特許 6654778 光源生成薄膜、微小光源励起装置、光学顕微鏡および光源生成薄膜の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6654778

(24)【登録日】2020年2月4日

(45)【発行日】2020年2月26日

(54)【発明の名称】光源生成薄膜、微小光源励起装置、光学顕微鏡および光源生成薄膜の製造方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 21/01 20060101AFI20200217BHJP

【ＦＩ】

   G01N21/01 D

【請求項の数】12

【全頁数】21

(21)【出願番号】特願2014-178249(P2014-178249)

(22)【出願日】2014年9月2日

(65)【公開番号】特開2016-50925(P2016-50925A)

(43)【公開日】2016年4月11日

【審査請求日】2017年8月4日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 平成２６年３月３日 公益社団法人 応用物理学会発行 「２０１４年 第６１回応用物理学会春季学術講演会「講演予稿集」 ，０３−１４８（１７ｐ−Ｅ６−１４）」にて公開 平成２６年３月１７日 公益社団法人 応用物理学会主催 「２０１４年 第６１回応用物理学会春季学術講演会」にて公開

(73)【特許権者】

【識別番号】304023318

【氏名又は名称】国立大学法人静岡大学

(74)【代理人】

【識別番号】100079049

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 淳

(74)【代理人】

【識別番号】100084995

【弁理士】

【氏名又は名称】加藤 和詳

(74)【代理人】

【識別番号】100099025

【弁理士】

【氏名又は名称】福田 浩志

(72)【発明者】

【氏名】川田 善正

(72)【発明者】

【氏名】居波 渉

(72)【発明者】

【氏名】小野 篤史

(72)【発明者】

【氏名】福田 真大

(72)【発明者】

【氏名】名和 靖矩

【審査官】 平田 佳規

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００９／１４８０９４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／１１０４５２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００３−５０３７５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 応用物理学会学術講演会講演予稿集，２０１１年，（2011 秋），p.03-139

【文献】 映像情報メディア学会誌，２０１４年 ７月２５日，第68巻 第8号，J344〜J347

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ２１／００− ２１／０１

Ｇ０１Ｎ ２１／１７− ２１／６１

Ｇ０１Ｑ ６０／１８− ６０／２２

Ｇ０１Ｑ ８０／００

Ｇ０２Ｂ ２１／００

Ｇ０２Ｂ ２１／０６− ２１／３６

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

基板と、
前記基板に形成された貫通孔と、
前記基板の第１の主面上に前記貫通孔を覆い、かつ可視光の波長未満の膜厚で設けられるとともに、前記基板の前記第１の主面とは反対側の第２の主面側から前記貫通孔を通って照射される電子ビームにより可視光の波長未満の大きさの微小光源が励起される発光薄膜と、
前記発光薄膜上に形成されるとともに、前記微小光源からの光を透過しかつ前記電子ビームを遮蔽するとともに、前記微小光源からの光で表面に表面プラズモンを励起させることにより前記微小光源の発光強度を増加させる金属薄膜と、を備え、
前記金属薄膜が金薄膜であり、前記金薄膜の膜厚が６ｎｍ〜８ｎｍであり、前記微小光源の光の波長が６１０ｎｍである
光源生成薄膜。

【請求項2】

前記金薄膜表面の前記微小光源の発光スポットのスポットサイズが７０ｎｍ〜８０ｎｍである
請求項１に記載の光源生成薄膜。

【請求項3】

前記基板と前記発光薄膜との間に、前記貫通孔を覆って形成されるとともに、前記第２の主面側から前記貫通孔を通って照射される電子ビームを透過するウィンドウ薄膜をさらに有する
請求項１または請求項２に記載の光源生成薄膜。

【請求項4】

前記ウィンドウ薄膜は、シリコン窒化膜またはシリコン酸化膜で形成される
請求項３に記載の光源生成薄膜。

【請求項5】

前記発光薄膜は、シリコン窒化膜、ユーロピウム賦活酸化イットリウムおよび酸化亜鉛のいずれか１つで形成される
請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の光源生成薄膜。

【請求項6】

前記金属薄膜の膜厚が、前記金属薄膜を形成する金属の表皮深さ未満である
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の光源生成薄膜。

【請求項7】

前記基板は、シリコン基板または酸化シリコン基板である
請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の光源生成薄膜。

【請求項8】

前記金属薄膜上に、生体の培養のために形成された培養薄膜をさらに有する
請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の光源生成薄膜。

【請求項9】

前記貫通孔が複数の貫通孔であり、
前記発光薄膜は、前記複数の貫通孔を覆って形成される
請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の光源生成薄膜。

【請求項10】

請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の光源生成薄膜と、
電子ビームを発生する電子ビーム発生部と、
前記発光薄膜に可視光の波長未満の大きさの微小光源が励起されるように前記電子ビーム発生部で発生した電子ビームを絞って前記発光薄膜に照射するとともに、前記電子ビームを走査する電子ビーム制御部と、
を備える微小光源励起装置。

【請求項11】

開孔部を具備する隔壁で囲まれるとともに内部が真空に保持され、かつ前記電子ビーム発生部と前記電子ビーム制御部とが内部に配置された真空容器をさらに備え、
前記光源生成薄膜は、前記第２の主面が前記隔壁側にされるとともに、前記貫通孔と前記開孔部とが重なりかつ前記発光薄膜が前記開孔部を塞ぐように前記隔壁上に配置されて前記隔壁の一部をなし、
前記微小光源は、前記開孔部および前記貫通孔を通過する前記電子ビームにより励起される
請求項１０に記載の微小光源励起装置。

【請求項12】

請求項１０または請求項１１に記載の微小光源励起装置と、
前記微小光源から発生して測定対象物に作用した測定光を検出する光検出部と、
を備える光学顕微鏡。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、電子ビームの照射により可視光の波長未満の大きさの微小光源が励起される光源生成薄膜およびその製造方法に関するものであり、また、この光源生成薄膜を用いた微小光源励起装置および光学顕微鏡に関するものである。

【背景技術】

【0002】

光学顕微鏡は、生きた生物試料をそのまま観察できるため、生命現象の解明において、非常に有効なツールとして用いられている。様々な機能を有する蛍光プローブが開発されており、位相差光学系、共焦点光学系、全反射蛍光観察法など様々な光学系を利用することによって、細胞機能の解明、単一分子の観察などが実現されてきた。光を用いた生体試料の観察については、これまでの長い歴史によって、多くの実績と技術の蓄積がある。

【0003】

生命現象の解明におけるターゲットの一つとして、細胞やたんぱく質など最小構成要素一つの機能解明ではなく、複数の構成要素における相互作用、情報伝達のメカニズム、エネルギー伝達のメカニズム、細胞内の情報分子のダイナミクスなどを明らかにすることが期待されている。生体の器官、臓器などの働きは、生体の最小構成要素である細胞間の相互作用によって決定されるものである。従って、器官・臓器の詳細なメカニズムの解明には、細胞間の相互作用を明らかにすることが必要である。また、実時間観察を行うことによって、複数の生体分子のダイナミクスを理解することが必要である。

【0004】

一方、光学顕微鏡の空間分解能は、光の波としての性質により制限され、たかだかサブミクロン程度の分解能しか実現できない。したがって、複数の分子間または微小器官の間における相互作用、情報の伝達機構を解明するには、より高い空間分解能を有する光学顕微鏡を開発することが必要である。

