特許 6653054 ＴＩＭ−３をターゲットとする脳損傷疾患治療用組成物及びこのスクリーニング方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6653054

(24)【登録日】2020年1月29日

(45)【発行日】2020年2月26日

(54)【発明の名称】ＴＩＭ−３をターゲットとする脳損傷疾患治療用組成物及びこのスクリーニング方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20200217BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20200217BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20200217BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20200217BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20200217BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/395 DZNA

   A61K39/395 N

   A61P9/10

   A61P9/00

   A61P25/00

   C07K16/18

【請求項の数】5

【全頁数】29

(21)【出願番号】特願2015-184356(P2015-184356)

(22)【出願日】2015年9月17日

(65)【公開番号】特開2017-57173(P2017-57173A)

(43)【公開日】2017年3月23日

【審査請求日】2018年9月5日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 論文（タイトル「Ｔｈｅ ＨＩＦ−１／ｇｌｉａｌ ＴＩＭ−３ ａｘｉｓ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂｒａｉｎ ｄａｍａｇｅ ｕｎｄｅｒ ｈｙｐｏｘｉａ」）を「ｎａｔｕｒｅ ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ」に掲載（公開日 ２０１５年３月２０日）

(73)【特許権者】

【識別番号】514039912

【氏名又は名称】ナショナル キャンサー センター

(74)【代理人】

【識別番号】100091683

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼川 俊雄

(74)【代理人】

【識別番号】100179316

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 寛奈

(72)【発明者】

【氏名】パク，ウン−ジョン

(72)【発明者】

【氏名】コ，ハン−ソク

(72)【発明者】

【氏名】ジョン，ソン−ホ

(72)【発明者】

【氏名】チャン，チ−ヨン

(72)【発明者】

【氏名】ユン，ヒ−ジョン

(72)【発明者】

【氏名】ジョン，セ−ボム

(72)【発明者】

【氏名】キム，ヒョン−ソク

(72)【発明者】

【氏名】アン，イェ−ヒョン

【審査官】 岩下 直人

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１１／１５５６０７（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｐ ９／００

Ａ６１Ｐ ９／１０

Ａ６１Ｐ ２５／００

Ｃ０７Ｋ １６／１８

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＴＩＭ−３（Ｔ−ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ ｍｕｃｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ３）抗体を有効成分として含む脳損傷疾患の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項2】

前記抗体は、配列番号１のアミノ酸配列で表されるＴＩＭ−３に結合するか、これと反応して、ＴＩＭ−３の活性を特異的に抑制または減少させる拮抗抗体であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記ＴＩＭ−３抗体は、ＨＩＦ−１（ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ−１）の発現または活性を抑制させることを特徴とする請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

前記ＴＩＭ−３抗体は、好中球走化因子（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ）の発現または活性を減少させることを特徴とする請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

前記脳損傷疾患は、脳梗塞、脳卒中、低酸素性脳損傷、虚血性脳疾患及び中風からなる群から選択されることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか一項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＴＩＭ−３（Ｔ−ｃｅｌｌｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ ｍｕｃｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ３）抑制剤を有効成分として含む脳損傷疾患の予防または治療用薬学的組成物及びＴＩＭ−３を利用した脳損傷疾患治療剤のスクリーニング方法に関する。

【背景技術】

【0002】

脳虚血（ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈａｅｍｉａ）は、複雑な病態生理学的変化を引き起こし、究極的に、特に虚血組織の中心部位（ｉｓｃｈａｅｍｉｃｃｏｒｅ）を取り囲む半陰影領域（ｐｅｎｕｍｂｒａｌａｒｅａ）で脳損傷を引き起こす。このような変化には、常在細胞（ｒｅｓｉｄｅｎｔ ｃｅｌｌ）の活性化、炎症性メディエーター（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ）の生成及び炎症細胞の浸潤（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）が含まれる。臨床実験結果によると、脳虚血による炎症反応は、脳損傷の発病と関連があるように見えるが、これと関連した炎症反応については未だ多く知られていない。

【0003】

Ｔ−細胞免疫グロブリン及びムチンドメインタンパク質ファミリ（Ｔ−ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ ｍｕｃｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ）のメンバーであるＴＩＭ−３は、ＴＨ１−依存的免疫反応を陰性的に調節する第１型ヘルパー（ｈｅｌｐｅｒ）Ｔ細胞（ＴＨ１）−特異的表面分子として初めて同定されたが、後続の研究において、ＴＩＭ−３は、ＴＨ１７細胞、Ｔｒｅｇｓ、ＮＫ細胞、タンパク白血球（ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）、樹脂状細胞、肥満細胞（ｍａｓｔ ｃｅｌｌｓ）及び小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）を含む多様な類型の兔疫細胞から発現されて、適応免疫（ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）だけでなく、先天免疫（ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）も調節するという事実が明かされた。最近の研究結果によると、ＴＩＭ−３は、先天性兔疫細胞の活性化を調節することに重要な役割をし、環境によって活性化マーカーまたは活性化制限因子として作用する。動物モデル及び人体で、ＴＩＭ−３は、感染、自己免疫疾患及び癌を含む多様な免疫関連疾病と密接な関連があることが表れた。興味深いことに、ＴＩＭ−３は、細胞の種類と環境によって多様な機能を表すとされる（非特許文献１）。例えば、晩成ウイルス感染及び腫瘍でＴＩＭ−３の抑制は、枯渇されたＴ細胞のエフェクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）機能を増加させる一方、ＴＩＭ−３信号伝逹の増加は、Ｔｈ−１−媒介されたＥＡＥ（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）を改善することが表れた。また、自己兔疫性肝炎でＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞上のＴＩＭ−３水準の減少は、免疫調節の損傷に寄与した一方、晩成Ｃ型肝炎では、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＩＭ−３が過発現された。

【0004】

低酸素症（ｈｙｐｏｘｉａ）に対する生理学的反応は、酸素−調節性アルファ−サブユニット（ｏｘｙｇｅｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ α−ｓｕｂｕｎｉｔ）と構成的ベータ−サブユニット（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ β−ｓｕｂｕｎｉｔ）とからなるヘテロ二量体の（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ）転写因子である、ＨＩＦ（ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ）−１によって主に媒介すると知られている。ＨＩＦ−１複合体は、低酸素症への適応と関連した様々な遺伝子の低酸素−反応部位（ｈｙｐｏｘｉｃ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ、ＨＲＥｓ）に結合する。興味深いことに、ＨＩＦ−１は、低酸素環境下だけでなく炎症環境下でも細胞反応を調節し、多くの炎症関連の疾病の発病にも重要な役割をするとされる。生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）及び試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）の実験において、ＨＩＦ−１は、骨髄細胞の移動のような骨髄細胞媒介の炎症反応に必須であることが表れた。また、ＨＩＦ−１活性は、虚血性肺及び腸の損傷後の病原性炎症反応と関連があった。従って、ＨＩＦ−１は、炎症関連の信号伝逹を調節する核心的な調節因子とされる。

【0005】

一方、中枢神経系（ＣＮＳ）は、免疫寛容地域（ｉｍｍｕｎｅ−ｐｒｉｖｉｌｅｇｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ）であると知られていたが、最近の研究結果で先天性及び後天的適応性免疫反応（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）を速めに誘発することができる精巧な監視システム（ｓｅｎｔｉｎｅｌ ｓｙｓｔｅｍ）を備えていると報告された。ＣＮＳの免疫反応において、主な兔疫細胞として機能する膠細胞（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ）は、脳の微細な変化を認知し、病態生理学的刺激に速く反応する。

【0006】

上記のような従来の報告に基づいて研究した結果、本発明者らは、低酸素症環境で小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）及び星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）のＴＩＭ−３発現が増加（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ）し、このようなＴＩＭ−３の発現増加が好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ）の低酸素性半陰影（ｈｙｐｏｘｉｃ ｐｅｎｕｍｂｒａ）への浸潤（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）に影響を及ぼすという事実を新たに発見した。このような浸潤は、虚血性脳損傷の主な原因として知られている。また、本発明者らは、神経膠細胞でＨＩＦ−１がＴＩＭ−３の酸素−依存的発現を調節するという事実を明らかにし、このような実験結果から本発明を完成した。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】ＵＳ２０１４／００９９２５４Ａ１

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｈａｎ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）

【非特許文献2】Ｃｒａｍｅｒ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．ＨＩＦ−１ａｌｐｈａ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｍｙｅｌｏｉｄ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ １１２，６４５−５７（２００３）

【非特許文献3】Ｚｈａｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｍｉｃｒｏｇｌｉａ ａｎｄ ｂｒａｉｎ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｆｒｏｍ ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｓｃｈｅｍｉａ ｉｎ ｎｏｒｍｏｇｌｙｃｅｍｉｃ ｂｕｔ ｎｏｔ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｆｅｍａｌｅ ｍｉｃｅ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１３，８５−５（２００４）

【非特許文献4】Ｓｗａｎｓｏｎ，Ｒ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｓｅｍｉａｕｔｏｍａｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｂｒａｉｎ ｉｎｆａｒｃｔ ｖｏｌｕｍｅ．Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．１０，２９０−９３（１９９０）

【非特許文献5】Ｆｒａｎｋ，Ｍ．Ｇ．，Ｗｉｅｓｅｌｅｒ−Ｆｒａｎｋ，Ｊ．Ｌ．，Ｗａｔｋｉｎｓ，Ｌ．Ｒ．＆Ｍａｉｅｒ，Ｓ．Ｆ． ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ａｎｄ ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ ｍｉｃｒｏｇｌｉａ ｆｒｏｍ ａｄｕｌｔ ｒａｔ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ：ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １５１，１２１−３０（２００６）

【非特許文献6】Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｄ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｒｏｄｅｎｔ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ．Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｃｈａｐｔｅｒ３，Ｕｎｉｔ３５（２００１）

【非特許文献7】Ｃｈａｎｇ，Ｃ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｄｕａｌｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ ｏｆ ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｉｎ ｒｏｔｅｎｏｎｅ−ｅｘｐｏｓｅｄ ｂｒａｉｎ−ｒｅｓｉｄｅｎｔ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７９，９６４−７９（２０１１）

【非特許文献8】Ｈｕａｎｇ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｉｎ ｍｉｃｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５，１８８３−８８５（１９９４）

【非特許文献9】Ｂｌｏｕｗ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｈｙｐｏｘｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ ｔｕｍｏｒｓ ｉｓ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｎ ｔｈｅｉｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ４，１３３−４６（２００３）

【非特許文献10】Ｋｕｔｎｅｒ，Ｒ．Ｈ．，Ｚｈａｎｇ，Ｘ．Ｙ．＆Ｒｅｉｓｅｒ，Ｊ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ ＨＩＶ−１−ｂａｓｅｄ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．４，４９５−０５（２００９）

【非特許文献11】Ｚｈａｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｍｉｃｒｏｇｌｉａ ａｎｄ ｂｒａｉｎ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｆｒｏｍ ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｓｃｈｅｍｉａ ｉｎ ｎｏｒｍｏｇｌｙｃｅｍｉｃ ｂｕｔ ｎｏｔ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｆｅｍａｌｅ ｍｉｃｅ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１３，８５−９５（２００４）

【非特許文献12】Ｗａｎｇ，Ｇ．Ｌ．＆Ｓｅｍｅｎｚａ，Ｇ．Ｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ １ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ｈｙｐｏｘｉａ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，２１５１３−２１５１８（１９９３）

【非特許文献13】Ｂｅｒｇｅｒｏｎ、Ｍ．，Ｙｕ，Ａ．Ｙ．，Ｓｏｌｗａｙ，Ｋ．Ｅ．，Ｓｅｍｅｎｚａ，Ｇ．Ｌ．＆Ｓｈａｒｐ，Ｆ．Ｒ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ−１（ＨＩＦ−１） ａｎｄ ｉｔｓ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｆｏｃａｌ ｉｓｃｈａｅｍｉａ ｉｎ ｒａｔ ｂｒａｉｎ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１１，４１５９−４１７０（１９９９）

【非特許文献14】Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ．Ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｂｒａｉｎ Ｌｉｂｒａｒｙ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｂｌ．ｏｒｇ／ａｔｌａｓ１６５／ａｔｌａｓ１６５＿ｓｔａｒｔ（１９９９）

【非特許文献15】Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｋ．Ｂ．Ｊ．＆Ｐａｘｉｎｏｓ，Ｇ．Ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｂｒａｉｎ ｉｎ Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ ３ｒｄ ｅｄｎ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２００８）

【非特許文献16】Ｇｅｒｒｉｅｔｓ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｅｄｅｍａ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｐａｃｅｏｃｃｕｐｙｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｉｎ ｒａｔ ｓｔｒｏｋｅ ｍｏｄｅｌｓ ｕｓｉｎｇ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ．Ｓｔｒｏｋｅ３５，５６６−５７１（２００４）

