特許 6653433 核酸アプタマー／ナノ銀プローブとＥＸＯ Ｉ酵素に基づく電気化学的バイオセンサ。

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6653433

(24)【登録日】2020年1月30日

(45)【発行日】2020年2月26日

(54)【発明の名称】核酸アプタマー／ナノ銀プローブとＥＸＯ Ｉ酵素に基づく電気化学的バイオセンサ。

(51)【国際特許分類】

   G01N 27/327 20060101AFI20200217BHJP

   G01N 27/416 20060101ALI20200217BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20200217BHJP

   G01N 33/483 20060101ALI20200217BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20200217BHJP

   C12Q 1/6837 20180101ALI20200217BHJP

   C12N 15/115 20100101ALN20200217BHJP

【ＦＩ】

   G01N27/327

   G01N27/416 336G

   G01N33/53 M

   G01N33/483 F

   G01N33/543 541Z

   C12Q1/6837 Z

   !C12N15/115 ZZNA

【請求項の数】3

【全頁数】13

(21)【出願番号】特願2018-518477(P2018-518477)

(86)(22)【出願日】2017年7月14日

(65)【公表番号】特表2018-531387(P2018-531387A)

(43)【公表日】2018年10月25日

(86)【国際出願番号】CN2017092880

(87)【国際公開番号】WO2018010681

(87)【国際公開日】20180118

【審査請求日】2018年4月9日

(31)【優先権主張番号】201610555404.6

(32)【優先日】2016年7月14日

(33)【優先権主張国】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】517359004

【氏名又は名称】青島大学

(74)【代理人】

【識別番号】100146374

【弁理士】

【氏名又は名称】有馬 百子

(74)【代理人】

【識別番号】100130111

【弁理士】

【氏名又は名称】新保 斉

(72)【発明者】

【氏名】夏 建飛

(72)【発明者】

【氏名】曹 喜▲ユエ▼

(72)【発明者】

【氏名】王 宗花

(72)【発明者】

【氏名】孫 華

【審査官】 櫃本 研太郎

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１３／０１４８４３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 中国特許出願公開第１０３５２５８１５（ＣＮ，Ａ）

【文献】 Noor Mohammad Danesh et al.，A novel electrochemical aptasensor based on arch-shape structure of aptamer-complimentary strand conjugate and exonuclease I for sensitive detection of streptomycin，Biosensors and Bioelectronics，２０１５年 ８月１１日，Vol. 75，pp.123-128

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ２７／２６−２７／４９

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

Ｇ０１Ｎ ２１／６２−２１／７４

Ｃ１２Ｑ １／００−３／００

Ｃ１２Ｍ １／００−３／１０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ターゲット物質の認識機能と電気化学的信号を発生させる機能を兼ね備えてターゲット生体分子を検出するバイオプローブであって、
ナノ銀とナノ銀の表面に接続された複数のプローブ本体とを備え、前記プローブ本体はターゲット物質に対して特異的認識機能を有する核酸アプタマー断片と該核酸アプタマー断片と部分相補的な塩基配列を構成する核酸断片とを含み、前記核酸アプタマー断片は前記核酸断片とハイブリダイゼーションして前記プローブ本体を形成し、前記核酸断片の３’末端がチオール化されており、
前記核酸断片の前記核酸アプタマー断片に対する競合ハイブリダイゼーション能力が前記ターゲット物質の核酸アプタマー断片に対するハイブリダイゼーション能力より低いことを特徴とするバイオプローブ。

【請求項2】

請求項１に記載のバイオプローブの製造方法であって、
ジスルフィド結合を開裂した前記核酸断片と核酸アプタマー断片を相補的に対合して、プローブ本体溶液を形成するステップと、
前記プローブ本体溶液とナノ銀コロイドを混合して反応させ、ターゲット生体分子を検出するバイオプローブを得るステップとを含む
ことを特徴とするバイオプローブの製造方法。

【請求項3】

ジスルフィド結合を開裂した前記核酸断片は、
前記核酸断片とトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンを含有する溶液とを反応させてジスルフィド結合を開裂して、ジスルフィド結合を開裂した前記核酸断片を得る方法によって製造されるものであり、
前記プローブ本体溶液の反応ステップでは、３５〜４０℃で１．５〜２．５時間反応させ、
前記混合反応の条件としては、密封遮光下、３５〜４０℃で撹拌しながら５〜６ｈ反応させ、２〜６℃で１０〜１４ｈ反応させ、
２〜６℃で１０〜１４ｈ反応させた後、撹拌しながら反応物にＰＢＳ緩衝液を加えてｐＨを調整し、次にＮａＣｌ溶液を加え、密封遮光下、２〜４ｈ撹拌し、密封遮光下、２〜６℃で１０〜２４ｈ反応させた後、ＰＢＳで遠心洗浄して、ターゲット生体分子を検出するバイオプローブを得る
請求項２に記載の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、電気化学的検出の技術分野に関し、具体的には、核酸アプタマー／ナノ銀バイオプローブとＥＸＯ Ｉ酵素のターゲットサイクル増幅戦略とに基づく電気化学的バイオセンサ及びその製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

