特許 6649050 幹細胞の未分化状態維持剤及び増殖促進剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6649050

(24)【登録日】2020年1月20日

(45)【発行日】2020年2月19日

(54)【発明の名称】幹細胞の未分化状態維持剤及び増殖促進剤

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0735 20100101AFI20200210BHJP

   C12N 5/078 20100101ALI20200210BHJP

   A61K 36/284 20060101ALI20200210BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20200210BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/0735ZNA

   C12N5/078

   A61K36/284

   A61P43/00 105

【請求項の数】3

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2015-223027(P2015-223027)

(22)【出願日】2015年11月13日

(65)【公開番号】特開2017-86020(P2017-86020A)

(43)【公開日】2017年5月25日

【審査請求日】2018年9月20日

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】592262543

【氏名又は名称】日本メナード化粧品株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110002572

【氏名又は名称】特許業務法人平木国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】大形 悠一郎

(72)【発明者】

【氏名】井上 悠

(72)【発明者】

【氏名】長谷川 靖司

【審査官】 川合 理恵

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０１−２９４６２１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 韓国登録特許第１０−１３５０１４４（ＫＲ，Ｂ１）

【文献】 韓国公開特許第１０−２０１５−００６７６７８（ＫＲ，Ａ）

【文献】 特表２００７−５３４７２５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Molecules, 2013, Vol. 18, pp. 7376-7388

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ５／００−５／２８

Ａ２３Ｌ ３３／００−３３／２９

Ａ６１Ｋ ８／００−８／９９

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

オケラの根茎の熱水もしくは水抽出物、エタノール水溶液抽出物、またはエタノール抽出物からなる胚性または体性幹細胞の未分化状態維持剤。

【請求項2】

オケラの根茎の熱水もしくは水抽出物、エタノール水溶液抽出物、またはエタノール抽出物からなる胚性または体性幹細胞の増殖促進剤。

【請求項3】

体性幹細胞が造血幹細胞である、請求項１又は２に記載の剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、幹細胞の未分化状態維持剤及び増殖促進剤、並びに幹細胞の未分化状態維持方法及び増殖促進方法に関する。

【背景技術】

【0002】

脊椎動物（特に哺乳動物）の組織は、傷害若しくは疾患、又は加齢等に伴い細胞・臓器の損傷が起こった場合、再生系が働き、細胞・臓器の損傷を回復しようとする。この作用に、当該組織に備わる幹細胞（組織幹細胞、体性幹細胞）が大きな役割を果たしている。幹細胞は、あらゆる細胞・臓器に分化する多能性を有しており、この性質により細胞・臓器の損傷部を補うことで回復に導くと考えられている。このような幹細胞を応用した、次世代の医療である再生医療に期待が集まっている。

【0003】

哺乳動物における幹細胞研究で最も進んでいる組織は骨髄である。骨髄には生体の造血幹細胞が存在しており、全ての血液細胞再生の源であることが明らかにされた。さらに骨髄には、造血幹細胞とは別に、臓器や組織（例えば、骨、軟骨、筋肉、脂肪等）へ分化可能な幹細胞が包含されていることが報告されている（非特許文献１参照）。

【0004】

さらに、近年、骨髄以外にも、皮膚、肝臓、膵臓、脂肪等、あらゆる臓器や組織に幹細胞が存在することが明らかにされ、各臓器や組織の再生及び恒常性維持を司っていることがわかってきた（非特許文献２〜５参照）。また、各臓器や組織に存在する幹細胞は可塑性に優れており、今まで自己複製が不可能であった臓器や組織の再生にも利用できる可能性がある。

【0005】

一方で、これらの幹細胞のうちのいくつかは、加齢とともに減少することが知られており、各組織の恒常性維持のために幹細胞の減少を防ぐ技術の研究が積極的になされている（非特許文献６）。また、近年、幹細胞の能力（多能性）を、臓器や組織の再生へ応用するため、細胞移植治療や組織工学（再生医療や再生美容）の分野において幹細胞を生体組織から分離した後に培養し増殖させる技術の開発が進められている（非特許文献７、８）。

【0006】

特に、幹細胞を生体外で培養する場合、幹細胞の能力である多能性を維持した状態、すなわち、未分化な状態を維持させたまま増殖させることが極めて重要である。もし、この培養時に幹細胞の未分化状態が維持できず分化誘導が進んでしまった場合、最終的に調製された幹細胞の能力（多能性）は失われていることになり、目的の効果（臓器や組織の再生等）を発揮できない。

【0007】

以上より、幹細胞を細胞移植治療や組織工学（再生医療や再生美容）に利用し、臓器や組織の再生を望む場合、幹細胞を、未分化状態を維持させたまま培養できなければならない。

【0008】

現在までに、幹細胞を、未分化状態を維持させたまま増殖させる技術について、幾つか報告があるが、未だ発展途上である。例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や造血幹細胞は、支持細胞（ストローマ細胞、又はフィーダー細胞）と共培養することで未分化を維持することができる（特許文献１及び非特許文献９〜１１参照）。しかしながら、最近になってフィーダー細胞由来の内在性ウイルスによる異種動物間の感染例が報告されており（非特許文献１２参照）、支持細胞を使用した幹細胞の培養は、医療用途を目的とした幹細胞の培養には適していない。

【0009】

その他の方法に、サイトカインを複雑に組合せることによって幹細胞の未分化状態を維持させる方法がある。例えば、マウスＥＳ細胞は、ＬＩＦ（白血病抑制因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ））を培地に添加することによって、未分化性が維持される（特許文献２及び非特許文献１３参照）。その他、初期作用性サイトカイントロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、ＦＬＴ−３リガンド、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）の存在下で、未分化性を維持させることが胚性幹細胞、体性幹細胞等で報告されている（特許文献３及び非特許文献１４参照）。

