特許 6644956 ＶＥＧＦに対する合成の抗体およびそれらの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6644956

(24)【登録日】2020年1月10日

(45)【発行日】2020年2月12日

(54)【発明の名称】ＶＥＧＦに対する合成の抗体およびそれらの使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/22 20060101AFI20200130BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20200130BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20200130BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20200130BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20200130BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20200130BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20200130BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20200130BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/22ZNA

   C12N15/13

   C12N15/63

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C12P21/08

【請求項の数】27

【全頁数】93

(21)【出願番号】特願2019-529229(P2019-529229)

(86)(22)【出願日】2017年9月7日

(65)【公表番号】特表2019-531762(P2019-531762A)

(43)【公表日】2019年11月7日

(86)【国際出願番号】IB2017001166

(87)【国際公開番号】WO2018046997

(87)【国際公開日】20180315

【審査請求日】2019年5月29日

(31)【優先権主張番号】62/384,644

(32)【優先日】2016年9月7日

(33)【優先権主張国】US

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】519079588

【氏名又は名称】サクシン ライフサイエンシス ピーヴィーティー エルティディー

【氏名又は名称原語表記】ＳＡＫＳＩＮ ＬＩＦＥＳＣＩＥＮＣＥＳ ＰＶＴ ＬＴＤ

(73)【特許権者】

【識別番号】518417983

【氏名又は名称】ザ ガバニング カウンシル オブ ザ ユニバーシティ オブ トロント

【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＧＯＶＥＲＮＩＮＧ ＣＯＵＮＣＩＬ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＴＯＲＯＮＴＯ

(74)【代理人】

【識別番号】100109634

【弁理士】

【氏名又は名称】舛谷 威志

(74)【代理人】

【識別番号】100129263

【弁理士】

【氏名又は名称】中尾 洋之

(72)【発明者】

【氏名】フェルース，フレドリック

(72)【発明者】

【氏名】モファット，ジェイソン

(72)【発明者】

【氏名】シドゥ，サシュデヴ

(72)【発明者】

【氏名】ラムチャンド，シーエヌ

(72)【発明者】

【氏名】ハリット，ラヴィカント

(72)【発明者】

【氏名】アロラ，リーナ

(72)【発明者】

【氏名】アントニー，アジュ

(72)【発明者】

【氏名】ヴィノドゥ，サンティ

【審査官】 福間 信子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００７−５２６７５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００９／０８０２５１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００９−５１８０１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００７／０２３７７６４（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ／ＵｎｉＰｒｏｔ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｋａｂａｔ法に従い画定される、以下の超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列：
配列番号１のアミノ酸３１位のヒスチジンからアミノ酸３５位のヒスチジンを含むＣＤＲＨ１、配列番号１のアミノ酸５０位のチロシンからアミノ酸６６位のグリシンを含むＣＤＲＨ２、および配列番号１のアミノ酸９９位のヒスチジンからアミノ酸１０９位のチロシンを含むＣＤＲＨ３
を含む重鎖可変ドメインおよび
配列番号３のアミノ酸２４位のアルギニンからアミノ酸３４位のアラニンを含むＣＤＲＬ１、配列番号３のアミノ酸５０位のリジンからアミノ酸５６位のアラニンを含むＣＤＲＬ２、および配列番号３のアミノ酸８９位のグルタミンからアミノ酸９７位のスレオニンを含むＣＤＲＬ３
を含む軽鎖可変ドメインを含む、ＶＥＧＦに特異的に認識し結合する抗ＶＥＧＦ抗体。

【請求項2】

ＩＭＧＴ法に従い画定される、以下の超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列：
配列番号１のアミノ酸２６位のグリシンからアミノ酸３３位のセリンを含むＣＤＲＨ１、配列番号１のアミノ酸５１位のイソロイシンからアミノ酸５８位のスレオニンを含むＣＤＲＨ２、および配列番号１のアミノ酸９７位のアラニンからアミノ酸１０９位のチロシンを含むＣＤＲＨ３
を含む重鎖可変ドメイン、および
配列番号３のアミノ酸２７位のグルタミンからアミノ酸３２位のアルギニンを含むＣＤＲＬ１、配列番号３のアミノ酸５０位のリジンからアミノ酸５２位のセリンを含むＣＤＲＬ２、および配列番号３のアミノ酸８９位のグルタミンからアミノ酸９７位のスレオニンを含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変ドメイン
を含む、ＶＥＧＦに特異的に認識し結合する抗ＶＥＧＦ抗体。

【請求項3】

ａ．図１６に太字で示されるＩＭＧＴ法に従って画定される以下のＣＤＲアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン：アミノ酸配列ＧＦＤＬＤＨＹＳを含むＣＤＲＨ１、アミノ酸配列ＩＹＰＳＹＧＹＴを含むＣＤＲＨ２、およびアミノ酸配列ＡＲＨＡＷＹＹＧＷＧＬＤＹを含むＣＤＲＨ３と；
ｂ．図１６に太字で示されるＩＭＧＴ法に従って画定される以下のＣＤＲアミノ酸配列：アミノ酸配列ＱＡＡＹＧＲを含むＣＤＲＬ１、アミノ酸配列ＫＡＳを含むＣＤＲＬ２、およびアミノ酸配列ＱＱＲＧＷＹＬＦＴを含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変ドメインと
を含む、ＶＥＧＦに特異的に認識し結合する抗ＶＥＧＦ抗体。

【請求項4】

該抗ＶＥＧＦ抗体が、単離された抗ＶＥＧＦ抗体である請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗ＶＥＧＦ抗体。

【請求項5】

ａ．図９Ｃに示される、または配列番号３に記載される超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および
ｂ．図９Ｃに示される、または配列番号１に記載される超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン
を含む、ＶＥＧＦに特異的に認識し結合するヒト抗ＶＥＧＦ抗体。

【請求項6】

ａ．図１６に太字で示されるＩＭＧＴ法に従って画定される以下のＣＤＲアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン：アミノ酸配列ＧＦＤＬＤＨＹＳを含むＣＤＲＨ１、アミノ酸配列ＩＹＰＳＹＧＹＴを含むＣＤＲＨ２、およびアミノ酸配列ＡＲＨＡＷＹＹＧＷＧＬＤＹを含むＣＤＲＨ３と；
ｂ．図１６に太字で示されるＩＭＧＴ法に従って画定される以下のＣＤＲアミノ酸配列：アミノ酸配列ＱＡＡＹＧＲを含むＣＤＲＬ１、アミノ酸配列ＫＡＳを含むＣＤＲＬ２、およびアミノ酸配列ＱＱＲＧＷＹＬＦＴを含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変ドメインと
を含む、ＶＥＧＦに特異的に認識し結合するヒト抗ＶＥＧＦ抗体。

【請求項7】

該ヒト抗ＶＥＧＦ抗体が単離されたヒト抗ＶＥＧＦ抗体である請求項５又は６に記載のヒト抗ＶＥＧＦ抗体。

【請求項8】

該抗ＶＥＧＦ抗体が合成されたヒト抗ＶＥＧＦ抗体である請求項１に記載の抗ＶＥＧＦ抗体。

【請求項9】

該抗ＶＥＧＦ抗体が合成されたヒト抗ＶＥＧＦ抗体である請求項２に記載の抗ＶＥＧＦ抗体。

【請求項10】

該抗ＶＥＧＦ抗体が合成されたヒト抗ＶＥＧＦ抗体である請求項３に記載の抗ＶＥＧＦ抗体。

【請求項11】

該ヒト抗ＶＥＧＦ抗体が合成されたヒト抗ＶＥＧＦ抗体である請求項５に記載のヒト抗ＶＥＧＦ抗体。

【請求項12】

該ヒト抗ＶＥＧＦ抗体が合成されたヒト抗ＶＥＧＦ抗体である請求項６に記載のヒト抗ＶＥＧＦ抗体。

【請求項13】

配列番号１のアミノ酸１位のグルタミン酸からアミノ酸３０位のフェニルアラニンを含む重鎖フレームワーク領域（ＦＲ）１であるＦＲＨ１のアミノ配列をさらに含むか、
配列番号１のアミノ酸３６位のトリプトファンからアミノ酸４９位のアラニンを含む重鎖フレームワーク領域（ＦＲ）２であるＦＲＨ２のアミノ配列をさらに含むか、
配列番号１のアミノ酸６７位のアルギニンからアミノ酸９８位のアルギニンを含む重鎖フレームワーク領域（ＦＲ）３であるＦＲＨ３のアミノ配列をさらに含むか、
配列番号１のアミノ酸１１０位のトリプトファンからアミノ酸１２０位のセリンを含む重鎖フレームワーク領域（ＦＲ）４であるＦＲＨ４のアミノ配列をさらに含むか、または
以下の重鎖フレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列：配列番号１のアミノ酸１位のグルタミン酸からアミノ酸３０位のフェニルアラニンを含むＦＲＨ１、配列番号１のアミノ酸３６位のトリプトファンからアミノ酸４９位のアラニンを含むＦＲＨ２、配列番号１のアミノ酸６７位のアルギニンからアミノ酸９８位のアルギニンを含むＦＲＨ３、および配列番号１のアミノ酸１１０位のトリプトファンからアミノ酸１２０位のセリンを含むＦＲＨ４
をさらに含み、ここで該フレームワーク領域はＫａｂａｔ法に従い画定される、請求項１または５に記載の抗ＶＥＧＦ抗体。

【請求項14】

配列番号３のアミノ酸１位のアスパラギン酸からアミノ酸２３位のシステインを含む軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ）１であるＦＲＬ１のアミノ配列をさらに含むか、
配列番号３のアミノ酸３５位のトリプトファンからアミノ酸４９位のチロシンを含む軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ）２であるＦＲＬ２のアミノ配列をさらに含むか、
配列番号３のアミノ酸５７位のグリシンからアミノ酸８８位のシステインを含む軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ）３であるＦＲＬ３のアミノ配列をさらに含むか、
配列番号３のアミノ酸９８位のフェニルアラニンからアミノ酸１０７位のリジンを含む軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ）４であるＦＲＬ４のアミノ配列をさらに含むか、または
以下の軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ）アミノ酸配列：配列番号３のアミノ酸１位のアスパラギン酸からアミノ酸２３位のシステインを含むＦＲＬ１、配列番号３のアミノ酸３５位のトリプトファンからアミノ酸４９位のチロシンを含むＦＲＬ２、配列番号３のアミノ酸５７位のグリシンからアミノ酸８８位のシステインを含むＦＲＬ３、および配列番号３のアミノ酸９８位のフェニルアラニンからアミノ酸１０７位のリジンを含むＦＲＬ４
をさらに含み、ここでフレームワーク領域はＫａｂａｔ法に従い画定される、請求項１または５に記載の抗ＶＥＧＦ抗体。

【請求項15】

配列番号１のアミノ酸１位のグルタミン酸からアミノ酸２５位のセリンを含む重鎖フレームワーク領域（ＦＲ）１であるＦＲＨ１のアミノ配列をさらに含むか、
配列番号１のアミノ酸３４位のイソロイシンからアミノ酸５０位のチロシンを含む重鎖フレームワーク領域（ＦＲ）２であるＦＲＨ２のアミノ配列をさらに含むか、
配列番号１のアミノ酸５９位のチロシンからアミノ酸９６位のシステインを含む重鎖フレームワーク領域（ＦＲ）３であるＦＲＨ３のアミノ配列をさらに含むか、
配列番号１のアミノ酸１１０位のトリプトファンからアミノ酸１２０位のセリンを含む重鎖フレームワーク領域（ＦＲ）４であるＦＲＨ４のアミノ配列をさらに含むか、または
以下の重鎖フレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列：配列番号１のアミノ酸１位のグルタミン酸からアミノ酸２５位のセリンを含むＦＲＨ１、配列番号１のアミノ酸３４位のイソロイシンからアミノ酸５０位のチロシンを含むＦＲＨ２、配列番号１のアミノ酸５９位のチロシンからアミノ酸９６位のシステインを含むＦＲＨ３、および配列番号１のアミノ酸１１０位のトリプトファンからアミノ酸１２０位のセリンを含むＦＲＨ４
をさらに含み、ここでフレームワーク領域はＩＭＧＴ法に従い画定される、請求項２、３、５または６に記載の抗ＶＥＧＦ抗体。

【請求項16】

配列番号３のアミノ酸１位のアスパラギン酸からアミノ酸２６位のセリンを含む軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ）１であるＦＲＬ１のアミノ配列をさらに含むか、
配列番号３のアミノ酸３３位のバリンからアミノ酸４９位のチロシンを含む軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ）２であるＦＲＬ２のアミノ配列をさらに含むか、
配列番号３のアミノ酸５３位のグルタミンからアミノ酸８８位のシステインを含む軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ）３であるＦＲＬ３のアミノ配列をさらに含むか、
配列番号３のアミノ酸９８位のフェニルアラニンからアミノ酸１０７位のリジンを含む軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ）４であるＦＲＬ４のアミノ配列をさらに含むか、または
以下の軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ）アミノ酸配列：配列番号３のアミノ酸１位のアスパラギン酸からアミノ酸２６位のセリンを含むＦＲＬ１、配列番号３のアミノ酸３３位のバリンからアミノ酸４９位のチロシンを含むＦＲＬ２、アミノ酸５３位のグルタミン酸からアミノ酸８８位のシステインを含むＦＲＬ３、および配列番号３のアミノ酸９８位のフェニルアラニンからアミノ酸１０７位のリジンを含むＦＲＬ４
をさらに含み、ここでフレームワーク領域はＩＭＧＴ法に従い画定される、請求項２、３、５または６に記載の抗ＶＥＧＦ抗体。

【請求項17】

抗体の断片であって、該抗体が請求項１、２、３、５、または６に記載の抗体であり、該断片がＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、およびＦｖ断片からなる群から選択される、抗体の断片。

【請求項18】

該抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、合成抗体、単鎖抗体、またはそれらの抗原結合断片である、請求項１、２、３、５、または６に記載の抗ＶＥＧＦ抗体。

【請求項19】

該抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、Ｆｃ領域に接合されているｓｃＦｖ、Ｆｃ領域に接合されているＦａｂ、およびＦｖ断片からなる群から選択される、請求項１８に記載の抗ＶＥＧＦ抗体。

【請求項20】

請求項１８に記載の抗体をコードする単離された核酸。

【請求項21】

請求項２０に記載の核酸を含むベクター。

【請求項22】

請求項２１に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項23】

請求項２２に記載の宿主細胞を培養し、その結果前記核酸が発現して抗体を生産することを含む、抗ＶＥＧＦ抗体を生産するプロセス。

【請求項24】

ヒトＶＥＧＦに結合する特異的な結合部の免疫グロブリン重鎖またはその抗原結合断片、免疫グロブリン軽鎖またはその抗原結合断片、または両方をコードする核酸であって、
前記特異的な結合部が、抗体の抗原結合部分を含み、
ａ）前記抗体の抗原結合部分の免疫グロブリン重鎖またはその抗原結合断片は、配列番号１の９１位のシトシンで始まり１０５位のシトシンで終わる核酸配列を含む免疫グロブリン重鎖ＣＤＲＨ１、配列番号１の１４８位のチミンで始まり１９８位のシトシンで終わる核酸配列を含む重鎖ＣＤＲＨ２、および配列番号１の２９５位のシトシンで始まり３２７位のシトシンで終わる核酸配列を含む重鎖ＣＤＲＨ３を含み、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３はＫａｂａｔ法に従い画定され；ならびに／または
ｂ）前記抗体の抗原結合部分の免疫グロブリン軽鎖またはその抗原結合断片は、配列番号３の７０位のシトシンで始まり１０２位のシトシンで終わる核酸配列を含む軽鎖ＣＤＲＬ１、配列番号３の１４８位のアデニンで始まり１６８位のシトシンまでの核酸配列を含む軽鎖ＣＤＲＬ２、および配列番号３の２６５位のシトシンで始まり２９１位のグアニンで終わる核酸配列を含む軽鎖ＣＤＲＬ３を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３はＫａｂａｔ法に従い画定される、核酸。

【請求項25】

該核酸が単離された核酸である請求項２４記載の核酸。

【請求項26】

哺乳動物において黄斑変性症の阻害、または細胞増殖性の障害の阻害に使用するための請求項１８に記載の抗体であって、該細胞増殖性の障害は、滲出型加齢性黄斑変性症、糖尿病性黄斑症、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）における黄斑浮腫、虹彩新血管新生、病理学的近視に起因する脈絡膜の新血管新生、成熟児網膜症、血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、網膜新血管新生、経扁平部硝子体切除（ＰＰＶ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、及びがんからなる群より選ばれる、抗体。

【請求項27】

該抗体がヒト又はヒト化抗ＶＥＧＦ抗体である請求項２６記載の抗体。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

この出願を通して、括弧内に様々な公報が参照される。これらの公報の開示は、参照によりその全体を本明細書に組み込まれる.

【0002】

加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）は、６０歳以上の人々の視力喪失および失明の主因である。ＡＭＤは、萎縮型（非新生血管型）または滲出型（新生血管型）のどちらかのＡＭＤとして診断される。ＡＭＤ患者の約８５から９０パーセントが、萎縮型ＡＭＤを持つものと診断される。それは、黄斑組織の老化および菲薄化の結果生じ得る疾患の早期段階であり、結果として黄斑にドルーゼとよばれる黄色斑の特徴を持つ色素の沈着が起こる。中心視の喪失が次第に萎縮型黄斑変性症に伴って起こるが、通常は滲出型ＡＭＤの重さには程遠いものである。

【0003】

かなりの割合の症例で、萎縮型ＡＭＤは、さらに進行または損傷した疾患の形態である滲出型ＡＭＤに進展し、重篤な視力喪失に至る。滲出型ＡＭＤは、血液および体液の漏出を結果として生じる網膜下での新しい血管の形成（血管形成）を含んだ、脈絡膜新血管新生の過程があるという特徴がある。この漏出は、永続的な損傷を感光性網膜細胞に引き起こし、その結果、視力喪失を生じる。血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、脈絡膜新血管新生の病態形成に中心的な役割を果たすようである。

【0004】

滲出型ＡＭＤのための治療方法としては、レーザー光凝固、ビスダイン（登録商標）（Ｖａｌｅａｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いる光線力学的レーザー療法、および抗ＶＥＧＦ薬剤が挙げられる。抗ＶＥＧＦ剤の発見は、この状態の治療に大変革をもたらしている。現在、承認されているまたはよく使用されている４つの抗ＶＥＧＦ剤としては、ペガプタニブ［マクジェン（登録商標）、Ｖａｌｅａｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ］、ラニビズマブ［ルセンティス（登録商標）、ＮｏｖａｒｔｉｓおよびＲｏｃｈｅ］、アフリベルセプトまたはＶＥＧＦトラップアイ［アイリーア（登録商標）、ＢａｙｅｒおよびＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ］、ならびにベバシズマブ［アバスチン（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ］が挙げられる。

【0005】

抗ＶＥＧＦ療法は、滲出型ＡＭＤを治療するために使用されることがある。しかし、現在の治療は、３か月にわたって１か月に１回、患部の眼内に抗ＶＥＧＦ薬剤を頻回注射し、次いで、さらに注射するために治療をモニタリングすることを含む。頻回の注射の適用は、黄斑浮腫や患者の眼のストレスなどの合併症に至らしめる。黄斑浮腫が長引く場合、やがて網膜の菲薄化、瘢痕、または網膜円孔が形成する可能性がある。そのため、滲出型ＡＭＤなど異常な血管新生に伴う疾患を治療するための薬剤および方法の改善が、依然として喫緊で求められている。

【発明の概要】

【0006】

この発明は、新規の抗ＶＥＧＦ抗体；およびそのような新規の抗ＶＥＧＦ抗体をコードする配列を含むポリヌクレオチド、ならびにそれらを含む医薬組成物を含めた組成物、ならびにそれらの使用を包含する。

【0007】

本願発明はまた、疾患を阻害または治療するための方法における、新規の抗ＶＥＧＦ抗体、そのような新規の抗ＶＥＧＦ抗体をコードする配列を含むポリヌクレオチド、および医薬組成物を含めた組成物を使用することを提供し、そのような疾患としては、例えば、滲出型加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性黄斑症、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）における黄斑浮腫、虹彩新血管新生、病理学的近視に起因する脈絡膜の新血管新生、成熟児網膜症、血管新生緑内障、およびがんなどがある。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】Ｆａｂタンパク質の濃度を決定するための標準曲線を示す図であり、この図は、ブラッドフォードのタンパク質アッセイを用いて吸光度５９５ｎｍでウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を参照標品とすることに基づき、５０μｇ／ｍＬから５００μｇ／ｍＬまでのＢＳＡの線形性を示す。

【図2】抗ＶＥＧＦ活性を有するＦａｂ量を定量するための標準曲線を示す図であり、この図は、固相化ヒトＶＥＧＦ（ｈＶＥＧＦ）１２１アイソフォームとセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−コンジュゲート抗カッパ軽鎖抗体とを用い、固相化ｈＶＥＧＦに結合している可溶性抗ＶＥＧＦ Ｆａｂを検出して４５０ｎｍでの吸光度を持つ比色生成物を生じる、ＥＬＩＳＡフォーマットであり、既知濃度の抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ［ルセンティス（登録商標）、ＮｏｖａｒｔｉｓおよびＲｏｃｈｅ］に対するものである。

【図3】ｈＶＥＧＦ−１２１に対するラニビズマブおよびＦａｂクローン＃２０１（Ｆａｂ２０１）の最大半数阻害濃度（ＩＣ５０）を決定するための競合結合アッセイを示す図である。２つの別々の実験で、Ｆａｂを、ｘ軸に標記された様々な濃度のｈＶＥＧＦ−１２１と共にインキュベーションした。各Ｆａｂの非結合画分を、ｈＶＥＧＦ−１２１被覆プレートを用いて捕捉し、ｙ軸に示されるように、抗カッパ軽鎖−ＨＲＰ−コンジュゲート抗体を用いて定量した。１００ｐＭの各Ｆａｂを、ｈＶＥＧＦ−１２１の逐次希釈物と共にインキュベーションした。非結合のＦａｂを、固相化ｈＶＥＧＦ−１２１を用いて捕捉し、抗カッパ軽鎖−ＨＲＰ−コンジュゲート抗体を用いて検出した。Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて５パラメーター非対称モデルによりフィッティングされたデータから算出されたＩＣ５０より推定されたＫｄを、表３に示す。

【図4】組換えのｈＶＥＧＦ１２１アイソフォームを用いて合成のナイーブな抗体断片（Ｆａｂ）のファージディスプレイライブラリーのスクリーニングから得られた、ＦａｂのＣＤＲ配列（Ａ）、およびＦａｂ−ＥＬＩＳＡフォーマットで、固相化ｈＶＥＧＦと、ナイーブファージディスプレイライブラリーから選択された可溶性Ｆａｂの逐次希釈物とを用いた、結合親和性の分析（Ｂ）を示す図である。ＫａｂａｔによるＣＤＲに対応するアミノ酸配列を下線表示する（Ａ）。Ｆａｂ−ＥＬＩＳＡによる力価測定を以下のように行った。２ｕｇ／ｍＬのｈＶＥＧＦ−１２１を用いて被覆されたウェル上で、濃度増加させたＦａｂをインキュベーションした。結合しているＦａｂを、抗カッパ軽鎖−ＨＲＰ−コンジュゲート抗体を用いて検出した（Ｂ）。解離定数（Ｋｄ）を、５０％有効最大濃度（ＥＣ５０）から推定し、線グラフの下の表に標記している。

【図5】競合的Ｆａｂ−ＥＬＩＳＡフォーマットにおける競合物としてＶＥＧＦの天然の受容体であるＦＬＴの存在下（＋）または不在下（−）での、選択されたＦａｂの固相化ｈＶＥＧＦへの結合の阻害を示す棒グラフであり、このＥＬＩＳＡフォーマットは、ｈＶＥＧＦ上の結合部位の重なる６種のＦａｂとＦＬＴとに整合したものである。マイクロタイタープレートのウェルを、２ｕｇ／ｍＬのｈＶＥＧＦで被覆した。洗浄したウェルを、ＰＢＴ中５００ｎＭ ＦＬＴ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３２１−ＦＬ−２５０）（＋）またはＰＢＴのみ（−）のどちらかを用いて、１時間プレインキュベーションした。次いで、亜飽和量のＦａｂをＦＬＴ−またはＦＬＴ＋のどちらかのウェルに添加し、プレートを１５分間インキュベーションして洗浄した。ウェルに添加したＦａｂの識別をｙ軸上に特定した。次いで、結合しているＦａｂを、抗カッパ軽鎖−ＨＲＰ抗体を用いて検出した。バックグラウンドを差し引いたＯＤ４５０ｎｍの測定値をｙ軸上に標示している。

【図6】（Ａ）ＦＦ０１２４−１ Ｆａｂ配列に基づくライブラリーの選択に由来するＦａｂ ＣＤＲ配列を示す図である。１０ｎＭのｈＶＥＧＦをＦａｂ−ファージと共にプレインキュベーションした際に、競合−ファージ−ＥＬＩＳＡに観察される残りの結合によって、Ｆａｂは順位付けされる。（ＢおよびＣ）パネルＡに挙げられた配列を持つ各種クローンについて競合的ファージ−ＥＬＩＳＡの結果を示す図である。１ｎＭ（Ｂ）または１０ｎＭ（Ｃ）のｈＶＥＧＦと共にプレインキュベーションした後の固相化ｈＶＥＧＦとのＦａｂファージの残りの結合を、ｈＶＥＧＦのプレインキュベーションのない結合のパーセンテージで示す。（＊）ＣＤＲ−Ｈ３（Ｋａｂａｔにより画定）は、このクローン群では「ＨＡＷＹＹＧＷＡＦＤＹ」配列も有する。（＊＊）ＣＤＲ−Ｈ３（Ｋａｂａｔにより画定）は、このクローン群では、「ＨＡＷＹＹＧＷＡＬＤＹ」配列および「ＨＡＷＹＹＧＷＡＦＤＹ」配列も有する。親ＦａｂであるＦＦ０１２４−１の配列および競合的ファージＥＬＩＳＡを、比較のために示す。ＫａｂａｔによるＣＤＲに対応するアミノ酸配列を下線表示する。親Ｆａｂ（ＦＦ０１２４−１）とは異なるアミノ酸配列を太字で強調表示している。

【図7】（Ａ）ＦＦ０１５８−Ｃ４ Ｆａｂ配列に基づくライブラリーの選択に由来するＦａｂのＣＤＲ配列と、攪拌フラスコ中の産生量と、一点での競合的ＥＬＩＳＡおよび／または競合的ＥＬＩＳＡによる親和性の測定値とを示す図である（ＫｄのデータおよびフィッティングはＢに示されている）。ＫａｂａｔによるＣＤＲに対応するアミノ酸配列を下線表示する。親Ｆａｂ（ＦＦ０１５８−Ｃ４）とは異なるアミノ酸配列を太字で強調表示する。

【図8】ＦＦ０１８８−Ｈ５ Ｆａｂ配列に基づくライブラリーの選択に由来するＦａｂのＣＤＲ配列と、攪拌フラスコ中の生産収量と、一点での競合的ＥＬＩＳＡおよび／または競合的ＥＬＩＳＡによる親和性の測定値と、融解温度（Ｔｍ）とを示す図である。ＫａｂａｔによるＣＤＲに対応するアミノ酸配列を下線表示する。親Ｆａｂ（ＦＦ０１８８−Ｈ５）とは異なるアミノ酸配列を太字で強調表示する。

【図9A】ＦａｂのＣＤＲ配列、生産収量、およびｈＶＥＧＦ結合速度論パラメーターを示す図である。（Ａ）ＣＤＲ配列と、攪拌フラスコ中の収量と、ＳＰＲによって測定されたｈＶＥＧＦ−１２１との結合オフ速度と、融解温度（Ｔｍ）とを示す表であり、データはＢに示されている。ＫａｂａｔによるＣＤＲに対応するアミノ酸配列を下線表示する。親Ｆａｂ（（ＦＦ０１１７−Ａ５）とは異なるアミノ酸配列を太字で強調表示する。

【図9B】（Ｂ）サーマルシフトアッセイを示す図である。

【図9C】（Ｃ）Ｆａｂ ＦＦ０３０４６−２の完全長配列の例を示す図である。

【図10】抗ＶＥＧＦ ＦａｂであるＦＦ０３０４６−１、ＦＦ０３０４６−２、およびラニビズマブ［ルセンティス（登録商標）；ＮｏｖａｒｔｉｓおよびＲｏｃｈｅ］による、ｈＶＥＧＦ依存的なヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の増殖の阻害を示す図であり、この阻害では、組換えヒトＶＥＧＦ１６５アイソフォームを使用してＨＵＶＥＣ細胞の増殖を刺激する。２×１０５個細胞／ｍＬのｌｏｇ相のＨｕｖｅｃ細胞を、２６０ｐＭのｒｈＶＥＧＦ−１６５と共にプレインキュベーションしたＦａｂの逐次希釈物に添加した。次いで、細胞を３７℃で３日間インキュベーションした後、レサズリン染色によって生細胞数を評価した。

【図11】競合的Ｆａｂ−ＥＬＩＳＡを示す図である。５ｐＭのｈＶＥＧＦ−１６５を、図の凡例に記載されるような抗ＶＥＧＦ抗体の逐次希釈物と共にインキュベーションした。結合溶液中にいくらかの非結合のｈＶＥＧＦ−１６５と共存する予め形成されたｈＶＥＧＦ−１６５／抗ＶＥＧＦ抗体複合体を、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ＥＬＩＳＡヒトＶＥＧＦイムノアッセイ（Ｒ＆Ｄカタログ番号：ＳＶＥ００）として提供されているヒトＶＥＧＦに特異的なモノクローナル抗体を被覆した９６穴ポリスチレンマイクロプレートの中に移し入れた。セイヨウワサビペルオキシダーゼにコンジュゲーションされたポリクローナル抗ｈＶＥＧＦ抗体と、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）アッセイキットに提供されるようなプレートに結合しているｈＶＥＧＦ−１６５を定量するための色素源としてのテトラメチルベンジジンとを用いて、プレートに結合しているｈＶＥＧＦ−１６５を検出した。Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて５パラメーター非対称モデルによりフィッティングされたデータから算出されたＫｄを、図の下の表に示す。

【図12】抗ＶＥＧＦ Ｆｃ−Ｆａｂ融合体であるＦＦ０３０９２−１のＤＮＡおよびタンパク質の配列を示す図である。

【図13】抗ＶＥＧＦ Ｆｃ−ｓｃＦｖ融合体であるＦＦ０３０７７−４のＤＮＡおよびタンパク質の配列を示す図である。単鎖核酸配列：ｓｃＦｖ融合体配列を下線表示し；Ｆｃ配列をイタリック体表示し；ＦｃとｓｃＦｖとの間のリンカーを下線および太字で表示し ＩＭＧＴ（登録商標）に従って画定されるＣＤＲに対応するＤＮＡコード配列およびアミノ酸配列を太字で示し；ｓｃＦｖ中のＫａｂａｔに従って画定されるＦａｂ ＦＦ０３０４６−２のＣＤＲ配列に対応するＤＮＡコード配列およびアミノ酸配列を二重下線で表示する。

