特許 6659557 １５−ヒドロキシ脂肪酸誘導体の作製方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6659557

(24)【登録日】2020年2月10日

(45)【発行日】2020年3月4日

(54)【発明の名称】１５−ヒドロキシ脂肪酸誘導体の作製方法

(51)【国際特許分類】

   C07C 51/367 20060101AFI20200220BHJP

   C07C 59/42 20060101ALI20200220BHJP

   C12P 7/64 20060101ALI20200220BHJP

【ＦＩ】

   C07C51/367

   C07C59/42

   C12P7/64

【請求項の数】12

【全頁数】45

(21)【出願番号】特願2016-551088(P2016-551088)

(86)(22)【出願日】2014年10月29日

(65)【公表番号】特表2016-537411(P2016-537411A)

(43)【公表日】2016年12月1日

(86)【国際出願番号】IB2014003086

(87)【国際公開番号】WO2015063617

(87)【国際公開日】20150507

【審査請求日】2017年10月27日

(31)【優先権主張番号】61/896,901

(32)【優先日】2013年10月29日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】514134169

【氏名又は名称】ディーエス バイオファーマ リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100097456

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 徹

(72)【発明者】

【氏名】メハル マンク

(72)【発明者】

【氏名】デビッド コウグフラン

(72)【発明者】

【氏名】ビル ドウネス

【審査官】 三上 晶子

(56)【参考文献】

【文献】 特表平１０−５０７１７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１０−１１０２４６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００６−５１４７０７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００７／０２４８５８６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特表２０１０−５１２７５７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Haviv, Fortuna et al.，Structural requirements for the inhibition of 5-lipoxygenase by 15-hydroxyeicosa-5,8,11,13-tetraenoic acid analogues，Journal of Medicinal Chemistry，１９８７年，vol.30 no.2，pp.254-263

【文献】 Nanda, S. et al.，Asymmetric synthesis of unnatural (Z,Z,E)-octadecatrienoid and eicosatrienoid by lipoxygenase-catalyzed oxygenation，Tetrahedron Asymmetry，２００３年，vol.14 no.13，pp.1799 - 1806

【文献】 Martini, Dominique et al.，Regiocontrol of soybean lipoxygenase oxygenation. Application to the chemoenzymatic synthesis of methyl 15(S)-HETE and methyl 5(S),15(S)-diHETE，Journal of Organic Chemistry，１９９６年，vol.61 no.25，pp.9062-9064

【文献】 Hamberg, Mats et al.，On the specificity of the oxygenation of unsaturated fatty acids catalyzed by soybean lipoxidase，Journal of Biological Chemistry，１９６７年，vol.242 no.22，pp.5329-5335

【文献】 Elshof, M. B. W. et al.，Biocatalytic hydroxylation of linoleic acid in a double-fed batch system with lipoxygenase and cysteine，EUROPEAN JOURNAL OF LIPID SCIENCE AND TECHNOLOGY，ドイツ，WILEY VCH VERLAG，１９９８年，vol.100 no.6，pp.246-251，ＵＲＬ，http://dx.doi.org/10.1002/(SICI)1521-4133(199806)100:6<246::AID-LIPI246>3.0.CO;2-Y

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｃ １／００−４０９／４４

Ｃ０７Ｂ ３１／００− ６１／００

Ｃ１２Ｐ １／００− ４１／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

エイコサペンタエン酸（EPA）又はジホモ−γ−リノレン酸（DGLA）の15-ヒドロキシ誘導体の生産のための方法であって、
少なくとも1.1バール〜4バールの酸素雰囲気下でEPA又はDGLAを酸化して、15-ヒドロペルオキシEPA又はDGLA中間体を形成する工程であって、該酸化が、該EPA又はDGLAを大豆粉抽出物と接触させることを含む該工程、及び
還元剤を使用して、該EPA又はDGLAの15-ヒドロキシ誘導体を形成する工程を含む、前記方法。

【請求項2】

前記酸化の工程が、前記EPA又はDGLAを、該EPA又はDGLAの1グラム当り400Mユニット未満と接触させることを含む、請求項１記載の方法。

【請求項3】

少なくとも50％の前記EPA又はDGLAの15-ヒドロキシ誘導体の収率が得られる、請求項１又は２記載の方法。

【請求項4】

前記DGLAの15-ヒドロキシ誘導体が、15(S)-ヒドロキシエイコサトリエン酸（15(S)-HETrE）である、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。

【請求項5】

前記EPAの15-ヒドロキシ誘導体が、15(S)-ヒドロキシエイコサペンタエン酸（15(S)-HEPE）である、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。

【請求項6】

前記還元剤が、システイン又は水素化ホウ素ナトリウムを含む、請求項１記載の方法。

【請求項7】

前記EPA又はDGLAの15-ヒドロキシ誘導体が、95％ wt/wt以上の純度を有する、請求項１記載の方法。

【請求項8】

バッチサイズが、100kg以上である、請求項１記載の方法。

【請求項9】

バッチサイズが、250kg以上である、請求項１記載の方法。

【請求項10】

バッチサイズが、500kg以上である、請求項１記載の方法。

【請求項11】

大豆粉をpH4.5の緩衝液と接触させて、粗製の大豆粉抽出物を生成すること；及び
該粗製の大豆粉抽出物を濾過して、前記大豆粉抽出物を生成することを更に含む、請求項１記載の方法。

【請求項12】

前記大豆粉抽出物が、2mg/mLの精製された凍結乾燥リポキシゲナーゼ酵素に相当する活性を有する、請求項１１記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

優先権の主張
本出願は、２０１３年１０月２９日出願の米国仮特許出願第６１／８９６，９０１号の優先権を主張し、その内容全体は、本明細書内に組み込まれ、依拠される。

【発明の概要】

【0002】

本開示は、対応する脂肪酸（例えば、それぞれジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）またはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ））から開始した、１５−（Ｓ）−ヒドロキシエイコサトリエン酸（ＨＥＴｒＥまたは１５−（Ｓ）−ＨＥＴｒＥ）、または１５（Ｓ）−ヒドロキシエイコサペンタエン酸（ＨＥＰＥまたは１５（Ｓ）−ＨＥＰＥ）などの１５−ヒドロキシ脂肪酸誘導体の生産のための２工程プロセスを提供する。第一の工程は、脂肪酸の１５（Ｓ）−ヒドロペルオキシド脂肪酸中間体への酵素的酸化（例えば、液状酵素配合物を使用して）を伴い、続いて１５（Ｓ）−ヒドロキシ脂肪酸誘導体への還元を行う。いくつかの実施形態において、酵素的酸化工程は、脂肪酸を、任意に大豆粉から得たリポキシゲナーゼ酵素と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、１５（Ｓ）−ヒドロペルオキシ脂肪酸中間体を還元する工程は、システインでのｉｎ−ｓｉｔｕ還元を含む。いくつかの実施形態において、本プロセスの少なくとも一部分は、空気を排除（例えば、部分的に排除）して実施される。いくつかの実施形態において、本プロセスは、１５（Ｓ）−ヒドロキシ脂肪酸誘導体を単離及び／または精製して、未加工の医薬品有効成分（ＡＰＩ）品質の製品を形成することをさらに含む。いくつかの実施形態において、単離及び／または精製工程は、クロマトグラフィ精製及び／または結晶化を含む。いくつかの実施形態において、本プロセスは、任意にｃＧＭＰに従って、数キログラムの量のＡＰＩを生産するために拡大される。

【0003】

いくつかの実施形態において、脂肪酸はＤＧＬＡであり、１５（Ｓ）−ヒドロペルオキシ脂肪酸中間体は１５（Ｓ）−ＨＰＥＴｒＥであり、１５（Ｓ）−ヒドロキシ脂肪酸誘導体は１５（Ｓ）−ＨＥＴｒＥである。
他の実施形態において、脂肪酸はＥＰＡであり、１５（Ｓ）−ヒドロペルオキシ脂肪酸中間体は１５（Ｓ）−ＨＰＥＰＥであり、１５（Ｓ）−ヒドロキシ脂肪酸誘導体は１５（Ｓ）−ＨＥＰＥである。

【図面の簡単な説明】

【0004】

【図1】本開示の一実施形態に従う、リポキシゲナーゼ酵素濃度の関数としての、経時的なメチレンブルー溶液の吸収度（６８０ｎｍ）の減少を示す。

【図2】本開示の一実施形態に従う、酵素充填量の削減及びより安価な酵素源を理由とする酵素費用負担減少を示す。

【図3】市販の凍結乾燥酵素及び大豆粉抽出物の材料費比較を示す。

【図4】本開示の一実施形態に従う、市販の酵素（２．０６ｍｇ／ｍＬ、０．２Ｍユニット／ｍＬ）と比較して、大豆粉抽出物（０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５）を使用したメチレンブルー溶液の漂白にかかる時間を例証する。

【図5】１８９１−０２９の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルのオーバーレイ（黄：Ｏ_２下で１時間後、紫：Ｏ_２下で２時間後、緑：Ｏ_２下で３時間後、さらに０．５当量のシステインを添加）、赤：週末にかけて大気条件下で撹拌し、さらに０．５当量のシステインを添加、青：単離された未加工のＨＥＴｒＥ）である。

【図6】１８２２−１５５−４Ｄ１のＨＰＬＣトレース及びピーク表である。

【図7】１８９１−０５１−７ＡのＨＰＬＣトレース及びピーク表である。

【図8】バッチ１８２２−１５５−４Ｄ１（赤、元来の方法）及びバッチ１８９１−０５１−７Ａ（青、本開示に従う方法）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルのオーバーレイである。

【図9】本開示の一実施形態に従うＨＥＴｒＥ反応の発熱率データを示す。

【図10】本開示の一実施形態に従うＨＥＴｒＥ反応の圧力対温度のプロットである。

【図11】本開示の一実施形態に従うＨＰＥＴｒＥ反応の発熱率データを示す。

【図12】本開示の一実施形態に従うＨＰＥＴｒＥ反応の圧力対温度のプロットである。

【図13】本開示の一実施形態において生産される過酸化材料１８２２−０６３−３のＬＣ−ＭＳ分析を示す。

【図14】Ｏ_２／空気の存在下で長期間実行された、本開示の一実施形態に従う反応（１８９１−００３−３、緑、１８９１−０２９−４、紫、及び拡大バッチ１８９１−０５、黄）における過酸化試料（１８２２−１６３−３、青、１８２２１９３−３、赤）を比較する、^１Ｈ ＮＭＲスペクトルのオーバーレイである。

【図15】４０％のＭｔＢＥ：シクロヘキサン混合物（外部温度７５℃）内で４．５日間還流させたＨＥＴｒＥのＵＰＬＣ純度データを示す。

【図16】^１Ｈ ＮＭＲによるＤＧＬＡとＨＥＴｒＥとの間のプロトン信号のオーバーラップを示す代表的なスペクトルである。

【図17】本開示の一実施形態に従う１５−（Ｓ）−ＨＥＴｒＥの精製物からの前部画分（１８９１−０５１−６Ｄ）の注釈付きＵＶクロマトグラムである。

【図18】本開示の一実施形態に従って生産される、精製された１５−（Ｓ）−ＨＥＴｒＥ（１８９１−０５１−７Ａ）の注釈付きＵＶクロマトグラムである。

【図19】本開示の一実施形態に従う１５（Ｓ）−ＨＥＴｒＥの精製物からの後部画分（１８９１−０５１−６Ｅ）の注釈付きＵＶクロマトグラムである。

【図20】ＤＧＬＡ及び主な不純物の化学構造及び他の特性データを示す。

【図21】精製されたＨＥＴｒＥ７２内の二量体不純物のフラグメンテーション分析からの質量スペクトルデータを示す。

【図22】ＭＳによって観察されるエステルフラグメントの生産の１つの可能な経路を提案する。

【発明を実施するための形態】

【0005】

本開示は、ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）から１５−（Ｓ）−ヒドロキシエイコサトリエン（１５−（Ｓ）−ＨＥＴｒＥ）を作製する方法を提供する。一工程において、ＤＧＬＡは、ω６の位置で生体内酸化され、続いて、結果として生じるヒドロペルオキシドが還元剤（例えば、水素化ホウ素ナトリウム及び／またはシステイン）を使用して還元される。代表的なプロセスは、スキーム１に示される。いくつかの実施形態において、１５（Ｓ）−ＨＥＴｒＥは、単一の工程で形成される（例えば、１５（Ｓ）−ＨＰＥＴｒＥ中間体を単離または精製することなく）。