【0010】

しかしながら、サイトカインは、高価であり、採取原料や保存性等の問題があり、容易な使用は難しい。加えて、ＬＩＦの効果は極めて特定の細胞系統に限定的であり、特に霊長類のＥＳ細胞や体性幹細胞においては、ＬＩＦの添加のみでは未分化状態を維持することができないことが明らかにされている（非特許文献１０参照）。

【0011】

このように、現在、報告されている幹細胞の未分化状態の維持方法はいずれも、煩雑な操作を必要とし、また未分化状態の維持効果が低い。従って、幹細胞を再生医療に利用するために、幹細胞を、未分化状態を維持したまま増殖させる技術が求められていた。つまり、安全且つ簡便で効率的に、幹細胞を、未分化状態を維持させたまま増殖させることができる技術が求められていた。

【0012】

オケラ（学名：Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ ｊａｐｏｎｉｃａ）は、キク科の多年草で、セスキテルペノイドのアトラクチロンなどの成分を含み、生薬の白朮（ビャクジュツ）は、本種のオケラ又はその近縁種のオオバナオケラ（学名：Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ ｏｖａｔａ Ｄｅ Ｃａｎｄｏｌｌｅ）の根茎で、主に健胃、利尿、強壮作用の漢方薬に配合されている。また、同じく近縁種のホソバオケラ（学名：Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ ｌａｎｃｅａ）の根茎である蒼朮（ソウジュツ）も、同様な薬効を有するものとして知られている。オケラは、上記の作用のほかに、単独で又は他の生薬と組み合わせて、毛穴目立ち予防又は改善作用（特許文献４）、抗うつ作用（特許文献５）、血清アルブミン増加作用（特許文献６）、抗菌防腐作用（特許文献７）、及び細胞外マトリックスの異常蓄積抑制作用（特許文献８）等があることがこれまで知られている。しかしながら、幹細胞の増殖促進効果や未分化状態維持効果については、これまで何ら知られていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0013】

【特許文献1】特開２００４−２４０８９号公報

【特許文献2】特表２００２−５２５０４２号公報

【特許文献3】特許第３５７３３５４号公報

【特許文献4】特開２０１１−１２１８７９号公報

【特許文献5】特開２００６−２４１０５５号公報

【特許文献6】特開２０１１−３７８５０号公報

【特許文献7】特開２００３−１１３０１３号公報

【特許文献8】特開平１０−６７６７４号公報

【非特許文献】

【0014】

【非特許文献1】Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ Ｍ．Ｆ．ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９年， Ｖｏｌ． ２８４， ｐｐ． １４３−１４７

【非特許文献2】Ｇｏｏｄｅｌｌ Ｍ．Ａ．ら， Ｎａｔ． Ｍｅｄ．， １９９７年， Ｖｏｌ． ３， ｐｐ． １３３７−１３４５

【非特許文献3】Ｚｕｌｅｗｓｋｉ Ｈ．ら， Ｄｉａｂｅｔｅｓ， ２００１年， Ｖｏｌ． ５０， ｐｐ． ５２１−５３３

【非特許文献4】Ｓｕｚｕｋｉ Ａ．ら， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， ２０００年， Ｖｏｌ． ３２， ｐｐ． １２３０−１２３９

【非特許文献5】Ｚｕｋ Ｐ．Ａ．ら， Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ２００１年， Ｖｏｌ． ７， ｐｐ． ２１１−２２８

【非特許文献6】長谷川靖司，Ａｅｓｔｈｅｔｉｃ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ， ２０１３年， Ｖｏｌ． ２３， ｐｐ． １−１１

【非特許文献7】馬渕 洋 他， 日本再生医療学会誌， ２００７年， Ｖｏｌ． ６， ｐｐ． ２６３−２６８

【非特許文献8】北川 全 他， 日本再生医療学会誌， ２００８年， Ｖｏｌ． ７， ｐｐ． １４−１８

【非特許文献9】Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｊ．Ａ．ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９９５年， Ｖｏｌ． ９２， ｐｐ． ７８４４−７８４８

【非特許文献10】Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｊ．Ａ．ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９８年， Ｖｏｌ． ２８２， ｐｐ． １１４５−１１４７

【非特許文献11】Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ Ｂ．Ｅ．ら， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ２０００年， Ｖｏｌ． １８， ｐｐ． ３９９−４０４

【非特許文献12】ｖａｎ ｄｅｒ Ｌａａｎ Ｌ．Ｊ．ら， Ｎａｔｕｒｅ， ２０００年， Ｖｏｌ． ４０７， ｐｐ． ９０−９４

【非特許文献13】Ｓｍｉｔｈ Ａ．Ｇ．ら， Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．， １９８７年， Ｖｏｌ． １２１， ｐｐ． １−９

【非特許文献14】Ｍａｄｌａｍｂａｙａｎ Ｇ．Ｊ．ら， Ｊ． Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．， ２００１年， Ｖｏｌ． １０， ｐｐ． ４８１−４９２

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0015】

本発明は、上述した実情に鑑み、幹細胞を、未分化状態を維持させたまま、効率良く増殖させることができる新たな物質を見出し、幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤として提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0016】

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、オケラの抽出物が、これまで知られていなかった幹細胞に対する優れた未分化状態維持効果及び増殖促進効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。

