特許 6647844 マーカーフリーのトランスジェニック植物を得るための方法および組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6647844

(24)【登録日】2020年1月17日

(45)【発行日】2020年2月14日

(54)【発明の名称】マーカーフリーのトランスジェニック植物を得るための方法および組成物

(51)【国際特許分類】

   A01H 1/00 20060101AFI20200203BHJP

   A01H 5/00 20180101ALI20200203BHJP

   C12N 5/14 20060101ALI20200203BHJP

   C12N 15/65 20060101ALI20200203BHJP

【ＦＩ】

   A01H1/00 AZNA

   A01H5/00 A

   C12N5/14

   C12N15/65 Z

【請求項の数】36

【外国語出願】

【全頁数】41

(21)【出願番号】特願2015-236274(P2015-236274)

(22)【出願日】2015年12月3日

(62)【分割の表示】特願2013-154166(P2013-154166)の分割

【原出願日】2007年5月11日

(65)【公開番号】特開2016-32479(P2016-32479A)

(43)【公開日】2016年3月10日

【審査請求日】2015年12月3日

【審判番号】不服2018-6421(P2018-6421/J1)

【審判請求日】2018年5月9日

(31)【優先権主張番号】60/799,875

(32)【優先日】2006年5月12日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】501231613

【氏名又は名称】モンサント テクノロジー エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100156122

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 剛

(72)【発明者】

【氏名】イェ・シュドン

(72)【発明者】

【氏名】マイケル・ダブリュー・ピーターセン

(72)【発明者】

【氏名】フアン・シーシェー

(72)【発明者】

【氏名】ポール・エス・チョメット

(72)【発明者】

【氏名】デイビッド・ウォルタース

(72)【発明者】

【氏名】スーザン・ジョンソン

(72)【発明者】

【氏名】ラリー・ギルバートソン

【合議体】

【審判長】 田村 聖子

【審判官】 中島 庸子

【審判官】 小暮 道明

(56)【参考文献】

【文献】 中国特許出願公開第１６５４６６２号明細書

【文献】 国際公開第９７／１４８０７号

【文献】 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００４年，Ｖｏｌ．５６１，ｐ．１２７−１３１

【文献】 Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．，２００３年，Ｖｏｌ．２２，ｐ．２４４−２５１

【文献】 Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９９年，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．４，ｐ．４０１−４１２

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

IPC C12N15/00,A01H1/00,A01H5/00

ＣＡＰｌｕｓ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ）

Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

トランスジェニック植物からマーカーフリーの種子を調製する方法であって、
ａ）関心のある核酸を含む第１のＤＮＡセグメントおよび種子中で機能的なプロモーターに作動可能に連結したＤＮＡカセットに物理的に連結したマーカー遺伝子を含む第２のＤＮＡセグメントを含むトランスジェニック植物の種子を得、ここに該ＤＮＡカセットは当該ＤＮＡカセットを含む種子に検出可能な表現型を付与し、該検出可能な表現型が種子の色の変化であり；
ｂ）検出可能な表現型を欠いている種子をスクリーニングし；ついで
ｃ）検出可能な表現型を欠く少なくとも第１の種子を選択して、マーカー遺伝子を含まない種子を得る
工程を含み、
ここに該検出可能な表現型がｇｕｓまたはｇｆｐによって付与されないことを特徴とする、該方法。

【請求項2】

工程ｃ）が、さらに、関心のある核酸の存在について種子をアッセイし、ついで関心のある核酸を含む種子を選択することを含む請求項１記載の方法。

【請求項3】

マーカー遺伝子が選択可能なマーカー遺伝子である請求項１記載の方法。

【請求項4】

マーカー遺伝子がスクリーニング可能なマーカー遺伝子である請求項１記載の方法。

【請求項5】

ＤＮＡカセットが、選択可能なマーカー遺伝子に翻訳的または転写的に融合したＲＮＡをコードする請求項３記載の方法。

【請求項6】

第１のＤＮＡセグメントおよび第２のＤＮＡセグメントが重複している請求項１記載の方法。

【請求項7】

工程ｃ）で選択した種子が、マーカー遺伝子およびＤＮＡカセットを欠いている請求項１記載の方法。

【請求項8】

トランスジェニック植物またはいずれか以前の世代のその先祖を、別のＤＮＡ構築物上の第１および第２のＤＮＡセグメントと同時形質転換する請求項１記載の方法。

【請求項9】

第１および第２のＤＮＡセグメントが異なるＴ−ＤＮＡボーダー配列によって境界が形成されている請求項１記載の方法。

【請求項10】

工程ａ）がトランスジェニック植物またはいずれか以前の世代のその先祖を第１および第２のＤＮＡセグメントを含む単一のＤＮＡ構築物で形質転換することを含む請求項９記載の方法。

【請求項11】

トランスジェニック植物を、植物またはいずれか以前の世代のその先祖を、（ｉ）関心のある核酸を含む左側および右側Ｔ−ＤＮＡボーダーによって挟まれた第１のＤＮＡセグメント、および（ｉｉ）第２のセットの左側および右側Ｔ−ＤＮＡボーダーによって挟まれた第２のＤＮＡセグメントを含み、ここに第２のＤＮＡセグメントはさらにトランスジェニック植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結したマーカー遺伝子を含む、ＤＮＡ構築物で形質転換することによって作成する請求項１記載の方法。

【請求項12】

第１および第２のＤＮＡセグメントが該トランスジェニック植物中で遺伝子的に連結していない請求項１記載の方法。

【請求項13】

第１および第２のＤＮＡセグメントが、該トランスジェニック植物中で遺伝子的に連結している請求項１記載の方法。

【請求項14】

トランスジェニック植物を、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、リゾビウム(Rhizobium)、メソリゾビウム(Mesorhizobium)またはシノリゾビウム(Sinorhizobium)属から選択される細菌菌株によって媒介される形質転換によって、第１および第２のＤＮＡセグメントを該植物またはいずれか以前の世代のその先祖に導入することによって作成する請求項１記載の方法。

【請求項15】

トランスジェニック植物を、マイクロプロジェクタイル・ボンバードメントによって該植物またはいずれか以前の世代のその先祖に第１および第２のＤＮＡセグメントを導入することによって作成する請求項１記載の方法。

【請求項16】

選択可能なマーカー遺伝子が、ＣＰ４ ＥＰＳＰＳ、ホスフィノスリシン・アセチルトランスフェラーゼ、ＤＭＯ、ＮｐｔＩＩ、グリホセートアセチルトランスフェラーゼ、変異型アセト乳酸シンターゼ、メトトレキサート抵抗性ＤＨＦＲ、ダラポンデハロゲナーゼ、ＰＭＩ、Protox、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼおよび５−メチルトリプトファン抵抗性アントラニル酸シンターゼよりなる群から選択される生成物をコードする請求項３記載の方法。

【請求項17】

ＤＮＡカセット配列がｃｒｔＢ遺伝子を含む請求項１記載の方法。

【請求項18】

ＤＮＡカセットが、胚、種子内胚乳、子葉、アリューロンおよび種皮から選択される組織で機能的なプロモーターに作動可能に連結している請求項１記載の方法。

【請求項19】

ＤＮＡカセットが、ナピンプロモーター、ベータ−ファゼオリンプロモーター、ベータ−コングリシニンサブユニットプロモーター、ゼインプロモーター、Ｏｓｇｔ−１プロモーター、オレオシンプロモーター、デンプン合成酵素プロモーター、グロブリン１プロモーター、オオムギＬＴＰ２プロモーター、アルファ−アミラーゼプロモーター、キチナーゼプロモーター、ベータ−グルカナーゼプロモーター、システインプロテイナーゼプロモーター、グルタレドキシンプロモーター、ＨＶＡ１プロモーター、セリンカルボキシペプチダーゼＩＩプロモーター、カタラーゼプロモーター、アルファ−グルコシダーゼプロモーター、ベータ−アミラーゼプロモーター、ＶＰ１プロモーター、ＵＳＰ、ＵＳＰ８８、ＵＳＰ９９、レクチンおよびブロンズ（bronze）２プロモーターよりなる群から選択されるプロモーターに作動可能に連結された核酸配列を含む請求項１記載の方法。

【請求項20】

検出可能な表現型を触媒活性の検出によってアッセイする、請求項１記載の方法。

【請求項21】

工程ｃ）を自動種子ソーティング機によって行う請求項１記載の方法。

【請求項22】

（ａ）植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結した関心のある遺伝子を挟む左側および右側Ｔ−ＤＮＡボーダーを含む第１のＤＮＡセグメント、および（ｂ）ＤＮＡカセットを含む種子に検出可能な表現型を付与するＤＮＡカセットに作動可能に連結した種子中で機能的なプロモーターおよび植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結したマーカー遺伝子を挟む第２のセットの左側および右側Ｔ−ＤＮＡボーダーを含む第２のＤＮＡセグメントを含み、ここに検出可能な表現型が種子の色の変化であり、ＤＮＡカセットがｃｒｔＢ遺伝子を含み、ここに該検出可能な表現型がｇｕｓまたはｇｆｐによって付与されないことを特徴とする、ＤＮＡ構築物。

【請求項23】

マーカー遺伝子が選択可能なマーカー遺伝子である請求項２２記載のＤＮＡ構築物。

【請求項24】

関心のある遺伝子が、除草剤耐性、昆虫もしくは有害生物抵抗性、病気抵抗性、増大したバイオマス、修飾した脂肪酸代謝、修飾した炭水化物代謝、および修飾した栄養品質よりなる群から選択される特性を付与する請求項２２記載の構築物。

【請求項25】

ＤＮＡカセットおよび選択可能なマーカー遺伝子が同一のプロモーターに作動可能に連結された請求項２２記載の構築物。

【請求項26】

ＤＮＡカセットおよび選択可能なマーカー遺伝子が異なるプロモーターに作動可能に連結された請求項２２記載の構築物。

【請求項27】

選択可能なマーカー遺伝子が、ＣＰ４ ＥＰＳＰＳ、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ、ＤＭＯ、ＮｐｔＩＩ、グリホセートアセチルトランスフェラーゼ、変異型アセト乳酸シンターゼ、メトトレキサート抵抗性ＤＨＦＲ、ダラポンデハロゲナーゼ、ＰＭＩ、Ｐｒｏｔｏｘ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼおよび５−メチルトリプロファン抵抗性アントラニル酸シンターゼよりなる群から選択される生成物をコードする請求項２２記載の構築物。

【請求項28】

ＤＮＡカセットが、胚、種子内胚乳、子葉、アリューロンおよび種皮よりなる群から選択される組織で機能的なプロモーターに作動可能に連結された請求項２２記載の構築物。

【請求項29】

ＤＮＡカセットが、ナピンプロモーター、ベータ−ファゼロリンプロモーター、ベータ−コングリシニンサブユニットプロモーター、ゼインプロモーター、Ｏｓｇｔ−１プロモーター、オレオシンプロモーター、デンプン合成酵素プロモーター、グロブリン１プロモーター、オオムギＬＴＰ２プロモーター、アルファ−アミラーゼプロモーター、キチナーゼプロモーター、ベータ−グルカナーゼプロモーター、システインプロテイナーゼプロモーター、グルタレドキシンプロモーター、ＨＶＡ１プロモーター、セリンカルボキシペプチダーゼＩＩプロモーター、カタラーゼプロモーター、アルファ−グルコシダーゼプロモーター、ベータ−アミラーゼプロモーター、ＶＰ１プロモーター、ＵＳＰ、ＵＳＰ８８またはＵＳＰ９９プロモーター、およびブロンズ（bronze）２プロモーターよりなる群から選択されるプロモーターに作動可能に連結された請求項２２記載の構築物。

【請求項30】

請求項２２記載の構築物で形質転換したトランスジェニック細胞。

【請求項31】

請求項２２記載の構築物で形質転換したトランスジェニック植物。

【請求項32】

植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結した関心のある遺伝子を挟む左側および右側Ｔ−ＤＮＡボーダーを含む第１のＤＮＡセグメント、およびＤＮＡカセットを含む種子中で検出可能な表現型を付与するＤＮＡカセットに作動可能に連結した種子中で機能的なプロモーターおよび植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結したマーカー遺伝子を挟む第２のセットの左側および右側Ｔ−ＤＮＡボーダーを含む第２のＤＮＡセグメントを含む第２のＤＮＡ構築物で同時形質転換したトランスジェニック植物であって、ここに検出可能な表現型が種子の色の変化であり、検出可能な表現型を付与するＤＮＡカセットがｃｒｔＢ遺伝子を含み；さらに、該検出可能な表現型がｇｕｓまたはｇｆｐによって付与されないことを特徴とする、該トランスジェニック植物。

【請求項33】

請求項３２記載の植物の細胞。

【請求項34】

右側および左側Ｔ−ＤＮＡボーダーを含むＤＮＡ構築物であって、ここに植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結した関心のある遺伝子を含む第１のＤＮＡセグメントが右側ボーダーの後に位置し、植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結したＤＮＡカセットおよびマーカー遺伝子を含む植物種子に検出可能な表現型を付与するＤＮＡカセットを含む第２のＤＮＡセグメントが左側ボーダーの後に位置し、ここに検出可能な表現型が種子の色の変化であり、検出可能な表現型を付与するＤＮＡカセットがｃｒｔＢ遺伝子を含み；さらに、該検出可能な表現型がｇｕｓまたはｇｆｐによって付与されないことを特徴とする、該ＤＮＡ構築物。

【請求項35】

右側および左側Ｔ−ＤＮＡボーダーを含むＤＮＡ構築物であって、ここにＤＮＡカセットを含む植物種子に検出可能な表現型を付与するＤＮＡカセットおよび植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結したマーカー遺伝子を含む第１のＤＮＡセグメントが右側ボーダーの後に位置し、植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結した関心のある遺伝子を含む第２のＤＮＡセグメントが左側ボーダーの後に位置し、ここに検出可能な表現型が種子の色の変化であり、検出可能な表現型を付与するＤＮＡカセットがｃｒｔＢ遺伝子を含み；さらに、該検出可能な表現型がｇｕｓまたはｇｆｐによって付与されないことを特徴とする、該ＤＮＡ構築物。

【請求項36】

第１および第２の右側Ｔ−ＤＮＡボーダーを含むＤＮＡ構築物であって、ここに植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結した関心のある遺伝子を含む第１のＤＮＡセグメントが第１の右側ボーダーの後に位置し、ＤＮＡカセットを含む植物種子に検出可能な表現型を付与するＤＮＡカセットおよび植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結したマーカー遺伝子を含む第２のＤＮＡセグメントが第２の右側ボーダーの後に位置し、ここに検出可能な表現型が種子の色の変化であり、検出可能な表現型を付与するＤＮＡカセットがｃｒｔＢ遺伝子を含み；さらに、該検出可能な表現型がｇｕｓまたはｇｆｐによって付与されないことを特徴とする、該ＤＮＡ構築物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、参照することによってその全体の開示が本明細書に取り込まれる2006年5月12日に出願した米国仮特許出願60/799,875に基づく優先権を主張する。

