特許 6649265 糖原病の処置のためのアデノ随伴ウイルスベクター

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6649265

(24)【登録日】2020年1月20日

(45)【発行日】2020年2月19日

(54)【発明の名称】糖原病の処置のためのアデノ随伴ウイルスベクター

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/864 20060101AFI20200210BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20200210BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20200210BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20200210BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20200210BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20200210BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20200210BHJP

   A61P 3/08 20060101ALI20200210BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20200210BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20200210BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20200210BHJP

   A61P 19/06 20060101ALI20200210BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/864 100Z

   C12N1/15ZNA

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   A61K31/7088

   A61K35/761

   A61P3/08

   A61P1/16

   A61P13/12

   A61P3/06

   A61P19/06

【請求項の数】18

【全頁数】44

(21)【出願番号】特願2016-554828(P2016-554828)

(86)(22)【出願日】2014年11月25日

(65)【公表番号】特表2016-538885(P2016-538885A)

(43)【公表日】2016年12月15日

(86)【国際出願番号】US2014067415

(87)【国際公開番号】WO2015081101

(87)【国際公開日】20150604

【審査請求日】2017年10月16日

(31)【優先権主張番号】61/908,861

(32)【優先日】2013年11月26日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】508285606

【氏名又は名称】ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ

(73)【特許権者】

【識別番号】500360769

【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ フロリダ リサーチ ファウンデーション，インコーポレイティド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】チョウ， ジャニス ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】バーン， バリー ジェイ．

【審査官】 戸来 幸男

(56)【参考文献】

【文献】 Mol. Ther.，２０１０年，vol.18, no.6，pp.1076-1084

【文献】 Mol. Genet. Metab.，２０１３年 ６月，vol.110, no.3，pp.275-280

【文献】 Hepatology，２０１２年，vo.56, no.5，pp.1719-1729

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／

ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号３のヌクレオチド１８２〜４４４１または配列番号１のヌクレオチド１８２〜４４４１を含む組換え核酸分子。

【請求項2】

配列番号３のヌクレオチド１７〜４８１９または配列番号１のヌクレオチド１７〜４８１９を含む、請求項１に記載の組換え核酸分子。

【請求項3】

配列番号３または配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項１または請求項２に記載の組換え核酸分子。

【請求項4】

請求項１から３までのいずれか一項に記載の組換え核酸分子を含むベクター。

【請求項5】

前記ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項４に記載のベクター。

【請求項6】

前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）ベクターである、請求項５に記載のベクター。

【請求項7】

請求項１から３までのいずれか一項に記載の組換え核酸分子または請求項４から６までのいずれか一項に記載のベクターを含む単離された宿主細胞。

【請求項8】

請求項１から３までのいずれか一項に記載の組換え核酸分子を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）。

【請求項9】

前記ｒＡＡＶがｒＡＡＶ８である、請求項８に記載のｒＡＡＶ。

【請求項10】

薬学的に許容される担体中に請求項８または請求項９に記載のｒＡＡＶを含む組成物。

【請求項11】

静脈内投与用に製剤化されている、請求項１０に記載の組成物。

【請求項12】

糖原病Ｉａ型（ＧＳＤ−Ｉａ）と診断された対象を処置するための組成物であって、治療有効量の請求項８もしくは請求項９に記載のｒＡＡＶまたは請求項１０もしくは請求項１１に記載の組成物を含む組成物。

【請求項13】

前記組成物が静脈内に投与されることを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。

【請求項14】

前記ｒＡＡＶが、１×１０^１１〜１×１０^１４ウイルス粒子（ｖｐ）／ｋｇの用量で投与されることを特徴とする、請求項１２または請求項１３に記載の組成物。

【請求項15】

前記ｒＡＡＶが、１×１０^１２〜８×１０^１３ｖｐ／ｋｇの用量で投与されることを特徴とする、請求項１４に記載の組成物。

【請求項16】

前記ｒＡＡＶが、１×１０^１３〜６×１０^１３ｖｐ／ｋｇの用量で投与されることを特徴とする、請求項１４に記載の組成物。

【請求項17】

前記組成物が、単回用量のｒＡＡＶで投与されることを特徴とする、請求項１２から１６までのいずれか一項に記載の組成物。

【請求項18】

前記組成物が、複数回用量のｒＡＡＶで投与されることを特徴とする、請求項１２から１６までのいずれか一項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１１月２６日に出願された米国仮出願第６１／９０８，８６１号の利益を請求し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

【0002】

分野
本開示は、糖原病、特に、糖原病Ｉａ型を処置するための遺伝子療法ベクターに関する。

【背景技術】

【0003】

糖原病Ｉａ型（ＧＳＤ−Ｉａまたはフォン・ギールケ病、ＭＩＭ２３２２００）は、主に肝臓、腎臓、および腸において発現する酵素であるグルコース−６−ホスファターゼ−α（Ｇ６Ｐａｓｅ−α）の欠損によって引き起こされる（Chouら、Nat Rev Endocrinol ６巻：６７６〜６８８頁、２０１０年）。Ｇ６Ｐａｓｅ−αは、Ｇ６ＰＣ遺伝子によりコードされる、９つの膜貫通へリックスによって小胞体（ＥＲ）内に固定（ａｎｃｈｏｒ）された疎水性タンパク質である（Chouら、Nat Rev Endocrinol ６巻：６７６〜６８８頁、２０１０年）。この酵素は、グリコーゲン分解および糖新生の最終ステップにおけるグルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）からグルコースおよびリン酸への加水分解を触媒する。ＧＳＤ−Ｉａに罹患している患者は、グルコース恒常性を維持することができず、空腹時低血糖、成長遅延、肝腫大、腎肥大症、高脂血症、高尿酸血症、および乳酸血症（lactic academia）を示す（Chouら、Nat Rev Endocrinol ６巻：６７６〜６８８頁、２０１０年）。

【0004】

現在のところ、ＧＳＤ−Ｉａは治癒しない。低血糖症は、食事療法を使用して管理することができ（Greeneら、N Engl J Med ２９４巻：４２３〜４２５頁、１９７６年；Chenら、N Engl J Med ３１０巻：１７１〜１７５頁、１９８４年）、これにより、患者がほぼ正常な成長および思春期発育を達成することが可能になる。しかし、長期間の臨床的合併症、およびそれらの基礎をなす病理学的プロセスは修正されないままである。最も重要な慢性リスクのうちの１つは肝細胞腺腫（ＨＣＡ）であり、これは２５歳を超えるＧＳＤ−Ｉ患者の７０〜８０％で発生する（Chouら、Nat Rev Endocrinol ６巻：６７６〜６８８頁、２０１０年；Labruneら、J Pediatr Gastroenterol Nutr ２４巻：２７６〜２７９頁、１９９７年；Rakeら、Eur J Pediatr １６１巻（補遺１）：Ｓ２０〜Ｓ３４頁、２００２年）。ＧＳＤ−Ｉａ患者におけるＨＣＡは、小さく、多発性であり、非被包性であり、局所圧迫および腫瘍内出血を含めた合併症を伴う。ＧＳＤ−Ｉａ患者の１０％で、ＨＣＡは悪性転換して肝細胞癌（ＨＣＣ）になる（Chouら、Nat Rev Endocrinol ６巻：６７６〜６８８頁、２０１０年；Rakeら、Eur J Pediatr １６１巻（補遺１）：Ｓ２０〜Ｓ３４頁、２００２年；Francoら、J Inherit Metab Dis ２８巻：１５３〜１６２頁、２００５年）。

【0005】

ＧＳＤ−Ｉａの動物モデルにおいて、Ｇ６Ｐａｓｅ−αを保有する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用した遺伝子療法試験が実施されており、これらの試験により、毒性を伴わない有効性が実証された（ChouおよびMansfield、Expert Opin Biol Ther １１巻：１０１１〜１０２４頁、２０１１年に総説されている）。ＧＳＤ−Ｉａのマウスモデルを使用した以前の試験では、Ｇ６Ｐａｓｅ−αを発現する組換えＡＡＶは、ＣＢＡプロモーター／ＣＭＶエンハンサー（Ghoshら、Gene Ther １３巻：３２１〜３２９頁、２００６年）、イヌＧ６ＰＣプロモーター（Koeberlら、Gene Ther １３巻：１２８１〜１２８９頁、２００６年）、またはＧ６ＰＣ ５’フランキング領域のヌクレオチド−２９８〜＋１２８にあるヒトＧ６ＰＣプロモーター（Koeberlら、Mol Ther １６巻：６６５〜６７２頁、２００８年）により導かれ、Ｇ６Ｐａｓｅ−α導入遺伝子を肝臓に送達し、この障害の長期の修正を実現することが示されている。しかし、これらの試験で見込みは示されたが、肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α欠損の完全な修正は誰にもできていない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Chouら、Nat Rev Endocrinol ６巻：６７６〜６８８頁、２０１０年

【非特許文献2】Greeneら、N Engl J Med ２９４巻：４２３〜４２５頁、１９７６年

【非特許文献3】Chenら、N Engl J Med ３１０巻：１７１〜１７５頁、１９８４年

【非特許文献4】Labruneら、J Pediatr Gastroenterol Nutr ２４巻：２７６〜２７９頁、１９９７年

【非特許文献5】Rakeら、Eur J Pediatr １６１巻（補遺１）：Ｓ２０〜Ｓ３４頁、２００２年

【非特許文献6】Francoら、J Inherit Metab Dis ２８巻：１５３〜１６２頁、２００５年

【非特許文献7】ChouおよびMansfield、Expert Opin Biol Ther １１巻：１０１１〜１０２４頁、２０１１年

【非特許文献8】Ghoshら、Gene Ther １３巻：３２１〜３２９頁、２００６年

【非特許文献9】Koeberlら、Gene Ther １３巻：１２８１〜１２８９頁、２００６年

【非特許文献10】Koeberlら、Mol Ther １６巻：６６５〜６７２頁、２００８年

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

本明細書では、糖原病、特にＧＳＤ−Ｉａを処置するための遺伝子療法の適用において使用することができる組換え核酸分子、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターおよび組換えＡＡＶが提供される。

【0008】

一部の実施形態では、組換え核酸分子は、Ｇ６ＰＣプロモーター／エンハンサー、合成イントロン、およびＧ６ＰＣコード領域を含み、後者は、必要に応じて、ヒト細胞において発現させるためにコドン最適化されたものである。組換え核酸分子は、Ｇ６ＰＣプロモーター／エンハンサーとイントロンの間ならびにイントロンとＧ６ＰＣコード配列の間に置かれたスタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）核酸配列をさらに含む。特定の非限定的な例では、組換え核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド１８２〜４４４１または配列番号３のヌクレオチド１８２〜４４４１を含む。

【0009】

一部の実施形態では、組換え核酸分子は、５’および３’末端逆位（ＩＴＲ）配列をさらに含む。いくつかの例では、組換え核酸分子（recombine ant nucleic acid）は、配列番号１のヌクレオチド１７〜４８１９または配列番号３のヌクレオチド１７〜４８１９を含む。他の実施形態では、組換え核酸分子は、配列番号１または配列番号３の完全なベクター核酸配列を含む。

【0010】

本明細書に開示されている組換え核酸分子を含むベクターも提供される。一部の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶ８ベクターなどのＡＡＶベクターである。さらに、本明細書に開示されている組換え核酸分子またはベクターを含む単離された宿主細胞が提供される。例えば、単離された宿主細胞は、ＡＡＶの増殖に適した細胞であってよい。

【0011】

本明細書では、本明細書に開示されている組換え核酸分子を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）も提供される。ｒＡＡＶを含む組成物も本開示により提供される。

【0012】

糖原病と診断された対象を処置する方法であって、糖原病Ｉａ型（ＧＳＤ−Ｉａ）の対象を選択するステップと、対象に、治療有効量の本明細書に開示されているｒＡＡＶ、またはｒＡＡＶを含む組成物を投与するステップとを含む方法がさらに提供される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
配列番号３のヌクレオチド１８２〜４４４１または配列番号１のヌクレオチド１８２〜４４４１を含む組換え核酸分子。
（項目２）
配列番号３のヌクレオチド１７〜４８１９または配列番号１のヌクレオチド１７〜４８１９を含む、項目１に記載の組換え核酸分子。
（項目３）
配列番号３または配列番号１のヌクレオチド配列を含む、項目１または項目２に記載の組換え核酸分子。
（項目４）
項目１から３までのいずれか一項に記載の組換え核酸分子を含むベクター。
（項目５）
前記ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、項目４に記載のベクター。
（項目６）
前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）ベクターである、項目５に記載のベクター。
（項目７）
項目１から３までのいずれか一項に記載の組換え核酸分子または項目４から６までのいずれか一項に記載のベクターを含む単離された宿主細胞。
（項目８）
項目１から３までのいずれか一項に記載の組換え核酸分子を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）。
（項目９）
前記ｒＡＡＶがｒＡＡＶ８である、項目８に記載のｒＡＡＶ。
（項目１０）
薬学的に許容される担体中に項目８または項目９に記載のｒＡＡＶを含む組成物。
（項目１１）
静脈内投与用に製剤化されている、項目１０に記載の組成物。
（項目１２）
糖原病と診断された対象を処置する方法であって、糖原病Ｉａ型（ＧＳＤ−Ｉａ）の対象を選択するステップと、前記対象に、治療有効量の項目８もしくは項目９に記載のｒＡＡＶまたは項目１０もしくは項目１１に記載の組成物を投与するステップとを含む方法。
（項目１３）
前記ｒＡＡＶを静脈内に投与する、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記ｒＡＡＶを、約１×１０^１１〜約１×１０^１４ウイルス粒子（ｖｐ）／ｋｇの用量で投与する、項目１２または項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記ｒＡＡＶを、約１×１０^１２〜８×１０^１３ｖｐ／ｋｇの用量で投与する、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記ｒＡＡＶを、約１×１０^１３〜６×１０^１３ｖｐ／ｋｇの用量で投与する、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記ｒＡＡＶを投与するステップが、単回用量のｒＡＡＶの投与を含む、項目１２から１６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
ｒＡＡＶを投与するステップが、複数回用量のｒＡＡＶの投与を含む、項目１２から１６までのいずれか一項に記載の方法。

【0013】

本発明の前述および他の目的、特徴、および利点は、添付の図面を参照して進める以下の発明の詳細な説明からより明白なものになろう。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】図１Ａ〜１Ｂは、ＡＡＶ−ＧＰＥを注入したＧ６ｐｃ^−／−マウスの表現型分析の結果を示すグラフである。（図１Ａ）１．２×１０^１１ｖｇ／マウスのＡＡＶ−ＧＰＥを注入した雌性Ｇ６ｐｃ^−／−マウスおよびそれらの雌性Ｇ６ｐｃ^＋／＋／Ｇ６ｐｃ^＋／−同腹仔の体重が示されている。注入時の年齢（２日齢、２週齢または４週齢）がグラフの上に示されている。（白丸）、Ｇ６ｐｃ^＋／＋／Ｇ６ｐｃ^＋／−マウス；（黒丸）、ＡＡＶ−ＧＰＥを注入したＧ６ｐｃ^−／−マウス。（図１Ｂ）ＡＡＶ−ＧＰＥの注入を受けたマウスの血中グルコース、コレステロール、トリグリセリド、尿酸、および乳酸レベルが示されている。各群におけるそれぞれの代謝産物は類似しているので、示されているデータは、６週齢〜２４週齢のプールしたデータである。（＋／＋＆＋／−）、Ｇ６ｐｃ^＋／＋／Ｇ６ｐｃ^＋／−マウス、（−／−）、Ｇ６ｐｃ^−／−マウス、または（−／−ＧＰＥ）、２日齢（ｎ＝３６）、２週齢（ｎ＝２４）、または４週齢（ｎ＝９）の、ＡＡＶ−ＧＰＥを注入したＧ６ｐｃ^−／−マウス。データは、平均±ＳＥＭとして示されている。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。

【0015】

【図2】図２Ａ〜２Ｂは、２４時間の絶食後の野生型マウスおよびＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ^−／−マウスにおける肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性およびｍＲＮＡ発現を示すグラフである。２週齢のＧ６ｐｃ^−／−マウス７匹、４週齢のＧ６ｐｃ^−／−マウス１１匹、１５週齢のＧ６ｐｃ^−／−マウス（＊）１匹、および３０週齢のＧ６ｐｃ^−／−マウス（＊＊）１匹に、ＡＡＶ−ＧＰＥを、用量を変動させて注入し、マウスが７０〜９０週齢になったらＧ６Ｐａｓｅ−α活性およびｍＲＮＡ発現を評価した。（図２Ａ）示されている週齢（Ｗ）における肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性が示されている。マウスを、野生型活性に対するそれらのＧ６Ｐａｓｅ−α活性に基づいて、低（ＡＡＶ−Ｌ）、中（ＡＡＶ−Ｍ）および高（ＡＡＶ−Ｈ）に群分けする。（図２Ｂ）ＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ^−／−マウスにおける肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α ｍＲＮＡ発現およびそれとＧ６Ｐａｓｅ−α活性との関係。データは、平均±ＳＥＭとして示されている。図２Ｂでは、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５である。

【0016】

【図3】図３Ａ〜３Ｃは、ＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ^−／−マウスの７０〜９０週齢時の表現型分析の結果を示すグラフである。（図３Ａ）血中グルコース、コレステロール、トリグリセリド、尿酸、および乳酸レベル。（図３Ｂ）体重、体長、およびＢＭＩ。Ｆ、雌性；Ｍ、雄性。（図３Ｃ）肝臓重量。処置が以下の通り示されている：（＋／＋）、野生型マウス；（−／−ＡＡＶ）、ＡＡＶ−ＧＰＥを種々の投与量で注入したＧ６ｐｃ^−／−マウス。ＡＡＶ−Ｌ（ｎ＝６）、ＡＡＶ−Ｍ（ｎ＝９）、およびＡＡＶ−Ｈ（ｎ＝５）は、それぞれ正常な肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性の３〜９％（低、Ｌ）、２２〜６３％（中、Ｍ）、および８１〜１２８％（高、Ｈ）を発現する、ＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ^−／−マウスである。データは、平均±ＳＥＭとして示されている。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５。