【0005】

光の回折限界を超えた微小領域を光学的に観察する顕微鏡として、近接場（ニアフィールド）顕微鏡が知られている。図１５に近接場顕微鏡の光学的観察の原理を示す。図１５に示すように、金属（図１５では「Ｍｅｔａｌ ｃｏａｔｉｎｇ」と表記）で遮蔽されたプローブの先端部にレーザ光（図１５では「Ｌａｓｅｒ Ｌｉｇｈｔ」と表記）が導入される。プローブの先端部には数ｎｍ〜数１０ｎｍ（図１５では「ａ」と表記）の開口部が形成されている。前記開口部は光の波長（図１５では「λ」と表記）に比べて非常に小さいので、プローブ先端部に導入されたレーザ光は前記開口部を通過できない。しかしながら、いわゆる近接場（ニアフィールド）効果によりレーザ光の一部が開口部から外部にしみ出す（エバネッセント波）。近接場顕微鏡では、このプローブ先端からしみ出した近接場光と測定対象物との相互作用が観察される。

【0006】

この近接場顕微鏡を用いれば、光の波長未満の微小領域を観察することができる。しかしながら、近接場顕微鏡では、プローブの先端を測定対象物に近接させて観察する必要があり、プローブを走査して測定対象物を観察するので、２次元の像を観察するのに非常に時間がかかる。また、生体のダイナミクスを観察するためには、実時間観察が必要であるが、従来型の近接場顕微鏡では、上記の理由により実時間観察は困難である。

【0007】

本発明に関連する先行技術としては、以下の特許文献１および特許文献２が挙げられる。特許文献１には、近接場光を用いた近接場顕微鏡において、複数のナノスケールの孔から光を照射して、近接場を生成する技術が開示されている。また、光を電子ビームにより励起することが示唆されている。この近接場顕微鏡では、微小光源はナノスケールの孔により生成されている。

【0008】

特許文献２には、光の回折限界を越えた分解能の近接場情報を高速で取得することにより、実時間観察を可能とした光学顕微鏡が開示されている。図１６に、特許文献２に開示された真空容器の隔壁１１４ａと蛍光薄膜１１３との配置関係を表した図を示す。図１６で「真空」と表記された側に真空容器が配置されており、当該真空容器内で電子ビームを発生させる。また、図１６で「大気圧」と表記された側には光学顕微鏡部が配置されており、当該光学顕微鏡部により試料１３０からの光を観察するように構成されている。そして、真空容器の隔壁１１４ａには貫通孔１１４ｂが設けられており、該貫通孔１１４ｂを覆って形成された蛍光薄膜１１３が真空側と大気圧側を隔離している。

【0009】

図１６に示すように、特許文献２に開示された光学顕微鏡では、数１０ｎｍに集束された電子ビームを蛍光薄膜１１３に照射し数１０ｎｍ以下の微小光源を生成する。そして、当該微小光源と試料との相互作用により生成した光を対物レンズを通して集光し、光検出部で検出することにより試料１３０の画像情報を取得する。特許文献２に開示された光学顕微鏡によれば、電子ビームの照射方向を制御することにより微小光源の位置を変えることができるので、２次元走査などが可能となる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【特許文献1】特表２００３−５２４７７９号公報

【特許文献2】特許第５３１７１３３号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

上述した通り、従来の光学顕微鏡では光の回折限界により分解能に限界があった。一方、光の回折限界を超えて光学的な観察を行う顕微鏡として近接場顕微鏡があるが、プローブを観察対象部に近接させて走査させる必要があり、像を形成するのに時間がかかる、という問題があった。

【0012】

特許文献２に開示された光学顕微鏡によれば、試料の実時間観察が可能となる。しかしながら、蛍光薄膜１１３を透過した電子ビームによる試料１３０の損傷については配慮されていない。特許文献２の蛍光薄膜１１３の厚さは、一例として１μｍとされているが、微小光源からの試料１３０への照射効率等を考慮してさらに蛍光薄膜１１３の厚さを薄くしたい場合もある。このような場合には、電子ビームが蛍光薄膜１１３を透過し、試料１３０に損傷を与え、正常な観測ができなくなる場合も想定される。

【0013】

さらに、特許文献２に開示された光学顕微鏡では、微小光源の強度が大きいほど観察像のＳ／Ｎ比が向上する。また、微小光源が小さいほど、つまり、微小光源の形状がたとえば球形の場合には、微小光源の直径が小さいほど観察像の分解能が向上する。この点、特許文献２では、微小光源自体の特性についての考察はなされていない。

【0014】

本発明は、上記問題を解決し、電子ビームによる試料への損傷を抑制するとともに、観察像のＳ／Ｎ比が向上し、さらに空間分解能の低下が抑制された光源生成薄膜、微小光源励起装置、光学顕微鏡、および光源生成薄膜の製造方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0015】

上記目的を達成するために、本発明の光源生成薄膜は、基板と、前記基板に形成された貫通孔と、前記基板の第１の主面上に前記貫通孔を覆い、かつ可視光の波長未満の膜厚で設けられるとともに、前記基板の前記第１の主面とは反対側の第２の主面側から前記貫通孔を通って照射される電子ビームにより可視光の波長未満の大きさの微小光源が励起される発光薄膜と、前記発光薄膜上に形成されるとともに、前記微小光源からの光を透過しかつ前記電子ビームを遮蔽するとともに、前記微小光源からの光で表面に表面プラズモンを励起させることにより前記微小光源の発光強度を増加させる金属薄膜と、を備え、前記金属薄膜が金薄膜であり、前記金薄膜の膜厚が６ｎｍ〜８ｎｍであり、前記微小光源の光の波長が６１０ｎｍであるものである。

【0016】

上記目的を達成するために、本発明の微小光源励起装置は、上記の光源生成薄膜と、電子ビームを発生する電子ビーム発生部と、前記発光薄膜に可視光の波長未満の大きさの微小光源が励起されるように前記電子ビーム発生部で発生した電子ビームを絞って前記発光薄膜に照射するとともに、前記電子ビームを走査する電子ビーム制御部と、を備える。

【0017】

上記目的を達成するために、本発明の光学顕微鏡は、上記の微小光源励起装置と、前記微小光源から発生して測定対象物に作用した測定光を検出する光検出部と、を備える。

【発明の効果】

【0019】

本発明によれば、電子ビームによる試料への損傷を抑制するとともに、観察像のＳ／Ｎ比が向上し、さらに空間分解能の低下が抑制された光源生成薄膜、微小光源励起装置、光学顕微鏡、および光源生成薄膜の製造方法を提供することが可能になる、という効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】実施の形態に係る光学顕微鏡の構成の一例を示す図である。

【図2】実施の形態に係る光源生成薄膜の構成の一例を示す図である。

【図3】実施の形態に係る光源生成薄膜のシミュレーションモデルを説明するための図である。

【図4】実施の形態に係る光源生成薄膜の金属薄膜の膜厚と電子ビーム透過率との関係の一例を示すグラフである。

【図5】実施の形態に係る光源生成薄膜の微小光源の生成状態を示す図である。

【図6】実施の形態に係る光源生成薄膜の電場強度分布と波長との関係を示すグラフである。

【図7】実施の形態に係る光源生成薄膜の電場強度と金属薄膜の膜厚との関係を示すグラフである。

【図8】実施の形態に係る光源生成薄膜のスポットサイズと金属薄膜の膜厚との関係を示すグラフである。

【図9】実施の形態に係る光源生成薄膜の製造方法の一例を示す縦断面図である。

【図10】実施の形態に係る光学顕微鏡による細胞の観察結果を示す図である。

【図11】実施の形態に係る金属薄膜の材料がＡｇである場合の電場強度分布を示すグラフである。

【図12】実施の形態に係る蛍光体薄膜の膜厚が厚い場合の電場強度分布を示すグラフである。

【図13】実施の形態に係る蛍光体薄膜の膜厚が厚い場合のシミュレーション条件を示す図、電場強度のピーク強度とスポットサイズの値を示す図である。

【図14】実施の形態に係る蛍光体薄膜がＺｎＯである場合の電場強度分布を示すグラフである。

【図15】従来技術に係る近接場顕微鏡の原理を説明するための概略図である。

【図16】従来技術に係る光学顕微鏡の、真空容器の隔壁と蛍光薄膜との配置関係を表した図である。

【図17】実施の形態に係る実施例の実施結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0021】

以下、図面を参照して、本発明を実施するための形態の一例について詳細に説明する。

【0022】

図１を参照して、本実施の形態に係る光学顕微鏡について説明する。図１に示すように、本実施の形態に係る光学顕微鏡１は、電子顕微鏡結像系１０と光学顕微鏡部２０とを備えている。