【図14】競合的Ｆａｂ−ＥＬＩＳＡを示す図である。５ｐＭのｈＶＥＧＦ−１６５を、図の凡例に記載されるような抗ＶＥＧＦ抗体の逐次希釈物と共にインキュベーションした。結合溶液中にいくらかの非結合のｈＶＥＧＦ−１６５と共存する予め形成されたｈＶＥＧＦ−１６５／抗ＶＥＧＦ抗体複合体を、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ＥＬＩＳＡヒトＶＥＧＦイムノアッセイ（Ｒ＆Ｄカタログ番号：ＳＶＥ００）として提供されているヒトＶＥＧＦに特異的なモノクローナル抗体を被覆した９６穴ポリスチレンマイクロプレートの中に移し入れた。セイヨウワサビペルオキシダーゼにコンジュゲーションされたポリクローナル抗ｈＶＥＧＦ抗体と、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）アッセイキットに提供されるようなプレートに結合しているｈＶＥＧＦ−１６５を定量するための色素源としてのテトラメチルベンジジンとを用いて、プレートに結合しているｈＶＥＧＦ−１６５を検出した。Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて５パラメーター非対称モデルによりフィッティングされたデータから算出されたＫｄを、図の下の表に示す。

【図15】抗ＶＥＧＦ完全長成熟型ＩｇＧ１であるＦＦ０３０９２−３のＤＮＡおよびタンパク質の配列を示す図である。

【図16】二重下線によって標示された実施例３由来の代替の実施形態のコード配列を有する抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ＃２１６のＤＮＡおよびタンパク質の配列を示す図である。

【図17】抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ２０１用の発現プラスミドの略図である。

【図18】抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ２０６用の発現プラスミドの略図である。

【図19】ｈＶＥＧＦ−１２１に対するルセンティス（ラニビズマブ、ＮｏｖａｒｔｉｓおよびＲｏｃｈｅ）およびＦａｂクローン＃２１６（Ｆａｂ２１６）の最大半数阻害濃度（ＩＣ５０）を決定するための競合結合アッセイを示す図である。２つの別々の実験で、Ｆａｂを、ｘ軸に標記された様々な濃度のｈＶＥＧＦ−１２１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｃａｔ−１００−２０Ａ）と共にインキュベーションした。各Ｆａｂの非結合画分を、ｈＶＥＧＦ−１２１被覆プレートを用いて捕捉し、ｙ軸に示されるように、抗カッパ軽鎖−ＨＲＰ−コンジュゲート抗体を用いて定量した。１００ｐＭの各Ｆａｂ＃２１６を、ｈＶＥＧＦ−１２１の逐次希釈物と共にインキュベーションした。非結合のＦａｂを、固相化ｈＶＥＧＦ−１２１を用いて捕捉し、抗カッパ軽鎖−ＨＲＰ−コンジュゲート抗体を用いて検出した。Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて５パラメーター非対称モデルによりフィッティングされたデータから算出されたＩＣ５０より推定されたＫｄを、図の下の表に示す。

【図20】競合的ＥＬＩＳＡを示す図である。１０ｐＭのｈＶＥＧＦ−１６５を、抗ＶＥＧＦ抗体Ｆａｂ ２１６の逐次希釈物と共にインキュベーションした。結合溶液中にいくらかの非結合のｈＶＥＧＦ−１６５と共存する予め形成されたｈＶＥＧＦ−１６５／抗ＶＥＧＦ抗体複合体を、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ＥＬＩＳＡヒトＶＥＧＦイムノアッセイ（Ｒ＆Ｄカタログ番号：ＳＶＥ００）として提供されているヒトＶＥＧＦに特異的なモノクローナル抗体を被覆した９６穴ポリスチレンマイクロプレートの中に移し入れた。セイヨウワサビペルオキシダーゼにコンジュゲーションされたポリクローナル抗ｈＶＥＧＦ抗体と、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）アッセイキットに提供されるようなプレートに結合しているｈＶＥＧＦ−１６５を定量するための色素源としてのテトラメチルベンジジンとを用いて、プレートに結合しているｈＶＥＧＦ−１６５を検出した。Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて５パラメーター非対称モデルによりフィッティングされたデータから算出されたＩＣ５０を用いて、推定したＫｄを、図の下の表に示す。

【図21】抗ＶＥＧＦ Ｆａｂの発酵データおよび発現収量を示す図である。

【図22】薬剤製品Ｆａｂ２０１の４℃での安定性を示す図である。

【図23】Ｆａｂ２０１およびルセンティス（登録商標）（ラニビズマブ）の免疫グロブリン重鎖可変領域のアラインメントを示す図である。アラインメントされた免疫グロブリン重鎖可変領域の配列の上および下の線は、それぞれＫａｂａｔ法およびＩＭＧＴ（登録商標）法によって画定されかつ配列番号１６に示される、Ｆａｂ２０１のＣＤＲの場所を標示する。ルセンティス（登録商標）（ラニビズマブ）の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＰＺ７６７２８．１およびＡＰＺ７６７２９．１から得られる。

【図24】Ｆａｂ２０１およびルセンティス（登録商標）（ラニビズマブ）の免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域のアラインメントを示す図である。アラインメントされたカッパ軽鎖可変領域の配列の上および下の線は、それぞれＫａｂａｔ法およびＩＭＧＴ（登録商標）法によって画定されかつ配列番号１６に示される、Ｆａｂ２０１のＣＤＲの場所を標示する。ルセンティス（登録商標）（ラニビズマブ）の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＰＺ７６７２８．１およびＡＰＺ７６７２９．１から得られる。

【発明を実施するための形態】

【0009】

【表1】

【0010】

定義
別段に定義のない限り、本明細書に使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の関連する実施形態が属する技術分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。

【0011】

本明細書に使用される際にかつ添付の特許請求の範囲では、単数形の「ａ」、「または」、および「ｔｈｅ」は、コンテキストが別段に明確に示さない限り、複数の指示対象を含むということに留意しなければならない。それゆえ、例えば、「ａｎ抗体」とは、複数のそのような抗体を含む。また、本明細書に使用される際に、「および／または」とは、挙げられた項目のうち１つまたは複数のいずれかおよび全ての可能な組合せを、ならびに代替的に（「または」で）解釈される場合には組合せの欠落を、参照および包含する。

【0012】

本明細書に使用される際に「少なくとも１つ」とは、列挙された要素のうち「１つまたは複数の」を意味することが意図される。

【0013】

本明細書に使用される際に、用語「実質的に含まない」とは、所与の物質または細胞のタイプを含まないかまたはその物質または細胞のタイプをほぼ含まないこと、例えば約１％未満の所与の物質または細胞のタイプを有することを含む。

【0014】

本明細書に使用される際に、用語の血管内皮成長因子「ＶＥＧＦ」とは、特にまたは文脈上別段に示さない限り、ＶＥＧＦファミリーの任意の天然の、バリアントの、もしくは合成のＶＥＧＦ ポリペプチド、またはその断片を指す。ＶＥＧＦファミリーは、７つのメンバー：ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＶＥＧＦ−Ｇ、およびＰＬＧＦを含み、全てのメンバーは、８つの不変のシステイン残基を含むシステインｋｎｏｔモチーフから構成される共通のＶＥＧＦ相同ドメインを有し、上記システイン残基は、各単量体内の保存された中心の４つの撚り合わされたβシートの一端にある分子間および分子内のジスルフィド結合に関与し、この単量体は、逆平行に並走した配向で二量体化して、血管形成に関係する［Hoeben, A., et al. (2004) Vascular endothelial growth factor and angiogenesis. Pharmacol. Rev. 56, 549-580に概説されており、分子間および分子内ジスルフィド結合を有するシステインｋｎｏｔモチーフの３Ｄ構造に関するHoebenら（2004）の図１を参照されたい］。ＶＥＧＦファミリー内の各メンバーは、別個の遺伝子によってコードされている。しかし、各メンバーは、選択的スプライシングまたはタンパク質分解ゆえに、複数の異なるアイソフォームを含むことがある。

【0015】

好適な一実施形態では、ＶＥＧＦとは、ＶＥＧＦ−Ａおよび血管形成を促進および維持する際に役割を果たすそのアイソフォームである。例えば、文献中に「−Ａ」の標示のないＶＥＧＦとしても参照されるＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の一次転写物の選択的スプライシングによって、異なるＶＥＧＦ−Ａアイソフォームをコードする異なるＶＥＧＦ−ＡのｍＲＮＡが生じるが、これらのアイソフォームは、多くの場合、単に続けて番号の付されたＶＥＧＦとして標示され、各種アイソフォームは、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の選択的スプライシングされたエクソン８ａまたは８ｂの存在に応じて、血管形成促進性または抗血管形成性を有する。特に興味深いのは、選択的スプライシングされたエクソン８ａの翻訳から生じるＶＥＧＦ−Ａアイソフォームであるが、これらのアイソフォームは、一般に血管形成促進性であって、一般に抗血管形成性であるエクソン８ｂのものとは対照的である。ヒトでは、選択的スプライシングから生じるエクソン８ａを含むＶＥＧＦ−Ａアイソフォームは、ＶＥＧＦ−Ａ_１２１（多くの場合、ＶＥＧＦ_１２１ともよばれる）、ＶＥＧＦ−Ａ_１４５（多くの場合、ＶＥＧＦ_１４５ともよばれる）、ＶＥＧＦ−Ａ_１４８（多くの場合、ＶＥＧＦ_１４８ともよばれる）、ＶＥＧＦ−Ａ_１６５（多くの場合、ＶＥＧＦ_１６５ともよばれる）、ＶＥＧＦ−Ａ_１８３（多くの場合、ＶＥＧＦ_１８３ともよばれる）、ＶＥＧＦ−Ａ_１８９（多くの場合、ＶＥＧＦ_１８９ともよばれる）、およびＶＥＧＦ−Ａ_２０６（多くの場合、ＶＥＧＦ_２０６ともよばれる）［Nowak, D. G., et al. (2008) Expression of pro- and anti-angiogenic isoforms of VEGF is differentially regulated by splicing and growth factors. J. Cell Sci. 121, 3487-3495］を含む。ＶＥＧＦ−Ａの各アイソフォームにおいてＶＥＧＦに続く番号は、分泌に続くシグナル配列の切断後のアミノ酸の数を指す。そして、この番号は、下付きまたは一列で、例えばそれぞれＶＥＧＦ_１２１またはＶＥＧＦ１２１などとされることがある。齧歯類、例えばマウスなどでは、これらのＶＥＧＦアイソフォームのオルソログは、１つ少ないアミノ酸を含有する。ＶＥＧＦは、常態ではホモ二量体の糖タンパク質であり、ヘパリン結合能の異なるアイソフォームを有する。比較的大きく塩基性の高いＶＥＧＦ_１８９アイソフォームおよびＶＥＧＦ_２０６アイソフォームは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）にある細胞表面のヘパリン含有プロテオグリカンに強固に結合し、一方で、酸性のＶＥＧＦ_１２１アイソフォームは、ヘパリン結合能を欠き、自由に拡散可能である。ＶＥＧＦ_１６５アイソフォームは、かなりの割合がヘパリンおよびＥＣＭに結合する、中間的な性質を有する。選択的スプライシングによって生産されるＶＥＧＦアイソフォーム以外に、ＥＣＭ結合性のＶＥＧＦアイソフォームは、タンパク質分解を受けて、高い分裂促進活性を有する生物活性断片を生成することがあり、そのようなものとしては、例えば、ヒトＶＥＧＦ−ＡアイソフォームのＶＥＧＦ１６５またはＶＥＧＦ１８９のタンパク質分解から生じるＶＥＧＦ_１１０またはＶＥＧＦ１００などがある［Ferrara, N., Gerber, H.-P., and LeCouter, J. (2003) The biology of VEGF and its receptors. Nature Medicine 9, 669-676；上記Hoeben,A.ら（2004）も参照されたい］。ＶＥＧＦ１００以外に、天然のタンパク質分解または人造のどちらかによる、ＶＥＧＦ遺伝子ファミリーに由来するＶＥＧＦタンパク質のいかなる断片も、それに対して抗体が生じるかまたは向けられる限り、ＶＥＧＦであるものと考えられてもよく、ＶＥＧＦタンパク質断片は、血管形成、黄斑変性症、腫瘍、またはヒトの疾患を促進および維持する際の役割を有する。

【0016】

対象または培養細胞からＶＥＧＦタンパク質を単離すること以外に、ＶＥＧＦタンパク質は、組換えＤＮＡの方法によって生産されることがある。例えば、いかなるＶＥＧＦアイソフォームまたは断片またはバリアントについてのＶＥＧＦタンパク質も、当技術分野に公知であるように、細菌、酵母、昆虫細胞、もしくは哺乳類細胞で生産されるか、または無細胞の翻訳抽出物もしくは転写−翻訳カップリング抽出物でのｉｎ ｖｉｔｒｏで生産されることがある。細菌細胞での生産の場合は、細菌で生産されて結果として得られる組換えＶＥＧＦタンパク質は、同じ一次アミノ酸配列を有することができるが、哺乳類細胞から単離されるＶＥＧＦタンパク質とは異なり、グリコシル化などの翻訳後修飾を欠くことがある。しかし、本願の開示は、天然の供給源から単離されるＶＥＧＦ以外に、細菌細胞で生産されるか、ｉｎ ｖｉｔｒｏの無細胞翻訳系もしくは転写−翻訳カップリング系を用いるなどｉｎ ｖｉｔｒｏで生産されるか、または組換えの方法によって生産される、ＶＥＧＦを包含する。ＶＥＧＦ抗原は、天然に発生したＶＥＧＦ分子であっても、組換え分子であっても、合成分子であってもよい。ＶＥＧＦ抗原は、無傷のＶＥＧＦタンパク質上でも、ＶＥＧＦアイソフォーム上でも、ＶＥＧＦの断片上でも、ＶＥＧＦの一部分に由来する配列を有するペプチド上でも存在していてよい。

【0017】

本明細書に使用される際に、「野生型ＶＥＧＦ配列」とは、一般に、天然に発生したＶＥＧＦアイソフォームに見られるか、または哺乳類細胞におけるＶＥＧＦ遺伝子の一次転写物のプロセッシングに続くＶＥＧＦ ｍＲＮＡの翻訳に由来するか、または任意のＶＥＧＦ ｃＤＮＡの翻訳に由来する、一次アミノ酸配列を指す。ＶＥＧＦ ｃＤＮＡは、例えば、マウス細胞またはヒト細胞などの哺乳類細胞からのポリソームのＶＥＧＦ ｍＲＮＡの逆転写によって、得られることがある。

【0018】

本明細書に使用される際に、「抗体」は、モノクローナル抗体（例えば完全長または無傷のモノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、多価抗体（例えば、結合価に応じた２つ以上の抗原との会合、およびアビディティの増加、例えば二価のＩｇＧ抗体に対し一価のそのＦａｂ抗体断片を比べて観察されるものなどを、可能にするような同じ特異性の２つ以上の抗原結合部位を有する抗体）、多特異性抗体（例えば、所望の生物活性を示す限りは二重特異性抗体）を含み、また、ある種の抗体断片（本明細書にさらに詳細に記載されるような）を含むことがある。抗体は、ヒトの、ヒト化の、親和性の成熟したおよび／または合成のものとすることができる。抗体は、当技術分野に公知の任意の方法によって、例えば、動物内でｉｎ ｖｉｖｏで、組織もしくは細胞の培養で、または酵素法および／もしくは化学合成法によるｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質合成系で、生産されることがある。組換えＤＮＡの方法は、抗体の生産で使用されることがあり、結果として得られる抗体は、組換え抗体であるものと考えられてもよい。組換え抗体は、細菌内に生産されるなど、動物生産物を含まずに生産されることがある。抗体またはその断片は、バクテリオファージの表面に提示されることがある。

【0019】

「抗体断片」または「複数の抗体断片」とは、抗体の一部分のみであり、この一部分は、無傷の抗体に存在する際に常態ではその一部分に関連する少なくとも１つの、好ましくは多数または全ての機能を保持する。抗体断片の例としては、Ｆａｂ断片、Fab’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、およびＦｖ断片；ダイアボディ；線状抗体；単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体分子を含めた単鎖抗体分子；同じ特異性を有する多数コピーの同じ抗体断片から形成される多価抗体；および抗体断片から形成される多特異性抗体が挙げられる。

【0020】

合成の ヒト抗ＶＥＧＦ抗体としては、１つまたは複数の 超可変領域またはその相補性決定領域（ＣＤＲ）に１つまたは複数の変化を含む「親和性の成熟した」抗体が挙げられ、そのような変化の結果として、それらの変化を持たない親抗体に比べて、ＶＥＧＦに対する抗体の親和性が向上する。抗体の可変領域に見られるＣＤＲは、Ｋａｂａｔ法またはＩＭＧＴ法によって画定されることがある［Martin, A. C. R. (1996) Accessing the Kabat Antibody Sequence Database by Computer PROTEINS: Structure, Function and Genetics 25: 130-133; Johnson, G. and Wu, T. T. (2004) The Kabat Database and a Bioinformatics Example. Methods in Molecular Biology 248: 11-25; Kabat, E. A.,Wu, T. T., Perry, H., Gottesman, K., and Foeller, C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., NIH Publication No. 91–3242, Bethesda, MD.; MacCallum, R. M., Martin, A. C. R. and Thornton, J. T. (1996) Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography. J. Mol. Biol. 262, 732-745; Lefranc, M.-P., Pommié, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, G. (2003) IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev. Comp. Immunol. 27: 55-77; およびLefranc, M.-P. (2005) IMGT, the international ImMunoGeneTics information system(登録商標). Nucleic Acids Res. 33: D593-D597; Lefranc, M.-P. et al. (2009) IMGT(登録商標), the international ImMunoGeneTics information system(登録商標). Nucleic Acids Res. 37: D1006-D1012］。抗体の特異性は、Ｋａｂａｔ法またはＩＭＧＴ（登録商標）法を含めた複数の方法によって画定され得る一連のＣＤＲによって画定または記載されることがある。

【0021】

抗体の抗原結合領域は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域のＣＤＲによって形成される抗原結合部位を含むことがある。

【0022】

障害または疾患とは、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体／組成物または方法を用いる治療から利益を得ることになる状態である。これには、慢性および急性の障害または疾患が含まれ、そのようなものとしては、問題になっている障害に哺乳動物を罹り易くする病理学的な状態が挙げられる。本明細書中の治療される障害の非限定的な例としては、細胞増殖性の障害が挙げられる。細胞増殖性の障害としては、滲出型加齢性黄斑変性症、糖尿病性黄斑症、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）における黄斑浮腫、虹彩新血管新生、病理学的近視に起因する脈絡膜の新血管新生、成熟児網膜症、血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、網膜新血管新生、経扁平部硝子体切除（ＰＰＶ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、またはがんなどの疾患が挙げられ得る。

【0023】

本明細書に使用される際に、「治療すること」とは、疾患または障害または疾患もしくは障害の生物学的徴候のうち１つもしくは複数を寛解させるための；（ａ）疾患もしくは障害に繋がるかもしくは関与する生物学的カスケードの１つもしくは複数の点、または（ｂ）疾患もしくは障害の生物学的徴候のうちの１つもしくは複数を直接的または間接的に妨げるための；疾患もしくは障害に関連する症状、作用、もしくは副作用のうち１つもしくは複数、または症状もしくは障害もしくはその治療のうち１つまたは複数を軽減するための；疾患または障害または疾患もしくは障害の生物学的徴候のうち１つもしくは複数の増悪を遅らせるための、療法を使用することを意味する。治療には、臨床的に意義のある応答を惹起することが含まれる。望ましい治療の効果としては、疾患の発生または再発の防止、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的結果の漸減、転移の防止、疾患の増悪の減速、病態の寛解または緩和、および緩解または予後の改善が挙げられる。実施形態によっては、本発明の抗体は、疾患または障害の発達を遅延させるために使用される。例えば、眼の状態の治療は、状態の症状を改善し、状態の重症度を低減し、状態の増悪の過程を変え、および／または基本状態を改善することがある。治療はまた、疾患または障害に罹っている対象のために生活の質を改善することを含むことがある（例えば、がんに罹っている対象は、本明細書に記載される本発明の組成物を用いて対象が免疫される際に副作用を引き起こす抗がん薬を、より低い用量で受けることがある）。本明細を通じて、本発明の組成物およびその使用のための方法は、適した治療をそれを必要とする対象に提供するために提供および選択される。

【0024】

「対象」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトとしてもよい。哺乳動物としては、以下に限定されないが、家畜動物（ウシ、ヒツジ、およびヤギなど）、競技動物、ペット（ネコ、イヌ、ウマなど）、霊長類動物（サル、ゴリラ、およびチンパンジー）、マウス、ならびにラットが挙げられる。

【0025】

本明細書に使用される際に、「有効量」とは、必要な投薬量および期間で、所望の治療的または予防的な結果を達成するのに有効な量を指す。

【0026】

本明細書に記載される本発明がさらに充分に理解されるものとなるように、以下の記載を示す。

【0027】

本発明の組成物およびそれを作製する方法
この発明は、新規の抗ＶＥＧＦ抗体；およびそのような新規の抗ＶＥＧＦ抗体をコードする配列を含むポリヌクレオチド、およびそれらを含む医薬組成物を含めた組成物を包含する。用語「医薬製剤」、「医薬組成物」、および「剤形」とは、本明細書では互換的に使用され、対象への投与に適した形態で本発明の活性成分（複数可）を含有する組成物を指す。

【0028】

本明細書に使用される際に、組成物は、ＶＥＧＦに結合する１つもしくは複数の本発明の抗体、および／またはＶＥＧＦに結合する１つもしくは複数の抗体をコードする配列を含む１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む。これらの組成物は、緩衝剤を含めて、医薬的に許容可能な賦形剤など、当技術分野に周知の適した担体をさらに含むことがある。

【0029】

ほんの一例として、抗体とは、２つの免疫グロブリン軽鎖と２つの免疫グロブリン重鎖とを接合することによって作出されることがあるＹの形状をとり得るタンパク質であり、１つの軽鎖が１つの重鎖に会合して、そのタンパク質の１本の腕を形成する。２本の腕は、一方の重鎖と他方との会合を介して接合する。典型的には、抗体の各腕は、同じ抗原を認識し、会合している軽鎖および重鎖の可変領域によって形成された抗原結合部位を介して抗原上のエピトープに結合する。エピトープに結合する軽鎖および重鎖の可変領域の一部分は、超可変領域または「相補性決定領域（ＣＤＲ）」とよばれる。具体的な抗原への抗体の特異性は、超可変領域またはＣＤＲのアミノ酸配列に依存し、これらの配列は、異なる結合特異性を有する抗体間で最も大きな可変性を示す。残りの非超可変領域または非ＣＤＲは、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。例えば、各軽鎖および各重鎖については、ＣＤＲ１〜３とよばれる、可変領域のアミノ末端からカルボキシル末端までの３つのＣＤＲがあり、それらは４つのＦＲ、すなわちＦＲ１〜４によって隔てられている。軽鎖ＣＤＲを重鎖ＣＤＲと区別するために、軽鎖ＣＤＲ１〜３は、ＣＤＲＬ１〜ＣＤＲＬ３、または代替的にＣＤＲ−Ｌ１からＣＤＲ−Ｌ３と称される。同様に、重鎖ＣＤＲ１〜３は、ＣＤＲＨ１〜ＣＤＲＨ３またはＣＤＲ−Ｈ１からＣＤＲ−Ｈ３と称される。軽鎖可変領域内の４つのＦＲは、ＦＲＬ１〜ＦＲＬ４またはＦＲ−Ｌ１からＦＲ−Ｌ４と称される。さらに、重鎖可変領域内の４つのＦＲは、ＦＲＨ１〜ＦＲＨ４またはＦＲ−Ｈ１からＦＲ−Ｈ４と称される、したがって、典型的な可変領域は、軽鎖についてＦＲＬ１−ＣＤＲＬ１−ＦＲＬ２−ＣＤＲＬ２−ＦＲＬ３−ＣＤＲＬ３−ＦＲＬ４の順番でアミノ末端からカルボキシル末端まで付加することによって形成される。同様に、重鎖は、ＦＲＨ１−ＣＤＲＨ１−ＦＲＨ２−ＣＤＲＨ２−ＦＲＨ３−ＣＤＲＨ３−ＦＲＨ４の順番で形成される。軽鎖可変領域には、カッパまたはラムダの軽鎖定常領域が続き、軽鎖を完成させる。一方で、重鎖可変領域は、そのＣ末端で、定常領域であるＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３に接合され、定常領域は、ＣＨ１とＣＨ２との間にヒンジ領域を伴い、ヒンジ領域は、第２の重鎖のヒンジ領域とのストランド間架橋に関与するシステイン残基（複数可）を有する。重鎖定常領域の配列は、免疫グロブリンのクラス（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭ）を決定し、各クラス内でサブクラス（例えばＩｇＧクラスでは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のサブクラス）を決定する。

【0030】

免疫グロブリンの軽鎖および重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域は、Ｅｌｖｉｎ Ａ．Ｋａｂａｔおよび同僚らによる配列比較［Kabat, E.A., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesman, K. S. and Foeller, C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Volumes 1-3. 5^th edition. NIH Publication No. 91-3242 (ISBN: 094137565X, 9780941375658)］を、各ＣＤＲとの関連性に応じて、特異的ＦＲと称される非ＣＤＲ配列と行うことに基づいて、画定されることがある。代替的に、免疫グロブリンのＣＤＲを特定するための別の方法が、Ｍａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃおよび同僚らによって開発され、ＩＭＧＴ（登録商標）図およびＣＤＲを特定するための方法を生み出した［Lefranc, M.-P., et al. (1999) IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucl. Acids Res. 27, 209-212; Lefranc, M.-P., et al. (2015) IMGT(登録商標), the international ImMunoGeneTics(登録商標) information system 25 years on. Nucl. Acids Res. 43, D413-D422］。ＣＤＲを特定するためのＫａｂａｔ法とＩＭＧＴ法のどちらも本明細書に使用されている。どちらの方法も、一致するＣＤＲ配列か、ＣＤＲ配列間の重複か、または他方の方法による対応のＣＤＲに対し決定されたＣＤＲ配列を完全な形で含有する１つのＣＤＲ配列のどれかを生じる。両方の方法によって特定されたＣＤＲ配列が同じ長さを産生できないかまたは重複している場合には、フレームワーク領域（デフォルトでは可変領域内のＣＤＲの外側またはＣＤＲ間の領域）は、サイズが一致しないか、同様に重複配列を持つものとなる。

【0031】

一実施形態では、本発明は、以下の超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを有する、単離された抗ＶＥＧＦ抗体またはその一部分もしくはバリアントを提供する：アミノ酸３１位のヒスチジンからアミノ酸３５位のヒスチジン（配列番号１）を含むＣＤＲＨ１、アミノ酸５０位のチロシンからアミノ酸６６位のグリシンを含むＣＤＲＨ２（配列番号１）、およびアミノ酸９９位のヒスチジンからアミノ酸１０９位のチロシンを含むＣＤＲＨ３（配列番号１）。

【0032】

本発明の抗ＶＥＧＦ抗体のバリアントとしては、あるアミノ酸配列を含む抗体が挙げられ得るが、この配列では、１つまたは複数のアミノ酸残基が、本明細書に開示されるＹバリアントのうちいずれかのアミノ酸配列と比べて異なり（例えば実施例３および図９Ｃおよび図１６を参照）、例えば、フレームワーク領域内への挿入、フレームワーク領域からの欠失、および／またはフレームワーク領域中での置換の生じたアミノ酸残基があるために変わっているが、ＣＤＲ領域内への挿入、ＣＤＲ領域からの欠失、および／またはＣＤＲ領域中での置換の生じたアミノ酸残基はない（例えば、ＫａｂａｔナンバリングとＩＭＧＴナンバリングのどちらかにより画定されるか；またはＣｈｏｔｈｉａ体系などの任意の他のＣＤＲ特定システム）。バリアントとしては、Ｆａｂ断片および単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片などの抗体断片が挙げられる。バリアントとしては、融合タンパク質、例えば図１２および図１３にあるようなものなどがさらに挙げられ得る。本明細書に開示されるバリアントおよび抗体は、組換えＤＮＡの方法によって生産されることがある。

【0033】

本発明の単離された抗体の一部分は、ＣＤＲ領域、重鎖および／もしくは軽鎖の可変ドメイン、またはＶＥＧＦに結合する抗体鎖の一部分など、有用な免疫学的に機能的な断片を含むか、または抗原または抗原上のエピトープへの結合性の特異性をもたらす（例えばＶＥＧＦを認識し結合する）。本発明の抗体がキャメルケースで表記される可能性があることは、当業者には明確となる。

【0034】

例えば、単離され抗体またはその一部分もしくはバリアントは、その生産環境から隔てられているおよび／または回収されたものである。生産環境とは、細胞ベース、例えば細胞でもよいし、無細胞、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳もしくは転写−翻訳カップリングの無細胞系でもよい。好適な実施形態では、抗体は、（ａ）例えばＬｏｗｒｙ法により決定されるところの約９５重量％超の抗体まで、および最も好ましくは約９９重量％超まで、または（ｂ）還元または非還元の条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで均一となるまで、精製されることになる。本明細書に使用される際に、用語「約」とは、数字表記、例えば温度、時間、量、濃度、およびその他、範囲を含めて、それらの前に使用される際には、（＋）または（−）の１０％、５％または１％で変わり得る近似値を標示する。

【0035】

別の実施形態では、本発明は、以下の超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する、単離された抗ＶＥＧＦ抗体またはその一部分もしくはバリアントを提供する：アミノ酸２４位のアルギニンからアミノ酸３４位のアラニン（配列番号３）を含むＣＤＲＬ１、アミノ酸５０位のリジンからアミノ酸５６位のアラニン（配列番号３）を含むＣＤＲＬ２、およびアミノ酸８９位のグルタミンからアミノ酸９７位のスレオニン（配列番号３）を含むＣＤＲＬ３。

【0036】

さらに追加の一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体またはその一部分は、図１６に太字で示されるＩＭＧＴナンバリングに従って画定される以下のＣＤＲアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン：アミノ酸配列ＧＦＤＬＤＨＹＳを含むＣＤＲＨ１、アミノ酸配列ＩＹＰＳＹＧＹＴを含むＣＤＲＨ２、およびアミノ酸配列ＡＲＨＡＷＹＹＧＷＧＬＤＹを含むＣＤＲＨ３と；図１６に太字で示されるＩＭＧＴナンバリングに従って画定される以下のＣＤＲアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン：アミノ酸配列ＱＡＡＹＧＲを含むＣＤＲＬ１、アミノ酸配列ＫＡＳを含むＣＤＲＬ２、およびアミノ酸配列ＱＱＲＧＷＹＬＦＴを含むＣＤＲＬ３とをさらに含むことがある。

【0037】

追加の一実施形態は、以下のＣＤＲアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインをさらに含む、抗ＶＥＧＦ抗体またはその一部分を提供する：アミノ酸３１位のヒスチジンからアミノ酸３５位のヒスチジン（配列番号１）を含むＣＤＲＨ１、アミノ酸５０位のチロシンからアミノ酸６６位のグリシンを含むＣＤＲＨ２（配列番号１）、およびアミノ酸９９位のヒスチジンからアミノ酸１０９位のチロシンを含むＣＤＲＨ３（配列番号１）。

