特許 6665111 ＰＫＫ発現を調節するための組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6665111

(24)【登録日】2020年2月21日

(45)【発行日】2020年3月13日

(54)【発明の名称】ＰＫＫ発現を調節するための組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20200302BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20200302BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20200302BHJP

   A61P 7/02 20060101ALI20200302BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20200302BHJP

   A61P 7/10 20060101ALI20200302BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20200302BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20200302BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20200302BHJP

   A61K 31/7125 20060101ALI20200302BHJP

   A61K 31/7115 20060101ALI20200302BHJP

   A61K 31/712 20060101ALI20200302BHJP

   A61K 47/50 20170101ALI20200302BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/09 ZZNA

   C12N15/113 130Z

   A61P29/00

   A61P7/02

   A61P43/00 111

   A61P7/10

   A61P9/10

   A61K48/00

   A61P43/00 123

   A61P11/00

   A61K31/7125

   A61K31/7115

   A61K31/712

   A61K47/50

【請求項の数】24

【全頁数】600

(21)【出願番号】特願2016-565502(P2016-565502)

(86)(22)【出願日】2015年5月1日

(65)【公表番号】特表2017-518045(P2017-518045A)

(43)【公表日】2017年7月6日

(86)【国際出願番号】US2015028765

(87)【国際公開番号】WO2015168532

(87)【国際公開日】20151105

【審査請求日】2018年4月27日

(31)【優先権主張番号】61/987,478

(32)【優先日】2014年5月1日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/058,629

(32)【優先日】2014年10月1日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/088,459

(32)【優先日】2014年12月5日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】595104323

【氏名又は名称】アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｉｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100075270

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 泰

(74)【代理人】

【識別番号】100101373

【弁理士】

【氏名又は名称】竹内 茂雄

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100128750

【弁理士】

【氏名又は名称】廣瀬 しのぶ

(72)【発明者】

【氏名】プラカシュ，タジャ・ピー

(72)【発明者】

【氏名】セス，プニット・ピー

(72)【発明者】

【氏名】スウェイジ，エリック・イー

(72)【発明者】

【氏名】フレアー，スーザン・エム

(72)【発明者】

【氏名】ブイ，フィン・ホア

【審査官】 飯室 里美

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１３／００３８０８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１３／１８８８７６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Nucleic Acid Therapeutics, 2013, Vol.23, p.175-187

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドは２０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号５７０の核酸塩基配列を有し、前記共役基は修飾オリゴヌクレオチドの５’末端で修飾オリゴヌクレオチドに共有結合で連結されている、化合物。

【請求項2】

化合物が修飾オリゴヌクレオチド及び共役基からなり、修飾オリゴヌクレオチドが一本鎖である、請求項１に記載の化合物。

【請求項3】

前記修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシド間結合は修飾ヌクレオシド間結合であり、ここで、該少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合であってもよい、請求項１または請求項２に記載の化合物。

【請求項4】

前記修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホジエステルヌクレオシド間結合を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項5】

前記修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つのホスホジエステルヌクレオシド間結合を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項6】

前記修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも３つのホスホジエステルヌクレオシド間結合を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項7】

前記修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも４つのホスホジエステルヌクレオシド間結合を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項8】

前記修飾オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合及びホスホロチオエートヌクレオシド間結合から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項9】

少なくとも１つのヌクレオシドは修飾核酸塩基を含み、ここで、該修飾核酸塩基は５−メチルシトシンであってもよい、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項10】

前記修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾糖を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項11】

前記修飾オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾糖、２’−Ｏ−メチル修飾糖、拘束エチル、ＬＮＡ、または３’−フルオロＨＮＡを含む、請求項１０に記載の化合物。

【請求項12】

請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物であって、
前記修飾オリゴヌクレオチドは
１０個の連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント、
５個の連結されたヌクレオシドからなる５’ウイングセグメント、
５個の連結されたヌクレオシドからなる３’ウイングセグメント、
を含み、前記ギャップセグメントは５’ウイングセグメントと３’ウイングセグメントの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは修飾糖を含む、前記化合物。

【請求項13】

請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物であって、前記共役基は細胞標的化部分を含み、ここで、該細胞標的化部分は以下の構造を有していてもよい、前記化合物：

【化1】

[この文献は図面を表示できません]

【請求項14】

前記共役基は以下を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の化合物：

【化2】

[この文献は図面を表示できません]

【請求項15】

修飾オリゴヌクレオチド及び共役基からなる化合物の塩であって、該化合物のアニオンが以下の構造：

【化3】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号５７０）を有する、前記化合物の塩。

【請求項16】

以下の構造の、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基からなる化合物：

【化4】

[この文献は図面を表示できません]

（配列番号５７０）、またはその塩。

【請求項17】

請求項１〜１４及び１６のいずれか１項に記載の化合物、または請求項１５に記載の塩、及び医薬的に許容される担体または希釈剤の少なくとも１つを含む医薬組成物。

【請求項18】

医薬的に許容される希釈剤はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である、請求項１７の医薬組成物。

【請求項19】

医薬組成物が前記化合物または塩およびＰＢＳから本質的になる、請求項１８の医薬組成物。

【請求項20】

請求項１〜１４及び１６のいずれか１項に記載の化合物、または請求項１５に記載の塩を含有する、ＰＫＫ関連疾患、障害及び病態を予防、治療及び改善するための医薬組成物。

【請求項21】

修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドは、５’ウイングセグメント、中央のギャップセグメント、及び３’ウイングセグメントからなるギャップマーであり、ここで：
５’ウイングセグメントは５個の２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドからなり、
中央のギャップセグメントは１０個のβ−Ｄ−デオキシリボヌクレオシドからなり、
３’ウイングセグメントは５個の２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドからなり、
前記共役基は、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端で該修飾オリゴヌクレオチドに連結されており、
修飾オリゴヌクレオチドは５’−ＴＧＣＡＡＧＴＣＴＣＴＴＧＧＣＡＡＡＣＡ−３’（配列番号５７０）の核酸塩基配列を有し、各シトシンは５’−メチルシトシンであり、修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合は５’から３’方向にｓｓｏｏｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｏｏｓｓであり、ここで、各「ｓ」はホスホロチオエート連結部であり、各「ｏ」はホスホジエステル連結部である、前記化合物。

【請求項22】

請求項２１の化合物、及び医薬的に許容される希釈剤または担体を含む、医薬組成物。

【請求項23】

医薬的に許容される希釈剤または担体はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である、請求項２２の医薬組成物。

【請求項24】

医薬組成物が前記化合物およびＰＢＳから本質的になる、請求項２２の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

配列表
本願は、電子形式の配列表とともに出願されている。この配列表は、２０１５年４月２７日に作成されたサイズ約６３６ｋｂのＢＩＯＬ０２５２ＷＯＳＥＱ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称のファイルとして提供される。この配列表の電子形式の情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

分野
本明細書は、動物においてヒト血漿プレカリクレイン（ＰＫＫ）ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を減少させるための化合物、組成物、及び方法を提供する。当該組成物及び方法は、炎症性及び血栓塞栓症病態を治療、予防、または改善するのに有用である。

【背景技術】

【0003】

血漿プレカリクレイン（ＰＫＫ）は、血漿カリクレイン（ＰＫ）の前駆体であり、ＫＬＫＢ１遺伝子によってコードされる。ＰＫＫは、血液凝固、フィブリン溶解、キニン生成、及び炎症の表面依存性活性化に関与する糖タンパク質である。ＰＫＫは、内部のＡｒｇ−Ｉｌｅのペプチド結合の切断によって、第ＸＩＩａ因子によってＰＫに変換される。ＰＫはキニノーゲンからキニンを遊離し、また、プラスミノーゲンからプラスミンを生成する。ＰＫは、炎症、血圧のコントロール、凝固、及び疼痛において役割を果たすいくつかのタンパク質からなる、キニン−カリクレイン経路のメンバーである。

【発明の概要】

【0004】

本明細書はＰＫＫ ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を調節するための化合物、組成物、及び方法を提供する。ある特定の実施形態では、ＰＫＫ ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を調節するのに有用な化合物は、アンチセンス化合物である。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。

【0005】

ある特定の実施形態では、細胞または組織で調節を行うことができる。ある特定の実施形態では、細胞または組織は動物内に存在する。ある特定の実施形態では、動物はヒトである。ある特定の実施形態では、ＰＫＫ ｍＲＮＡレベルが減少する。ある特定の実施形態では、ＰＫＫタンパク質レベルが減少する。そのような減少は、時間依存的または用量依存的に生じ得る。

【0006】

また、ＰＫＫ関連疾患、障害及び病態を予防、治療及び改善するための化合物、組成物、及び方法が提供される。ある特定の実施形態では、そのようなＰＫＫ関連疾患、障害、及び病態は、炎症性疾患である。ある特定の実施形態では、この炎症性疾患は、急性または慢性の炎症性疾患であってもよい。ある特定の実施形態では、当該炎症性疾患は、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）、浮腫、血管浮腫、腫脹、目蓋の血管浮腫、眼の浮腫、黄斑浮腫、脳浮腫を含んでもよい。ある特定の実施形態では、当該ＰＫＫ関連疾患、障害、及び病態は、血栓塞栓性疾患である。ある特定の実施形態では、当該血栓塞栓性疾患は、血栓症、塞栓症、血栓塞栓症、深部静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、脳卒中、及び心筋梗塞を含んでもよい。

【0007】

当該疾患、障害、及び病態は、共通の２つ以上のリスク因子、原因、または結果を有する可能性がある。

【0008】

炎症性疾患の発症のある特定のリスク因子及び原因は、炎症性疾患に対する遺伝的素因及び環境因子を含む。ある特定の実施形態では、対象は、変異補体１エステラーゼ阻害剤（Ｃ１−ＩＮＨ）遺伝子または変異因子１２遺伝子を有する。ある特定の実施形態では、当該対象は、アンジオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥ阻害剤）、またはアンギオテンシンＩＩ受容体遮断薬（ＡＲＢ）を摂取したことがあるか、摂取している。ある特定の実施形態では、対象は、血管性浮腫を引き起こすアレルギー反応があった。ある特定の実施形態では、対象は、Ｉ型ＨＡＥを有している。ある特定の実施形態では、対象は、ＩＩ型ＨＡＥを有している。ある特定の実施形態では、対象は、ＩＩＩ型ＨＡＥを有している。

【0009】

炎症性疾患の発症に関連するある特定の転帰として、四肢（すなわち、手、足、腕、脚）、腸（腹部）、顔、性器、喉頭（すなわち、発声器）を含む様々な身体部分の浮腫／腫脹、血管透過性、血管漏出、一般的な炎症、腹痛、膨満感、嘔吐、下痢、皮膚のかゆみ、呼吸器（喘息）反応、鼻炎、アナフィラキシー、気管支収縮、低血圧、昏睡、及び死が挙げられる。

【0010】

血栓塞栓性疾患の発症のある特定のリスク因子及び原因として、血栓塞栓性疾患に対する遺伝的素因、不動、手術（特に整形外科）、悪性腫瘍、妊娠、高齢、経口避妊薬の使用、心房細動、以前の血栓塞栓性病態、慢性炎症性疾患、及び遺伝性または獲得性プロトロンビン凝固障害が挙げられる。血栓塞栓症の病態の発症に関連するある特定の転帰として、病変血管の血流の減少、組織の死、及び死亡が挙げられる。

【0011】

ある特定の実施形態では、治療方法は、治療を必要とする個体にＰＫＫアンチセンス化合物を投与することを含む。ある特定の実施形態では、治療方法は、治療を必要とする個体にＰＫＫアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】実施例１２４に記載する、血液試料からの、ＨＭＷＫのウエスタンブロット定量を示す。

【図2】実施例１２７に記載する、血液試料からの、ＨＭＷＫのウエスタンブロット定量を示す。

【発明を実施するための形態】

【0013】

詳細な説明
当該一般的な説明及び以下の詳細な説明はどちらも例示的かつ説明的であるにすぎず、本願に係る発明を限定するものではないと理解すべきである。本明細書において、単数形の使用は、別段の明示がある場合を除き、複数形を含む。本明細書において「または（ｏｒ）」の使用は、別段の言明がある場合を除き、「及び／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。さらに、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、ならびに「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態の使用は、限定的ではない。また、「要素」または「成分」などの用語は、別段の明示がある場合を除き、１つのユニットを含む要素及び成分と２つ以上のサブユニットを含む要素及び成分をどちらも包含する。

【0014】

特別な定義が与えられない限り、本明細書に記載する分析化学、合成有機化学、ならびに医化学及び製薬化学に関連して用いられる術語、ならびにそれらの手順及び技法は、周知であり、当技術分野で一般に使用されるものである。化学合成及び化学分析には、標準的技法を使用することができる。そのような技法及び手順のうちある特定のものは、例えば「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」Ｓａｎｇｖｉ及びＣｏｏｋ編，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，ワシントンＤ．Ｃ．，１９９４、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，ペンシルベニア州イーストン，第２１版，２００５、及び「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ｓｔａｎｌｅｙ Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ編，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，フロリダ州ボカラトン、ならびにＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９に見いだすことができ、これらは、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。許容される場合、本開示の全体を通して言及する特許、出願、公開された出願、及び他の出版物、ならびに他のデータはすべて、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0015】

本明細書で使用する節の見出しは、構成上の目的のためだけにあり、記述の主題を限定するものとして解釈されるべきではない。本願に挙げるすべての文書、または文書の部分は、これらに限定されないが、特許、特許出願、記事、書籍、及び論文を含み、本明細書で検討する文書の部分を参照することにより、その全体が本明細書に明示的に組み込まれる。

【0016】

定義
特定の定義が与えられない限り、本明細書に記載する分析化学、合成有機化学、ならびに医化学及び製薬化学に関連して用いられる術語、ならびにそれらの手順及び技法は、周知であり、当技術分野で一般に使用されるものである。化学合成及び化学分析には、標準的技法を使用することができる。許可されている場合、本明細書出の開示全般を参照するすべての特許、出願、公開された出願及び他の刊行物、ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号及び国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）及び他のデータ等のデータベースにより得られる関連の配列情報は、本明細書で検討する文書の部分を参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれる。

【0017】

別段の表示がある場合を除き、以下の用語は、以下の意味を有する。

【0018】

「２’−Ｏ−メトキシエチル」（または２’−ＭＯＥ、２’−ＯＣＨ_２ＣＨ_２−ＯＣＨ_３及びＭＯＥ）は、フラノース環の２’位のＯ−メトキシエチル修飾を指す。２’−Ｏ−メトキシエチル修飾糖は修飾糖である。

【0019】

「２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ヌクレオシド」（または「２’−ＭＯＥヌクレオシド」）は、２’−ＭＯＥヌクレオシド糖部分を含むヌクレオシドを意味する。

【0020】

「２’−置換ヌクレオシド」は、ＨまたはＯＨ以外のフラノース環の２’位に置換基を含むヌクレオシドを意味する。ある特定の実施形態において、２’置換ヌクレオシドは、二環式糖修飾を有するヌクレオシドを含む。

【0021】

「２’−デオキシヌクレオシド」は、ヌクレオシドの糖部分の２’位に水素を含むヌクレオシドを意味する。

【0022】

「３’標的部位」とは、特定のアンチセンス化合物の最も３’側のヌクレオチドに相補的な標的核酸のヌクレオチドを指す。

【0023】

「５’標的部位」とは、特定のアンチセンス化合物の最も５’側のヌクレオチドに相補的な標的核酸のヌクレオチドを指す。

【0024】

「５−メチルシトシン」とは、５位に取り付けられたメチル基で修飾されたシトシンを意味する。５−メチルシトシンは修飾核酸塩基である。

【0025】

「約」とは、ある値の±７％以内を意味する。例えば、「ＰＫＫの少なくとも約７０％阻害を達成する化合物」と言明した場合、それは、ＰＫＫレベルが６３％〜７７％の範囲内で阻害されることを含意する。

【0026】

「同時に投与される」は、両方の薬理学的効果が同時に患者に現れる任意の方法で、２つの治療薬の同時投与を指す。同時投与は、両剤が、単一の医薬組成物、同じ投与形態で、または同じ投与経路で、投与されることを必要としない。両方の治療薬の効果が同時に現れる必要はない。効果は一定時間、重複する必要があるだけで、同一の広がりを持つ必要はない。

【0027】

「投与」は、動物に医薬品を提供することを意味し、医療専門家及び自己投与することによって投与することを含むが、これに限定されない。

【0028】

本明細書にいう「アルキル」とは、最大２４個の炭素原子を含有する飽和直鎖または分岐鎖炭化水素ラジカルを意味する。アルキル基の例として、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、ｎ−ヘキシル、オクチル、デシル、ドデシルなどが挙げられるが、これらに限定されない。アルキル基は、典型的には、１〜約２４個の炭素原子、より典型的には、１〜約１２個の炭素原子（Ｃ_１−Ｃ_１２アルキル）を含み、１〜約６個の炭素原子がより好ましい。

【0029】

本明細書にいう「アルケニル」とは、最大２４個の炭素原子を含有し、かつ少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する直鎖または分岐鎖炭化水素鎖ラジカルを意味する。アルケニル基の例として、エテニル、プロペニル、ブテニル、１−メチル−２−ブテン−１−イル、１，３−ブタジエンなどのジエンなどが挙げられるが、これらに限定されない。アルケニル基は、典型的には、２〜約２４個の炭素原子、より典型的には、２〜約１２個の炭素原子を含み、２〜約６個の炭素原子がより好ましい。本明細書にいうアルケニル基は、場合によっては、２つ以上のさらなる置換基を含みうる。

【0030】

本明細書にいう「アルキニル」とは、最大２４個の炭素原子を含有し、かつ少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する直鎖または分岐鎖炭化水素ラジカルを意味する。アルキニル基の例として、エチニル、１−プロピニル、１−ブチニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。アルキニル基は、典型的には、２〜約２４個の炭素原子、より典型的には、２〜約１２個の炭素原子を含み、２〜約６個の炭素原子がより好ましい。本明細書にいうアルキニル基は、場合によっては、２つ以上のさらなる置換基を含みうる。

【0031】

本明細書にいう「アシル」とは、有機酸からヒドロキシル基を除去することによって形成されるラジカルを意味し、一般式−Ｃ（Ｏ）−Ｘを有し、式中、Ｘは、典型的には、脂肪族、脂環式、または芳香族である。例として、脂肪族カルボニル、芳香族カルボニル、脂肪族スルホニル、芳香族スルフィニル、脂肪族スルフィニル、芳香族ホスフェート、脂肪族ホスフェートなどが挙げられる。本明細書にいうアシル基は、さらなる置換基を場合によっては含みうる。

【0032】

本明細書にいう「脂環式」とは、環式環系を意味し、当該環は、脂肪族である。当該環系は、２つ以上の環を含むことができ、少なくとも１つの環は脂肪族である。好ましい脂環式基は、環内に約５〜約９個の炭素原子を有する環を含む。本明細書にいう脂環式基は、場合によっては、さらなる置換基を含みうる。

【0033】

本明細書にいう「脂肪族」とは、最大２４個の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖炭化水素ラジカルを意味し、任意の２つの炭素原子の間の飽和度は、一重、二重、または三重結合である。脂肪族基は、好ましくは、１〜約２４個の炭素原子、より典型的には、１〜約１２個の炭素原子を含有し、１〜約６個の炭素原子がより好ましい。脂肪族基の直鎖または分岐鎖は、窒素、酸素、硫黄、及びリンを含む２つ以上のヘテロ原子で中断されていてもよい。ヘテロ原子によって中断されているそのような脂肪族基には、ポリアルコキシ、例えば、ポリアルキレングリコール、ポリアミン、及びポリイミンが含まれるが、これらに限定されない。本明細書にいう脂肪族基は、場合によっては、さらなる置換基を含みうる。

【0034】

本明細書にいう「アルコキシ」とは、アルキル基と酸素原子とで形成されるラジカルを意味し、アルコキシ基は当該酸素原子を使って親分子に取り付けられる。アルコキシ基の例として、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、ネオペントキシ、ｎ−ヘキソキシなどが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書にいうアルコキシ基は、場合によっては、さらなる置換基を含みうる。

【0035】

本明細書にいう「アミノアルキル」とは、アミノ置換されたＣ_１−Ｃ_１２ アルキルラジカルを意味する。当該ラジカルのアルキル部分は、親分子と共有結合を形成する。アミノ基は、任意の位置に位置することができ、アミノアルキル基は、アルキル部分及び／またはアミノ部分を、さらなる置換基で置換することができる。

【0036】

本明細書にいう「アラルキル」及び「アリールアルキル」とは、Ｃ_１−Ｃ_１２ アルキルラジカルに共有結合で連結されている芳香族基を意味する。結果として生じるアラルキル（またはアリールアルキル）基のアルキルラジカル部分は、親分子と共有結合を形成する。例として、ベンジル、フェネチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書にいうアラルキル基は、場合によっては、当該ラジカル基を形成するアルキル基、アリール基、またはそれら両方の基に取り付けられたさらなる置換基を含みうる。

【0037】

本明細書にいう「アリール」及び「芳香族」とは、２つ以上の芳香族環を有する単環式または多環式炭素環式環系ラジカルを意味する。アリール基の例として、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、イデニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいアリール環系は、２つ以上の環内に約５〜約２０個の炭素原子を有する。本明細書にいうアリール基は、場合によっては、さらなる置換基を含みうる。

【0038】

「改善」とは、病態または疾患の重症度の少なくとも１つの指標の軽減、遅延、停止、または逆転を指す。指標の重症度は、当業者に知られている主観的尺度または客観的尺度によって決定することができる。

【0039】

「動物」とは、ヒトまたはヒト以外の動物を指し、これには、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、及び非ヒト霊長類（サル及びチンパンジーを含むが、これらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない。

【0040】

「アンチセンス活性」とは、アンチセンス化合物によるその標的核酸へのハイブリダイゼーションに起因する任意の検出可能な活性または測定可能な活性を意味する。ある特定の実施形態では、アンチセンス活性が、標的核酸またはそのような標的核酸がコードするタンパク質の量または発現の減少である。「アンチセンス化合物」とは、水素結合によって標的核酸へのハイブリダイゼーションを起こすことができるオリゴマー化合物を意味する。アンチセンス化合物の例として、一本鎖化合物及び二本鎖化合物、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、及び占有に基づく（ｏｃｕｐａｎｃｙ−ｂａｓｅｄ）化合物が挙げられる。

【0041】

「アンチセンス化合物」は、水素結合によって標的核酸へのハイブリダイゼーションを受けることができるオリゴマー化合物を意味する。アンチセンス化合物の例として、一本鎖化合物及び二本鎖化合物、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、及び占有に基づく（ｏｃｕｐａｎｃｙ−ｂａｓｅｄ）化合物が挙げられる。

【0042】

「アンチセンス阻害」とは、アンチセンス化合物が存在しない場合の標的核酸レベルとの比較で、または標的核酸に相補的なアンチセンス化合物の存在下での標的核酸レベルの低減を意味する。「アンチセンス機序」は化合物と標的核酸とのハイブリダイゼーションを伴うすべての機序をいう。当該ハイブリダイゼーションの結果または効果は、標的の分解または標的の占有であり、これに付随して、例えば転写またはスプライシングに関わる細胞機構の停止が起こる。

【0043】

「アンチセンス機序」は、化合物と標的核酸とのハイブリダイゼーションに関与するすべての機序をいう。当該ハイブリダイゼーションの結果または効果は、標的の分解または標的の占有であり、例えば転写またはスプライシングに関わる細胞機構の停止が付随する。

【0044】

「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、標的核酸の対応するセグメントへのハイブリダイゼーションを可能にする核酸塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。「塩基相補性」とは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基と標的核酸中の対応する核酸塩基との正確な塩基対合（すなわちハイブリダイゼーション）を起こす能力を指し、これは、対応する核酸塩基間のワトソン−クリック型、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型水素結合によって媒介される。

【0045】

「塩基相補性」とは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基が標的核酸中の対応する核酸塩基と正確な塩基対合（すなわちハイブリダイゼーション）を起こす能力を指し、これは、対応する核酸塩基間のワトソン−クリック型、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型水素結合によって媒介される。

【0046】

「二環式糖」は、２つの原子の架橋によって修飾されるフラノース環を意味する。二環式糖は修飾された糖である。

【0047】

「二環式ヌクレオシド」（または、ＢＮＡ）は、糖環の２つの炭素原子をつなぐ橋を含む糖部分を有するヌクレオシドを意味し、それによって二環式糖系を形成する。ある特定の実施形態では、当該架橋は、糖環の４’−炭素及び２’−炭素を接続する。

【0048】

「キャップ構造」または「末端キャップ部分」とは、アンチセンス化合物のどちらかの末端に組み込まれた化学修飾を意味する。

【0049】

「炭水化物」とは、天然に存在する炭水化物、修飾炭水化物、または炭水化物誘導体を意味する。

【0050】

「炭水化物クラスター」とは、足場基またはリンカー基に取り付けられた２つ以上の炭水化物残基を有する化合物を意味する（例えば、炭水化物共役クラスターの例として、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｍａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｔｏ ａ Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ」Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，（１４）：１８−２９、またはＲｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．「Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ−Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ Ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｈｅｐａｔｉｃ Ａｓｉａｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ」Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００４，（４７）：５７９８−５８０８を参照のこと）。

【0051】

「炭水化物誘導体」とは、出発物質または中間体として炭水化物を用いて合成されうる任意の化合物を意味する。

【0052】

「ｃＥｔ」または「拘束エチル」とは、４’−炭素と２’−炭素とをつなぐ橋を含む糖部分を有する二環式ヌクレオシドを意味し、この橋は４’−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｏ−２’という式を有する。

【0053】

「ｃＥｔ修飾ヌクレオシド」（または「拘束エチルヌクレオシド」）は、４’−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｏ−２’橋を含む二環式糖部分を含むヌクレオシドを意味する。

【0054】

「化学的に異なる領域」は、同じアンチセンス化合物の別な領域よりも化学的に異なるいくつかの方法にあるアンチセンス化合物の領域を指す。例えば、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドを有する領域は、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾のないヌクレオシドを有する領域と化学的に異なる。

【0055】

「化学修飾」とは、天然に存在する対応物と比較した場合の化合物の化学的相違を意味する。オリゴヌクレオチドの化学修飾は、ヌクレオシド修飾（糖部分修飾及び核酸塩基修飾を含む）ならびにヌクレオシド間連結部修飾を含む。オリゴヌクレオチドの場合、核酸塩基配列だけの相違は、化学修飾には含まれない。

【0056】

「キメラアンチセンス化合物」は、少なくとも２つの化学的に異なる領域を有するアンチセンス化合物を意味し、各位置は複数のサブユニットを有する。

【0057】

「切断可能な結合」とは、開裂されうる任意の化学結合を意味する。ある特定の実施形態では、切断可能な結合は、アミド、ポリアミド、エステル、エーテル、ホスホジエステルの一方もしくは両方のエステル、リン酸エステル、カルバメート、ジスルフィド、またはペプチドのなかから選択される。

【0058】

「切断可能部分」とは、生理学的条件下で開裂されうる結合または基を意味する。ある特定の実施形態では、切断可能部分が、細胞の内部またはリソソームなどの細胞内コンパートメントの内部で切断される。ある特定の実施形態では、切断可能部分が、ヌクレアーゼなどの内在性酵素によって切断される。ある特定の実施形態では、切断可能部分が、１個、２個、３個、４個、または５個以上の切断可能な結合を有する原子団を含む。

【0059】

「同時投与」は、個体に２つ以上の治療薬を投与することを意味する。２つ以上の治療薬は、単一の医薬組成物であっても、別々の医薬組成物であってもよい。２つ以上の治療薬の各々は、同一または異なる投与経路を介して投与してもよい。同時投与は、並行または逐次投与を含む。

【0060】

「相補性」は、第一の核酸及び第二の核酸の核酸塩基間で対形成する能力を意味する。

【0061】

「含む」は、定められたステップもしくは要素、またはステップもしくは要素のグループを含むが、いかなる他のステップもしくは要素、またはステップもしくは要素のグループを排除しないことが理解される。

【0062】

「共役体」または「共役基」とは、オリゴヌクレオチドまたはオリゴマー化合物に結合される原子または原子団を意味する。概して、共役基は、それらが取り付けられた化合物の２つ以上の特性、例えば限定するわけではないが、薬力学的特性、薬物動態学的特性、結合特性、吸収特性、細胞分布特性、細胞取り込み特性、電荷特性、及び／またはクリアランス特性などを修飾する。
共役基に関連して「共役リンカー」または「リンカー」とは、任意の原子または原子団を含む共役基の一部分であって、（１）オリゴヌクレオチドを共役基の別の部分と共有結合で連結するか、または（２）共役基の２つ以上の部分を共有結合で連結するものを意味する。

【0063】

共役基は、本明細書においてはラジカルとして示され、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのオリゴマー化合物への共有結合を形成するための結合を提供する。ある特定の実施形態では、オリゴマー化合物における結合点が、オリゴマー化合物の３’末端ヌクレオシドの３’−ヒドロキシル基の３’−酸素原子である。ある特定の実施形態では、オリゴマー化合物における結合点が、オリゴマー化合物の５’末端ヌクレオシドの５’−ヒドロキシル基の５’−酸素原子である。ある特定の実施形態では、オリゴマー化合物への結合を形成するための結合は、切断可能な結合である。特定のそのような実施形態において、そのような切断可能な結合は、切断可能部分のすべてまたは一部を構成する。

【0064】

ある特定の実施形態では、共役基が、切断可能部分（例えば、切断可能な結合または切断可能なヌクレオシド）と、ＧａｌＮＡｃクラスター部分などの炭水化物クラスター部分とを含む。そのような炭水化物クラスター部分は、標的部分と、場合によっては、共役リンカーとを含む。あるある特定の実施形態では、炭水化物クラスター部分が、リガンドの数及びその実体によって特定される。例えば、あるある特定の実施形態では、炭水化物クラスター部分が３個のＧａｌＮＡｃ基を含み、「ＧａｌＮＡｃ_３」と表記される。あるある特定の実施形態では、炭水化物クラスター部分が４個のＧａｌＮＡｃ基を含み、「ＧａｌＮＡｃ_４」と表記される。具体的な炭水化物クラスター部分（具体的なテザー基、分岐基、及び共役リンカー基を有するもの）を、本明細書では、ローマ数字と、それに続く下付き文字「ａ」で説明し、表記する。したがって、「ＧａｌＮａｃ３−１_ａ」とは、３個のＧａｌＮａｃ基、ならびに具体的に特定されたテザー基、分岐基、及び連結基を有する共役基の具体的炭水化物クラスター部分を指す。そのような炭水化物クラスター断片は、切断可能な結合または切断可能なヌクレオシドなどの切断可能部分を介してオリゴマー化合物に取り付けられる。

【0065】

「共役化合物」とは、共役基としての使用に好適な任意の原子、原子団、または連結された原子団を意味する。あるある特定の実施形態では、共役化合物は、２つ以上の特性、例えば限定するわけではないが、薬力学的特性、薬物動態学的特性、結合特性、吸収特性、細胞分布特性、細胞取り込み特性、電荷特性、及び／またはクリアランス特性などを有しうるか、または付与しうる。

【0066】

「連続する核酸塩基」とは、互いに直接隣り合っている核酸塩基を意味する。

【0067】

「設計」または「設計された」とは、選ばれた核酸分子と特異的にハイブリダイズするオリゴマー化合物を作製するプロセスを指す。

【0068】

「希釈剤」は、薬理学的活性を欠いているが、医薬的に必要または望まれる組成物中の成分を意味する。例えば、注射される薬品中に、希釈剤は液体、例えば生理食塩水の溶液であってもよい。

【0069】

「用量」は、単回投与で、または指定された時間に提供される治療薬の特定の量を意味する。ある特定の実施形態では、用量は、１回、２回、またはそれ以上のボーラス、錠剤または注射で投与してもよい。例えば、皮下投与が所望されるある特定の実施形態では、単回の注射では容易に収まらない容量を必要とするため、所望の用量を達成するために２回以上注射してもよい。ある特定の実施形態では、治療薬は長期間または連続して注入することによって投与される。用量は１時間、１日、１週間、１カ月あたりの治療薬の量として示してもよい。

【0070】

「下流」とは、核酸の３’末端またはＣ末端に向かう相対的な方向を意味する。

【0071】

活性を調節するまたは病態を治療もしくは予防することに関して、「有効量」は、このような調節、治療もしくは予防を必要とする対象に、単回用量もしくはシリーズの部分として、効果の調節、または病態の治療もしくは予防もしくは改善に効果のある治療薬の量の投与を意味する。有効量は、処置される個体の健康状態及び身体状態、処置される個体の分類群、組成物の製剤、個体の医学的状態の評価、及び他の関連因子に依存して個体間で変動しうる。

【0072】

「効力」とは、所望の効果を生じさせる能力を意味する。

【0073】

「発現」には、遺伝子にコードされている情報を、細胞中に存在し細胞中で作動する構造物へと変換する機能のすべてが含まれる。そのような構造物として、転写産物及び翻訳産物が挙げられるが、これらに限定されない。

【0074】

「完全に相補的」または「１００％相補的」とは、第１核酸の各核酸塩基が第２核酸中に相補的核酸塩基を有することを意味する。ある特定の実施形態では、第１核酸がアンチセンス化合物であり、標的核酸が第２核酸である。

【0075】

「ギャップマー」とは、キメラアンチセンス化合物であって、ＲＮａｓｅ Ｈ切断を支持する複数のヌクレオシドを有する内側領域が、２つ以上のヌクレオシドを有する外側領域の間に配置されており、内側領域を構成するヌクレオシドが、外側領域を構成する１または複数のヌクレオシドと化学的に異なっているものを意味する。当該内側領域を「ギャップ」と呼び、当該外側領域を「ウイング」と呼ぶことができる。

【0076】

「ハロ」及び「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素から選択される原子を意味する。

【0077】

「ヘテロアリール」及び「ヘテロ芳香族」とは、単環式もしくは多環式芳香族環、環系、または縮合環系を含むラジカルであって、当該環のうちの少なくとも１つが芳香族であり、かつ２つ以上のヘテロ原子を含むものを意味する。ヘテロアリールは、縮合環のうちの２つ以上がヘテロ原子を含有していない系を含む縮合環系も包含するものとする。ヘテロアリール基は、典型的には、硫黄、窒素、または酸素から選択される１つの環原子を含む。ヘテロアリール基の例として、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、チオフェニル、フラニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、キノキサリニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロアリールラジカルは、親分子に直接取り付けるか、または脂肪族基もしくはヘテロ原子などの連結部分を介して取り付けることができる。本明細書にいうヘテロアリール基は、場合によっては、さらなる置換基を含みうる。

【0078】

「ハイブリダイゼーション」とは、相補的核酸分子のアニーリングを意味する。ある特定の実施形態では、相補的核酸分子に、アンチセンス化合物と標的核酸が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、相補的核酸分子に、アンチセンスオリゴヌクレオチドと核酸標的が含まれるが、これらに限定されない。

【0079】

「炎症性疾患を有する動物を識別すること」は、炎症性疾患と診断された動物、または炎症性疾患を発症しやすい動物を識別することを意味する。炎症性疾患を発症しやすい個体として、環境要因、個人的もしくは家族歴を有すること、または２つ以上の疾患に対する遺伝的素因をを含む炎症性疾患を発現する２つ以上のリスク因子を有する個体が挙げられる。このような識別は、個体の病歴の評価、遺伝子検査等の標準的な臨床検査または評価を含む方法によって達成することができる。

【0080】

「ＰＫＫ関連疾患を有する動物を識別すること」は、ＰＫＫ関連疾患であると診断された動物、またはＰＫＫ関連疾患を発症しやすい動物を識別することを意味する。ＰＫＫ関連疾患を発症しやすい個体として、２つ以上のＰＫＫ関連疾患の個人的もしくは家族歴をゆうすること、または遺伝的素因を含むＰＫＫ関連疾患を発症するリスク要因を２つ以上有する個体が挙げられる。そのような識別は、個体の病歴の評価、遺伝子検査等の標準的な臨床検査または評価を含む方法によって達成することができる。

【0081】

「血栓塞栓性疾患を有する動物を識別すること」は、血栓塞栓性疾患であると診断された動物、または血栓塞栓性疾患を発症しやすい動物を識別することを意味する。血栓塞栓性疾患を発症しやすい個体として、血栓塞栓性疾患を発症するリスク要因を２つ以上有する個体が挙げられ、例えば、血栓塞栓性疾患の家族歴、または２つ以上の遺伝的素因、不動、手術（特に整形外科）、悪性腫瘍、妊娠、高齢、経口避妊薬の使用、心房細動、血栓塞栓症の病歴、慢性炎症性疾患、及び遺伝性または獲得性プロトロンビン凝固障害を有することを含む。そのような識別は、個体の病歴の評価、遺伝子検査等の標準的な臨床検査または評価を含む方法によって達成することができる。

【0082】

「直接隣り合っている」とは、直接隣り合っている要素の間に介在する要素が存在しないことを意味する。「個体」とは、処置または治療のために選ばれたヒトまたはヒト以外の動物を意味する。

【0083】

「個体」とは、処置または治療のために選ばれたヒトまたはヒト以外の動物を意味する。

【0084】

「ＰＫＫを阻害すること」はＰＫＫ ｍＲＮＡ及び／またはタンパク質のレベルまたは発現を低下させることを意味する。ある特定の実施形態では、ＰＫＫ ｍＲＮＡ及び／またはタンパク質レベルは、ＰＫＫを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むＰＫＫを標的とする化合物の存在下のほうが、アンチセンスオリゴヌクレオチド等のＰＫＫアンチセンス化合物の非存在下におけるＰＫＫ ｍＲＮＡ及び／またはタンパク質レベルの発現より阻害される。

【0085】

「発現または活性を阻害する」とは、発現または活性の低減または遮断を指し、必ずしも発現または活性の完全な排除を示すわけではない。

【0086】

「ヌクレオシド間連結部」とは、ヌクレオシド間の化学結合を指す。

【0087】

「ヌクレオシド間中性連結基」とは、２つのヌクレオシドを直接連結する中性連結基を意味する。

【0088】

「ヌクレオシド間リン連結基」とは、２つのヌクレオシドを直接連結するリン連結基を意味する。

【0089】

「連結部モチーフ」とは、オリゴヌクレオチドまたはその一領域における連結部修飾のパターンを意味する。そのようなオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは修飾されていても無修飾でもよい。別段の表示がある場合を除き、連結部の説明しかない本明細書におけるモチーフは、連結部モチーフであるものとする。したがって、そのような事例では、ヌクレオシドは限定されない。

【0090】

「連結されたヌクレオシド」とは、ヌクレオシド間連結部によって一つに連結された隣り合うヌクレオシドを意味する。

【0091】

「ロックト核酸」または「ＬＮＡ」または「ＬＮＡヌクレオシド」は、ヌクレオシド糖単位の４’位と２’位の間に２個の炭素原子を連結する架橋を有する核酸モノマーを意味し、それによって二環式糖を形成する。そのような二環式糖の例として、以下に限定されないが、以下に示す、Ａ）α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’）ＬＮＡ、（Ｂ）β−Ｄ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’）ＬＮＡ、（Ｃ）エチレンオキシ（４’−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−２’）ＬＮＡ、（Ｄ）アミノオキシ（４’−ＣＨ_２−ＯＮ（Ｒ）−２’）ＬＮＡ及び（Ｅ）オキシアミノ（４’−ＣＨ_２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’）ＬＮＡが挙げられる。

【0092】

【化1】

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【0093】

本明細書で使用されるように、ＬＮＡ化合物として、以下に限定されないが、糖の４’と２’位の間に少なくとも１つの架橋を有する化合物が挙げられ、ここで各架橋は独立して、［Ｃ（Ｒ_１）（Ｒ_２）］_ｎ−、−Ｃ（Ｒ_１）＝Ｃ（Ｒ_２）−、−Ｃ（Ｒ_１）＝Ｎ−、−Ｃ（＝ＮＲ_１）−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒ_１）_２−、−Ｓ（＝Ｏ）_ｘ−及びＮ（Ｒ_１）−から選択される１または２〜４の連結基を含み、ここで、ｘは０、１または２であり、ｎは１、２、３、または４であり、各Ｒ_１とＲ_２は独立して、Ｈ、保護基、ヒドロキシル、Ｃ_１−Ｃ_１２アルキル、置換Ｃ_１−Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２−Ｃ_１２アルケニル、置換Ｃ_２−Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_２−Ｃ_１２アルキニル、置換Ｃ_２−Ｃ_１２アルキニル、Ｃ_５−Ｃ_２０アリール、置換Ｃ_５−Ｃ_２０アリール、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ_５−Ｃ_７脂環式ラジカル、置換Ｃ_５−Ｃ_７置換式ラジカル、ハロゲン、ＯＪ_１、ＮＪ_１Ｊ_２、ＳＪ_１、Ｎ_３、ＣＯＯＪ_１、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、ＣＮ、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）_２−Ｊ_１）、またはスルホキシル（Ｓ（＝Ｏ）−Ｊ_１）であり、ここで、各Ｊ_１とＪ_２は独立して、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_１２アルキル、置換Ｃ_１−Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２−Ｃ_１２アルケニル、置換Ｃ_２−Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_２−Ｃ_１２アルキニル、置換Ｃ_２−Ｃ_１２アルキニル、Ｃ_５−Ｃ_２０アリール、置換Ｃ_５−Ｃ_２０アリール、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、Ｃ_１−Ｃ_１２アミノアルキル、置換Ｃ_１−Ｃ_１２アミノアルキルまたは保護基である。

【0094】

ＬＮＡの定義に含まれる４’−２’架橋基の例として、以下に限定されないが、−［Ｃ（Ｒ_１）（Ｒ_２）］_ｎ−、−［Ｃ（Ｒ_１）（Ｒ_２）］_ｎ−Ｏ−、−Ｃ（Ｒ_１Ｒ_２）−Ｎ（Ｒ_１）−Ｏ−または−Ｃ（Ｒ_１Ｒ_２）−Ｏ−Ｎ（Ｒ_１）−が挙げられる。さらに、ＬＮＡの定義に含まれる他の架橋基は、４’−ＣＨ_２−２’，４’−（ＣＨ_２）_２−２’，４’−（ＣＨ_２）_３−２’，４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’，４’−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−２’，４’−ＣＨ_２−Ｏ−Ｎ（Ｒ_１）−２’及び４’−ＣＨ_２−Ｎ（Ｒ_１）−Ｏ−２’−架橋であり、各Ｒ_１とＲ_２は独立して、Ｈ、保護基、またはＣ_１−Ｃ_１２アルキルである。

【0095】

また、本発明に記載のＬＮＡの定義に含まれるＬＮＡでは、リボシル糖環の２’−ヒドロキシル基が、糖環の４’炭素原子に接続され、それによってメチレンオキシ（４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’）架橋を形成し、二環式糖部分を形成する。当該架橋はまた、２’酸素原子と４’炭素原子を接続するメチレン−（ＣＨ_２−）基であることができ、メチレンオキシ（４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’）ＬＮＡという用語を使用する。さらに、この位置のエチレン架橋基を有する二環式糖部分の場合では、エチレンオキシ（４’−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ−２’）ＬＮＡという用語を使用する。α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’）、メチレンオキシ（４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’）ＬＮＡもまた、本明細書で使用するＬＮＡの定義に含まれる。

【0096】

「ミスマッチ」または「非相補的核酸塩基」とは、第１核酸の核酸塩基が第２核酸または標的核酸の対応する核酸塩基と対合できない場合を指す。

【0097】

「修飾ヌクレオシド間連結部」とは、天然に存在するヌクレオシド間結合（すなわちホスホジエステルヌクレオシド間結合）からの置換または何らかの改変を指す。

【0098】

「修飾核酸塩基」とは、アデニン、シトシン、グアニン、チミジン（５−メチルウラシルとしても知られる）、またはウラシル以外の任意の核酸塩基を意味する。「無修飾核酸塩基」とは、プリン塩基で（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を意味する。

【0099】

「修飾ヌクレオシド」とは、修飾糖部分及び／または修飾核酸塩基を独立して有するヌクレオシドを意味する。

【0100】

「修飾ヌクレオチド」とは、修飾糖部分、修飾ヌクレオチド間連結部、及び／または修飾核酸塩基を独立して有するヌクレオチドを意味する。

【0101】

「修飾オリゴヌクレオチド」とは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間連結部、修飾糖、及び／または修飾核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドを意味する。

【0102】

「修飾糖」とは、天然糖部分からの置換及び／または何らかの改変を意味する。

【0103】

「単環式または多環式の環系」という用語は、単環式または縮合されもしくは連結された多環式のラジカル環系から選択されるすべての環系を包含するものとし、脂肪族、脂環式、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アリールアルキル、複素環式、ヘテロアリール、ヘテロ芳香族、及びヘテロアリールアルキルから個別に選択される単一の環系及び混成環系を包含するものとする。そのような単環式及び多環式の構造は、それぞれが同一のレベルの飽和を有する環を含有するか、またはそれぞれが独立して、完全飽和、部分飽和、もしくは完全不飽和を含むさまざまな飽和度を有する環を含有することができる。各環は、複素環式環が生じるように、そしてまた、例えば一方の環が炭素環原子のみを有しかつ縮合している環が２つの窒素原子を有するベンズイミダゾールなどの混合モチーフに存在しうるＣ環原子のみを含む環が生じるように、Ｃ、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される環原子を含むことができる。単環式または多環式の環系は、例えば一方の環に２つの＝Ｏ基が取り付けられているフタルイミドのように、さらに置換基で置換することができる。単環式または多環式の環系は、環原子を介した直接結合、複数の環原子を介した縮合、置換基を介した結合、または二機能性連結部分を介した結合などといったさまざまな戦略を用いて、親分子に取り付けることができる。

【0104】

「モノマー」は、オリゴマーの単一の単位を意味する。モノマーとして、限定されないが、天然に存在するか修飾された、ヌクレオシドが挙げられる。

【0105】

「モチーフ」とは、アンチセンス化合物における無修飾ヌクレオシドと修飾ヌクレオシドのパターンを意味する。

【0106】

「天然糖部分」とは、ＤＮＡ（２’−Ｈ）またはＲＮＡ（２’−ＯＨ）に見いだされる糖部分を意味する。

【0107】

「天然に存在するヌクレオシド間連結部」とは、３’→５’ホスホジエステル連結部を意味する。

【0108】

「中性連結基」とは、荷電していない連結基を意味する。中性連結基として、これに限定されないが、ホス、メチルホスホネート、ＭＭＩ（−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−Ｏ−）、アミド３（−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−）、アミド−４（−ＣＨ_２−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−）、ホルムアセタール（−Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−）、及びチオホルム（−Ｓ−ＣＨ_２−Ｏ−）が挙げられる。さらに、中性連結基には、シロキサン（ジアルキルシロキサン）、カルボン酸エステル、カルボキサミド、硫化物、スルホン酸エステル、及びアミドを含む非イオン性連結部も含まれる（例えば「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｖｉ及びＰ．Ｄ．Ｃｏｏｋ編，ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０；Ｃｈａｐｔｅｒ ３及び４（ｐｐ．４０−６５）を参照されたい）。さらに、中性連結基には、混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ_２成分パーツを含む非イオン性連結部も含まれる。

【0109】

「非相補的核酸塩基」とは、互いに水素結合を形成せず、他のいかなる形でもハイブリダイゼーションを支持することのない、一対の核酸塩基を指す。

【0110】

「非ヌクレオシド間中性連結基とは、２つのヌクレオシドを直接連結しない中性連結基を意味する。ある特定の実施形態では、非ヌクレオシド間中性連結基が、ヌクレオシドをヌクレオシド以外の基に連結する。ある特定の実施形態では、非ヌクレオシド間中性連結基は、どちらもヌクレオシドではない２つの基を連結する。

【0111】

「非ヌクレオシド間リン連結基」とは、２つのヌクレオシドを直接連結しないリン連結基を意味する。ある特定の実施形態では、非ヌクレオシド間リン連結基がヌクレオシドをヌクレオシド以外の基に連結する。ある特定の実施形態では、非ヌクレオシド間リン連結基が、どちらもヌクレオシドではない２つの基を連結する。

【0112】

「核酸」とは、モノマー型ヌクレオチドで構成された分子を指す。核酸には、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、一本鎖核酸、及び二本鎖核酸、低分子干渉リボ核酸ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）があるが、これらに限定されない。

【0113】

「核酸塩基」とは、もう一つの核酸の塩基と対合することができる複素環式部分を意味する。

【0114】

「核酸塩基相補性」とは、もう一つの核酸塩基と塩基対合することができる核酸塩基を指す。例えばＤＮＡでは、アデニン（Ａ）がチミン（Ｔ）と相補的である。。例えばＲＮＡでは、アデニン（Ａ）がウラシル（Ｕ）と相補的である。ある特定の実施形態では、相補的核酸塩基とは、アンチセンス化合物の核酸塩基であって、その標的核酸の核酸塩基と塩基対合することができるものを指す。例えば、あるアンチセンス化合物のある特定の位置にある核酸塩基が標的核酸のある特定の位置にある核酸塩基と水素結合することができるなら、当該オリゴヌクレオチドと当該標的核酸の間の水素結合の位置は、それら核酸塩基対において相補的であるとみなされる。

【0115】

「核酸塩基修飾モチーフ」とは、オリゴヌクレオチドに沿った核酸塩基への修飾のパターンを意味する。別段の表示がある場合を除き、核酸塩基修飾モチーフは、核酸塩基配列に依存しない。

【0116】

「核酸塩基配列」とは、連続する核酸塩基の順序を意味し、糖、連結部、及び／または核酸塩基修飾には依存しない。

【0117】

「ヌクレオシド」とは、糖に連結された核酸塩基を意味する。

【0118】

「ヌクレオシド模倣物」には、例えばモルホリノ、シクロヘキセニル、シクロヘキシル、テトラヒドロピラニル、ビシクロまたはトリシクロ糖模倣物、例えば非フラノース糖単位を有するヌクレオシド模倣物などといった、オリゴマー化合物の２つ以上の位置において糖または糖及び塩基を置き換えるため（連結部は必ずしも置き換えられない）に使用される構造が含まれる。ヌクレオチド模倣物には、例えばペプチド核酸またはモルホリノ（−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−または他の非ホスホジエステル連結部によって連結されたモルホリノ）などといった、オリゴマー化合物の２つ以上の位置においてヌクレオシド及び連結部を置き換えるために使用される構造が含まれる。糖代用物は、わずかに広い意味を持つ用語であるヌクレオシド模倣物と一部重複するが、糖単位（フラノース環）のみの置き換えを示すものとする。ここに提供するテトラヒドロピラニル環は、フラノース糖基がテトラヒドロピラニル環系で置き換えられた糖代用物の一例を例示するものである。「模倣物」とは、糖、核酸塩基、及び／またはヌクレオシド間連結部の代わりに使用される基を指す。一般的には、模倣物は、糖または糖−ヌクレオシド間連結部の組み合わせの代わりに使用され、核酸塩基は、選ばれたターゲットへのハイブリダイゼーションのために維持される。

【0119】

「ヌクレオシドモチーフ」とは、オリゴヌクレオチドまたはその一領域におけるヌクレオシド修飾のパターンを意味する。そのようなオリゴヌクレオチドの連結部は修飾されていても無修飾であってもよい。別段の表示がある場合を除き、ヌクレオシドの説明しかない本明細書におけるモチーフは、ヌクレオシドモチーフであるものとする。したがって、そのような事例では、連結部は限定されない。

【0120】

「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドの糖部分にリン酸基が共有結合で連結されているヌクレオシドを意味する。

【0121】

「オフターゲット効果」とは、意図された標的核酸以外の遺伝子のＲＮＡまたはタンパク質発現の調節に関連する望ましくないまたは有害な生物学的効果を指す。

【0122】

「オリゴマー化合物」または「オリゴマー」とは、連結されたモノマー型サブユニットのポリマーであって、核酸分子の少なくとも一領域にハイブリダイズすることができるものを意味する。

【0123】

「オリゴヌクレオチド」とは、連結されたヌクレオシドのポリマーを意味し、ヌクレオシドのそれぞれは互いに依存することなく修飾されていても無修飾でもよい。

【0124】

「非経口投与」とは、注射（例えばボーラス注射）または注入による投与を意味する。非経口投与には、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、腹腔内投与、または頭蓋内投与、例えば髄腔内投与もしくは脳室内投与が含まれる。

【0125】

「ペプチド」は、アミド結合によって少なくとも２つのアミノ酸を連結することによって形成される分子を意味する。以下に限定されないが、本明細書で使用されるペプチドは、ポリペプチド及びタンパク質を指す。

【0126】

「医薬品」とは、個体に投与したときに治療効果をもたらす物質を意味する。例えば、ある特定の実施形態では、ＰＫＫを標的にしたアンチセンスオリゴヌクレオチドは医薬品である。

【0127】

「医薬組成物」とは、対象への投与に適した物質の混合物を意味する。例えば医薬組成物はアンチセンスオリゴヌクレオチドと滅菌水溶液とを含みうる。

【0128】

「医薬上許容される誘導体」は、医薬上許容される塩、共役体、プロドラッグまたは本明細書に記載の化合物の異性体を包含する。

【0129】

「医薬上許容される塩」とは、アンチセンス化合物の生理学的かつ医薬的に許容される塩、すなわち、親オリゴヌクレオチドの望ましい生物学的活性を保持しており、しかも望ましくない毒性効果をそこに付与しない塩を意味する。

【0130】

「ホスホロチオエート連結部」とは、ホスホジエステル結合が非架橋酸素原子の１つを硫黄原子で置き換えることによって修飾されているヌクレオシド間の連結部を意味する。ホスホロチオエート連結部は修飾ヌクレオシド間連結部である。

【0131】

「リン連結基」とは、リン原子を含む連結基を意味する。リン連結基には、以下の式を有する基が含まれるが、これに限定されない：

【0132】

【化2】

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ここで、
Ｒ_ａ及びＲ_ｄはそれぞれ独立して、Ｏ、Ｓ、ＣＨ_２、ＮＨ、またはＮＪ_１であり、Ｊ_１はＣ_１−Ｃ_６アルキルまたは置換Ｃ_１−Ｃ_６アルキルであり、
Ｒ_ｂはＯまたはＳであり、
Ｒ_cは、ＯＨ、ＳＨ、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、置換Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、置換Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、アミノまたは置換アミノであり、
Ｊ_１は、Ｒ_ｂは、ＯまたはＳである。

【0133】

リン連結基には、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホネート、ホスホラミデート、ホスホロチオアミデート、チオノアルキルホスホネート、ホスホトリエステル、チオノアルキルホスホトリエステル、及びボラノホスフェートが含まれるが、これらに限定されない。

【0134】

「ＰＫＫ」は、ヒト血漿プレカリクレインを含む哺乳類の血漿プレカリクレインを意味する。血漿プレカリクレイン（ＰＫＫ）は、血漿カリクレイン（ＰＫ）の前駆体であり、ＫＬＫＢ１遺伝子によってコードされている。

【0135】

「ＰＫＫ関連疾患」とは、任意のＰＫＫ核酸またはその発現産物に関連する任意の疾患を意味する。このような疾患は、炎症性疾患または血栓塞栓性疾患を含んでもよい。このような疾患は、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）を含んでもよい。

【0136】

「ＰＫＫ ｍＲＮＡ」は、ＰＫＫをコードするＤＮＡ配列の任意のメッセンジャーＲＮＡの発現産物を意味する。

【0137】

「ＰＫＫ核酸」は、ＰＫＫをコードする任意の核酸を意味する。例えば、ある特定の実施形態では、ＰＫＫ核酸は、ＰＫＫをコードするＤＮＡ配列、ＰＫＫをコードするＤＮＡから転写されるＲＮＡ配列（イントロン及びエクソンを含むゲノムＤＮＡを含む）、及びＰＫＫをコードするｍＲＮＡ配列を含む。「ＰＫＫ ｍＲＮＡ」はＰＫＫタンパク質をコードするｍＲＮＡを意味する。

【0138】

「ＰＫＫタンパク質」は、ＰＫＫ核酸のポリペプチド発現産物を意味する。

【0139】

「一部分（ｐｏｒｔｉｏｎ）」とは、核酸の、所定の数の連続する（すなわち連結された）核酸塩基を意味する。ある特定の実施形態では、一部分が、標的核酸の、所定の数の連続する核酸塩基である。ある特定の実施形態では、一部分が、アンチセンス化合物の、所定の数の連続する核酸塩基である。

【0140】

「予防」または「予防すること」とは、数分から数日、数週間、数か月の期間にわたって、または無期限に疾患、障害、または状態の発症、発生を遅延させまたは未然に防ぐことを指す。

【0141】

「プロドラッグ」は、内因性酵素または他の化学物質及び／または条件の作用によって、体内または細胞内で活性形態（すなわち、薬剤）に変換される、不活性な形態で調製される治療薬を意味する。

【0142】

「予防有効量」とは、動物に予防的利益または防止的利益を与える医薬剤の量を指す。

【0143】

「保護基」とは、当業者に知られている任意の化合物または保護基を意味する。保護基の非限定的な例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，ＩＳＢＮ０−４７１−６２３０１−６，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，ニューヨークに見いだすことができる。

【0144】

「領域」は、少なくとも１つの同定可能な構造、機能、または特徴を有する標的核酸の一部分と定義される。

【0145】

「リボヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの糖部分の２’位にヒドロキシを有するヌクレオチドを意味する。リボヌクレオチドはさまざまな置換基のいずれでも修飾することができる。

【0146】

「ＲＩＳＣベースのアンチセンス化合物」とは、当該アンチセンス化合物のアンチセンス活性の少なくとも一部がＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に起因するアンチセンス化合物を意味する。

【0147】

「ＲＮａｓｅ Ｈベースのアンチセンス化合物」とは、当該アンチセンス化合物のアンチセンス活性の少なくとも一部が、標的核酸へのアンチセンス化合物のハイブリダイゼーションと、それに続くＲＮａｓｅ Ｈによる標的核酸の切断に起因する、アンチセンス化合物を意味する。

【0148】

「塩」は、アンチセンス化合物の生理学的及び医薬上許容される塩、すなわち、親オリゴヌクレオチドの望ましい生物活性を保持し、望ましくない毒性効果を付与しない塩を意味する。

【0149】

「セグメント」は、標的核酸内の領域の、さらに小さな一部分または下位部分と定義される。

【0150】

「別個の領域」とは、オリゴヌクレオチドの複数の部分であって、任意の隣接する部分の化学修飾または化学修飾のモチーフが、当該別個の領域を互いに区別することを可能にする少なくとも１つの相違点を含むものを意味する。

【0151】

「配列モチーフ」とは、オリゴヌクレオチドまたはその一部分に沿って配置された核酸塩基のパターンを意味する。別段の表示がある場合を除き、配列モチーフは化学修飾には依存しないので、化学修飾なしを含めて、化学修飾の任意の組み合わせを有しうる。

【0152】

「副作用」とは、処置に起因する所望の効果以外の生理学的反応を意味する。ある特定の実施形態では、副作用に、以下に限定されないが、注射部位反応、肝機能検査異常、腎機能検査異常、肝毒性、腎毒性、中枢神経系異常、及びミオパシーが含まれる。

【0153】

「一本鎖オリゴヌクレオチド」は、相補鎖にハイブリダイズされていないオリゴヌクレオチドを意味する。

【0154】

本明細書にいう「部位」は、標的核酸内のユニークな核酸塩基位置と定義される。

【0155】

「特異的にハイブリダイズ可能」または「特異的にハイブリタイズする」とは、アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的核酸との間に、特異的結合が望まれる条件下で、すなわちインビボアッセイや治療的処置の場合は生理的条件下で、所望の効果を誘導すると共に非標的核酸には最小限の効果しか呈さないかまたは効果を全く呈さないような、十分な相補度を有するアンチセンス化合物を指す。

【0156】

「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな条件」とは、オリゴマー化合物がそのターゲット配列にはハイブリダイズするが、他の配列にはごくわずかな数の配列にしかハイブリダイズしないような条件を指す。

【0157】

「対象」とは、処置または治療のために選択されたヒトまたはヒト以外の動物を意味する。

【0158】

「置換基（ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ）」及び「置換基（ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ ｇｒｏｕｐ）」とは、指名された親化合物の原子または基を置換する原子または基を意味する。例えば、修飾ヌクレオシドの置換基は、天然に存在するヌクレオシドに見られる原子または基とは異なる任意の原子または基である（例えば修飾２’−置換基はヌクレオシドの２’位にあるＨまたはＯＨ以外の任意の原子または基である）。置換基は、保護されていても保護されていなくてもよい。ある特定の実施形態では、本開示の化合物は、親化合物の１つの位置または２つ以上の位置に置換基を有する。置換基は、他の置換基でさらに置換されていてもよく、親化合物に直接取り付けるか、またはアルキル基もしくはヒドロカルビル基などの連結基を介して取り付けることができる。

【0159】

同様に、本明細書において使用する場合、化学官能基に関して「置換基」とは、指名された官能基に通常存在する原子または原子団とは異なる原子または原子団を意味する。ある特定の実施形態では、置換基が官能基の水素原子を置き換える（例えばある特定の実施形態では、置換メチル基の置換基は、無置換メチル基の水素原子のうちの１つを置き換える水素以外の原子または基である）。別段の表示がある場合を除き、置換基としての使用に適する基には、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル（−Ｃ（Ｏ）Ｒ_ａａ）、カルボキシル（−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒ_ａａ）、脂肪族基、脂環式基、アルコキシ、置換オキシ（−Ｏ−Ｒ_ａａ）、アリール、アラルキル、複素環式ラジカル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アミノ（−Ｎ（Ｒ_ｂｂ）（Ｒ_ｃｃ））、イミノ（＝ＮＲ_ｂｂ）、アミド（−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ_ｂｂ）（Ｒ_ｃｃ）または−Ｎ（Ｒ_ｂｂ）Ｃ（Ｏ）Ｒ_ａａ）、アジド（−Ｎ_３）、ニトロ（−ＮＯ_２）、シアノ（−ＣＮ）、カルバミド（−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ_ｂｂ）（Ｒ_ｃｃ）または−Ｎ（Ｒ_ｂｂ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ_ａａ）、ウレイド（−Ｎ（Ｒ_ｂｂ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ_ｂｂ）（Ｒ_ｃｃ））、チオウレイド（−Ｎ（Ｒ_ｂｂ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ_ｂｂ）−（Ｒ_ｃｃ））、グアニジニル（−Ｎ（Ｒ_ｂｂ）Ｃ（＝ＮＲ_ｂｂ）Ｎ（Ｒ_ｂｂ）（Ｒ_ｃｃ））、アミジニル（−Ｃ（＝ＮＲ_ｂｂ）Ｎ（Ｒ_ｂｂ）（Ｒ_ｃｃ）または−Ｎ（Ｒ_ｂｂ）Ｃ（＝ＮＲ_ｂｂ）（Ｒ_ａａ））、チオール（−ＳＲ_ｂｂ）、スルフィニル（−Ｓ（Ｏ）Ｒ_ｂｂ）、スルホニル（−Ｓ（Ｏ）_２Ｒ_ｂｂ）、及びスルホンアミジル（−Ｓ（Ｏ）_２Ｎ（Ｒ_ｂｂ）（Ｒ_ｃｃ）または−Ｎ（Ｒ_ｂｂ）Ｓ−（Ｏ）_２Ｒ_ｂｂ）が含まれるが、これらに限定されない。式中、各Ｒ_ａａ、Ｒ_ｂｂ、及びＲ_ｃｃは、独立して、Ｈ、場合によっては連結された化学官能基、またはさらなる置換基であり，好ましいものとしては、アルキル、アルケニル、アルキニル、脂肪族、アルコキシ、アシル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、脂環式、複素環式、及びヘテロアリールアルキルが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載する化合物内の選ばれた置換基は、再帰的に（ｔｏ ａ ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｄｅｇｒｅｅ）存在する。

【0160】

「置換糖部分」とは、天然に存在する糖部分ではないフラノシルを意味する。置換糖部分には、２’位、３’位、５’位及び／または４’位に置換基を含むフラノシルなどがあるが、これらに限定されない。ある特定の置換糖部分は二環式糖部分である。

【0161】

「糖部分」とは、ヌクレオシドの天然に存在する糖部分または修飾糖部分を意味する。

【0162】

「糖モチーフ」とは、オリゴヌクレオチドまたはその一領域における糖修飾のパターンを意味する。

【0163】

「糖代用物」とは、フラノシルを含まない構造であって、しかも、結果として生じるヌクレオシドサブユニットを一つに連結しかつ／または他のヌクレオシドに連結することで相補的なオリゴマー化合物にハイブリダイズすることができるオリゴマー化合物を形成することができるように、ヌクレオシドの天然に存在する糖部分を置き換えることができる構造を意味する。そのような構造には、フラノシルとは異なる数の原子を含むか（例えば４、６、または７員環）、または非酸素原子（例えば炭素、硫黄、もしくは窒素）によるフラノシルの酸素の置き換え、または原子数の変化と酸素の置き換えとの両方が含まれる。そのような構造は、置換糖部分（例えば場合によってはさらなる置換基を含む６員炭素環式二環式糖代用物）について記載したものに対応する置換も含みうる。糖代用物は、さらに複雑な糖の代替物（例えばペプチド核酸の非環系）も包含する。糖代用物には、モルホリノ、シクロヘキセニル及びシクロヘキシトールなどがあるが、これらに限定されない。

【0164】

「標的」とは、調節することが望まれるタンパク質を指す。

【0165】

「標的遺伝子」とは、標的をコードする遺伝子を指す。

【0166】

「ターゲティング」または「標的化される」とは、標的核酸に特異的にハイブリダイズして所望の効果を誘導することになるアンチセンス化合物を設計及び選択するプロセスを意味する。

【0167】

「標的核酸」、「標的ＲＮＡ」、「標的ＲＮＡ転写産物」及び「核酸標的」は、いずれも、アンチセンス化合物の標的となりうる核酸を意味する。

【0168】

「標的領域」とは、標的核酸のうち、２つ以上のアンチセンス化合物の標的となる部分を意味する。

【0169】

「標的セグメント」とは、標的核酸のうち、アンチセンス化合物が標的とするヌクレオチドの配列を意味する。「５’標的部位」とは、標的セグメントの最も５’側のヌクレオチドを指す。「３’標的部位」とは、標的セグメントの最も３’側のヌクレオチドを指す。

【0170】

「末端基」とは、オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端のいずれか、またはそれらの両方に取り付けられた２つ以上の原子を意味する。ある特定の実施形態では、末端基が共役基である。ある特定の実施形態では、末端基が２つ以上の末端基ヌクレオシドを含む。

【0171】

末端ヌクレオシド間連結部」とは、オリゴヌクレオチドまたはその所定の領域の少なくとも２つのヌクレオシド間の連結部を意味する。

【0172】

「治療有効量」とは、個体に治療的利益を与える医薬剤の量を意味する。

【0173】

「治療する」または「治療すること」または「治療」は、疾患または病態の改善をもたらすために組成物を投与することを指す。

【0174】

ヌクレオシドに関する「修飾のタイプ」またはある「タイプ」のヌクレオシドは、ヌクレオシドの化学修飾を意味し、修飾及び非修飾ヌクレオシドを含む。したがって、別段の表示がある場合を除き、「第一タイプの修飾を有するヌクレオシド」は、非修飾のヌクレオシドでもよい。

【0175】

「無修飾」核酸塩基とは、プリン塩基であるアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を意味する。

【0176】

「無修飾ヌクレオチド」とは、天然に存在する核酸塩基、糖部分及びヌクレオシド間連結部で構成されるヌクレオシドを意味する。ある特定の実施形態では、無修飾ヌクレオチドがＲＮＡヌクレオチド（すなわちβ−Ｄ−リボヌクレオシド）またはＤＮＡヌクレオチド（すなわちβ−Ｄ−デオキシリボヌクレオシド）である。

【0177】

「上流」は、核酸の５’末端またはＮ末端に向かう相対的な方向を意味する。

【0178】

「ウイングセグメント」とは、強化された阻害活性、標的核酸への結合親和性の増加、またはｉｎ ｖｉｖｏのヌクレアーゼによる分解への抵抗等のオリゴヌクレオチドの特性を付加するために修飾された複数のヌクレオシドを意味する。

【0179】

ある特定の実施形態
ある特定の実施形態は、血漿プレカリクレイン（ＰＫＫ）ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を阻害するための化合物、組成物、及び方法を提供する。ある特定の実施形態は、ＰＫＫ ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルを減少させるための化合物、組成物、及び方法を提供する。

【0180】

ある特定の実施形態は、血漿プレカリクレイン（ＰＫＫ）の核酸を標的とするアンチセンス化合物を提供する。ある特定の実施形態では、ＰＫＫ核酸は、ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号：ＮＭ＿０００８９２．３（配列番号１として本明細書に組み込まれる）、ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号：ＤＣ４１２９８４．１（配列番号２として本明細書に組み込まれる）、ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号：ＣＮ２６５６１２．１（配列番号３として本明細書に組み込まれる）、ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＡＫ２９７６７２．１（配列番号４として本明細書に組み込まれる）、ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＤＣ４１３３１２．１（配列番号５として本明細書に組み込まれる）、ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＡＶ６８８８５８．２（配列番号６として本明細書に組み込まれる）、ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号：ＣＤ６５２０７７．１（配列番号７として本明細書に組み込まれる）、ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＢＣ１４３９１１．１（配列番号８として本明細書に組み込まれる）、ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＣＢ１６２５３２．１（配列番号９として本明細書に組み込まれる）、核酸塩基１１１６９３００１から１１１７３００００まで切り捨てられたＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号：ＮＴ＿０１６３５４．１９、（配列番号１０として本明細書に組み込まれる）、ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＮＭ＿００８４５５．２（配列番号１１として本明細書に組み込まれる）、ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＢＢ５９８６７３．１（配列番号１２として本明細書に組み込まれる）、核酸塩基６１１４００１から６１４４０００まで切り捨てられたＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＮＴ＿０３９４６０．７（配列番号１３として本明細書に組み込まれる）、ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号：ＮＭ＿０１２７２５．２（配列番号１４として本明細書に組み込まれる）、核酸塩基１０９５２００１から１１０９８２０００まで切り捨てられたＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＮＷ＿０４７４７３．１（配列番号１５として本明細書に組み込まれる）、ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＸＭ＿００２８０４２７６．１（配列番号１７として本明細書に組み込まれる）、及び核酸塩基２３５８０００から２３９１０００まで切り捨てられたＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＮＷ＿００１１１８１６７．１（配列番号１８として本明細書に組み込まれる）である。

【0181】

ある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物を提供し、当該修飾オリゴヌクレオチドは、１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号３０〜２２２６の核酸塩基配列のいずれかの少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。

【0182】

ある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物を提供し、当該修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号５７０の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。

【0183】

ある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物を提供し、当該修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号７０５の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。

【0184】

ある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物を提供し、当該修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号１６６６の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、または少なくとも１６の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。

【0185】

ある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物を提供し、当該修飾オリゴヌクレオチドは２０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号５７０の核酸塩基配列を有する。

【0186】

ある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物を提供し、当該修飾オリゴヌクレオチドは２０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号７０５の核酸塩基配列を有する。

【0187】

ある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物を提供し、当該修飾オリゴヌクレオチドは１６個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号１６６６の核酸塩基配列を有する。

【0188】

ある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物を提供し、当該修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、以下の配列番号の核酸塩基配列の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、または少なくとも１６個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。配列番号６２、７２、１０３、２１３、３１２、３３４−３３９、３４４、３４５、３４６、３４８、３４９、３５１、３６９、３７３、３８１、３８２、３８３、３８５、３８７−３９１、３９９、４１１、４１２、４１４、４１６、４４４、４４６−４４９、４５２、４５３、４５４、４５９、４６０、４６２−４７２、４７３、４７６、４７７、４７９、４８０、４８１、４８４、４８９−４９５、４９７、５００、５０４、５０６、５２２、５２６、５３５、５５８、５５９、５６０、５６４、５６６、５６８−５７１、５７３、５７６、５７７、５７８、５８７、５９５、５９７−６０４、６０７、６０８、６１０、６１３、６１５、６１８、６１９、６２２、６２３、６２４、６３３、６３５、６３６、６３８、６３９、６４０、６４２、６４３、６４５、６５２、６５５−６５８、６６０、６６１、６７０、６７４−６７９、６８４、６８５、６９８、７０４、７０５、７０７、７０８、７１３、７１６、７１７、７２８、７３４、７３６、７６７、７６８、７７６、７９７、７９８、８００、８０２、８１０、８１５、８７６、８８０、８８２、８８３、８８６、８９１、９０１−９０５、９０８−９１１、９２２、９２３、９２４、９３１、９４２、９５０−９５７、９７２、９７４、９７８、９７９、９８０、９８７−９９１、１００５、１０１７−１０２１、１０２５、１０２６、１０２９、１０３０、１０３２、１０３４、１０３５、１０３７、１０４０、１０４１、１０４５、１０４６、１０５１、１０５４、１０５９、１０６０、１０６１、１０６４、１０６５、１０６６、１０７５、１０７６、１０８７、１０８９、１１１１、１１１４、１１１６、１１１７、１１２５、１１３３、１１５３、１１６９、１１７７、１１８１、１１８２、１１８７、１１９６、１２００、１２１４、１２２２、１２６７、１２７６、１２７７、１２８５、１２８６、１２８９、１２９０、１２９１、１３０３、１３６７、１３８９、１３９３、１３９８−１４０１、１４０６、１４０７、１４０８、１４１１、１４１９−１４２２、１４２６、１４３０、１４３１、１４３２、１４３４−１４３７、１４３９、１４４０、１４４３、１４４４、１４５１、１４５２、１４７１、１５１６、１５２７、１５３５、１５３７、１５３８、１５３９、１５４０、１５４１、１５６３、１５６４、１５６７、１５６８、１６１６、１６１７、１６２３、１６２９、１６６４、１６６５、１６６６、１６７９、１６８７、１７３４、１８０４、１８７６、１８８６、１９１５、２００８、２０１８、２１００、２１０１、２１１５、及び２１１６。ある実施形態では、当該修飾オリゴヌクレオチドはＰＫＫの少なくとも８０％のｍＲＮＡの阻害を達成する。