【0002】

（１．発明の分野）
本発明は一般的にトランスジェニック植物に関する。より詳細には、本発明は、形質転換植物中の望ましくないまたは不必要なＤＮＡの同定および除去に関する。

【背景技術】

【0003】

（２．関連技術の説明）
形質転換植物中の不必要なまたは望ましくないＤＮＡの同定は、多くの研究の主題であり、かかる植物からこれらのトランスジェニック配列を除去するために多くの異なる方法が努力して調べられている（例えば、Hansonら, 1999 ;Daleら, 1991 ; Ebinumaら, 1997 ; Yoderら, 1994 ; Kononovら, 1997 ; HareおよびChua, 2002; Scuttら, 2002; Puchta, 2003; de Vettenら, 2003; Halpin, 2005; 米国特許公開公報20030110532; 米国特許公開公報20040237142；米国特許第6,458,594号）。一般的には、トランスジェニック植物の農業的に有用な特性に寄与しないトランスジェニックＤＮＡを含まない植物を同定することは有利である。

【0004】

アグロバクテリウム（Agrobacterium）を媒介とする形質転換によって植物にトランスジーンを導入する多くの方法は、トランスジーンおよび関連する遺伝子エレメントを取り込み、ついでこれらを植物のゲノムに移入するＴ−ＤＮＡ（トランスファードＤＮＡ）を利用する。一般的に、トランスジーン（または複数のトランスジーン）は右側ボーダーＤＮＡ分子（ＲＢ）および左側ボーダーＤＮＡ分子（ＬＢ）によって境界が形成され、植物ゲノムに移入され、１またはそれを超える遺伝子座に組み込まれる。ＤＮＡ構築物が１を超えるＴ−ＤＮＡを含む場合、それらのＴ−ＤＮＡおよびその中に含まれるトランスジーンは別の遺伝子座で植物ゲノムに組み込まれ得ることが観察されている（Framondら, 1986）。これは、同時形質転換（co-transformation）といわれる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

同時形質転換法は、別のＴ−ＤＮＡを運搬しているプラスミドで形質転換したアグロバクテリウム菌株の混合物でＴ−ＤＮＡを送達することによって行い得る。同時形質転換は、各々が１のＴ−ＤＮＡを含有する２またはそれを超えるＤＮＡ構築物で１のアグロバクテリウム菌株を形質転換することによっても行い得る。さらなる方法は、単一のＤＮＡベクター上の２のＴ−ＤＮＡ、および異なる遺伝子座にＴ−ＤＮＡを組み込んだトランスジェニック細胞および植物を用いる。マイクロプロジェクタイルを用いるボンバードメントを含むＤＮＡを導入する物理的方法のような非−アグロバクテリウム媒介形質転換系においては、２のＤＮＡ分子を独立して標的ゲノムに組み込み、ついでその後の世代において独立して分離することができる。配列の独立した挿入およびその遺伝的分離を許容する２のＴ−ＤＮＡ構築物の使用は記載されている（例えば、米国特許第5,731,179号; Zhouら, 2003; Breitlerら, 2004; Satoら, 2004）。前記したことは当該技術分野における理解をさらに深めるが、製品開発をより効率的に行うマーカーフリー植物を得るための改善された方法および組成物に対する要望が存在し続けている。以前に記載されているスクリーニング法は非常に労働集約的であり、例えばＲ０および／またはＲ１植物材料を成長させた後にサザンブロットまたはＰＣＲ（登録商標）分析を必要とする。

【0006】

米国特許公開公報20060041956は、アグロバクテリウム媒介形質転換と結合した視覚的マーカー遺伝子の使用を記載している。しかしながら、当該公開公報は、どこでかかるマーカーが選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子に結合し、関心のある遺伝子に結合しないという方法については記載していない。したがって、農業的に有用でないマーカー配列および／または他のトランスジェニックＤＮＡを欠く植物を同定および除去し得る簡便性および効率性を改善する方法および組成物に対して当該技術分野における大きな要望が存在し続けている。

【課題を解決するための手段】

【0007】

１の態様において、本発明は、ａ）関心のある核酸を含む第１のＤＮＡセグメントおよび植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結したＤＮＡカセットに物理学的および／または遺伝学的に連結した植物マーカー遺伝子を含む第２のＤＮＡセグメントで形質転換したトランスジェニック植物の種子を得、ここに該ＤＮＡカセットは当該ＤＮＡカセットを含む種子に検出可能な表現型を付与し；ｂ）検出可能な表現型の不存在について種子をスクリーニングし；ついで、ｃ）検出可能な表現型を欠く少なくとも第１の種子を選択して、マーカー遺伝子を含まない種子を得る、工程を含むトランスジェニック植物からマーカーフリー種子を調製する方法を提供する。１の形態において、工程ｃ）は、さらに、関心のある核酸の存在について種子をアッセイし、ついで、関心のある核酸を含みかつ選択可能なマーカー遺伝子を欠く種子を選択することを含む。

【0008】

ある種の形態において、ＤＮＡカセットは選択可能なマーカー遺伝子に翻訳的または転写的に融合することができ；すなわち、それは選択可能なマーカー遺伝子に翻訳的または転写的に融合したＲＮＡをコードし得る。さらなる形態において、ＤＮＡカセットは、内因性遺伝子に少なくとも１９または２１ｂｐのホモロジーを有するアンチセンスまたはセンスＤＮＡフラグメントを含み、例えば、該アンチセンスまたはセンスＤＮＡフラグメントは種子中で機能的なプロモーターに作動可能に連結している。いまだ他の形態において、ＤＮＡカセットはＤＮＡフラグメントの一対の逆方向反復配列を含み、ここに各フラグメントは少なくとも１９または２１ｂｐのサイズであり、該ＤＮＡフラグメントは種子中で機能的なプロモーターに作動可能に連結した内因性遺伝子に相同である。内因性遺伝子に相同である逆方向ＤＮＡフラグメント反復配列は、選択可能なマーカー遺伝子内のイントロンに置くこともできる。ある種の形態においては、ＤＮＡカセットは少なくとも１９または２１のヌクレオチドを含むセンスまたはアンチセンスＲＮＡをコードし、ここにＤＮＡフラグメントは内因性遺伝子に相同である。

【0009】

本発明に係るマーカーフリー種子を調製する方法においては、選択した種子はスクリーニング可能な遺伝子またはスクリーニング可能なＤＮＡカセットを欠くことができる。トランスジェニック植物の種子を得ることは、第１および第２のＤＮＡセグメントでいずれか以前の世代のトランスジェニック植物またはその先祖を、別のＤＮＡ構築物上の第１および第２のＤＮＡセグメントで形質転換または同時形質転換することも含み得る。トランスジェニック植物の種子を得ることは、トランスジェニック植物またはいずれか以前の世代のその先祖を、第１および第２のＤＮＡセグメントを含む単一のＤＮＡ構築物で形質転換することも含み得る。第１および第２のＤＮＡセグメントは、異なるＴ−ＤＮＡボーダー配列によって境界を形成し得る。本発明の方法においては、トランスジェニック植物は、（ｉ）左側および右側Ｔ−ＤＮＡボーダーによって挟まれた第１のＤＮＡセグメント、および（ｉｉ）第２のセットの左側および右側Ｔ−ＤＮＡボーダーによって挟まれた第２のＤＮＡセグメントを含むＤＮＡ構築物で、植物またはいずれか以前の世代のその先祖を形質転換することによって作製することができ、ここに該第２のＤＮＡセグメントはトランスジェニック植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結した選択可能なマーカー遺伝子をさらに含む。第１および第２のＤＮＡセグメントは、トランスジェニック植物に遺伝子的に連結してもしなくてもよい。

【0010】

本発明により使用するトランスジェニック植物は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、リゾビウム（Rhizobium）、メソリゾビウム（Mesorhizobium）またはシノリゾビウム（Sinorhizobium）属から選択される細菌株によって媒介される形質転換によって、第１および第２のＤＮＡセグメントを植物またはいずれか以前の世代のその先祖に導入することによって作製することができる。トランスジェニック植物は、例えばマイクロプロジェクタイル・ボンバードメントによっても作製することができる。

【0011】

本発明と一緒に使用する選択可能なマーカーは、ＣＰ４ ＥＰＳＰＳ、ｂａｒ、ＤＭＯ、ＮｐｔＩＩ、グリホセートアセチルトランスフェラーゼ、変異型アセト乳酸シンターゼ、メトトレキサート抵抗性ＤＨＦＲ、ダラポンデハロゲナーゼ、ＰＭＩ、Ｐｒｏｔｏｘ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼおよび５−メチルトリプトファン抵抗性アントラニル酸シンターゼよりなる群から選択される生成物をコードし得る。本発明と一緒に使用するＤＮＡカセット配列は、例えば、ｃｒｔＢ、ｇｕｓ、ｇｆｐ、ｓａｃＢ、ｌｕｘ、アントシアニン合成遺伝子、ＤｅｆＨ９−ｉａａＭ、ｒｏｌＢ、ＯｓＣＤＰＫ２、ＡＰ２、ＡＲＦ２、ＡＮＴ転写因子、ＬＥＣ２、Ｓｎｆ−１、ｃｏｂＡ、ＫＡＳ４、ｓｐｌＡ、ゼイン逆方向繰り返し配列、Ｂ−ｐｅｒｕおよび酵母ＡＴＰ−ＰＦＫよりなる群から選択し得る。カセットは、胚、種子内胚乳、子葉、アリューロンおよび種皮から選択される組織中で機能的なプロモーターに作動可能に連結することができる。プロモーターは、例えば、ナピンプロモーター、ベータ−ファゼオリンプロモーター、ベータ−コングリシニンサブユニットプロモーター、ゼインプロモーター、Ｏｓｇｔ−１プロモーター、オレオシンプロモーター、デンプン合成酵素プロモーター、グロブリン１プロモーター、オオムギＬＴＰ２プロモーター、アルファ−アミラーゼプロモーター、キチナーゼプロモーター、ベータ−グルカナーゼプロモーター、システインプロテイナーゼプロモーター、グルタレドキシンプロモーター、ＨＶＡ１プロモーター、セリンカルボキシペプチダーゼＩＩプロモーター、カタラーゼプロモーター、アルファ−グルコシダーゼプロモーター、ベータ−アミラーゼプロモーター、ＶＰ１プロモーター、ＵＳＰプロモーター、ＵＳＰ８８プロモーター、ＵＳＰ９９プロモーター、レクチン、およびブロンズ（bronze）２プロモーターよりなる群から選択し得る。検出可能な表現型は、触媒活性の検出によってアッセイし得る。検出可能な表現型は、種子の色、種子の不透明性、種子の発芽可能性、種子の大きさ、種子の生存能力、種子の形、種子のテクスチャー、および欠陥のあるもしくは発育不全種子よりなる群から選択し得る。種子のスクリーニングは、自動種子ソーティング機によって行い得る。

【0012】

もう１の態様において、本発明は、（ａ）植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結した関心のある遺伝子を挟む左側および右側Ｔ−ＤＮＡボーダーを含む第１のＤＮＡセグメント、および（ｂ）ＤＮＡカセットを含む種子に検出可能な表現型を付与するＤＮＡカセットに作動可能に連結した種子中で機能的なプロモーターを挟む第２のセットの左側および右側Ｔ−ＤＮＡボーダーおよび植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結した選択可能なマーカー遺伝子を含む第２のＤＮＡセグメントを含むＤＮＡ構築物を提供する。関心のある遺伝子は、除草剤耐性、昆虫もしくは有害生物抵抗性、病気抵抗性、増加したバイオマス、修飾された脂肪酸代謝、修飾された炭水化物代謝、および修飾された栄養品質よりなる群から選択される特性を付与し得る。構築物においては、ＤＮＡカセットおよび選択可能なマーカー遺伝子は同一のプロモーターに作動可能に連結し得る。１の形態において、ＤＮＡカセットおよび選択可能なマーカー遺伝子は、異なるプロモーターに作動可能に連結する。特定の形態において、選択可能なマーカー遺伝子は、ＣＰ４ ＥＰＳＰＳ、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ、ＤＭＯ、ＮｐｔＩＩ、グリホセートアセチルトランスフェラーゼ、変異型アセト乳酸シンターゼ、メトトレキサート耐性ＤＨＦＲ、ダラポンデハロゲナーゼ、ＰＭＩ、Ｐｒｏｔｏｘ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼおよび５−メチルトリプトファン抵抗性アントラニル酸シンターゼよりなる群から選択される生成物をコードする。もう１の形態において、ＤＮＡカセットは、ｃｒｔＢ、ｇｕｓ、ｇｆｐ、ｓａｃＢ、ｌｕｘ、アントシアニン合成遺伝子、ＤｅｆＨ９−ｉａａＭ、ｒｏｌＢ、ＯｓＣＤＰＫ２、ＡＰ２、ＡＲＦ２、ＡＮＴ転写因子、ＬＥＣ２、Ｓｎｆ−１、ｃｏｂＡ、ＫＡＳ４、ｓｐｌＡ、ゼイン逆方向繰り返し配列、Ｂ−ｐｅｒｕおよび酵母ＡＴＰ−ＰＦＫよりなる群から選択される。ＤＮＡカセットは、胚、種子内胚乳、子葉、アリューロンおよび種皮よりなる群から選択される組織中で機能的なプロモーターに作動可能に連結することができる。１の形態において、ＤＮＡカセットは、ナピンプロモーター、ベータ−ファゼオリンプロモーター、ベータ−コングリシニンサブユニットプロモーター、ゼインプロモーター、Ｏｓｇｔ−１プロモーター、オレオシンプロモーター、デンプン合成酵素プロモーター、グロブリン１プロモーター、オオムギＬＴＰ２プロモーター、アルファ−アミラーゼプロモーター、キチナーゼプロモーター、ベータ−グルカナーゼプロモーター、システインプロテイナーゼプロモーター、グルタレドキシンプロモーター、ＨＶＡ１プロモーター、セリンカルボキシペプチダーゼＩＩプロモーター、カタラーゼプロモーター、アルファ−グルコシダーゼプロモーター、ベータ−アミラーゼプロモーター、ＶＰ１プロモーター、ＵＳＰ８８またはＵＳＰ９９プロモーターおよびブロンズ２プロモーターよりなる群から選択されるプロモーターに作動可能に連結する。

【0013】

いまだもう１の態様において、本発明は、本明細書に記載する構築物で形質転換したトランスジェニック細胞および植物を提供する。１の形態において、植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結した関心のある遺伝子を挟む左側および右側Ｔ−ＤＮＡボーダーを含む第１のＤＮＡセグメント、および植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結したＤＮＡカセットおよび選択可能なマーカー遺伝子を含む種子に検出可能な表現型を付与するＤＮＡカセットに作動可能に連結した種子中で機能的なプロモーターを挟む第２のセットの左側および右側Ｔ−ＤＮＡボーダーを含む第２のＤＮＡセグメントを含むＤＮＡ構築物で同時形質転換したトランスジェニック植物を提供する。かかる植物の細胞も提供する。

