特許 6646930 デジタルＰＣＲを実施するためのデバイスおよび方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6646930

(24)【登録日】2020年1月16日

(45)【発行日】2020年2月14日

(54)【発明の名称】デジタルＰＣＲを実施するためのデバイスおよび方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20200203BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20200203BHJP

   G01N 35/08 20060101ALI20200203BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20200203BHJP

【ＦＩ】

   C12M1/00 A

   C12Q1/686 Z

   G01N35/08 A

   G01N37/00 101

【請求項の数】12

【外国語出願】

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2014-241910(P2014-241910)

(22)【出願日】2014年11月28日

(65)【公開番号】特開2015-107113(P2015-107113A)

(43)【公開日】2015年6月11日

【審査請求日】2017年11月8日

(31)【優先権主張番号】13195075.0

(32)【優先日】2013年11月29日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】514156563

【氏名又は名称】アイメック・ヴェーゼットウェー

【氏名又は名称原語表記】ＩＭＥＣ ＶＺＷ

(74)【代理人】

【識別番号】100101454

【弁理士】

【氏名又は名称】山田 卓二

(74)【代理人】

【識別番号】100081422

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 光雄

(74)【代理人】

【識別番号】100100479

【弁理士】

【氏名又は名称】竹内 三喜夫

(72)【発明者】

【氏名】パオロ・フィオリーニ

(72)【発明者】

【氏名】ティム・スタケンボルフ

(72)【発明者】

【氏名】フレデリック・コレ

【審査官】 平林 由利子

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１２／００５２５６０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特表２０１３−５３６６９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−２５３４６６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５２４４３０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５２１７６４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００７−１２０３９９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５３０３０５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Zhi Zhu et al., Anal. Bioanal. Cje,. 2012, Vol.403, pp.2127-2143

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｍ １／００− ３／１０

Ｃ１２Ｑ １／００− １／７０

Ｇ０１Ｎ ３５／００−３７／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＷＰＩＤＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

デジタルＰＣＲを実施するためのマイクロ流体デバイス（１００）であって、
・半導体基板と、
・半導体基板に埋め込まれ、入口（１０２）および出口（１０３）を含む第１マイクロ流体チャネル（１０４）と、
・第１マイクロ流体チャネル（１０４）と熱的に結合した加熱エレメント（１０１）と、
・第１マイクロ流体チャネル（１０４）の入口（１０２）と接続され、キャリア媒体中に液滴を発生し、発生した液滴を第１マイクロ流体チャネル（１０４）内に、ある流速で送り込むための液滴発生器（１０７）と、
第１マイクロ流体チャネル（１０４）において、ＰＣＲの際に、ＰＣＲ生成物を含有する液滴を検出するために設けられた検出器（１０８）と、
検出器（１０８）と接続された演算ユニット（１１０）と、を備え、
加熱エレメント（１０１）は、第１マイクロ流体チャネル（１０４）全体の温度を少なくとも２つの温度値になるように循環させるように構成された温度制御ユニット（１１１）と接続された単一の加熱エレメントであり、
液滴発生器（１０７）の流速は、調整可能であり、
演算ユニット（１１０）は、ＰＣＲ生成物を含有する液滴の百分率を決定するように構成され、
液滴発生器（１０７）は、演算ユニット（１１０）と接続され、
液滴発生器（１０７）は、演算ユニット（１１０）によって決定された液滴の百分率に応じて、液滴のサイズを変化させ、液滴中の検体のコピーの回数を変更するように再構成可能であることを特徴とするマイクロ流体デバイス（１００）。

【請求項2】

片側で液滴発生器（１０７）の出口と接続され、別の片側で第１マイクロ流体チャネル（１０４）の入口（１０２）と接続された第２マイクロ流体チャネル（１０５）と、
第２マイクロ流体チャネル（１０５）に存在する発生した液滴を加熱するように設けられた加熱エレメントと、をさらに備える請求項１記載のマイクロ流体デバイス（１００）。

【請求項3】

検出器（１０８）は、ＰＣＲ生成物を含有する液滴を検出するために、第１マイクロ流体チャネル（１０４）の出口（１０３）に設けられる請求項１記載のマイクロ流体デバイス（１００）。

【請求項4】

第１マイクロ流体チャネル（１０４）を少なくとも部分的に取り囲む少なくとも１つの基板貫通溝（１０６）をさらに備える請求項１〜３のいずれかに記載のマイクロ流体デバイス（１００）。

【請求項5】

請求項１〜４のいずれかに記載のマイクロ流体デバイス（１００）を用いて流体サンプルにおいてＰＣＲを実施するための方法であって、
・流体サンプルをマイクロ流体デバイス（１００）に供給するステップと、
・液滴発生器（１０７）を用いて、流体サンプルの液滴を発生し、該液滴を第１マイクロ流体チャネル（１０４）内に送り込むステップと、
・単一の加熱エレメント（１０１）を用いて、第１マイクロ流体チャネル（１０４）全体の温度を少なくとも２つの温度値になるように循環させるステップとを含む方法。

【請求項6】

液滴を発生し、液滴を送り込むステップは、第１マイクロ流体チャネル（１０４）が液滴で完全に充填された場合に停止する請求項５記載の方法。

【請求項7】

第１マイクロ流体チャネル（１０４）の温度を循環させるステップは、液滴中の検体の飽和レベルに到達するまで実施される請求項５または６記載の方法。

【請求項8】

第１マイクロ流体チャネル（１０４）の温度を循環させるステップは、液滴を第１マイクロ流体チャネル（１０４）内に送り込みながら、第１マイクロ流体チャネル（１０４）の温度を少なくとも２つの温度値になるように連続的に循環させることを含む請求項５記載の方法。

【請求項9】

液滴は、第１マイクロ流体チャネル（１０４）の温度サイクルの持続時間に適合した流速で、第１マイクロ流体チャネル（１０４）内に送り込まれる請求項５記載の方法。

【請求項10】

液滴を第１マイクロ流体チャネル（１０４）内に送り込む前に、発生した液滴を予備加熱するステップをさらに含む請求項５、８または９記載の方法。

【請求項11】

検出器（１０８）を用いてＰＣＲ生成物を含有する液滴を検出するステップをさらに含む請求項５〜１０のいずれかに記載の方法。

【請求項12】

液滴中の検体のコピーの回数は、演算ユニット（１１０）によって決定された、ＰＣＲ生成物を含有する液滴の百分率に応じて、液滴発生器（１０７）によって変更される請求項１１記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、マイクロ流体デバイスに関する。特に、本開示は、ラボ・オン・チップ(lab-on-a-chip)デバイスにおいてデジタルＰＣＲを実施するための方法およびデバイスに関する。詳細には、本開示は、液滴ベース(droplet based)ＰＣＲを実施するための方法およびデバイスに関する。

