特許 6665281 安定性が増加されたヒト繊維芽細胞成長因子−２変異体及びその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6665281

(24)【登録日】2020年2月21日

(45)【発行日】2020年3月13日

(54)【発明の名称】安定性が増加されたヒト繊維芽細胞成長因子−２変異体及びその用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/18 20060101AFI20200302BHJP

   C07K 14/50 20060101ALI20200302BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20200302BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20200302BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20200302BHJP

   C12N 5/00 20060101ALI20200302BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20200302BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20200302BHJP

   A61K 38/18 20060101ALI20200302BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20200302BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20200302BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20200302BHJP

   A61K 8/64 20060101ALI20200302BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/18ZNA

   C07K14/50

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/00

   C12P21/02 H

   C12N15/63 Z

   A61K38/18

   A61P17/00

   A61P43/00 111

   A61Q19/00

   A61K8/64

【請求項の数】9

【全頁数】25

(21)【出願番号】特願2018-515742(P2018-515742)

(86)(22)【出願日】2015年7月24日

(65)【公表番号】特表2018-522580(P2018-522580A)

(43)【公表日】2018年8月16日

(86)【国際出願番号】KR2015007734

(87)【国際公開番号】WO2016195157

(87)【国際公開日】20161208

【審査請求日】2018年6月19日

(31)【優先権主張番号】10-2015-0078930

(32)【優先日】2015年6月4日

(33)【優先権主張国】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】517421884

【氏名又は名称】ピーエヌピー、バイオファーム、カンパニー、リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＰＮＰ ＢＩＯＰＨＡＲＭ ＣＯ．， ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】100091982

【弁理士】

【氏名又は名称】永井 浩之

(74)【代理人】

【識別番号】100091487

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 行孝

(74)【代理人】

【識別番号】100082991

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 泰和

(74)【代理人】

【識別番号】100105153

【弁理士】

【氏名又は名称】朝倉 悟

(74)【代理人】

【識別番号】100120617

【弁理士】

【氏名又は名称】浅野 真理

(74)【代理人】

【識別番号】100126099

【弁理士】

【氏名又は名称】反町 洋

(72)【発明者】

【氏名】シン、ハン−チョル

(72)【発明者】

【氏名】オ、ジョン−グァン

【審査官】 千葉 直紀

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０５−２６２７９８（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１のアミノ酸配列において、６９番目及び８７番目システインがセリンに置換され、７５番目アラニンがシステインに置換され、５０番目ヒスチジンがチロシンに置換された、高安定性の塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）変異体。

【請求項2】

請求項１に記載の変異体をコードする、遺伝子。

【請求項3】

前記遺伝子が、配列番号２のＤＮＡ塩基配列からなる、請求項２に記載の遺伝子。

【請求項4】

請求項２に記載の遺伝子を含む、発現ベクター。

【請求項5】

請求項４に記載の発現ベクターによって形質転換された、形質転換体。

【請求項6】

次のステップを含む、高安定性の塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）変異体の生産方法：
（ａ）請求項５に記載の形質転換体を培養するステップ；及び
（ｂ）前記ステップ（ａ）で得られた培養液から変異体を分離するステップ。

【請求項7】

前記（ｂ）ステップが、
（ｃ）前記形質転換体を細胞破砕し凝集体を分離するステップ；
（ｄ）前記分離された凝集体を除去するステップ；
（ｅ）前記凝集体が除去された上清をイオン交換樹脂クロマトグラフィーを用いて分離精製するステップ；及び
（ｆ）イオン交換樹脂後に高安定性塩基性繊維芽細胞成長因子変異体をヘパリン親和クロマトグラフィーを用いて分離精製するステップ
をさらに含むことを特徴とする、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

請求項１に記載の高安定性ｂＦＧＦ変異体を有効成分として含む、皮膚状態の改善用化粧料組成物。

【請求項9】

請求項１に記載の高安定性ｂＦＧＦ変異体を有効成分として含む、皮膚疾患の予防又は治療用薬学的組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、高安定性塩基性繊維芽細胞成長因子変異体及びその用途に関する。

【背景技術】

【0002】

成長因子は、細胞の成長、増殖、分化を調節する重要な役割を果たす。したがって、私たちの体は、傷、手術など内的及び外的要因による皮膚の損傷と老化に対して自然に修復するシステムが存在し、ここで重要な役割を担うのが成長因子である。各組織の機能を維持するために、様々な成長因子などが生成され、一定の濃度に維持されて機能を遂行している。加齢に応じて、皮膚などの各組織で成長因子の濃度は低くなり、細胞の再生及び分裂機能が弱くなり、しわが形成され、弾力性が減少するなど、老化が進む。

【0003】

そのうちｂＦＧＦ（Ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ−２）は、１５４個のアミノ酸から構成されており、分子量１７．１２３ダルトン（Ｄａｌｔｏｎ）のポリペプチドから構成されている。これは発生、血管生成そして傷の治癒に重要な役割を果たす。ＦＧＦ−２は、マイトジェン（有糸分裂物質）と化学走化性因子として、傷の治癒、血管の生成、そして神経系の成長において強い媒体である。

【0004】

しかし、このような血液及び組織に存在する成長因子の場合、その体内半減期が数分程度で非常に短いことが知られており、特にｂＦＧＦの場合、その構造上にジスルフィド結合を形成しない４つのシステイン残基を有することにより、その安定性に多くの影響を受けるという問題がある。

【0005】

また、ｂＦＧＦのようなタンパク質治療剤の生物学的利用度は、短いプラズマ半減期及びプロテアーゼに対する感受性によってしばしば制限されて、最大の臨床効能を妨害する。ｂＦＧＦをさらに効果的に用途を開発するためには、体内での安定性に加え、体外での物理化学的安定性を向上させてこそ医薬部外品及びクリームなどの化粧品の製造、保管、流通過程での使用が増加する。

