特許 6652693 ブロッキングオリゴヌクレオチドを用いたＤＮＡ増幅の方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6652693

(24)【登録日】2020年1月28日

(45)【発行日】2020年2月26日

(54)【発明の名称】ブロッキングオリゴヌクレオチドを用いたＤＮＡ増幅の方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6858 20180101AFI20200217BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20200217BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20200217BHJP

   C12Q 1/6876 20180101ALI20200217BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/6858

   C12N15/09ZNA

   C12Q1/686

   C12Q1/6876

【請求項の数】15

【全頁数】21

(21)【出願番号】特願2016-509503(P2016-509503)

(86)(22)【出願日】2014年4月29日

(65)【公表番号】特表2016-516432(P2016-516432A)

(43)【公表日】2016年6月9日

(86)【国際出願番号】EP2014058685

(87)【国際公開番号】WO2014177540

(87)【国際公開日】20141106

【審査請求日】2017年2月9日

【審判番号】不服2018-13913(P2018-13913/J1)

【審判請求日】2018年10月19日

(31)【優先権主張番号】13305566.5

(32)【優先日】2013年4月29日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】507214038

【氏名又は名称】キアゲン ゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】ビリア， オリビエ

【合議体】

【審判長】 長井 啓子

【審判官】 澤田 浩平

【審判官】 天野 貴子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００５−１２７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００４−２３６６５５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Ｊ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．（２０１１），Ｖｏｌ．１３，Ｎｏ．６，ｐ．６５７−６６８

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

C12N15/00-15/90,C12Q1/00-3/00

ＣＡＰＬＵＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

核酸試料由来の標的ＤＮＡ配列を選択的に増幅するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
ａ．少なくとも１つの標的変異部位において参照ＤＮＡ配列とは異なる少なくとも１つの標的ＤＮＡ配列を含むことが疑われる核酸試料に、
ｉ）前記標的変異部位を取り囲む前記参照ＤＮＡ配列の一部分と完全に相補的である、フォワードプライマーオリゴヌクレオチドおよびリバースプライマーオリゴヌクレオチド、およびｉｉ）前記プライマーオリゴヌクレオチドのうちの１つと競合するように設計され、ポリメラーゼによって伸長できないように改変された、ブロッキングオリゴヌクレオチド
を添加して、反応混合物を形成するステップ；ならびに
ｂ．ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅に前記反応混合物を供するステップであって、それによって、前記プライマーオリゴヌクレオチドが伸長され、前記標的ＤＮＡ配列を選択的に増幅する、ステップ
を含み、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、前記標的変異部位を含む前記参照ＤＮＡ配列の一部分と相補的であるが、前記標的変異部位の外側に前記参照ＤＮＡ配列との少なくとも１つのミスマッチを含むことを特徴とする、方法。

【請求項2】

前記標的変異部位が、１つもしくはいくつかのヌクレオチドの置換、１つもしくはいくつかのヌクレオチドの欠失、または１つもしくはいくつかのヌクレオチドの挿入を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記標的変異部位が、単一ヌクレオチド置換を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記ブロッキングオリゴヌクレオチド中の前記ミスマッチが、前記標的変異部位の上流、即ち５’領域に位置する、請求項１から３のいずれかに記載の方法。

【請求項5】

前記ブロッキングオリゴヌクレオチドの３’末端が、ポリメラーゼによる伸長を阻害するように改変される、請求項１から４のいずれかに記載の方法。

【請求項6】

前記ブロッキングオリゴヌクレオチドの３’末端が、Ｃ３スペーサー、Ｃ６アミンまたはホスフェート基を含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸またはロックト核酸のうちの１つである、請求項１から６のいずれかに記載の方法。

【請求項8】

前記ブロッキングオリゴヌクレオチド配列が、それが競合する前記プライマーオリゴヌクレオチドより高い融解温度（Ｔｍ）を有するように設計され、かつ／または高い濃度で添加される、請求項１から７のいずれかに記載の方法。

【請求項9】

前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、それが競合する前記プライマーオリゴヌクレオチドの濃度より少なくとも４または５倍高い濃度で添加される、請求項１から８のいずれかに記載の方法。

【請求項10】

前記反応混合物が、核酸検出色素をさらに含む、請求項１から９のいずれかに記載の方法。

【請求項11】

前記反応混合物が、プローブ、好ましくは標識されたプローブをさらに含む、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。

【請求項12】

前記プローブが加水分解プローブである、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記ＰＣＲが定量的ＰＣＲである、請求項１０から１２のいずれかに記載の方法。

【請求項14】

核酸試料において標的変異を検出および／または決定するための方法であって、請求項１から１３のいずれかに記載の増幅方法に、少なくとも１つの標的変異部位において参照ＤＮＡ配列とは異なる少なくとも１つの標的ＤＮＡ配列を含むことが疑われる核酸試料を供するステップ、ならびに増幅された前記標的ＤＮＡ配列の前記標的変異を検出および／または決定するステップを含む、方法。

【請求項15】

ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＨＲ−融解、ジデオキシシークエンシング、単一分子シークエンシング、パイロシークエンシング、第２世代ハイスループットシークエンシング、ＳＳＣＰ、ＲＦＬＰ、ｄＨＰＬＣ、デジタルＰＣＲ、ＡＲＭＳ−ＰＣＲおよび定量的ＰＣＲからなる群から選択される方法のうちの１つまたは複数を使用することによって、増幅された前記標的ＤＮＡ配列の前記標的変異を決定するステップを含む、請求項１４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、核酸試料中のバリアント標的配列、例えば変異の増幅、富化および／または検出に対する改善に関する。

【背景技術】

【0002】

遺伝学的分析において一般に遭遇する状況は、大過剰の非バリアント配列（「参照配列」）の存在下で、低いパーセントのバリアントＤＮＡ配列（「標的配列」）を同定する必要を伴う。一例として、過剰量の正常対立遺伝子の中の微量の疾患関連変異体対立遺伝子の高感度で確信的な検出が、早期または確証的診断、治療決定、疾患モニタリングおよび予後層別化にとって重要になっている。しかし、高い感度と使用の信頼性および実用性とのバランスをとることは、未だ課題のままである。