【0017】

【図4】図４Ａ〜４Ｃは、空腹時血中グルコースおよび耐糖能プロファイルを示すグラフである。（図４Ａ）７０〜９０週齢時の野生型マウスおよびＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ^−／−マウスにおける空腹時血中グルコースプロファイル。（図４Ｂ）６週齢〜８週齢時の無処置のＧ６ｐｃ^−／−マウスにおける空腹時血中グルコースプロファイル。（図４Ｃ）７０〜９０週齢時の野生型マウスおよびＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ^−／−マウスにおける耐糖能プロファイル。野生型マウスまたはＡＡＶ−ＧＰＥを注入したＧ６ｐｃ^−／−マウスを６時間にわたって絶食させ、２ｍｇ／ｇのデキストロースを腹腔内注射し、次いで、３０分ごとに尾静脈を通じて血液の試料採取を行った。データは、平均±ＳＥＭとして示されている。（＋／＋）、野生型マウス；（−／−）、無処置のＧ６ｐｃ^−／−マウス。ＡＡＶ−Ｌ（ｎ＝６）、ＡＡＶ−Ｍ（ｎ＝９）、およびＡＡＶ−Ｈ（ｎ＝５）は、それぞれ正常な肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性の３〜９％、２２〜６３％、および８１〜１２９％を発現する、ＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ^−／−マウスである。

【0018】

【図5】図５Ａ〜５Ｃは、２４時間の絶食後の７０〜９０週齢の野生型マウスおよびＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ^−／−マウスにおける血中インスリンおよびＳＲＥＢＰ−１ｃおよびグルコキナーゼの肝臓ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。（図５Ａ）空腹時血中インスリンレベルおよびそれらと動物の体重との関係。（図５Ｂ）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによるＳＲＥＢＰ−１ｃ ｍＲＮＡの定量化。（図５Ｃ）グルコキナーゼｍＲＮＡ、および空腹時血中インスリンと肝臓グルコキナーゼｍＲＮＡレベルとの関係の定量化。（＋／＋、白丸）、野生型マウス（ｎ＝２０）；（−／−ＡＡＶ、黒丸）ＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ^−／−マウス（ｎ＝２０）。データは、平均±ＳＥＭとして示されている。＊＊Ｐ＜０．００５。

【0019】

【図6-1】図６Ａ〜６Ｄは、１２週齢の野生型マウス、ｒＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウスおよびｒＡＡＶ−ｍｉＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウスにおける生化学的分析の結果を示すグラフである。ｒＡＡＶ−ＧＰＥおよびｒＡＡＶ−ｍｉＧＰＥは、それぞれ２８６４ｂｐのヒトＧ６ＰＣプロモーター／エンハンサー（ＧＰＥ）および３８２ｂｐの最小ヒトＧ６ＰＣプロモーター／エンハンサー（ｍｉＧＰＥ）によって指向される、ヒトＧ６Ｐａｓｅを発現するｒＡＡＶベクターである。（図６Ａ）肝臓ミクロソームＧ６Ｐａｓｅ−α活性およびそれとベクターゲノムコピー数との関係。（図６Ｂ）成長曲線。（図６Ｃ）ＢＭＩ値。（図６Ｄ）血中グルコースレベル。ＧＰＥ−高、高用量のｒＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウス（白丸）；ｍｉＧＰＥ−高、高用量のｒＡＡＶ−ｍｉＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウス（黒丸）；ＧＰＥ−低、低用量のｒＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウス（白四角）；ｍｉＧＰＥ−低、低用量のｒＡＡＶ−ｍｉＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウス（黒四角）；（＋／＋）、野生型（下三角）マウス。データは平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５。

【図6-2】図６Ａ〜６Ｄは、１２週齢の野生型マウス、ｒＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウスおよびｒＡＡＶ−ｍｉＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウスにおける生化学的分析の結果を示すグラフである。ｒＡＡＶ−ＧＰＥおよびｒＡＡＶ−ｍｉＧＰＥは、それぞれ２８６４ｂｐのヒトＧ６ＰＣプロモーター／エンハンサー（ＧＰＥ）および３８２ｂｐの最小ヒトＧ６ＰＣプロモーター／エンハンサー（ｍｉＧＰＥ）によって指向される、ヒトＧ６Ｐａｓｅを発現するｒＡＡＶベクターである。（図６Ａ）肝臓ミクロソームＧ６Ｐａｓｅ−α活性およびそれとベクターゲノムコピー数との関係。（図６Ｂ）成長曲線。（図６Ｃ）ＢＭＩ値。（図６Ｄ）血中グルコースレベル。ＧＰＥ−高、高用量のｒＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウス（白丸）；ｍｉＧＰＥ−高、高用量のｒＡＡＶ−ｍｉＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウス（黒丸）；ＧＰＥ−低、低用量のｒＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウス（白四角）；ｍｉＧＰＥ−低、低用量のｒＡＡＶ−ｍｉＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウス（黒四角）；（＋／＋）、野生型（下三角）マウス。データは平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５。

【0020】

【図7】図７Ａ〜７Ｃは、１２週齢の野生型マウス、ｒＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウスおよびｒＡＡＶ−ｍｉＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウスにおける表現型分析の結果を示すグラフである。（図７Ａ）肝臓重量。（図７Ｂ）肝臓グリコーゲン含量。（図７Ｃ）肝臓トリグリセリド含量。ＧＰＥ−高（ｎ＝６）、高用量のｒＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウス；ｍｉＧＰＥ−高（ｎ＝６）、高用量のｒＡＡＶ−ｍｉＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウス；ＧＰＥ−低（ｎ＝６）、低用量のｒＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウス；ｍｉＧＰＥ−低（ｎ＝６）、低用量のｒＡＡＶ−ｍｉＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウス；（＋／＋）、野生型マウス。データは平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５。

【0021】

【図8-1】図８Ａ〜８Ｃは、１２週齢の野生型マウス、ｒＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウスおよびｒＡＡＶ−ｍｉＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウスにおける空腹時血中グルコースおよび耐糖能プロファイルを示すグラフである。（図８Ａ）空腹時血中グルコースプロファイル。（図８Ｂ）２４時間の絶食後の血中グルコースレベル。（図８Ｃ）耐糖能プロファイル。ＧＰＥ−高（ｎ＝６）、高用量のｒＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウス（白丸）；ｍｉＧＰＥ−高（ｎ＝６）、高用量のｒＡＡＶ−ｍｉＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウス（黒丸）；ＧＰＥ−低（ｎ＝６）、低用量のｒＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウス（白四角）；ｍｉＧＰＥ−低（ｎ＝６）、低用量のｒＡＡＶ−ｍｉＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウス（黒四角）；（＋／＋）、野生型マウス（ｎ＝２４）（下三角）。データは平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５。

【図8-2】図８Ａ〜８Ｃは、１２週齢の野生型マウス、ｒＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウスおよびｒＡＡＶ−ｍｉＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウスにおける空腹時血中グルコースおよび耐糖能プロファイルを示すグラフである。（図８Ａ）空腹時血中グルコースプロファイル。（図８Ｂ）２４時間の絶食後の血中グルコースレベル。（図８Ｃ）耐糖能プロファイル。ＧＰＥ−高（ｎ＝６）、高用量のｒＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウス（白丸）；ｍｉＧＰＥ−高（ｎ＝６）、高用量のｒＡＡＶ−ｍｉＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウス（黒丸）；ＧＰＥ−低（ｎ＝６）、低用量のｒＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウス（白四角）；ｍｉＧＰＥ−低（ｎ＝６）、低用量のｒＡＡＶ−ｍｉＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウス（黒四角）；（＋／＋）、野生型マウス（ｎ＝２４）（下三角）。データは平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５。

【0022】

【図9】図９は、イヌＧ６Ｐａｓｅ−αタンパク質配列（配列番号１０）とヒトＧ６Ｐａｓｅ−αタンパク質配列（配列番号４）のアラインメントである。

【0023】

【図10】図１０は、ヒトＧ６Ｐａｓｅ−α、マウスＧ６Ｐａｓｅ−α、ラットＧ６Ｐａｓｅ−αおよびイヌＧ６Ｐａｓｅ−αの間のアミノ酸の差異を示す表である。

【0024】

【図11】図１１は、ｒＡＡＶを用いて形質導入したＧＳＤ−Ｉａマウスにおける肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ活性を示すグラフである。ＧＳＤ−Ｉａマウスに、ＧＰＥプロモーター／エンハンサーによって指向される、天然ヒトＧ６Ｐａｓｅまたはコドン最適化された（ｃｏ）ヒトＧ６Ｐａｓｅのいずれかを発現するｒＡＡＶ８ベクター（１０^１３ｖｇ／ｋｇ）を用いて形質導入した。１２週齢のマウスにおける肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ活性は１６５．４±１８．２ｎｍｏｌ／分／ｍｇであった。

【0025】

【図12】図１２は、１２週齢の野生型マウス（＋／＋）およびｒＡＡＶで処置したＧＳＤ−Ｉａマウスにおける肝臓重量を示すグラフである。

【0026】

【図13】図１３Ａおよび１３Ｂは、それぞれ１２週齢の野生型マウス（白丸）およびｒＡＡＶ８−ＧＰＥ−ｃｏ−Ｇ６Ｐａｓｅで処置したＧＳＤ−Ｉａマウス（黒丸）における耐糖能空腹時血中グルコースプロファイルを示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0027】

配列表
添付の配列表に列挙されている核酸配列およびアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２において定義されている通り、ヌクレオチド塩基については標準の文字略語、およびアミノ酸については３文字コードを使用して示されている。各核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、示されている鎖へのいずれの言及にも相補鎖が含まれると理解されたい。配列表は、２０１４年１１月１２日に作成された、３９．６ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出され、これは、参照により本明細書に組み入れられる。添付の配列表では：

【0028】

配列番号１は、以下の特徴部を含むＵＦ１１−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣプラスミドのヌクレオチド配列である：
ＩＴＲ−ヌクレオチド１７〜１６３
Ｇ６ＰＣプロモーター／エンハンサー−ヌクレオチド１８２〜３０４５
スタッファー−ヌクレオチド３０５１〜３１８４
イントロン−ヌクレオチド３１８５〜３３２１
スタッファー−ヌクレオチド３３２２〜３３６７
Ｇ６ＰＣコード配列−ヌクレオチド３３６８〜４４４１
ＩＴＲ−ヌクレオチド４６７４〜４８１９

【0029】

配列番号２は、以下の特徴部を含むＵＦ１１−Ｋ２９−Ｇ６ＰＣプラスミドのヌクレオチド配列である：
ＩＴＲ−ヌクレオチド１７〜１６３
Ｇ６ＰＣプロモーター／エンハンサー−ヌクレオチド１８２〜３０４５
イントロン−ヌクレオチド３０５２〜３１８８
Ｇ６ＰＣコード配列−ヌクレオチド３２０２〜４２７５
ＩＴＲ−ヌクレオチド４５０８〜４６５３

【0030】

配列番号３は、以下の特徴部を含むＵＦ１１−ＧＰＥ−ｃｏ−Ｇ６ＰＣプラスミドのヌクレオチド配列である：
ＩＴＲ−ヌクレオチド１７〜１６３
Ｇ６ＰＣプロモーター／エンハンサー−ヌクレオチド１８２〜３０４５
スタッファー−ヌクレオチド３０５１〜３１８４
イントロン−ヌクレオチド３１８５〜３３２１
スタッファー−ヌクレオチド３３２２〜３３６７
Ｇ６ＰＣコード配列−ヌクレオチド３３６８〜４４４１
ＩＴＲ−ヌクレオチド４６７４〜４８１９

【0031】

配列番号４は、ヒトＧ６ＰＣタンパク質のアミノ酸配列である。

【0032】

配列番号５〜８は、プライマー配列である。

【0033】

配列番号９は、イヌＧ６ＰＣのヌクレオチド配列である。

【0034】

配列番号１０は、イヌＧ６ＰＣのアミノ酸配列である。

【0035】

詳細な説明
Ｉ．略語
ＡＡＶ アデノ随伴ウイルス
ＢＭＩ 肥満度指数
ＣＢＡ ニワトリβ−アクチン
ＣＭＶ サイトメガロウイルス
ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着検定法
Ｇ６Ｐ グルコース−６−リン酸
Ｇ６ＰＣ グルコース−６−ホスファターゼ、触媒サブユニット
Ｇ６ＰＴ グルコース−６−リン酸トランスポーター
ＧＰＥ Ｇ６ＰＣプロモーター／エンハンサー
ＧＳＤ 糖原病
Ｈ＆Ｅ ヘマトキシリン＆エオシン
ＨＣＡ 肝細胞腺腫
ＨＣＣ 肝細胞癌
ＩＴＲ 末端逆位配列
ＯＲＦ オープンリーディングフレーム
ｒＡＡＶ 組換えＡＡＶ
ｖｇ ウイルスゲノム
ｖｐ ウイルス粒子

【0036】

ＩＩ．用語および方法
特に断りのない限り、技術用語は、従来の使用に従って使用されている。分子生物学において一般的な用語の定義は、Benjamin Lewin、Genes V、Oxford University Press刊、１９９４年（ＩＳＢＮ ０−１９−８５４２８７−９）；Kendrewら（編）、The Encyclopedia of Molecular Biology、published by Blackwell Science Ltd.、１９９４年（ＩＳＢＮ ０−６３２−０２１８２−９）；およびRobert A. Meyers（編）、Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference、VCH Publishers, Inc.刊、１９９５年（ＩＳＢＮ １−５６０８１−５６９−８）に見出すことができる。

【0037】

本開示の種々の実施形態の検討を容易にするために、以下の特定の用語の説明を提示する：

【0038】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）：ヒトおよびいくつかの他の霊長類種に感染する、小さな、複製欠損性の、エンベロープを有さないウイルスである。ＡＡＶは、疾患を引き起こすことは知られておらず、また、非常に軽度の免疫応答を誘発する。ＡＡＶを利用した遺伝子療法ベクターは、分裂細胞と静止細胞の両方に感染させることができ、宿主細胞のゲノムに組み込まずに、染色体外の状態で持続させることができる。これらの特徴により、ＡＡＶは遺伝子療法のための魅力的なウイルスベクターになっている。現在、１１種類のＡＡＶの血清型（ＡＡＶ１〜１１）が認識されている。

【0039】

投与／投与する：対象に治療剤（例えば、組換えＡＡＶ）などの薬剤を任意の有効な経路によって提供するまたは与えること。例示的な投与経路としては、これだけに限定されないが、注射経路（皮下注射、筋肉内注射、皮内注射、腹腔内注射、および静脈内注射など）、経口経路、管内経路、舌下経路、直腸経路、経皮経路、鼻腔内経路、膣経路および吸入経路が挙げられる。

【0040】

コドン最適化された：「コドン最適化された」核酸とは、コドンが特定の系（特定の種または種の群など）における発現に最適なものになるように変更された核酸配列を指す。例えば、核酸配列を、哺乳動物細胞における発現または特定の哺乳動物種（ヒト細胞など）における発現のために最適化することができる。コドン最適化により、コードされるタンパク質のアミノ酸配列は変更されない。

【0041】

エンハンサー：プロモーターの活性を増大させることによって転写の速度を増大させる核酸配列。

【0042】

Ｇ６ＰＣ：ヒト染色体１７ｑ２１に位置する、グルコース−６−ホスファターゼ−α（Ｇ６Ｐａｓｅ−α）をコードする遺伝子である。Ｇ６Ｐａｓｅ−αは、３５７アミノ酸の疎水性タンパク質であり、それを小胞体内に固定する９つのへリックスを有する（Chouら、Nat Rev Endocrinol ６巻：６７６〜６８８頁、２０１０年）。Ｇ６Ｐａｓｅ−αタンパク質は、糖新生およびグリコーゲン分解の最終ステップにおけるグルコース６−リン酸からグルコースおよびリン酸への加水分解を触媒し、また、グルコース恒常性において重要な酵素である。Ｇ６ＰＣ遺伝子の突然変異により、肝臓および腎臓におけるグリコーゲンおよび脂肪の蓄積に伴う重度の空腹時低血糖を特徴とする代謝障害である糖原病Ｉａ型（ＧＳＤ−Ｉａ）が引き起こされる。

【0043】

糖原病（ＧＳＤ）：筋肉、肝臓および他の組織内でのグリコーゲンの合成または分解のプロセシングの欠損に起因する疾患の群である。ＧＳＤは、遺伝的なものか、または後天性のもののいずれかであり得る。遺伝的ＧＳＤは、これらのプロセスに関与する代謝の任意の先天的なエラーによって引き起こされる。現在１１種の糖原病（ＧＳＤ Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型、ＶＩＩ型、ＩＸ型、ＸＩ型、ＸＩＩ型およびＸＩＩＩ型）が認識されている。ＧＳＤ−Ｉは、２つの常染色体劣性障害、ＧＳＤ−ＩａおよびＧＳＤ−Ｉｂからなる（Chouら、Nat Rev Endocrinol ６巻：６７６〜６８８頁、２０１０年）。ＧＳＤ−Ｉａは、グルコース−６−ホスファターゼ−αの欠損によって生じる。グルコース−６−リン酸トランスポーター（Ｇ６ＰＴ）の欠損はＧＳＤ−Ｉｂの原因となる。

【0044】

糖原病Ｉａ型（ＧＳＤ−Ｉａ）：フォン・ギールケ病としても知られているＧＳＤ−Ｉａは、最も一般的な糖原病であり、発生率は出生数１００，０００人に約１人である。ＧＳＤ−Ｉａは、酵素であるグルコース−６−ホスファターゼ−α（Ｇ６Ｐａｓｅ−α）の欠損によって生じる遺伝子疾患である。Ｇ６Ｐａｓｅ−αの欠損により、グリコーゲンから、および糖新生から遊離のグルコースを産生する肝臓の能力が損なわれる。ＧＳＤ−Ｉａに罹患している患者は、グルコース恒常性を維持することができず、空腹時低血糖、成長遅延、肝腫大、腎肥大症、高脂血症、高尿酸血症、および乳酸血症を示す（Chouら、Nat Rev Endocrinol ６巻：６７６〜６８８頁、２０１０年）。現在、ＧＳＤ−Ｉａは治癒できない。

【0045】

イントロン：タンパク質のコード情報を含有しない遺伝子内のひと続きのＤＮＡである。イントロンは、メッセンジャーＲＮＡの翻訳前に除去される。

【0046】

末端逆位配列（ＩＴＲ）：効率的な複製のために必要な、アデノ随伴ウイルスのゲノム内の対称的な核酸配列である。ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ ＤＮＡゲノムの各末端に位置する。ＩＴＲは、ウイルスＤＮＡの合成のための複製起点としての機能を果たし、また、ＡＡＶ組み込みベクターを生成するために必須のシス成分である。