【背景技術】

【0002】

最新技術は、ＰＣＲを実施する２つのタイプのデバイス、即ち、スタティックＰＣＲシステムとダイナミックＰＣＲシステムを類型化している。スタティックＰＣＲシステムにおいて、ＰＣＲは、流体が存在する空洞(cavity)内で実施される。これらのシステムの短所は、ユーザが増加させることができない固定された空洞体積である。ダイナミックＰＣＲシステムは、連続的な流体プロセシングを可能にする。デバイスは、流体チャネルと、流体チャネルを加熱するための複数の加熱エレメント（典型的には３つ）とを使用する。流体チャネルの下方には、固定された場所で異なる加熱エレメントが存在する。各加熱エレメントについての温度値は、ユーザによって設定できる。流体サンプルが流体チャネルを通過し、異なる加熱エレメントの異なる温度に曝される。マイクロ流体チャネルを通過しながら、流体チャネル中の流体サンプルに存在するＤＮＡが増幅される。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

典型的には、異なる加熱ゾーン間の交差(cross)加熱を防止するために、例えば、これらの間にスペースを設けることによって、異なる加熱エレメントが互いに分離している。これは、システムのコンパクト性を低減する。システムが大きな熱伝導率を持つ材料、例えば、シリコンを用いて製造した場合、異なる加熱ゾーン間の距離はより大きくする必要がある。

【0004】

これらのシステムの他の短所は、流体チャネルが特定の加熱エレメントを固定された回数で横断するため、設計によって固定された加熱サイクルの回数である。他の短所は、ＰＣＲサイクルでの異なる温度ステップの持続時間である。最新技術の設計は、ユーザが流体サンプルの流速を変更することを可能にするが、これにより全ての温度ステップの持続時間が変化する。ユーザは、単一の温度ステップの持続時間を変化させる可能性を有していない。異なるステップの持続時間の比率は、ＰＣＲ最適化において重要なパラメータであるが、変更できない。上述した不具合の少なくとも幾つかを克服するマイクロ流体デジタルＰＣＲデバイスのニーズがある。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本開示の第１態様において、デジタルＰＣＲを実施するためのマイクロ流体デバイスが提示される。該デバイスは、
半導体基板と、
半導体基板に埋め込まれ、入口および出口を含む第１マイクロ流体チャネルと、
第１マイクロ流体チャネルと熱的に結合した加熱エレメントと、
第１マイクロ流体チャネルの入口と接続され、液滴を発生し、発生した液滴を第１マイクロ流体チャネル内に、ある流速で送り込むための液滴発生器と、を備え、
加熱エレメントは、第１マイクロ流体チャネル全体の温度を少なくとも２つの温度値になるように循環させるように構成された温度制御ユニットと接続された単一の加熱エレメントであり、
液滴発生器の流速は、調整可能であることを特徴とする。

【0006】

本開示の一実施形態によれば、マイクロ流体デバイスは、片側で液滴発生器の出口と接続され、別の片側で第１マイクロ流体チャネルの入口と接続された第２マイクロ流体チャネルと、
第２マイクロ流体チャネルに存在する発生した液滴を加熱するように設けられた加熱エレメントとをさらに備える。

【0007】

本開示の一実施形態によれば、マイクロ流体デバイスは、第１マイクロ流体チャネルの出口に設けられ、ＰＣＲ生成物を含有する液滴を検出するための検出器をさらに備える。

【0008】

本開示の一実施形態によれば、マイクロ流体デバイスは、第１マイクロ流体チャネルにおいて、ＰＣＲの際に、ＰＣＲ生成物を含有する液滴を検出するために設けられた検出器をさらに備える。

【0009】

本開示の一実施形態によれば、マイクロ流体デバイスは、検出器と接続された演算ユニットをさらに備え、
演算ユニットは、ＰＣＲ生成物を含有する液滴の百分率を決定するように構成される。
本開示の一実施形態によれば、液滴発生器は、演算ユニットと接続され、液滴発生器は、液滴中の検体(analyte)のコピーの回数を変更するように再構成可能である。

【0010】

本開示の一実施形態によれば、マイクロ流体デバイスは、第１マイクロ流体チャネルを少なくとも部分的に取り囲む少なくとも１つの基板貫通(through-substrate)溝をさらに備える。

【0011】

本開示の一実施形態によれば、マイクロ流体デバイスは、マイクロ流体チャネルの出口に設けられ、液滴を加熱するための加熱エレメントをさらに備える。

【0012】

本開示の第２態様において、本開示の第１態様で説明したようなマイクロ流体デバイスを用いて流体サンプルにおいてＰＣＲを実施するための方法が提示される。該方法は、
流体サンプルをマイクロ流体デバイスに供給するステップと、
液滴発生器を用いて、流体サンプルの液滴を発生し、該液滴を第１マイクロ流体チャネル内に送り込むステップと、
単一の加熱エレメントを用いて、第１マイクロ流体チャネル全体の温度を少なくとも２つの温度値になるように循環させるステップとを含む。

【0013】

本開示の一実施形態によれば、液滴を発生し、液滴を送り込むステップは、第１マイクロ流体チャネルが液滴で完全に充填された場合に停止する。

【0014】

本開示の一実施形態によれば、第１マイクロ流体チャネルの温度を循環させるステップは、液滴中の検体の飽和レベルに到達するまで実施される。

【0015】

本開示の一実施形態によれば、第１マイクロ流体チャネルの温度を循環させるステップは、液滴を第１マイクロ流体チャネル内に送り込みながら、第１マイクロ流体チャネルの温度を少なくとも２つの温度値になるように連続的に循環させることを含む。