電気化学的バイオセンサは、生物学的活性物質（たとえば、酵素、抗体、核酸、細胞等）を生体感受性モチーフとして、電極を信号変換器として生化学的信号を電気化学的信号に変換することによって検出目的を達成させるバイオセンサである。電気化学的バイオセンサは、電極において得られた電位、電流または静電容量等の電気信号を特徴として信号を検出するものであり、高い感度と高い選択性を有すると同時に、装置がシンプルで、製造コストが低く、容易に小型化でき、現場でリアルタイムに検出することができる等のユニークな利点を有し、既に生物医学、食品分析、環境モニタリング等の様々な分野に幅広く適用されている。

【0003】

従来の電気化学的バイオセンサは、電気化学的信号の発生方式によってラベル付きタイプとラベルフリータイプに分類される。ラベル付きタイプの電気化学的バイオセンサは、ＤＮＡ鎖にメチレンブルー、フェロセン等の電気活性物質を標識するため、操作しにくく、コストが高く、ラベルフリータイプの電気化学的バイオセンサにより置換されていく。ラベルフリータイプの電気化学的バイオセンサは、標識ステップを省略して、基質液における電気活性物質を直接用いて検出するため、コストと操作の複雑さを大幅に低下させる。その反面、基質液が使用されることによって、ラベルフリータイプの電気化学的バイオセンサは使用範囲が制限される上、バックグラウンド信号が大きく、感度が低く、安定性が悪い。

【0004】

従って、現在、感度が高く安定性に優れたラベルフリータイプの生体分子検出方法が期待されている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、従来技術の欠点に対して、核酸アプタマー／ナノ銀バイオプローブに基づく電気化学的バイオセンサ及びその製造方法と応用を提供することを目的とする。該電気化学的バイオセンサは、生体分子の検出に用いると、選択性に優れて、感度が高い等の利点を有する。

【課題を解決するための手段】

【0006】

上記目的を達成させるために、本発明は下記技術案を採用する。

【0007】

本発明は、ターゲット物質の認識機能と電気化学的信号を発生させる機能を兼ね備えてターゲット生体分子を検出するバイオプローブ（以下、バイオ捕捉プローブと呼ばれることがある）であって、
ナノ銀とナノ銀の表面に接続された複数のプローブ本体とを備え、前記プローブ本体はターゲット物質に対して特異的認識機能を有する核酸アプタマー断片（以下、ターゲットアプタマーと呼ばれることがない）と該核酸アプタマー断片と部分相補的な塩基配列を構成する核酸断片（以下、捕捉プローブＤＮＡと呼ばれることがある）とを含み、前記核酸アプタマー断片は前記核酸断片とハイブリダイゼーションして前記プローブ本体を形成し、前記核酸断片の３’末端がチオール化されており、
前記核酸断片の前記核酸アプタマー断片に対する競合ハイブリダイゼーション能力が前記ターゲット物質の核酸アプタマー断片に対するハイブリダイゼーション能力より低いバイオプローブを提供することを第一目的とする。

【0008】

本発明は、前記ターゲット生体分子を検出するバイオプローブを含む電気化学的バイオセンサであって、
前記ターゲット生体分子を検出するバイオプローブはターゲット物質により開始されて、競合反応を行って、前記核酸アプタマー断片を前記プローブ本体から離脱させてターゲット物質と特異的に結合するステップと、
ＥＸＯ Ｉ酵素を加えて、ＥＸＯ Ｉ酵素で前記一本鎖形態として存在する核酸アプタマー断片を加水分解し、ターゲット物質が遊離して前記プローブ本体中の核酸アプタマー断片と特異的に結合し続けて、加水分解と特異的結合に対応したターゲット信号の増幅サイクル反応を形成し、最終的に前記核酸断片（捕捉プローブＤＮＡ）に接続されたナノ銀を得るステップと、
ナノ銀とナノ銀の表面に接続されて前記核酸断片の塩基と相補的であり、３’末端がチオール化された核酸断片（以下、相補的プローブＤＮＡと呼ばれることがある）とを含む、相補的プローブ（以下、バイオ相補的プローブと呼ばれることがある）を加えるステップと、
塩基相補的対合の原理を利用して、得られた前記相補的プローブの塩基と相補的であるナノ銀が前記相補的プローブＤＮＡを修飾した金電極の表面に集まり、金電極すなわち電気化学的バイオセンサを得るステップとを含む方法によって製造される電気化学的バイオセンサを提供することを第二目的とする。

【0009】

前記核酸断片（捕捉プローブＤＮＡ）に接続されたナノ銀としては、ナノ銀に上記核酸断片（捕捉プローブＤＮＡ）だけが接続される場合と、ナノ銀に上記核酸断片（捕捉プローブＤＮＡ）以外、前記プローブ本体が接続される場合がある。

【0010】

本発明に係る核酸アプタマー／ナノ銀バイオプローブとＥＸＯ Ｉ酵素のターゲットサイクル増幅策略とに基づく電気化学的バイオセンサの製造方法は、具体的に、以下のステップを含む。
（１）バイオ捕捉プローブの製造
ジスルフィド結合を開裂した捕捉プローブＤＮＡとターゲットアプタマーとを相補的に対合して、プローブ本体溶液（二本鎖ＤＮＡ溶液）を形成し、前記プローブ本体溶液とナノ銀コロイドを混合して反応させて、３’末端がチオール化されたバイオ捕捉プローブを得る。
（２）バイオ相補的プローブの製造
ジスルフィド結合を開裂したステップ（１）の前記捕捉プローブＤＮＡの塩基相補的プローブＤＮＡとナノ銀コロイドを混合して反応させ、ＤＮＡの３’末端がチオール化されたバイオ相補的プローブを得る。
（３）バイオ捕捉プローブの認識及び酵素を補助としたターゲットサイクル切断信号増幅
ステップ（１）で得られたバイオ捕捉プローブ、ターゲット物質及びＥＸＯＩエキソヌクレアーゼを混合して反応させる。
（４）電気化学的バイオセンサの製造
ステップ（３）で得られた溶液をステップ（２）で得られたバイオ相補的プローブに加え、次に前記相補的プローブＤＮＡを修飾した金電極を上記反応溶液に浸入して混合して反応させ、電極を取り出して、電気化学的バイオセンサを得る。