【0189】

ある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物を提供し、当該修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、以下の配列番号の核酸塩基配列の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、または少なくとも１６個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。配列番号６２、７２、１０３、２１３、３３４−３３９、３４４、３４６、３４８、３４９、３５１、３８１、３８２、３８３、３８５、３８９、３９０、３９１、４４６、４４８、４５２、４５３、４５４、４６６−４７３、４７６、４８１、４８４、４９１、４９２、４９４、４９５、４９７、５０４、５２６、５５８、５５９、５６６、５６８−５７１、５７６、５７８、５８７、５９５、５９７、５９８、６００−６０４、６０７、６１０、６１３、６１８、６１９、６２４、６３５、６３８、６３９、６４５、６５２、６５６、６５７、６５８、６６０、６７４、６７５、６７６、６８４、６９８、７０４、７０５、７０７、７１３、７１６、７６８、８７６、８８０、９０１−９０５、９０８−９１１、９２２、９２３、９２４、９３１、９４２、９５１、９５４−９５７、９７２、９７４、９７８、９７９、９８７、９８８、９９０、１００５、１０１９、１０２０、１０２１、１０２５、１０３２、１０３７、１０４０、１０４１、１０４５、１０５４、１０５９、１０６０、１０６１、１０６４、１０６５、１０６６、１０７５、１１１１、１１１６、１１１７、１１２５、１１３３、１１５３、１１６９、１１７７、１２００、１２２２、１２６７、１２８５、１２９０、１２９１、１３０３、１３６７、１３９８、１３９９、１４０１、１４０６、１４０８、１４１１、１４１９、１４２０、１４２１、１４２６、１４３０、１４３１、１４３２、１４３４−１４３７、１４４０、１４４３、１４４４、１４５１、１５３７−１５４０、１５６３、１６１６、１６７９、１６８７、１８０４、２００８、２１０１、２１１５、及び２１１６。ある実施形態では、当該修飾オリゴヌクレオチドはＰＫＫの少なくとも８５％のｍＲＮＡの阻害を達成する。

【0190】

ある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物を提供し、当該修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、以下の配列番号の核酸塩基配列の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、または少なくとも１６個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。配列番号３３４、３４６、３５１、３８２、３９０、３９１、４４６、４４８、４５２、４５３、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７６、４８１、４９１、４９５、５０４、５５８、５６６、５６８、５７０、５７１、５７８、５８７、５９７、５９８、６００、６０４、６１３、６３５、６３８、６４５、６５６、６５８、６６０、６７４、６７５、６８４、７０４、７０５、８８０、９０１−９０５、９０９、９２２、９３１、９５１、９５４、９５６、９９０、１００５、１０２０、１０３２、１０３７、１０４０、１０４１、１０４５、１０５４、１０７５、１１１１、１１２５、１１３３、１１５３、１２００、１２６７、１２９１、１３０３、１３９８、１３９９、１４０１、１４０６、１４２０、１４２６、１４３０、１４３１、１４３４、１４３５、１４３６、１４４０、１４４３、１４５１、１５３７−１５４０、２１１５、及び２１１６。ある実施形態では、当該修飾オリゴヌクレオチドはＰＫＫの少なくとも９０％のｍＲＮＡの阻害を達成する。

【0191】

ある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物を提供し、当該修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、以下の配列番号の核酸塩基配列の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、または少なくとも１６個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。配列番号３３４、３９１、４４８、４６８、４６９、５６８、５７０、５９８、６３５、６５８、６７４、６８４、７０５、９０１、９０３、９０４、９２２、９９０、１２６７、１２９１、１４２０、１４３０、１４３１、１４３４、１４３５、１４３６、１５３７、１５３８、及び１５４０。ある実施形態では、当該修飾オリゴヌクレオチドはＰＫＫの少なくとも９５％のｍＲＮＡの阻害を達成する。

【0192】

ある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物を提供し、当該修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、以下の配列番号の核酸塩基配列の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、または少なくとも１６個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。配列番号３３４、３３８、３４６、３４９、３８２、３８３、３９０、４４８、４５２、４５３、４５４、４９５、５２６、５５９、５７０、５８７、５９８、６３５、６６０、７０５、９０１、９０３、９０４、９０８、９２３、９３１、９５５、９７４、９８８、９９０、１０２０、１０３９、１０４０、１１１１、１１１７、１２６７、１２９１、１３４９、１３５２、１３６７、１３８９、１３９３、１３９９、１４０１、１４０８、１４１１、１４２６、１４９９、１５１６、１５３５、１５４４、１５４８、１５６３、１５６４、１５６８、１５６９、１５９８、１６１６、１６１７、１６２３、１６２４、１６４３、１６６１、１６６５、１６６６、１６７３、１６７９、１６９５、１７２０、１８０４、１８１７、１８７６、１８８１、１８８６、１９４０、１９４７、２００８、２０１８、２０１９、２０３１、２０４４、２１００、２１０１、２１１５、及び２１１６。ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、０．４以下のＩＣ_５０（μＭ）を達成する。

【0193】

ある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物を提供し、当該修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、以下の配列番号の核酸塩基配列の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、または少なくとも１６個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。配列番号３３４、３４６、３４９、３８２、４５３、４５４、４９５、５２６、５７０、５８７、５９８、６３５、６６０、９０１、９０３、９０４、９３１、９５５、９９０、１０２０、１１１１、１２６７、１３４９、１３５２、１３６７、１３８９、１３９９、１４０８、１４１１、１４２６、１５１６、１５３５、１５４４、１５４８、１５６３、１５６４、１５６８、１５６９、１５９８、１６１６、１６１７、１６２３、１６４３、１６６１、１６６５、１６６６、１６７３、１６９５、１８０４、１８７６、１８８１、２０１９、２０４４、２１００、２１０１、２１１５、及び２１１６。ある特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、０．３以下のＩＣ_５０（μＭ）を達成する。

【0194】

ある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物を提供し、当該修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、以下の配列番号の核酸塩基配列の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、または少なくとも１６個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。配列番号３３４、３４６、３８２、４５３、４９５、５２６、５７０、５８７、５９８、６３５、９０１、９０４、９３１、９５５、１０２０、１１１１、１３４９、１３５２、１３８９、１４２６、１５１６、１５３５、１５４４、１５４８、１５６４、１５６９、１５９８、１６１６、１６１７、１６６５、１６６６、１８０４、１８７６、１８８１、２０１９、２０４４、２１０１、及び２１１６。ある特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、０．２以下のＩＣ_５０（μＭ）を達成する。

【0195】

ある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物を提供し、当該修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、以下の配列番号の核酸塩基配列の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、または少なくとも１６個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。配列番号３３４、４９５、５８７、５９８、６３５、１３４９、１３５２、１３８９、１５１６、１５４４、１５４８、１５６９、１５９８、１６１７、１６６５、１６６６、１８０４、１８８１、及び２０１９。ある特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、０．２以下のＩＣ_５０（μＭ）を達成する。

【0196】

ある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物を提供し、当該修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号１０の核酸塩基２７４２７〜２７４６６の長さが等しい部分に相補的な、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む。

【0197】

ある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物を提供し、当該修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号１０の核酸塩基３３１８３〜３３２４２の長さが等しい部分に相補的な、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む。

【0198】

ある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物を提供し、当該修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号１０の核酸塩基３０５７０〜３０６１０の長さが等しい部分に相補的な、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む。

【0199】

ある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物を提供し、当該修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号１０の核酸塩基２７４２７〜２７５２０の長さが等しい部分に相補的な、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む。

【0200】

ある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物を提供し、当該修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号１０の核酸塩基３３０８５〜３３２４７の長さが等しい部分に相補的な、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む。

【0201】

ある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物を提供し、当該修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号１０の核酸塩基３０４７５〜３０６３９の長さが等しい部分に相補的な、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む。

【0202】

ある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物を提供し、当該修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号１０の核酸塩基２７３６２〜２７５２４の長さが等しい部分に相補的な、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む。

【0203】

ある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物を提供し、当該修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号１０の核酸塩基３３１０１〜３３２４０の長さが等しい部分に相補的な、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む。

【0204】

ある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物を提供し、当該修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号１０の核酸塩基３０４６３〜３０６３８の長さが等しい部分に相補的な、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む。

【0205】

ある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物を提供し、当該修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、ＰＫＫ核酸のエクソン９、エクソン１２、またはエクソン１４の等しい長さの部分と相補的な、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む。

【0206】

ある特定の実施形態は、当該修飾オリゴヌクレオチドの当該核酸塩基配列は、配列番号１０と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相補的である。

【0207】

ある特定の実施形態では、化合物は、一本鎖修飾オリゴヌクレオチドからなる。

【0208】

ある特定の実施形態では、当該修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシド間結合は修飾ヌクレオシド間結合である。

【0209】

ある特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

【0210】

ある特定の実施形態では、当該修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７個のホスホジエステルヌクレオシド間結合を含む。

【0211】

ある特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合及びホスホロチオエートヌクレオシド間結合から選択される。

【0212】

ある特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。

【0213】

ある特定の実施形態では、当該修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシドは、修飾核酸塩基を含む。

【0214】

ある特定の実施形態では、当該修飾核酸塩基は、５−メチルシトシンである。

【0215】

ある特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾糖を含む。

【0216】

ある特定の実施形態では、当該修飾糖は、２’修飾糖、ＢＮＡ、またはＴＨＰである。

【0217】

ある特定の実施形態では、当該修飾糖は、２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−Ｏ−メチル、拘束エチル、ＬＮＡ、または３’−フルオロＨＮＡのいずれかである。

【0218】

ある特定の実施形態では、化合物は、少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシド、２’−Ｏ−メチルヌクレオシド、拘束エチルヌクレオシド、ＬＮＡヌクレオシド、または３’−フルオロＨＮＡヌクレオシドを含む。

【0219】

ある特定の実施形態では、当該修飾オリゴヌクレオチドは以下を含み、
１０個の連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント、
５個の連結されたヌクレオシドからなる５’ウイングセグメント、
５個の連結されたヌクレオシドからなる３’ウイングセグメント、
ここで、当該ギャップセグメントは、５’ウイングセグメントと３’ウイングセグメントの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは修飾糖を含む。

【0220】

ある特定の実施形態では、当該修飾オリゴヌクレオチドは２０個の連結されたヌクレオシドからなる。

【0221】

ある特定の実施形態では、当該修飾オリゴヌクレオチドは１９個の連結されたヌクレオシドからなる。

【0222】

ある特定の実施形態では、当該修飾オリゴヌクレオチドは１８個の連結されたヌクレオシドからなる。

【0223】

ある特定の実施形態は、共役基及び以下の式：Ｔｅｓ Ｇｅｓ ｍＣｅｓ Ａｅｓ Ａｅｓ Ｇｄｓ Ｔｄｓ ｍＣｄｓ Ｔｄｓ ｍＣｄｓ Ｔｄｓ Ｔｄｓ Ｇｄｓ Ｇｄｓ ｍＣｄｓ Ａｅｓ Ａｅｓ Ａｅｓ ｍＣｅｓ Ａｅに従う修飾オリゴヌクレオチドから成る化合物を提供し、ここで、
Ａ＝アデニン、
ｍＣ＝５’−メチルシトシン、
Ｇ＝グアニン、
Ｔ＝チミン、
ｅ＝２’−Ｏ−メトキシメチル修飾ヌクレオシド、
ｄ＝２’−デオキシヌクレオシド、及び
ｓ＝ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

【0224】

ある特定の実施形態は、共役基及び以下の式： ｍＣｅｓ ｍＣｅｓ ｍＣｅｓ ｍＣｅｓ ｍＣｅｓ Ｔｄｓ Ｔｄｓ ｍＣｄｓ Ｔｄｓ Ｔｄｓ Ｔｄｓ Ａｄｓ Ｔｄｓ Ａｄｓ Ｇｄｓ ｍＣｅｓ ｍＣｅｓ Ａｅｓ Ｇｅｓ ｍＣｅに従う修飾オリゴヌクレオチドからなる化合物を提供し、ここで
Ａ＝アデニン、
ｍＣ＝５’−メチルシトシン、
Ｇ＝グアニン、
Ｔ＝チミン、
ｅ＝２’−Ｏ−メトキシメチル修飾ヌクレオシド、
ｄ＝２’−デオキシヌクレオシド、及び
ｓ＝ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

【0225】

ある特定の実施形態は、共役基及び以下の式：ｍＣｅｓ Ｇｅｓ Ａｋｓ Ｔｄｓ Ａｄｓ Ｔｄｓ ｍＣｄｓ Ａｄｓ Ｔｄｓ Ｇｄｓ Ａｄｓ Ｔｄｓ Ｔｄｓ ｍＣｋｓ ｍＣｋｓ ｍＣｅに従う修飾オリゴヌクレオチドからなる化合物を提供し、ここで、
Ａ＝アデニン、
ｍＣ＝５’−メチルシトシン、
Ｇ＝グアニン、
Ｔ＝チミン、
ｅ＝２’−Ｏ−メトキシメチル修飾ヌクレオシド、
k＝ｃＥｔ修飾ヌクレオシド、
ｄ＝２’−デオキシヌクレオシド、及び
ｓ＝ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

【0226】

ある特定の実施形態では、共役体基は、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端の修飾オリゴヌクレオチドに連結されている。ある特定の実施形態では、共役体基は、修飾オリゴヌクレオチドの３’末端の修飾オリゴヌクレオチドに連結されている。ある特定の実施形態では、当該共役基は、少なくとも１つのＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）少なくとも２つのＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、または少なくとも３つのＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含む。

【0227】

ある特定の実施形態は、以下の式の化合物を提供する。

【0228】

【化3】

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【0229】

ある特定の実施形態は、以下の式の化合物を提供する。

【0230】

【化4】

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【0231】

ある特定の実施形態は、以下の式の化合物を提供する。

【0232】

【化5】

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【0233】

ある特定の実施形態では、化合物は、本明細書に記載の任意の修飾オリゴヌクレオチドと共役基を含むまたはからそれらからなることができる。ある特定の実施形態では、化合物は、１２〜３０個の連結されたヌクレオシド及び共役基からなる修飾オリゴヌクレオチドを含むまたはそれからなることができ、配列番号３０〜２２２６の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続した核酸塩基配列、及び共役基を有する。

【0234】

ある特定の実施形態では、以下の化学構造を有する化合物は、５’−Ｘを有するＩＳＩＳ ７２１７４４を含むまたはそれから成り、ここでＸは本明細書に記載のＧａｌＮＡｃを含む共役基である。

【0235】

【化6】

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【0236】

ある特定の実施形態では、以下の化学構造を有する化合物は５’−Ｘを有するＩＳＩＳ ５４６２５４を含むまたはそれから成り、ここでＸは本明細書に記載のＧａｌＮＡｃを含む共役基である。

【0237】

【化7】

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【0238】

ある特定の実施形態は、以下の式を含む、またはそれからなる化合物を提供する。

【0239】

【化8】

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【0240】

ある特定の実施形態は、以下の式を含む、またはそれからなる化合物を提供する。

【0241】

【化9】

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【0242】

ある特定の実施形態は、以下の式を含む、またはそれからなる化合物を提供し、ここで、

【0243】

【化10】

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Ｒ^１は-ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３（ＭＯＥ）であり、Ｒ^２はＨであり、またはＲ^１とＲ^２はともに橋を形成し、ここでＲ^１は-Ｏ−であり、Ｒ^２は-ＣＨ_２−、−ＣＨ（ＣＨ_３）−、または−ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、Ｒ^１とＲ^２は、得られる橋が−Ｏ−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_３）−、及び-Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２−
から選択されるように、直接的に連結し、同じ環上のＲ^３とＲ^４の各対について、各環について独立して、Ｒ^３は、Ｈ及び-ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３から選択され、Ｒ^４はＨであり、またはＲ^３とＲ^４は共に橋を形成し、ここでＲ^３は-Ｏ−であり、Ｒ^４は-ＣＨ_２−、−ＣＨ（ＣＨ_３）−、または−ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、Ｒ^３とＲ^４は、得られる橋が−Ｏ−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_３）−、及び-Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２−
から選択されるように、直接的に連結し、
Ｒ^５はＨ及びＣＨ_３から選択され、
Ｚは、Ｓ⁻及びＯ⁻から選択される。

【0244】

ある特定の実施形態は、先行するいずれかの請求項に記載の化合物またはその塩と、医薬上許容される担体または希釈剤の少なくとも１つの化合物を含む組成物を提供する。

【0245】

ある特定の実施形態は、先行する請求項のいずれかの化合物または組成物を、動物に投与することを含む方法を提供する。

【0246】

ある特定の実施形態では、当該動物はヒトである。

【0247】

ある特定の実施形態では、化合物を投与することにより、ＰＫＫ関連疾患、障害または病態を予防、治療または改善する。

【0248】

ある特定の実施形態では、ＰＫＫ関連疾患、障害または病態は、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）、浮腫、血管浮腫、腫脹、目蓋の血管性浮腫、眼球浮腫、黄斑浮腫、脳浮腫、血栓症、塞栓症、血栓塞栓症、深部静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、脳卒中、または梗塞である。

【0249】

ある特定の実施形態は、炎症性疾患または血栓塞栓性疾患を治療するために医薬品の製造するための先行する請求項のいずれかに記載の化合物または組成物の使用を提供する。
アンチセンス化合物

【0250】

オリゴマー化合物として、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチドアナログ、オリゴヌクレオチド模倣物、アンチセンス化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びｓｉＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。オリゴマー化合物は、標的核酸に対して「アンチセンス」であってもよく、これは水素結合を介して標的核酸へのハイブリダイゼーションを受けることができることを意味する。

【0251】

ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、５’から３’方向に書かれた場合、それが標的化された標的核酸の標的セグメントの逆相補体を含む核酸塩基配列を有する。ある特定のそのような実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’から３’方向に書かれた場合、それが標的化された標的核酸の標的セグメントの逆相補体を含む核酸塩基配列を有する。

【0252】

ある特定の実施形態では、ＰＫＫ核酸を標的とするアンチセンス化合物は、長さが１２〜３０のサブユニットである。ある特定の実施形態では、ＰＫＫ核酸を標的とするアンチセンス化合物は、長さが１２〜２５のサブユニットである。ある特定の実施形態では、ＰＫＫ核酸を標的とするアンチセンス化合物は、長さが１２〜２２のサブユニットである。ある特定の実施形態では、ＰＫＫ核酸を標的とするアンチセンス化合物は、長さが１４〜２０のサブユニットである。ある特定の実施形態では、ＰＫＫ核酸を標的とするアンチセンス化合物は、長さが１５〜２５のサブユニットである。ある特定の実施形態では、ＰＫＫ核酸を標的とするアンチセンス化合物は、長さが１８〜２２のサブユニットである。ある特定の実施形態では、ＰＫＫ核酸を標的とするアンチセンス化合物は、長さが１９〜２１のサブユニットである。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、長さが８〜８０、１２〜５０、１３〜３０、１３〜５０、１４〜３０、１４〜５０、１５〜３０、１５〜５０、１６〜３０、１６〜５０、１７〜３０、１７〜５０、１８〜３０、１８〜５０、１９〜３０、１９〜５０、または２０〜３０の連結されたサブユニットである。

【0253】

ある特定の実施形態では、ＰＫＫ核酸を標的とするアンチセンス化合物は、長さが１２のサブユニットである。ある特定の実施形態では、ＰＫＫ核酸を標的とするアンチセンス化合物は、長さが１３のサブユニットである。ある特定の実施形態では、ＰＫＫ核酸を標的とするアンチセンス化合物は、長さが１４のサブユニットである。ある特定の実施形態では、ＰＫＫ核酸を標的とするアンチセンス化合物は、長さが１５のサブユニットである。ある特定の実施形態では、ＰＫＫ核酸を標的とするアンチセンス化合物は、長さが１６のサブユニットである。ある特定の実施形態では、ＰＫＫ核酸を標的とするアンチセンス化合物は、長さが１７のサブユニットである。ある特定の実施形態では、ＰＫＫ核酸を標的とするアンチセンス化合物は、長さが１８のサブユニットである。ある特定の実施形態では、ＰＫＫ核酸を標的とするアンチセンス化合物は、長さが１９のサブユニットである。ある特定の実施形態では、ＰＫＫ核酸を標的とするアンチセンス化合物は、長さが２０のサブユニットである。ある特定の実施形態では、ＰＫＫ核酸を標的とするアンチセンス化合物は、長さが２１のサブユニットである。ある特定の実施形態では、ＰＫＫ核酸を標的とするアンチセンス化合物は、長さが２２のサブユニットである。ある特定の実施形態では、ＰＫＫ核酸を標的とするアンチセンス化合物は、長さが２３のサブユニットである。ある特定の実施形態では、ＰＫＫ核酸を標的とするアンチセンス化合物は、長さが２４のサブユニットである。ある特定の実施形態では、ＰＫＫ核酸を標的とするアンチセンス化合物は、長さが２５のサブユニットである。ある特定の実施形態では、ＰＫＫ核酸を標的とするアンチセンス化合物は、長さが２６のサブユニットである。ある特定の実施形態では、ＰＫＫ核酸を標的とするアンチセンス化合物は、長さが２７のサブユニットである。ある特定の実施形態では、ＰＫＫ核酸を標的とするアンチセンス化合物は、長さが２８のサブユニットである。ある特定の実施形態では、ＰＫＫ核酸を標的とするアンチセンス化合物は、長さが２９のサブユニットである。ある特定の実施形態では、ＰＫＫ核酸を標的とするアンチセンス化合物は、長さが３０のサブユニットである。ある特定の実施形態では、ＰＫＫ核酸を標的とするアンチセンス化合物は、長さが３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、または８０、または上記の２つ値のいずれかによって定義される範囲のの連結されたサブユニットである。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、連結されたサブユニットは、ヌクレオシドである。

【0254】

ある特定の実施形態では、ＰＫＫ核酸を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドが短縮または切断されていてもよい。単一のサブユニットを５’端から欠失させるか（５’切断）、あるいは３’端から欠失させること（３’切断）ができる。ＰＫＫ核酸を標的とする短縮型または切断型アンチセンス化合物は、アンチセンス化合物の５’端から２つのサブユニットが欠失しているか、あるいは３’端から２つのサブユニットが欠失していてもよい。あるいは、欠失したヌクレオシドは、アンチセンス化合物全体に分散していてもよい（例えば１つのヌクレオチドが５’端から欠失し１つのヌクレオシドが３’端から欠失しているアンチセンス化合物）。

【0255】

延長されたアンチセンス化合物中に単一の追加サブユニットが存在する場合、当該追加サブユニットはアンチセンス化合物の５’端にあっても、３’端にあってもよい。２つ以上のサブユニットが存在する場合、追加されたサブユニットは互いに隣り合っていてもよい（例えば２つのサブユニットがアンチセンス化合物の５’端に付加されているか（５’付加）、あるいは３’端に付加されている（３’付加）アンチセンス化合物）。あるいは、付加されたサブユニットは、アンチセンス化合物全体に分散していてもよい（例えば１つのサブユニットが５’端に付加され、１つのサブユニットが３’端に付加されているアンチセンス化合物）。

【0256】

活性を排除することなく、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのアンチセンス化合物の長さを増加しもしくは減少させ、かつ／またはミスマッチ塩基を導入することができる。例えばＷｏｏｌｆら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７３０５−７３０９，１９９２）では、１３〜２５核酸塩基長の一連のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、標的ＲＮＡの切断を誘導するその能力について、卵母細胞注入モデルで試験された。アンチセンスオリゴヌクレオチドの末端近くに８個または１１個のミスマッチ塩基を含む２５核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ミスマッチを含まないアンチセンスオリゴヌクレオチドほどではなかったものの、標的ｍＲＮＡの特異的切断を指示することができた。また、標的特異的切断が、１３核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチド（１つまたは３つのミスマッチを持つものを含む）を使って達成された。

【0257】

Ｇａｕｔｓｃｈｉら（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９３：４６３−４７１，Ｍａｒｃｈ ２００１）は、ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡに対して１００％の相補性を有し、かつｂｃｌ−ｘＬ ｍＲＮＡに対して３つのミスマッチを有するオリゴヌクレオチドが、インビトロ及びインビボでｂｃｌ−２とｂｃｌ−ｘＬの発現をどちらも低減できることを実証した。さらにまた、このオリゴヌクレオチドはインビボで強力な抗腫瘍活性も示した。

【0258】

ＭａｈｅｒとＤｏｌｎｉｃｋ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１６：３３４１−３３５８，１９８８）は、一連のタンデム１４核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチド、ならびにそれぞれ２つまたは３つの当該タンデムアンチオリゴヌクレオチドの配列で構成される２８核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチド及び４２核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドを、ヒトＤＨＦＲの翻訳を停止させるその能力について、ウサギ網状赤血球アッセイで試験した。３つの１４核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドのそれぞれは単独で、２８核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは４２核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドよりもレベルは低かったものの、翻訳を阻害することができた。

【0259】

アンチセンス化合物モチーフ
ある特定の実施形態では、ＰＫＫ核酸を標的とするアンチセンス化合物が、強化された阻害活性、標的核酸に対する増加した結合アフィニティ、またはｉｎ ｖｉｖｏヌクレアーゼによる分解に対する耐性などといった性質が当該アンチセンス化合物に付与されるようなパターンまたはモチーフで配置された化学修飾サブユニットを有する。

【0260】

キメラアンチセンス化合物は、典型的には、ヌクレアーゼ分解に対する増加した耐性、増加した細胞取り込み、標的核酸に対する増加した結合アフィニティ、及び／または増加した阻害活性が付与されるように修飾された少なくとも１つの領域を含有する。キメラアンチセンス化合物の第２の領域は、任意でＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼＲＮａｓｅ Ｈの基質として役立ててもよい。

【0261】

ギャップマーモチーフを有するアンチセンス化合物は、キメラアンチセンス化合物と考えられる。ギャップマーでは、ＲＮａｓｅＨ切断を支持する複数のヌクレオチドを有する内側領域が、内側領域のヌクレオシドとは化学的に異なる複数のヌクレオチドを有する外側領域の間に配置されている。ギャップマーモチーフを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合、ギャップセグメントは一般にエンドヌクレアーゼ切断の基質として役立ち、一方、ウイングセグメントは修飾ヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態では、ギャップマーの領域が、個々の異なる領域を構成する糖部分のタイプによって区別される。ギャップマーの領域を区別するために使用される糖部分のタイプとして、いくつかの実施形態では、β−Ｄ−リボヌクレオシド、β−Ｄ−デオキシリボヌクレオシド、２’−修飾ヌクレオシド（そのような２’−修飾ヌクレオシドとして、例えば２’−ＭＯＥや２’−Ｏ−ＣＨ_３などを挙げることができる）、及び二環式糖修飾ヌクレオシド（そのような二環式糖修飾ヌクレオシドとして４’−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−２’橋（ここでｎ＝１またはｎ＝２）及び４’−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−２’）を有するものを挙げることができる）が挙げられる。ある特定の実施形態では、ウイングはいくつかの修飾糖部分、例えば２’−ＭＯＥを含んでもよい。ある特定の実施形態では、ウイングはいくつかの修飾糖部分と無修飾糖部分を含んでもよい。ある特定の実施形態では、ウイングは、２’−ＭＯＥヌクレオシド及び２’−デオキシヌクレオシドの様々な組合せを含んでもよい。

【0262】

異なる領域は、それぞれ一様な糖部分を含むか、異なった糖部分を含むか、または交互に並んだ糖部分を含みうる。ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、しばしば「Ｘ−Ｙ−Ｚ」と記載されるが、この場合、「Ｘ」は５’−ウイングの長さを表し、「Ｙ」はギャップの長さを表し、「Ｚ」は３’−ウイングの長さを表す。「Ｘ」と「Ｚ」は、一様な糖部分を含むか、異なった糖部分を含むか、または交互に並んだ糖部分を含みうる。ある特定の実施形態では、「Ｘ」と「Ｙ」が、２つ以上の２’−デオキシヌクレオシドを含みうる。「Ｙ」は２’−デオキシヌクレオシドを含みうる。本明細書において、「Ｘ−Ｙ−Ｚ」と記述されるギャップマーは、ギャップが５’−ウイング及び３’−ウイングのそれぞれと直接隣り合って配置されるような構成を有する。したがって、５’−ウイングとギャップの間にも、ギャップと３’−ウイングの間にも、介在ヌクレオチドは存在しない。本明細書に記載するアンチセンス化合物はいずれもギャップマーモチーフを有することができる。ある特定の実施形態では、「Ｘ」と「Ｚ」が同じであり、別の実施形態では、それらが異なる。

【0263】

ある特定の実施形態において、本明細書で提供されるギャップマーは、例えば、５−１０−５のモチーフを有する２０量体を含む。

【0264】

標的核酸、標的領域及びヌクレオチド配列
ヒト血漿プレカリクレイン（ＰＫＫ）をコードするヌクレオチド配列は、限定されないが、ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＮＭ＿０００８９２．３（配列番号１として本明細書に組み込まれる）、ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号：ＤＣ４１２９８４．１（配列番号２として本明細書に組み込まれる）、ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号：ＣＮ２６５６１２．１（配列番号３として本明細書に組み込まれる）、ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＡＫ２９７６７２．１（配列番号４として本明細書に組み込まれる）、ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＤＣ４１３３１２．１（配列番号５として本明細書に組み込まれる）、ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＡＶ６８８８５８．２（配列番号６として本明細書に組み込まれる）、ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号：ＣＤ６５２０７７．１（配列番号７として本明細書に組み込まれる）、ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＢＣ１４３９１１．１（配列番号８として本明細書に組み込まれる）、ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＣＢ１６２５３２．１（配列番号９として本明細書に組み込まれる）、核酸塩基１１１６９３００１から１１１７３００００まで切り捨てられたＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＮＴ＿０１６３５４．１９、（配列番号１０として本明細書に組み込まれる）、ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＮＭ＿００８４５５．２（配列番号１１として本明細書に組み込まれる）、ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＢＢ５９８６７３．１（配列番号１２として本明細書に組み込まれる）、核酸塩基６１１４００１から６１４４０００まで切り捨てられたＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＮＴ＿０３９４６０．７（配列番号１３として本明細書に組み込まれる）、ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＮＭ＿０１２７２５．２（配列番号１４として本明細書に組み込まれる）、核酸塩基１０９５２００１から１０９８２０００ まで切り捨てられたＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＮＷ＿０４７４７３．１（配列番号１５として本明細書に組み込まれる）、ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＸＭ＿００２８０４２７６．１（配列番号１７として本明細書に組み込まれる）、及び核酸塩基２３５８０００から２３９１０００まで切り捨てられたＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＮＷ＿００１１１８１６７．１（配列番号１８として本明細書に組み込まれる）である。

【0265】

本明細書に含まれる実施例の各配列番号に記載される配列は、糖部分への修飾、ヌクレオシド間結合、または核酸塩基に対する任意の修飾に依存しないことが理解される。したがって、配列番号によって定義されたアンチセンス化合物は、独立して、糖部分への１つ以上の修飾、ヌクレオシド間結合、または核酸塩基を含むことができる。Ｉｓｉｓ番号（Ｉｓｉｓ Ｎｏ）によって定義されるアンチセンス化合物は、核酸塩基配列及びモチーフの組み合わせを示す。

【0266】

ある特定の実施形態では、標的領域は、標的核酸の構造的に定義された領域である。例えば、標的領域は、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、エクソン、イントロン、エクソン／イントロン接合部、コーディング領域、翻訳開始領域、翻訳終結領域、または他の定義された核酸領域を含んでいてもよい。ＰＫＫの構造的に定義された領域は、ＮＣＢＩ等の配列データベースからの寄託番号によって得ることができ、そのような情報は、参照により本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態では、標的領域は、標的領域内の１つの標的セグメントの５’標的部位から、同一の標的領域内の別の標的セグメントの３’標的部位までの配列を含んでいてもよい。

【0267】

標的化は、所望の効果が生じるように、アンチセンス化合物がハイブリダイズする少なくとも１つの標的セグメントの決定を含む。ある特定の実施形態では、所望の効果は、ｍＲＮＡ標的核酸レベルの減少である。ある特定の実施形態では、所望の効果は、標的核酸または標的核酸に関連する表現型の変化によりコードされるタンパク質のレベルの減少である。

【0268】

標的領域は、２つ以上の標的セグメントを含んでいてもよい。標的領域内の複数の標的セグメントは重複してもよい。あるいは、重複していなくてもよい。ある特定の実施形態では、標的領域内の標的セグメントは、約３００個を超えないヌクレオチドにより分離される。ある特定の実施形態では、標的領域内の標的セグメントは、いくつかのヌクレオチドによって分離され、すなわち、標的核酸上の約２５０、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、もしくは１０個のヌクレオチド、２５０、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、もしくは１０個を超えないヌクレオチド、約２５０、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、もしくは１０個を超えないヌクレオチド、または前述値のいずれか２つによって定義される範囲のヌクレオチドで分離される。ある特定の実施形態では、標的領域内の標的セグメントは、標的核酸上で、５個を超えないヌクレオチド、または約５個を超えないヌクレオチドで分離される。ある特定の実施形態では、標的セグメントは連続する。本明細書に挙げる５’標的部位または３’標的部位のいずれかである開始核酸を有する範囲によって定義される標的領域が企図される。

【0269】

適切な標的セグメントは、５’ＵＴＲ、コーディング領域、３’ＵＴＲ、イントロン、エクソン、またはエクソン／イントロン接合内に見出すことができる。開始コドンまたは終止コドンを含む標的セグメントも、適切な標的セグメントである。適切な標的セグメントは、特に、開始コドンまたは終始コドン等の、ある特定の構造的に定義された領域を除外してもよい。

【0270】

適切な標的セグメントの決定は、ゲノム全体にわたって、標的核酸の配列と他の配列との比較を含むことができる。例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、異なる核酸間の類似性の領域を特定するために使用することができる。この比較により、選択された標的核酸（すなわち、非標的またはオフターゲット配列）以外の配列に非特異的にハイブリダイズし得るアンチセンス化合物配列を選択することを防ぐことができる。

【0271】

活性標的領域内のアンチセンス化合物の（例えば、標的核酸レベルの減少率によって定義されているように）活性の変化があり得る。ある特定の実施形態では、ＰＫＫ ｍＲＮＡレベルの減少は、ＰＫＫ発現の阻害の指標となる。ＰＫＫタンパク質のレベルの減少も、標的ｍＲＮＡ発現の阻害の指標となる。さらに、表現型の変化は、ＰＫＫ発現の阻害の指標となる。例えば、低減または予防された炎症は、ＰＫＫ発現の阻害の指標となる。別の例では、低減または予防された浮腫／腫脹は、ＰＫＫ発現の阻害の指標となる。別の例では、低減または予防された血管透過性は、ＰＫＫ発現の阻害の指標となりうる。別の例では、低減または予防された血管漏出はＰＫＫ発現の阻害の指標となりうる。ある特定の実施形態では、血管透過性は、エバンスブルー等の色素の定量化によって測定する。

【0272】

ハイブリタイゼーション
いくつかの実施形態では、本明細書に開示するアンチセンス化合物と標的核酸との間でハイブリダイゼーションが起こる。最もよくあるハイブリダイゼーションの機序は、核酸分子の相補的核酸塩基間での水素結合形成（例えばワトソン−クリック型、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型水素結合形成）を必要とする。

【0273】

ハイブリダイゼーションは、さまざまな条件下で起こりうる。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、ハイブリダイズさせようとする核酸分子の性質及び組成によって決まる。

【0274】

ある配列が標的核酸に特異的にハイブリダイズすることができるかどうかを決定する方法は、当技術分野では周知である。ある特定の実施形態において、ここに提供するアンチセンス化合物は、標的核酸と特異的にハイブリダイズすることができる。

【0275】

相補性
アンチセンス化合物の十分な数の核酸塩基が、所望の効果（例えばＰＫＫ核酸などの標的核酸のアンチセンス阻害）が生じるような形で、標的核酸の対応する核酸塩基と水素結合することができるのであれば、そのアンチセンス化合物と標的核酸とは互いに相補的である。

【0276】

アンチセンス化合物が依然として標的核酸に特異的にハイブリダイズできるのであれば、アンチセンス化合物とＰＫＫ核酸の間の非相補的核酸塩基は許容されうる。さらにまた、アンチセンス化合物は、介在セグメントまたは隣接セグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないような形で、ＰＫＫ核酸の２つ以上のセグメントにハイブリダイズしてもよい（例えばループ構造、ミスマッチ、またはヘアピン構造）。

【0277】

ある特定の実施形態において、ここに提供するアンチセンス化合物またはその指定部分は、ＰＫＫ核酸、その標的領域、標的セグメント、または指定部分に対して、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相同であるか、または少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相同である。標的核酸に対するアンチセンス化合物の相補性パーセントは、常法を使って決定することができる。

【0278】

例えば、アンチセンス化合物の２０核酸塩基中１８核酸塩基が標的領域に相補的であり、それゆえに特異的にハイブリダイズするであろうアンチセンス化合物は、９０パーセントの相補性に相当するであろう。この例では、残りの非相補的核酸塩基は一かたまりになって存在してもよいし、相補的核酸塩基の間に点在していてもよく、互いに連続している必要も、相補的核酸塩基と連続している必要もない。したがって、標的核酸と完全に相補的な２つの領域に挟まれた４つの非相補的核酸塩基を有する１８核酸塩基長のアンチセンス化合物は、標的核酸に対して７７．８％の総相補性を有し、したがって本発明の範囲に包含されるであろう。標的核酸の一領域に対するアンチセンス化合物の相補性パーセントは、当技術分野において知られているＢＬＡＳＴプログラム（ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）及びＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １９９０， ２１５， ４０３ ４１０； Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．， １９９７， ７， ６４９ ６５６）を使って、ルーチンに決定することができる。相同性パーセント、配列同一性パーセントまたは配列相補性パーセントは、例えばＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２ ４８９）を使用するＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，ウィスコンシン州マディソン、ユニバーシティ・リサーチ・パーク）により、デフォルト設定を使って決定することができる。

【0279】

ある特定の実施形態では、ここに提供するアンチセンス化合物またはその指定部分が、標的核酸またはその指定部分に完全に相補的（すなわち１００％相補的）である。例えばアンチセンス化合物は、血漿プレカリクレイン核酸、またはその標的領域、または標的セグメントもしくは標的配列に完全に相補的でありうる。本明細書にいう「完全に相補的」とは、アンチセンス化合物の各核酸塩基が、標的核酸の対応する核酸塩基と正確に塩基対合する能力を有することを意味する。例えば２０核酸塩基アンチセンス化合物は、そのアンチセンス化合物に完全に相補的な対応する２０核酸塩基部分が標的核酸中に存在するのであれば、４００核酸塩基長の標的配列に対して完全に相補的である。第１及び／または第２核酸の指定部分に関して完全に相補的という表現を使用することもできる。例えば３０核酸塩基アンチセンス化合物の２０核酸塩基部分は、４００核酸塩基長の標的配列に対して「完全に相補的」であることができる。３０核酸塩基オリゴヌクレオチドの２０核酸塩基部分は、標的配列が対応する２０核酸塩基部分（その各核酸塩基がアンチセンス化合物の当該２０核酸塩基部分に相補的であるもの）を有するのであれば、標的配列に対して完全に相補的である。同時に、当該３０核酸塩基アンチセンス化合物全体は、当該アンチセンス化合物の残りの１０核酸塩基も標的配列に相補的であるかどうかに依存して、標的配列に対して完全に相補的である場合も、そうでない場合もある。

【0280】

非相補的核酸塩基の場所はアンチセンス化合物の５’端または３’端であることができる。あるいは、１つまたは複数の非相補的核酸塩基が、アンチセンス化合物の内部位置にあってもよい。２つ以上の非相補的核酸塩基が存在する場合、それらは連続して（すなわち連結されて）いてもよいし、不連続であってもよい。一実施形態では、非相補的核酸塩基が、ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドのウイングセグメント中にある。

【0281】

ある特定の実施形態において、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０核酸塩基長のアンチセンス化合物または１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０核酸塩基長までのアンチセンス化合物が、標的核酸またはその指定部分との比較で含む非相補的核酸塩基は、４つ以下、３つ以下、２つ以下、または１つ以下である。

【0282】

ある特定の実施形態において、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０核酸塩基長のアンチセンス化合物または１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０核酸塩基長までのアンチセンス化合物が、標的核酸またはその指定部分との比較で含む非相補的核酸塩基は、６つ以下、５つ以下、４つ以下、３つ以下、２つ以下、または１つ以下である。

【0283】

ここに提供するアンチセンス化合物には、標的核酸の一部分に相補的なものも含まれる。ここでいう「一部分」とは、標的核酸の一領域または一セグメント内の所定の数の連続する（すなわち連結された）核酸塩基を指す。「一部分」は、アンチセンス化合物の、所定の数の連続する核酸塩基も意味しうる。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物が、ある標的セグメントの少なくとも８核酸塩基部分に相補的である。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物が、ある標的セグメントの少なくとも９核酸塩基部分に相補的である。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物が、ある標的セグメントの少なくとも１０核酸塩基部分に相補的である。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物が、ある標的セグメントの少なくとも１１核酸塩基部分に相補的である。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物が、ある標的セグメントの少なくとも１２核酸塩基部分に相補的である。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物が、ある標的セグメントの少なくとも１３核酸塩基部分に相補的である。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物が、ある標的セグメントの少なくとも１４核酸塩基部分に相補的である。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物が、ある標的セグメントの少なくとも１５核酸塩基部分に相補的である。ある標的セグメントの少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０核酸塩基部分もしくはそれ以上の核酸塩基部分、またはこれらの値のうちの任意の２つによって画定される範囲に相補的な、アンチセンス化合物も考えられる。

【0284】

同一性
ここに提供するアンチセンス化合物は、ある特定ヌクレオチド配列、配列番号、もしくは具体的Ｉｓｉｓ番号によって表される化合物、またはその一部分に対して、所定の同一性パーセントも有しうる。本明細書にいうアンチセンス化合物は、それが同じ核酸塩基対合能を有するのであれば、本明細書に開示する配列と同一である。例えば、ウラシルとチミジンはどちらもアデニンと対合するので、開示したＤＮＡ配列中のチミジンの代わりにウラシルを含有するＲＮＡは、当該ＤＮＡ配列と同一であるとみなされるであろう。本明細書に記載するアンチセンス化合物の短縮型及び延長型、ならびにここに提供するアンチセンス化合物と比較して非同一塩基を有する化合物も考えられる。非同一塩基は互いに隣り合っていてもよいし、アンチセンス化合物全体に散在していてもよい。アンチセンス化合物のパーセント同一性は、比較対象である配列との比較で同一塩基対合を有する塩基の数に従って計算される。

【0285】

ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物またはその一部分が、本明細書に開示するアンチセンス化合物、配列番号、またはその一部分の２つ以上と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。

【0286】

ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物の一部分を、標的核酸のうちの長さが等しい部分と比較する。ある特定の実施形態では、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５核酸塩基部分を、標的核酸のうちの長さが等しい部分と比較する。

【0287】

ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの一部を、標的核酸のうちの長さが等しい部分と比較する。ある特定の実施形態では、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５核酸塩基部分を、標的核酸のうちの長さが等しい部分と比較する。

【0288】

修飾
ヌクレオシドは塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの核酸塩基（塩基ともいう）部分は、通常、複素環式塩基部分である。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合で連結されたリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドの場合は、リン酸基を、糖の２’、３’または５’ヒドロキシル部分に連結することができる。オリゴヌクレオチドは、互いに隣り合うヌクレオシドを共有結合で連結して、線状ポリマー状のオリゴヌクレオチドを形成させることによって形成される。オリゴヌクレオチド構造内では、リン酸基は、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間連結部を形成していると、一般に言われる。

【0289】

アンチセンス化合物の修飾には、ヌクレオシド間連結部、糖部分、または核酸塩基の置換または改変が包含される。修飾アンチセンス化合物は、例えば強化された細胞取り込み、核酸標的に対する強化されたアフィニティ、ヌクレアーゼの存在下での増加した安定性、増加した阻害活性などといった望ましい性質ゆえに、ネイティブ型より好ましいことが多い。

【0290】

化学修飾ヌクレオシドは、短縮型または切断型アンチオリゴヌクレオチドの、その標的核酸に対する結合アフィニティを増加させるために使用することもできる。結果として、そのような化学修飾ヌクレオシドを有する短いアンチセンス化合物で、匹敵する結果を得ることができる場合が多い。

【0291】

修飾ヌクレオシド間連結部
ＲＮＡ及びＤＮＡの天然に存在するヌクレオシド間連結部は、３’→５’ホスホジエステル連結部である。２つ以上の修飾（すなわち天然に存在しない）ヌクレオシド間連結部を有するアンチセンス化合物は、例えば強化された細胞取り込み、核酸標的に対する強化されたアフィニティ、及びヌクレアーゼの存在下での増加した安定性などといった望ましい性質ゆえに、天然に存在するヌクレオシド間連結部を有するアンチセンス化合物よりも選択されることが多い。

【0292】

修飾ヌクレオシド間連結部を有するオリゴヌクレオチドには、リン原子が保たれているヌクレオシド間連結部と、リン原子を有さないヌクレオシド間連結部とが含まれる。代表的なリン含有ヌクレオシド間連結部には、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホラミデート、及びホスホロチオエートが含まれるが、これらに限定されない。リン含有連結部及び非リン含有連結部を調製する方法は、よく知られている。

【0293】

ある特定の実施形態では、血漿プレカリクレイン核酸を標的とするアンチセンス化合物が、２つ以上の修飾ヌクレオシド間連結部を含む。ある特定の実施形態では、修飾ヌクレオシド間連結部がホスホロチオエート連結部である。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物の各ヌクレオシド間連結部がホスホロチオエートヌクレオシド間連結部である。

【0294】

ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドが、当該オリゴヌクレオチドまたはその一領域に沿って、所定のパターンまたは修飾ヌクレオシド間連結部モチーフで配置された修飾ヌクレオシド間連結部を含む。ある特定の実施形態では、ヌクレオシド間連結部が、ギャップモチーフ（ｇａｐｐｅｄ ｍｏｔｉｆ）で配置される。そのような実施形態では、２つのウイング領域のそれぞれにあるヌクレオシド間連結部が、ギャップ領域中のヌクレオシド間連結部とは異なる。ある特定の実施形態では、ウイング中のヌクレオシド間連結部はホスホジエステルであり、ギャップ中のヌクレオシド間連結部はホスホロチオエートである。ヌクレオシドモチーフは独立して選択されるので、ギャップヌクレオシド間連結部モチーフを有するオリゴヌクレオチドは、ギャップヌクレオシ モチーフを有しても有さなくてもよく、ギャップヌクレオシドモチーフを有する場合、ウイング長とギャップ長は同じであっても同じでなくてもよい。

【0295】

ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドが、交互ヌクレオシド間連結部モチーフを有する領域を含む。ある特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドが、一様に修飾されたヌクレオシド間連結部の一領域を含む。特定のそのような実施形態では、オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部によって一様に連結された領域を含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエートによって一様に連結されている。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間連結部が、ホスホジエステル及びホスホロチオエートから選択される。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間連結部がホスホジエステル及びホスホロチオエートから選択され、少なくとも１つのヌクレオシド間連結部がホスホロチオエートである。

【0296】

ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドが、少なくとも６つのホスホロチオエートヌクレオシド間連結部を含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドが少なくとも８つのホスホロチオエートヌクレオシド間連結部を含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドが少なくとも１０個のホスホロチオエートヌクレオシド間連結部を含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドが少なくとも６つの連続するホスホロチオエートヌクレオシド間連結部のブロックを少なくとも１つは含む。 ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドが少なくとも８つの連続するホスホロチオエートヌクレオシド間連結部のブロックを少なくとも１つは含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドが少なくとも１０個の連続するホスホロチオエートヌクレオシド間連結部のブロックを少なくとも１つは含む。 ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドが少なくとも１２個の連続するホスホロチオエートヌクレオシド間連結部のブロックを少なくとも１つは含む。 ある特定のそのような実施形態では、少なくとも１つの上述のブロックが、オリゴヌクレオチドの３’端に位置する。ある特定のそのような実施形態では、少なくとも１つの上述のブロックがオリゴヌクレオチドの３’端から３ヌクレオシド以内に位置する。

【0297】

ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドが、２つ以上のメチルホスホネート連結部を含む。ある特定の実施形態では、ギャップマーヌクレオシドモチーフを有するオリゴヌクレオチドが、１つまたは２つのメチルホスホネート連結部を除くすべてがホスホロチオエート連結部である連結部モチーフを含む。ある特定の実施形態では、１つのメチルホスホネート連結部が、ギャップマーヌクレオシドモチーフを有するオリゴヌクレオチドの中央のギャップ中にある。

【0298】

ある特定の実施形態では、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部とホスホジエステルヌクレオシド間連結部の数を、ヌクレアーゼ耐性が維持されるように定めることが望ましい。ある特定の実施形態では、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部の数と位置及びホスホジエステルヌクレオシド間連結部の数と位置を、ヌクレアーゼ耐性が維持されるように定めることが望ましい。ある特定の実施形態では、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部を減少させ、かつホスホジエステルヌクレオシド間連結部の数を増加させることができる。 ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼ耐性を維持したまま、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部の数を減少させ、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部を増加させることができる。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼ耐性を保ったまま、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部の数を減少させることが望ましい。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼ活性を保ったまま、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部の数を増加させることが望ましい。

【0299】

修飾糖部分
アンチセンス化合物は、場合によっては、糖基が修飾されているヌクレオシドを２つ以上含有しうる。そのような糖修飾ヌクレオシドは、強化されたヌクレアーゼ安定性、増加した結合アフィニティ、または他の何らかの有益な生物学的性質を、アンチセンス化合物に付与しうる。ある特定の実施形態では、ヌクレオシドが化学修飾リボフラノース環部分を含む。化学修飾リボフラノース環の例には、置換基の付加（５’置換基、２’置換基、非ジェミナル環原子の橋による二環式核酸（ＢＮＡ）の形成、Ｓ、Ｎ（Ｒ）、またはＣ（Ｒ_１）（Ｒ_２）（Ｒ、Ｒ_１及びＲ_２は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_１２アルキルまたは保護基である）によるリボシル環酸素原子の置き換え、及びそれらの組み合わせなどがあるが、これらに限定されない。化学修飾糖の例としては、２’−Ｆ−５’−メチル置換ヌクレオシド（開示されている他の５’，２’−ビス置換ヌクレオシドについては、ＰＣＴ国際出願ＷＯ２００８／１０１１５７（公開日２００８年８月２１日）を参照されたい）、またはＳによるリボシル環酸素原子の置き換えと２’位におけるさらなる置換（米国特許出願公開ＵＳ２００５−０１３０９２３（公開日２００５年６月１６日）参照）、あるいはＢＮＡの５’−置換（ＰＣＴ国際出願ＷＯ２００７／１３４１８１（公開日２００７年１１月２２日）参照、この場合はＬＮＡが例えば５’−メチル基または５’−ビニル基で置換されている）などがある。

【0300】

修飾糖部分を有するヌクレオシドの例には、５’−ビニル、５’−メチル（ＲまたはＳ）、４’−Ｓ、２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ_３、２’−ＯＣＨ_２ＣＨ_３、２’−ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｆ及び２’−Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＣＨ_３置換基を含むヌクレオシドがあるが、これらに限定されない。２’位の置換基は、アリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ_１−Ｃ_１０アルキル、ＯＣＦ_３、ＯＣＨ_２Ｆ、Ｏ（ＣＨ_２）_２ＳＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_２−Ｏ−Ｎ（Ｒ_ｍ）（Ｒ_ｎ）、Ｏ−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ_ｍ）（Ｒ_ｎ）、及びＯ−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ_ｌ）−（ＣＨ_２）_２−Ｎ（Ｒ_ｍ）（Ｒ_ｎ）から選択することもできる（ここで、各Ｒ_ｌ、Ｒ_ｍ及びＲ_ｎは、独立して、Ｈまたは置換もしくは無置換Ｃ_１−Ｃ_１０アルキルである）。

【0301】

本明細書にいう「二環式ヌクレオシド」とは、二環式糖部分を含む修飾ヌクレオシドを指す。二環式ヌクレオシドの例には、４’リボシル環原子と２’リボシル環原子の間に橋を含むヌクレオシドなどがあるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、ここに提供するアンチセンス化合物が、４’→２’橋を含む二環式ヌクレオシドを２つ以上含む。そのような４’→２’架橋二環式ヌクレオシドの例として、次式の一つが挙げられるが、これらに限定されない：４’−（ＣＨ_２）−Ｏ−２’（ＬＮＡ）、４’−（ＣＨ_２）−Ｓ−２’、４’−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−２’（ＥＮＡ）、４’−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｏ−２’（拘束エチルまたはｃＥｔともいう）及び４’−Ｃ−Ｈ（ＣＨ_２ＯＣＨ_３）−Ｏ−２’（及びその類似体、２００８年７月１５日発行の米国特許第７，３９９，８４５号参照）、４’−Ｃ（ＣＨ_３）（ＣＨ_３）−Ｏ−２’（及びその類似体、国際出願公開ＷＯ２００９／００６４７８（公開日２００９年１月８日）参照）；４’−ＣＨ_２−Ｎ（ＯＣＨ_３）−２’（及びその類似体、国際出願公開ＷＯ／２００８／１５０７２９（公開日２００８年１２月１１日）参照）、４’−ＣＨ_２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ_３）−２’（米国特許出願公開ＵＳ２００４−０１７１５７０（公開日２００４年９月２日）参照）、４’−ＣＨ_２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’（式中、Ｒは、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_１２アルキル、または保護基である）（２００８年９月２３日発行の米国特許７，４２７，６７２号参照）、４’−ＣＨ_２−Ｃ−（Ｈ）（ＣＨ_３）−２’（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００９，７４，１１８−１３４参照）、及び４’−ＣＨ_２−Ｃ−（＝ＣＨ_２）−２’（及びその類似体、国際出願公開ＷＯ ２００８／１５４４０１（公開日２００８年１２月８日）参照）。

【0302】

公表された文献には二環式ヌクレオシドに関する他の報告文も見いだすことができる（例えばＳｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８，４，４５５−４５６；Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４，３６０７−３６３０；Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０００，９７，５６３３−５６３８；Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９８，８，２２１９−２２２２；Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，６３，１００３５−１００３９；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００７，１２９（２６）８３６２−８３７９；Ｅｌａｙａｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ，２００１，２，５５８−５６１；Ｂｒａａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００１，８，１−７；及びＯｒｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２００１，３，２３９−２４３；米国特許第６，２６８，４９０号；同第６，５２５，１９１号；同第６，６７０，４６１号；同第６，７７０，７４８号；同第６，７９４，４９９号；同第７，０３４，１３３号；同第７，０５３，２０７号；同第７，３９９，８４５号；同第７，５４７，６８４号；及び同第７，６９６，３４５号；米国特許出願公開番号ＵＳ２００８−００３９６１８；同ＵＳ２００９−００１２２８１；米国特許出願第６１／０２６，９９５号及び同第６１／０９７，７８７号；ＰＣＴ国際出願公開ＷＯ１９９９／０１４２２６；同ＷＯ２００４／１０６３５６；同ＷＯ２００５／０２１５７０；同ＷＯ２００７／１３４１８１；同ＷＯ２００８／１５０７２９；同ＷＯ２００８／１５４４０１；同ＷＯ２００９／００６４７８；同ＷＯ２０１０／０３６６９８；同ＷＯ２０１１／０１７５２１；同ＷＯ２００９／０６７６４７同ＷＯ２００９／１００３２０参照。前述の二環式ヌクレオシドのそれぞれは、例えばα−Ｌ−リボフラノースとβ−Ｄ−リボフラノースなど、２つ以上の立体化学的糖配置を有するものを調製することができる（１９９９年３月２５日にＷＯ９９／１４２２６として公開されたＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＤＫ９８／００３９３を参照されたい）。

【0303】

ある特定の実施形態では、限定するわけではないが、ＢＮＡヌクレオシドの二環式糖部分として、ペントフラノシル糖部分の４’位と２’位の間に少なくとも１つの橋を有する化合物が挙げられ、その橋は、独立して、−［Ｃ（Ｒ_ａ）（Ｒ_ｂ）］_ｎ−、−Ｃ（Ｒ_ａ）＝Ｃ（Ｒ_ｂ）−、−Ｃ（Ｒ_ａ）＝Ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＲ_ａ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒ_ａ）_２−、−Ｓ（＝Ｏ）_ｘ−、及び−Ｎ（Ｒ_ａ）−から独立して選択される１つの基または２〜４つの連結された基を含み、
式中、
ｘは、０、１、または２であり、
ｎは、１、２、３、または４であり、
各Ｒ_ａ及びＲ_ｂは、独立して、Ｈ、保護基、ヒドロキシル、Ｃ_１−Ｃ_１２アルキル、置換Ｃ_１−Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２−Ｃ_１２アルケニル、置換Ｃ_２−Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_２−Ｃ_１２アルキニル、置換Ｃ_２−Ｃ_１２アルキニル、Ｃ_５−Ｃ_２０アリール、置換Ｃ_５−Ｃ_２０アリール、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ_５−Ｃ_７脂環式ラジカル、置換Ｃ_５−Ｃ_７脂環式ラジカル、ハロゲン、ＯＪ_１、ＮＪ_１Ｊ_２、ＳＪ_１、Ｎ_３、ＣＯＯＪ_１、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、ＣＮ、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）_２−Ｊ_１）、またはスルホキシル（Ｓ（＝Ｏ）−Ｊ_１）であり、かつ
各Ｊ_１及びＪ_２は、独立して、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_１２アルキル、置換Ｃ_１−Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２−Ｃ_１２アルケニル、置換Ｃ_２−Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_２−Ｃ_１２アルキニル、置換Ｃ_２−Ｃ_１２アルキニル、Ｃ_５−Ｃ_２０アリール、置換Ｃ_５−Ｃ_２０アリール、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、Ｃ_１−Ｃ_１２アミノアルキル、置換Ｃ_１−Ｃ_１２アミノアルキルまたは保護基である。

【0304】

ある特定の実施形態では、二環式糖部分の橋が−［Ｃ（Ｒ_ａ）（Ｒ_ｂ）］_ｎ−、−［Ｃ（Ｒ_ａ）（Ｒ_ｂ）］_ｎ−Ｏ−、−Ｃ（Ｒ_ａＲ_ｂ）−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−または−Ｃ（Ｒ_ａＲ_ｂ）−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−である。ある特定の実施形態では、当該橋が、４’−ＣＨ_２−２’、４’−（ＣＨ_２）_２−２’、４’−（ＣＨ_２）_３−２’、４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’、４’−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−２’、４’−ＣＨ_２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’及び４’−ＣＨ_２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’−であり、式中、各Ｒは、独立して、Ｈ、保護基またはＣ_１−Ｃ_１２アルキルである。

【0305】

ある特定の実施形態では、二環式ヌクレオシドが、さらに異性立体配置によって定義される。例えば、４’−２’メチレン−オキシ橋を含むヌクレオシドは、α−Ｌ立体配置またはβ−Ｄ立体配置をとりうる。α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’）ＢＮＡは、以前に、アンチセンスオリゴヌクレオチドに組み込まれており、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドはアンチセンス活性を示した（Ｆｒｉｅｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，２１，６３６５−６３７２）。

【0306】

ある特定の実施形態では、二環式ヌクレオシドとして、以下に図示する（Ａ）α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｂ）β−Ｄ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｃ）エチレンオキシ（４’−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｄ）アミノオキシ（４’−ＣＨ_２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ、（Ｅ）オキシアミノ（４’−ＣＨ_２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’）ＢＮＡ、及び（Ｆ）メチル（メチレンオキシ）（４’−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｇ）メチレン−チオ（４’−ＣＨ_２−Ｓ−２’）ＢＮＡ、（Ｈ）メチレン−アミノ（４’−ＣＨ_２−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ、（Ｉ）メチル炭素環式（４’−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−２’）ＢＮＡ、（Ｊ）プロピレン炭素環式（４’−（ＣＨ_２）_３−２’）ＢＮＡ、及び（Ｋ）ビニルＢＮＡが挙げられるが、これらに限定されない：

【0307】

【化11】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｂｘは塩基部分であり、かつＲは、独立して、Ｈ、保護基、Ｃ_１−Ｃ_１２アルキルまたはＣ_１−Ｃ_１２アルコキシである。

【0308】

ある特定の実施形態では、式Ｉ：

【0309】

【化12】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり、
−Ｑ_ａ−Ｑ_ｂ−Ｑ_ｃ−は、−ＣＨ_２−Ｎ（Ｒ_ｃ）−ＣＨ_２−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ_ｃ）−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｏ−Ｎ（Ｒ_ｃ）−、−ＣＨ_２−Ｎ（Ｒ_ｃ）−Ｏ−または−Ｎ（Ｒ_ｃ）−Ｏ−ＣＨ_２であり、
Ｒ_ｃは、Ｃ_１−Ｃ_１２アルキルまたはアミノ保護基であり、かつ
Ｔ_ａ及びＴ_ｂは、それぞれ独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、共役基、反応性リン基、リン部分または支持媒体への共有結合による取り付けである］
を有する二環式ヌクレオシドが提供される。

【0310】

ある特定の実施形態では、式ＩＩ：

【0311】

【化13】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり、
Ｔ_ａ及びＴ_ｂは、それぞれ独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、共役基、反応性リン基、リン部分または支持媒体への共有結合による取り付けであり、
Ｚ_ａは、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_２−Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２−Ｃ_６アルキニル、置換Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、置換Ｃ_２−Ｃ_６アルケニル、置換Ｃ_２−Ｃ_６アルキニル、アシル、置換アシル、置換アミド、チオールまたは置換チオである］
を有する二環式ヌクレオシドが提供される。

【0312】

一実施形態では、当該置換基のそれぞれが、独立して、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、ＯＪ_ｃ、ＮＪ_ｃＪ_ｄ、ＳＪ_ｃ、Ｎ_３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ_ｃ、及びＮＪ_ｅＣ（＝Ｘ）ＮＪ_ｃＪ_ｄから独立して選択される置換基で一置換または多置換されており、式中、各Ｊ_ｃ、Ｊ_ｄ及びＪ_ｅは、独立して、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、または置換Ｃ_１−Ｃ_６アルキルであり、かつＸは、ＯまたはＮＪ_ｃである。

【0313】

ある特定の実施形態では、式ＩＩＩ：

【0314】

【化14】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり、
Ｔ_ａ及びＴ_ｂは、それぞれ独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、共役基、反応性リン基、リン部分または支持媒体への共有結合による取り付けであり、
Ｚ_ｂは、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_２−Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２−Ｃ_６アルキニル、置換Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、置換Ｃ_２−Ｃ_６アルケニル、置換Ｃ_２−Ｃ_６アルキニルまたは置換アシル（Ｃ（＝Ｏ）−）である］
を有する二環式ヌクレオシドが提供される。

【0315】

ある特定の実施形態では、式ＩＶ：

【0316】

【化15】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり、
Ｔ_ａ及びＴ_ｂは、それぞれ独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、共役基、反応性リン基、リン部分または支持媒体への共有結合による取り付けであり、
Ｒ_ｄは、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、置換Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_２−Ｃ_６アルケニル、置換Ｃ_２−Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２−Ｃ_６アルキニルまたは置換Ｃ_２−Ｃ_６アルキニルであり、
各ｑ_ａ、ｑ_ｂ、ｑ_ｃ及びｑ_ｄは、独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、置換Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_２−Ｃ_６アルケニル、置換Ｃ_２−Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２−Ｃ_６アルキニルまたは置換Ｃ_２−Ｃ_６アルキニル、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシル、置換Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシル、アシル、置換アシル、Ｃ_１−Ｃ_６アミノアルキルまたは置換Ｃ_１−Ｃ_６アミノアルキルである］
を有する二環式ヌクレオシドが提供される。

【0317】

ある特定の実施形態では、式Ｖ：

【0318】

【化16】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり、
Ｔ_ａ及びＴ_ｂは、それぞれ独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、共役基、反応性リン基、リン部分または支持媒体への共有結合による取り付けであり、
ｑ_ａ、ｑ_ｂ、ｑ_ｅ及びｑ_ｆは、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、Ｃ_１−Ｃ_１２アルキル、置換Ｃ_１−Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２−Ｃ_１２アルケニル、置換Ｃ_２−Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_２−Ｃ_１２アルキニル、置換Ｃ_２−Ｃ_１２アルキニル、Ｃ_１−Ｃ_１２アルコキシ、置換Ｃ_１−Ｃ_１２アルコキシ、ＯＪ_ｊ、ＳＪ_ｊ、ＳＯＪ_ｊ、ＳＯ_２Ｊ_ｊ、ＮＪ_ｊＪ_ｋ、Ｎ_３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪ_ｊ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ_ｊＪ_ｋ、Ｃ（＝Ｏ）Ｊ_ｊ、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＪ_ｊＪ_ｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪ_ｊＪ_ｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）−ＮＪ_ｊＪ_ｋまたはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪ_ｊＪ_ｋであるか、または
ｑ_ｅ及びｑ_ｆが全体として＝Ｃ（ｑ_ｇ）（ｑ_ｈ）であり、
ｑ_ｇ及びｑ_ｈは、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ_１−Ｃ_１２アルキルまたは置換Ｃ_１−Ｃ_１２アルキルである］
を有する二環式ヌクレオシドが提供される。

【0319】

メチレンオキシ（４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’）ＢＮＡモノマーであるアデニン、シトシン、グアニン、５−メチル−シトシン、チミン及びウラシルの合成及び調製は、それらのオリゴマー化及び核酸認識特性と共に、既に記述されている（Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４，３６０７−３６３０）。ＢＮＡとその調製はＷＯ９８／３９３５２及びＷＯ９９／１４２２６にも記述されている。

【0320】

メチレンオキシ（４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’）ＢＮＡ及び２’−チオ−ＢＮＡの類似体も既に調製されている（Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９８，８，２２１９−２２２２）。核酸ポリメラーゼの基質としてのオリゴデオキシリボヌクレオチド二重鎖を構成するロックトヌクレオシド類似体の調製も既に記述されている（Ｗｅｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９９／１４２２６）。さらにまた、コンフォメーションが制限された新規高アフィニティオリゴヌクレオチド類似体である２’−アミノ−ＢＮＡの合成も、当技術分野では既に記述されている（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，６３，１００３５−１００３９）。加えて、２’−アミノ−及び２’−メチルアミノ−ＢＮＡも調製されており、相補的なＲＮＡ鎖及び相補的ＤＮＡ鎖とのそれらの二重鎖の熱安定性が、以前に報告されている。

【0321】

ある特定の実施形態では、式ＶＩ：

【0322】

【化17】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり、
Ｔ_ａ及びＴ_ｂは、それぞれ独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、共役基、反応性リン基、リン部分または支持媒体への共有結合による取り付けであり、
各ｑ_ｉ、ｑ_ｊ、ｑ_ｋ及びｑ_ｌは、独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ_１−Ｃ_１２アルキル、置換Ｃ_１−Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２−Ｃ_１２アルケニル、置換Ｃ_２−Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_２−Ｃ_１２アルキニル、置換Ｃ_２−Ｃ_１２アルキニル、Ｃ_１−Ｃ_１２アルコキシル、置換Ｃ_１−Ｃ_１２アルコキシル、ＯＪ_ｊ、ＳＪ_ｊ、ＳＯＪ_ｊ、ＳＯ_２Ｊ_ｊ、ＮＪ_ｊＪ_ｋ、Ｎ_３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪ_ｊ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ_ｊＪ_ｋ、Ｃ（＝Ｏ）Ｊ_ｊ、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＪ_ｊＪ_ｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪ_ｊＪ_ｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ_ｊＪ_ｋまたはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪ_ｊＪ_ｋであり、かつ
ｑ_ｉとｑ_ｊまたはｑ_ｌとｑ_ｋは、全体として、＝Ｃ（ｑ_ｇ）（ｑ_ｈ）であり、式中、ｑ_ｇ及びｑ_ｈは、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ_１−Ｃ_１２アルキルまたは置換Ｃ_１−Ｃ_１２アルキルである］
を有する二環式ヌクレオシドが提供される。

【0323】

４’−（ＣＨ_２）_３−２’橋を有する炭素環式二環式ヌクレオシド及びアルケニル類似体橋４’−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ_２−２’は既に記述されている（Ｆｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５（２２），４４２９−４４４３及びＡｌｂａｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００６，７１，７７３１−７７４０）。炭素環式二環式ヌクレオシドの合成及び調製も、それらのオリゴマー化及び生化学的研究と共に記述されている（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００７，１２９（２６），８３６２−８３７９）。

【0324】

本明細書にいう「４’−２’二環式ヌクレオシド」または「４’→２’二環式ヌクレオシド」とは、フラノース環の２つの炭素原子をつなぐ橋を含むフラノース環を含み、当該橋が糖環の２’炭素原子と４’炭素原子をつなぐ、二環式ヌクレオシドを指す。

【0325】

本明細書にいう「単環式ヌクレオシド」とは、二環式糖部分ではない修飾糖部分を含むヌクレオシドである。ある特定の実施形態では、ヌクレオシドの糖部分または糖部分類似体が、どの位置で修飾または置換されていてもよい。

【0326】

本明細書にいう「２’−修飾糖」とは、２’位が修飾されたフラノシル糖を意味する。ある特定の実施形態では、そのような修飾が、ハライド、例えば限定するわけではないが、置換及び無置換アルコキシ、置換及び無置換チオアルキル、置換及び無置換アミノアルキル、置換及び無置換アルキル、置換及び無置換アリル、及び置換及び無置換アルキニルから選択される置換基を含む。ある特定の実施形態では、２’修飾が、限定するわけではないが、Ｏ［（ＣＨ_２）_ｎＯ］_ｍＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＦ、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＮＨ_２、ＯＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）ＣＨ_３、及びＯ（ＣＨ_２）_ｎＯＮ［（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３］_２などといった置換基（式中、ｎ及びｍは１〜約１０である）から選択される。他の２’−置換基は、Ｃ_１−Ｃ_１２アルキル、置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ_３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、Ｆ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリ−アルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、アンチセンス化合物の薬物動態特性を改良するための基または薬力学的性質を改良するための基、及び類似する性質を有する他の置換基から選択することもできる。ある特定の実施形態では、修飾ヌクレオシドが２’−ＭＯＥ側鎖を含む（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，２７２，１１９４４−１２０００）。そのような２’−ＭＯＥ置換は、無修飾ヌクレオシド及び他の修飾ヌクレオシド、例えば２’−Ｏ−メチル、Ｏ−プロピル、及びＯ−アミノプロピルと比較して、改良された結合アフィニティを有すると記述されている。２’−ＭＯＥ置換基を有するオリゴヌクレオチドは、インビボ用途に有望な特徴を持つ遺伝子発現のアンチセンス阻害剤であることも示されている（Ｍａｒｔｉｎ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４；Ａｌｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｉｍｉａ，１９９６，５０，１６８−１７６；Ａｌｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，１９９６，２４，６３０−６３７；及びＡｌｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９７，１６，９１７−９２６）。

【0327】

本明細書にいう「修飾テトラヒドロピランヌクレオシド」または「修飾ＴＨＰヌクレオシド」とは、通常のヌクレオシド中のペントフラノシル残基の代わりに六員テトラヒドロピラン「糖」（糖代用物）が使用されているヌクレオシドを意味する。修飾ＴＨＰヌクレオシドには、当技術分野においてヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、アニトール（ａｎｉｔｏｌ）核酸（ＡＮＡ）、マニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）核酸（ＭＮＡ）（Ｌｅｕｍａｎｎ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００２，１０，８４１−１９５４）またはフルオロＨＮＡ（Ｆ−ＨＮＡ）と呼ばれ、以下に図解するようにテトラヒドロピラン環系を有するものが含まれるが、これらに限定されない。

【0328】

【化18】

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【0329】

ある特定の実施形態では、式ＶＩＩ：

【0330】

【化19】

[この文献は図面を表示できません]

ＶＩＩ
を有する糖代用物が選択され、
式中、当該少なくとも１つの式ＶＩＩのテトラヒドロピランヌクレオシド類似体のそれぞれについて、独立して、
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり、
Ｔ_ａ及びＴ_ｂは、それぞれ独立して、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に連結するヌクレオシド間連結基であるか、またはＴ_ａ及びＴ_ｂのうちの一方がテトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に連結するヌクレオシド間連結基であり、Ｔ_ａ及びＴ_ｂのうちの他方がＨ、ヒドロキシル保護基、連結された共役基または５’もしくは３’末端基であり、
ｑ_１、ｑ_２、ｑ_３、ｑ_４、ｑ_５、ｑ_６及びｑ_７は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、置換Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_２−Ｃ_６アルケニル、置換Ｃ_２−Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２−Ｃ_６アルキニルまたは置換Ｃ_２−Ｃ_６アルキニルであり、かつＲ_１及びＲ_２のそれぞれは、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、置換または無置換アルコキシ、ＮＪ_１Ｊ_２、ＳＪ_１、Ｎ_３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ_１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ_１Ｊ_２、ＮＪ_３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ_１Ｊ_２及びＣＮであり、ＸはＯ、ＳまたはＮＪ_１であり、かつ各Ｊ_１、Ｊ_２及びＪ_３は、独立して、ＨまたはＣ_１−Ｃ_６アルキルである。