【0003】

堅固な標準的な方法であるＳａｎｇｅｒシークエンシングは、正常対立遺伝子のバックグラウンドにおいておよそ１０〜２０％の変異体対立遺伝子を検出できるにすぎないが、他のより高感度のＰＣＲベースのアッセイ、例えば、制限断片長多型、増幅不応性変異系（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）ＰＣＲ（ＡＲＭＳ−ＰＣＲ）、変性高速液体クロマトグラフィーおよびリアルタイムＰＣＲは、さらに限定され得る。最も広く使用される方法である増幅不応性変異系ＰＣＲは、ＰＣＲプライマーが、単一のヌクレオチド残基が異なる鋳型の間を識別するように設計される、増幅戦略である。この方法は単純かつ時間効率が良いが、配列特異的であり、検出すべき変異を事前に知る必要があり、しばしば深刻な偽陽性結果を生じる。

【0004】

以前の方法の本質的な欠点を克服することを目的とした新たな分子技術を開発することが試みられてきた。変異体対立遺伝子の非破壊的な選択および富化を可能にするＰＣＲ段階の革新が特に目的とされてきたが、それは、これが、標準的なシークエンシング分析などの下流のアッセイの感度および信用性を改善できるからである。これらの最近の富化ＰＣＲ技術には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）（Ｓｕｎら、２００２年）またはロックト核酸（ＬＮＡ）（Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚら、２００５年）およびより低い変性温度のＰＣＲでの同時増幅（Ｌｉら、２００８年）によって媒介されるＰＣＲクランピングが含まれる。各々の技術は、費用、利用可能性または富化効率に関して、それ自体の強みおよび制限を有する。

【0005】

Ｌｅｅら、２０１１年において、著者らは、３’改変オリゴヌクレオチド（ＭＥＭＯ）を用いた、変異体富化と呼ばれる単純で実用的な富化技術を記載している。この技術の概念は、ＰＮＡ／ＬＮＡ媒介性のＰＣＲクランピングの概念と類似しているが、ＰＮＡまたはＬＮＡは、より安価で設計が容易な３’改変オリゴヌクレオチドによって置き換えられている。簡潔に述べると、２つのジェネリックプライマーおよび１つのブロッキングプライマーが、ＰＣＲ反応混合物を構成する。ＰＣＲがこのブロッキングプライマーを介してＤＮＡを伸長させることができないように、このブロッキングプライマーの３’末端に、伸長阻害化合物、例えばＣ３スペーサー、Ｃ６アミンまたはホスフェートが結合される。このブロッキングプライマーは、標的変異部位を包含し、野生型配列と相補的である。２つのジェネリックプライマーのうちの１つは、ブロッキングプライマーと、標的変異部位に隣接する数塩基が重複し、従って、ブロッキングプライマーと競合する。それが競合するジェネリックプライマーより高い融解温度を有し、反応混合物中でより高い濃度で使用されるように設計された、ブロッキングプライマーのＤＮＡ結合は、野生型配列に関して支配的であるが、変異体配列に対するその親和性は、ミスマッチに起因して顕著に低減される。ブロッキングプライマーの競合の喪失は、ジェネリックプライマー対による変異体配列の選択的増幅を可能にする。

【0006】

このＭＥＭＯ−ＰＣＲは、甲状腺結節における稀な３ｂｐ ＢＲＡＦ遺伝子欠失を同定するために使用された（Ｊａｎｇら、２０１２年）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｓｕｎ Ｘ．， Ｈｕｎｇ Ｋ．， Ｗｕ Ｌ．， Ｓｉｄｒａｎｓｋｙ Ｄ．， Ｇｕｏ Ｂ． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｅｘｃｅｓｓ ａｍｏｕｎｔｓ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ＤＮＡ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００２；２０：１８６−１８９．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

しかし、特にバリアント標的配列がヌクレオチド置換（複数可）を保有する場合、改善された特異性を有する検出の方法が未だ必要とされている。実際、かかる配列は、これまであまり識別されてこなかった。

【課題を解決するための手段】

【0009】

発明の概要
本発明はここで、特に、限定されないが、過剰量の非バリアントまたは野生型（ＷＴ）配列（「参照配列」）の存在下でバリアントＤＮＡ配列（「標的配列」）を検出するための改善された方法を提供する。

【0010】

本発明の方法は、核酸試料由来の標的ＤＮＡ配列を選択的に増幅するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であり、この方法は、少なくとも１つの所定の標的変異部位において参照ＤＮＡ配列とは異なる少なくとも１つの標的ＤＮＡ配列を含むことが疑われる核酸試料のＰＣＲ増幅を実行するステップを含み、前記方法は、標的変異部位の外側の少なくとも１つのミスマッチを除いて、この標的変異部位を含む参照ＤＮＡ配列の一部分と相補的なブロッキングオリゴヌクレオチドを使用する。

【0011】

より具体的には、本発明は、核酸試料由来の標的ＤＮＡ配列を選択的に増幅するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供し、この方法は、
ａ．少なくとも１つの標的変異部位において参照ＤＮＡ配列とは異なる少なくとも１つの標的ＤＮＡ配列を含むことが疑われる核酸試料を提供するステップ；
ｂ．ｉ）この標的変異部位を取り囲む参照ＤＮＡ配列の一部分と完全に相補的である、フォワードプライマーオリゴヌクレオチドおよびリバースプライマーオリゴヌクレオチド、
ｉｉ）これらのプライマーオリゴヌクレオチドのうちの１つと競合するように設計され、ポリメラーゼによって伸長できないように改変された、ブロッキングオリゴヌクレオチド
を添加して、反応混合物を形成するステップ；
ｃ．ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅にこの反応混合物を供するステップであって、それによって、プライマーオリゴヌクレオチドが伸長され、前記標的ＤＮＡ配列を増幅する、ステップ；
を含み、前記方法は、ブロッキングオリゴヌクレオチドが、標的変異部位を含む参照ＤＮＡ配列の一部分と相補的であるが、この標的変異部位の外側に参照ＤＮＡ配列との少なくとも１つのミスマッチを含むことを特徴とする。