【0047】

単離された：「単離された」生物学的成分（核酸分子、タンパク質、ウイルスまたは細胞など）は、生物の細胞もしくは組織内の他の生物学的成分、または、他の染色体および染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質ならびに細胞などの成分が天然に存在する生物自体から実質的に分離または精製されている。「単離された」核酸分子およびタンパク質とは、標準の精製方法によって精製されたものを含む。この用語は、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸分子およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸分子およびタンパク質も包含する。

【0048】

作動可能に連結した：第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的な関係に置かれている場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列と作動可能に連結している。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列と作動可能に連結している。一般に、作動可能に連結したＤＮＡ配列は連続しており、必要であれば、同じ読み枠内の２つのタンパク質コード領域をつないでいる。

【0049】

薬学的に許容される担体：本開示において有用な薬学的に許容される担体（ビヒクル）は従来のものである。Remington's Pharmaceutical Sciences、E. W. Martin著、Mack Publishing Co.、Easton、PA、第１５版（１９７５年）には、１種または複数の治療用化合物、分子または薬剤の薬学的送達に適した組成物および製剤が記載されている。

【0050】

一般に、担体の性質は、使用される特定の投与形式に依存する。例えば、非経口用製剤は、通常、例えば、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの薬学的かつ生理的に許容される流体をビヒクルとして含む注射可能な流体を含む。固体組成物（例えば、粉末、ピル、錠剤、またはカプセルの形態）に関しては、従来の非毒性固体担体は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含み得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートなどの非毒性の補助物質を微量に含有してよい。

【0051】

疾患を予防すること、処置することまたは好転させること：疾患（ＧＳＤ−Ｉａなど）を「予防すること」とは、疾患の完全な発生を阻害することを指す。「処置すること」とは、疾患または病的状態の徴候または症状を、それが発生し始めた後に好転させる治療介入を指す。「好転させる」とは、疾患の徴候または症状の数または重症度を低減することを指す。

【0052】

プロモーター：核酸（例えば、遺伝子）の転写を指向／開始するＤＮＡの領域である。プロモーターは、転写の開始部位の近くの必要な核酸配列を含む。一般には、プロモーターは、転写させる遺伝子の近くに位置する。プロモーターは、必要に応じて、転写の開始部位から数千塩基対ほどに位置し得る遠位のエンハンサーまたはリプレッサーエレメントも含む。

【0053】

精製された：「精製された」という用語は、絶対的な純度を求めるものではなく、相対的な用語として意図されている。したがって、例えば、精製されたペプチド、タンパク質、ウイルス、または他の活性化合物とは、天然に付随するタンパク質および他の混入物から全体的にまたは部分的に単離されたものである。ある特定の実施形態では、「実質的に精製された」という用語は、細胞、細胞培養培地、または他の粗調製物から単離し、分画に供して最初の調製物の種々の成分、例えば、タンパク質、細胞破片（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｂｒｉｓ）、および他の成分などを除去したペプチド、タンパク質、ウイルスまたは他の活性化合物を指す。

【0054】

組換え：組換え核酸分子は、天然に存在しない配列を有するもの、または、そうでなければ分離している２つの配列のセグメントの人工的な組合せによってできた配列を有するものである。この人工的な組合せは、化学合成によって、または単離された核酸分子のセグメントを人工的に操作することによって、例えば、遺伝子工学の技法などによって成し遂げることができる。

【0055】

同様に、組換えウイルスは、天然に存在しないまたは起源が異なる少なくとも２つの配列の人工的な組合せによってできた配列（ゲノム配列など）を含むウイルスである。「組換え」という用語は、単に天然の核酸分子、タンパク質またはウイルスの一部の付加、置換、または欠失によって変更された核酸、タンパク質およびウイルスも含む。本明細書で使用される場合、「組換えＡＡＶ」とは、組換え核酸分子（Ｇ６Ｐａｓｅ−αをコードする組換え核酸分子など）がパッケージングされたＡＡＶ粒子を指す。

【0056】

配列同一性：２つもしくはそれ超の核酸配列、または２つもしくはそれ超のアミノ酸配列の間の同一性または類似性は、配列間の同一性または類似性に関して表現される。配列同一性は、同一性の百分率の単位で測定することができ、百分率が高いほど、配列の同一性が大きい。配列類似性は、類似性の百分率の単位で（保存的アミノ酸置換を考慮に入れる）測定することができ、百分率が高いほど、配列の類似性が大きい。核酸またはアミノ酸配列のホモログまたはオルソログは、標準の方法を使用してアラインした場合に、比較的高い程度の配列同一性／類似性を有する。この相同性は、オルソロガスなタンパク質またはｃＤＮＡが、より密接に関連する種に由来する場合（ヒト配列とマウス配列など）、関連性がより遠い種（ヒト配列とＣ．ｅｌｅｇａｎｓ配列など）と比較してより有意である。

【0057】

比較のための配列のアラインメントの方法は当技術分野で周知である。種々のプログラムおよびアラインメントアルゴリズムは、SmithおよびWaterman、Adv. Appl. Math.２巻：４８２頁、１９８１年；NeedlemanおよびWunsch、J. Mol. Biol. ４８巻：４４３頁、１９７０年；PearsonおよびLipman、Proc. Natl. Acad. Sci. USA８５巻：２４４４頁、１９８８年；HigginsおよびSharp、Gene、７３巻：２３７〜４４頁、１９８８年；HigginsおよびSharp、CABIOS ５巻：１５１〜３頁、１９８９年；Corpetら、Nuc. Acids Res.１６巻：１０８８１〜９０頁、１９８８年；Huangら、Computer Appls. in the Biosciences ８巻、１５５〜６５頁、１９９２年；ならびにPearsonら、Meth. Mol. Bio.２４巻：３０７〜３１頁、１９９４年に記載されている。Altschulら、J. Mol. Biol.２１５巻：４０３〜１０頁、１９９０年には、配列アラインメント方法および相同性の算出に関する詳細な考察が示されている。

【0058】

ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Altschulら、J. Mol. Biol.２１５巻：４０３〜１０頁、１９９０年）は、配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘと関連して使用するために、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）を含めたいくつかの供給源から、インターネット上で入手可能である。追加的な情報は、ＮＣＢＩウェブサイトにおいて見出すことができる。

【0059】

血清型：特徴的な抗原のセットによって区別される、密接に関連する微生物の群（ウイルスなど）である。

【0060】

スタッファー配列：一般には、２つの核酸特徴部の間（プロモーターとコード配列の間など）に所望の間隔を作るため、または核酸分子を所望の長さになるように伸長させるために使用される、より大きな核酸分子（ベクターなど）内に含有されるヌクレオチドの配列を指す。スタッファー配列は、タンパク質コード情報を含有せず、起源不明／合成起源であってよく、かつ／または、より大きな核酸分子内の他の核酸配列と無関係なものであってよい。

【0061】

対象：ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含むカテゴリーである、生きている多細胞脊椎動物である。

【0062】

合成：実験室において人工的な手段によって作製されたものであり、例えば、合成核酸は、実験室において化学的に合成することができる。

【0063】

治療有効量：指定の医薬品または治療剤（例えば、組換えＡＡＶ）の、その剤を用いて処置する対象、または細胞において所望の効果を実現するために十分な数量である。剤の有効量は、これだけに限定されないが、処置される対象または細胞、および治療用組成物の投与様式を含めたいくつかの因子に左右される。

【0064】

ベクター：ベクターは、ベクターが複製し、かつ／または宿主細胞に組み込む能力を乱すことなく外来核酸の挿入を可能にする核酸分子である。ベクターは、複製起点などの、宿主細胞におけるベクターの複製を可能にする核酸配列を含み得る。ベクターは、１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子および他の遺伝エレメントも含み得る。発現ベクターは、挿入される遺伝子（複数可）の転写および翻訳を可能にするために必要な調節配列を含有するベクターである。本明細書の一部の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶベクターである。

【0065】

特に説明がなければ、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。単数の用語「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」、および「ｔｈｅ（その）」は、文脈によりそうでないことが明らかでない限り、複数の言及を含む。「ＡまたはＢを含む」とは、Ａを含む、またはＢを含む、あるいはＡおよびＢを含むことを意味する。さらに、核酸またはポリペプチドに関して示されている全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子質量の値はおよそのものであり、説明のために提示されている。本明細書に記載のものと同様または同等である方法および材料を本開示の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料が以下に記載されている。本明細書において言及されている全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。矛盾する場合は、本明細書が用語の説明を含め、支配する。さらに、材料、方法および実施例は単に例示的なものであり、それに限定されるものではない。

【0066】

ＩＩＩ．いくつかの実施形態の概要
本明細書では、糖原病、特にＧＳＤ−Ｉａを処置するための遺伝子療法の適用において使用することができる組換え核酸分子、ＡＡＶベクターおよび組換えＡＡＶが提供される。

【0067】

組換え核酸分子は、Ｇ６ＰＣプロモーター／エンハンサー（ＧＰＥ）、合成イントロン、およびＧ６ＰＣコード領域を含む。Ｇ６ＰＣコード領域は、必要に応じて、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化される。組換え核酸分子は、Ｇ６ＰＣプロモーター／エンハンサーとイントロンの間ならびにイントロンとＧ６ＰＣコード配列の間に置かれたスタッファー核酸配列をさらに含む。組換え核酸分子は、ＡＡＶベクター内に含める場合には、５’および３’末端逆位配列（ＩＴＲ）配列をさらに含んでよい。

【0068】

Ｇ６ＰＣプロモーター／エンハンサー（ＡＡＶ−ＧＰＥ）を伴う、Ｇ６Ｐａｓｅ−αを発現する組換えＡＡＶは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける肝臓導入遺伝子の発現の指向に関して、代替プロモーター／エンハンサー（すなわち、ニワトリβ−アクチンプロモーター／ＣＭＶエンハンサー）を有する別のＧ６Ｐａｓｅ−αを発現する組換えＡＡＶよりも著しく効率的であることが本明細書に開示されている。２４週間の試験期間にわたって、ＡＡＶ−ＧＰＥを用いて処置したＧ６ＰＣ欠損マウス（ＧＳＤ−Ｉａに関するモデル）では、血中グルコース、血中代謝産物、肝臓グリコーゲンおよび肝臓脂肪のレベルが正常であることによって証明されるように、肝臓Ｇ６ＰＣ欠損の完全な正常化が示された（実施例１およびYiuら、Mol Ther １８巻：１０７６〜１０８４頁、２０１０年を参照されたい）。さらに、ＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ^−／−マウスの長期試験により、ＡＡＶ−ＧＰＥによって媒介される遺伝子療法が、３％超の肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−αを発現するマウスにおいて少なくとも７０〜９０週間にわたって効果的であることが実証された。具体的には、ＡＡＶ−ＧＰＥで処置したマウスでは、正常な肝臓脂肪の貯蔵、正常な血中代謝産物および耐糖能プロファイル、空腹時血中インスリンレベルの低下が示され、肝細胞腺腫などの肝臓の異常の証拠はなかった（実施例２およびLeeら、Hepatology ５６巻：１７１９〜１７２９頁、２０１２年を参照されたい）。

【0069】

さらに、Ｇ６ＰＣプロモーターの上流のエンハンサーエレメントが、ＧＳＤ−Ｉａの動物モデルにおける最適なＧ６ＰＣ発現のために極めて重要であるという所見が本明細書に開示されている。詳細には、ヌクレオチド−２６８４〜−１（Ｇ６ＰＣ開始部位に対して）にＧ６ＰＣプロモーター／エンハンサーを含むＡＡＶ−ＧＰＥを用いた処置により、３８３ｂｐの最小Ｇ６ＰＣプロモーター／エンハンサーのみを含有する、Ｇ６Ｐａｓｅ−αを発現する組換えＡＡＶと比較して、ＧＳＤ−Ｉａのマウスモデルにおいて、有意に高いレベルの肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α発現が生じ、肝臓グリコーゲン蓄積のより大きな減少が実現され、また、より良好な絶食耐性（ｔｏｌｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆａｓｔｉｎｇ）につながることが実証される（実施例３およびLeeら、Mol Genet Metab.１１０巻（３号）：２７５〜２８０頁、２０１３年を参照されたい）。

【0070】

本明細書には、Ｇ６ＰＣプロモーター／エンハンサーとイントロンの間ならびにイントロンとＧ６ＰＣコード配列の間に存在するスタッファーヌクレオチド配列が、Ｇ６Ｐａｓｅ−αの肝臓形質導入および発現のために重要であるという所見も開示されている。具体的には、スタッファー配列を欠くプラスミドＵＦ１１−Ｋ２９−Ｇ６ＰＣ（配列番号２）から作製した組換えＡＡＶでは、７．３ｎｍｏｌ／分／ｍｇのＧ６Ｐａｓｅ活性が示された。比較すると、プラスミドＵＦ１１−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣ（配列番号１）から作製した組換えＡＡＶでは、３３．０ｎｍｏｌ／分／ｍｇのＧ６Ｐａｓｅ活性が示された（実施例４を参照されたい）。本開示は、配列番号１および配列番号３として本明細書に記載されている、ＡＡＶベクター内に存在するスタッファー配列についての最初の記載を提供する。

【0071】

さらに、本明細書に開示されているデータは、Ｇ６ＰＣコード配列のコドン最適化により、ＡＡＶ−ｃｏ−ＧＰＥ（コドン最適化されたＧ６ＰＣ核酸配列を含有する）の投与後には、野生型Ｇ６ＰＣをコードするＡＡＶ−ＧＰＥの投与と比較して翻訳の効率がおよそ１．５〜２．５倍上昇し、その結果、肝臓におけるＧ６Ｐａｓｅ−α発現が有意に大きくなることを実証する（実施例５を参照されたい）。

【0072】

総合すると、これらの結果から、ヌクレオチド−２６８４〜−１におけるＧ６ＰＣプロモーター／エンハンサー、合成イントロン、イントロンに隣接するスタッファー配列、およびＧ６ＰＣコード領域（野生型またはコドン最適化された）を含む組換えＡＡＶが、効率的な肝臓導入遺伝子の発現およびｉｎ ｖｉｖｏにおけるＧＳＤ−Ｉａの処置のために極めて重要な特徴部であることが示される。

【0073】

本明細書では、配列番号１のヌクレオチド１８２〜４４４１または配列番号３のヌクレオチド１８２〜４４４１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子が提供される。例えば、核酸分子は、コドン最適化のためなどに、Ｇ６ＰＣコード領域内にヌクレオチド置換を含有してよい。別の例として、Ｇ６ＰＣコード領域は、異なる種に由来するＧ６ＰＣ、例えば、イヌＧ６ＰＣまたはコドン最適化された（ヒトにおける発現のために）バージョンのイヌＧ６ＰＣなどであってよい。いくつかの例では、配列番号１のヌクレオチド１８２〜３０４５または配列番号３のヌクレオチド１８２〜３０４５に示されるＧ６ＰＣコード領域をイヌＧ６ＰＣコード配列（配列番号９）と置き換える。あるいは、配列番号１または配列番号３のヒトＧ６ＰＣコード領域は、イヌＧ６ＰＣタンパク質配列とヒトＧ６ＰＣタンパク質配列の間で異なる残基におけるコーディングの変化をもたらすヌクレオチド置換を含有してよい。例えば、ヒトＧ６ＰＣタンパク質（配列番号４）の残基３、５４、１３９、１９６、１９９、２４２、２４７、２９２、２９８、３０１、３１８、３２４、３３２、３４７、３４９、３５０および／または３５３におけるコーディングの変化がもたらされるようにヌクレオチド置換を導入することができる。図９は、ヒトＧ６Ｐａｓｅ−αタンパク質配列とイヌＧ６Ｐａｓｅ−αタンパク質配列のアラインメントを示し、図１０は、ヒトＧ６Ｐａｓｅ−α、マウスＧ６Ｐａｓｅ−α、ラットＧ６Ｐａｓｅ−αおよびイヌＧ６Ｐａｓｅ−αの間のアミノ酸の差異を示す表を提示する。本開示は、図１０に列挙されている任意の残基におけるアミノ酸配列を変更させるヌクレオチド置換を企図する。

【0074】

他の場合では、ヌクレオチド置換は、スタッファー配列内または合成イントロンの配列内に存在してよい。３’ＩＴＲの下流（すなわち、３’ＩＴＲに対して３’側）のベクター配列、または５’ＩＴＲとＧＰＥの間、またはＧ６ＰＣコード領域と３’ＩＴＲの間などの、ベクター配列内のヌクレオチド置換も許容される可能性がある。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド１８２〜４４４１または配列番号３のヌクレオチド１８２〜４４４１を含む。これらの組換え核酸分子は、ヌクレオチド−２６８４〜−１におけるＧ６ＰＣプロモーター／エンハンサーの配列、合成イントロン、イントロンに隣接するスタッファー配列、およびＧ６ＰＣコード領域を含む。配列番号１は、野生型Ｇ６ＰＣコード配列を含み、配列番号３はコドン最適化されたＧ６ＰＣコード配列を含む。

【0075】

一部の実施形態では、組換え核酸分子は、３’ＩＴＲ配列および５’ＩＴＲ配列をさらに含む。したがって、配列番号１のヌクレオチド１７〜４８１９または配列番号３のヌクレオチド１７〜４８１９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子が提供される。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド１７〜４８１９または配列番号３のヌクレオチド１７〜４８１９を含む。特定の非限定的な例では、組換え核酸分子は、配列番号１（ＡＡＶ−ＧＰＥを生成するために使用するＵＦ１１−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣプラスミド）または配列番号３（コドン最適化されたＡＡＶ−ｃｏ−ＧＰＥを生成するために使用するＵＦ１１−ＧＰＥ−ｃｏ−Ｇ６ＰＣプラスミド）の完全な配列を含む。他の例では、組換え核酸分子は、配列番号１または配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0076】

他の実施形態では、配列番号２のヌクレオチド１８２〜４２７５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子が提供される。いくつかの例では、組換え核酸分子は、配列番号２のヌクレオチド１８２〜４２７５を含む。いくつかの例では、組換え核酸分子は、配列番号２のヌクレオチド１７〜４６５３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの例では、組換え核酸分子は、配列番号２のヌクレオチド１７〜４６５３を含む。特定の非限定的な例では、組換え核酸分子は、配列番号２（スタッファー配列を欠くＵＦ１１−Ｋ２９−Ｇ６ＰＣプラスミド）の完全な配列を含む。他の例では、組換え核酸分子は、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0077】