【0331】

ある特定の実施形態では、ｑ_１、ｑ_２、ｑ_３、ｑ_４、ｑ_５、ｑ_６及びｑ_７がそれぞれＨである、式ＶＩＩの修飾ＴＨＰヌクレオシドが提供される。ある特定の実施形態では、ｑ_１、ｑ_２、ｑ_３、ｑ_４、ｑ_５、ｑ_６及びｑ_７のうちの少なくとも１つがＨ以外である。ある特定の実施形態では、ｑ_１、ｑ_２、ｑ_３、ｑ_４、ｑ_５、ｑ_６及びｑ_７のうちの少なくとも１つがメチルである。ある特定の実施形態では、Ｒ_１及びＲ_２のうちの一方がフルオロである、式ＶＩＩのＴＨＰヌクレオシドが提供される。ある特定の実施形態では、Ｒ_１がフルオロ、かつＲ_２がＨであり、Ｒ_１がメトキシ、かつＲ_２がＨであり、そしてＲ_１がメトキシエトキシ、かつＲ_２がＨである。

【0332】

ある特定の実施形態では、糖代用物が、６つ以上の原子及び２つ以上のヘテロ原子を有する環を含む。例えばモルホリノ糖部分を含むヌクレオシド、及びオリゴマー化合物におけるそれらの使用が、報告されている（例えばＢｒａａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４１，４５０３−４５１０；及び米国特許第５，６９８，６８５号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；及び同第５，０３４，５０６号を参照されたい）。本明細書において使用する用語「モルホリノ」とは、以下の式を有する糖代用物を意味する：

【0333】

【化20】

[この文献は図面を表示できません]

【0334】

ある特定の実施形態では、例えば上記モルホリノ構造にさまざまな置換基を付加するか、上記モルホリノ構造のさまざまな置換基を改変することによって、モルホリノが修飾されていてもよい。そのような糖代用物を本明細書では「修飾モルホリノ」という。

【0335】

修飾の組み合わせ、例えば限定するわけではないが、２’−Ｆ−５’−メチル置換ヌクレオシド（開示されている他の５’，２’−ビス置換ヌクレオシドについてはＰＣＴ国際出願第ＷＯ２００８／１０１１５７号（公開日２００８年８月２１日）参照）、及びＳによるリボシル環酸素原子の置き換えと２’位におけるさらなる置換（米国特許出願公開ＵＳ２００５−０１３０９２３（公開日２００５年６月１６日）参照）、あるいは二環式核酸の５’−置換（ＰＣＴ国際出願ＷＯ２００７／１３４１８１（公開日２００７年１１月２２日）参照、この場合は４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’二環式ヌクレオシドの５’位が５’−メチル基または５’−ビニル基でさらに置換されている）なども提供される。炭素環式二環式ヌクレオシドの合成及び調製も、それらのオリゴマー化及び生化学的試験と共に記載されている（例えば、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００７，１２９（２６），８３６２−８３７９を参照のこと）。

【0336】

ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物が、天然に存在するヌクレオシド中のペントフラノシル残基の代わりに六員シクロヘキセニルを有するヌクレオシドである修飾シクロヘキセニルヌクレオシドを２つ以上含む。修飾シクロヘキセニルヌクレオシドとして、当技術分野に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない（例えば同一譲受人によるＰＣＴ出願公開ＷＯ２０１０／０３６６９６（公開日２０１０年４月１０日）、Ｒｏｂｅｙｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００８，１３０（６），１９７９−１９８４；Ｈｏｒｖａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００７，４８，３６２１−３６２３；Ｎａｕｗｅｌａｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００７，１２９（３０），９３４０−９３４８；Ｇｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ， Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，２００５，２４（５−７），９９３−９９８；Ｎａｕｗｅｌａｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５，３３（８），２４５２−２４６３；Ｒｏｂｅｙｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ，Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｆ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２００５，Ｆ６１（６），５８５−５８６；Ｇｕ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，２００４，６０（９），２１１１−２１２３；Ｇｕ ｅｔ ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，２００３，１３（６），４７９−４８９；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００３，６８，４４９９−４５０５；Ｖｅｒｂｅｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００１，２９（２４），４９４１−４９４７；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００１，６６，８４７８−８２；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，２００１，２０（４−７），７８５−７８８；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．，２０００，１２２，８５９５−８６０２；ＰＣＴ出願公開ＷＯ０６／０４７８４２；及びＰＣＴ出願公開ＷＯ０１／０４９６８７を参照されたい；また、各文献の本文は、参照によりそのまま本明細書に組み込まれる）。ある特定の修飾シクロヘキセニルヌクレオシドは、式Ｘを有する。

【0337】

【化21】

[この文献は図面を表示できません]

式中、当該少なくとも１つの式Ｘのシクロヘキセニルヌクレオシド類似体のそれぞれについて、独立して、
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり、
Ｔ_３及びＴ_４は、それぞれ独立して、シクロヘキセニルヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に連結するヌクレオシド間連結基であるか、またはＴ_３及びＴ_４のうちの一方がテトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に連結するヌクレオシド間連結基であり、かつＴ_３及びＴ_４のうちの他方がＨ、ヒドロキシル保護基、連結された共役基、または５’末端基もしくは３’末端基であり、かつ
ｑ_１、ｑ_２、ｑ_３、ｑ_４、ｑ_５、ｑ_６、ｑ_７、ｑ_８及びｑ_９は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、置換Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_２−Ｃ_６アルケニル、置換Ｃ_２−Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２−Ｃ_６アルキニル、置換Ｃ_２−Ｃ_６アルキニルまたは他の糖置換基である。

【0338】

本明細書にいう「２’−修飾」または「２’−置換」は、２’位にＨまたはＯＨ以外の置換基を含む糖を含むヌクレオシドを指す。２’−修飾ヌクレオシドには、糖環の２つの炭素原子をつなぐ橋が糖環の２’炭素ともう一つの炭素とをつないでいる二環式ヌクレオシド；及び非架橋２’置換基、例えばアリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ_１−Ｃ_１０アルキル、−ＯＣＦ_３、Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−ＣＨ_３、２’−Ｏ（ＣＨ_２）_２ＳＣＨ_３、Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−Ｎ（Ｒ_ｍ）（Ｒ_ｎ）、またはＯ−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ_ｍ）（Ｒ_ｎ）［式中、各Ｒ_ｍ及びＲ_ｎは、独立して、Ｈまたは置換または無置換Ｃ_１−Ｃ_１０アルキルである］を有するヌクレオシドなどがあるが、これらに限定されない。２’−修飾ヌクレオシドは、例えば糖の他の位置及び／または核酸塩基に、他の修飾をさらに含んでもよい。

【0339】

本明細書にいう「２’−Ｆ」とは、糖環の２’位にフルオロ基を含む糖を含むヌクレオシドを指す。

【0340】

本明細書にいう「２’−ＯＭｅ」または「２’−ＯＣＨ_３」または「２’−Ｏ−メチル」とは、それぞれ、糖環の２’位に−ＯＣＨ_３基を含む糖を含むヌクレオシドを指す。

【0341】

本明細書にいう「ＭＯＥ」または「２’−ＭＯＥ」または「２’−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３」または「２’−Ｏ−メトキシエチル」とは、それぞれ、糖環の２’位に−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３ 基を含む糖を含むヌクレオシドを指す。

【0342】

本明細書にいう「オリゴヌクレオチド」とは、複数の連結されたヌクレオシドを含む化合物を指す。ある特定の実施形態では、当該複数のヌクレオシドのうちの２つ以上が修飾されている。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドが、２つ以上のリボヌクレオシド（ＲＮＡ）及び／またはデオキシリボヌクレオシド（ＤＮＡ）を含む。

【0343】

アンチセンス化合物に組み込むためのヌクレオシドの修飾に使用することができるビシクロ糖代用環系及びトリシクロ糖代用環系は、当技術分野では、他にも多数知られている（例えば総説Ｌｅｕｍａｎｎ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００２，１０，８４１−１９５４を参照されたい）。そのような環系には、活性を強化するために、さまざまな追加の置換を行うことができる。

【0344】

修飾糖の調製方法は当業者にはよく知られている。そのような修飾糖の調製を教示する代表的米国特許の一部には、例えば限定するわけではないが、Ｕ．Ｓ．４，９８１，９５７；Ｕ．Ｓ．５，１１８，８００；Ｕ．Ｓ．５，３１９，０８０；Ｕ．Ｓ．５，３５９，０４４；Ｕ．Ｓ．５，３９３，８７８；Ｕ．Ｓ．５，４４６，１３７；Ｕ．Ｓ．５，４６６，７８６；Ｕ．Ｓ．５，５１４，７８５；Ｕ．Ｓ．５，５１９，１３４；Ｕ．Ｓ．５，５６７，８１１；Ｕ．Ｓ．５，５７６，４２７；Ｕ．Ｓ．５，５９１，７２２；Ｕ．Ｓ．５，５９７，９０９；Ｕ．Ｓ．５，６１０，３００；Ｕ．Ｓ．５，６２７，０５３；Ｕ．Ｓ．５，６３９，８７３；Ｕ．Ｓ．５，６４６，２６５；Ｕ．Ｓ．５，６７０，６３３；Ｕ．Ｓ．５，７００，９２０；Ｕ．Ｓ．５，７９２，８４７及びＵ．Ｓ．６，６００，０３２ならびに２００５年１２月２２日にＷＯ２００５／１２１３７１として公開された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１９２１９（出願日２００５年６月２日）
などがあり、これらはそれぞれ参照により本明細書にそのまま組み込まれる。

【0345】

修飾糖部分を有するヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分（天然、修飾またはそれらの組み合わせ）は、適当な核酸標的とのハイブリダイゼーションのために維持される。

【0346】

ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物が、修飾糖部分を有する２つ以上のヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態では、修飾糖部分が２’−ＭＯＥである。ある特定の実施形態では、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドがギャップマーモチーフで配置される。ある特定の実施形態では、修飾糖部分が、（４’−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｏ−２’）架橋基を有する二環式ヌクレオシドである。ある特定の実施形態では、当該（４’−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｏ−２’）修飾ヌクレオシドが、ギャップマーモチーフのウイング全体にわたって配置される。

【0347】

共役アンチセンス化合物
ある特定の実施形態において、本開示は、共役アンチセンス化合物を提供する。ある特定の実施形態において、本開示は、核酸転写産物に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む共役アンチセンス化合物を提供する。ある特定の実施形態において、本開示は、細胞を、核酸転写産物に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む共役アンチセンス化合物と接触させることを含む方法を提供する。ある特定の実施形態において、本開示は、細胞を、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む共役アンチセンス化合物と接触させること、及び細胞内の核酸転写産物の量または活性を低減させることを含む方法を提供する。

【0348】

アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰ−Ｒ）は以前に記載されている。例えばＰａｒｋ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ｖｏｌ．１０２，Ｎｏ．４７，ｐｐ．１７１２５−１７１２９（２００５）を参照されたい。これらの受容体は、肝臓細胞、特に肝細胞上で発現する。さらに、３つのＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）リガンドのクラスターを含む化合物は、ＡＳＧＰ−Ｒに結合して細胞内への当該化合物の取り込みをもたらす能力を有することが示されている。例えばＫｈｏｒｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６，９，ｐｐ．５２１６−５２３１（Ｍａｙ ２００８）を参照されたい。したがって、そのようなＧａｌＮＡｃクラスターを含む共役体が、肝臓細胞、具体的には肝細胞への特定化合物の取り込みを促進するために使用されている。例えば、特定のＧａｌＮＡｃ含有共役体は、インビボで肝臓細胞における二重鎖ｓｉＲＮＡ化合物の活性を増加させることが示されている。これらの例では、ＧａｌＮＡｃ含有共役体は、典型的には、ｓｉＲＮＡ位二重鎖のセンス鎖に取り付けられる。センス鎖はアンチセンス鎖が最終的に標的核酸とハイブリダイズする前に処分されてしまうため、共役体が活性を妨害する懸念はほとんどない。典型的には、共役体は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’端に取り付けられる。例えば米国特許第８，１０６，０２２号を参照されたい。本明細書に記載する特定の共役基は、今までに記載された共役基よりも活性が高く、かつ／または合成が容易である。

【0349】

本発明のある特定の実施形態において、共役体は、一本鎖アンチセンス化合物、例えば限定するわけではないが、ＲＮａｓｅ Ｈベースのアンチセンス化合物や、プレｍＲＮＡ標的核酸のスプライシングを改変するアンチセンス化合物に、取り付けられる。そのような実施形態では、共役体は、利益（細胞内への取り込みの改良）をもたらすのに十分な時間、アンチセンス化合物に取り付けられた状態にあるべきだが、その後は、切断されるか、または他の何らかの形で、活性に必要な後続ステップ、例えば標的核酸へのハイブリダイゼーション及びＲＮａｓｅ Ｈまたはスプライシングもしくはスプライシング調節に関連する酵素との相互作用などを妨害しないようにすべきである。この性質のバランスは、共役体を単にセンス鎖に取り付けるだけでよいｓｉＲＮＡ化合物の場合よりも、一本鎖アンチセンス化合物の場合に、より一層重要である。本明細書には、共役体を欠く同じアンチセンス化合物と比較して、インビボで肝臓細胞における力価が改良されている共役一本鎖アンチセンス化合物を開示する。これらの化合物に要求される性質のバランスを考えると、そのような力価の改良は驚くべきことである。

【0350】

ある特定の実施形態において、本明細書における共役基は、切断可能部分を含む。機序に束縛されることは望まないが、上述のように、共役体が取り込みの強化をもたらすのに十分な時間、化合物上に残っているべきであることは必然だが、その後は、共役体の何らかの部分、理想的には共役体の全部が切断されて、親化合物（例えばアンチセンス化合物）をその最も活性な形態で放出することが望ましい。ある特定の実施形態では、切断可能部分が切断可能なヌクレオシドである。そのような実施形態では、共役体の残りの部分（クラスター）を、２つ以上の切断可能な結合、例えばホスホジエステル連結部のものによって、ヌクレオシドを介してアンチセンスオリゴヌクレオチドに取り付けることにより、細胞中の内在性ヌクレアーゼを利用する。ある特定の実施形態では、クラスターがホスホジエステル連結部を介して切断可能なヌクレオシドに結合される。ある特定の実施形態では、切断可能なヌクレオシドが、ホスホジエステル連結部によってアンチセンスオリゴヌクレオチド（アンチセンス化合物）に取り付けられる。ある特定の実施形態では、共役基が、２つまたは３つの切断可能なヌクレオシドを含みうる。そのような実施形態では、上述の切断可能なヌクレオシドが、切断可能な結合（ホスホジエステル連結部のもの）によって、互いに、アンチセンス化合物に、かつ／またはクラスターに連結される。本明細書における特定の共役体は、切断可能なヌクレオシドを含まず、代わりに切断可能な結合を含む。オリゴヌクレオチドからの共役体の十分な切離は、細胞内で切断を受けやすい少なくとも１つの結合（切断可能な結合）によってもたらされることを示す。

【0351】

ある特定の実施形態では、共役アンチセンス化合物がプロドラッグである。そのようなプロドラッグは、動物に投与され、最終的には、より活性な形態に代謝される。例えば共役アンチセンス化合物は切断されることで、共役体の全部または一部を除去し、共役体の全部または一部を欠く活性な（またはより活性な）形態のアンチセンス化合物をもたらす。

【0352】

ある特定の実施形態では、共役体がオリゴヌクレオチドの５’端に取り付けられる。特定のそのような５’共役体は、同様の共役基が３’端に取り付けられている対応物よりも効率よく切断される。ある特定の実施形態では、活性の改良が切断の改良と相関しうる。ある特定の実施形態では、５’端に共役体を含むオリゴヌクレオチドの有効性が、３’端に共役体を含むオリゴヌクレオチドの有効性よりも高い（例えば実施例５６、８１、８３、及び８４を参照のこと）。さらに、５’への取り付けの方が、簡単なオリゴヌクレオチド合成が可能である。オリゴヌクレオチドは、典型的には、３’→５’方向に固体支持体上で合成される。３’共役オリゴヌクレオチドを作製するには、典型的には、事前に共役基を結合しておいた３’ヌクレオシドを固体支持体に取り付けてから、オリゴヌクレオチドを通常どおりに構築する。しかし、その共役ヌクレオシドを固体支持体に取り付ける操作は、合成を複雑にする。さらに、このアプローチを使用した場合、共役体は、オリゴヌクレオチドの合成の間ずっと存在することになり、後続のステップ中に分解されてしまうか、使用できる反応と試薬の種類を制限することになりうる。５’共役オリゴヌクレオチドについて本明細書に記載する構造及び技法を用いることにより、標準的な自動化された技法を使ってオリゴヌクレオチドを合成し、最後（最も５’側）のヌクレオシドと共に共役体を導入するか、またはオリゴヌクレオチドを固体支持体から切り離してから共役体を導入することができる。

【0353】

当分野の技術水準及び本開示を考慮すれば、当業者は、本明細書の共役体及び共役オリゴヌクレオチドをどれでも容易に作製することができる。さらに、本明細書に開示するある特定のそのような共役体及び共役オリゴヌクレオチドの合成は、これまでに開示されていた共役体の合成よりも容易であり、かつ／または必要とするステップ数が少なく、それゆえに安価に行うことができるので、それらは製造上の利点になる。例えば、特定の共役基の合成は、これまでに記載された共役基と比較して、より少ない合成ステップから成り、収率の増加をもたらす。実施例４６のＧａｌＮＡｃ３−１０及び実施例４８のＧａｌＮＡｃ３−７などの共役基は、既述の共役体、例えば、より多くの化学中間体の組み立てを必要とするＵ．Ｓ．８，１０６，０２２またはＵ．Ｓ．７，２６２，１７７に記載されているものよりも、はるかに簡単である。したがって、本明細書に記載するこれらの共役体及び他の共役体には、一本鎖オリゴヌクレオチドや二本鎖オリゴヌクレオチド（例えばｓｉＲＮＡ）のどちらかの鎖などといった任意のオリゴヌクレオチドと一緒に使用する際に、既述の化合物に優る利点がある。

【0354】

同様に、ＧａｌＮＡｃリガンドを１つまたは２つしか持たない共役基も、本明細書に開示する。ここに示すように、そのような共役基は、アンチセンス化合物の活性を改良する。そのような化合物は、３つのＧａｌＮＡｃリガンドを含む共役体よりも、調製がはるかに容易である。１つまたは２つのＧａｌＮＡｃリガンドを含む共役基は、一本鎖オリゴヌクレオチドや二本鎖オリゴヌクレオチド（例えばｓｉＲＮＡ）のどちらかの鎖などといった任意のアンチセンス化合物に取り付けることができる。

【0355】

ある特定の実施形態では、本明細書の共役体が、耐容性の特定尺度を、実質的に変化させない。例えば、共役アンチセンス化合物の免疫原性は非共役親化合物より高くないことを、本明細書において示す。力価が改良されるので、耐容性が同じままである実施形態は（あるいは実際には力価の増加分と比較して耐容性が少しだけ悪化したとしても）、治療に関して改良された性質を有する。

【0356】

ある特定の実施形態では、共役により、共役がなければ結果があまり思わしくないような方法で、アンチセンス化合物を改変することが可能になる。例えば、ある特定の実施形態では、全ホスホロチオエートアンチセンス化合物の２つ以上のホスホロチオエート連結部を、ホスホジエステル連結基で置き換えることにより、一部の耐容性尺度の改良が起こる。例えば、ある特定の事例では、２つ以上のホスホジエステルを有するそのようなアンチセンス化合物は、各連結部がホスホロチオエートである同じ化合物よりも、免疫原性が低い。しかし、ある特定の事例では、実施例２６に示すように、２つ以上のホスホロチオエート連結部をホスホジエステル連結部で置き換えると、細胞取り込みの低減及び／または力価の損失も起こる。ある特定の実施形態において、本明細書に記載する共役アンチセンス化合物は、共役全ホスホロチオエート対応物と比較して、取り込み及び力価をほとんどまたは全く失うことなく、そのような連結部の改変を許容する。事実、ある特定の実施形態では、例えば実施例４４、５７、５９、及び８６では、共役体と少なくとも１つのホスホジエステルヌクレオシド間連結部とを含むオリゴヌクレオチドが、同様に同じ共役体を含む全ホスホロチオエート対応物と比較した場合でさえ、実際に、インビボで力価の増加を呈する。さらに、共役が取り込み／力価の実質的な増加をもたらすので、その実質的な増加分が少し失われても、耐容性の改良を達成するという目的には、許容できる。したがって、ある特定の実施形態では、共役アンチセンス化合物が、少なくとも１つのホスホジエステル連結部を含む。

【0357】

ある特定の実施形態では、本明細書におけるアンチセンス化合物の共役が、肝細胞における送達、取り込み、及び活性の増加をもたらす。したがって、より多くの化合物が肝臓組織に送達される。しかし、ある特定の実施形態では、そのような送達の増加だけでは、活性の増加全体を説明できない。特定のそのような実施形態では、より多くの化合物が肝細胞に進入する。ある特定の実施形態では、そのような肝細胞取り込みの増加でも、活性の増加全体を説明することができない。そのような実施形態では、共役化合物の生産的取り込みが増加する。例えば、実施例１０２に示すように、ＧａｌＮＡｃ含有共役体の特定実施形態は、非実質細胞との対比で肝細胞におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃縮を増加させる。この濃縮は、肝細胞中で発現する遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドにとって有益である。

【0358】

ある特定の実施形態では、本明細書における共役アンチセンス化合物が、腎臓曝露の低減をもたらす。例えば、実施例２０に示すように、ＧａｌＮＡｃ含有共役体の特定実施形態を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度は、腎臓では、ＧａｌＮＡｃ含有共役体を欠くアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度より低い。これは、いくつかの有益な治療的意味を有する。腎臓における活性が求められていない治療的適応の場合、腎臓への曝露には、腎毒性のリスクがあり、それに見合う利益がない。さらに、腎臓における高濃度は、典型的には、尿への化合物の損失をもたらし、その結果、クリアランスが速くなる。したがって、標的が腎臓でない場合、腎臓内での蓄積は望ましくない。

【0359】

ある特定の実施形態において、本開示は、式：

【0360】

【化22】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、
Ａは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
Ｂは、切断可能部分であり、
Ｃは、共役リンカーであり、
Ｄは、分岐基であり、
各Ｅは、テザーであり、
各Ｆは、リガンドであり、かつ
ｑは、１〜５の整数である］
によって表される共役アンチセンス化合物を提供する。

【0361】

本明細書における上記の図及び同様の図において、分岐基「Ｄ」は、「ｑ」で示される数の（Ｅ−Ｆ）基に対応するのに必要な数だけ分岐している。したがって、ｑ＝１の場合、当該の式は、

【0362】

【化23】

[この文献は図面を表示できません]

であり、ｑ＝２の場合、当該の式は、

【0363】

【化24】

[この文献は図面を表示できません]

であり、ｑ＝３の場合、当該の式は

【0364】

【化25】

[この文献は図面を表示できません]

であり、ｑ＝４の場合、当該の式は

【0365】

【化26】

[この文献は図面を表示できません]

であり、ｑ＝５の場合、当該の式は

【0366】

【化27】

[この文献は図面を表示できません]

である。

【0367】

ある特定の実施形態では、次の構造を有する共役アンチセンス化合物が提供される。

【0368】

【化28】

[この文献は図面を表示できません]

【0369】

ある特定の実施形態では、次の構造を有する共役アンチセンス化合物が提供される。

【0370】

【化29】

[この文献は図面を表示できません]

【0371】

ある特定の実施形態では、次の構造を有する共役アンチセンス化合物が提供される。

【0372】

【化30】

[この文献は図面を表示できません]

【0373】

ある特定の実施形態では、次の構造を有する共役アンチセンス化合物が提供される。

【0374】

【化31】

[この文献は図面を表示できません]

【0375】

ある特定変数を２つ以上（例えば２つ以上の「ｍ」または２つ以上の「ｎ」を）有する実施形態では、別段の表示がある場合を除き、そのような特定変数のそれぞれは、独立して選択される。したがって、２つ以上のｎを有する構造の場合、各ｎは独立して選択されるため、それらは互いに同一である場合も、同一でない場合もありうる。

【0376】

ｉ．ある特定の切断可能部分
ある特定の実施形態において、切断可能部分は、切断可能な結合である。ある特定の実施形態において、切断可能部分は、切断可能な結合を含む。ある特定の実施形態において、共役基は、切断可能部分を含む。ある特定のそのような実施形態において、切断可能部分は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに結合する。ある特定のそのような実施形態において、切断可能部分は、細胞ターゲティング部分に直接結合する。ある特定のそのような実施形態において、切断可能部分は、共役リンカーに結合する。ある特定の実施形態において、切断可能部分は、ホスフェートまたはホスホジエステルを含む。ある特定の実施形態において、切断可能部分は、切断可能なヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体である。ある特定の実施形態において、ヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体は、プリン、置換プリン、ピリミジン、または置換ピリミジンから選択される場合によっては保護された複素環式塩基を含む。ある特定の実施形態において、切断可能部分は、ウラシル、チミン、シトシン、４−Ｎ−ベンゾイルシトシン、５−メチルシトシン、４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチルシトシン、アデニン、６−Ｎ−ベンゾイルアデニン、グアニン、及び２−Ｎ−イソブチリルグアニンから選択される、場合によっては保護された複素環式塩基を含むヌクレオシドである。ある特定の実施形態では、切断可能部分が、ホスホジエステル連結部によってアンチセンスオリゴヌクレオチドの３’位に取り付けられ、かつホスホジエステルまたはホスホロチオエート連結部によってリンカーに取り付けられた２’−デオキシヌクレオシドである。ある特定の実施形態では、切断可能部分が、ホスホジエステル連結部によってアンチセンスオリゴヌクレオチドの３’位に取り付けられ、かつホスホジエステルまたはホスホロチオエート連結部によってリンカーに取り付けられた２’−デオキシアデノシンである。ある特定の実施形態では、切断可能部分が、ホスホジエステル連結部によってアンチセンスオリゴヌクレオチドの３’位に取り付けられ、かつホスホジエステル連結部によってリンカーに取り付けられた２’−デオキシアデノシンである。

【0377】

ある特定の実施形態において、切断可能部分は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’位に取り付けられる。ある特定の実施形態において、切断可能部分は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’位に取り付けられる。ある特定の実施形態において、切断可能部分は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの２’位に取り付けられる。ある特定の実施形態において、切断可能部分は、ホスホジエステル連結部によってアンチセンスオリゴヌクレオチドに取り付けられる。ある特定の実施形態において、切断可能部分は、ホスホジエステル連結部またはホスホロチオエート連結部のいずれかによってリンカーに取り付けられる。ある特定の実施形態において、切断可能部分は、ホスホジエステル連結部によってリンカーに取り付けられる。ある特定の実施形態において、共役基は、切断可能部分を含まない。

【0378】

ある特定の実施形態において、切断可能部分は、複合体が動物に投与された後に、標的細胞によって内部に取り込まれて初めて切断される。細胞内で切断可能部分が切断され、それによって活性アンチセンスオリゴヌクレオチドが放出される。理論に束縛されることは望まないが、切断可能部分は細胞内で２つ以上のヌクレアーゼによって切断されると考えられる。ある特定の実施形態では、２つ以上のヌクレアーゼが切断可能部分とリンカーとの間のホスホジエステル連結部を切断する。ある特定の実施形態において、切断可能部分は、以下のなかから選択される構造を有し、

【0379】

【化32】

[この文献は図面を表示できません]

のなかから選択される構造を有し、式中、Ｂｘ、Ｂｘ_１、Ｂｘ_２、及びＢｘ_３のそれぞれは、独立して複素環式塩基部分である。ある特定の実施形態において、切断可能部分は以下のなかから選択される構造を有する。

【0380】

【化33】

[この文献は図面を表示できません]

【0381】

ｉｉ．ある特定のリンカー
ある特定の実施形態において、共役基は、リンカーを含む。ある特定のそのような実施形態において、リンカーは、切断可能部分に共有結合される。ある特定のそのような実施形態において、リンカーは、アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合される。ある特定の実施形態において、リンカーは、細胞ターゲティング部分に共有結合される。ある特定の実施形態において、リンカーは、固体支持体への共有結合をさらに含む。ある特定の実施形態において、リンカーは、タンパク質結合部分への共有結合をさらに含む。ある特定の実施形態において、リンカーは、固体支持体への共有結合をさらに含み、タンパク質結合部分への共有結合もさらに含む。ある特定の実施形態において、リンカーは、係留される（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）リガンドを取り付けるための位置を複数含んでいる。ある特定の実施形態において、リンカーは、係留されるリガンドを取り付けるための位置を複数含み、分岐基には取り付けられない。ある特定の実施形態において、リンカーは、２つ以上の切断可能な結合をさらに含む。ある特定の実施形態において、共役基は、リンカーを含まない。

【0382】

ある特定の実施形態において、リンカーは、アルキル、アミド、ジスルフィド、ポリエチレングリコール、エーテル、チオエーテル（−Ｓ−）、及びヒドロキシルアミノ（−Ｏ−Ｎ（Ｈ）−）基から選択される基を含む線状基を少なくとも１つは含む。ある特定の実施形態において、当該線状基は、アルキル、アミド、及びエーテル基から選択される基を含む。ある特定の実施形態において、当該線状基は、アルキル及びエーテル基から選択される基を含む。ある特定の実施形態において、当該線状基は、少なくとも１つのリン連結基を含む。ある特定の実施形態において、当該線状基は、少なくとも１つのホスホジエステル基を含む。ある特定の実施形態において、当該線状基は、少なくとも１つの中性連結基を含む。ある特定の実施形態において、当該線状基は、細胞ターゲティング部分及び切断可能部分に共有結合される。ある特定の実施形態において、当該線状基は、細胞ターゲティング部分及びアンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合される。ある特定の実施形態において、当該線状基は、細胞ターゲティング部分、切断可能部分、及び固体支持体に共有結合される。ある特定の実施形態において、当該線状基は、細胞ターゲティング部分、切断可能部分、固体支持体、及びタンパク質結合部分に共有結合される。ある特定の実施形態において、当該線状基は、２つ以上の切断可能な結合を含む。

【0383】

ある特定の実施形態において、リンカーは、足場基に共有結合された線状基を含む。ある特定の実施形態において、当該足場は、アルキル、アミド、ジスルフィド、ポリエチレングリコール、エーテル、チオエーテル、及びヒドロキシルアミノ基から選択される基を含む分岐状脂肪族基を含む。ある特定の実施形態において、当該足場は、アルキル、アミド、及びエーテル基から選択される基を含む分岐状脂肪族基を含む。ある特定の実施形態において、当該足場は、少なくとも１つの単環式または多環式環系を含む。ある特定の実施形態において、当該足場は、少なくとも２つの単環式または多環式環系を含む。ある特定の実施形態では、線状基が足場基に共有結合され、足場基は切断可能部分及びリンカーに共有結合される。ある特定の実施形態では、線状基が足場基に共有結合され、足場基は、切断可能部分、リンカー、及び固体支持体に共有結合される。ある特定の実施形態では、線状基が足場基に共有結合され、足場基は、切断可能部分、リンカー、及びタンパク質結合部分に共有結合される。ある特定の実施形態では、線状基が足場基に共有結合され、足場基は、切断可能部分、リンカー、タンパク質結合部分、及び固体支持体に共有結合される。ある特定の実施形態において、当該足場基は２つ以上の切断可能な結合を含む。

【0384】

ある特定の実施形態において、リンカーは、タンパク質結合部分を含む。ある特定の実施形態において、タンパク質結合部分は脂質、例えば限定するわけではないが、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）、ビタミン（例えば葉酸塩、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビオチン、ピリドキサール）、ペプチド、炭水化物（例えば単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、多糖）、エンドソーム溶解成分、ステロイド（例えばウバオール、ヘシゲニン、ジオスゲニン）、テルペン（例えばトリテルペン、例えば、サルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸）、またはカチオン性脂質を含むが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、タンパク質結合部分は、Ｃ１６〜Ｃ２２長鎖飽和もしくは不飽和脂肪酸、コレステロール、コール酸、ビタミンＥ、アダマンタン、または１−ペンタフルオロプロピルである。

【0385】

ある特定の実施形態において、リンカーは、以下のなかから選択される構造を有し、

【0386】

【化34】

[この文献は図面を表示できません]

式中、各ｎは、独立して、１〜２０であり、ｐは、１〜６である。

【0387】

ある特定の実施形態において、リンカーは、以下のなかから選択される構造を有し、

【0388】

【化35】

[この文献は図面を表示できません]

式中、各ｎは、独立して、１〜２０である。

【0389】

ある特定の実施形態において、リンカーは、以下のなかから選択される構造を有し、

【0390】

【化36】

[この文献は図面を表示できません]

式中、ｎは、１〜２０である。

【0391】

ある特定の実施形態において、リンカーは、以下のなかから選択される構造を有し、

【0392】

【化37】

[この文献は図面を表示できません]

式中、各Ｌは、独立して、リン連結基または中性連結基であり、
各ｎは、独立して、１〜２０である。

【0393】

ある特定の実施形態において、リンカーは以下のなかから選択される構造を有する。

【0394】

【化38】

[この文献は図面を表示できません]

【0395】

【化39】

[この文献は図面を表示できません]

【0396】

ある特定の実施形態において、リンカーは、以下のなかから選択される構造を有する。

【0397】

【化40】

[この文献は図面を表示できません]

【0398】

ある特定の実施形態において、リンカーは、以下のなかから選択される構造を有する。

【0399】

【化41】

[この文献は図面を表示できません]

【0400】

ある特定の実施形態において、リンカーは、以下のなかから選択される構造を有し、

【0401】

【化42】

[この文献は図面を表示できません]

式中、ｎは、１〜２０である。

【0402】

ある特定の実施形態において、リンカーは、以下のなかから選択される構造を有する。

【0403】

【化43】

[この文献は図面を表示できません]

【0404】

ある特定の実施形態において、リンカーは、以下のなかから選択される構造を有する。

【0405】

【化44】

[この文献は図面を表示できません]

【0406】

ある特定の実施形態において、リンカーは、以下のなかから選択される構造を有する。

【0407】

【化45】

[この文献は図面を表示できません]

【0408】

ある特定の実施形態において、共役リンカーは以下の構造を有する。

【0409】

【化46】

[この文献は図面を表示できません]

【0410】

ある特定の実施形態において、共役リンカーは以下の構造を有する。

【0411】

【化47】

[この文献は図面を表示できません]

．

【0412】

ある特定の実施形態において、リンカーは、以下のなかから選択される構造を有する。

【0413】

【化48】

[この文献は図面を表示できません]

【0414】

ある特定の実施形態において、リンカーは、以下のなかから選択される構造を有し、

【0415】

【化49】

[この文献は図面を表示できません]

式中、各ｎは、独立して、０、１、２、３、４、５、６、または７である。

【0416】

ｉｉｉ．ある特定の細胞ターゲティング部分
ある特定の実施形態において、共役基は、細胞ターゲティング部分を含む。ある特定のそのような細胞ターゲティング部分は、アンチセンス化合物の細胞取り込みを増加させる。ある特定の実施形態において、細胞ターゲティング部分は、分岐基、２つ以上のテザー、及び２つ以上のリガンドを含む。ある特定の実施形態において、細胞ターゲティング部分は、分岐基、２つ以上のテザー、２つ以上のリガンド、及び２つ以上の切断可能な結合を含む。

【0417】

１．ある特定の分岐基
ある特定の実施形態において、共役基は、分岐基及び少なくとも２つのテザーリガンドを含むターゲティング部分を含む。ある特定の実施形態において、分岐基は、共役リンカーを結合する。ある特定の実施形態において、分岐基は、切断可能部分を結合する。ある特定の実施形態において、分岐基は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを結合する。ある特定の実施形態において、分岐基は、リンカー及びテザーリガンドのそれぞれに共有結合される。ある特定の実施形態において、分岐基は、アルキル、アミド、ジスルフィド、ポリエチレングリコール、エーテル、チオエーテル及びヒドロキシルアミノ基から選択される基を含む分岐状脂肪族基を含む。ある特定の実施形態において、分岐基は、アルキル、アミド、及びエーテル基から選択される基を含む。ある特定の実施形態において、分岐基は、アルキル及びエーテル基から選択される基を含む。ある特定の実施形態において、分岐基は、単環式または多環式環系を含む。ある特定の実施形態において、分岐基は、２つ以上の切断可能な結合を含む。ある特定の実施形態において、共役基は、分岐基を含まない。

【0418】

ある特定の実施形態では、分岐基は、以下のなかから選択される構造を有し、

【0419】

【化50】

[この文献は図面を表示できません]

式中、各ｎは、独立して、１〜２０であり、
ｊは、１〜３であり、
ｍは、２〜６である。

【0420】

ある特定の実施形態において、分岐基は、以下のなかから選択される構造を有し、

【0421】

【化51】

[この文献は図面を表示できません]

各ｎは、独立して、１〜２０であり、
ｍは、２〜６である。

【0422】

ある特定の実施形態において、分岐基は、以下のなかから選択される構造を有する。

【0423】

【化52】

[この文献は図面を表示できません]

【0424】

【化53】

[この文献は図面を表示できません]

【0425】

ある特定の実施形態において、分岐基は、以下のなかから選択される構造を有し、

【0426】

【化54】

[この文献は図面を表示できません]

式中、各Ａ_１は、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｃ＝Ｏ、またはＮＨであり、
各ｎは、独立して、１〜２０である。

【0427】

ある特定の実施形態において、分岐基は、以下のなかから選択される構造を有し、

【0428】

【化55】

[この文献は図面を表示できません]

式中、各Ａ_１は、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｃ＝Ｏ、またはＮＨであり、
各ｎは、独立して、１〜２０である。

【0429】

ある特定の実施形態において、分岐基は、以下のなかから選択される構造を有し、

【0430】

【化56】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ａ_１は、Ｏ、Ｓ、Ｃ＝Ｏ、またはＮＨであり、
各ｎは、独立して、１〜２０である。

【0431】

ある特定の実施形態において、分岐基は以下のなかから選択される構造を有する。

【0432】

【化57】

[この文献は図面を表示できません]

【0433】

ある特定の実施形態において、分岐基は以下のなかから選択される構造を有する。

【0434】

【化58】

[この文献は図面を表示できません]

【0435】

ある特定の実施形態において、分岐基は以下のなかから選択される構造を有する。

【0436】

【化59】

[この文献は図面を表示できません]

【0437】

２．ある特定のテザー
ある特定の実施形態において、共役基は、分岐基に共有結合される２つ以上のテザーを含む。ある特定の実施形態において、共役基は、連結基に共有結合される２つ以上のテザーを含む。ある特定の実施形態において、各テザーは、アルキル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、アミド、及びポリエチレングリコール基から選択される２つ以上の基を任意の組み合わせで含む線状脂肪族基である。ある特定の実施形態において、各テザーは、アルキル、置換アルキル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、アミド、ホスホジエステル及びポリエチレングリコール基から選択される２つ以上の基を任意の組み合わせで含む線状脂肪族基である。ある特定の実施形態において、各テザーは、アルキル、エーテル、及びアミド基から選択される２つ以上の基を任意の組み合わせで含む線状脂肪族基である。ある特定の実施形態において、各テザーは、アルキル、置換アルキル、ホスホジエステル、エーテル、及びアミド基から選択される２つ以上の基を任意の組み合わせで含む線状脂肪族基である。ある特定の実施形態において、各テザーは、アルキル及びホスホジエステルから選択される２つ以上の基を任意の組み合わせで含む線状脂肪族基である。ある特定の実施形態において、各テザーは、少なくとも１つのリン連結基または中性連結基を含む。

【0438】

ある特定の実施形態において、テザーは、２つ以上の切断可能な結合を含む。ある特定の実施形態において、テザーは、アミド基またはエーテル基のいずれかを介して分岐基に結合される。ある特定の実施形態において、テザーは、ホスホジエステル基を介して分岐基に結合される。ある特定の実施形態において、テザーは、リン連結基または中性連結基を介して分岐基に結合される。ある特定の実施形態において、テザーは、エーテル基を介して分岐基に結合される。ある特定の実施形態において、テザーは、アミド基またはエーテル基のいずれかを介してリガンドに結合される。ある特定の実施形態において、テザーは、エーテル基を介してリガンドに結合される。ある特定の実施形態において、テザーは、アミド基またはエーテル基のいずれかを介してリガンドに結合される。ある特定の実施形態において、テザーは、エーテル基を介してリガンドに結合される。

【0439】

ある特定の実施形態において、各テザーは、リガンドと分岐基との間に約８〜約２０原子の鎖長を含む。ある特定の実施形態において、各テザー基は、リガンドと分岐基との間に約１０〜約１８原子の鎖長を含む。ある特定の実施形態において、各テザー基は、約１３原子の鎖長を含む。

【0440】

ある特定の実施形態において、テザーは、以下のなかから選択される構造を有し、

【0441】

【化60】

[この文献は図面を表示できません]

各ｎは、独立して、１〜２０であり、
各ｐは、１〜約６である。

【0442】

ある特定の実施形態において、テザーは、以下のなかから選択される構造を有し、

【0443】

【化61】

[この文献は図面を表示できません]

【0444】

ある特定の実施形態において、テザーは、以下のなかから選択される構造を有し、

【0445】

【化62】

[この文献は図面を表示できません]

式中、各ｎは、独立して、１〜２０である。

【0446】

ある特定の実施形態において、テザーは、以下のなかから選択される構造を有し、

【0447】

【化63】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｌは、リン連結基または中性連結基のいずれかであり、
Ｚ_１は、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ_２であり、
Ｚ_２は、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_６アルキルまたは置換Ｃ_１−Ｃ_６アルキルであり、
Ｒ_２はＨ、Ｃ_１−Ｃ_６アルキルまたは置換Ｃ_１−Ｃ_６アルキルであり、
各ｍ_１は独立して０〜２０であり、各テザーにつき少なくとも１つのｍ_１は０よりも大きい。

【0448】

ある特定の実施形態において、テザーは、以下のなかから選択される構造を有し、

【0449】

【化64】

[この文献は図面を表示できません]

【0450】

ある特定の実施形態において、テザーは、以下のなかから選択される構造を有し、

【0451】

【化65】

[この文献は図面を表示できません]

ここでＺ_２はＨまたはＣＨ_３であり、
各ｍ_１は独立して０〜２０であり、各テザーにつき少なくとも１つのｍ_１は０よりも大きい。

【0452】

ある特定の実施形態において、テザーは、以下のなかから選択される構造を有し、

【0453】

【化66】

[この文献は図面を表示できません]

式中、各ｎは、独立して、０、１、２、３、４、５、６、または７である。

【0454】

ある特定の実施形態において、テザーは、リン連結基を含む。ある特定の実施形態において、テザーは、いかなるアミド結合も含まない。ある特定の実施形態において、テザーは、リン連結基を含み、いかなるアミド結合も含まない。

【0455】

３．ある特定のリガンド
ある特定の実施形態において、本開示は、各リガンドがテザーに共有結合されるリガンドを提供する。ある特定の実施形態において、各リガンドは、標的細胞において少なくとも１種類の受容体に対する親和性を有するように選択される。ある特定の実施形態において、哺乳類肝臓細胞の表面において少なくとも１種類の受容体に対する親和性を有するリガンドが選択される。ある特定の実施形態において、肝アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰ−Ｒ）に対する親和性を有するリガンドが選択される。ある特定の実施形態において、各リガンドは、炭水化物である。ある特定の実施形態において、各リガンドは、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトースアミン、マンノース、グルコース、グルコサミン、及びフコースから独立して選択される。ある特定の実施形態において、各リガンドは、Ｎ−アセチルガラクトースアミン（ＧａｌＮＡｃ）である。ある特定の実施形態において、ターゲティング部分は２〜６個のリガンドを含む。ある特定の実施形態において、ターゲティング部分は３個のリガンドを含む。ある特定の実施形態において、ターゲティング部分は３個のＮ−アセチルガラクトサミンリガンドを含む。

【0456】

ある特定の実施形態において、リガンドは、炭水化物、炭水化物誘導体、修飾炭水化物、多価炭水化物クラスター、多糖、修飾多糖、または多糖誘導体である。ある特定の実施形態において、リガンドは、アミノ糖またはチオ糖である。例えばアミノ糖は、当技術分野で知られている多くの化合物、例えばグルコサミン、シアル酸、α−Ｄ−ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトピラノース（ＧａｌＮＡｃ）、２−アミノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−１−カルボキシエチル］−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース（β−ムラミン酸）、２−デオキシ−２−メチルアミノ−Ｌ−グルコピラノース、４，６−ジデオキシ−４−ホルムアミド−２，３−ジ−Ｏ−メチル−Ｄ−マンノピラノース、２−デオキシ−２−スルホアミノ−Ｄ−グルコピラノース、及びＮ−スルホ−Ｄ−グルコサミン、及びＮ−グリコロイル−α−ノイラミン酸から選択されうる。例えば、チオ糖は、５−チオ−β−Ｄ−グルコピラノース、メチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−１−チオ−６−Ｏ−トリチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、４−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノース、及びエチル３，４，６，７−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−１，５−ジチオ−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏ−ヘプトピラノシドからなる群から選択されうる。

【0457】

ある特定の実施形態において、「ＧａｌＮａｃ」または「Ｇａｌ−ＮＡｃ」は、文献内で一般にＮ−アセチルガラクトサミンと称される２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトピラノースを指す。ある特定の実施形態において、「Ｎ−アセチルガラクトサミン」は、２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトピラノースを指す。ある特定の実施形態において、「ＧａｌＮａｃ」または「Ｇａｌ−ＮＡｃ」は、２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトピラノースを指す。ある特定の実施形態において、「ＧａｌＮａｃ」または「Ｇａｌ−ＮＡｃ」は、β型：２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノースとα型：２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトピラノースの両方を含む、２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトピラノースを指す。ある特定の実施形態において、β型：２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノースとα型：２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトピラノースはどちらも可換的に使用されうる。したがって一方の型が図示される構造において、これらの構造は、他方の型も同様に含むものとする。例えばα型：２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトピラノースの構造が示される場合、この構造は他方の型も同様に含むものとする。特定の好ましい実施形態では、β型：２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトピラノースが好ましい実施形態である。

【0458】

【化67】

[この文献は図面を表示できません]

【0459】

ある特定の実施形態において、２つ以上のリガンドは、以下のなかから選択される構造を有し、

【0460】

【化68】

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式中、各Ｒ_１は、ＯＨ及びＮＨＣＯＯＨから選択される。

【0461】

ある特定の実施形態において、２つ以上のリガンドは以下のなかから選択される構造を有する。

【0462】

【化69】

[この文献は図面を表示できません]

【0463】

ある特定の実施形態において、２つ以上のリガンドは以下のなかから選択される構造を有する。

【0464】

【化70】

[この文献は図面を表示できません]

【0465】

ある特定の実施形態において、２つ以上のリガンドは以下のなかから選択される構造を有する。

【0466】

【化71】

[この文献は図面を表示できません]

【0467】

ｉ．ある特定の共役体
ある特定の実施形態において、共役基は、上述の構造的特徴を含む。特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有し、

【0468】

【化72】

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式中、各ｎは、独立して、１〜２０である。

【0469】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有し、

【0470】

【化73】

[この文献は図面を表示できません]

【0471】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有し、

【0472】

【化74】

[この文献は図面を表示できません]

式中、各ｎは、独立して、１〜２０であり、
Ｚは、Ｈまたは結合固体支持体であり、
Ｑは、アンチセンス化合物であり、
Ｘは、ＯまたはＳであり、
Ｂｘは複素環式塩基部分である。

【0473】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有し、

【0474】

【化75】

[この文献は図面を表示できません]

【0475】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する。

【0476】

【化76】

[この文献は図面を表示できません]

【0477】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する。

【0478】

【化77】

[この文献は図面を表示できません]

【0479】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する。

【0480】

【化78】

[この文献は図面を表示できません]

【0481】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する。

【0482】

【化79】

[この文献は図面を表示できません]

．

【0483】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する。

【0484】

【化80】

[この文献は図面を表示できません]

【0485】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する。

【0486】

【化81】

[この文献は図面を表示できません]

【0487】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する。

【0488】

【化82】

[この文献は図面を表示できません]

【0489】

ある特定の実施形態において、共役体はピロリジンを含まない。

【0490】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する。

【0491】

【化83】

[この文献は図面を表示できません]

【0492】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する。

【0493】

【化84】

[この文献は図面を表示できません]

【0494】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する。

【0495】

【化85】

[この文献は図面を表示できません]

【0496】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する。

【0497】

【化86】

[この文献は図面を表示できません]

【0498】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する。

【0499】

【化87】

[この文献は図面を表示できません]

【0500】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する。

【0501】

【化88】

[この文献は図面を表示できません]

【0502】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する。

【0503】

【化89】

[この文献は図面を表示できません]

【0504】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する。

【0505】

【化90】

[この文献は図面を表示できません]

【0506】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する。

【0507】

【化91】

[この文献は図面を表示できません]

【0508】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する。

【0509】

【化92】

[この文献は図面を表示できません]

【0510】

ある特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する。

【0511】

【化93】

[この文献は図面を表示できません]

【0512】

ある特定の実施形態において、共役基の細胞ターゲティング部分は以下の構造を有し、

【0513】

【化94】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｘは、６〜１１個の連続して結合された原子の置換テザーまたは無置換テザーである。

【0514】

ある特定の実施形態において、共役基の細胞ターゲティング部分は以下の構造を有し、

【0515】

【化95】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｘは、１０個の連続して結合された原子の置換テザーまたは無置換テザーである。

【0516】

ある特定の実施形態において、共役基の細胞ターゲティング部分は以下の構造を有し、

【0517】

【化96】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｘは、４〜１１個の連続して結合された原子の置換テザーまたは無置換テザーであり、当該テザーは、１個だけアミド結合を含む。

【0518】

ある特定の実施形態において、共役基の細胞ターゲティング部分は以下の構造を有し、

【0519】

【化97】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｙ及びＺは、Ｃ_１−Ｃ_１２置換もしくは無置換アルキル、アルケニル、もしくはアルキニル基、またはエーテル、ケトン、アミド、エステル、カルバメート、アミン、ピペリジン、ホスフェート、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、トリアゾール、ピロリジン、ジスルフィド、もしくはチオエーテルを含む基から独立して選択される。

【0520】

ある特定のそのような実施形態において、共役基の細胞ターゲティング部分は以下の構造を有し、

【0521】

【化98】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｙ及びＺは、Ｃ_１−Ｃ_１２置換もしくは無置換アルキル基、またはエーテル１個だけもしくはエーテル２個だけ、アミド、アミン、ピペリジン、ホスフェート、ホスホジエステル、またはホスホロチオエートを含む基から独立して選択される。

【0522】

ある特定のそのような実施形態において、共役基の細胞ターゲティング部分は以下の構造を有し、

【0523】

【化99】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｙ及びＺは、Ｃ_１−Ｃ_１２置換または無置換アルキル基から独立して選択される。

【0524】

ある特定のそのような実施形態において、共役基の細胞ターゲティング部分は以下の構造を有し、

【0525】

【化100】

[この文献は図面を表示できません]

式中、ｍ及びｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２から独立して選択される。

【0526】

ある特定のそのような実施形態において、共役基の細胞ターゲティング部分は以下の構造を有し、

【0527】

【化101】

[この文献は図面を表示できません]

式中、ｍは、４、５、６、７、または８であり、ｎは、１、２、３、または４である。

【0528】

ある特定の実施形態において、共役基の細胞ターゲティング部分は以下の構造を有し、

【0529】

【化102】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｘは、４〜１３個の連続して結合された原子の置換テザーまたは無置換テザーであり、Ｘは、エーテル基を含まない。

【0530】

ある特定の実施形態において、共役基の細胞ターゲティング部分は以下の構造を有し、

【0531】

【化103】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｘは、８個の連続して結合された原子の置換テザーまたは無置換テザーであり、Ｘは、エーテル基を含まない。

【0532】

ある特定の実施形態において、共役基の細胞ターゲティング部分は以下の構造を有し、

【0533】

【化104】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｘは、４〜１３個の連続して結合された原子の置換テザーまたは無置換テザーであり、当該テザーは、１個だけアミド結合を含み、Ｘはエーテル基を含まない。

【0534】

ある特定の実施形態において、共役基の細胞ターゲティング部分は以下の構造を有し、

【0535】

【化105】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｘは、４〜１３個の連続して結合された原子の置換テザーまたは無置換テザーであり、当該テザーは、アミド結合及び置換または無置換Ｃ_２−Ｃ_１１アルキル基からなる。

【0536】

ある特定の実施形態において、共役基の細胞ターゲティング部分は以下の構造を有し、

【0537】

【化106】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｙは、Ｃ_１−Ｃ_１２置換もしくは無置換アルキル、アルケニル、もしくはアルキニル基、またはエーテル、ケトン、アミド、エステル、カルバメート、アミン、ピペリジン、ホスフェート、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、トリアゾール、ピロリジン、ジスルフィド、もしくはチオエーテルを含む基から選択される。

【0538】

ある特定のそのような実施形態において、共役基の細胞ターゲティング部分は以下の構造を有し、

【0539】

【化107】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｙは、Ｃ_１−Ｃ_１２置換もしくは無置換アルキル基、またはエーテル、アミン、ピペリジン、ホスフェート、ホスホジエステル、もしくはホスホロチオエートを含む基から選択される。

【0540】

ある特定のそのような実施形態において、共役基の細胞ターゲティング部分は以下の構造を有し、

【0541】

【化108】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｙは、Ｃ_１−Ｃ_１２置換または無置換アルキル基から選択される。

【0542】

ある特定のそのような実施形態において、共役基の細胞ターゲティング部分は以下の構造を有し、

【0543】

【化109】

[この文献は図面を表示できません]

式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２である。

【0544】

ある特定のそのような実施形態において、共役基の細胞ターゲティング部分は以下の構造を有し、

【0545】

【化110】

[この文献は図面を表示できません]

式中、ｎは、４、５、６、７、または８である。

【0546】

ａ．あり特定の共役アンチセンス化合物
ある特定の実施形態において、共役体は、ヌクレオシドの２’、３’、または５’位でアンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドに結合される。ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は以下の構造を有し、

【0547】

【化111】

[この文献は図面を表示できません]

式中、
Ａは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
Ｂは、切断可能部分であり、
Ｃは、共役リンカーであり、
Ｄは、分岐基であり、
各Ｅは、テザーであり、
各Ｆは、リガンドであり、
ｑは、１〜５の整数である。

【0548】

ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は以下の構造を有し、

【0549】

【化112】

[この文献は図面を表示できません]

式中、
Ａは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
Ｃは、共役リンカーであり、
Ｄは、分岐基であり、
各Ｅは、テザーであり、
各Ｆは、リガンドであり、
ｑは、１〜５の整数である。
ある特定のそのような実施形態において、共役リンカーは、少なくとも１つの切断可能な結合を含む。
ある特定のそのような実施形態において、分岐基は、少なくとも１つの切断可能な結合を含む。
ある特定の実施形態において、各テザーは、少なくとも１つの切断可能な結合を含む。

【0550】

ある特定の実施形態において、共役体は、ヌクレオシドの２’、３’、または５’位でアンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドに結合される。

【0551】

ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は以下の構造を有し、

【0552】

【化113】

[この文献は図面を表示できません]

式中、
Ａは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
Ｂは、切断可能部分であり、
Ｃは、共役リンカーであり、
各Ｅは、テザーであり、
各Ｆは、リガンドであり、かつ
ｑは、１〜５の整数である。

【0553】

ある特定の実施形態において、共役体は、ヌクレオシドの２’、３’、または５’位でアンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドに結合される。ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は以下の構造を有し、

【0554】

【化114】

[この文献は図面を表示できません]

式中、
Ａは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
Ｃは、共役リンカーであり、
各Ｅは、テザーであり、
各Ｆは、リガンドであり、かつ
ｑは、１〜５の整数である。

【0555】

ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は以下の構造を有し、

【0556】

【化115】

[この文献は図面を表示できません]

式中、
Ａは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
Ｂは、切断可能部分であり、
Ｄは、分岐基であり、
各Ｅは、テザーであり、
各Ｆは、リガンドであり、かつ
ｑは、１〜５の整数である。

【0557】

ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は以下の構造を有し、

【0558】

【化116】

[この文献は図面を表示できません]

式中、
Ａは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
Ｄは、分岐基であり、
各Ｅは、テザーであり、
各Ｆは、リガンドであり、かつ
ｑは、１〜５の整数である。

【0559】

ある特定のそのような実施形態において、共役リンカーは、少なくとも１つの切断可能な結合を含む。

【0560】

ある特定の実施形態において、各テザーは、少なくとも１つの切断可能な結合を含む。

【0561】

ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は以下のなかから選択される構造を有する。

【0562】

【化117】

[この文献は図面を表示できません]

【0563】

ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は以下のなかから選択される構造を有する。

【0564】

【化118】

[この文献は図面を表示できません]

【0565】

ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は以下のなかから選択される構造を有する。

【0566】

【化119】

[この文献は図面を表示できません]

【0567】

上述の共役体、共役アンチセンス化合物、テザー、リンカー、分岐基、リガンド、切断可能部分、ならびに他の修飾のいくつかの調製を教示する代表的な米国特許、米国特許出願公開、及び国際特許出願公開には、ＵＳ５，９９４，５１７、ＵＳ６，３００，３１９、ＵＳ６，６６０，７２０、ＵＳ６，９０６，１８２、ＵＳ７，２６２，１７７、ＵＳ７，４９１，８０５、ＵＳ８，１０６，０２２、ＵＳ７，７２３，５０９、ＵＳ２００６／０１４８７４０、ＵＳ２０１１／０１２３５２０号、ＷＯ２０１３／０３３２３０、及びＷＯ２０１２／０３７２５４が含まれるが、これらに限定されず、これらの文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0568】

上述の共役体、共役アンチセンス化合物、テザー、リンカー、分岐基、リガンド、切断可能部分、ならびに他の修飾のいくつかの調製を教示する代表的な出版物には、ＢＩＥＳＳＥＮ ｅｔ ａｌ．「Ｔｈｅ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｏｆ ａ Ｔｒｉａｎｔｅｎｎａｒｙ Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ ｗｉｔｈ Ｈｉｇｈ Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｈｅｐａｔｉｃ Ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ａ Ｐｏｔｅｎｔ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｌｏｗｅｒｉｎｇ Ａｇｅｎｔ」Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９５）３８：１８４６−１８５２、ＢＩＥＳＳＥＮ ｅｔ ａｌ．「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ ｗｉｔｈ Ｈｉｇｈ Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｈｅｐａｔｉｃ Ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ」Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９５）３８：１５３８−１５４６、ＬＥＥ ｅｔ ａｌ．「Ｎｅｗ ａｎｄ ｍｏｒｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ｇｌｙｃｏ−ｌｉｇａｎｄｓ ｆｏｒ ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ」Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０１１）１９：２４９４−２５００、ＲＥＮＳＥＮ ｅｔ ａｌ．「Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｐｐｅｒ Ｓｉｚｅ Ｌｉｍｉｔ ｆｏｒ Ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｔｈｅ Ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｎ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ Ｖｉｖｏ」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１）２７６（４０）：３７５７７−３７５８４、ＲＥＮＳＥＮ ｅｔ ａｌ．「Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ−Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ Ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｈｅｐａｔｉｃ Ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ」Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２００４）４７：５７９８−５８０８、ＳＬＩＥＤＲＥＧＴ ｅｔ ａｌ．「Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅｓ ｆｏｒ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｈｅｐａｔｉｃ Ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ」Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）４２：６０９−６１８、及びＶａｌｅｎｔｉｊｎ ｅｔ ａｌ．「Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌｙｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ Ｃｌｕｓｔｅｒ ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ」Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９７，５３（２），７５９−７７０が含まれるが、これらに限定されず、これらの文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0569】

ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は、ＲＮａｓｅ Ｈベースのオリゴヌクレオチド（ギャップマーなど）またはスプライス調節オリゴヌクレオチド（完全修飾オリゴヌクレオチドなど）、及び少なくとも１つ、２つ、または３つのＧａｌＮＡｃ基を含む任意の共役基を含む。ある特定の実施形態において、共役アンチセンス化合物は、以下の参考文献：Ｌｅｅ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ Ｒｅｓ，１９７８，６７，５０９−５１４、Ｃｏｎｎｏｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９８２，２５７，９３９−９４５、Ｐａｖｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ，１９８３，２２，５３９−５４８、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９８４，２３，４２５５−４２６１、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ，１９８７，４，３１７−３２８、Ｔｏｙｏｋｕｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ，１９９０，３１，２６７３−２６７６、Ｂｉｅｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，１９９５，３８，１５３８−１５４６、Ｖａｌｅｎｔｉｊｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９７，５３，７５９−７７０、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ，１９９７，３８，３４８７−３４９０、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ，１９９７，８，７６２−７６５、Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ，２００１，１１，８２１−８２９、Ｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００１，２７６，３７５７７−３７５８４、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，２００３，３６２，３８−４３、Ｗｅｓｔｅｒｌｉｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ，２００４，２１，２２７−２４１、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ，２００６，１６（１９），５１３２−５１３５、Ｍａｉｅｒｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，２００７，１５，７６６１−７６７６、Ｋｈｏｒｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，２００８，１６，５２１６−５２３１、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，２０１１，１９，２４９４−２５００、Ｋｏｒｎｉｌｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ，２０１２，４２５，４３−４６、Ｐｕｊｏｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ，２０１２，５１，７４４５−７４４８、Ｂｉｅｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，１９９５，３８，１８４６−１８５２、Ｓｌｉｅｄｒｅｇｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，１９９９，４２，６０９−６１８、Ｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，２００４，４７，５７９８−５８０８、Ｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ，２００６，２６，１６９−１７５、ｖａｎ Ｒｏｓｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２００４，１１，４５７−４６４、Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，２００４，１２６，１４０１３−１４０２２、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ，２０１２，７７，７５６４−７５７１、Ｂｉｅｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ，２０００，１４，１７８４−１７９２、Ｒａｊｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ，１９９７，８，９３５−９４０、Ｄｕｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，２０００，３１３，２９７−３２１、Ｍａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ，２００３，１４，１８−２９、Ｊａｙａｐｒａｋａｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ Ｌｅｔｔ，２０１０，１２，５４１０−５４１３、Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ，２００２，１２，１０３−１２８、Ｍｅｒｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ，１９９４，５，６１２−６２０、Ｔｏｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，２０１３，２１，５２７５−５２８１、国際出願ＷＯ１９９８／０１３３８１；ＷＯ２０１１／０３８３５６；ＷＯ１９９７／０４６０９８；ＷＯ２００８／０９８７８８；ＷＯ２００４／１０１６１９；ＷＯ２０１２／０３７２５４；ＷＯ２０１１／１２００５３；ＷＯ２０１１／１００１３１；ＷＯ２０１１／１６３１２１；ＷＯ２０１２／１７７９４７；ＷＯ２０１３／０３３２３０；ＷＯ２０１３／０７５０３５；ＷＯ２０１２／０８３１８５；ＷＯ２０１２／０８３０４６；ＷＯ２００９／０８２６０７；ＷＯ２００９／１３４４８７；ＷＯ２０１０／１４４７４０；ＷＯ２０１０／１４８０１３；ＷＯ１９９７／０２０５６３；ＷＯ２０１０／０８８５３７；ＷＯ２００２／０４３７７１；ＷＯ２０１０／１２９７０９；ＷＯ２０１２／０６８１８７；ＷＯ２００９／１２６９３３；ＷＯ２００４／０２４７５７；ＷＯ２０１０／０５４４０６；ＷＯ２０１２／０８９３５２；ＷＯ２０１２／０８９６０２；ＷＯ２０１３／１６６１２１；ＷＯ２０１３／１６５８１６；米国特許４，７５１，２１９；８，５５２，１６３；６，９０８，９０３；７，２６２，１７７；５，９９４，５１７；６，３００，３１９；８，１０６，０２２；７，４９１，８０５；７，４９１，８０５；７，５８２，７４４；８，１３７，６９５；６，３８３，８１２；６，５２５，０３１；６，６６０，７２０；７，７２３，５０９；８，５４１，５４８；８，３４４，１２５；８，３１３，７７２；８，３４９，３０８；８，４５０，４６７；８，５０１，９３０；８，１５８，６０１；７，２６２，１７７；６，９０６，１８２；６，６２０，９１６；８，４３５，４９１；８，４０４，８６２；７，８５１，６１５；米国特許出願公開ＵＳ２０１１／００９７２６４；ＵＳ２０１１／００９７２６５；ＵＳ２０１３／０００４４２７；ＵＳ２００５／０１６４２３５；ＵＳ２００６／０１４８７４０；ＵＳ２００８／０２８１０４４；ＵＳ２０１０／０２４０７３０；ＵＳ２００３／０１１９７２４；ＵＳ２００６／０１８３８８６；ＵＳ２００８／０２０６８６９；ＵＳ２０１１／０２６９８１４；ＵＳ２００９／０２８６９７３；ＵＳ２０１１／０２０７７９９；ＵＳ２０１２／０１３６０４２；ＵＳ２０１２／０１６５３９３；ＵＳ２００８／０２８１０４１；ＵＳ２００９／０２０３１３５；ＵＳ２０１２／００３５１１５；ＵＳ２０１２／００９５０７５；ＵＳ２０１２／０１０１１４８；ＵＳ２０１２／０１２８７６０；ＵＳ２０１２／０１５７５０９；ＵＳ２０１２／０２３０９３８；ＵＳ２０１３／０１０９８１７；ＵＳ２０１３／０１２１９５４；ＵＳ２０１３／０１７８５１２；ＵＳ２０１３／０２３６９６８；ＵＳ２０１１／０１２３５２０；ＵＳ２００３／００７７８２９；ＵＳ２００８／０１０８８０１；及びＵＳ２００９／０２０３１３２のうちのいずれかにおいて見いだされる任意の共役基を含み、これらの文献のそれぞれは参照によりその全体が組み込まれる。

【0570】

細胞培養及びアンチセンス化合物による治療
アンチセンス化合物がＰＫＫ核酸のレベル、活性または発現に与える効果は、様々な細胞型でｉｎ ｖｉｔｒｏで試験を行うことができる。このような分析に使用する細胞型は、市販の販売者（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｍａｎａｓｓｕｓ， ＶＡ； Ｚｅｎ−Ｂｉｏ， Ｉｎｃ．， Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ， ＮＣ； Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手可能であり、市販で入手可能な試薬（例えばＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールズバッド）を使用して、販売者の指示書に従って培養する。例示的な細胞型としては、ＨｅｐａＲＧ^TMＴ細胞及びマウス初代培養肝細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

【0571】

アンチセンスオリゴヌクレオチドのインビトロ試験
本明細書には、細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置するための方法を記載する。この方法には、他のアンチセンス化合物による処置のために、適宜変更を加えることができる。

【0572】

細胞は、細胞が培養中で約６０〜８０％コンフルエントに達した時に、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理することができる。

【0573】

培養細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入するためによく使用される試薬の一つに、カチオン性脂質トランスフェクション試薬ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カリフォルニア州カールズバッド）がある。アンチセンスオリゴヌクレオチドをＯＰＴＩ−ＭＥＭ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カリフォルニア州カールズバッド）中でＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮと混合することで、所望の最終アンチセンスオリゴヌクレオチド濃度と、１００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドあたり２〜１２μｇ／ｍＬの範囲に及びうるＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ濃度にする。

【0574】

培養細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入するために使用されるもう一つの試薬は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カリフォルニア州カールズバッド）である。アンチセンスオリゴヌクレオチドをＯＰＴＩ−ＭＥＭ１還元血清培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カリフォルニア州カールズバッド）中でＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥと混合することで、所望のアンチセンスオリゴヌクレオチド濃度と、１００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドあたり２〜１２μｇ／ｍＬの範囲に及びうるＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮ濃度にする。

【0575】

培養細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入するために使用されるもう一つの技法に、エレクトロポレーションがある。

【0576】

培養細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入するために使用されるさらにもう一つの技法に、細胞によるオリゴヌクレオチド自由取り込みがある。

【0577】

細胞は、常法により、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理される。細胞はアンチセンスオリゴヌクレオチド処理の１６〜２４時間後に収集することができ、その時点で、標的核酸のＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルが、当技術分野に知られておりかつ本明細書に記載する方法によって測定される。一般に、複数の複製試料で処理を行う場合は、複製試料処理の平均としてデータを表す。

【0578】

使用するアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度は、細胞株ごとに異なる。ある特定細胞株に関して最適なアンチセンスオリゴヌクレオチド濃度を決定するための方法は、当技術分野では周知である。ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥによるトランスフェクションの場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、１ｎＭ〜３００ｎＭの範囲の濃度で使用される。エレクトロポレーションによるトランスフェクションの場合は、それより高い６２５ｎＭから２０，０００ｎＭまでの範囲の濃度で、アンチセンスオリゴヌクレオチドが使用される。

【0579】

ＲＮＡの単離
ＲＮＡ分析は、全細胞ＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡで行うことができる。ＲＮＡ単離の方法は当技術分野ではよく知られている。ＲＮＡは当技術分野において周知の方法を使って、例えばＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カリフォルニア州カールズバッド）を製造者が推奨するプロトコルに従って使用することによって、調製される。

【0580】

標的レベルまたは発現の阻害の分析
ＰＫＫ核酸のレベルまたは発現の阻害は、当技術分野で周知の様々な方法でアッセイすることができる。例えば、標的核酸レベルは、例えばノーザンブロット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、または定量的リアルタイムＰＣＲによって定量することができる。ＲＮＡ分析は、全細胞ＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡで行うことができる。ＲＮＡ単離の方法は当技術分野ではよく知られている。ノーザンブロット分析は、また当該技術分野ではルーチンになっている。定量的リアルタイムＰＣＲは、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州フォスターシティーから入手できる市販のＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７６００、７７００、または７９００配列検出システムを、製造者の指示書に従って使用することで好都合に達成することができる。

【0581】

標的ＲＮＡレベルの定量的リアルタイムＰＣＲ分析
標的ＲＮＡレベルの定量は、製造業者の説明書に従ってＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７６００、７７００、または７９００配列検出システム（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて定量的リアルタイムＰＣＲによって達成することができる。定量的リアルタイムＰＣＲの方法は、当技術分野でよく知られている。

【0582】

リアルタイムＰＣＲの前に、単離されたＲＮＡは、逆転写酵素（ＲＴ）反応に供し、リアルタイムＰＣＲ増幅のための基質として使用される相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成する。ＲＴ及びリアルタイムＰＣＲ反応は、同じ試料ウェル中で順次実施する。ＲＴ及びリアルタイムＰＣＲ試薬は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（カリフォルニア州カールズバッド）から得ることができる。ＲＴリアルタイムＰＣＲ反応は、当業者に周知の方法によって実施される。

【0583】

リアルタイムＰＣＲによって得られる遺伝子（またはＲＮＡ）標的量は、シクロフィリンＡ等の、発現が一定である遺伝子の発現レベルを使用、またはＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． カリフォルニア州カールスバッド）を使用した総ＲＮＡの定量化のどちらかによって正規化する。シクロフィリンＡの発現は、リアルタイムＰＣＲ、標的と同時、多重化、または別個に実行することによって定量する。総ＲＮＡは、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮによるＲＮＡ定量試薬（Ｉｎｖｅｔｒｏｇｅｎ， Ｉｎｃ． オレゴン州ユージーン）を使用して定量する。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮによるＲＮＡ定量化の方法は、Ｊｏｎｅｓ， Ｌ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ， （Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９８， ２６５， ３６８−３７４）に教示されている。ＣＹＴＯＦＬＵＯＲ ４０００装置（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ蛍光を測定するために使用する。

【0584】

プローブ及びプライマーは、ＰＫＫ核酸にハイブリダイズするように設計する。リアルタイムＰＣＲプローブ及びプライマーの設計方法は、当該分野で周知であり、ＰＲＩＭＥＲ ＥＸＰＲＥＳＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）等のソフトウェアを使用してもよい。

【0585】

タンパク質レベルの分析
ＰＫＫ核酸のアンチセンス阻害は、ＰＫＫタンパク質レベルを測定することによって評価することができる。ＰＫＫのタンパク質レベルは、免疫沈降、ウエスタンブロット分析（イムノブロッティング）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、定量タンパク質アッセイ、タンパク質活性アッセイ（例えば、カスパーゼ活性アッセイ）、免疫組織化学、免疫細胞化学または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）等の当該技術で周知の様々な方法で評価または定量化することができる。標的に対する抗体を同定し、抗体のＭＳＲＳカタログ（Ａｅｒｉｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ミズーリ州バーミンガム）等の種々のソースから得ることができ、当該技術で周知の従来のモノクローナルまたはポリクローナル抗体生成法で調製することができる。

【0586】

アンチセンス化合物のｉｎ ｖｉｖｏ試験
ＰＫＫの発現を阻害し、表現型の変化を起こす能力を評価するために、アンチセンス化合物、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの試験を動物で行う。

【0587】

ある特定の実施形態では、そのような表現型の変化は、炎症性疾患に関連するもの、例えば、炎症、浮腫／腫脹、血管透過性、及び血管漏出の減少を含む。ある特定の実施形態では、炎症は、動物の浮腫、体温、痛み、組織の色、及び腹部の機能の増加または減少を測定することによって測定する。

【0588】

ある特定の実施形態では、そのような表現型の変化として、血栓塞栓性疾患に関連するもの、例えば、長時間のａＰＴＴ、正常なＰＴと組み合わせた場合の長時間のａＰＴＴ時間、血小板第４因子（ＰＦ−４）の量の減少、血栓の形成の減少または血栓形成の時間の増加が挙げられる。

【0589】

正常な動物、または実験的疾患モデルで、試験を実施してもよい。動物に投与するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、リン酸緩衝生理食塩水等の医薬上許容される希釈剤中で製剤化する。腹腔内、静脈内、及び皮下等の非経口投与経路で投与を行う。アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与量及び投薬頻度の計算は当業者の能力の範囲内で行われ、投与経路及び動物の体重等の要因に依存する。アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置期間の後、ＲＮＡを肝臓組織から単離し、ＰＫＫ核酸発現の変化を測定する。