【非特許文献17】Ｌｅ，Ｄ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｓｐａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃａｓｐａｓｅ−３−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ ａｆｔｅｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｏｘｙｇｅｎ ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９９，１５１８８−１５１９３（２００２）

【非特許文献18】Ｂｒｏｕｇｈｔｏｎ、Ｂ．Ｒ．，Ｒｅｕｔｅｎｓ，Ｄ．Ｃ．＆Ｓｏｂｅｙ，Ｃ．Ｇ．Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｆｔｅｒ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ．Ｓｔｒｏｋｅ４０，ｅ３３１−ｅ３３９（２００９）

【非特許文献19】Ｃｈａｉｔａｎｙａ，Ｇ．Ｖ．，Ｓｔｅｖｅｎ，Ａ．Ｊ．＆Ｂａｂｕ，Ｐ．Ｐ．ＰＡＲＰ−１ ｃｌｅａｖａｇｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ：ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｃｅｌｌ−ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｉｎ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．ＣｅｌｌＣｏｍｍｕｎ．Ｓｉｇｎａｌ．８，３１（２０１０）

【非特許文献20】ＭｃＣｏｌｌ，Ｂ．Ｗ．，Ｒｏｔｈｗｅｌｌ，Ｎ．Ｊ．＆Ａｌｌａｎ，Ｓ．Ｍ．Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｓｔｉｍｕｌｕｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ ｔｈｅ ａｃｕｔｅ ｐｈａｓｅ ａｎｄ ＣＸＣ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓｔｒｏｋｅ ａｎｄ ｅｘａｃｅｒｂａｔｅｓ ｂｒａｉｎ ｄａｍａｇｅ ｖｉａ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１ ａｎｄ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２７，４４０３−．４４１２（２００７）

【非特許文献21】Ｃｈｅｎ、Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉ−ＣＤ１１ｂ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｄｕｃｅｓ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｃｅｌｌ ｄａｍａｇｅ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｆｏｃａｌ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｉｎ ｒａｔ．Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３５，４５８−．４６３（１９９４）

【非特許文献22】Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｓ．Ｄ．，Ｖｏｙｉｃｈ，Ｊ．Ｍ．，Ｂｕｒｌａｋ，Ｃ．＆ＤｅＬｅｏ，Ｆ．Ｒ．Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ａｒｃｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｅｘｐ．（Ｗａｒｓｚ）．５３，５０５−５１７（２００５）

【非特許文献23】Ｍｕｒｉｋｉｎａｔｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．２４，７８８−７９８（２０１０）

【非特許文献24】Ｍｕｉｒ，Ｋ．Ｗ．，Ｔｙｒｒｅｌｌ，Ｐ．，Ｓａｔｔａｒ，Ｎ．＆Ｗａｒｂｕｒｔｏｎ，Ｅ．Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｓｃｈａｅｍｉｃ ｓｔｒｏｋｅ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２０，３３４−．３４２（２００７）

【非特許文献25】Ｓａｉｊｏ，Ｋ．＆Ｇｌａｓｓ，Ｃ．Ｋ．Ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｏｒｉｇｉｎ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１，７７５−．７８７（２０１１）

【非特許文献26】Ｒｅｎ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｌｉｍｉｔ ＣＮＳ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ ｄｅｆｉｃｉｔｓ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓｔｒｏｋｅ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３１，８５５６−．８５６３（２０１１）

【非特許文献27】Ｋｌｅｉｎｓｃｈｎｉｔｚ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｐｏｓｔ−ｓｔｒｏｋｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｄ ＮＡＤＰＨ ｏｘｉｄａｓｅ ｔｙｐｅ ４ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ．８，ｐｉｉ：ｅ１０００４７９（２０１０）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明の目的は、ＴＩＭ−３（Ｔ−ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ ｍｕｃｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ３）をターゲットとしてこの発現または活性を抑制させる脳損傷疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供することにある。

【0010】

本発明の他の目的は、ＴＩＭ−３を利用して脳損傷疾患の治療剤をスクリーニングする方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0011】

上記目的を達成するために、本発明は、ＴＩＭ−３（Ｔ−ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ ｍｕｃｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ３）抑制剤を有効成分として含む脳損傷疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。

【0012】

本発明の一実施例において、前記ＴＩＭ−３抑制剤は、直接または間接的にＴＩＭ−３に結合するか、これと反応するか、またはこの発現を調節するなどの方法で、ＴＩＭ−３の発現または活性を特異的に抑制または減少させることができる物質であり、有機または無機化合物、タンパク質、抗体、ペプチドまたは核酸分子などを含む。本発明の一実施例において、前記ＴＩＭ−３抑制剤は、ＴＩＭ−３に結合するか、これと反応して、ＴＩＭ−３の活性を特異的に抑制または減少させる拮抗抗体またはその断片であるが、これに限定されない。本発明の一実施例において、前記ＴＩＭ−３抑制剤は、ＴＩＭ−３遺伝子の発現を直接または間接的に抑制する核酸分子であり、このような核酸分子の例としては、ＴＩＭ−３遺伝子またはその断片に対するアンチセンスヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡなどがあるが、これに限定されない。

【0013】

本発明の一実施例において、前記ＴＩＭ−３タンパク質は、序列番号１のアミノ酸序列からなり、前記ＴＩＭ−３遺伝子は、序列番号２の塩基序列からなる。

【0014】

本発明の一実施例において、前記ＴＩＭ−３抑制剤は、ＴＩＭ−３遺伝子の上位（ｕｐｓｔｒｅａｍ）遺伝子またはＴＩＭ−３遺伝子の発現調節部位の発現または活性を抑制することで、ＴＩＭ−３の発現を抑制する作用をする。

【0015】

本発明の一実施例において、前記ＴＩＭ−３抑制剤は、ＨＩＦ−１（ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ−１）の発現または活性を抑制させる。

【0016】

本発明の一実施例において、前記ＴＩＭ−３抑制剤は、好中球走化因子（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ）の発現または活性を減少させて、好中球の移動及び浸潤を阻害することで、脳損傷疾患の予防または治療効果を表す。

【0017】

また、本発明は、（ａ）ＴＩＭ−３が発現される細胞または動物モデルに候補物質を処理する段階と、（ｂ）前記候補物質処理後、ＴＩＭ−３の発現または活性程度を測定する段階と、（ｃ）前記ＴＩＭ−３の発現または活性程度が候補物質を処理しない対照群に比べて減少した候補物質を選別する段階とを含む脳損傷疾患治療剤のスクリーニング方法を提供する。

【0018】

本発明の一実施例において、前記スクリーニング方法は、前記（ｃ）段階で選別した候補物質が対照群に比べてＨＩＦ−１の発現または活性を抑制させるか否かを追加で分析する段階をさらに含む。

【0019】

本発明の一実施例において、前記（ｂ）段階の測定及び／または前記ＨＩＦ−１の発現または活性を分析する方法は、免疫組織化学染色、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡまたはタンパク質チップで構成された群から選ばれる方法で行うが、これに限定されない。

【0020】

本発明の一実施例において、前記ＴＩＭ−３が発現される細胞は、神経膠細胞（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ）であるが、これに限定されない。本発明の一実施例において、前記動物モデルは、低酸素虚血性（ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｓｃｈｅｍｉａ）脳損傷疾患モデルであるが、これに限定されない。

【0021】

本発明が適用可能な脳損傷疾患の例としては、脳梗塞、脳卒中、低酸素性脳損傷、虚血性脳疾患、中風などがあるが、これに限定されない。本発明の一実施例によると、前記脳損傷疾患は、低酸素（ｈｙｐｏｘｉａ）環境で発生した炎症（ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）関連の脳損傷である。

【発明の効果】

【0022】

本発明者らは、虚血によって発生する低酸素（ｈｙｐｏｘｉａ）状態時に誘発する脳損傷でＴＩＭ−３タンパク質がモジュレータとして役割をし、ＴＩＭ−３の発現が低酸素状態で発生する遺伝子発現を調節するＨＩＦ−１によって調節を受けることを確認した。そこで、本発明は、低酸素症が伴われる脳神経系疾患、例えば、脳梗塞、脳卒中、低酸素性脳損傷、虚血性脳疾患及び中風疾患の治療及び予防のために有用に使用されることができる。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】ＴＩＭ−３が低酸素虚血性脳卒中のマウスモデルの低酸素が誘導された脳領域で発現することを示す。（ａ）ＴＩＭ−３転写レベルを低酸素虚血性脳卒中の誘導２４時間後に、マウスモデルから対側性皮質（Ｃ，ｂｏｘｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）と脳卒中が誘導された同側性皮質（Ｉ，ｂｏｘｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）から脳組織を取り外して測定した。逆転写酵素遺伝子の増幅方法によって出た結果は、ｉｍａｇｅ Ｊプログラムを使用して量を測定し、ａｃｔｉｎの発現を反映して定量化した。ＨＩＦ−１α転写レベルは、低酸素のｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌで表した。右側パネルは、低酸素虚血性脳卒中誘導のマウスモデルの脳断面組織のＴＴＣ染色を示す。（ｂ）ウェスタンブロット分析法は、ＴＩＭ−３とＨＩＦ−１タンパク質の発現を示す（ｎ＝３）。相対的なＴＩＭ−３発現程度は、独立した３回の実験から測定された有意値で示した。（ｃ）低酸素虚血性脳卒中のマウス脳断面の同側性皮質と対側性皮質でＴＩＭ−３発現をＴｉｍ−３抗体を使用して免疫組織化学法を通じて確認し、ＴＩＭ−３を発現する細胞数をｍｍ^２当たり個数で測定した。（ｄ）免疫組織化学法は、低酸素虚血性脳卒中が誘導されたマウスで脳切片を取り外してＴＩＭ−３とｈｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ−１（ｒｅｄ、ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｈｙｐｏｘｉｃ ｒｅｇｉｏｎｓ）抗体を使用して測定したものである。Ｓｃａｌｅ ｂａｒｓ、５０μｍ（×２０）；５０μｍ（×４０）．（ｅ，ｆ）グループごとに３匹から同側性部位と対側性部位から脳細胞を分離し、星状細胞を表すことができるＧＦＡＰ（ｆ）と小膠細胞を表すＩｂａ−１（ｅ）、そしてＴＩＭ−３抗体を一斉に付けてＦＡＣＳ（蛍光利用細胞分類機）を使用して分析した。この結果は、ゲーティングされた小膠細胞で相対的なＴＩＭ−３レベルを表したもので、３回の独立した実験を通じて確認された。

【図2】一次培養した神経膠細胞において、ＨＩＦ−１αがＴＩＭ−３のプロモータに結合し、その発現を調節することを示す。（ａ）ＢＶ２細胞に２０％のＯ_２または１％のＯ_２環境を２４時間維持した後、ＴＩＭ−３の細胞表面発現様相をＰＥが結合されたＴＩＭ−３抗体で染色し、蛍光利用細胞分類機を使用して分析した。３回の独立した実験を通じて得た結果を棒グラフとして表し、平均値の変化（±ｓ．ｄ．）を正常環境サンプルと比較して表した。（ｂ）マウスから培養した神経膠細胞を２４時間の間正常環境と低酸素環境で培養し、その細胞をＴｉｍ−３抗体を使用して兔疫細胞化学法を通じてＴＩＭ−３の発現を確認した。（ｃ、ｄ）マウスから一次培養した神経膠細胞と神経細胞を２４時間の間正常環境と低酸素環境で培養し、逆転写酵素遺伝子増幅方法でＴＩＭ−３とａｃｔｉｎの発現程度を測定した。発現変化を独立して３回繰り返した実験を通じて平均値変化（±ｓ．ｄ．）をグラフで示す（ＮＳ、統計が有効でない、Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ ｔｅｓｔ）。（ｅ）マウスから由来した神経膠細胞を２４時間の間正常環境と低酸素環境で培養し、免疫沈降精製法をＨＩＦ−１抗体と対照群ＩｇＧを持って行った。結果は、３回の独立した実験を通じてグラフで示した。（ｆ）ＨＩＦ−１α^{＋ｆ／＋ｆ}マウスから由来した神経膠細胞にＡｄ−ＧＦＰ ｏｒ Ａｄ−Ｃｒｅ／ＧＦＰウイルスを感染させ、この感染された細胞にＴＩＭ−３−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ（Ｔｉｍ−３プロモータ遺伝子が入っているｖｅｃｔｏｒ）ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓを形質注入し、２４時間の間正常環境と低酸素環境で培養した。プロモータ遺伝子発現活性をｒａｔｉｏ ｏｆ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ／β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙとして表現した。（ｇ、ｈ）逆転写酵素遺伝子増幅方法（ｇ）とｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析法（ｈ）は、ｐｒｉｍｅｒと抗体を使用して２４時間の間正常環境と低酸素環境下で行った。このデータは、独立して３回の繰り返した実験を通じて表した。グラフは、低酸素環境化でＡｄ−ＧＦＰが感染された細胞に比べてＴＩＭ−３遺伝子転写とタンパク質の発現量を比べて示す。ＩＰ、免疫沈降