【0016】

本開示の一実施形態によれば、液滴は、第１マイクロ流体チャネルの温度サイクルの持続時間に適合した流速で、第１マイクロ流体チャネル内に送り込まれる。

【0017】

本開示の一実施形態によれば、該方法は、液滴を第１マイクロ流体チャネル内に送り込む前に、発生した液滴を予備加熱するステップをさらに含む。

【0018】

本開示の一実施形態によれば、該方法は、液滴を連続的に加熱し、第１マイクロ流体チャネルの出口で温度を増加させるステップをさらに含む。

【0019】

本開示の一実施形態によれば、該方法は、検出器を用いてＰＣＲ生成物を含有する液滴を検出するステップをさらに含む。

【0020】

本開示の一実施形態によれば、液滴中の検体(analyte)のコピーの回数は、演算ユニットによって決定された、ＰＣＲ生成物を含有する液滴の百分率に応じて、液滴発生器によって変更される。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】本開示の第１態様に従って、本開示の一実施形態を示す。

【図2】液滴を予備加熱するための加熱エレメントを用いた、本開示の一実施形態を示す。

【図3】液滴を検出するために、マイクロ流体チャネルと接続された蛍光検出器を用いた、本開示の一実施形態を示す。

【図4】検出器のデータを分析するために、検出器と接続された演算ユニットを用いた、本開示の一実施形態を示す。

【図5】演算ユニットが液滴発生器と接続され、演算ユニットからのデータに応じて液滴サイズを変更する、本開示の一実施形態を示す。

【図6】基板貫通溝が、第１マイクロ流体チャネルを少なくとも部分的に取り囲む、本開示の一実施形態を示す。

【図7】基板貫通溝が、第１マイクロ流体チャネルおよび液滴を予備加熱するための加熱エレメントを部分的に取り囲む、本開示の一実施形態を示す。

【図8】１）先行技術のデバイス（「空洞」）と、２）本開示の一実施形態（「マイクロチャネル」）を用いて、処理された液滴の比較を時間の関数として示す。

【発明を実施するための形態】

【0022】

本開示の実施形態において、「ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）」を参照する場合、これはＤＮＡ増幅のための方法である。それは、ＤＮＡ片の単一または幾つかのコピーを桁違いに増幅する分子生物学での生化学テクノロジーであり、これにより特定のＤＮＡシーケンスのコピーを生成する。

【0023】

本開示の実施形態において、「ラボ・オン・チップ(lab-on-a-chip)」を参照する場合、これは１つ又はそれ以上の実験室機能を単一チップ上に集積したデバイスである。

【0024】

本開示の実施形態において、「マイクロ流体」を参照する場合、この用語は、典型的には１ｍｍ未満のデバイスサイズを参照する。

【0025】

本開示の実施形態において、半導体基板を参照する場合、これは、例えば、シリコン（Ｓｉ）基板、シリカ（ＳｉＯ_２）基板、シリコンゲルマニウム（ＳｉＧｅ）基板、またはガラスシリコン基板などの基板を含んでもよい。

【0026】

本開示の実施形態において、「ＰＣＲ生成物を含有する液滴」を参照する場合、この用語は、検体の増幅がＰＣＲによって生じた液滴を参照する。用語「ＰＣＲ生成物」は、増幅された検体を参照する。

【0027】

本開示の目的は、ＰＣＲデバイスの動作中に、ユーザが下記事項について完全に制御できるＰＣＲデバイスを得ることである。
１）ＰＣＲサイクルの各温度ステップの持続時間
２）異なるＰＣＲサイクルの各温度ステップ値の値
３）デバイス中の流体サンプルの流速
４）デバイスによって処理される体積

【0028】

本開示の目的は、設計を変更することなく、バッチ式ＰＣＲおよび連続式ＰＣＲについて使用できる単一のデバイスを得ることである。

【0029】

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）がＤＮＡ増幅のためのテクニックである。それは、ＤＮＡ片の単一または幾つかのコピーを桁違いに増幅して、特定のＤＮＡシーケンスのコピーを生成する分子生物学での生化学テクノロジーである。ＰＣＲを実施するために、試薬、ＤＮＡ、プライマーを含有する混合物が反応容器に戴置される。反応容器の温度は、例えば、３つの温度値を通るように循環される。その結果、反応容器内のＤＮＡが増幅される。デジタルＰＣＲ反応は、平均で１未満のＤＮＡコピー／液滴を含有する小さな液滴内にターゲットＤＮＡを希釈することによって、ＤＮＡ分析を実施するための方法である。ＤＮＡと結合した場合、蛍光を発するラベルが試薬に添加される。ＰＣＲ反応の終わりに蛍光信号を表示する液滴を計数することによって、ターゲットＤＮＡの量の定量化が行われる。デジタルの性質に起因して、デジタルＰＣＲが、低いターゲット濃度の高精度測定を実施するのに特に適している。

【0030】

本開示の第１態様において、デジタルＰＣＲを実施するためのマイクロ流体デバイス１００が提示される。該デバイスは、半導体基板と、半導体基板に埋め込まれ、入口１０２および出口１０３を含む第１マイクロ流体チャネル１０４と、第１マイクロ流体チャネル１０４と熱的に結合した加熱エレメント１０１と、第１マイクロ流体チャネル１０４の入口１０２と接続され、液滴を発生し、発生した液滴を第１マイクロ流体チャネル１０４内に、ある流速で送り込むための液滴発生器１０７とを備え、加熱エレメント１０１は、第１マイクロ流体チャネル１０４全体の温度を少なくとも２つの温度値に循環させるように構成された温度制御ユニット１１１と接続された単一の加熱エレメントであり、液滴発生器１０７の流速は、調整可能であることを特徴とする。

【0031】

本開示の第１態様に提示されたようなデバイスは、連続式またはスタティック（バッチ式）ＰＣＲを実施するために使用できる。図１は、こうしたデバイスを示す。デバイス１００は、第１マイクロ流体チャネル１０４を備える。第１マイクロ流体チャネル１０４は、単一の入口１０２と、単一の出口１０３とを備える。第１マイクロ流体チャネル１０４は、入口１０２を出口１０３と相互接続する。流体サンプルから液滴を発生するための液滴発生器１０７が、マイクロ流体チャネル１０４の入口１０２と接続される。液滴発生器１０７は、液滴を発生し、この液滴を第１マイクロ流体チャネル１０４内に送り込む。液滴発生器１０７の流速は、動作中に調整可能である。液滴発生器１０７のこの流速は、液滴発生器１０７が第１マイクロ流体チャネル１０４内に液滴を送り込むときの速度として定義される。こうして第１マイクロ流体チャネル１０４内の液滴の伝搬速度は、液滴発生器１０７の流速によって定義される。利点として、第１マイクロ流体チャネル１０４内での液滴の流速および第１マイクロ流体チャネル１０４の温度サイクルが調整可能である。第１マイクロ流体チャネル１０４内での液滴の流速は、所望の温度サイクルの回数に調整可能であり、各温度サイクルは少なくとも２つの温度値を含む。