【0012】

この標的変異は、１つもしくはいくつかのヌクレオチドの置換、１つもしくはいくつかのヌクレオチドの欠失、または１つもしくはいくつかのヌクレオチドの挿入を含み得る。最も好ましくは、これは、単一ヌクレオチド置換であるまたは単一ヌクレオチド置換を含む。

【0013】

この方法は、公知のＰＣＲクランピング方法の改善である。

【0014】

本発明によって、ブロッキングオリゴヌクレオチドにおいて配列ミスマッチを追加することは、この標的配列の検出の特異性を顕著に改善することが見出された。特に、配列ミスマッチの追加は、ヌクレオチド置換（複数可）を特徴とするバリアント配列の識別を劇的に改善する。

【0015】

本発明の方法は、例えば診断目的のために、参照配列を含む核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ）試料由来の標的配列を含む核酸試料を区別するために特に有用である。

【0016】

本発明は、核酸試料において標的変異を検出および／決定するための方法をさらに提供し、この方法は、本明細書に記載される増幅方法に、少なくとも１つの標的変異部位において参照ＤＮＡ配列とは異なる少なくとも１つの標的ＤＮＡ配列を含むことが疑われる核酸試料を供するステップ、ならびに増幅された標的ＤＮＡ配列の標的変異を検出および／決定するステップを含む。

【0017】

従って、この方法は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、高解像度融解（ＨＲ−融解）、ジデオキシシークエンシング、単一分子シークエンシング、パイロシークエンシング、第２世代ハイスループットシークエンシング、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、変性高速液体クロマトグラフィー（ｄＨＰＬＣ）、デジタルＰＣＲ、ＡＲＭＳ−ＰＣＲおよび定量的ＰＣＲからなる群から選択される方法のうちの１つまたは複数を使用することによって、増幅された標的ＤＮＡ配列の標的変異を決定するステップを含み得る。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
核酸試料由来の標的ＤＮＡ配列を選択的に増幅するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
ａ．少なくとも１つの標的変異部位において参照ＤＮＡ配列とは異なる少なくとも１つの標的ＤＮＡ配列を含むことが疑われる核酸試料を提供するステップ；
ｂ．ｉ）前記標的変異部位を取り囲む前記参照ＤＮＡ配列の一部分と完全に相補的である、フォワードプライマーオリゴヌクレオチドおよびリバースプライマーオリゴヌクレオチド、
ｉｉ）前記プライマーオリゴヌクレオチドのうちの１つと競合するように設計され、ポリメラーゼによって伸長できないように改変された、ブロッキングオリゴヌクレオチド
を添加して、反応混合物を形成するステップ；
ｃ．ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅に前記反応混合物を供するステップであって、それによって、前記プライマーオリゴヌクレオチドが伸長され、前記標的ＤＮＡ配列を選択的に増幅する、ステップ
を含み、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、前記標的変異部位を含む前記参照ＤＮＡ配列の一部分と相補的であるが、前記標的変異部位の外側に前記参照ＤＮＡ配列との少なくとも１つのミスマッチを含むことを特徴とする、方法。
（項目２）
前記標的変異部位が、１つもしくはいくつかのヌクレオチドの置換、１つもしくはいくつかのヌクレオチドの欠失、または１つもしくはいくつかのヌクレオチドの挿入を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記標的変異部位が、単一ヌクレオチド置換を含む、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記ブロッキングオリゴヌクレオチド中の前記ミスマッチが、前記標的変異部位の上流、即ち５’領域に位置する、項目１から３のいずれかに記載の方法。
（項目５）
前記ブロッキングオリゴヌクレオチドの３’末端が、ポリメラーゼによる伸長を阻害するように改変される、項目１から４のいずれかに記載の方法。
（項目６）
前記ブロッキングオリゴヌクレオチドの３’末端が、Ｃ３スペーサー、Ｃ６アミンまたはホスフェート基を含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸またはロックト核酸のうちの１つである、項目１から６のいずれかに記載の方法。
（項目８）
前記ブロッキングオリゴヌクレオチド配列が、それが競合する前記プライマーオリゴヌクレオチドより高い融解温度（Ｔｍ）を有するように設計され、かつ／または高い濃度で添加される、項目１から７のいずれかに記載の方法。
（項目９）
前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、それが競合する前記プライマーオリゴヌクレオチドの濃度より少なくとも４または５倍高い濃度で添加される、項目１から８のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
前記反応混合物が、核酸検出色素をさらに含む、項目１から９のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
前記反応混合物が、プローブ、好ましくは標識されたプローブをさらに含む、項目１から１０のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
前記プローブが加水分解プローブである、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記ＰＣＲが定量的ＰＣＲである、項目１０から１２のいずれかに記載の方法。
（項目１４）
核酸試料において標的変異を検出および／または決定するための方法であって、項目１から１３のいずれかに記載の増幅方法に、少なくとも１つの標的変異部位において参照ＤＮＡ配列とは異なる少なくとも１つの標的ＤＮＡ配列を含むことが疑われる核酸試料を供するステップ、ならびに増幅された前記標的ＤＮＡ配列の前記標的変異を検出および／または決定するステップを含む、方法。
（項目１５）
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＨＲ−融解、ジデオキシシークエンシング、単一分子シークエンシング、パイロシークエンシング、第２世代ハイスループットシークエンシング、ＳＳＣＰ、ＲＦＬＰ、ｄＨＰＬＣ、デジタルＰＣＲ、ＡＲＭＳ−ＰＣＲおよび定量的ＰＣＲからなる群から選択される方法のうちの１つまたは複数を使用することによって、増幅された前記標的ＤＮＡ配列の前記標的変異を決定するステップを含む、項目１４に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】図１は、配列ミスマッチを含む３’改変オリゴブロックを使用する本発明の方法の略図を示す図である。野生型配列の存在下では、このオリゴブロック（１）が、その標的配列とハイブリダイズして、ＰＣＲ増幅阻害をもたらす。任意の配列バリエーション（複数可）の存在下では、競合プライマー（２）が、標的配列に優先的に結合し、例えば加水分解プローブ（３）からの蛍光発光によってモニタリングされ得るバリアント配列の特異的増幅をもたらす。