【化1】

スキーム１

【0006】

１キログラム以上の量のＧＭＰ １５−（Ｓ）−ＨＥＴｒＥ及び１５（Ｓ）−ＨＥＰＥの供給には、費用効率の高い酵素プロセスが必要とされる（例えば、臨床研究プログラムでの使用のため）。一実施形態において、１００、２５０、及び５００ｋｇバッチのＧＭＰ １５（Ｓ）−ＨＥＴｒＥの生産が実施された。本研究プログラムの成果は、大豆リポキシゲナーゼＰ１酵素による生体内酸化を介してＤＧＬＡから１５（Ｓ）−ＨＥＴｒＥを調製して１５（Ｓ）−ＨＰＥＴｒＥを得た後、１．１当量の水素化ホウ素ナトリウムで還元することであった。酸性化及び抽出後処理の後、単離された未加工の１５−（Ｓ）−ＨＥＴｒＥは、シリカゲル上のカラムクロマトグラフィによって精製され、ＨＰＬＣ面積パーセント（２３５ｎｍ）で９５％を超える純度で、５０％の収率を得た。

【0007】

生体内酸化反応は、より安価な酵素源として大豆粉を使用して実施され得るが、後処理プロセスが簡便ではないことが示された。

【0008】

別の実施形態において、５００ｇ以上の非ＧＭＰ １５（Ｓ）−ＨＥＴｒＥ（例えば、毒物学研究のため）のデモバッチが調製された。この実施形態において、５００ｇ以上の１５（Ｓ）−ＨＥＴｒＥ（ＨＰＬＣ面積％、２３５ｎｍで９５％を超える純度）が、ＤＧＬＡから調製された。単離された不純物のＬＣ−ＭＳ及びＭＳ−ＭＳ分析は、最終生成物内に存在する約５％の不純物の中にはジ及びトリ酸素化された化合物があることを示唆した。

【0009】

いくつかの実施形態において、本方法は、ＤＧＬＡを酸化剤で酸化して、１５（Ｓ）−ＨＰＥＴｒＥを形成することを含む。いくつかの実施形態において、酸化剤は、リポキシゲナーゼなどの酵素酸化剤である。いくつかの実施形態において、酸化剤は、大豆リポキシゲナーゼ酵素（例えば、リポキシゲナーゼＰ１酵素）である。いくつかの実施形態において、大豆リポキシゲナーゼ酵素は精製される。他の実施形態において、大豆リポキシゲナーゼ酵素は、混合物、例えば、大豆粉の成分として使用される。

【0010】

酸化工程は、水性媒体内で、かつ酵素活性を有効にするのに好適なｐＨで起こり得る。例えば、酸化剤が大豆リポキシゲナーゼ酵素であるとき、酸化工程は、緩衝水溶液内で、塩基性ｐＨ（例えば、約９、または約９．６のｐＨ）で起こり得る。酸化剤及び／または酵素は、ＤＧＬＡの量と比較して化学量論超過で存在し得る。例えば、酸化剤及び／または酵素は、約１当量、約１．１当量、約１．２当量、約１．３当量、約１．４当量、約１．５当量、約１．６当量、約１．７当量、約１．８当量、約１．９当量、約２当量、約２．１当量、約２．２当量、約２．３当量、約２．４当量、約２．５当量、約２．６当量、約２．７当量、約２．８当量、約２．９当量、約３当量、約３．１当量、約３．２当量、約３．３当量、約３．４当量、約３．５当量、約３．６当量、約３．７当量、約３．８当量、約３．９当量、約４当量、または約４を超える当量で存在し得る。

【0011】

いくつかの実施形態において、酸化工程は、例えば、酸化工程がＤＧＬＡを酵素と接触させることを含むとき、酸素源の追加を必要とする。そのような実施形態において、酸化工程は、大気酸素または精製された（例えば、少なくとも部分的に精製された）気体酸素などの酸素源の存在下で起こり得る。いくつかの実施形態において、酸化工程は、加圧酸素雰囲気下、例えば約１．１バール、約１．２バール、約１．３バール、約１．４バール、約１．５バール、約１．６バール、約１．７バール、約１．８バール、約１．９バール、約２バール、約２．１バール、約２．２バール、約２．３バール、約２．４バール、約２．５バール、約２．６バール、約２．７バール、約２．８バール、約２．９バール、約３バール、約３．１バール、約３．２バール、約３．３バール、約３．４バール、約３．５バール、約３．６バール、約３．７バール、約３．８バール、約３．９バール、約４バール、または約４バール超で起こる。

【0012】

酸化工程の温度は、過剰な熱生成を防ぐために制御され得る。
いくつかの実施形態において、例えば、酸化工程は、約０〜５℃で起こり得る。

【0013】

いくつかの実施形態において、酸化工程は、ＤＧＬＡを、ｐＨ約９．６の水性緩衝液（例えば、０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液）の存在下で、酸素雰囲気下で、約２．５バールで、０〜５℃で、約２当量の大豆リポキシゲナーゼＰ１酵素と接触させることを含む。

【0014】

別の実施形態において、酸化工程は、ＤＧＬＡを、ｐＨ約９．６の水性緩衝液（例えば、０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液）の存在下で、加圧酸素雰囲気内で、０〜５℃で、未加工の大豆粉抽出物である約２当量の大豆リポキシゲナーゼ酵素と接触させることを含む。

【0015】

いくつかの実施形態において、１５（Ｓ）−ＨＰＥＴｒＥ中間体を還元して１５（Ｓ）−ＨＥＴｒＥを形成する工程は、１５（Ｓ）−ＨＰＥＴｒＥ中間体を還元剤と接触させて１５（Ｓ）−ＨＥＴｒＥを形成することを含む。いくつかの実施形態において、還元剤は水素化ホウ素ナトリウムである。他の実施形態において、還元剤はシステインである。より穏やかな還元剤であるシステインは、ホウ化水素系還元剤と比べて追加の利点を提供する。例えば、システインは、副生成物として水素ガスを形成しないため、より安全なスケールアップの機会を可能にする。加えて、システインは、安定した試薬であり、ホウ化水素系試薬に必要とされる特別な取扱いまたは保存技術を必要としない。加えて、システインの酸化型（シスチン）は、水に部分的にだけ溶解する安定したジペプチドであり、いくつかの他の還元剤と比べて簡便な精製の機会を提供する。

【0016】

いくつかの実施形態において、ＤＧＬＡを酸化する工程及び１５（Ｓ）−ＨＰＥＴｒＥ中間体を還元して１５（Ｓ）−ＨＥＴｒＥを形成する工程は、１５（Ｓ）−ＨＰＥＴｒＥ中間体を単離または精製する工程なしで、単一反応槽内で起こる。そのような実施形態において、本方法は、上記のように、還元剤の存在下でＤＧＬＡを酸化剤及び／または酵素と接触させることを含む。還元剤は、化学量論超過量、例えば、ＤＧＬＡの量と比較して約２当量で存在し得る。いくつかの実施形態において、還元剤はシステインである。

【0017】

いくつかの実施形態において、本方法は、上記のように、還元剤の存在下でＤＧＬＡを酸化剤及び／または酵素と接触させることを含む。還元剤は、化学量論超過量、例えば、ＤＧＬＡの量と比較して約２当量で最初は存在し得る。本方法は、一定期間後に、追加量、例えばさらに約１当量、の還元剤を、反応槽に添加することをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、還元剤はシステインである。

【0018】

いくつかの実施形態において、本方法は、ＥＰＡを酸化剤で酸化して１５（Ｓ）−ＨＰＥＰＥを形成することを含む。いくつかの実施形態において、酸化剤は、リポキシゲナーゼなどの酵素酸化剤である。いくつかの実施形態において、酸化剤は、大豆リポキシゲナーゼ酵素（例えば、リポキシゲナーゼＰ１酵素）である。いくつかの実施形態において、大豆リポキシゲナーゼ酵素は精製される。他の実施形態において、大豆リポキシゲナーゼ酵素は、混合物、例えば、大豆粉の成分として使用される。

【0019】

いくつかの実施形態において、ＥＰＡを酸化する工程及び１５（Ｓ）−ＨＰＥＰＥ中間体を還元して１５（Ｓ）−ＨＥＰＥを形成する工程は、１５（Ｓ）−ＨＰＥＰＥ中間体を単離または精製する工程なしで、単一反応槽内で起こる。そのような実施形態において、本方法は、上記のように、還元剤の存在下でＥＰＡを酸化剤及び／または酵素と接触させることを含む。還元剤は、化学量論超過量、例えば、ＥＰＡの量と比較して約２当量で存在し得る。いくつかの実施形態において、還元剤はシステインである。

【0020】

いくつかの実施形態において、１５（Ｓ）−ＨＰＥＰＥ中間体を還元して１５（Ｓ）−ＨＥＰＥを形成する工程は、１５（Ｓ）−ＨＰＥＰＥ中間体を還元剤と接触させて１５（Ｓ）−ＨＥＰＥを形成することを含む。いくつかの実施形態において、還元剤は水素化ホウ素ナトリウムである。他の実施形態において、還元剤はシステインである。より穏やかな還元剤であるシステインは、ホウ化水素系還元剤と比べて追加の利点を提供する。例えば、システインは、副生成物として水素ガスを形成しないため、より安全なスケールアップの機会を可能にする。加えて、システインは、安定した試薬であり、ホウ化水素系試薬に必要とされる特別な取扱いまたは保存技術を必要としない。加えて、システインの酸化型（シスチン）は、水に部分的にだけ溶解する安定したジペプチドであり、いくつかの他の還元剤と比べて簡便な精製の機会を提供する。

【0021】

いくつかの実施形態において、本方法は、上記のように、還元剤の存在下でＥＰＡを酸化剤及び／または酵素と接触させることを含む。還元剤は、化学量論超過量、例えば、ＥＰＡの量と比較して約２当量で最初は存在し得る。本方法は、一定期間後に、追加量、例えばさらに約１当量、の還元剤を、反応槽に添加することをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、還元剤はシステインである。

【0022】

いくつかの実施形態において、１５（Ｓ）−ＨＥＰＥは、乾燥アセトン内で１５（Ｓ）−ＨＥＰＥを臭化アルキル（例えば、臭化エチル）及び炭酸カリウムで処理することによって、エステル（例えば、エチルエステル）に変換される。そのような実施形態において形成される未加工のエステルは、木炭及びシリカゲルでの処理によって簡便に精製されて高純度の１５（Ｓ）−ＨＥＰＥを形成し得る。

【0023】

いくつかの実施形態において、本方法は、１５−ヒドロキシ脂肪酸誘導体及び１つ以上の不純物を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、１つ以上の不純物は、過酸化生成物、過還元生成物、二量体、及び／または１５（Ｓ）−ヒドロキシ脂肪酸誘導体の位置異性体からなる、それらから本質的になる、またはそれらを含む。いくつかの実施形態において、過酸化生成物は、ジヒドロキシル化した化合物、１つ以上の余分なＣ＝Ｃ二重結合を有する化合物、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、過還元生成物は、所望の１５（Ｓ）−ヒドロキシ脂肪酸誘導体よりも１つ以上少ないＣ＝Ｃ二重結合を有する化合物である。いくつかの実施形態において、二量体は、第１の分子のカルボン酸部分と第２の分子のヒドロキシ部分との間に形成されるエステル二量体である。

【0024】

いくつかの実施形態において、本開示は、１５（Ｓ）−ヒドロキシ脂肪酸誘導体を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本組成物は、１つ以上の不純物をさらに含む。いくつかのそのような実施形態において、１５（Ｓ）−ヒドロキシ脂肪酸誘導体は、組成物内に存在する全脂肪酸の少なくとも約９０重量％、例えば、組成物内に存在する全脂肪酸の少なくとも約９０重量％、少なくとも約９１重量％、少なくとも約９２重量％、少なくとも約９３重量％、少なくとも約９４重量％、少なくとも約９５重量％、少なくとも約９６重量％、少なくとも約９７重量％、少なくとも約９８重量％、または少なくとも約９９重量％の量で存在する。いくつかの実施形態において、１５（Ｓ）−ヒドロキシ脂肪酸誘導体は、エチルエステルなどのエステルの形態にある。いくつかの実施形態において、本組成物は、不純物をさらに含み、該不純物は、存在する全脂肪酸のわずか約１０重量％、例えば、組成物内に存在する全脂肪酸のわずか約１０重量％、わずか約９重量％、わずか約８重量％、わずか約７重量％、わずか約６重量％、わずか約５重量％、わずか約４重量％、わずか約３重量％、わずか約２重量％、わずか約１重量％の量で存在する。