【0032】

（例１）
特定のＰＣＲ動作がそれぞれ３０秒の温度サイクルを３０回必要とする場合、液滴発生器１０７の流速は、入口１０２から出口１０３へ伝搬する発生した液滴の持続時間が９００秒と等しくなるように調整される。先行技術の連続フローＰＣＲデバイスでは、サイクル数は、設計によって固定され、例えば、３０サイクルが設計によって固定される。例えば、３２サイクルが必要になる場合、デバイスの再設計が必要になる。

【0033】

（例２）
特定の実験の場合、完全なＰＣＲ反応に必要な時間は１０分になることがある。第１マイクロ流体チャネル１０４の体積が２μＬである場合、第１マイクロ流体チャネル１０４での液滴およびキャリア媒体の合計流速は、０．２μＬ／分とすべきである。液滴発生器１０７は、第１マイクロ流体チャネル１０４での（液滴およびキャリア媒体の）合計流速が、０．２μＬ／分であることを確保するように調整できる。この柔軟性は、先行技術のデバイスには存在しない。

【0034】

特定のＰＣＲを実施するのに必要な時間に対する流速の適応性は、提示したマイクロ流体デバイスを極めて汎用性のあるものにする。

【0035】

液滴発生器１０７は、キャリア媒体の区画(compartment)を含んでもよい。本発明の特定の実施形態によれば、キャリア媒体はオイルであり、キャリア媒体区画はオイル区画である。液滴は、オイル中に発生してもよく、互いに異なる液滴を分離する。液滴発生器１０７は、流体サンプルを供給するための少なくとも１つの入口と、発生した流体サンプル液滴を排出するための少なくとも１つの出口とを含む。特定の実施形態によれば、液滴発生器１０７は、少なくとも２つの入口、即ち、流体サンプルを供給するための第１入口と、オイルを供給するための第２入口とを含む。

【0036】

単一の加熱エレメント１０１が存在し、マイクロ流体チャネル１０４全体の温度を変化させるように設置される。本開示の一実施形態によれば、加熱エレメント１０１は、第１マイクロ流体チャネル１０４の近傍、例えば、第１マイクロ流体チャネル１０４の下方に設置してもよく、マイクロ流体チャネル１０４全体のより均等な加熱を可能にする。加熱エレメント１０１は、温度制御ユニット１１１と接続される。温度制御ユニット１１１は、加熱エレメント１０１を制御し、第１マイクロ流体チャネル１０４を少なくとも２つの温度値に加熱するように構成される。温度制御ユニット１１１により、第１マイクロ流体チャネル１０４が予め定めた異なる温度値に加熱可能であり、これらの温度値を予め定めた期間だけ維持できる。温度制御ユニット１１１により、異なる温度値および対応する期間は、デバイス１００の動作中に変更でき、何時でも設定可能になる。各温度値では、第１マイクロ流体チャネル１０４が加熱される関連した期間が設定可能である。本開示の一実施形態によれば、温度値および関連した期間は、流体サンプルにおいてＰＣＲを実施するように設定される。本開示の特定の実施形態によれば、第１マイクロ流体チャネル１０４が加熱される３つの温度値および関連した期間は、９０〜９８℃（例えば、９５℃）で１〜６０秒の期間、６０〜６５℃で１〜６０秒の期間、６５〜７５℃で１〜６０秒の期間に設定してもよい。

【0037】

下記の例は、本開示で説明した液滴ＰＣＲデバイスと、空洞を用いた先行技術の液滴ＰＣＲデバイスとの間の相違点を説明する。

【0038】

（例３）
本例では、空洞を含む先行技術デバイスと、マイクロ流体チャネルを用いた本開示の一実施形態とを比較する。直径ｄの液滴が発生し、先行技術デバイスの空洞の辺の長さをＬで定義する。各液滴に周囲のオイルを加えた専有面積が２ｄ^２であると仮定する。先行技術デバイスにおいて、空洞内に含まれる液滴の数は、Ｎ_０＝Ｌ^２／２ｄ^２となり、液滴は時間ｔ_ＰＣＲ内で処理されるようになる。本開示の一実施形態において、マイクロ流体チャネルが幅ｄおよび厚さｗの壁を有すると仮定すると、先行技術デバイスの空洞と同じサイズを用いた場合、マイクロ流体チャネルに含まれる液滴の数は僅かに低くなり、Ｌ^２／２ｄ^２ ｄ／（ｄ＋ｗ）となる。第１の「有用」な液滴、例えば、完全ＰＣＲサイクルに曝されたものは、マイクロ流体チャネルの出口に到達し、時間ｔ_ＰＣＲ後に分析される。その時点から、分析された液滴の数が、Ｌ^２／２ｄ^２ ｄ／（ｄ＋ｗ）／ｔ_ＰＣＲのレートで増加する。図８は、両方のケースについて液滴の数を時間の関数として示す。

【0039】

本開示の一実施形態によれば、温度制御ユニット１１１は、液滴が第１マイクロ流体チャネル１０４を通過しながら、第１マイクロ流体チャネル１０４の温度を少なくとも２つの温度値に連続的に循環させるように構成できる。利点として、連続的なＰＣＲが液滴に対して実施でき、これにより液滴は、第１マイクロ流体チャネル１０４の入口１０２に連続的に供給され、第１マイクロ流体チャネル１０４の出口１０３で排出される。第１マイクロ流体チャネル１０４での液滴は、出口１０３を介して第１マイクロ流体チャネル１０４を出る前に、少なくとも２つの温度値にすることができる（ｎ回、ｎは温度サイクルの回数）。

【0040】

本開示の一実施形態によれば、温度制御ユニット１１１は、液滴が第１マイクロ流体チャネル１０４内に存在する場合だけ、少なくとも２つの温度値になる第１マイクロ流体チャネル１０４の温度のサイクルを開始するように構成できる。この構成は、デバイスがバッチ式ＰＣＲデバイスとして機能することが可能になる。この構成において、第１マイクロ流体チャネル１０４を液滴で充填した後、第１マイクロ流体チャネル１０４での液滴は、少なくとも２つの温度値に曝される。その後、液滴は、出口１０３を介して第１マイクロ流体チャネル１０４を出る。この構成において、液滴は、異なるバッチで第１マイクロ流体チャネル１０４に供給してもよい。

