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特許6663221Ｒ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現が調節された微生物及びそれを用いたポリヒドロキシアルカノエート共重合体の製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6663221
(24)【登録日】2020年2月18日
(45)【発行日】2020年3月11日
(54)【発明の名称】Ｒ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現が調節された微生物及びそれを用いたポリヒドロキシアルカノエート共重合体の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20200227BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20200227BHJP
C12N 15/60 20060101ALI20200227BHJP
C12P 7/62 20060101ALI20200227BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21ZNA
C12N15/31
C12N15/60
C12P7/62
【請求項の数】14
【全頁数】37
(21)【出願番号】特願2015-560051(P2015-560051)
(86)(22)【出願日】2015年1月30日
(86)【国際出願番号】JP2015052758
(87)【国際公開番号】WO2015115619
(87)【国際公開日】20150806
【審査請求日】2017年11月28日
(31)【優先権主張番号】特願2014-17879(P2014-17879)
(32)【優先日】2014年1月31日
(33)【優先権主張国】JP
(31)【優先権主張番号】特願2014-17873(P2014-17873)
(32)【優先日】2014年1月31日
(33)【優先権主張国】JP
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】000000941
【氏名又は名称】株式会社カネカ
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】特許業務法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】有川 尚志
(72)【発明者】
【氏名】佐藤 俊輔
(72)【発明者】
【氏名】松本 圭司
【審査官】
清野 千秋
(56)【参考文献】
【文献】
特表２００２−５２３０５０（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２０１１／１０５３７９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２００８／０９０８７３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第９５／０２１２５７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２０１３／０６５７７２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２０１３／０７１３５６（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｎ １／２１
Ｃ１２Ｎ １５／０９−１５／９０
Ｃ１２Ｐ ７／６２
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＷＰＩＤＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ゲノムＤＮＡ上にＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子を有する微生物であって、前記微生物はポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子を有し、前記Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の上流の塩基配列が、大腸菌由来のｔｒｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター及びｔｒｐプロモーター、並びに、ｐｈａＣ１遺伝子プロモーター及びｐｈａＣ１遺伝子改変プロモーターからなる群から選択される１つ以上のプロモーターを含む外来発現調節ＤＮＡを含み、それにより、Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現が調節されて３−ヒドロキシヘキサン酸（３ＨＨ）モノマーを含有するポリヒドロキシアルカノエート共重合体を産生することを特徴とする微生物。
【請求項2】
前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子が、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）由来の遺伝子である、請求項１記載の微生物。
【請求項3】
カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属である、請求項１又は２記載の微生物。
【請求項4】
カプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）である、請求項３記載の微生物。
【請求項5】
アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属である、請求項１〜４のいずれか１項記載の微生物。
【請求項6】
アエロモナス・ヒドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）である、請求項５記載の微生物。
【請求項7】
前記外来発現調節ＤＮＡが、前記プロモーター配列の下流にシャインダルガルノ（ＳＤ）配列をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の微生物。
【請求項8】
前記ＳＤ配列が、配列番号５１、５２及び６０〜６６のいずれかで示される塩基配列を含む、請求項７記載の微生物。
【請求項9】
前記ｐｈａＣ１遺伝子が、カプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）由来である、請求項１〜８のいずれか１項記載の微生物。
【請求項10】
前記ｐｈａＣ１遺伝子改変プロモーターが、配列番号５５〜５９のいずれかで示される塩基配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の微生物。
【請求項11】
前記大腸菌由来プロモーターが、配列番号４７、４８及び５０で示される塩基配列を含む、請求項１〜１０のいずれか１項記載の微生物。
【請求項12】
前記発現調節ＤＮＡが、配列番号３７〜４５のいずれかで示される塩基配列を含む、請求項１〜１１のいずれか１項記載の微生物。
【請求項13】
請求項１〜１２のいずれか１項記載の微生物を培養し、該微生物からポリヒドロキシアルカノエート共重合体を回収することを含むことを特徴とする、３−ヒドロキシヘキサン酸（３ＨＨ）モノマーを含有するポリヒドロキシアルカノエート共重合体の生産方法。
【請求項14】
前記ポリヒドロキシアルカノエート共重合体が、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）である、請求項１３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｒ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現が調節された組み換え微生物、及び該微生物を用いてモノマー組成比の制御されたポリヒドロキシアルカノエート共重合体を製造する方法に関する。【背景技術】
【0002】
ポリヒドロキシアルカノエート（以下、ＰＨＡと記すこともある）は、広範な微生物によって生成されるポリエステル型有機分子ポリマーである。ＰＨＡは生分解性を有する熱可塑性高分子であり、ＰＨＡは再生可能資源からも産生されうる。これらのことから、ＰＨＡを環境調和型素材又は生体適合型素材として工業的に生産し、多様な産業へ利用する試みが行われている。【0003】
現在までに数多くの微生物において、エネルギー貯蔵物質としてＰＨＡを菌体内に蓄積することが知られている。ＰＨＡの代表例としては、３−ヒドロキシ酪酸（以下、３ＨＢと記すこともある）のホモポリマーであるポリ−３−ヒドロキシ酪酸（以下、Ｐ（３ＨＢ）と記すこともある）が挙げられる。Ｐ（３ＨＢ）は熱可塑性高分子であり、自然環境中で生物的に分解されることから、環境にやさしいプラスチックとして注目されている。しかし、Ｐ（３ＨＢ）は結晶性が高いために硬くて脆い性質を持っており、実用的には応用範囲が限られている。応用範囲を広げるためには、Ｐ（３ＨＢ）に柔軟性を付与することが必要であった。【0004】
そこで、３ＨＢと３−ヒドロキシ吉草酸（以下、３ＨＶと記す）とからなるＰＨＡ共重合体（以下、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）と記す）とその製造方法が開発された（特許文献１、特許文献２）。Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）は、Ｐ（３ＨＢ）に比べると柔軟性に富むため、幅広い用途に応用できると考えられた。しかしながら、実際にはＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）中の３ＨＶモル分率を増加させてもそれに伴う物性の変化が乏しく、特にフィルムやシート、軟質系包装容器等へ加工するために要求される程には柔軟性が向上しないため、シャンプーボトルや使い捨て剃刀の取手等、硬質成型体の限られた分野にしか利用されていない。【0005】
さらにＰＨＡの柔軟性を高めるために、３ＨＢと３−ヒドロキシヘキサン酸（以下、３ＨＨと記すこともある）からなるＰＨＡ共重合体（以下、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）と記すこともある）及びその製造方法について研究が行われてきた（特許文献３、特許文献４）。これら報告においてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は、土壌より単離されたアエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）の野生株を用い、オレイン酸、パルミチン酸等の脂肪酸を炭素源として発酵生産されており、得られたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の３ＨＨ組成比は、オレイン酸を炭素源としたとき１５ｍｏｌ％、パルミチン酸を炭素源としたときに５ｍｏｌ％であった。【0006】
Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の物性に関する研究も行われている（非特許文献１）。この報告では、炭素数が１２個以上の脂肪酸を唯一の炭素源としてＡ． ｃａｖｉａｅを培養し、３ＨＨ組成比が１１〜１９ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を発酵生産している。Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は３ＨＨ組成比の増加にしたがって、Ｐ（３ＨＢ）の様な硬くて脆い性質から次第に柔軟な性質を示すようになり、３ＨＨ組成比がより高くなるとＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）を上回る柔軟性を示すことが明らかにされた。すなわち、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は３ＨＨ組成比を変えることで、硬質ポリマーから軟質ポリマーまで応用可能な幅広い物性を持たせることができるため、低３ＨＨ組成比のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）はテレビの筐体等のように硬さを要求されるものに、一方、高３ＨＨ組成比のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）はフィルム等のように柔軟性を要求されるものに、それぞれ使用できるなど、幅広い分野への応用が期待できる。【0007】
また、カプリアビダス・ネカトール（Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒ）を宿主とし、ｐＪＲＤ２１５（ＡＴＣＣ ３７５３３）にポリエステル合成酵素遺伝子やＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子等を導入したｐＪＲＤＥＥ３２やｐＪＲＤＥＥ３２ｄ１３等のＰＨＡ合成酵素発現プラスミドによる形質転換体のＰＨＡ生産性が調べられている（特許文献５、非特許文献２）。該菌株の培養後の菌体量はもともと４ｇ／Ｌと低かったが、植物油脂を炭素源とした同菌株の培養条件改善により菌体量は４５ｇ／Ｌ、ポリマー含量は６２．５％、３ＨＨ組成比は８．１ｍｏｌ％にまで、ポリマー生産性が向上することがわかった。このように、培養方法によってＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の３ＨＨ組成比やポリマー生産性を改善する試みがなされている（特許文献６）。しかし、一般的にプラスミドを使用して外来遺伝子を導入すると、バクテリアの増殖サイクルの期間にプラスミドが欠失する事によって、導入した遺伝子の不安定性が生じてしまうために、工業的生産にはあまり適さないという問題がある。【0008】
一方、Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子を、Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒの染色体ＤＮＡに組み込むことで３ＨＨ組成比を向上させた報告もなされている（特許文献７，非特許文献３）。この報告ではＣ． ｎｅｃａｔｏｒのｐｈａ合成酵素遺伝子を含むｐｈａオペロン領域にＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子を複数挿入することで３ＨＨ組成比を１０．５ｍｏｌ％にまで向上させている。【0009】
前述のようにＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）はその３ＨＨ組成比により物性が変化するため、幅広い用途に使用可能な一方、望ましい物性を得るためには３ＨＨ組成比の細かな制御が必要である。さらに、工業的な生産においては、プロセス簡略化の点から、同一の培養条件において、異なる３ＨＨ組成比のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産できるように、それぞれに適した菌株を複数取得することが望ましい。しかし、従来のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）生産菌株の育種において、３ＨＨ組成比の細かな制御を目的とした改良はなされていない。【先行技術文献】
【特許文献】
【0010】
【特許文献1】特開昭５７−１５０３９３号公報
【特許文献2】特開昭５９−２２０１９２号公報
【特許文献3】特開平５−９３０４９号公報
【特許文献4】特開平７−２６５０６５号公報
【特許文献5】特開平１０−１０８６８２号公報
【特許文献6】特開２００１−３４００７８号公報
【特許文献7】国際公開第ＷＯ２０１１／１０５３７９号公報
【非特許文献】
【0011】
【非特許文献1】Ｙ． Ｄｏｉ， Ｓ． Ｋｉｔａｍｕｒａ， Ｈ． Ａｂｅ， Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２８， ４８２２−４８２３ （１９９５）
【非特許文献2】Ｔ． Ｆｕｋｕｉ， Ｙ． Ｄｏｉ， Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ， １７９， １５， ４８２１−４８３０ （１９９７）
【非特許文献3】Ｙ． Ｋａｗａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ７８， ４９３−５０２ （２０１２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
本発明は、モノマー組成比の制御されたポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）共重合体を生産する微生物の育種、及び該微生物を用いてモノマー組成比の制御されたポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）共重合体を発酵生産することを目的とする。【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、微生物中に内在するＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現を調節することによって３ＨＨモノマー合成経路が制御され、微生物中に蓄積されるＰＨＡ共重合体のモノマー組成比率を効率的に制御できることを見出し、本発明を完成するに至った。【0014】
すなわち、本発明は、以下の特徴を包含する。【0015】
（１）ゲノムＤＮＡ上にＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子を有する微生物であって、該Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の上流の塩基配列が、１若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入及び／又は付加からなる改変を含み、それにより、Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現が調節されることを特徴とする微生物。【0016】
（２）上記改変が、Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現を調節可能にする、プロモーター配列、シャインダルガルノ（ＳＤ）配列、又はそれらの両方の塩基配列に１若しくは複数の塩基の置換又は挿入を含む、上記（１）記載の微生物。【0017】
（３）上記Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の上流の塩基配列が、置換又は挿入によって、外来プロモーター配列を含む、上記（１）又は（２）記載の微生物。【0018】
（４）上記置換又は挿入の位置が、Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の上流１万塩基以内である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の微生物。【0019】
（５）さらにポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子を有する、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の微生物。【0020】
（６）ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子が、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）由来の遺伝子である、上記（５）記載の微生物。【0021】
（７）カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属である、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の微生物。【0022】
（８）カプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）である、上記（７）記載の微生物。【0023】