【0014】

なおいまだもう１の態様において、本発明は、右側および左側Ｔ−ＤＮＡボーダーを含むＤＮＡ構築物を提供し、ここに植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結した関心のある遺伝子を含む第１のＤＮＡセグメントは右側ボーダーの後に位置し、植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結したＤＮＡカセットおよび選択可能なマーカー遺伝子のようなマーカー遺伝子を含む植物種子に検出可能な表現型を付与するＤＮＡカセットを含む第２のＤＮＡセグメントは左側ボーダーの後に位置する。

【0015】

なおいまだもう１の態様において、本発明は、右側および左側Ｔ−ＤＮＡボーダーを含むＤＮＡ構築物を提供し、ここに植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結したＤＮＡカセットおよび選択可能なマーカー遺伝子を含む植物種子に検出可能な表現型を付与するＤＮＡカセットを含む第１のＤＮＡセグメントは右側ボーダーの後に位置し、植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結した関心のある遺伝子を含む第２のＤＮＡセグメントは左側ボーダーの後に位置する。

【0016】

なおいまだもう１の態様において、本発明は、２の右側Ｔ−ＤＮＡボーダーを含むＤＮＡ構築物を提供し、ここに植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結した関心のある遺伝子を含む第１のＤＮＡセグメントは１の右側ボーダーの後に位置し、植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結したＤＮＡカセットおよび選択可能なマーカー遺伝子を含む植物に検出可能な表現型を付与するＤＮＡカセットを含む第２のＤＮＡセグメントは他の右側ボーダーの後に位置する。

【0017】

いまだもう１の態様において、本発明は、配列番号：２、配列番号：３、または配列番号：２もしくは配列番号：３に対して少なくとも７０％、７５％、８５％または９５％の同一性を有する配列を含み、かつ、フィトエンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列を提供する。１の形態において、本発明は、配列番号：２または配列番号：３の核酸配列を含む組換えＤＮＡ構築物；または、植物中で機能的な外因性プロモーターに作動可能に連結した、配列番号：２または配列番号：３に少なくとも７１％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有する配列を含み、かつ、フィトエンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ構築物も提供する。かかる配列を含む宿主細胞、ここに該細胞が細菌細胞または植物細胞であることは、本発明のもう１の形態である。もう１の形態において、本発明は、配列番号：２または配列番号：３、配列番号：２、配列番号：３、または配列番号：２もしくは配列番号：３に対して少なくとも７１％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有し、かつ、フィトエンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列を含むトランスジェニック植物または種子を提供する。

【0018】

以下の図面は本願明細書の一部をなし、それを含めて本発明のある種の態様をさらに説明する。本発明は、本明細書に示す具体的な形態の詳細な説明と組み合わせて図面を参照することによってより良好に理解し得る。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1A】ｐＭＯＮ１０３３８の概略図。

【図1B】ｐＭＯＮ１０３３９の概略図。

【図1C】ｐＭＯＮ６７４６５の概略図。

【図2】ｐＭＯＮ６７４６５で形質転換したダイズ組織におけるＣｒｔＢ発現。

【図3】事象Ａ３３９０８からの種子中のＣｒｔＢ発現。

【図4】未熟Ｒ１種子におけるｃｒｔＢ、ｇｕｓおよびＣＰ４／ＥＰＳＰＳの発現。

【図5】成熟Ｒ１種子におけるｃｒｔＢの発現。

【図6】ｐＭＯＮ６７４６５種子のＧＵＳ発現。

【図7】ＧＵＳ陽性種子上のＣＰ４およびＣｒｔＢ ＰＣＲ。

【図8】トランスジェニック事象をスクリーニングするための連鎖−サザンおよびスクリーニング可能なマーカーの比較。

【図9】マーカーフリー種子のためのＣＰ４選択可能なマーカー遺伝子に連結したスクリーニング可能な遺伝子を含む構築物の使用によって移入したＤＮＡ配列の概要。Ａ）ＲＢおよびＬＢによって挟まれた１のＴ−ＤＮＡ中に位置し、アグロバクテリウム媒介形質転換に使用する１の構築物中のＣＰ４選択可能なマーカー遺伝子に連結したスクリーニング可能な遺伝子を含む第２のＴ−ＤＮＡに物理学的に連結したＧＯＩ；Ｂ）２のボーダーを含む１のベクター、ここにＧＯＩはＲＢの後に位置する一方、スクリーニング可能および選択可能なマーカー遺伝子は第２のＲＢの後またはＬＢの後にバックボーンと一緒に位置する；Ｃ）ＧＯＩおよびスクリーニング可能な遺伝子−ＤＮＡは２のベクターに分離しており、１のアグロバクテリウム細胞または別のアグロバクテリウム細胞のいずれかで形質転換する；Ｄ）ＧＯＩおよびスクリーニング可能および選択可能なマーカー遺伝子からの２のＤＮＡセグメントの可能な連結。ＧＯＩ単独のみが正常な種子概観を示す一方、スクリーニング可能な遺伝子を含む細胞は視認できる表現型を示す；Ｅ）２の別のＤＮＡセグメントは、非−細菌媒介形質転換に使用するＧＯＩまたはスクリーニング可能および選択可能なマーカー遺伝子のいずれかを含む。

【図10】ｐＭＯＮ６７４２０は、同時形質転換用のＧＯＩ構築物を表す。

【図11】種子−特異的ゼインプロモーターによって駆動する、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＡＴＰ依存性ホスホフルクトキナーゼを含むプラスミドｐＭＯＮ９９５７５。

【図12】種子特異的酵母ＡＴＰ依存ホスホフルクトキナーゼが破壊された正常な穀粒発達を発現するトウモロコシ穂。

【図13】マーカー遺伝子のイントロン内に位置する反復繰り返しが視認できる表現型を生じることを説明するために用いるｄｓＲＮＡをコードする構築物の概略図。

【図14】視認できる表現型を生じるイントロン内に埋め込まれた反復繰り返し。

【図15】視認できる表現型に通じるトウモロコシ穂中のα−ゼインのサイレンシング。

【図16】ＫＡＳ４を含むｐＭＯＮ８３５３０の概略図。

【図17】ｐＭＯＮ８３５３０で形質転換したダイズ種子の子孫。左側の種子はＫＡＳ４の発現に起因して収縮していて選択可能なマーカーの存在を示す一方、右の種子は正常であってマーカーフリーである。

【図18】２Ｔ ＤＮＡ構築物中の同定配列として有用なＫＡＳ４を含むｐＭＯＮ１０７３１４の概略図。

【図19】同定遺伝子として有用なｓｐｌＡを含むｐＭＯＮ６８５８１の概略図。

【図20】ｐＭＯＮ６８５８１で形質転換した子孫ダイズ種子。右側の種子はｓｐｌＡの発現に起因して収縮していてスクリーニング可能または選択可能なマーカーの存在を示す一方、左の種子は正常であってマーカーフリーである。

【図21】２のＴ−ＤＮＡベクター形式−概略図。

【発明を実施するための形態】

【0020】

（発明の詳細な説明）

【0021】

以下は、本発明を実施することにおいて当業者を助けるために提供した本発明の詳細な説明である。当業者は、本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、本明細書に記載した形態における修飾および変化をなすことができる。

【0022】

本発明は、種子発現した同定遺伝子、配列またはカセットによって付与される表現型に基づいて、同定遺伝子およびマーカー遺伝子配列を含む種子から、同定配列およびマーカー遺伝子配列を欠くが目的の遺伝子または複数の遺伝子（ＧＯＩ）を含む種子を効率的に区別することを許容する構築物および方法を提供することによって、先行技術における欠点を克服する。詳細には、本発明は、１の形態において、（ｉ）関心のある遺伝子；および（ｉｉ）種々の植物組織中で発現し得る選択可能またはスクリーニング可能な遺伝子に物理学的に連結した種子中で発現する同定遺伝子を含む形質転換構造物および植物細胞を形質転換する方法を提供し、ここに該構築物および／または形質転換法は（ｉ）および（ｉｉ）の遺伝因子が独立して植物ゲノムに取り込まれ、したがって遺伝学的に互いに分離するように設計することができる。

【0023】

種子組織における同定配列の発現またはその欠失は、種子発現型同定配列および物理学的に連結した選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を欠く種子および植物の直接的同定を許容する一方、関心のあるトランスジーンをいまだ含む種子および植物の選択を許容する。関心のある遺伝子を含み、種子レベルでマーカー遺伝子を欠く種子を選択することは、それが比較的費用集約的および労働集約的である以前に利用されていたスクリーニング方法の必要性を回避する点において著しい進歩を表す。また、スクリーニングとして省力し得る時間は、例えば連鎖−サザン分析に必要なように、次世代の植物が組織収穫を許容する生長を必要とすることなく、発芽の前またはその間に行うことができる。

【0024】

１の形態において、植物組織の形質転換は、アグロバクテリウムまたは他のリゾビア（Rhizobia）媒介法（例えば、参照することによって本願明細書に特異的に取り込まれる、「Use of Non-Agrobacterium Bacterial Species for Plant Transformation」なる発明の名称で2006年5月16日に出願された米国仮特許出願60／800,872および指定代理人ファイル番号MONS：１００ＵＳＰ１を参照されたい）、および種子で発現する同定配列を含むＤＮＡ配列および物理学的に連鎖した選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子をＴ−ＤＮＡ上または他の配列上に一緒に存在させ、それを植物細胞に移入する方法（例えば、Ｔ−ＤＮＡ ＲＢおよび／またはＬＢ配列によって挟まれた、またはボーダー配列を含まない）によって行う。同定配列およびマーカー遺伝子は、関心のある遺伝子をそれ自体のＲＢおよびＬＢ配列によって挟まれた別のＴ−ＤＮＡ上に存在させつつ物理学的に連鎖した植物に移し得、または他の配列を植物細胞に移してそれを独立した遺伝子座に組み込むことができる（例えば、図２１）。選択可能および／またはスクリーニング可能なマーカーは、形質転換した植物組織の同定を許容する。受精能力のある植物を得ることができ、次世代において表現型の分離を継がせるために、育種スキームにおいて自家受粉または交雑することができる。かかる育種を行う戦略は当該技術分野でよく知られており、異なる植物間で詳細に変化し得る。同定配列の種子発現または発現の欠損は、マーカーおよび同定配列の存在に関して種子の容易な同定を許容する。例えば、関心のある遺伝子は、除草剤耐性、抗生物質抵抗性、昆虫抵抗性、病気抵抗性、ストレス耐性（例えば、渇水および低温）、高められた栄養効率性、高められた栄養含量（例えば、アミノ酸、タンパク質、糖、炭水化物、脂肪酸および／または油）、不稔系、産業用酵素（例えば、医薬およびバイオ燃料用の加工酵素）および高められた収量よりなる群から選択される特性をコードする少なくとも１の植物発現カセットを含み得る。

【0025】

植物細胞に移行し得る配列（例えば、Ｔ−ＤＮＡ）は、形質転換に利用する細菌株中の１の形質転換ベクターに存在し得る。もう１の形態において、同定配列および植物選択可能なマーカーを含む配列、および、関心のある遺伝子（または複数の遺伝子）は細菌株中の別の形質転換ベクター上に存在し得る。いまだもう１の形態において、同定配列および植物選択可能なマーカーを含むＴ−ＤＮＡおよび関心のある遺伝子を含むＴ−ＤＮＡは、形質転換に一緒に用いる別の細菌細胞または細菌株に見出し得る。

【0026】

いまだもう１の形態において、（ｉ）関心のある遺伝子；および（ｉｉ）種子中で発現し、かつ、選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子に物理学的に連鎖した同定配列を含むＤＮＡ配列は、マイクロプロジェクタイル・ボンバードメントのような物理学的方法によって植物細胞に導入することができる。かかる形態において、（ｉ）および（ｉｉ）のＤＮＡ配列は、ＤＮＡでのマイクロプロジェクタイルのコーティングの前またはその間に一緒に混合し得る別のＤＮＡフラグメント上に位置させることができる。ＤＮＡ配列は単一のマイクロプロジェクタイル上に存在させることができ、あるいは、それはボンバードメントに先立って一緒に混合する別のマイクロプロジェクタイル上に存在させることができる。

【0027】

同定配列によって伝達される表現型は、構成的種子特異的プロモーターに連結した外因性または内因性の遺伝子の異所過剰発現、またはアンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡ干渉または同時抑制技術を用いた内因性遺伝子のダウンレギュレーションによって達成し得る。内因性遺伝子の例には、限定されるものではないが、糖／デンプン代謝、タンパク質代謝および脂肪代謝に関与する遺伝子が含まれ得る。

【0028】

１の形態において、同定配列の種子発現は、同定配列を含むトランスジェニック植物の種子に検出可能な表現型を生じる。幾つかの形態において、表現型は、視覚検査によって検出することができ、種子の色、不透明性（または透明性）、蛍光、テクスチャー、大きさ、形、発芽能、生存能力あるいは一般的に物理学的または生化学的にアッセイ可能であって非トランスジェニック受容遺伝子型において見出されるものとは異なるいずれかの成分または特性における変化が含まれ得る。ある種の形態において、同定配列には、ｇｕｓＡ、ｇｆｐ（Pangら, 1996）、フィトエンシンターゼ、またはフィトエンデサチュラーゼをコードする遺伝子、またはアントシアニン遺伝子（Ｐ１、Ｌｃ、Ｂ−Ｐｅｒｕ、Ｃ１、Ｒ、Ｒｃ、ｍｙｂＡまたはｍｙｂ１（例えば、Selingerら, 1998; ludwigら, 1989; Himiら, 2005; Kobayashiら, 2002））が含まれる。特定の形態において、同定遺伝子は、トウモロコシ植物のような単子葉植物における発現に最適化されたｃｒｔＢ配列を含む遺伝子を含む、フィトエンシンターゼをコードするｃｒｔＢ遺伝子を含む（米国特許第5,429,939号；米国特許第6,429,356号；米国特許第5,545,816号）。このことに関して使用し得る遺伝子のもう１の例は、種子顔料の生成に関与する遺伝子である。

【0029】

他の形態において、表現型は、触媒活性の検出によってアッセイ可能である。いまだ他の形態において、表現型は組織切除表現型、例えば花粉、卵または種子組織の形成における遮断である。生殖体の生成または生存能力に必要な遺伝子をサイレンシング（silence）する、マーカー遺伝子を含む受精を減少または妨害する組成物および方法も、想像される。例えば、花粉の発達および生存能力に必要な遺伝子のサイレンシングを生じる配列を使用し得る。マーカー遺伝子を運搬する減数分裂分離から誘導された花粉は発達せず、あるいは見えないであろう。したがって、花粉を介したマーカー遺伝子の子孫への伝達が防がれる。異系交配授粉においては、すべての子孫がマーカーフリーであろう。他の内因性遺伝子のサイレンシングを生じる配列の使用から、種子表現型を生じる他の内因性遺伝子のサイレンシングを生じる配列（ｍｉＲＮＡを含むＲＮＡｉ技術）までの使用も予想される。かかる遺伝子には、限定されるものではないが：ゼインのような種子貯蔵タンパク質、Ｏｐａｑｕｅ２、ｗａｘｙをコードするかまたはその発現を修飾する遺伝子、ならびに種子における炭水化物、タンパク質、および／または脂質蓄積に関与するタンパク質をコードする他の遺伝子が含まれる。