【0025】

いくつかの実施形態において、本開示は、１５（Ｓ）−ＨＥＴｒＥを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本組成物は、１つ以上の不純物をさらに含む。いくつかのそのような実施形態において、１５（Ｓ）−ＨＥＴｒＥは、組成物内に存在する全脂肪酸の少なくとも約９０重量％、例えば、組成物内に存在する全脂肪酸の少なくとも約９０重量％、少なくとも約９１重量％、少なくとも約９２重量％、少なくとも約９３重量％、少なくとも約９４重量％、少なくとも約９５重量％、少なくとも約９６重量％、少なくとも約９７重量％、少なくとも約９８重量％、または少なくとも約９９重量％の量で存在する。いくつかの実施形態において、１５（Ｓ）−ＨＥＴｒＥは、エチルエステルなどのエステルの形態にある。いくつかの実施形態において、本組成物は、不純物をさらに含み、該不純物は、存在する全脂肪酸のわずか約１０重量％、例えば、組成物内に存在する全脂肪酸のわずか約１０重量％、わずか約９重量％、わずか約８重量％、わずか約７重量％、わずか約６重量％、わずか約５重量％、わずか約４重量％、わずか約３重量％、わずか約２重量％、わずか約１重量％の量で存在する。

【0026】

いくつかの実施形態において、本開示は、１５（Ｓ）−ＨＥＰＥを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本組成物は、１つ以上の不純物をさらに含む。いくつかのそのような実施形態において、１５（Ｓ）−ＨＥＰＥは、組成物内に存在する全脂肪酸の少なくとも約９０重量％、例えば、組成物内に存在する全脂肪酸の少なくとも約９０重量％、少なくとも約９１重量％、少なくとも約９２重量％、少なくとも約９３重量％、少なくとも約９４重量％、少なくとも約９５重量％、少なくとも約９６重量％、少なくとも約９７重量％、少なくとも約９８重量％、または少なくとも約９９重量％の量で存在する。いくつかの実施形態において、１５（Ｓ）−ＨＥＰＥは、エチルエステルなどのエステルの形態にある。いくつかの実施形態において、本組成物は、不純物をさらに含み、該不純物は、存在する全脂肪酸のわずか約１０重量％、例えば、組成物内に存在する全脂肪酸のわずか約１０重量％、わずか約９重量％、わずか約８重量％、わずか約７重量％、わずか約６重量％、わずか約５重量％、わずか約４重量％、わずか約３重量％、わずか約２重量％、わずか約１重量％の量で存在する。

【実施例】

【0027】

実施例１：未加工の植物ホモジネートのリポキシゲナーゼ活性を評価するための比色分析アッセイ
リノールヒドロペルオキシド、３−メチル−２−ベンゾチアゾリン（ＭＢＴＨ）、及び３−（ジメチルアミノ）安息香酸（ＤＭＡＢ）は、ヘモグロビンの存在下で反応して、５９０ｎｍで吸収する紫インダミン色素を生み出すことで知られる。この波長での吸収度は、リノールヒドロペルオキシドの濃度と最大３５ｕＭまで線形である。

【0028】

大豆粉１ｇを、最大２４時間の期間にわたって、４℃または周囲温度のいずれかで、１０ｍＬの適切なｐＨ調整された緩衝液または水（１：１０ｗ／ｖ）中に抽出した。磁気撹拌しながら（約５００ｒｐｍ）試験管内で反応を実行した。１時間及び２時間時点では、抽出溶液を、約１０分間沈降させた後、１０μＬの酵素溶液を取り出して、４ｍＬのキュベット内のアッセイ溶液Ａ（リノール酸及びＤＭＡＢを含有）（１ｍＬ）に添加した。室温で約５分間インキュベートした後、アッセイ溶液Ｂ（ＭＢＴＨ及びヘモグロビン）（１ｍＬ）を添加し、約５分間さらにインキュベートした後、吸収度読取り値（表１）を記録した。ホウ酸ナトリウム、ｐＨ１０．４の抽出物試料、及びブランク（酵素を除く全ての試薬）を除く全ての試料内で青色形成が観察された。この場合、淡灰色が観察され、吸収度は約０．２であった。ブランクは、リノール酸を除く全ての試薬及び酵素で実行され、０．２の吸収度を得た。酵素溶液が吸収度読取り値を干渉していると決定された。

【表1】

【0029】

残りの時点（５時間及び２４時間）を、異なる方法で分析した。抽出溶液を、約１０分間沈降させた後、１０μＬの酵素溶液を取り出して、２ｍＬのエッペンドルフチューブ内のアッセイ溶液Ａ（リノール酸及びＤＭＡＢを含有）（０．５ｍＬ）に添加した。室温で約５分間インキュベートした後、アッセイ溶液Ｂ（ＭＢＴＨ及びヘモグロビン）（０．５ｍＬ）を添加し、約５分間さらにインキュベートした。ラウリル硫酸ナトリウム溶液（１％ｗ／ｖ）（０．５ｍＬ）を添加して反応を停止させ、この溶液を、９．８ｒｃｆ、４℃で、５分間遠心分離機にかけた。次いでこの溶液を４ｍＬのキュベット内にデカントし、前と同じように分析した。結果は、いかなる特定の傾向も示さなかった。

【0030】

実施例２：代替の比色分析アッセイ条件
アッセイ感度を試験するため、希釈系列は、元来の充填値（供給業者による分析証明書に基づいて０．４２Ｍユニット（４．１１ｍｇ）／ｍＬ）で凍結乾燥酵素を使用し、それ以上比色検出が観察されなくなるまで半分希釈して、設定した。また、これをメチレンブルー漂白法（Ｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．４３，３，１９９５，ｐ．７４２，ＥＰ ｎｏ．２１１８１２６ Ａ１）を用いて分析し、それによって、１００μＭのメチレンブルー溶液の吸収度の減少を、リノール酸の存在下で酵素溶液とともにインキュベートしたときに徐々に、６８０ｎｍで分析した。メチレンブルー漂白アッセイを、２．１ｍＬの０．２Ｍ トリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ９．０、０．３ｍＬの１００μＭメチレンブルー溶液、０．３ｍＬの１０ｍＭリネオレートナトリウム基質、及び０．３ｍＬの大豆粉抽出物（全体積３ｍＬ）を使用して実施した。

【表2】

【0031】

ＤＭＡＢ−ＭＢＴＨアッセイでは、１０μＬの酵素溶液を取り出し、２ｍＬのエッペンドルフ内のアッセイ溶液Ａ（リノール酸及びＤＭＡＢを含有）（０．５ｍＬ）に添加した。室温で約５分間インキュベートした後、アッセイ溶液Ｂ（ＭＢＴＨ及びヘモグロビン）（０．５ｍＬ）を添加し、約５分間さらにインキュベートした。ラウリル硫酸ナトリウム溶液（１％ｗ／ｖ）（０．５ｍＬ）を添加して反応を停止させ、この溶液を、１６．１ｒｃｆ、４℃で、１０分間遠心分離機にかけた。次いでこの溶液を４ｍＬのキュベット内にデカントし、前と同じように分析した。これを２重で実行した。

【表3】

【0032】

表３の結果より、この方法を使用して得られた吸収度読取り値が、溶液内の酵素の濃度と線形の様態では一致しないことが明らかとなった。ｐＨ６の未加工の植物リポキシゲナーゼのアッセイには、元来の方法を使用した。ヘモグロビンは、８．５の最適ｐＨ、及び０．５ｍＭのリノール酸濃度で疑似リポキシゲナーゼ活性を示すことが報告されている。本アッセイはｐＨ９で実施されたため、これは得られた結果といくらかの関係があった可能性がある。しかしながら、酵素を除く全試薬を含有するブランクにおいては、色形成が観察されなかったことに注目した。しかしながら、得られた結果に基づいて、メチレンブルー漂白法を続行することを決定した。本方法は、単純かつ迅速であるが、特別に感度が高いわけではなく、定量化が困難である。活性レベルは、色が消える（すなわち、６８０ｎｍでの吸収度が０に達する）のにかかった時間によって決定される。より高い酵素充填量間の区別をするため、精製された酵素を有する希釈系列を、より低い濃度の酵素溶液を使用して繰り返した。３０μＬの酵素溶液のみをメチレンブルー漂白溶液に添加し、その体積を、２７０μＬの蒸留水で最大３ｍＬまで調整した。得られた結果を表４に記録する。

【表4-1】

【表4-2】

【0033】

希釈系列のグラフ表示を図１に示す。吸収度が減少し始める誘導時間（０．５〜２分）は、より低い酵素濃度を有する試料で観察される。

【0034】

大豆粉抽出物の活性を、市販の酵素の溶液と対比して、この方法を使用して、比色分析によってアッセイすることができると決定し、要求される酸化反応を実施するために十分な活性を示した。

【0035】

実施例３：還元剤としてのシステイン
凍結乾燥酵素の代替供給品が供給された。最初の試験は、酵素充填量を最大半分まで減少可能であることを示した。代替還元剤（システイン）と組み合わせることで、酵素充填量は、最初のＤＧＬＡ基質１グラム当り１３．７Ｍユニット（液状酵素調製）から１グラム当り１．８Ｍユニット（凍結乾燥酵素）に減少された。ＤＧＬＡ１グラム当り£１１．３７から、ＤＧＬＡ１グラム当り£０．７５（約１５倍の削減、図２）への、リポキシゲナーゼ酵素の費用削減を実現した。これは、減少された酵素充填量及びより安価な供給（凍結乾燥酵素では£０．４２／Ｍユニットに対して液状酵素調製では£０．８３／Ｍユニット）という２つの要因によるものであった。

【0036】

供給された凍結乾燥酵素が良好な安定性を有することも観察された。−２０℃で保存すること、及び使用後に乾燥させることが推奨されるものの、本バッチは、最適化された酵素充填量（１．８Ｍユニット／ｇ ＤＧＬＡ）を使用した反応に利用される前の２週間、周囲の大気条件で保存された。性能の低下は観察されなかった。ｐＨを維持し、反応構成成分を可溶化するために、反応は、緩衝溶液内で実行された。

【0037】

穏やかな還元剤、システインを、水素化ホウ素ナトリウムの代わりに使用した。システインの使用によって、酸化／還元反応を一工程内で実行することが可能になった。加えて、反応／反応停止中に可燃性水素は生成されなかった。さらには、恐らくはシステインの抗酸化剤特性に起因して、生産された過酸化生成物は少なくなった。また、プロセスの開始時に還元剤を添加することが、高濃度のヒドロペルオキシドによって不可逆の酵素不活性化を少なくするのに役立ち、ひいては酵素要件（例えば、費用節約）を引き下げ、かつ過酸化の可能性を低くする結果を導くと考えられる。

【0038】

実施例４：酵素充填量
先の生体内酸化反応を、ＤＧＬＡ基質１グラム当り約１３．７Ｍユニットの活性（１ユニットは、全体積１．０ｍＬにおいて、ｐＨ９．０の０．１Ｍホウ酸緩衝液中、２５℃で０．０２％リネオレートとともにインキュベートしたときに、２３４ｎｍで毎分０．００１ＡＵの増加を引き起こす酵素と定義される）の酵素充填量で液状酵素調製を使用して実施した。凍結乾燥粉であるリポキシゲナーゼの代替供給品も試験した。ＤＧＬＡ基質１グラム当り約１３．７Ｍユニットの活性を使用して、生体内酸化反応を、凍結乾燥酵素を用いて繰り返し、^１Ｈ ＮＭＲ分光法による同様の反応完了プロファイルを得た。この反応を、さらに３回、各回で酵素充填量を半分に減らして繰り返した。結果を表５にまとめる。

