特許 6660181 トリコデルマリーセイＱＭ６ａおよびその誘導体中の交配障害と関連する遺伝子／遺伝要素ならびにその同定方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6660181

(24)【登録日】2020年2月12日

(45)【発行日】2020年3月11日

(54)【発明の名称】トリコデルマリーセイＱＭ６ａおよびその誘導体中の交配障害と関連する遺伝子／遺伝要素ならびにその同定方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/15 20060101AFI20200227BHJP

   C12N 15/80 20060101ALI20200227BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/15

   C12N15/80 Z

【請求項の数】11

【全頁数】119

(21)【出願番号】特願2015-550064(P2015-550064)

(86)(22)【出願日】2013年12月23日

(65)【公表番号】特表2016-501549(P2016-501549A)

(43)【公表日】2016年1月21日

(86)【国際出願番号】EP2013077910

(87)【国際公開番号】WO2014102241

(87)【国際公開日】20140703

【審査請求日】2016年10月4日

【審判番号】不服2018-10154(P2018-10154/J1)

【審判請求日】2018年7月25日

(31)【優先権主張番号】12199606.0

(32)【優先日】2012年12月28日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】61/746,861

(32)【優先日】2012年12月28日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】512110525

【氏名又は名称】アーベー・エンザイムス・ゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】100075177

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 尚純

(74)【代理人】

【識別番号】100113217

【弁理士】

【氏名又は名称】奥貫 佐知子

(74)【代理人】

【識別番号】100080609

【弁理士】

【氏名又は名称】大島 正孝

(72)【発明者】

【氏名】クリスティアン・ピー・クビチェック

(72)【発明者】

【氏名】リタ・リンケ

(72)【発明者】

【氏名】ベルンハルド・セイボス

(72)【発明者】

【氏名】トマス・ハールマン

(72)【発明者】

【氏名】パトリック・ロレンツ

【合議体】

【審判長】 長井 啓子

【審判官】 中島 庸子

【審判官】 高堀 栄二

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

IPC C12N15/00-15/90

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＢＩＯＳＩＳ／ＣＡＰＬＵＳ／ＥＭＢＡＳＥ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

Ｕｎｉｐｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＭＡＴ１−２座を有するトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａ菌株またはその誘導菌株と交配する能力のないＭＡＴ１−１座を有するトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａ菌株またはその誘導菌株の交配障害を矯正するための方法であって、配列番号１３４の配列を持つ変異された遺伝子を、相当する機能的遺伝子を挿入することによって、補完することからなり、そして上記機能的遺伝子が配列番号：２１６、配列番号：２２６またはそれらの機能的に等しい配列よりなる群から選ばれ、上記機能的に等しい配列は配列番号：２１６または配列番号２２６の配列に対して少なくとも９５％の相同性を有し且つトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａ株またはその誘導株の交配障害を矯正する、上記方法。

【請求項2】

請求項１の方法によって得られた、トリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａの真菌性自己交配能力のある菌株。

【請求項3】

対象製品の工業的生産に使用するのに適したトリコデルマ（ハイポクレア）属の真菌株であって、請求項１の方法によって得られ且つ対象製品をエンコードする遺伝子によって形質転換されている真菌株。

【請求項4】

対象製品の工業的生産のためへの請求項３による真菌株の使用。

【請求項5】

対象製品が食品用酵素、飼料用酵素、技術用酵素、ホルモン、免疫グロブリン、ワクチン、抗菌性蛋白質または抗ウイルス性蛋白質から選ばれる請求項３に記載の真菌株。

【請求項6】

対象製品が食品用酵素、飼料用酵素、技術用酵素、ホルモン、免疫グロブリン、ワクチン、抗菌性蛋白質または抗ウイルス性蛋白質から選ばれる請求項４の使用。

【請求項7】

配列番号：２１６、配列番号：２２６の配列またはそれから誘導される機能的に等しい配列を有する、トリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａまたはその誘導菌株中の交配能力のために必須の遺伝子であって、上記機能的に等しい配列は、配列番号：２１６または配列番号２２６の配列に対して少なくとも９５％の相同性を有し且つトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａまたはその誘導株における交配障害と関連している、上記遺伝子。

【請求項8】

トリコデルマ リーセイＱＭ６ａの誘導菌株はＱＭ９１２３、ＱＭ９１３６、ＱＭ９４１４、ＭＧ４、ＭＧ５、ＲＵＴ−Ｃ３０、ＲＵＴ−Ｄ４、ＲＵＴ−ＮＧ１４、ＭＣＧ８０、Ｍ５、Ｍ６、ＭＨＣ１５、ＭＨＣ２２、Ｋｙｏｗａ Ｘ−３１、Ｋｙｏｗａ ＰＣ−１−４、Ｋｙｏｗａ ＰＣ−３−７、または、ＴＵ−６である、請求項１による方法。

【請求項9】

トリコデルマ リーセイＱＭ６ａの誘導菌株は、ＱＭ９１２３、ＱＭ９１３６、ＱＭ９４１４、ＭＧ４、ＭＧ５、ＲＵＴ−Ｃ３０、ＲＵＴ−Ｄ４、ＲＵＴ−ＮＧ１４、ＭＣＧ８０、Ｍ５、Ｍ６、ＭＨＣ１５、ＭＨＣ２２、Ｋｙｏｗａ Ｘ−３１、Ｋｙｏｗａ ＰＣ−１−４、Ｋｙｏｗａ ＰＣ−３−７、または、ＴＵ−６である、請求項２、３または５による菌株。

【請求項10】

トリコデルマ リーセイＱＭ６ａの誘導菌株は、ＱＭ９１２３、ＱＭ９１３６、ＱＭ９４１４、ＭＧ４、ＭＧ５、ＲＵＴ−Ｃ３０、ＲＵＴ−Ｄ４、ＲＵＴ−ＮＧ１４、ＭＣＧ８０、Ｍ５、Ｍ６、ＭＨＣ１５、ＭＨＣ２２、Ｋｙｏｗａ Ｘ−３１、Ｋｙｏｗａ ＰＣ−１−４、Ｋｙｏｗａ ＰＣ−３−７、または、ＴＵ−６である、請求項４による使用。

【請求項11】

トリコデルマ リーセイＱＭ６ａの誘導菌株はＱＭ９１２３、ＱＭ９１３６、ＱＭ９４１４、ＭＧ４、ＭＧ５、ＲＵＴ−Ｃ３０、ＲＵＴ−Ｄ４、ＲＵＴ−ＮＧ１４、ＭＣＧ８０、Ｍ５、Ｍ６、ＭＨＣ１５、ＭＨＣ２２、Ｋｙｏｗａ Ｘ−３１、Ｋｙｏｗａ ＰＣ−１−４、Ｋｙｏｗａ ＰＣ−３−７、または、ＴＵ−６である、請求項７による遺伝子。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は菌株トリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａまたはその誘導菌株の交配障害と関連する遺伝子／遺伝要素に関する。本発明は、さらにトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａおよびその誘導菌株中の交配障害と関連する遺伝子／遺伝要素を同定するための方法に関する。該方法は交配障害と関連する遺伝子／遺伝要素の速やかな且つ効率的な同定を可能とする。それ故、本発明は古典的な遺伝的手法による工業的生産者菌株を改良することを可能とするように、トリコデルマ リーセイを、改良され且つ平易化された菌株育成へ向けて処理するためのツールを開発するためのアプローチに関する。これは、菌株育成および維持におけるもう１つのツールを付加するに止まらず、トリコデルマ リーセイ（ハイポクレア ジェコリナ）の他の菌株から遺伝的形質を生産することおよび遺伝子の望ましくない実態変異および／または望ましくない遺伝子例えば抗生物質への抵抗性を与える遺伝子、マーカー遺伝子、副次的代謝、色素形成、望ましくない酵素等のための遺伝子から菌株を精澄にすることを可能とする。

【背景技術】

【0002】

糸状菌は細胞外蛋白質を高生産量で製造することができる。また、天然菌株中での有用な蛋白質の生産レベルは商業的開発のためにはあまりにも低すぎ、実質的な菌株改良計画を必要とすることになる（プント２００２）。工業的な糸状菌では、これは古典的な変異誘発および／または目標とする遺伝子操作によって、蛋白質エンジニアリングと組合せて、伝統的になされている。基本的に、このアプローチは菌を変異誘発源の半致死量に付し（よく用いられる：例えばＵＶ光による照射またはイオン化照射、ニトロソメチルグアニジン、エチルメタンスルホナートまたはエチジウム ブロマイドの如き化学的変異誘発物質の付加）そして続いて所望の製品を改良生産する生産菌をスクリーニングすることからなる。明らかに、このアプローチは選択された方法と同様なだけである。
トリコデルマ リーセイ（テレオモルフ ハイポクレア ジェコリナ）は酵素の工業的生産のための、便利で耐用性のある有機体である。ランダム突然変異源を用いて、学術的且つ工業的研究プログラムは、数１０年間に亘り、ソロモン島で１９４４年に米国軍テントキャンバス地から単離された“最初の”ティー リーセイ株ＱＭ６ａの酵素活性よりも数倍酵素活性が高いティー リーセイの菌株を製造していた（レクロムら２００９）。

【0003】

しかしながら、菌株改良のためにランダム突然変異源を用いる主な抑制は、明らかに、それが明確な目標とする遺伝子に作用するように方向付けできないという事実を生じるものである。突然変異はこのように利益をもたらしそして目標とする遺伝子を改良しあるいは崩壊させるだけでなく、他の遺伝子にも影響を与え、例えば菌株安定性、低減された生長速度あるいはアミノ酸および／またはビタミンへの栄養要求性に制限を起す、望まない二次的損失に導くことにもなる。組換え技術はねらう目標を導入することによってこれらの問題を解消するものの、それは未知のもしくは多様な遺伝子または大きなゲノムフラグメントにより引き起こされる複雑な遺伝的形質のためには不適当である。
セイル（Ｓｅｉｄｌ）ら（２００９）は、性的再生産を行う、トリコデルマ リーセイの能力を記載した最初であった。分類学的に、ティー．リーセイ（およびそのテレオモルフ エイチ、ジェコリナ）はアスコマイセテス（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）の族（ソルダリロマイセテス（Ｓｏｒｄａｒｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）綱）に属しそしてこの族内の雌雄異型である真菌類に属する。性的異質接合性とは異なる株や自家受精において成功裡の性的再生産が起るために必要な２つの交配型座ＭＡＴ１−１とＭＡＴ１−２が可能でないことを意味している。

【0004】

性的再生産の過程中に、ティー．リーセイは造のう器を含有する渦巻状あるいは種々の特色のある構造によって開始される子のう殻を製造する。造のう器は交配中に核を受け取りそして二核性菌糸系を製造する細胞である。渦巻き内の細胞の１つが造のう器として作用しそして残りが不活性のままであるかあるいは全構造を取り囲むように分岐し且つ増殖する菌糸を生み出す。多くの場合、隣り合う菌糸は、同様に渦巻を包み込むように携わる。これらの取り囲んでいる菌糸は子のう殻の壁すなわち殻壁を形成するようにいずれ統合する（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂｓｉｔｅ．ｎｂｍ−ｍｎｂ．ｃａ／ｍｙｃｏｌｏｇｙｗｅｂｐａｇｅｓ／ＮａｔｕｒａｌＨｉｓｔｏｒｙＯｆＦｕｎｇｉ／ＳｏｒｄａｒｉｏｍｙｃｅｔｅｓＤｉｓｃｕｓｓｉｏｎ．ｈｔｍｌ）（図３）。
ティー．リーセイにおける子のう殻の形成が起り、子のう果形成が造のう器の受精とともに始まるという子のう処女膜的意味である。始原体は引き続き生殖力のある、子のう遺伝子の多い菌糸から直接真の子実層へと分化する。処女膜的発育は、このように、生殖力のある菌糸の受精と分化で始まり、子のう果の発育に続く。子座（子実体）は、それ故、性的再生中雌として作用するパートナーによって形成される。