【0030】

非−生存花粉の表現型を付与する同定配列の発現も望ましい。同定配列を有していない花粉穀物のみが卵を受精することができ、したがって、花粉−特異的プロモーターの制御下の同定配列を運搬するトランスジェニック系統を雄性授粉者として用いる場合に同定配列およびマーカー配列を含まない種子の収量を増加するからである。同定配列は、花粉に対して致死的であるかまたは花粉発芽に対して阻害的であるタンパク質を生成し得る。あるいは、必須の内因性花粉遺伝子に相同である一対の逆方向反復塩基配列の発現を用いて、遺伝子をサイレンシングし、花粉を非−生存性とすることができる。花粉特異的な遺伝子およびプロモーターの例は当業者に知られており、例えば、ＬＡＴ５２およびＬＡＴ５９遺伝子、ならびに記載されているトマトのプロモーター（Eyalら, 1995）が含まれる。

【0031】

もう１の形態において、同定配列は、関心のある遺伝子を有する種子の選択をさらに高め、同定配列およびマーカー遺伝子を有する種子を排除するために、種子および花粉の両方において発現させることができる。これは、２のトランスジーンからなる同定配列を用いることによって行い得、そのうちの１は種子中で発現し、もう１は花粉中で発現する。あるいは、花粉および種子中の同じ同定配列を発現し得るプロモーターも、花粉および種子の両方において検出可能な表現型を生じることができる。花粉および種子の両方で発現するプロモーターの例には、トウモロコシWaxy遺伝子（ｚｍＧＢＳ；Shureら, 1983）、およびイネ小サブユニットＡＤＰ−グルコースピロホスフォリアーゼ（ｏｓＡＧＰ；Andersonら, 1991）である。花粉および種子の発現パターンもRussellおよびFromm, 1997に記載されている。

【0032】

あるいは、同定配列は、検出可能な表現型が得られるように、細胞または種子代謝の炭水化物、タンパク質、脂質または他の生成物を変化し得る。１の形態において、同定配列は、同定配列およびマーカー遺伝子を含有する種子におけるデンプン蓄積を破壊するレバンスクラーゼまたは酵母ＡＴＰ依存性ホスホフルクトキナーゼ（ＡＴＰ−ＰＦＫ）をコードするｓａｃＢ遺伝子の内胚乳−特異的発現を許容する（Caimiら, 1996; 図１２）。同定配列は遺伝子とすることができる。同定配列はさらに転写または翻訳融合物をコードし得る（例えば、米国特許第6,307,123号；米国特許公開20060064772）。

【0033】

米国特許第6,307,123号は、選択可能なマーカー遺伝子（ｎｐｔＩＩ）とスクリーニング可能なマーカー遺伝子（ｇｆｐ）との間の翻訳融合物の構築に関する。該方法を適用して、本明細書に記載する同定配列と本明細書に記載する選択可能またはスクリーニング可能なマーカーとの間の融合物を生成することができる。

【0034】

ポリペプチド融合物を作製するために用いることができるもう１の方法は、ユビキチン（Ｕｂ）プロセシング経路に基づく。この方法を用いて、２のタンパク質ドメインを含む長いポリペプチドを２の別々の活性タンパク質に切断する。この方法においては、単一の遺伝子カセットが２のＯＲＦをコードすることができ、その場合の２のＯＲＦ、例えばｃｒｔＢおよびＥＰＳＰＳ−ＣＰ４はＵｂの１４のＣ末端アミノ酸につづいて完全長のＵｂ配列によって分離される。イン・ビボ（in vivo）翻訳後、内因性の脱−ユビキチン化酵素（ＤＵＢ）がポリタンパク質を３の別々のユニットに切断する：１）Ｕｂの１４のＣ末端アミノ酸中で終了する同定配列ｃｒｔＢを含むＮ−末端タンパク質；２）Ｕｂプロモーター、および３）選択可能なマーカーＥＰＳＰＳ−ＣＰ４をコードするＣ−末端ポリペプチド。かかる方法は、当業者に知られている（例えば、Walkerら, 2007）。

【0035】

同定配列と選択可能またはスクリーニング可能なマーカーとの転写融合は、内部リボソーム入口部位（ＩＲＥＳ）を用いることによって作製し得る。例えば、ｃｒｔＢのＯＲＦにつづいてＥＳＰＳＰ−ＣＰ４のＯＲＦをコードする転写物は、それらの間に位置する機能的ＩＲＥＳを用いて作製し得る。幾つかのＩＲＥＳは当業者に知られている（例えば、参照することによって本願明細書に取り込まれる、Dinkovaら, 2005およびその中の参考資料；および、米国特許第7,119,187号を参照されたい）。

【0036】

種子組織における同定配列の表現型は、かずある中で視覚、生化学、免疫学および核酸ベース（例えば、ＰＣＲ−ベース）の方法を含む方法によって検出し得る。同定配列は、検出かのうな表現型をマーカー遺伝子の表現型から区別し得る種子組織における検出可能な表現型を付与し得る。同定配列によって付与された表現型は、種子発芽を変更することを含めることができる。同定配列は、表現型を識別し得るように、胚、内胚乳、子葉（または複数の子葉）、および種皮（種皮）を含む種子（穀粒）の１またはそれを超える部分で発現し得る。

【0037】

同定配列は、種なしの表現型も起し得る。１の形態において、組織破壊を行うために、同定配列は植物におけるｄｅｆＨ９−ｉａａＭまたはｒｏｌＢの胚珠特異的発現を指示し（例えば、Rotinoら, 1997、Carmiら, 2003、GenBank AM422760、X64255、AE009418）、それは発達を阻害し、マーカーおよび同定配列を含む子房において種なし表現型を生じる。いまだもう１の形態において、同定配列は、種子発達を中断する穀物作物におけるＯｓＣＤＰＫ２の過剰発現を指示する（Morelloら, 2000; 例えば、GenBank Y13658）。

【0038】

遺伝子エレメントを設計して、内因性遺伝子の発現を抑制して、マーカー遺伝子を含まない種子からそれを含む種子の識別を許容する種子表現型を生じるようにすることもできる。この同定配列の遺伝子エレメントは、例えばマーカーＤＮＡカセット内に存在させて、種子表現型がマーカーの存在に連鎖させてマーカーを含む種子の迅速な同定を許容するようにマーカー遺伝子に物理学的に連鎖させる。

【0039】

ＲＮＡｉを用いて、容易に記録される、好ましくは目視し得る、種子表現型を生じる１またはそれを超える遺伝子をサイレンシングすることができる。ＲＮＡｉ媒介種子表現型に必要なＤＮＡ配列はマーカー遺伝子と同じＴ−ＤＮＡ上に位置する。マーカー遺伝子を含むいずれの子孫種子も、種子表現型を示し、容易に同定されるであろう。かかる種子は、マーカー遺伝子の存在について生育およびスクリーニングする必要がないであろう。したがって、同定配列によって付与された表現型を有さない種子のみが生育し、および／または、ＧＯＩの存在についてスクリーニングされる。種子が自家授粉または異系交雑からのものであるかに依存して、この方法は自家授粉植物種について少なくとも３×または異系交雑植物種については１×によって植えるおよびスクリーニングする必要がある種子の数を減少する。

【0040】

ＲＮＡｉ関連経路を用いて標的遺伝子をサイレンシングするために用いることができる広範な種々の組成物が、当業者に知られている。１の形態は、配列の逆方向反復塩基配列を転写するＤＮＡカセットを集め、典型的には少なくとも約１９−２１ｂｐ長であってサイレンシングに標的化する１またはそれを超える遺伝子の部分に対応する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を作製することである。ｄｓＲＮＡは約１９−２１ｂｐ長であってサイレンシングに標的化する１またはそれを超える遺伝子の部分に対応することができる。同定配列を含むこのＤＮＡカセットは、選択可能なマーカー遺伝子と同一のＴ−ＤＮＡ内に位置する。当業者に知られている遺伝子をサイレンシングする他の方法には、限定するものではないが：同時抑制、アンチセンス、ｍｉＲＮＡ（天然または設計した）の発現、トランス作用ｓｉＲＮＡの発現、およびリボザイムの発現が含まれる。いずれのこれらの方法も、遺伝子サイレンシング効果が必要な配列がマーカー遺伝子と同一のＴ−ＤＮＡに位置する場合には、用いることができる。

【0041】

同定配列は種子のサイズを増大または減少することができる。１の形態において、同定配列は、同定配列および選択可能なマーカー遺伝子を含むより大きな種子を生じる、アンチセンスＲＮＡまたはＲＮＡ干渉またはコサプレッション技術（Jofukuら, 2005）によってＡＰ２遺伝子（例えば、GenBank U12546）のダウンレギュレーションを付与する。より大きな種子のサイズは、ＡＲＦ２遺伝子（Schruffら, 2006; 例えば、GenBank受理番号NM 203251；NM 180913）、またはＡＮＴ転写因子（MizukamiおよびFisher, 2000; 例えば、GenBank NM 202701、NM 119937、NM 180024、NM 101474、NM 202110）の異所の発現によっても行い得る。もう１の形態において、同定配列は、アンチセンスＲＮＡもしくはＲＮＡｉまたはコサプレッション技術によるＬＥＣ２（例えば、GenBank AF400123）またはＳｎｆ−１（GenBank AB101657、AB101657、AB101655）遺伝子のダウンレギュレーションを運んでおり、これは減少した種子サイズに通じる（Mendozaら, 2005; Radchukら, 2006）。変化した種子サイズは、重量、形または手動および／もしくは機械的手段による篩い分けによって容易にソートすることができる。

【0042】

特定の検出可能な表現型を有する種子の同定のために本発明を用いて自動スクリーニング技術を実行し得ることが特に予期される。このようにして、多数の種子を効率的にスクリーニングすることができ、同定配列を欠く種子を収集し得る。自動技術は、人的技術の信頼よりもより迅速で、より安価でより正確となり得る。この方法で使用することができるかかる種子ソーティング機器は記載されている。例えば、米国特許第4,946,046号は、色に従って種子をソートする装置を記載している。この機器においては、種子を回転式ドラムの均一な列のくぼみに置き、該種子をデジタル式イメージングカメラおよび光源の下側を通過させることによって、色に従って種子をソートする。イメージはカメラによって読まれ、コンピュータに送られ、それはドラム速度センサーからの情報も受ける。コンピュータは空気の突風を引き起こすシグナルを生成して、色の付いた種子を含むくぼみの底部の開口を通して空気を吹き込んでかかる種子を収集する。収集した種子は収集ホッパーに送給され、色の付いていない種子は別のホッパーに送給される。

【0043】

色の付いた種子の検出に用いる光源の波長ならびに色の付いた種子と検出カメラとの間に位置するバリアフィルタを変化させることによって、潜在的にはいずれの同定マーカーもこの技術を用いて検出することができる。例えば、ＧＦＰを発現する種子を検出するためには、励起光は青色光ＵＶスペクトル、典型的には約３９５ｎｍである。ＵＶ放射に好適な光源は当業者によく知られており、キセノンおよび水銀ランプが含まれる。好適なフィルタセットも当業者によく知られており、例えば、ＢＰ４５０−４９０励起フィルタ、ＦＴ５１０発色光スプリッタおよびＢＰ５１５−５６５バリアフィルタ（Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY）が含まれる。かかるフィルタセットおよび放射波長は、その開示全体が参照することによって本明細書に取り込まれるHeimおよびTsienにより詳細に論じられている。

【0044】

１またはそれを超える同定配列（または複数の同定配列）を含む構成を使用することによって、選択力を複数の選択可能なおよび／またはスクリーニング可能な遺伝子および関心のある遺伝子に拡張することができる。したがって、種々の異なる形質転換事象を表す多数のトランスジェニック種子を効率的にスクリーニングすることができ、目的のセットの同定配列を有する（または欠く）種子のみを選択することができる。

【0045】

組換えＤＮＡベクターは、例えば、線状ＤＮＡセグメントまたは閉環プラスミドとすることができる。ベクター系は単一のベクターもしくはプラスミド、または植物ゲノムに導入すべき全ＤＮＡを一緒になって含む２またはそれを超えるベクターまたはプラスミドとすることができる。本明細書に記載する核酸分子は、例えば、植物細胞中で機能して連結したコード配列または他のＤＮＡ配列の発現を駆動する好適なプロモーターの制御下のベクターに好適に挿入することができる。この目的に多くのベクターが利用可能であり、適当なベクターの選択は当該ベクターに挿入すべき核酸のサイズおよび当該ベクターで形質転換すべき特定の宿主細胞に主に依存するであろう。各ベクターは、その機能ならびに一緒に使用しまたは和合性である特定のベクターおよび植物細胞に依存する種々のコンポーネントを含む。

【0046】

植物細胞の安定な形質転換およびトランスジェニック植物の確立に好適な多数のベクターがよく知られている。例えば、Gelvinら(1990)。典型的には、章物発現ベクターには、限定されるものではないが、関心のある転写ユニットの１またはそれを超える遺伝子が含まれ、その各々には５'非翻訳領域が含まれ、それには作動可能に連結されたタンパク質コード配列（「オープンリーディングフレーム」、ＯＲＦ）の転写（例えば、エンハンサー、転写開始点ほかのようなシス作用プロモーター配列）および翻訳（例えば、リボソーム結合部位）を制御する配列が含まれ；３'非翻訳領域が含まれ、それには植物遺伝子の３'末端からのさらなる調節領域（(Thornburgら, 1987)；Anら, 1989）、例えばｍＲＮＡ安定性を上昇する３'ターミネーター領域が含まれる。あるいは、植物発現ベクターは、例えば、ＲＮＡｉ−媒介アプローチによって植物遺伝子発現を変化させ得るｍＲＮＡ分子が発現されるように設計することもできる。さらに、かかる構築物は通常、選択可能および／またはスクリーニング可能なマーカー転写ユニットおよび所望により細菌宿主細胞中でベクターの複製のために必要な複製開始点または他の配列を含むことができる。

【0047】

構築物は、例えば、ｏｒｉ３２２のようなエスシェリキア・コリの複製開始点、ｏｒｉＶまたはｏｒｉＲｉのような広範な宿主範囲の複製開始点のような細菌細胞中の複製機能、ならびに、スペクチノマイシンまたはストレプトマイシンに対する抵抗性を付与するＴｎ７アミノグルコシド・アデニルトランスフェラーゼ（ａａｄＡ）をコードするＳｐｅｃ／Ｓｔｒｐまたはゲンタマイシン（Ｇｍ、Ｇｅｎｔ）選択マーカー遺伝子のような選択マーカーのコード領域のような抗生物質選択を提供するプラスミド骨格ＤＮＡセグメントも含むことができる。植物形質転換については、宿主細菌株は、発現ユニットの移入機能を有するプラスミドを運搬しているアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＡＢＩ、Ｃ５８、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１またはＥＨＡ１０５とする場合がある。植物形質転換の当業者に知られている他の菌株は、本発明において機能し得る。