【0017】

すなわち、本発明は、以下を包含する。
（１）オケラの抽出物を有効成分として含有する幹細胞の未分化状態維持剤。
（２）オケラの抽出物を有効成分として含有する幹細胞の増殖促進剤。
（３）幹細胞が造血幹細胞である、（１）又は（２）に記載の剤。
（４）幹細胞を、オケラの抽出物を含有する培地で培養する工程を含む、幹細胞の製造方法。
（５）幹細胞を、オケラの抽出物を含有する培地で培養する工程を含む、幹細胞の未分化状態維持方法。
（６）幹細胞を、オケラの抽出物を含有する培地で培養する工程を含む、幹細胞の増殖促進方法。
（７）幹細胞が造血幹細胞である、（４）〜（６）のいずれかに記載の方法。

【発明の効果】

【0018】

本発明によれば、幹細胞を、未分化状態を維持したまま、効率的に増殖させることができる。従って、本発明は、再生医療や再生美容の分野において大きく貢献できるものである。

【発明を実施するための形態】

【0019】

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤は、オケラの抽出物を有効成分として含有する。

【0020】

本発明に用いるオケラは、キク科オケラ属に属する多年草で、本種のオケラ（学名：Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ ｊａｐｏｎｉｃａ）及びその類縁種であるオオバナオケラ（学名：Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ ｏｖａｔａ Ｄｅ Ｃａｎｄｏｌｌｅ）、ホソバオケラ（学名：Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ ｌａｎｃｅａ）が含まれ、産地は限定されない。本発明において、オケラの抽出物は、上記のオケラ属の本種又は類縁種の根茎、茎、葉、花、果実、種子等の植物体の一部又は植物体全体、あるいはそれらの混合物の抽出物をいうが、抽出材料としては、根茎が好ましい。また、抽出には、これらの植物体をそのまま使用してもよく、乾燥、粉砕、細切等の処理を行ってもよい。

【0021】

オケラからの抽出物の抽出方法は特に限定されず、例えば、加熱抽出方法であっても良いし、常温や冷温抽出方法であっても良い。抽出に使用する溶媒としては、例えば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール等）、液状多価アルコール（１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン、流動パラフィン等）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル等）等が挙げられる。好ましくは、水、低級アルコール及び液状多価アルコールが良く、特に好ましくは、水、エタノールが良い。これらの溶媒は１種でも２種以上を混合して用いても良く、例えば３０〜７０ｖ／ｖ％のエタノール水溶液を使用することもできる。また、上記抽出溶媒に酸やアルカリを添加して、ｐＨ調整した溶媒を使用することもできる。

【0022】

上述の溶媒を用いて、オケラを溶媒抽出に供する。溶媒に対するオケラの割合は、例えば１〜５０％（ｗ／ｗ）、好ましくは５〜２５％（ｗ／ｗ）が挙げられる。例えば、オケラの根茎の乾燥物に水を加え、９５〜１００℃における熱水抽出を行うことで、オケラの抽出物を得ることができる。あるいは、オケラの乾燥物に低級アルコール（例えば、エタノール等）又は液状多価アルコール（例えば、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等）を添加し、常温（例えば５〜３５℃）で抽出を行うことで、オケラの抽出物を得ることができる。

【0023】

溶媒抽出後、得られた溶媒相自体をオケラの抽出物とすることができる。あるいは、必要に応じて、得られた溶媒相を、濃縮（減圧濃縮、膜濃縮などによる濃縮）、希釈、濾過、乾燥等の処理及び活性炭等による脱色、脱臭処理等に供して、得られた生成物をオケラの抽出物とすることができる。特に、抽出した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥等の処理に供し、得られた乾燥物をオケラの抽出物として用いることが好ましい。

【0024】

このようにして得られたオケラの抽出物は、生体レベルで又は培養レベルで未分化状態を維持させつつ幹細胞を効率的に増殖させる作用を有するので、幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤として使用できる。さらに、本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤は、幹細胞を、未分化状態を維持しつつ効率的に増殖させるための細胞培養用添加剤、研究用試薬としても使用することができる。

【0025】

本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤を、ヒトを含めた哺乳動物の幹細胞に適用することで、幹細胞の未分化状態を維持し、また幹細胞の増殖を促進することができる。本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤を適用する幹細胞としては、本発明の目的に沿うものであれば特に限定されず、例えば胚性の幹細胞（ＥＳ細胞）；骨髄、血液、皮膚（表皮、真皮、皮下組織）、脂肪、毛包、脳、神経、肝臓、膵臓、腎臓、筋肉やその他の組織に存在する体性の幹細胞；遺伝子導入等により人工的に作製された幹細胞（人工多能性幹細胞：ｉＰＳ細胞）が挙げられる。好ましくは、本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤は、骨髄、血液、皮膚又は脂肪組織由来の幹細胞に対してより効果を発揮する。例えば、骨髄由来の幹細胞として造血幹細胞が挙げられ、本発明において「造血幹細胞」とは、多能性骨髄系幹細胞及び多能性リンパ系幹細胞を含み、骨髄系細胞（赤血球、血小板、好酸球、好塩基球、好中球、単球等）及びリンパ系細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞等）への分化が可能な細胞をいう。造血幹細胞は、ＣＤ３４抗原が陽性で、かつ、ＣＤ３８抗原が陰性である（ＣＤ３４＋ＣＤ３８−）ことにより特徴づけられる。ＥＳ細胞としては、例えば、着床以前の初期胚を培養することによって樹立されたＥＳ細胞、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立されたＥＳ細胞、及びそれらのＥＳ細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変したＥＳ細胞が挙げられる。このようなＥＳ細胞は、例えば、自体公知の方法によって作製することができるが、所定の機関より入手でき、さらには市販品を購入することもできる。また、これらの幹細胞は、初代培養細胞、継代培養細胞又は凍結細胞のいずれであってもよい。

