特許 6661700 タキサンを含有するナノ粒子およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6661700

(24)【登録日】2020年2月14日

(45)【発行日】2020年3月11日

(54)【発明の名称】タキサンを含有するナノ粒子およびその使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/337 20060101AFI20200227BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20200227BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20200227BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20200227BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20200227BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/337

   A61K47/34

   A61K9/14

   A61K39/395 C

   A61P35/00

【請求項の数】12

【外国語出願】

【全頁数】36

(21)【出願番号】特願2018-115890(P2018-115890)

(22)【出願日】2018年6月19日

(62)【分割の表示】特願2015-556980(P2015-556980)の分割

【原出願日】2014年2月1日

(65)【公開番号】特開2018-158939(P2018-158939A)

(43)【公開日】2018年10月11日

【審査請求日】2018年7月19日

(31)【優先権主張番号】61/760,890

(32)【優先日】2013年2月5日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】506166572

【氏名又は名称】エイエヌピー テクノロジーズ， インコーポレイテッド

(73)【特許権者】

【識別番号】515214682

【氏名又は名称】フルゲント・セラピューティクス・インコーポレーテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100120112

【弁理士】

【氏名又は名称】中西 基晴

(74)【代理人】

【識別番号】100122644

【弁理士】

【氏名又は名称】寺地 拓己

(72)【発明者】

【氏名】イン，レイ

(72)【発明者】

【氏名】パン，ジン

(72)【発明者】

【氏名】チャン，ユーベイ

(72)【発明者】

【氏名】チョウ，ビンセン

(72)【発明者】

【氏名】イェン，ユン

【審査官】 新熊 忠信

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１２／０９４６２０（ＷＯ，Ａ２）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／００−３３／４４

Ａ６１Ｋ ９／００− ９／７２

Ａ６１Ｋ ４７／００−４７／６９

Ａ６１Ｋ ３９／００−３９／４４

Ａ６１Ｐ ３５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）疎水性部分で修飾された少なくとも１つの末端基を含むポリオキサゾリンであって、前記ポリオキサゾリンが、線状部分、分岐部分または両方をさらに含み、前記分岐部分が、対称分岐ポリマー、非対称分岐ポリマーまたはそれらの組合せを含み、前記ポリオキサゾリン製造におけるモノマー対開始剤の比率が、６０：１である、ポリオキサゾリンと、ｂ）タキサンとを含み、前記ポリオキサゾリンおよび前記タキサンが、６：１〜８：１のポリマー対タキサン重量比を有し、
０．２２μｍフィルターを通過する、凝集体を有効成分として含む、癌を治療するための医薬組成物。

【請求項2】

前記開始剤が疎水性の求電子分子を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記開始剤が炭化水素を含む、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項4】

前記開始剤が、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素または両方の組合せを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項5】

前記開始剤が、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アラルキル、ハロゲン化アシルまたはそれらの組合せを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項6】

前記炭化水素が、飽和であっても不飽和であってもよい、２個から約２２個の炭素を含む、請求項３に記載の組成物。

【請求項7】

凍結乾燥前に５０ｎｍから約１００ｎｍの大きさを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項8】

前記ポリオキサゾリンがポリ（２−置換オキサゾリン）を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項9】

標的指向性部分をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項10】

前記標的指向性部分が、抗体、その抗原結合部分、抗原、細胞受容体、細胞受容体リガンドまたはレクチンリガンドを含む、請求項９に記載の組成物。

【請求項11】

前記ポリオキサゾリンが、ポリ（２−メチルオキサゾリン）、ポリ（２−エチルオキサゾリン）、ポリ（２−プロピルオキサゾリン）またはポリ（２−ブチルオキサゾリン）を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項12】

前記タキサンがパクリタキセルまたはドセタキセルを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

[0001]本開示は、表面修飾された分岐ポリマー（ＭＢＰ）または線状ポリマーに関し、該ポリマーは、少なくとも１つの鎖末端が疎水基で修飾された、表面修飾された対称分岐ポリマー（ＳＢＰ）、表面修飾された非対称分岐ポリマー（ＡＢＰ）、または線状ポリマーの何れでもよく、これは、水に不溶性または難溶性のタキサンに暴露されると複合ナノ粒子またはナノ凝集体を形成し、ここでは、該薬剤は、疎水性部分、疎水性セグメントまたは疎水性部位がある表面または構造などの疎水性ドメインまたはその近くに分散または付着する。目的の粒子または凝集体は安定であり、例えば、乾燥させることができ、再水和させることができる。ナノ粒子またはナノ凝集体は、直径が約２０ｎｍから約５００ｎｍの範囲であり得る。水に不溶性または難溶性のタキサンと凝集体を形成するホモポリマーとの間の自発的な相互作用には、疎水的、静電的、金属−リガンド各相互作用、水素結合および他の分子相互作用が関与することができる。目的の粒子または凝集体には制御放出特性があるので、例えば、適切な障害を治療するために受容者体内でタキサンを制御放出するための担体としてなどの有用性が見出される。例えば、本開示は、癌の治療において、パクリタキセルおよびその誘導体などのタキサンを、毒性を下げ、溶解性を向上させ、生物学的利用率を上げ、効力を高めてｉｎ ｖｉｖｏ送達するための、かかるポリマーの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

対称分岐ポリマー
[0002]スターバーストデンドリマー（Ｓｔａｒｂｕｒｓｔ ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）（または高密度星型ポリマー（Ｄｅｎｓｅ Ｓｔａｒ ｐｏｌｙｍｅｒ））およびコームバーストデンドリグラフト（Ｃｏｍｂｂｕｒｓｔ ｄｅｎｄｒｉｇｒａｆｔ）（または超櫛型分岐ポリマー（ｈｙｐｅｒ ｃｏｍｂ−ｂｒａｎｃｈｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒ））を含めた、樹状ポリマーと呼ばれる新規なクラスのポリマーが最近開発され、種々の産業用途のために研究された。これらのポリマーは、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）系分岐ポリマーならびに米国特許第４，４３５，５４８号；第４，５０７，４６６号；第４，５６８，７３７号；第４，５８７，３２９号；第５，３３８，５３２号；第５，５２７，５２４号；および第５，７１４，１６６号に記載されるデンドリマーなど、多くの場合、（ａ）明確に規定されたコア分子、（ｂ）対称な（同一の長さの）分岐および分岐接合部（ｂｒａｎｃｈ ｊｕｎｃｔｕｒｅ）を有する少なくとも２つの同心円状の樹状層（世代）、ならびに（ｃ）外表面基を持つ。他の例には、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）デンドリマー、例えば、米国特許第４，６３１，３３７号に開示されるものなど；ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）デンドリマー、例えば、米国特許第５，５３０，０９２号、第５，６１０，２６８号、および第５，６９８，６６２号に開示されるものなど；Ｆｒｅｃｈｅｔ型ポリエーテルおよびポリエステルデンドリマー、コアシェル型テクトデンドリマーなど、例えば、「Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、Ｎｅｗｋｏｍｅら編、ＶＣＨ ワインハイム、１９９６年、「Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ
ｐｏｌｙｍｅｒｓ」、ＦｒｅｃｈｅｔおよびＴｏｍａｌｉａ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．、２００１年；および米国特許第７，７５４，５００号に記載されるようなものが含まれる。

【0003】

[0003]コームバーストデンドリグラフトは、段階的な合成方法を通して、コア分子と、対称的な分岐を有する同心円状の層とで構築される。デンドリマーとは対照的に、コームバーストデンドリグラフトまたはポリマーは、単分散の線状ポリマーの構成単位で作成される（米国特許第５，７７３，５２７号、第５，６３１，３２９号および第５，９１９，４４２号）。さらに、分岐様式がデンドリマーのそれとは異なる。例えば、コームバース
トデンドリグラフトはポリマー主鎖に沿って分岐接合部を形成する（鎖分岐）のに対して、スターバーストデンドリマーは、多くの場合終端で分岐する（末端分岐）。使用するリビング重合技法に起因して、これらのポリマー（コアおよび分岐）の分子量分布（Ｍ_ｗ／Ｍ_ｎ）は、多くの場合狭い。よって、グラフトオングラフト法（ｇｒａｆｔ−ｏｎ−ｇｒａｆｔ ｐｒｏｃｅｓｓ）を通して生成されるコームバーストデンドリグラフトは、明確に規定され、Ｍ_ｗ／Ｍ_ｎ比は多くの場合１に近い。

【0004】

[0004]デンドリマーなどのＳＰＢは、主に、ダイバージェントまたはコンバージェント合成手法の何れかを通して、保護および脱保護する手順を繰り返すことによって生成される。デンドリマーは、コアおよび分岐の構成単位として小分子を利用するので、デンドリマーの分子量分布は多くの場合規定されている。低い世代が小さければ、単一分子量のデンドリマーが得られることが多い。デンドリマーが多くの場合小分子モノマーを構成単位として利用するのに対し、デンドリグラフトは、線状ポリマーを構成単位として使用する。

【0005】

[0005]デンドリマーおよびデンドリグラフトに加えて、他のＳＢＰには、対称な星形または櫛形ポリマー、例えば、対称な星形または櫛形ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＩ、ＰＰＩ、ポリオキサゾリン（ＰＯＸ）、ポリメチルオキサゾリン（ＰＭＯＸ）、ポリエチルオキサゾリン（ＰＥＯＸ）、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサンまたはそれらの組合せが含まれる。非対称分岐ポリマー
[0006]ＳＢＰとは異なり、非対称分岐ポリマー（ＡＢＰ）、特に非対称分岐デンドリマーまたは規則性ＡＢＰ（ｒｅｇ−ＡＢＰ）は、米国特許第４，２８９，８７２号、第４，３６０，６４６号、および第４，４１０，６８８号に記載されるように、多くの場合、コアと、制御され、明確に規定された非対称（不均等な長さの）分岐および非対称な分岐接合部とを持つ。

【0006】

[0007]一方、不規則性ＡＢＰ（ｒａｎ−ＡＢＰ）は、ａ）コアを持たず、ｂ）外部および内部の両方に存在する官能基、ｃ）不規則な／可変の分岐長さおよび様式（すなわち、末端分岐および鎖分岐）、ならびにｄ）不均等に分布する内部の空隙を有する。

【0007】

[0008]ｒａｎ−ＡＢＰ、例えばＰＥＩから作製されたものの合成および機構は、Ｊｏｎｅｓら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．９、１２５（１９４４年）、Ｊｏｎｅｓら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３０、１９９４（１９６５年）およびＤｉｃｋら、Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｃｈｅｍ．、Ａ４（６）、１３０１〜１３１４、（１９７０年））により報告された。Ｒａｎ−ＡＢＰ、例えば、ＰＯＸすなわちポリ（２−メチルオキサゾリン）およびポリ（２−エチルオキサゾリン）から作製されたものは、Ｌｉｔｔ（Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｃｈｅｍ．Ａ９（５）、７０３〜７２７（１９７５年））およびＷａｒａｋｏｍｓｋｉ（Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．２８、３５５１（１９９０年））によって報告された。ｒａｎ−ＡＢＰの合成は、多くの場合、ワンポットダイバージェント法またはワンポットコンバージェント法を使用できる。
ホモポリマー
[0009]ホモポリマーは、同一の繰り返し単位から構成されるポリマーまたはポリマー主鎖に関係している可能性があり、つまり、ホモポリマーは、同一のモノマー（例えば、ＰＥＩ線状ポリマー、ＰＯＸ線状ポリマー、ＰＥＩデンドリマー、ポリアミドアミン（ＰＡＡ）デンドリマーまたはＰＯＸデンドリグラフトおよび不規則性分岐ポリマー）から作成される。モノマーは、単純な化合物であっても、化合物の複合体または集合体であってもよく、その場合、集合体または複合体はホモポリマー中の繰り返し単位である。よって、集合体が３つの化合物、Ａ、ＢおよびＣから構成されるならば、複合体はＡＢＣと表記することができる。一方で、（ＡＢＣ）−（ＡＢＣ）−（ＡＢＣ）…から構成されるポリマ
ーは、本開示の目的のためのホモポリマーである。ホモポリマーは、線状であっても分岐していてもよい。よって、不規則性分岐ＰＥＩの場合、異なる長さの分岐が存在し、また分岐が不規則に起こっているが、その分岐ポリマーが単一のモノマー、すなわちエチレンイミンまたはアジリジンの繰り返し単位から構成されるので、その分子は本開示の目的のためのホモポリマーである。また、モノマーまたは複合体モノマーの構成成分の１種または複数を、修飾、置換、誘導体化することなどができ、例えば、官能基を担うように修飾できる。かかる分子は、主鎖が単一の単純なまたは複合したモノマーから構成されているので、本開示の目的のためのホモポリマーである。
水に難溶な薬剤：タキサン
[0010]パクリタキセルは、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ ＳｑｕｉｂｂによってＴａｘｏｌ（登録商標）として販売される、水に不溶な薬剤である。パクリタキセルは、タイヘイヨウイチイ、学名Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａに由来する（Ｗａｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９３：２３２５、１９７１年）。パクリタキセルおよびドセタキセル（これもＴａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）として販売される）を含めたタキサンは、乳癌、卵巣癌および肺癌、ならびに結腸および頭頸部の癌などを含めた種々の癌を治療するために使用される。

【0008】

[0011]しかし、パクリタキセルは水に難溶性であることから、その広範な使用が妨げられてきた。現在、Ｔａｘｏｌ（登録商標）およびそのジェネリック薬は、薬剤を可溶化させるために、１：１のエタノール：Ｃｒｅｍａｐｈｏｒ（登録商標）（ポリエトキシ化ヒマシ油）溶液を使用して製剤化されている。Ｃｒｅｍａｐｈｏｒ（登録商標）の存在は重度の過敏性反応につながっており、その結果として、副腎皮質ステロイド（例えばデキサメタゾン）および抗ヒスタミン剤で患者を薬物治療することが必要となる。

【0009】

[0012]代わりに、複合化パクリタキセル、例えば、パクリタキセルにヒト血清アルブミンを混合することによって生成される、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）を用いることによって、副腎皮質ステロイドおよび抗ヒスタミン剤の注射が不要となった。しかし、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）は、望ましくない副作用、例えば、胸痛、心拍停止、上室性頻拍、浮腫、血栓症、肺血栓塞栓症、肺塞栓症、高血圧などを含めた重度の心血管イベントを引き起こすので、心血管リスクのある患者はこの薬剤を使用することができない。
水に難溶性の薬剤の送達
[0013]ＳＢＰおよびＡＢＰを含めた分岐ポリマーが薬剤送達に使用されてきたが、これらの試みは、主に、薬剤を化学的にポリマーに付すこと、または単分子カプセル化（ｕｎｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）を通してかかる薬剤を内部に物理的にカプセル化することに集中している（米国特許第５，７７３，５２７号、第５，６３１，３２９号、第５，９１９，４４２号、および第６，７１６，４５０号）。

【0010】

[0014]例えば、高密度星型ポリマーについては米国特許第５，３３８，５３２号、第５，５２７，５２４号および第５，７１４，１６６号に、超櫛型分岐ポリマーについては米国特許第５，９１９，４４２号に記載される通りに、デンドリマーおよびデンドリグラフトは、単分子カプセル化手法を使用して、生理活性分子を物理的に封入すると考えられている。同様に、「デンドリマーボックス（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ ｂｏｘ）」を形成する、ＳＢＰを使用した種々の薬剤の単分子カプセル化が、Ｔｏｍａｌｉａら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、１９９０年、２９、１３８、および「Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ」Ｆｒｅｃｈｅｔ＆Ｔｏｍａｌｉａ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．、２００１年、３８７〜４２４頁に報告された。