【0006】

したがって、より安定し、かつ活性のある新規ｂＦＧＦ変異体の開発が必要である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】大韓民国公開特許第１０−２００９−００８３０６２号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明者らは高安定性塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ｂＦＧＦ）変異体（ｍｕｔａｎｔ）を開発するために鋭意努力した。その結果、ｂＦＧＦタンパク質の安定性を増加させ、二量体化（ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を防止するために、タンパク質のアミノ酸配列に変形を与える方式の分子設計方式を適用して、熱安定性と水溶液の状態での安定性に優れた効果を確認することにより、本発明を完成した。

【0009】

したがって、本発明の目的は、高安定性塩基性繊維芽細胞成長因子変異体を提供することにある。

【0010】

また、本発明の他の目的は、ｂＦＧＦ変異体をコードするＤＮＡ塩基配列を提供することにある。

【0011】

また、本発明のさらなる目的は、前記ＤＮＡ塩基配列を含む発現ベクターを提供することにある。

【0012】

また、本発明のさらなる目的は、前記発現ベクターによって形質転換された形質転換体を提供することにある。

【0013】

また、本発明のさらなる目的は、高安定性塩基性繊維芽細胞成長因子変異体を生産する方法を提供することにある。

【0014】

また、本発明のさらなる目的は、高安定性ｂＦＧＦ変異体を有効成分として含む皮膚状態の改善用化粧料組成物を提供することにある。

【0015】

また、本発明のさらなる目的は、高安定性ｂＦＧＦ変異体を有効成分として含む皮膚疾患の予防又は治療用薬学的組成物を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0016】

前記の目的を達成するために、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列内の２個以上のアミノ酸がセリンに置換され、１個以上のアミノ酸がシステインに置換され、表面のアミノ酸の１個がチロシンに置換された高安定性塩基性繊維芽細胞成長因子変異体を提供する。

【0017】

本明細書で使用される用語「塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）」又は「ＦＧＦ−２」は、分子量約１８ｋＤａに達する塩基性タンパク質（ｐＩ９．５８）であり、脳下垂体から主に分泌され、様々な中胚葉由来の細胞の成長を促進することが知られている。また、これは血管内膜細胞及び平滑筋細胞の成長を促進するタンパク質として外傷治療及び脈管形成に優れた効能を示し、コラーゲンとエラスチンの合成を増加させることで、皮膚の弾力を維持し、正常な細胞の成長を助け、傷からの回復を促進し、その治癒作用を行うことが知られている。

【0018】

本発明の変異体は、ｂＦＧＦの３次構造と種間の相同性アライメント（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）方法、及びコンピュータを用いたタンパク質の分子モデリングを通じ、ｂＦＧＦの活性部位と関連のない部位を選定し、変異実験によって製造された変異体として、ｂＦＧＦと他のｂＦＧＦがジスルフィド結合を形成するシステインのアミノ酸残基が類似する構造のセリン残基に置換されて表面のジスルフィド結合による沈殿に対して安定性が高められる。また、ｂＦＧＦ内のループに近い残基の１個をシステイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）に置換させてジスルフィド結合をさらに生成させることで、ループエントロピーを減少させる方法で安定性が増加したことを特徴とする。また、ｂＦＧＦ内にＨｉｓ残基をＴｙｒに置換することにより、水素結合及びファンデルワールス相互作用（Ｖａｎ ｄｅｒ ｗａａｌｓ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）を増加させ、タンパク質のキャビティ構造を安定させる方法で安定性が増加されたことを特徴とする。

【0019】

本発明の好ましい実施例によれば、前記セリンに置換されたアミノ酸は、配列番号１のアミノ酸配列６９番目のシステイン及び８７番目のシステインである。

【0020】

本発明の好ましい具現例によれば、前記システインに置換されたアミノ酸は、配列番号１のアミノ酸配列で２６番目リジン；配列番号１のアミノ酸配列で３４番目イソロイシン；配列番号１のアミノ酸配列で４０番目バリン；配列番号１のアミノ酸配列で５０番目ヒスチジン；配列番号１のアミノ酸配列で５２番目リジン；配列番号１のアミノ酸配列で７５番目アラニン；配列番号１のアミノ酸配列で７６番目メチオニン；配列番号１のアミノ酸配列で１１７番目アラニン；配列番号１のアミノ酸配列で６７番目グリシン；配列番号１のアミノ酸配列で６８番目バリン；配列番号１のアミノ酸配列で７０番目アラニン；配列番号１のアミノ酸配列で８２番目ロイシン；配列番号１のアミノ酸配列で８４番目アラニン；配列番号１のアミノ酸配列で１０８番目セリン；配列番号１のアミノ酸配列で１３６番目アラニン；配列番号１のアミノ酸配列で１３７番目イソロイシン；配列番号１のアミノ酸配列で１３８番目ロイシン；及び配列番号１のアミノ酸配列で１４４番目アラニンからなる群から選択された１種以上であり、より好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列で４０番目バリン；配列番号１のアミノ酸配列で５０番目のヒスチジン；配列番号１のアミノ酸配列で５２番目リジン；配列番号１のアミノ酸配列で７５番目アラニン；配列番号１のアミノ酸配列で７６番目メチオニン；配列番号１のアミノ酸配列で１１７番目アラニンからなる群から選択された１種以上であり、最も好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列で７５番目アラニンである。

【0021】

さらに変異体で７５番目アラニンをシステインに置換した変異体にタンパク質表面に露出された残基であるヒスチジン５０番残基をチロシンに置換した変異体が最も好ましい変異体である。

【0022】

すなわち、本発明のｂＦＧＦ変異体は、天然型ヒトｂＦＧＦアミノ酸配列（配列番号１）の６９番目及び８７番目のアミノ酸残基であるシステインがすべてセリンに置換され、５０番目ヒスチジンのチロシンに置換され、７５番目のアミノ酸残基であるアラニンがシステインにさらに置換されて、分子内ジスルフィド結合を形成し、残りのアミノ酸配列は、天然型のアミノ酸配列と同じヒトｂＦＧＦミューテイン（ｍｕｔｅｉｎ）を提供する。