【0023】

電子顕微鏡結像系１０は、電子ビーム（図１では「ＥＢ」と表記）を射出する電子源１１と、電子源１１から射出された電子ビームＥＢを所定位置に集束させる電子レンズ１２と、電子ビームＥＢが照射される光源生成薄膜５０と、内部が真空状態になっている真空容器１４と、を備えている。電子源１１および電子レンズ１２は、真空容器１４内に設けられている。光源生成薄膜５０は、真空容器１４の隔壁１４ａに設けられた貫通孔１４ｂを塞ぐように隔壁１４ａ上に載置され、隔壁の一部を構成している。そして、試料３０は、貫通孔１４ｂの上で且つ光源生成薄膜５０の上に配置されている。なお、光源生成薄膜５０は、隔壁１４ａに貼り付けて固定してもよい。

【0024】

また、図１に示すように、光学顕微鏡部２０は、試料３０からの光を集光する対物レンズ２１と、対物レンズ２１からの光を検出する光検出器２２と、光検出器２２で検出された信号を記録する信号記録部２３と、を備えている。なお、図１では、光源生成薄膜５０の大きさを誇張して大きく描いているが、実際には大気圧に耐えられるように、真空容器１４の上面の隔壁１４ａに形成された直径１００μｍ程度の微小の貫通孔１４ｂを塞ぐのに十分な程度の大きさ（具体的には、５ｍｍ×５ｍｍ程度）で構成されている。

【0025】

つぎに、図２を参照して、本実施の形態に係る光源生成薄膜５０についてより詳細に説明する。図２（ａ）は光源生成薄膜５０の斜視図を、図２（ｂ）は光源生成薄膜５０の図２（ａ）におけるＡ−Ａ’断面図を、図２（ｃ）は光源生成薄膜５０を真空容器１４の隔壁１４ａ上に載置した状態を示している。

【0026】

図２（ａ）および図２（ｂ）に示すように、本実施の形態に係る光源生成薄膜５０は、基板５２、基板５２の主面上に形成されたウィンドウ薄膜５４、ウィンドウ薄膜５４上に形成された蛍光体薄膜５６、および蛍光体薄膜５６上に形成された金属薄膜５８を含んで構成されている。基板５２の、ウィンドウ薄膜５４、蛍光体薄膜５６、および金属薄膜５８が形成された主面とは反対側の主面には、ウィンドウ部６０が設けられている。該ウィンドウ部６０は、後述するように、基板５２に設けられた貫通孔である。

【0027】

本実施の形態に係る光源生成薄膜５０においては、基板５２の形状は平面視略正方形とされ、その一辺の長さＬｓｕｂは、一例としてＬｓｕｂ＝５ｍｍである。また、ウィンドウ部６０も平面視略正方形に形成されており、その一辺の長さＬｗｉｎは、一例としてＬｗｉｎ＝１００μｍである。なお、本実施の形態では、基板５２およびウィンドウ部６０の形状を略正方形とした形態を例示して説明するが、これに限られず、たとえば円形状としてもよい。さらに、基板５２の形状とウィンドウ部６０の形状とが同じ形状である必要もない。

【0028】

本実施の形態に係る光源生成薄膜５０の基板５２は、蛍光体薄膜５６および金属薄膜５８を支持する支持体であり、基板５２の材料としては、たとえばシリコン（Ｓｉ）、酸化シリコン（ＳｉＯ_２）等を用いることができる。

【0029】

ウィンドウ薄膜５４は、電子顕微鏡結像系１０の真空側と光学顕微鏡部２０の大気側とを直接的に隔離するための部材であり、ウィンドウ薄膜５４の材料としては、たとえば、ＳｉＮ_ｘ膜（シリコン窒化膜）、ＳｉＯ_２（シリコン酸化膜）等を用いることができる。図２（ｃ）に示すように、電子ビームＥＢはウィンドウ薄膜５４を通して蛍光体薄膜５６に照射されるため、ウィンドウ薄膜５４が厚いと電子ビームＥＢが蛍光体薄膜５６に到達できず、また、到達できても散乱して収束スポットが大きくなってしまう。したがって、ウィンドウ薄膜５４の膜厚は、大気圧以上の圧力に耐え得る膜厚とすることが必要である一方、極力薄く（本実施の形態では、５０ｎｍ程度）する必要がある。

【0030】

蛍光体薄膜５６は、後述するように、電子ビームＥＢの照射を受けて微小光源ＬＳを生成する部材であり、蛍光体薄膜５６の材料としては、たとえば、Ｙ_２Ｏ_３：Ｅｕ^３＋（ユーロピウム賦活酸化イットリウム）、ＺｎＯ（酸化亜鉛）等を用いることができる。

【0031】

金属薄膜５８は、後述するように、電子ビームＥＢを遮蔽するための部材である。また、本実施の形態に係る金属薄膜５８では、金属薄膜５８の表面に表面プラズモンを発生させ、微小光源ＬＳの光強度を増強させる場合もある。金属薄膜５８の材料としては、たとえば、Ａｕ（金）、Ａｇ（銀）、Ｃｕ（銅）、Ａｌ（アルミニウム）等を用いることができる。

【0032】

図２（ｃ）に示すように、光源生成薄膜５０は、光源生成薄膜５０のウィンドウ部６０の位置と隔壁１４ａの貫通孔１４ｂの位置とを位置合わせして、隔壁１４ａ上に載置される。上述したように、その際接着剤等を用いて光源生成薄膜５０を隔壁１４ａに貼り付けてもよい。

【0033】

また、図２（ｃ）に示すように、電子源１１で発生された電子ビームＥＢは、電子レンズ１２により光源生成薄膜５０の蛍光体薄膜５６内に、たとえば、数ｎｍ〜数１０ｎｍの大きさで集束される。このため、集束された電子ビームＥＢにより蛍光体薄膜５６内で光が励起され、数１０ｎｍ程度の大きさの微小光源ＬＳが生成される。

【0034】

電子ビームは、電場や磁場などにより制御可能であるので、電場や磁場などにより電子ビームの照射方向を制御することにより蛍光体薄膜５６内の任意の場所に微小光源ＬＳを励起させることができ、その結果２次元走査などが可能になる。本実施の形態に係る光学顕微鏡１も図示しない電子ビーム制御部を備えており、電子源１１および電子レンズ１２は該電子ビーム制御部によって制御される。そして、電子源１１、電子レンズ１２、光源生成薄膜５０および該電子ビーム制御部を含んで、本実施の形態に係る微小光源励起装置が構成されている。

【0035】

微小光源の大きさは、微小光源ＬＳの形状が球状（略球状を含む）であれば、直径が可視光波長未満であり、微小光源ＬＳの形状が球形以外であれば、最短軸の長さが可視光波長未満である。