【0011】

以上のステップの順番は必要に応じて調整してもよい。

【0012】

ステップ（１）では、ターゲットアプタマーはターゲット物質に特異的に結合され、好ましくは、前記ターゲット物質がリゾチームである場合、前記捕捉プローブのＤＮＡ配列は、ＳＥＱＩＤ ＮＯ：１に示されるように、５’−Ａ ＣＴＣ ＴＴＴ ＡＧＣ ＣＣＴ ＧＡＴ−Ｃ６−ＳＨ−３’であり、リゾチームアプタマー配列は、ＳＥＱＩＤ ＮＯ：２に示されるように、５’− ＡＴＣ ＡＧＧ ＧＣＴ ＡＡＡ ＧＡＧ ＴＧＣ ＡＧＡ ＧＴＴ ＡＣＴ ＴＡＧ−３’である。

【0013】

前記ターゲット物質がγインターフェロン（ＩＦＮ−γ）である場合、前記捕捉プローブのＤＮＡ配列は、ＳＥＱＩＤ ＮＯ：４に示されるように、５´− ＣＣ ＡＡＣ ＡＣＡ ＡＣＣ ＡＡＣ ＣＣＣ−Ｃ６−ＳＨ−３´であり、γインターフェロンアプタマー配列は、ＳＥＱＩＤ ＮＯ：５に示されるように、５´−ＧＧＧ ＧＴＴ ＧＧＴ ＴＧＴ ＧＴＴ ＧＧＧ ＴＧＴ ＴＧＴ ＧＴＣ ＣＡＡ ＣＣＣ Ｃ−３´である。

【0014】

好ましくは、捕捉プローブＤＮＡの濃度は１００μＭ、ターゲットアプタマーの濃度は１００μＭである。前記捕捉プローブＤＮＡ、ターゲットアプタマー及びナノ銀コロイドの体積比率は（０．５〜１．５）：（０．５〜１．５）：１００である。

【0015】

プローブのジスルフィド結合を開裂するために、チオール化類還元剤を用いる等の方法が採用可能であり、好ましくは、前記ジスルフィド結合を開裂した捕捉プローブＤＮＡの製造方法は、捕捉プローブＤＮＡとトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンを含有する溶液を反応させてジスルフィド結合を開裂することであり、前記トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンを含有する溶液において、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の濃度が０．０１Ｍ、ＰＢの濃度が０．０１Ｍ、ＮａＣｌの濃度が０．１Ｍであり、反応時間が０．５〜１．５ｈ（好ましくは１ｈ）である。

【0016】

前記プローブ本体溶液（二本鎖ＤＮＡ溶液）の具体的な反応ステップでは、３５〜４０℃で１．５〜２．５時間反応させ、好ましくは３７℃で２ｈ反応させる。

【0017】

前記混合反応の条件としては、密封遮光下、３５〜４０℃で撹拌して５〜６ｈ反応させ、２〜６℃で１０〜１４ｈ反応させる。

【0018】

バイオ捕捉プローブをさらに安定化させるために、２〜６℃で１０〜１４ｈ反応させた後、撹拌しながら反応物にＰＢＳ緩衝液を加えてｐＨを調整し、次にＮａＣｌ溶液を加え、密封遮光下、２〜４ｈ撹拌して、密封遮光下、２〜６℃で一晩（反応時間１０〜２４ｈ）反応させた後、ＰＢＳで遠心洗浄して、バイオ捕捉プローブを得る。

【0019】

ステップ（２）では、ターゲット物質がリゾチームである場合、相補的プローブＤＮＡ配列は、ＳＥＱＩＤ ＮＯ：３に示されるように、５’−ＡＴＣ ＡＧＧ ＧＣＴ ＡＡＡ ＧＡＧ Ｔ−Ｃ６−ＳＨ−３’ であり、ターゲット物質がγインターフェロンである場合、相補的プローブＤＮＡ配列は、ＳＥＱＩＤ ＮＯ：６に示されるように、５´−ＧＧＧ ＧＴＴ ＧＧＴ ＴＧＴ ＧＴＴ ＧＧ−Ｃ６−ＳＨ −３´であり、その濃度が１００μＭである。前記相補的プローブＤＮＡとナノ銀コロイドの体積比率は０．５〜１．５：１００である。

【0020】

プローブのジスルフィド結合を開裂するために、チオール化類還元剤を用いる等の方法が採用可能であり、好ましくは、前記ジスルフィド結合を開裂した相補的プローブＤＮＡの製造方法は、相補的プローブＤＮＡとトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンを含有する溶液とを反応させてジスルフィド結合を開裂することであり、前記トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンを含有する溶液において、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の濃度が０．０１Ｍ、ＰＢの濃度が０．０１Ｍ、ＮａＣｌの濃度が０．１Ｍであり、反応時間が０．５〜１．５ｈ（好ましくは１ｈ）である。