【0011】

[0015]分子カプセル化を通して水に難溶性の薬剤を封入するために、疎水性のコアと親水性のシェルとを有する分岐コアシェルポリマーが使用されてもよい。親水性のコアと疎
水性のシェルとを有する不規則に分岐した超分岐コアシェル構造を使用して、単分子カプセル化および予め形成されたナノミセルを通して薬剤を担うこともなされてきた（米国特許第６，７１６，４５０号およびＬｉｕら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０１０年、１０、１３３４〜１３４１）。しかし、これらの単分子および予め形成されたミセル構造は、薬剤不在で作成される。

【0012】

[0016]実施形態において、ブロックコポリマー、例えば、ミクトアームポリマー（すなわち、Ｙ形／ＡＢ_２型の星型ポリマー）および（Ａ）が樹状である（Ｂ）の線状ブロックコポリマーが、パクリタキセルとステレオコンプレックスを形成することが観察された（Ｎｅｄｅｒｂｅｒｇら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００９年、１０、１４６０〜１４６８およびＬｕｏら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０１０年、２１、１２１６）。これらのブロックコポリマーは、ミセルの生成に使用されるよく知られた界面活性剤である、従来の脂質またはＡＢ型線状ブロックコポリマーに酷似している。

【0013】

[0017]しかし、かかる分岐ブロックコポリマーは作製することが困難であり、よって大量生産に適さない。

【0014】

[0018]分岐または線状ホモポリマーを疎水基で修飾することによって、水に難溶性または不溶性の薬剤に暴露したときに、制御された薬剤送達に適した安定な凝集体を自発的に形成させるという記載は存在していない。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0015】

本明細書は以下の発明の開示を包含する。
［１］ａ）疎水性部分で修飾された少なくとも１つの末端基を含むポリオキサゾリンであって、前記ポリオキサゾリンが、線状部分、分岐部分または両方をさらに含み、前記分岐部分が、対称分岐ポリマー、非対称分岐ポリマーまたはそれらの組合せを含み、前記ポリオキサゾリンが、５０：１から８０：１のモノマー対開始剤の比率を含む、ポリオキサゾリンと、
ｂ）タキサンと
を含み、前記ポリオキサゾリンおよび前記タキサンが、２：１〜１０：１のポリマー対タキサン重量比を有する、
凝集体。
［２］前記開始剤が疎水性の求電子分子を含む、［１］に記載の凝集体。
［３］前記開始剤が炭化水素を含む、［１］に記載の凝集体。
［４］前記開始剤が、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素または両方の組合せを含む、［１］に記載の凝集体。
［５］前記開始剤がハライド官能基を含む、［１］に記載の凝集体。
［６］前記開始剤が、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アラルキル、ハロゲン化アシルまたはそれらの組合せを含む、［５］に記載の凝集体。
［７］前記炭化水素が、飽和であっても不飽和であってもよい、２個から約２２個の炭素を含む、［３］に記載の凝集体。
［８］前記開始剤が、ヨウ化メチル、臭化メチル、塩化メチル、ヨウ化エチル、臭化エチル、塩化エチル、１−ヨードブタン、１−ブロモブタン、１−クロロブタン、１−ヨードヘキサン、１−ブロモヘキサン、１−クロロヘキサン、１−ヨードドデカン、１−ブロモドデカン、１−クロロドデカン、１−ヨード−オクタドデカン、１−ブロモ−オクタドデカン、１−クロロ−オクタドデカン、ヨウ化ベンジル、臭化ベンジル、塩化ベンジル、臭化アリル、塩化アリル、臭化アシル、塩化アシル、臭化ベンゾイルまたは塩化ベンゾイルを含む、［１］に記載の凝集体。
［９］前記開始剤がトシル基を含む、［１］に記載の凝集体。
［１０］凍結乾燥前に５０ｎｍから約１００ｎｍの大きさを含む、［１］に記載の凝集体。
［１１］前記ポリオキサゾリンの第２の末端基が、エチレンジアミンまたはその誘導体によって修飾された部位を含む、［１］に記載の凝集体。
［１２］前記タキサンが前記少なくとも１つの末端基と会合している、［１］に記載の凝集体。
［１３］前記ポリオキサゾリンがポリ（２−置換オキサゾリン）を含む、［１］に記載の凝集体。
［１４］標的指向性部分をさらに含む、［１］に記載の凝集体。
［１５］前記標的指向性部分が、抗体、その抗原結合部分、抗原、細胞受容体、細胞受容体リガンドまたはレクチンリガンドを含む、［１４］に記載の凝集体。
［１６］前記ポリオキサゾリンが、ポリ（２−メチルオキサゾリン）、ポリ（２−エチルオキサゾリン）、ポリ（２−プロピルオキサゾリン）またはポリ（２−ブチルオキサゾリン）を含む、［１］に記載の凝集体。
［１７］前記タキサンがパクリタキセルまたはドセタキセルを含む、［１］に記載の凝集体。
［１８］凍結乾燥後に７０〜９０ｎｍの大きさを含む、［１］に記載の凝集体。
[0019]一態様では、本開示は、パクリタキセルおよびその誘導体などのタキサンの溶解
性を増大させるための、修飾された分岐ポリマー（ＭＢＰ）または線状ポリマーの使用を
対象とする。

【0016】

[0020]本開示の別の態様では、非対称分岐ポリマー（ＡＢＰ）は、不規則性または規則性の何れかの非対称分岐を含む。不規則性ＡＢＰは、混在した末端分岐様式と鎖分岐様式とを有することもできる。

【0017】

[0021]本開示の別の態様では、ＡＢＰおよびＳＢＰは両方とも、新たな材料特性を実現することができるように、所与の時間で追加的な分岐を形成することができる少なくとも１つの分子または基でさらに修飾することができ、この場合、追加的な官能基がさらに付されてもよい。修飾されたポリマーはすべて、修飾ＳＢＰまたは修飾ＡＢＰとして定義することができる。

【0018】

[0022]本開示の別の態様では、非修飾分岐ポリマーおよび修飾分岐ポリマーは何れもダイバージェント法またはコンバージェント法で生成することができ、段階的または一段階合成プロセスの何れかを使用することができる。

【0019】

[0023]本開示の別の態様では、ＳＢＰには、これらに限定されないが、ＰＡＡデンドリマー；ＰＥＩデンドリマー；ＰＰＩデンドリマー；ポリエーテルデンドリマー；ポリエステルデンドリマー；櫛型分岐／星型分岐ポリマー、例えば、ＰＡＡ、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＭＯＸ、ＰＥＯＸ、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＡ）、ポリスチレン、ポリブタジエン、ポリイソプレンおよびポリジメチルシロキサン；櫛型分岐デンドリグラフト、例えば、ＰＥＯＸ、ＰＭＯＸ、ポリプロピルオキサゾリン（ＰＰＯＸ）、ポリブチルオキサゾリン、ＰＥＩ、ＰＡＡ；などが含まれる。

【0020】

[0024]本開示のさらなる態様では、ＳＢＰは内部に空隙を有することができ、一方、ＡＢＰは不均等に分布する空隙を有することができる。

【0021】

[0025]本開示の別の態様では、上述のＳＢＰ、例えば、デンドリマーもしくはデンドリグラフト、およびＡＢＰ、例えば、規則性もしくは不規則性分岐ポリマー、ならびに、星型分岐および櫛型分岐ポリマー、またはそれらの組合せを含むハイブリッド分岐ポリマーも、目的の前記薬剤誘起凝集体またはナノ粒子を生成するために使用することができる。

【0022】

[0026]本開示の別の態様では、分岐ポリマーは、官能基、例えば、これらに限定されないが、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＮＲ_２、ＮＲ_３^＋、ＣＯＯＲ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ⁻、ＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｒ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、Ｃ（Ｏ）ＮＨＲまたはＣ（Ｏ）ＮＲ_２（式中、Ｒは、任意の脂肪族基、芳香族基またはそれらの組合せでもよい）；脂肪族基（例えば炭化水素鎖）（分岐していてもよく、１つもしくは複数の二重および／もしくは三重結合を含有してもよく、ならびに／または置換されていてもよい）；芳香族基（複数の環を含有してもよく、それらが縮合していても別々でもよく、環が様々な大きさであってもよく、および／または環が置換基を含有してもよい）；ペルフルオロカーボン鎖；単糖類および／または多糖類（様々な大きさの環であってもよく、環がイオウもしくは窒素原子などのヘテロ原子を含有していても置換されていてもよく、２種以上の単糖類を含有してもよく、分岐していてもよく、および／または置換されていてもよい）；ポリエチレングリコールなどで修飾される。

【0023】

[0027]ＭＢＰの分子量は、約５００から５，０００，０００超、約５００から約１，０００，０００、約１，０００から約５００，０００、約２，０００から約１００，０００までの範囲とすることができる。

【0024】

[0028]本開示の別の態様では、ＳＢＰおよびＡＢＰの表面は、表面基の物理的特性とタキサンとの適合性が上がり、それによってＭＢＰの表面基領域、ドメイン、部分、またはセグメントとタキサンとの混和性が上がるように、修飾される。

【0025】

[0029]ある実施形態では、鎖末端での分岐ポリマーまたは線状ポリマーの修飾は、疎水性官能基、例えば、脂肪族鎖（例えば、線状であるか分岐であるかを問わず、１から約２２個の炭素を含む炭化水素鎖）、芳香族構造（例えば、１つまたは複数の芳香族環を含有し、それらは縮合していてもよい）またはそれらの組合せで行われる。

【0026】

[0030]公知の薬剤担体とは対照的に、本発明の分岐または線状ポリマー構造は、各ポリマー分子内にタキサンを物理的に封入するものではない。その代わりに、タキサンは、各分岐または線状ポリマーの、官能基を含有するドメイン／領域に位置するか、または分散するかの何れかであり得る。

【0027】

[0031]生じた目的の構造は、例えば、凍結乾燥またはその他の形態の乾燥によって任意選択により保存することができ、それによって目的の構造をさらに安定化させることができる。水または緩衝液に再溶解させると、直径が約５０から約５００ｎｍの範囲内の大きさのナノ粒子を得ることができる。

【0028】

[0032]多くの場合官能基化されている、多重分岐が存在すれば、分子内および分子間架橋の形成が可能となり、それによりタキサン含有ナノ粒子を安定化させることができる。希釈すると、前記物理的凝集体またはナノ粒子は分解し、制御された速度で薬剤を放出する。

【0029】

[0033]本開示の別の態様では、タキサンをカプセル化するために、線状ポリマーと分岐
ポリマーの混合物も利用することができる。前記線状および／または分岐ポリマーの少なくとも１つの末端基が、疎水性部分または官能基で修飾される。疎水性部分または官能基には、これらに限定されないが、炭化水素鎖（例えば、飽和化学結合または不飽和化学結合の何れかを有する１〜２２個の炭素を含有する）、およびアラルキル、芳香族環、フルオロカーボンなどを含有する疎水基が含まれ得る。

【0030】

[0034]本開示の別の態様では、分岐または線状ポリマーは、これらに限定されないが、抗体またはその抗原結合部分、抗原、同種炭水化物（例えばシアル酸）、細胞表面受容体リガンド、細胞表面受容体によって結合される部分、例えば前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、細胞表面の糖類に結合する部分、細胞外マトリックスリガンド、サイトゾル受容体リガンド、増殖因子、サイトカイン、インクレチン、ホルモン、レクチン、レクチンリガンド、例えば、ガラクトース、ガラクトース誘導体、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノース、マンノース誘導体など、ビタミン、例えば、葉酸塩またはビオチン；アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、ＤＮＡ、ＲＮＡなどを含めた、標的指向性部分／基を含むことができる。かかる標的指向性ナノ粒子は、好ましい治療位置で薬剤を放出するので、局所有効濃度を高め、望ましくない副作用を最小化することができる。

【0031】

[0035]本開示の別の態様では、標的指向性部分／基、ならびに疎水性、親水性、および／またはイオン性官能基を含めた官能基は、標的薬剤送達のための複合ナノ粒子の形成に先立って、分岐ポリマーに付される。

【0032】

[0036]本開示の別の態様では、モノマー対開始剤比およびポリマー対タキサン比を特定の範囲にすることによって、薬剤ナノ粒子が適正な大きさとなって、薬剤ナノ粒子の大規模製造および薬剤ナノ粒子の殺菌が容易になり、また、他のモノマー対開始剤比および／またはポリマー対タキサン比と比較して薬剤の効力が向上する。

【0033】

[0037]本開示のさらなる特徴および利点は、以下の「発明を実施するための形態」および添付の図面において説明され、これらから明らかとなろう。

【0034】

[0038]以下の図の説明および対応する図面は、本開示を例示する種々の実施形態を表す非限定的な例である。

【図面の簡単な説明】

【0035】

【図1】[0039]図１は、デンドリマー、星形ポリマー、デンドリグラフトおよび櫛形ポリマーを含めた、ＳＢＰを表す図である。球状または線状を問わず、すべてコアを有する。

【図2】[0040]対称分岐ＰＰＩデンドリマーの化学構造を表す図である。

【図3】[0041]対称分岐ＰＰＩデンドリマーの化学修飾反応を示す図である。８、１６、３２などの数字は、デンドリマーの表面の反応性基の数を示す。

【図4】[0042]図４Ａは、非対称の分岐接合部および様式を有する、不規則性（Ａ）ＡＢＰを示す図である。図４Ｂは、非対称の分岐接合部および様式を有する、規則性（Ｂ）ＡＢＰを示す図である。

【図5】[0043]不規則性非対称分岐ＰＥＩホモポリマーの化学構造を示す図である。

【図6A】[0044]合成スキームを表し、不規則性非対称分岐ＰＥＩホモポリマーの化学修飾反応を示す図である。

【図6B】合成スキームを表し、ポリマーのフォーカルポイントに一級アミノ基を有する、疎水性に修飾された不規則性分岐ポリ（２−エチルオキサゾリン）のワンポット合成を表す図である。開始剤／表面基（Ｉ）は、臭化炭化水素である。この反応は、オキサゾリン環を開環する。

【図7】[0045]分岐ポリマー（ＳＢＰおよびＡＢＰ）の表面ドメインまたは領域内または表面ドメインまたは領域上に担持された薬剤を示す図である。この図および他の図において、Ｒは表面基を示し、塗り潰された円は目的の薬剤を表す。

【図8】[0046]薬剤分子と分岐ポリマーの両方を含有する複合系ナノ粒子の一種を示す図である。

【図9】[0047]分岐ポリマー（ＳＢＰおよびＡＢＰ）の疎水性表面基に担持された、水に不溶性または難溶性の薬剤を示す図である。この図および他の図において、細い波線は、疎水性表面基を表す。

【図10】[0048]ここでおよび他の図で「Ｙ」として表される、抗体などの少なくとも１つの標的指向性基または部分も担う、種々の薬剤含有ナノ粒子を例示する図である。

【図11】[0049]生理食塩水中、ポリマー濃度２５ｍｇ／ｍＬおよび薬剤濃度５ｍｇ／ｍＬでの、ポリマー単独凝集体およびポリマー−薬剤凝集体の大きさの比較を示す図である。ポリマーは、疎水性に修飾された不規則性分岐ＰＥＯＸであり、薬剤はパクリタキセルである。

【図12】[0050]生理食塩水中、ポリマー濃度２．５ｍｇ／ｍＬおよび薬剤濃度０．５ｍｇ／ｍＬでの、ポリマー単独凝集体およびポリマー−薬剤凝集体の大きさの比較を示す図である。ポリマーは、疎水性に修飾された不規則性分岐ＰＥＯＸであり、薬剤はパクリタキセルである。