【0019】

【図2】図２は、ＩＤＨ１ Ｒ１３２変異の配列および位置を示す図である。ＩＤＨ１遺伝子の野生型配列中の下線は、バリアント配列において他のヌクレオチドによって置換され得る２つのヌクレオチド（Ｒ１３２コドン内）である。各バリアント配列について、対応する置換されたヌクレオチドが太字で示される。

【発明を実施するための形態】

【0020】

定義
本明細書で使用する場合、用語、標的配列を「増幅する」とは、標的配列の量を増加させることを指す。用語「選択的に増幅する」とは、その標的配列のみ（または実質的にそれのみ）が増幅されることを意味する。用語「富化する」とは、より具体的に、試料中の対応する参照配列に対する標的配列の比率を増加させることを意味する。例えば、標的配列対参照配列の比率が、最初に試料中で５パーセント〜９５パーセントである場合、この標的配列は、７０パーセントの標的配列対３０パーセントの参照配列の比率を生じるように、増幅反応において優先的に増幅され得る。従って、参照配列に対する標的配列の１４倍の富化があり得る。

【0021】

本明細書で使用する場合、用語「標的配列」とは、検出および増幅される目的の配列を指す。この標的配列は、典型的には、対応する参照配列に対して少なくとも５０パーセント相同、好ましくは少なくとも６０％相同、なお好ましくは少なくとも７０％相同であるが、参照配列とは少なくとも１つのヌクレオチドが異なるべきである。標的配列は、参照配列に対して使用されるのと同じ対のプライマーを用いるＰＣＲを介して増幅可能である。特定の一実施形態では、この標的配列は、対応する参照配列よりも、核酸試料においてあまり普遍的でない。この標的配列は、好ましくは、試料中の参照配列＋標的配列の総量の５０パーセント未満を構成する。この標的配列は、変異体対立遺伝子であり得る。例えば、試料（例えば、血液試料）は、多数の正常細胞および僅かながん性細胞を含み得る。これらの正常細胞は、非変異体または野生型の対立遺伝子を含むが、少数のがん性細胞は、体細胞変異を含む。この場合、変異体が標的配列であり、野生型配列が参照配列である。

【0022】

本明細書で使用する場合、用語「参照配列」とは、標的配列に対するのと同じプライマー対を用いて増幅され得るが、その増幅が所望されない配列を意味する。かかる配列は、非バリアントまたは野生型の配列を包含する。好ましくは、この「参照配列」は、完全に、または少なくとも部分的に、既知である。特定の一実施形態では、用語「参照配列」とは、対応する標的配列よりも、核酸試料においてより普遍的でない核酸を指す。この参照配列は、好ましくは、試料中の合計参照配列＋標的配列の５０パーセント超を構成する。好ましくは、この参照配列は、標的配列よりも、１０×、１５×、２０×、２５×、３０×、３５×、４０×、４５×、５０×、６０×、７０×、８０×、９０×、１００×、１５０×、２００×またはそれ超のＲＮＡおよび／またはＤＮＡレベルで発現される。

【0023】

本明細書で使用する場合、用語「野生型」とは、集団中の特定の遺伝子に関して最も一般的なポリヌクレオチド配列または対立遺伝子を指す。一般に、野生型対立遺伝子は、正常細胞から得られる。

【0024】

本明細書で使用する場合、用語「標的変異」とは、核酸配列中のヌクレオチド変化（即ち、単一のまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失または挿入）を指す。変異を有する核酸は、対応する野生型ポリヌクレオチド配列のものとは配列が異なる核酸配列（変異体対立遺伝子）を有する。本発明は、体細胞変異および多型に広く関する。本発明の方法は、１〜１０のヌクレオチド位置において変化を含む変異体対立遺伝子を選択的に増幅または富化することにおいて特に有用であるが、より多くの数の配列変化であっても有用である。変異体対立遺伝子は、典型的には、罹患組織または罹患細胞から得られ、疾患状態と関連している。用語「標的変異部位」とは、標的変異を含むまたは標的変異を含むことが疑われるかもしくは標的変異を含む可能性が高いＤＮＡ配列の領域を意味する。標的変異自体の性質または正確な場所は未知であり得るが、この標的変異部位は、規定または予め決定される。一般に、これは、標的変異を含む約５〜約３０ヌクレオチドの領域である。特定の一実施形態では、この変異は、その正確な位置が既知である単一のヌクレオチド置換であり得、その結果、この標的変異部位は、変異したヌクレオチド自体の位置であり得る。

【0025】

本明細書で使用する場合、用語「融解温度」または「Ｔ_ｍ」とは、ポリヌクレオチドがその相補的配列から解離する温度を指す。一般に、このＴ_ｍは、二本鎖核酸分子中のワトソン−クリック塩基対の半分が、破壊または解離される（即ち、「融解される」）が、ワトソン−クリック塩基対のもう半分が、二本鎖高次構造においてインタクトなままである温度として定義され得る。言い換えると、このＴ_ｍは、２つの相補的配列のヌクレオチドの５０パーセントがアニーリングし（二本鎖）、ヌクレオチドの５０パーセントが変性している（一本鎖）温度として定義される。従って、Ｔ_ｍは、二本鎖核酸分子から一本鎖核酸分子への移行（または逆に、一本鎖核酸分子から二本鎖核酸分子への移行）における中点を定義する。このＴ_ｍは、いくつかの方法によって、例えば、Ｗｅｔｍｕｒ、１９９１年による最近接計算（ｎｅａｒｅｓｔ−ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ）によって、ならびにＯｌｉｇｏ（商標）Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎを含む市販のプログラム、およびインターネット上で利用可能なプログラムによって、概算され得る。あるいは、このＴ_ｍは、実際の実験を介して決定され得る。例えば、二本鎖ＤＮＡ結合性色素またはインターカレート性色素、例えばエチジウムブロマイドまたはＳＹＢＲ−ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）が、核酸の実際のＴ_ｍを決定するために、融解曲線アッセイにおいて使用され得る。核酸のＴ_ｍを決定するためのさらなる方法は、当該分野で周知である。

【0026】

本明細書で使用する場合、「相同性」とは、２つのポリマー性分子、例えば、２つのポリヌクレオチド間のサブユニット配列類似性を指す。パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適切なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７年およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０年中に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して公に入手可能である。