【0005】

今日、産業で用いられるティー．リーセイの全株は、全て、ＱＭ６ａの株が有しているのと同じように、ＭＡＴ１−２座を有しているＱＭ６ａに戻って追跡することができる。異なる産業的株を好ましい特性を導入することによりさらに改良するために、あるいは例えば抗生物質への抵抗性を生み出す遺伝子や規定された要求にその存在が邪魔になる望ましくない生成物をコードする遺伝子の如き遺伝子や望ましくない遺伝子との交雑からの株を取り除くために、お互いと交配することは現在のところ可能ではない。
異なるティー．リーセイ突然変異体株を交配する非可能性を解消しうる可能性は、交配型座を同じゲノム座における反対の座によって交換することであろう。ティー．リーセイ ＱＭ６ａの場合、これはＭＡＴ１−２座をＭＡＴ１−１座と交換することを意味する。

【0006】

カン（Ｋａｎｇ）ら（１９９４）は、ＭＡＴ座が交換されたマグナポルテ グリシア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）の株は、反対の交配型の株（すなわち、ＭＡＴ１−２座がＭＡＴ１−１座で交換された株は元のＭＡＴ１−２保持株と交配するとき結実能力があった）と交配するとき結実能力があったことを示している。交配型座の成功裡の交換はニューロスポラ クラサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）（チャン（Ｃｈａｎｇ）、１９９４）についても記載されている。
特許文献１は糸状真菌株の性的挙動を改善するために交配型スウィッチングを使用することに関する。アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）を、雌雄異型真菌すなわち２つの反対の交配型を持つ１つまたはそれ以上の株の組合せをもたらす反対の交配型を持つ糸状真菌体への形質転換するように、アスペルギルス ニガーとアスペルギルス トゥビジェンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）の交配型の同定を開示している。

【0007】

セイル（Ｓｅｉｄｌ）ら（２００９）は、ティー．リーセイ株ＱＭ６ａ中に補完的交配型座（ＭＡＴ１−１）を異所的に導入しそれによって交配型座（ＭＡＴ１−１とＭＡＴ１−２）の両方を保持する株を作成した。この株はＭＡＴ１−１またはＭＡＴ１−２のいずれかを保持するティー．リーセイ テレモルフ エイチ．ジェコリナの天然型株と交配して結実する能力があった。しかしながら、株ＱＭ６ａおよびその誘導体（全てＭＡＴ１−２）との交配ではこの菌株は結実する能力がないことが見い出された。
これらの結果−両方の交配型を保持するＱＭ６ａ株はエイチ．ジェコリナのＭＡＴ１−１とＭＡＴ１−２株と子実体を形成することができるがＱＭ６ａとはそうではない−から、ティー．リーセイ ＱＭ６ａは雄性パートナーとして作用しうるが子実体を製造することができず、それ故雌性結実能力を有さないと結論される。恐らく、交配能力を維持するための選択的加圧操作なしに、６０年間以上も実験室で保持されたことが、性的再結合に必要な遺伝子の１つまたはそれ以上に突然変異をもたらしたものと思われる。

【0008】

このように、トリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａ株の該交配障害に関連する遺伝子の速やかな且つ効率的な同定を可能とする方法の必要性が従来技術には存在している。これまで、トリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａのゲノム中の交配障害と関連する遺伝子は今まで同定されたことも、特徴づけられたこともなかった。この理由は、主に性的交配を用いる古典的遺伝子的アプローチはその自家不妊性によりトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａについては確立されなかったという事実によるものである。さらに、どの遺伝子がＱＭ６ａの自家不妊性に寄与あるいは原因となっているのかは知られていなかった。これまで、ＱＭ６ａのゲノム（３４．１Ｍｂｐ）中の９１４３のアノテートされた（ａｎｎｏｔａｔｅｄ）遺伝子のどれがその自家不妊性と関連するのかは全く知られていない。ティー．リーセイ ＱＭ６ａの遺伝子はマルチネス（Ｍａｒｔｉｎｅｚ）ら（２００８）に発表されている。ティー．リーセイ核酸配列および注釈データはアクセションナンバーＡＡＩＬ ００００００００で遺伝子バンク（ＧｅｎＢａｎｋ）に寄託されている。
本発明者は、最近、ＱＭ６ａのＭＡＴ１−２座を、同じゲノム位置で、反対の交配型（ＭＡＴ１−１）で局所的に置き換えたが、ティー．リーセイ ＱＭ６ａ誘導ＭＡＴ１−２株で、得られたＭＡＴ１−１株を交配することは、自家不妊性を実験で明らかにすることでは成功しなかった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】国際公開第２０１１／０９５３７４号パンフレット

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

それ故、本発明の目的は、ティー．リーセイ ＱＭ６ａ株およびその誘導体の交配障害に関連する遺伝子／遺伝要素を同定し且つ提供することにある。

【0011】

本発明のさらに他の目的は、ティー．リーセイ ＱＭ６ａの交配障害と関連する遺伝子の速やかな且つ効率的な同定をするための方法を提供することにある。本発明のさらに他の目的は、トリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａおよびその誘導体の交配能力を回復するための方法を提供することにある。本発明のさらに他の目的は、ティー．リーセイ ＱＭ６ａおよびその誘導体の交配能力のある形態を提供することにある。本発明の他の目的は、トリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａおよびその誘導体の遺伝子情報を性的に組み換える方法を提供することにある。本発明のさらに他の目的は性的サイクルを有するトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａ株またはその誘導株を製造することにある。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明者らは驚くべきことにトリコデルマ リーセイ株ＱＭ６ａまたはその誘導株の交配障害は当該有機体の限定された遺伝子／遺伝要素および限定された遺伝子／遺伝要素における変異によって起こされそして該変異を修正もしくは除去することによって、すなわち該当する遺伝子／遺伝要素を機能的相対物で置き換えるかあるいは完全にもしくは部分的に欠如している遺伝子／遺伝要素を挿入することによって、修正されることを見い出した。該遺伝子／遺伝要素の機能的相対物はトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａの交配能力を回復する遺伝子または遺伝要素である。該能力は、第３表に記載されているとおり、遺伝子または遺伝要素が交配過程でその機能を発揮するような程度にまで変異を修正することによって該遺伝子／遺伝要素に付与される。好ましくは、それぞれの遺伝子／遺伝要素の全ての変異が修正される。

【0013】

さらに、トリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａ株またはその誘導株に対し、戻し交配の技術がトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａまたはその誘導株における交配障害（雌性不妊遺伝子）と関連する遺伝子または遺伝要素を同定するために有利に用いられることも見い出された。加えて、ある遺伝子における変異はトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａにおける交配障害と関連していることが判った。変異は単純ポイント変異、挿入もしくは除去であり、それによって除去は存在する遺伝子内の除去あるいは遺伝子／遺伝要素それ自体の完全なもしくは部分的な除去であることができる。
上記遺伝子もしくは遺伝要素情報はトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａの交配障害に役に立つかあるいは交配障害を−単独でまたは組合せで−引き起す理由となる。このように、該遺伝子／遺伝要素／遺伝情報は該有機体の交配障害と直接あるいは間接的に関連している。

【0014】

トリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａおよびその誘導株の交配障害と直接関連する遺伝子／遺伝情報は、一般に、機能性の完全なもしくは部分的欠如が該当する有機体と交配したとき子実体の生成を低減もしくは完全に喪失させる遺伝子である。用語“交配障害（ｍａｔｉｎｇ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）”は、損なわれたあるいは低減された交配能力の全ての度合に関係するものである。低減された交配能力は、生存可能な子のう胞子を持つ成熟した子実体が見られるまで、実質的に延長された時間見られる。該当する遺伝子および／または遺伝要素は、例えば成功裡の交配のために必要なフェロモン受容体をエンコードする遺伝子あるいは器官をエンコードする遺伝子の如き、トリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａおよびその誘導体の交配能力に直接影響する器官または代謝機序に直接影響を与える。遺伝要素は、蛋白質に翻訳されないが、トリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａまたはその誘導株の交配挙動に直接あるいは間接的に関連する遺伝情報を包含してなる。該遺伝情報は蛋白質の表現の制御または統制のために必要である。遺伝要素はプロモーター、エンハンサー、アクティベーター、レギュレーターもしくは表現制御配列であることができる。

【0015】

トリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａおよびその誘導株の交配障害と間接的に関連する遺伝子／遺伝要素は、該有機株の交配障害と直接関連しないが、トリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａおよびその誘導体が該当する有機体と交配する能力に間接的に影響する形態学的構造や代謝機序に関係する遺伝子である。例えば菌糸細胞壁構造や菌糸分岐と関連する遺伝子の変異はトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａおよびその誘導株の交配能力に間接的に影響を与える。該遺伝子の機能は該遺伝子によってエンコードされる蛋白質によって遂行される。該遺伝子／遺伝要素は相当する蛋白質の表現や制御のためにも必要である（例えばプロモーター、エンハンサー、アクティベーター、レギュレーター、イニシエーター、表現制御配列の蛋白質）。

【0016】

＜発明の要旨＞
それ故、本発明は、トリコデルマ リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ＱＭ６ａの菌株またはその誘導菌株の交配障害に関連する遺伝子／遺伝要素を同定するための方法であって、下記工程
ａ）ＭＡＴ１−２座を有するトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａ菌株またはその誘導菌株である第１菌株を用意し、
ｂ）該菌株を、相補的ＭＡＴ１−１座を有するトリコデルマ リーセイ（ハイポクレア ジェコリナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａ））菌株の交配能力のある菌株である第２菌株と、性的に交配させ、
ｃ）ｂ）の交配からのＭＡＴ１−１子孫またはその戻し交配体を、第１トリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａ菌株またはその誘導菌株と実質的に同じであるが、ＭＡＴ１−１座を有しそしてトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａまたはそのＭＡＴ１−２子孫と交配するための交配能力のある菌株が得られるまで、ａ）の第１菌株と繰返し戻し交配させ、
ｄ）ＭＡＴ１−２座を有するトリコデルマ リーセイ（ハイポクレア ジェコリナ）と交配するための交配能力のある、工程ｃ）からの子孫を選択し、そして
ｅ）工程ｄ）で選択された子孫のゲノムをａ）の第１菌株のゲノム配列と比較することにより交配障害と関連する遺伝子／遺伝要素を同定し、それによって該遺伝子／遺伝要素が変異形態中にあるいは第１菌株に削除および／または挿入のある形態中に完全にもしくは部分的に欠損するかあるいは存在しかくしてトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａの菌株またはその誘導菌株中の交配障害と直接または間接的に関連する遺伝子または遺伝要素であることを同定する、
からなる上記方法に関する。

【0017】

本発明は、さらに、上記特徴ｅ）により同定される交配障害と関連する遺伝子／遺伝要素に相当する交配能力のある菌株の機能的遺伝子および／または遺伝要素を、ＭＡＴ１−１座を有するトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａまたはその誘導菌株中に挿入しそして該菌株を、ＭＡＴ１−２座を有するトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａまたはその誘導菌株と交配する工程をさらに含み、それによってＭＡＴ１−１座を有し且つ上記のとおり同定された遺伝子／遺伝要素を挿入されたトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａまたはその誘導株による子実体の形成が該遺伝子／遺伝要素の該交配障害との直接関連を示している、上記に記載の方法に関する。

【0018】

本発明は、さらに、上記特徴ｅ）により同定された交配障害と関連する遺伝子／遺伝要素に相当する機能的遺伝子および／または遺伝要素と関連する交配能力のある表現型（フェノタイプ）を同定するための方法であって、
ａ）交配能力のあるトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａ ＭＡＴ１−１株を準備し、ｂ）上記機能的遺伝子または遺伝要素を非機能的とし、そしてｃ）該トリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａ ＭＡＴ１−１菌株の交配能力を測定する、
ここで、該トリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａ ＭＡＴ１−１菌株の陽性交配能力は交配能力のある表現型にとって、該遺伝子または遺伝要素が必須でないことを示しており、そして該トリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａ ＭＡＴ１−１菌株の陰性交配能力は交配能力のある表現型にとって該遺伝子または遺伝要素が必須であることを示している、上記方法に関する。