【0026】

さらに、本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤は、幹細胞の分化の方向性及び分化の過程等について同等の特性を持っていれば、全ての哺乳動物由来の幹細胞に応用が可能である。例えば、本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤は、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の哺乳動物の幹細胞に対して効果を発揮することができる。

【0027】

本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤の幹細胞への適用は、生体外であっても生体内であってもよく、いずれの場合もその作用を発揮できる。従って、本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤は、その有効量を添加した幹細胞培養用培地にて幹細胞を培養することによって、あるいは、ヒトを含む哺乳動物に投与することによって、幹細胞の未分化状態を維持し、増殖を促進することができる。

【0028】

本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤は、有効成分であるオケラの抽出物が優れた幹細胞の未分化状態維持作用及び増殖促進作用を有するので、皮膚、骨芽、軟骨、筋肉、神経、脂肪、肝臓などの生体内の組織又は臓器の幹細胞に作用して当該組織又は臓器の障害又は損傷を治療、改善、及び予防するのに有効である。また、幹細胞は、加齢などに伴い減少又は機能低下することから、本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤は、上記生体内の組織又は臓器の幹細胞の減少や機能低下に関連する疾患を治療、改善、及び予防するのに有効である。ここで、組織又は臓器の障害又は損傷、幹細胞の減少や機能低下に関連する疾患としては、例えば、皮膚関連では、シワ、タルミ、シミ、くすみ、肌荒れ、皮膚の肥厚、毛穴のひらき、ニキビ痕、創傷、瘢痕、ケロイドなどが挙げられ、薄毛や脱毛などの頭皮や毛髪の損傷も含まれる。また、骨関連では、骨粗しょう症、骨折（脊椎圧迫骨折、大腿骨頚部骨折等）など、軟骨疾患では、変形性関節症、関節リウマチ、椎間板ヘルニアなど、神経関連では、脊髄損傷、顔面神経麻痺、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、加齢に伴う記憶低下など、血液関連では、再生不良性貧血、白血病など、心血管関連では心筋梗塞、閉塞性動脈硬化症など、歯科関連では歯周病、歯槽膿漏による歯槽骨損傷など、眼科関連では、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、緑内障など、肝臓・膵臓関連では肝炎、肝硬変、糖尿病などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0029】

また、オケラの抽出物は、造血幹細胞の増殖促進作用及び未分化状態維持作用を有するので、造血幹細胞の減少又は機能低下に関連する血液及び造血器の疾患又は病態を治療、改善、及び予防するための医薬品として有効である。ここで、造血幹細胞の減少又は機能低下に関連する血液及び造血器の疾患又は病態としては、例えば、鉄欠乏性貧血、巨赤芽球性貧血、溶血性貧血、赤芽球癆、再生不良性貧血、先天性貧血（例えば鎌状赤血球血症）、発作性夜間色素尿症、二次性貧血（感染症、悪性腫瘍、慢性疾患、腎疾患、肝疾患、内分泌性疾患等に伴う貧血）、白血病、骨髄異形性症候群、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄増殖性疾患（真性多血症・本態性血小板血症・骨髄線維症など）、突発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血のほか、一般的な貧血状態（動悸、息切れ、眩暈、立ち眩み、異嗜症、易疲労感、倦怠感、食欲不振、悪心、頭痛、顔面蒼白、肌のクスミやクマ、耳鳴り、肩こり、口角炎等）などが挙げられるが、これらに限定はされない。また、「造血幹細胞の減少又は機能低下」は、上記の疾患によるものだけではなく、抗癌剤や免疫抑制剤の投与、癌の放射線治療によるものを含む。

【0030】

本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤におけるオケラの抽出物の含有量は、特に限定されないが、抽出物の性状（抽出液、濃縮物、又は乾燥物）により、例えば、０．００００１〜１００重量％の範囲で適宜設定でき、０．０００１〜１０重量％が好ましく、０．００１〜１重量％であることがより好ましい。

【0031】

本発明はまた、幹細胞を、オケラの抽出物を含有する培地で培養することで、幹細胞の未分化状態を維持させたまま、幹細胞増殖を促進する方法に関する。換言すれば、本発明に係る方法は、幹細胞を、オケラの抽出物を含有する培地で培養する工程を含む、幹細胞の製造方法、幹細胞の未分化状態維持方法、又は幹細胞の増殖促進方法ということができる。

【0032】

本発明に係る方法において、幹細胞の培養には、幹細胞の未分化状態維持及び増殖のために一般的に使用されている培地を用いればよい。例えば、幹細胞の生存及び増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン、脂肪酸）を含む基本培地、具体的には、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ １６４０、Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２（Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２）、Ｇｌａｓｇｏｗ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ）、ハンクス液（Ｈａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）等が挙げられる。また、培地に、増殖因子として塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）及び／又は白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）を添加してもよい。さらに、必要に応じて、培地は、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ビタミン類、インターロイキン類、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コラーゲン、フィブロネクチン、プロゲステロン、セレナイト、Ｂ２７−サプリメント、Ｎ２−サプリメント、ＩＴＳ−サプリメント、抗生物質等を含有してもよい。

【0033】

また、上記の成分以外には、１〜２０％の含有率で血清が培地に含まれることが好ましい。しかしながら、血清はロットの違いにより成分が異なり、その効果にバラツキがあるため、ロットチェックを行った後に使用することが好ましい。