【図13】[0051]生理食塩水中、ポリマー濃度２５０μｇ／ｍＬおよび薬剤濃度５０μｇ／ｍＬでの、ポリマー単独凝集体およびポリマー−薬剤凝集体の大きさの比較を示す図である。ポリマーは、疎水性に修飾された不規則性分岐ＰＥＯＸであり、薬剤はパクリタキセルである。

【図14】[0052]生理食塩水中、ポリマー濃度２５μｇ／ｍＬおよび薬剤濃度５μｇ／ｍＬでの、ポリマー単独凝集体およびポリマー−薬剤凝集体の大きさの比較を示す図である。ポリマーは、疎水性に修飾された不規則性分岐ＰＥＯＸであり、薬剤はパクリタキセルである。

【図15】[0053]３種のタキサン製剤に暴露したときの正常細胞の生存率を表す図である。

【図16】[0054]３種のタキサン製剤に暴露したときのＡ５４９肺癌細胞の細胞障害を表す図である。

【図17】[0055]３種の異なるタキサン製剤に暴露したときのＭＤＡ−ＭＢ−２３１トリプルネガティブ乳癌の細胞障害を表す図である。

【図18】[0056]３種の異なるタキサン製剤に暴露したときのＯＶ−９０卵巣癌の細胞障害を表す図である。

【図19】[0057]時間の経過に対する血漿中濃度を表す、３種の異なるタキサン製剤の薬物動態（ＰＫ）プロファイルを表す図である。

【図20】[0058]２種の対照で処置したマウスの異種移植モデルおよび３種の異なるタキサン製剤に暴露したマウスの異種移植モデルにおけるＡ５４９肺癌腫瘍量を表す図である。

【図21】[0059]切除された肺癌細胞腫瘍の画像を示す図であり、細胞腫瘍はマウス内で異種移植片として増殖し、そのマウスが２種の対照および２つの形態のタキサンで処置されたものである。

【図22】[0060]マウス異種移植モデルにおいて２種の負の対照および３種のタキサン製剤が卵巣癌の腫瘍の大きさに与える影響を表す図である。

【図23】[0061]切除された卵巣癌細胞腫瘍の画像を示す図であり、細胞腫瘍は、マウス内で異種移植片として増殖し、そのマウスが２種の対照および３つの形態のタキサンで処置されたものである。

【発明を実施するための形態】

【0036】

[0062]本開示における薬剤の溶解性は、薬剤１部を可溶化するのに必要とされる溶媒の部数に応じて、＜３０（可溶）、３０〜１００（難溶）および＞１００（不溶）と定義さ
れる。

【0037】

[0063]本開示の目的のために、「約」、「実質的に」などの単語は、記載の値または数字から１０％を超えない範囲の値として定義される。「ホモポリマー」は上述の通りである。
目的の薬剤
[0064]記載する目的の薬剤はタキサンであり、パクリタキセルおよびドセタキセルなどの他のタキサン誘導体を含む。パクリタキセルは非水溶性であり、様々な種類の癌の治療において、低い最大耐用量（ＭＴＤ）、ＰＫプロファイルおよび限定的な効力などの、明確に規定された性能特性を有する。本開示は、これらの性能特性を向上させる上での、前述の通りのＡＢＰの使用を範囲内に含む。
ナノ複合体、ナノ粒子またはナノ凝集体
[0065]ナノ複合体は、２種以上の材料または構成成分（例えば、ポリマーおよびタキサン）の物理的な混合物である。本開示では、かかる混合物は、固体または液体の何れかの状態である、タキサンと分岐ホモポリマー分子の間に形成される様々なナノスケールの相またはドメインを含有することができると考えられる。ナノ複合体は、バルクマトリックス（例えば、分岐ホモポリマーおよびタキサン）と、構造および化学的性質の相違のために異なる特性を呈し得るナノ寸法相（例えば、タキサンおよび分岐ポリマーの表面基によって形成されるドメイン、ならびに分岐ポリマーの内部によって形成されるドメイン）との組合せを含むことができる。ドメイン／相の溶解性が異なる可能性があるので、ナノ複合体を水溶液に溶解させると、相のうち１相は他の相（１つまたは複数）より速やかに溶解し、それによって複合凝集体が徐々に分解し、結果的に、複合体構成成分を段階的に制御放出することができ、また任意により構成成分の１つまたは複数を新規な形態、例えば新たな凝集体に再形成することができる。「ナノ複合体」、「ナノ粒子」および「ナノ凝集体」という用語は、本明細書では等しく、互換的に使用される。

【0038】

[0066]本開示に記載される凝集体の大きさは、直径約１０から約５００ｎｍ、直径約３０ｎｍから約３００ｎｍの間の範囲である。凝集体は、微小粒子またはバルク材料に観察されるものとは著しく異なる、大きさに関連する特性を呈することができる。

【0039】

[0067]対称な分岐を有するＳＢＰが図１に表され、ここでは、目的のホモポリマーすべてがコアを持ち、ホモポリマー全体にわたって、末端または鎖分岐の何れかからなる対称な分岐接合部を呈する。官能基は、主として外面に存在する。

【0040】

[0068]修飾ＳＢＰは、例えば、官能基を化学的に結合することを通して得られ、例えば、Ａｌｄｒｉｃｈから市販される対称分岐ＰＡＭＡＭまたはＰＰＩデンドリマー、ポリエーテルデンドリマー、ポリエステルデンドリマー、櫛型分岐／星型分岐ポリマー、例えば、ＰＥＯ、ＰＥＧ、ＰＭＯＸまたはＰＥＯＸ、ポリスチレンを含有するもの、および櫛型分岐デンドリグラフト、例えば、ＰＥＯＸ、ＰＭＯＸまたはＰＥＩを含有するものに対して行われる。

【0041】

[0069]市販の試薬を使用して（例えば、種々の世代のＰＰＩデンドリマー、図２）、かかるＳＢＰ／デンドリマーを作製する合成手順は公知であり（例えば、「Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ」Ｆｒｅｃｈｅｔ＆Ｔｏｍａｌｉａ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．，２００１年を参照されたい）、または幾つものＳＢＰが市販されている。櫛型分岐およびコームバーストポリマーの合成は、公知である（例えば、米国特許第５，７７３，５２７号、第５，６３１，３２９号および第５，９１９，４４２号を参照されたい）。

【0042】

[0070]ＳＢＰの分岐密度が高くなると、ポリマーは分子的に緻密になり、明確な内部の
空隙を有するようになるので、かかる分子は、その中にタキサンを封入するまたは包み込む担体として適切なものとなる。

【0043】

[0071]表面修飾によって、生じた修飾ＳＢＰの特性および用途を増大させることができる。例えば、適切に修飾すれば、水に不溶性のＳＢＰを水溶性にすることができる一方で、高電荷密度のＳＢＰを修飾して、ポリマー上またはポリマー表面に極めて少ない電荷を帯びるか電荷を帯びないように修飾することができる。その一方で、水溶性のＳＢＰを疎水性の表面基で修飾して、その表面において水に不溶性または難溶性の薬剤の可溶化能力を高めるようにすることができる。修飾は、ポリマーの任意の部位、例えば、終端、分岐、主鎖残基などで行うことができる。

【0044】

[0072]本開示の一実施形態では、ＳＢＰ（例えば、対称分岐ＰＥＩデンドリマー、ＰＰＩデンドリマー、ＰＡＭＡＭデンドリマーまたは対称分岐ＰＥＩデンドリグラフトなどの何れか）は、様々な種類の、例えば第一級アミン基で、例えば、マイケル付加またはホモポリマーのアミン基上へのアクリル酸エステルの付加を通して、修飾することができる。よって、例えばマイケル付加反応を通して、ＰＥＩ、ＰＰＩおよびポリリジン（ＰＬＬ）ホモポリマーの第一級および／または第二級アミノ基上にアクリル酸メチルを導入することができる。次に、エステル基を、例えばアミド化反応によって、さらに誘導体化することができる。よって、例えば、かかるアミド化反応、例えばエチレンジアミン（ＥＤＡ）とのアミド化反応によって、新しく形成される分岐の終端にアミノ基を付加することができる。ホモポリマーへの他の修飾は、例えば、「Ｐｏｌｙ（ａｍｉｎｅｓ） ａｎｄ Ｐｏｌｙ（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔｓ）」、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｐａｒｔ Ａ）中、Ｋｒｉｃｈｅｌｄｏｒｆ編、ニューヨーク、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、１９９４年、および「Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ
Ｏｔｈｅｒ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ」、Ｆｒｅｃｈｅｔ＆Ｔｏｍａｌｉａ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．、２００１年に提示される通りの、公知の化学反応を使用して作製することができる。ＥＤＡの誘導体も使用することができ、それには、ポリエチレンアミン、テトラメチルエチレンジアミンなどを含めた、反応性ＥＤＡ、置換されたＥＤＡ、または、例えば、ポリエチレンアミンファミリーの他のメンバー（例えば、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミンなど）を含む任意の分子的実体が含まれる。

【0045】

[0073]実施形態では、修飾は、ポリマーまたはポリマーの一部の疎水性に寄与するまたは疎水性を高める部分を含むことができる。例えば、疎水性官能基として、例えば、脂肪族鎖（例えば、飽和もしくは不飽和、線状、環状または分岐を問わず、１から約２２個の炭素を含む炭化水素鎖）、芳香族構造（例えば、１つまたは複数の芳香族環を含有し、それらは縮合していてもよい）またはそれらの組合せを、修飾剤として使用し、本明細書に提示する化学反応を実施して、本明細書に教示するポリマーに付加することができる。

【0046】

[0074]そのように付加すると、修飾ＳＢＰ、例えば、修飾ＰＥＩ、ＰＰＩ、ＰＡＭＡＭデンドリマーまたはＰＥＩデンドリグラフトが形成される。ＰＰＩおよびＰＥＩなどのＳＢＰの延長として、生じた修飾ＳＢＰも対称に分岐している。溶媒の環境（すなわち、ｐＨまたは極性）に応じて、表面官能基は、様々な電荷および／もしくは電荷密度、ならびに／または疎水基を担うことができる。次に、分子の形状および表面官能基の位置（すなわち、表面官能基の折り返し（ｂａｃｋ ｆｏｌｄｉｎｇ））を、これらの特徴的な特性に基づいてさらに調節することができる。

【0047】

[0075]本開示の別の実施形態では、修飾ＳＢＰは、例えば、ホモポリマー上の適切な部位との反応に適用できることが知られている種々の合成スキームの何れかを使用して生成することができる。さらに、選択した合成スキームに種々の試薬の何れかを使用して、ホ
モポリマーの主鎖に種々の修飾または付加の何れかをもたらすことができる。よって、例えば、上述のアミンへのマイケル付加反応の場合、種々の置換基の何れかの付加を使用することができ、例えば、アルキル化段階で、例えば、種々のアクリレート試薬の何れか（１から約２２個の炭素を含み、置換されていてもよく、脂肪族、芳香族、環状の、１つもしくは複数の結合で飽和した、またはそれらの組合せである、飽和または不飽和炭化水素などの炭化水素置換基を含むアクリレートなど）を使用して、付加を使用することができる。よって、適切な反応物には、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、アクリル酸ブチル、アクリル酸ペンチル、アクリル酸ヘキシル、アクリル酸ヘプチル、アクリル酸オクチル、アクリル酸ノニル、アクリル酸デシル、アクリル酸ウンデシル、アクリル酸ドデシルなど、およびそれらの混合物が含まれる。同様に、上で例示した例におけるアミド化段階では、種々のアミンの何れかを使用することができる。例えば、ＥＤＡ、モノエタノールアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、アルキルアミン、アリルアミン、または、ＰＥＧ、ＰＥＯ、ペルフルオロポリマー、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリジメチルシロキサン、ポリアクリレート、ポリメタクリル酸メチルなど、およびそれらの混合物を含むものを含めた、任意のアミノ修飾ポリマーを使用することができる。

【0048】

[0076]かかる合成戦略を用いれば、様々な化学組成を有するさらなる分岐を導入することができる分子の対称的な成長を可能とするだけでなく、構造の外面に複数の官能基を付加することが可能となろう。前駆体ホモポリマーを修飾し、引き続き、適正な分子量および官能基を有する所望のＳＢＰが得られるまで、同じまたは異なる合成プロセスを使用して修飾することができる。加えて、かかるポリマーの疎水性および親水性の特性ならびに電荷密度を、ホモポリマーを構築するのに適したモノマーおよび適切な修飾反応を使用して、特定の用途のニーズに適合するように合せることができる。

【0049】

[0077]本開示の別の実施形態では、ダイバージェント合成手順が使用されるならば、ポリ（２−置換オキサゾリン）（例えば、ポリ（２−メチルオキサゾリン）、ポリ（２−エチルオキサゾリン）、ポリ（２−プロピルオキサゾリン）およびポリ（２−ブチルオキサゾリンなど）を含む）、ＰＥＩ、ＰＥＯ／グリコール、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリホスフェート、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）またはポリスチレンなどの対称星型分岐または櫛型分岐ホモポリマーの鎖末端を、別の小分子またはポリマーで修飾して、ホモポリマーの鎖末端に、第一級、第二級もしくは三級アミン、カルボキシレート、ヒドロキシル、脂肪族（例えば、炭化水素鎖）、芳香族、フルオロアルキル、アリール、ＰＥＧ、ＰＥＯ、アセテート、アミドおよび／またはエステル基を含めた、種々の官能基を生じることができる。あるいは、コンバージェント合成手法を利用するならば、同じ種類の官能基を鎖端末に導入できるように、種々の開始剤を利用することもできる（「Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、Ｎｅｗｋｏｍｅら編、ＶＣＨ、ワインハイム、１９９６年、「Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ」Ｆｒｅｃｈｅｔ＆Ｔｏｍａｌｉａ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．、２００１年、およびＪ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｃｈｅｍ．Ａ９（５）、７０３〜７２７頁（１９７５年））。

【0050】

[0078]開始剤は、炭化水素、すなわち、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素または両方の組合せ、それに加えて、ハライド官能基、例えば、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アラルキル、ハロゲン化アシルまたはそれらの組合せを含めた、疎水性の求電子分子であり得る。かかる化合物の例は、一官能性開始剤であり、例えば、飽和または不飽和化学結合の何れかを有する、１から約２２個の炭化水素を含有する炭化水素、例えば、ヨウ化／臭化／塩化メチル、ヨウ化／臭化／塩化エチル、１−ヨード／ブロモ／クロロブタン、１−ヨード／ブロモ／クロロヘキサン、１−ヨード／ブロモ／クロロドデカン、１−ヨード／ブロモ／クロロオクタデカン、ヨウ化／臭化／塩化ベンジルなどである。他の開始剤には、
臭化／塩化アリルが含まれる。臭化／塩化アシル、臭化／塩化ベンゾイルなどのハロゲン化アシル、およびｐ−トルエンスルホン酸、メチルトシレート、および他のトシレートエステルなどのトシル基含有化合物も使用することができる。任意の１種または複数の開始剤を組み合わせて使用することができる。

【0051】

[0079]重合中、開始剤は重合を開始するために使用することができる。使用するとき、モノマー対開始剤の種々のモル比を使用して特定のポリマーを得ることができる。特定のポリマーは、分子の大きさなど、異なる特性を有することができる。したがって、モノマー対開始剤の適切なモル比は、２０：１から８０：１、例えば、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１、６５：１、７０：１または７５：１（２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４６：１、４７：１、４８：１、４９：１、５１：１、５２：１、５３：１、５４：１、５６：１、５７：１、５８：１、５９：１、６１：１、６２：１、６３：１、６４：１、６６：１、６７：１、６８：１、６９：１、７１：１、７２：１、７３：１、７４：１、７６：１、７７：１、７８：１、７９：１など含む）であり得る。