【0027】

核酸試料
本明細書で使用する場合、「試料」とは、目的の核酸（標的および／もしくは参照配列）を含むもしくは含むと推測される任意の物質、またはそれ自体、目的の標的核酸を含むもしくは含むと推測される核酸を指す。従って、用語「試料」には、例えば、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、滑液、尿、涙液、糞便、皮膚、呼吸器、小腸および泌尿生殖器の外分泌物、唾液、血球、腫瘍、臓器、組織、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物構成成分の試料、天然単離体（飲用水、海水、固形材料など）、微生物検体、および核酸トレーサー分子で「マークされた」対象または検体が含まれるがこれらに限定されない、核酸、細胞、生物、組織、体液または物質の試料が含まれる。ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織が包含される。

【0028】

この標的（および参照配列）は、ゲノムＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ウイルスＤＮＡ、哺乳動物ＤＮＡ、胎仔ＤＮＡまたは細菌ＤＮＡを含む種々の供給源から得られ得る。一実施形態では、本発明の方法において利用される核酸試料は、一般に、ゲノムＤＮＡ、例えば、標的および参照配列を有するゲノムＤＮＡを含む。ゲノムＤＮＡは、周知の方法に従って、例えば、市販のキット（例えば、ＦＦＰＥまたは血液からの抽出のための、ＱｉａｇｅｎによるＱＩＡｍｐ ＤＮＡ抽出キット）を使用することによって、血液、組織または細胞から単離され得る。別の一実施形態では、この核酸供給源は、ＲＮＡであり得、そこから、ｃＤＮＡが、標準的な方法によって生成される。

【0029】

特定の一実施形態では、本発明の方法の核酸試料は、核酸増幅反応において予め増幅された標的および／または参照配列を含む。当業者は、核酸を増幅するための多くの方法が利用可能であることを理解する。

【0030】

この参照配列は一般に野生型対立遺伝子であり、標的配列は変異体対立遺伝子であるが、逆もまた真であり得る。この変異体対立遺伝子は、任意の１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、挿入または変更を含み得る。一部の実施形態では、この変異体対立遺伝子は、体細胞変異である。

【0031】

反応混合物
本発明の方法は、ＰＣＲ反応の間に増幅産物を形成するように、標的配列および参照配列の対向する鎖にアニーリングする２つのプライマーを使用する。そのアンプリコンサイズは、典型的には、約６０〜約５００ｂｐの間、好ましくは約８０〜約２５０ｂｐの間である。

【0032】

これらのプライマーオリゴヌクレオチドは、一般に、１０〜４０ヌクレオチド、好ましくは１０〜３０ヌクレオチド、なお好ましくは１５〜２５ヌクレオチドを含む。これらのプライマーオリゴヌクレオチドは、好ましくは、５６〜６４℃周囲のＴｍを有する。これらのプライマーオリゴヌクレオチドは、参照配列および標的配列の一部分と１００％相補的である。一般に、これらのプライマーは、３’末端または５’末端において改変されない。

【0033】

これらのプライマーオリゴヌクレオチドのうちの１つは、本発明では「競合性」プライマーまたは「競合」プライマーであり、即ち、参照配列または標的配列への結合について、ブロッキングオリゴヌクレオチドと競合することを意図する。従って、競合性プライマーは、少なくとも部分的に、以下に説明するように、ブロッキングオリゴヌクレオチド配列と重複する。

【0034】

本明細書で使用する場合、「ブロッキングオリゴヌクレオチド」は、操作された一本鎖核酸配列である。このブロッキングオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸またはロックト核酸のうちの１つであり得る。好ましくは、これは、ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このブロッキングオリゴヌクレオチドは、一般に、１０〜４０ヌクレオチド、好ましくは１５〜３０ヌクレオチドを含む。

【0035】

このブロッキングオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼによって伸長できないように改変される。

【0036】

好ましい一実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドの３’末端は、ポリメラーゼによる伸長を阻害するように改変される。

【0037】

かかるブロッキング配列は、任意の公知の方法によって合成され得る。最初に、参照ブロッキング配列が、配列の３’末端の改変を可能にする標準的なオリゴヌクレオチド合成方法を使用する直接的合成によって作製され得る。この３’末端は、ホスフェート基、アミノ基、ジデオキシヌクレオチド、または５’から３’へのポリメラーゼ伸長をブロックする任意の他の部分を含み得る。あるいは、この参照ブロッキング配列は、最終産物として一本鎖ＤＮＡを生成するＰＣＲ反応の間のポリメラーゼ合成によって作製され得る。

【0038】

ブロッキングオリゴヌクレオチドの３’末端をブロックすることは、当業者に周知のいくつかの方法において達成され得る。例えば、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を用いた反応が、一本鎖参照ブロッキング配列の末端に単一のｄｄＮＴＰを付加するために、溶液中でジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）の存在下で使用され得る。ｄｄＮＴＰは、ポリメラーゼ伸長をブロックするように機能する。あるいは、ブロッキング配列の３’末端と相補的なオリゴヌクレオチド鋳型が、一過的な二本鎖構造を提供するために使用され得る。次いで、ポリメラーゼが、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドと対向する参照ブロッキング配列の３’末端において単一のｄｄＮＴＰを挿入するために使用され得る。

【0039】

例えば、ブロッキングオリゴヌクレオチドの３’末端は、Ｃ３スペーサー、Ｃ６アミンまたはホスフェート基を含み得る。

【0040】

この「Ｃ３スペーサー」改変は、オリゴヌクレオチドの３’末端に３炭素スペーサーを付加し、例えば、

【化1】

になる。

【0041】

Ｃ６アミン改変は、オリゴヌクレオチドの３’末端においてアミン官能性を取り込む。

【0042】

このブロッキングオリゴヌクレオチドは、プライマーオリゴヌクレオチドのうちの１つと競合するように設計される。

【0043】

従って、ブロッキングオリゴヌクレオチドの配列は、プライマーオリゴヌクレオチドのうちの１つの配列と重複する。この重複（即ち、競合プライマーとブロッキングオリゴヌクレオチドとの間の共通配列）は、ブロッキングオリゴヌクレオチドの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは８５％を含み得る、またはブロッキングオリゴヌクレオチドの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは８５％からなり得る。あるいは、この重複は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４ヌクレオチドを含み得る、または少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４ヌクレオチドからなり得る。この重複は、標的変異部位を含まない。