【0041】

本開示の第１態様で提示したようなデバイス１００は、デバイス１００の設計／構造を変更することなく、連続式ＰＣＲまたはバッチ式ＰＣＲのためのデバイスとして使用できることが好都合である。現在、設計を物理的に変更することなく、同じデバイスを用いて両方の機能を実施できる先行技術デバイスが存在しない。

【0042】

第１マイクロ流体チャネル１０４は、例えば、ＣＭＯＳ互換の処理テクニックを用いて、シリコン基板においてエッチング加工したチャネルでもよい。本開示の他の実施形態によれば、基板は、ＰＤＭＳ基板でもよい。第１マイクロ流体チャネル１０４は、例えば、成形(molding)テクニックを用いてＰＤＭＳ基板に形成されたチャネルでもよい。本開示の一実施形態によれば、マイクロ流体デバイス１００は、シリコンに全て製造してもよい。シリコンでの製造は、フィルタリング、ＤＮＡ／ＲＮＡ抽出、試薬混合、試薬保管などを含む種々のマイクロ流体コンポーネントの容易なモノリシック集積化を可能にする。利点として、未処理の生体サンプルまたは体液が使用可能である完全デジタルＰＣＲシステムを構築することが可能である。更なる利点として、安価なＣＭＯＳ互換の処理テクニックを用いて完全デバイスが製造できるため、製造コストが低減できる。

【0043】

本開示の一実施形態によれば、第１マイクロ流体チャネル１０４は、蛇行(meander)状の形状を採用してもよい。蛇行状の形状は、第１マイクロ流体チャネル１０４の長さを増加させ、そのサイズを低減し、よって完全なマイクロ流体デバイス１００のコストを低減する。利点として、液滴の通過時間（＝液滴が第１マイクロ流体チャネル１０４の入口１０２から出口１０３へ伝搬する時間）が、第１マイクロ流体チャネル１０４での液滴の流速（＝伝搬速度）を変更することなく、増加させることができる。他の利点として、空洞を用いた先行技術のバッチ式ＰＣＲデバイスと比較して、蛇行状の形状の使用は、第１マイクロ流体チャネル１０４の体積を空洞の体積と同等にすることができる。本開示の一実施形態によれば、第１マイクロ流体チャネル１０４は、第１マイクロ流体チャネル１０４での液滴の通過時間を所定の流速について増加できる任意の他の形状を有してもよい。

【0044】

本開示の一実施形態によれば、液滴発生器１０７は、液滴を発生し、該液滴を第１マイクロ流体チャネル１０４内に、予め定めた流速で送り込むための少なくとも１つのポンプを備える。本開示の一実施形態によれば、液滴発生器１０７は、キャリア媒体（例えば、オイル）および希釈液（例えば、水）のフローを独立に制御するための２つのポンプを備える。液滴発生器１０７は、キャリア媒体（例えば、オイル）区画と、検体およびＰＣＲ試薬区画１１３とを備えてもよい。本開示の一実施形態によれば、液滴発生器１０７は、、希釈液（例えば、水）区画１１２と、検体およびＰＣＲを希釈液と混合するための混合器(mixer)とをさらに備えてもよい。

【0045】

本開示の一実施形態によれば、マイクロ流体デバイス１００は、片側で液滴発生器１０７の出口と接続され、別の片側で第１マイクロ流体チャネル１０４の入口１０２と接続された第２マイクロ流体チャネル１０５と、第２マイクロ流体チャネル１０５に存在する発生した液滴を加熱するように設けられた加熱エレメントとをさらに備える。図２は、こうした実施形態を示す。

【0046】

第１マイクロ流体チャネル１０４に入る前に液滴を加熱するために、加熱エレメントが第１マイクロ流体チャネル１０４の入口に存在する。第２マイクロ流体チャネル１０５は、液滴発生器１０７の出口と、第１マイクロ流体チャネル１０４の入口１０２とを相互接続する。連続式ＰＣＲを実施する場合、第１マイクロ流体チャネル１０４の温度は、少なくとも２つの温度値になるように連続的に循環される。液滴が未知の温度で第１マイクロ流体チャネル１０４に入るのを回避するために、流体サンプルは、予め定めた温度に予備加熱される。従来、ＰＣＲを実施することは、流体サンプルをＤＮＡ変性温度に加熱する第１ステップを含む。変性温度とは異なる温度でＰＣＲを開始した場合、非特異的増幅が生じることがあり、例えば、選択したものとは異なるＤＮＡ断片が増幅されることがある。これは、第１マイクロ流体チャネル１０４に入る前に液滴を予備加熱することによって改善できる。発生した液滴は、予備加熱エレメントの温度、例えば、変性温度で第１マイクロ流体チャネル１０４に入る。利点として、非特異的増幅が生じない。本開示の一実施形態によれば、第２マイクロ流体チャネル１０５は、蛇行状の形状を採用してもよい。蛇行状の形状は、長さの増加に起因して、遅延エレメントとして機能し、第２マイクロ流体チャネル１０５の加熱を、限定された空間内で可能にする。利点として、面積（例えば、シリコン）およびコストが低減される。また、第２マイクロ流体チャネル１０５内の液滴を加熱するための加熱エレメントのサイズが低減できる。

【0047】

本開示の一実施形態によれば、第１マイクロ流体チャネル１０４の内側寸法は、発生した液滴のサイズに選択され、発生した単一の液滴だけが第１マイクロ流体チャネル１０４を通過できるようにする。本開示の一実施形態によれば、第１マイクロ流体チャネル１０４の内側寸法は、第１マイクロ流体チャネル１０４を通過する際、それぞれ発生した液滴の表面が、第１マイクロ流体チャネル１０４の内側表面全てに接触できるように選択される。連続式ＰＣＲを実施する場合、第１マイクロ流体チャネル１０４の内側寸法（例えば、幅および高さまたは直径）は、発生した液滴のサイズに選択する必要がある。発生した単一の液滴だけが、オイルによって分離され、第１マイクロ流体チャネル１０４を通過できる。本開示の一実施形態によれば、発生した液滴の体積は、その外側面が第１マイクロ流体チャネル１０４の壁と接触するようにする。単一の液滴だけが第１マイクロ流体チャネル１０４を通過できることは、液滴合体のリスクを低減するため、好都合である。単一の液滴を第１マイクロ流体チャネル１０４の出口で監視することも好都合である。