【0052】

[0080]非対称の分岐を有するＡＢＰが図４Ａおよび４Ｂに表され、ここでは、目的のポリマーのあるものはコアを持たず、鎖および末端分岐の両方からなる非対称な分岐接合部をホモポリマー全体にわたって呈する。官能基は、多くの場合、外面と内部の両方に存在する。しかし、より大きい官能基（例えば、大きい疎水性または親水性基）が使用された場合、官能基は、優先的におよび恐らく必然的に、例えば恐らく立体効果によって、ＡＢＰの外面に付される場合が多い。したがって、かかる表面ＭＢＰは、不溶性または難溶性の薬剤を可溶化させるまたはそれらの凝集体を形成するために利用することができる。

【0053】

[0081]修飾ＡＢＰは、例えば、規則性ＡＢＰ（ポリリジン（例えば分岐ＰＬＬ）など）、不規則性ＡＢＰ（ＰＥＩ（Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓから、またはＢＡＳＦからＬｕｐａｓｏｌ（商標）の商品名で市販される）またはＬｉｔｔの手順に従って調製することができるポリオキサゾリン（Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｃｈｅｍ．Ａ９（５）、７０３〜７２７頁（１９７５年））など）に、官能基を化学的に結合することを通して得ることができる。他のＡＢＰには、これらに限定されないが、ポリアクリルアミド、ポリホスフェート、ＰＶＰ、ＰＶＡなどが含まれ得る。

【0054】

[0082]かかる修飾ＡＢＰを作製するために、種々の公知の出発物質を使用することができる。かかるモノマーおよびポリマーは、大量に、穏当な価格で市販される。例えば、目的のホモポリマーを合成するために使用することができる、かかる前駆体モノマーの１つはＰＥＩである。不規則性非対称分岐ＰＥＩの合成は公知である（Ｊｏｎｅｓら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．９、１２５（１９４４年））。種々の分子量のＰＥＩが、様々な供給源から、例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ、ＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓおよびＢＡＳＦ（商品名Ｌｕｐｏｓａｌ（商標）の商品名で）から市販されている。不規則性非対称分岐ＰＥＩは、主に、ルイス酸またはブレンステッド酸を開始剤として使用する、アジリジン（エチレンイミン）およびアゼチジン（プロピレンイミン）などの環歪みを有する環状イミンモノマーのカチオン性開環重合を通して生成される（Ｄｅｒｍｅｒら、「Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ａｚｉｒｉｄｉｎｅｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、（１９６９年）、およびＰｅｌｌ、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７１（１９５９年））。方法の多くが本質的にワンポットプロセスなので、大量の不規則性ＡＢＰを容易に生成することができる。不規則に分岐したポリ（２−置換オキサゾリン）ポリマーは、Ｌｉｔｔの手順（Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｃｈｅｍ．Ａ９（５）、７０３〜７２７頁（１９７５年））を使用して調製することができる。

【0055】

[0083]ＡＢＰを作製するための合成プロセスは、多くの場合、巨大分子の中に種々の分岐接合部を生じる。言い換えれば、末端分岐接合部と鎖分岐接合部とが混合した状態が分子構造にわたって分布している。デンドリマーおよびデンドリグラフトと比較して、不規則性ＡＢＰの分岐密度は低くなり、分子構造はオープンになり得る。分岐様式は不規則であるが、Ｄｉｃｋら、Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｃｈｅｍ．、Ａ４（６）、１３０１〜１３１４（１９７０年）およびＬｕｋｏｖｋｉｎ、Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．９、５５９（１９７３年）に記載されるように、第一級、第二級および三級アミン基の平均比率は、約１：２：１という比率に比較的一致し得る。

【0056】

[0084]分岐接合部が存在すると、非対称性分岐ＰＥＩなどの不規則性ＡＢＰは、可能な球形、卵形または同様の外形を有する巨大分子を形成することができるようになる。球状構造の中に、巨大分子の内部の不完全な分岐接合部から形成された種々の大きさのポケットが存在する。内部のポケットが常に分子の中心のコアの周辺に位置するデンドリマーおよびデンドリグラフトとは異なり、不規則性ＡＢＰのポケットは、分子全体にわたって不均等に散在する。その結果、不規則性ＡＢＰは、種々の分子とさらに反応することができる外面の官能基と不均等に分散する内部の官能基の両方を持ち、これによって、新たな巨大分子構造、すなわち目的の修飾不規則性ＡＢＰが形成される。

【0057】

[0085]コアを有するものの、規則性ＡＢＰの官能基も外面と内部の両方に分布し、それは不規則性ＡＢＰと極めてよく似ている。かかるホモポリマーの１つはＰＬＬであり、それは、米国特許第４，２８９，８７２号、第４，３６０，６４６号、および第４，４１０，６８８号に記載される通りに作製することができる。かかるホモポリマーも、不規則性ＡＢＰに関するものと同様の方式で、本明細書で教示した通りに、また当技術分野で公知の通りに修飾することができる。

【0058】

[0086]本開示のある実施形態では、ＡＢＰ（例えば、不規則性非対称分岐ＰＥＩまたは規則性非対称分岐ＰＬＬの何れか）は、例えば、マイケル付加またはポリマーのアミン上へのアクリル酸エステルの付加を通して、様々な種類の第一級アミン基で修飾される。よって、例えば、マイケル付加反応を通して、アクリル酸メチルまたは本明細書で提示する通りの他のアクリレートを、例えば、ＰＥＩおよびＰＬＬホモポリマーの第一級および／または第二級アミノ基上に導入することができる。次に、エステル基を、例えばアミド化反応によって、さらに誘導体化することができる。よって、例えば、かかるアミド化反応、例えばＥＤＡとの反応によって、新たに形成された分岐の終端にアミノ基を付加することができる。ポリマーへの他の修飾は、例えば、「Ｐｏｌｙ（ａｍｉｎｅｓ） ａｎｄ Ｐｏｌｙ（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔｓ）」、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｐａｒｔ Ａ）中、Ｋｒｉｃｈｅｌｄｏｒｆ編、ニューヨーク、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、１９９４年に提示される通りの、公知の化学反応を使用して行うことができる。

【0059】

[0087]そのように付加すると、修飾ＡＢＰ、例えば、修飾ＰＥＩまたはＰＬＬホモポリマーが形成される。ＰＥＩおよびＰＬＬなどのＡＢＰの延長として、生じた修飾ＡＢＰも非対称に分岐している。溶媒の環境（すなわち、ｐＨまたは極性）に応じて、表面官能基は、様々な電荷および電荷密度を担うことができる。次に、分子の形状および官能基の位置（すなわち、官能基の折り返し）を、これらの特徴的な特性に基づいてさらに調節することができる。

【0060】

[0088]別の実施形態では、修飾ＡＢＰは、例えば、ホモポリマー上の適した部位との反応に適用できることが知られている種々の合成スキームの何れかを使用して生成することができる。さらに、選択した合成スキームに種々の試薬の何れかを使用して、ポリマーの
主鎖に種々の修飾または付加の何れかをもたらすことができる。よって、例えば、上述のアミンへのマイケル付加反応の場合、上文で提示する通りに、種々の置換基の何れかの付加をアルキル化段階で使用することができ、例えば、飽和または不飽和炭化水素を含むことができるアクリレート（脂肪族、分岐、飽和、芳香族、環状またはそれらの組合せであってもよい、炭素１個から炭素約２２個を含むものなど）を用いて、付加を使用することができる。適切な反応物には、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、アクリル酸ブチル、アクリル酸ペンチル、アクリル酸ヘキシル、アクリル酸ヘプチル、アクリル酸オクチル、アクリル酸ノニル、アクリル酸デシル、アクリル酸ウンデシル、アクリル酸ドデシルなど、およびそれらの混合物が含まれる。同様に、上で例示した例におけるアミド化段階では、本明細書で提示される、当技術分野で公知の方法で、種々のアミンの何れかを使用することができる。例えば、ＥＤＡ、モノエタノールアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、アルキルアミン、アリルアミン、または、ＰＥＧ、ペルフルオロポリマー、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリジメチルシロキサン、ポリアクリレート、ポリメタクリル酸メチルなどを含めた任意のアミノ修飾ポリマー、およびそれらの混合物を使用することができる。加えて、脂肪族（例えば、Ｃ_１から約Ｃ_２２の炭化水素）基、芳香族基を含めた疎水基、ポリエチレンポリマー、ポリスチレンポリマー、ペルフルオロポリマー、ポリジメチルシロキサン、ポリアクリレート、ポリメタクリル酸メチル、ならびに、ＯＨ基を含めた親水性基、ＰＥＯＸ、ＰＥＧ、ＰＥＯなどの親水性ポリマーなどの修飾ＡＢＰへの結合は、例えば、エポキシ反応、アミド化反応、マレイミドと反応した−ＳＨ基または−ＮＨ_２基を使用することを含むマイケル付加反応、アルデヒド／ケトン−アミン／ヒドラジドのカップリング反応、ヨード／ヨードアセチル−ＳＨのカップリング反応、ヒドロキシルアミン−アルデヒド／ケトンのカップリング反応などを使用して実現することができる。かかる合成戦略を用いれば、より多くのポケットが導入された分子の非対称的な成長を可能とするだけでなく、構造の内部と外面の両方に複数の官能基を付加することが可能となる。ホモポリマーは、適正な分子量および官能基を有する所望のＡＢＰが得られるまで、同じまたは異なる合成プロセスを使用してさらに修飾することができる。加えて、かかるホモポリマーの疎水性および親水性の特性、ならびに電荷密度を、ホモポリマーを構築するのに適したモノマーおよび適切な修飾反応を使用して、特定の用途のニーズに適合するように合せることができる。

【0061】

[0089]本開示の別の実施形態では、ＰＯＸなどの不規則性ＡＢＰのフォーカルポイント（コンバージェント合成の間に種々の反応性鎖末端が合流する）は、末端となるか、または別の小分子と反応して、ホモポリマーの鎖末端に、第一級、第二級または第三級アミン、カルボキシレート、ヒドロキシル、アルキル、フルオロアルキル、アリール、ＰＥＧ、アセテート、アミドおよび／またはエステル基を含めた種々の官能基を生じることができる。あるいは、重合がコンバージェント合成の間に開始される場合、同じ種類の官能基を表面基に導入できるように、種々の開始剤を利用することもできる（Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｃｈｅｍ．Ａ９（５）、７０３〜７２７頁（１９７５年））。

【0062】

[0090]分岐ポリマーのフォーカルポイントに第一級アミン基を有する、アルキルで表面修飾された不規則性分岐ポリ（２−エチルオキサゾリン）は、上記のＬｉｔｔおよびＷａｒａｋｏｍｓｋｉの手順を使用して調製することができる。例えば、カチオン開環プロセスによる２−エチルオキサゾリン重合のためにＣＨ_３（ＣＨ_２）_１７−Ｂｒを開始剤として利用して不規則性分岐ポリマーを作成し、次いでＮ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルピペラジン（Ｎ−Ｂｏｃ−ピペラジン）またはＥＤＡで反応停止させることができる。大過剰のＥＤＡで終了させると、疎水性に修飾された分岐ポリ（２−エチルオキサゾリン）ポリマーを、フォーカルポイントにおいて第一級アミン基で官能化することができる（図６Ｂ）。あるいは、Ｎ−Ｂｏｃ−ピペラジンで終了させた、疎水性に修飾された分岐ポリ（２−エチルオキサゾリン）ポリマーを脱保護して、フォーカルポイントに遊離アミノ基を作成することもできる。終了させない場合は、ポリマーのフォーカルポイントを加水
分解することができ、例えば、水（例えば、１Ｎ Ｎａ_２ＣＯ_３などを含有する）に溶解させてヒドロキシル基にすることができる。

【0063】

[0091]疎水性に修飾された分岐ポリ（２−オキサゾリン）ホモポリマーに第一級アミン基を導入すると、薬剤の溶解性が高まり、タキサン誘起凝集体が生じる一方で、第一級アミン基によって、種々の標的指向性基、例えば、抗体、その抗原結合部分、抗原または結合対のメンバーなどを、疎水性に修飾された分岐ポリ（２−オキサゾリン）ポリマーに付すことも可能となる（図１０）。かかる標的指向性基およびその修飾を含有するかかる凝集体またはナノ粒子によって、タキサンを有する凝集体に標的指向能がもたらされ、タキサンが所望の治療位置で優先的にまたは単独で放出されることが可能となる。

【0064】

[0092]本明細書で教示する通りに、疎水性に修飾されたホモポリマー（ＳＢＰとＡＢＰの両方が含まれる）などのＭＢＰを使用して、水に不溶性または難溶性のタキサンを可溶化させるため、または、パクリタキセルなどの水に不溶性または難溶性のタキサンを有する、タキサン誘起ナノ粒子を形成するために、カプセル化ポリマーまたはナノカプセルを作成することができる。有機溶媒環境において、親水性または両親媒性の内部は、ポリ（２−オキサゾリン）、ポリ（２−置換オキサゾリン）（ポリ（２−メチルオキサゾリン、ポリ（２−エチルオキサゾリン）、ポリ（２−プロピルオキサゾリン）およびポリ（２−ブチルオキサゾリン）などが含まれる）、ＰＥＧ、ＰＥＯ、ポリホスホネートなどでもよい。疎水性の外面は、脂肪族炭化水素（Ｃ_１から約Ｃ_２２など）、芳香族炭化水素、ポリエチレンポリマー、ポリスチレンポリマー、ペルフルオロポリマー、ポリジメチルシロキサン、ポリアクリレート、ポリメタクリル酸メチルなどを含むことができる。水性環境では、その逆が当てはまる。水性環境での薬剤誘起凝集体において、タキサンなどの薬剤分子は、ＭＢＰの疎水基／ドメインと会合している（図９）。分岐ホモポリマーの分岐密度（例えば、星型および櫛型ホモポリマーなどの低世代から、デンドリマーおよびデンドリグラフトなどの高世代まで）ならびに疎水性表面基の被覆量（例えば、０％から１００％の被覆率）は、著しくホモポリマーの溶解性に影響を与えることができ、その結果として、タキサンの溶解能または吸着／吸収能にも影響を与える。例えば、分岐密度および疎水基の被覆量が増大すると、ホモポリマーとタキサンの適合性が上がることとなる。

【0065】

[0093]ある場合では、約０．１から約３０重量％以上の表面疎水性構成成分を有するＡＢＰおよびＳＢＰが、パクリタキセルなどの水に難溶性または不溶性のタキサンを可溶化または分散させるのに有効である。加えて、利用する分岐ホモポリマー、例えば、ＰＯＸ、ＰＥＯＸ、ＰＭＯＸ、ＰＥＯ／ＰＥＧ、ポリアクリルアミド、ポリホスフェート、ＰＶＰおよびＰＶＡが、水と種々の有機溶媒の両方に可溶であることによって、種々のタキサン含有ナノ粒子または凝集体の形成が容易となる。水に良好に可溶するとともに、他の有機溶媒の有無にかかわらず水溶液中で疎水性薬剤と良好に混和するので、かかるホモポリマーは、水に難溶性のタキサンの溶解性を高めるのに有用なものとなる。例えば、目的のホモポリマーは、製剤ステップ、加工時間に加えて、製薬産業で現在使用されている複雑で高価な装置を使用する必要性を低減することにより、製造プロセスを簡略化し、製造コストを減少させる。追加的な分岐密度が必要であれば、ＳＢＰまたはＡＢＰを最初に本明細書で記載した通りに追加的な基で修飾し、次に、例えば、タキサンの溶解性を高めるための追加的な疎水性官能基を付すことができる。