【0021】

前記混合反応の条件としては、密封遮光下、３５〜４０℃で撹拌して５〜６ｈ反応させ、２〜６℃で１０〜１４ｈ反応させる。

【0022】

バイオ相補的プローブをさらに安定化させるために、２〜６℃で１０〜１４ｈ反応させた後、撹拌しながら反応物にＰＢＳ緩衝液を加えてｐＨを調整し、次にＮａＣｌ溶液を加え、密封遮光下、２〜４ｈ撹拌して、密封遮光下、２〜６℃で（反応時間１０〜２４ｈ）反応させた後、ＰＢＳで遠心洗浄して、バイオ相補的プローブを得る。

【0023】

ステップ（１）（２）では、前記ナノ銀の製造方法は以下のとおりである。氷水浴において、激しく撹拌しながら、１回に１ミリリットル滴下する速度で０．００２ Ｍ硝酸銀を緩慢にその体積に対して２〜２．５倍の０．００３Ｍ水素化ホウ素ナトリウムに加えて、硝酸銀の滴下が終了した後、５分間かけて連続して激しく撹拌し、得られた反応物を沸騰水浴に移して、３〜５分間加熱した直後、所定量の０．００３Ｍ水素化ホウ素ナトリウム溶液を加え、温水浴から取り出して激しく撹拌して室温まで冷却させ、製造されたナノ銀コロイドを王水で浸漬された茶色瓶に移して、遮光下、４℃で保存する。

【0024】

ステップ（３）では、前記ターゲット物質は所定濃度を有する被測定物または濃度が未知の被測定物であり、前記混合反応の条件としては、３５〜４０℃で０．５〜１．５ｈ反応させ、好ましくは３７℃で１ｈ反応させる。

【0025】

前記ステップ（１）で得られたバイオ捕捉プローブとターゲット物質との体積比率は１：１〜２、ＥＸＯＩエキソヌクレアーゼの添加量は１５〜２５Ｕであり、好ましくは、前記ステップ（１）で得られたバイオ捕捉プローブとターゲット物質との体積比率は１：１、ＥＸＯＩエキソヌクレアーゼの添加量は２０Ｕである。

【0026】

ステップ（４）では、ステップ（３）で得られた溶液とステップ（２）で得られたバイオ相補的プローブとの体積比率は１：１〜２、好ましくは１：１である。

【0027】

前記金電極について研磨処理を施す必要がある。研磨処理のステップとしては、金電極をアルミナパウダーで研磨し、次に、再蒸留水で洗浄し、さらにエタノールと再蒸留水においてそれぞれ超音波洗浄を行って、乾燥させて研磨処理済みの金電極を得る。具体的には、ウォッシュレザーにおいて０．３μｍと０．０５μｍのアルミナパウダーで順次研磨し、研磨後、まず再蒸留水で洗浄して、次にエタノールと再蒸留水においてそれぞれ超音波洗浄を２０−２５ｓ行って、窒素ガスで吹き干す。

【0028】

前記相補的プローブＤＮＡを修飾した金電極の製造方法には、前記相補的プローブＤＮＡをＴＣＥＰで２時間反応させてジスルフィド結合を開裂し、ここで、相補的プローブＤＮＡのジスルフィド結合を開裂した反応系において、ＤＮＡの濃度を１μＭ、ＴＣＥＰの濃度を０．０１Ｍ、ＰＢの濃度を０．０１Ｍ、ＮａＣｌの濃度を０．１Ｍにして、次にジスルフィド結合を開裂した相補的プローブＤＮＡを研磨処理済みの金電極において２４時間浸入して、前記相補的プローブＤＮＡを修飾した金電極を得るステップを含む。

【0029】

前記混合反応の条件としては、３５〜４０℃で１．５〜２．５ｈ反応させ、好ましくは３７℃で振とう反応を２ｈ行う。

【0030】

本発明第三目的は、上記電気化学センサの生体分子濃度検出における応用を提供することである。前記生体分子は、ＡＴＰ、アミノ酸、ヌクレオチド、毒素、酵素、成長因子、細胞接着分子、ウィルス、細菌及び細胞またはアプタマーとしてスクリーニング可能なほかの生体分子を含む。本発明の発明構想に基づき、各種生体分子の濃度、たとえばリゾチーム、γインターフェロン、ＡＴＰまたはその他生体分子を検出できる。その応用方法は、
標準濃度を有する各ターゲット物質の電気化学的バイオセンサについてＬＳＶ検出を行って、異なる標準濃度を有するターゲット物質のＬＳＶピーク電流を取得する、電気化学的検出をするステップ（１）と、
ステップ（１）のＬＳＶピーク電流についてターゲット物質の濃度の対数に対して線形回帰方程を作成して、該方法の検量線を得る、検量線を作成するステップ（２）と、
実際サンプルの電気化学センサを用いて電気化学的検出を行って、対応したＬＳＶピーク電流を得て、ＬＳＶピーク電流をステップ（２）の検量線に代入して、実際サンプルにおけるターゲット物質の濃度を得る、実際サンプルを検出するステップ（３）とを含む。

【0031】

ステップ（１）では、ＬＳＶ検出条件としては、金電極を作用電極、カロメル電極を参照電極、白金線電極をコントラスト電極として三電極システムを構成してＬＳＶ検出を行う。