さらに、本明細書に開示されている組換え核酸分子を含むベクターが提供される。一部の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶベクターである。ＡＡＶ血清型は、導入遺伝子を対象に送達するのに適した任意の血清型であってよい。いくつかの例では、ＡＡＶベクターは、血清型８ＡＡＶ（ＡＡＶ８）である。他の例では、ＡＡＶベクターは、血清型１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１または１２ベクター（すなわち、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１またはＡＡＶ１２）である。さらに他の例では、ＡＡＶベクターは、２つまたはそれ超のＡＡＶ血清型のハイブリッド（これだけに限定されないが、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８またはＡＡＶ２／９など）である。ＡＡＶ血清型の選択は、遺伝子療法の標的とされる細胞型（複数可）に一部依存する。ＧＳＤ−Ｉａの処置に関しては、肝臓および腎臓が関連する標的器官である。

【0078】

本明細書では、本明細書に開示されている組換え核酸分子またはベクターを含む単離された宿主細胞も提供される。例えば、単離された宿主細胞は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を作製するのに適した細胞（または細胞株）であってよい。いくつかの例では、宿主細胞は、ＨＥＫ−２９３細胞、ＢＨＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＲＤ細胞、ＨＴ−１０８０細胞、Ａ５４９細胞、Ｃｏｓ−７細胞、ＡＲＰＥ−１９細胞、またはＭＲＣ−５細胞などの哺乳動物細胞である。

【0079】

さらに、本明細書に開示されている組換え核酸分子を含むｒＡＡＶが提供される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ８および／またはｒＡＡＶ２である。しかし、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１もしくはＡＡＶ１２などの任意の他の適切なＡＡＶ血清型、または２つもしくはそれ超のＡＡＶ血清型のハイブリッド（これだけに限定されないが、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８またはＡＡＶ２／９など）であってよい。本明細書に開示されているｒＡＡＶと薬学的に許容される担体とを含む組成物も本開示により提供される。一部の実施形態では、組成物を静脈内投与または筋肉内投与用に製剤化する。ｒＡＡＶを投与するための適切な医薬製剤は、例えば、米国特許出願公開第２０１２／０２１９５２８号に見出すことができる。

【0080】

さらに、糖原病と診断された対象を処置する方法であって、ＧＳＤ−Ｉａの対象を選択するステップと、対象に、治療有効量の本明細書に開示されているｒＡＡＶ（またはｒＡＡＶを含む組成物）を投与するステップとを含む方法が提供される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶを静脈内に投与する。

【0081】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶを、約１×１０^１１〜約１×１０^１４ウイルス粒子（ｖｐ）／ｋｇの用量で投与する。いくつかの例では、ｒＡＡＶを、約１×１０^１２〜約８×１０^１３ｖｐ／ｋｇの用量で投与する。他の例では、ｒＡＡＶを、約１×１０^１３〜約６×１０^１３ｖｐ／ｋｇの用量で投与する。特定の非限定的な例では、ｒＡＡＶを、少なくとも約１×１０^１１ｖｐ／ｋｇ、少なくとも約５×１０^１１ｖｐ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１２ｖｐ／ｋｇ、少なくとも約５×１０^１２ｖｐ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１３ｖｐ／ｋｇ、少なくとも約５×１０^１３ｖｐ／ｋｇ、または少なくとも約１×１０^１４ｖｐ／ｋｇの用量で投与する。他の非限定的な例では、ｒＡＡＶを、約５×１０^１１ｖｐ／ｋｇ以下、約１×１０^１２ｖｐ／ｋｇ以下、約５×１０^１２ｖｐ／ｋｇ以下、約１×１０^１３ｖｐ／ｋｇ以下、約５×１０^１３ｖｐ／ｋｇ以下、または約１×１０^１４ｖｐ／ｋｇ以下の用量で投与する。１つの非限定的な例では、ｒＡＡＶを、約１×１０^１２ｖｐ／ｋｇの用量で投与する。ｒＡＡＶは、所望の治療結果のために、必要に応じて、単回用量で、または複数回用量（２用量、３用量、４用量、５用量、６用量、７用量、８用量、９用量または１０用量など）で投与することができる。

【0082】

ＩＶ．遺伝子療法の適用のための組換えＡＡＶ
ＡＡＶは、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ属に属する。ＡＡＶは、直鎖状の一本鎖ＤＮＡゲノムをパッケージングする、小さな、エンベロープを有さないウイルスである。ＡＡＶ ＤＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖はどちらも同等の頻度でＡＡＶカプシドにパッケージングされる。

【0083】

ＡＡＶゲノムは、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に隣接する２つの末端逆位配列（ＩＴＲ）を特徴とする。ＡＡＶ２ゲノムでは、例えば、ＩＴＲの最初の１２５ヌクレオチドはパリンドロームであり、それ自体の上に折り重なって塩基対形成を最大にし、Ｔ字形ヘアピン構造を形成する。Ｄ配列と称されるＩＴＲの他の２０塩基は対形成しないままである。ＩＴＲは、ＡＡＶ ＤＮＡ複製に重要なシス作用性配列であり、ＩＴＲは、複製起点であり、ＤＮＡポリメラーゼによる第２の鎖の合成のためのプライマーとしての機能を果たす。複製型単量体と称される、この合成の間に形成される二本鎖ＤＮＡを第２のラウンドの自己プライミング複製に使用し、複製型二量体を形成する。これらの二本鎖中間体は鎖置換機構によってプロセシングされ、その結果、パッケージングのために使用される一本鎖ＤＮＡと転写のために使用される二本鎖ＤＮＡがもたらされる。ＩＴＲ内には、Ｒｅｐ結合性エレメントおよび末端分解部位（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）（ＴＲＳ）が位置する。これらの特徴部は、ウイルス調節タンパク質Ｒｅｐにより、ＡＡＶ複製の間に二本鎖中間体をプロセシングするために使用される。ＡＡＶ複製における役割に加えて、ＩＴＲは、ＡＡＶゲノムのパッケージング、転写、非許容条件下での負の調節、および部位特異的組み込みにも必須である（DayaおよびBerns、Clin Microbiol Rev ２１巻（４号）：５８３〜５９３頁、２００８年）。

【0084】

ＡＡＶの左側のＯＲＦは、４種のタンパク質−Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０をコードするＲｅｐ遺伝子を含有する。右側のＯＲＦは、３種のウイルスカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）を産生させるＣａｐ遺伝子を含有する。ＡＡＶカプシドは、正二十面体対称に配置された６０種のウイルスカプシドタンパク質を含有する。ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、１：１：１０のモル比で存在する（DayaおよびBerns、Clin Microbiol Rev ２１巻（４号）：５８３〜５９３頁、２００８年）。

【0085】

ＡＡＶは、現在、遺伝子療法のために最も頻繁に使用されているウイルスのうちの１つである。ＡＡＶは、ヒトおよびいくつかの他の霊長類種に感染するが、疾患を引き起こすことは知られておらず、また、非常に軽度の免疫応答を誘発する。ＡＡＶを利用した遺伝子療法ベクターは、分裂細胞と静止細胞の両方に感染させることができ、宿主細胞のゲノムに組み込まずに染色体外の状態で持続させることができる。ＡＡＶの有利な特徴に起因して、本開示は、本明細書に開示されている組換え核酸分子および方法のためのＡＡＶの使用を企図する。

【0086】

ＡＡＶは、標的細胞に結合し、侵入する能力、核に侵入する能力、核内で長期間にわたって発現させる能力、および毒性が低いことを含めた、遺伝子療法ベクターに望ましい特徴をいくつか有する。しかし、ＡＡＶゲノムのサイズが小さいことにより、組み入れることができる異種ＤＮＡのサイズが限定される。この問題を最小限にするために、Ｒｅｐおよび組み込み効率エレメント（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＩＥＥ）をコードしないＡＡＶベクターが構築されている。ＩＴＲは、パッケージングのために必要なシスシグナルであるので、保持される（DayaおよびBerns、Clin Microbiol Rev ２１巻（４号）：５８３〜５９３頁、２００８年）。

【0087】

遺伝子療法に適したｒＡＡＶを作製するための方法は当技術分野で周知であり（例えば、米国特許出願第２０１２／０１００６０６号；同第２０１２／０１３５５１５号；同第２０１１／０２２９９７１号；および同第２０１３／００７２５４８号；およびGhoshら、Gene Ther１３巻（４号）：３２１〜３２９頁、２００６年を参照されたい）、本明細書に開示されている組換え核酸分子および方法と共に利用することができる。

【0088】

以下の実施例は、ある特定の特徴および／または実施形態を例示するために提供される。これらの実施例は、本開示を、記載されている特定の特徴または実施形態に限定するものと解釈されるべきではない。

【実施例】

【0089】

（実施例１）
遺伝子療法を使用した、糖原病Ｉａ型の肝臓Ｇ６ＰＣ欠損の完全な正常化
この実施例では、Ｇ６ＰＣ欠損マウスにおける、Ｇ６Ｐａｓｅ−αの肝臓遺伝子送達および発現の効率に関する、２つの異なるプロモーターによって駆動される、Ｇ６Ｐａｓｅ−αを発現するＡＡＶベクター２種の比較を記載する。その結果から、持続的なｉｎ ｖｉｖｏにおける肝臓導入遺伝子の発現を指向することに関して、Ｇ６ＰＣプロモーター／エンハンサー（ＡＡＶ−ＧＰＥ）を有するＡＡＶベクターの方が、ニワトリβ−アクチンプロモーター／ＣＭＶエンハンサー（ＡＡＶ−ＣＢＡ）を有するＡＡＶベクターよりも効率的であったことが実証される。さらに、ＡＡＶ−ＧＰＥを用いて処置したＧ６ＰＣ欠損マウスでは、正常なレベルの血中グルコース、血中代謝産物、肝臓グリコーゲンおよび肝臓脂肪が示された。

【0090】

材料および方法
ｐＵＦ１１−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣの構築およびＡＡＶベクターの調製
ヒトＧ６ＰＣプロモーター／エンハンサーの制御下にある、ヒトＧ６Ｐａｓｅ−αを含有するＵＦ１１−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣプラスミドを、マウスＧ６Ｐａｓｅ−αがＣＢＡプロモーター／ＣＭＶエンハンサーによって駆動される（Xuら、Hum Gene Ther １２巻：５６３〜５７３頁、２００１年）ｐＵＦ１１−ｍＧ６Ｐａｓｅ−α−ＣＢＡ（Ghoshら、Gene Ther １３巻：３２１〜３２９頁、２００６年）を以下の通り改変することによって構築した：ｐＵＦ１１−ｍＧ６Ｐａｓｅ−α−ＣＢＡからのＴｋｐ−ｎｅｏ断片をＸｈｏＩ／ＳｐｈＩ消化によって切り出し、残りのベクターをゲル精製し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いてポリッシュ（ｐｏｌｉｓｈ）し、次いで、自己ライゲーションしてｐＵＦ１１−ｍＧ６Ｐａｓｅ−α−ＣＢＡ−［Ｔｋｐ−ｎｅｏ］^−／−を得た。次いで、ｐＵＦ１１−ｍＧ６Ｐａｓｅ−α−ＣＢＡ−［Ｔｋｐ−ｎｅｏ］^−／−内のｍＧ６Ｐａｓｅ−αを、ＣＢＡプロモーター／ＣＭＶエンハンサーと一緒に、５’−ＳｂｆＩ部位および３’−ＮｏｔＩ部位においてヒトＧ６Ｐａｓｅ−α ｃＤＮＡで置換し、ｐＵＦ１１−Ｇ６ＰＣを得た。次いで、ＰＣＲを使用して、ヒトＧ６ＰＣプロモーター／エンハンサーを含有するＧ６ＰＣ ５’−フランキング領域のヌクレオチド−２８６４〜−１をクローニングした。ＰＣＲ鋳型は、ヒトＧ６ＰＣ遺伝子を含有する細菌人工染色体であり（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、プライマー対は、５’末端および３’末端にそれぞれ追加的なＫｐｎＩ部位およびＸｂａＩ部位を含有する、１Ｓ（５’−ＣＣＴＴＴＧＡＧＡＡＴＣＣＡＣＧＧＴＧＴ−３’；配列番号５）および２ＡＳ（５’−ＣＣＴＣＡＴＴＴＣＣＴＴＧＧＣＡＣＣＴＣ−３’；配列番号６）であった。次いで、Ｇ６ＰＣプロモーター／エンハンサーを含有するＫｐｎＩ−ＸｂａＩ断片を、ＫｐｎＩ−ＸｂａＩで直鎖化したｐＵＦ１１−Ｇ６ＰＣにライゲーションして、ｐＵＦ１１−Ｇ６ＰＣ−ＧＰＥ−１を得た。次に、５’末端および３’末端にそれぞれ追加的なＳｐｅＩ部位およびＳｂｆＩ部位を含有するプライマー対３Ｓ（５’−ＡＧＧＴＡＡＧＴＡＴＣＡＡＧＧＴＴＡＣＡ−３’；配列番号７）および４ＡＳ（５’−ＡＣＣＴＧＴＧＧＡＧＡＧＡＡＡＧＧＣＡＡ−３’；配列番号８）を使用したＰＣＲを使用して、ｐＣＩベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）由来のキメライントロンをクローニングした。次いで、このキメライントロンをＳｐｅＩ−ＳｂｆＩ断片として、ＳｐｅＩ−ＳｂｆＩで直鎖化したｐＵＦ１１−Ｇ６ＰＣ−ＧＰＥ−Ｉの大きな断片にライゲーションして、ｐＵＦ１１−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣ（配列番号１）を得た。全ての構築物を、ＤＮＡ配列決定によって検証した。

【0091】

ＡＡＶ−ＧＰＥおよびＡＡＶ−ＣＢＡを、それぞれｐＵＦ１１−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣおよびｐＵＦ１１−ｍＧ６Ｐａｓｅ−α−ＣＢＡを使用して作製し、これは、以前に記載されている通り生成、精製、および力価測定を行った（Ghoshら、Gene Ther １３巻：３２１〜３２９頁、２００６年）。ベクターゲノム定量化を、Ｇ６ＰＣまたはＣＢＡプロモーターを対象とするプライマーおよびプローブを用いたリアルタイムＰＣＲを使用して実施した。

【0092】

Ｇ６ｐｃ^−／−マウスへのＡＡＶベクターの注入
以前に記載されている通り、１２時間ごとに１５％グルコース２５〜１００μｌを腹腔内注射することからなるグルコース療法をＧ６ｐｃ^−／−マウスに施行した（Leiら、Nat Genet １３巻：２０３〜２０９頁、１９９６年）。離乳後に残存したマウスにマウス固形飼料を無制限に与えた（Zeigler Bros., Inc.、Gardners、PA）。

【0093】

ＡＡＶベクターを、２日齢のＧ６ｐｃ^−／−マウスには側頭静脈を通じて注入し、２週齢または４週齢のＧ６ｐｃ^−／−マウスには後眼窩洞を通じて注入した。年齢を釣り合わせたＧ６ｐｃ^＋／＋／Ｇ６ｐｃ^＋／−ならびに４週齢〜６週齢のＧ６ｐｃ^−／−マウスを対照として使用した。ウイルスの注入を受けたマウスについては、注入後すぐにグルコース療法を終了した。

【0094】

１２週齢または１４週齢のＡＡＶ−ＧＰＥを注入したＧ６ｐｃ^−／−マウスのグルコース負荷試験は、６時間にわたって絶食させた後に血液試料採取を行い、その後、１０％デキストロース０．２５ｍｌを皮下に注射し、さらに２時間にわたって３０分ごとに尾静脈を通じた血液試料採取を繰り返すことからなった。

【0095】

ホスホヒドロラーゼアッセイ
ミクロソーム単離およびホスホヒドロラーゼアッセイを基本的に以前に記載されている通り決定した（Leiら、Nat Genet １３巻：２０３〜２０９頁、１９９６年）。５０ｍＭのカコジル酸緩衝液、ｐＨ６．５、１０ｍＭのＧ６Ｐおよび適量のミクロソーム調製物を含有する反応混合物（１００μｌ）を３７℃で１０分インキュベートした。インタクトな膜を０．２％デオキシコール酸中、０℃で２０分インキュベートすることによって破壊ミクロソーム膜を調製した。非特異的ホスファターゼ活性を、破壊ミクロソーム調製物をｐＨ５、３７℃で１０分プレインキュベートすることによって推定し、酸に不安定なＧ６Ｐａｓｅ−αを不活化した。

【0096】

１０μｍの厚い肝組織切片を、４０ｍＭのトリスマレイン酸、ｐＨ６．５、１０ｍＭのＧ６Ｐ、３００ｍＭのスクロース、および３．６ｍＭの硝酸鉛を含有する溶液中、室温で１０分インキュベートすることによってＧ６Ｐａｓｅ−αの酵素組織化学的分析を実施した（Teutsch、Prog Histochem Cytochem １４巻：１〜９２頁、１９８１年）。捕捉されたリン酸鉛を、茶色の硫化鉛に変換した後に可視化した（Teutsch、Prog Histochem Cytochem １４巻：１〜９２頁、１９８１年）。

【0097】

表現型分析
血液試料を尾静脈から採取した。血中グルコース、総コレステロール、および尿酸を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、ＣＯ）から得たキットを使用して分析した。トリグリセリドをＳｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）からのキットを用いて測定し、乳酸をＴｒｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）からのキットによって測定した。

【0098】

ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色およびオイルレッドＯ染色のために、肝臓切片を１０％中性緩衝ホルマリン中に保存し、４〜１０ミクロンの厚さの薄片を作製した。染色した切片を、Ａｘｉｏｓｋｏｐ２ ｐｌｕｓ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅおよびＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ ４．５ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）を使用して可視化した。脂質蓄積の定量的組織化学的測定のために、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ３（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用してオイルレッドＯ染色を画素密度単位に変換した。