【0066】

[0094]疎水性に修飾されたＳＢＰまたはＡＢＰを、パクリタキセルなどの水に不溶性または難溶性のタキサンと混合すると、ポリマー単独で形成された凝集体とは異なる大きさを有する、異なる物理的凝集体が形成される（図１１〜１３）。ホモポリマーおよびタキサンの濃度が減少すると、ポリマー／タキサン凝集体の大きさおよび分布がポリマー単独凝集体のものに酷似するようになることから、誘起凝集体またはナノ粒子からタキサンが放出されることが示唆される。ポリマー単独凝集体の幅広い粒度分布は、脂質から構成さ
れる他の構造（タキサンと会合しているいないにかかわらず）に観察されるものと類似している。一方、目的のタキサン誘起凝集体は、それより分布の狭い特定の大きさを有する、すなわち、ある特定の大きさの独特な凝集体が生成される。凝集体中のタキサン濃度の減少、凝集体中のホモポリマー濃度の減少、凝集体濃度の減少につれて、またはそれらが任意に組み合わさったときに、凝集体の大きさが減少するおよび／または凝集体の大きさの分布が広くなることによって証明される通りに、目的の凝集体はパクリタキセルを放出する。分布が広くなるのは、タキサンが放出されることによってホモポリマー単独凝集体と種々の大きさのポリマー／タキサン凝集体が混合しているからであり、それは観察される唯一の凝集体がホモポリマー単独の特性を有するものになるまで続く。言い換えれば、タキサンは、受容者に導入された後、循環系などで徐々に放出される。その機構は、静脈内（ＩＶ）、経口、経皮、眼、筋肉内などの投与様式を含めた種々の薬剤送達用途のために、および遅延放出または持続放出プロファイルが望ましい可能性がある場合に重要である。

【0067】

[0095]ポリマー対タキサンの適切な重量比は６から８であり、例えば、６．５、７または７．５であり、６．１、６．２、６．３、６．４、６．６、６．７、６．８、６．９、７．１、７．２、７．３、７．４、７．６、７．７、７．８、７．９などが含まれる。

【0068】

[0096]重合におけるモノマー対開始剤のモル比と、ナノ粒子におけるポリマー対タキサンの重量比との組合せによって、薬剤ナノ粒子の大規模製造性、ナノ粒子の大きさ、および腫瘍縮小治療としての効力が決まる。一例として、１００：１のモノマー対開始剤モル比で合成されたポリマーを使用して、５：１のポリマー対タキサン重量比で調製したタキサン誘導凝集体は、ナノ粒子が大きくなり、例えば、凍結乾燥前に１２０〜１４０ｎｍの範囲内となる。大量に製造するとき、かかる大きいナノ粒子を、０．２μｍのフィルターに通す（注射液に必要とされる殺菌ステップ）ことは難しい。

【0069】

[0097]それと比べて、６０：１のモノマー対開始剤モル比を使用して合成されたポリマーを７：１のポリマー対タキサン重量比でタキサンと混合したとき、形成されたナノ粒子は凍結乾燥前に７０〜９０ｎｍの大きさであったために、粒子を０．２μｍのフィルターにほとんど難なく通すことが可能であった。

【0070】

[0098]凍結乾燥前に大きさが約１００ｎｍ以下である小さいナノ粒子は、大きい粒子よりも低い投与濃度で腫瘍を縮小させた。例えば、小さいナノ粒子は、大きいナノ粒子と比較すると、たった１／５のタキサン含有率で同じ癌治療効力を実現する。よって、より低い用量の薬剤を使用することができ、副作用の危険性が最小限に抑えられる。

【0071】

[0099]タキサン誘起凝集体は、標的指向性部分または基（これらに限定されないが、抗体（またはその抗原結合部分）、抗原、同種炭水化物（例えばシアル酸）、細胞表面受容体リガンド、細胞表面受容体に結合する部分、例えば前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、細胞表面の糖類に結合する部分、細胞外マトリックスリガンド、サイトゾル受容体リガンド、増殖因子、サイトカイン、インクレチン、ホルモン、レクチン、レクチンの標的、例えば、ガラクトース、ガラクトース誘導体、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノース、マンノース誘導体など、ビタミン、例えば、葉酸塩、ビオチンなど、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、ＤＮＡ、ＲＮＡなどが含まれる）と結合して、コンジュゲートを形成し、標的指向性基が目的のナノ複合体粒子に組み込まれるようにすることもできる（図１０）。
薬剤の製剤およびナノ粒子の調製
[00100]タキサンおよび修飾ホモポリマーは個々に、適切な緩衝液および／または溶媒
、例えば、緩衝液、メタノール、アセトン、エタノールなどに、適切な濃度で、例えば、一般にミリグラムまたはナノグラムの量である、ｉｎ ｖｉｖｏでの使用が確立している
濃度などで、懸濁させることができる。次に、２つの溶液は、室温またはタキサンおよびホモポリマーの完全性を維持するのに許容可能であることが公知である他の温度などの適切な温度で、１時間、２時間などの適切な期間、混合される。目的の凝集体は一旦形成されると安定なので、他のインキュベーション時間は、数分から数時間まで変動する可能性がある。凝集体は、当技術分野で公知の方法を実施して、例えば、濾過、遠心分離、蒸発、凍結乾燥、透析などによって、濃縮するまたは収集することができる。凝集体は、貯蔵寿命を延ばすために乾燥させることができる。

【0072】

[00101]例えば、パクリタキセルなどのタキサンを、４０ｍｇ／ｍＬまでの種々の量で
メタノールまたはエタノールに溶解させた。炭化水素（ＣＨ_３（ＣＨ_２）_１７）で修飾された不規則性分岐ＰＥＯＸ６０（モノマー対開始剤の比率＝６０：１）を、本明細書で教示する通りに調製し、１００ｍｇ／ｍＬまでの種々の濃度でメタノールまたはエタノールに溶解させた。

【0073】

[00102]次に、２つの溶液を種々の量で混合して、混合物中の最終的なホモポリマー対
タキサンの重量比が２：１から１０：１の範囲内になるようにし、回転蒸発させて乾燥させた。次に、この混合物を水または生理食塩水に再溶解させ、次いで０．２μＭのフィルターによって滅菌濾過し、量に応じて２０から７２時間凍結乾燥して、乾燥粉末を得た。

【0074】

[00103]凝集体またはナノ粒子の大きさは、光散乱によって測定すると、凍結乾燥前に
直径約５０から約１００ｎｍ、約６０から約９５ｎｍ、約７０から約９０ｎｍの範囲内であり（例えば、１ｍＬ当たりパクリタキセル３ｍｇにおける）、凍結乾燥後に直径約１１０まで、約１５０ｎｍまで、約１１５から約１４５ｎｍ、約１２０から約１４０ｎｍ（例えば、１ｍＬ当たりパクリタキセル５ｍｇにおける）の範囲内であり得る。

【0075】

[00104]本明細書で開示する通りの使用のための本開示の医薬組成物は、意図される投
与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例には、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下）、経口（例えば吸入）、経皮（局所）、経粘膜および直腸投与が含まれる。非経口、皮内または皮下用途に使用するための溶液または懸濁液は、滅菌希釈剤、例えば、注射用水、生理食塩水、油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム；錯化剤、例えばＥＤＴＡ；緩衝液、例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩；および張度調整剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロースを含むことができる。ｐＨは、酸または塩基、例えばＨＣｌまたはＮａＯＨで調整することができる。非経口調製物は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または複数用量バイアルに製品として封入することができる。一般に、ｉｎ ｖｉｖｏ診断薬は、経口、直腸、静脈内、腹腔内などに投与されることとなろう。

【0076】

[00105]注射液として使用するのに適切な医薬組成物は、滅菌水溶液または分散液およ
び滅菌注射用溶液または分散液を即時調製するための滅菌粉末を含む。静脈内投与の場合、最適な担体には、生理食塩水、静菌水またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。組成物は一般に、滅菌されており、注射針通過性が存在する程度に流動性がある。組成物は、製造および保管条件下で安定でなければならず、かつ細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、液体ＰＥＧ、ポリソルベートなど）およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。妥当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合は必要とされる粒径を維持することによって、増粘剤の使用および界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロ
ブタノール、フェノール、アスコルビン酸などによって実現することができる。等張化剤、例えば、マンニトール、ソルビトールなどの糖、多価アルコール、または塩化ナトリウムを、組成物に含めることができる。吸収を遅らせる作用剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを組成物中に含めることによって、注射用組成物の吸収を延長させることができる。

【0077】

[00106]滅菌注射用溶液は、活性化合物を、必要とされる量の妥当な溶媒中に、必要に
応じて上で列挙した成分の１種または組合せと共に組み込み、その後濾過滅菌することによって、調製することができる。一般に、分散液は、基剤となる分散媒および必要とされる他の成分（例えば、上で列挙したものおよび当技術分野で知られるようなものからの）を含有する滅菌ビヒクル中に、活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、調製物は、例えば、凍結乾燥、真空乾燥またはフリーズドライによって調製することができ、それらによって、活性成分に任意の所望の追加成分を加えた粉末が、予め濾過滅菌されたその溶液から得られる。目的の調製物は、保管可能であり、適切な液体で再構成して使用することができる。

【0078】

[00107]経口組成物は一般に、不活性希釈剤、風味剤（ｆｌａｖｏｒａｎｔ）、着臭剤
または食用担体を含む。組成物は、ゼラチンカプセルに封入するまたは錠剤に圧縮することができる。経口での治療的投与のために、活性化合物を賦形剤に組み込み、錠剤、トローチ剤またはカプセル剤の形態で使用することができる。経口組成物は、液状担体を使用して調製し、シロップまたは液体製剤とすることもでき、または、液状担体中の化合物を経口的に施し、うがいし、吐き出すまたは飲み込む、うがい液として使用するために調製することもできる。

【0079】

[00108]薬学的に適合する結合剤および／または補助物質を組成物の一部として含むこ
とができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、結合剤、例えば、微結晶性セルロース、トラガカントゴムもしくはゼラチン；賦形剤、例えば、デンプンもしくはラクトース、崩壊剤、例えば、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌもしくはコーンスターチ；滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅｓ；流動促進剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素；甘味料、例えば、スクロースもしくはサッカリン；または香味剤、例えば、ペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ香味剤を含有することができる。

【0080】

[00109]吸入による投与の場合、化合物は、適切な噴射剤、例えば二酸化炭素などのガ
スを含有する加圧容器もしくはディスペンサーまたはネブライザーからの湿式または乾式エアロゾル噴霧剤、あるいはミストの形態で送達される。

【0081】

[00110]全身投与も経粘膜的または経皮的手段によって行うことができる。経粘膜また
は経皮投与の場合、透過させようとするバリアに適した浸透剤が製剤に使用される。かかる浸透剤は一般に当技術分野で公知であり、それには、例えば、経粘膜投与の場合、洗浄剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻腔用スプレーまたは坐剤の使用を通して達成することができる。経皮投与の場合、活性化合物は、一般に当技術分野に公知の通りに軟膏剤、油薬、ゲルまたはクリームに製剤化される。適切な担体には、ジメチルスルホキシドが含まれる。

【0082】

[00111]化合物は、直腸に送達するために、坐剤（例えば、カカオ脂および他のグリセ
リドなどの従来の坐剤の基剤と共に）または保持浣腸剤の形態に調製することもできる。

【0083】

[00112]一実施形態では、活性化合物は、埋込体およびマイクロカプセル化送達系を含
めた制御放出製剤など、化合物が体から急速に排出されることを防ぐ担体を用いて調製さ
れる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸など、生分解性の、生体適合性ポリマーを使用することができる。

【0084】

[00113]かかる製剤を調製する方法は、当業者であれば明らかであろう。材料は、例え
ば、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃから、市販品として入手することもできる。

【0085】

[00114]本発明の凝集体は、クリーム、軟膏剤、ローション、膏薬、他の化粧品などの
、局所用形態で使用することができる。目的のタキサンなどの薬学的に活性な薬剤（ＰＡＡ）および他の生理活性または不活性化合物を担うことができ、それには、皮膚軟化薬、漂白剤、制汗剤、薬剤、保湿剤、芳香、色素、顔料、染料、酸化防止剤、油、脂肪酸、脂質、無機塩、有機分子、乳白剤、ビタミン、薬剤、角質溶解剤、ＵＶ遮断剤、日焼け促進剤、脱色剤、脱臭剤、香料、害虫忌避薬などが含まれる。

【0086】

[00115]投与を容易にし、投与量を均一にするために、経口または非経口組成物を単位
剤形で製剤化すると有利であり得る。単位剤形は、本明細書で使用される場合、治療すべき対象のための単位投与量として適切な、物理的に別々の単位を指し、各単位は、所望の治療的エンドポイントを生じるように計算された活性化合物の所定の分量を含有する。

【0087】

[00116]投与量、例えば、好ましい投与経路および量は、当技術分野で公知の方法を実
施して、前臨床および臨床試験から得られる経験的データに基づいて得ることができる。剤形および送達形態は、ＰＡＡの特性、ポリマー、実現しようとする特定の治療効果、受容者の特性および状態などによって決定付けられる場合およびそれらに依存する場合がある。数日間およびそれ以上におよぶ反復投与の場合、状態に応じて、所望のエンドポイントが得られるまで治療を持続することができる。例示的な投薬計画が、ＷＯ９４／０４１８８に開示されている。

【0088】

[00117]治療法の進捗は、患者データの入力（ｐａｔｉｅｎｔ ｉｎｐｕｔ）だけでな
く、従来の技法およびアッセイによってモニタリングすることができる。

【0089】

[00118]医薬組成物を、投与の指示書と共に容器、パック、またはディスペンサーに含
めることができる。

【0090】

[00119]別の投与方法は、目的の化合物を、栄養補助食品もしくは添加剤として、また
はビタミンと同様に予防ベースで摂取される剤形として、食品または飲料中にまたはそれらに添加することを含む。目的の凝集体は、胃の環境を通り抜けて残存すると見込まれる形態にカプセル化することができる。かかる形態は一般に知られており、例えば腸溶コーティング製剤である。あるいは、目的の凝集体は、当技術分野で公知の通りに化学的修飾するまたは遅延、持続もしくは制御放出をもたらすことが知られる作用剤と組み合わせるなど、半減期を延ばすために改変することができる。

【0091】

[00120]本開示を、ここから以下の非限定的な例で例示する。

【実施例】

【0092】

材料
[00121]対称分岐ＰＰＩデンドリマーは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
対称分岐ＰＥＩデンドリマーおよびデンドリグラフトは、米国特許第４，６３１，３３７号、第５，７７３，５２７号、第５，６３１，３２９号および第５，９１９，４４２号に提示される手順に従って調製した。すべての抗体は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂｉ
ｏｄｅｓｉｇｎまたはＦｉｔｚｇｅｒａｌｄから購入した。様々な世代のＰＡＭＡＭデンドリマーは、Ｄｅｎｄｒｉｔｅｃｈ，Ｉｎｃから購入した。
アミノ官能基を有する修飾された対称分岐ＰＰＩ（ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−ＮＨ_２−１．０）
[00122]以下を含めた試薬、対称分岐ＰＰＩ（ＳＢ−ＰＰＩ−４、８、１６、３２、６
４、ＭＷ３１６、７７３、１，６８７、３，５１４および７，１６８）、アクリル酸メチル（ＭＡ、ＦＷ＝８６．０９）、ＥＤＡ（ＦＷ＝６０．１０）およびメタノール、を利用した。