【表5】

【0039】

これらの試験の結果は、反応完了が依然として１時間以内に得られる上に、酵素充填量が、少なくとも半分減少され得ることを示す。より充填量の低い試料で得られた^１Ｈ ＮＭＲスペクトルは不確定であったが、ＤＧＬＡは、依然としてＮＭＲで見ることができ、その存在がＴＬＣによって確認された。

【0040】

実施例５：酵素源
先の反応は、リポキシゲナーゼの液状調製を使用して実施され、ＤＧＬＡ１グラム当り１３．７Ｍユニットの充填量で反応完了を得た。凍結乾燥純酵素の代替供給品が得られ、ＤＧＬＡ１グラム当りわずか６．８７Ｍユニットの酵素充填量を使用して、反応完了に達した。

【0041】

実施例６：反応媒体
緩衝液の代わりに純水を使用して実験を実施した。ＤＧＬＡを水に添加して、２つの非混合層を得た。２Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨを９．８に調整し、撹拌して乳濁液を得た。凍結乾燥酵素（ＤＧＬＡ１グラム当り６．８７Ｍユニット）を添加し、前と同じように反応を実施した。１時間後、反応混合物は依然として、不完全な変換を示す、濁った乳濁液であった。^１Ｈ ＮＭＲ分光法は、およそ４５％の未反応ＤＧＬＡ、及び過酸化不純物の一部を示した。これは、必要ｐＨ（約９）を維持し、かつ基質の可溶化を助けるためには、緩衝液が必要とされることを示唆する。１５−（Ｓ）−ＨＰＥＴｒＥもまた、ＤＧＬＡ基質の可溶化を助けると考えられる。

【0042】

実施例７：還元剤
中間体ヒドロペルオキシドを、前もって、１．１当量の水素化ホウ素ナトリウムを使用して、ワンポットシーケンスで、きれいに還元した。しかしながら、これは、特に後処理中に水素ガスの生成を導き、ｐＨ調整のために大量の１０％クエン酸溶液を必要とした。スケールアップにおいて、水素化ホウ素ナトリウムは、水素問題、充電モード、及び工場での予測される長い反応停止時間（約１７時間）が理由で、好まれない。

【0043】

水素化ホウ素ナトリウムの代わりにシステインが還元剤として使用される実験を実施した。様々な酵素充填量を使用していくつかの反応を実施した。様々な変形を表６に詳しく説明する。酸素圧下で（２．５バール）で、Ｐａｒｒ反応器内で反応を実行した。

【0044】

２当量のシステインが、最初に必要とされるように考えられる。３当量の添加は、恐らくは酵素活性化ヒドロペルオキシドの急速な除去に起因して、反応の失速、または少なくとも非常に遅い進行を引き起こした。しかしながら、２当量のシステインを最初に使用した場合、１時間の反応時間後に残留するヒドロペルオキシドを減少するために、さらなる当量のシステインを添加することが必要とされる。これは、恐らく、ヒドロペルオキシドではなく、酸素による反応混合物内のシステインの酸化が原因である。ＤＧＬＡ１グラム当り１．８Ｍユニット活性にまで酵素充填量を減少させることは、これらの条件下で達成可能で、数時間以内のＤＧＬＡの実質的に完全な消費、及び減少された不純物（例えば、過酸化生成物）形成が得られることも分かった。

【表6-1】

【表6-2】

【表6-3】

【0045】

実施例８：ダブルバッチフェッド発酵装置反応
基質（４０ｇ）及び酵素（１．８Ｍユニット／ｇ ＤＧＬＡ）をそれぞれ一定速度（１．６ｍＬ／分及び２ｍＬ／分）でｐＨ９．５の０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（８５０ｍＬ）に添加する、１Ｌの最終体積反応を３Ｌ発酵装置内で実行した。緩衝溶液に酸素を吹き込んで、５００ｒｐｍで撹拌した。酵素をｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸ナトリウム溶液（１５０ｍＬ）内に溶液として添加し、反応のｐＨを３Ｍ ＮａＯＨ（水溶液）の添加により約９．５に維持した。ＤＧＬＡの添加時、著しい発泡が発生し、一部の材料が槽から放出された（約１０％）。ポリプロピレングリコール２０００（２０ｍＬホウ酸緩衝液と１：１ｖ／ｖ）を抗発泡剤として添加したが、効果はあまりなかった。さらなる２０ｍＬが、発泡を著しく減少させることはなかった。酸素流を可能な限り最も低い設定まで減少させることが、次第に気泡を減少させた。１．５時間後、アリコートを^１Ｈ ＮＭＲにより分析したところ、残渣ＤＧＬＡ（６．２５重量％）を示した。この反応をさらに５時間継続した。次いで、懸濁液を、セライトを介して濾過してシスチンを除去し、固形クエン酸でｐＨ３まで酸性化した。結果として生じる懸濁液を、４℃で週末にかけて保存した。沈殿生成物及びさらなるシスチン残渣は、水溶液から沈降していた。これらを濾過によって収集し、白色クリームを得た。ＴＬＣは、水性濾液内に生成物がないことを示した。収集された「クリーム」を、ＭＴＢＥ内でスラリー化し、濾過すると粒状の白色固体が残った。濾液をロータリーエバポレータ上で濃縮すると、４４ｇの黄色油が残った。^１Ｈ ＮＭＲ分析は、ＨＰＥＴｒＥが無いこと、及び残渣ＤＧＬＡが１重量％未満であることを示した。しかしながら、本生成物は、ＰＰＧ２０００も含有していた。この油を、２０％ＭＴＢＥ：ヘキサン（１００ｍＬ）内でスラリー化し、シリカパッド（４００ｇ）に塗布した。このパッドを、ヘキサン（１．２Ｌ）、２０％ＭＴＢＥ：ヘキサン（２Ｌ）、及び４０％ＭＴＢＥ：ヘキサン（４Ｌ）で溶出した。本生成物含有画分をＴＬＣで識別した。初期生成物含有画分は、ＴＬＣにより、ＤＧＬＡのかすかな痕跡を含有しており、これらを組み合わせ、かつ別々に濃縮して、透き通った淡黄色油である生成物を１３ｇ得た。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）約０．５％ＤＧＬＡ、ＨＥＴｒＥ。残留生成物含有画分を組み合わせて、生成物を１４ｇ得た。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）−ＨＥＴｒＥ。ＨＰＬＣ面積％純度（２５２ｎｍ）−９６．９２％。カラムクロマトグラフィ後の生成物の総回収率は６２％であった。しかしながら、反応器内の発泡問題が原因で著しい損失が発生した。これは、十分な酸素が撹拌を介して混合物内に移送される場合には、反応を圧力下で実施する必要がないこと、及び延長された反応時間が副生成物の増加をもたらさなかったことを示している。理論に拘束されることを望むものではないが、これは、より少ない酵素充填量、より低い酸素可用性、及び反応混合物中の不安定なヒドロペルオキシド量の減少など多数の理由によるものであると考えられる。しかしながら、わずかな酸素圧下での反応は、反応発泡の問題を制御するのに役立つであろう。

【0046】

実施例９：酵素源としての大豆粉
１０ｇの大豆粉からの十分なリポキシゲナーゼ活性を抽出して、３ｇのＤＧＬＡをＨＥＴｒＥ（１：１０ｗ／ｖ ０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．５、３時間、１８０ｒｐｍ）にきれいに変換するための条件を開発した。

【0047】

凍結乾燥酵素及び大豆粉の現在の価格に基づいた費用比較は、材料費における７倍の節約を示すが（図３）、余分なユニット操作（抽出、濾過）が工場規模で要求されるため、低ボリュームでの節約の可能性は取るに足りないものである。

【0048】

酸素圧下で実施された、酵素源として大豆粉を使用した生体内酸化反応により、ＤＧＬＡのＨＰＥＴｒＥ（約９５％）への合理的な変換を得た。反応は、大豆粉を直接添加することによって実施され得るが、これが粘性のある反応混合物を生産した。反応混合物の酸性化は、タンパク質の沈降を引き起こし、そのとき、濾過するのが困難な生成された粘度の高い乳濁液が抽出される。層のきれいな分離は、遠心分離を用いて達成され得るが、これは、処理するボリュームに起因して、大規模では実現可能でないことが分かった。粉残渣を除去するのはかなり困難であったため、反応器の清掃にも問題があるだろう。

【0049】

代わりに活性酵素を室温で粉から緩衝溶液中に抽出した。遠心分離後、結果として生じる混濁液を使用して生体内酸化を実施した。これは、不溶性の炭水化物を反応混合物から除去するが、著しい量のタンパク質が原因で、後処理手続き中に乳濁液が形成される。

【0050】

大豆粉から半精製された酵素の単離を試みたが、これは不活性であることが分かった。
脱脂大豆粉からの酵素活性の抽出のための最適条件の系統的測定（緩衝液媒体、ｐＨ、時間、温度）。

【0051】

大豆粉から酵素を抽出することに関する調査を、ｐＨ及び抽出緩衝液（１：１０ｗ／ｖ大豆粉充填量）（表７）で検討し、比色分析アッセイ調査と並行して実施した。

【表7】

【0052】

これらの抽出物溶液のｐＨを分析したところ、ｐＨ４．５のホウ酸ナトリウム緩衝液は、大豆粉を添加すると６．１のｐＨを有することが分かった。ｐＨ１０の酢酸ナトリウム緩衝液は、大豆粉を添加すると６．８のｐＨを有し、純水抽出物のｐＨもまた６．８であった。これは、ホウ酸塩（８〜１０）及び酢酸（３．６〜５．６）緩衝液のｐＨ緩衝範囲と一致する。ｐＨ４．５の酢酸ナトリウム緩衝液を、大豆粉を添加してｐＨ５．２に変えた。

【0053】

タンパク質は、磁気攪拌機によって引き起こされるような摩擦によって損傷を受け得る。抽出の次のセットを、温度制御されたオービタルシェーカー内の５０ｍＬ遠心分離管内で実行した。多数の反応を、様々なｐＨ及び温度で設定し、１、２、及び１４時間の３つの時点、ならびに５、２５、及び４０℃の３種類の温度で分析した。アッセイ結果（差別の少ない条件でメチレンブルー漂白によって決定される（３００μＬ酵素溶液））を表８に示す。

【表8】

【表9】

【表10】

【0054】

これらの結果を精製された酵素の希釈系列の結果（表２）と比較することによって、≧０．１０５Ｍユニットの酵素活性／ｍＬが、調査されたｐＨ範囲にわたって大豆粉から抽出されることが決定された。これは、５００ｇの毒性バッチの合成で利用される酵素活性（０．４１Ｍユニット／ｍＬの反応混合物）のおよそ４分の１である。ｐＨ９．０では、２５及び４０℃での抽出が、酵素活性を減少させ、２時間の抽出時間後に顕著になるようである。より低いｐＨ値４．５及び６．５では、昇温での抽出は、これらの条件下で確定できる効果を有しない。

【0055】

１４時間抽出試料を、適切な条件下で週末にかけて撹拌し、前と同じように分析した（表１１）。

【表11】

【0056】

唯一の顕著な違いは、５℃でのｐＨ９．０のホウ酸塩抽出物の活性の減少であった。週末にかけて室温で放置された濾過抽出物（ｐＨ４．５）が、メチレンブルー漂白法で判定した際に、活性の著しい低下を示さなかったことも観察された。

【0057】

ｐＨ４．５及び６．５（１：５ｗ／ｖ大豆粉の充填量）で、及び３０℃の温度で、さらなる抽出を実施した（表１２）。抽出物溶液を、より感度の高い条件を使用して分析した（３０μＬの酵素溶液）（表４と比較）。

【0058】

ｐＨ４．５の抽出溶液の上清は、ｐＨ６．５及び９．０の両方で得られたものよりも濁りが少ないことが観察された。

【表12-1】

【表12-2】

【0059】

２５℃で週末にかけて放置されていた抽出物溶液（１：１０ｗ／ｖ）を、１日放置した後、濾過した。ｐＨ４．５の試料は、透き通った黄色の上清を有し、それをデカントし、セライトのパッドを介して濾過した。残渣粉も濾過し、固体ケークを得た。２０ｍＬの抽出物を、３３ｍＬの初期緩衝液体積から回復した。濁った上清を有したｐＨ６．５及び９．０の試料を、上記のように処理した。ｐＨ６．５の抽出物をデカントすると、上清は、粉残渣と混合した。この懸濁液を濾過して、１４ｍＬのわずかに混濁した黄色濾液を得た。ｐＨ９．０の抽出物は、２０ｍＬのオレンジ色をした混濁濾液を得た。