【0038】

本発明は、ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体またはその一部分を提供する。本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ誘導性の血管形成をｉｎ ｖｉｖｏで阻害する。

【0039】

また、本発明は、合成のヒト抗ＶＥＧＦ抗体またはその一部分もしくはバリアントを提供する。一実施形態では、それは、以下の超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン：アミノ酸２４位のアルギニンからアミノ酸３４位のアラニン（配列番号３）を含むＣＤＲＬ１またはその一部分、アミノ酸５０位のリジンからアミノ酸５６位のアラニン（配列番号３）を含むＣＤＲＬ２またはその一部分、およびアミノ酸８９位のグルタミンからアミノ酸９７位のスレオニン（配列番号３）を含むＣＤＲＬ３またはその一部分と；以下の超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン：アミノ酸３１位のヒスチジンからアミノ酸３５位のヒスチジンを含むＣＤＲＨ１（配列番号１）またはその一部分、アミノ酸５０位のチロシンからアミノ酸６６位のグリシンを含むＣＤＲＨ２（配列番号１）またはその一部分、およびアミノ酸９９位のヒスチジンからアミノ酸１０９位のチロシンを含むＣＤＲＨ３（配列番号１）またはその一部分とを含む。

【0040】

本発明の抗ＶＥＧＦ抗体の例としては、以下に限定されないが、配列番号２１〜２８にそれぞれ示されるようなバリアント２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、および２２０が挙げられる。

【0041】

さらに追加の一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、アミノ酸１位のグルタミン酸からアミノ酸３０位のフェニルアラニン（配列番号１）を含む重鎖フレームワーク領域（ＦＲ）１であるＦＲＨ１のアミノ配列をさらに含むことがある。

【0042】

さらに追加の一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、アミノ酸３６位のトリプトファンからアミノ酸４９位のアラニン（配列番号１）を含む重鎖フレームワーク領域（ＦＲ）２であるＦＲＨ２のアミノ配列さらに含むことがある。

【0043】

さらに追加の一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、アミノ酸６７位のアルギニンからアミノ酸９８位のアルギニン（配列番号１）を含む重鎖フレームワーク領域（ＦＲ）３であるＦＲＨ３のアミノ配列をさらに含むことがある。

【0044】

さらに追加の一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、アミノ酸１１０位のトリプトファンからアミノ酸１２０位のセリン（配列番号１）を含む重鎖フレームワーク領域（ＦＲ）４であるＦＲＨ４のアミノ配列をさらに含むことがある。

【0045】

さらに追加の一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の重鎖フレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列をさらに含むことがある：アミノ酸１位のグルタミン酸からアミノ酸３０位のフェニルアラニン（配列番号１）を含むＦＲＨ１、アミノ酸３６位のトリプトファンからアミノ酸４９位のアラニン（配列番号１）を含むＦＲＨ２、アミノ酸６７位のアルギニンからアミノ酸９８位のアルギニン（配列番号１）を含むＦＲＨ３、およびアミノ酸１１０位のトリプトファンからアミノ酸１２０位のセリン（配列番号１）を含むＦＲＨ４。

【0046】

さらに追加の一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、アミノ酸１位のアスパラギン酸からアミノ酸２３位のシステイン（配列番号３）を含む軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ）１であるＦＲＬ１のアミノ配列をさらに含むことがある。

【0047】

さらに追加の一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、アミノ酸３５位のトリプトファンからアミノ酸４９位のチロシン（配列番号３）を含む軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ）２であるＦＲＬ２のアミノ配列をさらに含むことがある。

【0048】

さらに追加の一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、アミノ酸５７位のグリシンからアミノ酸８８位のシステイン（配列番号３）を含む軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ）３であるＦＲＬ３のアミノ配列をさらに含むことがある。

【0049】

さらに追加の一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、アミノ酸９８位のフェニルアラニンからアミノ酸１０７位のリジン（配列番号３）を含む軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ）４であるＦＲＬ４のアミノ配列をさらに含むことがある。

【0050】

さらに追加の一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列をさらに含むことがある：アミノ酸１位のアスパラギン酸からアミノ酸２３位のシステイン（配列番号３）を含むＦＲＬ１、アミノ酸３５位のトリプトファンからアミノ酸４９位のチロシン（配列番号３）を含むＦＲＬ２、アミノ酸５７位のグリシンからアミノ酸８８位のシステイン（配列番号３）を含むＦＲＬ３、およびアミノ酸９８位のフェニルアラニンからアミノ酸１０７位のリジン（配列番号３）を含むＦＲＬ４。

【0051】

さらに追加の一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体またはその一部分もしくはバリアントは、以下をさらに含むことがある：（ｃ）以下のフレームワーク領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン：アミノ酸１位のアスパラギン酸からアミノ酸２３位のシステイン（配列番号３）を含むＦＲＬ１またはその一部分、アミノ酸３５位のトリプトファンからアミノ酸４９位のチロシン（配列番号３）を含むＦＲＬ２またはその一部分、アミノ酸５７位のグリシンからアミノ酸８８位のシステイン（配列番号３）を含むＦＲＬ３またはその一部分、およびアミノ酸９８位のフェニルアラニンからアミノ酸１０７位のリジン（配列番号３）を含むＦＲＬ４またはその一部分；ならびに（ｄ）以下のフレームワーク領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン：アミノ酸１位のグルタミン酸からアミノ酸３０位のフェニルアラニン（配列番号１）を含むＦＲＨ１またはその一部分、アミノ酸３６位のトリプトファンからアミノ酸４９位のアラニン（配列番号１）を含むＦＲＨ２またはその一部分、アミノ酸６７位のアルギニンからアミノ酸９８位のアルギニン（配列番号１）を含むＦＲＨ３またはその一部分、およびアミノ酸１１０位のトリプトファンからアミノ酸１２０位のセリン（配列番号１）を含むＦＲＨ４またはその一部分。

【0052】

本発明はまた、単離された抗ＶＥＧＦ抗体およびポリヌクレオチドの実施形態も包含する。本発明はまた、実質的に純粋な抗体およびポリヌクレオチドの実施形態も包含する。

【0053】

本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は、モノクローナル（例えば完全長または無傷のモノクローナル抗体）であることがある。本発明の一実施形態では、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は完全長抗体である。さらに、一実施形態では、完全長抗体は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖と配列番号１に示される重鎖とを含む。別の実施形態では、完全長抗体は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖と配列番号１に示される重鎖、アミノ酸２４位のアスパラギン酸からアミノ酸２３７位のシステイン（配列番号１７）を含む軽鎖とアミノ酸２４位のグルタミン酸からアミノ酸２５１位のスレオニン（配列番号１８）を含む重鎖（例えば重鎖Ｆａｂ２１６；図１６）、またはアミノ酸２４位のアスパラギン酸からアミノ酸２３７位のシステイン（配列番号７６）を含む軽鎖（例えば軽鎖Ｆａｂ２１６；図１６）とアミノ酸２４位のグルタミン酸からアミノ酸２５１位のスレオニン（配列番号７８）を含む重鎖（例えば重鎖Ｆａｂ２１６；図１６）を含む。

【0054】

また、本発明の範囲内に包含されるのは、本明細書に示される抗ＶＥＧＦ抗体のＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片、およびＦ（ａｂ’）_２断片である。これらの抗体断片は、酵素消化などの旧来の手段によって作出することができるか、または組換え手法によって、ならびに化学的な方法の使用を介して、生成されることがある。例えば、Ｆａｂ’−ＳＨ、すなわち２つの重鎖間のストランド間架橋における役割を果たすシステイン位などに還元ＳＨ基を有するＦａｂ’は、組換え手法によって、またはＦ（ａｂ’）_２抗体断片のジスルフィド結合を還元することによる化学的な方法によって、生産されることがある。そのような抗体断片は、キメラ体であってもヒト化体であってもよい。Ｆａｂ断片およびｓｃＦｖ断片は、親ＩｇＧに比べて保持性および内部移行性が向上するように、化学的なまたは遺伝子による架橋によって二量体、三量体、または四量体を形成するよう工学的に改変されることがある。これらの断片は、下記に記載される診断目的および治療目的に有用である。

【0055】

Ｆｖ断片は、抗原認識性および抗原結合性の完全な部位を含有する。単鎖Ｆｖ種では、軽鎖および重鎖が「二量体の」構造で会合するように、単一の重鎖および単一の軽鎖の可変ドメインが、ペプチドリンカーによって共有結合により連結されていることがある。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を画定するのは、この立体配置にある。合わせて、６つのＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的なＣＤＲを３つのみ含む半分のＦｖ）であっても、全結合部位よりも親和性が低いとはいえ、抗原を認識し結合する能力を有する。

【0056】

Ｆａｂ断片は、単一の抗原結合部位と残りの「Ｆｃ」断片とを含有する。Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）とを含有する。Ｆａｂ’断片は、本明細書に包含され、抗体ヒンジ領域由来の１つまたは複数のシステインを含む数残基が重鎖のＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に付加される点で、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆ（ａｂ’）_２抗体断片は、本明細書に包含され、ヒンジのシステインを間に有する一対のＦａｂ’断片である。抗体断片の他の化学的カップリングは、公知であり、本明細書に包含される。

【0057】

それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを、各種クラスに割り付けることができる。例えば、本発明の抗体は、免疫グロブリンクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭのいずれかであることがある。さらに、これらのクラスの中で、それらをさらに、例えばＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、ＩｇＡ_２のいずれかを含めたサブクラス（アイソタイプ）に分類することができる。各種クラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμのいずれかであることがある。

【0058】

モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団から得られ、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る可能な天然に発生した変異を除いて同一である。それゆえ、修飾語「モノクローナル」とは、別個の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示す。

【0059】

本発明の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製することができるか、または組換えＤＮＡの方法によって作製することがある。

【0060】

さらに、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は、１つまたは複数の所望の活性を持つ合成の抗体クローンをスクリーニングするためのコンビナトリアルライブラリーを用いることによって、作製することができる。原理としては、ファージ被覆タンパク質に融合された様々な抗体可変領域（Ｆｖ）の断片を提示するファージを含有するファージライブラリーをスクリーニングすることによって、合成の抗体クローンを選択する。そのようなファージライブラリーを、所望の抗原に対するアフィニティクロマトグラフィーによってパニングする。所望の抗原に結合可能なＦｖ断片を発現しているクローンは、抗原に吸着され、それゆえにライブラリー中の非結合性クローンから分離される。次いで、結合性クローンを、抗原から溶離し、抗原の吸着／溶離のサイクルを追加することによってさらに濃縮することができる。本発明の抗ＶＥＧＦ抗体のいずれも、目的のファージクローンを選択するのに適した抗原スクリーニング手順を設計した後、目的のファージクローン由来のＦｖ配列とKabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md. (1991), vols. 1-3に記載されている適した定常領域（Ｆｃ）配列とを用いて完全長の抗ＶＥＧＦ抗体クローンを構築することによって、得ることができる。

【0061】

本発明のキメラ抗体は、ヒトおよび非ヒトの一部分を含む免疫グロブリン分子である。キメラ抗体の抗原連結領域（可変領域）は、非ヒト源（例えばマウス）を由来とすることができ、キメラ抗体の定常領域は、生物学的エフェクター機能を免疫グロブリンに付与する定常領域は、ヒト源を由来とすることができる。キメラ抗体は、非ヒト抗体分子の抗原結合特異性と、ヒト抗体分子により付与されるエフェクター機能とを有するべきである。

【0062】

概して、キメラ抗体を生産するのに使用される手順は、以下のステップを含む可能性がある：
ａ）抗体分子の抗原結合部分をコードする正しい遺伝子セグメントを特定しクローニングすること；この遺伝子セグメント（重鎖のＶＤＪ、すなわち可変性多様性接合領域、または軽鎖のＶＪ、すなわち可変性接合領域、または単純にＶもしくは可変領域として知られる）は、ｃＤＮＡとゲノムのどちらの形態でもよい；
ｂ）定常領域またはその所望の一部の遺伝子セグメントをクローニングすること；
ｃ）転写および翻訳の可能な形態で完全なキメラ抗体がコードされるように、可変領域を定常領域にライゲーションすること；
ｄ）選択マーカーとプロモーター、エンハンサー、およびポリ（Ａ）付加配列などの遺伝子制御領域とを含有するベクター内にこの構築物をライゲーションすること；
ｅ）この構築物を細菌中で増幅すること；
ｆ）このＤＮＡを真核細胞内に、最も多くは哺乳類リンパ球内に導入すること（トランスフェクション）；
ｇ）選択マーカーを発現している細胞を選択すること；
ｈ）所望のキメラ抗体を発現している細胞をスクリーニングすること；および
ｋ）適切な結合特異性およびエフェクター機能について抗体を試験すること。

【0063】

本発明は、多くのタイプのベクターを包含する。用語ベクターとは、タンパク質コード情報を宿主細胞内に移送するのに使用される任意の分子または実体であり、そのようなものとしては、以下に限定されないが、プラスミド、バクテリオファージ、ウイルス、コスミド、およびファージミドが挙げられる。さらに、ある特定のベクターは、動作可能に連結されている遺伝子の発現を導くことが可能である。そのようなベクターは、本明細書に組換え発現ベクターまたは発現ベクターとして言及されている。概して、組換えＤＮＡ手法の際の使用のための発現ベクターは、プラスミドの形態であることがある。

【0064】

いくつかの別々の抗原結合特異性を持つ抗体は、キメラタンパク質を生産するように、これらのプロトコールによって操作されている［例えば抗ＴＮＰ：Boulianne et al., Nature 312:643 (1984)；および抗腫瘍抗原：Sahagan et al., J. Immunol. 137:1066 (1986)］。同様に、いくつかの異なるエフェクター機能は、抗原結合領域をコードするものに新しい配列を連結することによって達成されている。これらのいくつかは、酵素［Neuberger et al., Nature 312:604 (1984)］、別の種由来の免疫グロブリン定常領域、および別の免疫グロブリン鎖の定常領域［Sharon et al., Nature 309:364 (1984); Tan et al., J. Immunol. 135:3565-3567 (1985)］を含む。さらに、遺伝子改変を標的とするための相同組み換えを用いた、抗体分子を改変するためのおよびキメラ抗体分子を生産するための手順が、記載されている［Fell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8507-8511 (1989)］。

【0065】

抗体の抗原結合ドメインは、約１１０アミノ酸の２つの可変（Ｖ）領域、すなわち軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）由来の各１つから形成され、どちらも３つの超可変ループまたは相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を呈する。可変ドメインは、ＶＨおよびＶＬが可撓性の短いペプチドを介して共有結合により連結されている単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片としても、それらがそれぞれ定常ドメインに融合されて非共有結合的に相互作用しているＦａｂ断片としても、ファージ上に機能的に提示することができる。「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖で存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、このリンカーは、ｓｃＦｖを抗原結合に望ましい構造に形成することを可能にする。本明細書に使用される際に、ファージクローンをコードするｓｃＦｖとファージクローンをコードするＦａｂは、合わせて「Ｆｖファージクローン」または「Ｆｖクローン」と称される。

【0066】

「超可変領域」とは、配列内で超可変性のある、および／または構造的に画定されたループを形成する、抗体可変ドメインの領域である。概して、抗体は、６つの超可変領域を含むことがある。これらは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３と称する３つの領域を可変重鎖（ＶＨ）に含む。さらに、可変軽鎖（ＶＬ）には、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３と称する３つがある。数多くの超可変領域の表現が使用されており、本明細書に包含される。例えば、Ｋａｂａｔの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列の可変性に基づくことから、使用されることがある［Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)］。

【0067】

ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別々にクローニングすることができる。次いで、クローンを、ファージライブラリー中でランダムに組み換えて、抗原結合クローンについて探索してもよい。免疫された供給源由来のライブラリーは、ハイブリドーマの構築を必要とすることなく、免疫原に対する高い親和性の抗体をもたらす。あるいは、ナイーブなレパートリーをクローニングして、免疫を行うことなく、広範な非自己抗原ならびに自己抗原に対する単一のヒト抗体源をもたらすことができる。最後に、幹細胞から再編成されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダムな配列を含有するＰＣＲプライマーを用いることによって、可変性の高いＣＤＲ３領域をコードするように、およびｉｎ ｖｉｔｒｏで再編成を達成するように、ナイーブライブラリーを合成により作製することもできる。

【0068】

繊維状ファージを使用して抗体断片を提示してもよい。抗体断片は、次いで、単鎖Ｆｖ断片として提示することができる。ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、可撓性のポリペプチドスペーサーによって同じポリペプチド鎖上で、またはＦａｂ断片として連結してもよく、上記Ｆａｂ断片では、一方の鎖は繊維状ファージのｐＩＩＩに融合され、他方は細菌宿主細胞のペリプラズム内に分泌され、ペリプラズムでは、Ｆａｂ被覆タンパク質のアセンブリが構築され、このアセンブリは、いくつかの野生型被覆タンパク質との置き換えによってファージ表面に提示されてゆく。

【0069】

概して、抗体遺伝子断片をコードする核酸は、ヒトまたは動物から採取した免疫細胞から得られる。抗ＶＥＧＦクローンを選好する偏りのあるライブラリーが望ましい場合は、対象は、ＶＥＧＦを用いて免疫されて抗体応答を生じ、脾臓細胞および／または循環Ｂ細胞、他の末梢血リンパ球ｓ（ＰＢＬ）をライブラリー構築用に回収する。好適な一実施形態では、抗ＶＥＧＦクローンを選好する偏りのあるヒト抗体遺伝子断片ライブラリーは、ＶＥＧＦの免疫がＶＥＧＦに対するヒト抗体を生産するＢ細胞を生じるよう、機能的なヒト免疫グロブリン遺伝子のアレイを担持する（そして機能的な内在性抗体生産系を欠いている）遺伝子導入マウスに抗ＶＥＧＦ抗体の応答を生じることによって得られる。ヒト抗体を生産する遺伝子導入マウスの作出は、下記に記載されている。

【0070】

核酸（本明細書ではポリヌクレオチドとも称される）は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および／またはそれらの類似体とすることができる。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよび他の類似体を含んでいてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成成分によって中断していてもよい。ポリヌクレオチドは、合成後にさらに修飾されていてもよく、そのようなものとしては、例えば、標識体とのコンジュゲーションを介するものがある。

【0071】

本発明のペプチドまたはポリペプチドの配列に関連するアミノ酸配列のパーセント同一性は、配列のアラインメント後に本発明の特定のペプチドまたはポリペプチドの配列中のアミノ酸残基との同一性を共有する、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージを意味し、必要に応じて、上記アラインメントは、最大のパーセント配列同一性を得るようにギャップを含む。

【0072】

別の実施形態では、本発明は、少なくとも９１％のパーセント同一性を有するアミノ酸配列を具現する。別の実施形態では、本発明は、約９２〜９８％の範囲のパーセント同一性を有するアミノ酸配列を具現する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも９９％のパーセント同一性を有するアミノ酸配列を具現する。一実施形態では、本発明のアミノ酸配列は、本発明に示される全体配列の一部分のみ、例えば欠失を含む。そのような欠失は、内部にあっても端部にあってもよい。一実施形態では、本発明のアミノ酸配列は、追加のアミノ酸を含み、その追加のアミノ酸は、本発明のアミノ酸配列内に挿入されるか、または端部に付加される。一実施形態では、本発明は、アミノ酸置換を具現し、その置換は、ＶＥＧＦへの結合およびＶＥＧＦ機能の中和には干渉しない。そのような置換は多くの場合、保存されたアミノ酸置換であり、置換しているアミノ酸は、機能的に等価な生理化学的性質を有し、例えば脂肪族（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン）、ヒドロキシルまたは硫黄／セレン含有（セリンシステイン、セレノシステイン、スレオニン、メチオニン）、環状（プロリン）、芳香族（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）、塩基性（ヒスチジン、リジン、アルギニン）、および酸性、およびそれらのアミド（アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、およびグルタミン）などである。

【0073】

抗体可変遺伝子のセグメント（ＶＨセグメントおよびＶＬセグメントを含む）をコードする核酸は、目的とする細胞から回収されて増幅されてもよい。例えば、（天然と合成のどちらかの）ナイーブライブラリーによって生産される抗体は、中程度の親和性（約１０^６から１０^７Ｍ^−１のＫ_ｄ^−１）を持つ可能性があるが、二次ライブラリーを構築し再選択することによって、親和性成熟もｉｎ ｖｉｔｒｏで模倣させることができる。さらに、選択された個々のＦｖクローンにおいて、例えば目的とするＣＤＲにわたって広がるランダム配列を担持するプライマーを用いたＰＣＲを使用して、１つまたは複数のＣＤＲをランダムに変異させて、親和性のさらに高いクローンをスクリーニングすることによって、親和性成熟を行うことができる。別の有効なアプローチは、免疫されていないドナーから得られた天然に発生したＶドメインバリアントのレパートリーを有するファージディスプレイによって選択されたＶＨドメインまたはＶＬドメインを組み換えて、何巡かの鎖の再シャッフリングにてさらに高い親和性をスクリーニングすることである。この手法によって、約１０^−９Ｍの範囲のＫ_ｄというさらに高い親和性を持つ抗体および抗体断片の生産が可能になる。

【0074】

例えば、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体、その一部分またはバリアントは、約５０ｎＭを超えないＫ_（ｄ）値でヒトＶＥＧＦに結合することがある。別の一実施形態では、本抗ＶＥＧＦ抗体、その一部分またはバリアントは、約１０ｎＭを超えないＫ_（ｄ）値でヒトＶＥＧＦに結合する。さらに別の実施形態では、本抗ＶＥＧＦ抗体、その一部分またはバリアントは、約２．５ｎＭを超えないＫ_（ｄ）値でヒトＶＥＧＦに結合する。さらに進んだ一実施形態では、本抗ＶＥＧＦ抗体、その一部分またはバリアントは、約０．５ｎＭを超えないＫ_（ｄ）値でヒトＶＥＧＦに結合する。追加の一実施形態では、本抗ＶＥＧＦ抗体、その一部分またはバリアントは、約０．１５ｎＭを超えないＫ_（ｄ）値でヒトＶＥＧＦに結合する。さらに追加の実施形態では、本抗ＶＥＧＦ抗体、その一部分またはバリアントは、５ｐＭと１５０ｐＭトの間のＫ_（ｄ）値でヒトＶＥＧＦに結合する。さらに別の一実施形態では、本抗ＶＥＧＦ抗体、その一部分またはバリアントは、約０．１５ｎＭのＫ_（ｄ）値でヒトＶＥＧＦに結合する。別のさらに進んだ実施形態では、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体、その一部分またはバリアントは、９０ｐＭ＋２０ｐＭのＫ_（ｄ）値でヒトＶＥＧＦに結合する。さらに別の一実施形態では、本抗ＶＥＧＦ抗体、その一部分またはバリアントは、約２５ｐＭのＫ_（ｄ）値でヒトＶＥＧＦに結合する。一実施形態では、本抗ＶＥＧＦ抗体、その一部分またはバリアントは、約１０ｐＭのＫ_（ｄ）値でヒトＶＥＧＦに結合する。さらに別の実施形態では、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体、その一部分またはバリアントは、ヒトＶＥＧＦに対する親和性がラニビズマブ［ルセンティス（登録商標）；ＮｏｖａｒｔｉｓおよびＲｏｃｈｅ］またはベバシズマブ［アバスチン（登録商標）；Ｒｏｃｈｅ］よりも高く、Ｋ_（ｄ）値がラニビズマブまたはベバシズマブよりも３倍を超えて低い。さらに進んだ一実施形態では、本抗体またはその一部分もしくはバリアントは、ヒトＶＥＧＦに対する相対Ｋ_（ｄ）値がラニビズマブ［ルセンティス（登録商標）；ＮｏｖａｒｔｉｓおよびＲｏｃｈｅ］よりも４倍を超えて低い。別の実施形態では、本抗体またはその一部分もしくはバリアントは、ヒトＶＥＧＦに対する相対Ｋ_（ｄ）値がラニビズマブ［ルセンティス（登録商標）；ＮｏｖａｒｔｉｓおよびＲｏｃｈｅ］よりも１０倍を超えて低い。別の実施形態では、本抗体またはその一部分もしくはバリアントは、ヒトＶＥＧＦに対する相対Ｋ_（ｄ）値がラニビズマブ［ルセンティス（登録商標）；ＮｏｖａｒｔｉｓおよびＲｏｃｈｅ］よりも５０倍を超えて低い。別の実施形態では、本抗体またはその一部分もしくはバリアントは、ヒトＶＥＧＦに対する相対Ｋ_（ｄ）値がラニビズマブ［ルセンティス（登録商標）；ＮｏｖａｒｔｉｓおよびＲｏｃｈｅ］よりも約５５倍低い。さらに別の実施形態では、本抗体またはその一部分もしくはバリアントは、ヒトＶＥＧＦに対する相対Ｋ_（ｄ）値がベバシズマブ［アバスチン（登録商標）；Ｒｏｃｈｅ］よりも１０倍を超えて低い。別の実施形態では、本抗体またはその一部分もしくはバリアントは、ヒトＶＥＧＦに対する相対Ｋ_（ｄ）値がベバシズマブ［アバスチン（登録商標）；Ｒｏｃｈｅ］よりも５０倍を超えて低い。別の実施形態では、本抗体またはその一部分もしくはバリアントは、ヒトＶＥＧＦに対する相対Ｋ_（ｄ）値がベバシズマブ［アバスチン（登録商標）；Ｒｏｃｈｅ］よりも１００倍を超えて低い。別の実施形態では、本抗体またはその一部分もしくはバリアントは、ヒトＶＥＧＦに対する相対Ｋ_（ｄ）値がベバシズマブ［アバスチン（登録商標）；Ｒｏｃｈｅ］よりも約１１０倍低い。

【0075】

さらに進んだ一実施形態では、抗体またはその一部分もしくはバリアントは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで内皮細胞のＶＥＧＦ誘導性増殖を阻害するための約２００ｐＭを超えないＥＣ５０値を有する。さらに、追加の一実施形態、抗体またはその一部分もしくはバリアントは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで内皮細胞のＶＥＧＦ誘導性増殖の阻害に、ラニビズマブ［ルセンティス（登録商標）；ＮｏｖａｒｔｉｓおよびＲｏｃｈｅ］よりも有効である。さらに別の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで内皮細胞のＶＥＧＦ誘導性増殖を阻害するための相対ＩＣ５０値は、ラニビズマブ［ルセンティス（登録商標）；ＮｏｖａｒｔｉｓおよびＲｏｃｈｅ］より約１．５倍低い。

【0076】

一実施形態では、本発明は、安定性の増加した抗体を提供する。一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体またはそのバリアントの一部分は、ラニビズマブ［ルセンティス（登録商標）；ＮｏｖａｒｔｉｓおよびＲｏｃｈｅ］よりも安定性が高い。別の実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体またはそのバリアントの一部分は、ラニビズマブ［ルセンティス（登録商標）；ＮｏｖａｒｔｉｓおよびＲｏｃｈｅ］よりも貯蔵寿命が長い

【0077】

一実施形態では、本発明は、ラニビズマブ［ルセンティス（登録商標）；ＮｏｖａｒｔｉｓおよびＲｏｃｈｅ］よりも熱安定性の増加した抗体を提供する。例えば、本発明のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体の融解温度は、ラニビズマブ［ルセンティス（登録商標）；ＮｏｖａｒｔｉｓおよびＲｏｃｈｅ］よりも約１．５℃高いことがある。

【0078】

一実施形態では、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体またはその一部分もしくはバリアントは、ＢＳＡまたはＦｃに結合しない。

【0079】

本発明のＶＥＧＦに対する抗体をコードするＤＮＡ分子の構築の後、ＤＮＡ分子は、プラスミドなどの発現ベクター内の発現制御配列に動作可能に連結され、この制御配列は、ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識される。概して、プラスミドベクターは、宿主細胞に適合する種に由来する複製配列および制御配列を含有する。ベクターは、通常は、複製部位だけでなく、形質転換細胞で表現型選択を可能にすることができるタンパク質をコードする配列も担持する。原核宿主細胞および真核宿主細胞での発現に適したベクターは、当技術分野に公知であり、そのいくつかは、本明細書にさらに記載されている。真核生物、例えば酵母、または哺乳動物などの多細胞生物由来の細胞などが使用されることがある。

【0080】

宿主細胞は、この発明の上記の発現ベクターまたはクローニングベクターを用いてトランスフェクションされ、好ましくは形質転換されて、従来の栄養培地中で培養されるが、この培地は、プロモーターを誘導するために、形質転換体を選択するために、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために、適切であるように改変されている。

【0081】

トランスフェクションとは、どのコード配列も実際に発現されるか否かに関わらず、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを指す。非常に数多くのトランスフェクションの方法が、当業者に公知であり、そのようなものとしては、例えば、ＣａＰＯ_４沈殿およびエレクトロポレーションがある。トランスフェクションの成功は、一般に、このベクターの動作を示す任意の標示が宿主細胞内で起こった際に認識される。トランスフェクションのための方法は、当技術分野に周知である。

【0082】

形質転換とは、ＤＮＡが染色体外因子としてまたは染色体組み込み物によって複製可能となるように、ＤＮＡを生物内に導入することを意味する。使用される宿主細胞に応じて、そのような細胞に適切な標準的な手法を用いて、形質転換が行われる。形質転換のための方法は、当技術分野に周知であり、いくつかは本明細書にさらに記載されている。

【0083】

本発明のＶＥＧＦに対する抗体を生産するために使用される原核宿主細胞は、前掲のＳａｍｂｒｏｏｋらに概ね記載されるように培養することができる。

【0084】

哺乳類宿主細胞が、ＶＥＧＦに対する抗体を生産するために使用されることがあり、種々の培地中で培養されることがあるが、この培地は当技術分野に周知であり、そのいくつかは本明細書に記載されている。

【0085】

この開示で言及される宿主細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養での細胞、ならびに宿主動物内にある細胞を包含する。本発明のＶＥＧＦに対する抗体の精製を、技術分野で認識されている方法を用いて達成してもよく、そのいくつかは本明細書に記載されている。精製された抗体は、ファージディスプレイクローンのアフィニティクロマトグラフィーにより分離に用いるのに適したマトリックスに付加することができ、そのようなものとしては、例えばアガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、ガラスビーズ、セルロース、様々なアクリルコポリマー、ヒドロキシルメタクリレートゲル、ポリアクリルコポリマーおよびポリメタクリルコポリマー、ナイロン、中性担体およびイオン性担体などがある。

【0086】

ファージライブラリー試料は、固相を用いて、ファージ粒子の少なくとも一部分の結合に適した条件下で、固定化ＶＥＧＦに接触させられてもよい。通常は、ｐＨ、イオン強度、温度などを含めた条件が、生理的条件を模倣するように選択される。固相に結合しているファージは、洗浄され、次いで溶出されてもよい。ファージは、一巡りの選択で濃縮される可能性があり、濃縮されれば、細菌培養で成長させて、さらに何巡かの選択に供することができる。ＶＥＧＦに対し異なる親和性を持つファージ抗体の間では、親和性が僅かに異なっていても、選択することが可能である。