【図3】ＴＩＭ−３の遮断は、低酸素虚血性脳卒中後に誘導される脳損傷を有意味に減少させることを示す。（ａ）ＩｇＧ（ｎ＝１２）とＴＩＭ−３ ｂｌｏｃｋｉｎｇ抗体（ｎ＝１２）１００μｇを処理した低酸素虚血性脳卒中モデルマウスからＴＴＣ染色された脳切片のイメージを示す代表図。梗塞ｖｏｌｕｍｅは、ｉｍａｇｅ Ｊプログラムを通じて分析し、損傷された同側性部位を百分率で表現した。（ｂ）低酸素虚血性脳卒中の誘導２４時間後、ＴＩＭ−３抗体を処理したマウス（ｎ＝４）とＩｇＧ（ｎ＝４）を処理したマウスから得たＭＲＩ（磁気共鳴映像法）の代表写真。（ｃ）低酸素虚血性脳卒中の誘導２４時間後、ＴＩＭ−３抗体を処理したマウス（ｎ＝４）とＩｇＧ（ｎ＝４）を処理したマウスから得たＴ２−ＭＲＩ（磁気共鳴映像法）の代表写真。（ｄ）浮腫の形成程度をＴ２−ｗｅｉｇｈｔｅｄ ＭＲＩ ｉｍａｇｅｓ ａｎｄ ＡＤＣ ｍａｐを通じて得た。（ｅ）低酸素虚血性脳卒中の誘導２４時間後、ＴＩＭ−３抗体を処理したマウスと、ＩｇＧを処理したマウスから得た脳切片中でＮｅｕＮ（神経細胞）ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ−３（細胞死滅をｄｅｔｅｃｔｉｏｎする抗体）で免疫組織化学法をし、ｃｏｎｆｏｃａｌ顕微鏡で測定した代表写真。Ｓｃａｌｅ ｂａｒ、５０μｍ。グラフは、ＮｅｕＮとｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ−３抗体で染色された細胞数をｍｍ^２当たり平均個数を示す。（ｆ）低酸素虚血性脳卒中の誘導２４時間後、ＴＩＭ−３抗体を処理したマウスと、ＩｇＧを処理したマウスから得た対側性皮質と同側性皮質の中でｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ＰＡＲＰタンパク質（細胞死滅を表すタンパク質）の発現を表したｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ写真。グラフは、ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ＰＡＲＰのレベルを比べて示す。全てのデータは、３回の独立した実験から有意な値で表した。

【図4】ＴＩＭ−３遮断抗体が好中球の移動を減少させることを示す。逆転写酵素遺伝子増幅方法（ａ）及びウエスタンブロット分析法（ｂ）をＩｇＧとＴＩＭ−３ ｂｌｏｃｋｉｎｇ抗体が処理された低酸素虚血性脳卒中モデルマウスでＭＰＯ発現を測定するために使用した。グラフは、ＭＰＯレベルを比べて示した。（ｃ）低酸素虚血性脳卒中の誘導２４時間後、ＴＩＭ−３抗体を処理したマウスと、ＩｇＧを処理したマウスから得た脳切片中からＭＰＯとＧｒ−１抗体で免疫組織化学法をし、ｃｏｎｆｏｃａｌ顕微鏡で測定した代表写真。Ｓｃａｌｅ ｂａｒ，５０μｍ。グラフは、ＭＰＯとＧｒ−１抗体で染色された細胞数のｍｍ^２当たり平均個数を示す（±ｓ．ｄ．）。低酸素虚血性脳卒中モデルマウスから由来した（ｄ）大脳皮質と（ｅ）基底部位で得た脳切片をＭＰＯ抗体とＧｒ−１抗体を使用して免疫組織化学法を行い、ＭＰＯとＧｒ−１が染色された細胞をｍｍ^２当たり細胞数を数えた。

【図5】生体内と生体外の両方でＴＩＭ−３の遮断は、代表的な二つの好中球化学走性因子の発現を減少させることを示す。（ａ）マウスから一次培養した神経膠細胞（２×１０^５）をトランスウェルのｌｏｗ ｃｈａｍｂｅｒに敷いて、ＴＩＭ−３と対照群ＩｇＧ抗体を図示のように先ず処理した後、脾臓細胞５×１０^５をｕｐｐｅｒ ｃｈａｍｂｅｒに載せる。低酸素状況で２４時間培養後、脾臓細胞ｌｏｗ ｃｈａｍｂｅｒに移動された程度を蛍光利用細胞分類機を使用して分析した。独立した３回の実験を通じてｌｏｗ ｃｈａｍｂｅｒに移動したＧｒ−１^ｈｉｇｈＣＤ１１ｂ^ｈｉｇｈ細胞の％を平均値±ｓ．ｄで表現した。（ｂ）Ｇｒ−１^ｈｉｇｈＣＤ１１ｂ^ｈｉｇｈである好中球をＣ５７ＢＬ／６マウスの骨髄から分離し、ＩｇＧとＴＩＭ−３抗体を処理した神経膠細胞と共に低酸素環境で培養する。３回の独立した実験から得た結果は、ＩｇＧを処理した細胞を１と見た時、減少された程度を表す。（ｃ）逆転写酵素遺伝子増幅法をＩｇＧとＴＩＭ−３を処理した低酸素虚血性脳卒中モデルから得た組織に対して行った。（ｄ）グラフは、ａｃｔｉｎで補正して表した結果を示す（ｎ＝３）。（ｅ）マウスから由来した神経膠細胞にＩｇＧとＴＩＭ−３抗体を処理し、正常環境と低酸素環境で２４時間の間培養する。ＣＸＣＬ１とＩＬ−１ｂｅｔａ転写レベルは、逆転写酵素遺伝子増幅法によって決めた。グラフは、独立して３回実験した結果から出た。ＮＳ、有効性がない。

【図6】低酸素によって誘導される好中球の移動は、ＨＩＦ−１が欠けた環境で減少することを示す。（ａ）ＨＩＦ−１α^{＋ｆ／＋ｆ}マウスから一次培養した神経膠細胞（２×１０^５）にＡｄ−ＧＦＰ ｏｒ Ａｄ−Ｃｒｅ／ＧＦＰウイルスを感染させ、トランスウェルのｌｏｗ ｃｈａｍｂｅｒに載せ、５×１０^５をｕｐｐｅｒ ｃｈａｍｂｅｒに載せる。低酸素状況で２４時間培養後、脾臓細胞がｌｏｗ ｃｈａｍｂｅｒに移動した程度を蛍光利用細胞分類機を使用して分析した。（ｂ）Ｇｒ−１^ｈｉｇｈＣＤ１１ｂ^ｈｉｇｈである好中球をＣ５７ＢＬ／６マウスの骨髄から分離し、ＨＩＦ−１α^{＋ｆ／＋ｆ}マウスから一次培養した神経膠細胞をＡｄ−ＧＦＰまたはＡｄ−Ｃｒｅ／ＧＦＰウイルスで感染させて好中球細胞のように低酸素環境で培養する。３回の独立した実験を通じて得た結果は、Ａｄ−ＧＦＰ感染されたＨＩＦ−１α^{＋ｆ／＋ｆ}マウスの神経膠細胞と比べて好中球細胞の移動変化を示した。（ｃ）ＣＸＣＬ１とＩＬ−１ｂｅｔａ転写レベルは、Ａｄ−ＧＦＰまたはＡｄ−Ｃｒｅ／ＧＦＰウイルスを感染させた神経膠細胞を正常環境と低酸素環境で２４時間の間培養してその発現を確認した。（ｄ）グラフは、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲから得た結果である。

【図7】ＬｙｓＭ−Ｈｉｆ−１α^−／−形質転換マウスで低酸素虚血性脳卒中によって誘導された脳損傷が減少することを示す実験結果である。（ａ）ＨＩＦ−１α^{＋ｆ／＋ｆ}またはＬｙｓＭ−Ｈｉｆ−１α^−／−マウスから培養した神経膠細胞で表示されたプライマーを利用して逆転写酵素遺伝子増幅法を行った。（ｂ）ＴＩＭ−３遺伝子転写レベルをＨＩＦ−１α^{＋ｆ／＋ｆ} ｏｒ ＬｙｓＭ−Ｈｉｆ−１^α−／−マウス（ｎ＝３）の対側性皮質と虚血性脳卒中が誘導された同側性皮質から由来した脳組織から確認した。（ｃ）２４時間の間低酸素虚血性脳卒中が誘導されたＨＩＦ−１α^{＋ｆ／＋ｆ}（ｎ＝１２）ｏｒ ＬｙｓＭ−Ｈｉｆ−１α^−／−マウス（ｎ＝１２）からＴＴＣ染色された脳切片のイメージを示した代表図。梗塞ｖｏｌｕｍｅは、ｉｍａｇｅ Ｊプログラムを通じて分析し、損傷された同側性部位を百分率で表現した。（ｄ）低酸素脳卒中２４時間後、ＨＩＦ−１α^{＋ｆ／＋ｆ} ｏｒ ＬｙｓＭ−Ｈｉｆ−１α^−／−マウスから得た脳切片中でＮｅｕＮ（神経細胞をｄｅｔｅｃｔｉｏｎする抗体）ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ−３（細胞死滅をｄｅｔｅｃｔｉｏｎする抗体）で免疫組織化学法をし、ｃｏｎｆｏｃａｌ顕微鏡で測定した代表写真。Ｓｃａｌｅ ｂａｒ，５０μｍ。グラフは、ＮｅｕＮとｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ−３抗体で染色された細胞数のｍｍ^２当たり平均個数を示す。（±ｓ．ｄ．３回独立して実験）

【図8】ＬｙｓＭ−Ｈｉｆ−１ａ−／−マウスにＬＶ−ＴＩＭ３−ＧＦＰの頭蓋腔接種は、脳梗塞範囲と神経学的後遺症を増加させることを示す実験結果である。（ａ）ＩＶＩ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｓｙｓｔｅｍ（Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ−２００）を使用してＰＢＳ、ＧＦＰが過発現されるレンチウイルスを接種したマウス、そして、ＴＩＭ−３とＧＦＰが過発現されたレンチウイルスを接種したマウスの蛍光イメージを測定した代表図（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｆｉｌｔｅｒ，ｆｒｏｍ ４４５ ｔｏ ４９０ｎｍ、ａｎｄ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｆｉｌｔｅｒ，ｆｒｏｍ ５１５ ｔｏ ５７５ｎｍ）。（ｂ）ＬＶ−ＴＩＭ３−ＧＦＰまたはＬＶ−ＧＦＰを接種したマウスからＴＴＣ染色された脳切片のイメージを示した代表図。（ｃ、ｄ）梗塞大きさ（ｃ、ｎ＝６ ｆｏｒ ＬＶ−ＧＦＰ ｏｒ ｎ＝５ ｆｏｒ ＬＶ−ＴＩＭ３−ＧＦＰ）ａｎｄ 神経学的後遺症（ｄ、ｎ＝６ ｆｏｒ ｅａｃｈ ｇｒｏｕｐ）は、低酸素虚血性脳卒中の誘導２４時間後に検査した。

【図9】低酸素脳環境で発生可能なＴＩＭ−３関連事件の模式図である。低酸素環境依存的ＨＩＦ−１ａの活性は、小膠細胞と星状細胞でＴＩＭ−３発現を増加させる。ＨＩＦ−１／ＴＩＭ−３軸の活性化は、好中球誘引物質の生成と低酸素地域で好中球の浸潤を誘導する。好中球の非正常的な浸潤現象は、過度な炎症反応を誘導し、引き継いで脳の病態生理学的環境に原因となる。

【図10】１％の酸素条件及び２０％の酸素条件下で一次培養膠細胞またはＢＶ２小膠細胞にＴＩＭ−３のｓｈＲＮＡをそれぞれ細胞感染させた後、ＰＣＲ及び免疫細胞化学法を通じて細胞内でＴＩＭ−３の発現程度を比較分析した結果を示し、１０Ａは、一次培養膠細胞の結果を、１０Ｂは、ＢＶ２小膠細胞の結果を示し、１０ＡにおけるａはＰＣＲ分析結果であり、ｂは免疫細胞化学法を表す。

【発明を実施するための形態】

【0024】

本発明は、虚血性脳卒中など低酸素症による脳損傷疾患の治療用組成物及び脳損傷疾患治療剤のスクリーニング方法に関し、具体的には、ＴＩＭ（Ｔ−ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ ｍｕｃｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）−３抑制剤を有効成分として含む脳損傷疾患の治療用組成物、及び（ａ）ＴＩＭ−３が発現される細胞または動物に候補物質を処理する段階と、（ｂ）ＴＩＭ−３の発現または活性程度を測定する段階と、（ｃ）ＴＩＭ−３の発現または活性程度が候補物質を処理しない対照群に比べて減少した候補物質を選別する段階とを含む脳損傷疾患治療剤のスクリーニング方法に関する。