【0044】

このブロッキングオリゴヌクレオチド配列は、少なくとも部分的に、それが競合するプライマーオリゴヌクレオチドと重複するが、それが競合するプライマーオリゴヌクレオチドより高い融解温度（Ｔｍ）（例えば、約１〜約１５℃高い、好ましくは約１〜約１０℃高い）を有するように設計され、かつ／または高い濃度で添加される。

【0045】

例えば、このブロッキングオリゴヌクレオチドは、それが競合する前記プライマーオリゴヌクレオチドの濃度より少なくとも２倍、好ましくは少なくとも３倍、少なくとも４倍または少なくとも５倍高い濃度で添加される。

【0046】

このブロッキングオリゴヌクレオチドは、参照ＤＮＡ配列の一部分と相補的であり、この一部分は、標的変異部位に対応する（非変異または野生型）ヌクレオチド（複数可）を含む。この参照ＤＮＡ配列の前記一部分は、標的変異部位を除いて、標的ＤＮＡ配列の対応する一部分と同一である。

【0047】

好ましい一実施形態では、このブロッキングオリゴヌクレオチドは、その配列の中心部分が参照または標的ＤＮＡ配列の標的変異部位に結合するように設計される。

【0048】

競合性プライマーは、標的変異部位に隣接するいくつかの塩基がブロッキングオリゴヌクレオチドと重複する。

【0049】

本発明によれば、このブロッキングオリゴヌクレオチドはさらに、参照または標的ＤＮＡ配列上の対応するヌクレオチドと相補的でない少なくとも１つのヌクレオチドを含む。当然、前記ヌクレオチドは、標的変異部位には位置しないことを理解すべきである。

【0050】

参照または標的ＤＮＡ配列上の対応するヌクレオチドと相補的でないヌクレオチドは、好ましくは、ＧまたはＣヌクレオチドではなく、ＡまたはＴヌクレオチドである。

【0051】

ブロッキングオリゴヌクレオチド中のこのミスマッチ（即ち、参照配列上の対応するヌクレオチド（複数可）と相補的でない前記ヌクレオチド（複数可））は、好ましくは、標的変異部位の上流に位置する。

【0052】

なお好ましくは、このミスマッチは、競合性プライマーと重複するブロッキングオリゴヌクレオチドの部分中に位置し得る。

【0053】

このブロッキングオリゴヌクレオチドの結合は、競合プライマーの結合に対して、参照（または野生型）配列に関して支配的である。従って、参照配列のＰＣＲ伸長は生じ得ない。

【0054】

標的ＤＮＡ配列中の変異の存在下で、変異体またはバリアント配列に対するこのブロッキングオリゴヌクレオチドの親和性は、ミスマッチに起因して顕著に減少され、ＰＣＲ伸長を可能にする競合プライマーの優先的結合が存在する。従って、プライマー対による標的（変異体またはバリアント）配列の選択的増幅が存在する（図１を参照のこと）。

【0055】

いずれの機構によっても関連付けられることなく、本発明者らは、かかるミスマッチが、ブロッキングオリゴヌクレオチドの結合を不安定化し、これが、標的配列に対する競合性プライマーの優先的な結合、従って、標的配列のより識別性の高い増幅を生じると考えている。

【0056】

この反応混合物は、典型的には、酵素、塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）または増幅もしくは検出を実行するのに有用なオリゴヌクレオチドなどのさらなる成分を含む。

【0057】

特に、この反応混合物は、ヌクレオシド三リン酸の重合を触媒する酵素である核酸ポリメラーゼを含み得る。一般に、この酵素は、標的配列にアニーリングしたプライマーの３’末端において合成を開始し、鋳型に沿って５’方向で進行する。公知のＤＮＡポリメラーゼには、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼおよびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。用語「核酸ポリメラーゼ」は、ＲＮＡポリメラーゼもまた包含する。核酸鋳型がＲＮＡである場合、「核酸ポリメラーゼ」とは、ＲＮＡ依存的重合活性、例えば逆転写酵素を指す。

【0058】

例えば、前記反応混合物は、核酸検出色素、例えば蛍光色素（例えば、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ Ｄｙｅｓ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ、ＯｌｉＧｒｅｅｎおよびシアニン色素、例えばＹＯ−ＹＯ、エチジウムブロマイドならびにＳｙｂｒＧｒｅｅｎ）をさらに含み得る。

【0059】

好ましい一実施形態では、前記反応混合物は、プローブ、好ましくは標識されたプローブをさらに含み得る。

【0060】

このプローブは、有利には、プライマーまたはブロッキングオリゴヌクレオチドと重複しない。

【0061】

これは、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に特に有用である。

【0062】

このプローブは、フォワード（５’）ＰＣＲプライマー結合部位とリバース（３’）ＰＣＲプライマー結合部位との間に見出される標的ＤＮＡ上の配列にアニーリングするオリゴヌクレオチドである。プローブのＴｍは、一般に、プライマーのＴｍより高い。加水分解プローブ、例えばＴａｑｍａｎプローブが特に有利である。かかるプローブは、ＰＣＲの伸長ステップの間にハイブリダイズした伸長不能なＤＮＡプローブを分解する、Ｔａｑポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性に依存する。このプローブは、アンプリコン内の領域にハイブリダイズするように設計され、レポーター色素およびクエンチング色素で二重標識される。このクエンチャーが近位にあると、レポーター色素の蛍光が抑制される。Ｔａｑポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性がプローブを分解すると、レポーターの蛍光は、存在する鋳型の量と比例する比率で増加する。