（９）アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属である、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の微生物。【0024】
（１０）アエロモナス・ヒドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）である、上記（９）記載の微生物。【0025】
（１１）上記Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の上流の塩基配列が、置換又は挿入によって導入された、大腸菌由来プロモーター、ｐｈａＣ１遺伝子プロモーター及びｐｈａＣ１遺伝子改変プロモーターからなる群から選択される１つ以上のプロモーターを含む、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の微生物。【0026】
（１２）上記プロモーター配列の下流にＳＤ配列をさらに含む、上記（２）〜（１１）のいずれかに記載の微生物。【0027】
（１３）上記ＳＤ配列が、配列番号５１又は５２で示されるＳＤ配列である、上記（１２）記載の微生物。【0028】
（１４）上記Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子が他の遺伝子とオペロンを形成している、上記（１）〜（１３）のいずれかに記載の微生物。【0029】
（１５）モノマー組成比の制御されたポリヒドロキシアルカノエート共重合体を産生することができる、上記（５）〜（１４）のいずれかに記載の微生物。【0030】
（１６）カプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）由来のｐｈａＣ１遺伝子の改変プロモーターを含む３０ｂｐ〜９００ｂｐの発現調節ＤＮＡであって、該改変プロモーターが配列番号５５〜５９の塩基配列からなる群から選択される塩基配列を含む、発現調節ＤＮＡ。【0031】
（１７）上記ｐｈａＣ１遺伝子のシャインダルガルノ（ＳＤ）配列又はその改変ＳＤ配列をさらに含む、ただし該ＳＤ配列又は改変ＳＤ配列が、配列番号５１、５２、６０〜６６のいずれかで示される塩基配列を含む、上記（１６）記載の発現調節ＤＮＡ。【0032】
（１８）配列番号４７〜５０で示される塩基配列からなるプロモーターのいずれか１つと、配列番号５１、５２、６０〜６６のいずれかで示される塩基配列を含む、発現調節ＤＮＡ。【0033】
（１９）上記（１６）〜（１８）のいずれかに記載の発現調節ＤＮＡを含む、上記（１）〜（１５）のいずれかに記載の微生物。【0034】
（２０）上記（５）〜（１５）及び（１９）のいずれかに記載の微生物を培養し、該微生物からポリヒドロキシアルカノエート共重合体を回収することを含むことを特徴とする、ポリヒドロキシアルカノエート共重合体の生産方法。【0035】
（２１）上記ポリヒドロキシアルカノエート共重合体が、構成単位として３−ヒドロキシヘキサン酸（３ＨＨ）モノマーを含有する共重合体である、上記（２０）記載の方法。【0036】
（２２）上記ポリヒドロキシアルカノエート共重合体が、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）である、上記（２１）記載の方法。【発明の効果】
【0037】
本発明により、産業上有用な所望のモノマー組成比を有するＰＨＡ共重合体を発酵生産することができる。【0038】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１４−１７８７３号、２０１４−１７８７９号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。【発明を実施するための形態】
【0039】
以下、本発明につき、さらに詳細に説明する。１．ゲノムＤＮＡ上にＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子を有し、かつ、該遺伝子の発現が調節された微生物
本発明は、ゲノムＤＮＡ上にＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子を有する微生物であって、該Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の上流の塩基配列が、１若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入及び／又は付加からなる改変を含み、それにより、Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現が調節されることを特徴とする微生物を提供する。
【0040】
本明細書で使用する「ゲノムＤＮＡ」には、染色体ＤＮＡ（単に「染色体」ともいう。）だけでなく例えばメガプラスミドＤＮＡ（単に「メガプラスミド」ともいう。）なども包含し、好ましいゲノムＤＮＡは染色体である。また、本明細書で使用する「Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子」は、脂肪酸β酸化系の中間体であるエノイルＣｏＡからＰＨＡモノマーの供給源である（Ｒ）−３−ヒドロキシアシルＣｏＡに変換する酵素であるＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ（ＰｈａＪ）をコードする遺伝子である。【0041】
本発明に用いる微生物は、ゲノムＤＮＡ上にＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子を有する微生物であれば特に限定されず、Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子を元々有する野生株、或いは該野生株を人工的に突然変異処理して得られる変異株、或いは、遺伝子工学的手法により外来のＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子がゲノムＤＮＡ上に挿入又は置換された組み換え菌株のいずれでもよい。そのような微生物として、具体的には、細菌、酵母、糸状菌などが例示され、好ましくは、細菌であり、例えば、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属、ワウテルシア（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属等の細菌類が好ましい例として挙げられる。安全性及び生産性の観点から、より好ましくはラルストニア属、カプリアビダス属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、ワウテルシア属に属する細菌であり、さらに好ましくはラルストニア属又はアエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属に属する細菌であり、特に好ましくはカプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）又はアエロモナス・ヒドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）である。【0042】
細菌由来のＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼは、例えばＮＣＢＩ（米国）のＧｅｎＢａｎｋ等の公開データベースにおいて、例えばＡ． ｃａｖｉａｅ 由来のＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼとしてＢＡＡ２１８１６、Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒ由来のＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼとしてＹＰ＿７２５５７９．１、ＹＰ＿７２８５６１．１、ＹＰ＿７２８８２９．１などが登録され知られている。【0043】
本発明によれば、上記微生物は、ゲノムＤＮＡ上のＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の上流の塩基配列が、１若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入及び／又は付加からなる改変を含み、それにより、Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現が調節されることを特徴とする。ここで、該置換、欠失、挿入及び／又は付加は、野生型と比較して、Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現の強度を（正（＋）若しくは負（−）に、好ましくは正（＋）に）変化させうるものである限り特に限定されない。【0044】
Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の上流には、該遺伝子の発現を調節する、プロモーター配列、ＳＤ配列、又はそれら両方の配列に、１若しくは複数の塩基の改変を含んでもよいし、或いは、該プロモーター配列及びＳＤ配列以外の塩基配列もまた、１若しくは複数の塩基の改変を含んでもよい。具体的には、上記微生物のゲノムＤＮＡ上のＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の上流にもともと存在する（すなわち、野生型の）プロモーター配列、ＳＤ配列、又はその他の該遺伝子上流１万塩基以内の塩基配列に、好ましくはプロモーター配列、ＳＤ配列、又はその両方の塩基配列に、改変（すなわち、１若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入及び／又は付加、好ましくは置換又は挿入）を導入することによって、Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現の強度を変化させてもよく、或いは、ゲノムＤＮＡ上のＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の上流の塩基配列に、Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現を調節可能にするＤＮＡを、挿入するか、或いは、上流の任意の塩基配列と置換することによって導入し、Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現の強度を制御してもよい。【0045】
或いは、発現強度の調節を効率的に行う好ましい代替的手法として、ゲノムＤＮＡ上のＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の上流の翻訳開始点近傍の発現調節可能な部位において、その部位の塩基配列の一部をプロモーター配列及び／又はＳＤ配列を含む発現調節ＤＮＡと置換するか、或いは、その部位に該発現調節ＤＮＡを挿入することができる。【0046】
上記導入される（言い換えるなら、外来の）発現調節ＤＮＡは、例えば、同種又は異種の微生物由来のＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子のプロモーター配列、ＳＤ配列、又はそれらの改変配列、或いは同種又は異種の微生物由来の、Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子以外の遺伝子のプロモーター配列、ＳＤ配列、又はそれらの改変配列、を含むＤＮＡを包含しうる。ここで、同種の微生物由来のＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子のプロモーターとしては、同種の微生物における異なるＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子のプロモーター配列を使用してもよいし、同種の微生物における同一のＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子のプロモーター配列をその位置を変えて導入してもよい。同種微生物由来のＳＤ配列についても同様である。【0047】
本明細書中で使用する「１若しくは複数の塩基」という用語は、Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の翻訳開始部位の上流の、発現調節領域（プロモーター領域及び／又はＳＤ配列領域を含み、該プロモーター領域にはオペレーター配列も含みうる。）を含む１万塩基以内の塩基配列中の１若しくは複数の塩基、例えば１若しくは数個の塩基、少なくとも２０〜５０個の塩基、少なくとも５０〜１００個の塩基、少なくとも１００〜２００個の塩基などを指す。本明細書中、該１若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入及び／又は付加は、該遺伝子の発現を調節可能にする１若しくは複数の塩基の変異の導入である。また、本明細書中の「数個」とは、２〜１０の整数、好ましくは２〜７の整数を指す。【0048】
本明細書で使用する「発現調節可能な」又は「発現を調節可能にする」というような用語は、Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の転写によるｍＲＮＡ合成とその後のタンパク質合成を、未改変の場合と比べてほぼ同等レベル若しくはそれ以上或いはそれ未満となるように、好ましくは強化するように制御することを指す。【0049】
上記ゲノムＤＮＡ上のＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の上流の改変について、ゲノムＤＮＡ上に任意のＤＮＡを部位特異的に置換又は挿入する方法は当業者に周知であり、代表的な方法としては特に限定するわけではないが以下の方法が挙げられる。トランスポゾンと相同組換えの機構を利用した方法（Ｏｈｍａｎ等， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， ｖｏｌ．１６２：ｐ１０６８（１９８５））、相同組換えの機構によって起こる部位特異的な組み込みと第二段階の相同組換えによる脱落を原理とした方法（Ｎｏｔｉ等， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ｖｏｌ．１５４， ｐ１９７（１９８７））などがあり、また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｓａｃＢ遺伝子を共存させて、第二段階の相同組換えによって遺伝子が脱落した微生物株をシュークロース添加培地耐性株として容易に単離する方法（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ， Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ｖｏｌ．６， ｐ１１９５ （１９９２）、 Ｌｅｎｚ等， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， ｖｏｌ．１７６， ｐ４３８５（１９９４））も利用することができるが、ゲノムＤＮＡ上に任意ＤＮＡを挿入／置換出来ればその方法は特に制限されない。【0050】
「プロモーター」及び「ＳＤ配列」は、以下の一般的な定義を有する。【0051】
「プロモーター」は、遺伝子の転写開始反応の効率に関与する調節配列であり、転写開始点の比較的近くに存在して働く調節配列、転写開始点から離れて存在して働く調節配列の両方を包含する広義の意味を有している。例えば細菌などの原核生物では、通常、プロモーターは、遺伝子の転写開始点（＋１）の上流の−３５領域から−１０領域までの配列を含むが、それらの領域の配列は、原核生物種によってしばしば異なり、例えば、大腸菌におけるそのコンセンサス配列は、例えばＴＴＧＡＣＡ（配列番号５３）及びＴＡＴＡＡＴ（配列番号５４）であることが知られている。【0052】
ＳＤ配列は、一般に、遺伝子の翻訳開始点（＋１）の数塩基〜十数塩基上流に位置し、１６Ｓ ｒＲＮＡの３'末端部分と相補的又は、部分的に相補的な配列であり、ＳＤ配列の部分でリボソームがｍＲＮＡに結合し、そのすぐ下流の翻訳開始コドンから翻訳が開始される。そのため、ＳＤ配列は転写開始点と翻訳開始コドンの間に位置している。またＳＤ配列を含むｍＲＮＡにおける開始コドンより上流の非翻訳領域は、一般に５’ＵＴＲと呼ばれ、ｍＲＮＡの安定性に影響を与えることがある。本発明においてＳＤ配列は、転写開始点と、構造遺伝子の翻訳開始点の間に位置し、構造遺伝子の翻訳（タンパク質合成）に関与するｍＲＮＡ上のリボソーム結合配列、及び、該リボソーム結合配列をコードするＤＮＡ配列を指す。【0053】
本発明において、上記発現調節領域を置換又は挿入など改変する位置としては、対象となるＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子が存在するゲノムＤＮＡ領域上の上流で、その発現を調節できる限り特に制限されないが、Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子により近い位置において置換又は挿入されるのが好ましい。或いは、改変位置として、例えばＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の上流１万塩基以内に置換又は挿入されてもよく、上流１０００塩基以内に置換又は挿入されるのが好ましく、上流５００塩基以内に置換又は挿入されるのがさらに好ましく、上流５０塩基以内に置換又は挿入されるのが特に好ましい。【0054】
さらにまた、例えば上記Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒ等、微生物種によっては、Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子は、他の代謝系遺伝子やＰＨＡ合成に関与する酵素などの他の遺伝子とオペロンを形成している場合もある。そのような場合、他の構造遺伝子の発現に影響を与えずにＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現のみを効率的に制御するためには、Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子よりも上流に存在する他の構造遺伝子と、Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子との間に、置換又は挿入によって外部より導入されたプロモーターとＳＤ配列を有する発現調節配列が含まれることがもっとも好ましい。【0055】
また、上記Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒ等、微生物種によっては、Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子を複数有していることもある。そのような場合、発現調節の対象となるＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子は特に限定されず、複数存在するＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子のいずれか１つを対象としてもよいし、又は２つ以上を対象としてもよい。さらに、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒは、元来、ゲノムＤＮＡとして、染色体とメガプラスミドを有しており、本発明において発現の調節の対象となるＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子は、そのいずれに存在しているものでもかまわないが、染色体上に存在しているのが好ましい。【0056】