【0093】

[00123]丸底フラスコに、１．０ｇのＰＰＩ−６４デンドリマー（ＭＷ７１６８）およ
び２０ｍｌのメタノールを添加した（溶液Ａ）。別の丸底フラスコに、２．４ｇのアクリル酸メチル（ＭＡ）および１０ｍｌのメタノールを添加した（溶液Ｂ）。次に、室温で撹拌しながら溶液Ａを溶液Ｂにゆっくりと滴下した。生じた溶液を４０℃で２時間反応させた。反応完了後、溶媒および未反応のＭＡモノマーを回転蒸発によって除去し、次に、生成物である２．５ｇのＭＡ官能基化ＰＰＩを２０ｍｌのメタノールに再溶解させた。

【0094】

[00124]丸底フラスコに１６０ｇのＥＤＡおよび５０ｍｌのメタノールを添加し、その
後ＭＡ官能基化ＰＰＩを０℃でゆっくりと添加した。次に、この溶液を４℃で４８時間反応させた。溶媒および過剰なＥＤＡを、回転蒸発によって除去した。次に、粗生成物をエチルエーテル溶液から沈殿させ、透析によってさらに精製して、分子量が約２１，７６０である、約２．８ｇの第一級アミン官能基化対称分岐ＰＰＩ（ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−ＮＨ_２−１．０）を得た。生成物を、^１Ｈおよび^１３Ｃ核磁気共鳴（ＮＭＲ）ならびにサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって特性決定した。

【0095】

[00125]種々の分子量を有する他のＭＡまたは第一級アミンで修飾された対称分岐ＰＰ
Ｉデンドリマーおよび対称分岐ＰＥＩデンドリグラフトを、同様の方法で調製した。
ヒドロキシルおよびアミノ混合官能基を有する修飾された対称分岐ＰＰＩ（ｍｉｘ−ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−６４−ＮＨ_２／ＯＨ−２）
[00126]アミノ官能基化対称分岐ＰＰＩ（ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−６４−ＮＨ_２−１．０）
、ＭＡ、ＥＤＡ、モノエタノールアミン（ＭＥＡ、ＦＷ＝６１．０８）およびメタノールを利用した。

【0096】

[00127]丸底フラスコに、前の手順から生成された１．０ｇのアミノ修飾ＰＰＩすなわ
ちｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−ＮＨ_２−１．０および２０ｍｌのメタノールを添加した（溶液Ａ）。別の丸底フラスコに２．４ｇのＭＡおよび１０ｍｌのメタノールを添加した（溶液Ｂ）。次に、室温で撹拌しながら溶液Ａを溶液Ｂにゆっくりと滴下した。生じた溶液を４０℃で２時間反応させた。反応完了後、溶媒および未反応のモノマーＭＡを回転蒸発によって除去し、次に生成物である２．５ｇのＭＡ官能基化ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−６４−ＭＡ−１．５を２０ｍｌのメタノールに再溶解させた。

【0097】

[00128]丸底フラスコに、３２ｇのＥＤＡ、１３０ｇのＭＥＡおよび１００ｍｌのメタ
ノール（ＥＤＡ：ＭＥＡのモル比は２０：８０であった）を添加し、その後、ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−６４−ＭＡ−１．５を０℃でゆっくり添加した。次に、この溶液を４℃で４８時間反応させた。溶媒および過剰なＥＤＡを回転蒸発によって除去した。次に、粗生成物をエチルエーテル溶液から沈殿させ、透析によってさらに精製して、約２．８ｇのヒドロキシルおよびアミノ混合官能基化（混合表面）ＳＢＰ（ｍｉｘ−ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−６４−ＮＨ_２／ＯＨ−２．０、平均ＮＨ_２表面基２０％およびＯＨ表面基８０％、ならびに分子量約２１，８６２）を得た。

【0098】

[00129]ヒドロキシルとアミノ基の種々の比率ならびに様々な分子量を有する、修飾さ
れた他の不規則性ＡＢ−ＰＥＩおよび規則性ＡＢ−ＰＬＬ分子を同様の方法で調製した。

【0099】

[00130]不規則性非対称分岐ＰＥＩは、ＡｌｄｒｉｃｈおよびＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ
ｓから購入した。規則性ＡＢＰは、米国特許第４，２８９，８７２号に提示される手段に従って調製した。すべての抗体は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＢｉｏｄｅｓｉｇｎまたはＦｉｔｚｇｅｒａｌｄから購入した。
アミノ官能基を有する修飾された不規則性非対称分岐ＰＥＩ（ｍ−ｒａｎ−ＡＢ−ＰＥＩ−ＮＨ_２−１．０）
[00131]不規則性非対称分岐ＰＥＩ（ｒａｎ−ＡＢ−ＰＥＩ、ＭＷ２，０００、２５，
０００および７５，０００）、ＭＡ、ＥＤＡおよびメタノールを利用した。

【0100】

[00132]丸底フラスコに１．０ｇのＰＥＩ（ＭＷ２，０００）および２０ｍｌのメタノ
ールを添加した（溶液Ａ）。別の丸底フラスコに、３．０ｇのＭＡおよび１０ｍｌのメタノールを添加した（溶液Ｂ）。次に、室温で撹拌しながら溶液Ａを溶液Ｂにゆっくりと滴下した。生じた溶液を４０℃で２時間反応させた。反応完了後、溶媒および未反応のＭＡを回転蒸発によって除去し、次に生成物であるＭＡ官能基化ＰＥＩを２０ｍｌのメタノールに再溶解させた。

【0101】

[00133]丸底フラスコに、８０ｇのＥＤＡおよび５０ｍｌのメタノールを添加し、その
後、ＭＡ官能基化ＰＥＩを０℃でゆっくり添加した（メタノール２０ｍｌ中にＭＡ１ｇが溶解）。次に、この溶液を４℃で４８時間反応させた。溶媒および過剰なＥＤＡを回転蒸発によって除去した。次に、粗生成物をエチルエーテル溶液から沈殿させ、透析によってさらに精製して、分子量が約７，３００である、約３．０ｇの第一級アミン官能基化不規則性非対称分岐ＰＥＩ（ｍ−ｒａｎ−ＡＢ−ＰＥＩ−ＮＨ_２−１．０）を得た。生成物を、^１Ｈおよび^１３ＣＮＭＲならびにＳＥＣによって特性決定した。

【0102】

[00134]種々の分子量を有する、他のＭＡまたは第一級アミンで修飾された不規則性非
対称分岐ＰＥＩおよび規則性非対称分岐ＰＬＬポリマーを、同様の方法で調製した。
炭化水素鎖での分岐ポリマーの修飾
[00135]不規則性分岐ＰＥＩの１０％炭化水素鎖での修飾を一例として使用する。１グ
ラムの分岐ＰＥＩ（ＦＷ＝２５０００）を１０ｍＬのメタノールに溶解させた。この溶液に、０．２３ｇの１，２−エポキシヘキサン（ＦＷ＝１００．１６）を添加し、混合物を４０℃で２時間加熱した。次に、溶媒を回転蒸発させ、残留物を水に再溶解させた。透析（３，５００カットオフ）後、修飾されたＰＥＩが生じた。

【0103】

[00136]種々の割合（％）および長さ（例えば、Ｃ_４、Ｃ_１２、Ｃ_１８およびＣ_２２）
の炭化水素鎖を有する他のＭＢＰ、例えば、ＰＡＭＡＭ、ＰＥＩおよびＰＰＩのデンドリマーおよびデンドリグラフト、ならびに非対称ＰＬＬを同様の方法で調製した。
ヒドロキシルおよびアミノ混合官能基を有する修飾された不規則性非対称分岐ＰＥＩ（ｍ−ｒａｎ−ＡＢ−ＰＥＩ−ＮＨ_２／ＯＨ−２）
[00137]アミノ官能基化不規則性非対称分岐ＰＥＩ（ｍ−ｒａｎ−ＡＢ−ＰＥＩ−ＮＨ
_２−１．０）、ＭＡ、ＥＤＡ、モノエタノールアミン（ＭＥＡ、ＦＷ＝６１．０８）およびメタノールを利用した。

【0104】

[00138]丸底フラスコに、前の手順から生成された１．０ｇのアミノ修飾ＰＥＩすなわ
ちｍ−ｒａｎ−ＡＢ−ＰＥＩ−ＮＨ_２−１．０および２０ｍｌのメタノールを添加した（溶液Ａ）。別の丸底フラスコに３．０ｇのＭＡおよび１０ｍｌのメタノールを添加した（溶液Ｂ）。次に、室温で撹拌しながら溶液Ａを溶液Ｂにゆっくりと滴下した。生じた溶液を４０℃で２時間反応させた。反応完了後、溶媒および未反応のＭＡを回転蒸発によって除去し、次に、生成物であるＭＡ官能基化ｍ−ｒａｎ−ＡＢ−ＰＥＩ−ＭＡ−１．５を２０ｍｌのメタノールに再溶解させた。

【0105】

[00139]丸底フラスコに、６０ｇのＥＤＡ、２４４ｇのＭＥＡおよび１００ｍｌのメタ
ノール（ＥＤＡ：ＭＥＡのモル比は２０：８０であった）を添加し、その後、ｍ−ｒａｎ−ＡＢ−ＰＥＩ−ＭＡ−１．５を０℃でゆっくり添加した（メタノール２０ｍｌ中にＭＡ１ｇが溶解）。次に、この溶液を４℃で４８時間反応させた。溶媒および過剰なＥＤＡを回転蒸発によって除去した。次に、粗生成物をエチルエーテル溶液から沈殿させ、透析によってさらに精製して、約２．４ｇのヒドロキシルおよびアミノ混合官能基化不規則性ＡＢＰ（ｍ−ｒａｎ−ＡＢ−ＰＥＩ−ＮＨ_２／ＯＨ−２．０、平均ＮＨ_２表面基２０％およびＯＨ表面基８０％、ならびに分子量は約１８，０００であった）を得た。

【0106】

[00140]ヒドロキシル基とアミノ基の種々の比率ならびに様々な分子量を有する、他の
修飾された不規則性ＡＢ−ＰＥＩおよび規則性ＡＢ−ＰＬＬポリマーを同様の方法で調製した。
第一級アミン鎖末端基を有する、アルキル修飾された不規則性非対称分岐ポリ（２−エチルオキサゾリン）（ＰＥＯＸ）
[00141]ＣＨ_３−（ＣＨ_２）_１１−ＰＥＯＸ−ＡＢＰ１００（Ｃ_１２ＡＢＰ１００は、
初期反応におけるモノマー対開始剤の比率を表すための独断的な名称である）を、コアシェル構造を調製する一般的手順の通りに合成する。ＣＨ_３（ＣＨ_２）_１１−Ｂｒ（２．５２ｇ）を５００ｍｌのトルエン中に混合したものに蒸留ヘッドを付け、Ｎ_２下で約１５分間共沸して水を除去した。２−エチルオキサゾリン（１００ｇ）を、添加漏斗を通して滴加し、混合物を２４〜４８時間の間還流した。重合完了後、１２．１２ｇのＥＤＡを反応性ポリマー溶液（Ａ）に添加し、アミン官能基を導入した。ＰＯＸ鎖末端対ＥＤＡのモル比は１対２０であった。

【0107】

[00142]あるいは、Ｎ−Ｂｏｃ−ピペラジンまたは水（例えば、１Ｎ Ｎａ_２ＣＯ_３を
有する）を添加して反応を終了させることもできる。モルホリンまたはＰＥＩを反応性ポリマー溶液（Ａ）に添加して反応を終了させることもできる。粗生成物をメタノールに再溶解させ、次に大過剰のジエチルエーテルから沈殿させる。最下層をメタノールに再溶解させ、回転蒸発および真空によって乾燥させ、非対称不規則性分岐ＰＥＯＸポリマーを白色固体（１０１ｇ）として得た。

【0108】

[00143]他の非対称不規則性分岐ポリマー、例えば、Ｃ_６−ＰＥＯＸ ＡＢＰ２０、５
０、１００、２００、３００および５００、Ｃ_１２−ＰＥＯＸ ＡＢＰ２０、５０、２００、３００および５００、Ｃ_２２−ＰＥＯＸ ＡＢＰ２０、５０、１００、２００、３００および５００、ならびにポリスチレン−ＰＥＯＸなど、ならびに非修飾および修飾ポリ（２−置換オキサゾリン）、例えばポリ（２−メチルオキサゾリン）、を同様の方法で調製した。すべての生成物をＳＥＣおよびＮＭＲによって分析した。
第一級アミン鎖末端基を有する、アルキル修飾された不規則性非対称分岐ポリ（２−エチルオキサゾリン）（ＰＥＯＸ）
[00144]ＣＨ_３−（ＣＨ_２）_１７−ＰＥＯＸ−ＡＢＰ６０（Ｃ_１８ＡＢＰ６０は、初期
反応におけるモノマー対開始剤の比率を表すための独断的な名称である）を、コアシェル構造を調製する一般的手順の通りに合成する。ＣＨ_３（ＣＨ_２）_１７−Ｂｒ（５．６１ｇ）を５００ｍｌのトルエン中に混合したものに蒸留ヘッドを付け、Ｎ_２下で約１５分間共沸して水を除去した。２−エチルオキサゾリン（１００ｇ）を添加漏斗を通して滴加し、混合物を２４〜４８時間の間還流した。重合完了後、１０．１ｇのＥＤＡを反応性ポリマー溶液（Ａ）に添加し、アミン官能基を導入した。ポリオキサゾリン反応性鎖末端対ＥＤＡのモル比は１対１０であった。

【0109】

[00145]あるいは、Ｎ−Ｂｏｃ−ピペラジンまたは水（例えば、１Ｎ Ｎａ_２ＣＯ_３を
有する）を添加して反応を終了させることもできる。モルホリンまたはＰＥＩを反応性ポ
リマー溶液（Ａ）に添加して反応を終了させることもできる。粗生成物をメタノールに再溶解させ、次に大過剰のジエチルエーテルから沈殿させる。最下層をメタノールに再溶解させ、回転蒸発および真空によって乾燥させ、非対称不規則性分岐ＰＥＯＸポリマーを白色固体として得た。

【0110】

[00146]他の非対称不規則性分岐ポリマー、例えば、Ｃ_１８−ＰＥＯＸ ＡＢＰ２０、
４０、５０、７０、８０、１００、１２０、２００、３００、５００など、ならびに非修飾および修飾ポリ（２−置換オキサゾリン）、例えば、ポリ（２−メチルオキサゾリン）、を同様の方法で調製した。すべての生成物をＳＥＣおよびＮＭＲによって分析した。
混合表面で修飾された対称分岐ポリマー−ＩｇＧコンジュゲート
[00147]混合表面（ＯＨ／ＮＨ_２混合）で修飾された対称分岐ＰＰＩ−ＩｇＧコンジュ
ゲート（ｍｉｘ−ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−６４−ＮＨ_２／ＯＨ−２−ＩｇＧコンジュゲート）を、ポリマー抗体を調製する一般的手順の通りに調製する。