【0087】

標的抗原に対する抗ＶＥＧＦ ｍＡｂの反応性は、複数の周知の手段によって確定されてもよく、そのようなものとしては、ＶＥＧＦタンパク質、ペプチド、ＶＥＧＦ発現細胞、またはその抽出物を必要に応じて用いる、ウェスタンブロット、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、およびＦＡＣＳ解析が挙げられる。そのようなアッセイの例は、下記の実施例１に提示されている。

【0088】

本発明の抗体またはその断片は、それが結合する細胞に対し、細胞分裂抑制性であることがある。本明細書に使用される際に、「細胞分裂抑制性である」とは、その抗体がＶＥＧＦ陽性細胞の成長を阻害できるが必ずしも死滅できる訳ではないことを意味する。

【0089】

本発明のＦｖクローンをコードするＤＮＡは、重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域をコードする公知のＤＮＡ配列と組み合わせて、完全長または部分長の重鎖および／または軽鎖をコードするクローンを形成することができる。どのアイソタイプの定常領域も、この目的のために使用することができ、そのようなものとしては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥの定常領域が挙げられ、そのような定常領域は、任意のヒトまたは動物種から得ることができることが認識されよう。好適な一実施形態では、ヒト可変ＤＮＡ由来のＦｖクローンをヒト定常領域のＤＮＡに融合して、全ての完全長または部分長のヒトの重鎖および／または軽鎖のコード配列（複数可）を形成する。

【0090】

抗体断片
本願発明は抗体断片を包含する。全抗体に比べてサイズの小さな抗体断片は、いくらかの利点を有する。例えば、断片によって、さらに速やかなクリアランスが可能になることがあり、全抗体に比べた際に目的の部位へのアクセスの改善に繋がることがある。

【0091】

例えば、一実施形態では、抗体断片とは、配列番号３の１位のアスパラギン酸で始まり１０７位のリジンで終わるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインと、配列番号１の１位のグルタミン酸で始まり１２０位のセリンで終わるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインとを含むＦａｂである。

【0092】

別の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号５に示されるアミノ酸を含むＦｃ領域に接合されている。

【0093】

さらに別の実施形態では、抗体のバリアントは、本発明の抗体の抗原結合領域を含む組換えタンパク質である。例えば、バリアントは、配列番号９の２４１位のアスパラギン酸で始まり４８３位のセリンで終わるアミノ酸配列を含む、ｓｃＦｖであることがある。本発明のさらに別の一実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｆｃ領域に接合される。ほんの一例として、Ｆｃ領域に接合されているｓｃＦｖは、配列番号９に示されるアミノ酸を含むことがある。

【0094】

抗体断片の生産のための様々な手法がある。本抗体または断片は、組換え手段によって生産されることがある。例えば、これらの断片は、組換え宿主細胞によって直接的に生産することができる。Ｆａｂ抗体断片、Ｆｖ抗体断片、およびＳｃＦｖ抗体断片は全て、例えば大腸菌内で発現しそこから分泌させることができるが、それゆえ比較的簡便にこれらの断片を大量に生産することが可能である。抗体断片は、本明細書に議論されている抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨ断片を大腸菌から直接的に回収し、化学的にカップリングしてＦ（ａｂ’）_２断片を形成することができる。別のアプローチによれば、Ｆ（ａｂ’）_２断片を、組換え宿主細胞の培養物から直接的に単離することができる。抗体断片の生産のための他の手法は、熟練した実務者に明らかとなろう。他の実施形態では、選択される抗体は、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。ＦｖおよびｓＦｖは、定常領域を欠いた無傷の連結部位を有した唯一の種であり、それゆえ、それらは、ｉｎ ｖｉｖｏでの使用中の非特異的結合を低減するのに適している。ｓＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖのアミノ末端またはカルボキシ末端のどちらかでのエフェクタータンパク質の融合体を産生するために構築されることがある。

【0095】

合成のヒト抗ＶＥＧＦ抗体
本発明は、ＶＥＧＦに結合する抗体（例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、合成抗体、およびヒト化抗体）をさらに提供する。最も好適な抗体は、ＶＥＧＦに選択的に結合するものとなり、ＶＥＧＦではないタンパク質には結合しない（または弱く結合する）ものとなる。最も好適な抗体は、ＶＥＧＦに特異的に結合するものとなる。用語「特異的に結合する」とは、その抗体が大部分でＶＥＧＦに結合することを意味することが意図されている。具体的に想定される抗ＶＥＧＦ抗体としては、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、ならびにこれらの抗体の抗原結合ドメインおよび／または１つまたは複数の相補性決定領域を含有するそれらの断片（例えば組換えタンパク質）が挙げられる。これらの抗体は、任意の供給源から得ることができ、そのようなものとしては、例えばラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、マウス、またはヒトがある。

【0096】

一実施形態では、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は、抗ＶＥＧＦ中和抗体であることがある。一実施形態では、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦタンパク質に特異的に結合し、例えば、ＶＥＧＦ誘導性の血管形成をｉｎ ｖｉｖｏで阻害する。当業者が理解するものとなるように、本発明の抗体が向けられるＶＥＧＦタンパク質の領域またはエピトープは、意図されている適用によって変わることがある。

【0097】

例えば、生きたがん細胞上または眼細胞上の膜結合型ＶＥＧＦの検出のためのイムノアッセイで使用することを意図される抗体は、膜結合型ＶＥＧＦ上のアクセス可能なエピトープに向けられるべきである。異なるＶＥＧＦアイソフォームは、細胞膜結合のための潜在性が異なることがある。例えば、比較的大きく塩基性の高いＶＥＧＦ_１８９アイソフォームおよびＶＥＧＦ_２０６アイソフォーム（ＶＥＧＦ−Ａのアイソフォーム）は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）にある細胞表面のヘパリン含有プロテオグリカンに強固に結合し、それゆえ細胞に強固に結合するのが見られるが、一方で、ＶＥＧＦ_１２１アイソフォーム（ＶＥＧＦ−Ａ_１２１）は、ヘパリン結合能を欠き、自由に拡散可能である。ＶＥＧＦ_１６５アイソフォーム^＊ＶＥＧＦ−Ａ_１６５）は、かなりの割合がヘパリンおよびＥＣＭに結合する、中間的な性質を有する。そのような抗体の例は、以降の実施例に記載されている。他のエピトープを認識する抗体は、分泌されたＶＥＧＦタンパク質またはその断片を検出するために、損傷または乾燥した細胞内のＶＥＧＦを特定するのに有用であることがある。

【0098】

本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は、診断アッセイ、イメージング法、眼疾患の治療、視覚機能障害の治療、失明の防止、がんの管理の際の治療方法において、特に有用であることがある。本発明は、ＶＥＧＦタンパク質の検出およびがんの診断に有用な様々な免疫学的アッセイを提供する。そのようなアッセイは、一般に、ＶＥＧＦタンパク質を認識して結合することの可能な１つまたは複数の抗ＶＥＧＦ抗体を含み、当技術分野に周知の様々な免疫学的アッセイのフォーマットを包含し、そのようなものとしては、以下に限定されないが、様々なタイプの沈殿、凝集、補体結合、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光アッセイ（ＥＬＩＦＡ）［H. Liu et al. Cancer Research 58: 4055-4060 (1998)、免疫組織化学分析などが挙げられる。

【0099】

一実施形態では、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体およびその断片［例えばＦｖ，Ｆａｂ’，Ｆ（ａｂ’）２］およびそのバリアント（例えばｓｃＦｖ）は、網膜障害、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、黄斑変性症、滲出型加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑症、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）における黄斑浮腫、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）に続発する、虹彩新血管新生、網膜新血管新生、病理学的近視に起因する脈絡膜新血管新生、黄斑浮腫、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、成熟児網膜症、経扁平部硝子体切除（ＰＰＶ）、血管新生緑内障、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、および血管新生に伴う眼疾患から選択される疾患を治療するために治療的に使用されることがある。本発明の抗ＶＥＧＦ抗体およびその断片およびそのバリアントは、前述の疾患または状態に先立つ増悪を防止するおよび停止させるするために使用されることがある。

【0100】

治療有効量の本発明の物質／分子、アゴニストまたはアンタゴニストは、個体の病態、年齢、性別、および体重、ならびに物質／分子、アゴニストまたはアンタゴニストが個体内で所望の応答を惹起する能力などの要因によって変わることがある。治療有効量とは、物質／分子、アゴニストまたはアンタゴニストの任意の毒性または有害な作用を治療上有益な作用が上回るものでもある。予防的有効量とは、所望の予防の結果を達成するのに必要な投薬量でおよび期間の間に有効である量を指す。典型的には、予防的用量が疾患の早期のステージの前またはその時に対象で使用されることから、予防的有効量は治療有効量よりも低いことがあるが、必ずしもそういう訳ではない。

【0101】

一実施形態では、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体およびその断片［例えばＦｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２］は、がんの存在を検出するために使用される。本発明の抗ＶＥＧＦ抗体およびその断片は、ＶＥＧＦを発現し、ＶＥＧＦに応答し、ＶＥＧＦ依存的な血管形成関与する眼細胞または内皮細胞の存在を検出するために使用されることがある。様々な生体試料内でのそのようなＶＥＧＦ陽性（＋）細胞の存在が、ＶＥＧＦ抗体を用いて検出されることがあり、そのような試料としては、血清、硝子体液、眼、前立腺、および他の組織生検検体、骨や尿などの他の組織が挙げられる。さらに、抗ＶＥＧＦ抗体は、様々なイメージング法に、例えばインジウム−１１１（または他の同位体）をコンジュゲーションされた抗体を用いた免疫シンチグラフィーなどに、使用されることがある。

【0102】

抗ＶＥＧＦ抗体はまた、ＶＥＧＦタンパク質およびペプチドを精製するための、ならびにＶＥＧＦホモログおよび関連分子を単離するための方法に使用されることがある。例えば、一実施形態では、ＶＥＧＦタンパク質を精製する方法は、固体マトリックスにカップリングされている抗ＶＥＧＦ抗体を、ＶＥＧＦを含有する溶解物または他の溶液と共に、抗ＶＥＧＦ抗体のＶＥＧＦへの結合を可能にする条件下でインキュベーションすること；固体マトリックスを洗浄して不純物を除外すること；およびカップリングされている抗体からＶＥＧＦを溶離することを含む。さらに、抗ＶＥＧＦ抗体は、セルソーティングおよび精製の手法を用いてＶＥＧＦ陽性細胞を単離するために、使用されることがある。

【0103】

一実施形態では、ＶＥＧＦに特異的に認識し結合する単離されたヒト抗ＶＥＧＦ抗体またはその一部分もしくはバリアントは、表５ａおよび表５ｃに示されるような以下のバリアント２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、または２２０の超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。別の実施形態では、ＶＥＧＦに特異的に認識し結合する単離されたヒト抗ＶＥＧＦ抗体またはその一部分もしくはバリアントは、表５ｂおよび表５ｄに示されるような以下のバリアント２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、または２２０の超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。

【0104】

一実施形態では、ＶＥＧＦに特異的に認識し結合する単離されたヒト抗ＶＥＧＦ抗体またはその一部分もしくはバリアントは、表５ａまたは表５ｃに示されるようなアミノ酸配列を含むバリアント２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、または２２０の軽鎖のいずれかを含む。別の実施形態では、ＶＥＧＦに特異的に認識し結合する単離されたヒト抗ＶＥＧＦ抗体またはその一部分もしくはバリアントは、表５ｂまたは表５ｄに示されるようなアミノ酸配列を含むバリアント２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、または２２０の重鎖のいずれかを含む。

【0105】

一実施形態では、ＶＥＧＦに特異的に認識し結合する単離されたヒト抗ＶＥＧＦ抗体またはその一部分もしくはバリアントは、表５ａに示される以下のバリアント２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、または２２０の超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインと、表５ｂに示される以下のバリアント２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、または２２０の超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を含む対応の重鎖可変ドメインとを含む。

【0106】

一実施形態では、ＶＥＧＦに特異的に認識し結合する単離されたヒト抗ＶＥＧＦ抗体またはその一部分もしくはバリアントは、表５ｃに示されるような以下のバリアント２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、または２２０の超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインと、表５ｄに示されるような以下のバリアント２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、または２２０の超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を含む対応の重鎖可変ドメインとを含む。

【0107】

ヒト化抗体およびヒト抗体
本願発明は、新規のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体を包含する。ヒト化抗体とは、非ヒト免疫グロブリンに由来する配列を含有するキメラ抗体である。例えば、ヒト化抗体とは、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、そのグロブリンでは、レシピエントの超可変領域に由来する残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する非ヒト霊長類、マウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域に由来する残基に置き換えられている。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基が、対応の非ヒト残基に置き換えられていることがある。さらに、抗体の性能をいっそう磨き上げるために、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見出されない残基を含むことがある。このヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含むことがある。キメラ抗体は、特定の種に由来するかまたは特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応の配列に、一致するかまたは相同である、重鎖および／または軽鎖の一部分を含むことがあるが、その一方で、鎖（複数可）の残りは、別の種に由来するかまたは別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体ならびにそのような抗体の断片が所望の生物活性を示す限り、それらの対応の配列に一致するかまたは相同である。

【0108】

本発明の完全ヒト抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体を生産するための方法としては、ファージディスプレイ法および遺伝子導入法が挙げられる。例えば、本発明の完全ヒト抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体は、大規模なヒトＩｇ遺伝子コンビナトリアルライブラリー（すなわちファージディスプレイ）を採用したクローニング技術を用いて生成されることがある。本発明の完全ヒト抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含有するように遺伝子操作された遺伝子導入マウスを用いて生産されることもある。

【0109】

二重特異性抗体
二重特異性抗体とは、抗ＶＥＧＦのモノクローナルの、好ましくは本発明のヒト抗体またはヒト化抗体であり、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する。この場合では、結合特異性のうち一方はＶＥＧＦに対するものであり、他方は任意の他の抗原に対するものである。例示的な二重特異性抗体は、ＶＥＧＦタンパク質の２つの異なるエピトープに結合するものと思われる。

【0110】

本発明の一実施形態では、二重特異性抗体は、２つの異なる抗原に対する結合特異性を有し、一方の抗原は、本発明の抗体が結合するものである。例えば、二重特異性抗体は、ＣＤＲＨ１［例えばアミノ酸３１位からアミノ酸３５位のヒスチジン（配列番号１）］もしくはその一部分、ＣＤＲＨ２［例えばアミノ酸５０位のチロシンからアミノ酸６６位のグリシン（配列番号１）］もしくはその一部分、ＣＤＲＨ３［例えばアミノ酸９９位のヒスチジンからアミノ酸１０９位のチロシン（配列番号１）］もしくはその一部分、ＣＤＲＬ１［例えばアミノ酸２４位のアルギニンからアミノ酸３４位のアラニン（配列番号３）］もしくはその一部分、ＣＤＲＬ２［例えばアミノ酸５０位のリジンからアミノ酸５６位のアラニン（配列番号３）］もしくはその一部分、またはＣＤＲＬ３［例えばアミノ酸８９位のグルタミンからアミノ酸９７位のスレオニン（配列番号３）］もしくはその一部分、またはそれらの組合せのアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列を含むことがある。

【0111】

二重特異性抗体はまた、ＶＥＧＦ発現する細胞に細胞毒性剤を局在化させるために使用されることがある。これらの抗体は、ＶＥＧＦに結合する腕と、細胞毒性剤（例えばサポリン、抗インターフェロン−アルファ、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサート、または放射活性同位体ハプテン）を結合する腕とを有する。二重特異性抗体は、完全長抗体としても抗体断片［例えばＦ（ａｂ’_２二重特異性抗体］としても調製することができる。二重特異性抗体を作製するための方法は、当技術分野に公知である。２を超える結合価の抗体が想定される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。

【0112】

抗体のバリアント
実施形態によっては、本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ抗体のアミノ酸配列の改変（複数可）が想定される。本抗体のアミノ酸配列のバリアントは、例えば、適切なヌクレオチド変換を本抗体の核酸内に導入することによって、またはペプチド合成によって、調製されてもよい。そのような改変としては、例えば、抗体のアミノ酸配列からの欠失、および／またはその中への挿入、および／またはその中の残基の置換が挙げられる。どの組合せの欠失、挿入、および置換も、最終的な構築物が所望の特性を有するという条件で、その最終的な構築物に到達するように作製される。

【0113】

さらに、本発明の免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域に１つまたは複数のアミノ酸改変を導入することによって得られる、Ｆｃ領域バリアントを想定する。Ｆｃ領域バリアントは、ヒンジのシステインを含めた１つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸改変（例えば置換）を含む、ヒトＦｃ領域配列（例えばヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＦｃ領域）を含むことがある。この記載および当技術分野の教示によれば、実施形態によっては、本発明の方法で使用される抗体は、野生型のカウンターパート抗体に比べて、例えばＦｃ領域中に、１つまたは複数の変更を含むことがあることが想定される。

【0114】

核酸、ベクター、宿主細胞、および組換え方法
本発明の別の態様は、抗ＶＥＧＦ抗体およびその断片をコードする様々な核酸分子を、好ましくは単離された形態で提供し、そのような分子としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、および関連分子、本抗ＶＥＧＦ抗体をコードする配列に相補的な核酸分子またはその一部、および本抗ＶＥＧＦ抗体をコードする核酸にハイブリダイズするものが挙げられる。特に好適な核酸分子は、本明細書に開示されるヒトまたはマウスのＤＮＡ配列に実質的に一致するか相補的であるヌクレオチド配列を有するものとなる。特に想定されるのは、天然の供給源由来か合成であるかを問わず、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、リボザイム、およびアンチセンス分子、ならびに代替の骨格をベースとするかまたは代替の塩基を含む核酸である。

【0115】

本発明は、本願発明の抗ＶＥＧＦ抗体コード核酸分子の断片をさらに提供する。本明細書に使用される際に、抗ＶＥＧＦ抗体コード核酸分子の断片とは、抗ＶＥＧＦ抗体コード配列全体の小さな一部分を指す。断片のサイズは、その意図される使用によって決まるものとなる。

【0116】

一実施形態では、本発明は、ヒトＶＥＧＦに結合する特異的な結合部の免疫グロブリン重鎖もしくはその一部分、免疫グロブリン軽鎖もしくはその一部分、または両方をコードする、単離された核酸を提供する。本発明の一実施形態では、前記特異的な結合部は、抗体の抗原結合部分を含み、その際に、本抗体の抗原結合部分の免疫グロブリン重鎖もしくはその一部分は、９１位のシトシンで始まり１０５位のシトシンで終わる（配列番号１）核酸配列を含む免疫グロブリン重鎖のＣＤＲＨ１もしくはその一部分と、１４８位のチミンで始まり１９８位のシトシンで終わる（配列番号１）核酸配列を含む重鎖のＣＤＲＨ２もしくはその一部分と、２９５位のシトシンで始まり３２７位のシトシンで終わる（配列番号１）核酸配列を含む重鎖のＣＤＲＨ３もしくはその一部分とを含み；および／または本抗体の抗原結合部分の免疫グロブリン軽鎖もしくはその一部分は、７０位のシトシンで始まり１０２位のシトシンで終わる（配列番号３）核酸配列を含む軽鎖のＣＤＲＬ１もしくはその一部分と、１４８位のアデニンで始まり１６８位のシトシンまでの（配列番号３）核酸配列を含む軽鎖のＣＤＲＬ２もしくはその一部分と、２６５位のシトシンで始まり２９１位のグアニンで終わる（配列番号３）核酸配列を含む軽鎖のＣＤＲＬ３もしくはその一部分を含む。

【0117】

例えば、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体をコードする核酸分子は、その核酸分子がＶＥＧＦ抗体以外のポリペプチドをコードする混入した核酸分子から実質的に分離されている際には、単離されているものと考えられてもよい。当業者は、核酸の単離の手順を簡単に利用して、単離されたＶＥＧＦ抗体コード核酸分子を得ることができる。高度な純度を達成することが望ましい一方で、単離された核酸は、単離された核酸であるために、純粋である必要も絶対的な純度を達成する必要もない。

【0118】

別の実施形態では、上記の（ａ）または（ｂ）に示されたようなどの核酸配列も、同じアミノ酸配列をコードする等価な核酸配列に置き換えられることがある。さらに追加の一実施形態では、本抗体は、ヒトまたはヒト化の定常領域をさらに含む。例えば、このヒトまたはヒト化の定常領域は、ＩｇＧ１の定常領域であることがある。別の例では、このヒトまたはヒト化の定常領域は、ＩｇＧ４の定常領域である。

【0119】

本発明の一実施形態では、単離された核酸は、配列番号１６に示される配列を含む。

【0120】

さらに別の実施形態では、単離された核酸配列は、配列番号９に示されるような７２１位のグアニンで始まり１４４９位のチミンまでの核酸配列を含む単鎖Ｆｖ分子またはその一部分である、特異的な結合部をコードする。さらに別の追加の実施形態では、特異的な結合部は、配列番号１および３で示される核酸配列を含むＦａｂ、またはその一部分（複数可）である。さらに別の一実施形態では、抗体の重鎖は、配列番号１６に示されるような７０位のグアニンで始まり７１１位のチミンまでのアミノ酸配列と、配列番号１６にある８９７位のグアニンで始まり１５８０位のアデニンまでの核酸配列とを含む、ＦＲのアミノ酸配列またはその一部分（複数可）を含む。別の実施形態では、特異的な結合部は、配列番号１６に示されるような１位のアデニンで始まり７１１位のチミンまでの核酸配列と、配列番号１６にある８２８位のアデニンで始まり１５８０位のアデニンまでの核酸配列とを含む、Ｆａｂまたはその一部分（複数可）である。

【0121】

さらに別の実施形態では、特異的な結合部は、配列番号１６に示される核酸配列を含むＦａｂまたはその一部分である。

【0122】

一実施形態では、単離された核酸は、ヒトＶＥＧＦに結合する特異的な結合部の免疫グロブリン重鎖もしくはその一部分、免疫グロブリン軽鎖もしくはその一部分、または両方をコードし、抗体の抗原結合部分を含む前記特異的な結合部は、アミノ酸１位のグルタミン酸からアミノ酸３０位のフェニルアラニン（配列番号１）のアミノ酸配列をコードする１位のグアニンで始まり９０位のチミンで終わる（配列番号１）核酸配列を含む、免疫グロブリン重鎖フレームワーク領域（ＦＲ）１であるＦＲＨ１をさらに含む。

【0123】

一実施形態では、単離された核酸は、ヒトＶＥＧＦに結合する特異的な結合部の免疫グロブリン重鎖もしくはその一部分、免疫グロブリン軽鎖もしくはその一部分、または両方をコードし、抗体の抗原結合部分を含む前記特異的な結合部は、アミノ酸３６位のトリプトファンからアミノ酸４９位のアラニン（配列番号１）のアミノ酸配列をコードする１０６位のチミンで始まり１４７位のアデニンで終わる（配列番号１）核酸配列を含む、免疫グロブリン重鎖フレームワーク領域（ＦＲ）２であるＦＲＨ２をさらに含む。

【0124】

一実施形態では、単離された核酸は、ヒトＶＥＧＦに結合する特異的な結合部の免疫グロブリン重鎖もしくはその一部分、免疫グロブリン軽鎖もしくはその一部分、または両方をコードし、抗体の抗原結合部分を含む前記特異的な結合部は、アミノ酸６７位のアルギニンからアミノ酸９８位のアルギニン（配列番号１）のアミノ酸配列をコードする１９９位のシトシンで始まり２９４位のシトシンで終わる（配列番号１）核酸配列を含む、免疫グロブリン重鎖フレームワーク領域３であるＦＲＨ３をさらに含む。

【0125】

一実施形態では、単離された核酸は、ヒトＶＥＧＦに結合する特異的な結合部の免疫グロブリン重鎖もしくはその一部分、免疫グロブリン軽鎖もしくはその一部分、または両方をコードし、抗体の抗原結合部分を含む前記特異的な結合部は、アミノ酸１１０位のトリプトファンからアミノ酸１２０位のセリン（配列番号１）のアミノ酸配列をコードする３２８位のチミンで始まり３６０位のグアニンで終わる（配列番号１）核酸配列を含む、免疫グロブリン重鎖フレームワーク領域４であるＦＲＨ４をさらに含む。

【0126】

一実施形態では、単離された核酸は、ヒトＶＥＧＦに結合する特異的な結合部の免疫グロブリン重鎖もしくはその一部分、免疫グロブリン軽鎖もしくはその一部分、または両方をコードし、抗体の抗原結合部分を含む前記特異的な結合部は、アミノ酸１位のグルタミン酸からアミノ酸３０位のフェニルアラニン（配列番号１）のアミノ酸配列をコードする１位のグアニンで始まり９０位のチミンで終わる（配列番号１）核酸配列を含む重鎖フレームワーク領域ＦＲＨ１と、アミノ酸３６位のトリプトファンからアミノ酸４９位のアラニン（配列番号１）のアミノ酸配列をコードする１０６位のチミンで始まり１４７位のアデニンで終わる（配列番号１）核酸配列を含む重鎖フレームワーク領域ＦＲＨ２と、アミノ酸６７位のアルギニンからアミノ酸９８位のアルギニン（配列番号１）のアミノ酸配列をコードする１９９位のシトシンで始まり２９４位のシトシンで終わる（配列番号１）核酸配列を含む重鎖フレームワーク領域ＦＲＨ３と、アミノ酸１１０位のトリプトファンからアミノ酸１２０位のセリン（配列番号１）のアミノ酸配列をコードする３２８位のチミンで始まり３６０位のグアニンで終わる（配列番号１）核酸配列を含む重鎖フレームワーク領域ＦＲＨ４とをさらに含み、重鎖フレームワーク領域ＦＲＨ１からＦＲＨ４および重鎖相補性決定領域ＣＤＲＨ１からＣＤＲＨ３をコードする核酸配列は、ＦＲＨ１−ＣＤＲＨ１−ＦＲＨ２−ＣＤＲＨ２−ＦＲＨ３−ＣＤＲＨ３−ＦＲＨ４の順番で接合されている。

【0127】

一実施形態では、単離された核酸は、アミノ酸１位のグルタミン酸からアミノ酸１２０位のセリン（配列番号１）のアミノ酸配列をコードする１位のグアニンで始まり３６０位のグアニンで終わる（配列番号１）重鎖可変領域の核酸配列を含む。

【0128】

一実施形態では、単離された核酸は、ヒトＶＥＧＦに結合する特異的な結合部の免疫グロブリン重鎖もしくはその一部分、免疫グロブリン軽鎖もしくはその一部分、または両方をコードし、抗体の抗原結合部分を含む前記特異的な結合部は、アミノ酸１位のアスパラギン酸からアミノ酸２３位のシステイン（配列番号３）のアミノ酸配列をコードする１位のグアニンで始まり６９位のシトシンで終わる（配列番号３）核酸配列を含む、免疫グロブリン軽鎖フレームワーク領域１であるＦＲＬ１をさらに含む。

【0129】

一実施形態では、単離された核酸は、ヒトＶＥＧＦに結合する特異的な結合部の免疫グロブリン重鎖もしくはその一部分、免疫グロブリン軽鎖もしくはその一部分、または両方をコードし、抗体の抗原結合部分を含む前記特異的な結合部は、アミノ酸３５位のトリプトファンからアミノ酸４９位のチロシン（配列番号３）のアミノ酸配列をコードする１０３位のチミンで始まり１４７位のシトシンで終わる（配列番号３）核酸配列を含む、免疫グロブリン軽鎖フレームワーク領域２であるＦＲＬ２をさらに含む。

【0130】

一実施形態では、単離された核酸は、ヒトＶＥＧＦに結合する特異的な結合部の免疫グロブリン重鎖もしくはその一部分、免疫グロブリン軽鎖もしくはその一部分、または両方をコードし、抗体の抗原結合部分を含む前記特異的な結合部は、アミノ酸５７位のグリシンからアミノ酸８８位のシステイン（配列番号３）のアミノ酸配列をコードする１６９位のグアニンで始まり２６４位のチミンで終わる（配列番号３）核酸配列を含む、免疫グロブリン軽鎖フレームワーク領域３であるＦＲＬ３をさらに含む。

【0131】

一実施形態では、単離された核酸は、ヒトＶＥＧＦに結合する特異的な結合部の免疫グロブリン重鎖もしくはその一部分、免疫グロブリン軽鎖もしくはその一部分、または両方をコードし、抗体の抗原結合部分を含む前記特異的な結合部は、アミノ酸９８位のフェニルアラニンからアミノ酸１０７位のリジン（配列番号３）のアミノ酸配列をコードする２９２位のチミンで始まり３２１位のアデニンで終わる（配列番号３）核酸配列を含む、免疫グロブリン軽鎖フレームワーク領域４であるＦＲＬ４をさらに含む。

【0132】

一実施形態では、単離された核酸は、ヒトＶＥＧＦに結合する特異的な結合部の免疫グロブリン重鎖もしくはその一部分、免疫グロブリン軽鎖もしくはその一部分、または両方をコードし、抗体の抗原結合部分を含む前記特異的な結合部は、アミノ酸１位のアスパラギン酸からアミノ酸２３位のシステイン（配列番号３）のアミノ酸配列をコードする１位のグアニンで始まり６９位のシトシンで終わる（配列番号３）核酸配列を含む軽鎖フレームワーク領域ＦＲＬ１と、アミノ酸３５位のトリプトファンからアミノ酸４９位のチロシン（配列番号３）のアミノ酸配列をコードする１０３位のチミンで始まり１４７位のシトシンで終わる（配列番号３）核酸配列を含む軽鎖フレームワークＦＲＬ２と、アミノ酸５７位のグリシンからアミノ酸８８位のシステイン（配列番号３）のアミノ酸配列をコードする１６９位のグアニンで始まり２６４位のチミンで終わる（配列番号３）核酸配列を含む軽鎖フレームワークＦＲＬ３と、アミノ酸９８位のフェニルアラニンからアミノ酸１０７位のリジン（配列番号３）のアミノ酸配列をコードする２９２位のチミンで始まり３２１位のアデニンで終わる（配列番号３）核酸配列を含む軽鎖フレームワークＦＲＬ４とをさらに含み、軽鎖フレームワーク領域ＦＲＬ１からＦＲＬ４および軽鎖相補性決定領域ＣＤＲＬ１からＣＤＲＬ３をコードする核酸配列は、ＦＲＬ１−ＣＤＲＬ１−ＦＲＬ２−ＣＤＲＬ２−ＦＲＬ３−ＣＤＲＬ３−ＦＲＬ４の順番で接合されている。