【0032】

ＬＳＶ検出液はＰＢＳ緩衝液、具体的に０．２Ｍ ＰＢＳである。その調製方法としては、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ １．７８ｇを水１０００ｍＬに溶解して、Ｎａ_２ＨＰＯ_４水溶液を得て、ＮａＨ_２ＰＯ_４・Ｈ_２Ｏ １．３８ｇを水１０００ｍＬに溶解して、ＮａＨ_２ＰＯ_４水溶液を得て、Ｎａ_２ＨＰＯ_４水溶液８１０ｍＬ、ＮａＨ_２ＰＯ_４水溶液１９０ｍＬ及びＮａＣｌ １１．６９ｇを均一に混合して、ｐＨ７．４の０．２Ｍ ＰＢＳを得る。

【発明の効果】

【0033】

上記技術案のうち、１つの技術案は下記有益な効果を有する。
（１）本発明に係る核酸アプタマー／ナノ銀バイオプローブとＥＸＯ Ｉ酵素のターゲット策略とに基づく電気化学的バイオセンサは、新規なラベルフリー電気化学的バイオセンサであり、ターゲット物質の認識機能と電気化学的信号を発生させる機能を兼ね備える核酸アプタマーで修飾された銀ナノ粒子をターゲット生体分子を検出するバイオプローブとして、ターゲット物質により開始されて、相補的プローブとＥＸＯ Ｉ酵素によるサイクル切断増幅を補助として、ＤＮＡの相補的対合原理を利用して、該プローブは金電極の表面に集まり、ターゲット生体分子の濃度が大きいほど、誘導された核酸アプタマー／ナノ銀プローブの凝集程度が高くなり、さらに、ターゲット物質の認識過程にＥＸＯ Ｉエキソヌクレアーゼのターゲットサイクル増幅メカニズムを導入することで、該電気化学的バイオセンサはターゲット生体物質を高感度で効率よく検出できる。
（２）他の操作に比べて、本発明は、初めて電気化学的バイオセンサに認識と信号発生の２種の機能を備える核酸アプタマー／ナノ銀バイオプローブを適用することによって、従来のラベルフリー検出方法に使用される信号基質を省略して、該バイオセンサの操作を簡便にして、安定性を高め、検出限界を低下させて、感度を高め、選択性を向上させる。
（３）本発明では、電気化学的検出方法の使用により、操作を簡便にして、コストを削減させ、検出速度及び効率を高め、容易に小型化できる等の利点を付与し、現場でリアルタイムに迅速に検出できる。このため、核酸アプタマー／ナノ銀バイオプローブに基づく電気化学的バイオセンサは生体分子を検出するための新規な高感度方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0034】

【図1】本発明の原理の説明図

【図2】本発明でリゾチームを検出する場合の線形関係図

【発明を実施するための形態】

【0035】

以下、実施例を利用して本発明について更に説明する。

【0036】

実験に使用される装置及び試薬
（１）装置
ＣＨＩ６５０電気化学ワークステーション（上海辰華装置有限公司製）；飽和カロメル電極（ＳＣＥ）を参照電極、白金線電極を対電極とする。
（２）試薬
リゾチームアプタマー、γインターフェロンアプタマー及びレポートプローブ（上海生工生物工程股▲ふん▼有限公司製）
ほかの試薬はすべて分析的に純粋なものであり、実験用水は二次蒸留水である。