【0048】

本開示の一実施形態によれば、マイクロ流体デバイス１００は、第１マイクロ流体チャネルの出口１０３に設けられ、ＰＣＲ生成物を含有する液滴を検出するための検出器１０８をさらに備える。図３は、こうした実施形態を示す。

【0049】

液滴中の検体の存在は、第１マイクロ流体チャネル１０４の出口１０３に設けられた検出器１０８を用いて、第１マイクロ流体チャネル１０４の出口１０３で検出できる。液滴発生の際、ラベルを各液滴に添加してもよく、これは検体と結合したとき光を放出する。液滴中の検体の存在を検出することは、出口１０３または第１マイクロ流体チャネル１０４での液滴の蛍光発光またはＵＶ吸光度を検出することによって実施できる。ＵＶ吸光度を検出するには、光源を使用して、液滴を第１マイクロ流体チャネル１０４の出口１０３で照射してもよい。検出器は、例えば、イメージセンサなどの光学検出器でもよい。検出器は、複数の液滴を同時に検出するようにも構成できる。本開示の一実施形態によれば、検出器１０８は、デバイスの一部であって、半導体基板に埋め込んでもよい。本開示の他の実施形態によれば、検出器１０８は、第１マイクロ流体チャネル１０４の出口１０３と接続された第３マイクロ流体チャネルに埋め込んでもよい。第３マイクロ流体チャネルは、少なくとも部分的に透明材料で製造することができ、液滴からの発光が透明材料を通過して、光学検出器である検出器１０８に到達できる。検出器は、第３マイクロ流体チャネルの下方に設置してもよい。本開示の一実施形態によれば、光学検出器は、画素でもよい。光学検出器の上にあるスペクトルフィルタを使用して、液滴からの蛍光発光をフィルタ処理してもよい。利点として、異なる検体が異なる液滴において検出できる。

【0050】

本開示の一実施形態によれば、マイクロ流体デバイス１００は、第１マイクロ流体チャネル１０４において、ＰＣＲの際に、ＰＣＲ生成物を含有する液滴を検出するために設けられた検出器１０８をさらに備える。

【0051】

検出器１０８が第１マイクロ流体チャネル１０４に設置された場合、ＰＣＲの際に液滴がリアルタイムで監視できる。利点として、ＰＣＲの際の液滴の監視は、液滴中の検体の増幅速度を分析するために使用できる。例えば、液滴の蛍光発光の強度またはＵＶ吸光度の変化は、液滴中の検体の増幅曲線を導出するために使用できる。増幅曲線は、検体の増幅挙動を検査するために使用できる。利点として、ＰＣＲの際に液滴を監視しているため、ＰＣＲの実施が、ＰＣＲが完了した時点から停止できる。これは、分析にとってより短い全体時間をもたらす。ＰＣＲの際の液滴の監視は、連続的な監視でもよく、検出器１０８が第１マイクロ流体チャネル１０４全体で個々の液滴を監視することが可能である。例えば、検出器１０８は、第１マイクロ流体チャネル１０４全体の下方に設置されたイメージセンサでもよく、検出器１０８のサイズは、第１マイクロ流体チャネル１０４全体を通過する際に液滴の監視を可能にする。

【0052】

特定の実施形態によれば、第１マイクロ流体チャネル１０４の一部が、透明材料で製造することができ、液滴からの蛍光発光またはＵＶ吸光度が透明材料を通過して、検出器１０８に到達できる。本開示の一実施形態によれば、マイクロ流体デバイス１００は、検出器１０８と接続された演算ユニット１１０をさらに備える。演算ユニット１１０は、ＰＣＲ生成物を含有する液滴の百分率を決定するように構成される。こうした実施形態を図４に示す。ＰＣＲ生成物を含有する液滴の百分率の決定は、液滴の蛍光発光またはＵＶ吸光度に基づくものでもよい。

【0053】

演算ユニット１１０は、検体の１つ又はそれ以上のコピーを含有する液滴の数を決定するために使用される。演算ユニット１１０は、検出器１０８からの液滴の蛍光発光またはＵＶ吸光度の入力データ（例えば、画像）に基づいて、ＰＣＲ生成物を含有する液滴の百分率を連続的に決定するように構成されたプロセッサでもよい。

【0054】

本開示の一実施形態によれば、液滴発生器１０７は、演算ユニット１１０と接続される。液滴発生器１０７は、液滴中の検体のコピー回数を変更するように再構成可能である。こうした実施形態を図５に示す。再構成は、液滴のサイズを変更することを含んでもよい。発生した液滴のサイズは、蛍光液滴の百分率に応じて、液滴中の検体のコピーの平均回を変更するように変化してもよい。例えば、蛍光液滴の百分率が高すぎる場合、液滴の体積は減少できる。これは、オイルフローを増加し、検体フローを減少させることによって達成できる。いつでも液滴中の検体のコピー回数は、演算ユニット１１０によって決定される蛍光液滴の百分率に応じて、液滴発生器１０７によって変更できる。

【0055】

演算ユニット１１０は、発生した液滴を連続的に分析してもよい。分析は、蛍光液滴の百分率を決定することを含んでもよい。蛍光液滴の百分率についての情報は、再構成可能な液滴発生器１０７に戻して、発生した液滴中の検体のコピー回数を調整してもよい。液滴の連続分析は、フィードバックループを用いて、システムを最適な精度に近づけることを可能にする。下記の例はこのことを説明する。

【0056】

（例４）
比較的少ない数の液滴を分析した後、液滴の全てまたは大部分が蛍光性であることが判る。これは、液滴当りの検体コピー回数が高すぎることを示すであろう。この場合、液滴発生器１０７は、より低い検体のコピー回数／液滴を含有するより少ない液滴を発生するために使用できる。液滴のサイズをさらに低減できない場合、適切な希釈システムが使用できる。

【0057】

本開示の一実施形態によれば、液滴発生器１０７は、変更可能な希釈システムを含む。希釈システムの希釈値は、検出器１０８および演算ユニット１１０によって分析される液滴の制限された数に基づいて必要に応じて設定できる。発生した液滴中の検体のコピー回数の微調整を実施するために、実験の中断または新しい流体サンプルの投入が要求されないことが利点である。

【0058】

本開示の一実施形態によれば、液滴は、希釈液とともに混合された検体およびＰＣＲ試薬を含んでもよい。例えば、試薬は、ポリメラーゼまたは変異ポリメラーゼ、塩、ｐＨ調整用のバッファ、ヌクレオチドなどでもよい。例えば、希釈液は水でもよい。異なる成分が共に混合される比率は、液滴中の検体の濃度を定義する。検体は、例えば、異なる起源(origin)からのＤＮＡでもよい。液滴発生器は、液滴を発生し、オイルを用いて液滴を相互に分離できる。オイルは、鉱油またはフッ素化オイルでもよい。

