒）、ＣＤ４０およびＣＴＬＡ−４に対する同時結合を示す。点線は、ＣＤ４０のみに結合する対照Ａｂ、単一特異性抗体（５３０／５３１、Ａ２−５４）の結合を示す。結果は、二重特異性分子が、ＣＤ４０およびＣＴＬＡ−４に同時に特異的に結合可能であることを実証する。

【実施例8】

【0231】

細胞により発現させられる標的に対する、例示的二重特異性分子の二重結合特異性の実証
ＷＥＨＩ細胞上に発現するヒトＣＤ４０およびＨＥＫ細胞上に発現するヒトＣＴＬＡ−４に同時に結合する二重特異性抗体の能力を、インビトロでフローサイトメトリー解析により決定した。簡潔に述べると、ＷＥＨＩ−ＣＤ４０細胞をＰＫＨ６７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ＃ＭＩＤＩ６７）で標識化し、ＨＥＫ−ＣＴＬＡ４細胞をＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ＃ＭＩＮＩ２６）で標識化し、細胞をＰＢＳ−２％ＢＳＡで洗浄した。１細胞タイプ当たり０．５×１０^６個を、二重特異性ポリペプチド（９５７／５３０）と３０分間室温で混合した。細胞を洗浄し、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ機器上で製造者の指示（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国）に従い解析し、次に平均蛍光強度（「ＭＦＩ」）を決定した。代表的なＦＡＣＳプロットを図９に示す。これは、二重特異性ポリペプチドによる２つの標的への同時結合がインビトロで生じ、この二重特異性結合が、ＣＴＬＡ−４発現細胞とＣＤ４０発現細胞間の細胞−細胞接触をもたらすことを確認する。これは、蛍光顕微鏡法によりさらに確認された（示さず）。

【実施例9】

【0232】

ヒトＢ細胞の増殖を誘導する例示的二重特異性分子の能力の実証
末梢血からのバフィーコートを、スウェーデンのＵｐｐｓａｌａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｂｌｏｏｄ ＣｅｎｔｅｒおよびＬｕｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌの健常血液ドナーから得た。ヒトＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離により単離した。ＣＤ１９＋Ｂ細胞を、ＭＡＣＳマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で製造者の指示に従い単離した。ＣＤ１９＋細胞（５×１０^４個／ウェル、＞９５％純度）を、Ｒ１０培地中で１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４および本発明のポリペプチド（９５７／５３０）、またはＣＤ４０のための単一特異性抗体（５３０／５３１：Ａ２−５４）のいずれかの希釈系列とともに培養し、またはアミノ酸配列配列番号８の単離ポリペプチド（可溶性ＣＴＬＡ−４結合性ドメイン参照番号９０４）を対照として使用した。なぜならそれは、ＣＴＬＡ−４のみに特異的に結合するからである。４８から７２時間後、代謝活性をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ、米国）で測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用してＥＣ５０値を算出した。結果を表１０に示す。本発明の二重特異性ポリペプチドは、ヒトＢ細胞の増殖の相乗的増加をもたらす。

【実施例10】

【0233】

カニクイザルＣＤ４０に対する交差反応性
カニクイザルＣＤ４０を発現する細胞に結合する例示的二重特異性ポリペプチドの能力を、カニクイザルＣＤ４０の細胞外部分をコードする遺伝子をトランスフェクトしたＨＥＫ細胞（ＥＣＡＣＣ、ソールズベリー、英国）に対する結合を測定することにより評価した。これらのＨＥＫ細胞は、それらの表面にカニクイザルＣＤ４０を発現する。二重特異性ポリペプチドの濃度は、１および１０μｇ／ｍｌであった。試験された５つの二重特異性ポリペプチドすべてが、カニクイザルＣＤ４０に結合した。結果を、下の表に示す。

【0234】

【表22】

【実施例11】

【0235】

マウスＣＴＬＡ−４に対する交差反応性
本発明の例示的二重特異性ポリペプチドのマウスおよびヒトＣＴＬＡ−４に対する相対親和性を、阻害ＥＬＩＳＡ結合アッセイを使用して調査した。試験された二重特異性ポリペプチドは、１１４０／１１４１（１１４０重鎖と組み合わされた配列番号１１３）であった。このポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合部分は、１０４０変異体ＣＤ８６分子である。このＣＤ８６分子のＣＴＬＡ−４結合特性は、抗体への結合による影響を受けない。

【0236】

簡潔に述べると、９６ウェル平底高結合プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ＃６５５０７４）を４℃で一晩インキュベートし、ヒトＣＴＬＡ−４（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）でコーティングした。プレートを洗浄し（洗浄緩衝液：ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）Ｍｅｄｉｃａｇｏ＃０９−９４１０−１００）、次にＰＢＳＴ＋３％ＢＳＡ（Ｍｅｒｃｋ、＃１．１２０１８．０１００）中でブロッキングした。