【0036】

微小光源ＬＳと試料３０との相互作用により生成された光は、対物レンズ２１を通して光検出器２２で検出される。すなわち、可視光波長未満の大きさの微小光源ＬＳにより、微小光源ＬＳ周辺の試料３０（測定対象物）の近接場効果が測定され、測定対象物により近接場効果の影響を受けた光は光検出器２２により検出される。

【0037】

蛍光体薄膜５６内に生じた微小光源は、近接場光学顕微鏡において、微小開口によって生じたエバネッセント波を利用して試料を照明することと原理的に等価である。試料３０と蛍光体薄膜５６との距離が十分小さい場合、電子ビームＥＢによる励起によって生じた微小蛍光光源のエバネッセント波で試料を観察することができ、回折限界を超えた分解能を実現することが可能となる。以上により測定対象物の可視光波長未満の近接場効果が観察される。

【0038】

対物レンズ２１からの光により光検出器２２で生成された信号は、信号記録部２３で記録される。

【0039】

本実施の形態に係る光源生成薄膜５０の金属薄膜５８は、先述したように、基板５２のウィンドウ部６０を通して蛍光体薄膜５６に入射した電子ビームＥＢが、蛍光体薄膜５６を透過して試料３０に照射されないように遮蔽する機能を有している。なお、本実施の形態において「遮蔽する」とは、電子ビームＥＢの全部を遮蔽する場合のみならず、試料に対して許容される損傷の程度等に応じて、電子ビームＥＢの一部を遮蔽し、一部を透過する場合も含む。

【0040】

つぎに、図３ないし図１４を参照して、本実施の形態に係る光源生成薄膜の金属薄膜の構成および効果についてより詳細に説明する。図４ないし図８、図１１ないし図１４は、図３に示す光源生成薄膜５０のシミュレーションモデルを用い、ＦＤＴＤ（Ｆｉｎｉｔｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ Ｔｉｍｅ Ｄｏｍａｉｎ）法を用いてシミュレーションした結果を示している。ＦＤＴＤ法とは、解析する空間を細かいメッシュで切り、各メッシュポイントの電磁界の各成分を、マクセル方程式に基づいて時間的に解いていく手法である。
また、図９は、本実施の形態に係る光源生成薄膜の製造方法を、図１０は、本実施の形態に係る光源生成薄膜を用いて実際に細胞を観察した実施例をそれぞれ示している。

【0041】

［解析モデル］
図３（ａ）に示すように、本実施の形態に係る光源生成薄膜５０のシミュレーション用のモデルは、膜厚ｄＳのウィンドウ薄膜５４、膜厚ｄＦの蛍光体薄膜５６、および膜厚ｄＭの金属薄膜５８の積層体とされている。ウィンドウ薄膜５４の、蛍光体薄膜５６および金属薄膜５８が積層された面とは反対側の面から、電子ビームＥＢが蛍光体薄膜５６内で集束されるように入射される。蛍光体薄膜５６内に集束された電子ビームＥＢによって蛍光体薄膜５６内にカソードルミネセンスが発生し、微小光源ＬＳが形成される。

【0042】

図３（ｂ）は、光源生成薄膜５０を構成する各薄膜の材料、膜厚等の条件を示している。図３（ｂ）に示すように、本実施の形態に係る光源生成薄膜５０の、ウィンドウ薄膜５４の材料はＳｉ_３Ｎ_４（シリコン窒化膜）、膜厚はｄＳ＝５０ｎｍとしている。蛍光体薄膜５６の材料はＹ_２Ｏ_３：Ｅｕ^３＋、膜厚はｄＦ＝５０ｎｍとしている。金属薄膜５８の材料はＡｕ（一部、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌを含む）とし、膜厚ｄＭは、０ｎｍ〜２５ｎｍの範囲で変化させている。また、電子ビームＥＢの加速電圧Ｖａは５ｋＶとしている。

【0043】

［金属薄膜の電子ビーム透過抑制効果］
光源生成薄膜５０に向けて照射された電子ビームＥＢの散乱過程をモンテカルロ法を用いて解析することにより求めた、電子ビームＥＢの透過率の、金属薄膜５８の膜厚に対する依存性を図４に示す。図４は、金属薄膜５８の材料を、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、およびＡｌとし、各々の薄膜の膜厚ｄＭを変化させて電子ビームＥＢの透過率をシミュレーションした結果である。

【0044】

図４において、膜厚０ｎｍにおける電子ビームＥＢの透過率は、金属薄膜５８がない場合の透過率（すなわち、ウィンドウ薄膜５４および蛍光体薄膜５６を透過した透過率）であり、本実施の形態では７０％となっている。図４に示すように、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌのいずれについても、膜厚ｄＭが増加するにしたがい電子ビームＥＢの透過率が減少し、電子ビームＥＢの遮蔽効果が確認された。

【0045】

また、遮蔽効果の大きさはＡｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌの順に大きくなっており、Ａｕの遮蔽効果が最も大きい。Ａｕ薄膜についての数値をみると、膜厚ｄＭ＝１０ｎｍで電子ビームＥＢの透過率が２０％となっており、膜厚ｄＭ＝１０ｎｍのＡｕ薄膜により電子ビームＥＢを約７０％（（７０％−２０％）／７０％）遮蔽していることがわかる。さらに、Ａｕ薄膜の膜厚ｄＭを２５ｎｍ以上とした場合には、電子ビームＥＢの透過率はほぼ０％となっている。

【0046】

［光源生成薄膜における微小光源の生成］
図５を参照して、光源生成薄膜５０における微小光源ＬＳの生成について説明する。図５は、光源生成薄膜５０に向けて照射された電子ビームＥＢにより蛍光体薄膜５６内で励起される光の分布を解析して求めた、カソードルミネセンスの状態を示すシミュレーション結果である。

【0047】

図５においては、金属薄膜５８としてＡｕ薄膜を用い、該Ａｕ薄膜の膜厚をｄＭ＝１０ｎｍとしている。また、蛍光体薄膜５６としては、Ｙ_２Ｏ_３：Ｅｕ^３＋を用い、当該Ｙ_２Ｏ_３：Ｅｕ^３＋の発光波長λ_０を３５０ｎｍ、５００ｎｍ、６１０ｎｍと変えている。図５（ａ）はＡｕ薄膜がない場合（図５（ａ）では、「Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」と表記。λ_０＝６１０ｎｍ。以下、金属薄膜がない場合の光源生成薄膜５０を「基準薄膜」という場合がある）の、図５（ｂ）はλ_０＝３５０ｎｍの場合の、図５（ｃ）はλ_０＝５００ｎｍの場合の、図５（ｄ）はλ_０＝６１０ｎｍの場合のカソードルミネセンスのシミュレーション結果を示している。なお、電子ビームＥＢの加速電圧Ｖａは５ｋＶである。また、Ｙ_２Ｏ_３：Ｅｕ^３＋固有の発光波長は６１０ｎｍに近い値であるが、本実施の形態では該固有の発光波長が他の値（３５０ｎｍ、５００ｎｍ）であると仮定してシミュレーションしている。

【0048】

図５（ａ）に示すように、基準薄膜では電子ビームＥＢによって蛍光体薄膜５６内に光が励起されており、これが本実施の形態における微小光源ＬＳを形成する。また、図５（ｂ）、（ｃ）に示すように、発光波長λ_０が３５０ｎｍ、５００ｎｍの場合にも蛍光体薄膜５６内で光が励起されている。しかしながら、λ_０が３５０ｎｍ、５００ｎｍの場合には、Ａｕ薄膜の表面に特段の変化はない。