【0059】

本開示の一実施形態によれば、検体および試薬の量ならびに希釈液の量を変化させて、第１マイクロ流体チャネル１０４の出口１０３で分析された液滴に基づいて、発生した液滴中の検体のコピー回数を変更できる。

【0060】

本開示の一実施形態によれば、液滴発生器１０７は、検体と結合したとき、例えば、ＤＮＡと結合した場合、光を放出する少なくとも１つのラベルを、それぞれ発生した液滴に添加するように構成される。

【0061】

本開示の一実施形態によれば、マイクロ流体デバイス１００は、第１マイクロ流体チャネル１０４全体を冷却するための熱冷却エレメントをさらに備えてもよい。本開示の一実施形態によれば、熱冷却エレメントは、温度制御ユニットと接続してもよい。熱冷却エレメントは、加熱エレメントとして動作してもよい。熱冷却エレメントは、第１マイクロ流体チャネル１０４の近傍または下方に位置決めでき、温度サイクルの際（ＰＣＲの際）、第１マイクロ流体チャネル１０４を冷却するために使用できる。利点として、熱冷却エレメントは、第１マイクロ流体チャネル１０４を異なる温度になるように循環させるのに要する全体時間を低減できる。

【0062】

本開示の一実施形態によれば、マイクロ流体デバイス１００は、第１マイクロ流体チャネル１０４を少なくとも部分的に取り囲む少なくとも１つの基板貫通溝１０６をさらに備える。こうした実施形態を図６に示す。

【0063】

本開示の一実施形態によれば、第２マイクロ流体チャネル１０５は、基板貫通溝によって少なくとも部分的に取り囲まれる。こうした実施形態を図７に示す。

【0064】

第１マイクロ流体チャネル１０４は、基板貫通溝１０６で第１マイクロ流体チャネル１０４を少なくとも部分的または全て取り囲むことによって、基板の残りから分離できる。溝は、第１マイクロ流体チャネル１０４を基板の残りから絶縁し、反応容器の物理的および熱的質量を低減する。熱的に絶縁された小さな質量を加熱することは、短い熱時定数をもたらす。こうして第１マイクロ流体チャネル１０４は、より短い時間で特定の温度に加熱できる。基板貫通溝は、基板上または基板内にある他のコンポーネントが加熱されないことも確保している。この場合、溝は、熱バリアとして機能し、マイクロ流体デバイス上の種々のコンポーネントの温度を低減する。

【0065】

本開示の一実施形態によれば、マイクロ流体デバイス１００の半導体基板は、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体コンポーネントを封止するために、カバー層、例えば、パイレックス(Pyrex)カバー層と接合、例えば、陽極接合してもよい。カバー層は、基板貫通溝によって取り囲まれたマイクロ流体コンポーネントのための支持部としても機能する。

【0066】

本開示の一実施形態によれば、本開示の第１態様およびその実施形態に記載されたデバイスは、ラボ・オン・チップ(lab-on-a-chip)でもよい。マイクロ流体デバイスの全てのコンポーネントが、ＣＭＯＳ互換の処理テクニックを用いて、シリコンで製造してもよい。これにより、デバイスは、小型化でき費用効果がある方法で製造できる。特定の実施形態によれば、デバイスは、３ｍｍ×３ｍｍ、１０ｍｍ×１０ｍｍまたは２０ｍｍ×２０ｍｍの寸法を有してもよい。

【0067】

本開示の一実施形態によれば、マイクロ流体デバイス１００は、デバイス上の電気コンポーネント、例えば、ＭＥＭＳコンポーネント、ポンプ、ヒータを電気的に接続し、制御するためのトランジスタ層を備えてもよい。トランジスタ層は、マイクロ流体デバイス１００の半導体基板に埋め込んでもよい。

【0068】

本開示の一実施形態によれば、液滴発生器１０７の入口は、流体サンプルを準備するために構成されたマイクロ流体ブロックと接続してもよい。マイクロ流体ブロックは、マイクロ流体デバイスの一部でもよい。マイクロ流体ブロックは、流体サンプルから液滴を発生する前に、流体サンプルを準備する。準備ステップは、流体サンプルを精製したり、または流体サンプルから検体を抽出する精製または抽出ステップを含んでもよい。利点として、マイクロ流体ブロックにより、マイクロ流体デバイス１００が広範囲の流体サンプル、例えば、生体サンプルまたは体液などのために使用可能となり、これによりマイクロ流体デバイス１００に供給する前に、追加の手作業準備ステップを実施する必要がない。

【0069】

本開示の一実施形態によれば、加熱エレメントが、第１マイクロ流体チャネル１０４の出口１０３に設けられる。加熱エレメントは、液滴を、増加する温度に連続的に加熱するように構成してもよい。加熱エレメントの温度は、一定の時間だけ増加でき、例えば、加熱エレメントの温度を１０分間増加させる。液滴は、連続的に増加する温度、例えば、１０分内で６０から９０℃に増加する温度に曝される。温度を連続的に増加させて出口で液滴を加熱することによって、ＰＣＲ生成物の融解曲線分析が実施できる。利点として、融解曲線分析は、特異性(specificity)の制御として使用できる。

【0070】

本開示の第２態様において、本開示の第１態様で説明したようなデバイスを用いてＰＣＲを実施する方法が提示される。該方法は、流体サンプルを、本開示の第１態様およびその実施形態に係るマイクロ流体デバイス１００に供給するステップと、液滴発生器１０７を用いて、流体サンプルの液滴を発生し、該液滴を第１マイクロ流体チャネル１０４内に送り込むステップと、温度制御ユニット１１１を用いて、第１マイクロ流体チャネル１０４全体の温度を少なくとも２つの温度値になるように循環させるステップとを含む。

【0071】

本開示の一実施形態によれば、流体サンプルをマイクロ流体デバイス１００に供給するステップは、希釈液、サンプルおよびＰＣＲ試薬およびキャリア媒体（例えば、オイル）を液滴発生器１０７に供給することを含む。液滴発生器１０７は、予め定めたサイズの液滴を発生し、ポンプを用いて、液滴およびキャリア媒体（例えば、オイル）を調整可能な流速でマイクロ流体デバイス１００の第１マイクロ流体チャネル１０４に供給する。温度制御ユニット１１１は、加熱エレメント１０１を制御し、第１マイクロ流体チャネル１０４を少なくとも２つの温度値に加熱するために使用され、液滴でのＰＣＲを実施する。