【0019】

さらに、本発明は、交配能力のないトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａ株またはその誘導株の自己交配能力を回復する方法であって、交配障害と関連する、１つまたはそれ以上の変異されたあるいは完全にもしくは部分的に欠如している遺伝子が相当する機能的遺伝子によって置換されるかあるいは補完される、上記方法に関する。本発明は、上記の方法によって得られたまたは得られ得るトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａまたはその誘導菌株の自己交配能力のある菌株に関するものでもある。
本発明は、さらに、対象製品の工業的生産に使用するのに適したトリコデルマ（ハイポクレア）属の真菌株であって、上記株はトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａおよびその誘導株であり、そして交配能力が上記のようにして修正され且つ対象製品をエンコードする標的遺伝子および／または遺伝子によって形質転換されている真菌株に関する。
さらに、本発明は、上記方法によって得られた、トリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａの株中の交配障害と関連し、同封したシーケェスリスティングの配列の配列番号：８〜１５５および配列番号：１６３〜１７４の配列を有する遺伝子／遺伝要素ならびに同じ機能が遂行される限り、遺伝コードの縮退、相同性および／または同一性による該配列に関連する配列に関する。

【0020】

本発明は、同様に、交配能力に関して機能的遺伝子であり且つトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａの雌性不妊性を回復するに好適な、天然型有機体ハイポクレア ジェコリナに相当する遺伝子に関する。
特に、本発明は、配列番号：８〜１５５および配列番号：１６３〜１７４の機能的対応物すなわち第３表に記載された変異株の少なくとも１つおよび好ましくは全てが修正された配列番号：８〜１５５の配列に関する。本発明は、さらに、該修正された遺伝子の変異体および変異株ならびに交配能力が維持される限りにおいて、配列番号：１６３〜１７４の欠損遺伝子の変異体および変異株に関する。変異体および変異株は沈黙および非沈黙変異、挿入、削除または配列付加を包含する。変異は好ましくは保守的変異である。
本発明は、同様に、ハイポクレア ジェコリナの該遺伝子の機能的対応物に関する。但し、該遺伝子はトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａの雌性不妊性を回復する能力をまだ有しているものとする。該機能的対応物は、不妊性を授ける変異のみが修正された遺伝子である。
本発明は、特に配列番号：４０、配列番号：１１０、配列番号：１１２および配列番号：１３４を有する遺伝子の機能的対応物すなわち配列番号：２１６、配列番号：２１８、配列番号：２２０および配列番号：２２２またはこれから誘導される機能的に等価の配列に関する。

【0021】

＜本発明の説明＞
該遺伝子の配列および推定的にエンコードされる蛋白質自体は知られておりそしてマルチネス（Ｍａｒｔｉｎｅｚ）ら（２００８）により発表されているが、それらのいずれの交配障害に関する機能もこれまでに説明されてはいない。さらに、該遺伝子の配列は配列リストおよび相当する遺伝子へのさらなるリンクに特定されているとおりのアクセス番号でＮＣＢＩデータベースから取り出すことができる。配列番号：２６、７２、８２、８４、９４、９６、１００、７０、１０６、１２０、１３０、１４０および１５４が新たにアノテートされた。さらに、該遺伝子の変異は該有機体の交配障害特に雌性不妊性と関連していることは今まで知られていなかった。しかしながら、該データベースから、該配列はトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａまたはその誘導株における変異された配列であり、該有機体の交配能力の部分的もしくは完全な欠損と関連しておりそしてその遺伝子を機能的遺伝子によってどうのようにして置換するかとういことは明らかではない。

【0022】

しかしながら、同定された遺伝子がトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａにおける交配障害と関連していることは知られていなかった。変異、挿入および削除により、該遺伝子がトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａの交配障害と関連することがさらに見い出された。該遺伝子を非変異のおよび／または完全な形態で置き換えることはトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａの交配不能性を修正して性的交配によってＱＭ６ａの工業的に重要な株の生産を可能にすることになる。かくして、本発明者は、ティー．リーセイ ＱＭ６ａ ＭＡＴ１−１の不能性をティー．リーセイ ＱＭ６ａ ＭＡＴ１−２と交配して修正する遺伝子を見い出した。本発明者は、変異された形態であると考えられている現在存在する形態では、該有機体の交配障害と関連している、トリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａにおける遺伝子の位置を突き止めることを可能とした。本発明者は、さらにトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａは、その存在が交配能力と関連しそしてその完全なあるいは部分的欠損が交配障害と関連する、幾つかの遺伝子を欠損していることを見い出した。該交配障害は、トリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａがティー．リーセイＭＡＴ１−１有機体と交配する能力の完全なあるいは部分的な欠損の形態と関係し、特に該有機体の雌性不妊性と関係する。このように、該遺伝子はトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａの株における雌性不妊性と関連する遺伝子として考えられている。該遺伝子を、上記方法の最終的交配能力子孫の相当する遺伝子と比較すると、相当する機能的遺伝子を取り出すことができる。該比較は、どの遺伝子の違いまたは遺伝子の欠損が該有機体の観察された交配障害と関連しているかを明らかにする。このように、交配能力、特に雌性交配能力と関連する遺伝子は、それぞれ交配障害および雌性不妊性と関連する、ティー．リーセイ ＱＭ６ａの相当する遺伝子を修正するためのテンプレートとして用いられる。

【0023】

用語“交配障害”はトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａおよびその誘導体の相当する有機体と交配する能力障害のいかなる形態とも関連している。交配障害はトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａまたはその誘導体の完全なもしくは部分的な交配障害である。好ましくは、交配障害は、トリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａまたはその誘導株の雌性不妊性に関係する。交配障害は、図３に示されているように子のう菌類の性的サイクルの部分もしくは構造、例えば受精、精子形成あるいは性決定における欠損に関連する。
上記同定した遺伝子および／または遺伝要素はトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａの株またはその誘導株における交配障害と直接あるいは間接的に関連している。これは、該遺伝子および／または遺伝要素がそれぞれの交配障害のタイプについて寄与しているかあるいは原因となっていることを意味している。同じことが遺伝子の変異型における変異、挿入または削除についてもいえる。機能的型からの該違いは交配障害の原因となっているかあるいはそれに寄与しているかのいずれかである。
このように、本発明は、トリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａ株における交配障害と関連していると同定された遺伝子／遺伝要素配列番号：８〜１５５および配列番号：１６３〜１７４に関する。掲載配列表の配列番号：８〜１５５の配列は変異された配列と考えられそして第３表に示された該配列の変化、挿入およびまたは削除は改良された交配能力と関係している。

【0024】

本発明は、さらにハイポクレア ジェコリナに存在するだけであり、トリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａにその対応物を持たない、配列番号：１６３〜１７４の遺伝子／遺伝要素に関する。該配列およびトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａの交配障害に対するそれらの寄与は以前は知られていなかった。該遺伝子配列に関する本発明によるさらなる機能的内包は第４表に示されている。
上記遺伝子はトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａの全交配能力を回復するために相当する機能的遺伝子によって修正されあるいは単独でもしくは組合せで置換される。相当する完全に機能的な対応物は天然型ハイポクレア ジェコリナＭＡＴ１−１に存在し、そしてトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａ ＭＡＴ１−２の同定された遺伝子および／または遺伝要素の配列を、それぞれトリコデルマ リーセイＣＢＳ １／Ａ８ ０２、ＭＡＴ１−１、トリコデルマ リーセイＣＢＳ２／Ａ８−１１または天然型ハイポクレア ジェコリナＭＡＴ１−１の相当する遺伝子および／または遺伝要素の配列と比較することによって知られる。配列は、それ自体公知の方法によって遺伝子を配列させることで提供される。配列番号：１６３〜１７４によるトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａに欠如している遺伝子は、トリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａの交配能力を回復するために単独であるいは組合せで挿入される。該遺伝子の挿入は、変異、挿入または削除の上記修正と組合せてもよい。

【0025】

好ましくは、下記遺伝子が相当する非変異／完全遺伝子で置換され／補完される：配列番号：１６、配列番号：５０、配列番号：７０、配列番号：８６、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：１０６、配列番号：１２０、配列番号：１２８、配列番号：１６３、配列番号：１６５、配列番号：１６９、配列番号：１７１。修正され／補完されるべき遺伝子のためのさらに好ましい群は配列番号：８、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３２、配列番号：１３４、配列番号：１５０、配列番号：１５２、配列番号：１８、配列番号：１４、配列番号：１２６、配列番号：１３０、配列番号：１５４、配列番号：１６７、配列番号：１６８、配列番号：１７３および配列番号：１７４である。
さらに、好ましくは、下記遺伝子が相当する非変異／完全遺伝子で置換され／補完される：配列番号：３６、配列番号：４０、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６６、配列番号：６８、配列番号：７２、配列番号：８２、配列番号：９２、配列番号：１００、配列番号：１１０、配列番号：１１２、配列番号：１１８、配列番号：１２０、配列番号：１２２、配列番号：１２４、配列番号：１３４、配列番号：１３８、配列番号：１４４、配列番号：１４６、配列番号：１４８および配列番号：１５２。
もっと好ましくは、下記遺伝子が相当する非変異／完全遺伝子で置換され／補足される：配列番号：４０、配列番号：１１０、配列番号：１１２および配列番号：１３４。
交配能力と関連するさらに好ましい配列は、配列番号：２２４、配列番号：２２６、配列番号：２２８または配列番号：２３０である。

【0026】

本発明は、特に、トリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａまたはその誘導体の交配能力に必要とされる下記遺伝子に関する：配列番号：２１６、配列番号：２１８、配列番号：２２０および配列番号：２２２。
本発明は、同様に、該配列の機能的等価配列例えば遺伝コードの縮退による関連した配列または該配列にある程度の相同性例えば８０％、好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％〜９８％の相同性を有する配列に関する。
本発明は、さらに、トリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａの株またはその誘導株における交配障害と関連すると同定された修正遺伝子／遺伝要素によってエンコードされるポリペプチドに関する。
特に、本発明は、配列番号：２２０の核酸８８８〜２７９０、配列番号：２１８の核酸１２６３〜２７２６、配列番号：２２２の核酸９９０〜３１０７または配列番号：２１６の核酸９１９〜６０３９によってエンコードされるポリペプチドに関する。該ポリペプチドは、交配能力と関連しておりそして配列番号：２２１、２１９、２２３および２１７に相当している。本発明は、同様に、交配能力と関連しそして配列番号：２２０のコード配列、配列番号：２１８のコード配列、配列番号：２２２のコード配列または配列番号：２１６のコード配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％の配列同一性程度を有するポリペプチドに関する。但し、この場合変異の修正が維持され且つ配列は交配能力と関連しているものとする。