【0133】

一実施形態では、各ＣＤＲおよび各ＦＲのアミノ酸配列をコードする核酸がＩＭＧＴ法によって画定される、請求項４または６８に記載の単離された核酸は以下の通りである：７６位のグアニンで始まり９９位のチミンで終わる（配列番号７９）核酸配列を含むＩＭＧＴ定義によるＣＤＲＨ１；１５１位のアデニンで始まり１７４位のチミンで終わる（配列番号７９）核酸配列を含むＩＭＧＴ定義によるＣＤＲＨ２；２８９位のグアニンで始まり３２７位のシトシンで終わる（配列番号７９）核酸配列を含むＩＭＧＴ定義によるＣＤＲＨ３；７９位のシトシンで始まり９６位のシトシンで終わる（ＳＥＱＩＤ核酸配列を含むＩＭＧＴ定義によるＣＤＲＬ１ １４８位のアデニンで始まり１５６位のシトシンで終わる（配列番号７７）核酸配列を含むＩＭＧＴ定義によるＣＤＲＬ２；２６５位のシトシンで始まり２９１位のグアニンで終わる（配列番号７７）核酸配列を含むＩＭＧＴ定義によるＣＤＲＬ３；アミノ酸１位のグルタミン酸からアミノ酸２５位のセリン（配列番号７９）のアミノ酸配列をコードする１位のグアニンで始まり７５位のチミンで終わる（配列番号７９）核酸配列を含むＩＭＧＴ定義によるＦＲＨ１；アミノ酸３４位のイソロイシンからアミノ酸５０位のチロシン（配列番号７９）のアミノ酸配列をコードする１００位のアデニンで始まり１５０位のシトシンで終わる（配列番号７９）核酸配列を含むＩＭＧＴ定義によるＦＲＨ２；アミノ酸５９位のチロシンからアミノ酸９６位のシステイン（配列番号７９）のアミノ酸配列をコードする１７５位のチミンで始まり２８８位のチミンで終わる（配列番号７９）核酸配列を含むＩＭＧＴ定義によるＦＲＨ３；アミノ酸１１０位のトリプトファンからアミノ酸１２０位のセリン（配列番号７９）のアミノ酸配列をコードする３２８位のチミンで始まり３６０位のグアニンで終わる（配列番号７９）核酸配列を含むＩＭＧＴ定義によるＦＲＨ４；アミノ酸１位のアスパラギン酸からアミノ酸２６位のセリン（配列番号７７）のアミノ酸配列をコードする１位のグアニンで始まり７８位のチミンで終わる（配列番号７７）核酸配列を含むＩＭＧＴ定義によるＦＲＬ１；アミノ酸３３位のバリンからアミノ酸４９位のチロシン（配列番号７７）のアミノ酸配列をコードする９７位のグアニンで始まり１４７位のシトシンで終わる（配列番号７７）核酸配列を含むＩＭＧＴ定義によるＦＲＬ２；アミノ酸５３位のグルタミン酸からアミノ酸８８位のシステイン（配列番号７７）のアミノ酸配列をコードする１５７位のグアニンで始まり２６４位のチミンで終わる（配列番号７７）核酸配列を含むＩＭＧＴ定義によるＦＲＬ３；および／またはアミノ酸９８位のフェニルアラニンからアミノ酸１０７位のリジン（配列番号７７）のアミノ酸配列をコードする２９２位のチミンで始まり３２１位のアデニンで終わる（配列番号７７）核酸配列を含むＩＭＧＴ定義によるＦＲＬ４。

【0134】

一実施形態では、単離された核酸は、アミノ酸１位のアスパラギン酸からアミノ酸１０７位のリジン（配列番号３）のアミノ酸配列をコードする１位のグアニンで始まり３２１位のアデニンで終わる（配列番号３）軽鎖可変領域の核酸配列を含む。

【0135】

本発明の追加の一実施形態では、核酸は、抗体である特異的な結合部をコードする。

【0136】

さらに別の実施形態では、本抗体の重鎖は、アミノ酸１位のグルタミン酸からアミノ酸１２０位のセリンまで（配列番号１）のＦＦ０３０４６−２のＶ_Ｈドメインと、アミノ酸１２１位のアラニンからアミノ酸２１８位のバリンまで（配列番号１）のヒトＩｇＧ１定常領域のＣＨ１ドメインとを含み、本抗体の軽鎖は、アミノ酸１位のアスパラギン酸からアミノ酸１０７位のリジンまで（配列番号３）のＦＦ０３０４６−２のＶ_Ｌドメインと、アミノ酸１０８位のアルギニンからアミノ酸２１４位のシステインまで（配列番号３）のヒトカッパ軽鎖定常領域とを含む。

【0137】

さらに別の実施形態では、本抗体の重鎖は、アミノ酸１位のグルタミン酸からアミノ酸１２０位のセリンまで（配列番号１）のＦＦ０３０４６−２のＶ_Ｈドメインと、アミノ酸１２１位のアラニンからアミノ酸２１８位のバリンまで（配列番号１）のヒトＩｇＧ１定常領域のＣＨ１ドメインと、アミノ酸２１９位のグルタミン酸からアミノ酸２２８位のスレオニンまで（配列番号１）のヒトＩｇＧ１定常領域のヒンジ領域の一部分とを含み、本抗体の軽鎖は、アミノ酸１位のアスパラギン酸からアミノ酸１０７位のリジンまで（配列番号３）のＦＦ０３０４６−２のＶ_Ｌドメインと、アミノ酸１０８位のアルギニンからアミノ酸２１４位のシステインまで（配列番号３）のヒトカッパ軽鎖定常領域とを含む。

【0138】

また、本発明は、本抗体の重鎖が、アミノ酸２６１位のグルタミン酸からアミノ酸３８０位のセリンまで（配列番号１６）のＦＦ０３０４６−２のＶ_Ｈドメインと、アミノ酸３８１位のアラニンからアミノ酸４７８位のバリンまで（配列番号１６）のヒトＩｇＧ１定常領域のＣＨ１ドメインとを含み、本抗体の軽鎖が、アミノ酸２４位のアスパラギン酸からアミノ酸１３０位のリジンまで（配列番号１６）のＦＦ０３０４６−２のＶ_Ｌドメインと、アミノ酸１３１位のアルギニンからアミノ酸２３７位のシステインまで（配列番号１６）のヒトカッパ軽鎖定常領域とを含む、実施形態を提供する。

【0139】

本発明は、本抗体の重鎖が、アミノ酸２６１位のグルタミン酸からアミノ酸３８０位のセリンまで（配列番号１６）のＦＦ０３０４６−２のＶ_Ｈドメインと、アミノ酸３８１位のアラニンからアミノ酸４７８位のバリンまで（配列番号１６）のヒトＩｇＧ１定常領域のＣＨ１ドメインと、アミノ酸４７９位のグルタミン酸からアミノ酸４８８位のスレオニンまで（配列番号１６）のヒトＩｇＧ１定常領域のヒンジ領域の一部分とを含み、本抗体の軽鎖が、アミノ酸２４位のアスパラギン酸からアミノ酸１３０位のリジンまで（配列番号１６）のＦＦ０３０４６−２のＶ_Ｌドメインと、アミノ酸１３１位のアルギニンからアミノ酸２３７位のシステインまで（配列番号１６）のヒトカッパ軽鎖定常領域とを含む、実施形態を提供する。

【0140】

本発明は、配列番号１６に示される配列を有する単離された核酸を提供する。

【0141】

一実施形態では、恒常的プロモーターを使用して、本発明の抗体、その一部分またはバリアントの発現を制御する。別の一実施形態では、調節性プロモーターまたは誘導性プロモーターを使用して、本発明の抗体、その一部分またはバリアントを発現する。一実施形態では、調節性プロモーターまたは誘導性プロモーターは、ｐｈｏＡプロモーターである。本発明は、配列番号１５に記載されるような核酸配列またはその一部分をｐｈｏＡプロモーターが含む、単離された核酸を提供する。

【0142】

本発明は、核酸の転写の終結が転写ターミネーターの制御下にある、単離された核酸配列を提供する。一実施形態では、転写ターミネーターは、リボソームＲＮＡ遺伝子ターミネーターである。一実施形態では、リボソームＲＮＡ遺伝子ターミネーターは、配列番号１９に示されるような核酸配列またはその一部分を含む。

【0143】

本発明は、ベクターである、単離された核酸配列を提供する。一実施形態では、ベクターは、複製起点を含む。別の実施形態では、ベクターは、ｃｏｌＥ１複製起点を含む。

【0144】

一実施形態では、ベクターは、選択マーカーまたはスクリーニングマーカーを含む。一実施形態では、選択マーカーまたはスクリーニングマーカーは、薬剤選択マーカー、蛍光タンパク質、細胞表面マーカー、酵素、発光タンパク質、代謝マーカー、成長因子、および耐性因子からなる群から選択される。一実施形態では、ベクターは、配列番号２０に示されるようなテトラサイクリン耐性遺伝子を欠失したｐＢＲ３２２である。

【0145】

本発明は、本発明の抗体をコードする核酸がＢＳＡまたはＦｃに結合しない、単離された核酸を提供する。

【0146】

本発明の抗体の組換え生産のために、それをコードする核酸が単離され、さらに別のクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現に用いるために複製可能なベクター内に挿入されることがある。本抗体をコードするＤＮＡは、容易に単離され、従来の手順を用いて（例えば、本抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）配列解析される。数多くのベクターが利用可能である。ベクターの選択は、部分的には、使用される宿主細胞に依存する。一般に、好適な宿主細胞は、原核起源であるか真核起源（一般に哺乳動物）であるかのどちらかである。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥの定常領域を含めて、任意のアイソタイプの定常領域をこの目的に使用することができ、そのような定常領域を任意のヒトまたは動物種から得ることができることが、認識されよう。

【0147】

本発明の抗ＶＥＧＦ抗体をコードする単離された核酸は、１つまたは複数のサイレント変異を含むことがある。さらに、本発明の単離された核酸は、１つまたは複数のミスセンス変異を有することがあり、その場合に、ヌクレオチドの置換の結果として、アミノ酸の同一性に変化が生じるが、その置換により翻訳終止コドンが指定されることから、未熟に切り縮められたポリペプチドは生じない。本発明の単離された核酸は、インフレームの欠失または挿入を有することがあり、その欠失または挿入は、３の倍数の塩基または塩基対として起こる。

【0148】

また、提供されるのは、本明細書に記載されるような抗ＶＥＧＦ抗体コード配列またはその断片を含有する組換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）である。本明細書に使用される際に、ｒＤＮＡ分子とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの分子操作に供されているＤＮＡ分子である。ｒＤＮＡ分子を生成するための方法は、当技術分野に周知のである。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning (1989)を参照されたい。本願発明の好適なｒＤＮＡ分子では、抗ＶＥＧＦ抗体またはその断片をコードする抗ＶＥＧＦ抗体コードＤＮＡ配列は、１つまたは複数の発現制御配列および／またはベクター配列に動作可能に連結されている。ｒＤＮＡ分子は、ＶＥＧＦ 抗体全体をコードする可能性があるか、そのＶＥＧＦ抗体の断片をコードする可能性があるかのどちらかである。

【0149】

ＶＥＧＦ抗体コード配列を動作可能に連結するベクターおよび／または発現制御配列の選択は、当技術分野に周知のように、所望される機能的な特性、例えばタンパク質の発現と、形質転換される宿主細胞とに直接的に依存する。本願発明の想定するベクターは、少なくとも複製または宿主染色体内への挿入を、そして好ましくはｒＤＮＡ分子内ＶＥＧＦ抗体コード配列の発現を、導くことが可能である。

【0150】

動作可能に連結されたタンパク質コード配列の発現を調節するために使用される発現制御因子は、当技術分野に公知であり、以下に限定されないが、誘導性プロモーター、恒常的プロモーター、分泌シグナル、エンハンサー、転写ターミネーター、および他の調節因子が挙げられる。例えば、本発明の核酸の転写は、リボソームＲＮＡターミネーターの制御下にあることがある。一実施形態では、リボソームＲＮＡターミネーターは、配列番号１９に示されるような核酸配列またはその一部分を含む。

【0151】

一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体コード核酸分子を含有するベクターは、原核生物のレプリコン、すなわち、形質転換に用いられる細菌宿主細胞などの原核宿主細胞において、自律複製と染色体内での組換えＤＮＡ分子の維持とを導く能力を有するＤＮＡ配列を含むものとなる。そのようなレプリコンは、当技術分野に周知である。さらに、原核生物のレプリコンを含むベクターはまた、その発現が検出マーカーまたは薬剤耐性などの選択マーカーを付与する、遺伝子を含むこともある。典型的な細菌の薬剤耐性遺伝子は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与するものである。

【0152】

真核細胞に適合する発現ベクター、好ましくは脊椎動物細胞に適合するものもまた、抗ＶＥＧＦ抗体コード配列を挿入して本発明の抗ＶＥＧＦ抗体を発現するために使用することができる。真核細胞発現ベクターは、当技術分野に周知であり、複数の商業用供給元から入手可能である。典型的には、そのようなベクターは、所望のＤＮＡセグメントの挿入に便利な制限酵素部位を含有して提供される。そのようなベクターは、抗ＶＥＧＦ抗体恒常的な発現または調節性の発現のどちらかのためのプロモーター／エンハンサーの組合せを供給することがある。さらに、そのようなベクターは、真核細胞で有効な転写ターミネーターを含むことがある。

【0153】

本願発明のｒＤＮＡ分子を構築するために使用される真核細胞発現ベクターは、真核細胞で有効な選択マーカー、好ましくは薬剤耐性選択マーカーを、さらに含むことがある。

【0154】

本発明の実践に従えば、ベクターは、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体コード配列またはその一部分を含有するプラスミド、コスミド、ウイルスベクター、またはファージベクターとすることができる。さらに、本発明は、適した真核宿主細胞内にトランスフェクションされたプラスミド、コスミド、ウイルスベクター、またはファージベクターを含む、宿主−ベクター系を想定する。適した真核宿主細胞の例としては、酵母細胞、植物細胞、または哺乳類細胞などの動物細胞が挙げられる。宿主−ベクター系は、抗ＶＥＧＦ抗体またはその一部分もしくはバリアントの生産に有用である。あるいは、宿主細胞を、本発明に示されるように、細菌細胞などの原核性とすることができる。

【0155】

当技術分野に公知の利用可能な数多くのベクターを、本願発明の目的のために使用することができる。ベクターの構成成分としては、一般に、以下に限定されないが、複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸挿入物、および転写終結配列が挙げられる。例えば、核酸は、ｐｈｏＡプロモーターの制御下で発現されることがある。一実施形態では、ｐｈｏＡプロモーターは、配列番号１５に示されるような核酸配列またはその一部分を含む。ＰｈｏＡプロモーターは、低リン酸条件下（０．０５ｍＭを下回るリン酸濃度など）で、下流の核酸配列（本発明の核酸配列など）を転写するように誘導されることがある。

【0156】

本発明の発現ベクターは、ポリペプチド構成成分をそれぞれコードする２つ以上のプロモーター−シストロン対を含むことがある。あるいは、発現ベクターは、２つ以上のポリペプチド構成成分をコードする２つ以上のシストロンを有する１つのプロモーターを含むことがある。プロモーターは、シストロンに対し上流（５’）に配された非翻訳調節配列であり、シストロンの発現を変調させる。原核プロモーターは、典型的には、誘導性および恒常的の２つのクラスに分類される。誘導性プロモーターとは、その制御下で、培養条件の変化、例えば栄養の存在もしくは不在または温度の変化に応答して、シストロンの転写のレベルの増加を開始するプロモーターである。

【0157】

本発明の一実施形態では、ｐｈｏＡプロモーターなどの誘導性プロモーターが、上流に配され、免疫グロブリン軽鎖と免疫グロブリン重鎖の両方またはその一部分もしくはバリアントをコードする核酸に動作可能に連結される。低リン酸条件によってｐｈｏＡプロモーターを誘導する結果として、下流の核酸配列が転写され、ＲＮＡ転写物が生産されるが、ｐｈｏＡプロモーターが上流に配されて、免疫グロブリン軽鎖と免疫グロブリン重鎖との両方をコードする核酸に動作可能に連結された場合、結果としてバイシストロニックなｍＲＮＡが生産される。一実施形態では、バイシストロニックなｍＲＮＡが翻訳される結果、クローン＃２０１の場合にあるように、免疫グロブリン重鎖と免疫グロブリン軽鎖の両方が生産される。

【0158】

Ｆａｂ２０１コード配列（配列番号１６）を含み、細菌によるＦａｂ２０１の発現に使用できるバリアントクローン＃２０１（図１７）を、ブダペスト条約の規定の下、２０１７年９月５日、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ、マナサス、バージニア州２０１１０−２２０９に寄託し、ＡＴＣＣ寄託番号をＰＴＡ−１２４４３５として付与されている。

【0159】

可能性のある種々の宿主細胞によって認識される非常に数多くのプロモーターが周知である。実施形態によっては、一般に、生来の標的ポリペプチドプロモーターに比べて、発現される標的遺伝子の転写量をより多く、収量をより高いものとすることから、異種のプロモーターが利用される。宿主細胞または非宿主細胞由来の天然に発生したプロモーターに加えて、ウイルスプロモーターおよび人工プロモーターが、当技術分野に公知である。真核細胞（酵母、昆虫、または哺乳動物の細胞）では、プロモーターは、転写エンハンサーと組み合わせて使用される。

【0160】

形質転換された宿主細胞
本発明は、抗ＶＥＧＦ抗体またはその断片をコードする核酸分子を用いて形質転換された宿主細胞をさらに提供する。宿主細胞は、原核性と真核性のどちらかにすることができる。抗ＶＥＧＦ抗体の発現に有用な真核細胞は、その細胞株が細胞培養方法に適合し、かつ発現ベクターの伝搬および抗ＶＥＧＦ抗体遺伝子の発現に適合する限り、限定されない。好適な真核宿主細胞としては、以下に限定されないが、酵母、昆虫、および哺乳動物の細胞、好ましくは脊椎動物細胞、例えばマウス、ラット、サル、またはヒトの細胞株に由来するものなどが挙げられる。好適な脊椎動物細胞株としては、以下に限定されないが、ＣＨＯおよびＨＥＫ２９３が挙げられる。最も好適な脊椎動物細胞株は、生物製剤の製造または生産用に認可されたものである。好適な原核宿主は、大腸菌と枯草菌のどちらかである。

【0161】

本願発明のｒＤＮＡを用いた適切な細胞宿主の形質転換、トランスフェクション、またはトランスダクションは、周知の方法によって達成され、その方法は、典型的には、使用するベクターおよび採用する宿主系のタイプに依存する。原核宿主細胞の形質転換に関しては、エレクトロポレーションおよび塩−熱ショック処理法が典型的に採用されるが、例えば、Cohen et al., Proc Acad Sci USA (1972) 69:2110; and Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)を参照されたい。さらに、原核宿主細胞は、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体をコードする核酸を含むファージを用いて感染または形質導入させてもよい。ｒＤＮＡを含有するベクターを用いた脊椎動物細胞のトランスフェクションに関しては、エレクトロポレーション、カチオン脂質処理法または塩処理法が典型的に採用されるが、例えば、Graham et al., Virol (1973) 52:456; Wigler et al., Proc Natl Acad Sci USA (1979) 76:1373-76を参照されたい。さらに、脊椎動物細胞は、抗ＶＥＧＦ抗体をコードする核酸を含む真核ウイルス粒子を用いて感染または形質導入させてもよい。そのようなウイルス粒子は、ＤＮＡウイルス粒子であってもＲＮＡウイルス粒子であってもよく、以下に限定されないが、アデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルス、レトロウイルス、およびレンチウイルスの粒子が挙げられよう。

【0162】

形質転換、トランスフェクション、またはトランスダクションに成功した細胞、すなわち本願発明のｒＤＮＡ分子を含有する細胞は、周知の手法によって特定することができる。例えば、本願発明のｒＤＮＡを導入した結果として得られる細胞を、クローニングして、単一コロニーを生じることができる。それらのコロニーに由来する細胞を、採取し、溶解して、そのＤＮＡ内容物を、Southern, J Mol Biol (1975) 98:503またはBerent et al., Biotech (1985) 3:208などに記載された方法を用いてｒＤＮＡの存在について調べるか、または細胞から生産されたタンパク質を、免疫学的方法を介してアッセイすることができる。あるいは、姉妹細胞を、外来の核酸の存在について、当技術分野に公知の高感度の方法によって分析してもよく分析してもよい。また、形質転換、トランスフェクション、またはトランスダクションされた細胞は、細胞内に導入された同じ核酸上かまたはその細胞内に共導入された別々の核酸上に存在するマーカー（薬剤選択マーカー、イメージングマーカー、または検出マーカーのいずれか）に基づいて、単離又は特定されることがある。

【0163】

本発明の抗体を発現するのに適した原核宿主細胞としては、古細菌および真正細菌、例えばグラム陰性生物またはグラム陽性生物が挙げられる。有用な細菌の例としては、エシェリキア属（Escherichia）［例えば大腸菌（E. coli）］、バシラス（Bacilli）［例えば枯草菌（B. subtilis）］、腸内細菌（Enterobacteria）、シュードモナス（Pseudomonas）種［例えばシュードモナス・エルギノーザ（P. aeruginosa）］、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescans）、クレブシエラ（Klebsiella）、プロテウス（Proteus）、赤痢菌（Shigella）、根粒菌（Rhizobia）、ビトレオシラ（Vitreoscilla）、またはパラコッカス（Paracoccus）が挙げられる。

【0164】

抗体の生産
抗体の調製のための様々な方法が、当技術分野に周知である。例えば、宿主細胞を、上記の発現ベクターを用いて形質転換して、プロモーターを誘導するか形質転換体を選択するかまたは所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に改変された在来の栄養培地で培養することがある。

【0165】

形質転換とは、ＤＮＡが染色体外因子としてまたは染色体組み込みによってのどちらかで複製可能となるように、ＤＮＡを原核生物宿主内に導入することを意味する。使用する宿主細胞に応じて、そのような細胞に適切な標準的な手法を用いて形質転換を行う。

【0166】

本発明のポリペプチドを生産するために使用する原核細胞を、当技術分野に公知でありかつ選択された宿主細胞の培養に適している培地中で成長させる。適した培地の例としては、ルリアブロス（ＬＢ）に必要な栄養補助剤を足したものが挙げられる。

【0167】

抗体の精製
当技術分野に公知の標準的なタンパク質精製法を採用することができる。以下の手順は、適した精製手順の例である：イムノアフィニティカラムまたはイオン交換カラムでの分画、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカまたはＤＥＡＥなどの陽イオン交換樹脂でのクロマトグラフィー、およびゲル濾過例えばＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５。

【0168】

イムノコンジュゲート
本発明はまた、イムノコンジュゲート（互換的に「抗体−薬剤コンジュゲート」または「ＡＤＣ」と称される）を提供し、このコンジュゲートは、化学療法剤、薬剤、成長阻害剤、毒素（例えば細菌、真菌、植物、または動物を起源とする酵素活性を持つ毒素もしくはその断片）、または放射活性剤（すなわち放射性コンジュゲート）などの細胞毒性剤または治療剤にコンジュゲーションされた任意の本発明の抗ＶＥＧＦ（例えば、本明細書に記載されるその一部分もしくはバリアントを含む）を含む。例えば、治療剤としては、以下に限定されないが、抗腫瘍薬、サイトカイン、第２の抗体、または抗体の一部分（例えばＦｃ）が挙げられる。さらに、本発明は、プロドラッグを細胞毒性薬に変換する酵素に本発明の抗体が連結されている、実施形態を提供する。本発明の実践に従えば、本抗体の一部分は、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、およびＦ（ａｂ’）_２断片からなる群から選択されてもよい。

【0169】

成長阻害剤とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏのどちらかの細胞の成長を阻害する化合物または組成物を指す。成長阻害剤の例としては、細胞周期の進行を遮断する剤、例えばビンカ類（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、タキサン類を含めた古典的なＭ期遮断剤；ならびにトポイソメラーゼＩＩ阻害物質、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、およびブレオマイシンが挙げられる。追加の適した剤としては、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、およびａｒａ−Ｃが挙げられる。

【0170】

本発明の抗体またはその断片は、検出マーカーを用いて標識され、その結果としてイムノコンジュゲート、例えば診断用イムノコンジュゲートを生じていることがある。

【0171】

イムノコンジュゲートは、第２の分子をＶＥＧＦ陽性細胞にターゲティングするために使用することができる（Vitetta, E.S. et al., 1993, Immunotoxin therapy, in DeVita, Jr., V.T. et al., eds, Cancer: Principles and Practice of Oncology, 4th ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 2624-2636）。

【0172】

細胞毒性剤の例としては、以下に限定されないが、リシン、リシンＡ鎖、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（tenoposide）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラセンジオン、アクチノマイシンＤ、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、クリシン、クロチン、カリケアマイシン、サボンソウ（saponaria officinalis）阻害剤、マイタンシノイド類、およびグルココルチコイド、および他の化学療法剤、ならびに放射性同位体、例えば^２１２Ｂｉ、^１３１Ｉ、^１３１Ｉｎ、^９０Ｙ、および^１８６Ｒｅなどが挙げられる。適した検出マーカーとしては、以下に限定されないが、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤、または酵素が挙げられる。抗体はまた、プロドラッグをその活性形態に変換できる抗がんプロドラッグ活性化酵素にコンジュゲーションされることがある。

【0173】

さらに、任意の本発明のモノクローナル抗体または組換え抗体の抗原結合領域を含む本発明の組換えタンパク質を、がんを治療するために使用することができる。そのような状況では、組換えタンパク質の抗原結合領域は、治療活性を有する第２のタンパク質の少なくとも機能的に活性な一部分に接合される。第２のタンパク質としては、以下に限定されないが、酵素、リンカイン、オンコスタチン、または毒素を挙げることができる。適した毒素としては、上に記載されたものが挙げられる。

【0174】

治療剤を抗体にコンジュゲーションまたは接合するための手法は、周知である［例えば、Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); and Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)］を参照されたい。治療剤としてのＶＥＧＦ抗体の使用は、さらに本明細書に記載されている。

【0175】

他の抗ＶＥＧＦ抗体コード核酸分子を単離するための方法
本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ抗体コード核酸分子によって、抗ＶＥＧＦ抗体のホモログ、代替的に薄切されたアイソフォーム、対立遺伝子のバリアント、および本発明の抗ＶＥＧＦ抗体の変異体、ならびにコード配列および遺伝子配列の単離が可能になる。

【0176】

例えば、本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ抗体コード配列の一部分を合成し、ヒト以外の生物由来の抗ＶＥＧＦ抗体のタンパク質ファミリーのメンバーをコードするＤＮＡ、本明細書に記載されるヒトＶＥＧＦタンパク質の対立遺伝子のバリアント、および抗ＶＥＧＦ抗体遺伝子を含有するゲノム配列を取り出すプローブとして使用することができる。（約５〜７アミノ酸の広がりをコードする）およそ１６〜２１ヌクレオチドを含有するオリゴマー（またはオリゴヌクレオチド）を調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに使用して、過剰レベルの偽陽性を除外するようなストリンジェントな条件または充分なストリジェンシーの条件下でのハイブリダイゼーションを達成してもよい。特に目的とするオリゴマーは、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体の超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列をコードするものである。このオリゴマーを、本明細書に記載されるＣＤＲ配列またはそのようなＣＤＲ配列の一部分から調製してもよい。このオリゴマーを、本明細書に記載されるＣＤＲのアミノ酸配列またはその一部分を再コード化することにより調製してもよく、その結果、オリゴマーまたはその相補体の翻訳物は、本明細書に記載されるＣＤＲまたはその一部分をコードする。

【0177】

さらに、抗ＶＥＧＦ抗体コード核酸分子またはその断片を選択的に増幅／クローニングするためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）での使用のために、オリゴヌクレオチドプライマーの対を調製してもよい。そのようなＰＣＲプライマーを用いるＰＣＲの変性／アニーリング／伸長のサイクルは、当技術分野に周知であり、他の抗ＶＥＧＦ抗体コード核酸分子を単離する際の使用のために容易に適応させることができる。

【0178】

抗ＶＥＧＦ抗体コード配列の非ヒトホモログ、抗ＶＥＧＦ抗体コード配列の天然に発生した対立遺伝子のバリアント、およびゲノムの抗ＶＥＧＦ抗体コード配列は、本明細書に記載される抗体のＣＤＲ部分中で、ヒト抗ＶＥＧＦ抗体配列と高度な相同性を共有するものとなる。一般に、そのような核酸分子は、ストリンジェントな条件下でヒトＶＥＧＦ配列にハイブリダイズするものとなる。そのような配列は、典型的には、ヒト抗ＶＥＧＦ抗体コード配列と少なくとも７０％相同性、好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の相同性を含有するものとなる。

【0179】

ストリンジェントな条件とは、（１）洗浄のために、低いイオン強度と高い温度、例えば０．０１５Ｍ ＮａＣｌ／０．００１５Ｍ硝酸ナトリウム／０．１％ＳＤＳを５０℃で採用するか、または（２）ハイブリダイゼーションの間に、ホルムアミドなどの変性剤、例えば０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ ＮａＣｌと７５ｍＭクエン酸ナトリウムとを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５を含む、５０％（体積／体積）ホルムアミドを４２℃で採用するものである。

【0180】

別の例は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（５０mｇ／ｍＬ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを４２℃で使用し、併せて０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中、４２℃で洗浄することである。当業者は、明確で検出可能なハイブリダイゼーションシグナルを得るよう適切に、ストリンジェンシー条件を容易に決定し変えることができる。

【0181】

ＣＤＲコード領域またはＦＲコード領域を変異誘発し、結果として得られた抗体をＶＥＧＦとの結合能について特性解析することによって、他の抗ＶＥＧＦ抗体コード核酸分子を得てもよい。ＦＲコード領域については、ストランド間のジスルフィド結合の形成に関与するシステインと、ＣＤＲＨ３の直後のＦＲＨ４のアミノ末端終端にある保存されたトリプトファンとをコードするものを除いて、ＣＤＲコード領域に隣接するヌクレオチドが変異誘発の好適な部位であることがある。

【0182】

競合的阻害抗体を特定するためのアッセイ
本発明の別の態様は、本発明の抗体が認識し結合するＶＥＧＦと同じかまたは重複するエピトープに結合する追加の抗ＶＥＧＦ抗体を、検出し特定するために使用することができる、アッセイおよび方法に関連する。具体的には、抗ＶＥＧＦ抗体のＶＥＧＦに結合する能力および／またはＶＥＧＦ活性を阻害／刺激する能力によって、ＶＥＧＦに結合する抗ＶＥＧＦ抗体および他の剤および細胞成分を特定することができる。ＶＥＧＦ結合活性についてのアッセイは、ＶＥＧＦタンパク質を必要とすることがあるか、または、その断片もしくはそのペプチドが、ハイスループットスクリーニング法での使用に適する。

【0183】

あるいは、ＶＥＧＦタンパク質の決定的な位置（本発明の任意の抗体によって認識される）に免疫反応性のある抗体を、抗体ライブラリー、例えば合成のナイーブＦａｂファージディスプレイライブラリーなどから選択してもよい。初発のスクリーニングの後、焦点を合わせてＣＤＲ配列の変異誘発を実施してもよく、追加の何巡かのスクリーニングを、限定的なＶＥＧＦタンパク質またはＶＥＧＦタンパク質の一部分を用いて行い、望ましい活性の向上した抗ＶＥＧＦ抗体（例えばＶＥＧＦに対する高親和性の抗体）を選び出してもよい。選択されたファージに存在する選択されたＦａｂ配列を用いて、追加の何巡かの変異誘発およびスクリーニングを、所望のアウトカムに達するまで実施してもよい。