【0237】

試料（例示的ポリペプチド）を、室温で１時間、異なる濃度（１／４に連続希釈 ３００００から０．３ｎｇ／ｍｌ）の可溶性ビオチン化ヒトＣＴＬＡ４（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ＃３０Ｒ−ＣＤ１５２）または可溶性マウスＣＴＬＡ−４（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）で事前インキュベートした。

【0238】

次に、混合物をＥＬＩＳＡプレート中のブロッキングされたウェルに添加した。検出をストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ＃２１１２６）で実施し、その後ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ基質（Ｔｈｅｒｍｏ＃３７０６９）を使用してプレートを展開し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で検出した。結果を表１１に示す。マウスおよびヒトＣＴＬＡ−４で観察された阻害曲線は、２つの形態のＣＴＬＡ−４に対する例示的ポリペプチドの結合親和性が類似した強度であることを実証する。

【実施例12】

【0239】

ヒトＣＤ４０への結合
ヒトＣＤ４０に結合する異なる例示的二重特異性ポリペプチドの能力を、標準的結合ＥＬＩＳＡによりアッセイした。プロトコルは、上の実施例７に記載のとおりであった。結果を、図１２Ａ、ＢおよびＣの用量反応曲線として示す。ＥＣ５０値は０．３から１４ｎＭの範囲であった。試験された二重特異性ポリペプチドには、１１０７／１１４５（１１０７重鎖を有する配列番号１１０の二量体）、１１３６／１１４３（１１４３重鎖を有する配列番号１１１の二量体）、１１３２／１１３９（１１３２重鎖を有する配列番号１１２の二量体）、１１４０／１１４１（１１４０重鎖を有する配列番号１１３の二量体）、１１５０／１１５２（１１５０重鎖を有する配列番号１１４の二量体）および１１３４／１１４１（１１３４重鎖を有する配列番号１１３の二量体）が含まれる。

【実施例13】

【0240】

ヒトＣＴＬＡ−４への結合
６つの異なる例示的二重特異性ポリペプチドを、ヒトＣＤ４０に結合するそれらの能力について、標準的結合ＥＬＩＳＡを使用して試験した。プロトコルは、上の実施例７に記載のとおりであった。結果を、図１３ＡからＦの用量反応曲線として示す。実施例７からの例示的二重特異性分子（９５７／５３０）を、陰性対照としての抗ＣＤ４０単一特異性抗体、Ａ２−５４とともに比較のために含めた。６つの試験されたポリペプチドすべてが、およそ０．０２〜０．０５μｇ／ｍｌの範囲と算出されるＥＣ５０値を有していた。６つすべてが同じＣＤ８６バリアント（１０４０）を共有するので、これは、異なる抗体コンジュゲートがＣＴＬＡ−４に結合するこのバリアントの能力に影響しないことを示す。試験された二重特異性ポリペプチドは、１１０７／１１４５（１１０７重鎖を有する配列番号１１０の二量体）、１１３６／１１４３（１１４３重鎖を有する配列番号１１１の二量体）、１１３２／１１３９（１１３２重鎖を有する配列番号１１２の二量体）、１１４０／１１４１（１１４０重鎖を有する配列番号１１３の二量体）、１１５０／１１５２（１１５０重鎖を有する配列番号１１４の二量体）および１１３４／１１４１（１１３４重鎖を有する配列番号１１３の二量体）であった。

【実施例14】

【0241】

ＣＤ４０およびＣＴＬＡ−４に対する二重結合
実施例１３からの６つの異なる例示的二重特異性ポリペプチドを、ＣＤ４０およびＣＴＬＡ−４の両方に結合するそれらの能力について試験した。これを、表面プラズモン共鳴により、上の実施例７におけるのと同じプロトコルを使用して評価した。結果を表１４に示す。動態パラメータおよび親和性定数を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．１ソフトウェアを使用して算出し、下の表に示す。

【0242】

表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）により決定された、ヒトＣＤ４０への結合についての親和性定数。

【0243】

【表23】

【0244】

表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）により決定された、ヒトＣＴＬＡ−４への結合についての親和性定数。

【0245】

【表24】

【実施例15】

【0246】

二重特異性ポリペプチドは、インビボで抗腫瘍効果を有する
例示的二重特異性ポリペプチド１１４０／１１４１（１１４０重鎖を有する配列番号１１３の二量体）の抗腫瘍効果を、マウス膀胱移行上皮癌細胞株、Ｍｏｕｓｅ Ｂｌａｄｄｅｒ−４９（ＭＢ４９）細胞を接種したヒトＣＤ４０トランスジェニックマウスにポリペプチドを投与することにより研究した。処置は、統計的に有意な抗腫瘍有効性をもたらした。