本発明において、Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の上流において置換、挿入等改変（若しくは、変異）される発現調節配列に含有されるプロモーターやＳＤ配列は特に限定されず、Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現を調節可能な配列であればいずれも使用可能である。また、これらプロモーターやＳＤ配列は、対象となる微生物が元々有しているプロモーター及び／又はＳＤ配列と同じ若しくは異なる配列であってもよいし、或いは、対象となる微生物とは異なる微生物種（例えば、異なる属、種又は株）由来のプロモーター及び／又はＳＤ配列であってもよいし、或いは、これらの配列を改変して得られる改変プロモーター及び／又は改変ＳＤ配列であってもよい。本発明において、発現調節ＤＮＡに含有されるプロモーターとしては特に限定されないが、例えば、Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒがもつＰＨＡ合成酵素遺伝子（ｐｈａＣ１遺伝子）のプロモーターであるｐｈａＣ１プロモーター（ＲＥＰ）や、ｐｈａＣ１プロモーター（ＲＥＰ）の−３５領域及び／又は−１０領域の配列やその間の配列を、少なくとも１塩基の置換、欠失、挿入及び／又は付加によって変化させることにより得られる改変ｐｈａＣ１プロモーター（改変ＲＥＰ）の他、公知の大腸菌由来のプロモーター、例えば、配列番号４７で示されるｔｒｃプロモーター、配列番号４９で示されるｌａｃプロモーター、配列番号５０で示されるｌａｃＵＶ５プロモーター、配列番号４８で示されるｔｒｐプロモーターなどが挙げられる。この中でも、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーターなどの大腸菌由来のプロモーターが、Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現を強める効果が高い点で好ましい。また、改変ＲＥＰとして、例えば配列番号５５〜５９のいずれかに示される塩基配列を含むプロモーターが挙げられ、配列番号５９に示される塩基配列を含むプロモーターが好ましい。【0057】
上記の改変ＲＥＰについてさらに具体的に説明する。【0058】
改変ＲＥＰは、Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒがもつＰＨＡ合成酵素遺伝子であるｐｈａＣ１遺伝子のプロモーターであるｐｈａＣ１プロモーター（ＲＥＰ）の配列を改変して得られる。ｐｈａＣ１遺伝子は、ｐｈａＡ遺伝子、ｐｈａＢ１遺伝子とオペロンを組む形でゲノムＤＮＡ上に存在していることから、ｐｈａＣ１プロモーター（ＲＥＰ）はｐｈａオペロンプロモーターとも称される。【0059】
本発明において、改変の対象となるｐｈａＣ１プロモーター（ＲＥＰ）は、好ましくはＣ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株由来の配列番号６７（ＴＴＧＡＣＡＧＣＧＣＧＴＧＣＧＴＴＧＣＡＡＧＧＣＡＡＣＡＡＴ）で表される塩基配列を有するものである。ｐｈａＣ１プロモーター（ＲＥＰ）における−３５領域と−１０領域はそれぞれ１塩基目からの６塩基（例えば、ＴＴＧＡＣＡ（配列番号５３と同じ配列）と、２５塩基目からの６塩基（例えば、ＡＡＣＡＡＴ（配列番号６８））である。【0060】
改変ＲＥＰは、前述のＣ． ｎｅｃａｔｏｒ由来のｐｈａＣ１プロモーターの−３５領域及び−１０領域内の１もしくは数個の塩基、好ましくは１〜４個の塩基、の置換、付加、挿入及び／又は欠失、好ましくは置換、を有すること、また−３５領域と−１０領域との間の距離を、１もしくは数個の塩基、好ましくは１〜２個の塩基、の欠失又は付加によって変化させることにより得られ、かつプロモーター活性を有する。【0061】
本明細書中で使用される「数個」とは、２〜１０の整数、例えば２〜７の整数、２〜５の整数、２〜４の整数、２〜３の整数などを意味する。【0062】
本明細書において「プロモーター活性を有する」という用語は、プロモーターにＲＮＡポリメラーゼが結合し転写（ｍＲＮＡ合成）を開始できる能力を有していることを指す。【0063】
改変ＲＥＰは、例えば、配列番号５５〜５９のいずれかで示される塩基配列を有するプロモーターである。配列番号５５〜５９の塩基配列は、Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株の改変ｐｈａＣ１プロモーター配列であるので、菌株が異なる場合、改変ＲＥＰは、上記の配列番号５５〜５９の塩基配列と異なってもよい、該菌株の野生型プロモーター配列において１もしくは数個、好ましくは１〜４個の塩基の置換、付加、挿入及び／又は欠失を有する配列からなる。【0064】
改変ＲＥＰは、上記塩基の置換、付加、挿入及び／又は欠失により野生型のｐｈａＣ１プロモーター（ＲＥＰ）に比較してプロモーター活性もしくは転写効率が変化しており、構造遺伝子の発現強度の制御に有用である。ここで、該プロモーター活性の変化とは、野生型のｐｈａＣ１プロモーター（ＲＥＰ）と比較して活性が上昇したもの、活性が同等もしくは例えば８０％以内で低下したもの、或いは、野生型ｐｈａＣ１プロモーターを使用したときの遺伝子発現量と比較して高い又は同等又は８０％以内で低下した遺伝子発現量が得られるもの、のいずれをも含み、目的によって適宜選択できる。【0065】
ｐｈａＣ１プロモーター（ＲＥＰ）の改変は、例えば次のような手法により行うことができる。【0066】
ｐｈａＣ１プロモーター（ＲＥＰ）配列における１もしくは数個、好ましくは１〜４個の塩基の置換、付加、挿入及び／又は欠失を有する核酸の合成は、ＰＣＲによる変異導入法、部位特異的突然変異導入法、自動核酸合成法などの公知の方法に基づき行うことができる。通常よく使用されるＰＣＲによる変異導入法について簡単に説明すると、この方法は、例えば変異導入用プライマーとＰＣＲ法を組み合わせて行なうことができる。該変異導入用プライマーは、公知の方法に基づいて、標的核酸を特異的に増幅しうるオリゴヌクレオチドを設計し、これに目的とする塩基変異（置換、付加、挿入及び／又は欠失）を導入して作製すればよい。ＰＣＲによる増幅条件は、改変プロモーターを含む核酸を増幅できる限り、どのような条件を用いてもよい。具体的には、野生型ｐｈａＣ１遺伝子由来のプロモーター配列を含むおよそ３０ｂｐ〜９００ｂｐ、又はそれ以上（例えばおよそ３０ｂｐ〜１２００ｂｐ）、のサイズの二本鎖ＤＮＡを挿入したプラスミドを構築し、増幅対象の塩基配列を挟むようにセンス及びアンチセンス変異導入用プライマーをアニーリングし、２０〜４０サイクルの増幅反応を行うことを含む。【0067】
一方、本発明において、発現調節配列に含有されるＳＤ配列は特に限定されないが、例えば、配列番号５１で示されるｐｈａＣ１遺伝子のＳＤ配列（ｐｈａＣ１ＳＤ配列）、該ｐｈａＣ１ＳＤ配列の少なくとも１塩基を置換することで得られる改変ｐｈａＣ１ＳＤ配列などが挙げられる。改変ｐｈａＣ１ＳＤ配列としては特に限定されないが、配列番号５２（ＴＣＴＣＴＣＴ）、配列番号６０（ＴＧＴＧＡＧＡ）、配列番号６１（ＡＴＡＴＡＧＡ）、配列番号６２（ＡＧＴＧＡＧＡ）、配列番号６３（ＴＧＴＧＴＧＡ）、配列番号６４（ＴＧＡＧＴＧＡ）、配列番号６５（ＡＧＡＧＡＴＡ）及び配列番号６６（ＡＧＡＴＡＧＡ）で示される改変ＳＤ配列などが挙げられ、配列番号５２で示される改変ＳＤ配列が好ましい。【0068】
上記の改変ＳＤ配列についてさらに具体的に説明する。【0069】
改変ＳＤ配列は、例えばＡ． Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌらによって予測されているｐｈａＣ１ＳＤ配列（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉａｌ． １９９１， １７３（１）：１６８）を改変して得ることができる。この場合の改変の対象となるｐｈａＣ１ＳＤ配列は、Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒのゲノムＤＮＡ上においてｐｈａＣ１遺伝子の翻訳開始点から約１７塩基上流に位置し、具体的には、ＡＧＡＧＡＧＡ（配列番号６９）の塩基配列で示される。【0070】
改変ＳＤ配列は、前述のｐｈａＣ１遺伝子のＳＤ配列の１もしくは数個、好ましくは１〜７個の塩基を置換することで得られる「改変ｐｈａＣ１ＳＤ配列」である。改変ｐｈａＣ１ＳＤ配列の具体例は、上記の配列番号５２、６０〜６６のいずれかで示される塩基配列を含むＤＮＡである。【0071】
改変ｐｈａＣ１ＳＤ配列は、上記塩基の置換により野生型のｐｈａＣ１ＳＤ配列を用いた場合に比較して、翻訳活性及び／又はｍＲＮＡの安定性が変化しており、構造遺伝子の発現強度の制御に有用である。ここで、翻訳活性、及び／又はｍＲＮＡの安定性の変化とは、野生型ｐｈａＣ１ＳＤ配列と比較して上昇したもの、同等のもの、又は例えば６０％以内、４０％以内、若しくは２５％以内で低下したもの、或いは、野生型ｐｈａＣ１ＳＤ配列を使用したときと比較して高い、同等又は例えば６０％以内、４０％以内、若しくは２５％以内で低下した遺伝子発現量（又は、タンパク質生産量）が得られるもののいずれをも含み、目的によって適宜選択できる。【0072】
ｐｈａＣ１ＳＤ配列の改変体、すなわち、ｐｈａＣ１ＳＤ配列への塩基置換などの変異が導入された核酸の合成は、上記と同様に、ＰＣＲによる変異導入法、部位特異的突然変異導入法、自動核酸合成法などの公知の方法によって行うことができる。例えば、変異導入用プライマーとＰＣＲ法を組み合わせることによって行うことができる。該変異導入用プライマーは、公知の方法に基づいて、標的遺伝子断片を特異的に増幅しうるオリゴヌクレオチドを設計し、これに目的とする塩基変異（置換、付加、挿入及び／又は欠失）を導入して作製すればよい。ＰＣＲによる増幅条件は、標的核酸が増幅できる限り、どのような条件を用いてもよい。【0073】
ＳＤ配列は、発現調節因子として転写開始点と翻訳開始点の間に位置し、翻訳開始点から上流に数塩基〜十数塩基のところに位置している。また、ＳＤ配列を含む開始コドンより上流の非翻訳領域は、一般に５’ＵＴＲと呼ばれ、ｍＲＮＡの安定性に影響を与えることがある。そのため、ＳＤ配列やそれを含む５’ＵＴＲに変異を導入することによって、ｍＲＮＡの安定性が変化し、結果として遺伝子発現強度が変化することも考えられる。本発明においてＳＤ配列は、転写開始点と、構造遺伝子の翻訳開始点との間に位置し、構造遺伝子の翻訳（タンパク質合成）に関与するｍＲＮＡ上のリボソーム結合配列、及び、該リボソーム結合配列をコードするＤＮＡ配列を指す。【0074】
本発明の発現調節ＤＮＡとしては、上で例示したようなプロモーターとＳＤ配列を含有するものが好ましい。【0075】
そのような発現調節ＤＮＡは、プロモーターとＳＤ配列がともに、それぞれプロモーター機能、リボソーム結合機能を発揮しうるような適切な位置に配置されており、そうすることによって遺伝子発現に利用することができる。また、前述したように、プロモーターやＳＤ配列はそれぞれ遺伝子発現の異なるステップを制御することから、上記の改変ＲＥＰを公知のＳＤ配列とともに、或いは、上記の改変ＳＤ配列を公知のプロモーターとともに含有する発現調節ＤＮＡを作製して使用することもできる。また、本発明の発現調節ＤＮＡには、プロモーターとＳＤ配列以外に、発現調節に係わる適切なＤＮＡを含んでいてもよく、例えば、ｐｈａＣ１遺伝子上流９００塩基以内、５００塩基以内、３００塩基以内若しくは２００塩基以内の塩基配列や発現調節の対象となる構造遺伝子の上流９００塩基以内、５００塩基以内、３００塩基以内若しくは２００塩基以内の塩基配列を含んでいてもよい。また、このような塩基配列のサイズは、発現調節に関わるかぎり９００塩基を超えてもよいが、好ましくは９００塩基以内である。【0076】
上記の発現調節ＤＮＡにおけるプロモーターとＳＤ配列の挿入などによる配置は、公知の方法に基づき行うことができる。例えばＰＣＲ法によりそれぞれの配列を含む断片を増幅し、得られた増幅断片を適当な制限酵素で切断し、及び、適当な位置に結合することによって達成される。ここで、「適当な位置」について、上記発現調節ＤＮＡは、発現調節の対象となる構造遺伝子の上流で、その発現を調節できる限り特に制限されないが、対象となる構造遺伝子により近い位置に結合されるのが好ましい。例えば対象となる構造遺伝子がゲノムＤＮＡ上にある場合、そのゲノムＤＮＡ領域の上流１万塩基以内に置換又は挿入されることで結合されてもよく、上流１０００塩基以内に置換又は挿入されることで結合されるのが好ましく、上流５００塩基以内に置換又は挿入されることで結合されるのがさらに好ましく、上流５０塩基以内に置換又は挿入されることで結合されるのが特に好ましい。【0077】
また、例えば上記Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒ等のＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子のように、対象となる構造遺伝子が、他の構造遺伝子とオペロンを形成している場合、他の構造遺伝子の発現に影響を与えずに対象となる構造遺伝子の発現のみを効率的に制御するためには、対象となる構造遺伝子よりも上流に存在する他の構造遺伝子と、対象となる構造遺伝子との間に、置換又は挿入によって発現調節配列が結合されることが好ましい。一方、オペロンを構成している各種構造遺伝子の全てに対しその発現を制御したい場合には、当該オペロンにおける本来のプロモーター領域やその周辺に置換又は挿入によって発現調節配列が結合されることが好ましい。【0078】
また、上記発現調節配列を対象となる構造遺伝子と組み合わせて、プラスミドベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、コスミドベクターなどのベクターを構築する場合、上記発現調節配列においてそのプロモーターは、対象となる構造遺伝子の上流で、その発現を調節できる限り特に制限されないが、対象となる構造遺伝子に比較的近い位置に結合されるのが好ましい。例えば上流１万塩基以内に置換又は挿入されることで結合されてもよく、上流１０００塩基以内に置換又は挿入されることで結合されるのが好ましく、上流５００塩基以内に置換又は挿入されることで結合されるのがさらに好ましく、上流１００塩基以内に置換又は挿入されることで結合されるのが特に好ましい。また、ＳＤ配列は、ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳活性に関与することから、プロモーター下流の転写開始点と翻訳開始点の間に位置している必要があり、例えば、該遺伝子の翻訳開始点から数塩基〜十数塩基上流に配置するのがよい。【0079】
発現調節ＤＮＡは、例えば、配列番号４７〜５０で示されるプロモーター配列のいずれか１つの下流の適切な位置に、配列番号５１で示されるｐｈａＣ１遺伝子のＳＤ配列、又は配列番号５２、６０〜６６のいずれかの塩基配列で示されるその改変ＳＤ配列が存在することがより好ましい。なお、発現調節ＤＮＡは、プロモーター領域とＳＤ領域以外に任意のＤＮＡ配列を含みうるがその配列は特に限定されない。Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の上流に実際に置換、挿入等の改変若しくは変異を有する発現調節ＤＮＡとして、例えば、配列番号３７〜４５のいずれかに示される塩基配列を含むものが挙げられるがこれらに限定されない。【0080】
一の実施形態により、したがって、本発明はさらに、配列番号４７〜５０で示される塩基配列からなるプロモーター、又は、配列番号５５〜５９のいずれかに示される塩基配列を含む改変ＲＥＰのいずれか１つと、配列番号５１で示されるｐｈａＣ１ＳＤ配列、又は、配列番号５２、６０〜６６のいずれかで示される改変ｐｈａＣ１ＳＤ配列とを含む、発現調節ＤＮＡも提供する。上記のとおり、該ＳＤ配列は、該プロモーターの下流の適切な位置に配置される。上記のプロモーター、改変ＲＥＰ、ｐｈａＣ１ＳＤ配列、改変ｐｈａＣ１ＳＤ配列、発現調節ＤＮＡなどのＤＮＡは、例えば自動核酸合成機を使用することによって製造することができるし、また、ＰＣＲ法などの核酸増幅法によって増幅することができる。【0081】
Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現が調節された本発明の微生物を、ＰＨＡ共重合体の生産に利用する場合、当該微生物にはＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子以外にＰＨＡ合成酵素遺伝子が含有されている必要がある。この場合、本発明に用いる微生物として、Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子とＰＨＡ合成酵素遺伝子の両方を元々有する微生物を利用してもよいし、Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子とＰＨＡ合成酵素遺伝子のどちらか、又はその両方が遺伝子工学的手法により導入されたものであってもよい。また、ＰＨＡ合成酵素遺伝子は当該微生物が元来保有する染色体上又はプラスミド上又はメガプラスミド上に存在していてもよいし、或いは、プラスミド、ファージ、ファージミドなどの外来のベクター上に存在していてもよいが、染色体上又はプラスミド上又はメガプラスミド上に存在するのが好ましく、染色体上に存在するのがより好ましい。ＰＨＡ合成酵素遺伝子としては特に限定されないが、炭素数６以上のモノマー単位を含有するＰＨＡ共重合体を合成可能なＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が好ましく、構成単位として３ＨＨモノマーを含有するＰＨＡ共重合体を合成可能なＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子がより好ましい。そのようなＰＨＡ合成酵素遺伝子として、Ａ． ｃａｖｉａｅ由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子が好ましく、Ａ． ｃａｖｉａｅ野生株の有するＰＨＡ合成酵素遺伝子（ｐｈａＣ遺伝子）や、その変異酵素遺伝子である配列番号４６に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子、配列番号４６に示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列で、３ＨＨモノマーを含有する共重合ＰＨＡを合成可能なＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子等がより好ましい。なお、上記配列同一性は９０％以上であればより好ましく、更に好ましくは９５％以上、更により好ましくは９８％以上である。【0082】
そのような、Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子を有し、かつ、３ＨＨモノマーを含有するＰＨＡ共重合体を合成可能なＰＨＡ生産微生物として、Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒ、より好ましくはＣ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株にＡ． ｃａｖｉａｅ由来の配列番号４６に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＰＨＡ合成酵素遺伝子が導入された微生物を好ましい例として挙げることができる。【0083】
このような、構成単位として３ＨＨモノマーを含有するＰＨＡ共重合体を生産可能な微生物の作製方法は、特に限定するわけではないが、Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒを宿主として以下に例示する。上記例示したようなＡ． ｃａｖｉａｅ由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子を、Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒのゲノムＤＮＡ上に相同組換え法などでＣ． ｎｅｃａｔｏｒのＰＨＡ合成酵素遺伝子と置換する。そして、ゲノムＤＮＡ上に内在するＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の上流の塩基配列に、上記のプロモーター及びＳＤ配列を含有する発現調節ＤＮＡを相同組換え法などの方法で挿入する。【0084】
相同組換え法においては、導入すべき上記の遺伝子、プロモーター、ＳＤ配列及び発現調節配列から選択される核酸配列の他に、ゲノムＤＮＡ上の標的遺伝子座の導入部位の上流及び／又は下流の相同な塩基配列を含むベクターを、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、スフェロプラスト法などの公知の手法を用いて、上記の対象の微生物の形質転換を行い、ゲノムＤＮＡ上の標的遺伝子座に目的の核酸エレメントを導入することができる。ベクターとして、例えばプラスミド、ファージ、ファージミドなどを使用可能である。ベクターにはさらに、目的微生物を選択するためのマーカー遺伝子、例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子など、ターミネーターなどを含むことができる。なお、遺伝子クローニングや遺伝子組み換え技術については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９又は２００１）などに記載される技術を利用することができる。【0085】