【0048】

植物発現ベクターは、所望により、ＲＮＡプロセシングシグナル、例えばトランスジーン中のポリペプチドコード配列の上流または下流に位置し得るイントロンを含むことができる。また、発現ベクターは、植物遺伝子の３'−非翻訳領域からのさらなる調節配列も含むことができる。これらの３'非翻訳領域は、ｍＲＮＡ転写終結シグナルを含む。植物発現ベクターに含まれる他の運動可能なエレメントには、５'リーダー配列、トランジットシグナル配列、およびコード配列が含まれ得る。

【0049】

発現およびクローニングベクターには、植物選択マーカーともいわれる選択遺伝子が含まれ得る。この遺伝子は、選択培養様式で成長させる形質転換した植物細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択遺伝子は、除草剤を含む抗生物質、または他の毒素、例えばネオマイシン、メトトレキサート、ジカンバ、グルホシネートまたはグリホセート、のような選択因子に対する抵抗性を付与するタンパク質をコードする。外因性タンパク質またはそのフラグメントで首尾よく形質転換した細胞は、例えば、薬剤抵抗性を付与するタンパク質を生成し、かくして選択様式で生存する。種々の選択可能／スクリーニング可能／評点付け可能なマーカーおよびそれらをコードする遺伝子の例は、MikiおよびMcHugh, 2004に開示されている。

【0050】

ｍＲＮＡを生成する発現ベクターは、宿主植物細胞で認識され、関心のある核酸分子またはそのフラグメントをコードする核酸に作動可能に連結されている。誘導性または組織特異的なプロモーターも含むことができる。植物プロモーターは以下に論じる。

【0051】

１の形態において、使用する植物形質転換ベクターには、本発明の１またはそれを超えるヌクレオチド配列に作動可能に連結した外因性種子特異的プロモーターを含む単離されたおよび精製されたＤＮＡ分子が含まれる。もう１の形態において、プロモーターは種子発現されるが種子特異的でなく、かくして植物細胞におけるｍＲＮＡ以外のものの生成を許容する。当業者であれば、ＤＮＡのセグメントをトランスジェニック植物における発現のために単一のコンポジットＤＮＡセグメントに結合し得ることを容易に理解するであろう。

【0052】

本発明と一緒に用いる宿主細胞の形質転換に好適な方法は、プロトプラストの形質転換による（米国特許第5,508,184号; Omirullehら, 1993）、乾燥／阻害−媒介ＤＮＡ取込みによる（Potrykusら, 1985）、エレクトロポレーションによる（米国特許第5,384,253号）、炭化珪素ファイバーとの振とうによる（Kaepplerら, 1990; 米国特許第5,302,523号；および米国特許第5,464,765号）、アグロバクテリウム−媒介形質転換による（米国特許第5,563,055号; 第5,591,616号; 第5,693,512号; 第5,824,877号; 第5,981,840号; 第6,384,301号）およびＤＮＡコート粒子の加速による（米国特許第5,015,580号; 第5,550,318号; 第5,538,880号; 第6,160,208号; 第6,399,861号; 第6,403,865号; Padgetteら, 1995）などのような、それによってＤＮＡを細胞に導入することができる実質的にいずれの方法も含むと考えられる。これらのような技術の適用を通して、実質的にいずれの種の細胞も安定に形質転換することができる。多細胞生物種の場合、形質転換細胞はトランスジェニック生物に再生することができる。

【0053】

発現ベクターを植物に導入する最も広範に利用されている方法は、アグロバクテリウムの天然形質転換系に基づく（例えば、Horschら, 1985）。アグロバクテリウム・ツメファシエンスおよびリゾゲネスのＴｉおよびＲｉプラスミドは、各々、植物の遺伝子形質転換に寄与する遺伝子を運搬している。アグロバクテリウムベクター系およびアグロバクテリウム−媒介遺伝子トランスファーの説明は多くの参考文献によって提供されており、それにはGruberら, 1993; Mikiら, 1993, Moloneyら, 1989, および米国特許第4,940,838号および第5,464,763号が含まれる。シノリゾビウム（Sinorhizobium）、リゾビウム（Rhizobium）およびメソリゾビウム（Mesorhizobium）のような天然に植物と相互作用する他の細菌を修飾して多数の多様な植物への遺伝子トランスファーを媒介することができる（Broothaertsら, 2005）。これらの植物関連の共生細菌は、ディスアームドＴｉプラスミドおよび好適なバイナリーベクターの両方を獲得することによって遺伝子トランスファーにコンピーテントとすることができる。アグロバクテリウム−媒介形質転換法を介してトランスファーすべきＤＮＡ配列には、植物細胞中で発現すべき１またはそれを超える遺伝子を含むトランスファーＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）の範囲を通常決定する右側ボーダー（ＲＢ）および左側ボーダー（ＬＢ）配列のような１またはそれを超える「ボーダー」配列が含まれ、さらに、オーバードライブ配列（Toroら, 1989）または参照することによって本明細書に取り込まれる米国仮特許出願60/831,814に開示されているような複数のオーバードライブ配列のようなエンハンサー配列を含むことができる。

【0054】

ワタ形質転換の関係で特に有用となり得る技術は、米国特許第5,846.797、5,159,135号、第5,004,863号および第6,624,344号に開示されている。特にアブラナ属植物を形質転換する技術は、例えば米国特許第5,750,871号に開示されており；ダイズを形質転換する技術は、例えば、Zhangら, 1999、米国特許第6,384,301号および米国特許第7,002,058号に開示されている。本発明を用いた用途を見出し得る植物のいくつかの非限定的な例には、アルファルファ、オオムギ、豆類、ビート、ブロッコリ、キャベツ、ニンジン、キャノーラ、カリフラワー、セロリー、ハクサイ、トウモロコシ、ワタ、キュウリ、ナス、ウイキョウ、インゲンマメ、ヒョウタン、ニラネギ、レタス、メロン、エンバク、オクラ、タマネギ、エンドウ、コショウ、カボチャ、ラッカセイ、ジャガイモ、カボチャ、ダイコン、イネ、サトウモロコシ、ダイズ、ホウレンソウ、カボチャ、スウィートコーン、テンサイ、ヒマワリ、トマト、スイカおよびコムギが含まれる。

【0055】

ベクターまたは構築物は、種々の調節領域も含み得る。５'非−翻訳リーダー配列は、選択したプロモーターに由来して本発明のＤＮＡ分子の外因性遺伝子配列を発現することができ、望まれる場合には、ｍＲＮＡの翻訳が上昇するように特異的に修飾することができる。５'非−翻訳領域は選択したプロモーターから誘導して本発明のＤＮＡ分子の外因性遺伝子配列を発現させることができ、望ましい場合は、ｍＲＮＡの翻訳を増大するように特異的に修飾することができる。５'非−翻訳領域は、植物ウイルスＲＮＡ（例えば、タバコモザイクウイルス、タバコエッチウイルス、トウモロコシ矮化モザイクウイルス、アルファルファモザイクウイルス）から、好適な真核生物遺伝子、植物遺伝子（コムギおよびトウモロコシ・クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子リーダー）から、または合成遺伝子配列からも得ることができる。リーダー配列は、非関連のプロモーターまたはコード配列からも誘導し得る。本発明の関係で有用なリーダー配列には、トウモロコシＨｓｐ７０リーダー（参照することによってその全体が本明細書に取り込まれる、米国特許第5,362,865号および米国特許第5,859,347号）およびＴＭＶオメガエレメント（Gallieら, 1989）が含まれる。翻訳リーダーの例には、数ある中でも、トウモロコシおよびペチュニアのヒートショックタンパク質リーダー（米国特許第5,362,865）、植物ウイルスコートタンパク質リーダー、植物ｒｕｂｉｓｃｏリーダー、ＧｍＨｓｐ（米国特許第5,659,122号）、ＰｈＤｎａＫ（米国特許第5,362,865号）、ＡｔＡｎｔ１、ＴＥＶ（CarringtonおよびFreed, 1990）、ＡＧＲｔｕｎｏｓ（GenBank受理番号V00087；Bevanら, 1983）、ＯｓＡｃｔ１（米国特許第5641876号）、ＯｓＴＰＩ（米国特許第7,132,528号）およびＯｓＡｃｔ１５（米国特許公開番号20060162010）が含まれる。

【0056】

イントロン配列は単子葉植物細胞中のトランスジーンの発現を援助することが当該技術分野で知られている。イントロンの例には、トウモロコシ・アクチンイントロン（米国特許第5,641,876号）、トウモロコシＨＳＰ７０イントロン（ＺｍＨＳＰ７０；米国特許第5,859,347号；米国特許第5,424,412号）およびイネＴＰＩイントロン（ＯｓＴＰＩ；米国特許第7,132,528）が含まれ、本発明を実施するのに有利である。

【0057】

ベクターはトランジット・ペプチド核酸配列も含むことができる。カロテノイド合成に関与するものを含む多くのクロロプラスト局在タンパク質が前駆体として核遺伝子から発現し、インポート工程の後に削除されるクロロプラストトランジットペプチド（ＣＴＰ）によってクロロプラストに標的化される。他のかかるクロロプラストタンパク質の例には、リブロース−１,５−ビスホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニット（ＳＳＵ）、ならびに集光性複合体タンパク質Ｉおよびタンパク質ＩＩが含まれる。非−クロロプラストタンパク質をＣＴＰとの融合タンパク質の使用によってクロロプラストに標的化し得ること、ならびに、ＣＴＰ配列がタンパク質をクロロプラストに標的化するのに十分であることはイン・ビボ(in vivo)およびイン・ビトロ(in vitro)で実証されている。アラビドプシス・タリアーナ（Arabidopsis thaliana）（Ａｔ）ＥＰＳＰＳ ＣＴＰ（Kleeら, 1987）およびペチュニア・ハイブリダ（Ｐｈ）ＥＰＳＰＳ ＣＴＰ（della-Cioppaら, 1986）のような好適なクロロプラスト・トランジットペプチドの取込みが、外因性タンパク質配列をトランスジェニック植物のクロロプラストに標的化することが示されている。当業者であれば、必要であれば、特定のＣＴＰの機能性を利用して所与の遺伝子産物をクロロプラストに輸入する種々のキメラ構築物を作製し得ることを認識するであろう。本発明を実施するのに有用となり得る他のＣＴＰには、ＰｓＲｂｃＳ由来ＣＴＰ（ピサム・サティバム（Pisum sativum）Ｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニットＣＴＰ；Coruzziら, 1984）；ＡｒＲｂｃＳ ＣＴＰ（アラビドプシス・タリアーナRubisco小サブユニット１Ａ ＣＴＰ；ＣＴＰ１；米国特許第5,728,925号）；ＡｔＳｈｋＧ ＣＴＰ（ＣＴＰ２；Kleeら, 1987）；ＡｔＳｈｋＧＺｍ ＣＴＰ（ＣＴＰ２合成；単子葉植物発現に最適化したコドン；WO04009761の配列番号：14）；ＰｈＳｈｋＧ ＣＴＰ（ペチュニア・ハイブリダＥＰＳＰＳ；ＣＴＰ４；単子葉植物発現に最適化したコドン；Gasserら, 1988）；ＴａＷａｘｙ ＣＴＰ（トリチカム・アエスチバム（Triticum aestivum）顆粒結合デンプン合成酵素ＣＴＰ合成、トウモロコシ発現に最適化したコドン；Clarkら, 1991）；ＯｓＷａｘｙ ＣＴＰ（オリザ・サティバ（Oryza sativa）デンプン合成酵素ＣＴＰ；Okagaki, 1992）；ＮｔＲｂｃＳ ＣＴＰ（ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）リブロース1,5-二リン酸カルボキシラーゼ小サブユニットクロロプラスト・トランジット・ペプチド；Mazurら, 1985)；ＺｍＡＳ ＣＴＰ（ゼア・メイズ（Zea mays）アントラニル酸シンターゼ・アルファ２サブユニット遺伝子ＣＴＰ；Gardinerら, 2004）；およびＲｇＡＳ ＣＴＰ（ルタ・グラベオレンズ（Ruta graveolens）アントラニル酸シンターゼＣＴＰ；Bohlmannら, 1995）が含まれる。有用となり得る他のトランジット・ペプチドには、トウモロコシｃａｂ−ｍ７シグナル配列（PCT WO 97/41228）およびエンドウ(Pisum sativum)グルタチオン還元酵素シグナル配列（PCT WO 97/41228）が含まれる。

【0058】

転写の終結は、組換えトランスジーン（例えば、関心のある遺伝子、スクリーニング可能な遺伝子を含む同定配列、または植物選択マーカー遺伝子）に作動可能に連結した３'非−翻訳ＤＮＡ配列によって行い得る。組換えＤＮＡ分子の３'非−翻訳領域は、植物中で機能してＲＮＡの３'末端にアデニル酸ヌクレオチドの付加を引き起こすポリアデニル化シグナルを含む。３'非−翻訳領域は植物細胞中で発現する種々の遺伝子から得ることができる。ノパリンシンターゼ３'非翻訳領域（(Fraleyら, 1983）はこのキャパシティーにおいて通常使用される。ピサム・サティバム（Pisum sativum）Ｒｂｃ２遺伝子からのポリアデニル化分子（Ｐｓ．ＲｂｃＳ２−Ｅ９；Coruzziら, 1984）、ＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ（Genbank受理番号E01312）、Ｅ６（受理番号U30508）、イネ・グルテリン（Okitaら, 1989）およびＴａＨｓｐ１７（コムギ低分子量ヒートショックタンパク質遺伝子；受理番号X13431）は本発明を用いる使用に特に有利となり得る。

【0059】

構造プロモーターの使用が望ましい本発明の形態のためには、いずれのよく知られた構造植物プロモーターも使用することができる。構造植物プロモーターには、例えばカリフラワーモザイクウイルス（CaMV)３５Ｓプロモーターが含まれ、それは単子葉（例えば、Dekeyserら, 1990）；Teradaら, 1990）を含む大部分の植物組織において構造的な高レベルの発現を付与し（例えば、Odellら, 1985）、ノパリンシンターゼプロモーター（Anら, 1988）、オクトピンシンターゼプロモーター（Frommら, 1989）、カリフラワーモザイクウイルス１９Ｓプロモーター、ゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター、マンノピンシンターゼプロモーターおよびヒストンプロモーターが含まれる。

【0060】

本発明の他の形態のために、環境、ホルモン、化学的および／または発生シグナルに応答して調節されるよく知られた植物遺伝子プロモーターを用いることができ、それには、（１）熱（Callisら, 1988）、（２）光（例えばエンドウｒｂｃＳ−３Ａプロモーター、Kuhlemeierら, 1989；トウモロコシｒｂｃＳプロモーター、SchaffnerおよびSheen, 1991；またはクロロフィルａ／ｂ−結合タンパク質プロモーター、Simpsonら, 1985）、（３）アブシジン酸のようなホルモン（Marcotteら, 1989）、（４）傷（例えば、wunl, Siebertzら, 1989）；または（５）ジャスモン酸メチル、サリチル酸ほかのような化学物質によって調節されるプロモーターが含まれる。また、（６）器官−特異的プロモーター（例えば、Roshalら, 1987; Schernthanerら, 1988; Bustosら, 1989）を用いることも有利になり得る。