【0034】

市販品の培地としては、インビトロジェン製の間葉系幹細胞基礎培地や、三光純薬製の間葉系幹細胞基礎培地、ＴＯＹＯＢＯ社製のＭＦ培地、Ｓｉｇｍａ社製のハンクス液（Ｈａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）等を用いることができる。

【0035】

幹細胞の培養に用いる培養器は、幹細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、例えば、フラスコ、シャーレ、ディッシュ、プレート、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バッグ、ローラーボトルなどが挙げられる。

【0036】

培養器は、細胞非接着性であっても接着性であってもよく、目的に応じて適宜選択される。細胞接着性の培養器は、細胞との接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス等による細胞支持用基質などで処理したものを用いてもよい。細胞支持用基質としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチンなどが挙げられる。

【0037】

幹細胞培養に使用される培地に対するオケラの抽出物の添加濃度は、上述の本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤におけるオケラの抽出物の含有量に準じて適宜決定することができるが、オケラ抽出物の乾燥物に換算して、例えば１０〜１００００μｇ／ｍＬ、好ましくは１００〜５０００μｇ／ｍＬの濃度が挙げられる。また、幹細胞の培養期間中、オケラの抽出物を、定期的に培地に添加してもよい。

【0038】

幹細胞の培養条件は、幹細胞の培養に用いられる通常の条件に従えばよく、特別な制御は必要ではない。例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが約３０〜４０℃、好ましくは３６〜３７℃である。ＣＯ_２ガス濃度は、例えば約１〜１０％、好ましくは約２〜５％である。なお、培地の交換は２〜３日に１回行うことが好ましく、毎日行うことがより好ましい。前記培養条件は、幹細胞が生存及び増殖可能な範囲で適宜変動させて設定することもできる。

【0039】

幹細胞の未分化状態維持は、例えば、本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤の非存在下で培養した幹細胞と比較して、本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤の存在下で培養した該幹細胞において幹細胞未分化マーカー遺伝子の発現レベルがｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルで培養開始時の発現レベルと同程度のレベルに有意に維持されているか否かで評価することができる。幹細胞未分化マーカー遺伝子としては、例えばＮａｎｏｇ遺伝子（Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． ２００７ Ｊａｎ； １７（１）：４２−９． Ｒｅｖｉｅｗ． Ｎａｎｏｇ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｉｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ． Ｐａｎ Ｇ， Ｔｈｏｍｓｏｎ ＪＡ．）等が挙げられる。

【0040】

幹細胞未分化マーカー遺伝子発現レベルの測定方法としては、ｍＲＮＡレベルでは、例えば幹細胞未分化マーカー遺伝子に特異的なプライマーやプローブを用いたＲＴ−ＰＣＲ、定量ＰＣＲやノーザンブロッティング等の方法が挙げられ、また、タンパク質レベルでは、例えば幹細胞未分化マーカー遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的な抗体を用いたＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ウエスタンブロッティング等の免疫学的方法が挙げられる。

【0041】

発現レベルの測定の結果、培養開始時（１００％未分化状態）の幹細胞における幹細胞未分化マーカー遺伝子の発現レベルと本発明の幹細胞の未分化状態維持剤の存在下で所定時間培養後の幹細胞における幹細胞未分化マーカー遺伝子の発現レベルとの相対比が、本発明の幹細胞の未分化状態維持剤の非存在下で培養した場合の同相対比（コントロール）よりも大きい場合に幹細胞の未分化状態を維持できたと判定することができる。

【0042】

また、幹細胞の増殖促進は、例えば、本発明に係る幹細胞の増殖促進剤の非存在下で培養した幹細胞と比較して、本発明に係る幹細胞の増殖促進剤の存在下で培養した該幹細胞の細胞数が有意に増加されているか否かで評価することができる。細胞数の測定は、例えば、ＭＴＴ法やＷＳＴ法などにより、市販の細胞数測定キットを用いて行うことができる。測定の結果、培養開始時の幹細胞の細胞数と本発明の幹細胞の増殖促進剤の存在下で所定時間培養後の幹細胞の細胞数との相対比が、本発明の幹細胞の増殖促進剤の非存在下で培養した場合の同相対比（コントロール）よりも大きい場合に幹細胞の増殖を促進できたと判定することができる。

【0043】

上記の本発明に係る方法により調製された幹細胞は移植材料（細胞移植剤）として用いることができ、従来の骨髄移植又は臍帯血移植と同一の方法で実施できる。

【0044】

上記の本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤あるいは本発明に係る方法に準じて、オケラの抽出物を、単独で、あるいは培地と別々に又は培地と混合し、幹細胞の未分化状態維持又は増殖促進のための試薬キットとして提供することもできる。当該キットは、必要に応じて取扱い説明書等を含むことができる。あるいは、オケラの抽出物を培地と混合し、幹細胞の未分化状態維持又は増殖促進用培地として提供することもできる。

【0045】

本発明に係る上記の幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤を生体内に投与する場合は、そのまま投与することも可能であるが、本発明の効果を損なわない範囲で適当な添加物とともに化粧品、医薬部外品、医薬品、飲食品等の各種組成物に配合して提供することができる。なお、本発明の医薬品には、動物に用いる薬剤、即ち獣医薬も包含されるものとする。