【0247】

この実験に使用された動物モデルは、ｈＣＤ４０ｔｇマウスの側腹部における２．５×１０^５個のＭＢ４９細胞の注射により創出された。二重特異性ポリペプチドを、２００ｐｍｏｌ（４２μｇ）の用量で接種後７日目および１０日目に腫瘍周囲に投与し、腫瘍測定値をキャリパーにより得た。腫瘍成長および生存を経時的に追跡した。

【0248】

処置は、有意な抗腫瘍有効性をもたらし、図１５ＡおよびＢに示すとおり、生存が改善し、腫瘍体積が減少した。

【実施例16】

【0249】

二重特異性ポリペプチドは、インビボで抗腫瘍免疫記憶を確立する
膀胱癌について前に処置され二重特異性ポリペプチド１１４０／１１４１で治癒したマウスに、膀胱癌細胞で再免疫試験をした。二重特異性抗体クローンでの処置が、動物が再免疫試験されたときに、膀胱癌についての免疫記憶、したがって腫瘍に対する免疫を確立したことが示された。

【0250】

この実験のために、ＭＢ４９再免疫試験を、（実施例１５におけるように）以前に１１４０／１１４１での処置によりＭＢ４９腫瘍が治癒したｈＣＤ４０ｔｇマウスの側腹部における２．５×１０^５個の細胞の注射により実施した。未処置（すなわち、以前にポリペプチドで処置または接種されていない）ｈＣＤ４０ｔｇマウスを対照として使用した。キャリパーにより測定される腫瘍成長および生存を経時的に追跡した。

【0251】

図１６ＡおよびＢに示すとおり、以前に処置され、再免疫試験されたマウスは、１００％の生存率を有しており、腫瘍は完全に消失した。したがってデータは、二重特異性ポリペプチドでの処置が、ｈＣＤ４０ｔｇマウスにおけるＭＢ４９での腫瘍再免疫試験に対する統計的に有意な免疫を誘導することを示す。これは、免疫記憶の存在を実証する。この結果には臨床的関連性がある。なぜなら、抗腫瘍免疫記憶は、特に転移性腫瘍に対する長期持続処置効果を確立するために必要だからである。

【実施例17】

【0252】

Ｂ細胞増殖アッセイ
実施例１３からの６つの異なる例示的二重特異性ポリペプチドを、ヒトＢ細胞を刺激するそれらの能力について試験した。各二重特異性ポリペプチドを、ＣＴＬＡ−４結合性ドメインを欠く対応する単一特異性抗体と直接比較した。

【0253】

ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐヒトＢ細胞富化カクテル（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して白血球フィルターからのヒトＢ細胞を精製し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して密度分離した。Ｂ細胞純度を抗ヒトＣＤ１９−ＰＥ ａｂ（Ｍｉｌｔｅｎｅｙ）での染色により評価した。Ｂ細胞純度は、３つの実験の異なるドナー間で変化し、平均Ｂ細胞純度は６９％であった。

【0254】

Ｂ細胞を９６ウェルプレート上に、異なる濃度のＣＤ４０−ＣＤ８６抗体およびヒトＩＬ−４とともに播種した。プレートを加湿チャンバー内で、３７℃、５％ＣＯ^２で３日間インキュベートした。代謝活性を、Ｂ細胞増殖を反映するウェルのＡＴＰ含有量を測定するＣｅｌｌ ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）発光で測定した。Ｓ２Ｃ６を参照抗体として使用した。Ｓ２Ｃ６は、Ｂ細胞増殖アッセイにおいてアゴニスト作用を有するマウス抗ヒトＣＤ４０抗体である（Koho, Can Imm Imm 1984）。

【0255】

各抗体の用量反応曲線を、ｇｒａｐｈ Ｐａｄ ｐｒｉｓｍ ４．０を使用してプロットした。各抗体の効率を、抗体のＴＯＰ値（可変用量反応曲線フィッティングを使用して算出されたもの）を、参照抗体Ｓ２Ｃ６のＴＯＰ値で割ることにより正規化した。

【0256】

図１７に示すように、二重特異性ポリペプチドは、Ｂ細胞増殖アッセイにおいて、それらに対応するモノクローナル抗ＣＤ４０抗体よりも高い効率を示したのであり、ＣＴＬＡ−４結合部分がＢ細胞増殖を刺激する能力に影響することを示唆する。この効果は、抗体のＣＤ８６部分に結合でき、それにより抗体の架橋を誘導する、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４を発現する細胞（Ｂ細胞以外）の存在によるものでありうる。得られた免疫活性の増加は、インビボでのより強力な免疫活性化をもたらし、抗腫瘍活性の改善をもたらす潜在性を有する。