【0023】

本発明のｂＦＧＦ変異体は、タンパク質活性を維持しながら熱に対する安定性が天然型に比べて増加する。下記の実験例１〜３に示すように、ｂＦＧＦ変異体は、天然型と同等の活性を有しており、熱に対する安定性がやはり顕著に増加したことがわかる。ｂＦＧＦ変異体の中で６９番と８７番のアミノ酸をセリンに置換して、７５番のアミノ酸をシステインに置換した後、ジスルフィド結合を誘導した本発明のＫ７５（Ｓｔａｂｌｅ ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ｓｂＦＧＦ）は対照群である天然型ｂＦＧＦ、６９番と８７番のアミノ酸をセリンに置換したｂＦＧＦ変異体、７５番アミノ酸をシステインに置換したｂＦＧＦ変異体に比べて熱安定性が向上した。また、前記Ｋ７５の５０番ヒスチジンのチロシンに置換されたＨｓｂＦＧＦの場合、対照群である天然型及びＫ７５より優れた熱安定性が向上した。

【0024】

本発明の他の態様によると、本発明は、前記ｂＦＧＦ変異体をコードするＤＮＡ塩基配列（配列番号２）、及びこれを含む発現ベクターを提供する。

【0025】

本発明の発現ベクターは、一般的な発現用ベクターにｂＦＧＦの遺伝子を挿入して製造することができる。本発明の好ましい実施例では、発現用ベクターとしてｐＥＴ２１ａベクターを使用したが、必ずしもこれに限定されるものではなく、一般的に使用可能なすべての細胞発現用ベクターを使用することができる。本発明の好ましい実施例では、ｐＥＴ２１ａベクターにｂＦＧＦ遺伝子を挿入したベクターを製造し、これを「ｐＳＳＢ−ｂＦＧＦ」と命名した（図１ｂに開示）。

【0026】

本発明の他の態様によると、本発明は、前記発現ベクターによって形質転換された宿主細胞である形質転換体を提供する。

【0027】

本発明のｂＦＧＦ変異体は、部位特異突然変異誘導法等により製造されたｂＦＧＦ変異体をコードする遺伝子を含有するベクターで宿主細胞を形質転換させ、ｂＦＧＦ変異体を発現させる方法で製造することができ、また、化学的アミノ酸合成方法によって製造することができる。

【0028】

ｂＦＧＦ変異体をコードするＤＮＡは、天然型ｂＦＧＦの前記置換される部位のアミノ酸をコードするＤＮＡである。ｂＦＧＦ変異体をコードするＤＮＡ配列として好ましいのは、６９番目と８７番目のコドンがセリンをコードするコドンに置換され、７５番目のコドンがシステインをコードするコドンに置換されたものである。また、前記Ｋ７５の５０番ヒスチジンのチロシンに置換されたＨｓｂＦＧＦの場合、対照群である天然型及びＫ７５より優れた熱安定性が向上した。

【0029】

一方、コドンの縮退（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）によって１個のアミノ酸をコードするコドンが多数存在するため、同じアミノ酸配列をコードするＤＮＡであっても、そのヌクレオチド配列が異なりうることは周知の事実である。

【0030】

このようなｂＦＧＦ変異体をコードするＤＮＡは、化学的に合成するか、天然型ｂＦＧＦ ｃＤＮＡを製造し、これを基に部位特異突然変異誘導法などの方法を用いて製造することもできる。

【0031】

前記製造された本発明のｂＦＧＦ変異体をコードするＤＮＡは、当分野で公知の適切な原核又は真核発現システムのいずれかを用いて、これを発現させることができる（Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Habor Laboratory Press, USA, 1989）。

【0032】

発現は、糖化されていないｂＦＧＦ変異体の場合、好ましくは大腸菌、例えば、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）、大腸菌ＮＭ５２２などで行われ、大腸菌における発現のために使用することができる適切なベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋなどの文献（同上）及びＦｉｅｒｓなどの論文(“Proced.8th Int. Biotechnology Symposium”, Soc. Frac, de Microbiol., Paris,(Durand et al., eds.),pp.680-697, 1988）に言及されている。

【0033】

上述したベクターによる宿主細胞の形質転換は、通常の方法のいずれかによって行うことができる（Sambrooketal., Molecular Cloning, ALaboratory Manual, 1989; Ito et al., J. Bacteriol. 153:263, 1983）。

【0034】

大腸菌を形質転換させる場合には、ＤＮＡを吸収することができるコンピテントセル（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）を準備し、続いて公知の方法などにより処理することができる。

【0035】

本発明の他の態様によると、本発明は、次のステップを含む高安定性塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ｂＦＧＦ）変異体（ｍｕｔａｎｔ）の生産方法を提供する：
（ａ）前記形質転換体を培養するステップ；及び
（ｂ）前記ステップ（ａ）で得られた培養液から変異体を分離するステップ。

【0036】

本発明の好ましい具現例によれば、前記方法の（ｂ）ステップは、
（ｃ）前記形質転換体を細胞破砕し、凝集体を分離するステップ；
（ｄ）前記分離された凝集体を除去するステップ；
（ｅ）前記凝集体が除去された上清をイオン交換樹脂クロマトグラフィーを用いて分離精製するステップ；及び
（ｆ）前記イオン交換樹脂後、高安定性塩基性繊維芽細胞成長因子変異体をヘパリン親和クロマトグラフィーを用いて分離精製するステップを含む。

【0037】

一般的に、目的発現ベクターを含有する宿主微生物は、目的タンパク質の生産を最大化する範囲で最適な成長条件で培養される。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を選択標識として含有するベクターで形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞は、アンピシリンが含有されたＬＢ培地で３７℃で培養する。

【0038】

形質転換された宿主細胞を培養した後、生産されたｂＦＧＦ変異体の回収及び精製は、当該分野で公知の様々な方法又はそれらを組み合わせて使用することにより行うことができる。例えば、形質転換された大腸菌細胞から発現されたｂＦＧＦ変異体は、細胞培養物から、又は細胞の破砕後にタンパク質化学系に公知された適切な方法によって抽出することにより、回収することができる。