【0049】

それに対し、図５（ｄ）に示すように、λ_０が６１０ｎｍの場合にはＡｕ薄膜の表面に光が誘起され、微小光源ＬＳの発光強度が増強されることがわかった。以下に述べるように、このＡｕ薄膜の表面に誘起された光は表面プラズモン共鳴によって誘起された光（図５（ｄ）で「ＳＰ」と表記された部分）と考えられる。６１０ｎｍの発光波長λ_０で発光強度が増強されるのは、６１０ｎｍという波長が、金の表面において表面プラズモンが励起される波長に近い波長であるからと考えられる。

【0050】

［金属薄膜表面における電場強度分布］
図６を参照して、電場強度のラインプロファイルにより金属薄膜表面における電場強度分布について説明する。

【0051】

図６に「Ｒｅｆｅｅｎｃｅ」、「３５０ｎｍ」、「５００ｎｍ」、および「６１０ｎｍ」と表記されたグラフは、各々図５（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）のシミュレーションにおけるｙ方向の電場強度のラインプロファイルである。すなわち、Ａｕ薄膜（またはＹ_２Ｏ_３：Ｅｕ^３＋薄膜）の表面のｙ方向に２００ｎｍの長さの直線上での電場強度を算出した結果を示している。本実施の形態では、Ａｕ薄膜（またはＹ_２Ｏ_３：Ｅｕ^３＋薄膜）の表面からＺ方向に１０ｎｍの位置での電場強度を算出している。

【0052】

図６から、発光波長λ_０が３５０ｎｍの場合の電場強度は、基準薄膜の電場強度、すなわちＡｕ薄膜がない場合の電場強度よりも小さい。λ_０が５００ｎｍの場合の電場強度は、基準薄膜の電場強度と同程度の電場強度となっている。λ_０が５００ｎｍの場合、Ａｕ薄膜を設けても基準薄膜の電場強度と同程度の電場強度となっているので、Ａｕ薄膜により電場強度の増強が発生していると考えられる。そして、λ_０が６１０ｎｍの場合の電場強度は、基準薄膜の電場強度に対して約３倍の電場強度となっている。λ_０が６１０ｎｍの場合の電場強度と基準薄膜の電場強度との差分が表面プラズモンの励起に起因する発光強度、すなわち微小光源ＬＳの強度の増加分と考えられる。

【0053】

したがって、本実施の形態では、蛍光体薄膜５６の発光波長λ_０をたとえば６１０ｎｍに設定し、表面プラズモンによって強度が増強された微小光源ＬＳを用いることにより、よりＳ／Ｎ比が向上した光学顕微鏡１を実現することが可能である。

【0054】

しかしながら、表面プラズモンの励起がほとんど認められないλ_０が５００ｎｍの場合でも、基準薄膜と同程度の強度の光が生成される、すなわち従来技術に係る蛍光薄膜と同程度の強度の微小光源ＬＳが生成されるので、光学顕微鏡１の光源として使用することが可能である。さらに、必要とされる電子ビームＥＢの遮蔽効果と微小光源の強度によっては、λ_０が３５０ｎｍの場合であっても光学顕微鏡１の光源として使用することができる。したがって、本実施の形態における微小光源ＬＳの生成においては、表面プラズモンの励起は必須ではない。

【0055】

一方、光が金属に侵入する場合の深さには限界があるので、金属薄膜の膜厚が一定以上となった場合には、光が金属薄膜を透過できず原理的に微小光源ＬＳは得られない。したがって、金属薄膜の膜厚は、少なくとも、当該波長における表皮深さ（電界強度が１／ｅとなる深さ）未満であることが必要である。

【0056】

［金属薄膜表面における電場強度の金属薄膜の膜厚に対する依存性］
図７を参照して、金属薄膜表面における電場強度の金属薄膜の膜厚に対する依存性について説明する。図７は、Ａｕ薄膜の膜厚に対する電場強度のシミュレーション結果を示している。なお、図７のシミュレーション条件は、λ_０＝６１０ｎｍ、Ｖａ＝５ｋＶである。

【0057】

図７、および図７に基づく外挿から、Ａｕ薄膜の膜厚が無い（ｄＭ＝０）ときの電場強度の１倍以上の電場強度が得られるＡｕ薄膜の膜厚は、およそ３０ｎｍ以下であり、Ａｕ薄膜の膜厚が無い（ｄＭ＝０）ときの電場強度の２倍以上の電場強度が得られるＡｕ薄膜の膜厚は、およそ２ｎｍ〜２１ｎｍである。また、Ａｕ薄膜の膜厚が６ｎｍ〜８ｎｍでの範囲に電場強度のピークが存在することがわかる。つまり、本実施の形態では、Ａｕ薄膜が存在しても、Ａｕ薄膜が無いときの電場強度と同程度、またはそれ以上の電場強度が得られるという優位な効果を有し、Ａｕ薄膜が無いときの電場強度と同程度のＡｕ薄膜の膜厚は、およそ３０ｎｍ以下である。また、Ａｕ薄膜の膜厚が６ｎｍ〜８ｎｍの範囲で表面プラズモンの励起効率が最大となることがわかる。これは、Ａｕ薄膜の膜厚ｄＭが薄いと表面プラズモンが発生しにくく、Ａｕ薄膜の膜厚ｄＭが厚くなると光が透過しにくくなるためと考えられる。

【0058】

［金属薄膜の表面における微小光源のスポットサイズの、金属薄膜の膜厚に対する依存性］
図８を参照して、金属薄膜の表面における微小光源ＬＳのスポットサイズの、金属薄膜の膜厚に対する依存性について説明する。図８は、蛍光体薄膜５６内で生成された微小光源ＬＳに起因してＡｕ薄膜の表面に現出する発光スポットのスポットサイズと、Ａｕ薄膜の膜厚ｄＭとの関係をシミュレーションした結果を示している。スポットサイズは、電場強度の半値全幅（ＦＷＨＭ：Ｆｕｌｌ Ｗｉｄｔｈ ａｔ Ｈａｌｆ Ｍａｘｉｍｕｍ）で算出している。金属薄膜の表面における発光スポットからの光が試料３０に照射されるので、金属薄膜の表面におけるスポットサイズにより光学顕微鏡１の分解能が定まる。なお、図８のシミュレーションにおけるシミュレーション条件は、λ_０＝６１０ｎｍ、Ｖａ＝５ｋＶである。

【0059】

図８に示すように、Ａｕ薄膜を追加した場合でも、微小光源ＬＳのＡｕ薄膜の表面におけるスポットサイズは１００ｎｍ以下となっており、可視域における回折限界（２００ｎｍ程度）以下を達成していることがわかる。また、図８に示すように、Ａｕ薄膜の膜厚が２０ｎｍ程度以上となると、スポットサイズは１００ｎｍ未満の値（図８では、約９２ｎｍ）でほぼ一定値となることがわかる。

【0060】

また、図８から、上述した表面プラズモンの励起効率が最大となるＡｕ薄膜の膜厚である６ｎｍ〜８ｎｍの範囲における、Ａｕ薄膜の表面に現出するスポット光のスポットサイズは７０ｎｍ〜８０ｎｍである。つまり、Ａｕ薄膜を形成した本実施の形態に係る光源生成薄膜５０によっても、Ａｕ薄膜の表面におけるスポット光のスポットサイズを、可視域における回折限界に比べて十分に小さな値とすることが可能であることがわかる。