【0025】

大脳虚血（ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈａｅｍｉａ）は、一連の病態生理学的変化を引き起こして脳損傷を誘発する。炎症媒介体（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｍｅｄｉａｔｏｒ）の生産及び浸透は、脳損傷を引き起こす重要な段階で、大脳虚血による脳損傷程度は、炎症状態と非常に密接な関連があることを示唆する臨床及び研究結果が増加している。そこで、炎症調節をターゲットとする脳神経系疾患の治療剤の開発戦略に対する関心が高まっている。但し、現在までは、虚血性脳疾患時に伴われる炎症反応について知られた情報が非常に少ないという限界があった。

【0026】

本発明は、虚血以後に発生するｈｙｐｏｘｉａ（低酸素）状態による脳損傷に、ＴＩＭ−３が非正常的な炎症細胞の浸透及び炎症反応と連関があり、ＴＩＭ−３の制御は、炎症反応、脳細胞の死滅、脳梗塞部位の減少に影響を与えるということを糾明することにその特徴がある。本発明は、虚血によって発生する低酸素（ｈｙｐｏｘｉａ）状態時に誘発する脳損傷で、ＴＩＭ−３タンパク質がモジュレータとしての役割をしており、ＴＩＭ−３の発現が低酸素状態で発生する遺伝子発現を調節するＨＩＦ−１によって調節を受けるという研究結果を基盤としている。本発明の一実施例によると、低酸素虚血性脳卒中のマウスモデル（Ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｓｃｈｅｍｉａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ）の低酸素が誘導された脳領域の神経膠細胞（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ）でＴＩＭ−３の発現は増加し（図１）、ＴＩＭ−３の発現は、ＨＩＦ−１によって調節された（図２）。また、ＴＩＭ−３の遮断は、低酸素虚血症後に伴われる脳梗塞部位及び脳細胞の死滅を減少させ（図３）、好中球の脳への移動及び移動関連サイトカインを減少させることを確認した（図４）。また、低酸素によって誘導される好中球の移動及び脳損傷は、ＨＩＦ−１欠乏マウスの低酸素虚血脳卒中モデルでも減少され（図６）、該マウスにＴＩＭ−３の発現を増加させれば脳損傷が再び増加した。このような結果は、低酸素環境でＨＩＦ−１／ＴＩＭ−３軸と脳損傷の関連性を表す。

【0027】

従って、本発明は、ＴＩＭ−３抑制剤を有効成分として含有する脳損傷疾患、例えば、脳梗塞、脳卒中、低酸素性脳損傷、虚血性脳疾患及び中風疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供することができる。本明細書で使用された用語「予防」は、療法剤（例えば、予防剤または治療剤）または療法剤の組合物を投与して対象体で脳損傷疾患の兆候が表れるか再発または発展することを防ぐことを意味する。本明細書で使用された用語「治療」は、脳損傷疾患患者の症状やいずれか一つ以上の身体的パラメータを改善させるか調節するかその発生や進展を遅延させることを意味し、患者の認識有無は問わない。本発明の薬学的組成物は、一つ以上の薬剤学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む。前記担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アラビアガム、アルジネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート及び鉱物油が挙げられる。また、充填剤、抗凝集剤、滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤及び防腐剤などをさらに含んでもよい。使用に適合した担体としては、食塩水、燐酸塩緩衝食塩水、最小必須培地（ＭＥＭ）またはＨＥＰＥＳ緩衝液のＭＥＭを含む水性媒質を挙げられるが、これに限定されない。

【0028】

また、本発明の薬学的組成物は、哺乳動物に投与された後、活性成分の迅速、持続または遅延された放出を提供するように当業界に公知された方法を使用して剤形化することができる。剤形は、粉末、料粒、精製、エマルジョン、シロップ、エアゾル、軟質または硬質のゼラチンカプセル、滅菌注射溶液、滅菌粉末などの形態であってもよい。本発明の薬学的組成物は、筋肉、皮下、経皮、静脈、鼻腔内、腹腔内または経口の経路で投与されてもよく、好ましくは、筋肉内または皮下経路で投与される。組成物の投与量は、投与経路、動物の年齢、性別、体重及び重症度などの様々な因子によって適切に選択される。

【0029】

本発明の薬学的組成物は、下記の多様な経口または非経口投与形態で剤形化するが、これに限定されない。先ず、経口投与のための固形製剤としては、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、硬質または軟質カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、本発明の有効成分に少なくとも一つ以上の賦形剤を交ぜて調剤される。また、単純な賦形剤の他にマグネシウムステアレート、タルクのような滑剤を使用してもよい。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤またはシロップ剤などがあるが、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィンの他に様々な賦形剤が含まれてもよい。また、本発明の薬学的組成物は、非経口投与も可能であり、非経口投与は、皮下注射剤、静脈注射剤、筋肉内注射剤または胸部内注射剤を注入する方法などによる。この場合、非経口投与用剤型に製剤化するために、本発明の有効成分を安定剤または緩衝制と共に水で混合して溶液または懸濁液に製造し、これをアンプルまたはバイアルの単位投与型で製造することができる。非経口投与のための製剤としては、滅菌した水溶液、非水性溶剤、懸濁液剤、乳剤、凍結乾燥製剤または坐剤などが含まれる。非水性溶剤、懸濁液剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油またはエチルオレートのような注射可能なエステルなどが使用されてもよい。また、本発明の薬学的組成物は、マウス、ラット、家畜、人間などの哺乳動物に多様な経路で投与されてもよく、その例としては、経口、直腸、静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳血管内注射などがある。本発明の薬学的組成物は、患者の年、性別、体重によって適切な方法を選択して投与する。

【0030】

以下、本発明を実施例によってさらに詳しく説明する。下記の実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例に限らないということは、当業界で通常の知識を持った者において自明である。

【実施例1】

【0031】

実験材料及び方法
＜１−１＞実験動物
Ｒａｎｄａｌｌ Ｊｏｈｎｓｏｎ博士が製作したＨＩＦ−１α^{＋ｆ／＋ｆ}（ＨＩＦ−１α−ｆｌｏｘｅｄ ａｌｌｅｌｅｓ）を持ったマウスを使用した。骨髄系統細胞でＨＩＦ−１αに欠けたマウスは、ＨＩＦ−１α^{＋ｆ／＋ｆ}マウスとＬｙｓＭ−Ｃｒｅ形質転換マウスの異種交配から製作した（非特許文献２）。８週令の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｏｒｉｅｎｔ Ｂｉｏ）を生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）及び試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）実験に使用した。

【0032】

＜１−２＞低酸素性脳虚血症モデル及び梗塞（ｉｎｆａｒｃｔ）の体積の測定
Ｃ５７ＢＬ／６雄マウス（８週、Ｏｒｉｅｎｔ Ｂｉｏ）に対して非特許文献３のような方法でＨ／Ｉを誘導した。簡単に説明すると、マウスをＺｏｌｅｔｉｌ（Ｖｉｒｂａｃ）及びＲｏｍｐｕｎ（Ｂａｙｅｒ）（４：１）で麻酔させ、それぞれのマウスの右側総頸動脈（ｃｏｍｍｏｎ ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｙ）を露出させ、４−０手術用シルク（ｓｕｒｇｉｃａｌ ｓｉｌｋ）で二重接合した。切開部位を縫合し、過量の食べ物と水で２時間の間マウスを回復させた。全身性低酸素症（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｈｙｐｏｘｉａ）は、温度調節低酸素チャンバ（ＢｉｏＳｐｈｅｒｉｘ、Ｃ−４７４）で８％の酸素／バランスＮ２に露出させて誘導した。このような一時的一側脳虚血症（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈａｅｍｉａ）モデルは、同側半球（ｉｐｓｉｌａｔｅｒａｌ ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｅ）で再生可能な脳損傷を発生させるが、対側半球（ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｅ）では発生させない。ＴＩＭ−３−抑制（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）実験のために、Ｈ／Ｉ３０分後にマウスに１００μｇのラット（ｒａｔ）ＩｇＧ２ａ、ｋ ｉｓｏｔｙｐｅ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１６−４３２１）または抗ＴＩＭ−３モノクロニル抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＲＭＴ−３−２３）を静脈注射した。Ｈ／Ｉの２４時間が経った後マウスを殺した後、脳を除去し、直ちに２ｍｍ厚さのセクションで切った後、ＴＴＣと共に３７℃で３０分間培養した。前記セクションのイメージは、カメラが装着された立体顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ｓｔｅｒｅｏ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．Ｖ２０）で観察した。梗塞（ｉｎｆａｒｃｔ）体積は、梗塞組織の浮腫に対して償う間接的な方式で測定し、半球面積に対する損傷面積の割合の百分率で計算し、浮腫による半球の膨潤（ｓｗｅｌｌｉｎｇ）は補正された。梗塞体積の計算式は、以下の通りである（非特許文献４）：
梗塞体積（Ｉｎｆａｒｃｔ ｖｏｌｕｍｅ）（％）＝［（対側性半球−同側性半球の健康な領域）／対側性半球］×１００

【0033】

＜１−３＞磁気共鳴映像の測定（Ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｓ）
マウスを動物ベッドに固定させ、ＭＲＩ測定装備（Ｂｒｕｋｅｒ７Ｔ ＢｉｏＳｐｅｃ）下に位置させた後、映像測定の間麻酔させる。Ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅを持ったＲａｐｉｄ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎを利用してＴ２−加重された（ｗｅｉｇｈｔｅｄ）イメージを得た。０．７ｍｍ厚さの１８個の隣接軸スライスを得た［ｍａｔｒｉｘ２５６×２５６；ｆｉｅｌｄ ｏｆ ｖｉｅｗ＝２０×２０ｍｍ；ＴＲ（Ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ）＝２，５００ｍｓ；ＴＥ（Ｅｃｈｏ Ｔｉｍｅ）＝３５ｍｓ；ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｔｉｍｅ＝４分；ｎｏ ｇａｐ］。ＡＤＣ（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）マップは、スピン−エコーシーケンスを利用して拡散加重された（ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ−ｗｅｉｇｈｔｅｄ）イメージによって得た。このため、８個の隣接軸イメージを得た［ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ０．７ｍｍ、ｍａｔｒｉｘ２５６×１２８、ｆｉｅｌｄ ｏｆ ｖｉｅｗ＝２０×２０ｍｍ、ＴＲ＝２，０００ｍｓ、ＴＥ＝２６．９３６ｍｓ、ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｔｉｍｅ＝１６分、１ａｖｅｒａｇｅ、ｂ ｖａｌｕｅｓ＝４５，３５０、ｍｍ^２当たり１，０００及び２，０００ｓ、ｎｏ ｇａｐ］。ＡＤＣマップは、スキャナで得た。浮腫体積は、Ｔ２−加重されたイメージから得、ＡＤＣマップは、Ｉｍａｇｅ Ｊ ａｎａｌｙｓｅｒから得た。浮腫体積（Ｏｅｄｅｍａ ｖｏｌｕｍｅ）（％）＝［（同側性体積−対側性体積）／対側性体積］×１００。

【0034】

＜１−４＞マウス脳組織から小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）及び星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）の分離
公知の方法によって脳組織から小膠細胞を分離した（非特許文献５）。簡単に説明すると、かん流された（ｐｅｒｆｕｓｅｄ）マウスから脳を除去し、同側性（ｉｐｓｉｌａｔｅｒａｌ）及び対側性（ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ）半球に分けた後、研いで２５０μｇｍｌ^−１のｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ＩＶ／ＤＮａｓｅ Ｉを処理した後、３７℃で４５分間培養して分解した。その細胞分解産物を５０／７０％Ｐｅｒｃｏｌｌ濃度勾配（ｇｒａｄｉｅｎｔｓ）で１，０００ｇで２５分間分画した。５０及び７０％バンド間の境界面で小膠細胞を集め、ＨＢＳＳ（ｈａｎｋｓ’ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）で洗浄した（Ｗｅｌｇｅｎｅ）。分離した小膠細胞の純度は、ＦＡＣＳ分析で測定した。公知の方法によって星状細胞を分離した（非特許文献６）。簡単に説明すると、脳組織からの細胞サスペンション（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ）を３０／６０％のＰｅｒｃｏｌｌ濃度勾配（ｇｒａｄｉｅｎｔｓ）で１，０００ｇで２５分間分画した。ＰＢＳ／３０％の境界面で星状細胞を収集した。分離した星状細胞の純度は、抗−ＧＦＡＰ抗体を利用したＦＡＣＳ分析で測定した（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃３６７０、１：５００）。