【0184】

本発明の診断使用
多種多様な本発明の診断使用がある。例えば、本発明は、対象、例えば動物またはヒト対象で、黄斑変性症、または眼でのＶＥＧＦの過剰生産に関連する（実際のまたは潜在的な）視覚の機能障害もしくは喪失、またはＶＥＧＦタンパク質の存在に関連するがんを診断するための方法を提供する。一実施形態では、本方法は、本発明の抗体のうちいずれか１つまたは組合せを用いて、試料（例えば細胞または生体液の試料）中のＶＥＧＦタンパク質の数を定量的に決定することを含む。次いで、そうして決定された数を、正常な対象由来の試料中の量と比較することができる。測定できる程度に異なる量が試料中に存在していること（すなわち、被験試料中のＶＥＧＦの数が正常な試料由来の数を超える）は、黄斑変性症または視覚の機能障害もしくは喪失のリスクの存在または増加、またはがんの存在を標示する。被験試料中のＶＥＧＦの数が正常な試料由来の数を超える際に、ＶＥＧＦを細胞によって過剰発現する。

【0185】

別の実施形態では、診断は、本発明の核酸を用いて、ＶＥＧＦタンパク質をコードするＲＮＡの量を、対象由来の試料中で定量的に決定することを含む。そのように決定された量を、正常な対象由来の試料中のＲＮＡの量と比較することができる。繰り返しになるが、測定できる程度に異なる量が存在していることは、黄斑変性症または視覚の機能障害もしくは喪失のリスクの存在または増加、またはがんの存在を標示する。

【0186】

さらに、本発明は、対象で新生物のまたは新生物発生前の状態を診断するための方法を提供する。この方法は、対象から組織の試料を得ること、上記の方法を使用する際のＶＥＧＦの量および／または分布の差を検出することを含み、測定可能な別個の差は、そのような新生物のまたは新生物発生前の状態を標示する。

【0187】

本発明の実践に従えば、本発明の抗体は、本発明の任意のモノクローナル抗体が向けられているエピトープに向けることができる。さらに、組織切片を、膀胱、前立腺、骨、リンパ組織、膵臓、他の器官、または筋肉とすることができる。

【0188】

さらに、本発明は、黄斑変性症、または対象の眼における過剰なＶＥＧＦの存在に関連する視覚の機能障害または喪失を診断するための方法を提供する。この方法は、対象から眼の組織または細胞の試料を得ること、上記の方法を用いて組織または細胞中のＶＥＧＦの量の差を検出することを含み、測定可能な別個の差は、黄斑変性症、または対象の眼における過剰なＶＥＧＦの存在に関連する視覚の機能障害もしくは喪失を標示する。

【0189】

本発明はまた、生体液試料中のＶＥＧＦの濃度を検出し定量的に決定する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、１つまたは複数の過剰な本発明のモノクローナル抗体に固体支持体を接触させることを含み、このモノクローナル抗体が固体支持体の表面に付加することを可能にする条件下で、この抗体はＶＥＧＦとの複合体を形成する（好ましくは特異的に形成する）。モノクローナル抗体の付加された結果として得られる固体支持体を、次いで、生体液試料に接触させ、生体液中のＶＥＧＦが抗体に結合して、ＶＥＧＦ−抗体複合体を形成するものとする。この複合体は、検出マーカーを用いて直接的にまたは間接的に標識することができる。あるいは、ＶＥＧＦと抗体のどちらかを、複合体の形成前に標識することができる。次いで、この複合体を検出して定量的に決定し、それによって、生体液試料中のＶＥＧＦの濃度を検出して定量的に決定することができる。正常な対照の生体液に比べて高濃度の試料中ＶＥＧＦは、新生物のまたは新生物発生前の状態を標示する。あるいは、正常な対照の生体液に比べて高濃度の試料中ＶＥＧＦは、黄斑変性症または視覚の機能障害もしくは喪失のリスクが存在または増加していることを標示する。後者の場合、生体液を眼から得る。

【0190】

本発明の実践に従えば、生体液としては、以下に限定されないが、硝子体液、組織抽出物、尿、血液、血清、および痰が挙げられる。さらに、検出マーカーとしては、以下に限定されないが、酵素、ビオチン、蛍光団、発色団、重金属、常磁性同位体、または放射性同位体が挙げられる。

【0191】

さらに、本発明は、ＶＥＧＦを認識し結合する本発明の抗体（抗ＶＥＧＦ抗体）；および検出可能な標識と抗ＶＥＧＦ抗体の特異的な結合パートナーとのコンジュゲートを含む、診断キットを提供する。本発明の実践によれば、標識としては、以下に限定されないが、酵素、放射標識、発色団、および蛍光剤が挙げられる。

【0192】

ＶＥＧＦに関連する疾患の経過をモニタリングするための方法
さらに、本発明は、対象由来の試料中のＶＥＧＦの量を様々な時点で測定することによって、対象での黄斑変性症、または視覚の機能障害、またはがん（例えば、前立腺がん、膀胱、膵臓がんの前立腺転移、骨転移）、またはＶＥＧＦに関連する障害の経過をモニタリングするための方法を提供する。これは、試料中のＶＥＧＦの量の変化を決定する目的で、例えばその変化が小さな量変化であるか、または大きな変化、すなわちＶＥＧＦの過剰発現であるかを決定するために行う。一実施形態では、この方法は、対象由来の初発の試料中でＶＥＧＦタンパク質の存在を定量的に決定すること、およびそうして決定された量を対象由来の第２の試料中に存在する量と比較することを含み、そのような試料は、異なる時点で採取され、決定された量の差異は、黄斑変性症または視覚機能障害またはがんの経過を標示するものである。

【0193】

別の実施形態では、モニタリングは、対象由来の初発の試料において、ＶＥＧＦのＲＮＡの存在を定量的に決定すること、およびそうして決定された量を対象由来の第２の試料に存在する量と比較することによってもたらされ、そのような試料は、異なる時点で採取され、決定される量の差は、黄斑変性症または視覚機能障害またはがん（例えば、前立腺がん、膀胱、膵臓がんの前立腺転移、骨転移）の経過を標示する。

【0194】

試料は、動物またはヒト由来とすることができる。さらに、試料は、細胞試料とすることができる。例えば、本発明の方法を用いて、器官組織、例えば眼の組織もしくは細胞、前立腺組織、膀胱組織、膵臓組織、神経内分泌組織、および骨（癌腫の転移が可能な任意の組織、例えば結節、肺、肝臓、膵臓）を、黄斑変性症または視覚の機能障害もしくは喪失のリスクの存在または増加、またはがんもしくは転移性病変の存在について、評価することができる。あるいは、試料は、生体液、例えば眼の細胞外液、硝子体液、尿、血清、または血漿とすることができる。

【0195】

本発明の実践に従えば、検出を、組織学、ブロッティング、ＥＬＩＳＡ、およびＥＬＩＦＡを含む免疫学的検出手段によってもたらすことができる。試料が組織または細胞試料である際には、それをホルマリン固定、パラフィン包埋、または凍結することができる。

【0196】

本発明はさらに、供試される眼または新生物組織から得た組織切片中のＶＥＧＦの量および分布の差を、正常組織由来の組織切片中のＶＥＧＦの量および分布に比べて決定する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、供試される組織と正常組織との両方を、ＶＥＧＦとの複合体を特異的に形成する本発明のモノクローナル抗体に接触させること、ならびにそれによってＶＥＧＦの量および分布の差を検出することを含む。

【0197】

がんの療法および黄斑変性症などのＶＥＧＦに関連する障害またはＶＥＧＦに関連する眼疾患／障害の療法
本発明は、ＶＥＧＦに関連する疾患、例えば滲出型加齢性黄斑変性症、糖尿病性黄斑症、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）における黄斑浮腫、虹彩新血管新生、病理学的近視に起因する脈絡膜の新血管新生、成熟児網膜症、血管新生緑内障、および／またはがんなどを治療するために、例えば全身的に使用されることがある、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体を提供する。

【0198】

疾患細胞を標的とするが周囲の非患部の細胞および組織を標的としない抗体が好適である。そのため、本発明は、ＶＥＧＦ抗原を発現する疾患に感受性であるかまたは罹っている患者を治療する方法を提供し、この方法は、ＶＥＧＦタンパク質に特異的に結合する有効量の本発明の抗体を、前記患者に投与することを含む。別のアプローチでは、本発明は、ＶＥＧＦを発現する腫瘍細胞の成長を阻害する方法を提供し、この方法は、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体を、腫瘍細胞の成長を阻害するのに有効な量で、患者に投与することを含む。本発明のＶＥＧＦ ｍＡｂはまた、ＶＥＧＦ抗原を発現している細胞の成長を選択的に阻害するかまたはその細胞を死滅させるための方法に使用してもよく、この方法は、細胞の成長を阻害するかまたはその細胞を死滅させるのに充分な量で、本発明のＶＥＧＦ抗体のイムノコンジュゲートまたはイムノトキシンを細胞に反応させることを含む。

【0199】

例えば、 コンジュゲーションされていない本発明の抗VEGF抗体 ［モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、ヒト化、完全ヒトのものおよびその断片 (例えば 組換えタンパク質)を含む］を、その抗体が疾患細胞上のVEGFに結合して、そのような細胞および腫瘍の成長阻害(その破壊を含む)を媒介するように、患者に導入してもよく、そのような阻害を媒介する機構としては、補体complement-mediated cyto溶解, 抗体依存性細胞性細胞毒性、 altering 〆 physiologic function of VEGF, および／または 〆 阻害 of ligand binding or シグナル伝達経路ｓ. In addition to コンジュゲーションされていない抗VEGF抗体ｓ, 断片s thereof, and 組換えの タンパク質s of 本発明, 抗VEGF抗体ｓ コンジュゲーションされ to toxic 剤ｓ such as リシン may also be used therapeutically to deliver 〆 toxic 剤 直接的に to VEGF-bearing 腫瘍 細胞ｓ and thereby destroy 〆 腫瘍.

【0200】

例えば、本発明のモノクローナル抗体を臨床で適用する１つの方法は、細胞の阻害／死滅活性（例えばＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性）を示す本発明のモノクローナル抗体を用いて、非修飾形態でそれらを投与することである。一実施形態では、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性を検出するために、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は、培養した^５１Ｃｒ標識の標的腫瘍細胞を４時間のインキュベーション時間にわたって溶解したものについて、試験することができる。標的細胞は、^５１Ｃｒを用いて標識してもよく、次いで、エフェクター細胞（リンパ球分離媒体を使用することにより精製されたヒトリンパ球の形態で）と抗体との混合物に数時間（例えば４時間）曝露することができ、その際には抗体を、例えば０．１mｇ／ｍＬと１０mｇ／ｍＬとの間で変化させた濃度で添加する。標的細胞からの^５１Ｃｒの遊離を、腫瘍細胞の溶解（細胞毒性）の証拠として測定してもよい。遊離可能な^５１Ｃｒの総量を測定して、単独でインキュベーションした標的細胞に比べた際に、モノクローナル抗体とエフェクター細胞とを併用して観察された標的細胞のパーセント死滅性として、ＡＤＣＣを算出してもよい。

【0201】

本発明の方法の実践では、ＶＥＧＦを細胞表面に発現する患部細胞の成長を阻害することが可能な抗ＶＥＧＦ抗体は、その患部細胞がＶＥＧＦを発現または過剰発現する本明細書に記載されるような疾患に罹っている患者に、治療有効量で投与される。本発明の抗ＶＥＧＦ ｍＡｂ療法の方法は、著しい患部細胞の成長阻害をｉｎ ｖｉｖｏでもたらすことがある。本発明の抗体療法の方法は、化学療法、放射線照射、および／または他の療法のレジメンと組み合わされることがある。

【0202】

患者は、患部細胞におけるＶＥＧＦの過剰発現の存在およびレベルについて、好ましくは、患部組織の免疫組織化学的評価、定量的ＶＥＧＦイメージング、または信頼性を以てＶＥＧＦ発現の存在および程度を標示することが可能な他の手法を用いて、評価されることがある。細胞生検または手術検体の免疫組織化学分析が、この目的のために好適であることがある。患部組織の免疫組織化学分析のための方法は、当技術分野に周知である。

【0203】

本発明の方法は、単一の本発明の抗ＶＥＧＦ抗体だけでなく、異なるエピトープを認識するものなど、異なる個別の抗ＶＥＧＦ抗体の組合せ、すなわち「カクテル」の投与を想定している。そのような組合せのｍＡｂは、相乗的な治療効果を示すことがある。さらに、抗ＶＥＧＦｍＡｂの投与は、他の治療剤と組み合わされることがあり、そのようなものとして様々な細胞毒性剤が挙げられるが、これらに限定されない。抗ＶＥＧＦｍＡｂは、コンジュゲーションされていない形態で投与されてもよいし、治療剤がそれにコンジュゲーションされていてもよい。

【0204】

本発明の方法の実践に使用される抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体は、所望のデリバリ方法に適した担体を含む医薬組成物に製剤化されていてもよい。適した担体としては、抗ＶＥＧＦｍＡｂを組み合わせた際に抗体の抗疾患機能を保持しかつ対象の免疫系に反応しない、任意の物質が挙げられる。例としては、以下に限定されないが、複数の標準的な医薬担体、例えば滅菌リン酸緩衝生理食塩水溶液などのいずれかが挙げられる。

【0205】

本願発明は、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体製剤を患部に投与するための、局所的または全身的な様々な方法を提供する。当技術分野での標準的な実践がそうであるように、本発明の組成物は、どの医薬的に許容可能な形態で対象に投与されてもよい。

【0206】

有効である可能性のある投与経路としては、以下に限定されないが、注射、例えば眼球内注射、静脈内、筋肉内、腹腔内、経口、吸入、および皮下での方法など、ならびに埋め込みポンプ、持続点滴、遺伝子治療、リポソーム、坐剤、局所接触、ベシクル、カプセル、生分解性ポリマー、ハイドロゲル、および制御放出パッチによることが挙げられる。担体と混ぜ合わされた本発明の組成物は、疾患部位、例えば眼に直接的に投与される滅菌溶液としてパッケージングされることがある。

【0207】

本発明によれば、本発明の組成物を投与することは、治療有効量の本発明の組成物を、例えば付随的なまたは連続的に、１つまたは複数の追加の本発明の組成物と共投与することを含むことがある。投与はまた、剤（複数可）の連続的放出（持続放出）を含むことがあり、例えば、剤（複数可）を持続放出カプセルまたは他の連続的放出材の中に包埋することがある。

【0208】

一般に、治療は、有効な用量での許容可能な投与経路による、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体の投与を含むことがある。投薬量は、当業者に一般に認識されている様々な要因に依存するものとなり、そのようなものとしては、以下に限定されないが、疾患のタイプおよび疾患の重症度、グレードまたはステージ、使用される本発明の抗ＶＥＧＦ抗体の結合親和性および半減期、患者におけるＶＥＧＦ発現の程度、所望の定常状態の抗体濃度のレベル、治療の頻度、ならびに、使用される場合は本発明の治療方法と併用で使用される化学療法剤の影響が挙げられる。典型的な１日用量は、約０．１から１００ｍｇ／ｋｇまでに及ぶことがある。適切な用量を規定する際の主要な決定要因は、ある特定の状況で治療的に有効とするのに必要なある特定の抗体の量である。疾患の阻害または後退を達成するために、反復投与が必要とされることがある。

【0209】

結合親和性とは、一般に、分子（例えば抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有結合による相互作用の強さの総和を指す。親和性は、当技術分野に公知の一般的な方法によって測定することができ、そのようなものとしては、本明細書に記載されるものが挙げられる。結合親和性を測定する種々の方法は、当技術分野に公知であり、そのいずれも本願発明の目的に使用することができる。

【0210】

ＶＥＧＦ ｍＡｂの直接的な投与も可能であり、ある種の状況で利点がある場合がある。例えば、黄斑変性症の治療のために、本発明のＶＥＧＦ抗体を、眼の黄斑部に内に直接的に注射することがある。

【0211】

本発明は、数多くのＶＥＧＦ抗原を細胞表面に発現する細胞の細胞活性（例えば細胞の増殖、活性化、または伝搬）を阻害するための方法を、さらに提供する。この方法は、細胞表面のＶＥＧＦ抗原がイムノコンジュゲートとの複合体を形成するように、本発明のイムノコンジュゲート（例えば異種または同種の混合物）を細胞に反応させることを含む。細胞表面のＶＥＧＦ抗原の数が多いほど、ＶＥＧＦ抗体複合体が数多く形成される。ＶＥＧＦ抗体複合体の数が多いほど、阻害される細胞活性が大きい。細胞活性の阻害により細胞の阻害または死が生じる際には、この方法によって、新生物のまたは新生物の状態などの疾患に罹っている対象を治療することができる。

【0212】

本発明は、ＶＥＧＦをその受容体またはＶＥＧＦパートナーとの結合から遮断することによってＶＥＧＦの生物活性を阻害するための方法を、さらに提供する。この方法は、ＶＥＧＦ−イムノコンジュゲートまたはＶＥＧＦ−抗体の複合体をもたらす条件下で、ある量のＶＥＧＦを本発明の抗体またはイムノコンジュゲートに接触させ、それによって、ＶＥＧＦをその受容体またはＶＥＧＦパートナーとの結合から遮断し、ＶＥＧＦの活性を阻害することを含む。

【0213】

別の実施形態では、本発明は、細胞を阻害するのに充分な量でいずれか１つまたは組合せの本発明のイムノコンジュゲートを細胞に反応させることによってＶＥＧＦ抗原を発現する細胞を選択的に阻害するための方法を提供する。そのような量としては、細胞を死滅させる量、または細胞の成長もしくは増殖を阻害するのに充分な量が挙げられる。前掲に議論されたように、用量および投薬のレジメンは、ＶＥＧＦに関連する治療される疾患または障害の性質、その集団、抗体が向けられる部位、および患者に依存するものとなる。

【0214】

医薬組成物
本願発明は、任意の新規の本発明の抗ＶＥＧＦ抗体を含む組成物を提供する。「医薬的に許容可能な担体」という言い回しは、その特定の投与経路に適したものとなる当業者に公知の任意の担体を指す。さらに、新規の本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は、組成物中に唯一の医薬的に活性な成分として製剤化されてもよいし、他の活性成分と組み合わされてもよい。

【0215】

本明細書の組成物は、１つまたは複数の本発明の新規の抗ＶＥＧＦ抗体を含むことがある。本発明の新規の抗ＶＥＧＦ抗体は、一実施形態では、非経口投与用の滅菌済みの溶液または懸濁液など、適した医薬調製物に製剤化されている。

【0216】

本組成物では、有効な濃度の１つまたは複数の本発明の新規の抗ＶＥＧＦ抗体は、適した医薬担体と混合されていることがある。本組成物中の本発明の抗ＶＥＧＦ抗体の量または濃度は、投与時に、治療される疾患または障害の症状のうち１つまたは複数を治療するか、防止するか、または寛解させる量をデリバリするのに有効である。

【0217】

一実施形態では、治療的に有効な投薬量によって、約０．１ｎｇ／ｍＬから約５０−１００μｇ／ｍＬまでの血清濃度の活性成分が生じることがある。本医薬組成物は、別の実施形態では、１日当たり体重キログラム当たり約０．００１ｍｇから約２０００ｍｇまでの化合物の投薬量をもたらすことがある。医薬単位剤形は、調製されて、約０．０１ｍｇ、０．１ｍｇ、または１ｍｇから約５００ｍｇ、１０００ｍｇ、または２０００ｍｇまで、および一実施形態では約５ｍｇから約５００ｍｇまでの活性成分、または単位剤形当たりの必須成分の組合せをもたらすことがある。

【0218】

一実施形態では、本組成物は、抗ＶＥＧＦ抗体またはその一部分もしくはバリアント、ポリソルベート２０、スクロース、塩化ナトリウム、および緩衝液を含む。一実施形態では、本組成物は、リン酸緩衝液を含む。一実施形態では、リン酸緩衝液は、ｐＨが５．０と６．０との間である。別の実施形態では、本組成物は、緩衝液（例えばヒスチジン緩衝液）を含む。一実施形態では、ヒスチジン緩衝液は、ｐＨが約５．０と６．５との間（好ましくは約ｐＨ６．０）である。別の実施形態では、本組成物は、クエン酸緩衝液を含む。別の実施形態では、本組成物は、クエン酸ナトリウム緩衝液を含む。一実施形態では、クエン酸ナトリウム緩衝液は、ｐＨが約５．０と６．５との間（好ましくは約ｐＨ６．０）である。

【0219】

一実施形態では、本組成物は、抗ＶＥＧＦ抗体またはその一部分もしくはバリアントを約２ｍｇ／ｍｌから約１００ｍｇ／ｍｌ）の濃度で含む。一実施形態では、本組成物は、ポリソルベート２０を０．１％から０．０４％の濃度で含む。一実施形態では、本組成物は、スクロースを１％から２０％の濃度で含む。一実施形態では、本組成物は、塩化ナトリウムを１０ｍＭから８０ｍＭの濃度で含む。一実施形態では、本組成物は、リン酸緩衝液を１０ｍＭから１００ｍＭの濃度で含む。一実施形態では、本組成物は、ヒスチジン緩衝液を５ｍＭから５０ｍＭの濃度で含む。一実施形態では、本組成物は、クエン酸ナトリウム緩衝液を５ｍＭから２０ｍＭの濃度で含む。

【0220】

一実施形態では、本組成物は、約５ｍｇ／ｍＬの濃度の抗ＶＥＧＦ抗体またはその一部分もしくはバリアント、０．０３％ポリソルベート２０、５％スクロース、４０ｍＭ塩化ナトリウム、および１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）を含む。別の実施形態では、本組成物は、約５ｍｇ／ｍＬの濃度の抗ＶＥＧＦ抗体またはその一部分もしくはバリアント、０．０３％ポリソルベート２０、５％スクロース、４０ｍＭ塩化ナトリウム、および１０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ５．８）を含む。一実施形態では、本組成物は、約５ｍｇ／ｍＬの濃度の抗ＶＥＧＦ抗体またはその一部分もしくはバリアント、０．０３％ポリソルベート２０、５％スクロース、４０ｍＭ塩化ナトリウム、および１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を含む。

【0221】

活性成分または剤（すなわち新規の本発明の抗ＶＥＧＦ抗体）は、１回投与されてもよいし、複数のさらに少ない用量に分割されて時間間隔をおいて投与されてもよい。正確な投薬量および治療期間が治療される疾患に依存し、公知の試験プロトコールを用いて、またはｉｎ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏの試験データからの外挿によって、実験的に決定されることがあることが理解される。濃度および投薬量の値はまた、軽減される状態の重症度に応じて変わり得ることにも留意されたい。どの特定の対象に対しても、特異的な投薬レジメンが、個々の要求と、本組成物を投与するかまたはその投与を管理する者の専門的な判断とに従って、時間をかけて調整されるべきであること、および本明細書に規定される濃度範囲が例示に過ぎず、特許請求の範囲にある組成物の実践の範囲を限定することを意図するものではないことが理解されよう。

【0222】

活性剤を混合または添加すると、結果として得られる混合物は、溶液、懸濁液、エマルションなどとなることがある。結果として得られる混合物の形態は、複数の要因に依存し、そのようなものとしては、意図される投与様式、および選択された担体またはビヒクル中の活性剤の溶解性が挙げられる。

【0223】

本医薬組成物は、ヒトおよび動物への投与のために、適した量の本発明の組成物または活性剤を含有する単位剤形で、例えば滅菌済みの非経口の溶液または懸濁液、注射用の溶液または懸濁液などで、提供される。注射剤、溶液、およびエマルションはまた、１つまたは複数の賦形剤を含有する。適した賦形剤は、例えば、ポリソルベート２０、スクロース、塩化ナトリウム、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、またはエタノールである。

【0224】

医薬的に投与可能な液体組成物は、例えば、上記に規定されたような活性剤および任意選択の医薬アジュバントを、例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、グリコール、エタノールなどの担体または賦形剤中に、溶解、分散、またはその他混合し、それにより溶液または懸濁液を形成することによって、調製することができる。所望に応じて、投与される医薬組成物はまた、少量の湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、ｐＨ緩衝剤などの非毒性の補助物質、例えば酢酸塩、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、ソルビタンモノライレート、酢酸トリエタノールアミンナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミン、および他のそのような剤を含有することもある。

【0225】

また、本発明内に包含されるのは、凍結乾燥粉末であり、これを投与用に溶液、エマルション、および他の混合物として再構成することができる。この凍結乾燥粉末を注射用に水で再構成することによって、非経口投与に使用するための製剤がもたらされる。再構成するために、この凍結乾燥粉末を滅菌水または他の適した担体に添加する。正確な量は、選択された化合物に依存する。そのような量は、実験的に決定することができる。これらの溶液、特に眼に用いることを意図するものは、適切な塩を用いて、ｐＨ約５から７の約０．０１％から１０％（体積％）の等張溶液として製剤化されることがある。

【0226】

キット
本発明の別の態様によれば、キットが提供される。本発明によるキットとしては、本発明の組成物を含むパッケージ（複数可）が挙げられる。

【0227】

「パッケージ」という言い回しは、本明細書に提示される化合物または組成物を含有する任意のベッセルを意味する。好適な実施形態では、パッケージを、箱または包みとすることができる。医薬製品をパッケージングする際に使用するためのパッケージ材は、当業者に周知である。医薬パッケージ材の例としては、以下に限定されないが、ブリスターパック、ボトル、チューブ、インヘラー、ポンプ、バッグ、バイアル、コンテナ、シリンジ、ボトル、および選択された製剤および意図される投与および治療の様式に適した任意のパッケージ材が挙げられる。

【0228】

このキットはまた、パッケージ内には含有されないがパッケージ外に付加される品目、例えばピペットを含有することができる。

【0229】

キットは、任意選択的に、本願発明の活性剤または組成物を、治療を必要とする状態にある対象に投与するための指示書を含有することがある。キットはまた、本明細書にある化合物の米国食品医薬品局などの規制当局により認可された使用のための指示書を含むことがある。キットは、任意選択的に、本願化合物についてのラベルまたは製品添付文書を含有することがある。パッケージ（複数可）および／または何らかの製品添付文書（複数可）は、それ自体が規制当局に認可されていることがある。キットは、パッケージ内に活性剤を固相でも液相（示されている緩衝液など）でも含むことがある。キットはまた、本方法を実施するのに用いる溶液を調製するための緩衝液と、一方のコンテナから別の方に液体を移すためのピペットとを含むことがある。

【0230】

キットはまた、任意選択的に、本明細書に記載されるような併用療法に使用するための１つまたは複数の他の組成物を含有することがある。ある実施形態では、パッケージ（複数可）は、静脈内投与のためのコンテナである。他の実施形態では、化合物が注射手段で提供される。

【0231】

本願発明は、本明細書に開示される実施形態による範囲に限定されず、それらの実施形態は、本発明の個別の態様のただ１つの説明として意図されるものであり、機能的に等価ないかなるものも、本発明の範囲内にある。本明細書に記載されるものに加えて、本発明のモデルおよび方法に施される様々な改変は、上述の記載および教示から、当業者に次第に明らかになり、本発明の範囲内に属することが同様に意図される。そのような改変または他の実施形態は、本発明の真の範囲および趣旨を逸脱することなく実践することができる。

【実施例】

【0232】

実施例１：
ＶＥＧＦに対する新規の合成抗体の同定および分子特性解析
全体のプロセスには、ファージディスプレイ技術を用いたＦａｂの選択、すなわちクローンの選択とそれに続いて最も結合親和性の高いクローンを選択するための複数回の親和性成熟が含まれる。得られた配列を、ＰｈｏＡベースのベクターにクローニングした後、大腸菌での発現、タンパク質の精製、および親和性の決定を行う。詳細なプロトコールを下記に示す。

【0233】

１．ファージディスプレイ技術
合成ファージライブラリーの構築は、天然に発生した抗体の構造的および機能的な特性、バクテリオファージ被覆タンパク質の構造とアセンブリ、バクテリオファージの生物学、および宿主細胞の生物学に基づく。そのような知識に基づき、合成のＦａｂ抗体断片をファージ表面に提示する感染性バクテリオファージを生産する。どの単一Ｆａｂファージディスプレイライブラリーでも、Ｆａｂ−ファージ被覆タンパク質キメラ融合タンパク質の合成Ｆａｂ抗体断片部分は、様々な配列またはランダム配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）ループが接合され得る特異的なヒトフレームワーク領域（ＦＲ）またはヒトコンセンサス配列ＦＲを有することがある。ＣＤＲが抗原との結合に関与することから、ファージをＶＥＧＦなどの抗原に対してスクリーニングして、ＶＥＧＦに結合する合成Ｆａｂファージを特定し、ゆえにＶＥＧＦとの結合に関与するＣＤＲを有するファージを選出する。選択されたＦａｂファージによるＶＥＧＦ結合の向上には、選択されたＣＤＲの定方向の変異を生成すること、およびさらに何巡かファージ選択を行うことが必要であることがある。あるいは、ＦＲ配列の定方向の変異生成を、特に、ストランド間のジスルフィド形成に関与するシステインを除くＣＤＲ配列に隣接するアミノ酸残基、および高度に保存されたアミノ酸、例えばヒトＩｇＧ１の重鎖ＦＲＨ４の不変のトリプトファンなどについて、実施することがある。

【0234】

フレームワーク領域またはＦＲの残基は、本明細書に画定される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。超可変残基またはＣＤＲ配列の指定が、ＣＤＲを特定するためのＫａｂａｔ法またはＩＭＧＴ（登録商標）法との間で異なる可能性があることから、フレームワーク領域の配列は、異なることがある。具体的には、Ｋａｂａｔ体系とＩＭＧＴ（登録商標）体系との間でＦＲ配列が、一致するか、重複するか、または一方もしくは他方に含有されることがある。

【0235】

アクセプターのヒトフレームワーク領域（ＣＤＲ配列のための）は、ヒト免疫グロブリンフレームワーク領域に由来するかまたはヒトコンセンサスフレームワーク領域に由来するＶＬまたはＶＨのフレームワーク領域のアミノ酸配列を含む。例えば、Ｋａｂａｔ体系を用いると、重鎖可変領域のヒトフレームワーク領域配列は：アミノ酸１位のグルタミン酸からアミノ酸３０位のフェニルアラニン（配列番号１）を含むＦＲＨ１、アミノ酸３６位のトリプトファンからアミノ酸４９位のアラニン（配列番号１）を含むＦＲＨ２、アミノ酸６７位のアルギニンからアミノ酸９８位のアルギニン（配列番号１）を含むＦＲＨ３、およびアミノ酸１１０位のトリプトファンからアミノ酸１２０位のセリン（配列番号１）を含むＦＲＨ４である。

【0236】

ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来するアクセプターのヒトフレームワーク領域は、その同じアミノ酸配列を有していてもよいし、アミノ酸配列の変化を含有していてもよい。好ましくは５個を超えない、好ましくは４個以下または３個以下のアミノ酸変化が、存在するかまたは作製される。

【0237】

一例、Ｋａｂａｔ体系を用いると、軽鎖可変領域のヒトフレームワーク領域配列は：アミノ酸１位のアスパラギン酸からアミノ酸２３位のシステイン（配列番号３）を含むＦＲＬ１、アミノ酸３５位のトリプトファンからアミノ酸４９位のチロシン（配列番号３）を含むＦＲＬ２、アミノ酸５７位のグリシンからアミノ酸８８位のシステイン（配列番号３）を含むＦＲＬ３、およびアミノ酸９８位のフェニルアラニンからアミノ酸１０７位のリジン（配列番号３）を含むＦＲＬ４である。