【0590】

ある特定の適応
ある特定の実施形態では、本発明は、個体の治療方法を提供し、本明細書に記載の１つ以上の医薬組成物を投与することを含む。

【0591】

ある特定の実施形態では、個体は、炎症性疾患を有する。ある特定の実施形態では、個体は、以下に限定されないが、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）、浮腫、血管浮腫、腫脹、目蓋の血管浮腫、眼の浮腫、黄斑浮腫、及び脳浮腫を含む炎症性の症状を発症する危険性がある。これは、炎症のリスクをもたらす後天性の問題、疾患または障害、例えば、炎症性の病態に対する遺伝的素因、環境因子、及びＡＣＥ阻害剤及びＡＲＢといった特定の医薬品への暴露を有する個体を含む。ある特定の実施形態では、当該個体は、抗炎症治療を必要とする個体であると判断されている。当該個体の例として、補体１エステラーゼ阻害剤（すなわち、Ｃ１−ＩＮＨ）または因子１２の遺伝子コードに変異を有する個体含まれるが、これに限定されない。ある特定の実施形態では、異常なコードは、Ｃ１−ＩＮＨ（Ｉ型ＨＡＥ）の欠損、適切に機能するための既存のＣ１−ＩＮＨの不能（ＩＩ型ＨＡＥ）、または超機能亢進性因子１２（ＩＩＩ型ＨＡＥ）につながる可能性がある。

【0592】

ある特定の実施形態では、個体は、血栓塞栓性疾患を有している。ある特定の実施形態では、個体は、血液凝固障害の危険性があり、これらに限定されないが、梗塞、血栓症、塞栓症、深部静脈血栓症等の血栓塞栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、及び脳卒中を含む。これは、例えば、手術、がん、不動、敗血症、アテローム性動脈硬化症、心房細動といった血栓症のリスクにつながる後天性の問題、疾患、または障害、ならびに遺伝的素因、例えば抗リン脂質抗体症候群及び常染色体の有意性条件、第Ｖ因子ライデンがを有する個体を含む。ある特定の実施形態では、当該個体は、抗炎症治療を必要とする個体であると判断されている。このような個体の例として、限定されないが、主要な整形外科手術（例えば、腰／膝関節の交換または股関節骨折手術）を受けている個体、動脈細動を罹患しており、脳卒中を予防するために慢性治療の必要がある患者が挙げられる。

【0593】

ある特定の実施形態では、本発明は、個体のＰＫＫ発現を予防の目的で減少させる方法を提供している。ある特定の実施形態は、個体にＰＫＫ核酸を標的とする治療有効量のアンチセンス化合物を投与することにより、治療を必要とする個体を治療することを含む。

【0594】

一実施形態では、ＰＫＫ核酸を標的とする治療有効量のアンチセンス化合物の投与は、アンチセンス化合物の投与に対する個体の反応を測定するために、個体の血清中のＰＫＫレベルのモニタリングを伴う。アンチセンス化合物の投与に対する個体の応答は、治療介入の量及び持続時間を決定するために医師が使用する。

【0595】

ある特定の実施形態では、ＰＫＫ核酸を標的とするアンチセンス化合物を投与することにより、少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％、またはこれらの２つの値によって定義される範囲でＰＫＫ発現を減少させる。ある特定の実施形態では、ＰＫＫを標的とするアンチセンス化合物を含む医薬組成物は、炎症性疾患または血栓塞栓性疾患を罹患している、またはその疑いのある患者を治療するために、医薬品を調製するために使用する。

【0596】

ある特定の組成物
１．ＩＳＩＳ ５４６２５４
ある特定の実施形態では、ＩＳＩＳ ５４６２５４は、５−１０−５ＭＯＥギャップマーを特徴とし、（５’から３’）ＴＧＣＡＡＧＴＣＴＣＴＴＧＧＣＡＡＡＣＡ（配列番号５７０として本明細書に組み込まれる）の配列を有し、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合であり、各シトシンは、５’−メチルシトシンであり、ヌクレオシド１−５及び１６−２０のそれぞれは、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ヌクレオシドであり、ヌクレオシド６−１５のそれぞれは、２’−デオキシヌクレオシドである。

【0597】

ある特定の実施形態では、ＩＳＩＳ ５４６２５４は、以下の化学表記法：Ｔｅｓ Ｇｅｓ ｍＣｅｓ Ａｅｓ Ａｅｓ Ｇｄｓ Ｔｄｓ ｍＣｄｓ Ｔｄｓ ｍＣｄｓ Ｔｄｓ Ｔｄｓ Ｇｄｓ Ｇｄｓ ｍＣｄｓ Ａｅｓ Ａｅｓ Ａｅｓ ｍＣｅｓ Ａｅによって記述され、ここで、
Ａ＝アデニン、
ｍＣ＝５’−メチルシトシン、
Ｇ＝グアニン、
Ｔ＝チミン、
ｅ＝２’−Ｏ−メトキシメチル修飾ヌクレオシド、
ｄ＝２’−デオキシヌクレオシド、及び
ｓ＝ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

【0598】

ある特定の実施形態では、ＩＳＩＳ ５４６２５４は、以下の化学構造によって記述される。

【0599】

【化120】

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【0600】

構造１ ＩＳＩＳ ５４６２５４
ある特定の実施形態では、実施例２（以下）に提供されるように、ＩＳＩＳ ５４６２５４は、処理時間２４時間の後に、エレクトロポレーションを用いて５，０００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトし、ヒトプライマープローブセットＲＴＳ３４５４を使用することによって測定し、定量的リアルタイムＰＣＲにより測定し、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定された総ＲＮＡ含量に従って調整した場合に、培養されたＨｅｐａＲＧ（商標）細胞（ウェル当たり２０，０００細胞の密度）中のヒトＰＫＫ ｍＲＮＡを９５％阻害した。

【0601】

ある特定の実施形態では、実施例５（以下の表３４及び４１参照）に提供されるように、ＩＳＩＳ ５４６２５４は、処理時間１６時間の後に、エレクトロポーションを用いてトランスフェクトし、ヒトプライマープローブセットＲＴＳ３４５４を用いて、定量的リアルタイムＰＣＲによって測定し、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定された総ＲＮＡ含量に従って調整した場合に、培養されたＨｅｐａＲＧ（商標）細胞（ウェルあたり２０，０００細胞の密度）中で、４点用量反応曲線（０．１９μＭ、０．５６μＭ、１．６７μＭ、及び５．０μＭ）で、０．２μＭ及び０．３μＭのＩＣ_５０を達成した。

【0602】

ある特定の実施形態では、実施例７（以下）に提供されるように、ＩＳＩＳ ５４６２５４は、ヒトＰＫＫ遺伝子配列を保有するトランスジェニックマウスに、２．５ｍｇ／ｋｇ／週、５．０ｍｇ／ｋｇ／週、１０ｍｇ／ｋｇ／週または２０ｍｇ／ｋｇ／週のＩＳＩＳ ５４６２５４を、３週間、週２回皮下注射した場合に、３１％、５５％、８４％、及び８３％のヒトＰＫＫ ｍＲＮＡ阻害及び０％、３６％、５１％、及び７６％のヒトＰＫＫタンパク質阻害を達成した。

【0603】

ある特定の実施形態では、実施例８（以下）に提供されるように、ＩＳＩＳＩ ５４６２５４は、ＰＫＫ ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現の阻害に有効であり、霊長類に許容される。

【0604】

２．ＩＳＩＳ ５４６３４３
ある特定の実施形態では、ＩＳＩＳ ５４６３４３は、５−１０−５ＭＯＥギャップマーを特徴とし、（５’から３’） ＣＣＣＣＣＴＴＣＴＴＴＡＴＡＧＣＣＡＧＣ（配列番号７０５として本明細書に組み込まれる）の配列を有し、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合であり、各シトシンは、５’−メチルシトシンであり、ヌクレオシド１−５及び１６−２０のそれぞれは、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ヌクレオシドであり、ヌクレオシド６−１５のそれぞれは、２’−デオキシヌクレオシドである。

【0605】

ある特定の実施形態では、ＩＳＩＳ ５４６３４３は、以下の化学表記法：ｍＣｅｓ ｍＣｅｓ ｍＣｅｓ ｍＣｅｓ ｍＣｅｓ Ｔｄｓ Ｔｄｓ ｍＣｄｓ Ｔｄｓ Ｔｄｓ Ｔｄｓ Ａｄｓ Ｔｄｓ Ａｄｓ Ｇｄｓ ｍＣｅｓ ｍＣｅｓ Ａｅｓ Ｇｅｓ ｍＣｅで記述され、ここで、
Ａ＝アデニン、
ｍＣ＝５’−メチルシトシン、
Ｇ＝グアニン、
Ｔ＝チミン、
ｅ＝２’−Ｏ−メトキシメチル修飾ヌクレオシド、
ｄ＝２’−デオキシヌクレオシド、及び
ｓ＝ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

【0606】

ある特定の実施形態では、ＩＳＩＳ ５４６３４３は、以下の化学構造によって記述される。

【0607】

【化121】

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【0608】

構造２ ＩＳＩＳ ５４６３４３
ある特定の実施形態では、実施例２（以下の表９及び１０を参照のこと）に提供されるように、ＩＳＩＳ ５４６３４３は、処理時間２４時間の後に、エレクトロポレーションを用いて５，０００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトし、ヒトプライマープローブセットＲＴＳ３４５４を使用することによって測定し、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定された総ＲＮＡ含量に従って調整された定量的リアルタイムＰＣＲにより測定した場合に、培養されたＨｅｐａＲＧ（商標）細胞（ウェル当たり２０，０００細胞の密度）中のヒトＰＫＫ ｍＲＮＡを９７％及び９１％阻害した。

【0609】

ある特定の実施形態では、実施例５（以下の表３４及び４１参照）に提供されるように、ＩＳＩＳ５４６３４３は、処理時間１６時間の後に、エレクトロポーションを用いてトランスフェクトし、ヒトプライマープローブセットＲＴＳ３４５４を使用して定量的リアルタイムＰＣＲによって測定し、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定された総ＲＮＡ含量に従って調整した場合に、培養されたＨｅｐａＲＧ（商標）細胞（ウェルあたり２０，０００細胞の密度）中で、４点用量反応曲線（０．１９μＭ、０．５６μＭ、１．６７μＭ、及び５．０μＭ）で、０．４μＭのＩＣ_５０を達成した。

【0610】

ある特定の実施形態では、実施例７（以下）に提供されるように、ＩＳＩＳ ５４６３４３は、ヒトＰＫＫ遺伝子配列を保有するトランスジェニックマウスに、２．５ｍｇ／ｋｇ／週、５．０ｍｇ／ｋｇ／週、１０ｍｇ／ｋｇ／週または２０ｍｇ／ｋｇ／週のＩＳＩＳ ５４６３４３を、３週間、週２回皮下注射した場合に、４６％、６６％及び８６％のヒトＰＫＫ ｍＲＮＡ阻害及び０％、３８％及び７９％のヒトＰＫＫタンパク質阻害を達成した。

【0611】

ある特定の実施形態では、実施例８（以下）に提供されるように、ＩＳＩＳＩ ５４６３４３は、ＰＫＫ ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現の阻害に有効であり、霊長類に許容される。

【0612】

３．ＩＳＩＳ ５４８０４８
ある特定の実施形態では、ＩＳＩＳ ５４８０４８は、核酸塩基配列（５’から３’）ＣＧＡＴＡＴＣＡＴＧＡＴＴＣＣＣ（配列番号１６６６として本明細書に取り込まれる）を有する修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを特徴とし、１６個の２’−デオキシヌクレオシド、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ヌクレオシド、及びｃＥｔ修飾ヌクレオシドの組み合わせから成り、ヌクレオシド１，２及び１６のそれぞれは、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ヌクレオシドであり、ヌクレオシド３、１４、及び１５のそれぞれはｃＥｔ修飾ヌクレオシドであり、ヌクレオシド４−１３のそれぞれは２’−デオキシヌクレオシドであり、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、各シトシンは、５’−メチルシトシンである。

【0613】

ある特定の実施形態では、ＩＳＩＳ ５４８０４８は、以下の化学表記：ｍＣｅｓ Ｇｅｓ Ａｋｓ Ｔｄｓ Ａｄｓ Ｔｄｓ ｍＣｄｓ Ａｄｓ Ｔｄｓ Ｇｄｓ Ａｄｓ Ｔｄｓ Ｔｄｓ ｍＣｋｓ ｍＣｋｓ ｍＣｅによって記述され、ここで
Ａ＝アデニン、
ｍＣ＝５’−メチルシトシン、
Ｇ＝グアニン、
Ｔ＝チミン、
ｅ＝２’−Ｏ−メトキシメチル修飾ヌクレオシド、
k＝ｃＥｔ修飾ヌクレオシド、
ｄ＝２’−デオキシヌクレオシド、及び
ｓ＝ホスホロチオエートヌクレオシド間結合

【0614】

ある特定の実施形態では、ＩＳＩＳ ５４８０４８は、以下の化学構造によって記述される。

【0615】

【化122】

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【0616】

構造３ ＩＳＩＳ ５４８０４８
ある特定の実施形態では、実施例３（以下）に提供されるように、ＩＳＩＳ ５４８０４８は、処理時間２４時間の後に、エレクトロポーションを用いて１，０００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトし、ヒトプライマープローブセットＲＴＳ３４５４を使用して定量的リアルタイムＰＣＲにより測定し、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定された総ＲＮＡ含量に従って調整した場合に、培養されたＨｅｐａＲＧ（商標）細胞（ウェル当たり２０，０００細胞の密度）中のｍＲＮＡを８４％阻害した。

【0617】

ある特定の実施形態では、実施例６（以下）に提供されるように、ＩＳＩＳ ５４８０４８は、処理時間１６時間の後に、エレクトロポーションを用いてトランスフェクトし、ヒトプライマープローブセットＲＴＳ３４５４を用いて、定量的リアルタイムＰＣＲによって測定し、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定された総ＲＮＡ含量に従って調整した場合に、培養されたＨｅｐａＲＧ（商標）細胞（ウェルあたり２０，０００細胞の密度）中で、４点用量反応曲線（０．１１μＭ、０．３３μＭ、１．００μＭ、及び３．００μＭ）で、０．１μＭのＩＣ_５０を達成した。

【0618】

ある特定の実施形態では、実施例７（以下）に提供されるように、ＩＳＩＳ５４８０４８は、ヒトＰＫＫ遺伝子配列を保有するトランスジェニックマウスに、ＩＳＩＳ ５４８０４８を、２．５ｍｇ／ｋｇ／週、５．０ｍｇ／ｋｇ／週、１０ｍｇ／ｋｇ／週または２０ｍｇ／ｋｇ／週の３週間で、週２回皮下注射した場合に、７％、７７％、７２％及び８０％のヒトＰＫＫ ｍＲＮＡ阻害及び２３％、７０％、８９％及び９８％のヒトＰＫＫタンパク質阻害を達成した。

【0619】

ある特定の実施形態では、実施例８（以下）に提供されるように、ＩＳＩＳＩ ５４８０４８は、ＰＫＫ ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現の阻害に有効であり、霊長類に許容される。

【0620】

４．ＩＳＩＳ ７２１７４４
ある特定の実施形態では、ＩＳＩＳ ７２１７４４は、５−１０−５ＭＯＥギャップマーとして特徴を有し、（５’から３’）ＴＧＣＡＡＧＴＣＴＣＴＴＧＧＣＡＡＡＣＡ（配列番号５７０として本明細書に組み込まれる）の配列を有し、ヌクレオシド３〜４、４〜５、１６〜１７、及び１７〜１８の間のヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合であり、ヌクレオシド１〜２、２〜３、５〜６、６〜７、７〜８、８〜９、９〜１０、１０〜１１、１１〜１２、１２〜１３、１３〜１４、１４〜１５、１５〜１６、１８〜１９、及び１９〜２０の間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、各シトシンは５’−メチルシトシンであり、ヌクレオシド１〜５及び１６〜２０のそれぞれは、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ヌクレオシドであり、ヌクレオシド６〜１５のそれぞれは、２’−デオキシヌクレオシドである。

【0621】

ある特定の実施形態では、ＩＳＩＳ ７２１７４４は、以下の化学表記：ＧａｌＮＡｃ３−７_ａ−ｏ’Ｔｅｓ Ｇｅｓ ｍＣｅｏ Ａｅｏ Ａｅｓ Ｇｄｓ Ｔｄｓ ｍＣｄｓ Ｔｄｓ ｍＣｄｓ Ｔｄｓ Ｔｄｓ Ｇｄｓ Ｇｄｓ ｍＣｄｓ Ａｅｏ Ａｅｏ Ａｅｓ ｍＣｅｓ Ａｅによって記述され、ここで、
Ａ＝アデニン、
ｍＣ＝５’−メチルシトシン、
Ｇ＝グアニン、
Ｔ＝チミン、
ｅ＝２’−Ｏ−メトキシメチル修飾ヌクレオシド、
ｄ＝２’−デオキシヌクレオシド、及び
ｏ＝ホスホジエステルヌクレオシド間結合、
ｓ＝ホスホロチオエートヌクレオシド間結合、及び
ＧａｌＮＡｃ３−７_ａ−ｏ’＝

【0622】

【化123】

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【0623】

ある特定の実施形態では、ＩＳＩＳ ７２１７４４は、以下の化学構造によって記述される。

【0624】

【化124】

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【0625】

ある特定のホットスポット領域
１．配列番号１０の核酸塩基２７４２７〜２７４６６
ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１０の核酸塩基２７４２７〜２７４６６を標的とするように設計する（ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＮＴ＿０１６３５４．１９、核酸塩基１１１６９３００１〜１１１７３００００を切り捨てられた）。ある特定の実施形態では、配列番号１０の核酸塩基２７４２７〜２７４６６は、ホットスポット領域である。ある特定の実施形態では、配列番号１０の核酸塩基２７４２７〜２７４６６はアンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的とされる。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが１５、１６、１７、１８、１９、または２０の核酸塩基である。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーである。ある特定の実施形態では、ギャップマーは５−１０−５ＭＯＥギャップマー、４−９−４ＭＯＥギャップマー、４−１０−４ＭＯＥギャップマー、４−１０−３ＭＯＥギャップマー、３−１０−４ＭＯＥギャップマー、または３−１０−３ＭＯＥギャップマーである。ある特定の実施形態では、ギャップマーは、５−１０−５ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、４−９−４ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、４−１０−４ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、４−１０−３ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、３−１０−４ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、または３−１０−３ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマーである。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドはホスホロチオエートヌクレオシド間結合によって連結されている。

【0626】

ある特定の実施形態では、配列番号１０の核酸塩基２７４２７〜２７４６６は、ＩＳＩＳ番号：５３０９９３、５３０９９４、５３０９９５、５４６２５１、５４６２５２、５４６２５３、５４６２５４、５４６２５５、５４６２５６、５４７４１０、５４７４１１、５４７９７８、５４７９７９、５４７９８０、及び５４７９８１によって標的とされる。

【0627】

ある特定の実施形態では、配列番号１０の核酸塩基の核酸塩基２７４２７〜２７４６６は、配列番号９４、９５、９６、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、１５９７、１５９８、１５９９、及び１６００によって標的とされる。

【0628】

ある実施形態では、配列番号１０の核酸塩基２７４２７〜２７４６６を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４２％、少なくとも４３％、少なくとも４４％、少なくとも４５％、少なくとも４６％、少なくとも４７％、少なくとも４８％、少なくとも４９％、少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ ｖｉｖｏでＰＫＫ及び／またはタンパク質のレベルの減少を達成する。

【0629】

２．配列番号１０の核酸塩基３３１８３〜３３２４２
ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１０の核酸塩基３３１８３〜３３２４２を標的とするように設計する（核酸塩基１１１６９３００１〜１１１７３００００を切り捨てられたＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＮＴ＿０１６３５４．１９）。ある特定の実施形態では、配列番号１０の核酸塩基３３１８３〜３３２４２はホットスポット領域である。ある特定の実施形態では、配列番号１０の核酸塩基３３１８３〜３３２４２は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的とされる。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが１５、１６、１７、１８、１９、または２０の核酸塩基である。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーである。ある特定の実施形態では、ギャップマーは５−１０−５ＭＯＥギャップマー、４−９−４ＭＯＥギャップマー、４−１０−４ＭＯＥギャップマー、４−１０−３ＭＯＥギャップマー、３−１０−４ＭＯＥギャップマー、または３−１０−３ＭＯＥギャップマーである。ある特定の実施形態では、ギャップマーは、５−１０−５ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、４−９−４ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、４−１０−４ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、４−１０−３ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、３−１０−４ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、または３−１０−３ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマーである。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドはホスホロチオエートヌクレオシド間結合によって連結されている。

【0630】

ある特定の実施形態では、配列番号１０の核酸塩基３３１８３〜３３２４２は、ＩＳＩＳ番号：５３１０５２、５３１０５３、５３１０５４、５３１０５５、５３１０５６、５３１０５７、５３１１５８、５４６３４３、５４６３４５、５４７４８０、５４７４８１、５４７４８２、及び５４７４８３によって標的とされる。

【0631】

ある特定の実施形態では、配列番号１０の３３１８３〜３３２４２は、配列番号１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、２６１、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、及び７０７によって標的とされる。

【0632】

ある特定の実施形態では、配列番号１０の核酸塩基３３１８３〜３３２４２を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４２％、少なくとも４３％、少なくとも４４％、少なくとも４５％、少なくとも４６％、少なくとも４７％、少なくとも４８％、少なくとも４９％、少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ ｖｉｖｏで、ＰＫＫ ｍＲＮＡ及び／またはタンパク質のレベルの減少を達成する。

【0633】

３．配列番号１０の核酸塩基３０５７０〜３０６１０
ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１０の核酸塩基３０５７０〜３０６１０を標的とするように設計する（ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＮＴ＿０１６３５４．１９、核酸塩基１１１６９３００１〜１１１７３００００を切り捨てられた）。ある特定の実施形態では、配列番号１０の核酸塩基３０５７０〜３０６１０は、ホットスポットの領域である。ある特定の実施形態では、配列番号１０の核酸塩基３０５７０〜３０６１０は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的とされる。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが１５、１６、１７、１８、１９、または２０の核酸塩基である。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーである。ある特定の実施形態では、ギャップマーは５−１０−５ＭＯＥギャップマー、４−９−４ＭＯＥギャップマー、４−１０−４ＭＯＥギャップマー、４−１０−３ＭＯＥギャップマー、３−１０−４ＭＯＥギャップマー、または３−１０−３ＭＯＥギャップマーである。ある特定の実施形態では、ギャップマーは、５−１０−５ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、４−９−４ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、４−１０−４ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、４−１０−３ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、３−１０−４ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、または３−１０−３ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマーである。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドはホスホロチオエートヌクレオシド間結合によって連結されている。

【0634】

ある特定の実施形態では、配列番号１０の３０５７０〜３０６１０は、ＩＳＩＳ番号５３１０２６、５４６３０９、５４６３１０、５４６３１１、５４６３１３、５４７４５３、５４７４５４、５４７４５５、５４７４５６、５４７４５７、５４７４５８、５４８０４６、５４８０４７、５４８０４８、５４８０４９、及び５４８０５０によって標的とされる。

【0635】

ある特定の実施形態では、配列番号１０の３０５７０〜３０６１０は、配列番号１２９、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、１６６４、１６６５、１６６６年、１６６７、及び１６６８によって標的とされる。

【0636】

ある特定の実施形態であ、配列番号１０の核酸塩基３０５７０〜３０６１０を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４２％、少なくとも４３％、少なくとも４４％、少なくとも４５％、少なくとも４６％、少なくとも４７％、少なくとも４８％、少なくとも４９％、少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ ｖｉｖｏでＰＫＫ ｍＲＮＡ及び／またはタンパク質のレベルを減少させる。

【0637】

４．配列番号１０の核酸塩基２７４２７〜２７５２０
ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１０の核酸塩基２７４２７〜２７５２０を標的とするように設計する（ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＮＴ＿０１６３５４．１９、核酸塩基１１１６９３００１〜１１１７３００００を切り捨てられた）。ある特定の実施形態では、配列番号１０の核酸塩基２７４２７〜２７５２０は、ホットスポット領域である。ある特定の実施形態では、配列番号１０の核酸塩基２７４２７〜２７５２０はアンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的とされる。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが１５、１６、１７、１８、１９、または２０の核酸塩基である。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーである。ある特定の実施形態では、ギャップマーは５−１０−５ＭＯＥギャップマー、４−９−４ＭＯＥギャップマー、４−１０−４ＭＯＥギャップマー、４−１０−３ＭＯＥギャップマー、３−１０−４ＭＯＥギャップマー、または３−１０−３ＭＯＥギャップマーである。ある特定の実施形態では、ギャップマーは、５−１０−５ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、４−９−４ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、４−１０−４ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、４−１０−３ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、３−１０−４ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、または３−１０−３ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマーである。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドはホスホロチオエートヌクレオシド間結合によって連結されている。

【0638】

ある特定の実施形態では、配列番号１０の核酸塩基２７４２７〜２７５２０は、ＩＳＩＳ番号５３０９９３〜５３０９９９、５４６２５１〜５４６２５６、５４６２５８〜５４６２６０、５４６２６３、５４６２６５〜５４６２６８、５４７４１０〜５４７４１７、及び５４７９７８〜５４７９９２によって標的とされる。

【0639】

ある特定の実施形態では、配列番号１０の核酸塩基の核酸塩基の２７４２７〜２７５２０は、配列番号９４〜１００、５６６〜５８７、及び１５９７〜１６１１によって標的とされる。

【0640】

ある特定の実施形態では、配列番号１０の核酸塩基２７４２７〜２７５２０を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４２％、少なくとも４３％、少なくとも４４％、少なくとも４５％、少なくとも４６％、少なくとも４７％、少なくとも４８％、少なくとも４９％、少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ ｖｉｖｏでＰＫＫ及び／またはタンパク質のレベルの減少を達成する。

【0641】

５．配列番号１０の核酸塩基３３０８５〜３３２４７
ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１０の核酸塩基３３０８５〜３３２４７を標的とするように設計する（核酸塩基１１１６９３００１〜１１１７３００００を切り捨てられたＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＮＴ＿０１６３５４．１９）。ある特定の実施形態では、配列番号１０の核酸塩基３３０８５〜３３２４７は、ホットスポットの領域である。ある特定の実施形態は、配列番号１０の３３０８５〜３３２４７は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的とされる。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが１５、１６、１７、１８、１９、または２０の核酸塩基である。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーである。ある特定の実施形態では、ギャップマーは５−１０−５ＭＯＥギャップマー、４−９−４ＭＯＥギャップマー、４−１０−４ＭＯＥギャップマー、４−１０−３ＭＯＥギャップマー、３−１０−４ＭＯＥギャップマー、または３−１０−３ＭＯＥギャップマーである。ある特定の実施形態では、ギャップマーは、５−１０−５ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、４−９−４ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、４−１０−４ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、４−１０−３ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、３−１０−４ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、または３−１０−３ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマーである。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドはホスホロチオエートヌクレオシド間結合によって連結されている。

【0642】

ある特定の実施形態では、配列番号１０の核酸塩基３３０８５〜３３２４７は、ＩＳＩＳ番号５３１０４１〜５３１１５８、５４６３３６、５４６３３９、５４６３４０、５４６３４３、５４６３４５、５４７４７４〜５４７４８３、５４７７７８、５４８０７７〜５４８０８２、及び５４８６７７〜５４８６７８によって標的とされる。

【0643】

ある特定の実施形態では、配列番号１０の核酸塩基の核酸塩基３３０８５〜３３２４７は、配列番号１４４〜１６０、２６１、６９３〜７０７、１２５６、１３２０〜１３２５、２２１４、及び２２１５によって標的とされる。

【0644】

ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１０の核酸塩基３３０８５〜３３２４７を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４２％、少なくとも４３％、少なくとも４４％、少なくとも４５％、少なくとも４６％、少なくとも４７％、少なくとも４８％、少なくとも４９％、少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＰＫＫ及び／またはタンパク質レベルの減少を達成する。

【0645】

６．配列番号１０の核酸塩基３０４７５〜３０６３９
ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１０の核酸塩基３０４７５〜３０６３９を標的とするように設計する（ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＮＴ＿０１６３５４．１９、核酸塩基１１１６９３００１〜１１１７３００００を切り捨てられた）。ある特定の実施形態では、配列番号１０の核酸塩基３０４７５〜３０６３９は、ホットスポットの領域である。ある特定の実施形態は、配列番号１０の核酸塩基３０４７５〜３０６３９は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的とされる。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが１５、１６、１７、１８、１９、または２０の核酸塩基である。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーである。ある特定の実施形態では、ギャップマーは５−１０−５ＭＯＥギャップマー、４−９−４ＭＯＥギャップマー、４−１０−４ＭＯＥギャップマー、４−１０−３ＭＯＥギャップマー、３−１０−４ＭＯＥギャップマー、または３−１０−３ＭＯＥギャップマーである。ある特定の実施形態では、ギャップマーは、５−１０−５ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、４−９−４ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、４−１０−４ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、４−１０−３ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、３−１０−４ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、または３−１０−３ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマーである。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドはホスホロチオエートヌクレオシド間結合によって連結されている。

【0646】

ある特定の実施形態では、配列番号１０の核酸塩基３０４７５〜３０６３９は、ＩＳＩＳ番号５３１０２１〜５３１０２９、５３１１４６、５４６２９７、５４６２９９〜５４６３０４、５４６３０６〜５４６３１１、５４６３１３、５４６３１６〜５４６３１９、５４７４４４〜５４７４６２、５４８０３１、５４８０３２、及び５４８０３４〜５４８０５６によって標的とされる。

【0647】

ある特定の実施形態では、配列番号１０の核酸塩基の核酸塩基３０４７５〜３０６３９は、配列番号１２４〜１３２、２４９、６３３〜６６９、及び１６５０〜１６７４によって標的とされる。

【0648】

ある特定の実施形態では、配列番号１０の核酸塩基３０４７５〜３０６３９を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４２％、少なくとも４３％、少なくとも４４％、少なくとも４５％、少なくとも４６％、少なくとも４７％、少なくとも４８％、少なくとも４９％、少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、ｉｎ ｖｉｖｏ及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＰＫＫ及び／またはタンパク質のレベルの減少を達成する。

【0649】

７．配列番号１０の核酸塩基２７３６２〜２７５２４
ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１０の核酸塩基２７３６２〜２７５２４を標的とするように設計する（ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＮＴ＿０１６３５４．１９、核酸塩基１１１６９３００１〜１１１７３００００を切り捨てられた）。ある特定の実施形態では、核酸塩基２７３６２から２７５２４は、ＰＫＫのエクソン９に対応する（ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＮＴ＿０１６３５４．１９、核酸塩基１１１６９３００１〜１１１７３００００を切り捨てられた）。ある特定の実施形態では、配列番号１０の核酸塩基２７３６２〜２７５２４は、ホットスポットの領域である。ある特定の実施形態では、配列番号１０の核酸塩基２７３６２〜２７５２４は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的とされる。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが１５、１６、１７、１８、１９、または２０の核酸塩基である。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーである。ある特定の実施形態では、ギャップマーは５−１０−５ＭＯＥギャップマー、４−９−４ＭＯＥギャップマー、４−１０−４ＭＯＥギャップマー、４−１０−３ＭＯＥギャップマー、３−１０−４ＭＯＥギャップマー、または３−１０−３ＭＯＥギャップマーである。ある特定の実施形態では、ギャップマーは、５−１０−５ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、４−９−４ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、４−１０−４ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、４−１０−３ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、３−１０−４ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、または３−１０−３ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマーである。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドはホスホロチオエートヌクレオシド間結合によって連結されている。

【0650】

ある特定の実施形態では、配列番号１０の核酸塩基２７３６１〜２７５２４は、ＩＳＩＳ番号５３０９８５〜５３０９９９、５４６２４４、５４６２４７〜５４６２５６、５４６２５８〜５４６２６０、５４６２６３、５４６２６５〜５４６２６８、５４７４０３〜５４７４１７、５４７７２３、５４７９６８〜５４７９７０、及び５４７９７２〜５４７９９２によって標的とされる。

【0651】

ある特定の実施形態では、配列番号１０の核酸塩基の核酸塩基２７３６１〜２７５２４は、配列番号８６〜１００、５５４〜５８７、１２１７、及び１５８８〜１６１１によって標的とされる。

【0652】

ある特定の実施形態では、配列番号１０の核酸塩基２７３６２〜２７５２４を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４２％、少なくとも４３％、少なくとも４４％、少なくとも４５％、少なくとも４６％、少なくとも４７％、少なくとも４８％、少なくとも４９％、少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ ｖｉｖｏでＰＫＫ及び／またはタンパク質のレベルの減少を達成する。

【0653】

８．配列番号１０の核酸塩基３３１０１〜３３２４０
ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１０の核酸塩基３３１０１〜３３２４０を標的とするように設計する（ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＮＴ＿０１６３５４．１９、核酸塩基１１１６９３００１〜１１１７３００００を切り捨てられた）。ある特定の実施形態では、核酸塩基３３１０１〜３３２４０は、ＰＫＫのエクソン１４に対応する（ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＮＴ＿０１６３５４．１９、核酸塩基１１１６９３００１〜１１１７３００００を切り捨てられた）。ある特定の実施形態では、配列番号１０の核酸塩基３３１０１〜３３２４０は、ホットスポット領域である。ある特定の実施形態は、配列番号１０の核酸塩基３３１０１〜３３２４０は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的とされる。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが１５、１６、１７、１８、１９、または２０の核酸塩基である。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーである。ある特定の実施形態では、ギャップマーは５−１０−５ＭＯＥギャップマー、４−９−４ＭＯＥギャップマー、４−１０−４ＭＯＥギャップマー、４−１０−３ＭＯＥギャップマー、３−１０−４ＭＯＥギャップマー、または３−１０−３ＭＯＥギャップマーである。ある特定の実施形態では、ギャップマーは、５−１０−５ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、４−９−４ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、４−１０−４ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、４−１０−３ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、３−１０−４ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、または３−１０−３ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマーである。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドはホスホロチオエートヌクレオシド間結合によって連結されている。

【0654】

ある特定の実施形態では、配列番号１０の核酸塩基３３１０１〜３３２４０は、ＩＳＩＳ番号５３１０４１〜５３１１５８、５４６３３６、５４６３３９、５４６３４０、５４６３４３、５４６３４５、５４７４７４〜５４７４８３、５４８０７７〜５４８０８２、及び５４８６７８〜５４８６７８によって標的とされる。

【0655】

ある特定の実施形態では、配列番号１０の核酸塩基の核酸塩基３３１０１〜３３２４０は、配列番号１４４〜１６０、２６１、６９３〜７０７、１３２０〜１３２５、及び２２１５によって標的とされる。

【0656】

ある実施形態では、配列番号１０の核酸塩基３３１０１〜３３２４０を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４２％、少なくとも４３％、少なくとも４４％、少なくとも４５％、少なくとも４６％、少なくとも４７％、少なくとも４８％、少なくとも４９％、少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ ｖｉｖｏで、ＰＫＫ 及び／またはタンパク質レベルの減少を達成する。

【0657】

９．配列番号１０の核酸塩基３０４６３〜３０６３８
ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１０の核酸塩基３０４６３〜３０６３８を標的とするように設計する（核酸塩基１１１６９３００１〜１１１７３００００を切り捨てられたＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＮＴ＿０１６３５４．１９）。ある特定の実施形態では、核酸塩基３０４６３〜３０６３８はＰＫＫのエクソン１２に対応する（核酸塩基１１１６９３００１〜１１１７３００００を切り捨てられたＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＮＴ＿０１６３５４．１９）。ある特定の実施形態では、配列番号１０の核酸塩基３０４６３〜３０６３８は、ホットスポット領域である。ある特定の実施形態では、配列番号１０の核酸塩基３０４６３〜３０６３８は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的とされる。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが１５、１６、１７、１８、１９、または２０の核酸塩基である。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーである。ある特定の実施形態では、ギャップマーは５−１０−５ＭＯＥギャップマー、４−９−４ＭＯＥギャップマー、４−１０−４ＭＯＥギャップマー、４−１０−３ＭＯＥギャップマー、３−１０−４ＭＯＥギャップマー、または３−１０−３ＭＯＥギャップマーである。ある特定の実施形態では、ギャップマーは、５−１０−５ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、４−９−４ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、４−１０−４ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、４−１０−３ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、３−１０−４ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマー、または３−１０−３ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマーである。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合によって連結されている。

【0658】

ある特定の実施形態では、配列番号１０の核酸塩基３０４６３〜３０６３８は、ＩＳＩＳ番号５３１０２１〜５３１０２９、５３１１４６、５４６２９７、５４６２９９〜５４６３０４、５４６３０６〜５４６３１１、５４６３１３、５４６３１６〜５４６３１９、５４７４４４〜５４７４６２、５４８０３１、５４８０３２、及び５４８０３４〜５４８０５６によって標的とされる。

【0659】

ある特定の実施形態では、配列番号１０の核酸塩基の核酸塩基３０４６３〜３０６３８は、配列番号１２４〜１３２、２４９、６３３〜６６９、及び１６５０〜１６７４によって標的とされる。

【0660】

ある実施形態では、配列番号１０の核酸塩基３０４６３〜３０６３８を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４２％、少なくとも４３％、少なくとも４４％、少なくとも４５％、少なくとも４６％、少なくとも４７％、少なくとも４８％、少なくとも４９％、少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ ｖｉｖｏで、ＰＫＫ 及び／またはタンパク質レベルの減少を達成する。

【実施例】

【0661】

参照による非限定的な開示と組み込み
本明細書に記載のある特定の化合物、組成物及び方法を、ある特定の実施形態に従って具体的に説明してきたが、以下の実施例は、本明細書に記載の化合物を例示するためにのみあり、これを限定するものではない。本出願に記載の参考文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0662】

以下の実施例は、本開示のある特定の実施形態を例証するものであり、限定するものではない。さらに、具体的実施形態を記載する場合、本発明者らは、それらの具体的実施形態の一般的応用を企図している。例えば、ある特定モチーフを有するオリゴヌクレオチドの開示は、そのモチーフまたは同様のモチーフを有する他のオリゴヌクレオチドの合理的裏付けになる。同様に、例えば、ある特定高親和性修飾がある特定位置に見られる場合は、別段の表示がある場合を除き、同じ位置での他の高親和性修飾も好適であるとみなされる。

【0663】

実施例１：ホスホラミダイト（化合物１、１ａ、及び２）の調製のための一般的方法

【0664】

【化125】

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化合物１、１ａ、及び２を、本明細書に記載する当技術分野で周知の手順どおりに調製した（Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０１１，２１（４），１１２２−１１２５，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２０１０，７５（５），１５６９−１５８１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ，２００８，５２（１），５５３−５５４）、ならびに公開されたＰＣＴ国際出願（国際公開第ＷＯ２０１１／１１５８１８号、同第ＷＯ２０１０／０７７５７８号、同第ＷＯ２０１０／０３６６９８号、同第ＷＯ２００９／１４３３６９号、同第ＷＯ２００９／００６４７８、及び同第ＷＯ２００７／０９００７１号）、ならびに米国特許第７，５６９，６８６号も参照のこと）。

【0665】

実施例２：化合物７の調製

【0666】

【化126】

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化合物３（２−アセトアミド−１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄガラクトピラノースまたはガラクトサミンペンタアセテート）は、市販のものである。化合物５を公開された手順（Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９１，３４，２６９２）に従って調製した。

【0667】

実施例３：化合物１１の調製

【0668】

【化127】

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化合物８及び９は、市販のものである。

【0669】

実施例４：化合物１８の調製

【0670】

【化128】

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化合物１１を実施例３に例証される手順どおりに調製した。化合物１４は、市販のものである。化合物１７を、Ｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００４，４７，５７９８−５８０８）によって報告された同様の手順を用いて調製した。

【0671】

実施例５：化合物２３の調製

【0672】

【化129】

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化合物１９及び２１は、市販のものである。

【0673】

実施例６：化合物２４の調製

【0674】

【化130】

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化合物１８及び２３を実施例４及び５に例証される手順どおりに調製した。

【0675】

実施例７：化合物２５の調製

【0676】

【化131】

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化合物２４を実施例６に例証される手順どおりに調製した。

【0677】

実施例８：化合物２６の調製

【0678】

【化132】

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化合物２４を実施例６に例証される手順どおりに調製する。

【0679】

実施例９：３’末端にＧａｌＮＡｃ_３−１を含む共役ＡＳＯ（化合物２９）の一般的調製

【0680】

【化133】

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【0681】

【化134】

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保護されたＧａｌＮＡｃ_３−１は以下の構造を有する。

【0682】

【化135】

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共役基ＧａｌＮＡｃ_３−１（ＧａｌＮＡｃ_３−１_ａ）のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。ＧａｌＮＡｃ_３−１_ａは、以下の式を有する。

【0683】

【化136】

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【0684】

固体支持体に結合された保護ＧａｌＮＡｃ_３−１（化合物２５）を実施例７に例証される手順どおりに調製した。３’末端にＧａｌＮＡｃ_３−１を含むオリゴマー化合物２９を、自動ＤＮＡ／ＲＮＡ合成における標準的手順を用いて調製した（Ｄｕｐｏｕｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２００６，４５，３６２３−３６２７を参照のこと）。ホスホラミダイト構築ブロック（化合物１及び１ａ）を実施例１に例証される手順どおりに調製した。他のホスホラミダイト構築ブロックを用いて既定の配列及び組成を有するオリゴマー化合物を調製することができるため、例証されるホスホラミダイトは、代表的なものであり、限定する意図はない。固体支持体に添加されるホスホラミダイトの順序及び量を調整して、本明細書に記載するギャップトオリゴマー化合物を調製することができる。そのようなギャップトオリゴマー化合物は、任意の所与の標的によって指示される既定の組成及び塩基配列を有しうる。

【0685】

実施例１０：５’末端にＧａｌＮＡｃ_３−１を含む共役ＡＳＯ（化合物３４）の一般的調製

【0686】

【化137】

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Ｕｎｙｌｉｎｋｅｒ（商標）３０は、市販のものである。５’末端にＧａｌＮＡｃ_３−１クラスターを含むオリゴマー化合物３４を、自動ＤＮＡ／ＲＮＡ合成における標準的手順を用いて調製する（Ｄｕｐｏｕｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２００６，４５，３６２３−３６２７を参照のこと）。ホスホラミダイト構築ブロック（化合物１及び１ａ）を実施例１に例証される手順どおりに調製した。他のホスホラミダイト構築ブロックを用いて既定の配列及び組成を有するオリゴマー化合物を調製することができるため、例証されるホスホラミダイトは、代表的なものであり、限定する意図はない。固体支持体に添加されるホスホラミダイトの順序及び量を調整して、本明細書に記載するギャップトオリゴマー化合物を調製することができる。そのようなギャップトオリゴマー化合物は、任意の所与の標的によって決まる既定の組成及び塩基配列を有しうる。

【0687】

実施例１１：化合物３９の調製

【0688】

【化138】

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【0689】

【化139】

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化合物４、１３、及び２３を実施例２、４、及び５に例証される手順どおりに調製した。化合物３５をＲｏｕｃｈａｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２０１１，１２，２３４６−２３５３に公開された同様の手順を用いて調製する。

【0690】

実施例１２：化合物４０の調製

【0691】

【化140】

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化合物３８を実施例１１に例証される手順どおりに調製する。

【0692】

実施例１３：化合物４４の調製

【0693】

【化141】

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【0694】

【化142】

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化合物２３及び３６を実施例５及び１１に例証される手順どおりに調製する。化合物４１を、国際公開第ＷＯ２００９０８２６０７号に公開された同様の手順を用いて調製する。

【0695】

実施例１４：化合物４５の調製

【0696】

【化143】

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化合物４３を実施例１３に例証される手順どおりに調製する。

【0697】

実施例１５：化合物４７の調製

【0698】

【化144】

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化合物４６は、市販のものである。

【0699】

実施例１６：化合物５３の調製

【0700】

【化145】

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化合物４８及び４９は、市販のものである。化合物１７及び４７を実施例４及び１５に例証される手順どおりに調製する。

【0701】

実施例１７：化合物５４の調製

【0702】

【化146】

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化合物５３を実施例１６に例証される手順どおりに調製する。

【0703】

実施例１８：化合物５５の調製

【0704】

【化147】

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化合物５３を実施例１６に例証される手順どおりに調製する。

【0705】

実施例１９：固相技法による３’位にＧａｌＮＡｃ_３−１を含む共役ＡＳＯの調製のための一般的方法（ＩＳＩＳ６４７５３５、６４７５３６、及び６５１９００の調製）
別段の明示がある場合を除き、オリゴマー化合物の合成に用いるすべての試薬及び溶液を商業的供給源から購入する。標準のホスホラミダイト構築ブロック及び固体支持体を、例えば、Ｔ、Ａ、Ｇ、及び^ｍＣ残基を含む、ヌクレオシド残基の組み込みのために用いる。無水アセトニトリル中のホスホラミダイトの０．１Ｍ溶液をb−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシド及び２’−ＭＯＥに用いた。

【0706】

カラムに充填したＧａｌＮＡｃ_３−１負荷ＶＩＭＡＤ固体支持体（１１０μｍｏｌ／ｇ、Ｇｕｚａｅｖ ｅｔ ａｌ．，２００３）でのホスホラミダイトカップリング法により、ＡＳＯ合成を、ＡＢＩ ３９４合成装置（１〜２μｍｏｌの規模）またはＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＡＫＴＡオリゴパイロット合成装置（４０〜２００μｍｏｌの規模）で実行した。このカップリングステップでは、固体支持体の負荷量に対して４倍量のホスホラミダイトを送達し、ホスホラミダイト縮合を１０分間行った。他のすべてのステップは、製造業者から提供された標準のプロトコルに従った。トルエン中の６％ジクロロ酢酸溶液を用いて、ヌクレオチドの５’−ヒドロキシル基からジメチルトリチル（ＤＭＴ）基を除去した。カップリングステップ中、無水ＣＨ_３ＣＮ中の４，５−ジシアノイミダゾール（０．７Ｍ）を活性化剤として用いた。ホスホロチオエート連結部を、３分間の接触時間で、１：１のピリジン／ＣＨ_３ＣＮ中のキサンタンヒドリドの０．１Ｍ溶液による硫化によって導入した。６％の水を含有するＣＨ_３ＣＮ中の２０％のｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドの溶液を酸化剤として用いて、１２分間の接触時間で、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部を得た。

【0707】

所望の配列が構築された後、シアノエチルホスフェート保護基を、４５分間の接触時間で、トリエチルアミンとアセトニトリルの１：１（ｖ／ｖ）の混合物を用いて脱保護した。固体支持体に結合されたＡＳＯをアンモニア水（２８〜３０重量％）中に懸濁し、５５℃で６時間加熱した。

【0708】

その後、非結合型ＡＳＯを濾過し、アンモニアを沸去した。残渣を強アニオン交換カラムでの高圧液体クロマトグラフィーによって精製した（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｑ、３０μｍ、２．５４×８ｃｍ、Ａ＝３０％ＣＨ_３ＣＮ水溶液中１００ｍＭ酢酸アンモニウム、Ｂ＝Ａ中１．５Ｍ ＮａＢｒ、６０分後０〜４０％のＢ、流量１４ｍＬ／分−１、λ＝２６０ｎｍ）。残渣を逆相カラムでのＨＰＬＣにより脱塩して、固体支持体への初期負荷量に基づいて１５〜３０％の単離収率で所望のＡＳＯを得た。ＡＳＯを、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＭＳＤシステムを用いたイオン対ＨＰＬＣ／ＭＳ分析によって特徴付けた。

【0709】

当技術分野で周知の標準のオリゴヌクレオチド合成手順を用いて共役体を含まないアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成した。

【0710】

これらの方法を用いて、ＡｐｏＣ ＩＩＩを標的とする３個の別個のアンチセンス化合物を調製した。以下の表１７に要約されるように、ＡｐｏＣ ＩＩＩを標的とする３個のアンチセンス化合物のそれぞれは、同一の核酸塩基配列を有し、ＩＳＩＳ ３０４８０１は、すべてがホスホロチオエート連結部である５−１０−５ＭＯＥギャップマーであり、ＩＳＩＳ ６４７５３５は、ＧａｌＮＡｃ_３−１をその３’末端で共役させたことを除いて、ＩＳＩＳ ３０４８０１と同一であり、ＩＳＩＳ ６４７５３６は、その化合物の特定のヌクレオシド間連結部がホスホジエステル連結部であることを除いて、ＩＳＩＳ ６４７５３５と同一であった。表１７にさらに要約されるように、ＳＲＢ−１を標的とする２つの別個のアンチセンス化合物を合成した。ＩＳＩＳ ４４０７６２は、すべてがホスホロチオエートヌクレオシド間連結部である２−１０−２ ｃＥｔギャップマーであり、ＩＳＩＳ ６５１９００は、その３’末端にＧａｌＮＡｃ_３−１を含めたことを除いて、ＩＳＩＳ ４４０７６２と同一であった。

【0711】

【表1】

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下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｋ」は、６’−（Ｓ）−ＣＨ_３二環式ヌクレオシド（例えば、ｃＥｔ）を示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。上付き文字「ｍ」は、５−メチルシトシンを示す。「ＧａｌＮＡｃ_３−１」は、先の実施例９に示された構造を有する共役基を示す。ＧａｌＮＡｃ_３−１が、ＡＳＯを共役体の残りの部分に連結させる切断可能なアデノシンを含み、「ＧａｌＮＡｃ_３−１_ａ」と指定されることに留意されたい。上述の表ではこの命名法を用いて、共役体の一部であるアデノシンを含む全核酸塩基配列を示す。したがって、上述の表において、「Ａ_ｄｏ」を省略して「ＧａｌＮＡｃ_３−１」で終了する配列を列記することもできる。下付き文字「ａ」を用いて切断可能なヌクレオシドまたは切断可能部分を欠く共役基の部分を示すこの慣例をこれらの実施形態の全体を通して用いる。切断可能部分を欠く共役基のこの部分は、本明細書において「クラスター」または「共役クラスター」または「ＧａｌＮＡｃ_３クラスター」と称される。特定の事例において、これは、そのクラスター及びその切断可能部分を別々に提供することによって共役基を説明するのに好都合である。

【0712】

実施例２０：ｈｕＡｐｏＣ ＩＩＩトランスジェニックマウスにおけるヒトＡｐｏＣ ＩＩＩの用量依存的アンチセンス阻害
それぞれヒトＡｐｏＣ ＩＩＩを標的とし、かつ上に記載されるＩＳＩＳ ３０４８０１及びＩＳＩＳ ６４７５３５を別々に試験し、用量依存的試験において、ヒトＡｐｏＣ ＩＩＩトランスジェニックマウスにおけるヒトＡｐｏＣ ＩＩＩを阻害するそれらの能力について評価した。
処理

【0713】

ヒトＡｐｏＣＩＩＩトランスジェニックマウスを１２時間の明暗周期で維持し、Ｔｅｋｌａｄ実験食餌を不断給餌した。実験開始前に動物を研究施設で少なくとも７日間順化させた。ＡＳＯをＰＢＳ中に調製し、０．２ミクロンのフィルターを通して濾過して滅菌した。注入のためにＡＳＯを０．９％ＰＢＳ中に溶解した。

【0714】

ヒトＡｐｏＣ ＩＩＩトランスジェニックマウスに、ＩＳＩＳ ３０４８０１もしくは６４７５３５を、０．０８、０．２５、０．７５、２．２５、もしくは６．７５μｍｏｌ／ｋｇで、または対照としてＰＢＳを、週１回２週間、腹腔内に注入した。各処理群は、４匹の動物からなった。最終用量の投与から４８時間後に血液を各マウスから採取し、マウスを屠殺し、組織を収集した。
ＡｐｏＣ ＩＩＩ ｍＲＮＡ分析

【0715】

標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いてマウスの肝臓におけるＡｐｏＣ ＩＩＩ ｍＲＮＡレベルを決定した。ＰＢＳ処理対照に対して正規化する前に（Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎを用いて）ＡｐｏＣ ＩＩＩ ｍＲＮＡレベルを全ＲＮＡとの比較で相対的に決定した。以下の結果は、ＰＢＳ処理対照に対して正規化された各処理群のＡｐｏＣ ＩＩＩ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして提示され、「％ＰＢＳ」で表示される。各ＡＳＯの半数効果濃度（ＥＤ_５０）も以下の表１８に示される。

【0716】

例証されるように、ＰＢＳ対照と比較して、両方のアンチセンス化合物がＡｐｏＣ ＩＩＩ ＲＮＡを減少させた。さらに、ＧａｌＮＡｃ_３−１に共役されるアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ ６４７５３５）は、ＧａｌＮＡｃ_３−１共役体を欠くアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ ３０４８０１）よりもはるかに強力であった。

【0717】

【表2】

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【0718】

ＡｐｏＣ ＩＩＩタンパク質分析（比濁アッセイ）
２０１３年３月２９日の出版前にオンラインで公開されたＧｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によって報告された手順を用いて、血漿ＡｐｏＣ ＩＩＩタンパク質分析を行った。

【0719】

マウスから単離した約１００μＬの血漿を、希釈することなく、Ｏｌｙｍｐｕｓ臨床分析器及び市販の比濁ＡｐｏＣ ＩＩＩアッセイ（Ｋａｍｉｙａ、カタログ番号ＫＡＩ−００６、Ｋａｍｉｙａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）を用いて分析した。アッセイプロトコルを供給業者が説明するとおりに実行した。

【0720】

以下の表１９に示されるように、ＰＢＳ対照と比較して、両方のアンチセンス化合物がＡｐｏＣ ＩＩＩタンパク質を減少させた。さらに、ＧａｌＮＡｃ_３−１に共役されるアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ ６４７５３５）は、ＧａｌＮＡｃ_３−１共役体を欠くアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ ３０４８０１）よりもはるかに強力であった。

【0721】

【表3】

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【0722】

血漿トリグリセリド及びコレステロールを、Ｂｌｉｇｈ ａｎｄ Ｄｙｅｒの方法（Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．ａｎｄ Ｄｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：９１１−９１７、１９５９）（Ｂｌｉｇｈ，Ｅ ａｎｄ Ｄｙｅｒ，Ｗ，Ｃａｎ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ，３７，９１１−９１７，１９５９）（Ｂｌｉｇｈ，Ｅ ａｎｄ Ｄｙｅｒ，Ｗ，Ｃａｎ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ，３７，９１１−９１７，１９５９）を用いて抽出し、Ｂｅｃｋｍａｎｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ臨床分析器及び市販の試薬を用いて測定した。

【0723】

トリグリセリドレベルを、ＰＢＳを注入したマウスとの比較で相対的に測定し、「％ＰＢＳ」で表示する。結果が表２０に提示される。例証されるように、両方のアンチセンス化合物がトリグリセリドレベルを低下させた。さらに、ＧａｌＮＡｃ_３−１に共役されるアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ ６４７５３５）は、ＧａｌＮＡｃ_３−１共役体を欠くアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ ３０４８０１）よりも実質的にはるかに強力であった。

【0724】

【表4】

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【0725】

血漿試料をＨＰＬＣによって分析して、総コレステロールの量及びコレステロールの異なる画分（ＨＤＬ及びＬＤＬ）の量を決定した。結果が表２１及び２２に提示される。例証されるように、両方のアンチセンス化合物が総コレステロールレベルを低下させ、ＬＤＬを低下させ、ＨＤＬを上昇させた。さらに、ＧａｌＮＡｃ_３−１に共役されるアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ ６４７５３５）は、ＧａｌＮＡｃ_３−１共役体を欠くアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ ３０４８０１）よりも実質的にはるかに強力であった。ＨＤＬレベルの増加及びＬＤＬレベルの減少は、ＡｐｏＣ ＩＩＩのアンチセンス阻害の心臓血管の有益な影響である。

【0726】

【表5】

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【0727】

【表6】

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【0728】

薬物動態分析（ＰＫ）
ＡＳＯのＰＫも評価した。肝臓及び腎臓試料を切り刻み、標準のプロトコルを用いて抽出した。試料をＩＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳを利用するＭＳＤ１で分析した。全長ＩＳＩＳ ３０４８０１及び６４７５３５の組織レベル（μｇ／ｇ）を測定し、結果が表２３に提供される。例証されるように、総全長アンチセンス化合物の肝臓濃度は、これら２つのアンチセンス化合物と同様であった。したがって、ＧａｌＮＡｃ_３−１共役アンチセンス化合物が肝臓でより活性であるが（上のＲＮＡ及びタンパク質データによって実証されるように）、肝臓内で著しく高い濃度では存在しない。実際には、計算されたＥＣ_５０（表２３に提供される）は、共役化合物の力価の観察された増加が蓄積の増加に完全に起因するわけではないことを裏付ける。この結果は、共役体が、肝臓蓄積単独以外の機構によって、おそらくアンチセンス化合物の細胞への生産的な取り込みを改善することによって、力価を改善したことを示唆する。

【0729】

結果は、腎臓におけるＧａｌＮＡｃ_３−１共役アンチセンス化合物の濃度が、ＧａｌＮＡｃ共役体を欠くアンチセンス化合物の濃度よりも低いことも示す。これは、いくつかの有益な治療的意味を有する。腎臓における活性が要求されない治療的指標において、腎臓への曝露は、腎毒性の危険性を有し、それに見合う利益がない。さらに、腎臓における高濃度は、典型的には、尿への化合物の損失をもたらし、より迅速なクリアランスをもたらす。したがって、非腎臓標的の場合、腎臓蓄積は望ましくない。これらのデータは、ＧａｌＮＡｃ_３−１共役が腎臓蓄積を減少させることを示唆する。

【0730】

【表7】

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【0731】

ＩＳＩＳ ６４７５３５の代謝物も特定し、それらの質量を高分解能質量分析によって確認した。観察された代謝物の切断部位及び構造が以下に示される。標準的手順を用いて全長ＡＳＯの相対％を計算し、結果が表２３ａに提示される。ＩＳＩＳ ６４７５３５の主な代謝物は、全共役体を欠く全長ＡＳＯ（すなわち、ＩＳＩＳ ３０４８０１）であり、これは、以下に示される切断部位Ａでの切断に由来する。さらに、他の切断部位に由来するさらなる代謝物も観察された。これらの結果は、細胞内の酵素によって切断されうるか、またはサイトゾルの還元環境下で切断されうるか、またはエンドソーム及びリソソーム内の酸性ｐＨに対して不安定な、ＧａｌＮＡｃ_３−１糖とＡＳＯとの間のエステル、ペプチド、ジスルフィド、ホスホラミデート、またはアシルヒドラゾンなどの他の切断可能な結合の導入も有用でありうることを示唆する。

【0732】

【表8】

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【0733】

【化148】

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【0734】

【化149】

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【0735】

実施例２１：単回投与試験におけるヒトＡｐｏＣ ＩＩＩトランスジェニックマウスにおけるヒトＡｐｏＣ ＩＩＩのアンチセンス阻害
それぞれヒトＡｐｏＣ ＩＩＩを標的とし、かつ表１７に記載されるＩＳＩＳ ３０４８０１、６４７５３５、及び６４７５３６を、単回投与試験において、ヒトＡｐｏＣ ＩＩＩトランスジェニックマウスにおけるヒトＡｐｏＣ ＩＩＩを阻害するそれらの能力についてさらに評価した。

【0736】

処理
ヒトＡｐｏＣＩＩＩトランスジェニックマウスを１２時間の明暗周期に維持し、Ｔｅｋｌａｄ実験食餌を不断給餌した。実験開始前に動物を研究施設で少なくとも７日間順化させた。ＡＳＯをＰＢＳ中に調製し、０．２ミクロンのフィルターを通して濾過滅菌した。注入のためにＡＳＯを０．９％ＰＢＳ中に溶解した。

【0737】

ヒトＡｐｏＣ ＩＩＩトランスジェニックマウスに、ＩＳＩＳ ３０４８０１、６４７５３５、もしくは６４７５３６（上述のもの）、またはＰＢＳ処理対照を、以下に示される投与量で１回、腹腔内注入した。処理群は、３匹の動物から成り、対照群は、４匹の動物からなった。治療前及び最終用量後に血液を各マウスから採取し、血漿試料を分析した。最終投与の７２時間後にマウスを屠殺した。

【0738】

試料を収集し、分析して、肝臓におけるＡｐｏＣ ＩＩＩ ｍＲＮＡ及びタンパク質レベル、血漿トリグリセリド、ならびにＨＤＬ及びＬＤＬ画分を含むコレステロールを決定し、上述（実施例２０）のように評価した。これらの分析からのデータは、以下の表２４〜２８に提示される。血清における肝臓トランスアミナーゼレベル、すなわちアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を、標準のプロトコルを用いて、生理食塩水を注入したマウスとの比較で相対的に測定した。ＡＬＴ及びＡＳＴレベルは、アンチセンス化合物がすべての投与量で良好な耐性であったことを示した。

【0739】

これらの結果は、ＧａｌＮＡｃ_３−１共役体を欠くアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ ３０４８０１）と比較して、３’末端にＧａｌＮＡｃ_３−１共役体を含むアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ ６４７５３５及び６４７５３６）の力価の改善を示す。さらに、ＧａｌＮＡｃ_３−１共役体及びいくつかのホスホジエステル連結部を含むＩＳＩＳ ６４７５３６は、同一の共役体を含むＩＳＩＳ ６４７５３５と同程度に強力であり、ＡＳＯ内のすべてのヌクレオシド間連結部は、ホスホロチオエート連結部である。

【0740】

【表9】

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【0741】

【表10】

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【0742】

【表11】

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【0743】

【表12】

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【0744】

【表13】

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【0745】

これらの結果は、ＧａｌＮＡｃ_３−１共役体がアンチセンス化合物の力価を改善することを裏付ける。これらの結果は、ＧａｌＮＡｃ_３−１共役アンチセンス化合物の同等の力価も示し、これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、混成連結部（６個のホスホジエステル連結部を有するＩＳＩＳ ６４７５３６）及び同一のアンチセンス化合物の完全なホスホロチオエートバージョン（ＩＳＩＳ ６４７５３５）を有する。

【0746】

ホスホロチオエート連結部は、アンチセンス化合物にいくつかの特性を提供する。例えば、これらは、ヌクレアーゼ消化に抵抗し、タンパク質に結合し、腎臓／尿ではなく肝臓における化合物の蓄積をもたらす。これらは、肝臓における徴候を治療する際に特に望ましい特性である。しかしながら、ホスホロチオエート連結部は、炎症性応答とも関連している。したがって、化合物におけるホスホロチオエート連結部の数を減少させることにより、炎症の危険性の減少が見込まれるが、肝臓中の化合物の濃度も低下させ、腎臓及び尿中の濃度を増加させ、ヌクレアーゼの存在下で安定性を低下させ、全体の力価を低下させる。これらの結果は、特定のホスホロチオエート連結部がホスホジエステル連結部に置換されたＧａｌＮＡｃ_３−１共役アンチセンス化合物が、肝臓における標的に対して、完全なホスホロチオエート連結部を有する対応物と同程度に強力であることを示す。そのような化合物は、より炎症誘発性が低いと見込まれる（ＰＳの減少が炎症性効果の減少をもたらすことを示す実験を説明する実施例２４を参照のこと）。

【0747】

実施例２２：生体内におけるＳＲＢ−１を標的とするＧａｌＮＡｃ_３−１共役修飾ＡＳＯの影響
それぞれＳＲＢ−１を標的とし、かつ表１７に記載されるＩＳＩＳ ４４０７６２及び６５１９００を、用量依存的試験において、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＳＲＢ−１を阻害するそれらの能力について評価した。

【0748】

処理
６週齢の雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、ＩＳＩＳ ４４０７６２、６５１９００、またはＰＢＳ処理対照を、以下に示される投与量で１回、皮下注入した。各処理群は、４匹の動物からなった。最終投与の４８時間後にマウスを屠殺して、標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓におけるＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを決定した。ＰＢＳ処理対照に対して正規化する前に（Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎを用いて）ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを全ＲＮＡとの比較で相対的に決定した。以下の結果は、ＰＢＳ処理対照に対して正規化された各処理群のＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして提示され、「％ＰＢＳ」で表示される。

【0749】

表２９に例証されるように、両方のアンチセンス化合物がＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを低下させた。さらに、ＧａｌＮＡｃ_３−１共役体（ＩＳＩＳ ６５１９００）を含むアンチセンス化合物は、ＧａｌＮＡｃ_３−１共役体を欠くアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ ４４０７６２）よりもはるかに強力であった。これらの結果は、異なる標的に相補的であり、かつ異なる化学修飾ヌクレオシドを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、ＧａｌＮＡｃ_３−１共役体の力価利益が観察されることを実証し、この事例において、修飾ヌクレオシドは、拘束エチル糖部分（二環式糖部分）を含む。

【0750】

【表14】

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【0751】

実施例２３：ヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）アッセイプロトコル
ＢＤ Ｖａｕｔａｉｎｅｒ ＣＰＴチューブ法を用いてｈＰＢＭＣアッセイを実行した。ＵＳ ＨｅａｌｔｈＷｏｒｋｓ ｃｌｉｎｉｃ（Ｆａｒａｄａｙ ＆ Ｅｌ Ｃａｍｉｎｏ Ｒｅａｌ，Ｃａｒｌｓｂａｄ）においてインフォームドコンセントを得た志願ドナー由来の全血試料を得て、４〜１５個のＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ＣＰＴ８ｍＬチューブ（ＶＷＲカタログ番号ＢＤ３６２７５３）内に収集した。ＰＢＭＣアッセイデータシートを用いて、各ドナーのＣＰＴチューブ内の開始合計全血量の近似値を記録した。

【0752】

遠心分離の直前に、チューブを８〜１０回、穏やかに反転させることによって、血液試料を再度混合した。ＣＰＴチューブを、水平（スイングアウト）ローター内で、室温（１８〜２５℃）で３０分間、ブレーキオフで１５００〜１８００ＲＣＦで遠心分離した（２７００ＲＰＭ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｌｌｅｇｒａ ６Ｒ）。細胞を（Ｆｉｃｏｌｌとポリマーゲル層との間の）バフィーコート界面から回収し、５０ｍＬの滅菌円錐チューブに移し、最大５個のＣＰＴチューブ／５０ｍＬの円錐チューブ／ドナーをプールした。その後、細胞をＰＢＳ（Ｃａ^＋＋、Ｍｇ^＋＋を含まない；ＧＩＢＣＯ）で２回洗浄した。チューブを最大５０ｍＬまで満たし、数回反転させて混合した。その後、試料を、室温で１５分間、３３０×ｇで遠心分離し（１２１５ＲＰＭ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｌｌｅｇｒａ ６Ｒ）、ペレットを乱すことなくできるだけ多くの上澄みを吸引した。チューブを穏やかに回転させて細胞ペレットを取り除き、細胞をＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ（約１ｍＬ／１０ｍＬの開始全血量）中に再懸濁した。６０μＬの試料を、６００μＬのＶｅｒｓａＬｙｓｅ試薬（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、カタログ番号Ａ０９７７７）を有する試料バイアル（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）にピペット注入し、１０〜１５秒間穏やかにボルテックスした。試料を室温で１０分間インキュベートし、計数前に再度混合した。ＰＢＭＣ細胞型を用いたＶｉｃｅｌｌ ＸＲ細胞生存率分析器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で細胞懸濁液を計数した（１：１１の希釈係数を他のパラメータと共に保存した）。生細胞／ｍＬ及び生存率を記録した。細胞懸濁液をＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ中で１×１０^７生ＰＢＭＣ／ｍＬに希釈した。

【0753】

細胞を９６ウェル組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ）の５０μＬ／ウェル中に５×１０^５でプレーティングした。ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ中で希釈した２倍濃度のオリゴ／対照の５０μＬ／ウェルを実験テンプレートに従って添加した（合計１００μＬ／ウェル）。プレートを振盪器に設置し、約１分間混合させた。３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした後、プレートを４００×ｇで１０分間遠心分離し、その後、ＭＳＤサイトカインアッセイ（すなわち、ヒトＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−８、及びＭＣＰ−１）のために上澄みを除去した。

【0754】

実施例２４：ｈＰＢＭＣアッセイにおけるＧａｌＮＡｃ_３−１共役ＡＳＯの炎症誘発作用の評価
表３０に列記されるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を、実施例２３に記載されるプロトコルを用いたｈＰＢＭＣアッセイにおいて炎症誘発作用について評価した。ＩＳＩＳ ３５３５１２は、このアッセイにおいてＩＬ−６放出に関する高レスポンダーとして知られる内部標準物である。ｈＰＢＭＣを新鮮な志願ドナーから単離し、０、０．０１２８、０．０６４、０．３２、１．６、８、４０、及び２００μｍ濃度のＡＳＯで処理した。処理から２４時間後、サイトカインレベルを測定した。

【0755】

ＩＬ−６のレベルを一次読み出しとして用いた。標準的手順を用いてＥＣ_５０及びＥ_ｍａｘを計算した。結果が２つのドナー由来のＥ_ｍａｘ／ＥＣ_５０の平均比率として表され、「Ｅ_ｍａｘ／ＥＣ_５０」で表示される。より低い比率は、炎症誘発応答の相対的減少を示し、より高い比率は、炎症誘発応答の相対的増加を示す。

【0756】

試験化合物に関して、炎症誘発性が最も低い化合物は、ＰＳ／ＰＯ連結ＡＳＯ（ＩＳＩＳ ６１６４６８）であった。ＧａｌＮＡｃ_３−１共役ＡＳＯ（ＩＳＩＳ ６４７５３５）は、その非共役対応物（ＩＳＩＳ ３０４８０１）よりもわずかに炎症誘発性が低かった。これらの結果は、いくつかのＰＯ連結部の組み込みが炎症誘発反応を減少させ、ＧａｌＮＡｃ_３−１共役体の添加が化合物の炎症誘発性を高めず、炎症誘発応答を減少させうることを示す。したがって、混成ＰＳ／ＰＯ連結部及びＧａｌＮＡｃ_３−１共役体の両方を含むアンチセンス化合物が、完全ＰＳ連結アンチセンス化合物（ＧａｌＮＡｃ_３−１共役体の有無にかかわらず）と比較して、より低い炎症誘発応答をもたらすことが予想されるであろう。これらの結果は、ＧａｌＮＡｃ_３−１共役アンチセンス化合物、特に減少したＰＳ含有量を有するものの炎症誘発性がより低いことを示す。

【0757】

総合して、これらの結果は、ＧａｌＮＡｃ_３−１共役化合物、特にＰＳ含有量を減らしたものを、対応物であるＧａｌＮＡｃ_３−１共役体を欠く完全ＰＳアンチセンス化合物よりも高い用量で投与することができることを示唆する。これらの化合物の半減期が実質的に異なることが予想されないため、そのようなより高い投与量は、結果として低頻度の投薬につながる。実際には、ＧａｌＮＡｃ_３−１共役化合物の方が力価が高く（実施例２０〜２２を参照のこと）、再投薬は化合物の濃度が所望のレベル未満に低下した時に必要になるが、その所望のレベルは力価に基づくことから、そのような投与の頻度はさらに低くなるだろう。

【0758】

【表15】

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下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｋ」は、６’−（Ｓ）−ＣＨ_３二環式ヌクレオシド（例えば、ｃＥｔ）を示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。上付き文字「ｍ」は、５−メチルシトシンを示す。「Ａ_ｄｏ’−ＧａｌＮＡｃ_３−１_ａ」は、示されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端に結合される、実施例９に示される構造ＧａｌＮＡｃ_３−１を有する共役体を示す。

【0759】

【表16】

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【0760】

実施例２５：生体外におけるヒトＡｐｏＣ ＩＩＩを標的とするＧａｌＮＡｃ_３−１共役修飾ＡＳＯの影響
上述のＩＳＩＳ ３０４８０１及び６４７５３５を生体外で試験した。トランスジェニックマウス由来の２５，０００細胞／ウェルの密度の初代肝細胞を、０．０３，０．０８、０．２４、０．７４、２．２２、６．６７、及び２０μｍ濃度の修飾オリゴヌクレオチドで処理した。約１６時間の処理期間後、ＲＮＡを細胞から単離し、ｍＲＮＡレベルを定量的リアルタイムＰＣＲで測定し、ｈＡｐｏＣ ＩＩＩ ｍＲＮＡレベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮで測定された全ＲＮＡ含有量に従って調整した。

【0761】

標準的方法を用いてＩＣ_５０を計算し、結果が表３２に提示される。例証されるように、対照ＩＳＩＳ ３０４８０１と比較して、同程度の力価がＩＳＩＳ ６４７５３５で処理した細胞において観察された。

【0762】

【表17】

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【0763】

この実験において、生体内で観察されるＧａｌＮＡｃ_３−１共役の大きな力価利益は、生体外では観察されなかった。生体外での初代肝細胞におけるその後の自由取り込み実験は、ＧａｌＮＡｃ共役体を欠くオリゴヌクレオチドと比較して、さまざまなＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドの力価の増加を示した（実施例６０、８２、及び９２を参照のこと）。

【0764】

実施例２６：ＡｐｏＣ ＩＩＩ ＡＳＯ活性へのＰＯ／ＰＳ連結部の影響
ヒトＡｐｏＣ ＩＩＩトランスジェニックマウスに、ＩＳＩＳ ３０４８０１もしくはＩＳＩＳ ６１６４６８（両方ともに上述のもの）またはＰＢＳ処理対照を、２５ｍｇ／ｋｇで週１回２週間、腹腔内注入した。処理群は、３匹の動物から成り、対照群は、４匹の動物からなった。治療前及び最終服用後に血液を各マウスから採取し、血漿試料を分析した。最終投与の７２時間後にマウスを屠殺した。

【0765】

試料を収集し、分析して、上述のように肝臓におけるＡｐｏＣ ＩＩＩタンパク質レベルを決定した（実施例２０）。これらの分析からのデータが以下の表３３に提示される。

【0766】

これらの結果は、完全ＰＳ（ＩＳＩＳ ３０４８０１）と比較して、ウイングにＰＯ／ＰＳを有するアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ ６１６４６８）の力価の減少を示す。

【0767】

【表18】

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【0768】

実施例２７：化合物５６

【0769】

【化150】

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化合物５６は、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈから市販されているか、またはＳｈｃｈｅｐｉｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５（２２），４４４７−４４５４によって報告された公開された手順に従って調製することができる。