【0063】

好ましい一実施形態では、このプローブは、５’−レポーター色素（例えば、ＦＡＭ、６−カルボキシフルオレセイン）と、両方の色素が近位にあるかまたはプローブと結合している限りレポーター色素の発光スペクトルをクエンチする３’−クエンチャー色素（例えば、ＴＡＭＲＡ、６−カルボキシテトラメチルローダミン）とで標識され得る。このプローブは、２つのプライマー認識配列間の部位において標的鋳型にアニーリングする二重標識された蛍光発生プローブのポリメラーゼ誘導性の核酸分解的分解を含むプロセスにより、ＰＣＲアンプリコンの形成を知らせる。例えば、米国特許第６，３８７，６５２号を参照のこと。

【0064】

増幅反応
本発明に従う増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって実施される。

【0065】

その最も単純な形態では、ＰＣＲは、対向する鎖にハイブリダイズし、標的ＤＮＡ中の目的の領域に隣接する２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用する、特異的ＤＮＡ配列の酵素的合成のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法である。鋳型変性、プライマーアニーリング、およびＤＮＡポリメラーゼによるアニーリングしたプライマーの伸長を含む、反復的な一連の反応ステップは、その末端がプライマーの５’末端によって規定された特異的断片の指数関数的蓄積を生じる。

【0066】

従って、本明細書に記載されるＰＣＲは、２またはそれ超のサイクル、好ましくは１０〜５０サイクルにわたって、好ましくは反復される。

【0067】

ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡ（標的および参照配列）（少なくとも１ｆｇ；より有用には、１〜１０００ｎｇ）および少なくとも７．５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して実施される。典型的な反応混合物は以下を含む：５μｌのＤＮＡ、７．５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプライマー、１２．５μｌのＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｐｒｏｂｅ ＰＣＲ Ｋｉｔ由来の２×マスターミックスおよび２５μｌの総容量になるような脱イオン水。ＰＣＲは、プログラム可能なサーマルサイクラーを使用して実施される。

【0068】

本発明によれば、これらのプライマーは、約１００〜約５００ｎＭ、好ましくは約３００ｎＭの濃度で使用されるが、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、約１〜約５μＭ、好ましくは約２μＭの濃度で使用される。

【0069】

ＰＣＲサイクルの各ステップの長さおよび温度、ならびにサイクルの数は、実際のストリンジェンシー要求に従って調整される。アニーリングの温度およびタイミングは、プライマーが鋳型にアニーリングすると予測される効率および許容されるミスマッチの程度の両方によって決定される。プライマーアニーリング条件のストリンジェンシーを最適化する能力は、十分に当業者の知識の範囲内である。３０℃と７２℃との間のアニーリング温度が使用される。鋳型分子の最初の変性は通常、９２℃と９９℃との間で約１５秒間、好ましくは約１または４分間から約１０〜１５分間で生じ、その後、単純なＰＣＲについては、変性（９４〜９９℃で１５秒間〜１分間）、アニーリング（上で議論したように決定した温度、例えば６０℃；１５秒間〜２分間）および伸長（７２℃で１分間）からなる２０〜５０サイクル（ｑ−ＰＣＲでは、伸長およびアニーリングは、６０℃のステップで１分間にわたって同時に生じる）。必要に応じて、最終伸長ステップ（単純なＰＣＲにおいて有用）は、一般に、７２℃で約４分間実施され、その後に、４℃での不確定の（０〜２４時間）ステップが続き得る。

【0070】

本発明の増幅または富化の手順は、サーモサイクラーなどＰＣＲデバイスにおいて、またはより好ましくはリアルタイムＰＣＲデバイスにおいてリアルタイム反応条件下で、実施される。リアルタイム反応条件は、さらに、生成された場合にＰＣＲ産物を測定／検出するために、核酸検出剤（例えば、色素またはプローブ）を利用する。

【0071】

この方法のステップは、一般に、標的配列および参照配列の十分な増幅を得るために、複数サイクル反復される。一実施形態では、この方法のステップは、５〜４０サイクル、より好ましくは１０〜４０サイクル反復される。サイクルの最適な数は、当業者によって決定され得る。好ましくは、本発明の方法は、ＰＣＲデバイスにおいて、より好ましくは、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ Ｑ ５ｐｌｅｘ ＨＲＭ機械などのリアルタイム検出ＰＣＲデバイスにおいてリアルタイム反応条件下で、実施される。この実施形態では、この反応混合物は、反応の増幅産物を定量および／またはモニタリングするための核酸検出剤を含み得る。

【0072】

分析
標的配列の増幅の後には、例えば、標的配列の変異（複数可）を正確に決定するための方法による、増幅された配列の分析が続き得る。

【0073】

標的配列の増幅または富化が完了すると、試料は、さらに処理され得る、例えば、シークエンシング反応に供され得る。

【0074】

増幅された対立遺伝子は、以下を含む、当該分野で公知の種々の手順によってさらに処理され得る：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＨＲ−融解、ジデオキシシークエンシング、単一分子シークエンシング、第２世代ハイスループットシークエンシング、パイロシークエンシング、ＲＦＬＰ、デジタルＰＣＲ、ＡＲＭＳ−ＰＣＲおよび定量的ＰＣＲ。

【0075】

かかる分析方法により、増幅された標的配列の変異（複数可）の型を同定することが可能になる。

【0076】

以下の実施例は、その範囲を限定することなく、本発明を例示する。

【実施例】

【0077】

ＩＤＨ１遺伝子中の変異の検出
本明細書に記載される発明は、選択された領域中にヌクレオチドバリエーションを含むＤＮＡまたはｃＤＮＡ標的配列の選択的増幅のためのＰＣＲベースの方法である。反応混合物は、２つのジェネリックＰＣＲプライマー（「競合ＰＣＲプライマー」および「第２のＰＣＲプライマー」）ならびに特異的ブロッキングオリゴヌクレオチド（「オリゴブロック」）を含む。

【0078】

本発明は、ＩＤＨ１遺伝子中の変異の検出によって例示される。

【0079】

コドン１３２におけるＩＤＨ１変異が、グリオーマおよび血液学的悪性疾患において見出されている。変異体配列と野生型配列とは、１ヌクレオチドのみの置換が異なるので（図２を参照のこと）、野生型配列と変異配列との間の選択的識別を可能にする特異的ＰＣＲ方法が必要とされる。