【0061】

［まとめ］
以上のシミュレーション結果をまとめると、本実施の形態に係るシミュレーションによって、以下のことが明らかとなった。
（１）蛍光体薄膜（本実施の形態では、Ｙ_２Ｏ_３：Ｅｕ^３＋薄膜）上に金属薄膜（本実施の形態では、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ）を成膜することにより、電子ビームの透過を抑制することと、電子ビームの透過を有効に抑制可能な膜厚において、金属薄膜の表面から出射する微小光源を得ることとを両立させることが可能である。金属薄膜の膜厚の上限は、当該金属の当該波長における表皮深さである。
（２）金属薄膜の表面プラズモン励起波長に対応させて微小光源の波長を選定することにより、金属薄膜の表面に表面プラズモンを励起させることができ、その結果微小光源の強度を増強させ、観察像のＳ／Ｎ比を向上させることが可能である。
（３）金属薄膜の膜厚に対する表面プラズモンの励起強度にはピーク値が存在する。したがって、金属薄膜の膜厚を最適化することにより表面プラズモンの励起効率をより高め、観察像のＳ／Ｎ比をより向上させることが可能である。
（４））蛍光体薄膜上に金属薄膜を成膜した場合でも、微小光源から発生した光により金属薄膜の表面に形成されるスポット光のスポットサイズ、すなわち、試料に照射される光の直接の光源のスポットサイズを、可視域の回折限界より十分に小さな値とすることが可能である。

【0062】

ここで、本実施の形態に係る光学顕微鏡１における微小光源ＬＳの波長は、２００ｎｍ以上であることが好ましい。２００ｎｍ未満の波長では、光の散乱等の影響により大気中での観測が困難であり、観測系の周囲を真空に保つ必要が生ずる。また、２００ｎｍ未満の波長では、たとえば生体に対する損傷が発生しやすくなる。むろん、これらの条件が問題とならない場合には、２００ｎｍ未満の波長で本実施の形態に係る光学顕微鏡１を構成しても差し支えない。

【0063】

また、本実施の形態において、金属薄膜の表面における表面プラズモンの励起を積極的に利用する場合には、微小光源の波長との関係において、金属薄膜を構成する金属が表面プラズモンを励起することが可能な金属であることが必要である。金属が表面プラズモンを励起するための一般的な条件は、当該金属の誘電率の実部が負であることであり、そのような金属を選定すればよい。また、上記の２００ｎｍ以上という微小光源の波長の条件と併せると、励起される表面プラズモンの波長（金属によって固有の波長範囲が定まっている）が２００ｎｍ以上であることが必要となる。本実施の形態において検討した金属、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、およびＡｌは、いずでも上記条件を充足している。

【0064】

［光源生成薄膜の製造方法］
つぎに、図９を参照して、本実施の形態に係る光源生成薄膜５０の製造方法の一例の概略について説明する。本実施の形態では、基板５２の材料としてＳｉ、ウィンドウ薄膜５４の材料としてＳｉＮ_ｘ、蛍光体薄膜５６の材料としてＹ_２Ｏ_３：Ｅｕ^３＋、金属薄膜５８の材料としてＡｕを用いた形態を例示して説明する。

【0065】

まず、図９（ａ）に示すように、ＣＶＤ法、スパッタ法等により、Ｓｉ基板５２の一主面上にＳｉＮ_ｘ膜５４を形成する。基板５２の厚さは、５０μｍから３００μｍ程度であり、たとえば１００μｍ〜２００μｍ程度でも良く、ＳｉＮ_ｘ膜５４の膜厚は、たとえば５０ｎｍ程度とする。

【0066】

つぎに、図９（ｂ）に示すように、Ｓｉ基板５２のＳｉＮ_ｘ膜５４が形成された側とは反対側の主面をフォトリソグラフィを用いてマスキングし、アルカリ溶液等によりにエッチングしてウィンドウ部６０を形成する。この場合のエッチングは、Ｓｉ基板５２を貫通した後ＳｉＮ_ｘ膜５４で停止するようにする、つまりＳｉ基板５２を削り、ＳｉＮ_ｘ膜５４で停止するようなエッチング液を選択する。

【0067】

つぎに、図９（ｃ）に示すように、ＳｉＮ_ｘ膜５４上にスパッタ法等によりＹ_２Ｏ_３：Ｅｕ^３＋薄膜を形成する。Ｙ_２Ｏ_３：Ｅｕ^３＋薄膜の膜厚は、たとえば５０ｎｍとする。

【0068】

つぎに、図９（ｄ）に示すように、Ｙ_２Ｏ_３：Ｅｕ^３＋薄膜上にスパッタ法等によりＡｕ薄膜を形成する、Ａｕ薄膜の膜厚は、たとえば１０ｎｍとする。

【0069】

つぎに、ダイシングして、個々の光源生成薄膜５０に分割する。以上の工程により光源生成薄膜５０が製造される。

【0070】

なお、本実施の形態のように基板５２としてＳｉを用いる場合には、基板５２の表面を面方位（１００）とし、ウィンドウ部６０の側面を面方位（１１１）として、ＫＯＨ（水酸化カリウム）溶液などでエッチングすることにより、ウィンドウ部６０を精密に形成する事ができる。この場合、エッチング面の底角はほぼ５４．７度であり、このように形成された四角錘の頂角は、ほぼ７０．６度となる。

【0071】

［実施例］
つぎに、図１０を参照して、本実施の形態に係る光学顕微鏡１によって細胞を観察した結果について説明する。本実施例では、特に、光学顕微鏡１による長時間観察における試料への損傷の程度を実証することを目的とし、蛍光体薄膜５６を用いず、ＳｉＮ_ｘ薄膜を用いたウィンドウ薄膜５４上に金属薄膜５８（本実施例では金薄膜としている）を直接形成している。

【0072】

図１０（ａ）は、光学顕微鏡１によって試料としてのＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を観察した結果である画像を、図１０（ｂ）は、図１０（ａ）に示すＡ−Ｂ間のラインプロファイル（長さ約２μｍ）を各々示している。図１０（ｂ）では、実線が実測値、点線がラインプロファイルのピーク値およびＦＷＨＭを算出するための近似曲線（ガウスフィッティング）を表している。また、図１０（ｃ）は、ＳｉＮ_ｘ薄膜のみの場合（上段）とＳｉＮ_ｘ薄膜上に金薄膜を形成した場合（下段）の、光学顕微鏡１での観察時間の経過に対するＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の状態の変化を示している。なお、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞とは、マウスの頭蓋骨由来細胞株であり、金属薄膜５８上に固定、乾燥させている。

【0073】

ＳｉＮ_ｘには、電子ビームＥＢで励起することにより光を発生するという性質がある。本実施例では、ＳｉＮ_ｘのこの性質を用いて、ＳｉＮ_ｘ薄膜によりウィンドウ薄膜５４と蛍光体薄膜５６とを兼用化している（以下、このような薄膜を「発光薄膜」と称する場合がある）。したがって、電子ビームＥＢはＳｉＮ_ｘ薄膜内で集束させ、発光薄膜（ＳｉＮｘ薄膜）内で微小光源ＬＳが生成されるようにしている。金属薄膜５８としては、膜厚１５ｎｍのＡｕ薄膜を用い、電子ビームＥＢの加速電圧Ｖａは３ｋＶとしている。なお、Ａｕ薄膜の膜厚を１５ｎｍとし、電子ビームＥＢの加速電圧Ｖａを３ｋＶとした場合の、電子ビームの透過率は１０％以下である。