【0099】

肝臓のグリコーゲン含量を決定するために、ＨＣｌを用いて組織をホモジナイズし、１０分煮沸し、酢酸ナトリウムを用いて中和して最終的なｐＨを４．５にした（Teutsch、Prog Histochem Cytochem１４巻：１〜９２頁、１９８１年）。次いで、加水分解した組織をアミロ−α−１，４−α−１，６−グルコシダーゼで消化し、放出されたグルコースを、Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから得たキットを使用して測定した。グリコーゲン含量は、肝臓タンパク質１ｍｇ当たりのグルコシル単位のｎｍｏｌ数として報告される。

【0100】

抗体アッセイ
ヒトＧ６Ｐａｓｅ−αまたはマウスＧ６Ｐａｓｅ−αに対する抗体をウエスタン−ブロット分析によって検出した。Ａｄ−ヒトＧ６Ｐａｓｅ−αまたはＡｄ−マウスＧ６Ｐａｓｅ−αを感染させたＣＯＳ−１細胞由来のミクロソームタンパク質（Ghoshら、J Biol Chem ２７７巻：３２８３７〜３２８４２頁、２００２年）を１２％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲルによる電気泳動によって分解し、フッ化ポリビニリデン膜にトランスブロットした（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）。膜を、多数のチャネルを含有するＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ Ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に入れた。各チャネルの下の膜細片を、１：３０００に希釈したウサギ抗ヒトＧ６Ｐａｓｅ−α血清（Ghoshら、J Biol Chem ２７７巻：３２８３７〜３２８４２頁、２００２年）、または１：２００希釈した、ＡＡＶ−ＧＰＥを注入した動物またはＡＡＶ−ＣＢＡを注入した動物由来の血清試料と一緒にインキュベートした。１：２００に希釈した、無処置のＧ６ｐｃ^−／−およびＧ６ｐｃ^＋／＋／Ｇ６ｐｃ^＋／−同腹仔由来の血清試料を対照として使用した。一晩インキュベートした後、膜細片を、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしたヤギ抗ウサギＩｇＧまたはヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｋｉｒｋｅｇａｒｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）と一緒にインキュベートした。免疫複合体を、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）からのＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅを使用した化学発光系によって可視化した。

【0101】

ＣＤ８＋リンパ球免疫検出
マウス肝臓を急速凍結させ、Ｏ．Ｃ．Ｔ．（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ、Ｔｅｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）に包埋し、８ミクロンの厚さの薄片を作製した。切片をアセトン中に−２０℃で１０分にわたって固定し、乾燥させ、ＰＢＳで洗浄し、２％のＢＳＡを含有するＰＢＳを用いて３０分にわたってブロッキングし、１％ＢＳＡを補充したＰＢＳ中、ＣＤ８（Ａｂｃａｍ Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）に対するウサギポリクローナル抗体と一緒に４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、切片を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）色素とコンジュゲートしたヤギ抗ラットＩｇＧ抗体と一緒に、２５℃で１時間、暗所でインキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、標識した細胞を、ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を含有する退色防止水性封入剤を用いて封入し、Ａｘｉｏｓｋｏｐ２ ｐｌｕｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）を使用して可視化した。２００倍拡大率で、ランダムに選択した１０視野でＣＤ８＋細胞を計数し、平均（ｍｅａｎ ａｖｅｒａｇｅ）として報告した。

【0102】

統計分析
独立ｔ検定を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）Ｐｒｏｇｒａｍ、ｖｅｒｓｉｏｎ ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して実施した。値は、ｐ＜０．０５であれば統計学的に有意とみなした。

【0103】

結果
ＡＡＶ−ＧＰＥ注入により、長期間の肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α発現が指向される
以前に試験された（Koeberlら、Mol Ther １６巻：６６５〜６７２頁、２００８年）ヒトＧ６ＰＣプロモーターエレメントのヌクレオチド−２９８の上流の配列のｉｎ ｖｉｖｏにおける影響を調査するために、ヒトＧ６ＰＣ ５’−フランキング領域のヌクレオチド−２８６４〜−１の制御下でヒトＧ６Ｐａｓｅ−αを発現するＡＡＶ８ベクターであるＡＡＶ−ＧＰＥを構築した。マウスにおいてＡＡＶ−媒介性遺伝子療法を開始する標準の年齢はなく（Ghoshら、Gene Ther １３巻：３２１〜３２９頁、２００６年；Koeberlら、Gene Ther １３巻：１２８１〜１２８９頁、２００６年；Koeberlら、Mol Ther １６巻：６６５〜６７２頁、２００８年）、また、遺伝子移入の効率および持続の損失は肝臓の成長に伴う肝細胞増殖の速度の増大に影響されるという証拠があるので（Cunninghamら、Mol Ther １６巻：１０８１〜１０８８頁、２００８年）、Ｇ６ｐｃ^−／−マウスに、３つの異なる年齢、２日齢、２週齢、または４週齢の時点で注入し、肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α発現を２４週齢まで調査した。年齢の違いにかかわらず、マウスの各群に同じ用量のＡＡＶ−ＧＰＥ（１．２×１０^１１ウイルスゲノム（ｖｇ）／マウス）を注入した。注入を受けた動物の代謝プロファイルを２４週間の試験の間モニターし、全ての測定値を、それらのＧ６ｐｃ^＋／＋／Ｇ６ｐｃ^＋／−同腹仔および４〜６週齢の無処置のＧ６ｐｃ^−／−マウスの測定値と比較した。ＧＳＤ−Ｉａは、常染色体劣性障害であり、以前の試験では、Ｇ６ｐｃ^＋／＋同腹仔およびＧ６ｐｃ^＋／−同腹仔の表現型は野生型と区別できないことが示されている（Leiら、Nat Genet１３巻：２０３〜２０９頁、１９９６年）。

【0104】

注入を受けたＧ６ｐｃ^−／−動物の中で、注入時の年齢にかかわらず、２４週間の試験の持続時間にわたって、早期死亡は認められなかった。２日齢時にＡＡＶ−ＧＰＥ（１．２×１０^１１ｖｇ／マウス、６×１０^１３ｖｇ／ｋｇと同等である）の注入を受けたＧ６ｐｃ^−／−マウスでは、肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性は２週齢時には対照活性の７７．６％であり、４週齢の時点では、１６．２％まで低下し、６週齢時には対照活性の６．５％であった（表１）。しかし、６週間を超えると、肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性のレベルは２４週間まで安定化した（表１）。したがって、発現は、２４週間の試験全体にわたって１１．９分の１に降下し、この降下の大部分は最初の６週間以内に起こった。

【0105】

対照的に、２週齢時にＡＡＶ−ＧＰＥ（１．２×１０^１１ｖｇ／マウス、１．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇと同等である）の注入を受けたＧ６ｐｃ^−／−マウスでは、注入の２週間後（４週齢時）の肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性は、それらのＧ６ｐｃ^＋／＋／Ｇ６ｐｃ^＋／−同腹仔における活性の２．４倍であり（表１）、４３３．４±１１．１ｎｍｏｌ／ｍｇ／分に達した。肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性はその後、４週齢から６週齢の間に２．６分の１に低下したが、２４週間の試験の持続時間で、６週齢からほぼ正常な肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性（１７４．０±２２．４ｎｍｏｌ／ｍｇ／分）が維持された（表１）。同様に、４週齢時に同じ投与量（１．２×１０^１１ｖｇ／マウス、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇと同等である）のＡＡＶ−ＧＰＥの注入を受けたＧ６ｐｃ^−／−マウスでは、２４週齢時の肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性は３３５．６±４０．２ｎｍｏｌ／分／ｍｇであり、これは対照同腹仔における活性の１．９倍であった（表１）。これらの所見は、遺伝子移入の効率および持続の損失は肝臓の成長に伴う肝細胞増殖の速度の増大に影響されるという以前の提唱と一致した（Cunninghamら、Mol Ther１６巻：１０８１〜１０８８頁、２００８年）。肝臓の成長の速度が低下する発達後期における注射では、遺伝子発現の損失が少ない。

【0106】

肝臓におけるＧ６Ｐａｓｅ−α導入遺伝子の発現の分布を精査した。予測通り、無処置のＧ６ｐｃ^−／−マウスの肝臓切片において染色可能なＧ６Ｐａｓｅ−α活性は認められなかった。Ｇ６ｐｃ^＋／＋／Ｇ６ｐｃ^＋／−マウスでは、酵素組織化学的分析により、Ｇ６Ｐａｓｅ−αが肝臓全体を通して分布するが、血管の近傍におけるレベルが有意に高いことが示された。

【0107】

２日齢時にＡＡＶ−ＧＰＥの注入を受けたＧ６ｐｃ^−／−マウスでは、肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性は、２週齢時に肝臓全体を通して分布した。野生型マウスとは異なり、対照肝臓よりも強力に染色される病巣（ｆｏｃｉ）を伴い、発現は不均等であった。染色されたＧ６Ｐａｓｅ−α活性は２週齢から４週齢までに著しく低下し、これは、ホスホヒドロラーゼ活性が４．８分の１に低下したことと一貫した（表１）。重ねて、染色されたＧ６Ｐａｓｅ活性は減少し、６週齢以降安定化した。

【0108】

２週齢時または４週齢時にＡＡＶ−ＧＰＥの注入を受けたＧ６ｐｃ^−／−マウスでは、酵素組織化学的分析により、Ｇ６Ｐａｓｅ−α導入遺伝子は、酵素活性のレベルが有意に高い病巣を伴って肝臓全体を通して分布していることが再度示された。重ねて、組織化学的分析により推定されるＧ６Ｐａｓｅ−α活性は、定量的ホスホヒドロラーゼアッセイと一致した（表１）。２週齢時にＡＡＶ−ＧＰＥの注入を受けたＧ６ｐｃ^−／−マウスでは、肝臓内に、野生型肝臓内の細胞よりも低い強度で染色される細胞が存在した。したがって、ＡＡＶ−ＧＰＥの注入を受けたマウスでは、野生型Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性が示されるにもかかわらず、肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α発現の正常なパターンは回復しなかった。

【表1】

「材料および方法」の下で記載されている通り、G6pc^-/-(-/-)マウスに、2日齢時、2週齢時、または4週齢時に1.2×10¹¹vg/マウスのAAV-GPEを注入した。年齢を釣り合わせたG6pc^+/+/G6pc^+/-(+/+&+/-)マウスを陽性対照として使用し、4週齢〜6週齢のG6pc^-/-(-/-)マウスを陰性対照として使用した。表中の値は、無処置のG6pc^-/-マウスの肝臓ミクロソームにおけるG6Pase-α活性(1.8±0.2nmol/分/mg)をそれぞれの結果から引くことによってバックグラウンドに対して補正したものである。データは、平均±SEMとして示されている。

【0109】

ＡＡＶ−ＣＢＡ注入により、より低いレベルの肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α発現が導かれる
高レベルの肝臓導入遺伝子の発現を指向するために、ＣＢＡプロモーター／ＣＭＶエンハンサーが広く使用されている（Xuら、Hum Gene Ther １２巻：５６３〜５７３頁、２００１年）。しかし、ＣＭＶエンハンサーは、広範囲にわたるＣｐＧおよび非ＣｐＧメチル化によってサイレンシングされることが知られている（Brooksら、J Gene Med ６巻：３９５〜４０４頁、２００４年；Mehtaら、Gene ４２８巻：２０〜２４頁、２００９年）。ハイブリッドＣＢＡプロモーター／ＣＭＶエンハンサーの制御下でマウスＧ６Ｐａｓｅ−αを発現するＡＡＶ８ベクターであるＡＡＶ−ＣＢＡを使用した以前のｉｎ ｖｉｖｏでの実験では、乏しい発現が示され（Ghoshら、Gene Ther １３巻：３２１〜３２９頁、２００６年）、これは、おそらく、ＣＭＶプロモーターのメチル化に関連する。肝臓の遺伝子移入のｉｎ ｖｉｖｏにおける有効性をＡＡＶ−ＣＢＡとＡＡＶ−ＧＰＥの間で比較するために、Ｇ６ｐｃ^−／−マウスに、ＡＡＶ−ＧＰＥ実験と同様に、ＡＡＶ−ＣＢＡを、用量を増やし、４．８×１０^１１ｖｇ／マウスで２日齢時および２週齢時に注入し、２４週齢まで追跡した。

【0110】

２日齢時に注入を受けたＧ６ｐｃ^−／−マウスについては、２週齢時の肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性は、ＡＡＶ−ＣＢＡの注入を受けたマウスにおいてＡＡＶ−ＧＰＥの注入を受けたマウスと比較して２．８倍であり（表１および２）、これは、注入したＡＡＶ−ＣＢＡの投与量が４倍であることを反映するものである。しかし、新生児期にＡＡＶ−ＣＢＡの注入を受けた動物における肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性は４週齢時に２０．６±１．１ｎｍｏｌ／ｍｇ／分まで急速に低下し（表２）、ＡＡＶ−ＧＰＥの注入を受けた新生児Ｇ６ｐｃ^−／−マウスでは４．８分の１の低下であったのと比較して、２週齢時では１８．６分の１の低下であった（表１）。ＣＢＡとＧＰＥはベクターバックグラウンドが同一であるので、この所見により、持続的なｉｎ ｖｉｖｏにおける肝臓導入遺伝子の発現の指向に関して、ＣＢＡプロモーター／ＣＭＶエンハンサーの方がＧ６ＰＣプロモーター／エンハンサーよりも効率が低いことが示唆される。

【0111】

２週齢時に４．８×１０^１１ｖｇ／マウスのＡＡＶ−ＣＢＡの注入を受けたＧ６ｐｃ^−／−マウスでは、肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性は、４週齢時に２３６．９±６４．７であり（表２）、これは、２週齢時に１．２×１０^１１ｖｇ／マウスのＡＡＶ−ＧＰＥの注入を受けた４週齢のＧ６ｐｃ^−／−マウスの１．８３分の１であった（表１）。さらに、ＣＢＡベクターを用いると、肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性は、６週齢時の５５．７±２．７ｎｍｏｌ／ｍｇ／分から２４週齢時の３８．１±１．７ｎｍｏｌ／ｍｇ／分まで低下し続けた（表２）。これは、この期間にわたってほぼ野生型レベルに安定化していた、ＧＰＥベクターを用いた場合の発現レベルとは対照的であった（表１）。

【0112】

ＡＡＶ−ＣＢＡの注入を受けた動物の酵素組織化学的分析により、活性染色が、ＧＰＥベクターの活性染色と同様であり、対照肝臓におけるものよりも強力に染色された多数の病巣を伴って不均等に分布することが示された。しかし、定量的ホスホヒドロラーゼアッセイと一致して（表２）、全体的な染色強度は注入を受けるマウスの年齢が増すにつれて有意に低くなった。

【表2】

「材料および方法」の下で記載されている通り、G6pc^-/-(-/-)マウスに、2日齢時および2週齢時に4.8×10¹¹vg/マウスのAAV-CBAを注入した。年齢を釣り合わせたG6pc^+/+/G6pc^+/-(+/+&+/-)マウスを陽性対照として使用し、4週齢〜6週齢のG6pc^-/-(-/-)マウスを陰性対照として使用した。表中の値は、無処置のG6pc^-/-マウスの肝臓ミクロソームにおけるG6Pase-α活性(1.8±0.2nmol/分/mg)をそれぞれの結果から引くことによってバックグラウンドに対して補正したものである。データは、平均±SEMとして示されている。

【0113】

ＡＡＶ−ＧＰＥ注入により、ＧＳＤ−Ｉａの病理学的顕在化が修正される
グルコース療法下にあるＧ６ｐｃ^−／−マウスは成長が遅延し、２週齢までそれらの平均体重はそれらのＧ６ｐｃ^＋／＋／Ｇ６ｐｃ^＋／−同腹仔のおよそ６０％であった（Leiら、Nat Genet １３巻：２０３〜２０９頁、１９９６年）。ＡＡＶ−ＧＰＥの注入を受けた新生児Ｇ６ｐｃ^−／−マウスは成長速度が著しく改善され、注入を受けた動物の体重は、対照マウスに匹敵した（図１Ａ）。２週齢時または４週齢時にＡＡＶ−ＧＰＥの注入を受けたＧ６ｐｃ^−／−マウスでは、それらのＧ６ｐｃ^＋／＋／Ｇ６ｐｃ^＋／−同腹仔と平行するが値が低い成長曲線が示され、これは、遺伝子療法を始める前のＧ６ｐｃ^−／−マウスの開始時の体重が低いことと一貫している（図１Ａ）。

【0114】

グルコース療法下で、Ｇ６ｐｃ^−／−マウスでは低血糖症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、高尿酸血症、および乳酸血症が顕在化し続ける（Leiら、Nat Genet１３巻：２０３〜２０９頁、１９９６年；Kimら、J Hepatol ４８巻：４７９〜４８５頁、２００８年）。対照的に、ＡＡＶ−ＧＰＥを注入したＧ６ｐｃ^−／−マウスは正常な血中グルコースプロファイルを有し（図１Ｂ）、注入を受けた動物の中で、無処置のＧ６ｐｃ^−／−マウス（Leiら、Nat Genet １３巻：２０３〜２０９頁、１９９６年）およびヒトＧＳＤ−Ｉａ患者（Chouら、Curr Mol Med ２巻：１２１〜１４３頁、２００２年）に典型的である頻繁な低血糖発作を患う動物は認められなかった。新生児期に注入を受けたＧ６ｐｃ^−／−マウスにおける血中グルコースレベルは、それらの対照同腹仔よりも有意に低く（図１Ｂ）、これにより、正常な血中グルコースプロファイルを維持するためには、肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性が対照レベルの６．５％まで回復することでは不十分であることが示唆される。対照的に、２週齢時または４週齢時にＡＡＶ−ＧＰＥの注入を受けたＧ６ｐｃ^−／−マウスにおける血中グルコースレベルは、それらの対照同腹仔におけるレベルと区別できなかった（図１Ｂ）。ＡＡＶ−ＧＰＥ注入により、血清コレステロール、トリグリセリド、尿酸、および乳酸レベルも正常化したが、新生児期に注入を受けたＧ６ｐｃ^−／−マウスでは血中コレステロールおよび乳酸のレベルがわずかに高かった（図１Ｂ）。