【0770】

実施例２８：化合物６０の調製

【0771】

【化151】

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化合物４を実施例２に例証される手順どおりに調製した。化合物５７は、市販のものである。化合物６０を構造分析で確認した。

【0772】

他の単保護された置換または無置換アルキルジオール、例えば限定するわけではないが、本明細書に提示されるものを用いて既定の組成を有するホスホラミダイトを調製することができるため、化合物５７は、代表的なものであり、限定する意図はない。

【0773】

実施例２９：化合物６３の調製

【0774】

【化152】

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化合物６１及び６２を、Ｔｏｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２０１３，３，５６６−５７７、及びＪｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，２００７，６３（１９），３９８２−３９８８によって報告された手順と同様の手順を用いて調製する。

【0775】

あるいは、化合物６３を、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．の科学文献及び特許文献（Ｓｙｎｌｅｔｔ，２００３，１２，１８３８−１８４０、及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．の公開されたＰＣＴ国際出願第ＷＯ２００４０６３２０８号）に報告される手順と同様の手順を用いて調製する。

【0776】

実施例３０：化合物６３ｂの調製

【0777】

【化153】

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化合物６３ａを、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，７４（９），１７３１−１７３７によって報告された手順と同様の手順を用いて調製する。

【0778】

実施例３１：化合物６３ｄの調製

【0779】

【化154】

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化合物６３ｃを、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９８，９（５），４５１−４５３によって報告された手順と同様の手順を用いて調製する。

【0780】

実施例３２：化合物６７の調製

【0781】

【化155】

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実施例２に例証される手順どおりに化合物６４を調製した。化合物６５を、Ｏｒ ｅｔ ａｌ．の公開されたＰＣＴ国際出願第ＷＯ２００９００３００９号によって報告された手順と同様の手順を用いて調製する。他の保護基、例えば限定するわけではないが、本明細書に提示されるものを用いることができるため、化合物６５に用いた保護基は、代表的なものであり、限定する意図はない。

【0782】

実施例３３：化合物７０の調製

【0783】

【化156】

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実施例２に例証される手順どおりに化合物６４を調製した。化合物６８は、市販のものである。他の保護基、例えば限定するわけではないが、本明細書に提示されるものを用いることができるため、化合物６８に用いた保護基は、代表的なものであり、限定する意図はない。

【0784】

実施例３４：化合物７５ａの調製

【0785】

【化157】

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化合物７５をＳｈｃｈｅｐｉｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５（２２），４４４７−４４５４によって報告された公開された手順に従って調製する。

【0786】

実施例３５：化合物７９の調製

【0787】

【化158】

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化合物７６をＳｈｃｈｅｐｉｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５（２２），４４４７−４４５４によって報告された公開された手順に従って調製した。

【0788】

実施例３６：化合物７９ａの調製

【0789】

【化159】

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化合物７７を実施例３５に例証される手順どおりに調製する。

【0790】

実施例３７：固体支持体による５’末端にホスホジエステル連結ＧａｌＮＡｃ_３−２共役体を含む共役オリゴマー化合物８２の調製のための一般的方法（方法Ｉ）

【0791】

【化160】

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【0792】

【化161】

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ＧａｌＮＡｃ_３−２が、以下の構造を有する：

【0793】

【化162】

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共役基ＧａｌＮＡｃ_３−２（ＧａｌＮＡｃ_３−２_ａ）のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分を任意の切断可能部分と合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。ＧａｌＮＡｃ_３−２_ａは、以下の式を有する：

【0794】

【化163】

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【0795】

ＶＩＭＡＤ結合オリゴマー化合物７９ｂを、自動ＤＮＡ／ＲＮＡ合成における標準的手順を用いて調製した（Ｄｕｐｏｕｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２００６，４５，３６２３−３６２７を参照のこと）。ホスホラミダイト化合物５６及び６０を、それぞれ、実施例２７及び２８にそれぞれ例証される手順どおりに調製した。他のホスホラミダイト構築ブロック、例えば限定するわけではないが、本明細書に提示されるものを用いて、５’末端にホスホジエステル連結共役基を有するオリゴマー化合物を調製することができるため、例証されるホスホラミダイトは、代表的なものであり、限定する意図はない。固体支持体に添加されるホスホラミダイトの順序及び量を調整して、任意の既定の配列及び組成を有する本明細書に記載するオリゴマー化合物を調製することができる。

【0796】

実施例３８：５’末端にホスホジエステル連結ＧａｌＮＡｃ_３−２共役体を含むオリゴマー化合物８２の調製のための代替方法（方法ＩＩ）

【0797】

【化164】

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ＶＩＭＡＤ結合オリゴマー化合物７９ｂを、自動ＤＮＡ／ＲＮＡ合成における標準的手順を用いて調製した（Ｄｕｐｏｕｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２００６，４５，３６２３−３６２７を参照のこと）。ＧａｌＮＡｃ_３−２クラスターホスホラミダイト（化合物７９）を実施例３５に例証される手順どおりに調製した。この代替方法は、合成の最終ステップでのホスホジエステル連結ＧａｌＮＡｃ_３−２共役体のオリゴマー化合物への一段階導入を可能にする。他のホスホラミダイト構築ブロック、例えば限定するわけではないが、本明細書に提示されるものを用いて５’末端にホスホジエステル共役体を有するオリゴマー化合物を調製することができるため、例証されるホスホラミダイトは、代表的なものであり、限定する意図はない。固体支持体に添加されるホスホラミダイトの順序及び量を調整して、任意の既定の配列及び組成を有する本明細書に記載するオリゴマー化合物を調製することができる。

【0798】

実施例３９：固体支持体による５’末端にＧａｌＮＡｃ_３−３共役体（５’末端結合のためにＧａｌＮＡｃ_３−１修飾されたもの）を含むオリゴマー化合物８３ｈの調製のための一般的方法

【0799】

【化165】

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【0800】

【化166】

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化合物１８を実施例４に例証される手順どおりに調製した。化合物８３ａ及び８３ｂは、市販のものである。ホスホジエステル連結ヘキシルアミンを含むオリゴマー化合物８３ｅを標準のオリゴヌクレオチド合成手順を用いて調製した。保護されたオリゴマー化合物をアンモニア水で処理することにより、５’−ＧａｌＮＡｃ_３−３共役オリゴマー化合物（８３ｈ）を提供した。

【0801】

ＧａｌＮＡｃ_３−３が、以下の構造を有する：

【0802】

【化167】

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【0803】

共役基ＧａｌＮＡｃ_３−３（ＧａｌＮＡｃ_３−３_ａ）のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分を任意の切断可能部分と合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。ＧａｌＮＡｃ_３−３_ａは、以下の式を有する：

【0804】

【化168】

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【0805】

実施例４０：固体支持体による３’末端にホスホジエステル連結ＧａｌＮＡｃ_３−４共役体を含むオリゴマー化合物８９の調製のための一般的方法

【0806】

【化169】

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【0807】

【化170】

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ＧａｌＮＡｃ_３−４が、以下の構造を有する：

【0808】

【化171】

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式中、ＣＭは、切断可能部分である。ある特定の実施形態において、切断可能部分は、以下のものである：

【0809】

【化172】

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共役基ＧａｌＮＡｃ_３−４（ＧａｌＮＡｃ_３−４_ａ）のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分を任意の切断可能部分と合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。ＧａｌＮＡｃ_３−４_ａは、以下の式を有する：

【0810】

【化173】

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【0811】

保護されたＵｎｙｌｉｎｋｅｒ機能化固体支持体化合物３０は、市販のものである。化合物８４を、文献に報告される手順と同様の手順を用いて調製する（Ｓｈｃｈｅｐｉｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５（２２），４４４７−４４５４、Ｓｈｃｈｅｐｉｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９９，２７，３０３５−３０４１、及びＨｏｒｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５，４８４２−４８４９を参照のこと）。

【0812】

ホスホラミダイト構築ブロック（化合物６０及び７９ａ）を実施例２８及び３６に例証される手順どおりに調製する。他のホスホラミダイト構築ブロックを用いて、既定の配列及び組成を有する３’末端にホスホジエステル連結共役体を有するオリゴマー化合物を調製することができるため、例証されるホスホラミダイトは、代表的なものであり、限定する意図はない。固体支持体に添加されるホスホラミダイトの順序及び量を調整して、任意の既定の配列及び組成を有する本明細書に記載するオリゴマー化合物を調製することができる。

【0813】

実施例４１：固相技法による５’位にホスホジエステル連結ＧａｌＮＡｃ_３−２（Ｂｘがアデニンである実施例３７を参照のこと）共役体を含むＡＳＯの調製のための一般的方法（ＩＳＩＳ ６６１１３４の調製）
別段の明示がある場合を除き、オリゴマー化合物の合成に用いるすべての試薬及び溶液を商業的供給源から購入する。標準のホスホラミダイト構築ブロック及び固体支持体を、例えば、Ｔ、Ａ、Ｇ、及び^ｍＣ残基を含む、ヌクレオシド残基の組み込みのために用いる。ホスホラミダイト化合物５６及び６０を用いて、５’末端のホスホジエステル連結ＧａｌＮＡｃ_３−２共役体を合成した。無水アセトニトリル中のホスホラミダイトの０．１Ｍ溶液をb−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシド及び２’−ＭＯＥに用いた。

【0814】

カラムに充填されたＶＩＭＡＤ固体支持体（１１０μｍｏｌ／ｇ、Ｇｕｚａｅｖ ｅｔ ａｌ．，２００３）でのホスホラミダイトカップリング法により、ＡＳＯ合成を、ＡＢＩ ３９４合成装置（１〜２μｍｏｌの規模）またはＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＡＫＴＡオリゴパイロット合成装置（４０〜２００μｍｏｌの規模）で実行した。このカップリングステップについて、固体支持体の初期負荷量に対して４倍過剰のホスホラミダイトを送達し、ホスホラミダイトカップリングを１０分間行った。すべての他のステップは、製造業者から提供された標準のプロトコルに従った。トルエン中の６％ジクロロ酢酸溶液を用いて、ヌクレオチドの５’−ヒドロキシル基からジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基を除去した。カップリングステップ中、無水ＣＨ_３ＣＮ中の４，５−ジシアノイミダゾール（０．７Ｍ）を活性化剤として用いた。ホスホロチオエート連結部を、３分間の接触時間で、１：１のピリジン／ＣＨ_３ＣＮ中のキサンタンヒドリドの０．１Ｍ溶液による硫化によって導入した。６％の水を含有するＣＨ_３ＣＮ中の２０％のｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドの溶液を酸化剤として用いて、１２分間の接触時間で、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部を提供した。

【0815】

所望の配列が構築された後、シアノエチルホスフェート保護基を、４５分間の接触時間で、トルエン中の２０％ジエチルアミン（ｖ／ｖ）を用いて脱保護した。固体支持体に結合されたＡＳＯをアンモニア水（２８〜３０重量％）中に懸濁し、５５℃で６時間加熱した。その後、非結合型ＡＳＯを濾過し、アンモニアを沸去した。残渣を強アニオン交換カラムでの高圧液体クロマトグラフィーによって精製した（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｑ、３０μｍ、２．５４×８ｃｍ、Ａ＝３０％ＣＨ_３ＣＮ水溶液中１００ｍＭ酢酸アンモニウム、Ｂ＝Ａ中１．５Ｍ ＮａＢｒ、６０分後０〜４０％のＢ、流量１４ｍＬ／分、λ＝２６０ｎｍ）。残渣を逆相カラムでのＨＰＬＣにより脱塩して、固体支持体への初期負荷量に基づいて１５〜３０％の単離収率で所望のＡＳＯを得た。ＡＳＯを、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＭＳＤシステムを用いたイオン対ＨＰＬＣ／ＭＳ分析によって特徴付けた。

【0816】

【表19】

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下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｋ」は、６’−（Ｓ）−ＣＨ_３二環式ヌクレオシド（例えば、ｃＥｔ）を示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。上付き文字「ｍ」は、５−メチルシトシンを示す。ＧａｌＮＡｃ_３−２_ａの構造が実施例３７に示される。

【0817】

実施例４２：固相技法による５’位にＧａｌＮＡｃ_３−３共役体を含むＡＳＯの調製のための一般的方法（ＩＳＩＳ ６６１１６６の調製）
ＩＳＩＳ ６６１１６６の合成を、実施例３９及び４１に例証される手順と同様の手順を用いて実行した。

【0818】

ＩＳＩＳ ６６１１６６は、５’位がＧａｌＮＡｃ_３−３共役体を含む５−１０−５ＭＯＥギャップマーである。ＡＳＯを、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＭＳＤシステムを用いたイオン対ＨＰＬＣ／ＭＳ分析によって特徴付けた。

【0819】

【表20】

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下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。上付き文字「ｍ」は、５−メチルシトシンを示す。「５’−ＧａｌＮＡｃ_３−３ａ」の構造が実施例３９に示される。

【0820】

実施例４３：生体内におけるＳＲＢ−１を標的とする５’末端でのホスホジエステル連結ＧａｌＮＡｃ_３−２の用量依存的試験（Ｂｘがアデニンである実施例３７及び４１を参照のこと）
５’末端にホスホジエステル連結ＧａｌＮＡｃ_３−２共役体を含むＩＳＩＳ ６６１１３４（実施例４１を参照のこと）を、用量依存的試験においてマウスにおけるＳＲＢ−１のアンチセンス阻害について試験した。非共役ＩＳＩＳ ４４０７６２及び６５１９００（３’末端にＧａｌＮＡｃ_３−１共役体、実施例９を参照のこと）を比較のために試験に含め、先の表１７に記載する。

【0821】

処理
６週齢の雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、ＩＳＩＳ ４４０７６２、６５１９００、６６１１３４、またはＰＢＳ処理対照を、以下に示される投与量で１回、皮下注入した。各処理群は、４匹の動物からなった。最終投与の７２時間後にマウスを屠殺して、リアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓におけるＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを標準プロトコルに従って決定した。ＰＢＳ処理対照に対して正規化する前に（Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎを用いて）ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを全ＲＮＡとの比較で相対的に決定した。以下の結果は、ＰＢＳ処理対照に対して正規化された各処理群のＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして提示され、「％ＰＢＳ」で表示される。当該方法と同様の方法を用いてＥＤ_５０を測定し、以下に提示する。

【0822】

表３５に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを低下させた。実際には、５’末端にホスホジエステル連結ＧａｌＮＡｃ_３−２共役体（ＩＳＩＳ ６６１１３４）または３’末端に連結されたＧａｌＮＡｃ_３−１共役体（ＩＳＩＳ ６５１９００）を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、非共役アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ４４０７６２）と比較して、力価の大幅な改善を示した。さらに、５’末端にホスホジエステル連結ＧａｌＮＡｃ_３−２共役体を含むＩＳＩＳ ６６１１３４は、３’末端にＧａｌＮＡｃ_３−１共役体を含むＩＳＩＳ ６５１９００と比較して、等効力であった。

【0823】

【表21】

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３’ＧａｌＮＡｃ_３−１及び５’ＧａｌＮＡｃ_３−２の構造は、先の実施例９及び３７に記載されている。

【0824】

薬物動態分析（ＰＫ）
高用量群（７ｍｇ／ｋｇ）でのＡＳＯのＰＫを調べ、実施例２０に例証される方法と同一の方法で評価した。肝臓試料を切り刻み、標準のプロトコルを用いて抽出した。６６１１３４（５’ＧａｌＮＡｃ_３−２）及びＩＳＩＳ ６５１９００（３’ＧａｌＮＡｃ_３−１）の全長代謝物を特定し、これらの質量を高分解能質量分析によって確認した。結果は、５’末端にホスホジエステル連結ＧａｌＮＡｃ_３−２共役体を含むＡＳＯ（ＩＳＩＳ ６６１１３４）に対して検出された主な代謝物が、ＩＳＩＳ ４４０７６２であったことを示した（データ示されず）。検出可能なレベルでさらなる代謝物は観察されなかった。その対応物とは異なり、先の表２３ａに報告された代謝物と同様のさらなる代謝物が、３’末端にＧａｌＮＡｃ_３−１共役体を有するＡＳＯ（ＩＳＩＳ ６５１９００）で観察された。これらの結果は、ホスホジエステル連結ＧａｌＮＡｃ_３−１またはＧａｌＮＡｃ_３−２共役体を有することで、それらの力価を損なうことなくＡＳＯのＰＫプロファイルを改善しうることを示唆する。

【0825】

実施例４４：ＳＲＢ−１を標的とする３’末端にＧａｌＮＡｃ_３−１共役体（実施例９を参照のこと）を含むＡＳＯのアンチセンス阻害へのＰＯ／ＰＳ連結部の影響
それぞれＳＲＢ−１を標的とする、３’末端にＧａｌＮＡｃ_３−１共役体を含むＩＳＩＳ ６５５８６１及び６５５８６２を、単回投与試験においてマウスにおけるＳＲＢ−１を阻害するそれらの能力について試験した。親非共役化合物ＩＳＩＳ ３５３３８２を比較のために試験に含めた。

【0826】

ＡＳＯは５−１０−５ＭＯＥギャップマーであり、ギャップ領域は、１０個の２’−デオキシリボヌクレオシドを含み、各ウイング領域は、５個の２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを含む。ＡＳＯを先の実施例１９に例証される方法と同様の方法を用いて調製し、以下の表３６に示す。

【0827】

【表22】

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下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。上付き文字「ｍ」は、５−メチルシトシンを示す。「ＧａｌＮＡｃ_３−１」の構造が実施例９に示される。
処理

【0828】

６週齢の雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、ＩＳＩＳ ３５３３８２、６５５８６１、６５５８６２、またはＰＢＳ処理対照を、以下に示される投与量で１回、皮下注入した。各処理群は、４匹の動物からなった。治療前及び最終服用後に血液を各マウスから採取し、血漿試料を分析した。最終投与の７２時間後にマウスを屠殺して、リアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓におけるＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを決定した。ＰＢＳ処理対照に対して正規化する前に（Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎを用いて）ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを全ＲＮＡとの比較で相対的に決定した。以下の結果は、ＰＢＳ処理対照に対して正規化された各処理群のＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして提示され、「％ＰＢＳ」で表示される。当該方法と同様の方法を用いてＥＤ_５０を測定し、以下に報告する。

【0829】

表３７に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、ＰＢＳ処理対照と比較して、用量依存的様式でＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを低下させた。実際には、３’末端にＧａｌＮＡｃ_３−１共役体を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ６５５８６１及び６５５８６２）は、非共役アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ３５３３８２）と比較して、力価の大幅な改善を示した。さらに、混成ＰＳ／ＰＯ連結部を有するＩＳＩＳ ６５５８６２は、完全ＰＳ（ＩＳＩＳ ６５５８６１）と比較して、力価の改善を示した。

【0830】

【表23】

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【0831】

血清における肝臓トランスアミナーゼレベル、すなわちアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を、標準のプロトコルを用いて、生理食塩水を注入したマウスとの比較で相対的に測定した。臓器重量も評価した。結果は、ＰＢＳ対照と比較して、ＡＳＯで処理したマウスにおいて、トランスアミナーゼレベル（表３８）の増加も臓器重量（データ示されず）の増加も観察されなかったことを示した。さらに、混成ＰＳ／ＰＯ連結部を有するＡＳＯ（ＩＳＩＳ ６５５８６２）は、完全ＰＳ（ＩＳＩＳ ６５５８６１）と比較して、同様のトランスアミナーゼレベルを示した。

【0832】

【表24】

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【0833】

実施例４５：ＰＦＰエステル（化合物１１０ａ）の調製

【0834】

【化174】

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【0835】

【化175】

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化合物４（９．５ｇ、２８．８ｍｍｏｌｅ）を化合物１０３ａまたは１０３ｂ（３８ｍｍｏｌｅ）で個別に処理し、ジクロロメタン（２００ｍＬ）中のＴＭＳＯＴｆ（０．５当量）及びモレキュラーシーブで処理し、室温で１６時間撹拌した。この時点で、セライトを通して有機層を濾過し、その後、重炭酸ナトリウム、水、及びブラインで洗浄した。その後、有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で還元した。結果として生じた油状物をシリカゲルクロマトグラフィー（２％→１０％メタノール／ジクロロメタン）によって精製して、８０％超の収率で化合物１０４ａ及び１０４ｂを得た。ＬＣＭＳ及びプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。

【0836】

化合物１０４ａ及び１０４ｂを化合物１００ａ〜ｄ（実施例４７）と同一の条件で処理して、９０％超の収率で化合物１０５ａ及び１０５ｂを得た。ＬＣＭＳ及びプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。

【0837】

化合物１０５ａ及び１０５ｂを、化合物９０１ａ〜ｄと同一の条件下、化合物９０で個別に処理して、化合物１０６ａ（８０％）及び１０６ｂ（２０％）を得た。ＬＣＭＳ及びプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。

【0838】

化合物１０６ａ及び１０６ｂを化合物９６ａ〜ｄ（実施例４７）と同一の条件で処理して、１０７ａ（６０％）及び１０７ｂ（２０％）を得た。ＬＣＭＳ及びプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。

【0839】

化合物１０７ａ及び１０７ｂを化合物９７ａ〜ｄ（実施例４７）と同一の条件で処理して、４０〜６０％の収率で化合物１０８ａ及び１０８ｂを得た。ＬＣＭＳ及びプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。

【0840】

化合物１０８ａ（６０％）及び１０８ｂ（４０％）を化合物１００ａ〜ｄ（実施例４７）と同一の条件で処理して、８０％超の収率で化合物１０９ａ及び１０９ｂを得た。ＬＣＭＳ及びプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。

【0841】

化合物１０９ａを化合物１０１ａ〜ｄ（実施例４７）と同一の条件で処理して、３０〜６０％の収率で化合物１１０ａを得た。ＬＣＭＳ及びプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。あるいは、化合物１１０ｂを化合物１０９ｂから開始して同様の方法で調製することができる。

【0842】

実施例４６：ＰＦＰエステル（オリゴヌクレオチド１１１）との共役のための一般的手順；ＩＳＩＳ ６６６８８１（ＧａｌＮＡｃ_３−１０）の調製
標準の固相オリゴヌクレオチド手順を用いて５’−ヘキシルアミノ修飾オリゴヌクレオチドを合成し、精製した。５’−ヘキシルアミノ修飾オリゴヌクレオチドを０．１Ｍ四ホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．５、２００μＬ）中に溶解し、ＤＭＳＯ（５０μＬ）中に溶解した３当量の選択されたＰＦＰエステル化ＧａｌＮＡｃ_３クラスターを添加した。ＡＳＯ溶液への添加時にＰＦＰエステルが沈殿した場合、すべてのＰＦＰエステルが溶解した状態になるまでＤＭＳＯを添加した。室温で約１６時間混合した後、反応が完了した。結果として生じた溶液を水で希釈して１２ｍＬにし、その後、質量カットオフが３０００Ｄａのスピンフィルター中、３０００ｒｐｍで沈降させた。このプロセスを２回繰り返して、小分子不純物を除去した。その後、この溶液を凍結乾燥乾固させ、濃縮アンモニア水中に再溶解し、室温で２．５時間混合し、その後、真空内で濃縮して、アンモニアの大部分を除去した。共役オリゴヌクレオチドを精製し、ＲＰ−ＨＰＬＣによって脱塩し、凍結乾燥させて、ＧａｌＮＡｃ_３共役オリゴヌクレオチドを得た。

【0843】

【化176】

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【0844】

オリゴヌクレオチド１１１をＧａｌＮＡｃ_３−１０と共役する。共役基ＧａｌＮＡｃ_３−１０（ＧａｌＮＡｃ_３−１０_ａ）のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。ある特定の実施形態において、切断可能部分は、以下のＧａｌＮＡｃ_３−１０で合成されたオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ６６６８８１）に示される−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａ_ｄ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。ＧａｌＮＡｃ_３−１０（ＧａｌＮＡｃ_３−１０_ａ−ＣＭ−）の構造は、以下に示される：

【0845】

【化177】

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【0846】

この一般的手順に従って、ＩＳＩＳ ６６６８８１を調製した。標準の固相オリゴヌクレオチド手順を用いて５’−ヘキシルアミノ修飾オリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ６６０２５４）を合成し、精製した。ＩＳＩＳ ６６０２５４（４０ｍｇ、５．２μｍｏｌ）を０．１Ｍ四ホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．５、２００μＬ）中に溶解し、ＤＭＳＯ（５０μＬ）中に溶解した３当量のＰＦＰエステル（化合物１１０ａ）を添加した。ＡＳＯ溶液への添加時にＰＦＰエステルが沈殿した場合、ＰＦＰエステルを完全に溶解するためにさらなるＤＭＳＯ（６００μＬ）が必要であった。室温で約１６時間混合した後、反応が完了した。この溶液を水で希釈して全体積１２ｍＬにし、質量カットオフが３０００Ｄａのスピンフィルター中、３０００ｒｐｍで沈降させた。このプロセスを２回繰り返して、小分子不純物を除去した。この溶液を凍結乾燥乾固させ、濃縮アンモニア水中に再溶解し、室温で２．５時間混合し、その後、真空内で濃縮して、アンモニアの大部分を除去した。共役オリゴヌクレオチドを精製し、ＲＰ−ＨＰＬＣによって脱塩し、凍結乾燥させて、９０重量％の収率でＩＳＩＳ ６６６８８１（４２ｍｇ、４．７μｍｏｌ）を得た。

【0847】

【表25】

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大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、^ｍＣは、５−メチルシトシンを示す。下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。共役基は、太字で表示されている。

【0848】

実施例４７：ＧａｌＮＡｃ_３−８を含むオリゴヌクレオチド１０２の調製

【0849】

【化178】

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【0850】

【化179】

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【0851】

【化180】

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三酸９０（４ｇ、１４．４３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１２０ｍＬ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１２．３５ｍＬ、７２ｍｍｏｌｅ）中に溶解した。トリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（８．９ｍＬ、５２ｍｍｏｌｅ）をアルゴン下で滴加し、反応物を室温で３０分間撹拌させた。Ｂｏｃ−ジアミン９１ａまたは９１ｂ（６８．８７ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１２．３５ｍＬ、７２ｍｍｏｌｅ）とともに添加し、反応物を室温で１６時間撹拌させた。この時点で、ＤＭＦを減圧下で７５％超、減量し、その後、混合物をジクロロメタン中に溶解した。有機層を重炭酸ナトリウム、水、及びブラインで洗浄した。その後、有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で減量して、油状物とした。結果として生じた油状物をシリカゲルクロマトグラフィー（２％→１０％メタノール／ジクロロメタン）によって精製して、約８０％の収率で化合物９２ａ及び９２ｂを得た。ＬＣＭＳ及びプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。

【0852】

化合物９２ａまたは９２ｂ（６．７ｍｍｏｌｅ）を２０ｍＬのジクロロメタン及び２０ｍＬのトリフルオロ酢酸で、室温で１６時間処理した。結果として生じた溶液を蒸発させ、その後、メタノール中に溶解し、ＤＯＷＥＸ−ＯＨ樹脂で３０分間処理した。結果として生じた溶液を濾過し、減圧下で減量して油状物とすることで、８５〜９０％の収率の化合物９３ａ及び９３ｂを得た。

【0853】

化合物７または６４（９．６ｍｍｏｌｅ）をＤＭＦ（２０ｍＬ）中のＨＢＴＵ（３．７ｇ、９．６ｍｍｏｌｅ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５ｍＬ）で１５分間処理した。これに、化合物９３ａまたは９３ｂ（３ｍｍｏｌｅ）のいずれかを添加し、室温で１６時間撹拌させた。この時点で、ＤＭＦを減圧下で７５％超、減量し、その後、混合物をジクロロメタン中に溶解した。有機層を重炭酸ナトリウム、水、及びブラインで洗浄した。その後、有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で減量して、油状物とした。結果として生じた油状物をシリカゲルクロマトグラフィー（５％→２０％メタノール／ジクロロメタン）によって精製して、２０〜４０％の収率で化合物９６ａ〜ｄを得た。ＬＣＭＳ及びプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。

【0854】

化合物９６ａ〜ｄ（０．７５ｍｍｏｌｅ）をラネーニッケル上で３時間、エタノール（７５ｍＬ）中で個別に水素化した。この時点で、セライトを通して触媒を濾去し、エタノールを減圧下で除去して、８０〜９０％の収率で化合物９７ａ〜ｄを得た。ＬＣＭＳ及びプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。

【0855】

化合物２３（０．３２ｇ、０．５３ｍｍｏｌｅ）をＤＭＦ（３０ｍＬ）中のＨＢＴＵ（０．２ｇ、０．５３ｍｍｏｌｅ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１９ｍＬ、１．１４ｍｍｏｌｅ）で１５分間処理した。これに、化合物９７ａ〜ｄ（０．３８ｍｍｏｌｅ）を個別に添加し、室温で１６時間撹拌させた。この時点で、ＤＭＦを減圧下で７５％超、減量し、その後、混合物をジクロロメタン中に溶解した。有機層を重炭酸ナトリウム、水、及びブラインで洗浄した。その後、有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で減量して、油状物とした。結果として生じた油状物をシリカゲルクロマトグラフィー（２％→２０％メタノール／ジクロロメタン）によって精製して、３０〜４０％の収率で化合物９８ａ〜ｄを得た。ＬＣＭＳ及びプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。

【0856】

化合物９９（０．１７ｇ、０．７６ｍｍｏｌｅ）をＤＭＦ（５０ｍＬ）中のＨＢＴＵ（０．２９ｇ、０．７６ｍｍｏｌｅ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．３５ｍＬ、２．０ｍｍｏｌｅ）で１５分間処理した。これに、化合物９７ａ〜ｄ（０．５１ｍｍｏｌｅ）を個別に添加し、室温で１６時間撹拌させた。この時点で、ＤＭＦを減圧下で７５％超、減量し、その後、混合物をジクロロメタン中に溶解した。有機層を重炭酸ナトリウム、水、及びブラインで洗浄した。その後、有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で減量して、油状物とした。結果として生じた油状物をシリカゲルクロマトグラフィー（５％→２０％メタノール／ジクロロメタン）によって精製して、４０〜６０％の収率で化合物１００ａ〜ｄを得た。ＬＣＭＳ及びプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。

【0857】

化合物１００ａ〜ｄ（０．１６ｍｍｏｌｅ）を、１０％Ｐｄ（ＯＨ）_２／Ｃ上で３時間、メタノール／酢酸エチル（１：１、５０ｍＬ）中で個別に水素化した。この時点で、セライトを通して触媒を濾去し、有機物を減圧下で除去して、８０〜９０％の収率で化合物１０１ａ〜ｄを得た。ＬＣＭＳ及びプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。

【0858】

化合物１０１ａ〜ｄ（０．１５ｍｍｏｌｅ）をＤＭＦ（１５ｍＬ）及びピリジン（０．０１６ｍＬ、０．２ｍｍｏｌｅ）中に個別に溶解した。トリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（０．０３４ｍＬ、０．２ｍｍｏｌｅ）をアルゴン下で滴加し、反応物を室温で３０分間撹拌させた。この時点で、ＤＭＦを減圧下で７５％超、減量し、その後、混合物をジクロロメタン中に溶解した。有機層を重炭酸ナトリウム、水、及びブラインで洗浄した。その後、有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で減量して、油状物とした。結果として生じた油状物をシリカゲルクロマトグラフィー（２％→５％メタノール／ジクロロメタン）によって精製して、約８０％の収率で化合物１０２ａ〜ｄを得た。ＬＣＭＳ及びプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。

【0859】

【化181】

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【0860】

実施例４６に例証される一般的手順を用いて、ＧａｌＮＡｃ_３−８共役基を含むオリゴマー化合物１０２を調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ_３−８（ＧａｌＮＡｃ_３−８_ａ）のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。好ましい一実施形態において、切断可能部分は、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａ_ｄ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。

【0861】

ＧａｌＮＡｃ_３−８（ＧａｌＮＡｃ_３−８_ａ−ＣＭ−）の構造は、以下に示される：

【0862】

【化182】

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【0863】

実施例４８：ＧａｌＮＡｃ_３−７を含むオリゴヌクレオチド１１９の調製

【0864】

【化183】

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【0865】

【化184】

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文献（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００４，４７，５７９８−５８０８）に記載される手順に従って化合物１１２を合成した。

【0866】

化合物１１２（５ｇ、８．６ｍｍｏｌ）を１：１メタノール／酢酸エチル（２２ｍＬ／２２ｍＬ）中に溶解した。炭素（０．５ｇ）上水酸化パラジウムを添加した。反応混合物を室温で１２時間、水素下で撹拌した。セライトパッドを通して反応混合物を濾過し、そのパッドを１：１メタノール／酢酸エチルで洗浄した。濾液と洗浄物を合わせ、濃縮乾固させて、化合物１０５ａ（定量的）を得た。この構造を、ＬＣＭＳによって確認した。

【0867】

化合物１１３（１．２５ｇ、２．７ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（３．２ｇ、８．４ｍｍｏｌ）、及びＤＩＥＡ（２．８ｍＬ、１６．２ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１７ｍＬ）中に溶解し、反応混合物を室温で５分間撹拌した。これに、無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の化合物１０５ａ（３．７７ｇ、８．４ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。反応物を室温で６時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去して、油状物を得た。残渣をＣＨ_２Ｃｌ_２（１００ｍＬ）中に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（１００ｍＬ）及びブライン（１００ｍＬ）で洗浄した。有機相を分離し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、蒸発させた。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、ジクロロメタン中の１０〜２０％ＭｅＯＨで溶出して、化合物１１４（１．４５ｇ、３０％）を得た。この構造を、ＬＣＭＳ及び^１Ｈ ＮＭＲ分析によって確認した。

【0868】

化合物１１４（１．４３ｇ、０．８ｍｍｏｌ）を１：１メタノール／酢酸エチル（４ｍＬ／４ｍＬ）中に溶解した。パラジウム炭素（湿性、０．１４ｇ）を添加した。反応混合物を水素でフラッシュし、室温で１２時間、水素下で撹拌した。セライトパッドを通して反応混合物を濾過した。このセライトパッドをメタノール／酢酸エチル（１：１）で洗浄した。濾液と洗浄物を一つに合わせ、減圧下で蒸発させて、化合物１１５（定量的）を得た。この構造を、ＬＣＭＳ及び^１Ｈ ＮＭＲ分析によって確認した。

【0869】

化合物８３ａ（０．１７ｇ、０．７５ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（０．３１ｇ、０．８３ｍｍｏｌ）、及びＤＩＥＡ（０．２６ｍＬ、１．５ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（５ｍＬ）中に溶解し、反応混合物を室温で５分間撹拌した。これに、無水ＤＭＦ中の化合物１１５（１．２２ｇ、０．７５ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、反応物を室温で６時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をＣＨ_２Ｃｌ_２中に溶解した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液及びブラインで洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濾過した。有機層を濃縮乾固させ、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、ジクロロメタン中の３〜１５％ＭｅＯＨで溶出して、化合物１１６（０．８４ｇ、６１％）を得た。この構造を、ＬＣ ＭＳ及び^１Ｈ ＮＭＲ分析によって確認した。

【0870】

【化185】

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【0871】

化合物１１６（０．７４ｇ、０．４ｍｍｏｌ）を１：１メタノール／酢酸エチル（５ｍＬ／５ｍＬ）中に溶解した。パラジウム炭素（湿性、０．０７４ｇ）を添加した。反応混合物を水素でフラッシュし、室温で１２時間、水素下で撹拌した。セライトパッドを通して反応混合物を濾過した。このセライトパッドをメタノール／酢酸エチル（１：１）で洗浄した。濾液と洗浄物を一つに合わせ、減圧下で蒸発させて、化合物１１７（０．７３ｇ、９８％）を得た。この構造を、ＬＣＭＳ及び^１Ｈ ＮＭＲ分析によって確認した。

【0872】

化合物１１７（０．６３ｇ、０．３６ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（３ｍＬ）中に溶解した。この溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（７０μＬ、０．４ｍｍｏｌ）及びトリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（７２μＬ、０．４２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１２時間撹拌し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液に注いだ。この混合物をジクロロメタンで抽出し、ブラインで洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させた。このジクロロメタン溶液を濃縮乾固させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、ジクロロメタン中の５〜１０％ＭｅＯＨで溶出して、化合物１１８（０．５１ｇ、７９％）を得た。この構造を、ＬＣＭＳと、^１Ｈならびに^１Ｈ及び^１９Ｆ ＮＭＲによって確認した。

【0873】

【化186】

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【0874】

実施例４６に例証される一般的手順を用いて、ＧａｌＮＡｃ_３−７共役基を含むオリゴマー化合物１１９を調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ_３−７（ＧａｌＮＡｃ_３−７_ａ）のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。ある特定の実施形態において、切断可能部分は、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａ_ｄ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。

【0875】

ＧａｌＮＡｃ_３−７（ＧａｌＮＡｃ_３−７_ａ−ＣＭ−）の構造は、以下に示される：

【0876】

【化187】

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【0877】

実施例４９：ＧａｌＮＡｃ_３−５を含むオリゴヌクレオチド１３２の調製

【0878】

【化188】

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化合物１２０（１４．０１ｇ、４０ｍｍｏｌ）及びＨＢＴＵ（１４．０６ｇ、３７ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（８０ｍＬ）中に溶解した。トリエチルアミン（１１．２ｍＬ、８０．３５ｍｍｏｌ）を添加し、５分間撹拌した。反応混合物を氷浴中で冷却し、無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の化合物１２１（１０ｇ、ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。さらなるトリエチルアミン（４．５ｍＬ、３２．２８ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物をアルゴン雰囲気下で１８時間撹拌した。ＴＬＣ（１：１の酢酸エチル：ヘキサン；Ｒｆ＝０．４７）によって反応を監視した。溶媒を減圧下で除去した。残渣をＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）中に取り込み、１Ｍ ＮａＨＳＯ_４（３×１５０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（３×１５０ｍＬ）、及びブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させた。乾燥剤を濾去し、有機層を回転蒸発によって濃縮した。粗混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、ヘキサン中の３５〜５０％ＥｔＯＡｃを用いて溶出して、化合物１２２（１５．５０ｇ、７８．１３％）を得た。この構造を、ＬＣＭＳ及び^１Ｈ ＮＭＲ分析によって確認した。質量（ｍ／ｚ）５８９．３［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0879】

水（２０ｍＬ）及びＴＨＦ（１０ｍＬ）中のＬｉＯＨ（９２．１５ｍｍｏｌ）の溶液を、メタノール（１５ｍＬ）中に溶解した化合物１２２の冷溶液（７．７５ｇ、１３．１６ｍｍｏｌ）に添加した。反応混合物を室温で４５分間撹拌し、ＴＬＣ（１：１のＥｔＯＡｃ：ヘキサン）によって監視した。反応混合物を減圧下で濃縮して、半分の体積にした。残りの溶液を氷浴中で冷却して、濃縮ＨＣｌを添加して中和した。反応混合物を希釈し、ＥｔＯＡｃ（１２０ｍＬ）で抽出し、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄した。エマルジョンが生じたが、一晩静置すると濁りがなくなった。有機層を分離し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、蒸発させて、化合物１２３（８．４２ｇ）を得た。質量が大きすぎる原因はおそらく残留塩である。ＬＣＭＳは、この構造と一致した。この生成物をさらに精製することなく使用した。Ｍ．Ｗ．計算値：５７４．３６、Ｍ．Ｗ．実測値：５７５．３［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0880】

【化189】

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【0881】

文献（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１，１３３，９５８−９６３）に記載される手順に従って化合物１２６を合成した。

【0882】

【化190】

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【0883】

【化191】

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【0884】

化合物１２３（７．４１９ｇ、１２．９１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（３．４９ｇ、２５．８２ｍｍｏｌ）、及び化合物１２６（６．３３ｇ、１６．１４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（４０ｍＬ）中に溶解し、結果として生じた反応混合物を氷浴中で冷却した。これに、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４．４２ｍＬ、２５．８２ｍｍｏｌ）、ＰｙＢｏｐ（８．７ｇ、１６．７ｍｍｏｌ）、続いて、Ｂｏｐカップリング試薬（１．１７ｇ、２．６６ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で添加した。氷浴を除去し、溶液を室温まで温めた。１時間後に反応が完了したことを、ＴＬＣ（８９：１０：１のＤＣＭ：ＭｅＯＨ：ＡＡ）によって決定した。反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）中に溶解し、１Ｍ ＮａＨＳＯ_４（３×１００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（３×１００ｍＬ）、及びブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機相を分離し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、濃縮した。残渣を５０％ヘキサン／ＥｔＯＡＣ：１００％ＥｔＯＡｃの勾配でのシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、白色の泡状物として化合物１２７（９．４ｇ）を得た。ＬＣＭＳ及び^１Ｈ ＮＭＲは、その構造と一致した。質量（ｍ／ｚ）７７８．４［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0885】

トリフルオロ酢酸（１２ｍＬ）をジクロロメタン（１２ｍＬ）中の化合物１２７（１．５７ｇ、２．０２ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、室温で１時間撹拌した。反応混合物を減圧下でトルエン（３０ｍＬ）と共蒸発乾固させた。得られた残渣をアセトニトリル（３０ｍＬ）及びトルエン（４０ｍＬ）と２回共蒸発させて、トリフルオロ酢酸塩として化合物１２８（１．６７ｇ）を得て、さらに精製することなく次のステップで使用した。ＬＣＭＳ及び^１Ｈ ＮＭＲは、その構造と一致した。質量（ｍ／ｚ）４７８．２［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0886】

丸底フラスコ内で、化合物７（０．４３ｇ、０．９６３ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（０．３５ｇ、０．９１ｍｍｏｌ）、及びＨＯＡｔ（０．０３５ｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を一つに合わせ、減圧下、Ｐ_２Ｏ_５上で４時間乾燥させ、その後、無水ＤＭＦ（１ｍＬ）中に溶解し、５分間撹拌した。これに無水ＤＭＦ（０．２ｍＬ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．２ｍＬ）中の化合物１２８（０．２０ｇ、０．２６ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。反応混合物をアルゴン雰囲気下、室温で撹拌した。３０分間後に反応が完了したことを、ＬＣＭＳ及びＴＬＣ（７％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって決定した。反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣をＤＣＭ（３０ｍＬ）中に溶解し、１Ｍ ＮａＨＳＯ_４（３×２０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（３×２０ｍＬ）、及びブライン（３×２０ｍＬ）で洗浄した。有機相を分離し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をジクロロメタン中の５〜１５％ＭｅＯＨを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、化合物１２９（９６．６ｍｇ）を得た。ＬＣ ＭＳ及び^１Ｈ ＮＭＲは、この構造と一致する。質量（ｍ／ｚ）８８３．４［Ｍ＋２Ｈ］^＋。

【0887】

２０ｍＬのシンチレーションバイアル内で化合物１２９（０．０９ｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）をメタノール（５ｍＬ）中に溶解した。これに、少量の１０％Ｐｄ／Ｃ（０．０１５ｍｇ）を添加し、反応容器をＨ_２ガスでフラッシュした。反応混合物を室温で１８時間、Ｈ_２雰囲気下で撹拌した。セライトパッドを通して反応混合物を濾過し、このセライトパッドをメタノールで洗浄した。濾液洗浄物を一つにプールし、減圧下で濃縮して、化合物１３０（０．０８ｇ）を得た。ＬＣＭＳ及び^１Ｈ ＮＭＲは、その構造と一致した。この生成物をさらに精製することなく使用した。質量（ｍ／ｚ）８３８．３［Ｍ＋２Ｈ］^＋。

【0888】

１０ｍＬの先の尖った丸底フラスコに、化合物１３０（７５．８ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）、０．３７Ｍピリジン／ＤＭＦ（２００μＬ）、及び撹拌子を添加した。この溶液に、０．７Ｍトリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル／ＤＭＦ（１００μＬ）を撹拌しながら滴加した。１時間後に反応が完了したことを、ＬＣ ＭＳによって決定した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をＣＨＣｌ_３（約１０ｍＬ）中に溶解した。有機層をＮａＨＳＯ_４（１Ｍ、１０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（１０ｍＬ）、及びブライン（１０ｍＬ）にそれぞれ３回分配した。有機相を分離し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、濃縮して、化合物１３１（７７．７ｍｇ）を得た。ＬＣＭＳは、この構造と一致した。さらに精製することなく使用した。質量（ｍ／ｚ）９２１．３［Ｍ＋２Ｈ］^＋。

【0889】

【化192】

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【0890】

実施例４６に例証される一般的手順を用いて、ＧａｌＮＡｃ_３−５共役基を含むオリゴマー化合物１３２を調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ_３−５（ＧａｌＮＡｃ_３−５_ａ）のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。ある特定の実施形態において、切断可能部分は、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａ_ｄ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。

【0891】

ＧａｌＮＡｃ_３−５（ＧａｌＮＡｃ_３−５_ａ−ＣＭ−）の構造は、以下に示される：

【0892】

【化193】

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【0893】

実施例５０：ＧａｌＮＡｃ_４−１１を含むオリゴヌクレオチド１４４の調製

【0894】

【化194】

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【0895】

【化195】

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化合物１３４の合成。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄフラスコに、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、及びアセトニトリルで洗浄したアミノメチルＶＩＭＡＤ樹脂（２．５ｇ、４５０μｍｏｌ／ｇ）を添加した。この樹脂は、アセトニトリル（４ｍＬ）中で膨潤した。２０（１．０ｍｍｏｌ、０．７４７ｇ）、ＴＢＴＵ（１．０ｍｍｏｌ、０．３２１ｇ）、アセトニトリル（５ｍＬ）、及びＤＩＥＡ（３．０ｍｍｏｌ、０．５ｍＬ）を添加して、化合物１３３を１００ｍＬの丸底フラスコ内で事前に活性化した。この溶液を５分間撹拌させ、その後、振盪しながらＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄフラスコに添加した。懸濁液を３時間振盪させた。反応混合物を排出し、樹脂をアセトニトリル、ＤＭＦ、及びＤＣＭで洗浄した。ＤＣＭ中５００ｎｍ（消光係数＝７６０００）でＤＭＴカチオンの吸光度を測定することにより新たな樹脂負荷量を定量化し、２３８μｍｏｌ／ｇであると決定した。無水酢酸溶液中で１０分間３回懸濁することにより、この樹脂をキャップした。

【0896】

反復Ｆｍｏｃベース固相ペプチド合成法を用いて、固体支持体に結合された化合物１４１を合成した。少量の固体支持体を回収し、アンモニア水（２８〜３０重量％）中に６時間懸濁した。切断された化合物をＬＣ−ＭＳによって分析した。観察された質量は、その構造と一致した。質量（ｍ／ｚ）１０６３．８［Ｍ＋２Ｈ］^＋。

【0897】

固相ペプチド合成法を用いて、固体支持体に結合された化合物１４２を合成した。

【0898】

【化196】

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【0899】

ＤＮＡ合成装置において標準の固相合成を用いて、固体支持体に結合された化合物１４３を合成した。

【0900】

固体支持体に結合された化合物１４３をアンモニア水（２８−３０重量％）中に懸濁し、５５℃で１６時間加熱した。溶液を冷却し、固体支持体を濾過した。濾液を濃縮し、残渣を水中に溶解し、強アニオン交換カラム上でＨＰＬＣによって精製した。全長化合物１４４を含有する画分を一つにプールし、脱塩した。結果として生じたＧａｌＮＡｃ_４−１１共役オリゴマー化合物をＬＣ−ＭＳによって分析し、観察された質量は、その構造と一致した。

【0901】

共役基ＧａｌＮＡｃ_４−１１（ＧａｌＮＡｃ_４−１１_ａ）のＧａｌＮＡｃ_４クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。ある特定の実施形態において、切断可能部分は、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａ_ｄ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。

【0902】

ＧａｌＮＡｃ_４−１１（ＧａｌＮＡｃ_４−１１_ａ−ＣＭ）の構造は、以下に示される：

【0903】

【化197】

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【0904】

実施例５１：ＧａｌＮＡｃ_３−６を含むオリゴヌクレオチド１５５の調製

【0905】

【化198】

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文献（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９５，２２９，５４−６０）に記載されるように、化合物１４６を合成した。

【0906】

【化199】

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【0907】

化合物４（１５ｇ、４５．５５ｍｍｏｌ）及び化合物３５ｂ（１４．３グラム、５７ｍｍｏｌ）をＣＨ_２Ｃｌ_２（２００ｍＬ）中に溶解した。活性化モレキュラーシーブ（４Å、２ｇ、粉末）を添加し、反応物を窒素雰囲気下で３０分間撹拌させた。ＴＭＳ−ＯＴｆを添加し（４．１ｍＬ、２２．７７ｍｍｏｌ）、反応物を室温で一晩撹拌させた。完了した時点で、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（５００ｍＬ）及び粉砕した氷（約１５０ｇ）を注いで反応物を反応停止処理した。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮してオレンジ色の油状物を得た。粗物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、ＣＨ_２Ｃｌ_２中の２〜１０％ＭｅＯＨで溶出して、化合物１１２（１６．５３ｇ、６３％）を得た。ＬＣＭＳ及び^１Ｈ ＮＭＲは、予想した化合物と一致した。

【0908】

化合物１１２（４．２７ｇ、７．３５ｍｍｏｌ）を１：１のＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ（４０ｍＬ）中に溶解した。この溶液を通してアルゴン流を１５分間バブリングして反応混合物をパージした。パールマン触媒（炭素上の水酸化パラジウム、４００ｍｇ）を添加し、この溶液を通して水素ガスを３０分間バブリングした。完了した時点で（ＴＬＣ（ＣＨ_２Ｃｌ_２中の１０％ＭｅＯＨ）及びＬＣＭＳ）、セライトパッドを通して触媒を濾去した。濾液を回転蒸発によって濃縮し、高真空下で短時間乾燥させて、化合物１０５ａ（３．２８ｇ）を得た。ＬＣＭＳ及び１Ｈ ＮＭＲは、所望の生成物と一致した。

【0909】

化合物１４７（２．３１ｇ、１１ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１００ｍＬ）中に溶解した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、３．９ｍＬ、２２ｍｍｏｌ）、続いて、ＨＢＴＵ（４ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を窒素下で約１５分間撹拌させた。これに、乾燥ＤＭＦ中の化合物１０５ａ（３．３ｇ、７．４ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、窒素雰囲気下で２時間撹拌した。反応物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液及びブラインで洗浄した。有機相を分離し、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、濃縮してオレンジ色のシロップ状物を得た。粗物質をカラムクロマトグラフィー（ＣＨ_２Ｃｌ_２中の２〜５％ＭｅＯＨ）によって精製して、化合物１４８（３．４４ｇ、７３％）を得た。ＬＣＭＳ及び^１Ｈ ＮＭＲは、予想した生成物と一致した。

【0910】

化合物１４８（３．３ｇ、５．２ｍｍｏｌ）を１：１のＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ（７５ｍＬ）中に溶解した。この溶液を通してアルゴン流を１５分間バブリングして反応混合物をパージした。パールマン触媒（炭素上の水酸化パラジウム）を添加した（３５０ｍｇ）。この溶液を通して水素ガスを３０分間バブリングした。完了した時点で（ＴＬＣ（ＤＣＭ中の１０％ＭｅＯＨ）及びＬＣＭＳ）、セライトパッドを通して触媒を濾去した。濾液を回転蒸発によって濃縮し、高真空下で短時間乾燥させて、化合物１４９（２．６ｇ）を得た。ＬＣＭＳは、所望の生成物と一致した。残渣を乾燥ＤＭＦ（１０ｍＬ）中に溶解し、次のステップで即座に使用した。

【0911】

【化200】

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【0912】

化合物１４６（０．６８ｇ、１．７３ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（２０ｍＬ）中に溶解した。これに、ＤＩＥＡ（４５０μＬ、２．６ｍｍｏｌ、１．５当量）及びＨＢＴＵ（１．９６ｇ、０．５．２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１５分間、窒素下で撹拌させた。無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の化合物１４９（２．６ｇ）の溶液を添加した。ＤＩＥＡを添加することにより（必要に応じて）、反応物のｐＨをｐＨ＝９〜１０に調整した。反応物を室温で２時間、窒素下で撹拌させた。完了した時点で、反応物をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液で洗浄し、続いて、ブラインで洗浄した。有機相を分離し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、ＣＨ_２Ｃｌ_２中の２〜１０％ＭｅＯＨで溶出して、化合物１５０（０．６２ｇ、２０％）を得た。ＬＣＭＳ及び^１Ｈ ＮＭＲは、所望の生成物と一致した。

【0913】

化合物１５０（０．６２ｇ）を１：１のＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ（５Ｌ）中に溶解した。この溶液を通してアルゴン流を１５分間バブリングして反応混合物をパージした。パールマン触媒（炭素上の水酸化パラジウム）を添加した（６０ｍｇ）。この溶液を通して水素ガスを３０分間バブリングした。完了した時点で（ＴＬＣ（ＤＣＭ中の１０％ＭｅＯＨ）及びＬＣＭＳ）、触媒を濾去した（シリンジチップＴｅｆｌｏｎフィルター、０．４５μｍ）。濾液を回転蒸発によって濃縮し、高真空下で短時間乾燥させて、化合物１５１（０．５７ｇ）を得た。ＬＣＭＳは、所望の生成物と一致した。この生成物を４ｍＬの乾燥ＤＭＦ中に溶解し、次のステップで即座に使用した。

【0914】

【化201】

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【0915】

化合物８３ａ（０．１１ｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（５ｍＬ）中に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（７５μＬ、１ｍｍｏｌ）及びＰＦＰ−ＴＦＡ（９０μＬ、０．７６ｍｍｏｌ）を添加した。接触時に反応混合物は赤紫色になり、その後３０分間かけて徐々にオレンジ色になった。ＴＬＣ及びＬＣＭＳによって反応の進行を監視した。完了した時点で（ＰＦＰエステルの形成）、化合物１５１（０．５７ｇ、０．３３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液を添加した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを添加することにより（必要に応じて）、反応物のｐＨをｐＨ＝９〜１０に調整した。反応混合物を窒素下で約３０分間撹拌した。完了した時点で、溶媒の大部分を減圧下で除去した。残渣をＣＨ_２Ｃｌ_２で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液で洗浄し、続いて、ブラインで洗浄した。有機相を分離し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、濃縮してオレンジ色のシロップ状物を得た。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ_２Ｃｌ_２中の２〜１０％ＭｅＯＨ）によって精製して、化合物１５２（０．３５ｇ、５５％）を得た。ＬＣＭＳ及び^１Ｈ ＮＭＲは、所望の生成物と一致した。

【0916】

化合物１５２（０．３５ｇ、０．１８２ｍｍｏｌ）を１：１のＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）中に溶解した。この溶液を通してアルゴン流を１５分間バブリングして反応混合物をパージした。パールマン触媒（炭素上の水酸化パラジウム）を添加した（３５ｍｇ）。この溶液を通して水素ガスを３０分間バブリングした。完了した時点で（ＴＬＣ（ＤＣＭ中の１０％ＭｅＯＨ）及びＬＣＭＳ）、触媒を濾去した（シリンジチップＴｅｆｌｏｎフィルター、０．４５μｍ）。濾液を回転蒸発によって濃縮し、高真空下で短時間乾燥させて、化合物１５３（０．３３ｇ、定量的）を得た。ＬＣＭＳは、所望の生成物と一致した。

【0917】

化合物１５３（０．３３ｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を窒素下で撹拌しながら無水ＤＭＦ（５ｍＬ）中に溶解した。これに、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６５μＬ、０．３７ｍｍｏｌ）及びＰＦＰ−ＴＦＡ（３５μＬ、０．２８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を窒素下で約３０分間撹拌した。接触時に反応混合物は赤紫色になり、徐々にオレンジ色になった。さらにＮ，−ジイソプロピルエチルアミンを添加することにより、反応混合物のｐＨをｐＨ＝９〜１０で維持した。ＴＬＣ及びＬＣＭＳによって反応の進行を監視した。完了した時点で、溶媒の大部分を減圧下で除去した。残渣をＣＨ_２Ｃｌ_２（５０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液で洗浄し、その後、ブラインで洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、濃縮してオレンジ色のシロップ状物を得た。残渣をカラムクロマトグラフィーによって精製し、ＣＨ_２Ｃｌ_２中の２〜１０％ＭｅＯＨで溶出して、化合物１５４（０．２９ｇ、７９％）を得た。ＬＣＭＳ及び^１Ｈ ＮＭＲは、所望の生成物と一致した。

【0918】

【化202】

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【0919】

実施例４６に例証される一般的手順を用いて、ＧａｌＮＡｃ_３−６共役基を含むオリゴマー化合物１５５を調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ_３−６（ＧａｌＮＡｃ_３−６_ａ）のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。ある特定の実施形態において、切断可能部分は、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａ_ｄ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。

【0920】

ＧａｌＮＡｃ_３−６（ＧａｌＮＡｃ_３−６_ａ−ＣＭ−）の構造は、以下に示される：

【0921】

【化203】

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【0922】

実施例５２：ＧａｌＮＡｃ_３−９を含むオリゴヌクレオチド１６０の調製

【0923】

【化204】

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文献（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００４，４７，５７９８−５８０８）に記載される手順に従って化合物１５６を合成した。

【0924】

化合物１５６（１８．６０ｇ、２９．２８ｍｍｏｌ）をメタノール（２００ｍＬ）中に溶解した。パラジウム炭素（６．１５ｇ、１０重量％、負荷量（乾燥ベース）、マトリックス炭素粉末、湿式）を添加した。反応混合物を室温で１８時間、水素下で撹拌した。セライトパッドを通して反応混合物を濾過し、このセライトパッドをメタノールで完全に洗浄した。合わせた濾液を洗浄し、濃縮乾固させた。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、ジクロロメタン中の５〜１０％メタノールで溶出して、化合物１５７（１４．２６ｇ、８９％）を得た。質量（ｍ／ｚ）５４４．１［Ｍ−Ｈ］⁻。

【0925】

化合物１５７（５ｇ、９．１７ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（３０ｍＬ）中に溶解した。ＨＢＴＵ（３．６５ｇ、９．６１ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１３．７３ｍＬ、７８．８１ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で５分間撹拌した。これに、化合物４７（２．９６ｇ、７．０４ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。反応物を室温で８時間撹拌した。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液に注いだ。この混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層をブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、蒸発させた。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、ヘキサン中の５０％酢酸エチルで溶出して、化合物１５８（８．２５ｇ、７３．３％）を得た。この構造を、ＭＳ及び^１Ｈ ＮＭＲ分析によって確認した。

【0926】

化合物１５８（７．２ｇ、７．６１ｍｍｏｌ）を減圧下でＰ_２Ｏ_５上で乾燥させた。乾燥させた化合物を無水ＤＭＦ（５０ｍＬ）中に溶解した。これに、１Ｈ−テトラゾール（０．４３ｇ、６．０９ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３ｍＬ、３．８１ｍｍｏｌ）及び２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（３．６５ｍＬ、１１．５０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物をアルゴン雰囲気下で４時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（２００ｍＬ）で希釈した。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３及びブラインで洗浄した。有機相を分離し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、蒸発させた。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、ヘキサン中の５０〜９０％酢酸エチルで溶出して、化合物１５９（７．８２ｇ、８０．５％）を得た。この構造を、ＬＣＭＳ及び^３１Ｐ ＮＭＲ分析によって確認した。

【0927】

【化205】

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【0928】

標準のオリゴヌクレオチド合成手順を用いて、ＧａｌＮＡｃ_３−９共役基を含むオリゴマー化合物１６０を調製した。３単位の化合物１５９を固体支持体に、続いてヌクレオチドホスホラミダイトにカップリングした。保護されたオリゴマー化合物をアンモニア水で処理して、化合物１６０を得た。共役基ＧａｌＮＡｃ_３−９（ＧａｌＮＡｃ_３−９_ａ）のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。ある特定の実施形態において、切断可能部分は、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａ_ｄ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。ＧａｌＮＡｃ_３−９（ＧａｌＮＡｃ_３−９_ａ−ＣＭ）の構造は、以下に示される：

【0929】

【化206】

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【0930】

実施例５３：化合物１８（ＧａｌＮＡｃ_３−１ａ及びＧａｌＮＡｃ_３−３ａ）の調製のための代替手順

【0931】

【化207】

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ラクトン１６１をジアミノプロパン（３〜５当量）またはモノＢｏｃ保護ジアミノプロパン（１当量）と反応させて、アルコール１６２ａまたは１６２ｂを得た。非保護プロパンジアミンを上述の反応で用いた場合、過剰なジアミンを高真空下で蒸発させて除去し、ＣｂｚＣｌを用いて１６２ａ中の遊離アミノ基を保護して、カラムクロマトグラフィーによって精製した後に、白色の固体として１６２ｂを得た。アルコール１６２ｂをＴＭＳＯＴｆの存在下で化合物４とさらに反応させ１６３ａを得て、触媒水素化を用いてＣｂｚ基を除去することにより、これを１６３ｂに変換した。ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル１６４を、三酸１１３（実施例４８を参照のこと）をＤＭＦ（０．１〜０．５Ｍ）中のＰＦＰＴＦＡ（３．５当量）及びピリジン（３．５当量）と接触させることによって調製した。トリエステル１６４をアミン１６３ｂ（３〜４当量）及びＤＩＰＥＡ（３〜４当量）と直接反応させて、化合物１８を得た。上述の方法は、中間体精製を大幅に促進し、実施例４に記載される手順を用いて形成される副生成物の形成を最小限に抑える。

【0932】

実施例５４：化合物１８（ＧａｌＮＡｃ_３−１ａ及びＧａｌＮＡｃ_３−３ａ）の調製のための代替手順

【0933】

【化208】

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先の実施例５３に概説される手順を用いて酸１１３からトリＰＦＰエステル１６４を調製し、モノＢｏｃ保護ジアミンと反応させて、本質的に定量的な収率で１６５を得た。Ｂｏｃ基を塩酸またはトリフルオロ酢酸で除去して、トリアミンを得て、これをＤＩＰＥＡなどの好適な塩基の存在下でＰＦＰ活性化酸１６６と反応させて、化合物１８を得た。

【0934】

ＤＭＦ中のＰＦＰＴＦＡ（１〜１．２当量）及びピリジン（１〜１．２当量）で処理することにより、ＰＦＰ保護Ｇａｌ−ＮＡｃ酸１６６を対応する酸から調製した。次いで、アセトニトリル及び水中のＴＥＭＰＯ（０．２当量）及びＢＡＩＢを用いて酸化することにより、前駆酸を対応するアルコールから調製した。先の実施例４７に記載される条件を用いて１，６−ヘキサンジオール（または１，５−ペンタンジオールもしくは他のｎ値の他のジオール）（２〜４当量）及びＴＭＳＯＴｆと反応させることにより、前駆アルコールを糖中間体４から調製した。

【0935】

実施例５５：生体内におけるＳＲＢ−１を標的とする３’−共役基または５’−共役基のいずれかを含むオリゴヌクレオチド（ＧａｌＮＡｃ_３−１、３、８、及び９の比較）の用量依存的試験
以下に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてマウスにおけるＳＲＢ−１のアンチセンス阻害について試験した。非共役ＩＳＩＳ ３５３３８２を標準物として含めた。さまざまなＧａｌＮＡｃ_３共役基のそれぞれは、ホスホジエステル連結２’−デオキシアデノシンヌクレオシド（切断可能部分）によってそれぞれのオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端のいずれかで結合された。

【0936】

【表26】

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大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、^ｍＣは、５−メチルシトシンを示す。下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。共役基は、太字で表示されている。

【0937】

ＧａｌＮＡｃ_３−１_ａの構造は、先の実施例９に示される。ＧａｌＮＡｃ_３−９の構造は、先の実施例５２に示される。ＧａｌＮＡｃ_３−３の構造は、先の実施例３９に示される。ＧａｌＮＡｃ_３−８の構造は、先の実施例４７に示される。
処理

【0938】

６週齢の雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、ＩＳＩＳ ３５３３８２、６５５８６１、６６４０７８、６６１１６１、６６５００１、または生理食塩水を、以下に示される投与量で１回、皮下注入した。各処理群は、４匹の動物からなった。最終投与の７２時間後にマウスを屠殺して、リアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓におけるＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを標準プロトコルに従って決定した。以下の結果は、生理食塩水（対照）に対して正規化された各処理群のＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして提示される。

【0939】

表４０に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを低下させた。実際には、３’末端にホスホジエステル連結ＧａｌＮＡｃ_３−１及びＧａｌＮＡｃ_３−９共役体（ＩＳＩＳ ６５５８６１及びＩＳＩＳ ６６４０７８）ならびに５’末端に連結されたＧａｌＮＡｃ_３−３及びＧａｌＮＡｃ_３−８共役体（ＩＳＩＳ ６６１１６１及びＩＳＩＳ ６６５００１）を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、非共役アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ３５３３８２）と比較して、力価の大幅な改善を示した。さらに、３’末端にＧａｌＮＡｃ_３−９共役体を含むＩＳＩＳ ６６４０７８は、３’末端にＧａｌＮＡｃ_３−１共役体を含むＩＳＩＳ ６５５８６１と比較して、本質的に等効力であった。それぞれ、ＧａｌＮＡｃ_３−３またはＧａｌＮＡｃ_３−９を含む５’共役アンチセンスオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ ６６１１６１及びＩＳＩＳ ６６５００１は、３’共役アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ６５５８６１及びＩＳＩＳ ６６４０７８）と比較して、力価を増加させた。

【0940】

【表27】

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【0941】

血清における肝臓トランスアミナーゼレベル、すなわちアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を、標準のプロトコルを用いて、生理食塩水を注入したマウスとの比較で相対的に測定した。総ビリルビン及びＢＵＮも評価した。体重の変化を評価したが、生理食塩水群との有意な変化は見られなかった。ＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビン、及びＢＵＮ値が、以下の表に示される。

【0942】

【表28】

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【0943】

実施例５６：生体内におけるＳＲＢ−１を標的とする３’−共役基または５’−共役基のいずれかを含むオリゴヌクレオチドの用量依存的試験（ＧａｌＮＡｃ_３−１、２、３、５、６、７、及び１０の比較）
以下に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてマウスにおけるＳＲＢ−１のアンチセンス阻害について試験した。非共役ＩＳＩＳ ３５３３８２を標準物として含めた。３’末端にＧａｌＮＡｃ_３共役基を結合させたＩＳＩＳ ６５５８６１を除いて、さまざまなＧａｌＮＡｃ_３共役基のそれぞれは、ホスホジエステル連結２’−デオキシアデノシンヌクレオシド（切断可能部分）によってそれぞれのオリゴヌクレオチドの５’末端に取り付けられた。

【0944】

【表29】

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大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、^ｍＣは、５−メチルシトシンを示す。下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。共役基は、太字で表示されている。

【0945】

ＧａｌＮＡｃ_３−１_ａの構造は、先の実施例９に示される。ＧａｌＮＡｃ_３−２_ａの構造は、先の実施例３７に示される。ＧａｌＮＡｃ_３−３_ａの構造は、先の実施例３９に示される。ＧａｌＮＡｃ_３−５_ａの構造は、先の実施例４９に示される。ＧａｌＮＡｃ_３−６_ａの構造は、先の実施例５１に示される。ＧａｌＮＡｃ_３−７_ａの構造は、先の実施例４８に示される。ＧａｌＮＡｃ_３−１０_ａの構造は、先の実施例４６に示される。
処理

【0946】

６週齢の雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、ＩＳＩＳ ３５３３８２、６５５８６１、６６４５０７、６６１１６１、６６６２２４、６６６９６１、６６６９８１、６６６８８１、または生理食塩水を、以下に示される投与量で１回皮下注入した。各処理群は、４匹の動物からなった。最終投与の７２時間後にマウスを屠殺して、リアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓におけるＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを決定した。以下の結果は、生理食塩水（対照）に対して正規化された各処理群のＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして提示される。

【0947】

表４３に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを低下させた。実際には、共役アンチセンスオリゴヌクレオチドは、非共役アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ３５３３８２）と比較して、力価の大幅な改善を示した。５’共役アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３’共役アンチセンスオリゴヌクレオチドと比較して、力価のわずかな増加を示した。

【0948】

【表30】

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【0949】

血清における肝臓トランスアミナーゼレベル、すなわちアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を、標準のプロトコルを用いて、生理食塩水を注入したマウスとの比較で相対的に測定した。総ビリルビン及びＢＵＮも評価した。体重の変化を評価したが、生理食塩水群との有意な変化は見られなかった。ＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビン、及びＢＵＮ値が、以下の表４４に示される。

【0950】

【表31】

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【0951】

実施例５７：生体内におけるＡｐｏＣ ＩＩＩを標的とする３’−共役基を含むオリゴヌクレオチドの作用持続時間試験
マウスに以下に示される用量を１回注入し、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ及び血漿トリグリセリド（血漿ＴＧ）レベルを４２日間にわたって監視した。各群におけるヒトＡＰＯＣ−ＩＩＩを発現する３匹のトランスジェニックマウスを用いて、この試験を実行した。

【0952】

【表32】

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大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、^ｍＣは、５−メチルシトシンを示す。下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。共役基は、太字で表示されている。

【0953】

ＧａｌＮＡｃ_３−１_ａの構造は、先の実施例９に示される。

【0954】

【表33】

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【0955】

上の表に見られるように、作用持続時間は、非共役オリゴヌクレオチドと比較して、３’−共役基の付加によって増加した。共役完全ＰＳオリゴヌクレオチド６４７５３５と比較して、共役混成ＰＯ／ＰＳオリゴヌクレオチド６４７５３６の作用持続時間がさらに増加した。

【0956】

実施例５８：生体内におけるＳＲＢ−１を標的とする３’−共役基を含むオリゴヌクレオチドの用量依存的試験（ＧａｌＮＡｃ_３−１及びＧａｌＮＡｃ_４−１１の比較）
以下に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてマウスにおけるＳＲＢ−１のアンチセンス阻害について試験した。非共役ＩＳＩＳ ４４０７６２を非共役標準物として含めた。共役基のそれぞれは、ホスホジエステル連結２’−デオキシアデノシンヌクレオシド（切断可能部分）によってそれぞれのオリゴヌクレオチドの３’末端に取り付けられた。

【0957】

ＧａｌＮＡｃ_３−１_ａの構造は、先の実施例９に示される。ＧａｌＮＡｃ_３−１１_ａの構造は、先の実施例５０に示される。

【0958】

処理
６週齢の雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、ＩＳＩＳ ４４０７６２、６５１９００、６６３７４８、または生理食塩水を、以下に示される投与量で１回、皮下注入した。各処理群は、４匹の動物からなった。最終投与の７２時間後にマウスを屠殺して、リアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓におけるＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを決定した。以下の結果は、生理食塩水（対照）に対して正規化された各処理群のＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして提示される。

【0959】

表４７に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを低下させた。３’末端にホスホジエステル連結ＧａｌＮＡｃ_３−１及びＧａｌＮＡｃ_４−１１共役体を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ６５１９００及びＩＳＩＳ ６６３７４８）は、非共役アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ４４０７６２）と比較して、力価の大幅な増加を示した。２つの共役オリゴヌクレオチド、すなわちＧａｌＮＡｃ_３−１とＧａｌＮＡｃ_４−１１は、等効力であった。

【0960】

【表34】

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大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、^ｍＣは、５−メチルシトシンを示す。下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｋ」は、６’−（Ｓ）−ＣＨ_３二環式ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。共役基は、太字で表示されている。

【0961】

血清における肝臓トランスアミナーゼレベル、すなわちアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を、標準のプロトコルを用いて、生理食塩水を注入したマウスとの比較で相対的に測定した。総ビリルビン及びＢＵＮも評価した。体重の変化を評価したが、生理食塩水群との有意な変化は見られなかった。ＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビン、及びＢＵＮ値が、以下の表４８に示される。

【0962】

【表35】

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【0963】

実施例５９：生体内におけるＦＸＩを標的とするＧａｌＮＡｃ_３−１共役ＡＳＯの影響
以下に列記されるオリゴヌクレオチドを、複数回投与試験においてマウスにおけるＦＸＩのアンチセンス阻害について試験した。ＩＳＩＳ ４０４０７１を非共役標準物として含めた。共役基のそれぞれは、ホスホジエステル連結２’−デオキシアデノシンヌクレオシドの切断可能部分によってそれぞれのオリゴヌクレオチドの３’末端に取り付けられた。

【0964】

【表36】

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大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、^ｍＣは、５−メチルシトシンを示す。下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。共役基は、太字で表示されている。

【0965】

ＧａｌＮＡｃ_３−１_ａの構造は、先の実施例９に示される。

【0966】

処理
６週齢の雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、ＩＳＩＳ ４０４０７１、６５６１７２、６５６１７３、またはＰＢＳ処理対照を、以下に示される投与量で週２回３週間、皮下注入した。各処理群は、４匹の動物からなった。最終投与の７２時間後にマウスを屠殺して、リアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓におけるＦＸＩ ｍＲＮＡレベルを決定した。ＥＬＩＳＡを用いて血漿ＦＸＩタンパク質レベルも測定した。ＰＢＳ処理対照に対して正規化する前に（ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）を用いて）ＦＸＩ ｍＲＮＡレベルを全ＲＮＡとの比較で相対的に決定した。以下の結果は、各処理群のＦＸＩ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして提示される。データをＰＢＳ処理対照に対して正規化し、「％ＰＢＳ」で表示する。当該方法と同様の方法を用いてＥＤ_５０を測定し、以下に提示する。

【0967】

【表37】

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【0968】

表５０に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でＦＸＩ ｍＲＮＡレベルを低下させた。３’−ＧａｌＮＡｃ_３−１共役基を含むオリゴヌクレオチドは、非共役アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ４０４０７１）と比較して、力価の大幅な増加を示した。これら２つの共役オリゴヌクレオチドの間では、ＰＳ連結部のうちのいくつかをＰＯ（ＩＳＩＳ ６５６１７３）と置き換えることによって、力価がさらに増加した。