【0060】

３０℃のｐＨ４．５の抽出物（１：５ｗ／ｖ）もまた濾過して、わずか４ｍＬの濾液を１３．５ｍＬの初期緩衝液体積から得た。

【0061】

ｐＨ４．５及び６．５の抽出は、メチレンブルー溶液を漂白するのにかかる時間を基に、０．２１〜０．４２Ｍユニット／ｍＬの酵素活性を示した。しかしながら、ｐＨ４．５では、より透き通った抽出物を得ることができる。ｐＨ９．０では、抽出物活性は、徐々に減少し、得られる抽出物は再び濁るようである。１：５ｗ／ｖの粉充填量では、少量の抽出物のみを回復することができ、１：１０ｗ／ｖ抽出物と比べて活性の増加は著しくない。したがって、ｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液内の１：１０ｗ／ｖ充填量の大豆粉を、室温で抽出して有用な活性を得ることができる。

【0062】

実施例１０：酵素源としての大豆粉抽出物
１０ｇの７Ｂ大豆粉を、ｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液１００ｍＬを用いて、３時間、３２℃、１８０ｒｐｍで抽出した後、セライトを介して濾過して８５ｍＬの透き通った黄色濾液（ｐＨ５．２）を産出した。３０μＬ分をメチレンブルー漂白試験により分析すると、活性は、およそ２ｍｇ／ｍＬ（０．２Ｍユニット／ｍＬ）の精製された凍結乾燥酵素（図４）に匹敵した。

【0063】

約０．０５５Ｍユニット／ｍＬの反応溶液の市販の酵素充填量（１．８Ｍユニット／ｇ ＤＧＬＡ）は、反応完了に十分であった。

【0064】

２当量のシステインを、３５ｍＬの０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液とともにＰａｒｒ反応器に装入し、氷浴内で０〜５℃に冷却した。ｐＨを２Ｍ水酸化ナトリウム溶液で調整した後、ＤＧＬＡの添加、及びｐＨ９．６へのさらなる調整が続いた。大豆粉抽出物（５３ｍＬ）を添加して、１００ｍＬの体積及び９．３のｐＨを得た。酵素活性充填量は、０．１１Ｍユニット／ｍＬの反応溶液であった。反応を、Ｏ_２圧（３５ｐｓｉ、２．５バール）下で１時間実施した。^１Ｈ ＮＭＲ分光法は、わずかな残渣ＤＧＬＡ、ならびにＨＰＥＴｒＥ及びＨＥＴｒＥの混合物を示した（図５）。さらなる１当量のシステインの２回に分けた添加は、^１Ｈ ＮＭＲ分光法によって判定した際に、残留ＨＰＥＴｒＥの減少を可能にした。反応溶液を週末にかけて４℃で保存した。反応を前と同じように後処理した（図５）。

【0065】

実施例１１：１５（Ｓ）−ＨＥＴｒＥの単離及び精製
システイン還元剤の使用は、反応のための酵素活性充填量を７．６分の１減少（１３．７Ｍユニットから１．８Ｍユニット／ｇ ＤＧＬＡ）させることを可能にし、それにもかかわらず許容範囲の不純物プロファイルを得た。反応完了は、数時間以内に得られ得る。１０％クエン酸溶液で酸性化する代わりに、反応を固体クエン酸で酸性化し、ひいては総容量を約３０％減少させた。ＨＥＴｒＥ生成物は、シスチン残渣とともに反応混合物から沈殿し、それは濾過によって収集され得る。収集した沈殿物のＭｔＢＥでのスラリー化、及び濾過に続く、溶媒の除去が、＞１００重量％の未加工のＨＥＴｒＥの単離を可能にした。対照的に、先の後処理は、乳濁液形成を軽減するために、比較的高価な５０／５０ヘキサン／ＭｔＢＥ混合物（×３回）での抽出を伴った。乳濁液を分割するためにセライトを介した濾過と、及び生成物を回復するためにＭｔＢＥでの洗浄とを必要とする、ラグ層もまた収集した。未加工のＨＥＴｒＥ（４３０ｇ）を約７２Ｌの溶媒から回復した。しかしながら、この方法により、３２０ｇの未加工のＨＥＴｒＥを９ＬのＭｔＢＥからのみ回復した。

【0066】

１：１０ｗ／ｗ未加工ＨＥＴｒＥ：シリカゲル比率を使用したカラムクロマトグラフィ（約５５ｇ産出）による精製、及び（１）４Ｌの１０％ＭＴＢＥ：シクロヘキサン、（２）３Ｌの２０％ＭＴＢＥ：シクロヘキサン、及び（３）４Ｌの５０％ＭＴＢＥ：シクロヘキサン（総溶出体積：１１Ｌ）での溶出は、適切であると判明した。以前は、Ｂｉｏｔａｇｅ ＫＰ Ｓｉｌカラムは、１：１０ｗ／ｗ未加工ＨＥＴｒＥ：シリカゲル比率を使用して約４５ｇの１５（Ｓ）−ＨＥＴｒＥを精製するために使用され、かつ（１）２Ｌのヘキサン、（２）２Ｌの１０％ＭＴＢＥ：ヘキサン、（３）２Ｌの２０％ＭＴＢＥ：ヘキサン、（４）２Ｌの３０％ＭＴＢＥ：ヘキサン、（５）４Ｌの４０％ＭＴＢＥ：ヘキサン、（６）５０％ＭＴＢＥ：ヘキサン、及び（７）４ＬのＭＴＢＥ（総溶出体積：１９Ｌ）で溶出された。改善されたクロマトグラフィ条件は、溶媒体積の４０％減少、減少された処理時間（例えば、溶媒除去のため）、及び生成物分解の減少されたリスクを示す。

【0067】

還元剤としてシステインを使用すると、反応が進むにつれて、固体、恐らくは酸化型シスチンが反応から沈殿するのが観察された。最初に、反応の最後に見ることができる沈殿物をセライトを介した濾過によって収集し、透き通った濾液を得た後、固体クエン酸を使用してｐＨを３に調整した。さらなるシスチン／システインが、この段階で生成物とともに沈殿する。こね粉状の沈殿物を、焼結漏斗を介した濾過によって収集し、漏斗上で空気乾燥させることができた。次いで、この「こね粉状のもの」をＭＴＢＥ（１×１００ｍＬ、３×５０ｍＬ）内でスラリー化して生成物を除去し、それを濾過によって収集し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。

【0068】

精製された酵素を使用したとき、水性層の抽出により、急速に沈降する乳濁液を得た。しかしながら、粉抽出物を使用した反応の抽出により、分割するにはセライトを介した濾過が必要とされるゲル状の乳濁液を得た。これは、生成物の損失、またはフィルタを介して洗浄するために増加される溶媒使用をもたらし得る。沈殿した生成物／シスチンの直接濾過、及びＭＴＢＥでのスラリー化がこの問題を防ぐことが分かった。この手続きを実施した後、粉抽出物反応（１８９１−０２９）から結果として生じる水性濾液（ｐＨ３）を、１００ｍＬのＭＴＢＥで抽出し、セライトを介して濾過されるゲル状の乳濁液を得た。有機層のＴＬＣ分析は、非常に微かなＵＶ活性スポットのみを示し、単離された生成物（６２ｍｇ）の^１Ｈ ＮＭＲは、ＨＥＴｒＥが存在しないことを示したため、沈殿物の濾過がＨＥＴｒＥ生成物の回復に好適な方法であることを表している。

【0069】

この反応は、ＵＰＬＣ面積％（２５２ｎｍ）で純度９２．７３％を有する２．５ｇ（９４％）の未加工のＨＥＴｒＥを産出した。

【0070】

実施例１２：１０Ｌスケールアップ反応
１０Ｌスケールアップ反応を２回実施して（それぞれ３００ｇのＤＧＬＡ）、カラムクロマトグラフィ精製、溶媒除去、及び高真空乾燥の後、ＵＰＬＣで純度９７．２％を有する１５（Ｓ）−ＨＥＴｒＥを合計４６９ｇ（７４％）産出した。本材料は、比較用毒性バッチの約９０ｍＥｑ／ｋｇと比較して、１２．５ｍＥｑ／ｋｇの過酸化物値を有することが分かった。

【0071】

追加の１０Ｌスケールアップ反応を実施して、カラムクロマトグラフィ精製、溶媒除去、及び高真空乾燥の後、さらに２３９ｇ（７６％）の１５（Ｓ）−ＨＥＴｒＥを産出した。

【0072】

実施例１３：安定性研究
１０Ｌスケールアップ反応を２回実施して、安定性研究のために６００ｇのＤＧＬＡを処理した。これらは、スキーム２に示される条件を使用して実施された。

【化2】

スキーム２

【0073】

１０Ｌの０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１３．４）を水素化槽に装入し、２当量のシステインがその後に続いた。ＤＧＬＡを緩衝液溶液に装入し、０〜５℃に冷却した。ＬＰＸ１酵素パウダーを冷えた反応溶液に添加し、最低２バールの純酸素で加圧し、１時間撹拌した。１時間後の^１Ｈ ＮＭＲ分析は、約６％ＨＰＥＴｒＥ、及び８％残渣ＤＧＬＡを示した。反応試料のＣＡＤ分析は、残渣ＤＧＬＡが１２．６％ ｗ／ｗで存在することを示した。酸素圧下でさらに６０分後の分析は、^１Ｈ ＮＭＲにより約５％ＨＰＥＴｒＥ、及び４％ＤＧＬＡを示した。ＣＡＤ分析は、残渣ＤＧＬＡが５．０％ ｗ／ｗで存在することを示した。反応混合物を窒素でパージした後、さらに１当量のシステインを添加し、反応を１時間撹拌した。アリコートの分析は、^１Ｈ ＮＭＲにより、ＨＰＥＴｒＥが無いこと、及び３．５％ＤＧＬＡを示した。ＣＡＤ分析は、残渣ＤＧＬＡが３．８％ ｗ／ｗで存在することを示した。

【0074】

反応混合物を、窒素ブランケット下で１．３℃で一晩撹拌した。アリコートの分析は、^１Ｈ ＮＭＲにより、ＨＰＥＴｒＥが無いこと、及び３．５％ＤＧＬＡを示した。ＣＡＤ分析は、残渣ＤＧＬＡが５．３％ ｗ／ｗで存在することを示し、それは特異な結果であると考えられる。アリコートを、窒素雰囲気下で後処理し、直ちに過酸化物値を分析した。これは、２ｍＥｑ／ｋｇであることが分かった。バルク溶液を、窒素雰囲気下で、２５Ｌのドラム缶に流し、１０Ｌのガラス槽に移した。０．０２％ＢＨＴを含有するＭｔＢＥを添加し、固体クエン酸を少量ずつ添加することによってこの水溶液のｐＨを調整した。結果として生じる三相混合物（有機、水性、及び固体沈殿物）を沈降させた。この混合物を、次いで、窒素流出下で４Ｌ焼結漏斗を介して濾過した。１．５〜２時間を要した濾過中に、添加されたＭｔＢＥのおよそ３分の２が蒸発した。濾液層を槽に戻し、沈降させ、次いで分離した。水性層を再抽出した（×２回）。３つの抽出物層をロータリーエバポレータ上で別個に濃縮した。合計２７４ｇの未加工油を単離した（テトラクロロニトロベンゼン標準に対する^１Ｈ ＮＭＲアッセイにより、約２３１ｇ（７３％））。さらに５３ｇの未加工油（４３ｇ＋１０ｇ）を、単離された濾過ケークをＭｔＢＥ（２×１Ｌ）内でスラリー化した後に得て、^１Ｈ ＮＭＲアッセイにより、合計で３２７ｇの未加工の回復を得た（２７８ｇ（８８％）。第１の抽出物及びスラリー化された材料において、それぞれ８．６ｍＥｑ／ｋｇ及び１４．９ｍＥｑ／ｋｇの過酸化物値を得た。