【0035】

＜１−５＞神経膠細胞及びニューロン強化（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）中脳培養
１ないし３日が過ぎたマウスの大脳皮質からマウス１次混合神経膠細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｍｉｘｅｄ ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）を培養した（非特許文献７）。抗ＣＤ１１ｂ抗体を使用したＦＡＣＳ分析によってマウスの混合神経膠細胞の培養で小膠細胞の割合は３０．５０％と測定された（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１１−０１１２、５μｇｍｌ^−１）。１４胎児日（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｄａｙ）のマウスからニューロン強化（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）中脳細胞を培養した（非特許文献７）。簡単に説明すると、腹側の中脳組織（ｖｅｎｔｒａｌ ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ ｔｉｓｓｕｅｓ）を切開し、ＣＭＦ−ＨＢＳＳ（Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋−ｆｒｅｅ ＨＢＳＳ）で１０分間培養し、ＣＭＦ−ＨＢＳＳ内の０．０１％のトリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）で９分間３７℃で培養した。培養物を１０％ウシ胎児血清、６ｍｇｍｌ^−１グルコース、２０４ｍｇｍｌ^−１Ｌ−グルタミン及びトリプシンの阻害のための１００Ｕｍｌ^−１ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を添加したＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）で二回洗浄した後、粉砕して単一細胞に分離させた。細胞をポリ−Ｄ−ｌｙｓｉｎｅ（５ｍｇｍｌ^−１）及びラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）（０．２ｍｇｍｌ^−１）コーティングプレートに分注した（ウェル当たり２×１０^６細胞）。

【0036】

＜１−６＞アデノウイルス形質導入（Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）
Ｃｒｅ再組合酵素遺伝子がサイトメガロウイルスプロモータの調節下で発現される非増殖性アデノウイルス（ＡＤ−ＧＦＰ／Ｃｒｅ）をＶｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。レポーターＡｄ−ＧＦＰを対照群として使用した（Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ）。アデノウイルスの形質導入のために、１次混合神経膠細胞をＨＩＦ−１α^{＋ｆ／＋ｆ}マウスから培養し、Ａｄ−ＧＦＰまたはＡｄ−ＧＦＰ／Ｃｒｅで２４時間の間感染させた［ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）＝１００］。フローサイトメトリーで測定された感染効率（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）は、約５０％であった。

【0037】

＜１−７＞ＣｈＩＰアッセイ
ＣｈＩＰアッセイキット（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用してＣｈＩＰアッセイを行った。マウス１次混合神経膠細胞を低酸素環境で２４時間の間培養し、直ちに１％ホルムアルデヒド／ホスフェート−バッファー食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で固定し、超音波処理して５００ないし１，０００−ｂｐ ＤＮＡ断片を得た。クロマチン（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ）を５μｇの抗ＨＩＦ−１α（Ｎｏｖｕｓ、ＮＢ１００−１３４）またはウサギＩｇＧで免疫沈殿させた。免疫沈殿されたＤＮＡをＴＩＭ−３−プロモータに特異的なプロモータ対で増幅させた［Ｆ，５’−ＣＣＴＧＣＴＧＣＴＴＴＧＧＡＡＴＴＴＧＣ−３’（序列番号３）；及びＲ，５’−ＧＡＧＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＧＧＧＡＡＡＴＣ−３’（序列番号４）］。

【0038】

＜１−８＞好中球移動測定（Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）
ＦＩＴＣ−結合された抗ＣＤ１１ｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１１−０１１２、５μｇｍｌ^−１）及びＰＥ−結合された抗Ｇｒ−１（Ｌｙ６Ｇ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１２−５９３１、２ｕｇｍｌ^−１）の結合に基づいて、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して好中球を分離した。分類された好中球をトランスウェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）の上側チャンバにマウス１次混合神経膠細胞が分注された２４−ウェルプレート上に添加した。前記細胞を１％または２０％の酸素条件で２４時間の間培養した。移動（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｉｏｎ）は、ヘマサイトメータ（ｈａｅｍａｔｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）及びフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を利用して測定した。

【0039】

＜１−９＞神経学的後遺症（ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｅｆｉｃｉｔｓ）の測定
神経学的後遺症は、神経学的スコアリングシステム（ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）を使用して評価した（非特許文献８）。マウスの神経学的点数は、以下の通りである：０、正常運動機能（ｎｏｒｍａｌ ｍｏｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）；１、しっぽ持ち上げによる対側性胴体及び前肢の屈折（ｆｌｅｘｉｏｎ ｏｆｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ ｔｏｒｓｏ ａｎｄ ｆｏｒｅｌｉｍｂ ｕｐｏｎ ｌｉｆｔｉｎｇ ｂｙ ｔａｉｌ）；２、対側への回転（ｃｉｒｃｌｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ ｓｉｄｅ ｗｈｅｎ ｍｏｕｓｅ ｗａｓ ｈｅｌｄ ｂｙ ｔｈｅ ｔａｉｌ、ｂｕｔ ｎｏｒｍａｌ ｐｏｓｔｕｒｅ ａｔ ｒｅｓｔ）；３、休息期対側への偏向（ｌｅａｎｉｎｇ ｔｏ ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ ｓｉｄｅ ａｔ ｒｅｓｔ）；及び４、自発的運動能力の喪失（ｎｏ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｍｏｔｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ）。

【0040】

＜１−１０＞免疫組織化学（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
免疫組織化学のために脳を除去し、パラフィンに固定及び包埋した。ミクロトーム（ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）を使用して梗塞部位を通じて冠状部（ｃｏｒｏｎａｌ ｓｅｃｔｉｏｎｓ）（１０−ｍｍ厚さ）を切ってスライドにマウントした。パラフィンを除去し、セクションをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、１０％ウシ血清アルブミンで２時間の間ブロッキングした。その後、次の１次抗体を適用した：ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ＴＩＭ−３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−３０３２６、２μｇｍｌ^−１）、ｒａｔ ａｎｔｉ−Ｇｒ−１（Ｌｙ６Ｇ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＭＰＯ（Ｄａｋｏ、Ａ０３９８、１０μｇｍｌ^−１）、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−Ｉｂａ−１（Ｗａｋｏ、＃０１９−１９７４１、２μｇｍｌ^−１）、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ−３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃９６６２Ｓ、１：３００）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ＮｅｕＮ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、＃ＭＡＢ３７７、１０μｇｍｌ^−１）。ピモニダゾール（ｐｉｍｏｎｉｄａｚｏｌｅ）（Ｈｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ−１、Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して低酸素領域を検出した（非特許文献９）。共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０）を使用してイメージを得た。１次神経膠細胞でＴＩＭ−３発現の測定のために、マウス１次混合神経膠細胞をメタノールで固定し、ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、抗ＴＩＭ−３抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＦ１５２９、１μｇｍｌ^−１）で４℃で培養した。

【0041】

＜１−１１＞ＴＩＭ−３プロモータアッセイ
ゲノムＤＮＡからマウスＴＩＭ−３プロモータの１，５１７−ｂｐ断片（始めコドンに対して−１，５１７から＋１）をＰＣＲ−増幅し、ＰＧＬ３ ｂａｓｉｃ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。突然変異プライマー及びＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ重合酵素（ＮＥＢ）を使用して、それぞれのＨＲＥの部位特異的突然変異（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を行った。全ての製作物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）は、ＤＮＡシークエンシングで確認した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してマウス１次混合神経膠細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｍｉｘｅｄ ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）をトランスフェクションした。トランスフェクション後に、細胞を１％または２０％の酸素条件で２４時間の間培養し、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）でレポーター遺伝子活性を測定した。トランスフェクション効率の標準化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）のためにベータ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）活性を測定した。

【0042】

＜１−１２＞ウエスタンブロットの分析
Ｈ／Ｉマウスの右側及び左側半球を切開し、プロテアーゼ阻害剤（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）［２ｍＭ ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｐｈｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ、１００μｇｍｌ^−１ ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１０μｇｍｌ^−１ ｐｅｐｓｔａｔｉｎ、１μｇｍｌ^−１ ａｐｒｏｔｉｎｉｎ及び２ｍＭ ＥＤＴＡ］を含有した氷冷却したＲＩＰＡバッファーでｐｅｌｌｅｔ ｐｅｓｔｌｅ（Ｆｉｓｈｅｒ）で均質化した。均質化物を４℃で１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上層液を収去した。サンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分離し、ニトロセルロース膜（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）に移し、次の１次抗体と共に培養した：ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ＴＩＭ−３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＦ１５２９、０．１μｇｍｌ^−１）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ＰＡＲＰ（Ｚｙｍｅｄ、３３−３１００、２μｇｍｌ^−１）、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ＭＰＯ（Ｄａｋｏ、Ａ０３９８、２μｇｍｌ^−１）、ｇｏａｔ ａｎｔｉ−Ｉｂａ−１（Ａｂｃａｍ、ａｂ５０７６、０．５μｇｍｌ^−１）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ＧＦＡＰ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃３６７０、１：１，０００）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ＮｅｕＮ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、＃ＭＡＢ３７７、１μｇｍｌ^−１）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−α−ｔｕｂｕｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ、Ｔ５１６８、１：５，０００）、ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、＃ＭＡＢ３４１８、１μｇｍｌ^−１）、ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（Ａｂｃａｍ、ａｂ１１０７０、１μｇｍｌ^−１）、ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，＃１７０−６５１５，１：５，０００）、ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ｇｏａｔ（Ｚｙｍｅｄ，Ｒ−２１４５９，１：５，０００）、ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，＃１７０−６５１６，１：５，０００）。結果は、増加された化学発光システム（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｓｙｓｔｅｍ）を使用して視覚化し、濃度計（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）（Ｉｍａｇｅ Ｊ ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＮＩＨ）で定量した。全ての実験は、独立して少なくとも３回繰り返して行われた。

【0043】

＜１−１３＞ＲＴ−ＰＣＲ分析
Ｅａｓｙ−Ｂｌｕｅ（ｉＮｔＲＯＮ）を使用して総ＲＮＡを分離し、ａｖｉａｎ ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を製造社の説明に従って使用してｃＤＮＡを合成した。２５−３０サイクルの連続反応でＰＣＲを行った。全ての実験は、独立して少なくとも３回繰り返して行われ、ＰＣＲ産物は、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ Ｊを使用して定量してアクチンに対して標準化した。ＱｕａｎｔｉＦａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを行った。Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）及びＬｉｇｔｈＣｙｃｌｅｒ ４８０ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ１．５を使用してｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを行い分析した。

【0044】

定量的（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ）ＰＣＲに使用されたプライマーは、以下の通りである：
ＩＬ−１βに対して（ｆｏｒｗａｒｄ）５’−ＧＧＡＴＧＡＧＧＡＣＡＴＧＡＧＣＡＣＣＴ−３’（序列番号５）及び（ｒｅｖｅｒｓｅ）５’−ＴＣＣＡＴＴＧＡＧＧＴＧＧＡＧＡＧＣＴＴ−３’（序列番号６）；
ＣＸＣＬ１に対して（ｆｏｒｗａｒｄ）５’−ＴＧＣＡＣＣＣＡＡＡＣＣＧＡＡＧＴＣＡＴ−３’（序列番号７）及び（ｒｅｖｅｒｓｅ）５’−ＴＴＧＴＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＣＧＴＴＣＡＣ−３’（序列番号８）；
ＨＩＦ−１αに対して（ｆｏｒｗａｒｄ）５’−ＣＴＣＡＴＣＡＧＴＴＧＣＣＡＣＴＴＣＣ−３’（序列番号９）及び（ｒｅｖｅｒｓｅ）５’−ＴＣＡＴＣＴＴＣＡＣＴＧＴＣＴＡＧＡＣＣＡＣ−３’（序列番号１０）；
ＧＡＰＤＨに対して（ｆｏｒｗａｒｄ）５’−ＴＧＴＣＧＴＧＧＡＧＴＣＴＡＣＴＧＧＴＧＴＣＴＴＣ−３’（序列番号１１）及び（ｒｅｖｅｒｓｅ）５’−ＣＧＴＧＧＴＴＣＡＣＡＣＣＣＡＴＣＡＣＡＡ−３’（序列番号１２）。