【0039】

好ましくは、ｂＦＧＦ変異体を精製するために、組換え大腸菌細胞の培養液を遠心分離して細胞を収穫し、収穫した細胞をリゾチームを添加した緩衝溶液に懸濁させ、超音波で破砕する。細胞破砕液を遠心分離して不溶性顆粒状の凝集体を分離し、前記分離された凝集体を除去する。前記凝集体が除去された上清をイオン交換樹脂クロマトグラフィーを用いて分離精製し、イオン交換樹脂の後、ヘパリン親和クロマトグラフィーを用いて分離精製して結果物である高安定性ｂＦＧＦ変異体を獲得する。

【0040】

本発明の他の態様によると、本発明は、前記高安定性ｂＦＧＦ変異体を有効成分として含む皮膚疾患の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。

【0041】

下記の実施例で実証されたように、本発明の高安定性ｂＦＧＦ変異体は、天然ｂＦＧＦと同じ活性を有し、非常に優れた熱安定性及び水溶液での安定性を有する。したがって、本発明の組成物は、皮膚疾患の予防又は治療に非常に有効である。

【0042】

好ましくは、本発明の組成物は、皮膚の炎症、急性・慢性湿疹、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、慢性単純苔癬、間擦疹、剥奪皮膚炎、丘疹状蕁麻疹、乾癬、日光皮膚炎及びニキビなどの皮膚疾患の予防又は治療に使用される。

【0043】

また、本発明の組成物は、創傷治療用組成物を提供することができる。

【0044】

好ましくは、本発明の組成物は、閉鎖創（ｃｌｏｓｅｄ ｗｏｕｎｄ）及び開放創（ｏｐｅｎ ｗｏｕｎｄ）の治療に使用される。閉鎖創の例は、挫傷（ｃｏｎｔｕｓｉｏｎ ｏｒ Ｂｕｒｉｓｅ）を含み、開放創の例は、擦り傷（ａｂｒａｓｉｏｎ）、裂傷（ｌａｃｅｒａｔｉｏｎ）、剥離傷（Ａｖｕｌｓｉｏｎ）、刺し傷（ｐｅｎｅｔｒａｔｅｄ ｗｏｕｎｄ）及び銃傷（ｇｕｎ ｓｈｏｔ ｗｏｕｎｄ）を含む。

【0045】

本発明の組成物は、（ａ）上述した本発明のｂＦＧＦ変異体の薬学的有効量；及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物である。

【0046】

本明細書で使用される用語「薬学的有効量」は、上述したｂＦＧＦ変異体の効能又は活性を達成するのに十分な量を意味する。

【0047】

本発明の薬学的組成物に含まれる薬学的に許容される担体は、製剤時に通常的に利用されるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分に加えて潤滑剤、湿潤剤、甘味料、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適切な薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Remington’s Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995）に詳細に記載されている。

【0048】

本発明の薬学的組成物は、経口又は非経口、好ましくは非経口投与することができ、非経口投与の場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、局所投与、経皮投与などで投与することがことができる。

【0049】

本発明の薬剤学的組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、飲食品、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性などの要因によって多様に処方することができる。一方、本発明の薬剤学的組成物の好ましい１日投与量は、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇである。

【0050】

本発明の薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施することができる方法に従って、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することにより、単位容量形態で製造、又は多容量容器内に入れて製造することができる。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又はエマルジョンの形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤又はゲル（例えば、ハイドロゲル）の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。

【0051】

本発明の他の態様によると、本発明は、前記高安定性ｂＦＧＦ変異体を有効成分として含む皮膚状態の改善用化粧料組成物を提供する。

【0052】

下記の実施例で実証されたように、本発明の高安定性ｂＦＧＦ変異体は、天然ｂＦＧＦと同じ活性を有し、非常に優れた熱安定性及び水溶液での安定性を有する。したがって、本発明の組成物は、皮膚状態の改善に非常に有効である。

【0053】

好ましくは、本発明の組成物は、しわ改善、皮膚の弾力改善、皮膚の老化防止、脱毛防止又は発毛促進、皮膚保湿の改善、シミの除去、又はニキビの治療のような皮膚状態の改善に用いられる。

【0054】

本発明の組成物は、（ａ）上述した本発明のｂＦＧＦ変異体の化粧品学的有効量（ｃｏｓｍｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）；及び（ｂ）化粧品学的に許容される担体を含む化粧料組成物である。

【0055】

本明細書で使用される用語「化粧品的有効量」は、上述した本発明の組成物の皮膚改善効果を達成するために十分な量を意味する。

【0056】

本発明の化粧品組成物は、当業界で通常的に製造されるいかなる剤形でも製造することができ、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション及びスプレーなどに剤形化することができるが、これに限定されるものではない。より詳細には、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレー又はパウダーの剤形で製造することができる。

【0057】

本発明の剤形がペースト、クリーム又はゲルである場合には、担体成分として動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク、又は酸化亜鉛などを用いることができる。

【0058】

本発明の剤形がパウダー又はスプレーである場合には、担体成分としてラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケート又はポリアミドパウダーを用いることができ、特にスプレーの場合には、さらにクロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタン又はジメチルエーテルのような推進体を含むことができる。

【0059】

本発明の剤形が溶液又は乳濁液である場合には、担体成分として溶媒、溶解剤又は油濁剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール、又はソルビタンの脂肪酸エステルがある。

【0060】

本発明の剤形が懸濁液である場合には、担体成分として、水、エタノール又はプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガー又はトラカントなどを用いることができる。

【0061】

本発明の剤形が界面活性剤含有クレンジングである場合には、担体成分として脂肪族アルコール硫酸、脂肪族アルコールエーテル硫酸、スルホコハク酸モノエステル、イセチオン酸、イミダゾリウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテル硫酸、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体又はエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどを用いることができる。

【0062】

本発明の化粧品組成物に含まれる成分は、有効成分としてのｂＦＧＦ変異体と担体成分に加えて、化粧品組成物に通常的に用いられる成分を含み、例えば抗酸化剤、安定化剤、溶解剤、ビタミン、顔料及び香料のような通常の補助剤を含むことができる。