【0027】

配列同一性程度は、好ましくは比較と関係し且つ他の配列の“相当する”対応物を有する、より短い配列の残りの数が決定されるようなやり方で決められる。本発明の目的のためには、同一性は好ましくは通常の計算法を用いて通常のやり方で決定される。本発明によれば、それぞれの感熟蛋白質のｃＤＮＡ類またはアミノ酸のみが比較のために用いられる。同様に、好ましい同一配列対応物は公知のコンピュータープログラムによる同一配列として本発明により決定される。そのようなプログラムの例は、プログラム パート アライン プラス（Ａｌｉｇｎ Ｐｌｕｓ）を包含しそして米国ノースカロライナ州、ダラム（Ｄｕｒｈａｍ）のサイエンティフィック アンド エデュケーショナル ソフトウェア社から配布されているクローン マネージャー スイート（Ｃｌｏｎｅ Ｍａｎａｇｅｒ Ｓｕｉｔｅ）がある。上記したような２つのＤＮＡ配列またはアミノ酸配列の比較は、それ故、ＦａｓｔＳｃａｎ−ＭａｘＳｃｏｒｅ法によるかまたはＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｈ法によって、デフォルト値を維持しつつ、選択局所整列化（ｏｐｔｉｏｎ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）の下で実施される。“２つの配列の比較／局所迅速走査−マックススコア／ＤＮＡ配列の比較（Ｃｏｍｐａｒｅ Ｔｗｏ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／Ｌｏｃａｌ Ｆａｓｔ Ｓｃａｎ−ＭａｘＳｃｏｒｅ／ｃｏｍｐａｒｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）”またはアミノ酸については“２つの配列の比較／グローバル／アミノ酸としての配列の比較（Ｃｏｍｐａｒｅ Ｔｗｏ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／Ｇｌｏｂａｌ／Ｃｏｍｐａｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｓ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ）”機能を備えた、プログラム・バージョン“クローン マネージャー ７アライン プラス５（Ｃｌｏｎｅ Ｍａｎａｇｅｒ ７ Ａｌｉｇｎ Ｐｌｕｓ ５）”が本発明による同一性を計算するのに特に使用された。次の文献から入手できる計算法がここでは用いられた：ヒルシュバーグ、ディー．エス（Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ，Ｄ．Ｓ．）１９７５、最大の共通サブ配列を計算するための線形空間計算法（Ａ ｌｉｎｅａｒ ｓｐａｃｅ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ｍａｘｉｍａｌ ｃｏｍｍｏｎ ｓｎｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）、Ｃｏｍｍｕｎ Ａｓｓｏｃ Ｃｏｍｐｕｔ Ｍａｒｃｈ １８：３４１−３４３；メイヤー，イー．ダブル（Ｍａｙｅｒ，Ｅ．Ｗ．）およびダブル．ミラー（Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ）１９８８、線形空間における最適な整列化（Ｏｐｔｉｏｎａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ ｉｎ ｌｉｎｅｎｒ ｓｐａｃｅ）ＣＡＢＩＯＳ ４：１、１１−１７；チャオ．ケーエム（Ｃｈａｏ，Ｋ−Ｍ）、ダブル．アール．パーソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）およびダブル．ミラー（Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ）１９９２、特定の対角帯内の２つの配列の整列化（Ａｌｉｇｎｉｎｇ ｔｗｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ ｄｉａｇｏｎａｌ ｂａｎｄ）ＣＡＢＩＯＳ ８：５、４８１−４８７。

【0028】

本発明はさらに、交配能力と関連する上記したポリペプチドの付加分子および／または削除分子に関する。このように、本発明による交配能力と関連されるポリペプチドはＮ−末端および／またはＣ−末端にさらなる配列を付加することによって長鎖とされる。かくして得られたアミノ酸配列は、依然として交配能力を有している。
交配能力と関連されるポリペプチドの配列セグメントは修正された変異が維持される限りにおいて本発明により削除されてもよい。変異・長鎖化および短鎖化はそれ自体公知の方法でおよび当該技術分野で周知の方法の助けを借りて実施される。
このような変化体の製造は当該技術分野で一般に知られている。例えばポリペプチドのアミノ酸配列変化体はＤＮＡにおける変異によって製造することができる。核酸配列における変異や変化のための方法は当該技術分野において周知である（例えばトミック（Ｔｏｍｉｃ）ら、ＮＡＲ、１８；１６５６（１９９０）、ギーベル（Ｇｉｅｂｅｌ）とスプルティス（Ｓｐｒｔｉｚ）ＮＡＲ、１８：４９４７（１９９０）参照）。

【0029】

対象としている蛋白質の生物活性に負の影響を与えない適切なアミノ酸置換体の詳細は、デイホフ（Ｄａｙｈｏｆｆ）ら、蛋白質配列と構造の地図（Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）Ｎａｔｌ，Ｂｉｏｍｅｄ，Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，ワシントン ディー．シー．（１９７８）によるモデル中に見つけられる。アミノ酸を同様の性質を持つ他の１つで置換するような保存的置換が好ましい。これらの置換は同時に４つのサブグループを備えた２つの主グループに分割されてもよく、各サブグループにおける置換は、蛋白質の活性あるいは折りたたみに好ましくは影響を与えない保存的置換といわれる。

【0030】

【表1】

【0031】

本発明は、さらに、トリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａ株またはその誘導株における交配障害と関連するとして同定された遺伝子／遺伝要素の修正されたＤＮＡ配列に関する。特に、本発明は核酸８８８〜２７９０、または配列番号：２２０のコード用配列、核酸１２６３〜１４７６または配列番号：２１８のコード用配列、核酸９９０〜３１０７または配列番号：２２２のコード用配列あるいは核酸９１９〜６０３９または配列番号：２１６のコード用配列を有するかまたは含有してなる。

【0032】

さらに、特許請求された核酸配列および特許請求されたその部分と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％の相同性を含むこれらの配列が開示されている。但し、相当する配列が交配能力と関連しておりしかも変異の修正が維持されているものとする。好ましくは、相同性は７０〜１００％、さらに好ましくは８０〜１００％、最も好ましくは９０〜１００％である。相同性は同一性の程度として定義される。この目的のために、同一性の程度は、好ましくはこの比較に加わり且つ他の配列中に“相当する”補体を有する比較的短い配列の残りの数が決定されるやり方で定義される。相同性は、好ましくは、通常の計算法を用いる通常の方法によって決定される。相当する成熟蛋白質のｃＤＮＡのみがこの比較のために考慮される。同様に、好ましくは、同一配列補体が公知のコンピュータープログラムによって相同配列として決定される。そのようなプログラムの例は、プログラム パート アライン プラス（ｐｒｏｇｒａｍ ｐａｒｔ Ａｌｉｇｎ Ｐｌｕｓ）を含みそして米国ノースカロライナ州、ダラムのサイエンティフィック アンド エデュケーショナル ソフトウェア社によって配布されている、クローン マネージャー スイートである。この目的のために、上記定義されたとおり、２つのＤＮＡ配列の比較が、デフォルト値を維持しつつ、ＦａｓｔＳｃａｎ−ＭａｘＳｃｏｒｅ法を介するかまたはＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｈ法を介する選択局所整列化の下で、引き起こされる。本発明によれば、“２つの配列の比較／局所迅速走査−マックススコア／ＤＮＡ配列の比較”機能を備えたプログラムバージョン“クローン マネージャー ７ アライン プラス ５”が相同性の決定のために特に用いられた。この目的のために、次の文献で入手可能な計算法が用いられた：ヒルシュバーグ，ディー．エス．（１９７５）最長の共通サブ配列を計算するための線形空間計算法、Ｃｏｍｍｕｎ Ａｓｓｏｃ Ｃｏｍｐｕｔ Ｍａｃｈ １８：３４１−３４３；メイヤー，イー．ダブルとダブル．ミラー（１９８８）線形空間における最適な整列化、ＣＡＢＩＯＳ４：１、１１−１７；チャオ、ケーエム、ダブル．アール、ピーソンとダブル．ミラー（１９９２）特定の対角帯内の２つの配列の整列化、ＣＡＢＩＯＳ８：５、４８１−４８７。

【0033】

本発明は、さらに、遺伝コードの縮退のために、本発明による配列およびその対立遺伝子変異に関係するＤＮＡ配列に関する。遺伝コードの縮退は自然縮退により起るあるいは特に選ばれたコドンの使用による。自然対立遺伝子変異は、例えばポリメラーゼ チェイン リアクション（ＰＣＲ）やハイブリッド形成法の如き分子生物学のよく知られた方法を用いて同定される。

【0034】

本発明は、また交配能力と関連しておりそして配列の変異、改質又は変化を包含する交配障害性変異の修正を維持するＤＮＡ配列に関する。さらに、本発明は、上記した配列とリラックスしたまたは厳しい条件下でハイブリダイズする配列に関するものでもある。次の条件は厳しいと考えられる：デキストランサルフェート溶液（ジーンスクリーンプラス、デュポン社）中６５℃、１８時間ハイブリッド化、続いて、フィルターの洗滌３０分間、それぞれ６５℃で最初に６×ＳＳＣ、２度２×ＳＳＣ、２度２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳそして最後に０．２×ＳＳＣ（薄膜移動と検出法、アメルシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））
トリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａから誘導される株は、例えば、ティー．リーセイ ＱＭ６ａから１つまたは引き続く複数の工程で慣用の突然変異誘発（ＵＶ、ガンマ線照射、ニトログアニジン処理およびその他）の如きそれ自体公知の技術あるいは組み換え技術によって誘導された株であり、例えば当業者に知られているＱＭ９１２３、ＱＭ９１３６、ＱＭ９４１４、ＭＧ４、ＭＧ５、ＲＵＴ−Ｃ３０、ＲＵＴ−Ｄ４、ＲＵＴ−Ｍ−７、ＲＵＴ−ＮＧ１４、ＭＣＧ７７、ＭＣＧ８０、Ｍ５、Ｍ６、ＭＨＣ１５、ＭＨＣ２２、Ｋｙｏｗａ Ｘ−３１、Ｋｙｏｗａ ＰＣ−１−４、Ｋｙｏｗａ ＰＣ−３−７、ＴＵ−６およびその他である。該株はＣＢＳ、ＡＴＣＣ，ＤＳＭＺの如き公知の微生物保存機関から得ることができる。

【0035】

支配障害と関連する遺伝子を同定するための本発明の方法では、ＭＡＴ１−２座を持つトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａまたはその誘導株である最初の親株が準備される。該株は相補ＭＡＴ１−１座を有するトリコデルマ リーセイ（ハイポクレア ジェコリナ）の交配能力のある株である第２株と交配される。該株はＣＢＳ（微生物培養中央局）あるいはＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション）の如き国際的培養物集積機関から、ＭＡＴ１−１対立因子を持ちそしてティー．リーセイ ＱＭ６ａおよびその誘導体と、またはＭＡＴ１−２対立因子を持つ他のエイチ．ジェコリナ株と交配されたとき、繁殖力のある子実体を形成するためのハイポクレア ジェコリナ（ティー．リーセイのテレオモルフ）天然形単離体を選択することによって得られた。繁殖力のある子実体の形成は、このようにして得られた子のう胞子が発芽するかどうかをチェックするなどの簡単なテストによってチェックすることができる。該株の好ましい例はＣＢＳ９９９．９７ ＭＡＴ１−１株またはドルチニナ（Ｄｒｕｚｈｉｎｉｎａ）らにより２０１０にリストされたものの如き他の交配能力のあるＭＡＴ１−１トリコデルマ リーセイ（ハイポクレア ジェコリナ）株である。

【0036】

交配用パートナーとしてＱＭ６ａ／ＭＡＴ１−２を用いて成功裡に性的再生産を行うことが可能なＱＭ６ａ／ＭＡＴ１−１株を得るために、ＱＭ６ａ／ＭＡＴ１−１株は、ティー．リーセイ ＱＭ６ａ／ＭＡＴ１−２株の交配障害と関連して同定された遺伝子の機能的変異物を含有するプラスミドを用いて形質転換される。陽性形質転換体はティー．リーセイ ＱＭ６ａ ＭＡＴ１−２との交配用試験に付される。交配は、繁殖力のある子実体の形成によって証明された。それらの繁殖力は子のう胞子を単離しそしてそれが発芽しそして菌糸体に生育することで、対立する交配用パートナーと交配することが可能であることを示すことによって試験された。
特に、修正された候補遺伝子およびティー．リーセイ ＱＭ６ａ／ＭＡＴ１−２株（ＡＴＣＣ１３６３１）で補完されたティー．リーセイ ＱＭ６ａ／ＭＡＴ１−１の陽性形質転換体は、トリコデルマ リーセイにとって好適な交配条件下で共培養される。実施例３に実施計画の例が示されている。繁殖力は子実体から子のう胞子を単離し、それを発芽させそして得られるコロニーが交配可能であることを示すことによって試験された。陽性の交配結果は、可視可能な形態変化、細胞−細胞融合および二核体の形成によって証明される。