【0061】

トランスジェニック植物中のポリヌクレオチドの組織−特異的発現を駆動するために使用し得る広範な種々の植物プロモーター配列が存在する。事実、本発明の特定の形態において、使用するプロモーターは種子特異的なプロモーターである。β−コングリシニンのプロモーター（Chenら, 1989）またはナピンプロモーターのような他の種子−特異的プロモーターは、植物種子成熟の間に調節され（Kridlら, 1991; Kohno-Muraseら, 1994）、オオムギＨｖ．Ｐｅｒ１（Staceyら, 1996）、ファゼオリン（Bustosら, 1989）、ダイズトリプシンインヒビター（Riggsら, 1989）、ＡＣＰ（Baersonら, 1993）、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（Slocombeら, 1994）、ダイズ β−コングリシニンのα'サブユニット（Ｐ−Ｇｍ７Ｓ、例えばChenら, 1986を参照されたい）、Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ ＵＳＰ（Ｐ−Ｖｆ．Ｕｓｐ、例えば配列番号：１、２および３、米国特許出願20030229918を参照されたい）、グロブリンプロモーター（例えば、BelangerおよびKriz, 1991を参照されたい）、ダイズβ−コングリシニンのアルファ・サブユニット（７Ｓアルファ；参照することによって取り込まれる米国特許第6,825,398号）およびゼア・メイズ（Zea mays）Ｌ３オレオシンプロモーター（Ｐ−Ｚｍ．Ｌ３、例えばHongらを参照されたい；また、参照することによってその開示が具体的に本明細書に取り込まれる米国特許第6,433,252号）が含まれる。

【0062】

ゼインはゼア・メイズ（Zea mays）内胚乳に見出される一群の貯蔵タンパク質である。ゼイン遺伝子のゲノムクローンが単離されており（Pedersenら, 1982；米国特許第6,326,527号）、１５ｋＤａ、１６ｋＤａ、１９ｋＤａ、２２ｋＤ、２７ｋＤａおよびガンマ遺伝子を含むこれらのクローンからのプロモーターも用いることができる。例えば、ゼア・メイズで機能することが知られている他のプロモーターには、以下の遺伝子のプロモーターが含まれる：ｗａｘｙ（RussellおよびFromm, 1997；Shureら, 1983)、Ｂｒｉｔｔｌｅ (Girouxら, 1994)、Ｓｈｒｕｎｋｅｎ ２、分枝酵素ＩおよびＩＩ、デンプン合成酵素、脱分枝酵素、オレオシン、グルテリン、スクロースシンターゼ。ゼア・メイズ内胚乳発現用の他のプロモーターは、イネからのグルテリン遺伝子のプロモーター、より詳細にはＯｓｇｔ−１プロモーター（Zhengら, 1993）である。イネにおけるかかるプロモーターの例は、ＡＤＰＧＰＰサブユニットのプロモーター、顆粒結合および他のデンプン合成酵素、分枝酵素、脱分枝酵素、スクロースシンターゼ（Yangら, 1990）およびＢｅｔｌ１（基底内胚乳移動層）およびグルテリン１が含まれる。

【0063】

本発明で有用となり得る他のプロモーターの例は、米国特許第6,437,217号（トウモロコシＲＳ８１プロモーター）、米国特許第5,641,876号（イネアクチンプロモーター；ＯｓＡｃｔ１）、米国特許第6,426,446号（トウモロコシＲＳ３２４プロモーター）、米国特許第6,429,362号（トウモロコシＰＲ−１プロモーター）、米国特許第6,232,526号（トウモロコシＡ３プロモーター）、米国特許第6,177,611号（構造的トウモロコシプロモーター）、米国特許第5,322,938号、第5,352,605号、第5,359,142号および第5,530,196号（３５Ｓプロモーター）、米国特許第6,433,252号（トウモロコシＬ３オレオシンプロモーター）、米国特許第6,429,357号（イネアクチン２プロモーターならびにイネアクチン２イントロン）、米国特許第5,837,848号（根特異的プロモーター）、米国特許第6,294,714号（光誘導プロモーター）、米国特許第6,140,078号（塩誘導プロモーター）、米国特許第6,252,138号（病原菌誘導プロモーター）、米国特許第6,175,060号（リン欠乏誘導プロモーター）、米国特許第6,635,806号（ガンマ−コイキシンプロモーター）および米国特許第7,151,204号（トウモロコシクロロプラスト・アドラーゼプロモーター）が含まれる。用途を見出し得るさらなるプロモーターは、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモーター（Ebertら, 1987）、オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）プロモーター（それはアグロバクテリウム・ツメファシエンスの癌腫誘導プラスミド上に運搬されている）、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）１９Ｓプロモーター（Lawtonら, 1987）、CaMV ３５Ｓプロモーター（Odellら, 1985）、ゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Walkerら, 1987）のようなカリモウイルスプロモーター、スクロースシンターゼプロモーター（Yangら, 1990）、Ｒ遺伝子複合体プロモーター（Chandlerら, 1989）およびクロロフィル結合ａ／ｂ結合タンパク質遺伝子プロモーターほかが含まれる。本発明においては、エンハンサー配列を有するＣａＭＶ３５Ｓ（ｅ３５Ｓ；米国特許第5,322,938号；第5,352,605号；第5,359,142号；および第5,530,196号）、ＦＭＶ３５Ｓ（米国特許第6,051,753号；第5,378,619号）、peanut chlorotic streak caulimovirus (ＰＣｌＳＶ；米国特許第5,850,019号）、Ａｔ．Ａｃｔ ７（受理番号U27811）、Ａｔ．ＡＮＴ１（米国特許公開公報20060236420）、ＦＭＶ．３５Ｓ−ＥＦ１ａ（米国特許公開公報20050022261）、ｅＩＦ４Ａ１０（受理番号X79008）およびＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ（GenBank受理番号V00087；Depickerら, 1982；Bevanら, 1983）、イネサイトゾル・トリオースリン酸イソメラーゼ（OsTPI；米国特許第7,132,528号)、およびイネアクチン１５遺伝子（ＯｓＡｃｔ１５；米国特許公開公報20060162010）プロモーターは特に有利である。幾つかの例、例えばＯｓＴＰＩおよびＯｓＡｃｔ １５において、プロモーターは５'ＵＴＲおよび／または第１のイントロンを含むことができる。当業者によって知られている本発明を実施するのに有用な他のプロモーターも本発明によって予想されている。

【0064】

植物発現ベクターは、本発明において使用して分離する細胞または発現用（発現の喪失）の子孫をモニターすることができるスクリーニング可能または評点付け可能なマーカー遺伝子カセットも含むことができる。例示的なマーカーは知られており、種々の発色性基質の酵素をコードするβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）（Jeffersonら, 1987a；Jeffersonら, 1987b）；植物組織中でのアントシアニン色素（赤色）の生成を調節する産物をコードするＲ−遺伝子座（Dellaportaら, 1988）；β−ラクタマーゼ遺伝子（Sutcliffeら, 1978）；種々の発色性基質の酵素をコードする遺伝子（例えば、ＰＡＤＡＣ、発色性セファロスポリン）；ルシフェラーゼ遺伝子（Owら, 1986）；発色性カテコールを変換することができるカテコールジオキシゲナーゼをコードするｘｙ１Ｅ遺伝子（Zukowskyら, 1983）；α−アミラーゼ遺伝子（Ikatuら, 1990）；チロシンをＤＯＰＡおよびドーパミンに酸化し、ついでメラニンに縮合することができる酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子（Katzら, 1983）；緑色蛍光タンパク質（Elliotら, 1999）およびα−ガラクトシダーゼ）が含まれる。スクリーニング可能または評点付け可能なマーカー遺伝子は、スクリーニング可能または評点付け可能な遺伝子を含む同定配列と同じ遺伝子産物をコードすることができ、あるいは異なる遺伝子産物をコードすることができる。しかしながら、同定配列は卵、花粉または種子組織で発現され、一方スクリーニング可能または評点付け可能なマーカー遺伝子は形質転換植物細胞を同定する工程の間に発現する。同定配列は構成的に発現させることもできるが、卵、花粉または種子組織における表現型を運ぶのみでもよい。

【0065】

トランスジェニック植物は、植物細胞培養の分野でよく知られている方法によって形質転換植物細胞から再生することができる。アグロバクテリウム形質転換法を用いて形成したトランスジェニック植物は、典型的に、１つの染色体に挿入された単一の単純な組換えＤＮＡ配列を含み、トランスジェニック事象といわれる。かかるトランスジェニック植物は、挿入した外因性配列に対して異型接合であるということができる。トランスジーンに関して同型接合であるトランスジェニック植物は、単一の外因性遺伝子配列を含む独立した分離するトランスジェニック植物をそれ自体に交雑（自家授粉）することによって得ることができ、例えばＦ０植物からＦ１種子を得ることができる。生成したＦ１種子の１／４はトランスジーンに関して同型接合であろう。Ｆ１種子を発芽させると植物を生じ、それは典型的には異型接合体および同型接合体の間の区別を許容するＳＮＰアッセイまたは加熱増幅アッセイを用いて接合性について試験することができる（すなわち、接合性アッセイ）。

【0066】

多数の同定配列を使用することができ、例えば、その発現が視認し得る表現型を生じ得る遺伝子を用いることができ、それにはｇｕｓ、ｇｆｐおよびｌｕｃの使用が含まれる（例えば、Owら, 1986；WO 97/41228および米国特許第6,583,338号；例えばM26194; M15077を参照されたい）。「shurunken」種子表現型に通じるレバンスクラーゼ遺伝子、ＳａｃＢ（Caimiら, 1996；例えば、X02730）、または発芽の素材に通じるピロホスファターゼ遺伝子（Hajirezaeiら, 1999）も用いることができる。フィトエンシンターゼをコードする遺伝子（ｃｒｔＢ）も当該技術分野において知られており、それには、数ある中でもエルビニア・ウレドボーラ（Erwinia uredovora）（例えば、Misawaら, 1990；SandmannおよびMisawa, 1992；米国特許第5,429,939号；第6,429,356号）およびパントエア／エンテロバクター・アグロメランス（Pantoea/Enterobacter agglomerans）（例えば、GenBank M38423; M87280）からのものが含まれる。

【0067】

多面発現性種子発現型を生成する大部分のトランスジーンは、スクリーニング可能なマーカーに連結した視認し得る標識遺伝子として用いて、関心のある陽性種子のマーカーフリー遺伝子を同定することができる。視認可能な表現型はトランスジーンの異所性過剰発現によって生成することができ、またはアンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡ干渉または同時抑制技術によって内因性代謝経路遺伝子のダウンレギュレーションからも生じ得る。

【0068】

以下の定義および方法を提供して本発明をより良好に規定し、当業者が本発明を実施することに案内する。別段指摘しない限り、用語は、関連する技術における当業者による慣用的な用法に従って理解されるべきである。分子生物学における一般的な用語の定義は、Riegerら (1991)；およびLewin (1994)にも見出すことができる。３７ ＣＦＲセクション１．８２２に記載されているＤＮＡ塩基の命名法を用いる。

【0069】

「ＣＰ４」、「ａｒｏＡ：ＣＰ４」、「ＡＧＲＴＵ.ａｒｏＡ：ＣＰ４」、「ＣＰ４ ＥＰＳＰＳ」および「ＥＰＳＰＳ ＣＰ４」とは、ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（ＡＧＲＴＵ）ＣＰ４株から精製したタンパク質をいい、それは植物で発現した場合、グリホセートおよびグリホセート含有除草剤処方に対する耐性を付与する（参照することによってその全体が本明細書に取り込まれる米国特許第5,633,435号）。遺伝子配列はネイティブであっても、植物において発現を高めるために修飾されていてもよい。

【0070】

ＤＮＡ「セグメント」とは、ＤＮＡ構築物のＤＮＡ配列の領域をいう。ＤＮＡセグメントは、アグロバクテリウム−媒介植物細胞形質転換に用いる構築物に見出されるＴ−ＤＮＡ分子の中、間に存在するかまたはそれを挟んで存在することができる。例えば、ＤＮＡセグメントは、細菌中のプラスミドの複製のための遺伝子エレメントまたは他の種々のエレメント、ならびに、植物細胞形質転換に使用するよう設計されたＤＮＡ構築物の発現カセットを含むことができる。したがって、「ＤＮＡカセット」は、細胞中のＤＮＡ配列の発現のためのエレメント（または複数のエレメント）を含むＤＮＡセグメントを含むことができる。

【0071】

「融合タンパク質」とは、単一の単位として発現される翻訳融合物をいい、非−融合出発遺伝子配列によってコードされるタンパク質の表現型を付与する遺伝子産物をいまだ産生する。

【0072】

「単離した」核酸とは、天然発生する核酸、すなわち他の染色体および染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡを含む生物の細胞中の他の核酸配列から、慣用的な核酸精製方法によって実質的に分離または精製されたものである。該語は、組換え核酸および化学合成核酸も包含する。

【0073】

「グリホセート抵抗性遺伝子」とは、植物中でトランスジーンとして発現した場合に、さもなければ植物を損傷または殺すであろう除草剤グリホセートの耐性レベルの能力を付与するいずれの遺伝子をもいう。当業者に知られているいずれのグリホセート耐性遺伝子も、本発明の実施における使用に好適である。グリホセート（Ｎ−ホスホノメチルグリシンおよびいずれのその塩のいずれか除草剤的に活性な形を含む）は、酵素５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）を阻害する。グリホセート耐性を付与するために、種々の天然および変異型ＥＰＳＰＳ酵素がトランスジェニック植物で発現されており、それらのいずれのものも本発明において使用することができる。これらのＥＰＳＰＳの幾つかの例には、米国特許第4,940,835号、第4,971,908号、第5,145,783号、第5,188,642号、第5,310,667号および第6,803,501号と一致して記載および／または単離されたものが含まれる。それらは、アグロバクテリウム種 ＣＰ４株（ＡＧＲＴＵ．ａｒｏＡ：ＣＰ４）から単離されたクラスＩＩ ＥＰＳＰＳ遺伝子のような、構造的に異なる非−相同ＥＰＳＰＳ遺伝子から誘導することができる。

【0074】

「同定配列」なる語は、種子または生殖体の色、不透明性または透明性、蛍光、テクスチャー、サイズ、形、発芽能または生存能のような検出可能な表現型、または細胞もしくは種子の代謝の他の産物を付与する生成物をコードする核酸をいう。同定配列は、ＲＮＡ−ｉ媒介法を介するような、他の遺伝子の発現のダウン−レギュレーションを介して表現型を付与し得るヌクレオチド配列（例えば、遺伝子フラグメント）を含み得る。ある種の形態において、同定配列は、ｇｕｓＡ、ｇｆｐまたはｃｒｔＢ遺伝子のようなスクリーニング可能な遺伝子を含む。特定の形態において、同定配列は、エルビニア・ハービコーラ（Erwinia herbicola）パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans；参照することによって本明細書に取り込むGenBank M38423；および米国特許第5,429,939号、第6,429,356号）からのフィトエンシンターゼをコードするｃｒｔＢ遺伝子を含む。同定配列は、抗生物質抵抗性または除草剤耐性をコードするもののような植物の選択可能、スクリーニング可能および／または評点付け可能なマーカー遺伝子に物理学的に連結する。同定配列は、種子における検出可能な（例えば、スクリーニング可能または選択可能な）表現型を付与することができる。