【0080】

材料
本発明に従うオリゴブロック（ヌクレオチドミスマッチを有する）についての異なる設計を試験し（ＲＶＳ＿Ｒ１３２Ｂｌｃ＿ｄ５〜ＲＶＳ＿Ｒ１３２Ｂｌｃ＿ｄ８、表１）、ミスマッチなしの対応するオリゴブロック（ＲＶＳ＿Ｒ１３２Ｂｌｃ＿ｄ１〜ＲＶＳ＿Ｒ１３２Ｂｌｃ＿ｄ４、表１）と比較した。全てのオリゴブロックは、３’ホスフェート改変を含んだ。

【0081】

【表1】

【0082】

競合ＰＣＲプライマー、第２のＰＣＲプライマーおよびプローブの配列は、以下の表に示される。このプローブを、その５’末端において蛍光色素（ＦＡＭ）で、その３’末端においてクエンチャー色素（ＴＡＭＲＡ）で標識した。これらのプライマーおよびプローブを、いくつかのプライマーおよびプローブ設計から予め選択した。

【0083】

【表2-1】

【表2-2】

【0084】

ＰＣＲプライマー、オリゴブロックおよびプローブの濃度を以下に列挙する：

【化2】

【0085】

Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ Ｐｒｏｂｅ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｒｅｆ：２０４３４５）を増幅に使用し、ｑＰＣＲ反応を、以下のｑＰＣＲプログラムを使用して、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ Ｑ ５ｐｌｅｘ ＨＲＭ機械（ＱＩＡＧＥＮ）で実施した：

【表3】

【0086】

試験した各オリゴブロックについて、オリゴブロックを、競合ＰＣＲプライマー、第２のＰＣＲプライマーおよびプローブと混合した。これら全てのミックスを、ＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｈ変異またはＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｃ変異を含むプラスミドの非存在下または存在下で、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織から抽出したゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を含む試料（ＩＤＨ１ ＷＴ）に対して試験した。３つの試料を試験した：１００％ＷＴ試料（いずれのＩＤＨ１変異についても陰性）、１０％の変異レベルを有するＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｈ試料、および３０％の変異レベルを有するＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｃ試料。ｑＰＣＲ反応当たりのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）インプットは、２５μｌの最終ＰＣＲ容量につき２５ｎｇであった。

【0087】

結果
１．ミスマッチなしのオリゴブロックと比較した、本発明に従うオリゴブロックを使用して得られた性能
以下の表は、ミスマッチなしのオリゴブロックと比較した、本発明に従うオリゴブロックで得られた結果を示す。

【表4】

【0088】

最良の結果は、ＷＴ試料についての最も高いＣｔと変異体試料についての最も低いＣｔとの組合せにおいて得られる。表４で見られるように、オリゴブロックにおけるヌクレオチドミスマッチの追加により、ミスマッチなしの対応するオリゴブロックと比較して、変異体試料についてのより低いＣｔ値を得ることが可能である。例えば、本発明のｄ７オリゴブロックを用いてＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｃ変異体について得られたＣｔは、ｄ３オリゴブロックを用いた場合の４０．７３に対して、２８．７４であった。従って、オリゴブロックにおけるヌクレオチドミスマッチの追加は、ＷＴ試料と変異体試料との間のより良い識別を可能にする。

【0089】

２．本発明に従うオリゴブロックを使用した感度試験結果
次に、検出限界（ＬｏＤ；ＮＣＣＬＳガイドラインＣＬＳＩ ＥＰ１７−Ａ２）決定試験を、ｄ７オリゴブロックを使用して実施した。

【0090】

２０％、１５％、１０％、５％および２％の変異体レベルを有する６つのＩＤＨ１変異の連続希釈物が、以前に記載されたＰＣＲクランピング系を用いて試験されている。

【0091】

この分析方法は、オリゴブロックを含む反応ミックスで得られたＣｔ（Ｃｔ_変異体；変異体配列のみが増幅される）とオリゴブロックを含まない同じ反応ミックスで得られたＣｔ試料（Ｃｔ_合計；変異体配列およびＷＴ配列が一緒に増幅される）との間のΔＣｔ比較に基づく。
ΔＣｔ＝Ｃｔ_変異体−Ｃｔ_合計

【0092】

ΔＣｔデータは、６つのＩＤＨ１変異の各々および５つの変異レベルの各々について生成されており（表５）、ＬｏＤを、ＣＬＳＩ／ＮＣＣＬＳ ＥＰ１７−Ａガイドラインに記載されるような「精度プロファイル（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ）アプローチ」に基づいて決定した。表５に示すように、２．２３％の低い変異レベル（変異の型に依存する）が、本発明に従うＰＣＲ方法を使用して検出され得る。

【表5】

【0093】

３．ペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴと比較した、本発明に従うオリゴブロックを使用して得られた性能
バリアント配列を検出するためにＰＣＲクランプを実施するための最も一般的な方法は、ＰＮＡ（ペプチド核酸）オリゴを使用する。ＰＮＡオリゴは、３’改変オリゴブロックと同じ機能を有するが、より高いＤＮＡ親和性に起因して、これらは通常、ＷＴ配列とバリアント配列との間の検出のより良い識別を可能にする。

【0094】

４つのＰＮＡオリゴが設計されている（表６を参照のこと）。これらを、以前に記載されたように、競合ＰＣＲプライマー、第２のＰＣＲプライマーおよびプローブと混合した。試験した試料は、ＷＴ試料、ならびにＲ１３２ＨおよびＲ１３２Ｃ変異試料であった。

【表6】

【0095】

以下の表は、同じ試料に対する、４つのＰＮＡオリゴを用いて得られた結果およびｄ７オリゴブロックを用いて得られた結果を示す。

【表7】

【0096】

最良の結果は、ＷＴ試料についての最も高いＣｔを変異体試料についての最も低いＣｔと関連させた組合せにおいて得られる。表７で見られるように、ＰＮＡオリゴの中で、ｄ３ ＰＮＡオリゴは、ＷＴ配列とバリアント配列との間の最良の識別を可能にする、最良の性能を示すものであり、ｄ７オリゴブロックは、ｄ３ ＰＮＡオリゴの性能と匹敵する性能を示す（以下の表８を参照のこと）。

【表8】

【化3】

【図1】

【図2】

【配列表】

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