改変プロモーター及び/又は改変ＳＤ配列が導入された微生物のゲノムＤＮＡ上の目的遺伝子の発現活性を解析するために、以下のような手法を使用することができる。【0086】
改変ｐｈａＣ１プロモーター（改変ＲＥＰ）及び改変ｐｈａＣ１ＳＤ配列の遺伝子発現活性は、該プロモーター及びＳＤ配列の下流にレポーター遺伝子を連結し、そのレポーター遺伝子の発現量を公知の方法で測定することによって評価することができる。使用されるレポーター遺伝子としては特に限定されず、βガラクトシダーゼ遺伝子や酸性フォスファターゼ遺伝子のような酵素活性を測定できる遺伝子の他、遺伝子発現量を相対的、間接的に確認できるもの、例えば蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＥＧＦＰ等）、発光タンパク質（ルシフェラーゼ等）であってもよい。或いは、例えば、Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒによるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産において、Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子（ｐｈａＪ遺伝子）のコピー数を増加させた組み換え体ではその３ＨＨ組成が上昇することが示されていることから、該プロモーター及びＳＤ配列の下流にｐｈａＪ遺伝子などの遺伝子を連結した配列を有するプラスミドベクターを導入したＣ． ｎｅｃａｔｏｒ株において、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産し、その３ＨＨ組成を分析することでも、プロモーター及びＳＤ配列の遺伝子発現活性を推定することができる。【0087】
本発明の微生物を使用すると、モノマー組成比の制御されたポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）共重合体を生産することができる。従来、微生物発酵においてＰＨＡ共重合体のモノマー組成比を任意に制御しうる手法は知られていなかったが、本発明の微生物では、発現調節配列を改変することによって、種々のモノマー組成比に変更することができる。ＰＨＡ共重合体の例は、３-ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）と３-ヒドロキシヘキサン酸（３ＨＨ）との共重合体、３-ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）と３-ヒドロキシオクタン酸（３ＨＯ）との共重合体などであり、モノマーの炭素数は、例えば４〜８若しくはそれ以上であるが、これらに限定されない。また、ＰＨＡ共重合体が、例えばＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の場合、共重合体中の３ＨＨモノマー組成比（ｍｏｌ％）を約５〜約１５の間で制御することができる。本発明によれば、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の３ＨＨのモノマー組成比（ｍｏｌ％）を、好ましくは約６〜約１５、より好ましくは約８〜約１３、さらに好ましくは約９〜約１２とすることが可能であり、汎用性が高く、柔軟性のある生分解性ポリマーを生産できる。本発明では、ＰＨＡ共重合体が、構成単位として３−ヒドロキシヘキサン酸（３ＨＨ）モノマーを含有する共重合体が好ましく、とりわけ、上記のモノマー組成比を有するＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）である。【0088】
２．ポリヒドロキシアルカノエート共重合体の生産方法本発明はまた、上記微生物を培養し、該微生物からポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）共重合体を回収することを含むことを特徴とする、ポリヒドロキシアルカノエート共重合体の生産方法を提供する。
【0089】
本発明においては、上記のような、Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現が調節され、かつＰＨＡ合成酵素遺伝子を含有する微生物を培養することで、ＰＨＡ共重合体を菌体内に蓄積させて、ＰＨＡ共重合体を生産する。【0090】
培養時の炭素源としては、本発明のＰＨＡ生産微生物が資化可能であればどんな炭素源でも使用可能であるが、好ましくは、グルコース、フルクトース、シュークロースなどの糖類、パーム油、パーム核油、コーン油、やし油、オリーブ油、大豆油、菜種油、ヤトロファ油などの油脂やその分画油類、あるいはその精製副産物、ラウリン酸、オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリンスチン酸などの脂肪酸やそれらの誘導体等が好ましい。より好ましくは、パーム油、パーム核油などの植物油脂のほか、パーム核油を分別した低融点分画であるパーム核油オレイン、また特に食糧との競合を避ける観点から、ＰＦＡＤ（パーム油脂肪酸蒸留物）やＰＫＦＡＤ（パーム核油脂肪酸蒸留物）、菜種油の脂肪酸蒸留物といった油脂の精製副産物等が挙げられる。本発明のＰＨＡの生産においては、上記炭素源、炭素源以外の栄養源である窒素源、無機塩類、そのほかの有機栄養源を含む培地を用いて、前記微生物を培養することが好ましい。窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えばリン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。そのほかの有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。【0091】
培養温度、培養時間、培養時ｐＨ、培地等の条件は、使用する微生物、例えばラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属、ワウテルシア（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属等の細菌類において通常使用されるような培養条件でよい。【0092】
本発明において、菌体からのＰＨＡ共重合体の回収は、特に限定されないが、例えば次のような方法により行うことができる。培養終了後、培養液から遠心分離機等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水及びメタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてＰＨＡ共重合体を抽出する。このＰＨＡ共重合体を含んだ有機溶剤溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてＰＨＡ共重合体を沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてＰＨＡ共重合体を回収する。【0093】
得られたＰＨＡ共重合体の重量平均分子量（Ｍｗ）や３ＨＨ等のモノマー組成（ｍｏｌ％）の分析は、例えば、ガスクロマトグラフ法や核磁気共鳴法等により行うことができる。【0094】
本発明において生産されるＰＨＡ共重合体は、構成単位として３ＨＨモノマーを含有するＰＨＡ共重合体が好ましく、３ＨＢモノマーと３ＨＨモノマーを構成単位とするＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）がより好ましく、３ＨＨ組成比が５ｍｏｌ％以上１５ｍｏｌ％以下のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）がさらに好ましい。本発明で得られるＰＨＡは、３ＨＨ組成などのモノマー比が制御されており、硬質ポリマーから軟質ポリマーまで応用可能な幅広い物性を持たせることができる。【実施例】
【0095】
以下に実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら制限されるものではない。なお全体的な遺伝子操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９））に記載されているように行うことができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主等は、市場の供給者から購入し、その説明に従い使用することができる。なお、酵素としては、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。【0096】
[製造例１]ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株の作製まず、遺伝子破壊用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
【0097】
Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして配列番号１及び配列番号２で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で２分を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）を用いた。また同様に、配列番号３及び配列番号４で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。さらに、上記ＰＣＲで得られた２種類のＤＮＡ断片をテンプレートとして、配列番号１及び４で示されるプライマーを用いて同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。このＤＮＡ断片を、ＳｗａＩ消化した特開２００７−２５９７０８号明細書に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｐｈａＺ６構造遺伝子より上流及び下流の塩基配列を有する遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｐｈａＺ６（−＋）を作製した。【0098】
さらに、Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして配列番号５及び配列番号６で示されるプライマーを用いて、同様の条件でＰＣＲを行った。また同様に、配列番号７及び配列番号８で示されるプライマーを用いて、同様の条件でＰＣＲを行った。さらに、上記ＰＣＲで得られた２種類のＤＮＡ断片をテンプレートとして、配列番号５及び８で示されるプライマーを用いて同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。このＤＮＡ断片を、ＳｗａＩ消化した特開２００７−２５９７０８号明細書に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｐｈａＺ１構造遺伝子より上流及び下流のＤＮＡ配列を有する遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｐｈａＺ１（−＋）を作製した。【0099】
さらに、Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして配列番号９及び配列番号１０で示されるプライマーを用いて、同様の条件でＰＣＲを行った。また同様に、配列番号１１及び配列番号１２で示されるプライマーを用いて、同様の条件でＰＣＲを行った。さらに、上記ＰＣＲで得られた２種類のＤＮＡ断片をテンプレートとして、配列番号９及び１２で示されるプライマーを用いて同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。このＤＮＡ断片を、ＳｗａＩ消化した特開２００７−２５９７０８号明細書に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｐｈａＺ２構造遺伝子より上流及び下流のＤＮＡ配列を有する遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｐｈａＺ２（−＋）を作製した。【0100】
次に、遺伝子破壊株の作製を行った。【0101】
遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｐｈａＺ６（−＋）で大腸菌Ｓ１７−１株（ＡＴＣＣ４７０５５）を形質転換し、ＫＮＫ００５株（ＵＳ７３８４７６６号参照）とＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。ＫＮＫ００５株は配列表の配列番号４６に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を導入したＣ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株である。【0102】
培養液を２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．２ｇ／Ｌ、リン酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）に播種し、寒天培地上で生育してきた菌株を選択して、プラスミドがＫＮＫ００５株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株をプラスミドが脱落した株として取得した。さらにＰＣＲによる解析により染色体上のｐｈａＺ６遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した菌株１株を単離した。この遺伝子破壊株をＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ６株と命名した。得られたＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ６株はＣ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株の染色体上のｐｈａＺ６遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列表の配列番号４６に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入された株である。【0103】
さらに、同様の方法で、ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ６株を親株としてｐＮＳ２Ｘ−ｐｈａＺ２（−＋）を用いて、染色体上のｐｈａＺ６遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失した染色体遺伝子破壊株ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ２，６株を作製した。さらに、同様の方法で、ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ２，６株を親株としてｐＮＳ２Ｘ−ｐｈａＺ１（−＋）を用いて、染色体上のｐｈａＺ６遺伝子及びｐｈａＺ１遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失した染色体遺伝子破壊株ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株を作製した。得られたＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株はＣ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株の染色体上のｐｈａＺ６遺伝子及びｐｈａＺ１遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列表の配列番号４６に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入された株である。【0104】
[製造例２]ＫＮＫ００５ ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株の作製まず、プロモーター及びＳＤ配列挿入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
【0105】
Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして配列番号１３及び配列番号１４で示されるプライマーを用いて、製造例１と同様の条件でＰＣＲを行った。また同様に、配列番号１５及び配列番号１６で示されるプライマーを用いて、同様の条件でＰＣＲを行った。さらに、プラスミドｐＫＫ３８８−１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）をテンプレートとして配列番号１７及び配列番号１８で示されるプライマーを用いて同様の条件でＰＣＲを行った。上記ＰＣＲで得られた３種類のＤＮＡ断片をテンプレートとして、配列番号１３及び配列番号１６で示されるプライマーを用いて同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。このＤＮＡ断片を、ＳｗａＩ消化した特開２００７−２５９７０８号明細書に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｐｈａＪ４ｂ構造遺伝子より上流の塩基配列、ｔｒｃプロモーター、ｐｈａＣ１ＳＤ配列、及びｐｈａＪ４ｂ構造遺伝子配列を有するＤＮＡ挿入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＪ４ｂＵ−ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂを作製した。【0106】
次に、プロモーター及びＳＤ配列挿入株の作製を行った。【0107】
プロモーター及びＳＤ配列挿入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＪ４ｂＵ−ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂで大腸菌Ｓ１７−１株（ＡＴＣＣ４７０５５）を形質転換し、製造例１で作製したＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株とＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。培養液を２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．２ｇ／Ｌ、リン酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）に播種し、寒天培地上で生育してきた菌株を選択して、プラスミドがＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株をプラスミドが脱落した株として取得した。さらにＰＣＲによる解析により染色体上のｐｈａＪ４ｂ構造遺伝子の上流に、配列番号３８で示される、ｔｒｃプロモーター及びｐｈａＣ１ＳＤ配列を有するＤＮＡ断片が挿入された菌株１株を単離した。このプロモーター、及びＳＤ配列挿入株をＫＮＫ００５ ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株と命名した。【0108】
[製造例３]ＫＮＫ００５ ｌａｃＵＶ５−ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株の作製先ず、プロモーター及びＳＤ配列挿入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
【0109】
Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして配列番号１３及び配列番号１４で示されるプライマーを用いて、製造例１と同様の条件でＰＣＲを行った。また同様に、配列番号１５及び配列番号１６で示されるプライマーを用いて、同様の条件でＰＣＲを行った。さらに、Ｅ． ｃｏｌｉ ＨＢ１０１株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして配列番号１９及び配列番号２０で示されるプライマーを用いて同様の条件でＰＣＲを行った。上記ＰＣＲで得られた３種類のＤＮＡ断片をテンプレートとして、配列番号１３及び配列番号１６で示されるプライマーを用いて同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。このＤＮＡ断片を、ＳｗａＩ消化した特開２００７−２５９７０８号明細書に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｐｈａＪ４ｂ構造遺伝子より上流の塩基配列、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｐｈａＣ１ＳＤ配列、及びｐｈａＪ４ｂ構造遺伝子配列を有するＤＮＡ挿入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＪ４ｂＵ−ｌａｃＵＶ５−ｐｈａＪ４ｂを作製した。【0110】
次に、プロモーター及びＳＤ配列挿入株の作製を行った。【0111】
プロモーター及びＳＤ配列挿入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＪ４ｂＵ− ｌａｃＵＶ５−ｐｈａＪ４ｂで大腸菌Ｓ１７−１株（ＡＴＣＣ４７０５５）を形質転換し、製造例１で作製したＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株とＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。培養液を２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．２ｇ／Ｌ、リン酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）に播種し、寒天培地上で生育してきた菌株を選択して、プラスミドがＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株をプラスミドが脱落した株として取得した。さらにＰＣＲによる解析により染色体上のｐｈａＪ４ｂ構造遺伝子の上流に、配列番号３９で示される、ｌａｃＵＶ５プロモーター及びｐｈａＣ１ＳＤ配列を有するＤＮＡ断片が挿入された菌株１株を単離した。【0112】
このプロモーター、及びＳＤ配列挿入株をＫＮＫ００５ ｌａｃＵＶ５−ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株と命名した。【0113】
[製造例４]ＫＮＫ００５ ｔｒｐ−ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株の作製まず、プロモーター及びＳＤ配列挿入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
【0114】
Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして配列番号１３及び配列番号１４で示されるプライマーを用いて、製造例１と同様の条件でＰＣＲを行った。また同様に、配列番号１５及び配列番号１６で示されるプライマーを用いて、同様の条件でＰＣＲを行った。さらに、プラスミドｐＫＫ３８８−１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）をテンプレートとして配列番号１７及び配列番号２１で示されるプライマーを用いて同様の条件でＰＣＲを行った。【0115】
上記ＰＣＲで得られた３種類のＤＮＡ断片をテンプレートとして、配列番号１３及び配列番号１６で示されるプライマーを用いて同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。このＤＮＡ断片を、ＳｗａＩ消化した特開２００７−２５９７０８号明細書に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｐｈａＪ４ｂ構造遺伝子より上流の塩基配列、ｔｒｐプロモーター、ｐｈａＣ１ＳＤ配列、及びｐｈａＪ４ｂ構造遺伝子配列を有するＤＮＡ挿入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＪ４ｂＵ−ｔｒｐ−ｐｈａＪ４ｂを作製した。【0116】
次に、プロモーター及びＳＤ配列挿入株の作製を行った。【0117】
プロモーター及びＳＤ配列挿入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＪ４ｂＵ−ｔｒｐ−ｐｈａＪ４ｂで大腸菌Ｓ１７−１株（ＡＴＣＣ４７０５５）を形質転換し、製造例１で作製したＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株とＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。培養液を２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．２ｇ／Ｌ、リン酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）に播種し、寒天培地上で生育してきた菌株を選択して、プラスミドがＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株をプラスミドが脱落した株として取得した。さらにＰＣＲによる解析により染色体上のｐｈａＪ４ｂ構造遺伝子の上流に、配列番号４０で示される、ｔｒｐプロモーター及びｐｈａＣ１ＳＤ配列を有するＤＮＡ断片が挿入された菌株１株を単離した。【0118】
このプロモーター、及びＳＤ配列挿入株をＫＮＫ００５ ｔｒｐ−ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株と命名した。【0119】
[製造例５]ＫＮＫ００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株の作製まず、プロモーター及びＳＤ配列挿入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
【0120】
Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして配列番号１３及び配列番号１４で示されるプライマーを用いて、製造例１と同様の条件でＰＣＲを行った。また同様に、配列番号１５及び配列番号１６で示されるプライマーを用いて、同様の条件でＰＣＲを行った。また同様に、配列番号２２及び配列番号２３で示されるプライマーを用いて同様の条件でＰＣＲを行った。上記ＰＣＲで得られた３種類のＤＮＡ断片をテンプレートとして、配列番号１３及び配列番号１６を用いて同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。このＤＮＡ断片を、ＳｗａＩ消化した特開２００７−２５９７０８号明細書に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｐｈａＪ４ｂ構造遺伝子より上流の塩基配列、ｐｈａＣ１プロモーター、ｐｈａＣ１ＳＤ配列、及びｐｈａＪ４ｂ構造遺伝子配列を有するＤＮＡ挿入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＪ４ｂＵ−ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂを作製した。【0121】
次に、プロモーター及びＳＤ配列挿入株の作製を行った。プロモーター及びＳＤ配列挿入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＪ４ｂＵ−ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂで大腸菌Ｓ１７−１株（ＡＴＣＣ４７０５５）を形質転換し、製造例１で作製したＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株とＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。培養液を２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．２ｇ／Ｌ、リン酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）に播種し、寒天培地上で生育してきた菌株を選択して、プラスミドがＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株をプラスミドが脱落した株として取得した。さらにＰＣＲによる解析により染色体上のｐｈａＪ４ｂ構造遺伝子の上流に、配列番号３７で示される、ｐｈａＣ１プロモーター及びｐｈａＣ１ＳＤ配列を有するＤＮＡ断片が挿入された菌株１株を単離した。
【0122】
このプロモーター、及びＳＤ配列挿入株をＫＮＫ００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株と命名した。【0123】
[製造例６]ＫＮＫ００５ ＲＥＰＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株の作製まず、プロモーター及びＳＤ配列挿入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
【0124】
Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして配列番号１３及び配列番号１４で示されるプライマーを用いて、製造例１と同様の条件でＰＣＲを行った。また同様に、配列番号２４及び配列番号１６で示されるプライマーを用いて、同様の条件でＰＣＲを行った。また同様に、配列番号２２及び配列番号２５で示されるプライマーを用いて同様の条件でＰＣＲを行った。【0125】
上記ＰＣＲで得られた３種類のＤＮＡ断片をテンプレートとして、配列番号１３及び配列番号１６を用いて同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。このＤＮＡ断片を、ＳｗａＩ消化した特開２００７−２５９７０８号明細書に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｐｈａＪ４ｂ構造遺伝子より上流の塩基配列、ｐｈａＣ１プロモーター、ｐｈａＣ１ＳＤ配列改変体、及びｐｈａＪ４ｂ構造遺伝子配列を有するＤＮＡ挿入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＪ４ｂＵ−ＲＥＰＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ｂを作製した。【0126】
次に、プロモーター及びＳＤ配列挿入株の作製を行った。プロモーター及びＳＤ配列挿入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＪ４ｂＵ−ＲＥＰＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ｂで大腸菌Ｓ１７−１株（ＡＴＣＣ４７０５５）を形質転換し、製造例１で作製したＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株とＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。培養液を２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．２ｇ／Ｌ、リン酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）に播種し、寒天培地上で生育してきた菌株を選択して、プラスミドがＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株をプラスミドが脱落した株として取得した。さらにＰＣＲによる解析により染色体上のｐｈａＪ４ｂ構造遺伝子の上流に、配列番号４１で示される、ｐｈａＣ１プロモーター及びｐｈａＣ１ＳＤ配列改変体を有するＤＮＡ断片が挿入された菌株１株を単離した。
【0127】
このプロモーター、及びＳＤ配列挿入株をＫＮＫ００５ ＲＥＰＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株と命名した。【0128】
[製造例７]ＫＮＫ００５ ＲＥＰＮ１７ＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株の作製先ず、プロモーター及びＳＤ配列挿入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
【0129】
製造例６で作製したプラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＪ４ｂＵ−ＲＥＰＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ｂをテンプレートとして配列番号１３及び配列番号２６で示されるプライマーを用いて、製造例１と同様の条件でＰＣＲを行った。また同様に、配列番号２７及び配列番号１６で示されるプライマーを用いて、同様の条件でＰＣＲを行った。上記ＰＣＲで得られた２種類のＤＮＡ断片をテンプレートとして、配列番号１３及び配列番号１６を用いて同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。このＤＮＡ断片を、ＳｗａＩ消化した特開２００７−２５９７０８号明細書に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｐｈａＪ４ｂ構造遺伝子より上流の塩基配列、ｐｈａＣ１プロモーター改変体、ｐｈａＣ１ＳＤ配列改変体、及びｐｈａＪ４ｂ構造遺伝子配列を有するＤＮＡ挿入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＪ４ｂＵ−ＲＥＰＮ１７ＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ｂを作製した。【0130】
次に、プロモーター及びＳＤ配列挿入株の作製を行った。【0131】
プロモーター及びＳＤ配列挿入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＪ４ｂＵ−ＲＥＰＮ１７ＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ｂで大腸菌Ｓ１７−１株（ＡＴＣＣ４７０５５）を形質転換し、製造例１で作製したＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株とＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。培養液を２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．２ｇ／Ｌ、リン酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）に播種し、寒天培地上で生育してきた菌株を選択して、プラスミドがＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株をプラスミドが脱落した株として取得した。さらにＰＣＲによる解析により染色体上のｐｈａＪ４ｂ構造遺伝子の上流に、配列番号４２で示される、ｐｈａＣ１プロモーター改変体及びｐｈａＣ１ＳＤ配列改変体を有するＤＮＡ断片が挿入された菌株１株を単離した。【0132】
このプロモーター、及びＳＤ配列挿入株をＫＮＫ００５ ＲＥＰＮ１７ＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株と命名した。【0133】
[製造例８]ＫＮＫ００５ ｔｒｃＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ａ／ΔｐｈａＺ１，２，６株の作製まず、プロモーター及びＳＤ配列挿入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
【0134】
Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして配列番号２８及び配列番号２９で示されるプライマーを用いて、製造例１と同様の条件でＰＣＲを行った。また同様に、配列番号３０及び配列番号３１で示されるプライマーを用いて、同様の条件でＰＣＲを行った。さらに、プラスミドｐＫＫ３８８−１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）をテンプレートとして、配列番号３２及び配列番号３３で示されるプライマーを用いて同様の条件でＰＣＲを行った。【0135】
上記ＰＣＲで得られた３種類のＤＮＡ断片をテンプレートとして、配列番号２８及び配列番号３１を用いて同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。このＤＮＡ断片を、ＳｗａＩ消化した特開２００７−２５９７０８号明細書に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｐｈａＪ４ａ構造遺伝子より上流の塩基配列、ｔｒｃプロモーター、ｐｈａＣ１ＳＤ配列改変体、及びｐｈａＪ４ａ構造遺伝子配列を有するＤＮＡ挿入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＪ４ａＵ−ｔｒｃＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ａを作製した。【0136】
次に、プロモーター及びＳＤ配列挿入株の作製を行った。【0137】
プロモーター及びＳＤ配列挿入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＪ４ａＵ−ｔｒｃＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ａで大腸菌Ｓ１７−１株（ＡＴＣＣ４７０５５）を形質転換し、製造例１で作製したＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株とＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。培養液を２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．２ｇ／Ｌ、リン酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）に播種し、寒天培地上で生育してきた菌株を選択して、プラスミドがＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株をプラスミドが脱落した株として取得した。さらにＰＣＲによる解析により染色体上のｐｈａＪ４ａ構造遺伝子の上流に、配列番号４３で示される、ｔｒｃプロモーター及びｐｈａＣ１ＳＤ配列改変体を有するＤＮＡ断片が挿入された菌株１株を単離した。【0138】
このプロモーター、及びＳＤ配列挿入株をＫＮＫ００５ ｔｒｃＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ａ／ΔｐｈａＺ１，２，６株と命名した。【0139】
[製造例９]ＫＮＫ００５ ｌａｃＵＶ５−ｐｈａＪ４ａ／ΔｐｈａＺ１，２，６株の作製まず、プロモーター及びＳＤ配列挿入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
【0140】
Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして配列番号２８及び配列番号２９で示されるプライマーを用いて、製造例１と同様の条件でＰＣＲを行った。また同様に、配列番号３４及び配列番号３１で示されるプライマーを用いて、同様の条件でＰＣＲを行った。さらに、Ｅ． ｃｏｌｉ ＨＢ１０１株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして配列番号３５及び配列番号２０で示されるプライマーを用いて同様の条件でＰＣＲを行った。上記ＰＣＲで得られた３種類のＤＮＡ断片をテンプレートとして、配列番号２８及び配列番号３１を用いて同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。このＤＮＡ断片を、ＳｗａＩ消化した特開２００７−２５９７０８号明細書に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｐｈａＪ４ａ構造遺伝子より上流の塩基配列、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｐｈａＣ１ＳＤ配列、及びｐｈａＪ４ａ構造遺伝子配列を有するＤＮＡ挿入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＪ４ａＵ−ｌａｃＵＶ５−ｐｈａＪ４ａを作製した。【0141】
次に、プロモーター及びＳＤ配列挿入株の作製を行った。【0142】
プロモーター及びＳＤ配列挿入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＪ４ａＵ−ｌａｃＵＶ５−ｐｈａＪ４ａで大腸菌Ｓ１７−１株（ＡＴＣＣ４７０５５）を形質転換し、製造例１で作製したＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株とＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。培養液を２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．２ｇ／Ｌ、リン酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）に播種し、寒天培地上で生育してきた菌株を選択して、プラスミドがＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株をプラスミドが脱落した株として取得した。さらにＰＣＲによる解析により染色体上のｐｈａＪ４ａ構造遺伝子の上流に、配列番号３９で示される、ｌａｃＵＶ５プロモーター及びｐｈａＣ１ＳＤ配列を有するＤＮＡ断片が挿入された菌株１株を単離した。【0143】
このプロモーター、及びＳＤ配列挿入株をＫＮＫ００５ ｌａｃＵＶ５−ｐｈａＪ４ａ／ΔｐｈａＺ１，２，６株と命名した。【0144】
[製造例１０]ＫＮＫ００５ ｌａｃＵＶ５ＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ａ／ΔｐｈａＺ１，２，６株の作製まず、プロモーター及びＳＤ配列挿入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
【0145】
製造例９で作製したプラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＪ４ａＵ−ｌａｃＵＶ５−ｐｈａＪ４ａをテンプレートとして配列番号２８及び配列番号３３で示されるプライマーを用いて、製造例１と同様の条件でＰＣＲを行った。また同様に、配列番号３０及び配列番号３１で示されるプライマーを用いて、同様の条件でＰＣＲを行った。上記ＰＣＲで得られた２種類のＤＮＡ断片をテンプレートとして、配列番号２８及び配列番号３１を用いて同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。このＤＮＡ断片を、ＳｗａＩ消化した特開２００７−２５９７０８号明細書に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｐｈａＪ４ａ構造遺伝子より上流の塩基配列、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｐｈａＣ１ＳＤ配列改変体、及びｐｈａＪ４ａ構造遺伝子配列を有するＤＮＡ挿入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＪ４ａＵ−ｌａｃＵＶ５ＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ａを作製した。【0146】
次に、プロモーター及びＳＤ配列挿入株の作製を行った。【0147】
プロモーター及びＳＤ配列挿入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＪ４ａＵ−ｌａｃＵＶ５ＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ａで大腸菌Ｓ１７−１株（ＡＴＣＣ４７０５５）を形質転換し、製造例１で作製したＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株とＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。培養液を２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．２ｇ／Ｌ、リン酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）に播種し、寒天培地上で生育してきた菌株を選択して、プラスミドがＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株をプラスミドが脱落した株として取得した。さらにＰＣＲによる解析により染色体上のｐｈａＪ４ａ構造遺伝子の上流に、配列番号４４で示される、ｌａｃＵＶ５プロモーター及びｐｈａＣ１ＳＤ配列改変体を有するＤＮＡ断片が挿入された菌株１株を単離した。【0148】
このプロモーター、及びＳＤ配列挿入株をＫＮＫ００５ ｌａｃＵＶ５ＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ａ／ΔｐｈａＺ１，２，６株と命名した。【0149】
[製造例１１]ＫＮＫ００５ ｔｒｐ−ｐｈａＪ４ａ／ΔｐｈａＺ１，２，６株の作製先ず、プロモーター及びＳＤ配列挿入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
【0150】
Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして配列番号２８及び配列番号２９で示されるプライマーを用いて、製造例１と同様の条件でＰＣＲを行った。また同様に、配列番号３４及び配列番号３１で示されるプライマーを用いて、同様の条件でＰＣＲを行った。さらに、プラスミドｐＫＫ３８８−１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）をテンプレートとして、配列番号３２及び配列番号２１で示されるプライマーを用いて同様の条件でＰＣＲを行った。上記ＰＣＲで得られた３種類のＤＮＡ断片をテンプレートとして、配列番号２８及び配列番号３１を用いて同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。このＤＮＡ断片を、ＳｗａＩ消化した特開２００７−２５９７０８号明細書に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｐｈａＪ４ａ構造遺伝子より上流の塩基配列、ｔｒｐプロモーター、ｐｈａＣ１ＳＤ配列、及びｐｈａＪ４ａ構造遺伝子配列を有するＤＮＡ挿入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＪ４ａＵ−ｔｒｐ−ｐｈａＪ４ａを作製した。【0151】
次に、プロモーター及びＳＤ配列挿入株の作製を行った。【0152】
プロモーター及びＳＤ配列挿入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＪ４ａＵ−ｔｒｐ−ｐｈａＪ４ａで大腸菌Ｓ１７−１株（ＡＴＣＣ４７０５５）を形質転換し、製造例１で作製したＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株とＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。培養液を２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．２ｇ／Ｌ、リン酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）に播種し、寒天培地上で生育してきた菌株を選択して、プラスミドがＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株をプラスミドが脱落した株として取得した。さらにＰＣＲによる解析により染色体上のｐｈａＪ４ａ構造遺伝子の上流に、配列番号４０で示される、ｔｒｐプロモーター及びｐｈａＣ１ＳＤ配列を有するＤＮＡ断片が挿入された菌株１株を単離した。【0153】
このプロモーター、及びＳＤ配列挿入株をＫＮＫ００５ ｔｒｐ−ｐｈａＪ４ａ／ΔｐｈａＺ１，２，６株と命名した。【0154】
[製造例１２]ＫＮＫ００５ ｔｒｐＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ａ／ΔｐｈａＺ１，２，６株の作製まず、プロモーター及びＳＤ配列挿入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
【0155】
製造例１１で作製したプラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＪ４ａＵ−ｔｒｐ−ｐｈａＪ４ａをテンプレートとして配列番号２８及び配列番号３３で示されるプライマーを用いて、製造例１と同様の条件でＰＣＲを行った。また同様に、配列番号３０及び配列番号３１で示されるプライマーを用いて、同様の条件でＰＣＲを行った。上記ＰＣＲで得られた２種類のＤＮＡ断片をテンプレートとして、配列番号２８及び配列番号３１を用いて同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。このＤＮＡ断片を、ＳｗａＩ消化した特開２００７−２５９７０８号明細書に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｐｈａＪ４ａ構造遺伝子より上流の塩基配列、ｔｒｐプロモーター、ｐｈａＣ１ＳＤ配列改変体、及びｐｈａＪ４ａ構造遺伝子配列を有するＤＮＡ挿入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＪ４ａＵ−ｔｒｐＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ａを作製した。【0156】
次に、プロモーター及びＳＤ配列挿入株の作製を行った。【0157】
プロモーター及びＳＤ配列挿入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＪ４ａＵ−ｔｒｐ ＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ａで大腸菌Ｓ１７−１株（ＡＴＣＣ４７０５５）を形質転換し、製造例１で作製したＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株とＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。培養液を２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．２ｇ／Ｌ、リン酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）に播種し、寒天培地上で生育してきた菌株を選択して、プラスミドがＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株をプラスミドが脱落した株として取得した。さらにＰＣＲによる解析により染色体上のｐｈａＪ４ａ構造遺伝子の上流に、配列番号４５で示される、ｔｒｐプロモーター及びｐｈａＣ１ＳＤ配列改変体を有するＤＮＡ断片が挿入された菌株１株を単離した。【0158】
このプロモーター、及びＳＤ配列挿入株をＫＮＫ００５ ｔｒｐＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ａ／ΔｐｈａＺ１，２，６株と命名した。【0159】
[製造例１３]ＫＮＫ００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ａ／ΔｐｈａＺ１，２，６株の作製まず、プロモーター及びＳＤ配列挿入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
【0160】
Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして配列番号２８及び配列番号２９で示されるプライマーを用いて、製造例１と同様の条件でＰＣＲを行った。また同様に、配列番号３４及び配列番号３１で示されるプライマーを用いて、同様の条件でＰＣＲを行った。また同様に、配列番号３６及び配列番号２３で示されるプライマーを用いて同様の条件でＰＣＲを行った。上記ＰＣＲで得られた３種類のＤＮＡ断片をテンプレートとして、配列番号２８及び配列番号３１を用いて同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。このＤＮＡ断片を、ＳｗａＩ消化した特開２００７−２５９７０８号明細書に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｐｈａＪ４ａ構造遺伝子より上流の塩基配列、ｐｈａＣ１プロモーター、ｐｈａＣ１ＳＤ配列、及びｐｈａＪ４ａ構造遺伝子配列を有するＤＮＡ挿入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＪ４ａＵ−ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ａを作製した。【0161】
次に、プロモーター及びＳＤ配列挿入株の作製を行った。【0162】
プロモーター及びＳＤ配列挿入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＪ４ａＵ−ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ａで大腸菌Ｓ１７−１株（ＡＴＣＣ４７０５５）を形質転換し、製造例１で作製したＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株とＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。培養液を２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．２ｇ／Ｌ、リン酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）に播種し、寒天培地上で生育してきた菌株を選択して、プラスミドがＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株をプラスミドが脱落した株として取得した。さらにＰＣＲによる解析により染色体上のｐｈａＪ４ａ構造遺伝子の上流に、配列番号３７で示される、ｐｈａＣ１プロモーター及びｐｈａＣ１ＳＤ配列を有するＤＮＡ断片が挿入された菌株１株を単離した。【0163】
このプロモーター、及びＳＤ配列挿入株をＫＮＫ００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ａ／ΔｐｈａＺ１，２，６株と命名した。【0164】
[実施例１]ＫＮＫ００５ ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産種母培地の組成は１ｗ／ｖ％Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．２ｗ／ｖ％Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％ＫＨ２ＰＯ４とした。
【0165】
ＰＨＡ生産培地の組成は１．１ｗ／ｖ％Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％ＫＨ２ＰＯ４、０．１３ｗ／ｖ％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｖ／ｖ％微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かした溶液。）とした。炭素源はパーム核油を分別した低融点画分であるパーム核油オレインを単一炭素源として用いた。【0166】
製造例２で作製したＫＮＫ００５ ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株のグリセロールストック（５０μｌ）を種母培地（１０ｍｌ）に接種して２４時間培養し、培養液を種母とした。ＰＨＡ生産培養は５０ｍＬの生産培地を入れた坂口フラスコに前培養種母を１．０ｖ／ｖ％接種した。培養温度３０℃で７２時間振とう培養を行い、培養終了後、遠心分離によって菌体を回収、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。【0167】
得られた乾燥菌体１ｇに１００ｍＬのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のＰＨＡを抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が３０ｍＬになるまで濃縮後、９０ｍＬのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置した。析出したＰＨＡをろ別後、５０℃で３時間真空乾燥した。乾燥ＰＨＡの重量を測定し、ＰＨＡ生産量を算出した。結果を表１に示した。【0168】
【表1】
【0169】
生産されたポリエステルの３ＨＨ組成比率は以下のようにガスクロマトグラフィーによって測定した。乾燥ポリエステルの約２０ｍｇに２ｍｌの硫酸−メタノール混液（１５：８５）と２ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱することでポリエステル分解物のメチルエステルを得た。冷却後、これに１．５ｇの炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えて中和し、炭酸ガスの発生がとまるまで放置した。４ｍｌのジイソプロピルエーテルを添加してよく混合した後、遠心して、上清中のポリエステル分解物のモノマーユニット組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析した。ガスクロマトグラフは島津製作所ＧＣ−１７Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡ ＢＯＮＤ−１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。キャリアガスとしてＨｅを用い、カラム入口圧１００ｋＰａとし、サンプルは１μｌを注入した。温度条件は、初発温度１００〜２００℃まで８℃／分の速度で昇温、さらに２００〜２９０℃まで３０℃／分の速度で昇温した。【0170】
上記条件にて分析した結果、得られたポリエステルは共重合体ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）であり、３ＨＨ組成比率は上記の表１に示す通りであった。【0171】
[実施例２]ＫＮＫ００５ ｌａｃＵＶ５−ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産ＫＮＫ００５ ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株に代えて製造例３で作製したＫＮＫ００５ ｌａｃＵＶ５−ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株を用いて、実施例１と同様の方法でＰＨＡを生産し、得られたＰＨＡの生産量、及び３ＨＨ組成比率を測定した。結果を上記の表１に示した。
【0172】