【0075】

第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的な関係で位置する場合には、第１の核酸配列は第２の核酸配列と「作動可能に」結合しているまたは「連結している」。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響する場合は、プロモーターはタンパク質コード配列に作動可能に連結している。一般的に、作動可能に連結したＤＮＡ配列は隣接しており、２のタンパク質コード領域を結合する必要がある場合は、同じ読み枠で隣接している。

【0076】

「植物」なる語は、単子葉（例えば、ユリ、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギほか）、双子葉（例えば、ダイズ、ワタ、トマト、キャノーラ、ジャガイモ、アラビドプシス（Arabidopsis）、タバコほか）、裸子植物（マツ、モミ、ヒマラヤスギほか）を含むいずれの高等植物またはその子孫を包含し、植物の再生単位（例えば、種子、球根、塊茎、または植物を再生できる植物からの他の部分もしくは組織）、果実、花ほかを含む。

【0077】

「組換え核酸」は、例えば化学合成または遺伝子工学的技術によって核酸の単離したセグメントの操作によって２の別の方法で分離した配列のセグメントの人工的な組み合わせによって作製する。

【0078】

「ＤＮＡ構築物」または「ＤＮＡベクター」なる語は、組換えＤＮＡ技術によって機能的に影響を及ぼす様式で連結されたプロモーター、タンパク質コード配列、３'非翻訳領域ほかのような１またはそれを超えるＤＮＡ配列を含む、いずれかの起源に由来する、いずれかのプラスミド、コスミド、ウイルス、自律的複製配列、ファージまたは他の環状一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡをいう。植物形質転換用の組換えＤＮＡベクターは、細菌細胞中で複製することができる一般的には二本鎖の環状プラスミドである。組換え核酸構築物を作製および使用する慣用的な組成物および方法はよく知られている。例えば、数ある中でもSambrookら, 1989；およびAusubelら, 1992 (定期的に改訂されている）およびClarkら(1997)。

【0079】

「プロモーター」または「プロモーター領域」なる語は、ＲＮＡポリメラーゼの認識部位および／または転写の開始に必要な他の因子を正確な部位に提供することによってメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の生成を制御することによってコード配列の発現を制御する、通常はコード配列の上流（５'）側に見出される核酸配列をいう。本明細書で予期するように、プロモーターまたはプロモーター領域には、種々の調節配列への連結、ランダムもしくは制御した突然変異導入、およびエンハンサー配列の付加もしくは倍加によって誘導した種々のプロモーターが含まれる。プロモーター領域は、ｍＲＮＡを生成するその能力によって実証されるように、好適な組換えベクターの一部分として宿主に導入した場合に、その制御下でコード配列の転写を駆動することに寄与する。

【0080】

「再生」とは、植物細胞（例えば、植物プロトプラストまたは外植片）から植物を成長させる工程をいう。

【0081】

「選択可能なマーカー」とは、その発現が核酸配列を含む細胞の同定を促進する表現型を付与する核酸配列をいう。選択可能なマーカーには、毒性化学物質に対する抵抗性（例えば、抗生物質抵抗性）を付与するもの、または、視覚的に区別される特徴（例えば、色の変化または蛍光）を付与するものが含まれる。

【0082】

有用な優勢植物選択可能なマーカー遺伝子には、数ある中でも、抗生物質抵抗性遺伝子（例えば、ハイグロマイシン、イミダゾリノン、カナマイシン、ブレオマイシン、Ｇ４１８、ストレプトマイシンまたはスペクチノマイシンに対する抵抗性）；および除草剤抵抗性遺伝子（例えば、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ、修飾ＡＬＳ、ＢＡＲ、修飾クラスＩ ＥＰＳＰＳ、クラスＩＩ ＥＰＳＰＳ、ＤＭＯ）をコードする遺伝子が含まれる。

【0083】

「評点付け可能なマーカー遺伝子」または「スクリーニング可能なマーカー遺伝子」という用語の中に含まれるものは、形質転換細胞を同定または選択する手段としてその分泌を検出し得る分泌可能なマーカーをコードする遺伝子である。例としては、抗体相互作用によって同定することができる分泌可能な抗原、または触媒的に検出することができる分泌可能な酵素さえもコードするマーカーが含まれる。検出可能である小さい拡散可能なタンパク質、細胞外溶液中に検出することができる小さい活性酵素（例えば、α−アミラーゼ、β−ラクタマーゼ、ホスフィノスリシン・アセチルトランスフェラーゼ）、または細胞壁に挿入または捕捉されたタンパク質（拡張またはタバコＰＲ−Ｓの発現単位に見出されるもののようなリーダー配列を含むタンパク質のような）を含む多数のクラスに入る。他の可能な選択可能および／またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子は、当業者に明らかであろう。

【0084】

「Ｔ−ＤＮＡ」とは、アグロバクテリウムまたは他のリゾビア媒介形質転換法を介して植物ゲノムに組み込まれるＤＮＡ分子をいう。Ｔ−ＤＮＡ分子の少なくとも１の末端は、アグロバクテリウムＴｉまたはＲｉプラスミドからのＴ−ＤＮＡの少なくとも１のボーダー領域によって挟まれる。これらのボーダー領域は、一般的に右側ボーダー（ＲＢ）および左側ボーダー（ＬＢ）領域といい、その起源に依存してヌクレオチド配列および長さの変化として存在する（例えば、アグロバクテリウムのノパリンまたはオクトピン産生株）。トランスジーンを植物に移入するために設計されるＤＮＡ構築物に一般的に使用される右側領域は数百ポリヌクレオチド長となる場合があり、植物のゲノムへのＴ−鎖組込みを案内するＴ−鎖形成の後に、ＴｉまたはＲｉヘルパープラスミド由来のｖｉｒＤ２エンドヌクレアーゼがＤＮＡを消化し、５'末端に共有的に結合するニック部位を含む場合がある。Ｔ−ＤＮＡ分子（または複数の分子）は、一般的に１またはそれを超える植物発現カセットを含む。

【0085】

「トランスジーン」なる語は、該細胞または生物に形質転換した細胞または生物に対して非天然であるいずれの核酸配列をもいう。「トランスジーン」とは、コード配列または調節配列を修飾することによって異所的に発現するいずれの内因性配列をもいう場合がある。「トランスジーン」は、指示した組換えによる非−天然または天然の核酸配列の挿入によって修飾された天然の植物遺伝子のコンポーネント部分をも含む。

【実施例】

【0086】

実施例１
同定配列およびマーカー遺伝子、および関心のある遺伝子を含む２Ｔ−ＤＮＡベクターの調製
標準的な分子クローニング法（Sambrookら, 1989）に従って、２のＴ−ＤＮＡ植物発現ベクター、ｐＭＯＮ６７４６５、ｐＭＯＮ１０１３３８およびｐＭＯＮ１０１３３９（図１）を構築した。１のＴ−ＤＮＡはカナマイシンに対する抵抗性をコードするｎｐｔＩＩ遺伝子に作動可能に連結されたＣａＭＶ３５ＳプロモーターおよびＧＵＳレポーター遺伝子に作動可能に連結したＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを含む。他のＴ−ＤＮＡは、グリホセート抵抗性を付与するナピン：ｃｔｐ−ｃｒｔＢ：ナピン３'カセットおよび３５Ｓ：ｃｔｐ：ＣＰ４ ＥＰＳＰＳカセットを含む。ｏｒｉＶ複製起点を有するｐＭＯＮ６７４６５中のｃｒｔＢは、ブラシカ・ナプス（Brassica napus）からの１.８ｋｂ種子特異的ナピンプロモーターおよび１ｋｂナピンターミネーターによって駆動した。ｏｒｉＶ複製起点を有するｐＭＯＮ１０１３３８中およびｐＲｉ複製起点を有するｐＭＯＮ１０１３３９中のｃｒｔＢは、短いバージョンのナピンプロモーター（１ｋｂ）およびターミネーター（０.３ｋｂ）によって駆動した。エルビニア（Erwinia）種からのフィトエンシンターゼをコードするｃｒｔＢ遺伝子は、形質転換頻度に影響することなくダイズ種子にオレンジ色を付与する。

【0087】

実施例２
ｐＭＯＮ６７４６５を用いたダイズ組織片の形質転換および再生
ダイズ（栽培品種Ａ３２４４）組織を、実質的に以前に記載されているように（米国特許第6,384,301号、参照することによって本願明細書に取り込まれる）、アグロバクテリウム媒介法を介してｐＭＯＮ６７４６５（図１）で形質転換した。簡単には、手で切除したダイズ分裂組織片をアグロバクテリウムと２３℃にて２−４日、アグロバクテリウムと同時培養し、ＰＬＡＮＴＣＯＮ中の７５μＭグリホセート選択を含むＷＰＭ固形培地に移し、１６／８（明／暗）期下２８℃にて培養した。２週間後、組織片を新鮮なＷＰＭ培地に移し、シュート収穫まで培養した。２週間後、真の三つ葉を有するシュートを切断し、ＢＭＲ発根培地上で２−４週間培養した。発根した苗木を、種子成熟のために温室中で生育させた。分析した４０の事象の中で、７２.５％が両方のＴ−ＤＮＡによる同時形質転換を示した。４０の事象の中の４５％がｎｐｔＩＩおよびｇｕｓ遺伝子の両方を含んでいた。ｐＭＯＮ６７４６５からのＴ−ＤＮＡを含む事象Ａ３３９０８をさらに分析した。

【0088】

プラスミドｐＭＯＮ６７４６５を有するさらなる事象は同一栽培品種Ａ３２４４へのプラスミドの再−形質転換によって得、１３のトランスジェニック系統を０.２２％の形質転換頻度で得た。１３系統のうちの７は、ｇｕｓまたはＣＰ４マーカー遺伝子の存在または不存在についてのＰＣＲを介した正常外観種子の分析後に、関心のある遺伝子陽性であり、マーカーフリーであった（図６）。Ｒ０植物からの橙色種子も、ｃｒｔＢ遺伝子およびＣＰ４マーカー遺伝子の存在についてＰＣＲによって分析した。３を除くすべての橙色種子がｃｒｔＢおよびＣＰ４の両方について陽性であることが判明した（図７）が、ＣＰ４またはｃｒｔＢ遺伝子を含む正常外観種子は存在せず（図７、白色の欄）、これはｃｒｔＢ表現型がＣＰ４選択可能なマーカー遺伝子に強固に連鎖していることを示した。

【0089】

したがって、選択可能なマーカー遺伝子に連鎖したスクリーニング可能な遺伝子を含む同定配列を有する２のＴ−ＤＮＡ構築物の使用は、関心のある遺伝子を含むが選択可能なマーカーをコードする配列を欠くトランスジェニック事象のより効率的なスクリーニングおよび選択を許容する。連鎖−サザンベースのアプローチ（「標準２Ｔ」）、および関心のある遺伝子および選択可能なマーカーが独立して分離している子孫種子を同定するための標識ベース（すなわち、同定配列ベース）のスクリーニングの間の例示的な比較は、図８に見出される。同定配列アプローチの脂肪は、より多くのトランスジェニック事象、およびさらなる分析に有用な子孫を同定するための各事象のより多くの子孫をスクリーニングすることを許容する。

【0090】

実施例３
ダイズ事象Ａ３３９０８およびＲ１子孫種子におけるＣｒｔＢ／ＧＵＳ／ＣＰ４発現
事象Ａ３３９０８からの組織の目視検査（図２）は、茎および開いた若葉が橙色キャスト（cast）を示した。葉および根組織は、ＣｒｔＢ発現植物において別段表現的に正常であった。Ｒ０植物の種子（すなわち、Ｒ１世代）からの種皮はわずかなＣｒｔＢ発現を示したが、Ａ３３９０８由来の種子の子葉は異なる橙色を示し、そのうちの幾つかはしわになった表現型を有していた（図３）。

【0091】

事象Ａ３３９０８からの１２の未熟Ｒ１種子を種皮から切開し、ＣＰ４−ＥＰＳＰＳ ＥＬＩＳＡ、およびＣｒｔＢおよびＧＵＳ目視分析に付した（図４）。ＣｒｔＢ、ＧＵＳおよびＣＰ４−ＥＰＳＰＳ表現型の分離が明らかであった。９／１２の種子が３のアッセイすべてにおいて陽性であった。１／１２の種子がＣｒｔＢおよびＣＰ４−ＥＰＳＰＳ陽性であったが、ＧＵＳ陰性であり、ｇｕｓ遺伝子の欠失を有する、ｐＭＯＮ６７４６５の２のＴ−ＤＮＡの分離を示した。２／１２の種子はＣＰ４−ＥＰＳＰＳ ＥＬＩＳＡ陰性であった。これらの種子は両方ともＣｒｔＢ陰性であってＧＵＳ陽性であり、したがって同定配列（ｃｒｔＢ）および選択可能なマーカーＣＰ４−ＥＰＳＰＳ遺伝子の間の連鎖、およびｇｕｓ遺伝子座からのこれらのトランスジェニック遺伝子座の分離を示している。分離した種子における表現型比は、２の優性遺伝子座のメンデル分離と一致した。

【0092】

実施例４
Ｒ１種子目視分析
Ａ３３９０８からの成熟種子を色、大きさおよび形について目視分析した（図５）。（ｉ）マーカーフリー正常（例えば、黄色および平面）；（ｉｉ）橙色および平面；および（ｉｉｉ）橙色および収縮した種子が見られた。

【0093】

実施例５
ＧＵＳ陽性種子に対するＰＣＲ分析
ＩＮＶＡＤＥＲ ＰＣＲ（例えばMeinら, 2000）を用いて、トランスジェニックダイズ植物の種子におけるｐＭＯＮ６７４６５によって送達されるＣＰ４−ＥＰＳＰＳ、ｃｒｔＢおよびｇｕｓ遺伝子の分離を追跡した。事象Ａ３３９０８は、ＣＰ４−ＥＰＳＰＳマーカー遺伝子の単一のコピーおよびＮＰＴＩＩ遺伝子の単一のコピーを含むことが決定された。橙色：正常種子の分離は、事象Ａ３３９０８において予想される３：１の結果となった（表１）。