【0969】

表５０ａに例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でＦＸＩタンパク質レベルを低下させた。３’−ＧａｌＮＡｃ_３−１共役基を含むオリゴヌクレオチドは、非共役アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ４０４０７１）と比較して、力価の大幅な増加を示した。これら２つの共役オリゴヌクレオチドの間では、ＰＳ連結部のうちのいくつかをＰＯ（ＩＳＩＳ ６５６１７３）と置き換えることによって、力価がさらに増加した。

【0970】

【表38】

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【0971】

血清における肝臓トランスアミナーゼレベル、すなわちアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を、標準のプロトコルを用いて、生理食塩水を注入したマウスとの比較で相対的に測定した。総ビリルビン、総アルブミン、ＣＲＥ、及びＢＵＮも評価した。体重の変化を評価したが、生理食塩水群との有意な変化は見られなかった。ＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビン、及びＢＵＮ値が、以下の表に示される。

【0972】

【表39】

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【0973】

実施例６０：生体外におけるＳＲＢ−１を標的とする共役ＡＳＯの影響
以下に列記されるオリゴヌクレオチドを、複数回投与試験において初代マウス肝細胞におけるＳＲＢ−１のアンチセンス阻害について試験した。ＩＳＩＳ ３５３３８２を非共役標準物として含めた。共役基のそれぞれは、ホスホジエステル連結２’−デオキシアデノシンヌクレオシドの切断可能部分によってそれぞれのオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端に取り付けられた。

【0974】

【表40】

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大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、^ｍＣは、５−メチルシトシンを示す。下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。共役基は、太字で表示されている。

【0975】

ＧａｌＮＡｃ_３−１_ａの構造は、先の実施例９に示される。ＧａｌＮＡｃ_３−３ａの構造は、先の実施例３９に示される。ＧａｌＮＡｃ_３−８ａの構造は、先の実施例４７に示される。ＧａｌＮＡｃ_３−９ａの構造は、先の実施例５２に示される。ＧａｌＮＡｃ_３−６ａの構造は、先の実施例５１に示される。ＧａｌＮＡｃ_３−２ａの構造は、先の実施例３７に示される。ＧａｌＮＡｃ_３−１０ａの構造は、先の実施例４６に示される。ＧａｌＮＡｃ_３−５ａの構造は、先の実施例４９に示される。ＧａｌＮＡｃ_３−７ａの構造は、先の実施例４８に示される。

【0976】

処理
上に列記されるオリゴヌクレオチドを、２５，０００細胞／ウェルの密度でプレーティングし、かつ０．０３、０．０８、０．２４、０．７４、２．２２、６．６７、または２０ｎＭの修飾オリゴヌクレオチドで処理した初代マウス肝細胞において生体外で試験した。約１６時間の処理期間後、ＲＮＡを細胞から単離し、ｍＲＮＡレベルを定量的リアルタイムＰＣＲによって測定し、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定された総ＲＮＡ含有量に従ってＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを調整した。

【0977】

標準的方法を用いてＩＣ_５０を計算し、結果を表５３に提示する。結果は、オリゴヌクレオチドの細胞への進入を人工的に促進するために試薬も電気穿孔技法も用いない自由取り込み条件下で、ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドは、ＧａｌＮＡｃ共役体を含まない親オリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ３５３３８２）よりも肝細胞において著しく強力であったことを示す。

【0978】

【表41】

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【0979】

実施例６１：ＧａｌＮＡｃ_３−１２を含むオリゴマー化合物１７５の調製

【0980】

【化209】

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【0981】

【化210】

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【0982】

【化211】

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【0983】

【化212】

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化合物１６９は、市販のものである。ベンジル（ペルフルオロフェニル）グルタレートを化合物１７１に添加することによって化合物１７２を調製した。ＰＦＰ−ＴＦＡ及びＤＩＥＡをＤＭＦ中の５−（ベンジルオキシ）−５−オキソペンタン酸に添加することによって、ベンジル（ペルフルオロフェニル）グルタレートを調製した。実施例４６に例証される一般的手順を用いて、ＧａｌＮＡｃ_３−１２共役基を含むオリゴマー化合物１７５を化合物１７４から調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ_３−１２（ＧａｌＮＡｃ_３−１２_ａ）のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。ある特定の実施形態において、切断可能部分は、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａ_ｄ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。ＧａｌＮＡｃ_３−１２（ＧａｌＮＡｃ_３−１２_ａ−ＣＭ−）の構造は、以下に示される：

【0984】

【化213】

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【0985】

実施例６２：ＧａｌＮＡｃ_３−１３を含むオリゴマー化合物１８０の調製

【0986】

【化214】

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【0987】

【化215】

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実施例２に示される一般的手順を用いて、化合物１７６を調製した。実施例４９に例証される一般的手順を用いて、ＧａｌＮＡｃ_３−１３共役基を含むオリゴマー化合物１８０を化合物１７７から調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ_３−１３（ＧａｌＮＡｃ_３−１３_ａ）のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。ある特定の実施形態において、切断可能部分は、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａ_ｄ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。ＧａｌＮＡｃ_３−１３（ＧａｌＮＡｃ_３−１３_ａ−ＣＭ−）の構造は、以下に示される：

【0988】

【化216】

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【0989】

実施例６３：ＧａｌＮＡｃ_３−１４を含むオリゴマー化合物１８８の調製

【0990】

【化217】

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化合物１８１及び１８５は、市販のものである。実施例４６に例証される一般的手順を用いて、ＧａｌＮＡｃ_３−１４共役基を含むオリゴマー化合物１８８を化合物１８７から調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ_３−１４（ＧａｌＮＡｃ_３−１４_ａ）のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。ある特定の実施形態において、切断可能部分は、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａ_ｄ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。ＧａｌＮＡｃ_３−１４（ＧａｌＮＡｃ_３−１４_ａ−ＣＭ−）の構造は、以下に示される：

【0991】

【化218】

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【0992】

実施例６４：ＧａｌＮＡｃ_３−１５を含むオリゴマー化合物１９７の調製

【0993】

【化219】

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【0994】

【化220】

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化合物１８９は、市販のものである。実施例３１に示される一般的手順を用いて、化合物１９５を調製した。標準のオリゴヌクレオチド合成手順を用いて、ＧａｌＮＡｃ_３−１５共役基を含むオリゴマー化合物１９７を化合物１９４及び１９５から調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ_３−１５（ＧａｌＮＡｃ_３−１５_ａ）のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。ある特定の実施形態において、切断可能部分は、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａ_ｄ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。ＧａｌＮＡｃ_３−１５（ＧａｌＮＡｃ_３−１５_ａ−ＣＭ−）の構造は、以下に示される：

【0995】

【化221】

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【0996】

実施例６５：生体内におけるＳＲＢ−１を標的とする５’−共役基を含むオリゴヌクレオチドの用量依存的試験（ＧａｌＮＡｃ_３−３、１２、１３、１４、及び１５の比較）
以下に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてマウスにおけるＳＲＢ−１のアンチセンス阻害について試験した。非共役ＩＳＩＳ ３５３３８２を標準物として含めた。ＧａｌＮＡｃ_３共役基のそれぞれは、ホスホジエステル連結２’−デオキシアデノシンヌクレオシド（切断可能部分）によってそれぞれのオリゴヌクレオチドの５’末端に取り付けられた。

【0997】

【表42】

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大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、^ｍＣは、５−メチルシトシンを示す。下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。共役基は、太字で表示されている。

【0998】

ＧａｌＮＡｃ_３−３_ａの構造は、先の実施例３９に示される。ＧａｌＮＡｃ_３−１２ａの構造は、先の実施例６１に示される。ＧａｌＮＡｃ_３−１３ａの構造は、先の実施例６２に示される。ＧａｌＮＡｃ_３−１４ａの構造は、先の実施例６３に示される。ＧａｌＮＡｃ_３−１５ａの構造は、先の実施例６４に示される。
処理

【0999】

６〜８週齢のＣ５７ｂｌ６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、ＩＳＩＳ ３５３３８２、６６１１６１、６７１１４４、６７００６１、６７１２６１、６７１２６２、または生理食塩水を、以下に示される投与量で１回または２回、皮下注入した。２回投与されたマウスは、第１の投与の３日後に第２の投与を受けた。各処理群は、４匹の動物からなった。最終投与の７２時間後にマウスを屠殺して、リアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓におけるＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを標準プロトコルに従って決定した。以下の結果は、生理食塩水（対照）に対して正規化された各処理群のＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして提示される。

【1000】

表５５に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを低下させた。単回用量を受けた動物と２回の用量を受けた動物との間で標的ノックダウンの著しい差は観察されなかった（ＩＳＩＳ ３５３３８２の投与量３０及び２×１５ｍｇ／ｋｇ、ならびにＩＳＩＳ ６６１１６１の投与量５及び２×２．５ｍｇ／ｋｇを参照のこと）。ホスホジエステル連結ＧａｌＮＡｃ_３−３、１２、１３、１４、及び１５共役体を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、非共役アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ３３５３８２）と比較して、力価の大幅な増加を示した。

【1001】

【表43】

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【1002】

血清における肝臓トランスアミナーゼレベル、すなわちアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を、標準のプロトコルを用いて、生理食塩水を注入したマウスとの比較で相対的に測定した。総ビリルビン及びＢＵＮも評価した。体重の変化を評価したが、生理食塩水群との有意な差は見られなかった（データ示されず）。ＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビン、及びＢＵＮ値が、以下の表５６に示される。

【1003】

【表44】

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【1004】

実施例６６：５’−ＧａｌＮＡｃ_３クラスターを含むＳＲＢ−１を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害へのさまざまな切断可能部分の影響
以下に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてマウスにおけるＳＲＢ−１のアンチセンス阻害について試験した。ＧａｌＮＡｃ_３共役基のそれぞれは、ホスホジエステル連結ヌクレオシド（切断可能部分（ＣＭ））によってそれぞれのオリゴヌクレオチドの５’末端に取り付けられた。

【1005】

【表45】

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大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、^ｍＣは、５−メチルシトシンを示す。下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。共役基は、太字で表示されている。

【1006】

ＧａｌＮＡｃ_３−３_ａの構造は、先の実施例３９に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−１３ａの構造は、先の実施例６２に示した。

【1007】

処理
６〜８週齢のＣ５７ｂｌ６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、ＩＳＩＳ ６６１１６１、６７０６９９、６７０７００、６７０７０１、６７１１６５、または生理食塩水を、以下に示される投与量で１回、皮下注入した。各処理群は、４匹の動物からなった。最終投与の７２時間後にマウスを屠殺して、リアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓におけるＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを決定した。以下の結果は、生理食塩水（対照）に対して正規化された各処理群のＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして提示される。

【1008】

表５８に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを低下させた。さまざまな切断可能部分を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドはすべて、同様の力価を示した。

【1009】

【表46】

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【1010】

血清における肝臓トランスアミナーゼレベル、すなわちアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を、標準のプロトコルを用いて、生理食塩水を注入したマウスとの比較で相対的に測定した。総ビリルビン及びＢＵＮも評価した。体重の変化を評価したが、生理食塩水群との有意な差は見られなかった（データ示されず）。ＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビン、及びＢＵＮ値が、以下の表５６に示される。

【1011】

【表47】

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【1012】

実施例６７：ＧａｌＮＡｃ_３−１６を含むオリゴマー化合物１９９の調製

【1013】

【化222】

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実施例７及び９に例証される一般的手順を用いて、ＧａｌＮＡｃ_３−１６共役基を含むオリゴマー化合物１９９を調製する。共役基ＧａｌＮＡｃ_３−１６（ＧａｌＮＡｃ_３−１６_ａ）のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。ある特定の実施形態において、切断可能部分は、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａ_ｄ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。ＧａｌＮＡｃ_３−１６（ＧａｌＮＡｃ_３−１６_ａ−ＣＭ−）の構造は、以下に示される：

【1014】

【化223】

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【1015】

実施例６８：ＧａｌＮＡｃ_３−１７を含むオリゴマー化合物２００の調製

【1016】

【化224】

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実施例４６に例証される一般的手順を用いて、ＧａｌＮＡｃ_３−１７共役基を含むオリゴマー化合物２００を調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ_３−１７（ＧａｌＮＡｃ_３−１７_ａ）のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。ある特定の実施形態において、切断可能部分は、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａ_ｄ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。ＧａｌＮＡｃ_３−１７（ＧａｌＮＡｃ_３−１７_ａ−ＣＭ−）の構造は、以下に示される：

【1017】

【化225】

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【1018】

実施例６９：ＧａｌＮＡｃ_３−１８を含むオリゴマー化合物２０１の調製

【1019】

【化226】

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実施例４６に例証される一般的手順を用いて、ＧａｌＮＡｃ_３−１８共役基を含むオリゴマー化合物２０１を調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ_３−１８（ＧａｌＮＡｃ_３−１８_ａ）のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。ある特定の実施形態において、切断可能部分は、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａ_ｄ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。ＧａｌＮＡｃ_３−１８（ＧａｌＮＡｃ_３−１８_ａ−ＣＭ−）の構造は、以下に示される：

【1020】

【化227】

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【1021】

実施例７０：ＧａｌＮＡｃ_３−１９を含むオリゴマー化合物２０４の調製

【1022】

【化228】

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実施例５２に例証される一般的手順を用いて、ＧａｌＮＡｃ_３−１９共役基を含むオリゴマー化合物２０４を化合物６４から調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ_３−１９（ＧａｌＮＡｃ_３−１９_ａ）のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。ある特定の実施形態において、切断可能部分は、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａ_ｄ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。ＧａｌＮＡｃ_３−１９（ＧａｌＮＡｃ_３−１９_ａ−ＣＭ−）の構造は、以下に示される：

【1023】

【化229】

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【1024】

実施例７１：ＧａｌＮＡｃ_３−２０を含むオリゴマー化合物２１０の調製

【1025】

【化230】

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ＰＦＰ−ＴＦＡ及びＤＩＥＡを、トリフリン酸無水物を６−アミノヘキサン酸に添加することによって調製したアセトニトリル中の６−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）ヘキサン酸に添加することによって、化合物２０５を調製した。反応混合物を８０℃に加熱し、その後、室温まで下げた。実施例５２に例証される一般的手順を用いて、ＧａｌＮＡｃ_３−２０共役基を含むオリゴマー化合物２１０を化合物２０８から調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ_３−２０（ＧａｌＮＡｃ_３−２０_ａ）のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。ある特定の実施形態において、切断可能部分は、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａ_ｄ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。ＧａｌＮＡｃ_３−２０（ＧａｌＮＡｃ_３−２０_ａ−ＣＭ−）の構造は、以下に示される：

【1026】

【化231】

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【1027】

実施例７２：ＧａｌＮＡｃ_３−２１を含むオリゴマー化合物２１５の調製

【1028】

【化232】

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化合物２１１は、市販のものである。実施例５２に例証される一般的手順を用いて、ＧａｌＮＡｃ_３−２１共役基を含むオリゴマー化合物２１５を化合物２１３から調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ_３−２１（ＧａｌＮＡｃ_３−２１_ａ）のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。ある特定の実施形態において、切断可能部分は、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａ_ｄ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。ＧａｌＮＡｃ_３−２１（ＧａｌＮＡｃ_３−２１_ａ−ＣＭ−）の構造は、以下に示される：

【1029】

【化233】

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【1030】

実施例７３：ＧａｌＮＡｃ_３−２２を含むオリゴマー化合物２２１の調製

【1031】

【化234】

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ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリドを用いて、化合物２２０を化合物２１９から調製した。実施例５２に例証される一般的手順を用いて、ＧａｌＮＡｃ_３−２１共役基を含むオリゴマー化合物２２１を化合物２２０から調製する。共役基ＧａｌＮＡｃ_３−２２（ＧａｌＮＡｃ_３−２２_ａ）のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。ある特定の実施形態において、切断可能部分は、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａ_ｄ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。ＧａｌＮＡｃ_３−２２（ＧａｌＮＡｃ_３−２２_ａ−ＣＭ−）の構造は、以下に示される：

【1032】

【化235】

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【1033】

実施例７４：５’−ＧａｌＮＡｃ_３共役体を含むＳＲＢ−１を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害へのさまざまな切断可能部分の影響
以下に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてマウスにおけるＳＲＢ−１のアンチセンス阻害について試験した。ＧａｌＮＡｃ_３共役基のそれぞれは、それぞれのオリゴヌクレオチドの５’末端に取り付けられた。

【1034】

【表48】

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すべての表において、大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、^ｍＣは、５−メチルシトシンを示す。下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。共役基は、太字で表示されている。

【1035】

ＧａｌＮＡｃ_３−３_ａの構造は、先の実施例３９に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−１７ａの構造は、先の実施例６８に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−１８ａの構造は、実施例６９に示した。

【1036】

処理
６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、表６０に列記されるオリゴヌクレオチドまたは生理食塩水を、以下に示される投与量で１回、皮下注入した。各処理群は、４匹の動物からなった。最終投与の７２時間後にマウスを屠殺して、リアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓におけるＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを決定した。以下の結果は、生理食塩水（対照）に対して正規化された各処理群のＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして提示される。

【1037】

表６１に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを低下させた。ＧａｌＮＡｃ共役体を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、同様の力価を示し、ＧａｌＮＡｃ共役体を欠く親オリゴヌクレオチドよりも著しく強力であった。

【1038】

【表49】

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【1039】

血清における肝臓トランスアミナーゼレベル、すなわちアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を、標準のプロトコルを用いて、生理食塩水を注入したマウスとの比較で相対的に測定した。総ビリルビン及びＢＵＮも評価した。体重の変化を評価したが、生理食塩水群との有意な変化は見られなかった（データ示されず）。ＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビン、及びＢＵＮ値が、以下の表６２に示される。

【1040】

【表50】

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【1041】

実施例７５：５’−共役基を含むオリゴヌクレオチドの薬物動態分析
実施例６５、６６、及び７４に記載される処理手順に従って得た肝臓試料を用いて、上の表５４、５７、及び６０におけるＡＳＯのＰＫを評価した。肝臓試料を切り刻み、標準のプロトコルを用いて抽出し、内部標準とともにＩＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳによって分析した。適切なＵＶピークを統合することによってすべての代謝物の合わせた組織レベル（μｇ／ｇ）を測定し、適切な抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）を用いて、共役体を欠く全長ＡＳＯ（この場合、ＩＳＩＳ番号３５３３８２の「親」）の組織レベルを測定した。

【1042】

【表51】

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【1043】

上の表６３における結果は、特にＧａｌＮＡｃ_３共役基を有するオリゴヌクレオチドとＧａｌＮＡｃ_３共役基を有しないオリゴヌクレオチドとの間の投薬の違いを考慮に入れた場合、オリゴヌクレオチド投与の７２時間後に、ＧａｌＮＡｃ_３共役基を含むオリゴヌクレオチドの肝臓組織レベルが、ＧａｌＮＡｃ_３共役基を含まない親オリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ３５３３８２）の肝臓組織レベルよりも高かったことを示す。さらに、７２時間までに、ＧａｌＮＡｃ_３共役基を含む各オリゴヌクレオチドの４０〜９８％が親化合物に代謝され、ＧａｌＮＡｃ_３共役基がオリゴヌクレオチドから切断されたことを示す。

【1044】

実施例７６：ＧａｌＮＡｃ_３−２３を含むオリゴマー化合物２３０の調製

【1045】

【化236】

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【1046】

【化237】

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化合物２２２は、市販のものである。４４．４８ｍＬ（０．３３ｍｏｌ）の化合物２２２をピリジン（５００ｍＬ）中の塩化トシル（２５．３９ｇ、０．１３ｍｏｌ）で１６時間処理した。その後、反応物を蒸発させて油状物とし、ＥｔＯＡｃ中に溶解し、水、飽和ＮａＨＣＯ_３、ブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させた。酢酸エチルを濃縮乾固させ、カラムクロマトグラフィーによって精製し、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）、続いて、ＣＨ_２Ｃｌ_２中の１０％メタノールで溶出して、無色の油状物として化合物２２３を得た。ＬＣＭＳ及びＮＭＲは、その構造と一致した。１０ｇ（３２．８６ｍｍｏｌ）の１−トシルトリエチレングリコール（化合物２２３）を、ＤＭＳＯ（１００ｍＬ）中のアジ化ナトリウム（１０．６８ｇ、１６４．２８ｍｍｏｌ）で、室温で１７時間処理した。その後、反応混合物を水上に注ぎ、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を水で３回洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させた。有機層を濃縮乾固させて、５．３ｇの化合物２２４（９２％）を得た。ＬＣＭＳ及びＮＭＲは、その構造と一致した。１−アジドトリエチレングリコール（化合物２２４、５．５３ｇ、２３．６９ｍｍｏｌ）及び化合物４（６ｇ、１８．２２ｍｍｏｌ）を、４Ａモレキュラーシーブ（５ｇ）及びジクロロメタン（１００ｍＬ）中のＴＭＳＯＴｆ（１．６５ｍＬ、９．１１ｍｍｏｌ）で、不活性雰囲気下で処理した。１４時間後、反応物を濾過して当該モレキュラーシーブを除去し、有機層を飽和ＮａＨＣＯ_３、水、ブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させた。有機層を濃縮乾固させ、カラムクロマトグラフィーによって精製し、ジクロロメタン中の２〜４％メタノールの勾配で溶出して、化合物２２５を得た。ＬＣＭＳ及びＮＭＲは、その構造と一致した。化合物２２５（１１．９ｇ、２３．５９ｍｍｏｌ）をパールマン触媒上で、ＥｔＯＡｃ／メタノール（４：１、２５０ｍＬ）中で水素化した。８時間後、触媒を濾去し、溶媒を除去乾固して、化合物２２６を得た。ＬＣＭＳ及びＮＭＲは、その構造と一致した。

【1047】

化合物２２７を生成するために、ＤＭＦ（１００ｍＬ）中のニトロメタントリスプロピオン酸（４．１７ｇ、１５．０４ｍｍｏｌ）及びヒューニッヒ塩基（１０．３ｍＬ、６０．１７ｍｍｏｌ）の溶液をペンタフルオロトリフルオロアセテート（９．０５ｍＬ、５２．６５ｍｍｏｌ）で液滴処理した。３０分間後、反応物を氷水上に注ぎ、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を水、ブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させた。有機層を濃縮乾固させ、その後、ヘプタンから再結晶化して、白色の固体として化合物２２７を得た。ＬＣＭＳ及びＮＭＲは、その構造と一致した。化合物２２７（１．５ｇ、１．９３ｍｍｏｌ）及び化合物２２６（３．７ｇ、７．７４ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１５ｍＬ）中で、室温で２時間撹拌した。その後、反応物を蒸発乾固し、カラムクロマトグラフィーによって精製し、ジクロロメタン中の２〜１０％メタノールの勾配で溶出して、化合物２２８を得た。ＬＣＭＳ及びＮＭＲは、その構造と一致した。化合物２２８（１．７ｇ、１．０２ｍｍｏｌ）をエタノール（１００ｍＬ）中のラネーニッケル（約２ｇ、湿性）で、水素雰囲気下で処理した。１２時間後、触媒を濾去し、有機層を蒸発させて固体にし、これを次のステップで直接使用した。ＬＣＭＳ及びＮＭＲは、その構造と一致した。この固体（０．８７ｇ、０．５３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍＬ）中のベンジルグルタル酸（０．１８ｇ、０．８ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（０．３ｇ、０．８ｍｍｏｌ）、及びＤＩＥＡ（２７３．７μＬ、１．６ｍｍｏｌ）で処理した。１６時間後、ＤＭＦを減圧下で６５℃で除去して油状物とし、この油状物をジクロロメタン中に溶解した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ_３、ブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させた。有機層を蒸発させた後、化合物をカラムクロマトグラフィーによって精製し、ジクロロメタン中の２〜２０％メタノールの勾配で溶出して、カップリング生成物を得た。ＬＣＭＳ及びＮＭＲは、その構造と一致した。ベンジルエステルをパールマン触媒で、水素雰囲気下で１時間脱保護した。その後、この触媒を濾去し、溶媒を除去乾固して、酸を得た。ＬＣＭＳ及びＮＭＲは、その構造と一致した。酸（４８６ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（３ｍＬ）中に溶解した。ピリジン（５３．６１μＬ、０．６６ｍｍｏｌ）を添加し、反応物をアルゴンでパージした。ペンタフルオロトリフルオロアセテート（４６．３９μＬ、０．４ｍｍｏｌ）を反応混合物に緩徐に添加した。反応物の色が淡黄色からワイン色に変化し、少しの煙を発し、この煙をアルゴン流で吹き飛ばした。反応物を室温で１時間撹拌させた（反応の完了をＬＣＭＳによって確認した）。この溶媒を減圧下（回転蒸発）で７０℃で除去した。残渣をＤＣＭで希釈し、１Ｎ ＮａＨＳＯ_４、ブライン、飽和重炭酸ナトリウム、及び再度ブラインで洗浄した。有機物をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、濃縮乾固させて、黄色の脆い泡状物として２２５ｍｇの化合物２２９を得た。ＬＣＭＳ及びＮＭＲは、その構造と一致した。

【1048】

実施例４６に例証される一般的手順を用いて、ＧａｌＮＡｃ_３−２３共役基を含むオリゴマー化合物２３０を化合物２２９から調製した。ＧａｌＮＡｃ_３−２３共役基（ＧａｌＮＡｃ_３−２３_ａ）のＧａｌＮＡｃ_３クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。ＧａｌＮＡｃ_３−２３（ＧａｌＮＡｃ_３−２３_ａ−ＣＭ）の構造は、以下に示される：

【1049】

【化238】

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【1050】

実施例７７：ＧａｌＮＡｃ_３共役体を含むＳＲＢ−１を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害
以下に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてマウスにおけるＳＲＢ−１のアンチセンス阻害について試験した。

【1051】

【表52】

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【1052】

ＧａｌＮＡｃ_３−１_ａの構造は、先の実施例９に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−３_ａは、実施例３９に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−９ａは、実施例５２に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−１０ａは、実施例４６に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−１９_ａは、実施例７０に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−２０_ａは、実施例７１に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−２３_ａは、実施例７６に示される。

【1053】

処理
６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）のそれぞれに、表６４に列記されるオリゴヌクレオチドまたは生理食塩水を、以下に示される投与量で１回、皮下注入した。各処理群は、４匹の動物からなった。最終投与の７２時間後にマウスを屠殺して、リアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓におけるＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを決定した。以下の結果は、生理食塩水（対照）に対して正規化された各処理群のＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして提示される。

【1054】

表６５に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを低下させた。

【1055】

【表53】

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【1056】

標準のプロトコルを用いて、血清中の肝臓トランスアミナーゼレベル、すなわちアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）も測定した。総ビリルビン及びＢＵＮも評価した。体重の変化を評価したが、生理食塩水群との有意な変化は見られなかった（データ示されず）。ＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビン、及びＢＵＮ値が、以下の表６６に示される。

【1057】

【表54】

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【1058】

実施例７８：ＧａｌＮＡｃ_３共役体を含むアンギオテンシノーゲンを標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害
以下に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験において正常血圧のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットにおけるアンギオテンシノーゲン（ＡＧＴ）のアンチセンス阻害について試験した。

【1059】

【表55】

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ＧａｌＮＡｃ_３−１_ａの構造は、先の実施例９に示した。

【1060】

処理
６週齢の雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットのそれぞれに、表６７に列記されるオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳを、以下に示される投与量で週１回、合計３回の投与で、皮下注入した。各処理群は、４匹の動物からなった。最終投与の７２時間後にラットを屠殺した。リアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓におけるＡＧＴ ｍＲＮＡレベルを決定した。全アンギオテンシノーゲンＥＬＩＳＡ（カタログ番号ＪＰ２７４１２、ＩＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ）を用いて、１：２０，０００で希釈したＡＧＴ血漿タンパク質レベルを測定した。以下の結果は、ＰＢＳ対照に対して正規化された各処理群の肝臓におけるＡＧＴ ｍＲＮＡレベルまたは血漿におけるＡＧＴタンパク質レベルの平均パーセントとして提示される。

【1061】

表６８に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式で肝臓におけるＡＧＴ ｍＲＮＡ及び血漿タンパク質レベルを低下させ、ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドは、ＧａｌＮＡｃ共役体を欠く親オリゴヌクレオチドよりも著しく強力であった。

【1062】

【表56】

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【1063】

標準のプロトコルを用いて、屠殺時に血漿中の肝臓トランスアミナーゼレベル、すなわちアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、ならびに体重も測定した。結果が以下の表６９に示される。

【1064】

【表57】

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【1065】

実施例７９：ＧａｌＮＡｃ_３共役体を含むＡＰＯＣ−ＩＩＩを標的とするオリゴヌクレオチドの生体内における作用持続時間
以下の表７０に列記されるオリゴヌクレオチドを、単回投与試験においてマウスにおける作用持続時間について試験した。

【1066】

【表58】

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ＧａｌＮＡｃ_３−１_ａの構造は、先の実施例９に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−３_ａは、実施例３９に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−７_ａは、実施例４８に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−１０_ａは、実施例４６に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−１３_ａは、実施例６２に示される。

【1067】

処理
ヒトＡＰＯＣ−ＩＩＩを発現する６〜８週齢のトランスジェニックマウスのそれぞれに、表７０に列記されるオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳを１回皮下注入した。各処理群は、３匹の動物からなった。投薬前に血液を採取して、ベースライン、ならびに投与後７２時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、及び６週間時点のレベルを決定した。実施例２０に記載されるように、血漿トリグリセリド及びＡＰＯＣ−ＩＩＩタンパク質レベルを測定した。以下の結果は、ベースラインレベルに対して正規化された各処理群の血漿トリグリセリド及びＡＰＯＣ−ＩＩＩレベルの平均パーセントとして提示され、親オリゴヌクレオチドの投与量がＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチドの投与量の３倍であったにもかかわらず、ＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチドが共役基を有しない親オリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ３０４８０１）よりも長い作用持続時間を示したことを示す。

【1068】

【表59-1】

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【1069】

【表59-2】

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【1070】

実施例８０：ＧａｌＮＡｃ_３共役体を含むα−１抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害
以下の表７２に列記されるオリゴヌクレオチドを、マウスにおけるＡ１ＡＴの用量依存的阻害試験において試験した。

【1071】

【表60】

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ＧａｌＮＡｃ_３−１_ａの構造は、先の実施例９に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−３_ａは、実施例３９に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−７_ａは、実施例４８に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−１０_ａは、実施例４６に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−１３_ａは、実施例６２に示される。

【1072】

処理
６週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）のそれぞれに、表７２に列記されるオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳを、以下に示される投与量で週１回、合計３回の投与で、皮下注入した。各処理群は、４匹の動物からなった。最終投与の７２時間後にマウスを屠殺した。リアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓におけるＡ１ＡＴ ｍＲＮＡレベルを決定した。マウスα１−抗トリプシンＥＬＩＳＡ（カタログ番号４１−Ａ１ＡＭＳ−Ｅ０１、Ａｌｐｃｏ，Ｓａｌｅｍ，ＮＨ）を用いて、Ａ１ＡＴ血漿タンパク質レベルを決定した。以下の結果は、ＰＢＳ対照に対して正規化された各処理群の肝臓におけるＡ１ＡＴ ｍＲＮＡ及び血漿タンパク質レベルの平均パーセントとして提示される。

【1073】

表７３に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式で肝臓におけるＡ１ＡＴ ｍＲＮＡ及びＡ１ＡＴ血漿タンパク質レベルを低下させた。ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドは、親（ＩＳＩＳ ４７６３６６）よりも著しく強力であった。

【1074】

【表61】

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【1075】

標準のプロトコルを用いて、屠殺時に血漿中の肝臓トランスアミナーゼ及びＢＵＮレベルを測定した。体重及び臓器重量も測定した。結果が以下の表７４に示される。体重は、ベースラインと比較した％として示される。臓器重量は、ＰＢＳ対照群と比較した体重の％として示される。

【1076】

【表62】

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【1077】

実施例８１：生体内におけるＧａｌＮＡｃ_３クラスターを含むＡ１ＡＴを標的とするオリゴヌクレオチドの作用持続時間
表７２に列記されるオリゴヌクレオチドを、単回投与試験においてマウスにおける作用持続時間について試験した。

【1078】

処理
６週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスのそれぞれに、表７２に列記されるオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳを１回皮下注入した。各処理群は、４匹の動物からなった。投薬の前日に血液を採取して、ベースライン、ならびに投与後５、１２、１９、及び２５日時点のレベルを決定した。ＥＬＩＳＡを用いて血漿Ａ１ＡＴタンパク質レベルを測定した（実施例８０を参照のこと）。以下の結果は、ベースラインレベルに対して正規化された各処理群の血漿Ａ１ＡＴタンパク質レベルの平均パーセントとして提示される。結果は、ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドがＧａｌＮＡｃ共役体を欠く親（ＩＳＩＳ ４７６３６６）よりも強力であり、かつより長い作用持続時間を有したことを示す。さらに、５’−ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ６７８３８１、６７８３８２、６７８３８３、及び６７８３８４）は、概して、３’−ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ６５６３２６）よりもさらに強力であり、さらに長い作用持続時間を有した。

【1079】

【表63】

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【1080】

実施例８２：ＧａｌＮＡｃ_３共役体を含むＳＲＢ−１を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体外におけるアンチセンス阻害
処理の２時間前に、初代マウス肝細胞を１５，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。表７６に列記されるオリゴヌクレオチドをウィリアムＥ培地に２、１０、５０、または２５０ｎＭで添加し、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。オリゴヌクレオチド添加の１６時間後に細胞を溶解し、ＲＮｅａｓｅ ３０００ ＢｉｏＲｏｂｏｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを精製した。リアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを標準のプロトコルに従って決定した。Ｐｒｉｓｍ ４ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて、ＩＣ_５０値を決定した。結果は、さまざまな異なるＧａｌＮＡｃ共役基及びさまざまな異なる切断可能部分を含むオリゴヌクレオチドが、生体外自由取り込み実験において、ＧａｌＮＡｃ共役基を欠く親オリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ３５３３８２及び６６６８４１）よりも著しく強力であることを示す。

【1081】

【表64-1】

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【1082】

【表64-2】

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【1083】

【表64-3】

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【1084】

【表64-4】

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ＧａｌＮＡｃ_３−１_ａの構造は、先の実施例９に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−３_ａは、実施例３９に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−５_ａは、実施例４９に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−６_ａは、実施例５１に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−７_ａは、実施例４８に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−８_ａは、実施例４７に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−９_ａは、実施例５２に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−１０_ａは、実施例４６に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−１２_ａは、実施例６１に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−１３_ａは、実施例６２に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−１４_ａは、実施例６３に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−１５_ａは、実施例６４に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−１７_ａは、実施例６８に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−１８_ａは、実施例６９に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−１９_ａは、実施例７０に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−２０_ａは、実施例７１に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−２３_ａは、実施例７６に示される。

【1085】

実施例８３：ＧａｌＮＡｃ_３クラスターを含む、第ＸＩ因子を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害
以下の表７７に列記されるオリゴヌクレオチドを、マウスにおける第ＸＩ因子の用量依存的阻害試験において試験した。

【1086】

【表65】

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ＧａｌＮＡｃ_３−１_ａの構造は、先の実施例９に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−３_ａは、実施例３９に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−７_ａは、実施例４８に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−１０_ａは、実施例４６に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−１３_ａは、実施例６２に示される。

【1087】

処理
６〜８週齢のマウスのそれぞれに、以下に列記されるオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳを、以下に示される投与量で週１回、合計３回の投与で、皮下注入した。各処理群は、４匹の動物からなった。最終投与の７２時間後にマウスを屠殺した。リアルタイムＰＣＲを用いて肝臓における第ＸＩ因子ｍＲＮＡレベルを測定し、標準のプロトコルに従ってシクロフィリンに対して正規化した。肝臓トランスアミナーゼ、ＢＵＮ、及びビリルビンも測定した。以下の結果は、ＰＢＳ対照に対して正規化された各処理群の平均パーセントとして提示される。

【1088】

表７８に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式で肝臓における第ＸＩ因子ｍＲＮＡを低下させた。結果は、ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドが、ＧａｌＮＡｃ共役体を欠く親（ＩＳＩＳ ４０４０７１）よりも強力であったことを示す。さらに、５’−ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ６６３０８６、６７８３４７、６７８３４８、及び６７８３４９）は、３’−ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ６５６１７３）よりもさらに強力であった。

【1089】

【表66】

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【1090】

実施例８４：ＧａｌＮＡｃ_３共役体を含む第ＸＩ因子を標的とするオリゴヌクレオチドの生体内における作用持続時間
表７７に列記されるオリゴヌクレオチドを、単回投与試験においてマウスにおける作用持続時間について試験した。

【1091】

処理
６〜８週齢のマウスのそれぞれに、表７７に列記されるオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳを１回皮下注入した。各処理群は、４匹の動物からなった。投薬の前日に尾採血によって血液を採取して、ベースライン、ならびに投与後３、１０、及び１７日間時点のレベルを決定した。Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）の第ＸＩ因子捕捉及びビオチン化検出抗体（それぞれ、カタログ番号ＡＦ２４６０及びＢＡＦ２４６０）、ならびにＯｐｔＥＩＡ試薬セットＢ（カタログ番号５５０５３４、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて、第ＸＩ因子血漿タンパク質レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。以下の結果は、ベースラインレベルに対して正規化された各処理群の第ＸＩ因子血漿タンパク質レベルの平均パーセントとして提示される。結果は、ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドが、ＧａｌＮＡｃ共役体を欠く親（ＩＳＩＳ ４０４０７１）よりも強力であり、より長い作用持続時間を有したことを示す。さらに、５’−ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ６６３０８６、６７８３４７、６７８３４８、及び６７８３４９）は、３’−ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ６５６１７３）よりもさらに強力であり、さらに長い作用持続時間を有した。

【1092】

【表67】

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【1093】

実施例８５：ＧａｌＮＡｃ_３共役体を含む、ＳＲＢ−１を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害
表７６に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてマウスにおけるＳＲＢ−１のアンチセンス阻害について試験した。

【1094】

処理
６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスのそれぞれに、表７６に列記されるオリゴヌクレオチドまたは生理食塩水を、以下に示される投与量で週１回、合計３回の投与で、皮下注入した。各処理群は、４匹の動物からなった。最終投与の４８時間後にマウスを屠殺して、リアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを決定した。以下の結果は、生理食塩水（対照）に対して正規化された各処理群の肝臓におけるＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして提示される。

【1095】

表８０及び８１に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを低下させた。

【1096】

【表68】

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【1097】

標準のプロトコルを用いて、肝臓トランスアミナーゼレベル、総ビリルビン、ＢＵＮ、及び体重も測定した。各処理群の平均値が以下の表８２に示される。

【1098】

【表69】

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【1099】

実施例８６：ＧａｌＮＡｃ_３クラスターを含む、ＴＴＲを標的とするオリゴヌクレオチドの生体内におけるアンチセンス阻害
以下の表８３に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてヒトＴＴＲ遺伝子を発現するトランスジェニックマウスにおけるヒトトランスサイレチン（ＴＴＲ）のアンチセンス阻害について試験した。

【1100】

処理
８週齢のＴＴＲトランスジェニックマウスのそれぞれに、以下の表に列記されるオリゴヌクレオチド及び投与量またはＰＢＳを、週１回３週間、合計３回の投与で、皮下注入した。各処理群は、４匹の動物からなった。最終投与の７２時間後にマウスを屠殺した。この実験を通してさまざまな時点で尾採血を実行し、血漿ＴＴＲタンパク質、ＡＬＴ、及びＡＳＴレベルを測定し、表８５〜８７に報告した。動物を屠殺した後、血漿ＡＬＴ、ＡＳＴ、及びヒトＴＴＲレベルを測定し、体重、臓器重量、及び肝臓におおけるヒトＴＴＲ ｍＲＮＡレベルも測定した。臨床分析器（ＡＵ４８０、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＣＡ）を用いて、ＴＴＲタンパク質レベルを測定した。標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓におけるヒトＴＴＲ ｍＲＮＡレベルを決定した。表８４〜８７に提示される結果は、各処理群の平均値である。ｍＲＮＡレベルは、ＰＢＳ群の平均と比較した平均値である。血漿タンパク質レベルは、ベースラインでのＰＢＳ群の平均値と比較した平均値である。体重は、個々の処理群それぞれを屠殺するまでのベースラインからの平均体重変化率である。示される臓器重量は、動物の体重に対して正規化されており、各処理群の平均正規化臓器重量は、ＰＢＳ群の平均正規化臓器重量との比較で提示される。

【1101】

表８４〜８７において、「ＢＬ」は、第１の投与の直前に測定したベースラインを示す。表８４及び８５に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でＴＴＲ発現レベルを低下させた。ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドは、ＧａｌＮＡｃ共役体を欠く親（ＩＳＩＳ ４２０９１５）よりも強力であった。さらに、ＧａｌＮＡｃ共役体及び混成ＰＳ／ＰＯヌクレオシド間連結部を含むオリゴヌクレオチドは、ＧａｌＮＡｃ共役体及び完全ＰＳ連結部を含むオリゴヌクレオチドよりもさらに強力であった。

【1102】

【表70】

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表８５の説明文を実施例７４で見つけることができる。ＧａｌＮＡｃ_３−１の構造は、実施例９に示される。ＧａｌＮＡｃ_３−３_ａの構造は、実施例３９に示される。ＧａｌＮＡｃ_３−７_ａの構造は、実施例４８に示される。ＧａｌＮＡｃ_３−１０_ａの構造は、実施例４６に示される。ＧａｌＮＡｃ_３−１３_ａの構造は、実施例６２に示される。ＧａｌＮＡｃ_３−１９_ａの構造は、実施例７０に示される。

【1103】

【表71】

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【1104】

【表72】

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【1105】

【表73】

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【1106】

【表74-1】

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【1107】

【表74-2】

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【1108】

実施例８７：ＧａｌＮＡｃ_３クラスターを含むＴＴＲを標的とするオリゴヌクレオチドの単回投与による生体内における作用持続時間
ＩＳＩＳ番号４２０９１５及び６６０２６１（表８３を参照のこと）を、単回投与試験においてマウスにおける作用持続時間について試験した。ＩＳＩＳ番号４２０９１５、６８２８８３、及び６８２８８５（表８３を参照のこと）も、単回投与試験においてマウスにおける作用持続時間について試験した。

【1109】

処理
ヒトＴＴＲを発現する８週齢の雄トランスジェニックマウスのそれぞれに、１００ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ番号４２０９１５または１３．５ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ番号６６０２６１を１回皮下注入した。各処理群は、４匹の動物からなった。投薬前に尾採血を実行して、ベースライン、ならびに投与後３、７、１０、１７、２４、及び３９日目のレベルを決定した。実施例８６に記載されるように、血漿ＴＴＲタンパク質レベルを測定した。以下の結果は、ベースラインレベルに対して正規化された各処理群の血漿ＴＴＲレベルの平均パーセントとして提示される。

【1110】

【表75】

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【1111】

処理
ヒトＴＴＲを発現する雌トランスジェニックマウスのそれぞれに、１００ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ番号４２０９１５、１０．０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ番号６８２８８３、または１０．０ｍｇ／ｋｇの６８２８８５を１回皮下注入した。各処理群は、４匹の動物からなった。投薬前に尾採血を実行して、ベースライン、ならびに投与後３、７、１０、１７、２４、及び３９日目のレベルを決定した。実施例８６に記載されるように、血漿ＴＴＲタンパク質レベルを測定した。以下の結果は、ベースラインレベルに対して正規化された各処理群の血漿ＴＴＲレベルの平均パーセントとして提示される。

【1112】

【表76】

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表８８及び８９における結果は、ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドが、共役体を欠く親オリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ４２０９１５）よりも強力であり、より長い作用持続時間を有することを示す。

【1113】

実施例８８：ＧａｌＮＡｃ_３共役体を含むＳＭＮを標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるスプライシング調節
表９０に列記されるオリゴヌクレオチドを、マウスにおけるヒト運動ニューロン生存（ＳＭＮ）のスプライシング調節について試験した。

【1114】

【表77】

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ＧａｌＮＡｃ_３−７_ａの構造は、先の実施例４８に示した。「Ｘ」は、Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ（Ｐｈｉｌｏｍａｔｈ，ＯＲ）によって生成された５’一次アミンを示し、ＧａｌＮＡｃ_３−７_ｂは、以下に示すように、リンカーの−ＮＨ−Ｃ_６−Ｏ部分を欠くＧａｌＮＡｃ_３−７_ａの構造を示す。

【1115】

【化239】

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ＩＳＩＳ番号７０３４２１及び７０３４２２は、モルホリノオリゴヌクレオチドであり、これら２つのオリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドは、モルホリノヌクレオチドである。

【1116】

処理
ヒトＳＭＮを発現する６週齢のトランスジェニックマウスに、表９１に列記されるオリゴヌクレオチドまたは生理食塩水を１回皮下注入した。各処理群は、２匹の雄及び２匹の雌からなった。投与の３日後にマウスを屠殺して、標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲを用いて、エクソン７を有する場合とエクソン７を有しない場合の肝臓におけるヒトＳＭＮ ｍＲＮＡレベルを決定した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を用いて総ＲＮＡを測定した。ＳＭＮ ｍＲＮＡレベルを総ｍＲＮＡに対して正規化し、さらに生理食塩水処理群の平均に対して正規化した。結果として生じたエクソン７を含むＳＭＮ ｍＲＮＡとエクソン７を欠くＳＭＮ ｍＲＮＡとの平均比が、表９１に示される。結果は、スプライシングを調節し、かつＧａｌＮＡｃ共役体を含む完全修飾オリゴヌクレオチドが、ＧｌａＮＡｃ共役体を欠く親オリゴヌクレオチドよりも肝臓におけるスプライシングの改変に著しく強力であることを示す。さらに、この傾向は、２’−ＭＯＥ及びモルホリノ修飾オリゴヌクレオチドを含む複数の修飾化学でも維持される。

【1117】

【表78】

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【1118】

実施例８９：ＧａｌＮＡｃ_３共役体を含むアポリポタンパク質Ａ（Ａｐｏ（ａ））を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害
以下の表９２に列記されるオリゴヌクレオチドを、トランスジェニックマウスにおけるＡｐｏ（ａ）の用量依存的阻害に関する試験で試験した。

【1119】

【表79】

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ＧａｌＮＡｃ_３−７_ａの構造は、実施例４８に示される。

【1120】

処理
８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）のそれぞれに、表９２に列記されるオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳを、以下に示される投与量で週１回、合計６回の投与で、皮下注入した。各処理群は、３〜４匹の動物からなった。第１の投与の前日に、かつ各投与後週１回、尾採血を実行して、血漿Ａｐｏ（ａ）タンパク質レベルを決定した。最終投与の２日後にマウスを屠殺した。リアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓におけるＡｐｏ（ａ）ｍＲＮＡレベルを決定した。ＥＬＩＳＡを用いてＡｐｏ（ａ）血漿タンパク質レベルを決定し、肝臓トランスアミナーゼレベルを決定した。表９３におけるｍＲＮＡ及び血漿タンパク質の結果は、ＰＢＳ処理群と比較した処理群の平均パーセントとして提示される。血漿タンパク質レベルをさらにＰＢＳ群のベースライン（ＢＬ）値に対して正規化した。平均絶対トランスアミナーゼレベル及び体重（ベースライン平均と比較した％）が表９４に報告される。

【1121】

表９３に例証されるように、オリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式で肝臓におけるＡｐｏ（ａ）ｍＲＮＡ及び血漿タンパク質レベルを低下させた。さらに、ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドは、ＧａｌＮＡｃ共役体を欠く親オリゴヌクレオチドよりも著しく強力であり、より長い作用持続時間を有した。表９４に例証されるように、トランスアミナーゼレベル及び体重はオリゴヌクレオチドの影響を受けず、オリゴヌクレオチドが良好な耐容性を示したことを示す。

【1122】

【表80】

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【1123】

【表81】

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【1124】

実施例９０：ＧａｌＮＡｃ_３クラスターを含むＴＴＲを標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害
以下の表９５に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてヒトＴＴＲ遺伝子を発現するトランスジェニックマウスにおけるヒトトランスサイレチン（ＴＴＲ）のアンチセンス阻害について試験した。

【1125】

処理
ＴＴＲトランスジェニックマウスのそれぞれに、表９６に列記されるオリゴヌクレオチド及び投与量またはＰＢＳを、週１回３週間、合計３回の投与で、皮下注入した。各処理群は、４匹の動物からなった。第１の投与の前に、尾採血を実行して、ベースライン（ＢＬ）での血漿ＴＴＲタンパク質レベルを決定した。最終投与の７２時間後にマウスを屠殺した。臨床分析器（ＡＵ４８０、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＣＡ）を用いて、ＴＴＲタンパク質レベルを測定した。標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓におけるヒトＴＴＲ ｍＲＮＡレベルを決定した。表９６に提示される結果は、各処理群の平均値である。ｍＲＮＡレベルは、ＰＢＳ群の平均と比較した平均値である。血漿タンパク質レベルは、ベースラインでのＰＢＳ群の平均値と比較した平均値である。「ＢＬ」は、第１の投与の直前に測定したベースラインを示す。表９６に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でＴＴＲ発現レベルを低下させた。ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドは、ＧａｌＮＡｃ共役体を欠く親（ＩＳＩＳ ４２０９１５）よりも強力であり、ホスホジエステルまたはデオキシアデノシンの切断可能部分を含むオリゴヌクレオチドは、共役体を欠く親と比較して、力価の著しい改善を示した（ＩＳＩＳ番号６８２８８３及び６６６９４３対４２０９１５、ならびに実施例８６及び８７を参照のこと）。

【1126】

【表82】

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表９５の説明文を実施例７４で見つけることができる。ＧａｌＮＡｃ_３−３_ａの構造は、実施例３９に示される。ＧａｌＮＡｃ_３−７_ａの構造は、実施例４８に示される。ＧａｌＮＡｃ_３−１０_ａの構造は、実施例４６に示される。ＧａｌＮＡｃ_３−１３_ａの構造は、実施例６２に示される。

【1127】

【表83】

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【1128】

実施例９１：非ヒト霊長類におけるＧａｌＮＡｃ_３共役体を含む第ＶＩＩ因子を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害
以下の表９７に列記されるオリゴヌクレオチドを、非終末用量増加試験（ｎｏｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ，ｄｏｓｅ ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ）においてサルにおける第ＶＩＩ因子のアンチセンス阻害について試験した。

【1129】

処理
処置した（ｎｏｎ−ｎａiｖｅ）サルのそれぞれに、増加用量の表９７に列記されるオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳを、０、１５、及び２９日目に皮下注入した。各処理群は、４匹の雄及び１匹の雌からなった。第１の投与の前とその後のさまざまな時点で、血液採取を実行して、血漿第ＶＩＩ因子タンパク質レベルを決定した。ＥＬＩＳＡによって第ＶＩＩ因子タンパク質レベルを測定した。表９８に提示される結果は、第１の投与の直前に測定したベースライン（ＢＬ）でのＰＢＳ群の平均値と比較した各処理群の平均値である。表９８に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式で第ＶＩＩ因子の発現レベルを低下させ、ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドは、サルにおいてＧａｌＮＡｃ共役体を欠くオリゴヌクレオチドよりも著しく強力であった。

【1130】

【表84】

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表９７の説明文を実施例７４で見つけることができる。ＧａｌＮＡｃ_３−１０_ａの構造は、実施例４６に示される。

【1131】

【表85】

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【1132】

実施例９２：ＧａｌＮＡｃ_３共役体を含むＡｐｏ−ＣＩＩＩを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる初代肝細胞におけるアンチセンス阻害
初代マウス肝細胞を１５，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、マウスＡｐｏＣ−ＩＩＩを標的とする表９９に列記されるオリゴヌクレオチドを、０．４６、１．３７、４．１２、または１２．３５、３７．０４、１１１．１１、もしくは３３３．３３ｎＭまたは１．００μｍで添加した。オリゴヌクレオチドとともに２４時間インキュベートした後、細胞を溶解し、ＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを精製した。標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ ｍＲＮＡレベルを決定した。Ｐｒｉｓｍ ４ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて、ＩＣ_５０値を決定した。結果は、切断可能部分がホスホジエステルであるかホスホジエステル連結デオキシアデノシンであるかにかかわらず、ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドが、共役体を欠く親オリゴヌクレオチドよりも著しく強力であったことを示す。

【1133】

【表86】

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ＧａｌＮＡｃ_３−１_ａの構造は、先の実施例９に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−３_ａは、実施例３９に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−７_ａは、実施例４８に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−１０_ａは、実施例４６に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−１３_ａは、実施例６２に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−１９_ａは、実施例７０に示される。

【1134】

実施例９３：混成ウイング及び５’−ＧａｌＮＡｃ_３共役体を含むＳＲＢ−１を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害
表１００に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてマウスにおけるＳＲＢ−１のアンチセンス阻害について試験した。

【1135】

【表87】

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ＧａｌＮＡｃ_３−３_ａの構造は、先の実施例３９に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−７ａの構造は、先の実施例４８に示される。下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｋ」は、６’−（Ｓ）−ＣＨ_３二環式ヌクレオシド（ｃＥｔ）を示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部（ＰＯ）を示す。上付き文字「ｍ」は、５−メチルシトシンを示す。

【1136】

処理
６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、表１００に列記されるオリゴヌクレオチドまたは生理食塩水を、以下に示される投与量で１回、皮下注入した。各処理群は、４匹の動物からなった。最終投与の７２時間後にマウスを屠殺した。リアルタイムＰＣＲを用いて、肝臓におけるＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを測定した。標準のプロトコルに従って、ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルをシクロフィリンｍＲＮＡレベルに対して正規化した。結果は、生理食塩水対照群と比較した各処理群のＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして提示される。表１０１に例証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、用量依存的様式でＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを低下させ、ＧａｌＮＡｃ共役体を含み、かつ完全ｃＥｔまたは混成糖修飾のいずれかのウイングを有するギャップマーオリゴヌクレオチドは、共役体を欠き、かつ完全ｃＥｔ修飾ウイングを含む親オリゴヌクレオチドよりも著しく強力であった。

【1137】

体重、肝臓トランスアミナーゼ、総ビリルビン、及びＢＵＮも測定し、各処理群の平均値が表１０１に示される。体重は、オリゴヌクレオチド投与の直前に測定したベースライン体重（％ＢＬ）と比較した平均体重率として示される。

【1138】

【表88-1】

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【1139】

【表88-2】

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【1140】

実施例９４：２’−糖修飾及び５’−ＧａｌＮＡｃ_３共役体を含むＳＲＢ−１を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害
表１０２に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてマウスにおけるＳＲＢ−１のアンチセンス阻害について試験した。

【1141】

【表89】

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下付き文字「ｍ」は、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオシドを示す。完全な表の説明文については、実施例７４を参照されたい。ＧａｌＮＡｃ_３−３_ａの構造は、先の実施例３９に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−７ａの構造は、先の実施例４８に示した。

【1142】

処理
実施例９３に記載されるプロトコルを用いて試験を完了した。結果が以下の表１０３に示され、ＧａｌＮＡｃ共役体を含む２’−ＭＯＥ修飾オリゴヌクレオチドと２’−ＯＭｅ修飾オリゴヌクレオチドとが両方ともに、共役体を欠くそれぞれの親オリゴヌクレオチドよりも著しく強力であったことを示す。体重、肝臓トランスアミナーゼ、総ビリルビン、及びＢＵＮの測定結果は、これらの化合物がすべて良好な耐容性を示したことを示す。

【1143】

【表90】

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【1144】

実施例９５：二環式ヌクレオシド及び５’−ＧａｌＮＡｃ_３共役体を含むＳＲＢ−１を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害
表１０４に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてマウスにおけるＳＲＢ−１のアンチセンス阻害について試験した。

【1145】

【表91】

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下付き文字「ｇ」は、フルオロ−ＨＮＡヌクレオシドを示し、下付き文字「ｌ」は、２’−Ｏ−ＣＨ_２−４’橋を含むロックドヌクレオシドを示す。他の省略形については、実施例７４の表の説明文を参照されたい。ＧａｌＮＡｃ_３−１_ａの構造は、先の実施例９に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−３_ａの構造は、先の実施例３９に示し、ＧａｌＮＡｃ_３−７ａの構造は、先の実施例４８に示した。

【1146】

処理
実施例９３に記載されるプロトコルを用いて試験を完了した。結果が以下の表１０５に示され、ＧａｌＮＡｃ共役体及びさまざまな二環式ヌクレオシド修飾を含むオリゴヌクレオチドが、共役体を欠くが二環式ヌクレオシド修飾を含む親オリゴヌクレオチドよりも著しく強力であったことを示す。さらに、ＧａｌＮＡｃ共役体及びフルオロ−ＨＮＡ修飾を含むオリゴヌクレオチドは、共役体を欠くがフルオロ−ＨＮＡ修飾を含む親よりも著しく強力であった。体重、肝臓トランスアミナーゼ、総ビリルビン、及びＢＵＮの測定結果は、これらの化合物がすべて良好な耐容性であったことを示した。

【1147】

【表92】

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【1148】

実施例９６：ＧａｌＮＡｃ_３共役基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの血漿タンパク質結合
ＡｐｏＣ−ＩＩＩを標的とする表７０に列記されるオリゴヌクレオチド及びＡｐｏ（ａ）を標的とする表１０６におけるオリゴヌクレオチドを限外濾過アッセイにおいて試験して、血漿タンパク質結合を評価した。

【1149】

【表93】

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表の説明文については、実施例７４を参照されたい。ＧａｌＮＡｃ_３−７ａの構造は、先の実施例４８に示される。

【1150】

Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ限外濾過ユニット（３０，０００ＮＭＷＬ、低結合再生セルロース膜、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を３００μＬの０．５％Ｔｗｅｅｎ ８０で事前に条件付け、２０００ｇで１０分間遠心分離し、その後、Ｈ_２Ｏ中の３００μＬの３００μｇ／ｍＬ対照オリゴヌクレオチド溶液で事前に条件付け、２０００ｇで１６分間遠心分離した。これらの試験で用いる表７０及び１０６の各試験オリゴヌクレオチドのフィルターへの非特異的結合を評価するために、３００μＬのＨ_２Ｏ中の２５０ｎｇ／ｍＬ溶液オリゴヌクレオチド（ｐＨ７．４）を事前に条件付けたフィルターに設置し、２０００ｇで１６分間遠心分離した。ＥＬＩＳＡアッセイによって濾過していない試料及び濾過した試料を分析して、オリゴヌクレオチド濃度を決定した。３つの複製物を用いて各試料の平均濃度を得た。濾過していない試料と比較した濾過した試料の平均濃度を用いて、血漿の不在下でフィルターによって回収されたオリゴヌクレオチドの割合（％回収）を決定する。

【1151】

薬物を使用していない健常なヒト志願者、カニクイザル、及びＣＤ−１マウス由来のＫ３−ＥＤＴＡ中に収集された凍結全血漿試料をＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ ＬＬＣ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）から購入した。試験オリゴヌクレオチドを、２つの濃度（５μｇ／ｍＬ及び１５０μｇ／ｍＬ）で血漿の１．２ｍＬの一定分量に添加した。各スパイクした血漿試料の一定分量（３００μＬ）を事前に条件付けられたフィルターユニット内に設置し、３７°Ｃで３０分間インキュベートした直後に２０００ｇで１６分間遠心分離した。ＥＬＩＳＡによって、濾過してスパイクした血漿試料及び濾過していないスパイクした血漿試料の一定分量を分析して、各試料中のオリゴヌクレオチドの濃度を決定した。１つの濃度ごとに３つの複製物を用いて、各試料中の結合オリゴヌクレオチド及び非結合オリゴヌクレオチドの平均割合を決定した。濾過していない試料の濃度と比較した濾過した試料の平均濃度を用いて、血漿タンパク質に結合されていない血漿中のオリゴヌクレオチドの割合（％非結合）を決定する。各オリゴヌクレオチドの％非結合を％回収で割ることによって、最終非結合オリゴヌクレオチド値を非特異的結合に対して補正する。最終％非結合値を１００から差し引くことによって、最終％結合オリゴヌクレオチド値を決定する。各種の血漿において試験した２つの濃度のオリゴヌクレオチド（５μｇ／ｍＬ及び１５０μｇ／ｍＬ）の結果が表１０７に示される。結果は、ＧａｌＮＡｃ共役基が血漿タンパク質結合に大きな影響を与えないことを示す。さらに、完全ＰＳヌクレオシド間連結部を有するオリゴヌクレオチドも混成ＰＯ／ＰＳ連結部を有するオリゴヌクレオチドも血漿タンパク質に結合し、完全ＰＳ連結部を有するオリゴヌクレオチドは、混合ＰＯ／ＰＳ連結部を有するオリゴヌクレオチドよりも若干高い程度に血漿タンパク質に結合する。

【1152】

【表94】

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【1153】

実施例９７：ＧａｌＮＡｃ_３共役基を含むＴＴＲを標的とする修飾オリゴヌクレオチド
ＧａｌＮＡｃ共役体を含む表１０８に示されるオリゴヌクレオチドを、ＴＴＲを標的とするように設計した。

【1154】

【表95】

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表１０８の説明文を実施例７４で見つけることができる。ＧａｌＮＡｃ_３−１の構造は、実施例９に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−３_ａの構造は、実施例３９に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−７_ａの構造は、実施例４８にした。ＧａｌＮＡｃ_３−１０_ａの構造は、実施例４６に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−１３_ａの構造は、実施例６２に示した。ＧａｌＮＡｃ_３−１９_ａの構造は、実施例７０に示した。

【1155】

実施例９８：ｈＰＭＢＣアッセイにおけるＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドの炎症誘発作用の評価
表１０９に列記されるオリゴヌクレオチドを、実施例２３及び２４に記載されるようにｈＰＭＢＣアッセイにおいて炎症誘発作用について試験した（オリゴヌクレオチドの説明については、表３０、８３、９５、及び１０８を参照のこと）。ＩＳＩＳ ３５３５１２は、正の対照として用いられる高レスポンダーであり、他のオリゴヌクレオチドは、表８３、９５、及び１０８に記載されるものである。１人の志願ドナー由来の血液を用いて表１０９に示される結果を得た。結果は、混合ＰＯ／ＰＳヌクレオシド間連結部を含むオリゴヌクレオチドが、完全ＰＳ連結部を有する同一のオリゴヌクレオチドと比較して、著しく低い炎症誘発応答をもたらしたことを示す。さらに、ＧａｌＮＡｃ共役基は、このアッセイにおいて大きく影響しなかった。

【1156】

【表96】

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【1157】

実施例９９：アシアロ糖タンパク質受容体に対するＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドの結合親和性
アシアロ糖タンパク質受容体に対する表１１０に列記されるオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドの説明については、表７６を参照のこと）の結合親和性を、競合的受容体結合アッセイにおいて試験した。競合相手のリガンドであるα１−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）中で１Ｕノイラミニダーゼ−アガロースとともに３７℃で１６時間インキュベートし、シアル酸アッセイまたはサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）のいずれかで９０％を超える脱シアル化を確認した。Ａｔｓｍａ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．１９９１ Ｊａｎ；３２（１）：１７３−８１を参照のこと）の手順に従って、一塩化ヨウ素を用いてＡＧＰをヨウ素化した。この方法において、脱シアル化α１−酸性糖タンパク質（ｄｅ−ＡＧＰ）を、１０ｍＭ塩化ヨウ素、Ｎａ^１２５Ｉ、及び０．２５Ｍ ＮａＯＨ中の１Ｍグリシンに添加した。室温で１０分間インキュベートした後、３ＫＤＭＷＣＯスピンカラムを利用してこの混合物を２回濃縮することによって、^１２５Ｉ標識ｄｅ−ＡＧＰを遊離^１２５Ｉから分離した。このタンパク質を、Ａｇｉｌｅｎｔ ＳＥＣ−３カラム（７．８×３００ｍｍ）及びβ−ＲＡＭカウンタを装備したＨＰＬＣシステムにおいて標識効率及び純度について試験した。^１２５Ｉ標識ｄｅ−ＡＧＰ及びＡＳＯを含有するさまざまなＧａｌＮＡｃクラスターを利用した競合実験を以下のとおりに実行した。ヒトＨｅｐＧ２細胞（１０^６細胞／ｍＬ）を、２ｍＬの適切な成長培地中の６ウェルプレートにプレーティングした。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、及び１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを補充したＭＥＭ培地を用いた。細胞を、それぞれ、５％及び１０％ＣＯ_２で、３７℃で１６〜２０時間インキュベートした。実験前に細胞をＦＢＳを有しない培地で洗浄した。細胞を、２％ＦＢＳを有する適切な成長培地を含有する１ｍＬの競合混合物、１０^−８Ｍ ^１２５Ｉ標識ｄｅ−ＡＧＰ、及び１０^−１１〜１０^−５Ｍの範囲の濃度のＡＳＯを含有するＧａｌＮＡｃクラスターとともに、３７℃で３０分間インキュベートした。１０^−２Ｍ ＧａｌＮＡｃ糖の存在下で非特異的結合を決定した。細胞をＦＢＳを有しない培地で２回洗浄して、非結合^１２５Ｉ標識ｄｅ−ＡＧＰ及び競合相手であるＧａｌＮＡｃ ＡＳＯを除去した。１％β−メルカプトエタノールを含有するＱｉａｇｅｎのＲＬＴ緩衝液を用いて、細胞を溶解した。１０分間の短時間凍結／解凍サイクル後に溶解物を丸底アッセイチューブに移し、γ−カウンタでアッセイした。非特異的結合を差し引いた後に、^１２５Ｉタンパク質カウントを最も低いＧａｌＮＡｃ−ＡＳＯ濃度カウントの値で割った。非線形回帰アルゴリズムを用いた単一部位競合結合等式に従って阻害曲線を当てはめて、結合親和性（Ｋ_Ｄ）を計算した。

【1158】

表１１０における結果を５つの異なる日に実行した実験から得た。上付き文字「ａ」の付いたオリゴヌクレオチドの結果は、２つの異なる日に実行した実験の平均である。結果は、５’末端にＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチドがヒトＨｅｐＧ２細胞上のアシアロ糖タンパク質受容体に結合し、３’末端にＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチドよりも１．５〜１６倍高い親和性を有することを示す。

【1159】

【表97】

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【1160】

実施例１００：生体内におけるＡｐｏ（ａ）を標的とするＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害
以下の表１１１ａに列記されるオリゴヌクレオチドを、単回投与試験においてマウスにおける作用持続時間について試験した。

【1161】

【表98】

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ＧａｌＮＡｃ_３−７_ａの構造は、実施例４８に示した。

【1162】

処理
ヒトＡｐｏ（ａ）を発現する雌トランスジェニックマウスのそれぞれに、表１１１ｂに列記されるオリゴヌクレオチド及び投与量またはＰＢＳを、週１回、合計６回の投与で、皮下注入した。各処理群は、３匹の動物からなった。投薬の前日に血液を採取して、血漿中のＡｐｏ（ａ）タンパク質のベースラインレベル、ならびに第１の投与後７２時間、１週間、及び２週間時点のレベルを決定した。第１の投与後３週間、４週間、５週間、及び６週間時点でさらに血液を採取する。ＥＬＩＳＡを用いて血漿Ａｐｏ（ａ）タンパク質レベルを測定した。表１１１ｂにおける結果は、ベースラインレベル（％ＢＬ）に対して正規化された各処理群の血漿Ａｐｏ（ａ）タンパク質レベルの平均パーセントとして提示され、結果は、ＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチドがＡｐｏ（ａ）発現の強力な減少を示したことを示す。この強力な影響は、完全ＰＳヌクレオシド間連結部を含むオリゴヌクレオチド及び混成ＰＯ及びＰＳ連結部を含むオリゴヌクレオチドにおいて観察された。

【1163】

【表99】

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【1164】

実施例１０１：安定した部分を介して連結されたＧａｌＮＡｃクラスターを含むオリゴヌクレオチドによるアンチセンス阻害
表１１２に列記されるオリゴヌクレオチドを生体内におけるマウスＡＰＯＣ−ＩＩＩ発現の阻害について試験した。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスのそれぞれに、表１１２に列記されるオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳを１回皮下注入した。各処理群は、４匹の動物からなった。ＩＳＩＳ ４４０６７０で処理した各マウスは、２、６、２０、または６０ｍｇ／ｋｇの投与を受けた。ＩＳＩＳ ６８０７７２または６９６８４７で処理した各マウスは、０．６、２、６、または２０ｍｇ／ｋｇを受けた。ＩＳＩＳ ６９６８４７のＧａｌＮＡｃ共役基は、安定した部分（容易に切断可能なホスホジエステル含有結合の代わりにホスホロチオエート連結部）を介して連結されている。投与の７２時間後に動物を屠殺した。リアルタイムＰＣＲを用いて、肝臓におけるＡＰＯＣ−ＩＩＩ ｍＲＮＡレベルを測定した。標準のプロトコルに従って、ＡＰＯＣ−ＩＩＩ ｍＲＮＡレベルをシクロフィリンｍＲＮＡレベルに対して正規化した。結果は、生理食塩水対照群と比較した各処理群のＡＰＯＣ−ＩＩＩ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして表１１２に提示される。結果は、ＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチドが、共役基を欠くオリゴヌクレオチドよりも著しく強力であったことを示す。さらに、切断可能部分を介してオリゴヌクレオチドに連結されたＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ６８０７７２）は、安定した部分を介してオリゴヌクレオチドに連結されたＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ ６９６８４７）よりもさらに強力であった。

【1165】

【表100】

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ＧａｌＮＡｃ_３−７_ａの構造は、実施例４８に示した。

【1166】

実施例１０２：ＧａｌＮＡｃ共役体を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの肝臓における分布
ＧａｌＮＡｃ共役体を含まないＩＳＩＳ ３５３３８２（表３６を参照のこと）及びＧａｌＮＡｃ共役体を含むＩＳＩＳ ６５５８６１（表３６を参照のこと）の肝臓における分布を評価した。雄ｂａｌｂ／ｃマウスに、ＩＳＩＳ ３５３３８２または６５５８６１を、表１１３に列記される投与量で１回、皮下注入した。２匹の動物からなった１８ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ ６５５８６１群を除いて、各処理群は、３匹の動物からなった。投与の４８時間後に動物を屠殺して、オリゴヌクレオチドの肝臓における分布を決定した。１細胞あたりのアンチセンスオリゴヌクレオチド分子の数を測定するために、ルテニウム（ＩＩ）トリス−ビピリジン標識（ＭＳＤ ＴＡＧ、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を、アンチセンスオリゴヌクレオチドを検出するために用いるオリゴヌクレオチドプローブに共役させた。表１１３に提示される結果は、１細胞あたり１００万オリゴヌクレオチド分子を１単位として表した各処理群のオリゴヌクレオチドの平均濃度である。結果は、等価用量で、ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドが、全肝臓及び肝細胞において、ＧａｌＮＡｃ共役体を含まないオリゴヌクレオチドよりも高い濃度で存在したことを示す。さらに、ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドは、非実質肝臓細胞において、ＧａｌＮＡｃ共役体を含まないオリゴヌクレオチドよりも低い濃度で存在した。１細胞あたりの肝細胞及び非実質肝臓細胞におけるＩＳＩＳ ６５５８６１の濃度が同様であった一方で、肝臓は、約８０体積％肝細胞であった。したがって、肝臓内に存在するＩＳＩＳ ６５５８６１オリゴヌクレオチドの大部分が肝細胞内に見られる一方で、肝臓内に存在するＩＳＩＳ ３５３３８２オリゴヌクレオチドの大部分は、非実質肝臓細胞内に見られた。

【1167】

【表101】

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【1168】

実施例１０３：ＧａｌＮＡｃ_３共役体を含むＡＰＯＣ−ＩＩＩを標的とするオリゴヌクレオチドの生体内における作用持続時間
以下の表１１４に列記されるオリゴヌクレオチドを、単回投与試験においてマウスにおける作用持続時間について試験した。

【1169】

【表102】

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ＧａｌＮＡｃ_３−３_ａの構造は、実施例３９に示され、ＧａｌＮＡｃ_３−１９_ａは、実施例７０に示される。

【1170】

処理
ヒトＡＰＯＣ−ＩＩＩを発現する雌トランスジェニックマウスのそれぞれに、表１１４に列記されるオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳを１回皮下注入した。各処理群は、３匹の動物からなった。投薬前に血液を採取して、ベースライン、ならびに投与後３、７、１４、２１、２８、３５、及び４２日間のレベルを決定した。実施例２０に記載されるように、血漿トリグリセリド及びＡＰＯＣ−ＩＩＩタンパク質レベルを測定した。表１１５における結果は、ベースラインレベルに対して正規化された各処理群の血漿トリグリセリド及びＡＰＯＣ−ＩＩＩレベルの平均パーセントとして提示される。実施例７９の表７１における結果と以下の表１１５における結果の比較は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結部及びホスホロチオエートヌクレオシド間連結部の両方を含むオリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部のみを含む等価オリゴヌクレオチドよりも増加した作用持続時間を示したことを示す。