【0037】

実施例１

【0038】

リゾチームを検出する電気化学的バイオセンサの製造方法は、図１に示すように、以下のステップを含む。
（１）ナノ銀の製造
氷水浴において０．００３Ｍ水素化ホウ素ナトリウム１００ｍｌを２５０ｍｌ三つ口丸底フラスコに投入して、前後にある２つの開口をシールして、激しく撹拌した。ピペットガンを用いて、１回に１ミリリットル滴下するように０．００２Ｍ硝酸銀５０ｍＬを、１０ｍｌ添加する毎に２分間を空けるように緩慢に水素化ホウ素ナトリウムに加え、硝酸銀の添加が終了した後、５ｍｉｎ連続して激しく撹拌した。丸底フラスコを沸騰水浴に入れて、３〜５分間加熱した直後、迅速に０．００３Ｍ水素化ホウ素ナトリウム溶液を１０ｍｌ加えた。フラスコを温水浴から取り出して、続けて激しく撹拌して室温まで冷却させた。製造されたナノ銀コロイドを王水で浸漬された茶色瓶に移して、遮光下、４℃で保存した。
（２）捕捉プローブの製造
捕捉プローブＤＮＡ（５’−Ａ ＣＴＣ ＴＴＴ ＡＧＣ ＣＣＴ ＧＡＴ−Ｃ６−ＳＨ−３’；配列 ＳＥＱＩＤ ＮＯ：１）１０μＬを２ｍＬ遠心分離管に投入して、捕捉プローブＤＮＡに０．０１Ｍ ＴＣＥＰ（０．０１Ｍ ＰＢ、０．１Ｍ ＮａＣｌ）溶液２μＬを加えて１時間静置してジスルフィド結合を開裂した。次にリゾチームアプタマー（５’− ＡＴＣ ＡＧＧ ＧＣＴ ＡＡＡ ＧＡＧ ＴＧＣ ＡＧＡ ＧＴＴ ＡＣＴ ＴＡＧ−３’；配列 ＳＥＱＩＤ ＮＯ：２）１０μＬを加えて水浴鍋に入れて３７℃で２時間反応させて、二本鎖を形成した。３ｍＬガラス反応瓶に、ナノ銀コロイド１ｍｌを加えて、次に二本鎖ＤＮＡを加えてシールして、遮光下で５〜６時間かけて緩やかに撹拌し、マグネチックスターラーから取り出した後、４℃で１２時間反応させた。１２時間後、反応瓶に０．１Ｍ ＰＢＳ緩衝溶液１２２μＬを加えてｐＨを調整し、低速撹拌した。１回に１μＬ添加する速度で２Ｍ ＮａＣｌ溶液２１μＬを加えた後、密封遮光下、３時間低速撹拌し、密封遮光下、４℃で一晩放置した後、０．１Ｍ ＰＢＳで遠心洗浄した。
（３）相補的プローブの製造
相補的プローブＤＮＡ（５’−ＡＴＣ ＡＧＧ ＧＣＴ ＡＡＡ ＧＡＧ Ｔ−Ｃ６−ＳＨ−３’；配列 ＳＥＱＩＤ ＮＯ：３）１０μＬを２ｍＬ遠心分離管に投入して、捕捉プローブＤＮＡに０．０１Ｍ ＴＣＥＰ（０．０１Ｍ ＰＢ、０．１Ｍ ＮａＣｌ）溶液２μＬを加えて１時間静置してジスルフィド結合を開裂した。３ｍＬガラス反応瓶に、ナノ銀コロイド１ｍｌを加え、次にジスルフィド結合を開裂した相補的プローブＤＮＡ １０μＬを加えて、密封遮光下、５〜６時間低速撹拌し、マグネチックスターラーから取り出した後、４℃で１２時間反応させた。１２時間後、反応瓶に０．１Ｍ ＰＢＳ緩衝溶液１２２μＬを加えてｐＨを調整し、低速撹拌した。１回に１μＬ添加する速度で２Ｍ ＮａＣｌ溶液２１μＬを加えた後、密封遮光下、３時間低速撹拌し、密封遮光下、４℃で一晩放置した後、０．１Ｍ ＰＢＳで遠心洗浄した。
（４）標準濃度を有するリゾチーム溶液の調製
超純水を用いて１００ｕＭ母液を調製して、０．１Ｍ ＰＢＳ緩衝溶液で母液を希釈して０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、１ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭの濃度勾配を有するリゾチーム溶液を調製した。
（５）捕捉プローブの認識と酵素を補助としたターゲットサイクル切断信号増幅
２ｍＬ遠心分離管に捕捉プローブ１００μＬと勾配濃度を有するリゾチーム１００ｕＬとを加え、次に２０ Ｕ ＥＸＯ Ｉ エキソヌクレアーゼを加えて、水浴鍋において３７℃で１時間放置した。
（６）相補的プローブＤＮＡを修飾した金電極の製造
金電極の研磨処理
金電極をウォッシュレザーにおいて０．３ｕｍと０．０５ｕｍのＡｌ_２Ｏ_３で順次研磨して鏡面に仕上げて、順次エタノール、再蒸留水で超音波洗浄を２０−２５秒間行い、次に０．５Ｍ硫酸溶液において、掃引速度を０．１Ｖ／ｓとしてサイクリックボルタンメトリーを行って、安定的になると、蒸留水できれいに洗浄して、窒素ガスで吹き干した。
前記相補的プローブＤＮＡをＴＣＥＰで２時間反応させてジスルフィド結合を開裂して、ここで、相補的プローブＤＮＡのジスルフィド結合を開裂した反応系において、ＤＮＡの濃度を１μＭ、ＴＣＥＰの濃度を０．０１Ｍ、ＰＢの濃度を０．０１Ｍ、ＮａＣｌの濃度を０．１Ｍにして、次にジスルフィド結合を開裂した相補的プローブＤＮＡを研磨処理済みの金電極に２４時間浸入して、前記相補的プローブＤＮＡを修飾した金電極を得た。
（７）電気化学的バイオセンサの製造
それぞれステップ（５）で得られた各溶液をステップ（３）で得られたバイオ相補的プローブに加え、次に相補的プローブＤＮＡを修飾した金電極を上記反応溶液に浸入して混合して反応させ、電極を取り出して、各濃度勾配での電気化学的バイオセンサを得た。