【0094】

【表1】

【0095】

実施例６
同定配列としてのＡＴＰ ＰＦＫの使用
トウモロコシを含むデンプンを豊富に含む穀物粒について、収縮または破壊された種子発育の表現型を生じる糖／デンプン代謝の操作を利用し得る。ｓａｃＢの種子特異的発現（Caimiら, 1996）、またはトウモロコシ穂における酵母ＡＴＰ依存性ホスホフルクトキナーゼの種子特異的発現（ＡＴＰ ＰＦＫ；例えばGenBank 受理番号NC 003423、bases2297466..2300294）は破壊された穀粒発育を生じた（図１２）。ＣＰ４選択可能なマーカーおよびＡＴＰ−ＰＦＫを含む構築物ｐＭＯＮ９９５７５は、関心のある遺伝子を含む１のＴ−ＤＮＡ構築物との同時形質転換に、各々がこれらの構築物のうちの１を含む２のアグロバクテリウム株の細胞を混合し、ついで混合した細菌培養物で植物細胞を形質転換することにより直接的に用い得る。あるいは、種子特異的発現するＡＴＰ−ＰＦＫカセットは、マーカーフリー種子の効率的同定のために、同定配列として２のＴ−ＤＮＡ構築物にサブクローニングし得る。この遺伝子を含む穀粒は極めて収縮し、発芽しない。同定配列フリーであってマーカー遺伝子フリーの穀粒のみが正常な外観を示している。

【0096】

実施例７
同定配列としてのポルフィリン合成に関与する遺伝子の使用
Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン依存性ウロポルフィリノーゲンＩＩＩ（ウロゲン）メチルトランスフェラーゼ（ＳＵＭＴ）は、イー・コリ（E．coli）、酵母およびＣＨＯ細胞中で過剰発現させた場合に明赤色蛍光のポルフィリノイド化合物を生成する。この特性は形質転換イー・コリ（E．coli）コロニーの目視選択を可能にし（RossnerおよびScott, 1995）、形質転換した酵母細胞およびＣＨＯ細胞の自動ソーティングを可能にした（WildtおよびDeuschle, 1999）。この蛍光は、ジ−およびトリ−メチル化ウロゲン（ジヒドロシロヒドロクロリンおよびトリメチルピロロコルフィンの結果であり、その両方はポルフィリン合成経路に見出される化合物である（すなわち、クロロフィルおよびコバラミン）。

【0097】

プロピオニバクテリウム・フリューデンレイチ（Propionibacterium freudenreichii）からのＳＵＭＴをコードするｃｏｂＡ（GenBank受入番号U13043；参照することによって本明細書に取り込まれる）で形質転換した細胞は、６０５ｎｍの発光帯とともに３８４ｎｍおよび５００ｎｍに吸収ピークを有する蛍光シグナルを与える。ｃｏｂＡウロゲンメチルトランスフェラーゼによって生成する蛍光ポルフィリノイドは、植物材料をマーキングするための良好なスペクトルシグナルを有する。３８４または５００ｎｍのいずれかでの励起は、強力なクロロフィル吸収を回避し、得られる赤色発光はそれが（５００ｎｍ吸収起源からの）実体ストークシフトを有し、遠赤外におけるクロロフィル自己蛍光と重複しないために容易に検出される（Haseloff, 1999）。

【0098】

トウモロコシＳＵＭＴ（GenBank D83391）のカルボキシ末端、アラビドプシス（Arabidopsis）Ｕｐｍ１（GenBank L47479）およびイー・コリ（E．coli）CysG（GenBank X14202）タンパク質は、ピイ・フリューデンレイチの遺伝子（cobA）、シュードモナス・デニトリフィカンス（cobA；GenBank M59236）およびシネコシスティス（Synechocystis）種（正式には、アナシスティス・ニデュランス（Anacystis nidulans）；GenBank X70966）（いずれも参照することによって本明細書に取り込まれる）によってコードされるタンパク質に極めて類似し、同様にして使用することができる。

【0099】

実施例８
検出可能な種子表現型を生成するための遺伝子サイレンシングの使用
マーカー遺伝子カセットのイントロン内に位置する逆方向繰り返し配列は、植物細胞における有効な遺伝子サイレンシングに通じる。これは、米国特許公開公報2006／0200878号に開示されている（例えば、参照することによって本明細書に取り込まれる図７、８、９）。イントロン内に位置する逆方向反復塩基配列によってコードされるｄｓＲＮＡが遺伝子サイレンシングを誘起することができるかを試験するために、ルシフェラーゼ遺伝子の〜４００ｂｐセグメントの逆方向反復塩基配列（配列番号：１）をＥＰＳＰＳ−ＣＰ４遺伝子カセット（ｐＭＯＮ７３８７４）中のイネアクチン１プロモーターのイントロンに設置し、トウモロコシ葉プロトプラストの一過性の形質転換においてルシフェラーゼ遺伝子を抑制する構築物の能力を試験した。対照として、対照プラスミドがルシフェラーゼ遺伝子の代わりにＧＵＳ遺伝子のセグメントの逆方向反復塩基配列を有する（ｐＭＯＮ７３８７５）以外は同様のプラスミドを試験した。最後に、逆方向反復塩基配列を有していない以外は同一であるさらなる対照、ｐＭＯＮ２５４９２、も用いた（図１３）。

【0100】

ホタル・ルシフェラーゼの抑制およびＲＥＮＩＬＬＡルシフェラーゼ（Promega Corp., Madison, WI）内部対照に対する標準化のためのトウモロコシ葉プロトプラストの経時的遺伝子サイレンシング系においてこれら３のプラスミドを試験すると、イントロン内に逆方向反復塩基配列をコードするｄｓＲＮＡを有するプラスミド（ｐＭＯＮ７３８７４）が対照ｐＭＯＮ７３８７５およびｐＭＯＮ２５４９２に対してルシフェラーゼを抑制することができることが判明した（図１４）。実験は２回繰り返したが、同様の結果であった。

【0101】

遺伝子サイレンシング・アプローチを介してトウモロコシ穀粒表現型を創製し得るかを試験するために、Ｗａｘｙ遺伝子を抑制するように設計した構築物を作製した。ｐＭＯＮ８１９９０はＷａｘｙ遺伝子の一部分の逆方向反復塩基配列を含む。ｐＭＯＮ８１９９０を含むトランスジェニック・トウモロコシ植物は、デンプン生成に対するヨウ素を用いた花粉および穀粒の染色によって判定して、独立したＲ０植物の少なくとも６５％においてＷａｘｙ遺伝子のサイレンシングを示した。比較すると、Ｗａｘｙのセンスフラグメントを発現するｐＭＯＮ８１９９３を含む植物は、Ｗａｘｙ遺伝子の有効なサイレンシングを示さなかった。

【0102】

視認し得る表現型に通じるゼイン（種子貯蔵タンパク質）をコードする遺伝子のサイレンシングも示された。ｐＭＯＮ７３５６７には、トウモロコシ穀粒のα−ゼインをコードする遺伝子の配列の逆方向反復塩基配列も含まれる。逆方向反復塩基配列の転写はこれらの遺伝子のサイレンシングを生じ、試験した２９のＲ０植物のうち２６において１９ｋＤおよび２２ｋＤのα−ゼインのレベルを低下した。図１５は、このｄｓＲＮＡをコードする配列で形質転換した細胞から生じた穀粒が明らかな視認し得る表現型を有し、ここで減少したゼインを有する穀粒は野生型穀粒よりも透明性が低い。

【0103】

したがって、マーカー遺伝子のイントロン内に存在するｄｓＲＮＡをコードする配列は、本発明に係る同定配列として用いることができる。例えば、選択可能なマーカー遺伝子のイントロン中に選択可能なマーカーとしてＣＰ４ ＥＰＳＰＳのようなグリホセート耐性遺伝子およびかかるｄｓＲＮＡコード配列を含む構築物は、各々これらの構築物のうちの１を含む２のアグロバクテリウム菌株の細胞を混合し、植物細胞を混合した細菌培養物で形質転換することによって、関心のある遺伝子を含む１のＴ−ＤＮＡ構築物での同時形質転換に用いることができる。あるいは、ｄｓＲＮＡをコードするカセットは、マーカーフリー種子の有効な同定のために、同定配列として２Ｔ−ＤＮＡ構築物にサブクローニングし得る。当業者であれば、マイクロプロジェクタイル・ボンバードメント媒介植物細胞形質転換に用いるための類似の構築物を設計することもできるであろう。

【0104】

実施例９
同定配列としてのＫＡＳ４の使用
バイナリーベクターｐＭＯＮ８３５３０（図１６）は、同一Ｔ−ＤＮＡ上の選択可能なマーカーとしてのＣＰ４植物発現可能なカセットと一緒にダイズＵＳＰ８８プロモーター（米国特許第7,078,588号）によって駆動されるＫＡＳ４（ケト−アセチル−ＡＣＴシンターゼ；GenBank受理番号AF060518）を含む。ＫＡＳ４遺伝子の種子特異的発現は、遺伝子を含まない正常な種子から簡単に区別し得る（図１７）。構築物は同定配列として直接的に使用することができ、かかる同定配列および選択可能なマーカーを含むＴ−ＤＮＡは、関心のある遺伝子を含むＴ−ＤＮＡを含む第２の構築物と一緒に、各々これらの構築物を含むアグロバクテリウム菌株を混同し、混合した細菌培養物で植物細胞を形質転換することによって、同時形質転換し得る。

【0105】

ＫＡＳ４発現カセットはｐＭＯＮ１０７３１４に示す２Ｔ−ＤＮＡプラスミドにも存在し（図１８）、ここに１のＴ−ＤＮＡが同定配列としてのｓｐｌＡ遺伝子（アグロバクテリウム・ツメファシエンスからのスクロースホスホリアーゼ；Genbank受理番号AE009432）およびマーカー遺伝子を含み、もう１のＴ−ＤＮＡが当業者に知られているルーチンのクローニング法によって構築される関心のある遺伝子を含み得る。ついで、２のＴ−ＤＮＡプラスミドは、例えば、ダイズ形質転換のために用いることができる。同定遺伝子は、同定遺伝子によって提供される表現型に基づいてマーカー遺伝子なしに種子の選択に用いる。

【0106】

実施例１０
同定配列としてのｓｐＬＡ遺伝子の使用
バイナリーベクターｐＭＯＮ６８５８１（図１９）は、同一のＴ−ＤＮＡ上に選択可能なマーカーとしてのＣＰ４植物発現可能なカセットと一緒に、ダイズ７Ｓアルファプロモーターによって駆動されるｓｐｌＡ（アグロバクテリウム・ツメファシエンスからのスクロースホスホリアーゼ；GenBank受理番号AE009432）を含む。ｓｐｌＡ遺伝子の種子特異的発現は、遺伝子を含まない正常な種子から簡単に区別し得る収縮した種子を生じる（図２０）。構築物は同定配列として直接的に使用することができ、かかる同定配列および選択可能なマーカーを含むＴ−ＤＮＡは、関心のある遺伝子を含むＴ−ＤＮＡを含む第２の構築物と、各々これらの構築物のうちの１を含む２のアグロバクテリウム菌株を混合し、植物細胞を混合した細菌培養物で形質転換することによって、同時形質転換し得る。ｓｐｌＡ発現カセットは当業者に知られているルーチンのクローニング法によって、２のＴ−ＤＮＡベクターに容易にサブクローニングすることもでき、ここに１のＴ−ＤＮＡは同定配列としてのｓｐｌＡおよびマーカー遺伝子を含み、もう１のＴ−ＤＮＡは関心のある遺伝子を含む。ついで、２のＴ−ＤＮＡプラスミドは、例えばダイズ形質転換のために用いることができる。同定配列は、同定配列によって提供される表現型に基づいて選択可能なまたはスクリーニング可能なマーカー遺伝子なしに、種子選択に用いる。

【0107】

実施例１１
マーカーフリー・トウモロコシ種子の作製における幾つかの同定配列の使用
複数の２のＴ−ＤＮＡ植物発現ベクターを構築した。各々の構築物において、第１のＴ−ＤＮＡセグメントは関心のある核酸の例として植物で発現可能なｕｉｄＡトランスジーンを含み、第２のＴ−ＤＮＡセグメントは選択可能なマーカーとしての植物で発現可能なＣＰ４ ＥＰＳＰＳトランスジーンおよび下記の表に示す同定配列からなる。単子葉植物における発現用に設計されたｃｒｔＢの配列は、当該技術分野で知られている方法によって調製した（例えば、配列番号：２、配列番号：３に見出されるコドン最適化によって）。ｐＭＯＮ６８４１２は配列番号：３を含む。第１のＴ−ＤＮＡは右側および左側ボーダーによって挟まれる一方で第２のＴ−ＤＮＡはベクター骨格に位置し、２のＴ−ＤＮＡ形式はタンデム形式として一般的に知られている（Huangら, 2005）。トウモロコシ組織は、当該技術分野で知られている方法によって各々の構築物で別々に形質転換した。各同定遺伝子を用いた予想される表現型を下記の表２に示す。内胚乳中での同定配列の発現のための別のプロモーターには、イネからのグルテリン１プロモーター、トウモロコシからのｗａｘｙプロモーター、およびトウモロコシからのｂｒｉｔｔｌｅ２プロモーターが含まれる。

【0108】

【表2】

【0109】

本明細書に開示し、特許請求するすべての組成物および方法は、本願明細書の開示に鑑みて過度な実験なしに作製および実施することができる。本発明の組成物および方法を前記の形態および例示的な実施例の観点から記載したが、当業者であれば、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく、変形、変化、修飾および改変を本明細書に記載した組成物、方法ならびに本明細書に記載した方法の工程または一連の工程に適用し得ることが明らかであろう。より具体的には、同一または同様の結果を達成しつつ、両方が化学的および物理学的に関連するある種の因子を、本明細書に記載した因子に代えて用い得ることは明らかであろう。当業者に対して明らかなすべてのかかる同様の置換および変形は、添付する特許請求の範囲によって規定される本発明の意図、範囲および概念の中にあるとみなされる。

【0110】

参照
以下の参照文献は、それらが本明細書に記載したものについての例示的方法または本命支所に記載するものの他の詳細な補足を提供する程度において、参照することによって本願明細書に特異的に取り込まれる。
米国特許第4,940,835号; 米国特許第4,940,838号; 米国特許第4,946,046号; 米国特許第4,971,908号; 米国特許第5,015,580号; 米国特許第5,145,783号; 米国特許第5,188,642号; 米国特許第5,302,523号; 米国特許第5,310,667号; 米国特許第5,362,865号; 米国特許第5,384,253号; 米国特許第5,429,939号; 米国特許第5,464,763号; 米国特許第5,464,765号; 米国特許第5,508,184号; 米国特許第5,538,880号; 米国特許第5,545,816号; 米国特許第5,550,318号; 米国特許第5,563,055号; 米国特許第5,591,616号; 米国特許第5,633,435号; 米国特許第5,693,512号; 米国特許第5,731,179号; 米国特許第5,824,877号; 米国特許第5,859,347号; 米国特許第5,981,840号; 米国特許第6,160,208号; 米国特許第6,307,123号; 米国特許第6,326,527号; 米国特許第6,384,301号; 米国特許第6,399,861号; 米国特許第6,403,865号; 米国特許第6,429,356号; 米国特許第6,433,252号; 米国特許第6,458,594号; 米国特許第6,583,338号; 米国特許第6,803,501号; 米国特許第6,825,398号; 米国特許第7,078,588号; 米国特許第7,119,187号; 米国特許第7,151,204号。
米国特許公開20030110532; 米国特許公開20030229918; 米国特許公開20040237142; 米国特許公開20060041956; 米国特許公開20060064772; 米国特許公開20060200878
国際公開WO 00/018939
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【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【配列表】

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