【1171】

【表103】

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【1172】

実施例１０４：５’−ＧａｌＮＡｃ_２共役体を含むオリゴヌクレオチドの合成

【1173】

【化240】

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化合物１２０は市販されており、化合物１２６の合成は実施例４９に記載されている。化合物１２０（１ｇ、２．８９ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（０．３９ｇ、２．８９ｍｍｏｌ）、及びＨＯＢｔ（１．６４ｇ、４．３３ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．７５ｍＬ、１０．１ｍｍｏｌ）を添加した。約５分後、アミノヘキサン酸ベンジルエステル（１．３６ｇ、３．４６ｍｍｏｌ）をこの反応物に添加した。３時間後、反応混合物を１００ｍＬの１Ｍ ＮａＨＳＯ４に注ぎ、２×５０ｍＬ酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせ、４０ｍＬ飽和ＮａＨＣＯ_３で３回、ブラインで２回洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。この生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ：ＥＡ：Ｈｅｘ＝１：１：１）によって精製して、化合物２３１を得た。ＬＣＭＳ及びＮＭＲは、その構造と一致した。化合物２３１（１．３４ｇ、２．４３８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１０ｍＬ）中に溶解し、トリフルオロ酢酸（１０ｍＬ）を添加した。室温で２時間撹拌した後、反応混合物を減圧下で濃縮し、トルエン（３×１０ｍＬ）と共蒸発させた。残渣を減圧下で乾燥させて、トリフルオロ酢酸塩として化合物２３２を得た。化合物１６６の合成は、実施例５４に記載される。化合物１６６（３．３９ｇ、５．４０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３ｍＬ）中に溶解した。化合物２３２（１．３ｇ、２．２５ｍｍｏｌ）の溶液をＤＭＦ（３ｍＬ）中に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．５５ｍＬ）を添加した。反応物を室温で３０分間撹拌し、その後、水（８０ｍＬ）に注ぎ、水層をＥｔＯＡｃ（２×１００ｍＬ）で抽出した。有機相を分離し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（３×８０ｍＬ）、１Ｍ ＮａＨＳＯ_４（３×８０ｍＬ）、及びブライン（２×８０ｍＬ）で洗浄し、その後、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、化合物２３３を得た。ＬＣＭＳ及びＮＭＲは、その構造と一致した。化合物２３３（０．５９ｇ、０．４８ｍｍｏｌ）をメタノール（２．２ｍＬ）及び酢酸エチル（２．２ｍＬ）中に溶解した。パラジウム炭素（１０重量％Ｐｄ／Ｃ、湿性、０．０７ｇ）を添加し、反応混合物を水素雰囲気下で３時間撹拌した。セライトパッドを通して反応混合物を濾過し、濃縮して、カルボン酸を得た。カルボン酸（１．３２ｇ、１．１５ｍｍｏｌ、クラスター遊離酸）をＤＭＦ（３．２ｍＬ）中に溶解した。これに、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．３ｍＬ、１．７３ｍｍｏｌ）及びＰＦＰＴＦＡ（０．３０ｍＬ、１．７３ｍｍｏｌ）を添加した。室温で３０分間撹拌した後、反応混合物を水（４０ｍＬ）に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（２×５０ｍＬ）で抽出した。上述のように標準の後処理を完了して、化合物２３４を得た。ＬＣＭＳ及びＮＭＲは、その構造と一致した。実施例４６に記載される一般的手順を用いて、オリゴヌクレオチド２３５を調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ_２−２４のＧａｌＮＡｃ_２クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_２−２４_ａ）をオリゴヌクレオチド上に存在する任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。ＧａｌＮＡｃ_２−２４（ＧａｌＮＡｃ_２−２４_ａ−ＣＭ）の構造は、以下に示される：

【1174】

【化241】

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【1175】

実施例１０５：ＧａｌＮＡｃ_１−２５共役体を含むオリゴヌクレオチドの合成

【1176】

【化242】

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化合物１６６の合成は、実施例５４に記載される。実施例４６に記載される一般的手順を用いて、オリゴヌクレオチド２３６を調製した。

【1177】

あるいは、以下に示されるスキームを用いてオリゴヌクレオチド２３６を合成し、実施例１０に記載される手順を用いて、化合物２３８を用いてオリゴヌクレオチド２３６を形成した。

【1178】

【化243】

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共役基ＧａｌＮＡｃ_１−２５のＧａｌＮＡｃ_１クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_１−２５_ａ）をオリゴヌクレオチド上に存在する任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。ＧａｌＮＡｃ_１−２５（ＧａｌＮＡｃ_１−２５_ａ−ＣＭ）の構造は、以下に示される：

【1179】

【化244】

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【1180】

実施例１０６：５’−ＧａｌＮＡｃ_２または５’−ＧａｌＮＡｃ_３共役体を含むＳＲＢ−１を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害
表１１６及び１１７に列記されるオリゴヌクレオチドを、用量依存的試験においてマウスにおけるＳＲＢ−１のアンチセンス阻害について試験した。
処理

【1181】

６週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、２、７、もしくは２０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ番号４４０７６２；または０．２、０．６、２、６、もしくは２０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ番号６８６２２１、６８６２２２、もしくは７０８５６１；または生理食塩水を１回皮下注入した。各処理群は、４匹の動物からなった。最終投与の７２時間後にマウスを屠殺した。リアルタイムＰＣＲを用いて、肝臓におけるＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを測定した。標準のプロトコルに従って、ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルをシクロフィリンｍＲＮＡレベルに対して正規化した。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、用量依存的様式でＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを低下させ、ＥＤ_５０結果が、表１１６及び１１７に提示される。以前の研究において、三価ＧａｌＮＡｃ共役オリゴヌクレオチドが二価ＧａｌＮＡｃ共役オリゴヌクレオチドよりも著しく強力であり、これは、次いで、一価ＧａｌＮＡｃ共役オリゴヌクレオチドよりも著しく強力であったことが示されたが（例えば、Ｋｈｏｒｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１６，５２１６−５２３１（２００８）を参照のこと）、表１１６及び１１７に示されるように、一価、二価、及び三価ＧａｌＮＡｃクラスターを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、同様の力価でＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを低下させた。

【1182】

【表104】

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表の説明文については、実施例９３を参照されたい。ＧａｌＮＡｃ_３−１３ａの構造は、実施例６２に示し、ＧａｌＮＡｃ_２−２４ａの構造は、実施例１０４に示した。

【1183】

【表105】

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表の説明文については、実施例９３を参照されたい。ＧａｌＮＡｃ_１−２５ａの構造は、実施例１０５に示した。

【1184】

実施例７５に記載される手順を用いて、表１１６及び１１７における肝臓中のオリゴヌクレオチドの濃度も評価した。以下の表１１７ａ及び１１７ｂに示される結果は、肝臓組織のオリゴヌクレオチド（μｇ）／ｇ単位のＵＶによって測定された各処理群の平均総アンチセンスオリゴヌクレオチド組織レベルである。結果は、ＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチドがＧａｌＮＡｃ共役基を欠く同一の用量のオリゴヌクレオチドよりも著しく高いレベルで肝臓に蓄積したことを示す。さらに、それらのそれぞれの共役基に１、２、または３個のＧａｌＮＡｃリガンドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドはすべて同様のレベルで肝臓に蓄積した。上記のＫｈｏｒｅｖ ｅｔ ａｌ．の文献参照を考慮すると、これは意外な結果であり、上の表１１６及び１１７に示される活性データと一致する。

【1185】

【表106】

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【1186】

実施例１０７：ＧａｌＮＡｃ_１−２６またはＧａｌＮＡｃ_１−２７共役体を含むオリゴヌクレオチドの合成

【1187】

【化245】

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ＤＭＦ中ＨＢＴＵ及びＤＩＥＡを用いて、オリゴヌクレオチド２３９を化合物４７（実施例１５を参照のこと）と酸６４（実施例３２を参照のこと）とのカップリングによって合成する。結果として生じたアミド含有化合物をホスフィチル化し、その後、実施例１０に記載される手順を用いて、オリゴヌクレオチドの５’末端に付加する。共役基ＧａｌＮＡｃ_１−２６のＧａｌＮＡｃ_１クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_１−２６_ａ）をオリゴヌクレオチド上に存在する任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。ＧａｌＮＡｃ_１−２６（ＧａｌＮＡｃ_１−２６_ａ−ＣＭ）の構造は、以下に示される：

【1188】

【化246】

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【1189】

ＧａｌＮＡｃ_１共役基をオリゴヌクレオチドの３’末端に付加するために、実施例７に記載される手順を用いて、化合物４７と６４の反応から形成されたアミドを固体支持体に付加する。その後、実施例９に記載される手順を用いて、オリゴヌクレオチド合成を完了して、オリゴヌクレオチド２４０を形成する。

【1190】

【化247】

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共役基ＧａｌＮＡｃ_１−２７のＧａｌＮＡｃ_１クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_１−２７_ａ）をオリゴヌクレオチド上に存在する任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。ＧａｌＮＡｃ_１−２７（ＧａｌＮＡｃ_１−２７_ａ−ＣＭ）の構造は、以下に示される：

【1191】

【化248】

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【1192】

実施例１０８：生体内におけるＡｐｏ（ａ）を標的とするＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害
以下の表１１８に列記されるオリゴヌクレオチドを、マウスにおける単回投与試験において試験した。

【1193】

【表107】

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ＧａｌＮＡｃ_３−７_ａの構造は、実施例４８に示される。

【1194】

処理
ヒトＡｐｏ（ａ）を発現する雄トランスジェニックマウスのそれぞれに、表１１９に列記されるオリゴヌクレオチド及び投与量またはＰＢＳを１回皮下注入した。各処理群は、４匹の動物からなった。投薬の前日に血液を採取して、血漿中のＡｐｏ（ａ）タンパク質のベースラインレベル及び第１の投与後の１週間時点のレベルを決定した。週１回約８週間、さらに血液を採取する。ＥＬＩＳＡを用いて血漿Ａｐｏ（ａ）タンパク質レベルを測定した。表１１９における結果は、ベースラインレベル（％ＢＬ）に対して正規化された各処理群の血漿Ａｐｏ（ａ）タンパク質レベルの平均パーセントとして提示され、結果は、アンチセンスオリゴヌクレオチドがＡｐｏ（ａ）タンパク質の発現を低下させたことを示す。さらに、ＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチドは、共役基を含まないオリゴヌクレオチドよりもさらに強力なＡｐｏ（ａ）発現の減少を示した。

【1195】

【表108】

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【1196】

実施例１０９：ＧａｌＮＡｃ_１−２８またはＧａｌＮＡｃ_１−２９共役体を含むオリゴヌクレオチドの合成

【1197】

【化249】

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オリゴヌクレオチド２４１を実施例７１に記載される手順と同様の手順を用いて合成して、ホスホラミダイト中間体を形成し、続いて、実施例１０に記載される手順を用いてオリゴヌクレオチドを合成する。共役基ＧａｌＮＡｃ_１−２８のＧａｌＮＡｃ_１クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_１−２８_ａ）をオリゴヌクレオチド上に存在する任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。ＧａｌＮＡｃ_１−２８（ＧａｌＮＡｃ_１−２８_ａ−ＣＭ）の構造は、以下に示される：

【1198】

【化250】

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【1199】

ＧａｌＮＡｃ_１共役基をオリゴヌクレオチドの３’末端に付加するために、実施例７１に記載される手順と同様の手順を用いてヒドロキシル中間体を形成し、その後、実施例７に記載される手順を用いてこれを固体支持体に付加する。その後、実施例９に記載される手順を用いてオリゴヌクレオチド合成を完了させて、オリゴヌクレオチド２４２を形成する。

【1200】

【化251】

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共役基ＧａｌＮＡｃ_１−２９のＧａｌＮＡｃ_１クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_１−２９_ａ）をオリゴヌクレオチド上に存在する任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。ＧａｌＮＡｃ_１−２９（ＧａｌＮＡｃ_１−２９_ａ−ＣＭ）の構造は、以下に示される：

【1201】

【化252】

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【1202】

実施例１１０：ＧａｌＮＡｃ_１−３０共役体を含むオリゴヌクレオチドの合成

【1203】

【化253】

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ＧａｌＮＡｃ_１−３０共役基を含むオリゴヌクレオチド２４６（式中、Ｙが、Ｏ、Ｓ、置換もしくは無置換Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル、アミノ、置換アミノ、アジド、アルケニル、またはアルキニルから選択される）を上に示されるように合成する。共役基ＧａｌＮＡｃ_１−３０のＧａｌＮＡｃ_１クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_１−３０_ａ）を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。ある特定の実施形態において、Ｙは、切断可能部分の一部である。ある特定の実施形態において、Ｙは、安定した部分の一部であり、切断可能部分は、オリゴヌクレオチド上に存在する。ＧａｌＮＡｃ_１−３０_ａの構造は、以下に示される：

【1204】

【化254】

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【1205】

実施例１１１：ＧａｌＮＡｃ_２−３１またはＧａｌＮＡｃ_２−３２共役体を含むオリゴヌクレオチドの合成

【1206】

【化255】

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【1207】

【化256】

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ＧａｌＮＡｃ_２−３１共役基を含むオリゴヌクレオチド２５０（式中、Ｙが、Ｏ、Ｓ、置換もしくは無置換Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル、アミノ、置換アミノ、アジド、アルケニル、またはアルキニルから選択される）を上に示されるように合成する。共役基ＧａｌＮＡｃ_２−３１のＧａｌＮＡｃ_２クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_２−３１_ａ）を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドの５’末端に直接隣接したＹ含有基は、切断可能部分の一部である。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドの５’末端に直接隣接したＹ含有基は、安定した部分の一部であり、切断可能部分は、オリゴヌクレオチド上に存在する。ＧａｌＮＡｃ_２−３１_ａの構造は、以下に示される：

【1208】

【化257】

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【1209】

ＧａｌＮＡｃ_２−３２共役体を含むオリゴヌクレオチドの合成は、以下に示される。

【1210】

【化258】

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【1211】

ＧａｌＮＡｃ_２−３２共役基を含むオリゴヌクレオチド２５２（式中、Ｙが、Ｏ、Ｓ、置換もしくは無置換Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル、アミノ、置換アミノ、アジド、アルケニル、またはアルキニルから選択される）を上に示されるように合成する。共役基ＧａｌＮＡｃ_２−３２のＧａｌＮＡｃ_２クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ_２−３２_ａ）を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドの５’末端に直接隣接したＹ含有基は、切断可能部分の一部である。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドの５’末端に直接隣接したＹ含有基は、安定した部分の一部であり、切断可能部分は、オリゴヌクレオチド上に存在する。ＧａｌＮＡｃ_２−３２_ａの構造は、以下に示される：

【1212】

【化259】

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【1213】

実施例１１２：ＧａｌＮＡｃ_１共役体を含む修飾オリゴヌクレオチド
ＳＲＢ−１を標的とする表１２０のオリゴヌクレオチドをＧａｌＮＡｃ_１共役基で合成して、ＧａｌＮＡｃリガンドを含有する共役基を含むオリゴヌクレオチドの力価をさらに試験した。

【1214】

【表109-1】

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【1215】

【表109-2】

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【1216】

実施例１１３：ＧａｌＮＡｃクラスターを含むカリクレインＢ、血漿（フレッチャー因子）１を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド
表１２１のオリゴヌクレオチドは、ヒトカリクレインＢ、血漿（フレッチャー因子）１またはプレカリクレイン（ＰＫＫ）を標的とするように設計した。

【1217】

【表110】

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【1218】

実施例１１４：２’−ＭＯＥ糖修飾を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドによるＨｅｐａＲＧ（商標）細胞中のヒトＰＫＫのアンチセンス阻害
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＫＫを標的とするように設計し、ＰＫＫ ｍＲＮＡに対する効果についてｉｎ ｖｉｔｒｏ試験を実施した。ＨｅｐａＲＧ（商標）細胞は、ヒト肝前駆細胞株由来の分化された肝細胞であり、初代ヒト肝細胞の特性を保持しており（Ｌｕｂｂｅｒｓｔｅｄｔ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１１ ６３： ５９−６８）、スクリーン中で使用した。

【1219】

以下の表に示すキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−１０−５ＭＯＥギャップマーとして設計された。これらのギャップマーは２０ヌクレシオド長であり、中央のギャップセグメントは１０個の２’−デオキシヌレドで構成され、５’側と３’側にそれぞれ５個のヌクレオシドを含むウイングセグメントが隣接している。５’ウイングセグメント中の各ヌクレオシドと３’ウイングセグメント中の各ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を有する。ヌクレオシド間連結部は、各ギャップマーの全体を通して、ホスホロチオエート連結部である。シトシン残基は、各ギャップマーの全体を通してすべて、５−メチルシトシンである。「開始部位」とは、ヒト遺伝子配列中で当該ギャップマーの標的になる最も５’側のヌクレオシドを示す。「終止部位」とは、ヒト遺伝子配列中で当該ギャップマーの標的になる最も３’側のヌクレオシドを示す。以下の表に示す各ギャップマーは、本明細書で配列番号１として設計したヒトＰＫＫ ｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＮＭ＿０００８９２．３）もしくは本明細書で配列番号１０として設計したヒトＰＫＫゲノム配列（ヌクレオチド１１１６９３００１から１１１７３００００まで切り捨てられたＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＮＴ＿０１６３５４．１９）のいずれかを標的とする。「該当なし」は、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドが当該特定の遺伝子配列を標的としないことを示す。

【1220】

ウェルあたり２０，０００細胞の密度で培養されたＨｅｐａＲＧ（商標）細胞は、エレクトロポレーションを用いて３，０００ ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約２４時間の処理時間経過後に、ＲＮＡを細胞から単離し、ＰＫＫ ｍＲＮＡレベルを、定量的リアルタイムＰＣＲにより測定した。ヒトプライマープローブセットＲＴＳ３４５４（配列番号２０として本明細書で設計した順方向配列ＣＣＡＡＡＡＡＡＧＧＴＧＣＡＣＣＡＧＴＡＡＣＡ、配列番号２１として本明細書で設計した逆方向配列ＣＣＴＣＣＧＧＧＡＣＴＧＴＡＣＴＴＴＡＡＴＡＧＧ、配列番号２２として本明細書で設計したプローブ配列 ＣＡＣＧＣＡＡＡＣＡＴＴＴＣＡＣＡＡＧＧＣＡＧＡＧＴＡＣＣ）を使用してｍＲＮＡレベルを測定した。ＰＫＫ ｍＲＮＡレベルは、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定される総ＲＮＡ含量に従って調整した。同様の培養条件を有していた一連の実験で、アンチセンスオリゴヌクレオチドの試験を実施した。各実験の結果は、以下に示す別のテーブルで表す。結果は、未処理の対照細胞と比較して、ＰＫＫの阻害パーセントとして表す。

【1221】

【表111-1】

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【1222】

【表111-2】

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【1223】

【表111-3】

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【1224】

【表112-1】

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【1225】

【表112-2】

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【1226】

【表112-3】

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【1227】

【表113-1】

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【1228】

【表113-2】

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【1229】

【表113-3】

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【1230】

【表113-4】

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【1231】

【表113-5】

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【1232】

【表113-6】

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【1233】

【表113-7】

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【1234】

【表113-8】

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【1235】

【表113-9】

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【1236】

【表114-1】

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【1237】

【表114-2】

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【1238】

【表114-3】

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【1239】

【表114-4】

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【1240】

【表114-5】

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【1241】

【表114-6】

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【1242】

【表114-7】

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【1243】

【表114-8】

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【1244】

【表114-9】

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【1245】

【表114-10】

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【1246】

【表114-11】

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【1247】

実施例１１５：２’−ＭＯＥ糖修飾を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドによるＨｅｐａＲＧ（商標）細胞中のヒトＰＫＫのアンチセンス阻害
追加のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＫＫ核酸を標的とするように設計し、ＰＫＫ ｍＲＮＡに対する効果についてｉｎ ｖｉｔｒｏ試験を実施した。

【1248】

以下の表のキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−１０−５ＭＯＥギャップマー、４−９−４ＭＯＥギャップマー、４−１０−４ＭＯＥギャップマー、４−１０−３ＭＯＥギャップマー、３−１０−４ＭＯＥギャップマー、または３−１０−３ＭＯＥギャップマーとして設計した。５−１０−５ＭＯＥギャップマーは、２０ヌクレシオド長であり、中央のギャップセグメントは１０個の２’−デオキシヌレドで構成され、中央のギャップセグメントは１０個の２’−デオキシヌクレオシドで構成され、５’側と３’側にそれぞれ５個のヌクレオシドを含むウイングセグメントが隣接している。４−９−４ＭＯＥギャップマーは、１７ヌクレシオド長であり、中央のギャップセグメントは９個の２’−デオキシヌレドで構成され、５’側と３’側にそれぞれ４個のヌクレオシドを含むウイングセグメントが隣接している。４−１０−４ＭＯＥギャップマーは、１８ヌクレシオド長であり、中央のギャップセグメントは１０個の２’−デオキシヌレドで構成され、５’側と３’側にそれぞれ４個のヌクレオシドを含むウイングセグメントが隣接している。４−１０−３ＭＯＥギャップマーは、１７ヌクレシオド長であり、中央のギャップセグメントは１０個の２’−デオキシヌレドで構成され、５’側と３’側にそれぞれ４個と３個のヌクレオシドを含むウイングセグメントが隣接している。３−１０−４ＭＯＥギャップマーは、１７ヌクレシオド長であり、中央のギャップセグメントは１０個の２’−デオキシヌレドで構成され、５’側にウイングセグメントが隣接しており、３’側にそれぞれ４個と３個のヌクレオシドを含む。３−１０−３ＭＯＥギャップマーは、１６ヌクレシオド長であり、中央のギャップセグメントは１０個の２’−デオキシヌレドで構成され、５’側と３’側にそれぞれ３個のヌクレオシドを含むウイングセグメントが隣接している。５’ウイングセグメント中の各ヌクレオシドと３’ウイングセグメント中の各ヌクレオシドは２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を有する。ヌクレオシド間連結部は、各ギャップマーの全体を通して、ホスホロチオエート連結部である。シトシン残基は、各ギャップマーの全体を通してすべて、５−メチルシトシンである。「開始部位」とは、ヒト遺伝子配列中で当該ギャップマーの標的になる最も５’側のヌクレオシドを示す。「終止部位」とは、ヒト遺伝子配列中で当該ギャップマーの標的になる最も３’側のヌクレオシドを示す。以下の表に示す各ギャップマーは、配列番号１または配列１０のいずれかを標的とする。「該当なし」は、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドが当該特定の遺伝子配列を標的としないことを示す。

【1249】

ウェルあたり２０，０００個の細胞密度の培養されたＨｅｐａＲＧ（商標）は、５，０００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドを有するエレクトロポレーションを用いてトランスフェクトした。約２４時間処理を行った後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＰＫＫ ｍＲＮＡレベルと定量的リアルタイムＰＣＲによって測定した。ヒトプライマープローブセットＲＴＳ３４５４を使用してｍＲＮＡレベルを測定した。ＰＫＫ ｍＲＮＡレベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定する総ＲＮＡ含量に従って調整した。同様の培養条件を有する一連の実験でアンチセンスオリゴヌクレオチドの試験を行った。各実験の結果は、以下に示す別個の表に表す。結果は、未処理の対照細胞に対するＰＫＫの阻害率（％）として表す。

【1250】

【表115-1】

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【1251】

【表115-2】

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【1252】

【表115-3】

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【1253】

【表116-1】

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【1254】

【表116-2】

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【1255】

【表116-3】

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【1256】

【表116-4】

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【1257】

【表116-7】

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【1258】

【表116-8】

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【1259】

【表117-1】

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【1260】

【表117-2】

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【1261】

【表117-3】

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【1262】

【表118-1】

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【1263】

【表118-2】

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【1264】

【表118-3】

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【1265】

【表119-1】

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【1266】

【表119-2】

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【1267】

【表119-3】

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【1268】

【表120-1】

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【1269】

【表120-2】

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【1270】

【表120-3】

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【1271】

【表121-1】

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【1272】

【表121-2】

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【1273】

【表121-3】

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【1274】

【表122-1】

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【1275】

【表122-2】

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【1276】

【表122-3】

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【表122-4】

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【1278】

【表122-5】

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【1280】

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【表122-8】

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【1288】

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【1289】

【表123-8】

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【1290】

【表123-9】

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【1291】

【表123-10】

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【1292】

【表123-11】

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【表123-12】

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【1294】

【表123-13】

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【1295】

【表123-14】

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【1296】

【表123-15】

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【1297】

【表124-1】

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【1298】

【表124-2】

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【1299】

【表124-3】

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【1300】

【表124-4】

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【1301】

【表124-5】

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【1302】

【表124-6】

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【1303】

【表124-7】

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【1304】

【表124-8】

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【1305】

【表124-9】

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【1306】

【表124-10】

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【1307】

【表124-11】

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【1308】

【表125-1】

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【1309】

【表125-2】

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【1310】

【表125-3】

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【1311】

【表125-4】

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【1312】

【表126-1】

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【1313】

【表126-2】

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【1314】

【表126-3】

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【1315】

【表126-4】

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【1316】

【表126-5】

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【1317】

【表126-6】

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【1318】

【表126-7】

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【1319】

【表126-8】

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【1320】

【表126-9】

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【1321】

【表126-10】

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【1322】

【表126-11】

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【1323】

【表126-12】

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【1324】

【表126-13】

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【1325】

【表126-14】

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【1326】

【表126-15】

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【1327】

【表126-16】

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【1328】

【表126-17】

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【1329】

【表126-18】

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【1330】

【表126-19】

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【1331】

【表126-20】

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【1332】

【表126-21】

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【1333】

【表126-22】

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【1334】

【表126-23】

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【1335】

【表126-24】

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【1336】

【表126-25】

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【1337】

【表126-26】

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【1338】

【表126-27】

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【1339】

【表126-28】

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【1340】

【表126-29】

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【1341】

実施例１１６：ＭＯＥ、デオキシ及びｃＥｔ糖修飾を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドによるＨｅｐａＲＧ（商標）細胞中のヒトＰＫＫのアンチセンス阻害
追加のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＫＫ核酸を標的にするように設計し、ＰＫＫ ｍＲＮＡに対する効果についてｉｎ ｖｉｔｒｏ試験を行った。

【1342】

以下の表のキメラのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、デオキシ、ＭＯＥ及びｃＥｔギャップマーとして設計した。ギャップマーは長さが１６ヌクレオチドであり、そのヌクレオチドはＭＯＥ糖修飾、ｃＥｔ糖修飾、またはデオキシ修飾のいずれかを有する。列「化学構造」は、各オリゴヌクレオチドの糖修飾を記載している。「ｋ」はｃＥｔ糖修飾を示し、その数はデオキシヌクレオシドの数を示し、そうでなければ、「ｄ」はデオキシヌクレオシドを示し、「ｅ」は２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を示す。各ギャップマー全体のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。各オリゴヌクレオチド全体のすべてのシトシン残基は、５−メチルシトシンである。「開始部位」とは、ヒト遺伝子配列中で当該ギャップマーの標的となる最も５’側のヌクレオシドを示す。「終止部位」とは、ヒト遺伝子配列中で当該ギャップマーの標的となる最も３’側のヌクレオシドを示す。以下の表に示す各ギャップマーは、配列番号１として本明細書で設計したヒトＰＫＫ ｍＲＮＡ、または配列番号１０として本明細書で設計したヒトＰＫＫ遺伝子配列のいずれかを標的とする。「該当なし」は、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、当該特定の遺伝子配列を標的としないことを示す。

【1343】

ウェルあたり２０，０００個の細胞密度の培養されたＨｅｐａＲＧ（商標）に、１，０００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、エレクトロポレーションを用いてトランスフェクトした。約２４時間処理を行った後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＰＫＫ ｍＲＮＡレベルを定量的リアルタイムＰＣＲによって測定した。ヒトプライマープローブセットＲＴＳ３４５４を使用してｍＲＮＡレベルを測定した。ＩＳＩＳ ５３１２３１もこのアッセイに含めた。ＰＫＫ ｍＲＮＡレベルを、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定する総ＲＮＡ含量に従って調整した。同様の培養条件を有する一連の実験でアンチセンスオリゴヌクレオチドの試験を行った。各実験の結果は、以下に示す別個の表に表す。結果は、未処理の対照細胞に対するＰＫＫの阻害率（％）として表す。

【1344】

【表127-1】

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【1345】

【表127-2】

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【1346】

【表127-3】

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【表128-1】

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【表136-5】

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【1390】

【表137-1】

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【1392】

【表137-3】

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【1393】

【表137-4】

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【1398】

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【1400】

【表138-5】

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【1401】

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【1403】

【表138-8】

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【表138-9】

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【表138-10】

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【表139-1】

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【1409】

【表139-3】

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【1410】

【表139-4】

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【1411】

【表139-5】

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【1412】

実施例１１７：ＨｅｐａＲＧ（商標）細胞中のヒトＰＫＫの用量依存的アンチセンス阻害
ＰＫＫ ｍＲＮＡの有意なｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害を表す上記の試験からギャップマーを選択し、ＨｅｐａＲＧ（商標）細胞中で、様々な用量で試験を行った。ウェルあたり２０，０００個の細胞密度で細胞を播種し、０．１２μＭ、０．３７μＭ、１．１１μＭ、３．３３μＭ及び１０．００μＭの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、エレクトロポレーションを用いてトランスフェクトした。約１６時間処理を行った後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＰＫＫ ｍＲＮＡレベルを定量的リアルタイムＰＣＲで測定した。ヒトＰＫＫプライマープローブセットＲＴＳ３４５４を使用して、ｍＲＮＡレベルを測定した。ＰＫＫ ｍＲＮＡレベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定したときの総ＲＮＡ含量に従って調整した。同様の培養条件を有する一連の実験で、アンチセンスオリゴヌクレオチドの試験を行った。各実験の結果は、以下に示す別個の表に表す。結果は、未処理の対照細胞に対するＰＫＫの阻害率（％）として表す。

【1413】

各オリゴヌクレオチドの半数阻害濃度（ＩＣ_５０）も表す。ＰＫＫ ｍＲＮＡレベルは、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した細胞で、用量依存的に有意に減少した。

【1414】

【表140】

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【1415】

【表141】

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【1416】

実施例１１８：ＨｅｐａＲＧ（商標）細胞中のヒトＰＫＫの用量依存的アンチセンス阻害
ＰＫＫ ｍＲＮＡの有意なｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害を表す上記の試験からギャップマーを選択し、ＨｅｐａＲＧ（商標）細胞中で、様々な用量で試験を行った。ウェルあたり２０，０００個の細胞密度で細胞を播種し、０．１９μＭ、０．５６μＭ、１．６７μＭ、及び５．００μＭの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、エレクトロポレーションを用いてトランスフェクトした。約１６時間処理を行った後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＰＫＫ ｍＲＮＡレベルを定量的リアルタイムＰＣＲで測定した。ヒトＰＫＫプライマープローブセットＲＴＳ３４５４を使用して、ｍＲＮＡレベルを測定した。ＰＫＫ ｍＲＮＡレベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定したときの総ＲＮＡ含量に従って調整した。同様の培養条件を有する一連の実験で、アンチセンスオリゴヌクレオチドの試験を行った。各実験の結果は、以下に示す別個の表に表す。結果は、未処理の対照細胞に対するＰＫＫの阻害率（％）として表す。「該当なし」は、特定の用量の特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドについて、測定を実施しなかったことを示す。

【1417】

各オリゴヌクレオチドの半数阻害濃度（ＩＣ_５０）も表す。ＰＫＫ ｍＲＮＡレベルは、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した細胞で、用量依存的に有意に減少した。

【1418】

【表142】

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【1419】

【表143】

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【1420】

【表144】

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【1421】

【表145-1】

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【1422】

【表145-2】

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【1423】

【表146】

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【1424】

【表147】

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【1425】

【表148】

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【1426】

【表149】

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【1427】

【表150】

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【1428】

実施例１１９：ＨｅｐａＲＧ（商標）細胞中のヒトＰＫＫの用量依存的アンチセンス阻害
ＰＫＫ ｍＲＮＡの有意なｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害を表す上記の試験のギャップマーを選択し、ＨｅｐａＲＧ（商標）細胞中で様々な用量で試験を行った。ウェルあたり２０，０００個の細胞密度で細胞を播種し、０．１１μＭ、０．３３μＭ、１．００μＭ、及び３．００μＭの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、エレクトロポレーションを用いてトランスフェクトした。約１６時間処理を行った後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＰＫＫ ｍＲＮＡレベルを定量的リアルタイムＰＣＲで測定した。ヒトＰＫＫプライマープローブセットＲＴＳ３４５４を使用して、ｍＲＮＡレベルを測定した。ＰＫＫ ｍＲＮＡレベルを、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定したときの総ＲＮＡ含量に従って調整した。同様の培養条件を有する一連の実験でアンチセンスオリゴヌクレオチドの試験を行った。各実験の結果は、以下に示す別個の表に表す。結果は、未処理の対照細胞に対するＰＫＫの阻害率（％）として表す。「該当なし」は、特定の用量の特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドについて、測定を実施しなかったことを示す。

【1429】

各オリゴヌクレオチドの半数阻害濃度（ＩＣ_５０）も表す。ＰＫＫ ｍＲＮＡレベルは、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した細胞で、用量依存的に有意に減少した。

【1430】

【表151】

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【1431】

【表152】

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【1432】

【表153】

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【1433】

【表154】

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【1434】

実施例１２０：トランスジェニックマウスにおけるヒトＰＫＫを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性
ヒトＫＬＫＢ１遺伝子配列の３７，３９０塩基対フラグメント（染色体４：位置１８７１４８６７２−１８７１７９６２５、寄託番号：ＮＣ＿０００００４．１１）を含むトランスジェニックマウスは、上述の試験から選択したＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置を行い、このモデルにおける有効性を評価した。

【1435】

処置
トランスジェニックマウスの群に、ＩＳＩＳ ５４６２３２、ＩＳＩＳ ５４６２５１、ＩＳＩＳ ５４６２５４、ＩＳＩＳ ５４６３４３、ＩＳＩＳ ５４６８２８、ＩＳＩＳ ５４７４５５、ＩＳＩＳ ５４７４５７、ＩＳＩＳ ５４７９２７、及びＩＳＩＳ ５４８０４８を、２．５ｍｇ／ｋｇ／週、５．０ｍｇ／ｋｇ／週、１０ｍｇ／ｋｇ／週または２０ｍｇ／ｋｇ／週で、３週間週に２回、皮下注射した。トランスジェニックマウスの１つの群には、ＰＢＳを３週間皮下注射した。最後の投与から４８時間後にマウスを安楽死させ、次の分析のために臓器及び血漿を採取した。

【1436】

ＲＮＡ分析
ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの標的の減少への効果を評価するために、ヒトＰＫＫのリアルタイムＰＣＲ分析のために、ＲＮＡを肝組織から抽出した。結果は、ＰＢＳ対照に対するＰＫＫ ｍＲＮＡの阻害率（％）として表す。表１６９に示すように、ＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理は、ＰＢＳ対照に比べ、ＰＫＫ ｍＲＮＡが有意に減少した。

【1437】

【表155】

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【1438】

タンパク質の分析
すべての群で血漿ＰＫＫタンパク質レベルを評価した。結果は、ＰＢＳ対照に対するＰＫＫタンパク質の阻害率（％）として表す。表１７０に示すように、ＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理は、ＰＢＳ対照に比べて、ＰＫＫタンパク質レベルが有意に減少した。

【1439】

【表156】

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【1440】

実施例１２１：カニクイザルにおけるヒトＰＫＫを標的とするＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果
上述の試験から選択したＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドで、カニクイザルに処置を行った。アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性と耐容性を評価した。試験対象のヒトアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アカゲザルのゲノム配列（ヌクレオチド２３５８０００〜２３９１０００を切り捨てられ、配列番号１８として本明細書で示されたＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＮＷ＿００１１１８１６７．１）と交差反応性であった。配列番号１８に対する各オリゴヌクレオチドの標的開始部位を、表１７１に表す。「ミスマッチ」は、オリゴヌクレオチドがアカゲザルの配列とミスマッチするヌクレオチドの数を示している。ヒトオリゴヌクレオチドとアカゲザルの配列との間の相補性が大きいほど、ヒトオリゴヌクレオチドがアカゲザルの配列と交差反応する可能性が大きい。「該当なし」は、オリゴヌクレオチドが、アカゲザルの配列と３つより多いミスマッチがあることを示している。

【1441】

【表157】

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【1442】

処置
試験を実施する前に、サルを３０日間隔離し、その間に健康全般を毎日観察した。サルは２〜４歳で、体重は２〜４ｋｇであった。４匹のランダムに割り付けられた雄のカニクイザルの１０の群に、ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳを皮下注射した。試験の第１週に４つの用量からなる投与計画（ｌｏａｄｉｎｇ ｒｅｇｉｍｅｎ）（１、３、５、７日目）で、４０ｍｇ／ｋｇの用量のＰＢＳ溶液またはＩＳＩＳオリゴヌクレオチドを最初に投与し、次に１４日目（２〜１３週）に、週に１回の維持投与計画（ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｒｅｇｉｍｅｎ）を開始した。背中の４部位に時計回りに、１用量につき１部位、皮下注射を行った。注射部位は、ケタミンで鎮静させながら、いれずみで印をつけ、最小３ｃｍの間隔を置いた。

【1443】

試験期間中、サルの病気または苦痛の兆候を最小１日１回観察した。処置、外傷または病気によるわずかな痛みまたは苦痛を示したサルは、すぐに担当の獣医師と試験責任者に報告した。健康状態が良くないサルや瀕死の状態のサルは、さらなるモニタリングと可能な安楽死をすることにした。例えば、ＩＳＩＳ ５４７４４５で処理した２匹のサルは、物静かな行動、側臥位、刺激に対する反応の喪失、呼吸の減少があったために安楽死させた。実施例に記述のプロトコルは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ （ＩＡＣＵＣ）によって承認された。

【1444】

標的の減少
ＲＮＡ分析
８７または８８日目、最後の投与から４８時間後に、プライマープローブセットＲＴＳ３４５５（配列番号２３として本明細書で設計した順方向配列ＣＣＴＧＴＧＴＧＧＡＧＧＧＴＣＡＣＴＣＡ、配列番号２４として本明細書で設計した逆方向配列ＣＣＡＣＴＡＴＡＧＡＴＧＣＧＣＣＡＡＡＣＡＴＣ、配列番号２５として本明細書で設計したプローブ配列ＣＣＣＡＣＴＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＣＴＴＣＣＣ）を使用して、ＰＫＫのリアルタイムＰＣＲ分析のために、ＲＮＡを肝組織から抽出した。得られたものはハウスキーピング遺伝子シクロフィリンに正規化した。結果をＰＢＳ対照に対するＰＫＫ ｍＲＮＡの阻害率（％）として表す。表１７２に示すように、ＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドでの処置によって、ＰＢＳ対照に比べて、ＰＫＫ ｍＲＮＡが有意に減少した。

【1445】

【表158】

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【1446】

タンパク質分析
約０．９ｍＬの血液を、投与前、１７日目、３１日目、４５日目、５９日目、７３日目の各時間に、すべての対象動物から採取し、３．２％のクエン酸ナトリウムを含む管に置いた。管を遠心分離（室温で１０分間３０００回転）にかけ、血漿を得た。血漿中のＰＫＫタンパク質レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。結果は表１７３に表し、ＰＢＳ対照レベルと比較した阻害率（％）として表した。結果は、ＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドがＰＫＫタンパク質レベルを有意に減少させたことを示す。

【1447】

【表159】

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【1448】

耐容性試験
肝機能
ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの肝機能への影響を評価するために、サルを一晩絶食にした。約１．５ｍＬの血液試料を全試験群から採取した。血液は、血漿を分離するために抗凝固剤のない管に集めた。管を最短９０分間室温に保管し、その後１０分間、３，０００回転で遠心分離にかけた。様々な肝機能マーカーのレベルをＴｏｓｈｉｂａ １２０ＦＲ ＮＥＯ化学分析器（Ｔｏｓｈｉｂａ Ｃｏ．， Ｊａｐａｎ）を用いて測定した。結果は表１７４に表し、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの予測の範囲を超えて、肝機能に影響することはなかった。

【1449】

【表160】

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【1450】

血液学
カニクイザルの体内のＩＳＩＳオリゴヌクレオチドが血液学的数値に及ぼす影響を評価するために、約１．２ｍＬの血液試料を、投与前、８７日目または８８日目に、試験対象の動物それぞれから採取し、Ｋ_２−ＥＤＴＡを含む管に保管した。試料は、赤血球細胞（ＲＢＣ）数、白血球細胞（ＷＢＣ）数、血小板数、ヘモグロビン含有量、ヘマトクリットについて、ＡＤＶＩＡ２１２０ｉ血液学的検査器（ＳＩＥＭＥＮＳ、ＵＳＡ）を用いて分析した。分析データを表１７５に表す。

【1451】

データによると、この投与では、オリゴヌクレオチドの大部分が、アンチセンスオリゴヌクレオチドの予測の範囲を超えて、血液学的数値に変化を及ぼさなかった。

【1452】

【表161】

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【1453】

腎機能
ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの腎機能に及ぼす影響を評価するために、サルを一晩絶食にした。約１．５ｍＬの血液試料を全試験群から採取した。血液は、血漿を分離するために、抗凝固剤のない管に集めた。管を最短９０分間室温に保管し、１０分間、３，０００回転の遠心分離にかけた。Ｔｏｓｈｉｂａ １２０ＦＲ ＮＥＯ化学分析器（Ｔｏｓｈｉｂａ Ｃｏ．， Ｊａｐａｎ）を使用して、ＢＵＮとクレアチニンのレベルを測定した。結果はｍｇ／ｄＬの単位で表１７６に表した。血漿の化学データによると、ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの大部分が、アンチセンスオリゴヌクレオチドの予測の範囲を超えて、腎機能に影響を及ぼさなかった。特に、ＩＳＩＳ ５４６２５４による処理は、サルの腎機能に関して良好な耐容性であった。

【1454】

尿検査によっても腎機能を評価した。新鮮な尿を湿った氷の上の清潔なケージパン（ｃａｇｅ ｐａｎ）を使用して、すべての動物から採取した。新鮮な尿を集める前に、一晩食べ物を与えず、水だけを与えた。Ｔｏｓｈｉｂａ １２０ＦＲ ＮＥＯ 自動化学分析器（Ｔｏｓｈｉｂａ Ｃｏ．， Ｊａｐａｎ）を用いて、総タンパク質レベルとクレアチニンレベルを測定し、クレアチニンに対するタンパク質の比を計算した。その結果を表１７７に表す。

【1455】

【表162】

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【1456】

【表163】

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【1457】

Ｃ反応性タンパク質レベルの分析
カニクイザルのＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの炎症効果を評価するために、サルを一晩絶食にした。約１．５ｍＬの血液試料を全試験群から採取した。血液は、血漿を分離するために抗凝固剤のない管に集めた。管を最短９０分間室温に保管し、１０分間、３，０００回転で遠心分離にかけた。Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）は、肝臓で合成され、炎症のマーカーとして使用され、Ｔｏｓｈｉｂａ １２０ＦＲ ＮＥＯ化学分析器（Ｔｏｓｈｉｂａ Ｃｏ．， Ｊａｐａｎ）を使用して測定した。相補的Ｃ３も同様に測定し、データはベースライン値の割合として表す。結果は表１７８に表し、ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドによる処理が、サルに炎症を引き起こさなかったことを示している。

【1458】

【表164】

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【1459】

実施例１２２：マウス初代培養肝細胞中のマウスＰＫＫ ｍＲＮＡのアンチセンス阻害
マウスＰＫＫ核酸を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、ＰＫＫ ｍＲＮＡに及ぼす効果についてｉｎ ｖｉｔｒｏ試験を行った。ウェルあたり１０，０００細胞の密度で培養されたマウスの初代培養肝細胞に、サイトフェクチン試薬を使用して、１２．５ｎＭ、２５．０ｎＭ、５０．０ｎＭ、１００．０ｎＭ、及び２００．０ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。約２４時間の処理を行った後、ＲＮＡを細胞から単離し、マウスＰＫＫ ｍＲＮＡレベルを、マウスプライマープローブセットＲＴＳ３３１３（配列番号２２２８として本明細書で設計した順方向配列ＴＧＣＣＴＧＣＴＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＣＴＣ、配列番号２２２９として本明細書で設計した逆方向配列ＴＧＧＣＡＡＡＧＴＣＣＣＴＧＴＡＡＴＧＣＴ、配列番号２２３０として本明細書で設計したプローブ配列ＣＧＴＧＡＣＴＣＣＡＣＣＣＡＡＡＧＡＧＡＣＡＡＡＴＡＡＡＣＧ）を用いて、定量的リアルタイムＰＣＲによって測定した。ＰＫＫ ｍＲＮＡレベルは、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮによって測定したときのＲＮＡ総含量に従って調整した。

【1460】

キメラのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−１０−５ＭＯＥギャップマーとして設計した。このギャップマーは長さが２０ヌクレオチドであり、中央のギャップセグメントは１０個の２’−デオキシヌクレオシドから成り、それぞれ５ヌクレオシドを含むウイングによって、（５’位と３’位の）両側で隣り合っている。５’ウイングセグメント中の各ヌクレオシドと３’ウイングセグメント中の各ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を有している。ヌクレオシド間連結部は、各ギャップマーの全体を通して、ホスホロチオエート連結部である。シトシン残基は、各ギャップマーの全体にわたりすべて、５−メチルシトシンである。結果は、ＰＫＫ ｍＲＮＡレベルが用量依存的に有意に減少したことを示している。

【1461】

ある特定の例では、ＩＳＩＳ ４８２５８４（ＧＧＣＡＴＡＴＴＧＧＴＴＴＴＴＧＧＡＡＴ、配列番号２２４４）は、用量依存的にＰＫＫ ｍＲＮＡを減少させ、８４ｎＭの半数阻害濃度（ＩＣ_５０）を得た（表１７９参照）。ＩＳＩＳ ４８２５８４は、配列番号１１（ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＮＭ＿００８４５５．２）に対して標的化され、標的開始部位１５８６と標的終止部位１６０５を有する。「標的開始部位」とは、ヒト遺伝子配列中で当該ギャップマーの標的になる最も５’側のヌクレオシドを示す。「標的終止部位」とは、ヒト遺伝子配列中で当該ギャップマーの標的になる最も３’側のヌクレオシドを示す。

【1462】

【表165】

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【1463】

実施例１２３：ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＰＫＫ ｍＲＮＡのアンチセンス阻害
ＰＫＫ ｍＲＮＡに対するＩＳＩＳ ４８２５８４の効果について、ｉｎ ｖｉｖｏ試験を行った。

【1464】

処置
雄ＢＡＬＢ／ｃマウスの６つの群を、２．５ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、１０．０ｍｇ／ｋｇ、２０．０ｍｇ／ｋｇ、４０．０ｍｇ／ｋｇ、または８０．０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ ４８２５８４を、３週間にわたって週に２回（週の用量は５．０ｍｇ／ｋｇ、１０．０ｍｇ／ｋｇ、２０．０ｍｇ／ｋｇ、４０．０ｍｇ／ｋｇ、８０．０ｍｇ／ｋｇ、または１６０．０ｍｇ／ｋｇ）、皮下投与をして処置した。ＢＡＬＢ／ｃマウスの対照群を、ＰＢＳを３週間にわたって週に２回皮下投与して処置した。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳの最後の投与から２日後に、１０ｍｇ／ｋｇのキシラジンで混合した１５０ｍｇ／ｋｇのケタミンを腹腔内注射することによって、全群のマウスに麻酔をかけた。肝臓をＲＮＡ分析のために回収した。

【1465】

ＲＮＡ分析
ＰＫＫのリアルタイムＰＣＲを実施するために肝臓組織からＲＮＡを抽出した。ＰＫＫ ｍＲＮＡレベルは、マウスプライマープローブセットを使用して測定した（配列番号２２３１として本明細書で設計した順方向配列ＡＣＡＡＧＴＧＣＡＴＴＴＴＡＣＡＧＡＣＣＡＧＡＧＴＡＣ、配列番号２２３２として本明細書で設計した逆方向配列ＧＧＴＴＧＴＣＣＧＣＴＧＡＣＴＴＴＡＴＧＣＴ、配列番号２２３３として本明細書で設計したプローブ配列ＡＡＧＣＡＣＡＧＴＧＣＡＡＧＣＧＧＡＡＣＡＣＣＣ）。結果はＰＢＳ対照に対するＰＫＫの阻害率（％）として表す。表１８０に示すように、ＩＳＩＳ ４８２５８４による処置は、ＰＢＳ対照に比べ、ＰＫＫ ｍＲＮＡを用量依存的に有意に減少させた。

【1466】

【表166】

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【1467】

タンパク質分析
抗凝固剤としてクエン酸ナトリウムを含む管に血漿を集めた。試料は、４〜１２％勾配ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で実行し、次にマウスＰＫＫ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）による免疫ブロット法を実行した。ブロットを二次的フルオロフォア標識抗体（ＬＩ−ＣＯＲ）でインキュベートし、Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｍａｇｅｒ （ＬＩ−ＣＯＲ）に撮像した。結果は、ＰＢＳ対照に対するＰＫＫの阻害率（％）として表す。表１８１に示すように、ＩＳＩＳ ４８２５８４の処置は、ＰＢＳ対照に比べ、ＰＫＫ血漿タンパク質を用量依存的に有意に減少させた。

【1468】

【表167】

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【1469】

実施例１２４：血管浮腫マウスモデルにおけるマウスＰＫＫのアンチセンス阻害のｉｎ ｖｉｖｏ効果
遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）は、局所的膨張及び皮下組織中の血管透過性の増加を特徴とする（Ｍｏｒｇａｎ， Ｂ．Ｐ． Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３６３： ５８１−８３， ２０１０）。補体系のタンパク質であるＣ１阻害因子の欠損によって引き起こされる。Ｃ１−ＩＮＨ欠損の確立されたマウスモデルとＣａｐｔｏｐｒｉｌ誘導性浮腫（両者ともＨＡＥの特徴である血管透過性を引き起こす）の２つのマウスモデルを本試験に使用した。血管透過性の回復は、高分子キニノゲン（ＨＭＷＫ）の血漿レベルの増加を伴う。

【1470】

最初のモデルでは、浮腫は血圧降下薬として知られているＣａｐｔｏｐｒｉｌによる処置により誘発され、マウスの血管透過性を増加させ、遺伝性血管浮腫の病理を再現する。

【1471】

第二のモデルでは、浮腫は、マウスＣ１阻害因子ｍＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドであるＩＳＩＳ ４６１７５６による処置により誘発され、マウスの血管透過性を増加させ、遺伝性血管浮腫の病理を再現する。ＩＳＩＳ ４６１７５６（配列番号２２４５；ＡＡＡＧＴＧＧＴＴＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＧ）は、ＮＭ＿００９７７６．３（配列番号２２４３）のヌクレオシド１７３０−１７４９標的とする５−１０−５ＭＯＥギャップマーである。

【1472】

ＰＫＫのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害因子であるＨＯＥ−１４０とＩＳＩＳ ４８２５８４の効果は、Ｃａｐｔｏｐｒｉｌ及び血管透過性のＩＳＩＳ ４６１７５６誘発性マウスモデルで評価した。マウス群のいくつかは、血管拡張と血管透過性をブロックする、ブラジキニンＢ２受容体の選択的アンタゴニストであるＨＯＥ−１４０で処理し、（Ｃｒｕｄｅｎ ａｎｄ Ｎｅｗｂｙ， Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ９： ２３８３−９０， ２００８）。他のマウスはＰＫＫ ｍＲＮＡ発現を阻害するＩＳＩＳ ４８２５８４で処置した。ＨＯＥ−１４０による処置効果を、ＩＳＩＳ ４８２５８４による処理効果と比較した。

【1473】

処置
このアッセイについての様々な処置群を表１８２に表す。

【1474】

群１は、ＰＢＳを４週間にわたって週に２回、皮下投与して処置した４匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｙｒｃ−２Ｊマウスから成った。群１には他のいかなる処置も行わず、血管透過性の基礎レベルを測定するための対照群とした。

【1475】

群２は、ＰＢＳを４週間にわたって週に２回、皮下投与して処置した８匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｙｒｃ−２Ｊマウスから成った。処置期間の最後に、２０μｇのＣａｐｔｏｐｒｉｌを腹腔内投与した。群２は、Ｃａｐｔｏｐｒｉｌ誘発性血管透過性のＰＢＳ対照群とした。

【1476】

群３は、ＰＢＳを４週間にわたって週に２回、皮下投与して処置した８匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｙｒｃ−２Ｊマウスから成った。１４日目に、Ｃ１阻害因子ＩＳＩＳ ４６１７５６を標的とする５０ｍｇ／ｋｇのアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、２週間にわたって週に２回腹腔内投与した。処置期間の最後に、２０μｇのＣａｐｔｏｐｒｉｌを腹腔内投与した。群３は、ＣａｐｔｏｐｒｉｌとＩＳＩＳ ４６１７５６誘発性血管透過性についてのＰＢＳ対照群とした。

【1477】

群４は、ＰＢＳを４週間にわたって週に２回、皮下投与して処置した８匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｙｒｃ−２Ｊマウスから成った。１４日目に、Ｃ１阻害因子ＩＳＩＳ ４６１７５６を標的とする５０ｍｇ／ｋｇのアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、２週間にわたって週に２回腹腔内投与した。処置期間の最後に、２０μｇのＣａｐｔｏｐｒｉｌを腹腔内投与した。その後、３０μｇのＨＯＥ−１４０も投与した。群４はＨＯＥ−１４０の血管透過性の阻害についての陽性対照とした。

【1478】

群５は、４０ｍｇ／ｋｇの対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ １４１９２３、マウス標的としては知られていない５−１０−５ＭＯＥギャップマー、（ＣＣＴＴＣＣＣＴＧＡＡＧＧＴＴＣＣＴＣＣ、配列番号２２４６）を、４週間にわたって週に２回皮下投与して処置した８匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｙｒｃ−２Ｊマウスから成った。１４日目に、Ｃ１阻害因子ＩＳＩＳ ４６１７５６を標的とする５０ｍｇ／ｋｇのアンチセンスオリゴヌクレオチドを皮下投与し、２週間にわたって週に２回腹腔内投与した。処置期間の最後に、２０μｇのＣａｐｔｏｐｒｉｌを腹腔内投与した。群５はＣａｐｔｏｐｒｉｌとＩＳＩＳ ４６１７５６誘発性血管透過性についての対照群とした。

【1479】

群６は、４０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ ４８２５８４を４週間にわたって週に２回、皮下投与して処置した８匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｙｒｃ−２Ｊマウスから成った。処理期間の最後に、２０μｇのＣａｐｔｏｐｒｉｌを腹腔内投与した。群６は、ＰＫＫ ＡＳＯのＣａｐｔｏｐｒｉｌ誘発性血管透過性に対する影響を検討するための実験処置群とした。

【1480】

群７は、４０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ ４８２５８４を４週間にわたって週に２回、皮下投与して処置した８匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｙｒｃ−２Ｊマウスから成った。１４日目に、Ｃ１阻害因子ＩＳＩＳ ４６１７５６を標的とする５０ｍｇ／ｋｇのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、２週間にわたって週に２回皮下投与した。処置期間の最後に、２０μｇのＣａｐｔｏｐｒｉｌを腹腔内投与した。群７は、ＰＫＫ ＡＳＯのＣａｐｔｏｐｒｉｌ及びＩＳＩＳ ４６１７５６誘発性血管透過性に対する影響を検討するための実験処置群とした。

【1481】

全群に３０ｍｇ／ｋｇのエバンスブルー溶液を尾静脈に注入した。エバンスブルー溶液注入から３０分後に、マウスを屠殺し、結腸、足、耳及び腸を回収した。血液試料は、心臓穿刺で採取した。

【1482】

【表168】

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【1483】

血管透過性の定量
足、結腸、耳及び腸から採取した組織は、別個にホルムアミドに一晩おき、エバンスブルーを浸出した。耳及び足の組織を含むホルムアミド溶液を５５℃に加熱し、一晩放置した。染液が浸透したホルムアミド溶液の色彩強度は、ＯＤ_{６００ｎｍ}で測定し、表１８３に表す。浮腫を表しているマウスにはより多くの染液を取り込み、高いＯＤ値を示している。

【1484】

表１８３に示すように、ＩＳＩＳ ４８２５８４の処置によって、Ｃａｐｔｏｐｒｉｌで処置したマウス（群６）とＣａｐｔｏｐｒｉｌとＩＳＩＳ ４６１７５６ で処置したマウス（群７）のマウスは、それぞれのＰＢＳ群（群２と３）に比べて、血管透過性を防いでいる。群６と７のマウスの血管透過性の測定値もまた、血管透過性はＣａｐｔｏｐｒｉｌとＩＳＩＳ ４６１７５６で誘発された、対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ １４１９２３で処置したマウス（群５）に比べ、大部分の組織で減少した。両処置群（群６と７）の結腸と足の組織中の血管透過性の測定値は、ＰＢＳでのみ処置されたマウス（群１）で観察されたときの基礎レベルと同等であった。ＩＳＩＳ ４８２５８４で処置したマウスの血管透過性の減少は、このアッセイで陽性対照であったブラジキニン２受容体アンタゴニスト、ＨＯＥ１４０で処置されたマウスに見られた血管透過性と同等であった。

【1485】

したがって、ＰＫＫ ｍＲＮＡのアンチセンス阻害は、ＨＡＥの徴候である血管透過性の治療と予防に利益をもたらしうる。

【1486】

【表169】

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【1487】

高分子キニノゲン（ＨＭＷＫ）の定量
血液試料からのＨＭＷＫのウエスタンブロット法を、図１に表す。

【1488】

図１に示すように、群１と２の試料は、群６と７に比べ、ＨＭＷＫのレベルが低く、このことは血管透過性が群６と７では逆転していることを示している。図１ではまた、群１と２の試料は、群６と７に比べ、ＨＭＷＫ切断産物が増加している。したがって、ＨＭＷＫの欠損は、ＨＭＷＫのＰＫＫ切断によって、（ブラジキニン及びＨＫａを含む）切断産物に引き起こされる。

【1489】

実施例１２５：マウスにおけるマウスＰＫＫのアンチセンス阻害が基礎の透過性及びＣａｐｔｏｐｒｉｌ誘発性透過性に及ぼすｉｎ ｖｉｖｏ効果
基礎の透過性は、ナイーブ、未処置のマウスに起こる血管透過性のレベルである。基礎またはＣａｐｔｏｐｒｉｌ誘発性のいずれかの血管透過性の予防におけるＩＳＩＳ ４８２５８４の効果を評価した。
処置

【1490】

このアッセイの様々な処置群を表１８４に表す。

【1491】

群１は、８匹のマウスから成り、４週間にわたって週に２回、ＰＢＳを皮下に投与して処置した。群１に他のいかなる治療薬も投与せず、血管透過性の基礎レベルを測定するための対照群とした。

【1492】

群２は、８匹のマウスから成り、４週間にわたって週に２回、ＰＢＳを皮下に投与して処置した。処理期間の最後に、２０μｇのＣａｐｔｏｐｒｉｌを腹腔内投与した。群２はＣａｐｔｏｐｒｉｌ誘発性血管透過性についての陰性対照群とした。

【1493】

群３は、８匹のマウスから成り、４週間にわたって週に２回、ＰＢＳを皮下に投与して処置した。処置期間の最後に、３０μｇのＨＯＥ−１４０を腹腔内投与した。群３は基礎の血管透過性の阻害についての陽性対照とした。

【1494】

群４は、８匹のマウスから成り、４週間にわたって週に２回、ＰＢＳを皮下に投与して処置した。処置期間の最後に、２０μｇのＣａｐｔｏｐｒｉｌを腹腔内投与した。また、３０μｇのＨＯＥ−１４０を腹腔内投与した。群４は、Ｃａｐｔｏｐｒｉｌ誘発性血管透過性の阻害についての陽性対照とした。

【1495】

群５は、８匹のマウスから成り、４０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ ４８２５８４を４週間にわたって週に２回、皮下投与して処置した。群５は、ＩＳＩＳ ４８２５８４の基礎の血管透過性に及ぼす効果を検討するための実験処置群とした。

【1496】

群６は、８匹のマウスから成り、４０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ ４８２５８４を４週間にわたって週に２回、皮下投与して処置した。処置期間の最後に、２０μｇのＣａｐｔｏｐｒｉｌを腹腔内投与した。群６は、ＩＳＩＳ ４８２５８４のＣａｐｔｏｐｒｉｌ誘発性血管透過性に及ぼす効果を検討するための実験処置群とした。

【1497】

全群に３０ｍｇ／ｋｇのエバンスブルー溶液を尾静脈に注入した。エバンスブルー溶液注入から３０分後に、マウスを屠殺し、結腸、足、耳及び腸を回収した。

【1498】

【表170】

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【1499】

血管透過性の定量
足、結腸、腸及び耳から採取した組織は、別個にホルムアミドに一晩おき、エバンスブルーを浸出した。足及び耳の組織を含むホルムアミド溶液を５５℃に加熱し、一晩放置した。染液が浸透したホルムアミド溶液の色彩強度は、ＯＤ_{６００ｎｍ}で測定し、表１８５に表す。浮腫を表しているマウスには染液をより多く取り込み、高いＯＤ値を示している。

【1500】

表１８５に示すように、ＩＳＩＳ ４８２５８４で処置されたマウスは、ＰＢＳ対照に比べ、血管透過性が減少した（群５対群１）。ＩＳＩＳ ４８２５８４での処置による血管透過性の減少は、ＨＯＥ−１４０での処置（陽性対照とした群３）によって生じたものと同等であった。ＩＳＩＳ ４８２５８４で処置されたマウスは、ＰＢＳ対照に比べ、大部分の組織でＣａｐｔｏｐｒｉｌ誘発性血管透過性の減少を示した（群６対群２）。ＩＳＩＳ ４８２５８４での処置によるＣａｐｔｏｐｒｉｌ誘発性血管透過性の減少は、ＨＯＥ−１４０での処理（陽性対照とした群４）によって生じたものと同等であった。

【1501】

【表171】

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【1502】

実施例１２６：マウスＰＫＫのアンチセンス阻害がＣａｐｔｏｐｒｉｌ誘発性血管透過性に及ぼす用量依存的効果
ＩＳＩＳ ４８２５８４の用量を変化させたときのＣａｐｔｏｐｒｉｌ誘発性血管透過性に与える効果を評価した。

【1503】

処置
このアッセイの様々な処置群は、表１８６に表す。

【1504】

群１は、４匹のマウスから成り、３週間にわたって週２回ＰＢＳを皮下投与して処置した。群１には他のいかなる治療薬も投与せず、血管透過性の基礎レベルを測定するための対照群とした。

【1505】

群２は、８匹のマウスから成り、３週間にわたって週２回ＰＢＳを皮下投与して処置した。処置期間の最後に、２０μｇのＣａｐｔｏｐｒｉを腹腔内投与した。群２は、Ｃａｐｔｏｐｒｉｌ誘発性血管透過性の対照群とした。

【1506】

群３は、４匹のマウスから成り、３週間にわたって週２回ＰＢＳを皮下投与して処置した。処置期間の最後に、２０μｇのＣａｐｔｏｐｒｉを腹腔内投与した。また、３０μｇのＩｃａｔｉｂａｎｔ（ＨＯＥ−１４０）を腹腔内投与した。群４は、Ｃａｐｔｏｐｒｉｌ誘発性血管透過性の阻害の陽性対照とした。

【1507】

群４、５、６、７、８及び９は、８匹のマウスから成り、３週間にわたって週２回、それぞれにＩＳＩＳ ４８２５８４を２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、または８０ｍｇ／ｋｇ（週に５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、または１６０ｍｇ／ｋｇに対応する）皮下投与した。処置期間の最後に、２０μｇのＣａｐｔｏｐｒｉを腹腔内投与した。群４〜９は、ＩＳＩＳ ４８２５８４の用量の変化がＣａｐｔｏｐｒｉｌ誘発性血管透過性に及ぼす効果を検討するための実験処置群とした。

【1508】

全群に３０ｍｇ／ｋｇのエバンスブルー溶液を尾静脈に注入した。エバンスブルー溶液注入から３０分後に、マウスを屠殺し、結腸、足、耳及び腸を回収した。血液試料は、心臓穿刺で採取した。

【1509】

【表172】

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【1510】

血管透過性の定量化
採取した組織は、別個にホルムアミド溶液に一晩おき、エバンスブルーを浸出した。足及び耳の組織を含むホルムアミド溶液を５５℃に加熱し、一晩放置した。染液が浸透したホルムアミド溶液の色彩強度は、ＯＤ_{６００ｎｍ}で測定し、表１８７に表す。浮腫を表しているマウスは染液をよりおおく取り込み、高いＯＤ値を示している。

【1511】

表１８７に示すように、より高用量のＩＳＩＳ ４８２５８４（群４、５及び６）を投与されたマウスでは、対応するＰＢＳ対照群（群２）に比べ、Ｃａｐｔｏｐｒｉｌ誘発性血管透過性のレベルが減少した。これらの処置群（群４及び５）のマウスの血管透過性の減少は、血管透過性の基礎レベル（群１に示すように）ならびにＨＯＥ−１４０（群３）を投与されたマウスの血管透過性の基礎レベルと同等であった。

【1512】

【表173】

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【1513】

血管漏出の定量
心臓穿刺によって採取された血液は、すぐに、氷冷した３倍体積のエタノールと混合した。溶液を４℃で２０分間、１５，０００ｇの遠心分離にかけ、細胞片と沈殿した血漿タンパク質を取り除いた。１０ｋＤａのＭＷＣＯフィルターによる限外濾過によってエタノール抽出物をさらに精製した。エタノール抽出血漿溶液の色彩強度を、ＯＤ_{６２０ｎｍ}で測定した。結果は、ＰＢＳ対照群１のＯＤ値に対する増加率または減少率として、表１８８に表す。浮腫を発現しているマウスの組織は、血漿からより多くの染液を漏出しており、そのため、血管漏出の減少により、高いＯＤを示す処置群に対し、ＯＤが低いことが予想された。１６０ｍｇ／ｋｇ／週及び８０ｍｇ／ｋｇ／週のＩＳＩＳ ４８２５８４を投与されたマウス（群４及び５）は、Ｃａｐｔｏｐｒｉｌを投与されたＰＢＳ陰性対照（群２）に比べ、血管漏出が低かった。群４及び５の結果は、ＨＯＥ−１４０を投与された陽性群（群３）と同等であった。

【1514】

【表174】

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【1515】

実施例１２７：マウスにおけるマウスＰＫＫのアンチセンス阻害が基礎透過性に及ぼす用量依存的効果
ＩＳＩＳ ４８２５８４の用量を変化させたときの血管透過性に及ぼす効果を評価した。

【1516】

処置
このアッセイの様々な処置群は、表１８９に表す。

【1517】

群１は、８匹のマウスから成り、３週間にわたって週２回ＰＢＳを皮下投与して処置した。群１には他のいかなる治療薬も投与せず、血管透過性の基礎レベルを測定するための対照群とした。

【1518】

群２は、４匹のマウスから成り、３週間にわたって週２回ＰＢＳを皮下投与して処置した。処置の最後に、３０μｇのＨＯＥ−１４０を腹腔内投与した。群２は基礎血管透過性の阻害についての陽性対照とした。

【1519】

群３、４、５、６、７、及び８は、８匹のマウスから成り、３週間にわたって週２回、それぞれに、ＩＳＩＳ ４８２５８４を２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、または８０ｍｇ／ｋｇ（週に５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ，または１６０ｍｇ／ｋｇに対応する）皮下投与して処置した。群４〜９は、ＩＳＩＳ ４８２５８４の用量の変化が基礎血管透過性に及ぼす効果を検討するための実験処置群とした。

【1520】

全群に３０ｍｇ／ｋｇのエバンスブルー溶液を尾静脈に注入した。エバンスブルー溶液注入から３０分後に、マウスを屠殺し、結腸、足、及び耳を回収し、透過性の欠損について検討した。血液試料は、心臓穿刺で採取した。

【1521】

【表175】

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【1522】

血管透過性の定量
足、結腸及び耳から採取した組織は、別個にホルムアミドに一晩おき、エバンスブルーを浸出した。足及び耳の組織を含むホルムアミド溶液を５５℃に加熱し、一晩放置した。染液が浸透したホルムアミド溶液の色彩強度は、ＯＤ_{６００ｎｍ}で測定し、表１９０に表す。高いＯＤ値は高い透過性と関連している。

【1523】

表１９０に示すように、ＩＳＩＳ ４８２５８４を投与されたマウス（群３〜８）の大部分の組織は、全ての用量で、ＰＢＳ対照（群１）に比べ、基礎血管透過性が減少した。ＩＳＩＳオリゴヌクレオチド処置群の基礎血管透過性の減少は、ＨＯＥ−１４０を投与された陽性対照群（群２）で示されたものと同等であった。

【1524】

【表176】

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【1525】

血管漏出の定量
心臓穿刺によって採取された血液は、すぐに、氷冷した３倍体積のエタノールと混合した。溶液は４℃で２０分間、１５，０００ｇで遠心分離にかけ、細胞片と沈殿した血漿タンパク質を取り除いた。エタノール抽出物は、１０ｋＤａのＭＷＣＯフィルターによる限外濾過によってさらに精製した。エタノール抽出血漿溶液の色彩強度は、ＯＤ_{６２０ｎｍ}で測定した。結果は、群１ＰＢＳ対照のＯＤ値に対する増加率または減少率として表１９１に表す。処置群は、血管漏出の減少により高いＯＤ値を表しうることが予想された。ＩＳＩＳオリゴヌクレオチド処置群のすべてのマウスが、ＰＢＳ陰性対照に比べ、有意に血管漏出が減少した。

【1526】

【表177】

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【1527】

高分子キニノゲン（ＨＭＷＫ）の定量
血液試料からのＨＭＷＫのウエスタンブロット法を、図２及び表１９２及び１９３に示す。

【1528】

表１９２に示すように、４８２５８４の処置群は、ＰＢＳ対照に比べ、ＨＭＷＫのレベルが高く、用量依存的に増加している。ＰＫＫアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置は、ＨＭＷＫの安定性をもたらしている。したがって、ＩＳＩＳ ４８２５８４処置群では、用量依存的に、血管透過性が減少している。表１９３に示すように、ＩＳＩＳ ４８２５８４の処置群は、ＰＢＳ対照に比べ、ＨＭＷＫ切断産物が少なく、用量依存的に減少している。そのため、ＨＭＷＫの減少は、ＨＭＷＫのＰＫＫ切断によって、（ブラジキニン及びＨＫａを含む）切断産物に引き起こされる。データは濃度計によって測定された強度単位で表している。

【1529】

【表178】

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【1530】

【表179】

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【1531】

実施例１２８：マウスにおけるＰＫＫを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドとＣａｐｔｏｐｒｉｌ誘発性血管透過性の因子１２の併用療法
Ｃａｐｔｏｐｒｉｌ誘発性血管透過性モデルにおいて、ＩＳＩＳ ４１０９４４、因子１２を標的とする５−１０−５ＭＯＥギャップマー（ＧＣＡＴＧＧＧＡＣＡＧＡＧＡＴＧＧＴＧＣ；配列番号２２４７）であるＩＳＩＳ ４８２５８４の用量を変化させてマウスに処置を行った。

【1532】

処置
このアッセイの様々な処置群は、表１９４に表す。

【1533】

群１は、４匹のマウスから成り、３週間にわたって週２回ＰＢＳを皮下投与して処置した。群１には他のいかなる治療薬も投与せず、血管透過性の基礎レベルを測定するための対照群とした。

【1534】

群２は、８匹のマウスから成り、３週間にわたって週２回ＰＢＳを皮下投与して処置した。処置期間の最後に、２０μｇのＣａｐｔｏｐｒｉを腹腔内投与した。群２は、Ｃａｐｔｏｐｒｉｌ誘発性血管透過性の対照群とした。

【1535】

群３は、４匹のマウスから成り、３週間にわたって週２回ＰＢＳを皮下投与して処置した。処置期間の最後に、２０μｇのＣａｐｔｏｐｒｉを腹腔内投与した。また、３０μｇのＨＯＥ−１４０を腹腔内投与した。群３は、Ｃａｐｔｏｐｒｉｌ誘発性血管透過性の阻害の陽性対照とした。

【1536】

群４、５、６、７、及び８は、８匹のマウスから成り、３週間にわたって週２回、それぞれに、ＩＳＩＳ ４８２５８４とＩＳＩＳ ４１０９４を２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ（週に５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇに対応する）皮下投与した。処置期間の最後に、２０μｇのＣａｐｔｏｐｒｉを腹腔内投与した。群４〜８は、ＩＳＩＳ ４１０９４４とＩＳＩＳ ４８２５８４の用量の変化がＣａｐｔｏｐｒｉｌ誘発性血管透過性に及ぼす効果を検討するための実験処置群とした。

【1537】

全群に３０ｍｇ／ｋｇのエバンスブルー溶液を尾静脈に注入した。エバンスブルー溶液注入から３０分後に、マウスを屠殺し、結腸、足、耳及び腸を回収した。

【1538】

【表180】

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【1539】

血管透過性の定量
足、結腸、及び耳から採取した組織は、ホルムアミドに一晩おき、エバンスブルーに浸出した。足及び耳の組織を含むホルムアミド溶液を５５℃に加熱し、一晩放置した。染液が浸透したホルムアミド溶液の色彩強度は、ＯＤ_{６００ｎｍ}で測定し、表１９５に表す。より高いＯＤ値は、より高い透過性レベルに関連している。

【1540】

表１９５に示すように、ＩＳＩＳ ４８２５８４とＩＳＩＳ ４１０９４４の併用で処置されたマウス（群３〜８）の組織の大部分が、全ての用量で、ＰＢＳ対照（群１）に比べ、血管透過性が減少した。ＩＳＩＳオリゴヌクレオチド処置群の血管透過性の減少は、基礎ＰＢＳ対照（群１）、ならびにＨＯＥ１４０で処置された陽性対照（群２）で示された血管透過性と同等であった。ＰＫＫと因子１２アンチセンスオリゴヌクレオチドの組み合わせでは、透過性が相乗的に減少した。予想したように、血管漏出の対応する相乗的な減少も観察した。

【1541】

【表181】

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【1542】

実施例１２９：マウスにおける基礎血管透過性についてのＰＫＫを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと因子１２の併用療法
基礎血管透過性において、ＩＳＩＳ ４１０９４４、因子１２を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＩＳＩＳ ４８２５８４の用量を変化させてマウスに処置を行った。

【1543】

処置
このアッセイの様々な処置群は、表１９６に表す。

【1544】

群１は、８匹のマウスから成り、３週間にわたって週２回ＰＢＳを皮下投与して処置した。群１には他のいかなる治療薬も投与せず、血管透過性の基礎レベルを測定するための対照群とした。