【0238】

同じＦａｂ重鎖配列（配列番号１）についてＩＭＧＴ（登録商標）法によって特定されるフレームワーク領域配列の場合、ＩＭＧＴ（登録商標）定義による重鎖可変領域のフレームワーク領域配列は：ＩＭＧＴ定義によるアミノ酸１位のグルタミン酸からアミノ酸２５位のセリン（配列番号１）を含むＦＲＨ１、ＩＭＧＴ定義によるアミノ酸３４位のイソロイシンからアミノ酸５０位のチロシン（配列番号１）を含むＦＲＨ２、ＩＭＧＴ定義によるアミノ酸５９位のチロシンからアミノ酸９６位のシステイン（配列番号１）を含むＦＲＨ３、およびＩＭＧＴ定義によるアミノ酸１１０位のトリプトファンからアミノ酸１２０位のセリン（配列番号１）を含むＦＲＨ４である。同じＦａｂ軽鎖配列（配列番号３）についてＩＭＧＴ（登録商標）法によって特定されるフレームワーク領域配列の場合、ＩＭＧＴ（登録商標）定義による軽鎖可変領域のフレームワーク領域配列は：ＩＭＧＴ定義によるアミノ酸１位のアスパラギン酸からアミノ酸２６位のセリン（配列番号３）を含むＦＲＬ１、ＩＭＧＴ定義によるアミノ酸３３位のバリンからアミノ酸４９位のチロシン（配列番号３）を含むＦＲＬ２、ＩＭＧＴ定義によるアミノ酸５３位のグルタミン酸からアミノ酸８８位のシステイン（配列番号３）を含むＦＲＬ３、およびＩＭＧＴ定義によるアミノ酸９８位のフェニルアラニンからアミノ酸１０７位のリジン（配列番号３）を含むＦＲＬ４である。

【0239】

可変領域において、ＦＲおよびＣＤＲの配置は：重鎖可変領域についてはＦＲＨ１−ＣＤＲＨ１−ＦＲＨ２−ＣＤＲＨ２−ＦＲＨ３−ＣＤＲＨ３−ＦＲＨ４、軽鎖可変領域についてはＦＲＬ１−ＣＤＲＬ１−ＦＲＬ２−ＣＤＲＬ２−ＦＲＬ３−ＣＤＲＬ３−ＦＲＬ４である。

【0240】

Ｆａｂファージディスプレイライブラリーは、繊維状ファージベクター系（Ｍ１３バクテリオファージなど）であるファージミドに構築され、ファージミドは、抗体軽鎖のコード配列と、被覆タンパク質に融合されたＦａｂ抗体断片重鎖のコード配列とを含有する。ライブラリーが構築されると、それは大腸菌内に形質転換され、ファージミドは、複製して（ｃｏｌＥ１などのｄｓＤＮＡ起点を用いて）、抗体の軽鎖と重鎖−被覆タンパク質融合タンパク質とを発現する。ヘルパーファージ（ＫＯ７）による共感染の際に、ファージミドは、ｓｓＤＮＡ起点を用いて、ビリオン内にパッケージングされた一本鎖ＤＮＡとして複製し、このビリオンは、ファージミド由来の重鎖−被覆融合タンパク質とヘルパーファージ由来の野生型被覆タンパク質とによって修飾されている。ヘルパーファージは、野生型被覆タンパク質の合成と、ファージミドのＭ１３／ｆ１ファージ起点を介した複製／パッケージングとに必要な遺伝情報を提供する。

【0241】

ファージミドのビリオンは、宿主細胞から押し出され、各ファージ粒子は、そのファージ粒子内にコード配列が被包されているユニークな抗体／Ｆａｂを提示する。これらのファージ粒子を、ＶＥＧＦタンパク質に曝露し、ＶＥＧＦ結合について選択し、その細菌宿主細胞に感染させることにより増幅することで、Ｆａｂの特性解析とＦａｂ核酸配列の単離とをさらに行うことが可能になる。

【0242】

ファージミドクローンは、さらに親和性成熟に供されるが、この親和性成熟は、抗原結合領域内のアミノ酸の組合せの微調整、ライブラリーの調製とその後のファージディスプレイライブラリーのスクリーニング、濃縮、およびバリデーションをさらに含む。何巡かの親和性成熟が、所望の親和性を有するクローンを作り出すのに必須である可能性がある。

【0243】

何十億ものＦａｂのプールから、所望の抗原タンパク質への最も高い親和性を有する僅か（〜１００）な結合体を、１巡目でスクリーニングする。これに続く何巡かの選択で、クローンのさらにいっそうの濃縮を抗原誘導方式で実施するが、ここで出願人は、１００個から、良好な親和性を有する最良の結合体を見出す（〜１０）。最良の親和性（ｎＭ）を有する最良のクローンを、次いで発現ベクター内にサブクローニングし、発現して、最良の産生量を有するクローンをスクリーニングにより見出す。良好な親和性と産生量とを有するクローンを選択し、本願に基づいて、親和性をｐＭの範囲にさらに向上させなければならない。

【0244】

基本ベクター骨格は、全てのＦａｂ構築物で同じである。変化はＣＤＲ内のみにある。３つのそのようなＣＤＲ領域がある。Ｌ鎖–ＣＤＲ−Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３とＨ鎖–ＣＤＲ−Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３である。これらのＣＤＲのうち１つまたは組合せを変化させてライブラリー中に何十億もの可能性を作り出す。

【0245】

２．ＰｈｏＡベースベクター中のＦａｂのクローニング
ＤＮＡ構築物２１４０ｂｐを遺伝子合成し、この構築物は、ｐｈｏＡプロモーター、クローン＃１２１（Ｆａｂ−Ａ５）のＦａｂコード配列、およびｒｒｎＢターミネーターの配列を含んでいた。構築物を、改変型ｐＢＲ３２２ベクター内にＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ部位でクローニングして、クローン＃１２１を生成した。続いて、クローン＃１２１を、１４５４ｂｐサイズのｔｅｔ^Ｒ耐性遺伝子を欠失させることによって改変して、クローン＃１３１を生成した。

【0246】

８番目から２０３番目の位置のアミノ酸領域に対応するＦａｂ−Ｆ８．ｙのＤＮＡ配列を遺伝子合成し、このＤＮＡ断片を、標準的なクローニング手法を用いてクローン＃１３１内に置き換えて、クローン＃２０１を作製した。クローン＃２０１から生じたＦａｂ２０１は、アミノ酸配列では、Ｆａｂ ＦＦ０３０４６−２に対し、成熟型カッパ軽鎖定常領域のアミノ酸１２３での単アミノ酸変化を除いて一致しているが、ここでは、Ｆａｂ ＦＦ０３０４６−２のグルタミン酸（図９Ｃを参照）が、クローン＃２０１ではセリンに変化している（図１６を参照）ことに留意されたい。クローン＃２０１に由来するＦａｂバリアント＃２１６は、同じセリンを成熟型カッパ軽鎖定常領域のアミノ酸１２３（図１６を参照）に有し、このセリンは、例えばアミノ末端分泌シグナルの延長した配列番号１６または配列番号１７に示されるような、プロセッシングされていない翻訳されたカッパ軽鎖のアミノ酸１４６に対応する。Ｆａｂ２１６について代替のコード配列が図１６に示されていることにも留意する。抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ２０１および抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ２１６の発現プラスミドの略図が、図１７および図１８に示されている。

【0247】

３．組換えのＦａｂの形質転換および発現
組換えＦａｂの形質転換を大腸菌Ｄｈ５αおよびＢＬ２１で行った。

【0248】

グリセロールストックの復活
−８０℃から出したグリセロールバイアルを、氷上に１０分間解凍する。５０μＬの１００ｍｇ／ｍＬからのカルベニシリンまたは１００ｍｇ／ｍＬアンピシリン、５０ｍＬのルリアブロス（ＬＢ）に添加する。７μＬの解凍したグリセロールストック培養物を取り、抗生物質を含む５０ｍＬのＬＢブロスに接種した。インキュベーターシェーカー中で３７℃、２１０ｒｐｍで一晩、培養物を成長させた。

【0249】

プラスミドの単離
一晩成長させた５ｍＬの培養物を取り、Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（カタログ番号：２７１０４）を用いてプラスミドを単離する。

【0250】

コンピテント細胞の調製：
凍結ストックから出した細菌を、適切な抗生物質（カルベンシリン／アンピシリン）と共にプレートに広げる。単一コロニーを拾い、抗生物質を含むＬＢ中で、６００ｎｍでのＯＤが０．４〜０．６に到達するまで細胞を成長させる。培養物を４０００ｇ、４℃で１０分間スピンダウンさせる。ペレットを４℃でＴＳＢの１／２０体積に再懸濁する。細胞を氷上で１０分間インキュベーションし、１０％滅菌グリセロールの最終濃度となるよう添加する。細胞を個別のチューブに分注し（１００ｕＬの細胞）、液体窒素またはドライアイス中で凍結する。チューブを−８０℃で貯蔵する。

【0251】

形質転換
希釈したＤＮＡを１．５ｍＬチューブ中で１０μＬの１×ＫＣＭと混合した。チューブを氷上で２〜５分間冷却した後、同じ体積のコンピテント細胞（１０ｕＬ）を添加した。チューブをさらに氷上で２０分間インキュベーションし、次いで、室温で１０分間インキュベーションした。２００ｕＬのＳｕｐｅｒ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｂｒｏｔｈ ｗｉｔｈ Ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＳＯＣ）またはＬＢ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を添加し、細胞を３７℃で１時間撹拌することによって回復させた。１００−２００ｕＬの上記培養物を取り、適切な抗生物質（カルベニシリン／アンピシリン）を含むＬＢアガロースプレート上で、３７℃で一晩成長させた。

【0252】

形質転換体からのマスター細胞バンクの調製
前接種物を調製する（１０ｍＬのＬＢ培地ｐＨ７．０＋１０μＬの１００ｍｇ／ｍｌストックからのカルベンシリン）。培養物を３７℃／２１０ｒｐｍで一晩成長させる。１ｍＬの一晩成長させた培養物を１００ｍＬの新鮮ＬＢ培地（１００ｍＬのＬＢ培地ｐＨ７．０＋１００μＬの１００ｍｇ／ｍｌストックからのカルベンシリン）中で継代培養する。培養物を、３７℃／２１０ｒｐｍで、ＯＤ_６００が０．４から０．６の間に到達するまで成長させる。培養物を滅菌条件下、４０００ｒｐｍでスピンする。ペレットを滅菌条件下、６ｍＬの滅菌ＬＢ培地ｐＨ７．０＋４ｍＬの５０％滅菌グリセロール中、６０：４０（成長させた培養物：グリセロール）の比で再懸濁する。多数のグリセロールストックを調製し、最初に−２０℃で貯蔵し、次いで後に−８０℃に移す。グリセロールストックを定期的に復活させる。

【0253】

前接種物の調製
大腸菌で新たに形質転換された２０１の単一コロニーを、ＬＢアガロースプレートから拾った。大腸菌ＢＬ２１−２０１を、カルベニシリン抗生物質（１０μｌ）を含有するＬＢブロス（１０ｍＬ）中に接種した。培養物を、オービタルシェーカー中で３７℃、２１０ｒｐｍで１６時間保った。培養物の６００ｎｍでのＯＤを１６時間後に確認した。

【0254】

最小培地での成長および誘導：
５００ｍＬの成長培地および生産培地を調製した。培地のｐＨを７．０に調整した。摂取前に、５００μＬのカルベニシリン（１００ｍｇ／ｍＬストックより）、５００μＬのチアミンＨＣＬ（１Ｍ滅菌ストックより）、２．５ｍＬの滅菌グルコース（４０％滅菌ストックより）、および３２０μＬのリン酸カリウム（１Ｍ ＫＨ_２ＰＯ_４より）を添加した。成長培地に８％の一晩成長培養物（前培養物）を接種した。成長培地中の培養物の初発のＯＤ（６００ｎｍ）、グルコース濃度、およびリン酸濃度を、同時に確認した。培養フラスコをオービタルシェーカー中、３７℃、２１０ｒｐｍで、ＯＤが２〜２．５の間に到達するまで保った。ＯＤ（６００ｎｍ）を確認して、成長培地中の培養物のグルコース濃度およびリン酸濃度を見積もった。培養物を４０００ｒｐｍ、＋２５℃で１５分間スピンした。細胞ペレットを滅菌条件で洗浄し、４０００ｒｐｍで１５分間スピンした。細胞ペレットを低リン酸濃度（０．０６４ｍＭ作業用濃度）．の５００ｍＬの生産培地に再懸濁した。生産培養フラスコを３０℃、２１０ｒｐｍで２０時間保った。同時に、生産培地中の培養物のＯＤ（６００ｎｍ）、ＷＣＷ、ＤＣＷ、グルコースおよびリン酸の濃度を分析した。発現した培養物を４３００ｇ、＋４℃で３０分間スピンした。

【0255】

Ｆａｂの精製
１００ｍＬの培養物からタンパク質を抽出した後のプロセス
１４０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含有する２０ｍＭリン酸緩衝液を用いて、細菌ペレットの溶解を行った。１００ｍＬの培養物から得た２０ｇのペレットに対し、４Ｌの溶解緩衝液を使用した。ペレットの洗浄は、２Ｌの溶解緩衝液を用いて行い、その際に、ペレットを再懸濁して、４℃、４，３００ｇで１５分間遠心分離した。次いで、ペレットを２Ｌの溶解緩衝液に４℃で再懸濁し、６５℃の水浴で５分間、予加熱した。短時間の混合ステップの後、ＴｒｉｔｏｎＸ１００を０．１％の比率で添加して、５分間混合した。次いで、懸濁液を水浴に移して６５℃で４０分間維持した後、溶解物を氷上で冷却した。

【0256】

溶解物を４，３００ｇで１０分間遠心分離し、上清を１７，０００ｇ、４℃で３０分間さらに清澄化することによって、ペレットの清澄化を行った。最終的な上清を０．４５µｍＰＥＳ膜フィルターに通して濾過した。濾過物をＣａｐｔｏ Ｌ（ＧＥ）親和性クロマトグラフィーに通して精製したが、そのクロマトグラフィーでは、２％スクロースをｐＨ２．０で含有する０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ緩衝液を用いてｆａｂを溶離した。溶離したｆａｂを、ｐＨ８．８の１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液を用いて直ちに中和した。中和したｆａｂをｐＨ６．０の２０ｍＭリン酸緩衝液に置換した後、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ ＥＴ Ｃｌｅａｎ Ｌ樹脂を通してエンドトキシンの除去を行った。精製画分は、ブラッドフォードアッセイによって定量的に、銀染色を用いた還元および非還元のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって定性的に分析し、活性タンパク質は、ＥＬＩＳＡを用いて分析した。エンドトキシンのレベルは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ ＬＡＬキットを用いて分析した。

【0257】

ブラッドフォード法を介した定量のためのＢＳＡ標準曲線（図１）は、以下のように行った。５０ｕｇ／ｍｌから５００ｕｇ／ｍｌまでの濃度を作製するために、ＢＳＡ試料を逐次的に希釈した。簡潔に述べれば、アッセイに用いるために、１０ｕｌの各標品を、実作業用ブラッドフォード試薬に混合し、室温で５分間インキュベーションして、マルチプレートリーダーにて吸光度を５９５ｎｍで測定した。

【0258】

表１：図１の標準曲線のプロットに使用された表

【表2】

【0259】

精製Ｆａｂの産生量の定量および活性の決定
攪拌フラスコ中の発現クローンからのおよび精製後のＦａｂの産生量の定量に用いるために。ルセンティスの標準曲線を作製し、細胞溶解物中およびカラムクロマトグラフィー（タンパク質精製）後の溶離物中のＦａｂの濃度の決定に用いた。

【0260】

定量的ＥＬＩＳＡのプロトコール
緩衝液を調製した［洗浄緩衝液（ＰＴ）、希釈緩衝液（ＰＢＴ）、およびブロッキング緩衝液］。ＶＥＧＦ−１２１（ヒトＶＥＧＦ−Ａ_１２１）を使用して、Ｎｕｎｃ９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐプレートをＰＢＳ中ウェル当たり終濃度５０ｎｇ／１００ｕＬで２時間、緩やかに攪拌しながら被覆した。ｈＶＥＧＦを被覆プレートから除去した。２００ｕＬのブロッキング緩衝液を添加して、プレートを緩やかに攪拌しながらＲＴで１時間、インキュベーションした。ブロッキング緩衝液をフィルターペーパー上に放り付けることによって除去した。プレートを２００ｕｌの洗浄緩衝液で３回洗浄した。２０ｕｇ／ｍＬのストック溶液から、ルセンティス（登録商標）（ラニビズマブ；ＮｏｖａｒｔｉｓおよびＲｏｃｈｅ）を希釈緩衝液中５００ｎｇ／ｍＬに希釈した。５００ｎｇ／ｍＬの希釈ルセンティス（登録商標）を用いて、ルセンティス（登録商標）の一通りの逐次希釈を実施して、２００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、…、０．３９ｎｇ／ｍＬの希釈ルセンティス（登録商標）を得た。１００ｕＬの逐次希釈ルセンティス（登録商標）をウェルに３連で添加し、プレートを緩やかに攪拌しながらＲＴで１時間、インキュベーションした。プレートのウェル中の溶液を叩き捨て、プレートを２００ｕＬの洗浄緩衝液で３×洗浄した。１００ｕＬの抗カッパ軽鎖抗体−ＨＲＰコンジュゲート（希釈緩衝液中１：５０００）を添加して、ＲＴで１時間インキュベーションした。プレートを洗浄緩衝液で３×、ＰＢＳで２×洗浄し、フィルターペーパー上に放り付けて緩衝液を完全に除去した。１００ｕＬのＴＭＢ基質を各ウェルに添加し、比色反応を５分間展開させた。１００ｕＬの１Ｎ硫酸を添加して反応を停止した。プレートをマルチモードプレートリーダーにて４５０ｎｍで読んだ。未知の試料については、いくつかの希釈物を作製し、標準曲線（図２および表２）を用いて値を外挿する。

【0261】

表２：図２の標準曲線（定量的ＥＬＩＳＡ）のプロットに使用された値

【表3】

【0262】

親和性アッセイ
親和性アッセイのステップは以下の通りである。緩衝液を調製した［洗浄緩衝液（ＰＢＳＴ）、希釈緩衝液（ＰＢＴ）、ブロッキング緩衝液、および停止緩衝液］。Ｎｕｎｃ３８４ウェルプレートのウェルを、ＰＢＳ中ウェル当たり終濃度５０ｎｇ／２５ｕＬでｈＶＥＧＦを用いて、１５０ｒｐｍ、ＲＴで２時間被覆した。２時間後、ｈＶＥＧＦを被覆プレートから除去した。７５ｕＬのブロッキング緩衝液を添加して、２００ｒｐｍ、ＲＴで緩やかに撹拌しながら１時間インキュベーションした。ブロッキング緩衝液を除去して、プレートを７５ｕＬのＰＢＳＴで６×洗浄し、ティッシュタオル上に叩き付けて乾燥した。その間に、付着防止加工プレート／Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ中で、ｈＶＥＧＦの開始濃度２×（１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ…）をＰＢＴ中に調製し、その結果、ＶＥＧＦの終濃度の×を５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ…）とした。２００ｐＭルセンティス（２×）のＦａｂをＰＢＴ中に調整し、結果として終濃度Ｘを１００ｐＭとした。５０ｕＬの１００ｐＭ ｈＶＥＧＦ（２×）（１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ…）を５０ｕＬの２００ｐＭルセンティス（２×）に混合して、結果として終濃度Ｘを（５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５…）とし、２００ｒｐｍ、ＲＴで緩やかに撹拌しながら１時間インキュベーションした。同様のステップをＦａｂ分子についても続けて行った。２５ｕＬのこの逐次希釈ｈＶＥＧＦ／Ｆａｂ混合物をプレートに添加し、２００ｒｐｍ、ＲＴで緩やかに撹拌しながら３０分間インキュベーションした。プレートに固定化されていない一次抗体を除去し、プレートを７５ｕＬのＰＢＳＴで６×洗浄し、ティッシュタオル上に叩き付けて乾燥した。２５ｕＬの抗カッパ軽鎖ＨＲＰ（ＰＢＴ中１：５０００）を添加して、２００ｒｐｍ、ＲＴで緩やかに撹拌しながら４５分間インキュベーションした。プレートに固定化されていない二次抗体を除去し、プレートを各ウェル中７５ｕＬのＰＢＳＴで６×、ＰＢＳで２×洗浄し、ティッシュタオル上に叩き付けて乾燥した。２５ｕＬのＴＭＢ基質を添加し、２００ｒｐｍ、ＲＴで緩やかに撹拌しながら５分間インキュベーションした。２５ｕＬの１Ｎ硫酸をプレートに添加して、反応を停止した。プレートをマルチモードプレートリーダーにて４５０ｎｍで読んだ（図３および表３を参照）。

【0263】

表３

【表4】

【0264】

ｈＶＥＧＦ−１６５ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ＥＬＩＳＡヒトＶＥＧＦイムノアッセイキット（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いた競合的ＥＬＩＳＡ
簡潔に述べれば、１０ｐＭのｈＶＥＧＦ−１６５を、図の凡例に記載されるような抗ＶＥＧＦ抗体の逐次希釈物と共にインキュベーションした。結合溶液中にいくらかの非結合のｈＶＥＧＦ−１６５が共存する予め形成させたｈＶＥＧＦ−１６５／抗ＶＥＧＦ抗体複合体を、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ＥＬＩＳＡヒトＶＥＧＦイムノアッセイ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．；カタログ番号：ＳＶＥ００）に提供されるようなヒトＶＥＧＦに特異的なモノクローナル抗体を被覆した９６ウェルポリスチレンマイクロプレートに移す。プレートに結合しているｈＶＥＧＦ−１６５を、セイヨウワサビペルオキシダーゼにコンジュゲーションされたポリクローナル抗ｈＶＥＧＦ抗体と、色素源としてテトラメチルベンジジンとを用いて検出して、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）アッセイキットに提供されるようなプレートに結合しているｈＶＥＧＦ−１６５を定量する。データから算出されたＫｄを、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて５パラメーターの非対称モデルにフィッティングした。

【0265】

以下は、プロモーター−ｐｈｏＡ、Ｆａｂ−Ｆ８．ｙ、およびターミネーター−ｒｒｎＢのコード配列である。

【0266】

プロモーター−ｐｈｏＡ
GACCAACAGCGGTTGATTGATCAGGTAGAGGGGGCGCTGTACGAGGTAAAGCCCGATGCCAGCATTCCTGACGACGATACGGAGCTGCTGCGCGATTACGTAAAGAAGTTATTGAAGCATCCTCGTCAGTAAAAAGTTAATCTTTTCAACAGCTGTCATAAAGTTGTCACGGCCGAGACTTATAGTCGCTTTGTTTTTATTTTTTAATGTATTTGTAACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTATGTAGAGGTTGAGGTGATTTT（配列番号１５）

【0267】

Ｆａｂ−Ｆ８．ｙのコード配列
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGCCGCCTACGGCCGCGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACAAAGCATCCGAACTCTACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTCATTATTCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA（配列番号１６）

【0268】

ターミネーター−ｒｒｎＢ
CGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACATCCATGCGTTAACGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGGAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGTGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAACTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTT（配列番号１９）

【0269】

ｐＢＲ３２２のテトラサイクリン耐性遺伝子を欠失している、ヌクレオチド１３５３位から４３６１位までのｐＢＲ３２２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｊ０１７４９．１）の核酸配列
GAATGCGCAAACCAACCCTTGGCAGAACATATCCATCGCGTCCGCCATCTCCAGCAGCCGCACGCGGCGCATCTCGGGCAGCGTTGGGTCCTGGCCACGGGTGCGCATGATCGTGCTCCTGTCGTTGAGGACCCGGCTAGGCTGGCGGGGTTGCCTTACTGGTTAGCAGAATGAATCACCGATACGCGAGCGAACGTGAAGCGACTGCTGCTGCAAAACGTCTGCGACCTGAGCAACAACATGAATGGTCTTCGGTTTCCGTGTTTCGTAAAGTCTGGAAACGCGGAAGTCAGCGCCCTGCACCATTATGTTCCGGATCTGCATCGCAGGATGCTGCTGGCTACCCTGTGGAACACCTACATCTGTATTAACGAAGCGCTGGCATTGACCCTGAGTGATTTTTCTCTGGTCCCGCCGCATCCATACCGCCAGTTGTTTACCCTCACAACGTTCCAGTAACCGGGCATGTTCATCATCAGTAACCCGTATCGTGAGCATCCTCTCTCGTTTCATCGGTATCATTACCCCCATGAACAGAAATCCCCCTTACACGGAGGCATCAGTGACCAAACAGGAAAAAACCGCCCTTAACATGGCCCGCTTTATCAGAAGCCAGACATTAACGCTTCTGGAGAAACTCAACGAGCTGGACGCGGATGAACAGGCAGACATCTGTGAATCGCTTCACGACCACGCTGATGAGCTTTACCGCAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAAGAATTC

【0270】

実施例２
第１世代の抗ＶＥＧＦ Ｆａｂの選択−ナイーブ抗体ライブラリーの選択と種間交差反応性と選択されたＦａｂの特異性
抗体断片（Ｆａｂ）ファージライブラリーＦ（H. Persson, Et. al., J Mol Biol, vol. 425, no. 4, pp. 803–811, 2013.）を、Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ（カタログ番号１００−２０Ａ）から得た組換えヒト血管内皮成長因子（ｈＶＥＧＦ）１２１に対して選択した。Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ（カタログ番号４５０−３２）から得たマウスＶＥＧＦ（ｍＶＥＧＦ）とｈＶＥＧＦに対する結合について、および抗体の結晶化可能断片（Ｆｃ）とウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に対する結合のないことについて、Ｆａｂをスクリーニングした。総計７種のＦａｂを選択し、そのうち６種（ＦＦ０１２４−１、ＦＦ０１２４−３、ＦＦ０１２４−４、ＦＦ０１２４−５、ＦＦ０１２４−６、およびＦＦ０１２４−７）は、ｈＶＥＧＦとｍＶＥＧＦの両方に結合するが、ＦｃおよびＢＳＡには結合しない。これらのＦａｂのｈＶＥＧＦに対する親和性を、Ｆａｂ−ＥＬＩＳＡによって見積もった（図４）。

【0271】

ＦａｂがｈＶＥＧＦ受容体ＦＬＴに対するｈＶＥＧＦの結合性を遮断する能力と親和性の順位
ＦＬＴは、天然のＶＥＧＦ受容体の１つである。ＦＬＴと予めインキュベーションした際に、６種のＦａｂが小さくｈＶＥＧＦと結合するが（図５）、このことは、６種のＦａｂとＦＬＴとが、ｈＶＥＧＦ上に重複した結合部位を有し、それらがｈＶＥＧＦに対するＦＬＴの結合を阻害する可能性を有することを示唆する。５種のＦａｂを鋳型として使用して、ＦＦ０１２４−１配列、ＦＦ０１２４−３配列、ＦＦ０１２４−４配列、ＦＦ０１２４−６配列、およびＦＦ０１２４−７配列をベースにしたライブラリーを作製した。これらのライブラリーを、ｈＶＥＧＦに対する親和性の高さについて選択した。

【0272】

第２世代の抗ＶＥＧＦ Ｆａｂの選択−第１世代の抗ＶＥＧＦ抗体の親和性成熟
次世代のライブラリーは、Ｆａｂ ＦＦ０１２４−１、ＦＦ０１２４−３、ＦＦ０１２４−４、ＦＦ０１２４−６、およびＦＦ０１２４−７をベースにした。各ライブラリーの多様性は、１×１０^９から４×１０^９に及んだ。５つのライブラリーを、既に記載されたようにプールし（多様性の総計１０^１０）生産した。次いで、プールしたＦａｂ−ファージライブラリーを選択し、見積もった親和性によって順位付けした選択クローンの配列を図６に報告する。１０ｎＭの一点での競合ＥＬＩＳＡに基づくと、Ｆａｂ ＦＦ０１５８−Ｃ４、ＦＦ０１５８−Ｆ１１、およびＦＦ０１５８−Ｃ１１は、ｈＶＥＧＦに最も低い親和性で結合する。これらは、既に記載されたように、細菌中で可溶性タンパク質として生産されたものである。溶液中のｈＶＥＧＦに対する親和性を、競合的Ｆａｂ−ＥＬＩＳＡによって測定した（図７）。

【0273】

ＦＦ０１５８−Ｃ４およびＣ１１の生産の収量は、通常観察されるよりも５倍から１０倍低かった。この生産収量の低下にどのアミノ酸位置が関与するのかを特定するため、出願人らは、ＦＦ０１５８−Ｃ４およびＦＦ０１５８−Ｃ１１のＣＤＲ配列の１つ１つを、収量の高いＦａｂである抗マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）抗体のＣＤＲ配列に置き換えた。ＣＤＲ−Ｈ１とＣＤＲ−Ｈ２の両方が、抗−ＭＢＰ ＦａｂのＣＤＲの各配列に戻して変異させた際に、ＦＦ０１５８−Ｃ４の生産の収量を通常のレベルに回復した。

【0274】

第３世代の抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ−第２世代の抗ＶＥＧＦ抗体の親和性成熟と収量の向上
ＣＤＲ−Ｈ１またはＣＤＲ−Ｈ２の変異は、ＦＦ０１５８−Ｃ４の生産収量を向上できることから、出願人らは、ＣＤＲ−Ｈ１およびＣＤＲ−Ｈ２に焦点を合わせた多様性を有する２種の異なるライブラリーを作出した。ｐＴａｃプロモーターと、重鎖とｐＩＩＩコード配列の間のアンバー終止とを有する抗−ＭＢＰＦａｂファージミドを用いて、ライブラリーを造成した。このフォーマットでは、Ｆａｂは、アンバーサプレッサー細菌株で発現された際にはファージ上に提示され、非アンバーサプレッサー細菌株で発現された際には可溶性形態で分泌される。ファージにより提示されたＦａｂを親和性について選択したのに対し、分泌されたＦａｂをタンパク質収量についてスクリーニングした。

【0275】

Ｆａｂを提示するファージ粒子を作出するために、ＳＲ３２０によるエレクトロポレーション後に生じたファージを、アンバー終止サプレッサー株Ｏｍｎｉｍａｘ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内に感染させた。９×１０^９の多様性を持つライブラリーを、ｈＶＥＧＦ−１２１との結合について選択し、クローンを生産収量の向上について、小規模の細菌培養でスクリーニングした。興味深いことに、最も収量が向上した２種のＦａｂ（Ｆａｂ ＦＦ０１８８−Ｈ５／ＦＦ０１０８８−Ｂ１０およびＦＦ０１８８−Ｆ１２）は、重鎖のＣＤＲ−Ｈ１［Ｋａｂａｔ（登録商標）ナンバリングで定義される際の］にフェニルアラニンからヒスチジンへのアミノ酸変異を有する。３１位のフェニルアラニン残基（Ｆａｂ ＦＦ０１８８−Ａ９およびＦＦ０１８８−Ａ２）は、図７に示されるように、大きな収量の向上（それぞれ２倍および３倍の向上）を生じない。熱安定性は、３種全てのＦａｂで一致する：ＦＦ０１５８−Ｃ４、ＦＦ０１８８−Ｆ１２、およびＦＦ０１８８−Ｈ５：７４．５℃。