【0115】

肝腫大は、ＧＳＤ−Ｉａの別の臨床症状であり、過剰なグリコーゲンおよび脂質の沈着によって主に引き起こされる（Chouら、Curr Mol Med ２巻：１２１〜１４３頁、２００２年）。影響を受けておらず、ＡＡＶ−ＧＰＥを形質導入したマウスの２４週齢時の肝組織切片では、組織学的異常は観察されなかった。２４週齢のＧ６ｐｃ^＋／＋／Ｇ６ｐｃ^＋／−マウスの肝臓内のグリコーゲン含量は、平均でタンパク質１ｍｇ当たりグルコシル単位１．８９±０．１７ｎｍｏｌであった。新生児期にＡＡＶ−ＧＰＥを注入した動物では、２４週齢時のグリコーゲン含量は有意に高く、タンパク質１ｍｇ当たりグルコシル単位４．６５±０．１９ｎｍｏｌであり、これは、ＧＳＤ−Ｉａマウスにおいて観察されるグリコーゲン貯蔵欠損を示す。対照的に、２週齢時または４週齢時に注入を受けたマウスでは、２４週齢時に野生型レベルのグリコーゲン、すなわち、それぞれタンパク質１ｍｇ当たりグルコシル単位１．６１±０．３９ｎｍｏｌ、および１．６５±０．１９ｎｍｏｌであり、これは、発達のこの段階ではＧＳＤ−Ｉａ疾患の特徴的な組織像が存在しないことを示す。

【0116】

オイルレッドＯ染色により、２４週齢時に、ＡＡＶ−ＧＰＥを注入した動物における脂質含量がＧ６ｐｃ^＋／＋／Ｇ６ｐｃ^＋／−同腹仔における脂質含量と同様であることが示された。定量的組織化学的測定のために、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用して、オイルレッドＯ染色を用いて画像処理した脂質を画素密度単位に変換した。ＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ^−／−マウスの肝臓における密度単位は、対照マウスにおける密度単位よりも低かったが（およそ１５０画素密度単位／μｍ^２、およそ３００画素密度単位／μｍ^２と比較して）、差異は統計学的に有意ではなかった。総合すると、これらの結果から、ＡＡＶ−ＧＰＥを注入したＧ６ｐｃ^−／−マウスが組織学的異常を示さず、肝臓内のグリコーゲンおよび脂肪含量が正常であることが示される。

【0117】

ＡＡＶ−ＧＰＥを注入したＧ６ｐｃ^−／−マウスは、正常な空腹時血糖および耐糖能プロファイルを示す
それぞれ２週齢時および４週齢時にＡＡＶ−ＧＰＥの注入を受けた、１２週齢および１４週齢のＧ６ｐｃ^−／−マウスにおける空腹時血中グルコースレベルを調査した。Ｇ６ｐｃ^＋／＋／Ｇ６ｐｃ^＋／−マウスにおける血中グルコースレベルは６時間の絶食後に変化しなかった。重要なことに、２週齢時または４週齢時のいずれかにＡＡＶ−ＧＰＥの注入を受けたＧ６ｐｃ^−／−マウスにおける血中グルコースレベルも６時間の絶食後に変化せず、これにより、注入を受けたＧ６ｐｃ^−／−マウスがもはやＧＳＤ−Ｉａの特徴である空腹時低血糖を患っていないことが実証される（Chouら、Curr Mol Med ２巻：１２１〜１４３頁、２００２年）。無処置のＧ６ｐｃ^−／−マウスを用いた同様の絶食実験により、急速な低血糖症が生じ、その後、ほんの短時間の絶食後に低血糖発作が生じた。

【0118】

肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−αの過剰発現によって糖尿病が誘導され得ることが複数の試験によって示されている（Liuら、Biochem Biophys Res Commun ２０５巻：６８０〜６８６頁、１９９４年；Antinozziら、Annu Rev Nutr １９巻：５１１〜５４４頁、１９９９年；Cloreら、Diabetes ４９巻：９６９〜９７４頁、２０００年）。４週齢時にＡＡＶ−ＧＰＥの注入を受けた２４週齢のＧ６ｐｃ^−／−マウスにおける肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性は、それらのＧ６ｐｃ^＋／＋／Ｇ６ｐｃ^＋／−同腹仔における活性のほぼ２倍であったので、本発明者らは、４週齢時にＡＡＶ−ＧＰＥの注入を受けた１４週齢のＧ６ｐｃ^−／−マウスにおいてグルコース負荷試験を行った。対照として、２週齢時にＡＡＶ−ＧＰＥの注入を受けた１２週齢のＧ６ｐｃ^−／−マウスにおいてもグルコース負荷試験を実施した。これらの動物では野生型の肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性のレベルが示された。注入を受けたＧ６ｐｃ^−／−マウスにおける耐糖能プロファイルは、対照同腹仔の耐糖能プロファイルと区別できなかった。

【0119】

ヒトＧ６Ｐａｓｅ−αに対する免疫応答の非存在
注入を受けたＧ６ｐｃ^−／−マウスにおいて、ヒトＧ６Ｐａｓｅ−αに対する液性応答が生じるかどうかを決定するために、ＡＡＶ−ＧＰＥまたはＡＡＶ−ＣＢＡの注入を受けたマウス由来の血清を使用してウエスタンブロット分析を実施した。陽性対照として、同じくマウスＧ６Ｐａｓｅ−αを認識するウサギ抗ヒトＧ６Ｐａｓｅ−α抗血清を使用した（Ghoshら、J Biol Chem ２７７巻：３２８３７〜３２８４２頁、２００２年）。２４週齢まで生存した、ＡＡＶ−ＧＰＥを注入したＧ６ｐｃ^−／−マウスまたはＡＡＶ−ＣＢＡを注入したＧ６ｐｃ^−／−マウスのいずれにおいてもＧ６Ｐａｓｅ−αに対する抗体は検出されなかった。さらに、Ｇ６ｐｃ^＋／＋／Ｇ６ｐｃ^＋／−同腹仔または無処置のＧ６ｐｃ^−／−マウスの血清においてＧ６Ｐａｓｅ−αに対する内在性抗体は存在しなかった。

【0120】

ＡＡＶ−ＣＢＡ注入により、肝臓ＣＤ８＋リンパ球浸潤の増加が誘発される
ＡＡＶ−ＣＢＡを注入したＧ６ｐｃ^−／−マウスの肝臓内にＧ６Ｐａｓｅ−αに対する検出可能な抗体が存在しないことにより、Ｇ６Ｐａｓｅ−α導入遺伝子に対する細胞性免疫応答はこのベクターによって指向される導入遺伝子の発現の急速な低下の原因ではないことが示唆される。別の可能性は、ＡＡＶ−ＣＢＡベクターによって誘発される炎症性免疫応答である。したがって、Ｇ６ｐｃ^−／−マウスにＡＡＶ−ＣＢＡまたはＡＡＶ−ＧＰＥを注入後２週間の肝臓ＣＤ８＋リンパ球浸潤を調査した。２週齢および４週齢の野生型またはＧ６ｐｃ^−／−マウスでは、肝臓ＣＤ８＋リンパ球数は少なかった。２日齢時にＡＡＶ−ＣＢＡまたはＡＡＶ−ＧＰＥの注入を受けたＧ６ｐｃ^−／−マウスでは、２週齢時の肝臓ＣＤ８＋リンパ球数は、ベクターの種類のそれぞれについて同様であり、無処置の２週齢の野生型またはＧ６ｐｃ^−／−動物における数に匹敵した。２週齢時にＡＡＶ−ＧＰＥの注入を受けたＧ６ｐｃ^−／−マウスでは、肝臓ＣＤ８＋リンパ球数は４週齢時に少ないままであった。対照的に、２週齢時にＡＡＶ−ＣＢＡの注入を受けたＧ６ｐｃ^−／−マウスでは、肝臓ＣＤ８＋リンパ球数は４週齢時に著しく増加した。その結果から、ＡＡＶ−ＣＢＡによって誘発される炎症応答により、少なくとも一部において、ＣＢＡプロモーター／ＣＭＶエンハンサーによって指向される肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α発現の急速な低下および有効性の低さを説明することができることが示唆される。

【0121】

（実施例２）
遺伝子療法を使用した糖原病Ｉａ型における肝細胞腺腫の予防および代謝異常の修正
この実施例では、長期試験においてＡＡＶ−ＧＰＥベクターの有効性を評価するための試験を記載している。Ｇ６ｐｃ^−／−マウスにおけるＡＡＶ−ＧＰＥベクターによって媒介される遺伝子療法は、野生型肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−αの３％超を発現するマウスにおいて少なくとも７０〜９０週間にわたって効果的であった。その結果から、ＡＡＶ−ＧＰＥで処置したマウスでは、正常な肝臓脂肪の貯蔵、正常な血中代謝産物および耐糖能プロファイル、空腹時血中インスリンレベルの低下が示され、肝臓の異常の証拠は示されないことが実証された。

【0122】

材料および方法
Ｇ６ｐｃ^−／−マウスへのＡＡＶ−ＧＰＥの注入
ＡＡＶ−ＧＰＥベクター（実施例１およびYiuら、Mol Ther １８巻：１０７６〜１０８４頁、２０１０年に記載されている）を、Ｇ６ｐｃ^−／−マウス（Leiら、Nat Genet １３巻：２０３〜２０９頁、１９９６年）に後眼窩洞を通じて注入した。年齢を釣り合わせたＧ６ｐｃ^＋／＋／Ｇ６ｐｃ^＋／−ならびに６〜１０週齢のＧ６ｐｃ^−／−マウスを対照として使用した。ウイルスの注入を受けたマウスについては、注入後すぐにグルコース療法（Leiら、Nat Genet １３巻：２０３〜２０９頁、１９９６年）を終了した。

【0123】

マウスのグルコース負荷試験は、６時間にわたる絶食後に血液試料採取し、その後、グルコース溶液を体重１ｇ当たり２ｍｇで腹腔内注射し、尾静脈を通じた血液試料採取を２時間にわたって繰り返すことからなった。

【0124】

ホスホヒドロラーゼおよびミクロソームＧ６Ｐ取り込みアッセイ
ミクロソームの単離、ホスホヒドロラーゼアッセイ、Ｇ６Ｐａｓｅ−αの酵素組織化学的分析、およびミクロソームＧ６Ｐ取り込みアッセイを以前に記載されている通り実施した（Yiuら、Mol Ther １８巻：１０７６〜１０８４頁、２０１０年；Leiら、Nat Genet １３巻：２０３〜２０９頁、１９９６年）。

【0125】

表現型分析
マウスを、まず、肝臓小結節についてＶｅｖｏ２１００ ｓｙｓｔｅｍ（ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）を使用した超音波によって検査し、血液試料を尾静脈から採取した。血中グルコース、総コレステロール、および尿酸をＴｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、ＣＯ）から入手したキットを使用して分析し、トリグリセリドをＳｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）からのキットによって分析し、乳酸をＴｒｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）からのキットによって分析し、インスリンをＣｒｙｓｔａｌ Ｃｈｅｍ（Ｄｏｗｎｅｒｓ Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）からの超高感度マウスインスリンＥＬＩＳＡキットによって分析した。肝臓グリコーゲン含量を以前に記載されている通り測定した（Yiuら、Mol Ther １８巻：１０７６〜１０８４頁、２０１０年）。肝臓トリグリセリド、グルコース、およびＧ６Ｐの含量を決定するために、肝組織をＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００、０．５％Ｎａ−デオキシコール酸、および０．１％ＳＤＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）中でホモジナイズし、トリグリセリドをＳｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓからキットを使用して測定し、グルコースをＴｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎからのキットによって測定し、Ｇ６ＰをＢｉｏＶｉｓｉｏｎ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）からのキットによって測定した。

【0126】

ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色およびオイルレッドＯ染色（Yiuら、Mol Ther １８巻：１０７６〜１０８４頁、２０１０年）のために、肝臓切片を１０％中性緩衝ホルマリン中に保存し、４〜１０ミクロンの厚さの薄片を作製した。染色した切片を、Ａｘｉｏｓｋｏｐ２ ｐｌｕｓ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅおよびＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ ４．５ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）を使用して可視化した。

【0127】

定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲおよび抗体分析
全ＲＮＡを肝組織からＴＲＩｚｏｌ（商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して単離した。ｍＲＮＡ発現をＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＴａｑＭａｎプローブを使用したＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７３００ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）におけるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した。データを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳＤＳ ｖ１．３ ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して分析し、β−アクチンＲＮＡに対して正規化した。ヒトＧ６Ｐａｓｅ−αに対する抗体を以前に記載されている通りウエスタン−ブロット分析によって検出した（Yiuら、Mol Ther １８巻：１０７６〜１０８４頁、２０１０年）。

【0128】

統計分析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）Ｐｒｏｇｒａｍ、 ｖｅｒｓｉｏｎ ４（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して独立ｔ検定を実施した。値は、Ｐ＜０．０５で統計学的に有意であるとみなした。

【0129】

結果
ＡＡＶ−ＧＰＥ注入により、長期間の肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α発現が指向される
ＡＡＶ−ＧＰＥを、用量を変動させて（５×１０^１２〜３×１０^１３ウイルス粒子（ｖｐ）／ｋｇ）注入した２週齢または４週齢のＧ６ｐｃ^−／−マウス（ｎ＝１８）では、野生型肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性の３％から１００％に回復し、維持されると予測された。１５週齢のＧ６ｐｃ^−／−マウス１匹（５×１０^１２ｖｐ／ｋｇ）および３０週齢のＧ６ｐｃ^−／−マウス１匹（１×１０^１３ｖｐ／ｋｇ）にも注入を行った。グルコース療法下のＧＳＤ−Ｉａマウスの低い生存率により、試験のために入手可能な成体マウスの数が重度に制限された（Leiら、Nat Genet１３巻：２０３〜２０９頁、１９９６年）。注入を受けた動物２０匹の代謝プロファイルおよび組織学的プロファイルを７０〜９０週間にわたってモニターし、全ての測定値をそれらのＧ６ｐｃ^＋／＋同腹仔およびＧ６ｐｃ^＋／−同腹仔の測定値と比較した。Ｇ６ｐｃ^＋／＋マウスおよびＧ６ｐｃ^＋／−マウスの表現型はどちらも野生型と区別できない（Leiら、Nat Genet １３巻：２０３〜２０９頁、１９９６年）。

【0130】

ＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ^−／−マウスの早期死亡は認められなかった。肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性およびグリコーゲン含量を、２４時間の絶食後に屠殺したマウスにおいて評価した。７０〜９０週齢の野生型マウス（ｎ＝２０）の平均空腹時肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性は１８５．８±１２．７ｎｍｏｌ／ｍｇ／分であった（図２Ａ）。計画の通り、処置を受けたマウスにおいて様々な肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性が回復した。７０〜９０週齢時に屠殺した、ＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ^−／−マウス２０匹のうち、６匹のマウスが低レベル（野生型活性の３％〜９％）の肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性を有し、これらをＡＡＶ−Ｌと称し、９匹のマウスが中間のレベル（野生型活性の２２％〜６３％）の肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性を有し、これらをＡＡＶ−Ｍと称し、５匹のマウスが高レベル（野生型活性の８１％〜１２８％）の肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性を有し、これらをＡＡＶ−Ｈと称した（図２Ａ）。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析により、肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α ｍＲＮＡ発現とＧ６Ｐａｓｅ−α活性の間の直線関係が示された（図２Ｂ）。

【0131】

酵素組織化学的分析により、野生型マウスにおけるＧ６Ｐａｓｅ−αは肝臓全体を通して分布し、血管の近傍におけるレベルが有意に高いことが示された。無処置のＧ６ｐｃ^−／−マウスの肝臓切片では染色可能なＧ６Ｐａｓｅ−α活性は認められなかった。ＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ^−／−マウスでもＧ６Ｐａｓｅ−αは肝臓全体を通して分布したが、血管に関連するものではない病巣に著しく高レベルの酵素活性が含有された。ＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ^−／−マウスにおける肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−αの分布が不均等であることにより、野生型Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性の８１〜１２８％を発現するＡＡＶ−Ｈ肝臓を含め、かなりの割合の肝細胞が少ないまたはわずかなＧ６Ｐａｓｅ−αを有することが示唆される。ＧＳＤ−Ｉａ表現型のレスキューのために均一な肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α発現は必要ない。

【0132】

ＡＡＶ−ＧＰＥ注入によりＧＳＤ−Ｉａにおける代謝異常が修正される
ＧＳＤ−Ｉａは、低血糖症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、高尿酸血症、および乳酸血症を特徴とする（Chouら、Nat Rev Endocrinol ６巻：６７６〜６８８頁、２０１０年）。野生型肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性を発現するＡＡＶ−Ｈマウスにおける血中グルコースレベルは対照同腹仔におけるレベルと区別できなかった（図３Ａ）。それぞれ正常な肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性の２２〜６３％および３〜９％を発現するＡＡＶ−ＭおよびＡＡＶ−Ｌでも、正常血糖（約１００ｍｇ／ｄｌ）の状態が維持されたが（Yoshizawaら、J Clin Invest １１９巻：２８０７〜２８１７頁、２００９年）、それらの血中グルコースレベルは一貫して対照同腹仔よりも低かった（図３Ａ）。ＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ^−／−マウスの全てでコレステロールおよびトリグリセリドの正常な血清プロファイルが示されたが、処置を受けたＧ６ｐｃ^−／−マウスにおける尿酸および乳酸の血清中レベルは、対照同腹仔におけるレベルよりも低かった（図３Ａ）。

【0133】

ＡＡＶ−ＧＰＥで処置した雌性マウスおよび雄性マウスの７０週齢〜９０週齢時の平均体重は、それぞれ、それらの年齢および性別を釣り合わせた対照マウスの７０％および６２％であった（図３Ｂ）。しかし、処置を受けたＧ６ｐｃ^−／−マウスの平均体長は対照の９０％であった（図３Ｂ）。したがって、ＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ^−／−マウスの肥満度指数（ＢＭＩ）値（Baharyら、Proc Natl Acad Sci USA ８７巻：８６４２〜８６４６頁、１９９０年）は、対照同腹仔の値よりも有意に低かった（図３Ｂ）。どちらのマウス群のＢＭＩ値も正常な成長を示すものであるが（Baharyら、Proc Natl Acad Sci USA ８７巻：８６４２〜８６４６頁、１９９０年）、ＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ^−／−マウスは相当に痩せていた。野生型マウスにおける肝臓重量は比較的一定であった（図３Ｃ）。ＡＡＶ−ＧＰＥの注入を受けたマウスでは、肝臓重量は肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−αの活性の回復と逆相関した（図３Ｃ）。肝臓重量を体重に対するパーセントで表した場合、ＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ^−／−マウスは体重が少ないので、有意に高い値になる。しかし、絶対的な肝臓重量を直接比較した場合、ＡＡＶ−Ｍ、ＡＡＶ−Ｈ、および対照同腹仔の間で有意な差異は認められなかった（図３Ｃ）。しかし、ＡＡＶ−Ｌマウスでは肝腫大が継続して示された。ＡＡＶ−ＧＰＥによる腎臓への導入遺伝子の送達はわずかであるか全くなかった（Yiuら、Mol Ther １８巻：１０７６〜１０８４頁、２０１０年）。しかし、高い肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性を発現する、注入を受けたマウスの腎臓重量は少なく、これにより、良好な肝臓の代謝制御によって腎肥大症が正常化したことが示唆される。