【0074】

図１０（ａ）に示すように、本実施の形態に係る光学顕微鏡１によってＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞内の顆粒が観察された。また、図１０（ｂ）に示すラインプロファイルから、細胞内の顆粒の大きさが約１３７ｎｍ（ＦＷＨＭ）であることがわかった。したがって、発光薄膜上に電子ビーム遮蔽用の金属薄膜５８を成膜した場合でも、回折限界以下の空間分解能で細胞の観察を行えることが実証された。

【0075】

さらに、図１０（ｃ）に示すように、ＳｉＮ_ｘ薄膜のみの場合には明らかにＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の状態が変化し、細胞の一部が失われているが、ＳｉＮ_ｘ薄膜上に金薄膜を形成した場合にはほとんど細胞の状態が変化していない。したがって、発光薄膜上に金属薄膜５８を形成することにより、試料への損傷が有効に抑制されることがわかる。

【0076】

本実施例のように、ウィンドウ薄膜５４自体に電子ビーム励起による発光という特性が備わっていれば、ウィンドウ薄膜５４で蛍光体薄膜５６を兼ねることが可能である。逆に、蛍光体薄膜５６に真空側と大気圧側とを隔離させるだけの強度をもたせれば、蛍光体薄膜５６でウィンドウ薄膜５４を兼ねることも可能である。つまり、本発明において、ウィンドウ薄膜５４と蛍光体薄膜５６の２層構成にすることは必須ではなく、双方の特質を備えた１層の薄膜を用いる形態としてもよい。さらには、たとえば、ウィンドウ薄膜５４としてのＳｉＮ_ｘ薄膜を基板５２の上に形成後、該ＳｉＮ_ｘ薄膜上に発光薄膜としてのＳｉＮ_ｘ薄膜を形成してもよい。

【0077】

以上のような発光薄膜を用いた形態とすることにより、光源生成薄膜５０自体の膜厚が薄くなるので、光源生成薄膜５０の電子ビーム入射位置から試料までの距離が短くなり、電子ビームの加速電圧がより低い電圧であっても空間分解能の高い観察像が得られる。なお、この場合の光源生成薄膜の製造方法は、たとえば、図９に示す光源生成薄膜の製造方法において、ウィンドウ薄膜５４および蛍光体薄膜５６のいずれか一方の形成を省略すればよい。

【0078】

つぎに、金属薄膜５８の材料を変えた場合、蛍光体薄膜５６の膜厚を変えた場合、蛍光体薄膜５６の材料を変えた場合の電場強度分布のシミュレーション結果について説明する。

【0079】

［金属薄膜の材料がＡｇである場合の電場強度分布］
図１１（ａ）に、金属薄膜５８の材料がＡｇである場合の電場強度分布を示す。図１１（ａ）において、「Ｙ_２Ｏ_３：Ｅｕ^３＋＋Ａｇ１０ｎｍ」と表記されたグラフが金属薄膜５８の材料をＡｇとした場合のグラフであり、「Ｙ_２Ｏ_３：Ｅｕ^３＋」と表記されたグラフが、金属薄膜５８がない場合、すなわち基準薄膜の電場強度分布を示すグラフである。１１（ｂ）は、図１１（ａ）に対応するシミュレーション条件を示している。すなわち、シミュレーション条件は以下のとおりである。
ウィンドウ薄膜：Ｓｉ_３Ｎ_４、膜厚ｄＳ＝５０ｎｍ
蛍光体薄膜：Ｙ_２Ｏ_３：Ｅｕ^３＋、膜厚ｄＦ＝５０ｎｍ
金属薄膜：Ａｇ、膜厚ｄＭ＝１０ｎｍ
また、発光波長λ_０は６１０ｎｍ、電子ビームＥＢの加速電圧Ｖａは５ｋＶ、電場強度の算出位置は、Ａｇ薄膜（またはＹ_２Ｏ_３：Ｅｕ^３＋薄膜）の表面の表面から１０ｎｍ離れた位置としている。

【0080】

図１１（ａ）に示すように、金属薄膜５８としてＡｇ薄膜を適用した場合にも電場強度の増大が認められ、ピーク値で約２倍となっている。また、Ａｇ薄膜を適用した場合のスポットサイズは８４ｎｍ（ＦＷＨＭ）であり、基準薄膜の４３ｎｍ（ＦＷＨＭ）に対して約２倍になってはいるものの回折限界よりも十分小さい値となっている。ただし、本シミュレーションでは、図７に示すような最適化を行っていないので、Ａｇ薄膜の膜厚の最適化を行うことにより電場強度のピーク値はさらに大きくなる可能性がある。

【0081】

［蛍光体薄膜の膜厚を厚くした場合の電場強度分布］
図１２に、蛍光体薄膜５６の膜厚をｄＦ＝２００ｎｍとした場合の電場強度分布の波長に対する依存性を示す。また、図１３（ａ）に、図１２に対応するシミュレーション条件を、図１３（ｂ）に、図１２の各条件における電場強度のピーク値（図１３（ｂ）では、「ピーク強度」と表記）およびスポットサイズ（図１３（ｂ）では、「ＦＷＨＭ」と表記）を示す。図１３（ａ）に示すように、シミュレーション条件は以下のとおりである。
ウィンドウ薄膜：Ｓｉ_３Ｎ_４、膜厚ｄＳ＝５０ｎｍ
蛍光体薄膜：Ｙ_２Ｏ_３：Ｅｕ^３＋、膜厚ｄＦ＝２００ｎｍ
金属薄膜：Ａｕ、膜厚ｄＭ＝２０ｎｍ

【0082】

また、発光波長λ_０は３５０ｎｍ、５１５ｎｍ、６１０ｎｍ、電子ビームＥＢの加速電圧Ｖａは５ｋＶ、電場強度の算出位置は、Ａｕ薄膜（またはＹ_２Ｏ_３：Ｅｕ^３＋薄膜）の表面から１０ｎｍ離れた位置としている。ここで、図１２（ａ）に示す基準薄膜のグラフにおいて２つの曲線が描かれているが、実線が電場強度のシミュレーション値を、点線がシミュレーション値に対するフィッティングカーブ（ガウス曲線）を示している。

【0083】

図１３（ｂ）に示すように、発光波長λ_０＝３５０ｎｍの場合の電場強度のピーク値は基準薄膜（金属薄膜５８なし）の電場強度のピーク値より小さいが、λ_０＝５１５ｎｍの場合の電場強度のピーク値は基準薄膜の電場強度のピーク値とほぼ同程度である。λ_０＝６１０ｎｍの場合の電場強度のピーク値は基準薄膜の電場強度のピーク値の約１．８倍となっており、蛍光体薄膜５６の膜厚を厚くした場合でも電場強度の増大が確認された。また、図示は省略するが、λ_０＝６１０ｎｍの場合には表面プラズモンが発生していることを確認している。

【0084】

また、図１３（ｂ）に示すように、λ_０＝３５０ｎｍ以外のスポットサイズは２００ｎｍ未満となっており、蛍光体薄膜５６の膜厚を厚くした場合でも回折限界以下の分解能を達成可能であることがわかる。蛍光体薄膜５６の成膜においては、成膜開始時から一定の膜厚までは欠陥が多く含まれ、その後欠陥の少ない蛍光体薄膜が形成されるような場合もある。かかる場合には一定値以上の膜厚の蛍光体薄膜５６を成膜する必要があるが、このような場合でも実用的な微小光源が得られることがわかる。