【実施例18】

【0257】

ヒトＰＢＭＣにおける免疫細胞の活性化
ヒトＰＢＭＣは、ＣＤ４０を発現する抗原提示細胞およびＣＴＬＡ−４を発現するＴ細胞を含有する。実施例１３からの２つの例示的二重特異性分子（１１３４／１１４１および１１４０／１１４１）を、これら免疫細胞を活性化するそれらの能力についてアッセイした。各二重特異性ポリペプチドを、ＣＴＬＡ−４結合性ドメインを欠く対応する単一特異性抗体と直接比較した。

【0258】

白血球フィルターまたはバフィー血液（buffy blood）からのヒトＰＢＭＣ（２〜４人のドナー／実験）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での密度分離を使用して精製した。ＰＢＭＣをＣＤ３で事前コーティング（一晩）した９６ウェルプレート上に、異なる濃度の二重特異性ポリペプチドまたは対応する単一特異性抗体とともに播種した。Ｔ細胞刺激因子であるブドウ球菌エンテロトキシンＡ（staphylococcal enterotoxin A：ＳＥＡ）を培養培地に添加した。プレートを加湿チャンバー内で、３７℃、５％ＣＯ^２で2日間インキュベートし、ＩＬ−２ ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して上清中のＩＬ−２濃度を測定した。試験された各濃度でのＩＬ−２産生を、ＩＬ−２ ＥＬＩＳＡ標準曲線から算出した。

【0259】

各二重特異性ポリペプチドの、対応する単一特異性抗体に対する平均倍率変化を、各二重特異性ポリペプチドの２つの最高値の平均（ＴＯＰ値）を対応する単一特異性抗体のＴＯＰ値で割ることにより算出した。２つの二重特異性ポリペプチドが、ＩＬ−２産生により測定される強力なＴ細胞活性化をもたらした。ＩＬ−２産生における平均倍率変化は、図１８に示すとおり、単一特異性抗体に対して有意に高かった。

【0260】

二重特異性ポリペプチド１１３４／１１４１および１１４０／１１４１の抗ＣＤ４０抗体部分が、ＣＤ４０受容体に対するＣＤ４０Ｌ結合を遮断可能でないことが決定された（データは示さず）。したがって、これらの抗ＣＤ４０抗体（およびＣＤ４０上の同じエピトープに結合する任意のもの）は、ＣＴＬＡ−４結合性ドメインを有する二重特異性フォーマットにおける使用のための特に好ましい特性を有する。二重特異性フォーマットにおいてＣＤ４０上のこの特定のエピトープに結合することは、驚くほど強力な免疫活性化を可能にし、これはインビボでの強力な抗腫瘍効果をもたらす潜在性を有する。

【実施例19】

【0261】

ＣＴＬＡ−４はＢ細胞の活性化を誘導した
免疫活性化を、ヒトＣＴＬＡ−４を発現するように形質転換された細胞およびＢ細胞を、例示的二重特異性ポリペプチドとともにインキュベートすることにより、さらに調査した。

【0262】

２．５×１０^３個のＨＥＫ野生型細胞（ＨＥＫ−ｗｔ）またはＣＴＬＡ−４をもたらすよう形質導入されたＨＥＫ細胞（ＣＴＬＡ４−ＨＥＫ）を、９６ウェルプレートのウェル内に播種した。異なる濃度の実施例１３からの例示的二重特異性ポリペプチド（１１４０／１１４１）を、加湿チャンバー内、３７℃、５％ＣＯ２での事前インキュベーション前に、細胞含有ウェルおよび空のウェルに添加した。２時間のインキュベーション後、２人の健常ドナーの白血球フィルターから単離された５×１０^３個のＢ細胞を、各ウェルにＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）とともに添加した。

【0263】

４８時間のインキュベーション後、細胞を回収し、抗ヒトＣＤ１９−ＰＥ（Ｂ細胞）および活性化マーカー：抗ヒトＣＤ８３−ＡＰＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に対する抗体の共染色により、Ｂ細胞活性化を解析した。ＣＤ８３発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ上でフローサイトメトリーにより測定し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用してデータを解析し、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ４を使用して統計解析を実施した。

【0264】

図１９に示すとおり、ＣＤ８３の上方制御の効率は、二重特異性ポリペプチドのＣＴＬＡ４−ＨＥＫおよびＢ細胞との共培養時に、対照と比較して４〜１４倍増加した。対照は、二重特異性ポリペプチドのＨＥＫ−ｗｔおよびＢ細胞との共培養か、またはＢ細胞単独のいずれかであった。

【0265】

多くのＣＤ４０アゴニストが、最適活性を誘導するために抗体のＦｃ部分を介した架橋を必要とすることが知られている（Li et al 20011, Science、White et al 2011 J Immunol）。二重特異性ポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合部分は、この架橋の増加を提供し、免疫活性化の増加をもたらしうる。免疫活性化の増加は、インビボでの抗腫瘍効果の増加をもたらしうる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]