[実施例３]ＫＮＫ００５ ｔｒｐ−ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産ＫＮＫ００５ ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株に代えて製造例４で作製したＫＮＫ００５ ｔｒｐ−ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株を用いて、実施例１と同様の方法でＰＨＡを生産し、得られたＰＨＡの生産量、及び３ＨＨ組成比率を測定した。結果を上記の表１に示した。
【0173】
[実施例４]ＫＮＫ００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産ＫＮＫ００５ ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株に代えて製造例５で作製したＫＮＫ００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株を用いて、実施例１と同様の方法でＰＨＡを生産し、得られたＰＨＡの生産量、及び３ＨＨ組成比率を測定した。結果を上記の表１に示した。
【0174】
[実施例５]ＫＮＫ００５ ＲＥＰＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産ＫＮＫ００５ ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株に代えて製造例６で作製したＫＮＫ００５ ＲＥＰＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株を用いて、実施例１と同様の方法でＰＨＡを生産し、得られたＰＨＡの生産量、及び３ＨＨ組成比率を測定した。結果を上記の表１に示した。
【0175】
[実施例６]ＫＮＫ００５ ＲＥＰＮ１７ＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産ＫＮＫ００５ ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株に代えて製造例７で作製したＫＮＫ００５ ＲＥＰＮ１７ＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株を用いて、実施例１と同様の方法でＰＨＡを生産し、得られたＰＨＡの生産量、及び３ＨＨ組成比率を測定した。結果を上記の表１に示した。
【0176】
[実施例７]ＫＮＫ００５ ｔｒｃＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ａ／ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産ＫＮＫ００５ ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株に代えて製造例８で作製したＫＮＫ００５ ｔｒｃＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ａ／ΔｐｈａＺ１，２，６株を用いて、実施例１と同様の方法でＰＨＡを生産し、得られたＰＨＡの生産量、及び３ＨＨ組成比率を測定した。結果を上記の表１に示した。
【0177】
[実施例８]ＫＮＫ００５ ｌａｃＵＶ５−ｐｈａＪ４ａ／ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産ＫＮＫ００５ ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株に代えて製造例９で作製したＫＮＫ００５ ｌａｃＵＶ５−ｐｈａＪ４ａ／ΔｐｈａＺ１，２，６株を用いて、実施例１と同様の方法でＰＨＡを生産し、得られたＰＨＡの生産量、及び３ＨＨ組成比率を測定した。結果を上記の表１に示した。
【0178】
[実施例９]ＫＮＫ００５ ｌａｃＵＶ５ＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ａ／ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産ＫＮＫ００５ ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株に代えて製造例１０で作製したＫＮＫ００５ ｌａｃＵＶ５ＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ａ／ΔｐｈａＺ１，２，６株を用いて、実施例１と同様の方法でＰＨＡを生産し、得られたＰＨＡの生産量、及び３ＨＨ組成比率を測定した。結果を上記の表１に示した。
【0179】
[実施例１０]ＫＮＫ００５ ｔｒｐ−ｐｈａＪ４ａ／ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産ＫＮＫ００５ ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株に代えて製造例１１で作製したＫＮＫ００５ ｔｒｐ−ｐｈａＪ４ａ／ΔｐｈａＺ１，２，６株を用いて、実施例１と同様の方法でＰＨＡを生産し、得られたＰＨＡの生産量、及び３ＨＨ組成比率を測定した。結果を上記の表１に示した。
【0180】
[実施例１１]ＫＮＫ００５ ｔｒｐＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ａ／ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産ＫＮＫ００５ ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株に代えて製造例１２で作製したＫＮＫ００５ ｔｒｐＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ａ／ΔｐｈａＺ１，２，６株を用いて、実施例１と同様の方法でＰＨＡを生産し、得られたＰＨＡの生産量、及び３ＨＨ組成比率を測定した。結果を上記の表１に示した。
【0181】
[実施例１２]ＫＮＫ００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ａ／ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産ＫＮＫ００５ ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株に代えて製造例１３で作製したＫＮＫ００５ ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ａ／ΔｐｈａＺ１，２，６株を用いて、実施例１と同様の方法でＰＨＡを生産し、得られたＰＨＡの生産量、及び３ＨＨ組成比率を測定した。
【0182】
[比較例１]ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産ＫＮＫ００５ ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株に代えて製造例１で作製したＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株を用いて、実施例１と同様の方法でＰＨＡを生産し、得られたＰＨＡの生産量、及び３ＨＨ組成比率を測定した。結果を上記の表１に示した。
【0183】
[実施例１３]他の発現調節配列が微生物株によるＰＨＡの生産及び３ＨＨ組成比率に及ぼす影響を調べるための試験及び結果（１３−１）プラスミドベクターｐＣＵＰ２−ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂの作製
Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株のｐｈａＣ１の野生型のプロモーター（ＲＥＰ）及びＳＤ配列と、ｐｈａＪ４ｂ遺伝子を含む塩基配列からなるＤＮＡを挿入したプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂを次のように作製した。 Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして配列番号７２及び配列番号２３で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で６０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片をＲＥＰとした。次に、Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして配列番号７０及び配列番号７１で示されるプライマーを用いて同様の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片を（ＲｅＳＤ）−ｐｈａＪ４ｂとした。次に、ＲＥＰ及び（ＲｅＳＤ）−ｐｈａＪ４ｂをテンプレートとして配列番号７２及び配列番号７１で示されるプライマーを用いて同様の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩで消化した。このＤＮＡ断片をＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ（ＥｃｏＲＩ）とした。このＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ（ＥｃｏＲＩ）を、国際公開公報ＷＯ／２００７／０４９７１６号公報に記載のプラスミドベクターｐＣＵＰ２をＭｕｎＩで切断したものと連結した。ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂ（ＥｃｏＲＩ）とｐＣＵＰ２をＭｕｎＩで切断したものを連結したプラスミドベクターについて、ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製のＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて塩基配列を決定し、鋳型としたＤＮＡの塩基配列と同一であることを確認するとともに、ｐｈａＪ４ｂ遺伝子がｐＣＵＰ２上のｐａｒＰ遺伝子とは逆向きに挿入されたものを取得した。取得したプラスミドベクターをｐＣＵＰ２−ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂとした。
【0184】
（１３−２）プロモーター改変プラスミドベクターｐＣＵＰ２−ＲＥＰＰ３Ｍ１４−ｐｈａＪ４ｂの作製上記（１３−１）で作製したプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂに対して、ｐｈａＪ４ｂの発現調節を行うＣ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株のｐｈａＣ１Ｃのプロモーターに配列番号７３で示した変異を導入したｐＣＵＰ２−ＲＥＰＰ３Ｍ１４−ｐｈａＪ４ｂを次のように作製した。
【0185】
上記（１３−１）で作製したプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂをテンプレートとして配列番号７２及び配列番号７４で示されるプライマーを用いて上記（１３−１）と同様の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をＲＥＰ−ＰＵとした。次に、上記（１３−１）で作製したプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂをテンプレートとして配列番号７１及び配列番号７５で示されるプライマーを用いて上記（１３−１）と同様の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片を（ＲＥＰＰ３Ｍ）−ｐｈａＪ４ｂとした。次に、ＲＥＰ−ＰＵ及び（ＲＥＰＰ３Ｍ）−ｐｈａＪ４ｂをテンプレートとして配列番号７２及び配列番号７１で示されるプライマーを用いて上記（１３−１）と同様の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩで消化した。このＤＮＡ断片をＲＥＰＰ３Ｍ−ｐｈａＪ４ｂ（ＥｃｏＲＩ）とした。このＲＥＰＰ３Ｍ−ｐｈａＪ４ｂ（ＥｃｏＲＩ）を、国際公開公報ＷＯ／２００７／０４９７１６号公報に記載のプラスミドベクターｐＣＵＰ２をＭｕｎＩで切断したものと連結した。ＲＥＰＰ３Ｍ−ｐｈａＪ４ｂ（ＥｃｏＲＩ）とｐＣＵＰ２をＭｕｎＩで切断したものを連結したプラスミドベクターについて、上記（１３−１）と同様の方法で塩基配列を決定し、上記（１３−１）で作製したプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂに対して、ｐｈａＣ１のプロモーター部分の塩基配列が配列番号７３で示したように変異が導入されたものを取得し、ｐＣＵＰ２−ＲＥＰＰ３Ｍ１４−ｐｈａＪ４ｂとした。【0186】
（１３−３）プロモーター改変プラスミドベクターｐＣＵＰ２−ＲＥＰＮ１７−ｐｈａＪ４ｂの作製上記（１３−１）で作製したプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂに対して、ｐｈａＪ４ｂの発現調節を行うＣ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株のｐｈａＣ１のプロモーターに配列番号７６で示した変異を導入したｐＣＵＰ２−ＲＥＰＮ１７−ｐｈａＪ４ｂを次のように作製した。
【0187】
上記（１）で作製したプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂをテンプレートとして配列番号７１及び配列番号７７で示されるプライマーを用いて上記（１３−１）と同様の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片を（ＲＥＰＮ１７）−ｐｈａＪ４ｂとした。次に、上記（１３−２）で作製したＲＥＰ−ＰＵ及び（ＲＥＰＮ１７）−ｐｈａＪ４ｂをテンプレートとして配列番号７２及び配列番号７１で示されるプライマーを用いて上記（１３−１）と同様の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩで消化した。このＤＮＡ断片をＲＥＰＮ１７−ｐｈａＪ４ｂ（ＥｃｏＲＩ）とした。このＲＥＰＮ１７−ｐｈａＪ４ｂ（ＥｃｏＲＩ）を、国際公開公報ＷＯ／２００７／０４９７１６号公報に記載のプラスミドベクターｐＣＵＰ２をＭｕｎＩで切断したものと連結した。ＲＥＰＮ１７−ｐｈａＪ４ｂ（ＥｃｏＲＩ）とｐＣＵＰ２をＭｕｎＩで切断したものを連結したプラスミドベクターについて、上記（１３−１）と同様の方法で塩基配列を決定し、上記（１３−１）で作製したプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂに対して、ｐｈａＣ１のプロモーター部分の塩基配列が配列番号７６で示したように変異が導入されたものを取得し、ｐＣＵＰ２−ＲＥＰＮ１７−ｐｈａＪ４ｂとした。【0188】
（１３−４）ＳＤ配列改変プラスミドベクターｐＣＵＰ２−ＲＥＰＳＤＭ４−ｐｈａＪ４ｂの作製上記（１３−１）で作製したプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂに対して、ｐｈａＪ４ｂの発現調節を行うＣ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株のｐｈａＣ１のＳＤ配列を塩基配列ＴＧＴＧＴＧＡ（配列番号６３）に改変したｐＣＵＰ２−ＲＥＰＳＤＭ４−ｐｈａＪ４ｂを次のように作製した。
【0189】
上記（１３−１）で作製したプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂをテンプレートとして配列番号７１及び配列番号７８で示されるプライマーを用いて上記（１３−１）と同様の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片を（ＲＥＰ）ＳＤＭ４−ｐｈａＪ４ｂとした。次に、上記（１３−１）で作製したプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂをテンプレートとして配列番号７２及び配列番号７９で示されるプライマーを用いて上記（１３−１）と同様の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をＲＥＰ−ＳＤＵとした。次に、（ＲＥＰ）ＳＤＭ４−ｐｈａＪ４ｂ及びＲＥＰ−ＳＤＵをテンプレートとして配列番号７２及び配列番号７１で示されるプライマーを用いて上記（１３−１）と同様の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩで消化した。このＤＮＡ断片をＲＥＰＳＤＭ４−ｐｈａＪ４ｂ（ＥｃｏＲＩ）とした。このＲＥＰＳＤＭ４−ｐｈａＪ４ｂ（ＥｃｏＲＩ）を、国際公開公報ＷＯ／２００７／０４９７１６号公報に記載のプラスミドベクターｐＣＵＰ２をＭｕｎＩで切断したものと連結した。ＲＥＰＳＤＭ４−ｐｈａＪ４ｂ（ＥｃｏＲＩ）とｐＣＵＰ２をＭｕｎＩで切断したものを連結したプラスミドベクターについて、上記（１３−１）と同様の方法で塩基配列を決定し、上記（１３−１）で作製したプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂに対して、ｐｈａＣ１のＳＤ配列部分の塩基配列がＴＧＴＧＴＧＡ（配列番号６３）に改変されたものを取得し、ｐＣＵＰ２−ＲＥＰＳＤＭ４−ｐｈａＪ４ｂとした。【0190】
（１３−５）ＳＤ配列改変プラスミドベクターｐＣＵＰ２−ＲＥＰＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ｂの作製上記（１３−１）で作製したプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂに対して、ｐｈａＪ４ｂの発現調節を行うＣ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株のｐｈａＣ１のＳＤ配列を塩基配列ＴＣＴＣＴＣＴ（配列番号５２）に改変したｐＣＵＰ２−ＲＥＰＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ｂを次のように作製した。
【0191】
上記（１３−１）で作製したプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂをテンプレートとして配列番号７１及び配列番号８０で示されるプライマーを用いて上記（１３−１）と同様の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片を（ＲＥＰ）ＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ｂとした。【0192】
次に、（ＲＥＰ）ＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ｂ及び上記（１３−４）で作製したＲＥＰ−ＳＤＵをテンプレートとして配列番号７２及び配列番号７１で示されるプライマーを用いて上記（１３−１）と同様の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩで消化した。このＤＮＡ断片をＲＥＰＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ｂ（ＥｃｏＲＩ）とした。このＲＥＰＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ｂ（ＥｃｏＲＩ）を、国際公開公報ＷＯ／２００７／０４９７１６号公報に記載のプラスミドベクターｐＣＵＰ２をＭｕｎＩで切断したものと連結した。【0193】
ＲＥＰＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ｂ（ＥｃｏＲＩ）とｐＣＵＰ２をＭｕｎＩで切断したものを連結したプラスミドベクターについて、上記（１３−１）と同様の方法で塩基配列を決定し、上記（１３−１）で作製したプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ＲＥＰ−ｐｈａＪ４ｂに対して、ｐｈａＣ１のＳＤ配列部分の塩基配列がＴＣＴＣＴＣＴ（配列番号５２）に改変されたものを取得し、ｐＣＵＰ２−ＲＥＰＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ｂとした。 【0194】