【0134】

ＡＡＶ−ＧＰＥを注入したＧ６ｐｃ^−／−肝臓における組織学的異常、脂肪症、またはＨＣＡの非存在
ＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ^−／−マウスにおけるＨＣＡ小結節の存在を決定するために、肝臓当たり５つまたはそれ超の別々の切片を使用して、超音波分析を行い、その後、広範囲にわたる肝臓の検査および肝臓生検試料の組織学的分析を行った。超音波および形態学的分析により、７０週齢〜９０週齢まで生存した野生型マウス（ｎ＝２０）およびＡＡＶ−ＧＰＥを形質導入したＧ６ｐｃ^−／−マウス（ｎ＝２０）において肝臓小結節は検出されなかった。２週齢時または４週齢時に注入を受けた、ＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ^−／−マウス（ｎ＝１８）では、グリコーゲン貯蔵が増加した以外は肝臓の組織学的異常は示されなかった。正常な肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性の６％を発現した、１５週齢時に注入を受けた８４週齢のマウスでは、１つの肝臓切片においてグリコーゲン貯蔵の上昇およびわずかな壊死性病巣が示された。正常な肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性の３８％を発現した、３０週齢時に注入を受けた９０週齢のマウスの肝組織切片の大部分では、組織学的異常は示されず、１つの肝臓切片が多くの壊死性病巣を有した。壊死性病巣は、６週齢以降の無処置のＧＳＤ−Ｉａマウスにおいて見られる特徴的な肝臓病態であるので（Kimら、J Hepatol ４８巻：４７９〜４８５頁、２００８年）、これらの壊死性病巣は、１５週齢時または３０週齢時の遺伝子療法を開始する前に発生した可能性がかなり高い。

【0135】

肝臓特異的Ｇ６ｐｃ−ヌルマウスの肝臓では顕著な脂肪症を伴ってＨＣＡを発生することが報告された（Mutelら、J Hepatol ５４巻：５２９〜５３７頁、２０１１年）。数匹の野生型マウスで肝臓脂肪の貯蔵が増加し、ＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ^−／−マウスの肝臓における脂肪の貯蔵はわずかであったか、全くなかった。さらに、ＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ^−／−マウス（ｎ＝２０）における肝臓トリグリセリド含量は、野生型マウスにおける肝臓トリグリセリド含量と統計学的に異ならなかった。オイルレッドＯ染色により、ＡＡＶ−ＧＰＥで処置した動物（ｎ＝２０）における脂質含量が対照における脂質含量と同様であることが確認された。

【0136】

シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）は、ＨＣＣを含めた多くの前悪性のがん状態および悪性のがんにおいて過剰発現するマーカーであることが十分に確立されている（Wu、Cancer Treat Rev ３２巻：２８〜４４頁、２００６年）。定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により、ＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ^−／−および対照同腹仔において同様のレベルの肝臓ＣＯＸ−２メッセージが発現したことが示された。

【0137】

ＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ^−／−マウスでは正常な空腹時血糖および耐糖能プロファイルが示される
絶食を始める前の野生型マウス（ｎ＝２０）の平均血中グルコースレベルは１６５．０±３．０ｍｇ／ｄｌ（ゼロ時間）であり、これは２４時間の絶食後には１１３．３±６．５ｍｇ／ｄｌに減少した（図４Ａ）。ＡＡＶ−ＬマウスとＡＡＶ−Ｍマウスの空腹時血中グルコースプロファイルは対照マウスのプロファイルと平行したが、血中グルコースレベルは一貫して低く（図４Ａ）、一方、ＡＡＶ−Ｈマウスの空腹時血糖プロファイルは対照マウスのプロファイルと区別できなかった。著しく異なり、無処置のＧ６ｐｃ^−／−マウスは、絶食６０〜７５分以内にＧＳＤ−Ｉａの特質である顕著な低血糖症を示した（図４Ｂ）（Chouら、Nat Rev Endocrinol ６巻：６７６〜６８８頁、２０１０年）。要約すると、ＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ^−／−マウスは、もはやＧＳＤ−Ｉａの空腹時低血糖特性を患っていない（Chouら、Nat Rev Endocrinol ６巻：６７６〜６８８頁、２０１０年）。

【0138】

ＡＡＶ−ＭマウスおよびＡＡＶ−Ｈマウスにおける血中耐糖能プロファイルは野生型同腹仔のプロファイルと区別できなかった（図４Ｃ）。ＡＡＶ−Ｌマウスでは、腹腔内グルコース注射後に、血中グルコースレベルが野生型対照よりも速い速度で低下した。

【0139】

ＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ^−／−マウスにおける空腹時血中インスリンレベルの低下
インスリンシグナル伝達により、肝臓のグルコース代謝および脂質代謝が調節される（LeavensおよびBirnbaum、Crit Rev Biochem Mol Biol ４６巻：２００〜２１５頁、２０１１年）。２４時間の絶食後に、７０〜９０週齢の野生型マウス（ｎ＝２０）およびＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ^−／−マウス（ｎ＝２０）における血中インスリンレベルは、それぞれ１．８４±０．２９および０．５６±０．０９ｎｇ／ｍｌであった（図５Ａ）。どちらも正常範囲内であったが（de Lucaら、J Clin Invest １１５巻：３４８４〜３４９３頁、２００５年）、ＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ^−／−マウスにおける空腹時血中インスリンレベルの方が正常な平均値に近かった（de Lucaら、J Clin Invest １１５巻：３４８４〜３４９３頁、２００５年）。ＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ^−／−マウスにおける空腹時血中インスリンレベルは肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−αの回復と相関しなかったが、野生型マウスおよび処置を受けたＧ６ｐｃ^−／−マウスにおけるインスリンレベルは、それらの体重と直線関係を示した（図５Ａ）。

【0140】

インスリンの転写効果は、ステロール調節エレメント結合タンパク質−１ｃ（ＳＲＥＢＰ−１ｃ）によって媒介される（LeavensおよびBirnbaum、Crit Rev Biochem Mol Biol ４６巻：２００〜２１５頁、２０１１年）。定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により、２４時間絶食させた、ＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ^−／−マウスおよび対照マウスにおいて同様のレベルの肝臓ＳＲＥＢＰ−１ｃ転写物が発現したことが示された（図５Ｂ）。グルコキナーゼはグルコースセンサーである（Massaら、IUBMB Life ６３巻：１〜６頁、２０１１年）。肝臓グルコキナーゼ活性は、空腹時など、血中インスリンレベルが低いと低下する（Massaら、IUBMB Life ６３巻：１〜６頁、２０１１年）。血中インスリンで見られたのと同様に、ＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ^−／−マウスにおける２４時間の絶食後の肝臓グルコキナーゼ転写物は、対照同腹仔における転写物よりも有意に少なかった（図５Ｃ）。興味深いことに、肝臓グルコキナーゼｍＲＮＡと空腹時血中インスリンのレベルは、野生型マウスとＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ^−／−マウスのどちらにおいても直線関係を示した（図５Ｃ）。

【0141】

ＡＡＶ−ＧＰＥを注入したＧ６ｐｃ^−／−マウスの肝臓におけるグルコース恒常性
絶食中、血中グルコース恒常性は、肝臓において糖新生およびグリコーゲン分解の最終ステップにおけるＧ６ＰＴ／Ｇ６Ｐａｓｅ−α複合体によるＧ６Ｐの加水分解によって産生される内在性グルコースによって維持される（Chouら、Nat Rev Endocrinol ６巻：６７６〜６８８頁、２０１０年）。機能的なＧ６Ｐａｓｅ−αを欠くＧ６ｐｃ^−／−マウスは、肝臓、腎臓、または腸において内在性グルコースを産生することができない。２４時間の絶食後の肝臓の遊離のグルコースレベルは、野生型マウス（ｎ＝２０）ではタンパク質１ｍｇ当たり３８９±１７ｎｍｏｌであり、ＡＡＶ−Ｌマウス（ｎ＝６）、ＡＡＶ−Ｍマウス（ｎ＝９）、およびＡＡＶ−Ｈマウス（ｎ＝５）では、それぞれ野生型マウスの６１％、６８％および９０％であった。絶食させたＡＡＶ−Ｌ肝臓およびＡＡＶ−Ｍ肝臓における細胞内Ｇ６Ｐレベルは、それぞれ野生型肝臓の２．９倍および１．６倍であったが、絶食させたＡＡＶ−Ｈ肝臓における細胞内Ｇ６Ｐレベルは野生型肝臓のレベルと統計学的に同様であった。

【0142】

肝臓のＧ６Ｐは、細胞質における、グリコーゲン合成、解糖、ペントース−リン酸経路を含めたいくつかの代謝経路、およびＥＲ内腔における内在性グルコース産生に関与する。上記の経路に関与するいくつかの重要な酵素の肝臓での発現を、２４時間の絶食後のマウスにおいて調査した。これらの酵素として、肝臓の糖新生における最初の重要なステップ（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ ｓｔｅｐ）を触媒するサイトゾルホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ−Ｃ）（HansonおよびReshef、Biochimie ８５巻：１１９９〜１２０５頁、２００３年）；フルクトース−１，６−二リン酸をフルクトース−６−リン酸に変換するフルクトース−１，６−ビスホスファターゼ（ＦＢＰａｓｅ−１）（Hers、J Inherit Metab Dis １３巻：３９５〜４１０頁、１９９０年）；グリコーゲン分解およびグリコーゲン合成におけるグルコース−６−Ｐおよびグルコース−１−Ｐの可逆的変換を触媒するホスホグルコムターゼ（ＰＧＭａｓｅ）（Hers、J Inherit Metab Dis １３巻：３９５〜４１０頁、１９９０年）；フルクトース−６−Ｐをフルクトース−１，６−二リン酸に変換することによって解糖における不可逆的な律速ステップを触媒するホスホフルクトキナーゼ−１（phosphofructokianse-1）（ＰＦＫ−１）（Hers、J Inherit Metab Dis１３巻：３９５〜４１０頁、１９９０年）；Ｇ６Ｐを６−ホスホグルコノラクトンに変換することによってペントース−リン酸経路における第１の反応を触媒するＧ６Ｐデヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）（Wamelinkら、J Inherit Metab Dis３１巻：７０３〜７１７頁、２００８年）；および細胞質内Ｇ６ＰをＥＲ内腔に輸送するＧ６ＰＴ（Chouら、Nat Rev Endocrinol６巻：６７６〜６８８頁、２０１０年）が含まれる。

【0143】

定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析により、絶食させた肝臓では、ＰＥＰＣＫ−ＣおよびＰＧＭａｓｅ転写物は変化しなかったが、ＦＢＰａｓｅ−１転写物はＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ^−／−マウスにおいて対照と比較して増加したことが示された。ＡＡＬ−Ｌ肝臓におけるＰＦＫ−１およびＧ６ＰＤＨ転写物はどちらも増加したが、ＡＡＶ−Ｍ肝臓およびＡＡＶ−Ｈ肝臓ではなお統計学的に野生型肝臓と同様であった。ＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ^−／−マウスにおける肝臓Ｇ６ＰＴ ｍＲＮＡレベルは、肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性のレベルの回復にかかわらず、野生型対照の２．２倍であった。Ｇ６ＰＴに媒介性される肝臓ミクロソームＧ６Ｐ取り込み活性は、内在性グルコース産生を律速するものであるが（Arionら、J Biol Chem ２５１巻：６７８４〜６９０頁、１９７６年）、Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性と共依存性である（Leiら、Nat Genet １３巻：２０３〜２０９頁、１９９６年）。インタクトなＧ６ＰＴを用いてＧ６ｐｃ^−／−マウスから調製した肝臓ミクロソームでは、野生型肝臓ミクロソームと比較して著しく低いＧ６Ｐ取り込み活性が示され（Leiら、Nat Genet １３巻：２０３〜２０９頁、１９９６年）、これは、遺伝子移入によってＧ６Ｐａｓｅ−α活性を回復させると、逆転させることができる（Zingoneら、J Biol Chem ２７５巻：８２８〜８３２頁、２０００年）。ＡＡＶ−Ｌ肝臓、ＡＡＶ−Ｍ肝臓、およびＡＡＶ−Ｈ肝臓では、ミクロソームＧ６Ｐ取り込み活性は、それぞれ野生型活性の４３％、５０％、および７２％であり、これは、肝臓の遊離のグルコースレベルと平行した肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性の上昇を反映する（図２Ａ）。

【0144】

ヒトＧ６Ｐａｓｅ−αに対する免疫応答の非存在
注入を受けたマウスにおいてヒトＧ６Ｐａｓｅ−αに対する液性応答が生じるかどうかを決定するために、７０〜９０週齢の対照マウスおよびＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ^−／−マウスから得た血清を使用してウエスタンブロット分析を実施した。マウスＧ６Ｐａｓｅ−αも認識する、ヒトＧ６Ｐａｓｅ−αに対するモノクローナル抗体（Yiuら、Mol Ther １８巻：１０７６〜１０８４頁、２０１０年）を陽性対照として使用した。７０〜９０週齢まで生存した、ＡＡＶ−ＧＰＥを注入したＧ６ｐｃ^−／−マウスまたは野生型対照マウスのいずれにおいてもＧ６Ｐａｓｅ−αに対する抗体は検出されなかった。

【0145】

（実施例３）
Ｇ６ＰＣプロモーターの上流エンハンサーエレメントは糖原病Ｉａ型における最適なＧ６ＰＣ発現に極めて重要である
この実施例では、ＡＡＶ−ＧＰＥベクターの有効性をさらに評価するための試験を記載している。２６８４ｂｐのＧ６ＰＣプロモーター／エンハンサーを含む一本鎖ベクターであるＡＡＶ−ＧＰＥを、３８２ｂｐの最小Ｇ６ＰＣプロモーター／エンハンサーを含有する二本鎖ベクターであるＡＡＶ−ｍｉＧＰＥと比較した。この実施例に記載されている結果は、ＡＡＶ−ＧＰＥベクターにより、ＧＳＤ−Ｉａマウスにおいて、ＡＡＶ−ｍｉＧＰＥベクターと比較して有意に高いレベルの肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α発現が指向され、肝臓グリコーゲン蓄積のより大きな減少が実現され、また、より良好な絶食耐性につながったことを示すものである。

【0146】

材料および方法
Ｇ６ｐｃ−／−マウスへのｒＡＡＶベクターの注入
全てのＧ６ｐｃ−／−マウスをグルコース療法で生存維持させた（Leiら、Nat. Genet.１３巻：２０３〜２０９頁、１９９６年）。２週齢のＧ６ｐｃ−／−マウスに後眼窩洞を通じてｒＡＡＶベクターを注入した。年齢を釣り合わせたＧ６ｐｃ＋／＋／Ｇ６ｐｃ＋／−マウスを対照として使用した。ｒＡＡＶベクターの注入を受けたマウスについては、注入後すぐにグルコース療法を終了した。全てのウイルス形質導入を２週齢のＧ６ｐｃ−／−マウスに実施し、１２週齢時に有効性を評価した。

【0147】

ホスホヒドロラーゼアッセイ
ミクロソームの単離およびホスホヒドロラーゼアッセイを基本的に以前に記載されている通り決定した（Leiら、Nat. Genet.１３巻：２０３〜２０９頁、１９９６年）。ホスホヒドロラーゼアッセイに関しては、５０ｍＭのカコジル酸緩衝液、ｐＨ６．５、１０ｍＭのＧ６Ｐおよび適量のミクロソーム調製物を含有する反応混合物（１００μｌ）を３０℃で１０分インキュベートした。インタクトな膜を０．２％デオキシコール酸中、０℃で２０分インキュベートすることによって破壊ミクロソーム膜を調製した。非特異的ホスファターゼ活性を、破壊ミクロソーム調製物をｐＨ５、３７℃で１０分プレインキュベートすることによって推定し、酸に不安定なＧ６Ｐａｓｅ−αを不活化した。

【0148】

ベクターＤＮＡおよびｍＲＮＡの定量化
ＧｅｎＥｌｕｔｅ（商標）Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用してマウス組織由来の総ＤＮＡを単離し、ＴＲＩｚｏｌ（商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して全ＲＮＡをマウス組織から単離した。ベクターゲノム数およびｍＲＮＡ発現を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＴａｑＭａｎプローブを使用したＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７３００ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）でそれぞれＰＣＲおよびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した。Ｇ６ＰＣについてはＴａｑＭａｎプローブセットＨｓ００６０９１７８＿ｍ１、およびβ−アクチンについてはＭｍ００６０７９３９＿ｓ１を使用してヒトＧ６ＰＣ遺伝子のベクターゲノム数をマウスβ−アクチンに対して正規化した。ヒトＧ６ＰＣ遺伝子の０．０１〜１００コピーに対応するプラスミドＤＮＡを標準曲線に使用した。ベクターゲノムコピー数を決定するために、試料のＣｔ値を標準曲線と比較した。Ｇ６ＰＣについてはＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブセットＨｓ００６０９１７８＿ｍ１およびＲｐｌ１９についてはＭｍ０２６０１６３３＿ｇ１を使用してＧ６ＰＣ ｍＲＮＡ発現をＲｐｌ１９ ＲＮＡに対して正規化した。

【0149】

表現型分析
Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、ＣＯ）から入手したキットを使用して血中グルコースを分析した。肝臓グリコーゲンおよびトリグリセリド含量を以前に記載されている通り測定した（実施例１および２、ならびにYiuら、Mol. Ther.１８巻：１０７６〜１０８４頁、２０１０年；Leeら、Hepatology ５６巻：１７１９〜１７２９頁、２０１２年）。肝臓トリグリセリドを決定するために、肝組織をＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００、０．５％Ｎａ−デオキシコール酸、および０．１％ＳＤＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）中にホモジナイズし、Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）からのキットを使用してトリグリセリドを測定した。

【0150】

マウスのグルコース負荷試験は、６時間にわたる絶食後に血液試料採取し、その後、グルコース溶液を体重１ｇ当たり２ｍｇで腹腔内注射し、２時間にわたって尾静脈を通じた血液試料採取を繰り返すことからなった。