【0037】

天然エイチ．ジェコリナＭＡＴ１−１株はティー．リーセイ ＱＭ６ａおよびその誘導株と交配されそして繁殖力のある子実体を作り、一方これはＭＡＴ１−２がＭＡＴ１−１に対し交換されたティー．リーセイ株では起らないので、本発明者はティー．リーセイ ＱＭ６ａの遺伝子はこの不成功の理由となる遺伝的特徴を含んでいるに違いないと結論した。すなわち、原因となる遺伝的特徴と相当する遺伝子は、理論的には、エイチ．ジェコリナＭＡＴ１−１株の１つの遺伝子を配列させることによって同定される。しかしながら、この戦略には重大な障害がある：ティー．リーセイとエイチ．ジェコリナの天然型株はそれらの染色体に平均して０．５〜１．５％の核酸変異を示す。染色体が仮に３４．１Ｍｂｐであるとすると、これはティー．リーセイおよび／またはエイチ．ジェコリナの２つの天然型株は１７０５００〜５１１５００の核酸の違いがあることを意味している。それらの大部分が遺伝子に起らないとしても、そして仮にそうだとしても、沈黙変異をもたらすことになり、非沈黙核酸交換を示す遺伝子の数は雌体繁殖力と関連した遺伝子を同定するに用いるにはあまりにも多すぎるようである。

【0038】

それ故、この核酸の違いの背景を、まずエイチ．ジェコリナ ＭＡＴ１−１に対して、続いて得られる子孫からの株に対して、ティー．リーセイ ＱＭ６ａの幾つかの繰返し交配によって低減させることに決定した。遺伝学の法則により、性的交配の子孫はＭＡＴ１−１親株の遺伝子５０％とＭＡＴ１−２親株の遺伝子５０％を有する。ＭＡＴ１−１を持つこれらの子孫の１つが再び交配すると、ＭＡＴ１−１株に由来する遺伝子量を５０％だけさらに低減し交配２回目の後には元の２５％となる。さらに繰返すと元のＭＡＴ１−１遺伝子の量の１２．５％（３回目）、６．２５％（４回目）、３．１２５％（５回目）、１．５６％（６回目）、０．７８％（７回目）および０．３９％（８回目）となる。ティー．リーセイ／エイチ．ジェコリナが９１４３のアノートされた遺伝子を有している事実からすると、これは験べる候補遺伝子の数を、８回目の交配世代では、その全てがティー．リーセイとＭＡＴ１−１株の間の核酸の違いを有しているわけではないが、３５７に低減することになる。しかしながら、これをさらに低減させるために、３回目の交配で生じる子孫が８回目の世代まで別々に交配される２つの株群に分けられた。各工程において生じるＭＡＴ１−１子孫が依然としてＱＭ６ａと繁殖性子実体を生成しうる能力が証明された。

【0039】

戻し交配が数学的計算により親株すなわち最初の株と実質的に同じ株が得られるまで繰返される；戻し交配は、もし正しい遺伝子で生じる可能性が比較的高いことを望むなら、８回よりも多く繰返される。理論的には、全部で１９回の戻し交配が０．０００１４％（＝１／９１４３；ティー．リーセイ遺伝子の中のアノートされた遺伝子の数は９１４３である）のＭＡＴ１−１遺伝子パーセンテージに到達するのに必要となる。戻し交配は通常５〜１９回、好ましくは６〜１２回、より好ましくは７〜１０回、さらに好ましくは８〜９回そして最も好ましくは８回繰返される。このように、親株と実質的に同じである株は該株が経験した戻し交配の数に関連して定義される。これは、戻し交配された株と親株との間の実質的な同一性は、交配の数に基づいて数学的に計算されるとおり、交配障害と関連する遺伝子と交配障害と関連しない遺伝子との間の関係と関係していることを意味する。

【0040】

ＭＡＴ１−２座を有するトリコデルマ リーセイ（ハイポクレア ジェコリナ）と交配する交配能力があり且つ交配障害／雌性不妊のための遺伝子および／またはトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａ中に存在しない遺伝子／遺伝情報の未変異形態を含有する、上記戻し交配の子孫は、先ず、ＭＡＴ１−１座を含有する子孫からこれらの株を同定し、次いでそれ自体公知の方法でティー．リーセイ ＱＭ６ａ（ＭＡＴ１−２）と繁殖力のある子実体を生成できることを証明することによって選ばれる。
上記で概観した戻し交配に引き続き、ＭＡＴ１−１バッククランドからトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａの系統へ移される望ましい遺伝子（同様に雌性妊性遺伝子）の組合せを得ることは基本的に可能性のあることであるが、戻し交配戦略の使用は、下記に本発明に従って得られるように、補完し且つ限定された雌性妊性遺伝子の最小限のセットのみを保有する、交配能力のあるＱＭ６ａ株またはその誘導株に到達するように、ノックアウト戦略と組合せられるべきである。

【0041】

遺伝子再結合の偶然性のために、ＭＡＴ１−１バックグランドから望ましい遺伝子の限定されたセットを保有ししかも同時に全ての望ましくないバックグランド遺伝子を喪失することは次第に起こりそうもないようになる。それ故、ある進歩した戻し交配世代の後、交配における雌性妊性遺伝子を喪失する可能性は非交配と関連する遺伝子を喪失する可能性よりも大きくなり、必要とされる雌性妊性遺伝子の最小セットを持つ交配能力のある子孫を得るチャンスは非常に小さくなる。それ故、得られる交配能力のある子孫中に保持される交配と関係のない、ＭＡＴ１−１雌性妊性遺伝子ドナーからの多くの遺伝子を未だ持っているうちに、戻し交配の連鎖を早い時点で停止することは望ましいことである。

【0042】

戻し交配戦略によってのみ交配能力のあるトリコデルマ株を生成することを試みることの別の欠点は、全ての雌性妊性遺伝子がＭＡＴ１−１ドナー遺伝子からの多くのランダムな非交配関連遺伝子とともに遺伝子中に集められた段階で停止することが必要であるために、それぞれのラインはこれらの非交配関連遺伝子に関して同じようにして生成された他のラインと異なり、望ましくない異成分を製造する。戻し交配戦略の使用は、交配障害と関連する候補遺伝子のプールに至る。該候補遺伝子のプールは、トリコデルマ リーセイの交配能力のあるＱＭ６ａ ＭＡＴ１−１株中のそれぞれの同定された遺伝子を目標としたノックアウトおよびかくして得られたトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａ ＭＡＴ１−１株の交配能力の決定によってさらに純粋なものとされる。

【0043】

交配と関連する単一遺伝子よりも多くのものがティー．リーセイ ＱＭ６ａ中で非機能性となることが可能であるので、その結果、単一遺伝子での補完は交配機能性の獲得には至らず、交配能力のあるティー．リーセイ ＱＭ６ａ誘導株中の全候補遺伝子のためのノックアウト株が調製された。このようにして交配のための必須遺伝子が、ＱＭ６ａの交配性欠如の専らの原因であるのかあるいは一群の不活性化された必須交配遺伝子の一部であるのかが同定される。この目的のために、好ましくはＣＢＳ１／Ａ８ ０２（ＭＡＴ１−１）株のｔｋｕ７０除去変異体が製造される。ｔｋｕ７０遺伝子はトリコデルマ リーセイおよび他の糸状菌中に存在する非相同性末端結合性（ＮＨＥＪ）経過の一部分である。ｔｋｕ７０遺伝子のノックアウトはトリコデルマ リーセイの増加した相同的再結合効果を生み出し（ガンタオ（Ｇｕａｎｇｔａｏ）ら、２００８）、かくして交配における関連性のために試験されるべき遺伝子ノックアウトを保有する株の数を増加させることとなる。

【0044】

ｔｋｕ７０遺伝子およびそれぞれの候補遺伝子のノックアウトは該遺伝子を作動不能とするのに適切な技術例えば部分的、実質的あるいは機能的な除去、沈黙化、不活性化あるいは下方制御によって達成される。好ましくは、相当するノックアウト有機体を同定するために、相当する作成物中にマーカーが挿入される。相当する技術は当該技術分野で知られている。ノックアウト有機体はノックアウト遺伝子の機能すなわち該有機体の交配挙動を研究することを可能とする。
このようにして、ノックアウトされたとき、交配能力のある株ＣＢＳ１／Ａ８ ０２Δｔｋｕ７０（ＭＡＴ１−１）中の交配能力を消していない遺伝子が交配に必須でないものとして同定され、その結果トリコデルマ リーセイ中の雌性妊性の候補遺伝子のリストから除去される。
ノックアウト戦略は、上記同定された遺伝子／遺伝要素と関連する交配能力のないフェノタイプを同定するのにも用いられる。交配能力のないノックアウトトリコデルマリーセイ ＱＭ６ａ株は、例えば、上記同定されたそれぞれの遺伝子／遺伝要素が、例えば部分的、実質的あるいは機能的な除去、沈黙化、不活性化または下方制御によって非機能的とされた、天然型ハイポクレア ジェコリナ株である。相当する方法はそれ自体知られている。

【0045】

交配障害と関連する遺伝子は、上記したとおり選択された子孫の遺伝子を配列させそしてそれをティー．リーセイ ＱＭ６ａの親株（上記で用いられた第１株）の遺伝子配列と比較することによって同定される。この目的のために、ＣＬＣゲノミック ワークベンチ（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ）（バージョン５．１、ＣＬＣｂｉｏ．Ａｒｈｕｓ、デンマーク）およびニューブレア（ｎｅｗｂｌｅｒ）で組みたてられたデノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）（バージョン２．６０、ロッシェ／４５４、ブランドホルド ＣＴ、米国）およびＣＬＣゲノミック ワークベンチが、ＢＬＡＳＴ（アルツル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、１９９０）とｒ２ｃａｔ（フスマンとストエ（Ｈｕｓｅｍａｎｎ ａｎｄ Ｓｔｏｙｅ）、２０１０）を備えたティー．リーセイ ＱＭ６ａ配列スカホールドのスカホールドに対し得られた配列をマップ化するのに用いられた。ＱＭ６ａの参照配列と２つの戻し交配されたラインの整列された配列との間の単一核酸多形（ＳＮＰ）および挿入と削除（挿入欠失）はマウブ（Ｍａｕｖｅ）のカスタム化されたバージョンを用いて同定された（リスマン（Ｒｉｓｓｍａｎ）ら、２００９）。ＳＮＰと挿入欠失とはカスタムＲスクリプトを用いるＱＭ６ａのコード用配列に対しマップ化された。候補遺伝子は、沈黙変異について手作業で検査され、そして推定蛋白質の機能と関与しない保存アミノ酸交換（例えばＥ対Ｄ、Ｖ対Ｉなど）を導く変異は廃棄された。変異のそれぞれの性質は戻し交配のために用いられるハイポクレア株のタイプにもちろん依存している。このように、それぞれの遺伝子中の異なる変異は、異なるハイポクレア株を用いることによって得られる。ティー．リーセイ ＱＭ６ａおよび誘導株の交配不能性を修正する遺伝子中に同定される全変異カットに共通なことは、それぞれのＱＭ６ａ遺伝子の変異において交配不能性変異を修正する変異であるということである。

【0046】

公表されたティー．リーセイ ＱＭ６ａ遺伝子配列中に存在しない、バックグランド中の大きなＤＮＡ挿入は次のようにして同定される。戻し交配されたラインとＱＭ６ａの異なる遺伝子配列の間の、ＢＬＡＳＴ プログラムによる核酸対比の結果は、これらの遺伝子の同定のためのカスタムＲスクリプトを用いることによって、ＱＭ６ａの遺伝子配列中に存在しない領域を同定して分析された。この方で同定された配列が、抽出されそして翻訳された核酸配列がこれらの配列の間の類似性を見つけるため、ＢＬＡＳＴＸ調査によるＮＣＢＩの蛋白質データベースを調査するのに用いられた。
それぞれの変異の証明は、ＭＡＴ１−１座を有するトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａを、戻し交配に用いられた同じタイプの相当するＭＡＴ１−２株と交配したとき生存可能な子のう胞子を持つ成熟した子実体の形成によって証明される、有機体の交配能力の回復である。