【0046】

本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤を化粧品や医薬部外品に配合する場合は、その剤形は、水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、粉末分散系、油液系、ゲル系、軟膏系、エアゾール系、水−油二層系、又は水−油−粉末三層系等のいずれでもよい。また、当該化粧品や医薬部外品は、幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤とともに、皮膚外用組成物において通常使用されている各種成分、添加剤、基剤等をその種類に応じて選択し、適宜配合し、当分野で公知の手法に従って製造することができる。その形態は、液状、乳液状、クリーム状、ゲル状、ペースト状、スプレー状等のいずれであってもよい。皮膚外用組成物の配合成分としては、例えば、油脂類（オリーブ油、ヤシ油、月見草油、ホホバ油、ヒマシ油、硬化ヒマシ油等）、ロウ類（ラノリン、ミツロウ、カルナウバロウ等）、炭化水素類（流動パラフィン、スクワレン、スクワラン、ワセリン等）、脂肪酸類（ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸等）、高級アルコール類（ミリスチルアルコール、セタノール、セトステアリルアルコール、ステアリルアルコール、ベヘニルアルコール等）、エステル類（ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、オクタン酸セチル、トリオクタン酸グリセリン、ミリスチン酸オクチルドデシル、ステアリン酸オクチル、ステアリン酸ステアリル等）、有機酸類（クエン酸、乳酸、α-ヒドロキシ酢酸、ピロリドンカルボン酸等）、糖類（マルチトール、ソルビトール、キシロビオース、N-アセチル-D-グルコサミン等）、蛋白質及び蛋白質の加水分解物、アミノ酸類及びその塩、ビタミン類、植物・動物抽出成分、種々の界面活性剤、保湿剤、紫外線吸収剤、抗酸化剤、安定化剤、防腐剤、殺菌剤、香料等が挙げられる。

【0047】

化粧品や医薬部外品の種類としては、例えば、化粧水、乳液、ジェル、美容液、一般クリーム、日焼け止めクリーム、パック、マスク、洗顔料、化粧石鹸、ファンデーション、おしろい、浴用剤、ボディローション、ボディシャンプー、ヘアシャンプー、ヘアコンディショナー、育毛剤等が挙げられる。

【0048】

本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤を医薬品に配合する場合は、薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物と混合し、患部に適用するのに適した製剤形態の各種製剤に製剤化することができる。薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物としては、その剤形、用途に応じて、適宜選択した製剤用基材や担体、賦形剤、希釈剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、崩壊剤又は崩壊補助剤、安定化剤、保存剤、防腐剤、増量剤、分散剤、湿潤化剤、緩衝剤、溶解剤又は溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、噴射剤、着色剤、甘味剤、矯味剤、香料等を適宜添加し、公知の種々の方法にて経口又は非経口的に全身又は局所投与することができる各種製剤形態に調製すればよい。本発明の医薬品を上記の各形態で提供する場合、通常当業者に用いられる製法、たとえば日本薬局方の製剤総則［２］製剤各条に示された製法等により製造することができる。

【0049】

本発明の医薬品の形態としては、特に制限されるものではないが、例えば錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、トローチ剤、顆粒剤、散剤、液剤、丸剤、乳剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤などの経口剤、注射剤（例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤）、点滴剤、座剤、軟膏剤、ローション剤、点眼剤、噴霧剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、貼付剤などの非経口剤などが挙げられる。また、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよく、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。

【0050】

本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤を、前記皮膚関連の損傷や疾患を治療、改善、及び予防するための医薬品として用いる場合に適した形態は外用製剤であり、例えば、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、液剤、貼付剤（パップ剤、プラスター剤）、フォーム剤、スプレー剤、噴霧剤などが挙げられる。軟膏剤は、均質な半固形状の外用製剤をいい、油脂性軟膏、乳剤性軟膏、水溶性軟膏を含む。ゲル剤は、水不溶性成分の抱水化合物を水性液に懸濁した外用製剤をいう。液剤は、液状の外用製剤をいい、ローション剤、懸濁剤、乳剤、リニメント剤等を含む。

【0051】

本発明の医薬品は、上記疾患の発症を抑制する予防薬として、及び／又は、正常な状態に改善する治療薬として機能する。本発明の医薬品の有効成分は、天然物由来であるため、非常に安全性が高く副作用がないため、前述の疾患の治療、改善、及び予防用医薬として用いる場合、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ等の哺乳動物に対して広い範囲の投与量で経口的に又は非経口的に投与することができる。

【0052】

本発明の化粧品、医薬品、医薬部外品における幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤の含有量は特に限定されないが、製剤（組成物）全重量に対して、オケラの抽出物の乾燥物に換算して、０．００１〜３０重量％が好ましく、０．０１〜１０重量％がより好ましい。上記の量があくまで例示であって、組成物の種類や形態、一般的な使用量、効能・効果などを考慮して適宜設定・調整すればよい。また、製剤化における有効成分の添加法については、予め加えておいても、製造途中で添加してもよく、作業性を考えて適宜選択すればよい。

【0053】

また、本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤は、飲食品にも配合できる。また、本発明において、飲食品とは、一般的な飲食品のほか、医薬品以外で健康の維持や増進を目的として摂取できる食品、例えば、健康食品、機能性食品、保健機能食品、又は特別用途食品を含む意味で用いられる。健康食品には、栄養補助食品、健康補助食品、サプリメント等の名称で提供される食品を含む。保健機能食品は食品衛生法又は健康増進法により定義され、特定の保健の効果や栄養成分の機能、疾病リスクの低減などを表示できる、特定保健用食品及び栄養機能食品、ならびに科学的根拠に基づいた機能性について消費者庁長官に届け出た内容を表示できる機能性表示食品が含まれる。また特別用途食品には、特定の対象者や特定の疾患を有する患者に適する旨を表示する病者用食品、高齢者用食品、乳児用食品、妊産婦用食品等が含まれる。幹細胞が造血幹細胞である場合は、本剤は、特に高齢者、妊産婦、月経や出血傾向を伴う疾病（胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃腸のポリープや癌、痔など）時における貧血や貧血に伴う諸症状の改善及び予防のための健康食品等に好適に用いることができる。ここで、飲食品に付される特定の保健の効果や栄養成分の機能等の表示は、製品の容器、包装、説明書、添付文書などの表示物、製品のチラシやパンフレット、新聞や雑誌等の製品の広告などにすることができる。