【0151】

統計分析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）Ｐｒｏｇｒａｍ、ｖｅｒｓｉｏｎ ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して独立ｔ検定を実施した。値は、ｐ＜０．０５であれば統計学的に有意とみなした。

【0152】

結果
ｒＡＡＶ−ＧＰＥまたはｒＡＡＶ−ｍｉＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウスにおける肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α発現
１２週間にわたるＧ６ｐｃ−／−マウスの処置におけるｒＡＡＶ−ＧＰＥベクター（実施例１およびYiuら、Mol. Ther.１８巻：１０７６〜１０８４頁、２０１０年を参照されたい）およびｒＡＡＶ−ｍｉＧＰＥベクター（Koeberlら、Mol. Ther.１６巻：６６５〜６７２頁、２００８年）の有効性を調査するための試験を行った。各ベクターを、２つの異なる研究センターにおいて、群当たりマウス６匹のマウスを用い、２種類の用量、１×１０^１３ウイルス粒子（ｖｐ）／ｋｇ（高用量）および２×１０^１２ｖｐ／ｋｇ（低用量）で使用した。どちらのセンターでも同様の結果が得られた。形質導入されたＧ６ｐｃ−／−マウスにおける肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性は、２つのセンターからの統合データを表すが、他の報告データは単一の試験からのものである。ｒＡＡＶに媒介される肝臓の遺伝子移入の効率および持続が、初期発生の間は、肝臓の成長に伴う肝細胞増殖の速度が大きく、それによりｒＡＡＶが有効に感染した細胞の数が希薄化することに起因して少ないことが複数の試験によって示されている（Yiuら、Mol. Ther.１８巻：１０７６〜１０８４頁、２０１０年；Cunningham、Mol. Ther.１６巻：１０８１〜１０８８頁、２００８年）。この試験では、ｒＡＡＶベクターを、肝細胞増殖が高いままである２週齢のＧ６ｐｃ−／−マウスに投与した。したがって、１２週齢時に検査した肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α発現は、同じベクター投与量の注入を受けた成体マウスにおいて見られる発現よりも有意に低い。ヒト疾患における最良の介入の時期はまだ確立されていない。

【0153】

どちらのセンターにおいても、処置を受けたＧ６ｐｃ−／−マウスの全てが１２週齢まで生存し、早期死亡は見られなかった。１２週齢の野生型マウスの肝臓では、ミクロソームＧ６Ｐａｓｅ−α活性は２０３．５±１０．３ｎｍｏｌ／分／ｍｇ（ｎ＝２４）であった。２つのセンターにおいて独立に決定された統合データ（処置当たりｎ＝１２）により、１２週齢時に、高用量ｒＡＡＶ−ＧＰＥ療法では、ｒＡＡＶ−ｍｉＧＰＥの活性の３．５倍である、野生型肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性の約１８％が再構成され、低用量ｒＡＡＶ−ＧＰＥ療法では、ｒＡＡＶ−ｍｉＧＰＥの３．６倍超の活性が生じたことが示された（図６Ａ）。肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α活性は肝臓のベクターゲノムコピー数と共に直線的に上昇し、ｒＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウス（ｎ＝６）のコピー数はｒＡＡＶ−ｍｉＧＰＥで処置したマウス（ｎ＝６）よりも有意に多かった（図６Ａ）。

【0154】

ｒＡＡＶ−ＧＰＥまたはｒＡＡＶ−ｍｉＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウスの代謝プロファイル
ｒＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウスおよびｒＡＡＶ−ｍｉＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウスは全て、体重は少なかったが、それらの野生型同腹仔と平行する成長曲線を示した（図６Ｂ）。処置を受けたマウスの肥満度指数（ＢＭＩ）値は、ベクターまたは用量レベルに関係なく、野生型マウスの値と区別できなかった（図６Ｃ）。処置を受けたＧ６ｐｃ−／−マウスの全てで、血中グルコースレベルは一貫して野生型対照よりも低かったが、それでも正常範囲の下限は上回り（図６Ｄ）、注入を受けた動物の中で、ＧＳＤ−Ｉａに典型的である頻繁な低血糖発作を患ったものはなかった（Chouら、Curr. Mol. Med.２巻：１２１〜１４３頁、２００２年；Chouら、Nat. Rev. Endocrinol.６巻：６７６〜６８８頁、２０１０年；Leeら、Hepatology５６巻：１７１９〜１７２９頁、２０１２年）。

【0155】

肝臓グリコーゲンおよび／または中性脂肪蓄積の１つの尺度である、身体に対する肝臓の相対的な重量（Chouら、Curr. Mol. Med.２巻：１２１〜１４３頁、２００２年；Chouら、Nat. Rev. Endocrinol.６巻：６７６〜６８８頁、２０１０年）は、処置を受けたＧ６ｐｃ−／−マウス群４つ全てにおいて野生型マウスよりも高かったが、高用量のｒＡＡＶ−ＧＰＥで処置したマウスでは、他の群よりも有意に正常に近かった（図７Ａ）。これと一貫して、ｒＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウスおよびｒＡＡＶ−ｍｉＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウスにおけるグリコーゲン含量は、それらの野生型対照よりも著しく高く（図７Ｂ）、ベクター用量が高い方が、低ベクター用量よりもグリコーゲンが良好に低減し、これにより、肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ−α発現がより大きく回復することにより肝腫大が改善されることが実証される。しかし、単に高用量療法を比較すると、ｒＡＡＶ−ｍｉＧＰＥで処置したマウスは、ｒＡＡＶ−ＧＰＥで処置したマウスよりも４３％多くのグリコーゲンを有した。肝臓グリコーゲンが継続して上昇したにもかかわらず、ｒＡＡＶで処置したＧ６ｐｃ−／−マウスのいずれの肝組織切片においても１２週齢時に組織学的異常は観察されなかった。低用量のｒＡＡＶ−ｍｉＧＰＥで処置したマウスを例外として、肝臓トリグリセリド含量は野生型と他のｒＡＡＶで処置したＧ６ｐｃ−／−マウス３群の間で統計学的に異ならなかった（図７Ｃ）。

【0156】

ｒＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウスまたはｒＡＡＶ−ｍｉＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウスにおける空腹時血糖および耐糖能プロファイル
野生型マウス（ｎ＝２４）については、絶食前の平均血中グルコースレベルは１７２．２±２．６ｍｇ／ｄｌ（ゼロ時間）であり、これは、絶食８時間後には１３４．６±３．８ｍｇ／ｄｌに低下した（図８Ａ）。高用量療法マウス（処置当たりｎ＝６）の空腹時血中グルコースプロファイルは、低用量療法マウス（処置当たりｎ＝６）よりも有意に良好であったが、高用量であっても、ｒＡＡＶ−ＧＰＥで処置したマウスでは有意に高いグルコースレベルが持続し、６時間の絶食中、野生型レベルで安定化し、一方、ｒＡＡＶ−ｍｉＧＰＥで処置したマウスでは、はるかに低い、野生型レベルの６０％でプラトーに達した（図８Ａ）。高用量のｒＡＡＶ−ＧＰＥで処置したマウスおよびｒＡＡＶ−ｍｉＧＰＥで処置したマウスは同様に２４時間の絶食を持続させることができたが、空腹時血中グルコースレベルは、ｒＡＡＶ−ＧＰＥで処置したマウスにおいて、ｒＡＡＶ−ｍｉＧＰＥで処置したマウスよりも有意に高かった（図８Ｂ）。要約すると、ｒＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウスは、ｒＡＡＶ−ｍｉＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウスよりも野生型に近く、より絶食に耐えることができた。

【0157】

腹腔内グルコース注射後、処置を受けたＧ６ｐｃ−／−マウス（処置当たりｎ＝６）の血中耐糖能プロファイルをモニターした。一般に、プロファイルは野生型マウスのプロファイルと平行し（図８Ｃ）、高用量で処置したマウスは低用量で処置したマウスよりも良好に応答した。

【0158】

１２週齢の、高用量のｒＡＡＶ−ＧＰＥで処置したＧ６ｐｃ−／−マウスの肝臓、腎臓、腸、脳、精巣、および卵巣におけるヒトＧ６ＰＣ導入遺伝子の生体内分布を定量的ＰＣＲによって分析した（表１）。形質導入を受けた肝臓では、ＤＮＡ１μｇ当たりのベクターゲノムコピー数は、９４，４４０±７，６２４（または０．５１±０．０４ベクターコピー／二倍体ゲノム）であった。形質導入を受けた腎臓および腸では、数は劇的に減少し、平均で、それぞれ肝臓コピー数のたった２．５７％および０．６４％であり、これにより、ｒＡＡＶ８ウイルスは腎臓および腸には効率的に形質導入されなかったことが示される。脳および精巣におけるＤＮＡ１μｇ当たりのゲノムコピー数はさらに少なく、それぞれ肝臓コピー数の０．１２％および０．０２％であった。卵巣ではバックグラウンドレベルのヒトＧ６ＰＣゲノムのみが検出された。

【0159】

ｒＡＡＶ−ＧＰＥベクターは、主に肝臓、腎臓内の近位尿細管、および腸において発現する組織特異的プロモーター／エンハンサーエレメントを含有する（Chouら、Curr. Mol. Med.２巻：１２１〜１４３頁、２００２年；Chouら、Nat. Rev. Endocrinol.６巻：６７６〜６８８頁、２０１０年）。ヒトＧ６ＰＣ転写物の定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析では、ゲノムコピー数と遺伝子発現の間の相関が示された（表３）。肝臓では、Ｒｐｌ１９転写物に対するヒトＧ６ＰＣ ｍＲＮＡのレベルは０．６２７４０±０．０４４４５であった。ゲノムコピー分析から予測された通り、腎臓では肝臓ヒトＧ６ＰＣ ｍＲＮＡの０．０３％のみが発現し、腸、脳、精巣、および卵巣ではバックグラウンドレベルのヒトＧ６ＰＣ ｍＲＮＡのみが検出された。

【表3】

【0160】

データは平均±SEMである。導入遺伝子を含有しない野生型組織の値は、肝臓、腎臓、腸、脳、精巣、および卵巣の平均±SEMである。括弧内の数は肝臓値に対する%である。

【0161】

（実施例４）
スタッファー配列を有するＡＡＶベクターとスタッファー配列を有さないＡＡＶベクターの比較
この実施例では、Ｇ６Ｐａｓｅ−αを発現するＡＡＶベクターにおけるイントロンに隣接するスタッファーヌクレオチド配列が効率的な肝臓の形質導入のために重要であるという所見を記載している。

【0162】

Ｇ６Ｐａｓｅ−αの導入遺伝子送達および肝臓での発現に対するスタッファー配列の寄与を評価するために、プラスミドＵＦ１１−Ｋ２９−Ｇ６ＰＣを構築した。ＵＦ１１−Ｋ２９−Ｇ６ＰＣ（配列番号２）は、ＵＦ１１−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣ（配列番号１）とは、イントロンの周囲のスタッファー配列を欠くことが異なる。Ｇ６ＰＣプロモーター／エンハンサー（ＧＰＥ）およびＧ６ＰＣコード配列は各プラスミドで同一である。

【0163】

Ｇ６ｐｃ−／−マウスに、組換えＡＡＶ−Ｋ２９−Ｇ６ＰＣまたは組換えＡＡＶ−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣのいずれかを１×１０^１３ｖｐ／ｋｇで投与した。その結果から、ＡＡＶ−Ｋ２９−Ｇ６ＰＣでは、ＡＡＶ−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣと比較して、ＧＳＤ−Ｉａマウスにおける肝臓の形質導入効率が著しく低下することが示された。ＡＡＶ−Ｋ２９−Ｇ６ＰＣを形質導入した肝臓およびＡＡＶ−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣを形質導入した肝臓におけるＧ６Ｐａｓｅ活性は、それぞれ７．３ｎｍｏｌ／分／ｍｇおよび３３．０ｎｍｏｌ／分／ｍｇであった。これらの結果は、イントロンに隣接するスタッファー配列が効率的な肝臓の形質導入のために重要であることを実証するものである。

【0164】

（実施例５）
コドン最適化されたＧ６ＰＣをコードするＡＡＶベクターの生成
この実施例では、コドン最適化されたＧ６ＰＣを含有するＡＡＶベクターの構築および特徴付けを記載している。

【0165】

ＵＦ１１−ＧＰＥ−ｃｏ−Ｇ６ＰＣプラスミド（コドン最適化されたＧ６ＰＣを含む；配列番号３）は、ＵＦ１１−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣプラスミド（配列番号１）に由来するが、ＡＡＶ−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣの野生型Ｇ６Ｐａｓｅコード配列が合成のコドン最適化されたＧ６Ｐａｓｅ（配列番号３のヌクレオチド３３６８〜４４４１）で置き換えられている。

【0166】

一過性ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現アッセイにより、ｃｏ−Ｇ６Ｐａｓｅが野生型ヒトＧ６Ｐａｓｅの１．９倍の酵素活性を示すことが示された。さらに、組換えＡＡＶ−ＧＰＥ−ｃｏ−Ｇ６ＰＣの２つのバッチをｉｎ ｖｉｖｏ活性について評価し、ＧＳＤ−Ｉａマウスにおける組換えＡＡＶ−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣの活性と比較した。ＡＡＶ−ＧＰＥ−ｃｏ−Ｇ６ＰＣの第１のバッチは、肝臓への形質導入に関して、ＡＡＶ−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣよりも５０％効率的であった。ＡＡＶ−ＧＰＥ−ｃｏ−Ｇ６ＰＣの第２のバッチは、肝臓への形質導入に関して、組換えＡＡＶ−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣよりも２．５倍効率的であった。

【0167】

これらの結果は、Ｇ６ＰＣのコドン最適化により、Ｇ６Ｐａｓｅ−αを発現する組換えＡＡＶの肝臓形質導入能力が増大することを実証するものである。

【0168】

（実施例６）
コドン最適化されたヒトＧ６Ｐａｓｅを発現する組換えＡＡＶベクターの有効性の評価
本実施例では、ＧＳＤ−ＩａマウスにおけるｒＡＡＶ８−ＧＰＥ−Ｇ６Ｐａｓｅによって媒介される遺伝子送達の有効性とｒＡＡＶ８−ＧＰＥ−ｃｏ−Ｇ６Ｐａｓｅによって媒介される遺伝子送達の有効性を比較するための試験を記載する。

【0169】

ＧＳＤ−Ｉａマウスにおける遺伝子送達の有効性を、２種のＡＡＶベクター：１）ｒＡＡＶ８−ＧＰＥ−Ｇ６Ｐａｓｅ（約３ｋｂのヒトＧ６ＰＣプロモーター／エンハンサー（ＧＰＥ）によって指向される、ヒトＧ６Ｐａｓｅ−αを発現するｒＡＡＶ８ベクター）；および２）ｒＡＡＶ８−ＧＰＥ−ｃｏ−Ｇ６Ｐａｓｅ（ＧＰＥによって指向される、コドン最適化された（ｃｏ）ヒトＧ６Ｐａｓｅ−αを発現するｒＡＡＶ８ベクター）の２〜３個の独立したバッチを使用して比較した。図１１の結果から、４週齢の、および１２週齢の、ｒＡＡＶ８−ＧＰＥ−ｃｏ−ｈＧ６Ｐａｓｅで処置したＧＳＤ−Ｉａマウスのどちらの肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ活性も、ｒＡＡＶ８−ＧＰＥ−Ｇ６Ｐａｓｅベクターによって回復したそれぞれの活性の１．９倍であったことが示される。

【0170】

処置を受けたＧＳＤ−Ｉａマウスの全てで、コレステロール、トリグリセリド、尿酸および乳酸の正常な血清プロファイルならびに肝臓脂肪の正常なレベルが示された。ｒＡＡＶの注入を受けたマウスでは、肝臓重量は肝臓Ｇ６Ｐａｓｅ活性の回復と逆相関した。ｒＡＡＶ−ＧＰＥ−Ｇ６Ｐａｓｅで処置したマウスでは、ｒＡＡＶ−ＧＰＥ−ｃｏ−Ｇ６Ｐａｓｅで処置したマウスと比較して有意に重症度の高い肝腫大が示された（図１２）。

【0171】

機能的に、１２週齢時に、ｒＡＡＶ８−ＧＰＥ−ｃｏ−Ｇ６Ｐａｓｅで処置したＧＳＤ−Ｉａマウスでは正常な耐糖能プロファイルが示され（図１３Ａ）、２４時間の絶食にわたって正常血糖が維持された（図１３Ｂ）。

【0172】

（実施例７）
ＡＡＶベースの遺伝子療法を使用したヒトＧＳＤ−Ｉａの処置
この実施例では、Ｇ６ＰＣをコードするＡＡＶベクターをＧＳＤ−Ｉａの処置のために臨床使用する例示的な方法を記載している。

【0173】

ＧＳＤ−Ｉａと診断された患者を処置のために選択する。一般には、患者は少なくとも１８歳であり、免疫調節に前曝露したことがあってもよくまたはなくてもよい。患者に、本明細書に開示されているＡＡＶ−ＧＰＥ−Ｇ６ＰＣまたはＡＡＶ−ＧＰＥ−ｃｏ−Ｇ６ＰＣなどの、Ｇ６ＰＣを発現する組換えＡＡＶを治療有効量で投与する。組換えＡＡＶは、静脈内に投与することができる。適切な治療量は、医師が選択することができる。いくつかの場合には、治療有効用量は、１×１０^１１〜１×１０^１４ウイルス粒子（ｖｐ）／ｋｇの範囲、例えば、約１×１０^１２ｖｐ／ｋｇなどである。ほとんどの場合、単回用量を患者に投与する。免疫調節の非存在下では、患者はｒＡＡＶの単回注入のみを許容する可能性がある。対象が免疫調節に前曝露したことがある場合、２またはそれ超の用量を投与することができる。処置の有効性を決定するために対象の健康を経時的にモニターすることができる。

【0174】

開示されている発明の原理を適用することができる多くの可能性のある実施形態を考慮して、例示されている実施形態は単に本発明の好ましい例であり、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではないことが理解されるべきである。むしろ、本発明の範囲は、以下の請求項によって定義される。したがって、これらの請求項の範囲および精神の範囲内に入る発明の全てを特許請求する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]