【0075】

第２のバッチを同じ様式で生産したが、反応溶液の初期温度は、より低い１．４℃対４．２℃であった。１時間後の^１Ｈ ＮＭＲ分析は、約３％ＨＰＥＴｒＥ、及び１１％残渣ＤＧＬＡを示した。反応試料のＣＡＤ分析は、残渣ＤＧＬＡが１５．５％ ｗ／ｗで存在することを示した。酸素圧下でさらに１２０分後の分析は、^１Ｈ ＮＭＲにより、約６％ ＨＰＥＴｒＥ、及び４％ＤＧＬＡを示した。反応混合物を窒素でパージした後、さらに１当量のシステインを添加し、反応を窒素ブランケット下で一晩撹拌した。アリコートの分析は、^１Ｈ ＮＭＲにより、ＨＰＥＴｒＥが無いこと、及び約３％ＤＧＬＡを示した。ＣＡＤ分析は、残渣ＤＧＬＡが４．０％ ｗ／ｗで存在することを示した。

【0076】

アリコートを窒素雰囲気下で後処理し、直ちに過酸化物値を分析したところ、５ｍＥｑ／ｋｇであることが分かった。バルク溶液を、窒素雰囲気下で、２５Ｌのドラム缶に流し、１５Ｌのガラス槽に移した。固体クエン酸でｐＨ３．２に酸性化した後、結果として生じる固体沈殿物を、窒素流出下で多孔性１、４Ｌ焼結漏斗を介した濾過によって収集した。次いで濾過ケークを槽に戻し、ＭｔＢＥでスラリー化し（３回×３Ｌ）、毎回濾過した。３つの濾液層をロータリーエバポレータ上で別個に濃縮した。合計３２５ｇの未加工油を単離した（テトラクロロニトロベンゼン標準に対する^１Ｈ ＮＭＲアッセイにより、約２８４ｇ（９０％））。第１の抽出物画分では、１０ｍＥｑ／ｋｇの過酸化物値を得た。

【0077】

未加工の材料を組み合わせ、多数の７５Ｌ Ｂｉｏｔａｇｅ ＫＰ−Ｓｉｌカラム上でカラムクロマトグラフィによって精製した。精製された画分を、ＴＬＣ分析に基づいて組み合わせ、４０℃（光から保護される）でロータリーエバポレータ上で濃縮した後、窒素でベントし、８０℃で保存した。単離された純ＨＥＴｒＥ画分をＭｔＢＥ中に溶解し、きれいな焼結漏斗を介して濾過し、組み合わせた後、４０℃（光から保護される）でロータリーエバポレータ上で濃縮した。精製された材料を光から保護し、高真空ポンプ上で３日間室温で乾燥させた後、窒素でベントし、−８０℃で保存した。元来のＨＰＬＣ法（２３５ｎｍ）を使用して、ＵＰＬＣ（２５２ｎｍ）で９７．４％面積純度、及び９７．３％面積純度で、合計４６９ｇの淡黄色油を得た。^１Ｈ ＮＭＲスペクトルは構造に準じた。本材料を残渣溶媒のためのＧＣヘッドスペースにより分析し、ＭｔＢＥ及びシクロヘキサンについてそれぞれ、４３４及び９．２ｐｐｍの値を得た（制限５０００及び３８８０ｐｐｍ）。本バッチに関して１２．５ｍＥｑ／ｋｇの過酸化物値を計算した（対して、先の毒性バッチでは約９０ｍＥｑ／ｋｇ）。

【0078】

この方法で生産される材料を、元来のＯＰＲＤ法を使用したＨＰＬＣによる毒性バッチと比較した。ＨＰＬＣトレースを図６及び図７に示す。

【0079】

これらのバッチは、同様のプロファイル及び純度を有する。２つのスペクトル間の主な相違は、約３５〜３６分で顕著であるが、これは恐らくは広範で不明瞭なピークの統合が原因である。４８．１分での不純物は、毒性バッチ内で０．５５％に対して試験バッチ内では０．９２％で存在し、それは修正された反応条件に起因し得るか、ＤＧＬＡ開始材料の組成物に起因し得る可能性が高い（トコフェロール安定化させたバッチを使用して試験バッチを調製した）。６３〜６６分の間の不純物は、面積％の変動と一致する。トレースの比較から明らかな０．１％を超える新しい不純物はない。

【0080】

^１Ｈ ＮＭＲスペクトルのオーバーレイは、実質的に同一のプロファイルを示した（図８）。
表１３は、毒性バッチの調製のために以前に利用された条件を、試験バッチの調製のために使用される条件と大まかに比較する。

【表13】

【0081】

スケールアップ試験バッチの実施中に、Ｏ_２圧下で２．５〜３時間後、約４〜５％残渣ＤＧＬＡが反応混合物内に残ったことが観察された。試験反応中に、最終当量のシステイン還元剤を添加し、大気条件下で撹拌し、残渣ＤＧＬＡのさらなる変換を起こさせた。しかしながら、スケールアップ反応中、反応混合物を窒素でパージした後に最終当量のシステインを添加したため、ＤＧＬＡレベルのさらなる減少は不可能であった。本論拠は、反応混合物内の酸素の存在を減少させ、ひいてはさらなる過酸化物形成及びシステインの酸化の可能性を最小限にすることであった。さらに２０〜５０％の酵素活性が添加される、さらなる試験を実施した。最終当量のシステインとともに２０％酵素活性の添加は、^１Ｈ ＮＭＲによって判定した際に、＜１％残渣ＤＧＬＡを得ることが分かった。

【0082】

残りの１０Ｌの実行を、本明細書内に詳述されるプロセス説明に従って実施した。合計２３９ｇの淡黄色油を、前と同じように^１Ｈ ＮＭＲプロファイルで得た。

【0083】

実施例１４：プロセス説明
プロセス説明（ＰＤ）は、この全研究中に実施される反応の結果に基づいて生成された。安定性研究プロジェクトのために十分なＨＥＴｒＥを提供するための２×３００ｇのＤＧＬＡの処理において、プロセス説明案に従った。ＰＤは、以下の例示的工程を含む：
１．ホウ酸（６１．８ｇ、１ｍｏｌ）及びＮａＯＨ（１２０．０ｇ；３ｍｏｌ）を１０Ｌの水に装入し、溶解するまで撹拌することによって、ホウ酸ナトリウム緩衝液０．１Ｍを調製する。
２．１０．０Ｌの０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液を水素化槽に装入する。
３．システイン（２３７．２ｇ；１．９５８ｍｏｌ；２．０当量）を装入し、溶解するまで撹拌する。
４．ＤＧＬＡ（３００．０ｇ；９．７９ｍｏｌ；１．０当量／重量／体積）を緩衝液溶液に装入し、０〜５℃に冷却する。
５．目盛付きｐＨプローブを使用してｐＨが約９．３〜９．６であることを確認する。
６．必要に応じて、４Ｍ ＮａＯＨ溶液でｐＨを調製する。
７．ＬＰＸ１酵素パウダー（５．３０ｇ、１７．７ｍｇ／ｇ ＤＧＬＡ；１．８Ｍユニット／ｇ ＤＧＬＡ、１．７７重量％）を冷えた反応溶液に装入する。
８．反応槽を最低２バールの純酸素で加圧する。
９．反応を２バール酸素圧下で、０〜５℃で１時間撹拌する。
１０．発泡を防ぐために酸素をゆっくりと放出する。
１１．化学者チェック：アリコートを除去する；固体クエン酸を使用して抽出物をｐＨ３に酸性化し、ＭＴＢＥで抽出する。Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、ロータリーエバポレータ上で溶媒を除去し、^１Ｈ ＮＭＲにより残渣を分析して、ＤＧＬＡのＨＰＥＴｒＥ／ＨＥＴｒＥへの変換を確認する。
１２．さらなるＬＰＸ１酵素パウダー（１．０６ｇ、３．５ｍｇ／ｇ ＤＧＬＡ、０．３６Ｍユニット／ｇ ＤＧＬＡ、０．３５重量％）及び１当量のシステイン（１１９．０ｇ；０．９７９ｍｏｌ）を添加し、酸素下でさらに１．５時間撹拌する。
１３．酸化完了について分析する−反応混合物のアリコートを除去し、等体積のＭｅＯＨで反応を停止させ、開始材料の消費を示すためにＣＡＤ検出により分析する。残渣ＤＧＬＡが＜１０ｇ／ｋｇ（ＨＰＬＣ／ＣＡＤによる）の場合は合格。ＩＰＣが不合格の場合、酸素圧下でさらに１時間撹拌を継続し、分析を繰り返す。
１４．還元完了について分析する−アリコートを除去する；固体クエン酸を使用して抽出物をｐＨ３に酸性化し、ＭＴＢＥで抽出する。Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、ロータリーエバポレータ上で溶媒を除去し、^１Ｈ ＮＭＲ及び／またはＵＰＬＣ／ＵＶにより残渣を分析して、残渣ＨＰＥＴｒＥが無いことを確認する。試験段階中、試料を酸素から保護し、遅滞なく過酸化物試験を実施する。ＮＭＲ及び／またはＵＰＬＣ／ＵＶにより１５−ＨＰＥＴｒＥが検出不可能な場合は合格。過酸化物値はＦＩＯである。ＩＰＣが不合格の場合、システイン（５９．５ｇ、０．４８９ｍｏｌ、０．５当量）を添加し、窒素ブランケット下でさらに４〜８時間撹拌を継続し、分析を繰り返す。
１５．反応混合物を窒素でパージする（×３回）。
１６．反応器内容物を、窒素流出下で２５Ｌドラム缶に移す。
１７．反応混合物を窒素ブランケットされた約１５Ｌ槽に装入する。
１８．目盛付きｐＨ測定器でｐＨをチェックしながら、固体クエン酸（必要に応じ、装入表（表１６、付録１）を参考）を、撹拌された、窒素ブランケットされた反応混合物に少量に分けて装入する。ｐＨ≦３．５に調整する。毎回次の分量を添加する前にｐＨが安定するのを待つ。添加回数、ｐＨ傾向、観察を記録する。
１９．撹拌を止め、沈殿した固体を焼結漏斗上で濾過する。濾過中、外部窒素ブランケットを適用する。
２０．水性濾液層を１０Ｌドラム缶内に移す。
２１．湿潤ケークを抽出槽内に戻す。ＭｔＢＥ（３Ｌ）を抽出槽に装入する。
２２．１０分間撹拌し、沈降させる。
２３．撹拌を止め、沈殿した固体を焼結漏斗上で濾過する。濾過中、外部窒素ブランケットを適用する。
２４．有機濾液をきれいな１０Ｌドラム缶に移す。
２５．工程２１〜２４を２回繰り返す。
２６．２５０ｍバール／摂氏４０℃浴で蒸留物収集が緩徐になるまで未加工の生成物溶液を蒸発させる。ロータリーエバポレータを窒素でベントする。蒸発が終わる前に、溶液を風袋軽量済１Ｌフラスコに移す。可能な限り空気から保護する。
２７．未加工の重量を決定し、１５−ＨＥＴｒＥ：ＭｔＢＥモル比（ＦＩＯ）のためにＮＭＲ試料を採取する。過酸化物試験のために、ＦＩＯ試料を、新鮮なときに採取し、遅滞なく分析する。ＵＰＬＣ／ＵＶでの未加工の純度のためにＦＩＯ試料を採取する。
２８．窒素下で摂氏−８０℃で未加工の生成物を保存する。
２９．未加工のＨＥＴｒＥを１体積のシクロヘキサン内に８０ｇずつに分けて溶解し、シクロヘキサンで事前溶出されたＢｉｏｔａｇｅ ７５Ｌシリカカートリッジに適用する。１０％ＭｔＢＥ：シクロヘキサンで開始して最大５０％ＭｔＢＥ：シクロヘキサンまでのカラムから生成物を溶出する。
３０．ＴＬＣに基づいて生成物画分を事前に組み合わせる。
３１．カラム画分純度を分析する−事前に組み合わされた生成物画分のアリコートを除去し、ＵＰＬＣにより分析する。％面積純度が＞９５％の場合は合格。ＩＰＣが不合格の場合、再精製のために画分を取っておく。
３２．純粋な生成物を含有する画分を好適に組み合わせる。
３３．４０℃でロータリーエバポレータ上で溶媒を除去する。窒素でベントする。
３４．材料を、撹拌しながら、高真空下で一定重量まで乾燥させる。
３５．窒素下で真空を解放する。
３６．残渣溶媒を分析する−乾燥させた生成物のアリコートを除去し、ＧＣヘッドスペースにより分析する。残渣溶媒がＩＣＨ限界未満（＜５０００ｐｐｍ ＭｔＢＥ、３８８０ｐｐｍシクロヘキサン）の場合は合格。ＩＰＣが不合格の場合、バルク材料を高真空ポンプに戻し、２４時間乾燥を継続し、分析を繰り返す。
３７．窒素ブランケット下で、風袋計量済アンバーボトルに移し、８０℃で保存する。