【0045】

その他に使用されたＰＣＲプライマー序列は、以下の通りである：
ＴＩＭ−３に対して（ｆｏｒｗａｒｄ）５’−ＣＣＣＴＧＣＡＧＴＴＡＣＡＣＴＣＴＡＣＣ−３’（序列番号１３）及び（ｒｅｖｅｒｓｅ）５’−ＧＴＡＴＣＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＡＧＧＴＣ−３’（序列番号１４）；
ＨＩＦ１αに対して（ｆｏｒｗａｒｄ）５’−ＡＧＣＣＴＴＡＡＣＣＴＧＴＣＴＧＣＣＡＣＴＴ−３’（序列番号１５）及び（ｒｅｖｅｒｓｅ）５’−ＧＡＡＡＴＣＡＴＴＴＡＡＣＡＴＴＧＣＡＴＡＴＡＴＡＣＴＡＧＡＡＣＡＴ−３’（序列番号１６）；
ＭＰＯに対して（ｆｏｒｗａｒｄ）５’−ＡＧＧＡＴＡＧＧＡＣＴＧＧＡＴＴＴＧＣＣＴＧ−３’（序列番号１７）及び（ｒｅｖｅｒｓｅ）５’−ＧＴＧＧＴＧＡＴＧＣＣＡＧＴＧＴＴＧＴＣＡ−３’（序列番号１８）；
ＩＬ−１βに対して（ｆｏｒｗａｒｄ）５’−ＴＡＣＡＧＧＣＴＣＣＧＡＧＡＴＧＡＡＣＡＡＣＡＡ−３’（序列番号１９）及び（ｒｅｖｅｒｓｅ）５’−ＴＧＧＧＧＡＡＧＧＣＡＴＴＡＧＡＡＡＣＡＧＴＣＣ−３’（序列番号２０）；
ＣＸＣＬ１に対して（ｆｏｒｗａｒｄ）５’−ＣＧＣＴＣＧＣＴＴＣＴＣＴＧＴＧＣＡＧＣ−３’（序列番号２１）及び（ｒｅｖｅｒｓｅ）５’−ＧＴＧＧＣＴＡＴＧＡＣＴＴＣＧＧＴＴＴＧＧ−３’（序列番号２２）；
Ａｃｔｉｎに対して（ｆｏｒｗａｒｄ）５’−ＣＡＴＧＴＴＴＧＡＧＡＣＣＴＴＣＡＡＣＡＣＣＣＣ−３’（序列番号２３）及び（ｒｅｖｅｒｓｅ）５’−ＧＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＴＣＧＡＡＧＴＣＴＡＧ−３’（序列番号２４）。

【0046】

＜１−１４＞フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）
全ての染色段階は、闇中で行われ、ＢＤ Ｆｃ Ｂｌｏｃｋで遮断された。新たに得た小膠細胞及び星状細胞を、次の抗体で染色した：ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−Ｉｂａ−１（Ｗａｋｏ、＃０１９−１９７４１、１μｇｍｌ^−１）後にＡｌｅｘａ ４８８−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｃｈｉｃｋ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ２１４４１、２μｇｍｌ^−１）、及びＰＥ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＴＩＭ−３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＲＭＴ−３−２３、２μｇｍｌ^−１）またはｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ Ａｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、２μｇｍｌ^−１）で４℃で３０分間、ＧＦＡＰの細胞内染色のために、ＩＣ ｆｉｘａｔｉｏｎ／ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎバッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して細胞を２０分間固定及び透過化し、透過化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）バッファーで二回洗浄し、抗ＧＦＡＰ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃３６７２、１：５００）と共に透過化バッファーで３０分間培養し、Ａｌｅｘａ ４８８−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｃｈｉｃｋ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ２１２００、２μｇｍｌ^−１）で染色した。データは、Ｃｅｌｌ−Ｑｕｅｓｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＦｌｏｗ Ｊｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）パッケージで分析した。

【0047】

＜１−１５＞レンチウイルス生産及び定位注射（ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）
ＴＩＭ−３（ＧＥ Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）のコーディング序列をＰＬＬ３．７．ＥＦ１αプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｉｎｃ．）に接合させてＰＬＬ３．７．ＥＦ１α−ＴＩＭ３を製作した。前記プラスミドを使用して再組合レンチウイルスＬＶ−ＴＩＭ３−ＧＦＰを製作した。対照群としてＧＦＰのみを発現するレンチウイルスベクター（ＬＶ−ＧＦＰ）を作った。レンチウイルスをフローサイトメトリーを使用して滴定した（非特許文献１０）。脳固定装置（ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を利用してＬＶ−ＴＩＭ３−ＧＦＰまたはＬＶ−ＧＦＰを注射した。それぞれのマウスは、４回のレンチウイルス（５×１０^６ＴＵｍｌ^−１を含有した２０μリットルを右側半球に）頭蓋注射（ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ）を打たれた。試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）蛍光イメージングのため、収集された細胞をＦＡＣＳ及び抗ＧＦＰ抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、ｓｃ−９９９６、１：１，０００）を使用したウエスタンブロッティングで分析した。Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ’ｓ Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍを使用して全身の生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）イメージングを行った［励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）フィルターで４４５から４９０ｎｍ、放出（ｅｍｉｓｓｉｏｎ）フィルターで５１５から５７５ｎｍで照射］。

【0048】

＜１−１６＞データの分析
全てのデータは、平均±ｓ．ｄで表示した。ＳｉｇｍａＰｌｏｔ１０．０を使用してＰｏｓｔ−ｈｏｃ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ（Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ ｔｅｓｔ）を行った。神経学的点数（ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｃｏｒｅｓ）は非母数的（ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ）統計処理で評価した。二つのグループ（ＩｇＧ ｖｓ ａｎｔｉ−ＴＩＭ−３、ＨＩＦ−１α^{＋ｆ／＋ｆ}マウス ｖｓ ＬｙｓＭ−Ｈｉｆ−１α^−／−マウス、ＬＶ−ＧＦＰ注射 ＬｙｓＭ−Ｈｉｆ−１α^−／−マウス ｖｓ ＬＶ−ＴＩＭ３−ＧＦＰ注射ＬｙｓＭ− Ｈｉｆ−１α^−／−）間の比較は、Ｍａｎｎ−ｈｉｔｎｅｙ Ｕ−ｔｅｓｔｓで分析した。

【実施例2】

【0049】

低酸素半陰影（ｈｙｐｏｘｉｃ ｐｅｎｕｍｂｒａ）でのＴＩＭ−３発現の増加
虚血性脳損傷と炎症間の相互依存的関連性の基礎となる分子的機作を調べるために、本発明者らは、脳の低酸素虚血症（ｃｅｒｅｂｒａｌ ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｓｃｈａｅｍｉａ、Ｈ／Ｉ）による病態生理学的炎症反応に主な役割をすることができる候補分子を調査した。このため、右側頚動脈の一方接合（ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ）後、全身的低酸素症（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｈｙｐｏｘｉａ）を誘発した一時的一側脳虚血症（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈａｅｍｉａ）マウスモデルを利用した（非特許文献１１）。Ｈ／Ｉの２４時間後に対側性（ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ）及び半陰影（ｐｅｎｕｍｂｒａｌ）皮質領域から組織を得た後、多様な炎症関連分子の発現水準をＲＮＡ及びタンパク質水準で調査した。その結果、同側性半陰影（ｉｐｓｉｌａｔｅｒａｌ ｐｅｎｕｍｂｒａ）でＴＩＭ−３（Ｔ−ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ ｍｕｃｉｎ ｄｏｍａｉｎ−３）の転写水準が対側性領域（ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ ｒｅｇｉｏｎｓ）ではるかに高く増加したことを発見した。また、同側性半陰影（ｉｐｓｉｌａｔｅｒａｌ ｐｅｎｕｍｂｒａ）でＴＩＭ−３タンパク質も対側性領域より増加したことを確認した（図１ａ、ｂ）。前記同側性半陰影領域は、低酸素下で陽性対照群（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）であるＨＩＦ−１の転写体及びタンパク質水準が高いと報告された（非特許文献１２；及び非特許文献１３）。

【0050】

上記結果を確証するために、ＴＩＭ−３に対する抗体を利用してＨ／Ｉマウスの冠状面（ｃｏｒｏｎａｌ ｓｅｃｔｉｏｎｓ）に免疫組織化学法を行った（非特許文献１４；及び非特許文献１５）。その結果、上記結果と一致するように、同側性半陰影でＴＩＭ−３−陽性細胞が非常に増加したことが確認できた（図１ｃ）。さらに低酸素症マーカーであるピモニダゾール（ｐｉｍｏｎｉｄａｚｏｌｅ）（ｈｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ−１）を利用して、Ｈ／Ｉマウスのｈｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ−１染色された低酸素半陰影でＴＩＭ−３が高く発現されたことを確認した（図１ｄ）。

【0051】

このような結果は、ＴＩＭ−３発現が低酸素半陰影で上向き調節されるということを示し、ＴＩＭ−３が脳虚血による病態生理学的変化に所定の役割ができることを示唆する。

【実施例3】

【0052】

低酸素環境の神経膠細胞でＴＩＭ−３発現の上向き調節
本発明者は、Ｈ／Ｉ後に如何なる細胞がＴＩＭ−３の上向き調節（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）を表すについて調査した。ウエスタンブロット分析の結果、Ｈ／Ｉ２４時間後にＨ／Ｉマウスの同側性皮質で、活性化された小膠細胞マーカーであるＩｂａ−１（ｉｏｎｉｚｅｄ ｃａｌｃｉｕｍｂｉｎｄｉｎｇ ａｄａｐｔｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）及び活性化された星状膠細胞マーカーであるＧＦＡＰ（ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）のタンパク質発現水準が対側性皮質よりさらに高かった。一方、ＮｅｕＮ（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｎｕｃｌｅｉ）、マイクロチューブル−連関タンパク質２（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）及びグルタメートデカルボキシラーゼ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）のようなニューロン細胞マーカーの発現水準は、半陰影皮質組織（ｐｅｎｕｍｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ ｔｉｓｓｕｅｓ）で減少した。

【0053】

従って、本発明者らは、Ｈ／Ｉ２４時間後に小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）及び星状膠細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）でＴＩＭ−３の発現水準を調査した。免疫組織化学の結果、Ｈ／Ｉマウスの同側性皮質でＴＩＭ−３−発現細胞の多くの領域は、Ｉｂａ−１陽性で表れた。また、同側性皮質のＧＦＡＰ−免疫活性（ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ）星状膠細胞でＴＩＭ−３の強い発現も観察された。さらに、Ｈ／Ｉマウスから分離した脳細胞のＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）分析の結果、低酸素虚血症（ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｓｃｈａｅｍｉａ）は、小膠細胞及び星状膠細胞の活性をもたらし、これは、増加したＴＩＭ−３の発現を表す。高い水準のＩｂａ−１を発現する小膠細胞及び高い水準のＧＦＡＰを発現する星状膠細胞は、Ｈ／Ｉ２４時間後に同側性半陰影（ｉｐｓｉｌａｔｅｒａｌ ｐｅｎｕｍｂｒａ）で非常に増加し、これは、小膠細胞及び星状膠細胞が低酸素環境で活性化されたことを意味する。また、ＴＩＭ−３の発現は、同側性皮質から分離したＩｂａ−１−陽性小膠細胞及びＧＦＡＰ−陽性星状膠細胞において、対側性領域で分離したものより、有意味な水準で高く表れた（図１ｅ、ｆ）。

【0054】

このような結果は、低酸素下で活性化された小膠細胞及び星状膠細胞でＴＩＭ−３の発現が非常に増加するという事実を裏付ける。

【実施例4】

【0055】

低酸素環境でＴＩＭ−３のＨＩＦ−１−依存的増加
前記実験結果に基づいて本発明者らは、神経膠細胞（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ）でＴＩＭ−３の発現が酸素分圧（ｏｘｙｇｅｎ ｔｅｎｓｉｏｎ）によって変更され得るか否かを、ＢＶ２小膠細胞及び１次培養された神経膠細胞を使用して実験した。ＢＶ２細胞は、正常酸素（ｎｏｒｍｏｘｉｃ）（２０％のＯ_２）または低酸素（ｈｙｐｏｘｉｃ）（１％のＯ_２）条件で２４時間の間培養し、ＴＩＭ−３の細胞表面水準は、ＦＡＣＳ分析で測定した。興味深いことに、ＴＩＭ−３発現は、低酸素条件で非常に増加した（図２ａ）。免疫細胞化学（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）の分析結果も、マウス１次混合神経膠細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｍｉｘｅｄ ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）でＴＩＭ−３発現が正常酸素（ｎｏｒｍｏｘｉｃ）環境に比べて低酸素（ｈｙｐｏｘｉｃ）環境で非常に増加するということを示した（図２ｂ）。また、本発明者らは、低酸素環境でＴＩＭ−３の転写水準が１次混合神経膠細胞では増加したことに対し、１次ニューロン細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｌｌｓ）では増加しないことを確認した（図２ｃ、ｄ）。このような結果は、神経膠細胞で低酸素症がＴＩＭ−３発現を誘導することを示す。