【0111】

[00148]他のコンジュゲート、例えば、ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−４−ＮＨ_２−１−ＩｇＧ、
ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−８−ＮＨ_２−１−ＩｇＧ、ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−１６−ＮＨ_２−１−ＩｇＧ、ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−３２−ＮＨ_２−１−ＩｇＧ、ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−４−ＮＨ_２−２−ＩｇＧ、ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−８−ＮＨ_２−２−ＩｇＧ、ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−１６−ＮＨ_２−２−ＩｇＧ、ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−３２−ＮＨ_２−２−ＩｇＧ、ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−４−ＮＨ_２−３−ＩｇＧ、ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−８−ＮＨ_２−３−ＩｇＧ、ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−１６−ＮＨ_２−３−ＩｇＧ、ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−３２−ＮＨ_２−３−ＩｇＧ、ｍｉｘ−ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−４−ＮＨ_２／ＯＨ−１（ＯＨ／ＮＨ_２混合）−ＩｇＧ、ｍｉｘ−ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−８−ＮＨ_２／ＯＨ−１（ＯＨ／ＮＨ_２混合）−ＩｇＧ、ｍｉｘ−ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−１６−ＮＨ_２／ＯＨ−１（ＯＨ／ＮＨ_２混合）−ＩｇＧ、ｍｉｘ−ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−３２−ＮＨ_２／ＯＨ−１（ＯＨ／ＮＨ_２混合）−ＩｇＧ、ｍｉｘ−ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−４−ＮＨ_２／ＯＨ−２（ＯＨ／ＮＨ_２混合）−ＩｇＧ、ｍｉｘ−ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−８−ＮＨ_２／ＯＨ−２（ＯＨ／ＮＨ_２混合）−ＩｇＧ、ｍｉｘ−ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−１６−ＮＨ_２／ＯＨ−２（ＯＨ／ＮＨ_２混合）−ＩｇＧ、ｍｉｘ−ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−３２−ＮＨ_２／ＯＨ−２（ＯＨ／ＮＨ_２混合）−ＩｇＧ、ｍｉｘ−ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−４−ＮＨ_２／ＯＨ−３（ＯＨ／ＮＨ_２混合）−ＩｇＧ、ｍｉｘ−ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−８−ＮＨ_２／ＯＨ−３（ＯＨ／ＮＨ_２混合）−ＩｇＧ、ｍｉｘ−ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−１６−ＮＨ_２／ＯＨ−３（ＯＨ／ＮＨ_２混合）−ＩｇＧ、ｍｉｘ−ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−３２−ＮＨ_２／ＯＨ−３（ＯＨ／ＮＨ_２混合）−ＩｇＧ、ならびに第一級アミンおよび混合ＯＨ／ＮＨ_２で修飾されたコームバーストＰＥＩデンドリグラフト（０〜５世代）も、同様の方法で得た。目的の修飾ＳＢＰに付された他の標的指向性部分の合成も同様の方法で得た。
ＬＣ−ＳＰＤＰ−混合表面ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−６４−ＮＨ_２／ＯＨ−２
[00149]混合表面不規則分岐ｍｉｘ−ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−６４−ＮＨ_２／ＯＨ−２（４
×１０^−７ｍｏｌ）を含む４００μｌのリン酸塩緩衝液（２０ｍＭリン酸塩および０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）に、４．０×１０^−６ｍｏｌのスルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（Ｐｉｅｒｃｅ、ＩＬ）を含む水４００μＬを添加した。混合物をボルテックスし、３０℃で３０分間インキュベートした。ＬＣ−ＳＰＤＰ−ｍｉｘ−ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−６４−ＮＨ_２／ＯＨ−２をゲル濾過クロマトグラフィーによって精製し、緩衝液Ａ（０．１Ｍリン酸塩、０．１Ｍ ＮａＣｌおよび５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．８）で平衡化した。生成物をさらに濃縮し、およそ０．７７ｎｍｏｌの濃度の４６５μＬの溶液を得た。
チオール化ｍｉｘ−ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−６４−ＮＨ_２／ＯＨ−２
[00150]ＬＣ−ＳＰＤＰ ｍｉｘ−ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−６４−ＮＨ_２／ＯＨ−２（６５
μｌの緩衝液Ａ中に５０ｎｍｏｌ）を、１００μＬのジチオスレイトール（ＤＴＴ）（緩衝液Ａ中に５０ｍＭ））と混合し、室温で１５分間インキュベートした。過剰なＤＴＴおよび副生物を、緩衝液Ａを用いたゲル濾過によって除去した。生成物を１０Ｋ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ中で濃縮し、３９０μＬのチオール化ｍｉｘ−ｍ
−ＳＢ−ＰＰＩ−６４−ＮＨ_２／ＯＨ−２を得て、これを活性化抗体とのコンジュゲーションに使用した。
マレイミドＲ（ＭＡＬ−Ｒ）活性化抗体
[00151]抗体を含むＰＢＳ（３１０μＬ、５．１ｍｇすなわち３４ｎｍｏｌ）に、２０
．４μＬのＭＡＬ−Ｒ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）溶液（１０ｍＭ水溶液）を添加した。混合物をボルテックスし、３０℃で１５分間インキュベートした。生成物を、緩衝液Ａを用いたゲル濾過によって精製した。マレイミド−Ｒ活性化抗体を、チオール化ｍｉｘ−ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−６４−ＮＨ_２／ＯＨ−２とのコンジュゲーションに使用した。
ｍｉｘ−ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−６４−ＮＨ_２／ＯＨ−２−抗体コンジュゲート
[00152]チオール化ｍｉｘ−ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−６４−ＮＨ_２／ＯＨ−２（３１０μＬ
または３５．７ｎｍｏｌ）にＭＡＬ−Ｒ活性化抗体（４．８ｍＬまたは３４ｎｍｏｌ）を添加した。反応混合物をおよそ８００μＬに濃縮し、次に、４℃で一晩および／または室温で約１時間インキュベートした。完了後、反応を１００μＬのエチルマレイミド（５０ｍＭ溶液）で停止させ、次に、コンジュゲートを、ｐＨ６の２０ｍＭリン酸塩緩衝液中塩化ナトリウムの段階的勾配を用いるカルボキシメチルセルロース（ＣＭ）カラム（５ｍＬ）で分画した。コンジュゲートを塩化ナトリウムの勾配で溶離し、陽イオン交換クロマトグラフィー、紫外分光法およびポリアクリルアミドゲル電気泳動によって特性決定した。還元カップリングによるコンジュゲーション−抗体の還元
[00153]抗体２．１ｍｇすなわち１４ｎｍｏｌを含む１６０μＬの緩衝液Ｂ（０．１Ｍ
リン酸ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．１Ｍ ＮａＣｌを含有する、ｐＨ６．０）に、４０μＬのＤＴＴ（緩衝液Ｂ中に５０ｍＭ）を添加した。この溶液を室温で３０分間静置した。生成物を、緩衝液Ｂで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムでのゲル濾過によって精製した。還元した抗体を２２０μＬに濃縮し、コンジュゲーションに使用した。
ＭＡＬ−Ｒ−混合表面修飾ＳＢＰ
[00154]４００μＬ（４００ｘ１０^−９モル）、ｐＨ７．４における混合表面修飾ＳＢ
Ｐに、４００μＬのＭＡＬ−Ｒ−ＮＨＳ（１０ｍＭ水溶液）を添加した。これを混合し、３０℃で１５分間インキュベートした。完了後、生成物を緩衝液Ｂで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムで精製した。ＭＡＬ−Ｒ−混合表面修飾ＳＢＰを収集し、同じ緩衝液中で一定分量にして−４０℃で保管した。
混合表面修飾ＳＢＰ−抗体コンジュゲート
[00155]還元された抗体（２２０μＬ中１４ｎｍｏｌ）に、撹拌しながらＭＡＬ−Ｒ−
ｍｉｘ−ｍ−ＳＢ−ＰＰＩ−６４−ＮＨ_２／ＯＨ−２（１５４μＬ、１６．６ｎｍｏｌ）を添加した。１２．５μＬの炭酸ナトリウム（１．０Ｍ溶液）を添加することによってｐＨを約６．８に調整し、反応を１時間室温で継続し、１００μＬのシステアミン（０．４ｍＭ溶液）を添加して終了させた。コンジュゲーション混合物を、塩化ナトリウム勾配溶離を用いるＣＭセルロースカラムで精製した。
ＩｇＧ−非対称不規則性分岐ポリマーコンジュゲート
[00156]不規則性分岐混合表面（ＯＨ／ＮＨ_２混合）ｍ−ｒａｎ−ＡＢ−ＰＥＩ−ＮＨ
_２／ＯＨ−２−ＩｇＧコンジュゲートを、ポリマー−抗体コンジュゲートを調製する一般的手順の通りに調製する。

【0112】

[00157]他のコンジュゲート、例えば、ＰＥＩ−ＩｇＧ、ｍ−ｒａｎ−ＡＢ−ＰＥＩ−
ＮＨ_２−１−ＩｇＧ、ｍ−ｒａｎ−ＡＢ−ＰＥＩ−ＮＨ_２−２−ＩｇＧ、ｍ−ｒａｎ−ＡＢ−ＰＥＩ−ＮＨ_２−３−ＩｇＧ、ｍ−ｒａｎ−ＡＢ−ＰＥＩ−ＮＨ_２−４−ＩｇＧ、ならびにｍ−ｒａｎ−ＡＢ−ＰＥＩ−ＮＨ_２／ＯＨ−１（ＯＨ／ＮＨ_２混合）−ＩｇＧ、ｍ−ｒａｎ−ＡＢ−ＰＥＩ−ＮＨ_２／ＯＨ−２（ＯＨ／ＮＨ_２混合）−ＩｇＧ、ｍ−ｒａｎ−ＡＢ−ＰＥＩ−ＮＨ_２／ＯＨ−３（ＯＨ／ＮＨ_２混合）−ＩｇＧ、規則性ポリリジンポリマー、第一級アミン鎖末端を有するアルキル修飾不規則性分岐ポリ（２−エチルオキサ
ゾリン）をすべて同様の方法で合成した。非対称不規則性分岐ＰＥＯＸポリマーとの種々のタンパク質コンジュゲートの合成も同様の方法で行う。
ＬＣ−ＳＰＤＰ−混合表面ｍ−ｒａｎ−ＡＢ−ＰＥＩ−ＮＨ_２／ＯＨ−２
[00158]混合表面不規則分岐ｍ−ｒａｎ−ＡＢ−ＰＥＩ−ＮＨ_２／ＯＨ−２（４×１０
^−７ｍｏｌ）を含む４００μＬのリン酸塩緩衝液（２０ｍＭリン酸塩および０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）に、４．０×１０^−６ｍｏｌのスルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（Ｐｉｅｒｃｅ、ＩＬ）を含む水４００ｍＬを添加した。これをボルテックスし、３０℃で３０分間インキュベートした。ＬＣ−ＳＰＤＰ−ｍ−ｒａｎ−ＡＢ−ＰＥＩ−ＮＨ_２／ＯＨ−２をゲル濾過クロマトグラフィーによって精製し、緩衝液Ａ（０．１Ｍリン酸塩、０．１Ｍ ＮａＣｌおよび５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．８）で平衡化した。生成物をさらに濃縮し、およそ０．７７ｎｍｏｌ／μｍｏｌの濃度の４６５μｌの溶液を得た。
チオール化ｍ−ｒａｎ−ＡＢ−ＰＥＩ−ＮＨ_２／ＯＨ−２
[00159]ＬＣ−ＳＰＤＰ ｍ−ｒａｎ−ＡＢ−ＰＥＩ−ＮＨ_２／ＯＨ−２（６５ｍｌの
緩衝液Ａ中に５０ｎｍｏｌ）を、１００μＬのジチオスレイトール（ＤＴＴ）（緩衝液Ａ中に５０ｍＭ）と混合し、室温で１５分間インキュベートした。過剰なＤＴＴおよび副生物を、緩衝液Ａを用いたゲル濾過によって除去した。生成物を１０Ｋ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ中で濃縮し、３９０μＬのチオール化ｍ−ｒａｎ−ＡＢ−ＰＥＩ−ＮＨ_２／ＯＨ−２を得て、これを活性化抗体とのコンジュゲーションに使用した。

【0113】

[00160]上で記載した通りに作製したマレイミド−Ｒ活性化抗体を、チオール化ｍ−ｒ
ａｎ−ＡＢ−ＰＥＩ−ＮＨ_２／ＯＨ−２とのコンジュゲーションに使用した。
ｍ−ｒａｎ−ＡＢ−ＰＥＩ−ＮＨ_２／ＯＨ−２−抗体コンジュゲート
[00161]チオール化ｍ−ｒａｎ−ＡＢ−ＰＥＩ−ＮＨ_２／ＯＨ−２（３１０μＬすなわ
ち３５．７ｎｍｏｌ）をＭＡＬ−Ｒ活性化抗体（４．８ｍＬすなわち３４ｎｍｏｌ）に添加した。反応混合物をおよそ８００μＬに濃縮し、４℃で一晩および／または室温で約１時間インキュベートした。完了後、反応を１００μＬのエチルマレイミド（５０ｍＭ溶液）で反応停止させ、次に、コンジュゲートを、ｐＨ６の２０ｍＭリン酸塩緩衝液中塩化ナトリウムの段階的勾配を用いるＣＭセルロースカラム（５ｍＬ）で分画した。コンジュゲートを塩化ナトリウムの勾配で溶離し、陽イオン交換クロマトグラフィー、紫外分光法およびポリアクリルアミドゲル電気泳動によって特性決定した。
パクリタキセル製剤およびナノ粒子の調製
[00162]一般的手順の通りに、パクリタキセルを４０ｍｇ／ｍＬの濃度までメタノール
に溶解させた。別にＣ_１８ＰＥＯＸＡＢＰ６０ポリマーを１００ｍｇ／ｍＬの濃度までメタノールに溶解させた。次に、２つの溶液を種々の量で混合し、混合物中の最終的なポリマー対パクリタキセルのモル比が３：１から１０：１の範囲内になるようにした。続いて、混合物を量に応じて２０〜９６時間凍結乾燥した。

【0114】

[00163]光散乱で測定した凝集体の大きさは、凍結乾燥前は直径約７０ｎｍから９０ｎ
ｍ、凍結乾燥後は１２０〜１４０ｎｍの範囲内であった。

【0115】

[00164]あるいは、パクリタキセルとＣ_１８ＰＥＯＸＡＢＰ６０ポリマーの両方を、ア
セトン、メタノールまたはエタノールなどの共通の溶媒に溶解させ、次に撹拌または超音波処理しながら水に滴加し、その後０．２２μｍのフィルターで滅菌濾過することができる。次に、凍結乾燥によって最終生成物を生じ、凝集体の大きさを光散乱によって測定することができる。