【0063】

本発明の組成物は、上述した本発明の高安定性ｂＦＧＦ変異体を有効成分として含むため、この両者間に共通の内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。

【発明の効果】

【0064】

本発明によれば、本発明のｂＦＧＦ変異体は、熱安定性と水溶液の状態での安定性に優れ、流通と保管の過程でも、既存の天然型ｂＦＧＦの製品とは異なり、活性を失わない機能性化粧品の生産及び皮膚創傷被覆剤などに活用が可能である。

【図面の簡単な説明】

【0065】

【図1】プラスミド及びｐＳＳＢ−ｂＦＧＦの組み立ての概要を示す。

【図2】プラスミド及びｐＳＳＢ−ｂＦＧＦの組み立ての概要を示す。

【図3】天然型ｂＦＧＦと本発明のｂＦＧＦ変異体の細胞破砕後のＴ（細胞破砕後の懸濁液）Ｓ（細胞破砕後の上清）Ｐ（細胞破砕後の不溶性凝集体）のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。

【図4】天然型ｂＦＧＦと本発明のｂＦＧＦ変異体の細胞破砕後のＴ（細胞破砕後の懸濁液）Ｓ（細胞破砕後の上清）Ｐ（細胞破砕後の不溶性凝集体）のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。

【図5】天然型ｂＦＧＦと本発明のｂＦＧＦ変異体の熱安定性の指標であるＴＭ（融解温度）の差異の結果を示す。

【図6】天然型ｂＦＧＦと本発明のｂＦＧＦ変異体の活性の比較結果を示す。

【図7】天然型ｂＦＧＦと、本発明のｂＦＧＦ変異体の人体の状態に最も近いＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ）状態で、２５℃で２０日間インキュベーションした後の安定性の比較結果を示す。

【図8】天然型ｂＦＧＦ（Ａ）と本発明のｂＦＧＦ変異体（Ｋ７５）（Ｂ）の最終精製後のＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた分析である。

【図9】天然型ｂＦＧＦと本発明のｓｂＦＧＦ変異体及びＨｓｂＦＧＦの熱安定性の指標であるＴＭ（融解温度、Ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）の差異の結果を示す。

【図10】本発明のｓｂＦＧＦ変異体及びＨｓｂＦＧＦの人体の状態に最も近いＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ）状態で、５０℃で一週間インキュベーションした後の安定性の比較結果を示す。

【図11】天然型ｂＦＧＦと本発明のｓｂＦＧＦ変異体及びＨｓｂＦＧＦ人体の状態に最も近いＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ）状態で、６０℃で５日間インキュベーションした後の安定性の比較結果を示す。

【図12】天然型ｂＦＧＦと本発明のｓｂＦＧＦ変異体及びＨｓｂＦＧＦ人体の状態に最も近いＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ）状態で、６０℃で５日間インキュベーションした後のＨＰＬＣ定量の比較結果を示す。

【図13】天然型ｂＦＧＦと本発明のｂＦＧＦ変異体のｂＦＧＦ活性の比較結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0066】

以下、実施例は、ただ本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨に基づいて、本発明の範囲がこれら実施例により制限されないことは、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者にとって自明である。

【0067】

実験方法及び材料
ＤＮＡコンストラクション（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）
タンパク質の発現ベクターであるｐＥＴ２１ａ（図１）と発現用Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ではＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）をＮｏｖａｇｅｎから購入し、クローニング用Ｅ．ｃｏｌｉ菌株はＴｏｐ１０を用いた。遺伝子組換え時に使用された制限酵素はすべてＮＥＢ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の製品であり、リガーゼはＲｏｃｈｅ社のＴ４ ＤＮＡリガーゼである。ＰＣＲ時に使用されたＥｘ ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼはＴａｋａｒａ社の製品であり、点突然変異に使用されたｐｆｕＵｌｔｒａ^ＴＭＨＦ ＤＮＡポリメラーゼは、Ａｇｉｌｅｎｔ社の製品である。ＤＮＡゲル抽出キット、プラスミドミニプレップキットは（株）コスモジンテックの製品である。また、プライマーは（株）コスモジンテックで製作し、ＤＮＡシーケンシングも（株）コスモジンテックに依頼して行った。

【0068】

タンパク質発現（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）
発現誘導体であるＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−１−ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）と抗生剤として用いられたアンピシリンとクロラムフェニコールはすべてＳｉｇｍａ社から購入した。Ｅ．ｃｏｌｉ培養ＬＢ培地を作製するときに使用したバクトトリプトン、酵母エキスはＢＤ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｎｓｏｎ）社から購入し、ＮａＣｌはトクヤマ製品を使用した。

【0069】

タンパク質精製（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）
精製過程で使用される試薬は、可能な限り純度の高い製品を使用し、精製過程で使用した試薬は、以下の通りである。一塩基性リン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、二塩基性リン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、塩化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）である。ＦＰＬＣで使用されたカラムはＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅのＳＰ−ｓｅｐｈｒｏｓｅ、ヘパリン親和性カラムを使用した。

【0070】

ＦＰＬＣ
ＦＰＬＣはＧＥ ＵＰＣ−８００を使用した。

【0071】

ＣＤ（円偏光二色性、Ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ）
ＣＤはＪａｓｃｏ社Ｊ−８１０ ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒを使用した。

【0072】

相同性モデリング（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｍｏｄｅｌｉｎｇ）
相同性モデリングはモデラー（Ａｎｄｒｅｊ Ｓａｌｉ ｌａｂ）を用いた。

【0073】

エネルギーミニマイゼーション（Ｅｎｅｒｇｙ ｍｉｎｉｍｉｚａｔｉｏｎ）
エネルギーミニマイゼーションはキメラに含まれるＡｍｂｅｒ ９９ＦＦ ｆｏｒｃｅ ｆｉｌｅｄを使用した。

【0074】

ジスルフィド結合予測（Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｐｒｅｄｉｃｔ）
ジスルフィド結合の形成による予測は、ＹＡＳＡＲＡ Ｗｅｂ ｓｅｒｖｅｒを用いた。