【0047】

交配障害と直接関連する遺伝子を得るために、上記同定された遺伝子がＭＡＴ１−１座を有するトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａまたはその誘導株中に挿入されそして該株をＭＡＴ１−２座を有するトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａまたはその誘導株と交配する。それにより、挿入された該遺伝子を持つＭＡＴ１−１座を持つトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａまたはその誘導株による子実体の形成が該交配障害を持つ該遺伝子と該直接関連があることを示している。同様にして遺伝子要素と交配挙動の寄与的影響が証明される。
上記技術により、もちろん、交配障害／雌性妊性と関連する遺伝子が同定されるだけでなく、１つまたはそれ以上の機能的に試験可能なフェノタイプ特性と関連する他の目標遺伝子も同様に同定される。さらに、例えば微生物や植物の如き他の有機体が、該有機体が交配能力を有する限り、上記システム中のトリコデルマ リーセイ株の代りに用いられる。

【0048】

従来技術に基づいて、ティー．リーセイ ＱＭ６ａ（ＭＡＴ１−２）中でそれらの機能を喪失した、交配障害または雌性妊性と関連する非変異且つこのような機能的遺伝子をＭＡＴ１−２座がＭＡＴ１−１座によって置換されたティー．リーセイ ＱＭ６ａ中に再導入することによって、ティー．リーセイ ＱＭ６ａ（ＭＡＴ１−２）またはその他のＭＡＴ１−２誘導体と交配する能力を回復することは期待されなかった。ＭＡＴ１−２座をＭＡＴ１−１座で置き換えるとともに、工業的トリコデルマ株中へ上記同定した遺伝子を導入することによって、これらの株は他のティー．リーセイ（ＭＡＴ１−２）株と交配することができるようになり、かくして雄性または雌性妊性遺伝子および基本的に対象となるいかなる目標遺伝子を同定する迅速な方法を可能とする。
第３表および第４表に示された配列相違の修正についての知識と、トリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａの交配能力の改善に関するそれらの機能的意味は、妊性と関係のある遺伝子について他の微生物を検査するための特定のプローブまたは特定のプローブを含有する配列を構築するために用いることができる。第３表と第４表の情報に基づいて、ベクターキットが交配可能性と関連する遺伝子の回復または修復を可能とする。

【0049】

本発明は、さらに対象となる製品の工業的生産に用いるために好適なトリコデルマ（ハイポクレア）属の真菌株に関するものでもある。ここで、上記株は上記したとおりにして得られたものであり且つ対象とする製品をエンコードする遺伝子で形質転換されたものとする。
対象とする製品は、工業的用途のある製品である。例えば、研究目的、診断目的、例えばホルモン、免疫グロブリン、ワクチン、抗菌性蛋白質、抗ウイルス性蛋白質、酵素等の治療目的、栄養目的あるいは技術的応用のために用いられる蛋白質あるいはポリペプチドである。蛋白質あるいはポリペプチドの好ましい例は、例えばポリガラクトウロニダーゼ類、ペクチン、メチルエステラーゼ類、キシロガラクトウロノイダーゼ類／ラムノガラクトウロニダーゼ類、アラビノフラノシターゼ類、アラバナーゼ類／アラビナナーゼ類、アミラーゼ類、フィターゼ類、キシラナーゼ類、セルラーゼ類、プロテアーゼ類、マンナナーゼ類、トランスグルタミナーゼ類などの食品酵素、例えばフィターゼ類、キシラナーゼ類、エンドグルカナーゼ類、マンナナーゼ類およびプテアーゼ類などの動物飼料酵素、さらに例えばセルラーゼ類、プロテアーゼ類、アミラーゼ類、ラッカーセ類、オキシドレダクターゼ類などの技術的酵素である。対象とする製品はバイオポリマーであってもよい。

【0050】

上記トリコデルマによる対象とする製品の工業的製品は当業者に知られており、トリコデルマ属の真菌株について確立された発酵法により実施される。対象とする製品を表現し且つ分泌するためにトリコデルマ株は対象とする製品の表現と分泌のため慣用の条件下で培養される。そのために菌が寒天板上に植え付けられあるいはそれぞれ、寒天板上での最初の生長および胞子サスペンジョンまたは菌糸サスペンジョンが水中発酵用の接種源として用いられる。発酵は必要なＣ源とＮ源および僅かな元素と鉱物塩を含有する媒体中で実施される。もし誘導性プロモーターが用いられるなら、媒体はインデューサーまたはそれらの前駆体も含むべきである。発酵は温度とｐＨはもちろん、レドックス電位、部分酵素含量などの発酵条件の制御の下で実施される。さらなるＣ源とＮ源および媒体中の他の成分の制御された管理は効果的である（フェドバッチ法）。発酵の最後に、対象とする製品を含む培養液体は公知の物理的方法でバイオマスと分離されそして対象とする製品がこの方法中に単離される。

【0051】

トリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａの交配能力の上記修復は幾つかのユニークな利益と関連している。該方法はトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａを天然型とさらに緊密に類似する有機体へと形質転換することを可能とする。この方法はトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａまたはその誘導体中の２つまたはそれ以上の有利な遺伝特性を組合せることを可能とする。該特性は、次いでトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａおよびその誘導体の子孫中に移される。従って、工業的に興味のある化合物の既に存在する、高度に効率的な生産体をさらに改善することができる。ティー．リーセイ株を交配する能力は、それらのフェノタイプによって検査され得るマーカー遺伝子または他の望ましくない遺伝子例えば二次代謝、顔料形成、望ましくない酵素（例えばプロチアーゼ類）、モルホロジー、無性発達などのための遺伝子を除去するのに用いることもできる。

【図面の簡単な説明】

【0052】

【図1】ティー．リーセイ ＱＭ６ａ株中のＭＡＴ１−２座をＭＡＴ１−１座によって直接置換するためのベクターの概略図である。選択マーカーとしてｈｐｈ遺伝子（ハイグロマイシン抵抗性）が用いられた。ｈｐｈカセットはｍａｔ１−１−３遺伝子と転写ＩＤ５９１４７を持つ遺伝子（ＤＮＡリアーゼ）の間の遺伝子間域に挿入された。

【図2】ＣＢＳ／ＭＡＴ１−１株とＱＭ６ａ株の交配のスキームである。各交配の子孫（ＭＡＴ１−１座を有する）が親株ＱＭ６ａと戻し交配される。これらの株のＣＢＳ１／Ａ８−２とＣＢＳ２／Ａ８−１１ＤＮＡが抽出されそして全ゲノム配列化に付された。

【図3】子のう菌類中の性的および無性的発達の概略図である（ファゼンダ（Ｆａｚｅｎｄａ）ら、２００８）。

【図4】交配障害と関連する遺伝子を移すための主なベクター構築の概略図である。５’インサートまたは挿入物は交配障害と関連する異なる遺伝子−ここでは転写ＩＤ Ｔｒｉｒｅ２ ５９７４０を持つ遺伝子に相当する。略語：Ｐｔｒｐｃ−ｔｒｐＣプロモーター；ｎｐｔｌｌ−ジェネティシンサルフェートＧ４１８に抵抗性を与える遺伝子；Ｔｔｒｐｃ−ｔｒｐＣターミネーター。

【図5】図５ａ、６ａ、７ａおよび８ａはトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａの交配能力に必須なものとして同定された機能的遺伝子の相補ベクターである。図５ｂ（配列番号：２２０／２２１）、６ｂ（配列番号：２１６／２１７）、７ｂ（配列番号：２１８／２１９）および８ｂ(配列番号：２２２／２２３)は、機能的プロモーターおよびターミネーターと一緒にそれぞれの相補遺伝子自体に関する。プロモーターとターミネーター配列は他の同等に機能的なプロモーターおよび／またはターミネーター配列で交換されていてもよい。

【0053】

下記実施例は本発明の主題を例証もしくは説明するものである。

【実施例】

【0054】

実施例１
１．材料と方法
セイル（Ｓｅｉｄｌ）らにより記載された株（２００９）はＭＡＴ１−２座の他に、ＭＡＴ１−１座も宿している。この株は、異なったＭＡＴ１−１およびＭＡＴ１−２保有天然型株を用いて性的に再生産することができるが、親株ティー．リーセイ ＱＭ６ａ（ＭＡＴ１−２）を用いてはできない。まだ存在するＭＡＴ１−２座（これは遺伝子内の元の座に存在する）がこの株中に性的再生産の機能不全をもたらしていることを排除するため、ティー．リーセイ ＱＭ６ａのＭＡＴ１−２座が天然型株エイチ．ジェコリナ Ｃ．Ｐ．Ｋ、１２８２から増幅されたＭＡＴ１−１座によって直接的に且つ相同的に交換される（Ｇ．Ｊ．Ｓ、８５〜２４９）。
ベクター構築のために、上流および下流の相同体領域を含むＭＡＴ１−１座がエイチ．ジェコリナ１２８２から増幅されそしてベクターｐＣＲブラント（ｂｌａｎｔ）（ライフ テクノロジー／インビトロゲンから入手可能）中でクローン化された。次のステップでハイグロマイシンに抵抗性を与えるｈｐｈ遺伝子（ハイグロマイシンＢフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子）が、遺伝子ｍａｔ１−１−３と転写ＩＤ５９１４７を持つ遺伝子（エンドヌクレアーゼ／ＤＮＡリアーゼ）との間の遺伝子内領域に位置されるＡｖｒｌｌ制御サイトを用いるベクター中でサブクローン化された。図１はベクター構築の概略的概観であり、第１表は用いられたプライマー類の配列を与えている。第２表はＭＡＴ１−２置換ベクター内の遺伝子の正確な位置を記載している。このベクターの完全配列は配列番号７として記載されている配列内に見ることができる。

【0055】

【表2】

【0056】

ティー．リーセイ ＱＭ６ａの形質転換のために、置換カセットがプライマー１−２置換カセットｆｗと１−２置換カセットｒｖを用いてＰＣＲによるベクターから増幅された。形質転換反応当り置換カセット１０μｇが用いられた。

【0057】

【数1】

【0058】

と名付けられた得られた株は、ＭＡＴ１−２天然型株（例えばＣＢＳ９９９．９７）に対し交配性パートナーとして成功裡に作用することができるが、親株ティー．リーセイ ＱＭ６ａとの交配はできない。

【0059】

【表3】

【0060】

２．変異されそして欠落する遺伝子
ティー．リーセイ ＭＡＴ１−２と交配することが可能なエイチ．ジェコリナ天然型ＭＡＴ１−１単離体と比較してティー．リーセイ中で変異される遺伝子を同定するために、ゲノム配列アプローチが用いられた。最初の試みは天然型単離体はＱＭ６ａ（その配列は公に入手可能である：ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｊｇｉ−ｐｓｆ．ｏｒｇ／Ｔｒｉｒｅ２／Ｔｒｉｒｅ２．ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ）と＞６０，０００ＳＮＰ異なっていたことを示していたので、このバックグランドの大部分は、ＱＭ６ａをＭＡＴ１−１株と性的交配させ次いでＭＡＴ１−１子孫のＱＭ６ａとの戻し交配のサイクルを繰返すことによって除去された。この目的のために、ＱＭ６ａ（ＭＡＴ１−２）株が２つの独立したラインでＣＢＳ９９９．９７（ＭＡＴ１−１）株と交配されてＭＡＴ１−１座を有する性的に能力のある株を得た。ＭＡＴ１−１座を有する単一子のう胞子の培養体は親株ＱＭ６ａと数度戻し交配されて雌性妊性（ＦＳ）をもたらす候補遺伝子のより容易な同定を可能とするＣＢＳ９９９．９７特定遺伝子の数を低減した。この工程を数世代にわたって繰返すことによって、ＱＭ６ａとほぼ同じ（それらのゲノムの＞９９％）であるが、ＭＡＴ１−１座を有しそして性的能力のある２つの株が生成された。２つの独立したラインからの８世代目の子孫のゲノムが次いで配列されそしてゲノム比較により、ＦＳをもたらすかまたは妊性に必要な候補遺伝子（例えば両ライン中に存在するＣＢＳ９９９．９７）特定遺伝子が同定された。