【0084】

実施例１５：反応器洗浄
ＤＧＬＡ及びＨＥＴｒＥ残渣は、エタノール及びメタノール、またはアセトンなどのアルコール中に容易に溶解できる。システインは、水（２８０ｇ／Ｌ＠２５℃）、及びエタノール（１．５ｇ／１００ｇのエタノール＠１９℃）中に溶解でき、シスチンは、加熱しながら１Ｍ ＨＣｌ（５０ｇ／Ｌ）、及び塩基性溶液中に溶解できる。

【0085】

反応後処理から収集された固体５５０ｍｇを、加熱しながら１２ｍＬの１Ｍ ＨＣｌ内でスラリー化した。本材料のバルクを５０℃で加熱しながら溶解した。少量の不溶性材料を見ることができた。さらなる１Ｍ ＨＣｌ（１２ｍＬ）の添加により、粘り気のある固体を溶解することはできなかった。残渣材料を濾過によって収集した（１４ｍｇ、湿潤、２．５％）。

【0086】

収集した固体５５０ｍｇを、１０ｍＬの４Ｍ ＮａＯＨ内で加熱しながら（ヒートガン）スラリー化した。本材料のバルクを溶解したが、再び少量の不溶性材料を見ることができた。

【0087】

さらなるＮａＯＨ（１０ｍＬ）の添加により、固体を溶解することはできなかった。

【0088】

１０Ｌ反応の実施後、水素化槽を水及びメタノールで洗浄し、沈殿したシステイン／シスチンなどを除去した。１５Ｌガラス槽内での反応混合物の後処理後、反応器を苛性溶液（約０．５Ｍ）で洗浄し、８０℃に加熱し、一晩撹拌した後、アセトンで洗い流して槽を見た目にきれいにした。

【0089】

実施例１６：熱危険性評価
Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｔｏｏｌ（ＡＲＳＳＴ）は、プロセス産業における化学的危険性の可能性を迅速かつ安全に特定することができる効果的な熱量計である。

【0090】

合成反応（スキーム２）は、ホウ酸ナトリウム緩衝液中のリポキシゲナーゼ酵素を使用したＤＧＬＡの過酸化を伴う。次いで、結果として生じる過酸化物（１５−（Ｓ）−ＨＰＥＴｒＥ）を、ｉｎ−ｓｉｔｕで、システインの存在下で最終生成物１５−（Ｓ）−ＨＥＴｒＥに還元する。この反応は、０〜５℃でワンポット手続きとして実行されることが意図される。主たる懸念は、特に過酸化物がこの反応の経過中に形成されるため、昇温が不都合な熱イベントを引き起こし得ることであった。

【0091】

全ての試薬を、ラボ内で調製された水溶液としてＡＲＳＳＴセルに装入した。溶液濃度は、開始試薬のおよそ５％であった。およそ１０ｇの溶液をＡＲＳＳＴ槽に一括で移し、圧力パッドを適用し、運転を開始した。水が蒸発するのを防ぐため、２５０℃で運転を停止した。

【0092】

槽内の温度は、添加前は２１℃であった。自己発熱率は、およそ０．９℃／分であった。反応の過程中に著しい発熱は観察されなかった（図９）。Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｔｏｏｌ（ＡＲＳＳＴ）または直接走査熱量測定（ＤＳＣ）を使用して、熱危険性は観察されなかった。

【0093】

試験範囲内（最大１４０℃）でさらなる発熱性は観察されなかった。運転の経過中に気体発生は観察されなかった。自己発熱率は、恐らくは生成物の分解からの揮発性化合物の形成により１００℃で減少し、永久気体形成は観察されなかった（図１０）。

【0094】

反応溶液（約１０ｇ）を使用してさらなる運転を実行し、そこでは、この場合はいかなる熱危険性の可能性も観察される可能性が高かったため、システイン還元剤を除外し、したがって主に中間体過酸化物を含有していた（図１１）。

【0095】

発熱は、４０℃の開始温度を有すると検出され、ＡＴＲは１３℃であった。バックグラウンド加熱率は０．９℃／分であった。揮発性物質の形成、恐らくは生成物の分解が原因で、自己発熱率はおよそ１１６℃で減少し始めた。前と同じように、この反応において気体のいかなる放出の証拠もなかった（図１２）。

【0096】

４０℃の開始温度及び１３℃のＡＴＲでの発熱が、この反応において観察された。反応は０〜５℃で実行されるため、それが問題になる可能性は低い。反応中の過酸化物レベルが低いため、観察された発熱が標準反応条件下で見られる可能性は低い。この反応において目に見える気体放出は観察されなかった。反応は、０〜５℃の提案された温度範囲で操作するのに安全である。

【0097】

未希釈のＨＥＴｒＥの試料を、２０〜３００℃の範囲にわたって２、５、１０、２０℃／分の発熱率でＤＳＣにより分析した。著しい発熱は観察されなかったが、約４０℃でわずかな発熱が観察され、それは恐らく試料から蒸発する残渣溶媒（ＭｔＢＥ）が原因であった。

【0098】

実施例１７：ロバスト性研究
修正されたプロセスを使用すると、Ｏ_２下での延長された反応時間（最大４時間）は、生成物の品質へのいかなる悪影響も示さなかった。

【0099】

７５℃の外部温度で４０％ＭｔＢＥ：シクロヘキサン内で還流させる時間の延長（４．５日）は、ＨＥＴｒＥの著しい分解を引き起こさなかった。以前に、真空下で５０℃で（１８２２−１２９−４Ｅ）加熱される未希釈のＨＥＴｒＥは、分解を示した（１つの主な不純物が観察され、それは自己で形成されるエステルと特定されている。

【0100】

実施例１８：反応時間に関する１５（Ｓ）−ＨＰＥＴｒＥ／ＨＥＴｒＥの安定性の調査
多数の反応が、反応の様々な段階におけるロバスト性に関する有用な情報を提供した。結果を表１４にまとめる。

【表14-1】

【表14-2】

【0101】

以前に、元の処理条件（ヒドロペルオキシドの生成に続き、水素化ホウ素ナトリウムを使用してＨＥＴｒＥに還元）を使用すると、酸素圧下で延長された時間（４時間）は、^１Ｈ ＮＭＲ（図１４）、及びＬＣＭＳ（図１３）により判定した際に、過酸化不純物の形成を導くことが観察された（実験１８２２−０６３）。ＲＴ約７．８でのピークは３３７のｍ／ｚを有し、ジ−ＨＥＴｒＥと一致し、吸収度は、化合物のトリエン酸特性と一致する、最大で２６７ｎｍである。

【0102】

以前と同じ酵素充填量（１３．７Ｍユニット／ｇ ＤＧＬＡ）を使用してヒドロペルオキシド中間体を形成した後、２当量のシステイン還元剤を添加し、Ｏ２／空気下でさらに３．５時間撹拌する、初期反応（１８２２−１９３）を実施した。^１Ｈ ＮＭＲプロファイル（図１４）は、１８２２−１６３で得たものと類似していた。過酸化は、高酵素充填量、または酸素に対するヒドロペルオキシドの反応特性のいずれかが原因で、ヒドロペルオキシド中間体により発生しているようであった。

【0103】

次の実験（１８２２−１９５）では、２当量のシステイン還元剤を反応の開始時に添加し、それをＯ_２圧下で３０分間撹拌した。一部の残渣ＤＧＬＡが、ＨＥＴｒＥ及びＨＰＥＴｒＥの混合物ならびに少量の過酸化不純物とともに、^１Ｈ ＮＭＲスペクトル内で見ることができた。大気条件下で一晩保存後、不純物プロファイルは、ＨＰＥＴｒＥのさらなる還元はなく、わずかに悪化しているように見え、それはシステインが、ヒドロペルオキシドまたは酸素のいずれかによって全て酸化されたことを示唆した。

【0104】

実験１８２２−１９７では、反応の開始時の３当量のシステインの添加が、過酸化を減少させるように見えたが、ＤＧＬＡのＨＥＴｒＥへの変換も遅らせた。過剰なシステインは、酵素活性化ＨＰＥＴｒＥの還元を加速することが想定され、これは過酸化の欠如、ならびに停滞する反応の原因となり得る。

【0105】

次いで、酵素充填量を、それぞれ３．６、１．８、０．９Ｍユニット酵素活性／グラム ＤＧＬＡ基質に減少した、実験１８９１−００１〜００５を実行した。反応の開始時に２当量のシステインを添加し、それをＯ２圧下に１時間置いた後、^１Ｈ ＮＭＲにより分析し、次いでさらに１当量のシステインを添加し、空気またはＯ２圧下でさらに１時間撹拌した。^１Ｈ ＮＭＲ（図１４）により過酸化不純物は観察されなかったが、低いレベルが２５２ｎｍでのＵＰＬＣにより見ることができた。

【0106】

反応混合物に６．５時間継続して酸素を吹き込んだ発酵装置反応１８９１−００９は、^１Ｈ ＮＭＲにより過酸化生成物を示さなかった。この場合、溶液中の活性酵素の濃度は、常に低レベルであった。

【0107】

反応１８９１−０２９を、酸素下で３時間撹拌し、空気下で週末にかけて保存した。わずかな量の過酸化不純物が、^１Ｈ ＮＭＲにより見ることができた（図１４）。
スケールアップバッチ１８９１−０５１（１．８Ｍユニット／ｇ ＤＧＬＡ）を、Ｏ_２圧下で２．５〜３．７５時間維持したが、^１Ｈ ＮＭＲ分析により判定した際に、純度に対する重大な影響はなかった。

【0108】

実施例１９：溶媒除去条件下での安定性
５００ｍＬ４０％ＭｔＢＥ：シクロヘキサン中ＨＥＴｒＥ（約９．１ｇ）溶液を、７５℃（外部油浴温度）で４００ｍバール真空（コンデンサ冷却液温度−０℃）で加熱する、熱安定性試験を実施した。これが、穏やかな還流を確立した。溶液を光から保護した。試料を、窒素雰囲気下で、様々な時点で取り出し、ＵＰＬＣ（２５２ｎｍ）により分析した（図１５）。

【0109】

本条件は、プールされたカラム画分からの工場スケールの溶媒除去で直面する可能性のある条件を模倣するように設計された。６時間後、純度の著しい減少は検出されなかった。還流は、さらに１１２時間にわたって延長された。純度の著しい減少は観察されず、０．４４から０．６４％への増加はあったものの、ＲＴ １２．２分での二量体不純物の形成の急速な増加もなかった。

【0110】

実施例２０：反応完了ＩＰＣのための非ＮＭＲ法の調査
ｗ／ｗ ＤＧＬＡ標準に対する化学エアロゾル検出（ＣＡＤ）法を使用して、反応混合物内の残渣ＤＧＬＡを決定した。先の反応を、反応混合物からのアリコートの除去及び小型後処理に続く^１Ｈ ＮＭＲ分析を基に、反応完了について評価した。しかしながら、残渣ＤＧＬＡとＨＥＴｒＥ生成物信号との間にいくらかのオーバーラップがあったため、この方法は理想的ではなかった（図１６）。

【0111】

代替の方法が好ましかった。ＤＧＬＡは２１０ｎｍを超えて吸収しないため、ＵＶ分析は考慮に入れなかった。ＩＰＣ試料を０．１％ ｗ／ｗ ＤＧＬＡ標準と比較する、荷電化エアロゾル検出（ＣＡＤ）は、好適な方法であることが分かった。ＩＰＣ試料を反応から取り出し、５０％メタノールで反応を停止して酵素を変性させた後、分析を実施した。この方法は、反応試料内の残渣ＤＧＬＡレベルのより正確な決定を可能にする。