【0075】

ジスルフィド結合距離測定
ジスルフィド結合が可能な距離を測定するｐｌｏｔｉｎｇ ｐｒｏｇｒａｍはＰｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔａｃｔ ｍａｐ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ（Ａｎｄｒｅａｓ Ｖｉｋｌｕｎｄ.）を用いた。

【0076】

タンパク質の構造
ＰＤＢに登録された４ＦＧＦ、１ＢＬＡ １ＢＬＤを用いた。

【0077】

ベクターシステム（Ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ）
変異体ｂＦＧＦを生産するための発現ベクターとしてｐＥＴ２１ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用した。天然型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）ｂＦＧＦ遺伝子は（株）ＰｎＰ ｂｉｏｐｈａｒｍから得、これを下記プライマーを用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を介して、天然型を増幅させた。このように得られたＰＣＲ産物をｐＥＴ２１ａベクターに制限酵素であるＮｄｅＩ,ＸｈｏＩを処理した後、挿入して接合させた。

【0078】

点突然変異（Ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）
ｂＦＧＦの安定性を増加させるために、タンパク質の構造（ＰＤＢ：４ＦＧＦ）と分子モデル方法を通じて変化させるアミノ酸部分を探し、下記プライマー（下記実施例４）を使用してｐｆｕ Ｕｌｔｒａ^ＴＭＤＮＡポリメラーゼを用いてＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ突然変異誘発法を用いて増幅させた。使用した天然型ｂＦＧＦ鋳型を除去するためにＤｐｎＩ反応を進行してＴｏｐ１０に形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）させ、シーケンスを通じて変異体（ｍｕｔａｎｔ）を確認した。

【0079】

天然型及び変異体ｂＦＧＦの発現
ｂＦＧＦが挿入された組換えベクターをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に熱ショック法で形質転換させた。このＥ．ｃｏｌｉ菌株を５０ｕｇ／ｍｌアンピシリンを含む５００ｍｌ ＬＢ培地に接種してＯ．Ｄ６００値が０．６になるまで３７℃で育てた。その後０．５ｍＭ ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−１−ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を入れて４時間培養した後Ｏ．Ｄ６００値が２．０以上になると８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離してｃｅｌｌを取った。

【0080】

細胞破砕
ｂＦＧＦタンパク質を発現させたＥ．ｃｏｌｉｌからタンパク質を得るために、細胞を破砕した。収集した細胞に２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、４℃で超音波破砕機で破砕した。この後、１３０００ｒｐｍで１５分間、４℃で遠心分離して不溶性物質（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）を除去した後、上清を取ってＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。

【0081】

形質転換体（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の精製
超音波処理によって破砕された細胞溶解液を４℃で１３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清をとって０．４５ｕｍフィルターを用いてフィルタリングをし、この溶液をＦＰＬＣ（Ｆａｓｔ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）ＳＰカラムとヘパリンカラムを用いて精製した。このとき、精製条件は、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）緩衝液に１００ｍＭ ＮａＣｌ溶液Ａと２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）緩衝液に１Ｍ ＮａＣｌ ＢをＳＰカラムに２ｍｌ／分の速度で０％Ａから１００％Ｂまで直線勾配で流して溶出させた後、約１８ＫＤａサイズのｂＦＧＦタンパク質を含む画分を集めた。その後、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）緩衝液に５００ｍＭ ＮａＣｌ溶液Ａと２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）緩衝液に２Ｍ ＮａＣｌ Ｂをヘパリン親和性カラムに２ｍｌ／分の速度で０％Ａから１００％Ｂまで直線勾配で流して溶出させた後、約１８ＫＤａサイズのｂＦＧＦタンパク質を含む画分を集めた。このとき、ｂＦＧＦを含む画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析法で確認した後、定量を行った。

【0082】

分子モデリング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｏｄｅｌｉｎｇ）
ＰＤＢに登録されたタンパク質の構造である１ＢＬＡ（ＮＭＲ）を用いて、ジスルフィド結合が可能な候補群を設定した。タンパク質接触マップ可視化（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔａｃｔ ｍａｐ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ）プログラムを用いて、２個のアミノ酸のＣ−ａｌｐｈａ炭素の距離が７Å以下、Ｃ−ｂｅｔａ炭素の距離が５Åである残基をプロット（ｐｌｏｔ）を用いて分析した。その後Ｙａｓａｒａ ｅｎｅｒｇｙ ｍｉｎｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｓｅｒｖｅｒを用いて、ジスルフィド結合の生成の有無を分析し、キメラのＡＭＢＥＲ ｆｏｒｃｅ ｆｉｌｅｄ ＦＦ９９を用いて、エネルギーミニマイゼーションを行った。その後、生成されたタンパク質の構造を天然型のｂＦＧＦ整列（ａｌｉｇｎ）させてＲＭＳＤを測定０．５以下の値を有する構造を実験で行った。

【0083】

ＣＤ（Ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ）
天然型ｂＦＧＦと変異体の構造分析及びＴＭ測定のために、それぞれｂＦＧＦを２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）に溶かし、最終濃度が０．２ｍｇ／ｍｌとなるように一定にする。そして０．１ｃｍ ｃｅｌｌに入れ１９０ｎｍ〜２５０ｎｍの領域にバンド幅１ｎｍ、応答０．２５秒、データピッチ０．１ｎｍ、スキャン速度２０ｎｍ／分、セル長１ｃｍ、蓄積（ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）８回、温度は２０℃の条件で構造を分析した。温度安定度を分析するために融解温度は、２０℃と９５℃での２０５ｎｍの波長で０．１ｃｍ ｃｅｌｌに０．２ｍｇ／ｍｌの濃度で行った。条件は、１℃／分の条件で、２０℃〜９５℃まで測定した。