【0061】

それぞれのラインについて、それぞれ３２０ｂｐと８ｋｂｐ挿入サイズを持つ２つのライブラリーを製造した。ＤＮＡはコバリス（Ｃｏｖａｒｉｓ）Ｓ２システム（コバリス社、ウォバーン、マサチューセッツ）を用いて断片化されそして断片（フラグメント）はＱ１Ａクイック ＰＣＲ精製キット（クアゲン；ヒルデン、ドイツ）を用いて精製された。一対の末端ライブラリーが製造者の指示に従ってＮＥＢネクスト ＤＮＡサンプル製造モジュール（ニュー イングランド バイオラボ、イスヴィッチ（Ｉｐｓｗｉｃｈ）、マサチューセッツ）を用いて製造された。まとめると、断片はクレノウ（ｋｌｅｎｏｗ）とＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて末端修復されそしてＴ４ポリヌクレオチド キナーゼを用いてホスホリル化された。断片は、次いで、クレノウ エクソ ＤＮＡポリメラーゼを用いて３’−アデニル化され、そしてイルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）調節剤がＤＮＡリガーゼを用いて付加された。〜４００ｂｐの結紮生成物（Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ）がクアゲン ゲル抽出キット（クアゲン；ヒルデン、ドイツ）を用いてゲル精製された。標準イルミナ ライブラリー調製実施要綱でゲル精製工程中に導入されるグアニン−シトシン（ＧＣ）バイアスを回避するために、ゲルスライスは加熱の代りに室温で溶解された。大きさが選択され、調節剤で改質されたＤＮＡ断片がプージョン（Ｐｈｕｓｉｏｎ）ＤＮＡ ポリメラーゼ（ニュー イングランド バイオラボ、イスヴィッチ、マサチューセッツ）と実施要綱：ポリメラーゼ活性化（９８℃ ３０秒）、次いで１０サイクル（９８℃で１０秒間保持、６５℃で３０秒間アニールそして７２℃で５０秒間延長）、最後に７２℃で５分間延長、を用いて、ＰＥ ＰＣＲプライマー１．０と２．０（イルミナ、サンディエゴ、カルホルニア）を用いてＰＣＲ増幅された。ライブラリーはクビット（Ｑｕｂｉｔ）ＨＳアッセイキット（インビトロゲン、カールスバッド、カリフォルニア、米国）を用いて精製され且つ定量化された。

【0062】

クラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ）増幅がトルセック（ＴｒｕＳｅｑ）ＰＥ クラスターキットｖ５を用いてクラスターステーションで実施され、そして全てのライブラリーが２×１０７ｂｐの対の末端実施要綱を用いて、トルセック ＳＢＳ３６サイクルキットｖ５（イルミナ、サンディエゴ、カリフォルニア）を用いて１つのイルミナＨｉＳｅｑ２０００レーン上に配列された。配列用イメージファイルが配列用コントロール ソフトウェア（ＳＣＳ）リアルタイム分析（ＲＴＡ）ｖ２．６およびＣＡＳＡＶＡ ｖ１．７を用いて処理されてベースコールとフレッド様（Ｐｈｒｅｄ−ｌｉｋｅ）ベース資質スコアを生成し且つ誤読を除去した。

【0063】

２つのラインの配列はＣＬＣゲノミック ワークベンチ（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ、バージョン５．１、ＣＬＣバイオ、アーウス、デンマーク）および初めから組立てられたニューブレア（ｎｅｗｂｌｅｒ、バージョン２．６０、ロッシェ／４５４、ブランドホルドＣＴ、米国）とＣＬＣゲノミック ワークベンチを用いて資質濾過された。得られるスカフォールド（ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）およびシングルトン（ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ）連結断片（ｃｏｎｔｉｇｓ）は、ブラスト（ＢＬＡＳＴ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０）とｒ２ｃａｔ（ＨｕｓｅｍａｎｎとＳｔｏｙｅ、２０１０）によるティー．リーセイ ＱＭ６ａ配列スカフォールドのスカフォールドに対してマップ化された。ＱＭ６ａ参照配列と２つの戻り交配されたラインの整列された配列との間の単一ヌクレオチド ポリモルフィズム（ＳＮＰｓ）および挿入および除去（インデル）は、マウブ（Ｍａｕｖｅ、リスマンら、２００９）のカスタム化バージョンを用いて同定された。ＳＮＰとインデルはカスタム Ｒ スクリプトを用いてＱＭ６ａコーディング配列に対しマップ化された。結果として、ティー．リーセイ ＱＭ６ａに対し雌性妊性を保証する下記遺伝子が得られた（第３表）。さらに、ティー．リーセイ ＱＭ６ａの観察された交配障害と関連する該遺伝子中の変異が示された。第４表はトリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａ中に欠落していることが見つかった遺伝子を示している。第５表はノックアウト戦略によって同定された、ティー．リーセイ ＱＭ６ａ中の交配障害と関連する遺伝子を示している。

【0064】

【表4】

【0065】

【表5】

【0066】

【表6】

【0067】

【表7】

【0068】

【表8】

【0069】

【表9】

【0070】

【表10】

【0071】

【表11】

【0072】

【表12】

【0073】

【表13】

【0074】

【表14】

【0075】

【表15】

【0076】

【表16】

【0077】

【表17】

【0078】

【表18】

【0079】

【表19】

【0080】

【表20】

【0081】

【表21】

【0082】

【表22】

【0083】

【表23】

【0084】

【表24】

【0085】

【表25】

【0086】

【表26】

【0087】

【表27】

【0088】

【表28】

【0089】

【表29】

【0090】

【表30】

【0091】

【表31】

【0092】

【表32】

【0093】

【表33】

【0094】

【表34】

【0095】

【表35】

【0096】

【表36】

【0097】

【表37】

【0098】

【表38】

【0099】

【表39】

【0100】

【表40】

【0101】

【表41】

【0102】

【表42】

【0103】

【表43】

【0104】

【表44】

【0105】

【表45】

【0106】

【表46】

【0107】

【表47】

【0108】

【表48】

【0109】

【表49】

【0110】

【表50】

【0111】

【表51】

【0112】

【表52】

【0113】

【表53】

【0114】

【表54】

【0115】

【表55】

【0116】

【表56】

【0117】

【表57】

【0118】

【表58】

【0119】

【表59】

【0120】

【表60】

【0121】

【表61】

【0122】

【表62】

【0123】

【表63】

【0124】

【表64】

【0125】

【表65】

【0126】

【表66】

【0127】

【表67】

【0128】

【表68】

【0129】

【表69】

【0130】

【表70】

【0131】

【表71】

【0132】

【表72】

【0133】

【表73】

【0134】

【表74】

【0135】

【表75】

【0136】

【表76】

【0137】

【表77】

【0138】

【表78】

【0139】

【表79】

【0140】

【表80】

【0141】

【表81】

【0142】

実施例２
トリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａ株またはその誘導株中の交配障害と直接または間接的に関連する変異遺伝子の同定

【0143】

１．概説
上記交配障害と直接または間接的に関連し且つＱＭ６ａおよびその子孫中で非機能的な遺伝子を同定するために、これらの遺伝子はＭＡＴ１−２座がＭＡＴ１−１座によって置換されたティー．リーセイ ＱＭ６ａ株中へ個別にあるいは幾つかの遺伝子の集まりで形質転換された。テストされるべき遺伝子はジェネテシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）、耐性マーカーを含有するプラスミド中でクローン化されそしてプロトプラスト（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ）形質転換によって上記該ティー．リーセイ ＱＭ６ａ ＭＡＴ１−１株中で形質転換された。有糸分裂的に安定な形質転換体は、次いで、ＰＣＲ分析によって、染色体ＤＮＡ中でそれぞれの遺伝子の集積のためにテストされた。陽性形質転換体は次いで、ティー．リーセイ ＱＭ６ａ ＭＡＴ１−２と可能性のある交配に付されそして繁殖性結実体の形成によって証明された（それらの繁殖性は子のう胞子を単離し、そしてそれらが対の交配パートナーと交配し得たことを実証することによってテストされた）。次の実験要綱は交配障害と関連すると同定されたいかなる遺伝子に対しても使用することができる。

【0144】

２．交配障害と関連する遺伝子に機能欠落を有する株の調製
雌性妊性遺伝子候補が古典的遺伝学（交配、戻し交配）と比較ゲノム配列法の組合せによって先ず同定された。戻し交配後に得られた交配能力のある株（ＣＢＳ１／Ａ８ ０２、ＭＡＴ１−１）と交配能力のない最初の株（ＱＭ６ａ、ＭＡＴ１−２）との間のゲノム差は、定義によれば、交配の機能的補完のために必要とされる遺伝子を完全に含有していなければならない。加えて、必要とされるＦＳ遺伝子は、２つの戻し交配ライン（ＣＢＳ１／Ａ８ ０２、ＭＡＴ１−１とＣＢＳ２／Ａ８ １１、ＭＡＴ１−１）の終了点で共有されなければならない。さらに、交配能力バックグランド中のＦＳ遺伝子の不活性化は、機能的交配を衰弱させるに違いない。全てのこれらの方策は、トリコデルマ リーセイ ＱＭ６ａ（ＭＡＴ１−１）中に単独でまたは組合わせて導入されたときに、交配能力を再構築する遺伝子のリストに到達するように行われた。

【0145】

交配と関連する単一の遺伝子よりも多くの遺伝子がティー．リーセイ ＱＭ６ａ中で非機能的となり、そしてその結果単一遺伝子での補完が交配機能の獲得に至らないことが可能であるので、全ての候補遺伝子についてのノックアウト株が交配能力のあるティー．リーセイ ＱＭ６ａ誘導株に製造された。このようにして、交配に必須の如何なる遺伝子が、ＱＭ６ａ中の交配性欠落の専らの原因となっているのかあるいは不活性化された必須の交配性遺伝子の一群の一部であるのかが同定される。この目的のために、ＣＢＳ１／Ａ８ ０２（ＭＡＴ１−１）株のｔｋｕ７０削除変異体が製造された。ｔｋｕ７０遺伝子のノックアウトは、ＣＢＳ１／Ａ８ ０２（ＭＡＴ１−１）株を、選択マーカーとしてピリチアミン ハイドロブロマイド（ｐｔｒＡ）への抵抗性を持つＱＭ９４１４株（ティー．リーセイ ＱＭ６ａの交配不可能な子孫）のｔｋｕ７０削除変異体と、交配することによって達成された。この交配の子孫はＭＡＴ１−１座の存在とｔｋｕ７０削除についてスクリーンされた。得られた株は、以下においてＣＢＳ１／Ａ８ ０２△ｔｋｕ７０と呼ばれる。

【0146】

ティー．リーセイｇｐｄプロモーターおよびターミネーターの下でハイグロマイシン（ｈｐｈ）抵抗性を与える遺伝子によって中断された遺伝子特定フランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ）域の１．０〜１．５ｋｂ断片からなる削除カセットがイースト再構成クローニング（コロ（ｃｏｌｏｔ）ら、２００６）によって集積された。候補遺伝子の個々のフランキング域は、プージョン（Ｐｈｕｓｉｏｎ）ポリメラーゼを持つＣＢＳ９９９．９７／ＭＡＴ１−１株の染色体ＤＮＡからのオリゴヌクレオチド（１０μＭ）５Ｆ＋５Ｒおよび３Ｆ＋３Ｒを用いて増幅された（サーモ フィッシャー）。ｇｐｄプロモーターとターミネーター配列を含むｐｈｐ遺伝子（２．７ｋｂ）はプライマーｈｐｈＦおよびｈｐｈＲ（ｈｐｈＦ：ＧＧＡＴＣＣＧＡＧＡＧＣＴＡＣＣＴＴＡＣ（配列番号：１７５））、ｈｐｈＲ（ＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣＴＡＴＧＧＣＴＴＡ（配列番号：１７６））を用いるプラスミドｐＬＨｈｐｈ（ハートル（Ｈａｒｔｌ）ら、２００７）からＰＣＲによって増幅された。ＰＣＲによって、約１９ｂｐ配列がフランキング域に導入されて相同的組換を可能とする、イースト シャトルベクターｐＲＳ４２６（ＵＲＡ＋）またはｈｐｈメーカー遺伝子のいずれかと重なる。全ての断片の増幅のために、６２℃〜５８℃の範囲の徐冷温度でタッチダウンＲＣＲプログラムが用いられた。用いられたオリゴヌクレオチドの配列は第６表に示されている。