（１３−６）プラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｔｒｃＳＤＭ１−ｐｈａＪ４ｂの作製（１）配列番号４７で示されるｔｒｃプロモーターと、Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株のｐｈａＣ１のＳＤ配列、ｐｈａＪ４ｂ遺伝子を含む塩基配列からなるＤＮＡを挿入したプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂを次のように作製した。
【0195】
Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして配列番号８１及び配列番号８２で示されるプライマーを用いて上記（１３−１）と同様の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をＭｕｎＩ及びＳｐｅＩで消化した。このＤＮＡ断片を（ＲｅＳＤ）−ｐｈａＪ４ｂ（ＭｕｎＩ，ＳｐｅＩ）とした。この（ＲｅＳＤ）−ｐｈａＪ４ｂ（ＭｕｎＩ，ＳｐｅＩ）を国際公開公報ＷＯ／２００７／０４９７１６号公報に記載のプラスミドベクターｐＣＵＰ２をＭｕｎＩ及びＳｐｅＩで切断したものと連結した。（ＲｅＳＤ）−ｐｈａＪ４ｂ（ＭｕｎＩ，ＳｐｅＩ）とｐＣＵＰ２をＭｕｎＩ及びＳｐｅＩで切断したものを連結したプラスミドベクターについて、上記（１３−１）と同様の方法で塩基配列を決定し、鋳型としたＤＮＡの塩基配列と同一であることを確認した。得られたプラスミドをｐＣＵＰ２−ＲｅＳＤ−ｐｈａＪ４ｂとした。次に、プラスミドｐＫＫ３８８−１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）をテンプレートとして配列番号８３及び配列番号８５で示されるプライマーを用いて上記（１３−１）と同様の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をＭｕｎＩで消化した。このＤＮＡ断片をｔｒｃ（ＭｕｎＩ）とした。次にｔｒｃ（ＭｕｎＩ）を上記のプラスミドｐＣＵＰ２−ＲｅＳＤ−ｐｈａＪ４ｂをＭｕｎＩで切断したものと連結した。ｔｒｃ（ＭｕｎＩ）とｐＣＵＰ２−ＲｅＳＤ−ｐｈａＪ４ｂをＭｕｎＩで切断したものを連結したプラスミドベクターについて、上記（１３−１）と同様の方法で塩基配列を決定し、鋳型としたＤＮＡの塩基配列と同一であることを確認するとともに、プラスミドベクターをテンプレートとして配列番号８１及び配列番号８３で示されるプライマーを用いて上記（１３−１）と同様の条件でＰＣＲを行った際に、ｔｒｃプロモーター及びｐｈａＪ４ｂ遺伝子を含む塩基配列からなる増幅断片が得られる向きにｔｒｃ（ＭｕｎＩ）断片が挿入されたプラスミドを取得した。得られたプラスミドｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂとした。【0196】
（２）上で作製したプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂに対して、ｐｈａＪ４ｂの発現調節を行うＣ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株のｐｈａＣ１のＳＤ配列を塩基配列ＴＧＴＧＡＧＡ（配列番号６０）に改変したｐＣＵＰ２−ｔｒｃＳＤＭ１−ｐｈａＪ４ｂを次のように作製した。【0197】
Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして配列番号８１及び配列番号８４で示されるプライマーを用いて上記（１３−１）と同様の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をＳｐｅＩで消化し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで５’末端をリン酸化した。このＤＮＡ断片をＳＤＭＡ−ｐｈａＪ４ｂ（ＳｐｅＩ）とした。【0198】
次にＳＤＭＡ−ｐｈａＪ４ｂ（ＳｐｅＩ）を、上記（１３−６）の（１）のプラスミドｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂをＰｍａＣＩ及びＳｐｅＩで切断したものと連結した。ＳＤＭＡ−ｐｈａＪ４ｂ（ＳｐｅＩ）とｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂをＰｍａＣＩ及びＳｐｅＩで切断したものを連結したプラスミドベクターについて、上記（１３−１）と同様の方法で塩基配列を決定し、上記（１３−６）の（１）で作製したプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂに対して、ｐｈａＣ１のＳＤ配列部分の塩基配列がＴＧＴＧＡＧＡ（配列番号６０）に改変されたものを取得し、ｐＣＵＰ２−ｔｒｃＳＤＭ１−ｐｈａＪ４ｂとした。【0199】
（１３−７）プラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｔｒｃＳＤＭ３−ｐｈａＪ４ｂの作製上記（１３−６）の（１）で作製したプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂに対して、ｐｈａＪ４ｂの発現調節を行うＣ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株のｐｈａＣ１のＳＤ配列を塩基配列ＡＧＴＧＡＧＡ（配列番号６２）に改変したｐＣＵＰ２−ｔｒｃＳＤＭ３−ｐｈａＪ４ｂを次のように作製した。
【0200】
上記（１３−６）の（２）に記載の方法で得た、ＳＤＭＡ−ｐｈａＪ４ｂ（ＳｐｅＩ）とｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂをＰｍａＣＩ及びＳｐｅＩで切断したものを連結したプラスミドベクターについて、上記（１３−１）と同様の方法で塩基配列を決定し、上記（１３−６）の（１）で作製したプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂに対して、ｐｈａＣ１のＳＤ配列部分の塩基配列がＡＧＴＧＡＧＡ（配列番号６２）に改変されたものを取得し、ｐＣＵＰ２−ｔｒｃＳＤＭ３−ｐｈａＪ４ｂとした。【0201】
（１３−８）プラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｔｒｃＳＤＭ４−ｐｈａＪ４ｂの作製上記（１３−６）の（１）で作製したプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂに対して、ｐｈａＪ４ｂの発現調節を行うＣ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株のｐｈａＣ１のＳＤ配列を塩基配列ＴＧＴＧＴＧＡ（配列番号６３）に改変したｐＣＵＰ２−ｔｒｃＳＤＭ４−ｐｈａＪ４ｂを次のように作製した。
【0202】
上記（１３−６）の（２）に記載の方法で得た、ＳＤＭＡ−ｐｈａＪ４ｂ（ＳｐｅＩ）とｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂをＰｍａＣＩ及びＳｐｅＩで切断したものを連結したプラスミドベクターについて、上記（１３−１）と同様の方法で塩基配列を決定し、上記（１３−６）の（１）で作製したプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂに対して、ｐｈａＣ１のＳＤ配列部分の塩基配列がＴＧＴＧＴＧＡ（配列番号６３）に改変されたものを取得し、ｐＣＵＰ２−ｔｒｃＳＤＭ４−ｐｈａＪ４ｂとした。【0203】
（１３−９）プラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｔｒｃＳＤＭ５−ｐｈａＪ４ｂの作製上記（１３−６）の（１）で作製したプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂに対して、ｐｈａＪ４ｂの発現調節を行うＣ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株のｐｈａＣ１のＳＤ配列を塩基配列ＴＧＡＧＴＧＡ（配列番号６４）に改変したｐＣＵＰ２−ｔｒｃＳＤＭ５−ｐｈａＪ４ｂを次のように作製した。
【0204】
上記（１３−６）の（２）に記載の方法で得た、ＳＤＭＡ−ｐｈａＪ４ｂ（ＳｐｅＩ）とｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂをＰｍａＣＩ及びＳｐｅＩで切断したものを連結したプラスミドベクターについて、上記（１３−１）と同様の方法で塩基配列を決定し、上記（１３−６）の（１）で作製したプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂに対して、ｐｈａＣのＳＤ配列部分の塩基配列がＴＧＡＧＴＧＡ（配列番号６４）に改変されたものを取得し、ｐＣＵＰ２−ｔｒｃＳＤＭ５−ｐｈａＪ４ｂとした。【0205】
（１３−１０）プラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｔｒｃＳＤＭ２−ｐｈａＪ４ｂの作製上記（１３−６）の（１）で作製したプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂに対して、ｐｈａＪ４ｂの発現調節を行うＣ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株のｐｈａＣ１のＳＤ配列を塩基配列ＡＴＡＴＡＧＡ（配列番号６１）に改変したｐＣＵＰ２−ｔｒｃＳＤＭ２−ｐｈａＪ４ｂを次のように作製した。
【0206】
Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして配列番号８６及び配列番号８１で示されるプライマーを用いて上記（１３−１）と同様の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をＳｐｅＩで消化し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで５'末端をリン酸化した。このＤＮＡ断片をＳＤＭＧ−ｐｈａＪ４ｂ（ＳｐｅＩ）とした。【0207】
次にＳＤＭＧ−ｐｈａＪ４ｂ（ＳｐｅＩ）を、上記（１３−６）の（１）のプラスミドｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂをＰｍａＣＩ及びＳｐｅＩで切断したものと連結した。【0208】
ＳＤＭＧ−ｐｈａＪ４ｂ（ＳｐｅＩ）とｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂをＰｍａＣＩ及びＳｐｅＩで切断したものを連結したプラスミドベクターについて、上記（１３−１）と同様の方法で塩基配列を決定し、上記（１３−６）の（１）で作製したプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂに対して、ｐｈａＣ１のＳＤ配列部分の塩基配列がＡＴＡＴＡＧＡ（配列番号６１）に改変されたものを取得し、ｐＣＵＰ２−ｔｒｃＳＤＭ２−ｐｈａＪ４ｂとした。【0209】
（１３−１１）プラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｔｒｃＳＤＭ６−ｐｈａＪ４ｂの作製上記（１３−６）の（１）で作製したプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂに対して、ｐｈａＪ４ｂの発現調節を行うＣ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株のｐｈａＣ１のＳＤ配列を塩基配列ＡＧＡＧＡＴＡ（配列番号６５）に改変したｐＣＵＰ２−ｔｒｃＳＤＭ６−ｐｈａＪ４ｂを次のように作製した。
【0210】
上記（１３−９）に記載の方法で得た、ＳＤＭＧ−ｐｈａＪ４ｂ（ＳｐｅＩ）とｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂをＰｍａＣＩ及びＳｐｅＩで切断したものを連結したプラスミドベクターについて、上記（１３−１）と同様の方法で塩基配列を決定し、上記（１３−６）の（１）で作製したプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂに対して、ｐｈａＣ１のＳＤ配列部分の塩基配列がＡＧＡＧＡＴＡ（配列番号６５）に改変されたものを取得し、ｐＣＵＰ２−ｔｒｃＳＤＭ６−ｐｈａＪ４ｂとした。【0211】
（１３−１２）プラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｔｒｃＳＤＭ７−ｐｈａＪ４ｂの作製上記（１３−６）の（１）で作製したプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂに対して、ｐｈａＪ４ｂの発現調節を行うＣ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株のｐｈａＣ１のＳＤ配列を塩基配列ＡＧＡＴＡＧＡ（配列番号６６）に改変したｐＣＵＰ２−ｔｒｃＳＤＭ７−ｐｈａＪ４ｂを次のように作製した。
【0212】
上記（１３−９）に記載の方法で得た、ＳＤＭＧ−ｐｈａＪ４ｂ（ＳｐｅＩ）とｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂをＰｍａＣＩ及びＳｐｅＩで切断したものを連結したプラスミドベクターについて、上記（１３−１）と同様の方法で塩基配列を決定し、上記（１３−６）の（１）で作製したプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂに対して、ｐｈａＣのＳＤ配列部分の塩基配列がＡＧＡＴＡＧＡ（配列番号６６）に改変されたものを取得し、ｐＣＵＰ２−ｔｒｃＳＤＭ７−ｐｈａＪ４ｂとした。【0213】
（１３−１３）ＰＨＡの生産量、及び３ＨＨ組成比率分析種母培地の組成は１ｗ／ｖ％Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．２ｗ／ｖ％Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％ＫＨ２ＰＯ４とした。
【0214】
種母培地を用いてプラスミドベクター導入株を培養する場合には、カナマイシンを最終濃度１００μｇ／ｍｌとなるように添加した。【0215】
ＰＨＡ生産培地の組成は１．１ｗ／ｖ％Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％ＫＨ２ＰＯ４、０．１３ｗ／ｖ％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｖ／ｖ％微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの。）とした。炭素源はパーム核油を分別した低融点画分であるパーム核油オレインを単一炭素源として用いた。【0216】
上で作製した各プラスミドベクターによって上記ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株を形質転換して得られたプラスミドベクター導入株、すなわち、ｐＣＵＰ２−ＲＥＰＮ１７−ｐｈａＪ４ｂ ｉｎ ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株、ｐＣＵＰ２−ＲＥＰＳＤＭ４−ｐｈａＪ４ｂ ｉｎ ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株、ｐＣＵＰ２−ＲＥＰＳＤＭ１１−ｐｈａＪ４ｂ ｉｎ ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株、ｐＣＵＰ２−ｔｒｃＳＤＭ１−ｐｈａＪ４ｂ ｉｎ ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株、ｐＣＵＰ２−ｔｒｃＳＤＭ３−ｐｈａＪ４ｂ ｉｎ ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株、ｐＣＵＰ２−ｔｒｃＳＤＭ４−ｐｈａＪ４ｂ ｉｎ ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株、ｐＣＵＰ２−ｔｒｃＳＤＭ５−ｐｈａＪ４ｂ ｉｎ ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株、ｐＣＵＰ２−ｔｒｃＳＤＭ２−ｐｈａＪ４ｂ ｉｎ ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株、ｐＣＵＰ２−ｔｒｃＳＤＭ６−ｐｈａＪ４ｂ ｉｎ ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株、ｐＣＵＰ２−ｔｒｃＳＤＭ７−ｐｈａＪ４ｂ ｉｎ ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株の１０株について、グリセロールストック（５０μＬ）をそれぞれ種母培地（１０ｍＬ）に接種して培養温度３０℃で２４時間振とう培養し、培養液を種母とした。【0217】
ＰＨＡ生産培養は５０ｍＬの生産培地を入れた坂口フラスコに前培養種母を１．０ｖ／ｖ％接種した。培養温度３０℃で７２時間振とう培養を行い、培養終了後、遠心分離によって菌体を回収、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。【0218】
得られた乾燥菌体１ｇに１００ｍＬのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のＰＨＡを抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が３０ｍＬになるまで濃縮後、９０ｍＬのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置した。析出したＰＨＡをろ別後、５０℃で３時間真空乾燥した。乾燥ＰＨＡの重量を測定し、ＰＨＡ生産量を算出した。結果を表２に示した。【0219】
生産されたポリエステルの３ＨＨ組成比率は以下のようにガスクロマトグラフィーによって測定した。乾燥ポリエステルの約２０ｍｇに２ｍｌの硫酸−メタノール混液（１５：８５）と２ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱することでポリエステル分解物のメチルエステルを得た。冷却後、これに１．５ｇの炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えて中和し、炭酸ガスの発生がとまるまで放置した。４ｍｌのジイソプロピルエーテルを添加してよく混合した後、遠心して、上清中のポリエステル分解物のモノマーユニット組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析した。【0220】
ガスクロマトグラフは島津製作所ＧＣ−１７Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡ ＢＯＮＤ−１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。キャリアガスとしてＨｅを用い、カラム入口圧１００ｋＰａとし、サンプルは１μｌを注入した。温度条件は、初発温度１００〜２００℃まで８℃／分の速度で昇温、さらに２００〜２９０℃まで３０℃／分の速度で昇温した。【0221】
上記条件にて分析した結果、得られたポリエステルは共重合体ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）であり、３ＨＨ組成比率は表２に示す通りであった。【0222】
【表2】
【産業上の利用可能性】
【0223】
本発明の微生物は、モノマー組成比の制御されたポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）共重合体を生産することを可能にするため、硬質ポリマーから軟質ポリマーまで幅広い物性をもつ生分解性ポリマーを生産することができる。【0224】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。【配列表フリーテキスト】
【0225】
配列番号１〜３６、７０〜７２、７４〜７５、７７〜８６：プライマー配列番号３８〜４０、４３〜４５：発現調節ＤＮＡ
配列番号６０〜６６：ＳＤ配列
配列番号７６、５５〜５９：プロモーター
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]