【0039】

実施例２

【0040】

（１）捕捉プローブの製造
捕捉プローブＤＮＡ（５’−Ａ ＣＴＣ ＴＴＴ ＡＧＣ ＣＣＴ ＧＡＴ−Ｃ６−ＳＨ−３’；配列 ＳＥＱＩＤ ＮＯ：１）１０μＬを２ｍＬ遠心分離管に投入して、捕捉プローブＤＮＡに０．０１Ｍ ＴＣＥＰ（０．０１Ｍ ＰＢ、０．１Ｍ ＮａＣｌ）溶液２μＬを加えて１時間静置してジスルフィド結合を開裂した。次にリゾチームアプタマー（５’− ＡＴＣ ＡＧＧ ＧＣＴ ＡＡＡ ＧＡＧ ＴＧＣ ＡＧＡ ＧＴＴ ＡＣＴ ＴＡＧ−３’；配列 ＳＥＱＩＤ ＮＯ：２）１０μＬを加えて水浴鍋において３７℃で１．５時間反応させて、二本鎖を形成した。３ｍＬガラス反応瓶に、ナノ銀コロイド１ｍｌを加えて、次に二本鎖ＤＮＡを加えてシールして、遮光下で５〜６時間かけて低速撹拌し、マグネチックスターラーから取り出した後、５℃で１３時間反応させた。１３時間後、反応瓶に０．１Ｍ ＰＢＳ緩衝溶液１２２μＬを加えてｐＨを調整し、低速撹拌した。１回に１μＬ添加する速度で２Ｍ ＮａＣｌ溶液２１μＬを加えた後、密封遮光下、３時間低速撹拌し、密封遮光下、４℃で一晩放置した後、０．１Ｍ ＰＢＳで遠心洗浄した。
（２）相補的プローブの製造
相補的プローブＤＮＡ（５’−ＡＴＣ ＡＧＧ ＧＣＴ ＡＡＡ ＧＡＧ Ｔ−Ｃ６−ＳＨ−３’；配列 ＳＥＱＩＤ ＮＯ：３）１０μＬを２ｍＬ遠心分離管に投入して、捕捉プローブＤＮＡに０．０１Ｍ ＴＣＥＰ（０．０１Ｍ ＰＢ、０．１Ｍ ＮａＣｌ）溶液２μＬを加えて１時間静置してジスルフィド結合を開裂した。３ｍＬガラス反応瓶に、ナノ銀コロイド１ｍｌを加え、次にジスルフィド結合を開裂した相補的プローブＤＮＡ １０μＬを加えて、密封遮光下、５〜６時間低速撹拌し、マグネチックスターラーから取り出した後、５℃で１３時間反応させた。１３時間後、反応瓶に０．１Ｍ ＰＢＳ緩衝溶液１２２μＬを加えてｐＨを調整し、低速撹拌した。１回に１μＬ添加する速度で２Ｍ ＮａＣｌ溶液２１μＬを加えた後、密封遮光下、３時間低速撹拌し、密封遮光下、４℃で一晩放置した後、０．１Ｍ ＰＢＳで遠心洗浄した。
（３）標準濃度を有するリゾチーム溶液の調製
超純水を用いて１００ｕＭ母液を調製して、０．１Ｍ ＰＢＳ緩衝溶液で母液を希釈して０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、１ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭの濃度勾配を有するリゾチーム溶液を調製した。
（４）捕捉プローブの認識及び酵素を補助としたターゲットサイクル切断信号増幅
２ｍＬ遠心分離管に捕捉プローブ１００μＬと勾配濃度を有するリゾチーム１００ｕＬとを加え、次に２０ Ｕ ＥＸＯ Ｉ エキソヌクレアーゼを加えて、水浴鍋において３５℃で１．５時間放置した。
（５）電気化学的バイオセンサの製造
それぞれステップ（４）で得られた各溶液をステップ（２）で得られたバイオ相補的プローブに加え、次に実施例１のステップ（６）の相補的プローブＤＮＡを修飾した金電極を上記反応溶液に浸入して混合して反応させ、修飾された電極を取り出しいて、各濃度勾配での電気化学的バイオセンサを得た。

【0041】

実施例３

【0042】

実施例１で製造された電気化学的バイオセンサによって、リゾチームの濃度を測定する方法は、以下のステップを含む。
（１）電気化学的検出
実施例１で得られた各電極を取り出した後、０．０１Ｍ ＰＢで２−３回洗浄して、電極を０．２Ｍ ＰＢＳの検出液に浸入して、カロメル参照電極と白金線コントラスト電極とともに三電極システムを構成して、ＬＳＶ検出を行った。
（２）検量線の作成
標準濃度を有するリゾチームが認識されたＬＳＶピーク電流について、リゾチーム濃度の対数に対して線形回帰方程を作成して、該方法の検量線を得た。図２に示すように、該線形回帰方程はＩ＝０．５０６８ｌｇＣ＋０．６７７９８、Ｒ^２＝０．９９７、線形範囲は１．５ｐＭ−１０ｎＭ、検出限界は２９０ｆＭ（Ｓ／Ｎ＝３）であった。
（３）実際サンプルの検出
実際サンプルについて実施例１の方法によって操作を行って、得られたピーク電流を検量線に代入して、実際サンプルにおけるリゾチームの濃度を得た。
リゾチームの検出結果から明らかなように、異なる濃度のリゾチームは、ピーク電流の曲線が顕著に変化しており、リゾチームは、１．５ｐＭ−１０ｎＭの濃度範囲で良好な線形関係を示し、本発明に係る電気化学的バイオセンサによるリゾチームの検出限界は２９０ｆＭと低くなる。