【0084】

ジスルフィド結合が可能な残基（Ｒｅｓｉｄｕｅ ｎｕｍｂｅｒ）と予測結果を表１に示した。

【0085】

【表1】

【0086】

細胞増殖分析（Ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）
作製された天然型ｂＦＧＦと変異体が実際に活性を示すか否かを確認するために、細胞増殖能力を用いた実験を（株）ジェネウェルに依頼して行った。実験に使用したＮＩＨ−３Ｔ３ ｃｅｌｌは１０％熱不活性化されたウシ胎児血清、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ完全培地を用いて維持した。９６ｗｅｌｌ培養プレートに２ｘ１０^３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌのＮＩＨ−３Ｔ３ ｃｅｌｌを分株（ｓｅｅｄｉｎｇ）した。２４時間培養したＮＩＨ−３Ｔ３ ｃｅｌｌは無血清ＤＭＥＭ培地で飢餓（ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ）させた後、０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地にサンプル溶液をそれぞれの濃度別に処理し、７２時間培養した。培養後、１０ｕｌのＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド］溶液を添加し、２時間反応させた後に用いて１００ｕｌのＤＭＳＯにホルマザン結晶を溶解させた。吸光度は分光光度計を用いて５４０ｎｍの波長で測定した。薬剤に対する感受性は、薬剤を処理していないｗｅｌｌ（対照群）の吸光度に対する薬剤処理ｗｅｌｌでの割合で比較した。

【0087】

インキュベーションテスト（Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ）
室温で保管程度を確認するために、天然型ｂＦＧＦと変異体のインキュベーションテストを行った。１ＸＰＢＳ（ｐＨ７．３）で、それぞれの天然型ＦＧＦ−２と変異体を０．５ｍｇ／ｍｌに溶かした後、３７℃、５０℃と６０℃ｗａｔｅｒ ｂａｔｈでインキュベーションを行った。２４時間単位でサンプリング（ｓａｍｐｌｉｎｇ）して１３０００ｒｐｍで１５分間、４℃で遠心分離して上清のみを得てＮａｎｏ ｄｒｏｐによる定量及びＨＰＬＣ分析を行った。

【0088】

＜実施例１：ヒトｂＦＧＦ ｃＤＮＡを含むｐＳＳＢ−ｂＦＧＦプラスミドの構築＞
ヒト単核細胞ｃＤＮＡライブラリーを鋳型にしてプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応によりｂＦＧＦをコードするＤＮＡを準備した。使用したプライマーの塩基配列は、以下の通りである：

【0089】

センスプライマー５’−ＧＧＣＧＧＧＣＡＴＡＴＧＣＣＣＧＣＣＴＴＧＣＣＣＧＡＧＧ−３’（配列番号３）及び
アンチセンスプライマー３’−ＴＧＡＴＧＡＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＣＡＧＣＴＣＴＴＡＧＣＡＧＡＣＡＴ−５’（配列番号４）。

【0090】

図２のｂＦＧＦ部分を前記に記載のプライマーを用いて増幅し、増幅されたＤＮＡ切片１ｕｇを５０ｕｌ ＴＥ（ｐＨ８．０）溶液に溶かした後、２単位のＮｄｅＩ（ＮＥＢ社）と２単位のＢａｍＨＩ（ＮＥＢ社）と混合した後、３７℃で２時間反応させて５’−末端にＮｄｅＩ制限酵素部位と３’−末端にＢａｍＨＩ制限酵素部位を有するようにした。ＤＮＡ精製キット（ＧｅｎｅＡｌｌ社）を用いてＤＮＡのみを精製した後、このＤＮＡ切片２０ｎｇを同じ方法でＮｄｅＩとＢａｍＨＩでそれぞれ処理して準備した２０ｎｇのｐＥＴ２１ａ（＋）プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）と共に１０ｕｌのＴＥ（ｐＨ８．０）溶液に混ぜた後、１単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ社）を添加して１６℃で４時間反応させて接合させた。こうして作られたプラスミドをｐＳＳＢ−ｂＦＧＦと命名した。

【0091】

＜実施例２：ヒトｂＦＧＦの大腸菌形質転換体の製造＞
発現プラスミドｐＳＳＢ−ｂＦＧＦでＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に熱ショックで形質転換させた。形質転換後、固体培地に生じる、アンピシリンに耐性のあるコロニーを選別して、１０ｍｌのＬＢ培地（ＬＢ／アンピシリン）に接種した。３７℃で１２時間培養した後、１００％グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）と１：１で混ぜて−７０℃にストックを保管した。

【0092】

＜実施例３：ヒトｂＦＧＦの精製＞
実施例２で作製したストックを１０ｍｌのＬＢ培地（ＬＢ／アンピシリン）に接種した後、１２時間以上培養した。その後、５００ｍｌのＬＢ培地（ＬＢ／アンピシリン）に移し、６００ｎｍで吸光度がＯ．Ｄ０．４〜０．５のときにＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−１−ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を最終濃度が０．５ｍＭになるように入れた。３７℃で４時間、２００ｒｐｍの速度で振とう培養した後、８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して大腸菌ペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を得た。このペレットを２５ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）緩衝液に懸濁させた後、超音波処理方法で細胞を破砕した。

【0093】

超音波処理によって破砕された細胞溶解液を４℃で１３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清をとって０．４５ｕｍフィルターを用いてフィルタリングし、この溶液をＦＰＬＣ（Ｆａｓｔ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）とＳＰカラムとヘパリンカラムを用いて精製した。このとき、精製条件は、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）緩衝液に１００ｍＭ ＮａＣｌ溶液Ａと、条件は、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）緩衝液に２Ｍ ＮａＣｌ ＢをＳＰカラムに２ｍｌ／分の速度で０％Ａから５０％Ｂまで直線勾配で流して溶出させた後、約１８ＫＤａサイズのｂＦＧＦタンパク質を含む画分を集めた。その後２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）緩衝液に１００ｍＭ ＮａＣｌ溶液Ａと２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）緩衝液に２Ｍ ＮａＣｌ ＢをＳＰカラムに２ｍｌ／分の速度で５０％Ａから１００％Ｂまで直線勾配に流して溶出させた後、約１８ＫＤａサイズのｂＦＧＦタンパク質を含む画分を集めた。このとき、ｂＦＧＦを含む画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析法で確認した後、定量を行い、１０ｍｇのｂＦＧＦを獲得した。