【0054】

飲食品の形態は、食用に適した形態、例えば、固形状、液状、顆粒状、粒状、粉末状、カプセル状、クリーム状、ペースト状のいずれであってもよい。特に、上記の健康食品等の場合の形状としては、例えば、タブレット状、丸状、カプセル状、粉末状、顆粒状、細粒状、トローチ状、液状（シロップ状、乳状、懸濁状を含む）等が好ましい。

【0055】

飲食品の種類としては、パン類、麺類、菓子類、乳製品、水産・畜産加工食品、油脂及び油脂加工食品、調味料、各種飲料（清涼飲料、炭酸飲料、美容ドリンク、栄養飲料、果実飲料、乳飲料など）及び該飲料の濃縮原液及び調整用粉末等が挙げられるが、これらに限定はされない。

【0056】

本発明の飲食品は、その種類に応じて通常使用される添加物を適宜配合してもよい。添加物としては、食品衛生法上許容されうる添加物であればいずれも使用できるが、例えば、ブドウ糖、ショ糖、果糖、異性化液糖、アスパルテーム、ステビア等の甘味料；クエン酸、リンゴ酸、酒石酸等の酸味料；デキストリン、デンプン等の賦形剤；結合剤、希釈剤、香料、着色料、緩衝剤、増粘剤、ゲル化剤、安定剤、保存剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤などが挙げられる。

【0057】

本発明の飲食品が一般的な飲食品の場合は、その飲食品の通常の製造工程においてオケラの抽出物を添加する工程を含めることによって製造することができる。また健康食品の場合は、前記の医薬品の製造方法に準じればよく、例えば、タブレット状のサプリメントでは、オケラの抽出物に、賦形剤等の添加物を添加、混合し、打錠機等で圧力をかけて成形することにより製造することができる。また、必要に応じてその他の材料（例えば、ビタミンＣ、ビタミンＢ_２、ビタミンＢ_６等のビタミン類、カルシウムなどのミネラル類、食物繊維等）を添加することもできる。

【0058】

本発明の飲食品におけるオケラの抽出物の配合量は、幹細胞の未分化状態維持効果及び増殖促進効果を発揮できる量であればよいが、対象飲食品の一般的な摂取量、飲食品の形態、効能・効果、呈味性、嗜好性及びコストなどを考慮して適宜設定すればよい。

【実施例】

【0059】

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

【0060】

［実施例１］オケラの抽出物の製造例
以下に、オケラを用いた溶媒抽出物の製造例を示す。

【0061】

（製造例１）オケラの熱水抽出物
オケラの根茎の乾燥物１００ｇに精製水８００ｍＬを加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してオケラの熱水抽出物を５．８ｇ得た。

【0062】

（製造例２）オケラの５０％エタノール抽出物
オケラの根茎の乾燥物１００ｇに５０（ｖ／ｖ）％エタノール水溶液４００ｍＬを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、オケラの５０％エタノール抽出物を３．２ｇ得た。

【0063】

（製造例３）オケラのエタノール抽出物
オケラの根茎の乾燥物１００ｇにエタノール１Ｌを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、オケラのエタノール抽出物を４．６ｇ得た。

【0064】

（製造例４）オオバナオケラの熱水抽出物
オオバナオケラの根茎の乾燥物１００ｇに精製水８００ｍＬを加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してオオバナオケラの熱水抽出物を５．９ｇ得た。

【0065】

（製造例５）オオバナオケラの５０％エタノール抽出物
オオバナオケラの根茎の乾燥物１００ｇに５０（ｖ／ｖ）％エタノール水溶液４００ｍＬを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、オオバナオケラの５０％エタノール抽出物を３．９ｇ得た。

【0066】

（製造例６）オオバナオケラのエタノール抽出物
オオバナオケラの根茎の乾燥物１００ｇにエタノール１Ｌを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、オオバナオケラのエタノール抽出物を４．１ｇ得た。

【0067】

（製造例７）ホソバオケラの熱水抽出物
ホソバオケラの根茎の乾燥物１００ｇに精製水８００ｍＬを加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してホソバオケラの熱水抽出物を６．１ｇ得た。

【0068】

（製造例８）ホソバオケラの５０％エタノール抽出物
ホソバオケラの根茎の乾燥物１００ｇに５０（ｖ／ｖ）％エタノール水溶液４００ｍＬを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、ホソバオケラの50%エタノール抽出物を５．１ｇ得た。

【0069】

（製造例９）ホソバオケラのエタノール抽出物
ホソバオケラの根茎の乾燥物１００ｇにエタノール１Ｌを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、ホソバオケラのエタノール抽出物を４．６ｇ得た。

【0070】

［実施例２］オケラの抽出物の幹細胞に対する増殖促進効果及び未分化状態維持効果の評価
以下に、実施例１において製造したオケラの抽出物を用いた、幹細胞に対する増殖促進効果及び未分化状態維持効果の実験例とその結果を示す。