【0112】

実施例２１：不純物のＬＣ−ＭＳ調査
精製された１５（Ｓ）−ＨＥＴｒＥ、ならびにＰＲＤ開発の経過中に調製された不純物が豊富な前部及び後部画分を、ＬＣ−ＭＳ及びＭＳ−ＭＳにより分析した。ＤＧＬＡに関して供給された規格、及び入手したデータに基づき、観察された不純物に関して暫定的構造を示唆した。ＤＧＬＡ開始材料の規格に基づき、存在する３つの主な不純物（図２０）は、それぞれ１．１、１．６、及び０．４％のＧＣ分析により、ＦＡＭＥ面積％を有する、２０：２ω６（イコサジエン酸（ＥＤＡ）、Ｃ_２０Ｈ_３６Ｏ_２、ＲＭＭ３０８．４８）、２０：３ω３（エイコサトリエン酸（ＥＴＥ）Ｃ_２０Ｈ_３４Ｏ_２、ＲＭＭ３０６．４８）、及び２０：４ω３（エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）、Ｃ_２０Ｈ_３２Ｏ_２、ＲＭＭ３０４．４８）であった。０．２％面積（ＦＡＭＥ）面積でそれぞれさらに２種類の未確認の不純物もまた存在し、ＦＡＭＥ ＧＣ分析により３．５面積％の総不純物を示した。

【0113】

精製された生成物（１８９１−０５１−７Ａ）から確認された質量の暫定的構造を、表１５に含める。ｍ／ｚ３２３（ＲＴ ７．６８分）及び３１９（ＲＴ ６．３分）で精製された材料内で確認された主な不純物は、ＥＤＡ及びＥＴＡのヒドロキシル化生成物（それぞれＨＥＤＡ及びＨＥＴＥ）と一致する。ＥＴＥのヒドロキシル化に関連した即座に確認可能な不純物を、精製された材料内で検出することはできなかったが（ｍ／ｚ３２１を予期した）が、後部画分内では、ｍ／ｚ３２１（ＲＴ ７．１９分）でのピークが、主なＨＥＴｒＥ生成物ピーク上で観察された。３つ目の主な不純物は、５８３のｍ／ｚ（ＲＴ １１．４１）を有したが、それは恐らく６２５のｍ／ｚで、１２．２２分で見ることができる二量体生成物に関連する。最初に、これは、Ｄｉｅｌｓ Ａｌｄｅｒ機構、または自己エステル化のいずれかが原因で形成されると仮定された。ＬＣ ＭＳ−ＭＳ（図２１）を、＋２５℃で保存されていた試料（安定性研究１７７３Ａ００３０Ｅからの試料２２９）で実施したところ、この二量体純度は増加していた。

【表15-1】

【表15-2】

【0114】

不純物の式はＣ_４０Ｈ_６６Ｏ_５であった。断片化モードは、不純物のエステル二量体特性を支持する。ＭＳ／ＭＳアルゴリズムによる識別は、エステル開裂からの予期されるパターンである、ＨＥＴｒＥと同じプロファイルを有する娘イオンを示した（図２２）。

【0115】

実施例２２：ＥＰＡからの１５（Ｓ）−ＨＥＰＥの生産
反応を、ＤＩ水中に（５Ｌ）完全に溶解したホウ砂（１９４ｇ、０．５０８ｍｏｌ）によって実行した。Ｌ−システイン（４０ｇ、０．３３ｍｏｌ）、及び２５〜３０℃で３０分間撹拌した。ＰＰＧ−２０００（抗発泡剤、２ｍＬ）を添加し、４Ｍ ＮａＯＨを使用して反応質量ｐＨを９．５５〜９．６５に調整した。ＥＰＡ（５０ｇ、０．１６５ｍｏｌ）を添加し、２５〜３０℃で３０分間撹拌した。反応質量を０〜５℃に冷却し、ＬＰＸ１酵素（１．２５ｇ、２．４９％）を添加した。反応混合物を酸素（業務グレード、９９．５％）（１Ｋｇ＊２）でパージし、酸素ガス（２．２Ｋｇ）で反応槽を加圧した。反応混合物を、０〜５℃で、酸素圧（２．２Ｋｇ）下で１時間撹拌した。ＥＰＡの変換完了後、質量を窒素ガス（グレードＩ、１Ｋｇ＊２）で脱気した。Ｌ−システイン（２０ｇ、０．１６５ｍｏｌ）を添加し、反応槽を窒素ガス（グレードＩ、２．２Ｋｇ）で加圧した。本質量を０〜５℃で１時間撹拌した。ペルオキシ中間体の変換完了後、窒素圧を解放し、本質量を反応器から取り外し、ＤＭ水（１５０ｍＬ＊２）で洗い流した。未加工のｐＨを４０％ ｗ／ｗ クエン酸溶液を使用して３．０〜４．０に調整し、続いてＭＴＢＥ（１Ｌ）を添加した。この二相層を３０分間撹拌し、濾過した。主な濾液を、層分離のために採取し、残渣をＭＴＢＥ（５００ｍＬ＊２）で洗浄した。ＭＴＢＥで洗浄した残渣を、分離した水性層の抽出のために採取した。有機層を組み合わせ、無水硫酸ナトリウム（１５ｇ）上で乾燥させ、濾過した。濾液を、３０〜３５℃で真空下で濃縮し、９５．００％ＨＰＬＣ純度を有する淡黄色の液体（４８ｇ）としてステージ−Ｉを得た。

【0116】

１５（Ｓ）−ＨＥＰＥのエステル化を、乾燥アセトン（３００ｍＬ）中にステージ−Ｉ（３０ｇ、０．０９４ｍｏｌ）を溶解することによって実行した。炭酸カリウム（６８．３６ｇ、０．４９５ｍｏｌ）及び臭化エチル（３０．８ｇ、０．２８３ｍｏｌ）を添加し、その質量を２５〜３０℃で４８時間撹拌した。ステージ−Ｉの完了後、冷却したＤＭ水（１２０ｍＬ）及びブライン溶液（３０ｍＬ）を１０〜２０℃で反応質量に添加した。反応質量を２５〜３０℃にし、次いで６０分間撹拌した。この二相層を分離し、上部有機層を２５〜３０℃で真空下で濃縮し、溶媒を蒸留して取り除いた。ヘキサン（２２５ｍＬ）を未加工に添加し、その質量を２５〜３０℃で３０分間撹拌した。この二相層を分離し、上部有機層をブライン溶液（１５％、９０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム（４．５ｇ）上で乾燥させ、濾過した。濾液をノーリット木炭（ＳＸプラス、３ｇ）と添加し、１時間撹拌した。黒色溶液を、セライトパッドを介して濾過した後、濾液をシリカゲル（１００〜２００メッシュ、２０％）と添加し、次いで１時間撹拌した。スラリー質量を濾過した後、濾液を２５〜３０℃で真空下で濃縮して、溶媒を蒸留して取り除いた。濃縮された質量を、ＭＴＢＥ（９０ｍＬ＊２）で追跡し、９７．１３％ＨＰＬＣ純度を有する淡黄色の液体（２１．７３ｇ）としてステージ−ＩＩを得た。

【0117】

結論及び推奨
ＤＧＬＡの新規ワンポット生体内酸化／還元は、ほんのわずかの酵素充填量、ならびにかなり少ない抽出及びクロマトグラフィ溶媒のみを使用しながら、同様の純度の１５（Ｓ）−ＨＥＴｒＥ材料を著しく増加した収率（二工程法の５３％に対して７６％）で生み出す。

【0118】

連続ワンポッドモードで使用される、先の還元剤水素化ホウ素ナトリウムは、ｉｎ−ｓｉｔｕ還元剤として使用されるシステインで置き換えられた。これは、より大きい規模では問題となっている、品質及び収率にとって脅威となる可能性のある長い反応停止時間を伴う、反応及び後処理中の水素生成を防ぐ。システインの使用のさらなる追加の利点は、還元剤が反応の開始時、すなわち生体内酸化工程の前に、添加され得ることである。したがって、生成されたヒドロペルオキシド中間体は、それが形成されるときにｉｎ−ｓｉｔｕで還元され、高レベルのヒドロペルオキシドによって引き起こされる酵素不活性化を防ぐと同時に、過酸化及びヒドロペルオキシド中間体分解を原因とする不純物形成を防ぐ。これが、要求されるリポキシゲナーゼ酵素充填量を７．６分の１減少させるという結果を導いた。凍結乾燥酵素の代替のより安価な供給と組み合わせることで、これは、酵素費用負担を全体で１５分の１減少させるという結果を導いた。

【0119】

酵素充填量要件を減少する試みと並行して、酵素源調査は、大豆粉から抽出されるリポキシゲナーゼが、かくして１５−（Ｓ）−ＨＥＴｒＥプロセスに有効な酵素源であることを明らかにした。それは、大規模製造向けの長期的オプションとして見られるが、好適な大豆粉除去技術はまだ開発されていない。短期的には、及びより小規模の数キログラムの製造向けには、凍結乾燥単離された酵素を使用することが、その高費用が追加の大豆粉処理操作が不必要なことで相殺されることから、推奨される。

【0120】

後処理手続きは、高価なヘキサン及びＭｔＢＥ溶媒混合物を使用した乳濁液形成抽出から、未加工の生成物を単離するためのＭｔＢＥとの反応沈殿物の単純なスラリー化へと簡略化された。１０％溶液ではなく固体クエン酸を使用した反応混合物の酸性化が、反応体積を減少させることを助けた。

【0121】

より欠点のない反応プロファイルに起因して、カラム生成条件は、毒性ヘキサンをより安全なシクロヘキサンと置き換えながらも、消費される溶媒の量を減少させるように修正された。これは、溶媒蒸発中の処理時間の減少、ひいては生成物分解の関連リスクの減少という追加の利点を有する。溶液中、及び高温面への曝露に対する１５（Ｓ）−ＨＥＴｒＥの熱安定性の研究は、工場で典型的な溶媒条件下では、著しい分解が＜２日の時間規模で発生するはずがないことを示した。最終的に、＞１００ｋｇの大規模に向けた製造費用削減のために、カラムクロマトグラフィから、塩、共結晶、または他の誘導体の結晶化による精製に移行することが依然として望ましい。

【0122】

新しい処理方法は、酸素曝露、ひいては過酸化物及びそれに続く分解生成物の生成を減少させることを目指して、全ての好適な段階で不活性雰囲気下で材料を取り扱うことを含んでいた。得られる過酸化物値は、かくして、以前に得られた９０＋の値と比較して、１０〜１５の辺りである。安定性試験からの結果は、材料の初期品質が観察された安定性に好影響を与えたことを示唆する（エステルの形成は考慮せず）。

【0123】

精製された材料内の主な不純物（＞０．１０％面積）をＬＣ−ＭＳにより特定する試みは、それらが開始ＤＧＬＡから主に派生することを示唆する。自己エステル化生成物もまた、観察可能であり、その量は、より高い温度（＞−２０℃）で徐々に増加する。不純物特定の状況は、初期段階の臨床試験及び関連製造には十分である。

【0124】

現在設計されているようなプロセスは、いかなる重大な熱危険性も示さない―反応混合物が４０℃に達するときに、わずかな温度上昇が観察されるが、温度は０〜５℃の間に維持されるため、これは、安全なプロセススケールアップの障害にはならない。

【0125】

結論として、かくして、この研究プログラムから生じる開発されたプロセスは、ｃＧＭＰに従った安全かつロバストな初期段階の数キログラムのスケールアップ製造のための目的にかなっている。

【表16】

本件出願は、以下の構成の発明を提供する。
（構成１）
システインが還元剤として使用される、脂肪酸の１５−ヒドロキシ誘導体の生産のためのプロセス。
（構成２）
脂肪酸１グラム当り４００Ｍユニット未満が反応で使用される、構成１に記載の前記プロセス。
（構成３）
収率が、少なくとも約５０％である、構成１または構成２に記載の前記プロセス。
（構成４）
前記１５−ヒドロキシ誘導体が、１５（Ｓ）−ＨＥＴｒＥである、構成１〜３のいずれか一項に記載の前記プロセス。
（構成５）
前記脂肪酸を酸化して、１５−ヒドロペルオキシ脂肪酸中間体を形成することと、前記中間体を還元して、前記１５−ヒドロキシ誘導体を形成することとを含む、構成１〜４のいずれか一項に記載の前記プロセス。
（構成６）
前記１５−ヒドロキシ誘導体が、１５（Ｓ）−ヒドロキシエイコサペンタエン酸である、構成１〜５のいずれか一項に記載の前記プロセス。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】