【0043】

実施例４

【0044】

γインターフェロンを検出する電気化学的バイオセンサの製造方法は、以下のステップを含む：
（１）ナノ銀の製造
実施例１のナノ銀の製造ステップと同様であった。
（２）捕捉プローブの製造
捕捉プローブＤＮＡ（５´− ＣＣ ＡＡＣ ＡＣＡ ＡＣＣ ＡＡＣ ＣＣＣ−Ｃ６−ＳＨ−３´；配列 ＳＥＱＩＤ ＮＯ：４）１０μＬを２ｍＬ遠心分離管に投入して、捕捉プローブＤＮＡに０．０１Ｍ ＴＣＥＰ（０．０１Ｍ ＰＢ、０．１Ｍ ＮａＣｌ）溶液２μＬを加えて１時間静置してジスルフィド結合を開裂した。次にγインターフェロンアプタマー（５´−ＧＧＧ ＧＴＴ ＧＧＴ ＴＧＴ ＧＴＴ ＧＧＧ ＴＧＴ ＴＧＴ ＧＴＣ ＣＡＡ ＣＣＣ Ｃ−３´；配列 ＳＥＱＩＤ ＮＯ：５）１０μＬを加えて水浴鍋において３７℃で２時間反応させて、二本鎖を形成した。３ｍＬガラス反応瓶に、ナノ銀コロイド１ｍｌを加えて、次に二本鎖ＤＮＡを加えてシールして、遮光下で５〜６時間かけて低速撹拌し、マグネチックスターラーから取り出した後、４℃で１２時間反応させた。１２時間後、反応瓶に０．１Ｍ ＰＢＳ緩衝溶液１２２μＬを加えてｐＨを調整し、低速撹拌した。１回に１μＬ添加する速度で２Ｍ ＮａＣｌ溶液２１μＬを加えた後、密封遮光下、３時間低速撹拌し、密封遮光下、４℃で一晩放置した後、０．１Ｍ ＰＢＳで遠心洗浄した。
（３）相補的プローブの製造
相補的プローブＤＮＡ（５´−ＧＧＧ ＧＴＴ ＧＧＴ ＴＧＴ ＧＴＴ ＧＧ−Ｃ６−ＳＨ −３´；配列 ＳＥＱＩＤ ＮＯ：６）１０μＬを２ｍＬ遠心分離管に投入して、捕捉プローブＤＮＡに０．０１Ｍ ＴＣＥＰ（０．０１Ｍ ＰＢ、０．１Ｍ ＮａＣｌ）溶液２μＬを加えて１時間静置してジスルフィド結合を開裂した。３ｍＬガラス反応瓶に、ナノ銀コロイド１ｍｌを加え、次にジスルフィド結合を開裂した相補的プローブＤＮＡ １０μＬを加えて、密封遮光下、５〜６時間低速撹拌し、マグネチックスターラーから取り出した後、４℃で１２時間反応させた。１２時間後、反応瓶に０．１Ｍ ＰＢＳ緩衝溶液１２２μＬを加えてｐＨを調整し、低速撹拌した。１回に１μＬ添加する速度で２Ｍ ＮａＣｌ溶液２１μＬを加えた後、密封遮光下、３時間低速撹拌し、密封遮光下、４℃で一晩放置した後、０．１Ｍ ＰＢＳで遠心洗浄した。
（４）標準濃度を有するγインターフェロン溶液の調製
超純水を用いて１００ｕＭ母液を調製して、０．１Ｍ ＰＢＳの緩衝溶液で母液を希釈して０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、１ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭの濃度勾配を有するγインターフェロン溶液を調製した。
（５）捕捉プローブの認識と酵素を補助としたターゲットサイクル切断信号増幅
２ｍＬ遠心分離管に捕捉プローブ１００μＬと勾配濃度を有するγインターフェロン１００ｕＬとを加え、次に２０ Ｕ ＥＸＯ Ｉ エキソヌクレアーゼを加えて、水浴鍋において３７℃で１時間放置した。
（６）相補的プローブＤＮＡを修飾した金電極の製造
金電極の研磨処理
金電極をウォッシュレザーにおいて０．３ｕｍと０．０５ｕｍのＡｌ_２Ｏ_３で順次研磨して鏡面に仕上げて、順次エタノール、再蒸留水で超音波洗浄を２０−２５秒間行い、次に０．５Ｍ硫酸溶液において、掃引速度を０．１Ｖ／ｓとしてサイクリックボルタンメトリーを行って、安定的になると、再蒸留水できれいに洗浄して、窒素ガスで吹き干した。
前記相補的プローブＤＮＡをＴＣＥＰで２時間反応させてジスルフィド結合を開裂して、ここで、相補的プローブＤＮＡのジスルフィド結合を開裂した反応系において、ＤＮＡの濃度を１μＭ、ＴＣＥＰの濃度を０．０１Ｍ、ＰＢの濃度を０．０１Ｍ、ＮａＣｌの濃度を０．１Ｍにして、次にジスルフィド結合を開裂した相補的プローブＤＮＡを研磨処理済みの金電極に２４時間浸入して、前記相補的プローブＤＮＡを修飾した金電極を得た。
（７）電気化学的バイオセンサの製造
それぞれステップ（５）で得られた各溶液をステップ（３）で得られたバイオ相補的プローブに加え、次に相補的プローブＤＮＡを修飾した金電極を上記反応溶液に浸入して混合して反応させ、電極を取り出して、各濃度勾配での電気化学的バイオセンサを得た。

【0045】

実施例４における電気化学的バイオセンサを用いてＬＳＶ検出を行い、試験した結果、本発明における実施例４で製造された電気化学的バイオセンサはγインターフェロンの濃度を検出することができ、異なる濃度を有するγインターフェロンに対してピーク電流曲線が顕著に変化しており、本発明に係る電気化学的バイオセンサはγインターフェロンに対する検出限界がｆＭ級と低くなる。

【0046】

上記実施例は、本発明の好適な実施形態であるが、本発明の実施形態は上記実施例により制限されず、本発明の主旨及び原理を逸脱することなく、想到し得る変化、修飾、置換、組み合わせ、簡略化はいずれも同等置換形態とされて、本発明の保護範囲に含まれる。

【図1】

【図2】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]