【0071】

（実験例１）幹細胞に対する増殖促進効果の評価
ヒト幹細胞培養液（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて培養したヒト体性幹細胞（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、６ｃｍディッシュに３ｘ１０^５個播種し、被験物質（製造例１〜９のオケラの抽出物）を最終濃度が３１２μｇ／ｍＬ、６２５μｇ／ｍＬ、１２５０μｇ／ｍＬになるように添加し、３日間培養を続けた。

【0072】

３日間の培養後、細胞をＰＢＳ（−）にて３回洗浄した後、ラバーポリスマンにて集め、それぞれの細胞数をカウントした。
被験物質未添加時の総細胞数をコントロールとし、コントロールを１００（％）とした場合の、被験物質添加時の細胞数の増減（％）を算出し、幹細胞増殖促進効果の評価を行った。
これらの試験結果を以下の表１に示す。

【0073】

【表1】

【0074】

表１に示すように、オケラの抽出物に、顕著な幹細胞増殖促進効果が認められた。また、なお、上述のコントロールの値を１００％とした場合、培養開始時のヒト体性幹細胞数は、２５％であった。以上より、オケラの抽出物の極めて優れた幹細胞増殖促進効果を明らかにした。なお、本実験例で用いた幹細胞以外にも、市販のヒト造血幹細胞、胚性の幹細胞（ＥＳ細胞）についても同様な試験を行ったところ、顕著な幹細胞増殖促進効果が認められた。

【0075】

（実験例２）幹細胞に対する未分化状態維持効果の評価
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ培養液（Ｇｉｂｃｏ社製）に、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、１５％、Ｓｉｇｍａ社製）、ヌクレオシド液（１００倍希釈、大日本製薬社製）、非必須アミノ酸液（１００倍希釈、大日本製薬社製）、β２−メルカプトエタノール液（１００倍希釈、大日本製薬社製）、Ｌ−グルタミン液（１００倍希釈、大日本製薬社製）、ペニシリン（１００ｕｎｉｔ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ社製）とストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ社製）を加えて調製した培地を用いて、マウス胚性幹細胞（マウスＥＳ細胞：コスモバイオ社製）を、ゼラチン（Ｓｉｇｍａ社製）でコートした６ｃｍディッシュに５ｘ１０^５個播種し、被験物質（製造例１〜９のオケラの抽出物）を最終濃度が１２５０μｇ／ｍＬになるように培地に添加し、３日間培養を続けた。

【0076】

培養３日後に、細胞を回収し、ＰＢＳ（−）にて２回洗浄し、Ｔｒｉｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって細胞からＲＮＡを抽出した。２−ＳＴＥＰリアルタイムＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、抽出したＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した後、ＡＢＩ７３００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により、下記のプライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲ（９５℃：１５秒間、６０℃：３０秒間、４０ｃｙｃｌｅｓ）を実施し、Ｎａｎｏｇ（未分化マーカー： Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． ２００７ Ｊａｎ； １７（１）：４２−９．Ｒｅｖｉｅｗ． Ｎａｎｏｇ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｉｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ． Ｐａｎ Ｇ， Ｔｈｏｍｓｏｎ ＪＡ．）の遺伝子発現を確認した。その他の操作は定められた方法に従って実施した。

【0077】

Ｎａｎｏｇ（未分化マーカー）用プライマーセット：
ＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＴＴＴＴＴＣＡＴＣＣ（配列番号１）
ＧＡＧＧＣＡＧＧＴＣＴＴＣＡＧＡＧＧＡＡ（配列番号２）
Ｇａｐｄｈ（内部標準）用のプライマーセット：
ＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ（配列番号３）
ＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＡＴＧ（配列番号４）

【0078】

未分化状態維持効果は、培養開始時のマウスＥＳ細胞におけるＮａｎｏｇ ｍＲＮＡの発現量を内部標準であるＧａｐｄｈ ｍＲＮＡの発現量に対する割合として算出したＮａｎｏｇの遺伝子相対発現量（Ｎａｎｏｇ遺伝子発現量／Ｇａｐｄｈ遺伝子発現量）の値を１００％未分化状態とし、これに対し、培養３日後のＥＳ細胞におけるＮａｎｏｇの遺伝子相対発現量の値を算出し、評価した。
これらの試験結果を以下の表２に示す。

【0079】

【表2】

【0080】

表２に示すように、オケラの抽出物には、顕著な幹細胞の未分化状態維持効果が認められた。なお、本実験例で用いた幹細胞以外にも、体性の幹細胞として市販のヒト造血幹細胞についても同様な試験を行ったところ、顕著な幹細胞の未分化状態維持効果が認められた。

【0081】

以上の各実験例に示すように、オケラの抽出物を幹細胞に適用することで、従来の技術に比べて、簡便且つ効率的に、未分化状態を維持させたまま幹細胞の増殖を促進させることが可能になった。

【産業上の利用可能性】

【0082】

本発明の活用例として、再生医療や再生美容への応用が期待される。例えば、本発明を利用することで、再生医療や再生美容に用いる未分化状態の幹細胞を簡便に効率良く調製することが可能となる。さらに、幹細胞の移植後又は組織に存在する幹細胞に対して、本発明に係るオケラの抽出物を、直接的に注入するか又は経口投与、塗布、貼付等により適用することで、該幹細胞を、未分化状態を維持させたまま増殖させることが可能である。 すなわち、本発明は、再生医療や再生美容における、幹細胞の製造方法及び／又は幹細胞の未分化状態維持剤又は増殖促進剤としての利用が可能である。

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]