【0116】

[00165]疎水性に表面修飾された種々の分岐ポリマー、例えば、Ｃ_４、Ｃ_６、Ｃ_１２ま
たはＣ_２２炭化水素で修飾された不規則分岐ＰＥＯＸ、ＰＥＩおよびＰＰＩポリマー；Ｃ_４、Ｃ_６、Ｃ_１２、Ｃ_１８およびＣ_２２炭化水素で修飾されたＰＡＭＡＭ、ＰＥＩおよび
ＰＰＩのデンドリマーおよびデンドリグラフト；ならびにＣ_４、Ｃ_６、Ｃ_１２、Ｃ_１８およびＣ_２２炭化水素で修飾された分岐ＰＬＬ／ポリマーを使用する、他のタキサン誘起凝集体またはナノ粒子は、同様の方法で調製することができる。
Ｃ_１８ＰＥＯＸＡＢＰ６０ポリマー対パクリタキセルの比率が７：１であるナノ粒子
[00166]Ｃ_１８ＰＥＯＸＡＢＰ６０（７００ｍｇ）を９．３３ｍＬのメタノールに溶解
させ、７５ｍｇ／ｍＬの溶液を得た。パクリタキセルの１５ｍｇ／ｍＬ溶液も、１００ｍｇを６．６７ｍＬのメタノールに溶解させることによって調製した。２つの溶液を２０分間混合すると、１ｍＬ当たり６．２５ｍｇのパクリタキセルと４３．７５ｍｇのポリマーとを含有する溶液が得られ、ポリマー対薬剤の比率が７：１である溶液となった。混合物を回転蒸発器に入れて、メタノールを蒸発除去させて乾燥させた。生じた固体を撹拌しながら３３．３ｍＬの水に再溶解させて、最終的なパクリタキセル濃度である３ｍｇ／ｍＬとした。この溶液調製物を０．８μｍのフィルターに通し、次に０．２２μｍのフィルターに通した。濾液を、使用した量に応じて２４〜７２時間にわたって凍結乾燥した。このバイアルに栓をし、即時使用可能な白色粉末を室温で保管した。この調製物をＦＩＤ−００７と名付けた。
ナノ粒子の測定
[00167]種々のポリマー、ポリマー単独凝集体、ならびに薬剤誘起ポリマー凝集体の大
きさを、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ−ＺＳ Ｚｅｎ３６００粒径分析器を使用する動的光散乱法によって測定した。
活性試験
[00168]生細胞は代謝によってＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨなどの「還元当量」を生成す
る。かかる還元性化合物は、中間的な電子輸送試薬に電子を渡し、それはテトラゾリウム製品、ＭＴＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を還元して水溶性、着色性のホルマザン産物にすることができる。細胞は、死ぬとテトラゾリウム製品を還元する能力を急速に失う。したがって、着色したホルマザン産物の産生は、培養物中の生細胞の数に比例する。

【0117】

[00169]ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ製品（Ｐｒｏｍｅｇａ）
は、培養物中の生細胞の数を決定するためのＭＴＳアッセイである。ＭＴＳテトラゾリウムはＭＴＴテトラゾリウムと類似しているが、ＭＴＳ還元のホルマザン産物が細胞培養培地に可溶であり、可溶化させる溶液の使用を必要としないという利点がある。アッセイウェルに直接添加する単一の試薬を、培養培地１００μｌに対して試薬２０μｌという推奨比率で使用した。細胞を３７℃で１〜４時間インキュベートし、次に４９０ｎｍでの吸光度を測定した。
ナノカプセル化パクリタキセル／ＡＢＰ６０（ＦＩＤ−００７）の毒性および効力
[00170]前述の通りに、ナノカプセル化パクリタキセルを、Ｃ_１８ＡＢＰ６０ポリマー
を使用して、７：１のポリマー対パクリタキセル比で調製した。ＦＩＤ−００７と名付けたその調製物を、正常なヒト皮膚線維芽細胞株および種々の癌細胞株を用いた細胞障害性試験、ならびに３種のマウス異種移植モデルでの毒性（最大耐用量、すなわちＭＴＤ）および腫瘍増殖の阻害に関するｉｎ ｖｉｖｏ試験において、ＴａｘｏｌおよびＡｂｒａｘａｎｅと比較した。
ＦＩＤ−００７のＩｎ Ｖｉｔｒｏ活性
[00171]ＦＩＤ−００７を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害性実験において、Ｔａｘｏｌお
よびＡｂｒａｘａｎｅと共に正常なヒト線維芽細胞および種々の癌細胞株で試験した。ＦＩＤ−００７は、乳癌、卵巣癌および肺癌細胞に由来する細胞株を含めた一連のヒト癌細胞株の増殖をｉｎ ｖｉｔｒｏで阻害する一方で、ＦＩＤ−００７は、ＴａｘｏｌおよびＡｂｒａｘａｎｅに観察されるレベルと同様の、正常細胞に対するより低い毒性を示した（図１５）。総じて、ＦＩＤ−００７は、正常細胞に対して腫瘍細胞に対するよりも１０倍毒性が低く、１００μＭ超という極めて高いＥＣ_５０を示した。ＦＩＤ−００７は、ヒト肺癌細胞株Ａ５４９での７２時間の毒性アッセイで活性であり、ＩＣ_５０は２．８ｎｇ／ｍＬであった（図１６）。正常細胞に対するＦＩＤ−００７の細胞障害は、Ｔａｘｏｌ
およびＡｂｒａｘａｎｅのそれと同等であった。ＦＩＤ−００７はＭＤＡ−ＭＢ−２３１（トリプルネガティブ乳癌細胞）に対して細胞障害性であり、ＩＣ_５０は４．９ｎｇ／ｍＬであった（図１７）。ＦＩＤ−００７は、ＯＶ−９０（卵巣癌細胞）に対して細胞障害性であり、ＩＣ_５０は５．０ｎｇ／ｍＬであった（図１８）。３種の癌細胞株すべてについて、ＦＩＤ−００７の細胞障害は、ＴａｘｏｌおよびＡｂｒａｘａｎｅのそれと同等であった。
ＦＩＤ−００７のＩｎ Ｖｉｖｏ活性
[00172]一連の実験を行って、マウスに静脈内投与されたＦＩＤ−００７のｉｎ ｖｉ
ｖｏでの忍容性、活性、および 基本的薬物動態を、ＴａｘｏｌおよびＡｂｒａｘａｎｅと比較して決定した。ＦＩＤ−００７は、毎日最大１５０ｍｇ／ｋｇの投薬まで忍容性が高かった。抗新生物活性を確認するために、３種の異なるマウス異種移植モデル（肺癌、卵巣癌および乳癌を含む）において、ＦＩＤ−００７を忍容性が高い用量でマウスに毎日静脈内投与した。概して、ＦＩＤ−００７は、マウス異種移植モデルにおいて、ＴａｘｏｌおよびＡｂｒａｘａｎｅなどの同様の標的を有する標準的な細胞障害剤より忍容性が高く、腫瘍の増殖を選択的に阻害した。

【0118】

[00173]マウスでのＦＩＤ−００７の半減期を、最適化したＨＰＬＣ法を使用して決定
すると、およそ９．３時間であった。肝臓および脾臓、次いで血液が、１時間目に最大のＦＩＤ−００７濃度を有する器官であった。ＦＩＤ−００７、ＴａｘｏｌおよびＡｂｒａｘａｎｅのＰＫプロファイルを図１９に示す。

【0119】

[00174]健康なＣＤ−１マウスおよびＳＣＩＤ（免疫不全）マウスの尾静脈を介して種
々の用量の薬剤を数週間にわたって投与した試験において、ＦＩＤ−００７の単回投与のＭＴＤをＴａｘｏｌおよびＡｂｒａｘａｎｅのそれと比較した。対照のマウスには生理食塩水を投与した。ＣＤ−１マウスの単回投与のＭＴＤは、Ｔａｘｏｌ、Ａｂｒａｘａｎｅ、およびＦＩＤ−００７について、それぞれ２０ｍｇ／ｋｇ、２４０ｍｇ／ｋｇ、および１７５ｍｇ／ｋｇであることが見出された。大きな副作用は、生存したすべてのマウスでは観察されなかった。しかし、対照群（生理食塩水で処置）と比較して、体重増加がＡｂｒａｘａｎｅおよびＦＩＤ−００７の投与群すべてに観察された。１２０ｍｇ／ｋｇ以上のＡｂｒａｘａｎｅによって、用量依存的な体重の増加が生じた。同じことが１５０ｍｇ／ｋｇ以上の用量のＦＩＤ−００７で観察された。

【0120】

[00175]ＦＩＤ−００７の多回投与のＭＴＤを、０日目、３日目、６日目に、健康なＣ
Ｄ−１およびＳＣＩＤマウス（１０週、雌）に尾静脈を介してＦＩＤ−００７（１００および１５０ｍｇ／ｋｇ）を投与することによって、同様に決定した。動物を１日当たり２回モニタリングし、３日毎に計量した。ＦＩＤ−００７の場合、ＣＤ−１マウスでの多回投与のＭＴＤは１００ｍｇ／ｋｇであり、ＳＣＩＤマウスでは３０ｍｇ／ｋｇであることが判明し、ＳＣＩＤマウスでは注射後直ちに幾つかの副作用があった。ＦＩＤ−００７多回投与群は、対照群と比較して過度の体重増加がなかった。

【0121】

[00176]腫瘍増殖を阻害するＦＩＤ−００７のｉｎ ｖｉｖｏでの効力を、ヒトの肺癌
、乳癌および卵巣癌の腫瘍を異種移植したマウスモデルで、ＴａｘｏｌおよびＡｂｒａｘａｎｅのそれと比較した。６０匹の雌および雄のＳＣＩＤマウス（６〜８週、２０〜２６ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、乳癌および卵巣癌用に４０匹の雌マウス、肺癌用に２０匹の雄マウス）に、肺Ａ５４９、乳房ＭＤＡ−ＭＢ−２３１または卵巣ＯＶ９０の各種細胞を含む無血清培地の懸濁液０．１ｍＬを、胴体の各側（左および右）に注射した。細胞は、加湿したインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２、９５％空気）内で予め培養した。マウスの腫瘍１つ当たり３×１０^６個（Ａ５４９）、１０^７個（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、および５×１０^６個（ＯＶ−９０）の量の細胞を使用した。腫瘍を７〜９日間増殖させ、その後処置を開始し、すべての腫瘍量測定値をデジタル式カリパス（ＶＷＲ Ｉｎｃ
．）を使用して得た。腫瘍量を、式（Ｗ^２×Ｌ）／２（式中、Ｗは最大腫瘍幅およびＬは最大腫瘍長さ）によって算出した。腫瘍および体重の測定値は、最初の処置前の同日に、その後３日毎に得た。０日目を処置の最初の日として示した。０日目に腫瘍を生じた動物を５つの群に無作為に分けると［１群当たりマウス約４匹（腫瘍８個）］、各処置群は広範な腫瘍の大きさを示した。

【0122】

[00177]Ａｂｒａｘａｎｅ（８０ｍｇ／ｋｇ）、ＦＩＤ−００７（２０ｍｇ／ｋｇ）、
Ｔａｘｏｌ（２０ｍｇ／ｋｇ）および、ナノ担体００１−Ｂと名付けた、Ｃ_１８ＡＢＰ６０ポリマーから出発した物質（２０ｍｇ／ｋｇ）を、注射毎に新しく調製した。生理食塩水を、ビヒクル対照として使用した。薬剤または生理食塩水は、尾静脈注射を介して３日毎に投与した。薬剤の用量は、予め決定された単回および多回投与ＭＴＤに基づいて、すべての処置群に対して等毒性であるように選択した。肺癌、乳癌、および卵巣癌群はそれぞれ、合計４回の注射を受けた。対照、ＡｂｒａｘａｎｅおよびＦＩＤ−００７の注入量は、全試験を通して注射当たり０．１ｍＬであった。Ｔａｘｏｌ製剤は粘性なので、２０ｍｇ／ｋｇ用量のために注射当たり０．２ｍＬを投与した。平均体重および腫瘍量測定値を、同じ群中のすべての動物の平均値を求めることによって算出した。肺癌および卵巣癌の場合は最後の処置から２１日目、乳癌の場合は１０日目に、イソフルランを用いてマウスを安楽死させた。血液および単離した血清、ならびに腫瘍組織および肝臓を収集して−８０℃で保管した。

【0123】

[00178]肺癌（Ａ５４９）異種移植群の場合、総じて、何れの処置群でも死亡は発生し
なかった。恐らくＴａｘｏｌの毒性が原因で、処置後最初の３０分間に数匹のマウスで荒い息遣いおよび不活動が観察された。平均体重および腫瘍量測定値を、同じ群中のすべての動物の平均値を求めることによって算出した。生理食塩水対照、Ｔａｘｏｌ、ＦＩＤ−００７およびナノビヒクル対照の全平均体重増加は、それぞれ６．０５％、５．８７％、６．３８％および１２．３％であった。しかし、Ａｂｒａｘａｎｅ群のすべてのマウスは悪性の神経毒性を発現し、２０％を超える体重が減少した。これらのマウスを１３日目に屠殺した。腫瘍量は、生理食塩水対照群の場合１８２７ｍｍ^３、ナノ担体−００１Ｂビヒクル対照群の場合１３１１ｍｍ^３、Ｔａｘｏｌ群の場合３０５．８ｍｍ^３増加した。しかし、ＦＩＤ−００７群は、腫瘍量が３９．７ｍｍ^３減少した（図２０）。図２１および２２は、処置群の腫瘍の代表的画像を示す。

【0124】

[00179]乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）異種移植群の場合、何れの処置群でも死亡は発
生しなかった。恐らくＴａｘｏｌの毒性が原因で、処置後最初の３０分間に荒い息遣いおよび不活動が観察された。Ａｂｒａｘａｎｅ群において、すべてのマウスが３回の処置後に後肢の弱りおよび２０％の体重減少という副作用を示したので、その群では４回目の処置を中止することを決定した。平均体重および腫瘍量測定値を、同じ群中のすべての動物の平均値を求めることによって算出した。生理食塩水、Ｔａｘｏｌ、ＦＩＤ−００７およびナノ担体−００１Ｂの場合の全平均体重増加は、それぞれ３．７６％、０．４６％、１．８％、および４．２％であった。Ａｂｒａｘａｎｅ群の場合、平均体重の低下は７．６６％であった。腫瘍量は、生理食塩水およびナノ担体−００１Ｂ群において、それぞれ３２８．６ｍｍ^３および４５８．８ｍｍ^３増加した。ＦＩＤ−００７、ＴａｘｏｌおよびＡｂｒａｘａｎｅ群では、腫瘍量はそれぞれ１０８．７ｍｍ^３、７５．５ｍｍ^３および７０．２ｍｍ^３減少した。腫瘍量の観察を図２３に示す。図２４および２５は、処置群の腫瘍の代表的画像を示す。

【0125】

[00180]卵巣癌（ＯＶ−９０）異種群の場合、Ｔａｘｏｌ処置群は、処置後最初の３０
分間に２匹のマウスで観察された、荒い息遣いおよび不活動を有するある毒性を示した。平均の体重増加は生理食塩水対照、Ｔａｘｏｌ、Ａｂｒａｘａｎｅ、ＦＩＤ−００７およびナノ担体−００１Ｂ対照群で、それぞれ、３．２３％、１７．１％、１３．５％、１５
．４％および２．２４％であった。腫瘍量は、生理食塩水対照、ナノ担体−００１Ｂ対照およびＴａｘｏｌ群で、それぞれ、６５２．７ｍｍ^３、２７１．９ｍｍ^３および９．１ｍｍ^３増加した一方で、ＦＩＤ−００７群では９３．１ｍｍ^３およびＡｂｒａｘａｎｅ群（８０ｍｇ／ｋｇ）では７２．４ｍｍ^３腫瘍量が減少した。図２６は、各処置群について観察される腫瘍量をまとめて示す。図２７および２８は、解剖前後の腫瘍の代表的な画像である。

【0126】

[00181]ＦＩＤ−００７は、正常細胞に対して低レベルの毒性を維持しながら、肺、乳
房および卵巣の細胞株に対して、確立された抗新生物薬であるＴａｘｏｌおよびＡｂｒａｘａｎｅと同様のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害性を明示した。腫瘍増殖を阻害し、腫瘍塊を縮小する、ＦＩＤ−００７のｉｎ ｖｉｖｏ効力は、ヒトの肺癌、乳癌、および卵巣癌のマウス異種移植モデルにおいて、２つの承認薬と同程度に良好またはそれらより有意に良好であった。

【0127】

[00182]本明細書に引用されるすべての参考文献は、参照により全体が本明細書に組み
込まれる。

【0128】

[00183]本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書の教示に種々の変更
および改変を為すことができることが認識されよう。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】