【0056】

ＨＩＦ−１は、低酸素環境で多くの遺伝子の主な転写調節因子である。神経膠細胞で低酸素によって刺激されたＴＩＭ−３の上向き調節がＨＩＦ−１によって媒介されるかについて調べるために、本発明者らは、抗ＨＩＦ−１α抗体及び潜在的ＨＲＥコンセンサス序列（ＨＩＦ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＨＲＥ）ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）を含むＴＩＭ−３プロモータ領域（ｅｌｅｍｅｎｔｓ）を利用してＣｈＩＰアッセイ（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）を行った。図２ｅに示すように、低酸素環境の１次混合神経膠細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｍｉｘｅｄ ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ）でＨＩＦ−１αは、ＨＲＥ−含みＴＩＭ−３プロモータ領域に結合することができた。さらに、上記の結果を確認するために、本発明者らは、ＨＩＦ−１α−欠乏神経膠細胞でＴＩＭ−３プロモータの活性を調査した。ＨＩＦ−１α^{ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ}（ＨＩＦ−１α^{＋ｆ／＋ｆ}）マウスから１次混合神経膠細胞を培養した後、アデノウイルス−Ｃｒｅ／ＧＦＰ（Ａｄ−Ｃｒｅ／ＧＦＰ）または対照群ＧＦＰ（緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を暗号化するアデノウイルス（Ａｄ−ＧＦＰ））で感染させた。ＦＡＣＳを利用してウイルス感染の効率を確認し、細胞をＴＩＭ−３ルシフェラーゼレポーター（−１，５１７／＋１）でトランスフェクションした後、ＴＩＭ−３プロモータ活性を測定した。予想どおり、低酸素環境でＴＩＭ−３プロモータ活性は、対照群Ａｄ−ＧＦＰ−感染された神経膠細胞（ＨＩＦ１α^{＋ｆ／＋ｆ}）では非常に増加したが、Ａｄ−Ｃｒｅ／ＧＦＰ−感染された、ＨＩＦ−１α−欠乏神経膠細胞（ＨＩＦ１α^Δ／Δ）では非常に減少した（図２ｆ）。ＴＩＭ−３プロモータの潜在的ＨＲＥｓの部位特異的突然変異（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）は、ルシフェラーゼ活性の低酸素−依存的増加を野生型レポーターに比べて非常に減少させた。また、Ａｄ−Ｃｒｅ／ＧＦＰ−感染されたＨＩＦ−１α−欠乏神経膠細胞でＴＩＭ−３転写体及びタンパク質の低酸素刺激による増加は非常に抑制された（図２ｇ、ｈ）。

【0057】

このような結果は、低酸素環境でＴＩＭ−３の発現がＨＩＦ−１−依存的方式で調節されることを示す。

【実施例5】

【0058】

マウスＨ／ＩモデルでＴＩＭ−３抑制による脳損傷の減少
Ｈ／Ｉマウスモデルの神経膠細胞でＴＩＭ−３が上向き調節されたので、本発明者らは、大脳（ｃｅｒｅｂｒａｌ）Ｈ／Ｉ後に脳で低酸素誘導されたＴＩＭ−３の役割を調査した。このため、Ｈ／Ｉ２４時間後にＴＩＭ−３−抑制抗体が脳損傷に及ぼす影響をＴＴＣ（２，３，５−ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）染色を利用して調査した。図３ａに示すように、対照群ＩｇＧ−注射マウスに比べて１００μｇのＴＩＭ−３−抑制抗体を静脈注射したマウスでＴＴＣ−陰性領域が非常に減少したことを確認することができた。このような結果は、低酸素環境でＴＩＭ−３−抑制抗体が脳損傷を減少させることができることを示す。

【0059】

脳梗塞の生命を脅威する結果である浮腫は、炎症と虚血性脳損傷に伴って表れる（非特許文献１６）。従って、本発明者らは、ＴＩＭ−３−抑制がＨ／Ｉによる浮腫の形成に及ぼす影響を調査した。梗塞（ｉｎｆａｒｃｔ）領域と浮腫の形成を観察するために、Ｈ／Ｉの１日から７日までＴ２−加重（ｗｅｉｇｈｔｅｄ）磁気共鳴映像を得た。ＴＴＣ染色から得た結果と同様に、Ｈ／Ｉの１日目、ＴＩＭ−３−抗体−注入マウスの同側性半球（ｉｐｓｉｌａｔｅｒａｌ ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｅｓ）で梗塞と浮腫の形成は、ＩｇＧ−注入マウスに比べて非常に減少し（図３ｂ−ｄ）、このような浮腫の形成と梗塞の減少は、３、５及び７日目にも持続した（図３ｃ、ｄ）。

【0060】

Ｈ／Ｉ後の脳損傷とＴＩＭ−３の関連性を追加で調査するために、ＴＩＭ−３−抑制抗体がニューロン細胞の死滅に及ぼす影響を、脳虚血症に重要な役割をする細胞死滅エフェクタープロテアーゼ（ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｐｒｏｔｅａｓｅ）であるカスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）−３の発現を測定することで調査した（非特許文献１７；及び非特許文献１８）。免疫組織化学の結果、ＩｇＧ−処理Ｈ／Ｉマウスの同側性皮質領域のニューロン細胞でカスパーゼ−３の発現は非常に増加したことに対し、ＴＩＭ−３抑制抗体処理マウスでこのような増加は非常に減少した（図３ｅ）。次に、対照群ＩｇＧまたはＴＩＭ−３−抑制抗体を処理したＨ／Ｉマウスの同側性及び対側性皮質において、カスパーゼ−３によって切断するカスパーゼ−３活性のマーカーで、虚血性細胞の死滅と関連のあるＰＡＲＰ（ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）の水準を測定した（非特許文献１９）。図３ｆに示すように、対照群ＩｇＧ−注射Ｈ／Ｉマウスの同側性皮質組織で全長ＰＡＲＰの発現は非常に減少したが、ＴＩＭ−３−抑制抗体−注射Ｈ／Ｉマウスでは減少しなかった。

【0061】

このような結果は、ＴＩＭ−３の抑制がマウスで脳虚血症後の梗塞部位とニューロン細胞の死滅を非常に減少させることができることを示す。

【実施例6】

【0062】

ＴＩＭ−３抑制による好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）の浸潤の減少
様々な研究によると、好中球は、虚血性脳で数時間中に速く浸潤されて、炎症反応と脳損傷の発生に関与する（非特許文献２０；及び非特許文献２１）。神経膠細胞は、虚血症発生後の数分内に関連した活性を表す脳損傷に１次的に反応する細胞のうち一つであるので、本発明者らは、神経膠細胞でＴＩＭ−３のＨＩＦ−１−依存的増加が好中球の虚血半陰影（ｉｓｃｈａｅｍｉｃ ｐｅｎｕｍｂｒａ）への浸潤に影響を及ぼし、ＴＩＭ−３が好中球を集める能力の下向き調節（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）は、脳虚血後の脳損傷を減少させることができるという仮説を立てた。これにより、先ず代表的な二つの好中球マーカーであるＭＰＯ（ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）及びＧｒ−１（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１）の発現を測定し、Ｈ／Ｉ後、２４時間になった時、対側性領域に比べて半陰影皮質（ｐｅｎｕｍｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ）及び線条体（ｓｔｒｉａｔｕｍ）で前記マーカーに陽性である細胞（ＭＰＯ^＋Ｇｒ−１^＋）が大きく増加することを確認した。次に、本発明者らは、神経膠細胞（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）が低酸素環境でＧｒ−１^ｈｉｇｈＣＤ１１ｂ^ｈｉｇｈ好中球を集めることができるか否かについて調査した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスから脾臓細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ）を分離し、１次混合神経膠細胞または兔疫細胞を損傷部位に集めると知られたマウス胎仔線維芽細胞（ｍｕｒｉｎｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）の対照群細胞を含むか含まないトランスウェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）システムにおいて、１または２０％の酸素条件で２４時間の間培養した（非特許文献２２）。神経膠細胞またはマウス胎仔線維芽細胞の存在下で、Ｇｒ−１^ｈｉｇｈＣＤ１１ｂ^ｈｉｇｈ細胞は、低酸素環境では下側チャンバに非常に多く移動したが、正常（ｎｏｒｍｏｘｉｃ）環境では数個の細胞のみが移動した。しかし、このようなＧｒ−１^ｈｉｇｈＣＤ１１ｂ^ｈｉｇｈ細胞の移動の低酸素依存的増加は、神経膠細胞のない状態では非常に減少した。このような結果は、神経膠細胞が低酸素環境でＧｒ−１^ｈｉｇｈＣＤ１１ｂ^ｈｉｇｈ細胞を集めることに関与し得ることを示唆する。

【0063】

次に、本発明者らは、Ｈ／Ｉ後の２４時間になった時、ＴＩＭ−３−抑制が好中球の同側性半球（ｉｐｓｉｌａｔｅｒａｌ ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｅｓ）への浸潤に及ぼす効果を実験した。Ｈ／Ｉマウスの皮質組織に対する逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）及びウエスタンブロット分析の結果は、対照群ＩｇＧ−処理マウスに比べてＴＩＭ−３−抑制抗体−処理マウスでＭＰＯ発現の水準が非常に減少することを示した（図４ａ、ｂ）。同側性皮質の冠状面（ｃｏｒｏｎａｌ ｓｅｃｔｉｏｎ）に対する免疫組織化学の実験結果も、ＴＩＭ−３−抑制抗体処理によってＭＰＯ^＋Ｇｒ−１^＋細胞が非常に減少することを示す（図４ｃ）。このような結果は、抗好中球及び抗ＭＰＯ抗体を使用した免疫組織化学実験によっても確認された。また、Ｈ／Ｉ脳（ｂｒｅｇｍａ−２から＋２）の多くの同側性領域の冠状面を使用して、ＴＩＭ−３抑制が好中球の浸潤に及ぼす影響を様々な時点で測定した。図４ｄ、ｅに示すように、全ての観察時点（１〜７日）でＴＩＭ−３を抑制させたマウスの半陰影皮質及び線条体（ｓｔｒｉａｔｕｍ）でさらに少ない数のＭＰＯ^＋Ｇｒ−１^＋細胞が観察された。

【0064】

上記の結果は、低酸素環境でＴＩＭ−３が好中球の損傷された脳への浸潤と関連していることを強く示唆する。

【実施例7】

【0065】

ＴＩＭ−３の遮断による好中球補充（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）の減少
膠細胞ＴＩＭ−３が好中球の移動に及ぼす影響をさらに特異的に測定するために、低酸素環境で膠細胞が好中球を補充する能力がＴＩＭ−３の遮断によって影響を受けるか否かを調査した。トランスウェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）システムを利用して、１次膠細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）を下側チャンバにプレーティングし、ＴＩＭ−３−抑制抗体または対照群ＩｇＧで前処理した後、上側チャンバに脾臓細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ）をローディングした。１％の酸素条件で２４時間の間細胞を培養し、下側チャンバにあるＧｒ−１^ｈｉｇｈＣＤ１１ｂ^ｈｉｇｈ細胞の割合をＦＡＣＳ分析で測定した。その結果、低酸素環境で下側チャンバにあるＧｒ−１^ｈｉｇｈＣＤ１１ｂ^ｈｉｇｈ細胞が、対照群ＩｇＧに比べて、１０ｍｇのＴＩＭ−３−抑制抗体によって非常に減少したことを確認した（図５ａ）。
上記の結果をさらに検証するために、低酸素環境で骨髄（ＢＭ）由来のＧｒ−１^ｈｉｇｈＣＤ１１ｂ^ｈｉｇｈ細胞の移動を調査した。Ｇｒ−１^ｈｉｇｈＣＤ１１ｂ^ｈｉｇｈ
細胞をＢＭ細胞から分離して上側チャンバにプレーティングし、下側チャンバには、１％の酸素条件でＴＩＭ−３−抑制抗体または対照群ＩｇＧ−処理された１次混合神経膠細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｍｉｘｅｄ ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）をローディングした。上記の結果と一致するように、ＢＭ由来のＧｒ−１^ｈｉｇｈＣＤ１１ｂ^ｈｉｇｈ細胞の下側チャンバへの移動は、対照群ＩｇＧ処理に比べてＴＩＭ−３−抑制抗体処理によって非常に減少した（図５ｂ）。このような結果は、脳虚血後、低酸素領域に好中球が補充されるにあたって膠細胞ＴＩＭ−３の役割を明確に示す。

【実施例8】

【0066】

ＴＩＭ−３抑制による好中球走化因子（ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔｓ）の減少
好中球の炎症または損傷部位への浸潤は、化学走性因子（ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔｓ）によって調節され、これらは虚血後脳の好中球浸潤に先立って上向き調節される（非特許文献２３）。従って、本発明者らは、ＴＩＭ−３抑制が虚血状態の脳で好中球化学走性因子として作用するＩＬ−１β及びＣＸＣＬ１の水準に及ぼす影響を調査した（非特許文献２４）。Ｈ／Ｉ後、３０分になった時、マウスに１００ｍｇのＴＩＭ−３−抑制抗体または対照群ＩｇＧを静脈注射した。２４時間後に、同側性及び対側性皮質組織でＩＬ−１β及びＣＸＣＬ１転写水準を調査した。図５ｃ、ｄに示すように、対照群ＩｇＧを注射したＨ／Ｉマウスの同側性皮質領域でＩＬ−１β及びＣＸＣＬ１の転写体水準が全て非常に増加したが、このような効果は、ＴＩＭ−３−抑制抗体を注射したマウスでは非常に減少した。