【0276】

第４世代の抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ―第３世代の抗ＶＥＧＦ抗体の親和性成熟と収量の向上
収量の向上した抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ ＦＦ０１８８−Ｈ５の親和性を向上させるために、出願人らは、ＦＦ０１８８−Ｈ５配列を鋳型として有する新しいライブラリーを設計した。多様化させたＣＤＲの終止コドンを鋳型に追加して、２つのライブラリーの親配列の数を限定した。

【0277】

ライブラリーの多様性は、６×１０^９であった。ファージライブラリーをアンバーサプレッサー株Ｏｍｎｉｍａｘ（商標）で増幅して、ファージにより提示されたＦａｂを生じることができるようにした。次いで、ライブラリーをｈＶＥＧＦ−１２１に対して選択し、選択した６４クローンを、一点での競合的ファージ−ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。１ｎＭ ｈＶＥＧＦの競合の後に最も低い残りの結合を示した２０クローンを特性解析に供した（図８は、ユニークな９クローンの配列とさらに別の特性解析を示す）。ＦＦ０１１７−Ａ５は、リットル当たり５．４ｍｇの収量、ｈＶＥＧＦに対する８０＋／−４０ｐＭの親和性、７７℃のＴｍを有する。ＦＦ０１１７−Ａ５は、親和性および熱安定性に関してラニビズマブより優れている。すなわち、ＦＦ０１１７−Ａ５の競合的Ｆａｂ−ＥＬＩＳＡにおける親和性は、ラニビズマブよりも４倍から１５倍高く、ＦＦ０１１７−Ａ５のＴｍは、３．５℃高かった。

【0278】

第５世代の抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ―第４世代の抗ＶＥＧＦ抗体の親和性成熟と収量の向上
抗ＶＥＧＦ ＦａｂＦＦ０１１７−Ａ５の親和性をさらに向上させるために、出願人らは、ＦＦ０１１７−Ａ５配列を有する新しいライブラリーを鋳型として設計した。すなわち、ＦＦ０１１７−Ａ５を変異させて、ＣＤＲ−Ｌ１およびＣＤＲ−Ｌ２に終止コドンを導入し、ＦａｂのＨＣのＣ末端終端をコードする配列を改変し、二価の提示に代えて一価の提示を可能にした。ライブラリーの多様性は、６×１０^９である。１０^１０個のファージ粒子を使用して、５００ｍＬのアンバーサプレッサー株Ｏｍｎｉｍａｘ（登録）の培養物を感染させ、Ｆａｂ提示ファージ粒子を作製した。

【0279】

ライブラリーＦＦ０１１５９−１を選択し、ｈＶＥＧＦとの結合を示すＦａｂ−ファージクローンを配列解析し、可溶性Ｆａｂ（図９）として生産した。ライブラリーＦＦ０１１５９−１を、ＣＤＲ−Ｌ２（Ｋａｂａｔ）の端部の近辺に１残基の欠失を伴って設計したため、選択されたＦａｂであるＦＦ０３０３３−４およびＦＦ０３０３３−８は、既に欠失していたチロシン残基を欠失位置に再挿入されるように変異誘発されていた。結果として得られたＦａｂを、ＦＦ０３０４６−１およびＦＦ０３０４６−２と命名した。Ｆａｂ ＦＦ０３０４６−２のＣＤＲ配列、熱安定性、生産収量、およびｈＶＥＧＦに対する結合親和性を、図９に示す。ＦＦ０３０４６−２ ＦａｂがｈＶＥＧＦ依存的なヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）増殖を遮断する能力を、図１０に報告する。２６０ｐＭのｈＶＥＧＦ−１６５をＨＵＶＥＣ増殖アッセイで使用した。ＦＦ０３０４６−２（２００ｐＭ＋／−１０ｐＭ）のＥＣ５０は、アッセイに使用したｈＶＥＧＦ−１６５の濃度を下回ったが、このことは、ＦＦ０３０４６−２のＥＣ５０が、このＨＵＶＥＣアッセイによって実際には過小評価された可能性があることを意味する。ｈＶＥＧＦに対するＦＦ０３０４６−２ Ｆａｂの親和性を、溶液中でも測定した。ｈＶＥＧＦ−１６５を使用して、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅアッセイも用いて検出した。これによって、出願人らは、ｈＶＥＧＦの作業用濃度を５ｐＭという低いものとすることが可能になった（図１１）。このアッセイでは、ｈＶＥＧＦ−１６５に対するＦＦ０３０４６−２の親和性は、ラニビズマブをはるかに下回っている（９０ｐＭ＋／−２０ｐＭ対３９０ｐＭ＋／−５０ｐＭ）。

【0280】

抗ＶＥＧＦのｓｃＦｖおよびＦａｂのＣ末端Ｆｃ融合体
次いで、出願人らは、ＦＦ０３０４６−２のｓｃＦｖまたはＦａｂのバージョンをヒトＦｃのＣ末端に融合している。この融合タンパク質は、ＦｃのＣ末端に融合されたＦａｂ／ｓｃＦｖの１つ１つに単一のＶＥＧＦ分子をしっかりと留める能力に起因してさらに低いクリアランスとさらに高い親和性とを有するものと、出願人らは予想している。ＦｃのＮ−末端をｓｃＦｖまたはＦａｂに融合して、他の目的のタンパク質に結合させることができることがそうであるように、これによって、多特異性を持つ実体の生成が容易なものとなる。

【0281】

ＦａｂおよびｓｃＦｖとＦｃとの融合体の配列を図１２および図１３にそれぞれ示す。他の抗ＶＥＧＦタンパク質に比べた際のｈＶＥＧＦ−１６５に対するＦａｂおよびｓｃＦｖの融合体の親和性を、図１４に示す。ｈＶＥＧＦに対するＦＦ０３０７７−４およびＦＦ０３０９２−１の親和性は、Ｆａｂ ＦＦ０３０４６−２と同様であった。ＦａｂＦＦ０３４６−２の完全長ＩｇＧバージョン（ＦＦ０３０９２−３）の配列を、図１５に示す。

【0282】

合わせると、ＦＦ０３０９２−１、ＦＦ０３０７７−４、およびＦＦ０３０４６−２は、異なるｉｎ ｖｉｖｏ効能に変換することができた異なる薬物動態的プロファイルを有することが可能であった、異なる３種の抗ＶＥＧＦの実体である。ＦＦ０３０４６−２の溶解性および生産の収量をさらに向上させるために、いくつかのバリアント（例えば実施例３に示される配列）を、生産収量、溶解性およびｈＶＥＧＦ結合親和性について試験するように設計した。

【0283】

実施例３：
Ｙバリアントの配列
バリアント２０１
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGCCGCCTACGGCCGCGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACAAAGCATCCGAACTCTACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTCATTATTCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA（配列番号２１）

【0284】

バリアント２０２
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGCCGCCTACGGCCGCGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACAAAGCATCCGAACTCGACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTCATTATTCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA（配列番号２２）

【0285】

バリアント２０３
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGCCGCCTACGGCCGCGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACAAAGCATCCGATCTCTACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTCATTATTCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA（配列番号２３）

【0286】

バリアント２０４
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGCCGCCTACGGCCGCGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACAAAGCAGACGAACTCTACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTCATTATTCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA（配列番号２４）

【0287】

バリアント２０５
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGCCGCCTACGGCCGCGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACAAAGATTCCGAACTCTACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTCATTATTCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA（配列番号２５）

【0288】

バリアント２０６
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGCCGCCTACGGCCGCGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACGATGCATCCGAACTCTACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTCATTATTCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA（配列番号２６）

【0289】

バリアント２０７
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGCCGCCTACGGCCGCGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTGACAAAGCATCCGAACTCTACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTCATTATTCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA（配列番号２７）

【0290】

バリアント２０８
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCGATGCCAGTCAGGCCGCCTACGGCCGCGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACAAAGCATCCGAACTCTACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTCATTATTCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA（配列番号２８）

【0291】

バリアント２０９
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGCCGCCTACGGCCGCGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACAAAGCATCCGAACTCTACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTCATTATTCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA（配列番号２９）

【0292】

バリアント２１２
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGCCGCCTACGGCCGCGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACAAAGCATCCGAACTCTACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTCATTATTCTATAGACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA（配列番号３０）

【0293】

バリアント２１３
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGCCGCCTACGGCCGCGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACAAAGCATCCGAACTCTACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTCATTATGATATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA（配列番号３１）

【0294】

バリアント２１４
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGCCGCCTACGGCCGCGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACAAAGCATCCGAACTCTACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTCATGATTCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA（配列番号３２）

【0295】

バリアント２１５
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGCCGCCTACGGCCGCGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACAAAGCATCCGAACTCTACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTGATTATTCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA（配列番号３３）

【0296】

バリアント２１６
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGCCGCCTACGGCCGCGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACAAAGCATCCGAACTCTACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTAGATCATTATTCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA（配列番号３４）

【0297】

バリアント２１７
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGACGCCTACGGCCGCGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACAAAGCATCCGAACTCTACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTCATTATTCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA（配列番号３５）

【0298】

バリアント２１８
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGCCGCCGACGGCCGCGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACAAAGCATCCGAACTCTACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTCATTATTCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA（配列番号３６）

【0299】

バリアント２１９
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGCCGCCTACGACCGCGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACAAAGCATCCGAACTCTACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTCATTATTCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA（配列番号３７）

【0300】

バリアント２２０
ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGCCGCCTACGGCGACGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACAAAGCATCCGAACTCTACGCCGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACGTGGCTGGTATCTGTTCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATTCACAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAAAAACATAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAATACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCGATTTATTTCATTATTCTATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCATACATTTACCCGTCTTATGGCTATACTTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCCATGCGTGGTATTATGGGTGGGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAA（配列番号３８）

【0301】

上記のＹバリアントの核酸配列によってコードされる免疫グロブリン軽鎖および重鎖の断片を、Ｋａｂａｔ体系またはＩＭＧＴ（登録商標）体系によって画定されるＣＤＲと併せて、図４、図６〜図９および図１２〜図１６に示す。

【0302】

クローン＃２０１によって生産されるＦａｂをベースにしたＦａｂバリアントは、下記の表４に示されるように、ＶＥＧＦ−１６５に対し種々の結合親和性を示した。バリアントのうち２種（Ｓｌ．Ｎｏ．３および９）は、ヒトＶＥＧＦ−１６５アイソフォームに対してクローン＃２０１の出発のＦａｂよりも高い親和性を示し、このことは、ＶＥＧＦに対するＦａｂのＫｄのいっそうの向上が得られる可能性があることを標示し、これら２種のバリアントが約１２ｐＭおよび１４ｐＭというＫｄ値を有することにある通りである。

【0303】

クローン＃２０１の変異誘発に由来するＦａｂバリアント２１６は、重鎖のＣＤＲ１配列［ＩＭＧＴ（登録商標）法によって画定される際の］でのフェニルアラニン残基からアスパラギン酸残基への単アミノ酸変化を有し、その結果、クローン＃２０１由来のＦａｂ２０１のＣＤＲ−Ｈ１であるＧＦＤＬＦＨＹＳは、Ｆａｂバリアント２１６のＣＤＲ−Ｈ１であるＧＦＤＬＤＨＹＳとなる。図１９および図２０および表４に示されるように、Ｆａｂ２１６でのフェニルアラニンからアスパラギン酸への変化の存在によって、ＶＥＧＦに対するその結合親和性が、親Ｆａｂ２０１に比べて僅かに低減する（Ｆａｂ２１６についてのＫｄがおよそ３５＋４ｐＭであるのに対し、Ｆａｂ２０１について２５＋２ｐＭである；表４を参照されたい）が、Ｆａｂ２０１のように、Ｆａｂ２１６の解離定数Ｋｄは、ルセンティスのＫｄよりも約５〜１６×低い（図１９および図２０を参照されたい）。

【0304】

表４：クローン＃２０１のバリアントのＫｄ値

【表5】

【0305】

Ｙバリアントについての配列のアラインメントを、下記の表５ａ〜表５ｄに示す。

【0306】

表５ａ
右側の段に標示されるバリアント２０１〜２２０の軽鎖の多重配列アラインメント［ＩＭＧＴ（登録商標）に従って画定されるＣＤＲ配列を下線表示する］

【表6】

【0307】

表５ｂ
右側の段に標示されるバリアント２０１〜２２０の重鎖の多重配列アラインメント［ＩＭＧＴ（登録商標）に従って画定されるＣＤＲ配列を下線表示する］

【表7】

【0308】

表５ｃ
右側の段に標示されるバリアント２０１〜２２０の軽鎖の多重配列アラインメント［Ｋａｂａｔに従って画定されるＣＤＲ配列を下線表示する］

【表8】

【0309】

表５ｄ

【表9】

【0310】

実施例４：
製剤１は以下の賦形剤を含む。０．０３％のポリソルベート２０、５％のスクロース、４０ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのリン酸緩衝液、および５．８のｐＨ。代替的な実施形態では、ポリソルベート２０を約０．１％から０．０４％の範囲で使用することがある。さらに、スクロースを約１％から約２０％の範囲で使用することがある。塩化ナトリウムを約１０から約８０ｍＭの範囲で使用することがある。リン酸緩衝液を約１０から約１００ｍＭの範囲で使用することがある。また、ｐＨを約５から６の範囲とすることがある。

【0311】

製剤２は以下の賦形剤を含む。０．０３％のポリソルベート２０、０．０５％のスクロース、４０ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのヒスタジン（histadine）緩衝液、および５．５のｐＨ。代替の実施形態では、ポリソルベート２０を約１％から約２０％の範囲で使用することがある。さらに、スクロースを約１％から約２０％の範囲で使用することがある。塩化ナトリウムを約１０から約８０ｍＭの範囲で使用することがある。ヒスチジン緩衝液を約５から約５０ｍＭの範囲で使用することがある。また、ｐＨを約５から５．５の範囲とすることがある。

【0312】

製剤３は以下の賦形剤を含む。０．０３％のポリソルベート２０、０．０５％のスクロース、４０ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液、および５のｐＨ。代替の実施形態では、ポリソルベート２０を約０．１％から０．０４％の範囲で使用することがある。さらに、スクロースを約１％から約２０％の範囲で使用することがある。塩化ナトリウムを約１０から約８０ｍＭの範囲で使用することがある。クエン酸ナトリウム緩衝液を約５から約２０ｍＭの範囲で使用することがある。また、ｐＨを約５から５．５の範囲とすることがある。

【0313】

実施例５：
バリアント２０１の生化学的な説明
バリアント２０１は、図２３および図２４に示されたヒト抗ＶＥＧＦ可変ドメインを含むＦａｂ抗体であり、最初に融合タンパク質（配列番号１６）として生産された後、プロセッシングされて２３アミノ末端分泌シグナルを除去され、成熟Ｆａｂ２０１抗体断片を生じ、この断片は、図２３に示された重鎖の可変領域−ＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域の部分と、図２４に示されたカッパ軽鎖可変領域−カッパ軽鎖定常領域とを有する。ルセンティスのような他の既知の抗ＶＥＧＦ抗体に比べると、バリアント２０１の可変ドメインは、特にＫａｂａｔ体系またはＩＭＧＴ（登録商標）体系のどちらかによって画定されるようなＣＤＲに多重変異を含有する（図２３および図２４）。これらの変異は、バリアント２０１のＶＥＧＦとのさらに強い結合を付与する（図３）。

【0314】

実施例６：
ＶＥＧＦに対する合成抗体についての上流のプロセスの情報
ＫＣＭ法による大腸菌ＢＬ２１における抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ−２０１構築物の形質転換
抗ＶＥＧＦ ＦａｂのＤＮＡ構築物を１０μＬの１×ＫＣＭと混合し、氷上で２〜５分間予冷した後、同じ体積のコンピテント細胞（１０ｕＬ）を添加した。チューブを氷上で２０分間、さらにインキュベーションし、次いで、室温で１０分間インキュベーションした。２００ｕＬのＳｕｐｅｒ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｂｒｏｔｈ ｗｉｔｈ Ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＳＯＣ）を添加して、細胞をオービタルシェーカー中、３７℃で１時間インキュベーションした。１００µＬの上記培養物を、適切な抗生物質（カルベニシリン）と共にＬＢアガープレート上に広げ、プレートを３７℃で１４時間インキュベーションした。

【0315】

攪拌フラスコ培養における抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ−２０１の発現
前接種物の調製：
大腸菌ＢＬ２１−２０１の凍結した作業用細胞バンクから得た１０μＬを、カルベニシリン抗生物質（１００ｍｇ／ｍｌストックより１０μＬ）を含有する１０ｍＬの滅菌ＬＢブロスに接種した。培養物をオービタルシェーカー中、３７℃、２１０ｒｐｍで１６時間（一晩）インキュベーションした。

【0316】

最小培地における成長および誘導：
表５に記されるような成長および生産用の最小塩培地を調製する。培地のｐＨを７．０±０．３に調整する。成長および生産培地を１２１℃、１５ｐｓｉで１５分間、オートクレーブにかける。

【0317】

接種前に、５００μＬのカルベニシリン（１００ｍｇ／ｍＬストックより）、５００μＬのチアミンＨＣＬ（１Ｍ滅菌ストックより）、２．５ｍＬの滅菌グルコース（４０％滅菌ストックより）、および３２０μＬのリン酸カリウム（１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４より）を添加した。８％の一晩成長培養物（前接種物）を成長培地に移した。養物の初発のＯＤ（６００ｎｍ）、グルコース濃度、およびリン酸濃度を、成長培地中で測定した。

【0318】

培養フラスコを３７℃、２１０ｒｐｍで７〜８時間（ＯＤが２〜２．５の間に到達するまで）インキュベーションした。培養物のＯＤ（６００ｎｍ）、グルコース濃度、およびリン酸濃度を、８時間の成長後に成長培地中で確認した。培養物を４０００ｒｐｍ、＋３０℃で１５分間スピンした。細胞ペレットを最小培地（リン酸含まず）で洗浄し、４０００ｒｐｍで１５分間、再度スピンした。上清をゆっくりと排出した。細胞ペレットを、リン酸濃度の低い５００ｍＬの生産培地に再懸濁した。培養フラスコを３０℃、２１０ｒｐｍで１６時間インキュベーションした。採取した培養物のＯＤ（６００ｎｍ）、グルコース濃度、およびリン酸濃度を確認した。発現した培養物を４３００Ｇ、＋４℃で３０分間スピンした。抗ＶＥＧＦ Ｆａｂの発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認し、ＥＬＩＳＡによって発現レベルを定量した。

【0319】

２．５Ｌの発酵塩培地での抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ−２０１の発現
２．５Ｌ発酵槽での発現：
抗ＶＥＧＦ抗体を、３．７Ｌ発酵槽で発酵プロセスを用いて大スケールで生産した。

【0320】

接種物の調製：
各２．５Ｌの発酵にすいて、大腸菌ＢＬ２１−２０１の２０μＬの凍結された作業用細胞バンクを、カルベニシリン抗生物質（１００ｍｇ／ｍｌＬストックからの２５０μＬ）を含有する２５０ｍＬの滅菌ＬＢブロスに接種した。培養フラスコをオービタルシェーカー中、３７℃、２１０ｒｐｍで１６時間（一晩）インキュベーションした。

【0321】

最小塩培地での高細胞密度発酵：
２．５Ｌの発酵培養用に最小塩培地を調製した。培地のｐＨを水酸化アンモニウム（２５％）によって７．０±０．３に調整した。最小塩培地を３．７Ｌ発酵槽中、１２１℃、１５ｐｓｉで２０分間、滅菌した。

【0322】

接種の前に、２．５ｍＬのカルベニシリン（１００ｍｇ／ｍＬストックより）、２．５ｍＬのチアミンＨＣＬ（１Ｍ滅菌ストックより）、２．５ｍＬの微量元素、３００μｌのＬ−６１消泡剤、および１００ｍＬの滅菌グルコース溶液（４０ｇのグルコースを含有）を添加した。ＤＯレベルを１００％に較正し設定した後、接種物を移した。Ｄｏを較正した後、１０％（２５０ｍＬ）の一晩清澄培養物（接種物）を発酵槽培地中に移した。発酵培地中の培養物の初発のＯＤ（６００ｎｍ）、グルコース濃度、およびリン酸濃度を確認した。

【0323】

発酵を３７℃、３ｌｐｍの空気流で実施し、水酸化アンモニウム（２５％）．によって７．０±０．３のｐＨに制御した。発酵槽の背圧を０．５バーゲージに維持し、振動速度を５００ｒｐｍに設定した。発酵の間、振動を５００から１２００ｒｐｍに増加させることによって（振動を徐々に増加させた）、および発酵槽中の背圧を保つによって、最小ＤＯレベルを３０％に維持した。培養物のＯＤ（６００ｎｍ）は、１２時間で１８±２に到達し、この時点で、コンピュータに基づくフィードを開始して、高細胞密度培養を達成した。濃縮フィードは、グルコース（４５０ｇ）、２５ｍＬの１Ｍ硫酸マグネシウム、２５ｍＬの２０×塩培地、および５０ｍＬの１Ｍリン酸カリウムを含有していた。濃縮フィードを発酵槽に添加し、流速１ｍＬ／分で１８時間開始した。発酵槽がＯＤ（６００ｎｍ）１２０±１０前後に到達した際に、並行してリン酸濃度を測定した。２１±２時間で、発酵培養物中のリン酸濃度は０．０５ｍＭを下回り、この時点で、発酵温度を３７℃から３０℃に次第に変化させた。発酵培養物中のリン酸濃度が０．０５ｍＭよりも下回った際に、誘導を開始した。後誘導を３０℃および１２００ｒｐｍで１０時間実施した。純粋な酸素を添加して、高細胞密度培養のために最小の溶存酸素レベル（３０％）を維持した。空気と純粋な酸素との混合物を、３０℃、４ｌｐｍの流速でポンプ送出して、溶存酸素を設定点に維持した。ＯＤ（ａｔ６００ｎｍ），発酵培養物のグルコース濃度およびリン酸濃度を、誘導後に測定した。培養物を４３００Ｇ、＋４℃で３０分間スピンし、上清を捨てた。抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ−２０１の精製を実施し、発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認して、ＥＬＩＳＡによって定量した。
発酵データおよび発現収量を図２１に示す。

【0324】

実施例７：
ＶＥＧＦに対する合成抗体のための下流のプロセスの情報
細胞ペレットの懸濁液および溶解：
大腸菌細胞ペレットの溶解は、溶解緩衝液［溶解緩衝液−２００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４、４００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭフッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）、２ｍＭＥＤＴＡ、５％スクロース、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いて実施した。約４４６グラムの湿重量の細胞ペレットを、室温で４．０Ｌの溶解緩衝液（およそ１：１０の比率）に懸濁し、均一な細胞懸濁液を得るまで細胞ペレットを勢いよく混合した。ペレットを−８０℃から取り出して室温で溶解を実施したことから、極端な温度差があったために、高い緩衝液強度が塩濃度と相まった結果、細菌の細胞壁上に浸透圧ショックを生じ、それを高度に多孔質化してペリプラズム領域から分子を自由に流出させる。この方法は、タンパク質を遊離するには充分ではなく、高圧ホモジナイザーを用いたさらに別の処理を必要とする。

【0325】

そのようにして得た細胞ペーストを、８００ｂａｒの圧力、４℃の温度で、３回の連続通過でＧＥＡホモジナイザーを通過させた。各通過後には顕微鏡試験を実施して、完全な溶解が起こっていることを確認した。

【0326】

加熱および遠心分離：
ホモジネート溶解物を、水浴中６５℃で１時間加熱し、次いで、氷上で２０分間冷却した。冷却した溶解物を、４℃、１７，０００ｇで３０分間遠心分離することによって清澄化した。さらに、清澄化した溶解物を、Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎにより１０ＫＤａを用いて、初発の溶解物の体積の６倍に濃縮した。

【0327】

ステップ１ Ｃａｐｔｏ−Ｌによる精製：
体積２０ｍＬのＧＥ Ｃａｐｔｏ ＬをＸＫ１６／２０カラムに詰め、０．４Ｍ塩化ナトリウムを含む０．２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４を用いて平衡化した。濃縮した溶解物を流速４ｍＬ／分でロードし、平衡化緩衝液で洗浄した。０．２Ｍグリシン−Ｃｌ／２％スクロース、ｐＨ２．０を含有する緩衝液を用いてＳａｋｓｉｎ Ｆａｂ−２０１を溶離し、採集した溶離物を１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．８により直ちに中和した。

【0328】

ステップ２ Ｑ−セファロースによる精製：
ｃａｐｔｏ−Ｌクロマトグラフィーから得た最初の溶離物を、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．３に対し透析し、エンドトキシンおよびＨＣＤＮＡを除去するために１０ｍＬのアニオン交換樹脂ＧＥ Ｑセファロースを用いて仕上げた。精製したｆａｂをフロースルーとして採集した。

【0329】

ステップ３ ＳＰ−セファロースによる精製：
Ｑ−セファロースから得たフロースルーを、ＸＫ２６／２０に詰めた１５ｍＬのカチオン交換ＧＥ ＳＰセファロース樹脂の上にロードした。僅かに伝導度を増加させて樹脂を洗浄し、結合していたＦａｂを含むタンパク質の溶離を、導電率１４〜１６ｍＳ／ｃｍでの勾配溶出によって行った。強固に結合していたタンパク質を、緩衝液を含む１Ｍ塩化ナトリウムにより溶出した。原薬を２０ｍＭ ＰＢ、ｐＨ５．６に対して透析し、最後に滅菌濾過した（０．２２µｍ）。

【0330】

実施例８：
製剤化したＦＡＢ ２０１の薬剤としての安定性
原薬Ｆａｂ２０１を、滲出型ＡＭＤに対する硝子体内注射が容易となるように安定性特性を上げるための製剤化（薬剤製品）に供した。薬剤製品ＤＰ＿２０１を、５から１０ｍｇ／ｍＬの間の濃度域で製剤化した。ＡＰＩに加えて、製剤は、１０ｍＭリン酸緩衝液／４０ｍＭ ＮａＣｌ／０．０３％ポリソルベート２０／５％スクロース溶液をｐＨ５．８で含有する。製剤のモル浸透圧濃度は、およそ２７６ｍＯｓｍであり、ヒト硝子体内液と同等である。

【0331】

安定性を定量的ＥＬＩＳＡおよびＳＤＳ ＰＡＧＥについて分析した。データでは、図２２に図示されるように、この薬剤製品が４℃で８か月間（２４０日間）安定であることが示唆された。

【0332】

実施例９：
ウサギの眼における抗血管形成の長期試験
試験を実施し、Ｓａｋｓｉｎ ＬｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓＰｖｔ．Ｌｔｄ．、ＴＩＣＥＬ Ｂｉｏ−Ｐａｒｋ Ｆａｃｉｌｉｔｙ、タラマーニー、チェンナイ、インドによって発見された抗ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）Ｆａｂ（抗原結合断片）タンパク質（被験分子＃２０１）の効能および持続可能性を、ＶＥＧＦ誘導性網膜漏出モデルウサギ（ダッチベルト、３〜４か月齢の雄、体重–１．０〜１．３ｋｇ）にて、商業的に入手可能なルセンティスと比較して評価した。試験は、ＰｈａｒｍＯｐｔｉｍａ，ＬＬＣ、ポーテージ、ミシガン州、米国で実施した。何群かのウサギを、０日目に硝子体内投与（ＩＶＴ）によって、被験分子＃２０１（５０μＬの製剤緩衝液中に１５０μｇ）、ルセンティス（５０μＬの製剤緩衝液中に１５０μｇ）、またはビヒクル（５０μＬ製剤緩衝液）で処置した。次いで、各群由来の動物に、ＶＥＧＦへの曝露をＩＶＴによって７日目、２１日目、または３７日目に与え、効能が長期にわたり持続するか否かを決定した。

【0333】

ＩＶＴ投与（被験分子＃２０１、ルセンティス、ビヒクル、またはＶＥＧＦ）の前に、ウサギをイソフルラン蒸気で麻酔し効かせた。注射前に、それぞれの眼を眼科用ベタジン溶液で潤してリンスした。プロパラカイン（０．５％）を眼球表面に適用し、眼科用開瞼器を用いて眼を開かせて保持し、ノギスを用いて毛様体扁平部を角膜縁から約４．０ｍｍにて印付けした。次いで、毛様体扁平部を介して硝子体中間部内に、レンズを避ける角度で被験分子をデリバリした。

【0334】

ＶＥＧＦへの曝露の３日後に、フルオレセイン血管造影図（ＦＡ）を全ての動物に実施した。眼をプロパラカインで麻酔し、瞳孔をトロピカミドおよびＥｙｅＰｒｉｍで散大させた。動物をイソフルラン蒸気で麻酔して効かせ、０．１ｍＬの１０％眼科用フルオレセインナトリウムをウサギ耳静脈に投与して、少なくとも２分間循環させた後、イメージングした。下記に示す標準的なスコア化システム（表６）を用いて、イメージをグレード付けした。

【0335】

表６．フルオレセインイメージングのスコア化システム

【表10】

【0336】

最終的なＦＡの後、静脈内へのバルビツール酸塩の過剰用量投与によって、動物を安楽死させた。眼を摘出して、硝子体、房水、および網膜を採集した。さらに分析するまで、全試料を−８０℃で保存した。

【0337】

両眼のスコアをクラスカル−ウォリス一元ＡＮＯＶＡに供して、群間に有意差を見出した。有意差を示すデータをダン検定に供し、群間の有意差を決定した。

【0338】

ＶＥＧＦへの曝露の１週間後、被験分子＃２０１の投与は、結果として、予想された量の漏出をビヒクル注射群に生じ、完全な保護をルセンティスと被験分子＃２０１との両方に由来する群にもたらした。ＶＥＧＦへの曝露の３週間後、被験分子＃２０１の投与は、結果として、予想された量の漏出をビヒクル処理群に生じ、ルセンティス処理ウサギよりも有意に大きな保護を被験分子＃２０１処理ウサギにもたらした。ＶＥＧＦへの曝露の５週間後、被験分子＃２０１の投与は、結果として、予想された量の漏出をビヒクル処理群に生じたが、ルセンティスと被験分子＃２０１との両方由来の群には保護をもたらさなかった（表７）。

【0339】

表７．被験分子投与の１、３および５週間後のＶＥＧＦ曝露ウサギのフルオレセインイメージングスコア

【表11】

値を平均値±ＳＤとして表す。どの単一カラムでも、同様の上付きを示す値は、統計学的に同じ（ダン検定）である。

【0340】

結論
本研究から、被験分子＃２０１の効能の持続可能性は、ＶＥＧＦ誘導性の網膜漏出モデルウサギにおいて、被験分子＃２０１の投与の３週間後のＶＥＧＦ曝露の後では、ルセンティスよりも非常に大きかったことを結論とすることができよう。この効能の分子基盤は、図２３および図２４に示されるように、ルセンティスに比べた際のＦａｂ２０１のＣＤＲの違いに起因するものと考えられる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図9B】

【図9C】

【図10】

【図11】

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【図13】

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【図21】

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【図23】

【図24】