【0085】

図示は省略するが、本シミュレーション条件において、金薄膜の膜厚を０〜４０ｎｍ変化させた場合の、電場強度のピーク値、およびスポットサイズ（ＦＷＨＭ）についてもシミュレーションしている。その結果によれば、金薄膜の膜厚が無いときの電場強度の１倍以上の電場強度が得られる金薄膜の膜厚は、およそ３０ｎｍ以下であり、金薄膜の膜厚が無いときの電場強度の２倍以上の電場強度が得られる金薄膜の膜厚は、およそ４ｎｍ〜２０ｎｍである。また、電場強度がピークとなる金薄膜の膜厚は、４ｎｍ〜９ｎｍ程度の範囲であり、図７に示す蛍光体薄膜の膜厚が５０ｎｍの場合の電場強度がピークとなる範囲６ｎｍ〜８ｎｍと同様の傾向を示すことがわかった。また、スポットサイズについては、金薄膜の膜厚０〜２０ｎｍの範囲で２００ｎｍ（ＦＷＨＭ）以下となっており、回折限界以下の分解能を達成することが可能であることがわかった。

【0086】

［蛍光体としてＺｎＯを用いた場合の電場強度分布］
図１４（ａ）に、蛍光体薄膜５６を構成する蛍光体としてＺｎＯを用いた場合の電場強度のラインプロファイルを、図１４（ｂ）に、図１４（ａ）に対応するシミュレーション条件示す。すなわち、シミュレーション条件は以下のとおりである。
ウィンドウ薄膜：Ｓｉ_３Ｎ_４、膜厚ｄＳ＝５０ｎｍ
蛍光体薄膜：ＺｎＯ、膜厚ｄＦ＝５０ｎｍ
金属薄膜：Ａｇ、Ａｌ、膜厚ｄＭ＝１０ｎｍ
金属薄膜５８の材料はＡｇおよびＡｌとし、膜厚はいずれも１０ｎｍとしている。また、発光波長λ_０は３９０ｎｍ、電子ビームＥＢの加速電圧Ｖａは５ｋＶ、電場強度の算出位置は、Ａｇ（Ａｌ）薄膜（またはＺｎＯ薄膜）の表面から１０ｎｍ離れた位置としている。

【0087】

図１４（ａ）において、「ＺｎＯ」と表記されたグラフが基準薄膜の電場強度分布を、「ＺｎＯ＋Ａｇ」と表記されたグラフが金属薄膜５８をＡｇ薄膜とした場合の電場強度分布を、「ＺｎＯ＋Ａｌ」と表記されたグラフが金属薄膜５８をＡｌ薄膜とした場合の電場強度分布を各々示している。

【0088】

図１４（ａ）に示すように、金属薄膜５８がＡｌの場合の電場強度のピーク値は基準薄膜（金属薄膜５８なし）の電場強度のピーク値よりも小さいが、金属薄膜５８がＡｇ薄膜の場合の電場強度のピーク値は基準薄膜の電場強度のピーク値の約１．６倍となっている。したがって、蛍光体薄膜５６を構成する薄膜の材料をＺｎＯとした場合についても電場強度の増強が確認された。

【0089】

図１４（ａ）においてかっこ内に示す数値は、ＦＷＨＭで表した金属薄膜（または蛍光体薄膜）表面におけるスポットサイズを示している。すなわち、基準薄膜のスポットサイズは６３ｎｍ、Ａｌ薄膜の場合には８３ｎｍ、Ａｇ薄膜の場合には６４ｎｍとなっている。したがって、蛍光体薄膜５６の材料をＺｎＯとした場合でも十分小さなスポットサイズが得られ、回折限界以下の分解能を達成可能であることがわかる。

【0090】

なお、本シミュレーションにおいては、金属薄膜５８の膜厚は１０ｎｍ一定としており最適化を行っていないので、電場強度のピーク値、あるいはスポットサイズはさらに改善の余地があると考えられる。また、Ａｌ薄膜で電場強度のピーク値が小さいのは、主として、Ａｌ薄膜の膜厚が最適値となっていないことに起因していると考えられる。図７に示す金薄膜の膜厚に関する最適化のような最適化を行うことにより、ピーク値はさらに向上すると考えられる。また、発光波長λ_０をＡｌの表面プラズモン励起波長に近い波長とすることにより、電場強度のピーク値がさらに大きくなるものと予測される。

【0091】

以上、詳述したように、本実施の形態によれば、電子ビームによる試料への損傷を抑制するとともに、観察像のＳ／Ｎ比が向上し、さらに空間分解能の低下が抑制された光源生成薄膜、微小光源励起装置、光学顕微鏡、および光源生成薄膜の製造方法を提供することが可能となる。

【0092】

以上、本発明の実施の形態の一例について説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された技術的思想の範疇において各種の変更が可能である。

【0093】

たとえば、上記実施の形態では、電子線ビームによるカソードルミネセンスで蛍光体薄膜内に微小光源を生成する形態を例示して説明したが、これに限られず、たとえば、電磁波によって蛍光体薄膜内に微小光源を生成する形態としてもよい。

【0094】

また、上記実施の形態では、ウィンドウ薄膜を用いて電子顕微鏡結像系１０の真空側と光学顕微鏡部２０の大気側とを隔離する形態を例示して説明したが、これに限られない。
たとえば、蛍光体薄膜あるいは金属薄膜を大気圧以上の圧力に耐え得るように選択し、蛍光体薄膜および金属薄膜を真空容器の隔壁上に直接形成する形態としてもよい。

【0095】

また、上記実施の形態では、金属薄膜の材料として、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、およびＡｌを用いた形態を例示して説明したが、これに限られず、他の金属、たとえばＰｔ（白金）等を用いた形態としてもよい。

【0096】

また、上記実施の形態では、光源生成薄膜にウィンドウ部を１つ設ける場合を例示して説明したが、これに限られず、複数のウィンドウ部を設けてもよい。図１７に、複数のウィンドウ部６０ａを有する光源生成薄膜５０ａの一例を示す（図１７に示す例では、ウィンドウ部６０ａが３×３のマトリクス状に配置された例を示している）。光源生成薄膜５０ａの各部サイズは、一例として以下のようになっている。すなわち、略正方形のウィンドウ部６０ａの一辺の長さｄ１が約０．１ｍｍ、略正方形の光源生成薄膜５０ａの一辺の長さｄ２が約５．０ｍｍ、ウィンドウ部６０ａ間の間隔ｄ３が約０．８５ｍｍ、基板５２ａの厚さｄ４が約２００μｍ、ウィンドウ薄膜５４ａの厚さｄ５が約５０ｎｍとなっている。

【0097】

また、上記実施の形態では、表面を特に加工しない金属薄膜上に試料を載置する形態を例示して説明したが、これに限られず、生体観察に適するように細胞の培養が可能なように加工してもよい。たとえば、金属薄膜上にポリスチロール樹脂（細胞培養フラスコなどに使用されるプラスチック）やコラーゲン、ポリリジン、フィブロネクチンなどを、スピンコーティングなどにより数１０ｎｍ程度の厚さにコートすればよい。これらは、いずれも難接着性や難培養性の細胞を培養する場合に、培養フラスコにコーティングされる材料である。

【符号の説明】

【0098】

１ 光学顕微鏡
１０ 電子顕微鏡結像系
１１ 電子源
１２ 電子レンズ
１４ 真空容器
１４ａ 隔壁
１４ｂ 貫通孔
２０ 光学顕微鏡部
２１ 対物レンズ
２２ 光検出器
２３ 信号記録部
３０ 試料
５０ 光源生成薄膜
５２ 基板
５４ ウィンドウ薄膜
５６ 蛍光体薄膜
５８ 金属薄膜
６０ ウィンドウ部
１１３ 蛍光薄膜
１１４ａ 隔壁
１１４ｂ 貫通孔
１３０ 試料
ＥＢ 電子ビーム

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】