【1545】

群２に、４匹のマウスから成り、３週間にわたって週２回ＰＢＳを皮下投与して処置した。処置期間の最後に、３０μｇのＨＯＥ−１４０を腹腔内投与した。群２は、基礎血管透過性の阻害の陽性対照とした。

【1546】

群３、４、５、６、及び７は、８匹のマウスから成り、３週間にわたって週２回、それぞれに、ＩＳＩＳ ４８２５８４とＩＳＩＳ ４１０９４４を２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、または４０ｍｇ／ｋｇ（週に５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇに対応する）皮下投与した。群３〜７は、ＩＳＩＳ ４１０９４４とＩＳＩＳ ４８２５８４が基礎誘発性血管透過性に及ぼす効果を検討するための実験処置群とした。

【1547】

全群に３０ｍｇ／ｋｇのエバンスブルー溶液を尾静脈に注入した。エバンスブルー溶液注入から３０分後に、マウスを屠殺し、結腸、足、耳及び腸を回収した。

【1548】

【表182】

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【1549】

血管透過性の定量
足、結腸、腸及び耳から採取した組織は、ホルムアミドに一晩おき、エバンスブルーを浸出した。足及び耳の組織を含むホルムアミド溶液を５５℃に加熱し、一晩放置した。染液が浸透したホルムアミド溶液の色彩強度は、ＯＤ_{６００ｎｍ}で測定し、表１９７に表す。より高いＯＤ値は、より高い透過性レベルに関連している。

【1550】

表１９７に示すように、ＩＳＩＳ ４８２５８４とＩＳＩＳ ４１０９４４の組み合わせで処置されたマウスの大部分の組織は、全ての用量（群２〜７）で、ＰＢＳ対照（群１）に比べ、血管透過性が減少した。ＩＳＩＳオリゴヌクレオチド処置群の血管透過性の減少は、ＨＯＥ１４０で処置された陽性対照（群２）で示された血管透過性の減少と同等であった。ＰＫＫと因子１２アンチセンスオリゴヌクレオチドの組み合わせでは、透過性が相乗的に減少した。予想したように、血管漏出の対応する相乗的な減少も観察した。

【1551】

【表183】

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【1552】

実施例１３０：ＩＳＩＳ ４８２５８４による因子１２タンパク質活性化の阻害
ＰＫＫ ｍＲＮＡのアンチセンス阻害の因子１２タンパク質活性化への影響を評価した。

【1553】

処置
このアッセイの様々な処理群は、表１９８に表す。

【1554】

群１は、８匹のマウスから成り、３週間にわたって週２回ＰＢＳを皮下投与して処置した。群１には他のいかなる治療薬も投与せず、因子１２の活性化を測定するための対照群とした。

【1555】

群２、３、４、５、及び６は、８匹のマウスから成り、３週間にわたって週２回、それぞれに、ＩＳＩＳ ４８２５８４を２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、または４０ｍｇ／ｋｇ（週に５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇに対応する）皮下投与した。群２〜６は、ＩＳＩＳ ４８２５８４が因子１２の活性化に及ぼす効果を検討するための実験処置群とした。

【1556】

処置期間の最後に、血漿は、血漿中の因子１２についてＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ（登録商標）因子１２ａをベースとするアミド分解アッセイから採取した。

【1557】

【表184】

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【1558】

血漿中の因子１２の活性化についてのアッセイ
９６ウェルのポリプロピレンマイクロプレート中の８５μＬのＰＢＳおよび１μｇ／ｍｌのデキストラン硫酸（５００ｋＤａ）に、血漿（５μＬ）を添加し、溶液を室温で５分間インキュベートした。Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ（登録商標）ＦＸＩＩａ（１０μＬの２ｍＭ溶液）と０．２ｍＭのＫＡＬＬＩＳＴＯＰ（商標）溶液を添加し、吸光速度（ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ｋｉｎｅｔｉｃ）を４０５ｎｍで測定した。因子１２の活性化は、吸光度蓄積（ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）の線形位相で測定した。結果は、ＰＢＳ対照試料で測定された因子１２の活性化の割合として、表１９９に表す。表１９９に見られるように、ＩＳＩＳ ４８２５８４によるＰＫＫの阻害は、基質による因子１２の活性化の減少をもたらし、このことはＰＫＫが、適切な因子１２の活性化に必要であることを示唆している。

【1559】

【表185】

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【1560】

実施例１３１：マウスＰＫＫのアンチセンス阻害がＣ１−ＩＮＨアンチセンスオリゴヌクレオチド誘発性血管透過性に及ぼすｉｎ ｖｉｖｏ効果
マウスＣ１阻害因子ｍＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドであるＩＳＩＳ ４６１７５６によって誘発される血管透過性は、マウスの血管透過性を増加させ、遺伝性血管浮腫の病理を再現する。このモデルへのＩＳＩＳ ４８２５８４の効果を評価した。

【1561】

処置
８匹のマウスから成る一群は、４０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ ４８２５８４を、３週間にわたって週に２回（週の用量は８０ｍｇ／ｋｇ）、投与した。８匹のマウスから成る第二の群は、４０ｍｇ／ｋｇの対照オリゴヌクレオチド、ＩＳＩＳ １４１９２３で、３週間にわたって週に２回（週の用量は８０ｍｇ／ｋｇ）皮下投与して処置した。８匹のマウスから成る第三の群３は、ＰＢＳを３週間にわたって週に２回投与することによって処置した。１４日目に、全群に１２．５ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ ４６１７５６を３週間にわたって週に２回（週の用量は２５ｍｇ／ｋｇ）を投与した。マウスの対照群は、ＰＢＳを３週間にわたって週に２回投与したが、ＩＳＩＳ ４６１７５６は投与しなかった。

【1562】

処置の最後に、全群に３０ｍｇ／ｋｇのエバンスブルー溶液を尾静脈に注入した。エバンスブルー溶液注入から３０分後に、マウスを屠殺し、結腸、足、耳及び腸を回収した。また、ＲＮＡ分析のために肝臓を回収した。

【1563】

ＲＮＡ分析
ＲＮＡは、Ｃ１−ＩＮＨ及びＰＫＫ ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析のために、肝臓から単離した。Ｃ１−ＩＮＨのためのプライマープローブセットは、ＲＴＳ３２１８（配列番号２２３４として本明細書で指定した順方向配列ＧＡＧＴＣＣＣＣＣＡＧＡＧＣＣＴＡＣＡＧＴ、配列番号２２３５として本明細書で指定した逆方向配列ＴＧＴＣＡＴＴＴＧＴＴＡＴＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＡＣＡ、配列番号２２３６として本明細書で設計したプローブ配列ＣＴＧＣＣＣＴＣＴＡＣＣＴＧＧＣＣＡＡＣＡＡＣＣＡ）である。ＰＫＫのためのプライマープローブセットは、ＲＴＳ３２８７（配列番号２２３７として指定した順方向配列ＡＣＡＡＧＴＧＣＡＴＴＴＴＡＣＡＧＡＣＣＡＧＡＧＴＡＣ、配列番号２２３８として設計した逆方向配列ＧＧＴＴＧＴＣＣＧＣＴＧＡＣＴＴＴＡＴＧＣＴ、配列番号２２３９として指定したプローブ配列ＡＡＧＣＡＣＡＧＴＧＣＡＡＧＣＧＧＡＡＣＡＣＣＣ）である。結果は、ＩＳＩＳ ４６１７５６で処置をしていないＰＢＳ対照と比較したときの阻害率（％）として、表２００に表す。データは、ＩＳＩＳ ４６１７５６がＣ１−ＩＮＨ ｍＲＮＡ発現を有意に減少させ、ＩＳＩＳ ４８２５８４による処置がＰＫＫ発現を有意に減少させたことを示している。

【1564】

【表186】

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【1565】

血管透過性の定量
足、結腸、及び腸から採取した組織は、ホルムアミド溶液に一晩おき、エバンスブルーを浸出した。足の組織を含むホルムアミド溶液を５５℃に加熱し、一晩放置した。染液が浸透したホルムアミド溶液の色彩強度は、ＯＤ_{６００ｎｍ}で測定した。データは、ＩＳＩＳ ４６１７５６で処置していないＰＢＳ対照と比較したときの増加率または減少率（％）として、表２０１に表す。データは、ＩＳＩＳ ４８２５８４による処置が、ＩＳＩＳ ４６１７５６によって誘発される血管透過性を防いだことを示している。

【1566】

【表187】

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【1567】

実施例１３２：ＦｅＣｌ_３誘発性下大静脈血栓症モデルにおけるマウスＰＫＫのアンチセンス阻害のｉｎ ｖｉｖｏ効果
ＰＫＫのｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの有意な阻害を示したＩＳＩＳ ４８２５８４を、ＦｅＣｌ_３誘発性下大静脈血栓症マウスモデルで評価した。

【1568】

処置
８匹の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスの３つの群に、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、または４０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ ４８２５８４を、３週間にわたって週２回（週の用量は２０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、または８０ｍｇ／ｋｇ）皮下投与した。１２匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの２つの対照群にそれぞれ、ＰＢＳで処置、３週間にわたって週２回皮下投与して処置した。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳの最後の投与から２日後に、１０ｍｇ／ｋｇのキシラジンと混合した１５０ｍｇ／ｋｇのケタミンを腹腔内注射することによって、全群のマウスに麻酔をかけた。第１の対照群を除き、麻酔をかけたマウスの全群で、ＦｅＣｌ_３によって血栓形成が誘発した。

【1569】

ＦｅＣｌ_３処理を行ったマウスにおいて、１０％のＦｅＣｌ_３溶液を事前に浸したフィルター紙（２ｘ４ｍｍ）を、大静脈に直接適用することによって、血栓の形成が誘発された。暴露から３分後に、フィルター紙を取り除いた。フィルター紙の適用から３０分後に、血小板の分析のために、血栓を含む静脈の全長を切除した。肝臓はＲＮＡ分析のために回収した。

【1570】

血小板組成の定量
血小板因子４（ＰＦ−４）のリアルタイムＰＣＲを使用して、血栓形成の測定値として、大静脈の血小板を定量した。ＰＦ−４ ｍＲＮＡレベルは、マウスプライマープローブセットｍＰＦ４＿ＬＴＳ＿０００８６（配列番号２２４０として本明細書で指定した順方向配列ＡＧＡＣＣＣＡＴＴＴＣＣＴＣＡＡＧＧＴＡＧＡＡＣＴ、配列番号２２４１として本明細書で指定した逆方向配列ＣＧＣＡＧＣＧＡＣＧＣＴＣＡＴＧ、配列番号２２４２として本明細書で指定したプローブ配列ＴＣＴＴＴＧＧＧＴＣＣＡＧＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＴＴ）を使用して測定した。結果は、２つのＰＢＳ処理対照群と比較したときの、ＩＳＩＳオリゴヌクレオチド処置マウスのＰＦ−４の割合として表す。表２０２に示すように、ＩＳＩＳ ４８２５８４による処置は、ＰＢＳ対照に比べ、ＰＦ−４の有意な減少をもたらした。そのため、当該化合物によるＰＫＫの減少は、血栓の形成の阻害に有用である。

【1571】

【表188】

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【1572】

実施例１３３：尾の出血アッセイにおけるマウスＰＫＫのアンチセンス阻害のｉｎ ｖｉｖｏ効果
ＩＳＩＳ ４８２５８４による処置が、マウスに過剰な出血または大量の出血を引き起こすかどうかを観察するために、尾の出血を測定した。

【1573】

処置
１０匹の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、または４０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ ４８２５８４を、３週間にわたって週２回（週の用量は２０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、または８０ｍｇ／ｋｇ）を皮下投与して処置した。８匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの対照群を、ＰＢＳを３週間にわたって週２回、皮下投与して処置した。

【1574】

尾の出血アッセイ
ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳの最後の処置から２日後に、マウスを尾を出血させるためのチャンバーに固定した。マウスにイソフランでチャンバーにおいて麻酔をかけた。その後、尾の小さい部分（切片から約４ｍｍ）を滅菌ハサミで切り出した。切り出した尾は、３７℃に温めた約１０ｍＬの０．９％のＮａＣｌ緩衝液で満たされた１５ｍＬのＦａｌｃｏｎ管にすぐに置いた。血液は４０分かけて採取した。出血前と出血後の管の生理食塩水の重さを測った。結果は表２０３に示す。

【1575】

ＩＳＩＳ ４８２５８４による処置は、出血に有意に影響しなかった。これらのデータは、本明細書で提供される当該化合物の出血能力は低いことを示唆している。実施例１９の結果で得られたこれらのデータは、本明細書に記載の当該化合物でのＰＫＫの阻害は、関連する出血のリスクを有さずに抗血栓の活性を提供するのに有用であることを示唆している。

【1576】

【表189】

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【1577】

実施例１３４：ＦｅＣｌ_３誘発性腸間膜血栓症モデルにおけるマウスＰＫＫのアンチセンス阻害のｉｎ ｖｉｖｏ効果
ＦｅＣｌ_３誘発性腸間膜血栓症マウスモデルでＩＳＩＳ ４８２５８４を評価した。

【1578】

処置
Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウス６〜８匹の群を、４０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ ４８２５８４を、３週間にわたって週２回皮下注射して処置した（週の用量は８０ｍｇ／ｋｇ）。Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウス６匹の対照群を、ＰＢＳを３週間にわたって週２回皮下注射して処置した。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳの最後の投与から２日後に、２５ｍｇ／ｋｇのキシラジンで混合した７５ｍｇ／ｋｇのケタミンを腹腔内注射することによって、全群のマウスに麻酔をかけた。

【1579】

用量５ｍｇ／ｋｇのローダミン６Ｇ染色を皮下注射し、血小板を染色した。用量１ｍｇ／ｋｇのＡｌｅｘａ−６４７標識化抗フィブリノーゲン抗体を尾静脈に注射し、フィブリンを染色した。腹部を正中切開によって開口した。内臓の腸間膜をガラスカバーグラスに広げ、腸間膜細動脈（７０〜１２０μｍ）を、顕微鏡で観察することにより位置確認した。６％のＦｅＣｌ_３溶液を事前に浸した綿糸（２ｘ０．３ｍｍ）を、標的の血管に直接適用することによって、血栓形成が誘発された。３分間の暴露の後、糸を取り除き、両方の染液の色彩強度を、適切なフィルターで、蛍光顕微鏡検査法（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦｌｕｏＶｉｅｗ １０００共焦点レーザー顕微鏡）によって７０分間記録した。

【1580】

対照及び処置群の血小板凝集の結果を任意単位（ａ．ｕ．）で表２０４に表す。血小板凝集は、ＰＢＳで処置したマウスに比べ、８０ｍｇ／ｋｇ／週のＩＳＩＳ ４８２５８４で処置したマウスで減少した。対照及び処置群のフィブリン形成の結果を任意単位（ａ．ｕ．）で表２０５に表す。フィブリン形成は、ＰＢＳで処置したマウスに比べ、用量８０ｍｇ／ｋｇ／週のＩＳＩＳ ４８２５８４で処置したマウスで減少した。したがって、これらの結果は、ＩＳＩＳ ４８２５８４が血栓形成を阻害することを示唆している。

【1581】

【表190】

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【1582】

【表191】

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【1583】

実施例１３５：狭窄誘発性下大静脈血栓症モデルにおけるマウスＰＫＫのアンチセンス阻害のｉｎ ｖｉｖｏ効果
狭窄誘発性下大静脈（ＩＶＣ）血栓症モデルでＩＳＩＳ ４８２５８４を評価した。血流の減少及び内皮損傷が、このモデルの特徴であり、Ｓｔ．Ｔｏｍａｓモデルとしても知られている。

【1584】

処置
ＢＡＬＢ／ｃマウス６〜８匹の４つの群を、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇまたは４０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ ４８２５８４を３週間にわたって週２回皮下注射して処置した（週の用量は１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇまたは８０ｍｇ／ｋｇ）。ＢＡＬＢ／ｃマウス８匹の対照群を、３週間にわたって週２回ＰＢＳを皮下注射して処置した。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳの最後の投与から２日後に、２．５％の吸入用のイソフルランで麻酔をかけた。マウスのＩＶＣを、左腎静脈の下、正中切開によって露わにし、鈍的解剖によって腹部大動脈から分離した。６−０シルクタイ（ｓｉｌｋ ｔｉｅ）（Ｅｔｈｉｃｏｎ、ＵＫ）をちょうど左腎静脈のシアノ血管の後ろに配置し、金属製４−０縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ、ＵＫ）をＩＶＣにわたって長軸方向に配値し、シルクタイを頂上で縛った。金属製縫合糸はその後取り除いた。２つの神経血管手術用クリップ（Ｂｒａｕｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ， ＰＡ）を、結紮下の２つに分かれた位置にそれぞれ２０秒間置き、その後、取り除いた。腹腔の内容物を置き換え、腹腔を閉じた。２４時間後、ＩＶＣをあらわにし、血栓形成を確認した。形成された血栓のすべてを採取し、１０％のホルマリンに２４時間固定した。

【1585】

血栓の重さを測り、結果は、ミリグラムで表２０６に表す。結果によって示されるように、ＩＳＩＳ ４８２５８４の用量を増加させながらの処置は、結果的に対応する血栓の重量の減少をもたらした。この結果は、ＰＫＫの阻害が血栓形成の阻害に有用であることを示している。

【1586】

【表192】

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【1587】

実施例１３６：ＧａｌＮＡｃ_３共役基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドによるマウスＰＫＫの阻害
以下の表に示すように、ＰＫＫ ｍＲＮＡの効果について、ＩＳＩＳ ４８２５８４とＩＳＩＳ ７２２０５９のｉｎ ｖｉｖｏ試験を行った。

【1588】

【表193】

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下付き文字：「ｅ」は２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示す。「ｄ」はβ−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示す。「ｓ」はホスホロチオエートヌクレオシド間結合（ＰＳ）を示す。「ｏ」はリン酸ジエステルヌクレオシド間結合（ＰＯ）を示す。「ｏ」は−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。上付き文字「ｍ」は５−メチルシトシンを示す。「ＧａｌＮＡｃ_３−７」の構造は実施例４８に示している。

【1589】

処置
Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ−Ｔｙｒ^ｃ−２Ｊマウス４匹からなる４つの群を、５．０ｍｇ／ｋｇ、１０．０ｍｇ／ｋｇ、２０．０ｍｇ／ｋｇ、または４０．０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ ４８２５８４を、３週間にわたって週２回皮下注射して処置した（週の用量は１０．０ｍｇ／ｋｇ、２０．０ｍｇ／ｋｇ、４０．０ｍｇ／ｋｇ、または８０．０ｍｇ／ｋｇ）。ＢＡＬＢ／ｃマウス４匹からなる４群を、それぞれ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、または８．０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ ７２２０５９を、３週間にわたって週２回皮下注射して処置した（週の用量は２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、８．０ｍｇ／ｋｇ、または１６．０ｍｇ／ｋｇ）。ＢＡＬＢ／ｃマウス４匹の対照群を、ＰＢＳを３週間にわたって週２回皮下注射した。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳの最後の投与から３日後に、全群のマウスに、誘導のために空気中に２．５％蒸発させたイソフルラン、次にメインテナンスのためにノーズコーンによる１〜２％のイソフルランによって麻酔をした。その後、頚椎脱臼した。安楽死の後、ＲＮＡ分析のために肝臓を回収した。

【1590】

ＲＮＡ分析
ＰＫＫのリアルタイムＰＣＲのためにＲＮＡを肝組織から抽出した。ＰＫＫ ｍＲＮＡレベルを、マウスプライマープローブセットを使用して測定した（配列番号２２３１として本明細書で指定した順方向配列ＡＣＡＡＧＴＧＣＡＴＴＴＴＡＣＡＧＡＣＣＡＧＡＧＴＡＣ、配列番号２２３２として本明細書で指定した逆方向配列ＧＧＴＴＧＴＣＣＧＣＴＧＡＣＴＴＴＡＴＧＣＴ、配列番号２２３３として本明細書で指定したプローブ配列ＡＡＧＣＡＣＡＧＴＧＣＡＡＧＣＧＧＡＡＣＡＣＣＣ）。結果は、ＰＢＳ対照に対するＰＫＫの阻害率（％）として表す。以下の表２０８に示すように、ＧａｌＮＡｃ_３共役基を含むＩｓｉｓ ７２２０５９は、親アンチセンスオリゴヌクレオチド、Ｉｓｉｓ ４８２５８４より、有意に強力にＰＫＫ ｍＲＮＡを減少させた。この結果は、上述の実施例の結果と一致しており、マウスとヒトの両方の多くの標的遺伝子で、ＧａｌＮＡｃ_３共役基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、親アンチセンスオリゴヌクレオチドより有意に強力であった。したがって、ＧａｌＮＡｃ_３共役基を含むヒトＰＫＫアンチセンスオリゴヌクレオチドは、同様に、共役基を含まない親アンチセンスオリゴヌクレオチドより、強力にヒトＰＫＫ ｍＲＮＡを減少させることが予想される。

【1591】

【表194】

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【1592】

実施例１３７：ＧａｌＮＡｃ_３共役基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドによるヒトＰＫＫの阻害
以下の表に示すように、ヒトＰＫＫ ｍＲＮＡに対する効果について、ＩＳＩＳ ５４６２５４とＩＳＩＳ ７２１７４４のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験を行った。

【1593】

【表195】

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下付き文字：「ｅ」は２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示す。「ｄ」はβ−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示す。「ｓ」はホスホロチオエートヌクレオシド間結合（ＰＳ）を示す。「ｏ」はリン酸ジエステルヌクレオシド間結合（ＰＯ）を示す。上付き文字「ｍ」は５−メチルシトシンを示す。「ＧａｌＮＡｃ_３−７」の構造は実施例４８に示している。「ＧａｌＮＡｃ_３−７_ａ−ｏ’」は、切断可能部分が−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−であるＧａｌＮＡｃ_３−７共役基を示す。

【1594】

肝臓のｉｎ ｖｉｔｒｏの生理学的微小環境を模倣するために、間質細胞を含む初代ヒト肝細胞共培養物（ＨｅｐａｔｏＰａｃ ｋｉｔ ＨＰＨＵ−ＴＸ−９６Ｓ、Ｈｅｐｒｅｇｅｎ、Ｍｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を、製造者の指示に従って使用した。以下の表に挙げる濃度のＩｓｉｓオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳを、トランスフェクション試薬の非存在下で、各ウェルに添加した。９６時間後、細胞を溶解し、ＲＮＡを細胞から単離した。ＰＫＫ ｍＲＮＡレベルは、プライマープローブセットＲＴＳ３４５４を使用して、定量的リアルタイムＰＣＲによって測定し、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定する総ＲＮＡ含量に正規化した。結果は、ＰＢＳ処理細胞に対するＰＫＫ ｍＲＮＡレベルの阻害率（％）として以下の表に表し、ＩＣ_５０値は、４値ロジスティックモデル（ＪＭＰ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を使用して計算した。結果は、オリゴヌクレオチドを細胞に人工的に移行することを促進するための試薬またはエレクトロポレーション技術を使用しない自由な取り込み条件下で、ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドが、ＧａｌＮＡｃ共役体を含まない親オリゴヌクレオチドより、有意に強力であったことを示している。

【1595】

【表196】

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出願時の請求の範囲
〔１〕
修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは、１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号３０〜２２２６の核酸塩基配列のいずれかの少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する、化合物。
〔２〕
修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号５７０の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する、化合物。
〔３〕
修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号７０５の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する、化合物。
〔４〕
修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号１６６６の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、または少なくとも１６の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する、化合物。
〔５〕
修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは２０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号５７０の核酸塩基配列を有する、化合物。
〔６〕
修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは２０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号７０５の核酸塩基配列を有する、化合物。
〔７〕
修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは１６個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号１６６６の核酸塩基配列を有する、化合物。
〔８〕
修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号６２、７２、１０３、２１３、３１２、３３４−３３９、３４４、３４５、３４６、３４８、３４９、３５１、３６９、３７３、３８１、３８２、３８３、３８５、３８７−３９１、３９９、４１１、４１２、４１４、４１６、４４４、４４６−４４９、４５２、４５３、４５４、４５９、４６０、４６２−４７２、４７３、４７６、４７７、４７９、４８０、４８１、４８４、４８９−４９５、４９７、５００、５０４、５０６、５２２、５２６、５３５、５５８、５５９、５６０、５６４、５６６、５６８−５７１、５７３、５７６、５７７、５７８、５８７、５９５、５９７−６０４、６０７、６０８、６１０、６１３、６１５、６１８、６１９、６２２、６２３、６２４、６３３、６３５、６３６、６３８、６３９、６４０、６４２、６４３、６４５、６５２、６５５−６５８、６６０、６６１、６７０、６７４−６７９、６８４、６８５、６９８、７０４、７０５、７０７、７０８、７１３、７１６、７１７、７２８、７３４、７３６、７６７、７６８、７７６、７９７、７９８、８００、８０２、８１０、８１５、８７６、８８０、８８２、８８３、８８６、８９１、９０１−９０５、９０８−９１１、９２２、９２３、９２４、９３１、９４２、９５０−９５７、９７２、９７４、９７８、９７９、９８０、９８７−９９１、１００５、１０１７−１０２１、１０２５、１０２６、１０２９、１０３０、１０３２、１０３４、１０３５、１０３７、１０４０、１０４１、１０４５、１０４６、１０５１、１０５４、１０５９、１０６０、１０６１、１０６４、１０６５、１０６６、１０７５、１０７６、１０８７、１０８９、１１１１、１１１４、１１１６、１１１７、１１２５、１１３３、１１５３、１１６９、１１７７、１１８１、１１８２、１１８７、１１９６、１２００、１２１４、１２２２、１２６７、１２７６、１２７７、１２８５、１２８６、１２８９、１２９０、１２９１、１３０３、１３６７、１３８９、１３９３、１３９８−１４０１、１４０６、１４０７、１４０８、１４１１、１４１９−１４２２、１４２６、１４３０、１４３１、１４３２、１４３４−１４３７、１４３９、１４４０、１４４３、１４４４、１４５１、１４５２、１４７１、１５１６、１５２７、１５３５、１５３７、１５３８、１５３９、１５４０、１５４１、１５６３、１５６４、１５６７、１５６８、１６１６、１６１７、１６２３、１６２９、１６６４、１６６５、１６６６、１６７９、１６８７、１７３４、１８０４、１８７６、１８８６、１９１５、２００８、２０１８、２１００、２１０１、２１１５、及び２１１６の核酸塩基配列のいずれかの少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、または少なくとも１６個の連続する核酸塩基配列を有する、化合物。
〔９〕
前記修飾オリゴヌクレオチドはＰＫＫの少なくとも８０％のｍＲＮＡの阻害を達成する、請求項８に記載の化合物。
〔１０〕
修飾オリゴヌクレオチド及び共役基から成り、前記修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号６２、７２、１０３、２１３、３３４−３３９、３４４、３４６、３４８、３４９、３５１、３８１、３８２、３８３、３８５、３８９、３９０、３９１、４４６、４４８、４５２、４５３、４５４、４６６−４７３、４７６、４８１、４８４、４９１、４９２、４９４、４９５、４９７、５０４、５２６、５５８、５５９、５６６、５６８−５７１、５７６、５７８、５８７、５９５、５９７、５９８、６００−６０４、６０７、６１０、６１３、６１８、６１９、６２４、６３５、６３８、６３９、６４５、６５２、６５６、６５７、６５８、６６０、６７４、６７５、６７６、６８４、６９８、７０４、７０５、７０７、７１３、７１６、７６８、８７６、８８０、９０１−９０５、９０８−９１１、９２２、９２３、９２４、９３１、９４２、９５１、９５４−９５７、９７２、９７４、９７８、９７９、９８７、９８８、９９０、１００５、１０１９、１０２０、１０２１、１０２５、１０３２、１０３７、１０４０、１０４１、１０４５、１０５４、１０５９、１０６０、１０６１、１０６４、１０６５、１０６６、１０７５、１１１１、１１１６、１１１７、１１２５、１１３３、１１５３、１１６９、１１７７、１２００、１２２２、１２６７、１２８５、１２９０、１２９１、１３０３、１３６７、１３９８、１３９９、１４０１、１４０６、１４０８、１４１１、１４１９、１４２０、１４２１、１４２６、１４３０、１４３１、１４３２、１４３４−１４３７、１４４０、１４４３、１４４４、１４５１、１５３７−１５４０、１５６３、１６１６、１６７９、１６８７、１８０４、２００８、２１０１、２１１５、及び２１１６の核酸塩基配列のいずれかの少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、または少なくとも１６個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する、化合物。
〔１１〕
前記修飾オリゴヌクレオチドはＰＫＫの少なくとも８５％のｍＲＮＡの阻害を達成する、請求項１０に記載の化合物。
〔１２〕
修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号３３４、３４６、３５１、３８２、３９０、３９１、４４６、４４８、４５２、４５３、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７６、４８１、４９１、４９５、５０４、５５８、５６６、５６８、５７０、５７１、５７８、５８７、５９７、５９８、６００、６０４、６１３、６３５、６３８、６４５、６５６、６５８、６６０、６７４、６７５、６８４、７０４、７０５、８８０、９０１−９０５、９０９、９２２、９３１、９５１、９５４、９５６、９９０、１００５、１０２０、１０３２、１０３７、１０４０、１０４１、１０４５、１０５４、１０７５、１１１１、１１２５、１１３３、１１５３、１２００、１２６７、１２９１、１３０３、１３９８、１３９９、１４０１、１４０６、１４２０、１４２６、１４３０、１４３１、１４３４、１４３５、１４３６、１４４０、１４４３、１４５１、１５３７−１５４０、２１１５、及び２１１６の核酸塩基配列のいずれかの少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、または少なくとも１６個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する、化合物。
〔１３〕
前記修飾オリゴヌクレオチドはＰＫＫの少なくとも９０％のｍＲＮＡの阻害を達成する、請求項１２に記載の化合物。
〔１４〕
修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号３３４、３９１、４４８、４６８、４６９、５６８、５７０、５９８、６３５、６５８、６７４、６８４、７０５、９０１、９０３、９０４、９２２、９９０、１２６７、１２９１、１４２０、１４３０、１４３１、１４３４、１４３５、１４３６、１５３７、１５３８、及び１５４０の核酸塩基配列のいずれかの少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、または少なくとも１６の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する、化合物。
〔１５〕
前記修飾オリゴヌクレオチドはＰＫＫの少なくとも９５％のｍＲＮＡの阻害を達成する、請求項１４に記載の化合物。
〔１６〕
修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号３３４、３３８、３４６、３４９、３８２、３８３、３９０、４４８、４５２、４５３、４５４、４９５、５２６、５５９、５７０、５８７、５９８、６３５、６６０、７０５、９０１、９０３、９０４、９０８、９２３、９３１、９５５、９７４、９８８、９９０、１０２０、１０３９、１０４０、１１１１、１１１７、１２６７、１２９１、１３４９、１３５２、１３６７、１３８９、１３９３、１３９９、１４０１、１４０８、１４１１、１４２６、１４９９、１５１６、１５３５、１５４４、１５４８、１５６３、１５６４、１５６８、１５６９、１５９８、１６１６、１６１７、１６２３、１６２４、１６４３、１６６１、１６６５、１６６６、１６７３、１６７９、１６９５、１７２０、１８０４、１８１７、１８７６、１８８１、１８８６、１９４０、１９４７、２００８、２０１８、２０１９、２０３１、２０４４、２１００、２１０１、２１１５、及び２１１６のいずれかの核酸塩基配列の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、または少なくとも１６個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する、化合物。
〔１７〕
前記修飾オリゴヌクレオチドは０．４以下のＩＣ_５０（μＭ）を達成する、請求項１６に記載の化合物。
〔１８〕
修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号３３４、３４６、３４９、３８２、４５３、４５４、４９５、５２６、５７０、５８７、５９８、６３５、６６０、９０１、９０３、９０４、９３１、９５５、９９０、１０２０、１１１１、１２６７、１３４９、１３５２、１３６７、１３８９、１３９９、１４０８、１４１１、１４２６、１５１６、１５３５、１５４４、１５４８、１５６３、１５６４、１５６８、１５６９、１５９８、１６１６、１６１７、１６２３、１６４３、１６６１、１６６５、１６６６、１６７３、１６９５、１８０４、１８７６、１８８１、２０１９、２０４４、２１００、２１０１、２１１５、及び２１１６の核酸塩基配列のいずれかの少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、または少なくとも１６の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する、化合物。
〔１９〕
前記修飾オリゴヌクレオチドは０．３以下のＩＣ_５０（μＭ）を達成する、請求項１８に記載の化合物。
〔２０〕
修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号３３４、３４６、３８２、４５３、４９５、５２６、５７０、５８７、５９８、６３５、９０１、９０４、９３１、９５５、１０２０、１１１１、１３４９、１３５２、１３８９、１４２６、１５１６、１５３５、１５４４、１５４８、１５６４、１５６９、１５９８、１６１６、１６１７、１６６５、１６６６、１８０４、１８７６、１８８１、２０１９、２０４４、２１０１、及び２１１６の核酸塩基配列のいずれかの少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、または少なくとも１６の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する、化合物。
〔２１〕
前記修飾オリゴヌクレオチドは、０．２以下のＩＣ_５０（μＭ）を達成する請求項２０に記載の化合物。
〔２２〕
修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号３３４、４９５、５８７、５９８、６３５、１３４９、１３５２、１３８９、１５１６、１５４４、１５４８、１５６９、１５９８、１６１７、１６６５、１６６６、１８０４、１８８１、及び２０１９の核酸塩基配列のいずれかの少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、または少なくとも１６個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する、化合物。
〔２３〕
前記修飾オリゴヌクレオチドは、０．２以下のＩＣ_５０（μＭ）を達成する、請求項２２に記載の化合物。
〔２４〕
修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号１０の核酸塩基２７４２７〜２７４６６の長さが等しい部分に相補的な、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む、化合物。
〔２５〕
修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号１０の核酸塩基３３１８３〜３３２４２の長さが等しい部分に相補的な、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む、化合物。
〔２６〕
修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号１０の核酸塩基３０５７０〜３０６１０の長さが等しい部分に相補的な、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む、化合物。
〔２７〕
修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号１０の核酸塩基２７４２７〜２７５２１の長さが等しい部分に相補的な、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む、化合物。
〔２８〕
修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号１０の核酸塩基３３０８５〜３３２４８の長さが等しい部分に相補的な、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む、化合物。
〔２９〕
修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号１０の核酸塩基３０４７５〜３０６３９の長さが等しい部分に相補的な、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む、化合物。
〔３０〕
修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号１０の核酸塩基２７３６２〜２７５２５の長さが等しい部分に相補的な、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む、化合物。
〔３１〕
修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号１０の核酸塩基３３１０１〜３３２４１の長さが等しい部分に相補的な、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む、化合物。
〔３２〕
修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、配列番号１０の核酸塩基３０４６３〜３０６３９の長さが等しい部分に相補的な、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む、化合物。
〔３３〕
修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドから成り、ＰＫＫ核酸のエクソン９、エクソン１２、またはエクソン１４の長さが等しい部分に相補的な、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む、化合物。
〔３４〕
前記修飾オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基配列は、配列番号１０と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相補的である、請求項２４〜３３に記載の化合物。
〔３５〕
一本鎖修飾オリゴヌクレオチド及び共役基からなる、前記請求項のいずれかに記載の化合物。
〔３６〕
少なくとも１つのヌクレオシド間結合は修飾ヌクレオシド間結合である、前記請求項のいずれかに記載の化合物。
〔３７〕
少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項３６に記載の化合物。
〔３８〕
前記修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホジエステルヌクレオシド間結合を含む、請求項３６に記載の化合物。
〔３９〕
前記修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つのホスホジエステルヌクレオシド間結合を含む、請求項３６に記載の化合物。
〔４０〕
修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも３つのホスホジエステルヌクレオシド間結合を含む、請求項３６に記載の化合物。
〔４１〕
前記修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも４つのホスホジエステルヌクレオシド間結合を含む、請求項３６に記載の化合物。
〔４２〕
前記修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも５つのホスホヌクレオシド間結合を含む、請求項３６に記載の化合物。
〔４３〕
前記修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも６つのホスホジエステルヌクレオシド間結合を含む、請求項３６に記載の化合物。
〔４４〕
前記修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも７つのホスホジエステルヌクレオシド間結合を含む、請求項３６に記載の化合物。
〔４５〕
前記修飾オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合及びホスホロチオエートヌクレオシド間結合から選択される、請求項３８〜４４のいずれかに記載の化合物。
〔４６〕
各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である、請求項３７に記載の化合物。
〔４７〕
少なくとも１つのヌクレオシドは修飾核酸塩基を含む、前記請求項のいずれかに記載の化合物。
〔４８〕
前記修飾核酸塩基は５−メチルシトシンである、請求項３９に記載の化合物。
〔４９〕
前記修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾糖を含む、前記請求項のいずれかに記載の化合物。
〔５０〕
前記修飾糖は２’修飾糖、ＢＮＡ、またはＴＨＰである、請求項４９に記載の化合物。
〔５１〕
前記修飾糖は、２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−Ｏ−メチル、拘束エチル、ＬＮＡ、または３’−フルオロＨＮＡのいずれかである、請求項５０に記載の化合物。
〔５２〕
少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシド、２’−Ｏ−メチルヌクレオシド、拘束エチルヌクレオシド、ＬＮＡヌクレオシド、または３’−フルオロ−ＨＮＡヌクレオシドを含む、前記請求項のいずれかに記載の化合物。
〔５３〕
前記修飾オリゴヌクレオチドは
１０個の連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント、
５個の連結されたヌクレオシドからなる５’ウイングセグメント、
５個の連結されたヌクレオシドからなる３’ウイングセグメント、
を含む、前記請求項に記載の化合物であって、前記ギャップセグメントは５’ウイングセグメントと３’ウイングセグメントの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは修飾糖を含む、前記化合物。
〔５４〕
前記修飾オリゴヌクレオチドは２０個の連結されたヌクレオシドからなる、前記請求項のいずれかに記載の化合物。
〔５５〕
前記修飾オリゴヌクレオチドは１９個の連結されたヌクレオシドからなる、前記請求項のいずれかに記載の化合物。
〔５６〕
前記修飾オリゴヌクレオチドは１８個の連結されたヌクレオシドからなる、前記請求項のいずれかに記載の化合物。
〔５７〕
共役基及び以下の式Ｔｅｓ Ｇｅｓ ｍＣｅｓ Ａｅｓ Ａｅｓ Ｇｄｓ Ｔｄｓ ｍＣｄｓ Ｔｄｓ ｍＣｄｓ Ｔｄｓ Ｔｄｓ Ｇｄｓ Ｇｄｓ ｍＣｄｓ Ａｅｓ Ａｅｓ Ａｅｓ ｍＣｅｓ Ａｅに従う修飾オリゴヌクレオチドからなる化合物であって、
Ａ＝アデニン、
ｍＣ＝５’−メチルシトシン、
Ｇ＝グアニン、
Ｔ＝チミン、
ｅ＝２’−Ｏ−メトキシメチル修飾ヌクレオシド、
ｄ＝２’−デオキシヌクレオシド、及び
ｓ＝ホスホロチオエートヌクレオシド間結合
である、化合物。
〔５８〕
共役基及び以下の式ｍＣｅｓ ｍＣｅｓ ｍＣｅｓ ｍＣｅｓ ｍＣｅｓ Ｔｄｓ Ｔｄｓ ｍＣｄｓ Ｔｄｓ Ｔｄｓ Ｔｄｓ Ａｄｓ Ｔｄｓ Ａｄｓ Ｇｄｓ ｍＣｅｓ ｍＣｅｓ Ａｅｓ Ｇｅｓ ｍＣｅに従う修飾オリゴヌクレオチドからなる化合物であって、
Ａ＝アデニン、
ｍＣ＝５’−メチルシトシン、
Ｇ＝グアニン、
Ｔ＝チミン、
ｅ＝２’−Ｏ−メトキシメチル修飾ヌクレオシド、
ｄ＝２’−デオキシヌクレオシド、及び
ｓ＝ホスホロチオエートヌクレオシド間結合
である、化合物。
〔５９〕
共役基及び以下の式ｍＣｅｓ Ｇｅｓ Ａｋｓ Ｔｄｓ Ａｄｓ Ｔｄｓ ｍＣｄｓ Ａｄｓ Ｔｄｓ Ｇｄｓ Ａｄｓ Ｔｄｓ Ｔｄｓ ｍＣｋｓ ｍＣｋｓ ｍＣｅに従う修飾オリゴヌクレオチドからなる化合物であって、
Ａ＝アデニン、
ｍＣ＝５’−メチルシトシン、
Ｇ＝グアニン、
Ｔ＝チミン、
ｅ＝２’−Ｏ−メトキシメチル修飾ヌクレオシド、
ｋ＝ｃＥｔ修飾ヌクレオシド、
ｄ＝２’−デオキシヌクレオシド、及び
ｓ＝ホスホロチオエートヌクレオシド間結合
である、化合物。
〔６０〕
以下の式に従う共役基及び修飾オリゴヌクレオチドからなる化合物。

【化1001】

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〔６１〕
以下の式に従う共役基及び修飾オリゴヌクレオチドからなる化合物。

【化1002】

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〔６２〕
以下の式に従う共役基及び修飾オリゴヌクレオチドからなる化合物。

【化1003】

[この文献は図面を表示できません]

〔６３〕
前記共役基は、前記修飾オリゴヌクレオチドの５’末端の前記修飾オリゴヌクレオチドに連結されている、請求項１〜６２のいずれかに記載の化合物。
〔６４〕
前記共役基は、前記修飾オリゴヌクレオチドの３’末端の前記修飾オリゴヌクレオチドに連結されている、請求項１〜６２のいずれかに記載の化合物。
〔６５〕
前記共役基は１つだけリガンドを含む、請求項１〜６４のいずれかの化合物。
〔６６〕
前記共役基は２つだけリガンドを含む、請求項１〜６４のいずれかに記載の化合物。
〔６７〕
前記共役基は３つ以上のリガンドを含む、請求項１〜６４のいずれかの化合物。
〔６８〕
前記共役基は３つだけリガンドを含む、請求項１〜６４のいずれかに記載の化合物。
〔６９〕
各リガンドは、多糖、修飾多糖、マンノース、ガラクトース、マンノース誘導体、ガラクトース誘導体、Ｄ−マンノピラノース、Ｌ−マンノピラノース、Ｄ−アラビノース、Ｌ−ガラクトース、Ｄ−キシロフラノース、Ｌ−キシロフラノース、Ｄ−グルコース、Ｌ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ガラクトース、α−Ｄ−マンノフラノース、β−Ｄ−マンノフラノース、α−Ｄ−マンノピラノース、β−Ｄ−マンノピラノース、α−Ｄ−グルコピラノース、β−Ｄ−グルコピラノース、α−Ｄ−グルコフラノース、β−Ｄ−グルコフラノース、α−Ｄ−フルクトフラノース、α−Ｄ−フルクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトピラノース、β−Ｄ−ガラクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトフラノース、β−Ｄ−ガラクトフラノース、グルコサミン、シアル酸、α−Ｄ−ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、２−アミノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−１−カルボキシエチル］−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース、２−デオキシ−２−メチルアミノ−Ｌ−グルコピラノース、４，６−ジデオキシ−４−ホルムアミド−２，３−ジ−Ｏ−メチル−Ｄ−マンノピラノース、２−デオキシ−２−スルホアミノ−Ｄ−グルコピラノース、Ｎ−グリコロイル−α−ノイラミン酸、５−チオ−β−Ｄ−グルコピラノース、メチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−１−チオ−６−Ｏ−トリチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、４−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノース、エチル３，４，６，７−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−１，５−ジチオ−α−Ｄ−グルコ−ヘプトピラノシド、２，５−アンヒドロ−Ｄ−アロノニトリル、リボース、Ｄ−リボース、Ｄ−４−チオリボース、Ｌ−リボース、Ｌ−４−チオリボースのなかから選択される、請求項６５〜６８のいずれか一項に記載の化合物。
〔７０〕
各リガンドは、Ｎ−アセチルガラクトサミンである、請求項６９に記載の化合物。
〔７１〕
前記共役基は以下を含む、請求項１〜６４のいずれかに記載の化合物。

【化1004】

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〔７２〕
前記共役基は以下を含む、請求項１〜６４のいずれかに記載の化合物。

【化1005】

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〔７３〕
前記共役基は以下を含む、請求項１〜６４のいずれかに記載の化合物。

【化1006】

[この文献は図面を表示できません]

〔７４〕
前記共役基は以下を含む、請求項１〜６４のいずれかに記載の化合物。

【化1007】

[この文献は図面を表示できません]

〔７５〕
前記共役基は以下を含む、請求項１〜６４のいずれかに記載の化合物。

【化1008】

[この文献は図面を表示できません]

〔７６〕
前記共役基は、少なくとも１つのリン共役基または中性の共役基を含む、請求項６４〜７０のいずれかに記載の化合物。
〔７７〕
前記共役基は以下のなかから選択される構造を含み、

【化1009-1】

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【化1009-2】

[この文献は図面を表示できません]

ｎは１〜１２であり、
ｍは１〜１２である、
請求項１〜７６のいずれかに記載の化合物。
〔７８〕
前記共役基は、以下のなかから選択される構造を有するテザーを有し、

【化10010】

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Ｌはリン共役基または中性連結基のいずれかであり、
Ｚ_１はＣ（＝Ｏ）ＯＲ_２であり、
Ｚ_２は、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_６アルキルまたは置換Ｃ_１−Ｃ_６アルキルであり、
Ｒ_２はＨ、Ｃ_１−Ｃ_６アルキルまたは置換Ｃ_１−Ｃ_６アルキルであり、
各ｍ_１は独立して０〜２０であり、少なくとも１つのｍ_１は各テザーにつき０よりも大きい、
請求項１〜７６のいずれかに記載の化合物。
〔７９〕
共役基は以下のなかから選択される構造を有するテザーを有し、

【化10011】

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Ｚ_２はＨまたはＣＨ_３であり、
各ｍ_１は独立して０〜２０であり、少なくとも１つのｍ_１は各テザーにつき０よりも大きい、
請求項７８に記載の化合物。
〔８０〕
前記共役基は、以下のなかから選択される構造を有するテザーを有し、

【化10012】

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；
ｎは１〜１２であり、
ｍは１〜１２である、
請求項６４〜７０のいずれかに記載の化合物。
〔８１〕
前記共役基は修飾オリゴヌクレオチドに共有結合で結合されている、請求項１〜８０のいずれかに記載の化合物。
〔８２〕
以下の式によって表される構造を有し、

【化10013】

[この文献は図面を表示できません]

ここで、
Ａは修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂは切断可能部分であり、
Ｃは共役リンカーであり、
Ｄは分岐基であり、
各Ｅはテザーであり、
各Ｆはリガンドであり、
ｑは１〜５の整数である、
請求項１〜８１のいずれかに記載の化合物。
〔８３〕
以下の式によって表される構造を有し、

【化10014】

[この文献は図面を表示できません]

ここで、
Ａは修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂは切断可能部分であり、
Ｃは共役リンカーであり、
Ｄは分岐基であり、
各Ｅはテザーであり、
各Ｆはリガンドであり、
各ｎは独立して０または１であり、
ｑは１〜５の整数である、
請求項１〜８１のいずれかに記載の化合物。
〔８４〕
以下の式によって表される構造を有し、

【化10015】

[この文献は図面を表示できません]

ここで、
Ａは修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂは切断可能部分であり、
Ｃは共役リンカーであり、
各Ｅはテザーであり、
各Ｆはリガンドであり、
ｑは１〜５の整数である、
請求項１〜８１のいずれかに記載の化合物。
〔８５〕
以下の式によって表される構造を有し、

【化10016】

[この文献は図面を表示できません]

ここで、
Ａは修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｃは共役リンカーであり、
Ｄは分岐基であり、
各Ｅはテザーであり、
各Ｆはリガンドであり、
ｑは１〜５の整数である、
請求項１〜８１のいずれかに記載の化合物。
〔８６〕
以下の式によって表される構造を有し、

【化10017】

[この文献は図面を表示できません]

ここで、
Ａは修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｃは共役リンカーであり、
各Ｅはテザーであり、
各Ｆはリガンドであり、
ｑは１〜５の整数である、
請求項１〜８１のいずれかに記載の化合物。
〔８７〕
以下の式によって表される構造を有し、

【化10018】

[この文献は図面を表示できません]

ここで、
Ａは修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂは切断可能部分であり、
Ｄは分岐基であり、
各Ｅはテザーであり、
各Ｆはリガンドであり、
ｑは１〜５の整数である、
請求項１〜８１のいずれかに記載の化合物。
〔８８〕
以下の式によって表される構造を有し、

【化10019】

[この文献は図面を表示できません]

ここで、
Ａは修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂは切断可能部分であり、
各Ｅはテザーであり、
各Ｆはリガンドであり、
ｑは１〜５の整数である、
請求項１〜８１のいずれかに記載の化合物。
〔８９〕
以下の式によって表される構造を有し、

【化10020】

[この文献は図面を表示できません]

ここで、
Ａは修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｄは分岐基であり、
各Ｅはテザーであり、
各Ｆはリガンドであり、
ｑは１〜５の整数である、
請求項１〜８１のいずれかに記載の化合物。
〔９０〕
前記共役リンカーは、以下のなかから選択される構造を有し、

【化10021】

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ここで、各Ｌは、独立して、リン共役基または中性の共役基であり、
各ｎは独立して１〜２０である、
請求項８２〜８９のいずれかに記載の化合物。
〔９２〕
前記共役リンカーは、以下のなかから選択される構造を有する、請求項８３〜９０のいずれかに記載の化合物：

【化10022】

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〔９３〕
前記共役リンカーは以下の構造を有する、請求項８３〜９０のいずれかに記載の化合物：

【化10023】

[この文献は図面を表示できません]

〔９４〕
前記共役リンカーは、以下のなかから選択される構造を有する、請求項８３〜９０のいずれかに記載の化合物：

【化10024】

[この文献は図面を表示できません]

〔９５〕
前記共役リンカーは、以下のなかから選択される構造を有する、請求項８３〜９０のいずれかに記載の化合物：

【化10025】

[この文献は図面を表示できません]

〔９６〕
前記共役リンカーは、以下のなかから選択される構造を有する、請求項８３〜９０のいずれかに記載の化合物：

【化10026】

[この文献は図面を表示できません]

〔９７〕
前記共役リンカーはピロリジンを含む、請求項８３〜９６のいずれかに記載の化合物。
〔９８〕
前記共役リンカーはピロリジンを含まない、請求項８３〜９６のいずれかに記載の化合物。
〔９９〕
前記共役リンカーはＰＥＧを含む、請求項８３〜９８のいずれかに記載の化合物。
〔１００〕
前記共役リンカーはアミドを含む、請求項８３〜９９のいずれかに記載の化合物。
〔１０１〕
前記共役リンカーは、少なくとも２つのアミドを含む、請求項８３〜９９のいずれかに記載の化合物。
〔１０２〕
前記共役リンカーはアミドを含まない、請求項８３〜９９のいずれかに記載の化合物。
〔１０３〕
前記共役リンカーはポリアミドを含む、請求項８３〜１０２のいずれかに記載の化合物。
〔１０４〕
前記共役リンカーはアミンを含む、請求項８３〜１０３のいずれかに記載の化合物。
〔１０５〕
前記共役リンカーは、２つ以上のジスルフィド結合を含む、請求項８３〜１０４のいずれかに記載の化合物。
〔１０６〕
前記共役リンカーはタンパク質結合部分を含む、請求項８３〜１０５のいずれかに記載の化合物。
〔１０７〕
前記タンパク質結合部分は脂質を含む、請求項１０６に記載の化合物。
〔１０８〕
前記タンパク質結合部分は、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）、ビタミン（例えば、葉酸、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビオチン、ピリドキサール）、ペプチド、炭水化物（例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、多糖）、エンドソーム溶解成分、ステロイド（例えば、ウバオール、ｈｅｃｉｇｅｎｉｎ、ジオスゲニン）、テルペン（例えば、トリテルペン、例えば、サルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデリノール誘導体化リトコール酸）、またはカチオン性脂質のなかから選択される、請求項１０６に記載の化合物。
〔１０９〕
前記タンパク質結合部分は、Ｃ１６〜Ｃ２２長鎖の飽和もしくは不飽和脂肪酸、コレステロール、コール酸、ビタミンＥ、アダマンタンまたは１−ペンタフルオロプロピルのなかから選択される請求項１０６に記載の化合物。
〔１１０〕
前記共役リンカーは、以下のなかから選択される構造を有し、

【化10027】

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ここで、各ｎは独立して１〜２０であり、ｐは１から６である、
請求項８２〜１０９のいずれかに記載の化合物。
〔１１１〕
前記共役リンカーは、以下のなかから選択される構造を有し、

【化10028】

[この文献は図面を表示できません]

ここで、各ｎは独立して１〜２０である、
請求項８２〜１１０のいずれかに記載の化合物。
〔１１２〕
前記共役リンカーは、以下のなかから選択される構造を有する、請求項８２〜１１０のいずれかに記載の化合物：

【化10029】

[この文献は図面を表示できません]

〔１１３〕
前記共役リンカーは、以下のなかから選択される構造を有し、

【化10030】

[この文献は図面を表示できません]

ｎは１〜２０である、
請求項８２〜１１０のいずれかに記載の化合物。
〔１１４〕
前記共役リンカーは、以下のなかから選択される構造を有する、請求項８２〜１１０のいずれかに記載の化合物：

【化10031】

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〔１１５〕
前記共役リンカーは、以下のなかから選択される構造を有し、

【化10032】

[この文献は図面を表示できません]

ここで、各ｎは独立して、０、１、２、３、４、５、６、または７である、
請求項８２〜１１０のいずれかに記載の化合物。
〔１１６〕
前記共役リンカーは、以下の構造を有する、請求項８２〜１１０のいずれかに記載の化合物：

【化10033】

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〔１１７〕
前記分枝基は、以下の構造の１つを有し、

【化10034】

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ここで、各Ａ_１は独立してＯ、Ｓ、Ｃ＝ＯまたはＮＨであり、
各ｎは独立して１〜２０である、
請求項８２〜１１６のいずれかに記載の化合物。
〔１１８〕
前記分枝基は以下の構造の１つを有し、

【化10035】

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各Ａ_１は独立してＯ、Ｓ、Ｃ＝ＯまたはＮＨであり、
各ｎは独立して１〜２０である、
請求項８２〜１１６のいずれかに記載の化合物。
〔１１９〕
前記分枝基は、以下の構造を有する、請求項８２〜１１６のいずれかに記載の化合物：

【化10036】

[この文献は図面を表示できません]

〔１２０〕
前記分枝基は以下の構造を有する、請求項８２〜１１６のいずれかに記載の化合物：

【化10037】

[この文献は図面を表示できません]

〔１２１〕
前記分枝基は、以下の構造を有する、請求項８２〜１１６のいずれかに記載の化合物：

【化10038】

[この文献は図面を表示できません]

〔１２２〕
前記分枝基は、以下の構造を有する、請求項８２〜１１６のいずれかに記載の化合物：

【化10039】

[この文献は図面を表示できません]

〔１２３〕
前記分岐基はエーテルを含む、請求項８２〜１１６のいずれかに記載の化合物。
〔１２４〕
前記分枝基は、以下の構造を有し、

【化10040】

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ここで、各ｎは独立して１〜２０であり、
ｍは２から６である、
請求項８２〜１１６のいずれかに記載の化合物。
〔１２５〕
前記分枝基は、以下の構造を有する、請求項８２〜１１６のいずれかに記載の化合物：

【化10041】

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〔１２６〕
前記分枝基は、以下の構造を有する、請求項８２〜１１６のいずれかに記載の化合物：

【化10042】

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〔１２７〕
前記分岐基は以下を含み、

【化10043】

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ここで、各ｊは１から３の整数であり、
前記各ｎは１から２０の整数である、
請求項８２〜１１６のいずれかに記載の化合物。
〔１２８〕
前記分岐基は以下を含む請求項８２〜１１６のいずれかに記載の化合物：

【化10044】

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〔１２９〕
各テザーは、以下のなかから選択され、

【化10045】

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ここで、Ｌは、リン共役基及び中性の共役基から選択され、
Ｚ_１はＣ（＝Ｏ）ＯＲ_２であり、
Ｚ_２は、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_６アルキルまたは置換Ｃ_１−Ｃ_６アルキルであり、
Ｒ_２はＨ、Ｃ_１−Ｃ_６アルキルまたは置換Ｃ_１−Ｃ_６アルキルであり、
各ｍ_１は独立して０〜２０であり、少なくとも１つのｍ_１は各テザーにつき０よりも大きい、
請求項８２〜１２８のいずれかに記載の化合物。
〔１３０〕
各テザーは、以下のなかから選択され、

【化10046】

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Ｚ_２はＨまたはＣＨ_３であり、
各ｍ_２は独立して０〜２０であり、少なくとも１つのｍ_２は各テザーにつき０よりも大きい、
請求項８２〜１２８のいずれかに記載の化合物。
〔１３１〕
各テザーは、以下のなかから選択され、

【化10047】

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ｎは１〜１２であり、
ｍは１〜１２である、
請求項８２〜１２８のいずれかに記載の化合物。
〔１３２〕
少なくとも１つのテザーはエチレングリコールを含む、請求項８２〜１２８のいずれかに記載の化合物。
〔１３３〕
少なくとも１つのテザーはアミドを含む、請求項８２〜１２８または１３０のいずれかに記載の化合物。
〔１３４〕
少なくとも１つのテザーはポリアミドを含む、請求項８２〜１２８または１３０のいずれかに記載の化合物。
〔１３５〕
少なくとも１つのテザーはアミンを含む、請求項８２〜１２８または１３０のいずれかに記載の化合物。
〔１３６〕
少なくとも２つのテザーは互いに異なっている、請求項８２〜１２８または１３０のいずれかに記載の化合物。
〔１３７〕
テザーの全ては互いに同じである、請求項８２〜１２８または１３０のいずれかに記載の化合物。
〔１３８〕
各テザーは、以下のなかから選択され、

【化10048】

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ここで、各ｎは独立して１〜２０であり、
各ｐは１から約６である、
請求項８２〜１２８のいずれかに記載の化合物。
〔１３９〕
各テザーは、以下のなかから選択される、請求項８２〜１２８のいずれかに記載の化合物：

【化10049】

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〔１４０〕
各テザーは、以下の構造を有し、

【化10050】

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各ｎは独立して１〜２０である、
請求項８２〜１２８のいずれかに記載の化合物。
〔１４１〕
各テザーは、以下の構造を有する、請求項８２〜１２８のいずれかに記載の化合物：

【化10051】

[この文献は図面を表示できません]

〔１４２〕
前記テザーは、以下のなかから選択される構造を有し、

【化10052】

[この文献は図面を表示できません]

各ｎは独立して、０、１、２、３、４、５、６、または７である、
請求項８２〜１２８のいずれかに記載の化合物。
〔１４３〕
前記テザーは、以下のなかから選択される構造を有する、請求項８２〜１２８のいずれかに記載の化合物：

【化10053】

[この文献は図面を表示できません]

〔１４４〕
前記リガンドはガラクトースである、請求項１４０〜１４３のいずれかに記載の化合物。
〔１４５〕
前記リガンドはマンノース−６−リン酸である、請求項１４０〜１４３のいずれかに記載の化合物。
〔１４６〕
各リガンドは以下のなかから選択され、

【化10054】

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各Ｒ_１はＯＨ及びＮＨＣＯＯＨから選択される、
請求項１４０〜１４３のいずれかに記載の化合物。
〔１４７〕
各リガンドは以下のなかから選択される、請求項１４０〜１４３のいずれかに記載の化合物：

【化10055】

[この文献は図面を表示できません]

〔１４８〕
各リガンドは以下の構造を有する、請求項１４０〜１４３のいずれかに記載の化合物：

【化10056】

[この文献は図面を表示できません]

〔１４９〕
各リガンドは以下の構造を有する、請求項１４０〜１４３のいずれかに記載の共役されるアンチセンス化合物：

【化10057】

[この文献は図面を表示できません]

〔１５０〕
前記共役基は細胞標的化部分を含む、前記請求項のいずれかに記載の化合物。
〔１５１〕
前記共役基は以下の構造を有する細胞標的化部分を含み、

【化10058】

[この文献は図面を表示できません]

各ｎは独立して１〜２０である、
請求項１５０に記載の化合物。
〔１５２〕
前記細胞標的化部分は以下の構造を有する、請求項１５０に記載の化合物：

【化10059】

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〔１５３〕
細胞標的化部分は以下の構造を有し、

【化10060】

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各ｎは独立して１〜２０である、
請求項１５０に記載の化合物。
〔１５４〕
前記細胞標的化部分は以下の構造を有する、請求項１５０に記載の化合物：

【化10061】

[この文献は図面を表示できません]

〔１５５〕
前記細胞標的化部分は以下を含む、請求項１５０に記載の化合物：

【化10062】

[この文献は図面を表示できません]

〔１５６〕
前記細胞標的化部分は以下を含む、請求項１５０に記載の化合物：

【化10063】

[この文献は図面を表示できません]

〔１５７〕
前記細胞標的化部分は以下の構造を有する、請求項１５０に記載の化合物：

【化10064】

[この文献は図面を表示できません]

〔１５８〕
前記細胞標的化部分は以下の構造を有する、請求項１５０に記載の化合物：

【化10065】

[この文献は図面を表示できません]

〔１５９〕
前記細胞標的化部分は以下を含む、請求項１５０に記載の化合物：

【化10066】

[この文献は図面を表示できません]

〔１６０〕
前記細胞標的化部分は以下の構造を有する、請求項１５０に記載の化合物：

【化10067】

[この文献は図面を表示できません]

〔１６１〕
前記細胞標的化部分は以下を含む、請求項１５０に記載の化合物：

【化10068】

[この文献は図面を表示できません]

〔１６２〕
前記細胞標的化部分は以下を含む、請求項１５０に記載の化合物：

【化10069】

[この文献は図面を表示できません]

〔１６３〕
前記細胞標的化部分は以下を含む、請求項１５０に記載の化合物：

【化10070】

[この文献は図面を表示できません]

〔１６４〕
前記細胞標的化部分は以下の構造を有する、請求項１５０に記載の化合物：

【化10071】

[この文献は図面を表示できません]

〔１６５〕
前記細胞標的化部分は以下の構造を有する、請求項１５０に記載の化合物：

【化10072】

[この文献は図面を表示できません]

〔１６６〕
前記細胞標的化部分は以下の構造を有する、請求項１５０に記載の化合物：

【化10073】

[この文献は図面を表示できません]

〔１６７〕
前記細胞標的化部分は以下の構造を有する、請求項１５０に記載の化合物：

【化10074】

[この文献は図面を表示できません]

〔１６８〕
前記細胞標的化部分は以下の構造を有する、請求項１５０に記載の化合物：

【化10075】

[この文献は図面を表示できません]

〔１６９〕
前記細胞標的化部分は以下を含む、請求項１５０に記載の化合物：

【化10076】

[この文献は図面を表示できません]

〔１７０〕
前記細胞標的化部分は以下を含む、請求項１５０に記載の化合物：

【化10077】

[この文献は図面を表示できません]

〔１７１〕
前記細胞標的化部分は以下を含む、請求項１５０に記載の化合物：

【化10078】

[この文献は図面を表示できません]

〔１７２〕
前記細胞標的化部分は以下を含む、請求項１５０に記載の化合物：

【化10079】

[この文献は図面を表示できません]

〔１７３〕
前記細胞標的化部分は以下の構造を有する、請求項１５０に記載の化合物：

【化10080】

[この文献は図面を表示できません]

〔１７４〕
前記細胞標的化部分は以下を含む、請求項１５０に記載の化合物：

【化10081】

[この文献は図面を表示できません]

〔１７５〕
前記細胞標的化部分は以下の構造を有する、請求項１５０に記載の化合物：

【化10082】

[この文献は図面を表示できません]

〔１７６〕
前記細胞標的化部分は以下を含み、

【化10083】

[この文献は図面を表示できません]

各Ｙは、Ｏ、Ｓ、置換もしくは非置換Ｃ_１−Ｃ_１０アルキル、アミノ、置換アミノ、アジド、アルケニルまたはアルキニルから選択される、請求項１５０に記載の化合物。
〔１７７〕
前記共役基は以下を含み、

【化10084】

[この文献は図面を表示できません]

；
各Ｙは、Ｏ、Ｓ、置換もしくは非置換Ｃ_１−Ｃ_１０アルキル、アミノ、置換アミノ、アジド、アルケニルまたはアルキニルから選択される、請求項１５０に記載の化合物。
〔１７８〕
前記細胞標的化部分は以下の構造を有し、

【化10085】

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；

各Ｙは、Ｏ、Ｓ、置換もしくは非置換Ｃ_１−Ｃ_１０アルキル、アミノ、置換アミノ、アジド、アルケニルまたはアルキニルから選択される、請求項１５０に記載の化合物。
〔１７９〕
前記共役基は以下を含む、前記請求項のいずれかに記載の化合物：

【化10086】

[この文献は図面を表示できません]

〔１８０〕
前記共役基は以下を含む、前記請求項のいずれかに記載の化合物：

【化10087】

[この文献は図面を表示できません]

〔１８１〕
前記共役基は以下を含む、前記請求項のいずれかに記載の化合物：

【化10088】

[この文献は図面を表示できません]

〔１８２〕
前記共役基は以下を含む、前記請求項のいずれかに記載の化合物：

【化10089】

[この文献は図面を表示できません]

〔１８３〕
前記共役基は、ホスホジエステル、アミド、またはエステルのなかから選択される切断可能部分を含む、前記請求項のいずれかに記載の化合物。
〔１８４〕
前記共役基は、ホスホジエステル切断可能部分を含む、前記請求項のいずれかに記載の化合物。
〔１８５〕
前記共役基は、切断可能部分を含まず、前記共役基は、前記共役基と前記オリゴヌクレオチドの間にホスホロチオエート結合を含む、前記請求項のいずれかに記載の化合物。
〔１８６〕
前記共役基はアミド切断可能部分を含む、前記請求項のいずれかに記載の化合物。
〔１８７〕
前記共役基は、エステル切断可能部分を含む、前記請求項のいずれかに記載の化合物。
〔１８８〕
以下の構造を有し、

【化10090】

[この文献は図面を表示できません]

各ｎは独立して１〜２０であり、
Ｑ_１３はＨまたはＯ（ＣＨ_２）_２−ＯＣＨ_３であり、
Ａは修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂｘは複素環式塩基部分である、
前記請求項のいずれかに記載の化合物。
〔１８９〕
以下の構造を有し、

【化10091】

[この文献は図面を表示できません]

各ｎは独立して１〜２０であり、
Ｑ_１３はＨまたはＯ（ＣＨ_２）_２−ＯＣＨ_３であり、
Ａは修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂｘは複素環式塩基部分である、
前記請求項のいずれかに記載の化合物。
〔１９０〕
以下の構造を有し、

【化10092】

[この文献は図面を表示できません]

各ｎは独立して１〜２０であり、
Ｑ_１３はＨまたはＯ（ＣＨ_２）_２−ＯＣＨ_３であり、
Ａは修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｚは、Ｈまたは連結された固体支持体であり、
Ｂｘは複素環式塩基部分である、
前記請求項のいずれかに記載の化合物。
〔１９１〕
以下の構造を有し、

【化10093】

[この文献は図面を表示できません]

各ｎは独立して１〜２０であり、
Ｑ_１３はＨまたはＯ（ＣＨ_２）_２−ＯＣＨ_３であり、
Ａは修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｚは、Ｈまたは連結された固体支持体であり、
Ｂｘは複素環式塩基部分である、
前記請求項のいずれかに記載の化合物。
〔１９２〕
以下の構造を有し、

【化10094】

[この文献は図面を表示できません]

Ｑ_１３はＨまたはＯ（ＣＨ_２）_２−ＯＣＨ_３であり、
Ａは修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂｘは複素環式塩基部分である、
前記請求項のいずれかに記載の化合物。
〔１９３〕
以下の構造を有し、

【化10095】

[この文献は図面を表示できません]

、
Ｑ_１３はＨまたはＯ（ＣＨ_２）_２−ＯＣＨ_３であり、
Ａは修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂｘは複素環式塩基部分である、
前記請求項のいずれかに記載の化合物。
〔１９４〕
以下の構造を有し、

【化10096】

[この文献は図面を表示できません]

、
Ｑ_１３はＨまたはＯ（ＣＨ_２）_２−ＯＣＨ_３であり、
Ａは修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂｘは複素環式塩基部分である、
前記請求項のいずれかに記載の化合物。
〔１９５〕
以下の構造を有し、

【化10097】

[この文献は図面を表示できません]

Ｑ_１３はＨまたはＯ（ＣＨ_２）_２−ＯＣＨ_３であり、
Ａは修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂｘは複素環式塩基部分である、
前記請求項のいずれかに記載の化合物。
〔１９６〕
以下の構造を有し、

【化10098】

[この文献は図面を表示できません]

Ｑ_１３はＨまたはＯ（ＣＨ_２）_２−ＯＣＨ_３であり、
Ａは修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂｘは複素環式塩基部分である、
前記請求項のいずれかに記載の化合物。
〔１９７〕
以下の構造を有し、

【化10099】

[この文献は図面を表示できません]

Ｑ_１３はＨまたはＯ（ＣＨ_２）_２−ＯＣＨ_３であり、
Ａは修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂｘは複素環式塩基部分である、
前記請求項のいずれかに記載の化合物。
〔１９８〕
以下の構造を有し、

【化100100】

[この文献は図面を表示できません]

Ｑ_１３はＨまたはＯ（ＣＨ_２）_２−ＯＣＨ_３であり、
Ａは修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂｘは複素環式塩基部分である、
前記請求項のいずれかに記載の化合物。
〔１９９〕
以下の構造を有し、

【化100101】

[この文献は図面を表示できません]

Ｑ_１３はＨまたはＯ（ＣＨ_２）_２−ＯＣＨ_３であり、
Ａは修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂｘは複素環式塩基部分である、
前記請求項のいずれかに記載の化合物。
〔２００〕
以下の構造を有し、

【化100102】

[この文献は図面を表示できません]

Ｑ_１３はＨまたはＯ（ＣＨ_２）_２−ＯＣＨ_３であり、
Ａは修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂｘは複素環式塩基部分である、
前記請求項のいずれかに記載の化合物。
〔２０１〕
以下の構造を有し、

【化100103】

[この文献は図面を表示できません]

Ｑ_１３はＨまたはＯ（ＣＨ_２）_２−ＯＣＨ_３であり、
Ａは修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂｘは複素環式塩基部分である、
前記請求項のいずれかに記載の化合物。
〔２０２〕
以下の構造を有し、

【化100104】

[この文献は図面を表示できません]

Ｑ_１３はＨまたはＯ（ＣＨ_２）_２−ＯＣＨ_３であり、
Ａは修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂｘは複素環式塩基部分である、
前記請求項のいずれかに記載の化合物。
〔２０３〕
前記共役基は以下を含み、

【化100105】

[この文献は図面を表示できません]

Ｑ_１３はＨまたはＯ（ＣＨ_２）_２−ＯＣＨ_３であり、
Ａは修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂｘは複素環式塩基部分である、
前記請求項のいずれかに記載の化合物。
〔２０４〕
前記共役基は以下を含み、

【化100106】

[この文献は図面を表示できません]

Ｑ_１３はＨまたはＯ（ＣＨ_２）_２−ＯＣＨ_３であり、
Ａは修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂｘは複素環式塩基部分である、
前記請求項のいずれかに記載の化合物。
〔２０５〕
前記共役基は以下を含み、

【化100107】

[この文献は図面を表示できません]

Ｑ_１３はＨまたはＯ（ＣＨ_２）_２−ＯＣＨ_３であり、
Ａは修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂｘは複素環式塩基部分である、
前記請求項のいずれかに記載の化合物。
〔２０６〕
Ｂ_ｘは、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、またはシトシンまたは５−メチルシトシンのなかから選択される、前記請求項のいずれかに記載の化合物。
〔２０７〕
Ｂ_ｘはアデニンである、前記請求項のいずれかに記載の化合物。
〔２０８〕
Ｂ_ｘはチミンである、前記請求項のいずれかに記載の化合物。
〔２０９〕
Ｑ_１３はＯ（ＣＨ_２）_２−ＯＣＨ_３である、前記請求項のいずれかに記載の化合物。
〔２１０〕
Ｑ_１３はＨである、前記請求項のいずれかに記載の化合物。
〔２１１〕
以下に記載の修飾オリゴヌクレオチドからなる化合物：

【化100108】

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〔２１２〕
前記請求項のいずれかに記載の化合物またはその塩、及び医薬的に許容される担体または希釈剤の少なくとも１つを含む組成物。
〔２１３〕
請求項１〜２１２のいずれかの化合物を含むプロドラッグ。
〔２１４〕
前記請求項のいずれかに記載の化合物またはその塩、及び医薬的に許容される担体または希釈剤の少なくとも１つを含む組成物。
〔２１５〕
動物に前記請求項のいずれかに記載の化合物または組成物を投与することを含む方法。
〔２１６〕
前記動物はヒトである、請求項２１５に記載の方法。
〔２１７〕
前記化合物を投与することによりＰＫＫ関連疾患、障害または病態を予防、治療、または改善する、請求項２１５または２１６に記載の方法。
〔２１８〕
前記ＰＫＫ関連疾患、障害または病態は、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）、浮腫、血管浮腫、腫脹、目蓋の血管浮腫、眼の浮腫、黄斑浮腫、脳浮腫、血栓症、塞栓症、血栓塞栓症、深部静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、脳卒中、または梗塞である、請求項２１７に記載の方法。
〔２１９〕
炎症性疾患または血栓塞栓性疾患を治療するための医薬品を製造するための前記請求項のいずれかに記載の化合物または組成物の使用。

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]