【0147】

このようにして、ノックアウトされたとき、交配能力のあるＣＢＳ１／Ａ８ ０２△ｔｋｕ７０（ＭＡＴ１−１）株中の交配能力を消滅させなかった遺伝子が交配には必須でないものとして同定されそしてその結果トリコデルマ リーセイ中の雌性妊性についての候補遺伝子のリストから除去された。この目的のために、４つの遺伝子が同定され、その削除は交配不可能性をもたらした。これらの遺伝子は配列番号：４０、１１０、１１２および１３４を持つ遺伝子の機能的同族体である。配列番号：４０、配列番号１１０、配列番号１１２および配列番号：１３４の遺伝子に相当する機能的遺伝子のノックアウトのある形質転換体については、交配は見い出せなかった。

【0148】

【表82】

【0149】

【表83】

【0150】

実施例３：交配障害と関連する遺伝子で補完された株の調製
交配パートナーとしてＱＭ６ａ／ＭＡＴ１−２を用いる成功裡の性的再生産を行い得るＱＭ６ａ／ＭＡＴ１−１を得るために、ＱＭ６ａ／ＭＡＴ１−１株が、ティー．リーセイ ＱＭ６ａ／ＭＡＴ１−２株中の交配障害と関連するものとして同定された遺伝子の機能的変異体を含有するプラスミドで形質転換された。

【0151】

同定された候補遺伝子トリレ２ ６７３５０、トリレ２ ７６８８７、トリレ２ １０５８３２およびトリレ２ ５９２７０で遺伝子補完するために用いられたＱＭ６ａ／ＭＡＴ１−１株がティー．リーセイ ＱＭ６ａ／ＭＡＴ１−２株中の同質組込みについて、ＭＡＴ１−１座、マーカー遺伝子および３’−フランキング域からなる遺伝子置換カセットを形質転換することによって構築された。３’域を包含するＭＡＴ１−１座は、プージョン ポリメラーゼ（サーモ フィッシャー）を持つＣＢＳ９９９．９７（ＭＡＴ１−１株）から、プライマーＭＡＴ１−１ インフュージョンｆｗ（ＧＴＧＣＴＧＧＡＡＴＴＣＡＧＧＣＣＴＧＧＣＴＴＧＡＴＧＣＴＧＣＴＡＡＣＣＴＣＣ（配列番号：１９３））とＭＡＴ１−１インフュージョンｒｖ（ＴＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＡＧＧＣＣＴＡＣＴＣＣＧＣＡＡＧＡＴＣＡＡＡＴＣＣＧ（配列番号：１９４））を用いることによって増幅された。増幅サンプル（アンプリコン）はインフュージョンＨＤクローニングシステム（インフュージョンＨＤクローニングシステムＣＥ、クロンテック社）を用いるＰＣＲブラントベクター（ｐＣＲブラント、インビトロゲン）中でクローン化された。選択マーカーとして、ティー．リーセイ ｇｐｄプロモーターとターミネーターの下でハイグロマイシン（ｈｐｈ）抵抗性をもたらす遺伝子が用いられた。ｈｐｈカセットが、プライマーｈｐｈ Ａｖｒｌｌ ｆｗ（ＧＴＣＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＡＧＧＡＣＣＴＣＴＴＣＧＧＣＧＡＴＡＣＡＴＡＣＴＣ（配列番号：１９５））とｈｐｈ Ａｖｒｌｌ ｒｖ（ＧＧＣＴＴＴＣＡＣＧＧＡＣＣＣＴＡＧＧＴＴＧＧＡＡＴＣＧＡＣＣＴＴＧＣＡＴＧ（配列番号：１９６））を用いるプラスミドｐＬＨｈｐｈ（ハートルら、２００７）からＰＣＲによって増幅された。３’−フランキング域を包含するＭＡＴ１−１座を有するプラスミドは次いで、Ａｖｒｌｌ（サーモ フィッシャー）によって温浸されたＭＡＴ１−１座のｍａｔ１−１−３遺伝子と３’フランキング域の間に、インフュージョン クローニングシステム（インフュージョンＨＤクローニングシステムＣＥ、クロンテック社）を用いて、ｈｐｈカセットが挿入された。ティー．リーセイ ＱＭ６ａ／ＭＡＴ１−２株中の交配型交換のために、遺伝子置換カセットが、プライマー１−２置換カセットｆｗ（ＴＧＧＡＡＣＧＡＣＴＴＴＧＴＡＣＧＣＡＣ（配列番号：１９７））と１−２置換カセットｒｖ（ＧＧＣＡＣＡＡＧＡＧＧＡＣＡＧＡＣＧＡＣ（配列番号：１９８））を用いるＰＣＲによって上記プラスミドから増幅された。遺伝子置換カセットは、次いでプロトプラスト（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ）形質転換（グルーバー（Ｇｒｕｂｅｒ）ら、１９９０）によって形質転換された。それぞれの形質転換について１０μｇのＤＮＡが用いられた。得られた株は、以下において、ＱＭ６ａ／ＭＡＴ１−１と呼ばれる。
ＱＭ６ａ株の交配性欠落を補完するために、新たに同定された候補遺伝子、トリレ２ ６７３５０、トリレ２ ７６８８７およびトリレ２ １０５８３２の天然型（ＣＢＳ９９９．９７）対立遺伝子がＱＭ６ａ／ＭＡＴ１−１株中に異所的に導入された。

【0152】

異所的遺伝子組込みのために、候補遺伝子の天然型（ＣＢＳ９９９．９７）対立遺伝子続いてジェネチシンジサルフェート Ｇ４１８（ｎｐｔｌｌ）抵抗性をもたらす遺伝子を含有するプラスミドが構築された。形質転換のためのベクターとして、ウィーン工科大学、化学工学研究所、研究領域遺伝子技術および応用生化学のベクターコレクション（未発表）で入手できたプラスミドｐＰｋｉ−Ｇｅｎが選択された。このプラスミドはｐＲＬＭｅｘ３０（マッハ（Ｍａｃｈ）ら、１９９４）から誘導された。プラスミドｐＲＬＭｅｘ３０は、ＸｂａｌとＨｉｎｄｌｌｌ（サーモ フィッシャー サイエンティフィック／ファーメンタス、ｓｔ、レオン−ロット、ドイツ国）を用いて温浸され、ｈｐｈコード用域とｃｂｈ２ターミネーター用域（２０６６ｂｐ）を除去し、それによってｐｋｉ１プロモーターを残留させた。次に、〜８００ｂｐのｔｒｐＣプロモーター、ｎｐｔｌｌコード用域および〜７００ｂｐのｔｒｐＣターミネーターを含む２．４ｋｂ断片がプライマーＧｅｎ ＦＷ（ＣＣＴＣＴＴＡＡＣＣＴＣＴＡＧＡＣＧＧＣＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＴＴＣＡＧＧ）（配列番号：１５６）とＧｅｎＲＶ（ＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＴＡＣＣＴＣＴＡＡＡＣＡＡＧＴＧＴＡＣＣＴＧＴＧ）（配列番号１５７）を用いるｐｌｌ９９（ナミキら、２００１）から増幅された。２つの断片インフュージョン組換え（クロンテック、米国）によって結合されてプラスイミドｐＲｋｉ−Ｇｅｎを生成した。ｎｐｔｌｌ遺伝子はジェネチシン ジサルフェートＧ４１８に抵抗性をもたらし、それは次いで真菌形質転換体を選択するために用いられた。

【0153】

さらなる工程において、プラスミド ｐＰｋｉ−ＧｅｎはＥｃｏＲＩおよびＸｂａｌ（サーモ フィッシャー サイエンティフィック／ファーメンタス Ｓｔ．レオンロート、ドイツ国）と温浸されてｐＫｉ１プロモーター（〜７４０ｂｐ）を除去した。交配障害の原因となると同定された遺伝子（すなわちトリレ２ ６７３５０、トリレ２ ７６８８７、トリレ２ １０５８３２および５９２７０）は、ＰＣＲによってＣＢＳ９９９．９７／ＭＡＴ１−１株から増幅されそしてインフュージョン組み換え（クロンテック 米国）により上記切断ベクター中に導入された。それぞれの遺伝子の増幅のために用いられたオリゴヌクレオチドは第７表に示されている。得られたプラスミドの完全な配列は配列番号２１２〜２１５および図５〜８に示されている。

【0154】

【表84】

【0155】

ＱＭ６ａ／ＭＡＴ１−１株は、次いで、それぞれの候補遺伝子を含有する円形プラスミドでプロトプラスト形質転換（グルーバーら、１９９０）により形質転換された。それぞれの候補遺伝子のうちの単一遺伝子または組合せのどちらが交配欠陥の原因であるのか判っていないので、候補遺伝子は単独でおよび組合せでも形質転換された。形質転換反応につき１０μｇの円形プラスミドが用いられた。全部で６ｍｌのプロトプラスト懸濁液のうち、それぞれ１ｍｌのプロトプラスト懸濁液が１００μｇ／ｍｌの濃度でジェネチシンサルフェートＧ４１８を含むオーバレイ媒体４ｍｌに添加された。それぞれの溶液は、次いで、ジェネチシンサルフェートＧ４１８が添加されたモルト抽出寒天（２％ ｗ／ｖ）を含有する寒天プレート上に真菌形質転換体を選択するために１００μｇ／ｍｌの濃度まで注がれた。プレートは暗所で２８℃で７日間培養された。可能性のある形質転換体が、次いで真菌形質転換体を選択するために、ジェネチシンサルフェートＧ４１８ １００μｇ／ｍｌを含むポテトテキストローズ寒天（ディフコ、米国）を含有する新しいプレートに移した。

【0156】

有糸分裂的に安定な形質転換体が、次いでＰＣＲ分析により染色体ＤＮＡ中でそれぞれの遺伝子の組込みのためにテストされた。染色体ＤＮＡは、リウ（Ｌｉｕ）ら（２０００）に従って抽出された。遺伝子の陽性組込みについてテストするために、遺伝子特定プライマーおよびｎｐｔｌｌカセット内に結合しているプライマーが用いられた。それらの配列は第８表に示されている。

【0157】

【表85】

【0158】

陽性形質転換体は、次いで、ティー．リーセイ ＱＭ６ａ ＭＡＴ１−２を用いる交配性アッセイに付された。交配性は繁殖性結実体の形成によって証明される。それらの妊性は子のう胞子を単離しそしてそれらが、発芽しそして菌糸体に成長して、対の交配性パートナーと交配することができることを実証することによってテストされる。

【0159】

交配可能性の修復を証明するために、陽性形質転換体は交配アッセイでテストされる。交配アッセイは、ティー．リーセイ天然型ＱＭ６ａ／ＭＡＴ１−２株（ＡＴＣＣ １３６３１）が、修復された候補遺伝子で補完されたティー．リーセイ ＱＭ６ａ／ＭＡＴ１−１の陽性形質転換体と共に培養されているＰＤＡ（Ｄｉｆｃｏ（登録商標）、ポテト デキストロース寒天）プレート上で、行われる。プレートは、天然の日周光サイクルに暴露して室温（２０〜２３℃）に保持して結実体形成を促進した。それらの妊性は、結実体から子のう胞子を単離しそしてそれから成長したコロニーが対の交配性パートナーと交配できることを実証することによってテストされた。

【0160】

【表86】

参考文献

【0161】

【表87】

【0162】

【表88】

【0163】

【表89】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]