【0067】

膠細胞ＴＩＭ−３の役割をさらに調べるために、ＴＩＭ−３の遮断がＩＬ−１β及びＣＸＣＬ１発現水準に及ぼす影響を調査した。前記細胞にＴＩＭ−３−抑制抗体または対照群ＩｇＧを処理し、１％の酸素または２０％の酸素条件下で２４時間の間培養した。上記の結果と一致するように、２０％の酸素条件に比べて１％の酸素条件で培養したＩｇＧ−処理対照群細胞でＩＬ−１β及びＣＸＣＬ１転写体の水準は増加したが、このような増加は、ＴＩＭ−３−抑制抗体を処理した細胞で非常に減少した（図５ｅ、ｆ）。

【0068】

このような結果は、細胞ＴＩＭ−３が好中球の浸潤の調節を通じて脳虚血症の発病に重要な役割をする因子であることを示す。

【実施例9】

【0069】

ＨＩＦ−１欠乏による好中球の移動及び梗塞（ｉｎｆａｒｃｔ）の減少
低酸素環境の神経膠細胞でＨＩＦ−１αがＴＩＭ−３の発現を調節するという発見に基づいて、本発明者らは、ＨＩＦ−１αが低酸素環境で神経膠細胞の好中球の補充能力に影響を及ぼすか否かを調査した。ＨＩＦ−１α^{＋ｆ／＋ｆ}マウスから培養した１次混合神経膠細胞をＡｄ−ＧＦＰまたはＡｄ−ＧＦＰ／Ｃｒｅで感染させ、トランスウェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）システムで脾臓細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ）と共に１％または２０％の酸素条件で２４時間の間培養した。低酸素環境で下側チャンバのＧｒ−１^ｈｉｇｈＣＤ１１ｂ^ｈｉｇｈ細胞の割合は、脾臓細胞をＡｄ−ＧＦＰ／Ｃｒｅ感染されたＨＩＦ−１α−欠乏神経膠細胞と共に培養した時、対照群Ａｄ−ＧＦＰ−感染細胞に比べて非常に減少した。一方、２０％の酸素条件で移動したＧｒ−１^ｈｉｇｈＣＤ１１ｂ^ｈｉｇｈ細胞の数は、ＨＩＦ−１α−欠乏及び正常細胞の間に大きな差がなかった（図６ａ）。次に、本発明者らは、移動したＢＭ−由来Ｇｒ−１^ｈｉｇｈＣＤ１１ｂ^ｈｉｇｈ細胞の数が、１％の酸素条件でＨＩＦ−１α−欠乏神経膠細胞と共に培養することによって非常に減少したことを発見した（図６ｂ）。また、対照群Ａｄ−ＧＦＰ−感染細胞に比べて、ＴＩＭ−３の低酸素−依存的増加が表れないＡｄ−ＧＦＰ／Ｃｒｅ−感染されたＨＩＦ−１α−欠乏神経膠細胞でＩＬ−１β及びＣＸＣＬ１の低酸素−依存的増加は非常に減少した（図６ｃ、ｄ）。

【0070】

小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）は、脳で常在骨髄細胞（ｒｅｓｉｄｅｎｔｍｙｅｌｏｉｄ ｃｅｌｌｓ）となることが知られている（非特許文献２５）。膠細胞ＨＩＦ−１αの役割を確認するために、本発明者らは、骨髄細胞で特異的にＨＩＦ−１αが欠けたＬｙｓＭＣｒｅ−ＨＩＦ−１α^{＋ｆ／＋ｆ}（ＬｙｓＭ−Ｈｉｆ−１α^−／−）マウスでＨ／Ｉ後の脳損傷の程度を調査した。先ず、本発明者らは、ＬｙｓＭ−Ｈｉｆ−１α^−／−マウスの１次小膠細胞でＨＩＦ−１αの水準を測定した。図７ａに示すように、ＨＩＦ−１α転写体の水準は、ＨＩＦ−１α^{＋ｆ／＋ｆ}に比べてＬｙｓＭ−Ｈｉｆ−１α^−／−マウスの小膠細胞で非常に低かった。Ｈ／Ｉ後、２４時間になった時、ＴＩＭ−３転写体の水準もＬｙｓＭ−Ｈｉｆ−１α^−／−マウスの東側皮質領域でさらに低かった（図７ｂ）。本発明者らは、ＨＩＦ−１α^{＋ｆ／＋ｆ}マウスに比べてＬｙｓＭ−Ｈｉｆ−１α^−／−マウスでＴＴＣ染色−陰性領域が非常に減少したことを発見し、これは、Ｈ／Ｉの２４時間後、脳損傷で小膠細胞ＨＩＦ−１αの役割を表す（図７ｃ）。ＨＩＦ−１α^{＋ｆ／＋ｆ}マウスに比べてＬｙｓＭ−Ｈｉｆ−１α^−／−マウスのニューロン細胞でカスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）−３の発現も非常に減少した（図７ｄ）。さらに、Ｈ／Ｉの２４時間後、ＬｙｓＭ−Ｈｉｆ−１α^−／−マウスの同側性皮質でＩＬ−１β及びＣＸＣＬ１発現の有意味な増加は検出されなかった。

【0071】

このような結果は、低酸素症でＨＩＦ−１αがＴＩＭ−３−関連の好中球の浸潤及び繋がる脳損傷と密接な関連があることを示す。

【実施例10】

【0072】

ＴＩＭ−３の遮断及びＨＩＦ−１αの欠乏がＮＤＳに及ぼす影響
減少された梗塞（ｉｎｆａｒｃｔ）の体積及びニューロン細胞の死滅が神経機能の改善と連関するか否かを調べるために、公知の方法を使用してＨ／ＩモデルでＮＤＳ（ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｅｆｉｃｉｔ ｓｃｏｒｅ）を測定した（非特許文献２６；及び非特許文献２７）。神経学的後遺症（ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｅｆｉｃｉｔｓ）は、対側性胴体（ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ ｔｏｒｓｏ）と前肢の屈折（ｆｌｅｘｉｏｎ）、対側への回転（ｃｉｒｃｌｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ ｓｉｄｅ）、停止期の対側への偏向（ｌｅａｎｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ ｓｉｄｅ ａｔ ｒｅｓｔ）、及び自発的運動活動（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｍｏｔｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ）によって測定した。Ｈ／Ｉによる神経学的後遺症は、ＩｇＧ−処理マウスに比べて、ＴＩＭ−３−抑制抗体を処理したマウスで減少した。Ｈ／Ｉの２０時間後に、ＩｇＧ処理マウスに対するＮＤＳは２．８±０．８（±ｓ．ｄ．）であったことに対し、ＴＩＭ−３−抑制抗体処理マウスに対するＮＤＳは０．８±０．８であった（表１；Ｐ＝０．０１２；Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ−ｔｅｓｔ）。

【0073】

【表1】

【0074】

このような結果は、ＴＩＭ−３が低酸素環境で神経機能と関連があることを示す。次に、本発明者らは、ＨＩＦ−１α^{＋ｆ／＋ｆ}マウス（ｎ＝１０）及びＬｙｓＭ−Ｈｉｆ−１α^−／−マウス（ｎ＝１１）に対して、Ｈ／Ｉ後２４時間になった時、ＮＤＳを測定した。ＨＩＦ−１α^{＋ｆ／＋ｆ}マウスでは偏向（ｌｅａｎｉｎｇ）行動と自発的運動機能の不在が観察されたが、ＬｙｓＭ−Ｈｉｆ−１α^−／−マウスでは観察されなかった。ＬｙｓＭ−Ｈｉｆ−１α^−／−マウスにおける平均ＮＤＳは、ＨＩＦ−１α^{＋ｆ／＋ｆ}マウスより非常に低かった（表２；１．２±０．６ ｖｓ．２．６±１．１、Ｐ＝０．０００８）

【0075】

【表2】

【0076】

このような結果は、ＨＩＦ−１α／ＴＩＭ−３軸（ａｘｉｓ）が脳梗塞体積及び病態生理学的炎症反応だけでなく、神経機能とも密接に関連していることを示す。

【実施例11】

【0077】

ＨＩＦ−１α−欠乏マウスでＴＩＭ−３による神経損傷の増加
本発明者らは、ＴＩＭ−３がＨ／Ｉ後にＨＩＦ−１α−欠乏マウスの形質に影響を及ぼし得るか否かを実験した。このため、ＴＩＭ−３及びＧＦＰを発現するレンチウイルスベクター（ＬＶ−ＴＩＭ３−ＧＦＰ）を製作した。先ず、レンチウイルスが神経膠細胞を感染できるか否かを調査した後、レンチウイルス−注射マウスのＧＦＰ−陽性−ＣＤ１１ｂ^ｈｉｇｈＣＤ４５^ｌｏｗ神経膠細胞でＴＩＭ−３の発現が非常に増加したことを観察した。脳固定装置（ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を利用してウイルスをＬｙｓＭ−Ｈｉｆ−１α^−／−マウスの右側半球に注射した。対照群マウスには、ＧＦＰのみを発現するＬＶ−ＧＦＰを注射した。それぞれのマウスの右側半球に４回の頭蓋内注射（ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を行った（図８ａ）。Ｈ／Ｉは、ＬｙｓＭ−Ｈｉｆ−１α^−／−マウスにＬＶ−ＴＩＭ３−ＧＦＰまたはＬＶ−ＧＦＰを注射し、５日後に誘導し、梗塞大きさ（ｉｎｆａｒｃｔ ｓｉｚｅ）及び神経学的結果は、２４時間後に調査した。図８ｂ、ｃに示すように、対照群ＬＶ−ＧＦＰ−注射マウス（ｎ＝６）に比べて、ＬＶ−ＴＩＭ３−ＧＦＰ注射マウス（ｎ＝５）でＴＴＣ−染色−陰性領域が非常に増加した。また、ＬＶ−ＴＩＭ３−ＧＦＰを注射したＬｙｓＭ−Ｈｉｆ−１α^−／−マウスに対する平均ＮＤＳは、ＬＶ−ＧＦＰ−注射対照群マウスより高かった（図８ｄ）（１．１±０．７ ｖｓ．２．３±０．８、Ｐ＝０．０４６）。このような結果は、低酸素環境でＨＩＦ−１／ＴＩＭ−３軸と脳損傷の関連性を再度示す結果である。

【実施例12】

【0078】

ＴＩＭ−３に対するｓｈＲＮＡを利用したＴＩＭ−３抑制活性の分析
上記で行った実施例における実験は、ＴＩＭ−３に対する抗体を利用して行い、さらに、本発明者らは、ＴＩＭ−３を抑制することができるまた他の方法として、ＴＩＭ−３に対するｓｈＲＮＡの使用可能性を確認した。このため、先ず一次培養膠細胞（図１０Ａ）またはＶ２小膠細胞（図１０Ｂ）にＴＩＭ−３に対するｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスまたは対照群レンジウイルスを製品生産会社（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ ＃ｓｃ−７２０１５−Ｖ）から提供された説明書に従って細胞内に感染させた。以後、感染された細胞を２４時間の間１％または２０％の酸素条件で培養し、逆転写重合酵素連鎖反応分析法、免疫細胞化学法及び流細胞分析法を利用してＴＩＭ−３の発現を確認し、このような実験は、３回の独立した繰返し実験から結果を得て、ｍｅａｎＳＤとして示した。

【0079】

分析の結果、図１０に示すように、本発明の実験で使用したＴＩＭ−３に対するｓｈＲＮＡは、対照群と比べてみると、効果的にＴｉｍ−３の発現を要請することが表れ、また、低酸素条件でＴＩＭ−３に対するｓｈＲＮＡを処理した群の場合、対照群を処理した群に比べてＴＩＭ−３の発現増加が阻害することが表れた。

【0080】

従って、このような結果からみると、ＴＩＭ−３の発現または活性を阻害し得るＴＩＭ−３に対する抗体またはｓｈＲＮＡを含むＴＩＭ−３阻害剤は、ＴＩＭ−３の発現または活性を効果的に阻害することができることが表れ、よって、このような阻害剤を脳損傷疾患の予防または治療のための製剤として使用可能なことが分かった。

【0081】

これまで本発明についてその好ましい実施例を中心として検討した。本発明が属する技術分野で通常の知識を持った者は、本発明が本発明の本質的な特性から逸脱しない範囲で変形された形態で具現可能なことが理解できるであろう。従って、開示された実施例は、限定的な観点ではなく、説明的な観点で考慮されるべきである。本発明の範囲は、前述した説明ではなく、特許請求の範囲に表れており、それと同等な範囲内にある全ての差異点は、本発明に含まれると解釈されなければならない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]