【0072】

本開示の一実施形態によれば、液滴を発生し、液滴を送り込むステップは、第１マイクロ流体チャネル１０４が液滴で完全に充填された場合に停止する。

【0073】

バッチ式ＰＣＲを実施する場合、第１ステージにおいて、第１マイクロ流体チャネル１０４は、液滴で部分的または完全に充填される。第２ステージにおいて、ＰＣＲを液滴において実施する。液滴発生器１０７は、第１マイクロ流体チャネル１０４が液滴で部分的または完全に充填されるまで、液滴を発生し、液滴を第１マイクロ流体チャネル１０４に送り込む。その後、送り込みが停止する。その後、第１マイクロ流体チャネル１０４の温度は、少なくとも２つの温度値になるように循環し、ＰＣＲサイクルを液滴において実施する。その後、液滴は、第１マイクロ流体チャネル１０４から送り出され、新たに発生した液滴が、新たなＰＣＲ動作を実施するために第１マイクロ流体チャネル１０４に供給してもよい。この手順は繰り返してもよい。

【0074】

本開示の一実施形態によれば、第１マイクロ流体チャネル１０４の温度を循環することは、液滴中の検体の飽和レベルに到達するまで実施される。温度の循環は、ＰＣＲの飽和ステージに到達した場合、停止する。このステージで、ＰＣＲサイクルが完了し、第１マイクロ流体チャネル１０４内の液滴は、第１マイクロ流体チャネル１０４から送り出される。この動作は、繰り返すことができ、これにより新しいバッチの液滴が、部分的または完全に充填されるまで第１マイクロ流体チャネル１０４に供給され、その後、ＰＣＲが再び実施される。

【0075】

本開示の一実施形態によれば、第１マイクロ流体チャネル１０４の温度を循環することは、液滴を第１マイクロ流体チャネル１０４に送り込みながら、第１マイクロ流体チャネル１０４の温度を少なくとも２つの温度値になるように連続的に循環させることを含む。

【0076】

連続式ＰＣＲを実施するために、液滴が液滴発生器１０７によって発生し、第１マイクロ流体チャネル１０４に送り込まれる。第１マイクロ流体チャネル１０４内の液滴は、常に移動している。液滴が第１マイクロ流体チャネル１０４の入口１０２から第１マイクロ流体チャネル１０４の出口１０３に進行するとき、第１マイクロ流体チャネル１０４内の温度は、少なくとも２つの温度値になるように連続的に循環する。

【0077】

本開示の一実施形態によれば、液滴は、第１マイクロ流体チャネル１０４の温度サイクルの持続時間に適合した流速で、第１マイクロ流体チャネル１０４に送り込まれる。

【0078】

第１マイクロ流体チャネル１０４での液滴の伝搬速度は、液滴発生器１０７の流速によって定義される。この流速は、第１マイクロ流体チャネル１０４の温度サイクルの持続時間に適合している。利点として、第１マイクロ流体チャネル１０４内の液滴の流速、および第１マイクロ流体チャネル１０４の温度サイクルは、互いに適合できる。第１マイクロ流体チャネル１０４内の液滴の流速は、所望の温度サイクルの回数に調整可能であり、各温度サイクルは少なくとも２つの温度値を含む。

【0079】

本開示の一実施形態によれば、該方法は、液滴を第１マイクロ流体チャネル１０４内に送り込む前に、発生した液滴を予備加熱するステップを含む。この予備加熱は、加熱エレメントを用いて実施してもよい。

【0080】

本開示の一実施形態によれば、発生した液滴は、第１マイクロ流体チャネル１０４に入る前に、予め定めた温度（例えば、増幅される検体の変性温度）に加熱される。発生した液滴は、予め定めた温度で第１マイクロ流体チャネル１０４に入る。連続式ＰＣＲを実施する場合、第１マイクロ流体チャネル１０４の温度は、少なくとも２つの温度値になるように連続的に循環される。液滴が未知の温度で第１マイクロ流体チャネル１０４に入るのを回避するために、液滴は、予め定めた温度に予備加熱される。従来、ＰＣＲを実施することは、流体サンプルを変性温度に加熱する第１ステップを含む。変性温度とは異なる温度で処理を開始することは、非特異的増幅を生じさせることがあり、例えば、選択したものとは異なるＤＮＡ断片が増幅されることがある。これは、液滴を予備加熱することによって解消される。例えば、発生した液滴は、予備加熱エレメントの温度、例えば、検体の変性温度で第１マイクロ流体チャネル１０４に入る。

【0081】

本開示の一実施形態によれば、該方法は、検出器１０８を用いて出口１０３で液滴を検出するステップをさらに含む。本開示の一実施形態によれば、ＰＣＲ生成物を含有する液滴の検出は、検出器を用いて液滴の蛍光発光または液滴のＵＶ吸光度を検出することを含む。連続式ＰＣＲを実施する場合、液滴は、第１マイクロ流体チャネル１０４に連続的に送り込まれる。液滴は、第１マイクロ流体チャネル１０４の出口１０３において連続的に監視できる。監視された液滴からの情報、例えば、蛍光発光またはＵＢ吸光度は、液滴発生器１０７へのフィードバックとして使用でき、必要に応じて液滴中の検体のコピー回数を変更する。本開示の一実施形態によれば、液滴中の検体のコピー回数は、演算ユニット１１０によって決定された、ＰＣＲ生成物を含有する液滴の百分率に応じて、液滴発生器１０７によって変更される。液滴中の検体のコピー回数は、液滴発生器１０７の一部でもよい希釈システムを用いて変更してもよい。代替として、液滴中の検体のコピー回数は、液滴発生器１０７によって液滴のサイズを変化させることによって変更してもよい。利点として、フィードバックシステムは、マイクロ流体デバイス１００をリアルタイムで微調整するために使用できる。動作中のこうした微調整は、先行技術デバイスでは不可能である。

【0082】

本開示の一実施形態によれば、該方法は、検出器１０８を用いてＰＣＲ生成物を含有する液滴を計数するステップをさらに含む。本開示の一実施形態によれば、液滴を検出した後、液滴は、液滴の蛍光発光またはＵＶ吸光度に基づいて選別してもよい。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】