【0094】

＜実施例４：ｐＳＳＢ−ｂＦＧＦ変異体プラスミドの構築＞
天然型のｐＳＳＢ−ｂＦＧＦプラスミドを鋳型としてｐｆｕＵｌｔｒａ^ＴＭＨＦ ＤＮＡポリメラーゼを用いて、それぞれの変異体に該当する二つの相補的なプライマーを用いてＰＣＲによりｐＳＳＢ−ｂＦＧＦ変異体プラスミドを作製した。そしてＤｐｎＩを用いて、鋳型であった天然型のｐＳＳＢ−ｂＦＧＦプラスミドを切断した後、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０に熱ショックで形質転換させた。形質転換後、固体培地に生じるアンピシリンに耐性のあるコロニーを選別して、１０ｍｌのＬＢ培地（ＬＢ／アンピシリン）に接種した。３７℃で１６時間培養した後、ＤＮＡ ｐｒｅｐを実施して得られたＤＮＡをシーケンシングを通してｐＳＳＢ−ｂＦＧＦ変異体プラスミドを確認した。このとき使用したプライマーの塩基配列は、以下の通りである：

【0095】

６９番目のシステインのコドンであるＴＧＴがセリンのコドンであるＴＣＴで置換時センスプライマー５’−ＴＣＴ ＡＴＣ ＡＡＡ ＧＧＡ ＧＴＧ ＴＣＴ ＧＣＴ ＡＡＣ ＣＧＴ ＴＡＣ ＣＴＧ−３’（配列番号５）及びアンチセンスプライマー３’−ＣＡＧ ＧＴＡ ＡＣＧ ＧＴＴ ＡＧＣ ＡＧＡ ＣＡＣ ＴＣＣ ＴＴＴ ＧＡＴ ＡＧＡ−５’（配列番号６）；

【0096】

８７番目のシステインのコドンであるＴＧＴがセリンのコドンであるＴＣＴで置換時センスプライマー５’−ＴＴＡ ＣＴＧ ＧＣＴ ＴＣＴ ＡＡＡ ＴＣＴ ＧＴＴ ＡＣＧ ＧＡＴ ＧＡＧ ＴＧＴ−３’（配列番号７）及びアンチセンスプライマー３’−ＡＣＡ ＣＴＣ ＡＴＣ ＣＧＴ ＡＡＣ ＡＧＡ ＴＴＴ ＡＧＡ ＡＧＣ ＣＡＧ ＴＡＡ−５’（配列番号８）；

【0097】

７５番目のアラニンのコドンであるＧＣＴがシステインのコドンであるＴＣＴで置換時センスプライマー５’−ＧＣＴ ＡＡＣ ＣＧＴ ＴＡＣ ＣＴＧ ＴＧＣ ＡＴＧ ＡＡＧ ＧＡＡ ＧＡＴ ＧＧＡ−３’（配列番号９）及びアンチセンスプライマー３’−ＴＣＣ ＡＴＣ ＴＴＣ ＣＴＴ ＣＡＴ ＧＣＡ ＣＡＧ ＧＴＡ ＡＣＧ ＧＴＴ ＡＧＣ−５’（配列番号１０）；

【0098】

２６番目リジンのコドンであるＡＡＡがシステインのコドンであるＴＧＣで置換時センスプライマー５’−ＡＡＧ ＣＧＧ ＣＴＧ ＴＡＣ ＴＧＣ ＴＧＣ ＡＡＣ ＧＧＧ ＧＧＣ ＴＴＣ ＴＴＣ−３’（配列番号１１）及びアンチセンスプライマー３’−ＧＡＡ ＧＡＡ ＧＣＣ ＣＣＣ ＧＴＴ ＧＣＡ ＧＣＡ ＧＴＡ ＣＡＧ ＣＣＧ ＣＴＴ−５’（配列番号１２）；

【0099】

３４番目イソロイシンのコドンであるＡＴＣがシステインのコドンであるＴＧＣで置換時センスプライマー５’−ＧＧＣ ＴＴＣ ＴＴＣ ＣＴＧ ＣＧＣ ＴＧＣ ＣＡＣ ＣＣＣ ＧＡＣ ＧＧＣ ＣＧＡ−３’（配列番号１３）及びアンチセンスプライマー３’−ＴＣＧ ＧＣＣ ＧＴＣ ＧＧＧ ＧＴＧ ＧＣＡ ＧＣＧ ＣＡＧ ＧＡＡ ＧＡＡ ＧＣＣ−５’（配列番号１４）；

【0100】

４０番目バリンのコドンであるＧＴＴがシステインのコドンであるＴＧＣで置換時センスプライマー５’−ＣＡＣ ＣＣＣ ＧＡＣ ＧＧＣ ＣＧＡ ＴＧＣ ＧＡＣ ＧＧＧ ＧＴＣ ＣＧＧ ＧＡＧ−３’（配列番号１５）及びアンチセンスプライマー３’−ＣＴＣ ＣＣＧ ＧＡＣ ＣＣＣ ＧＴＣ ＧＣＡ ＴＣＧ ＧＣＣ ＧＴＣ ＧＧＧ ＧＴＧ−５’（配列番号１６）；

【0101】

５０番目のヒスチジンのＣＡＣがシステインのコドンであるＴＧＣで置換時センスプライマー５’−ＧＡＧ ＡＡＧ ＡＧＣ ＧＡＣ ＣＣＴ ＴＧＣ ＡＴＣ ＡＡＧ ＣＴＡ ＣＡＡ ＣＴＴ−３’（配列番号１７）及びアンチセンスプライマー３’−ＡＡＧ ＴＴＧ ＴＡＧ ＣＴＴ ＧＡＴ ＧＣＡ ＡＧＧ ＧＴＣ ＧＣＴ ＣＴＴ ＣＴＣ−５’（配列番号１８）；

【0102】

５２番目リジンのコドンであるＡＡＧがシステインのコドンであるＴＧＣで置換時センスプライマー５’−ＡＧＣ ＧＡＣ ＣＣＴ ＣＡＣ ＡＴＣ ＴＧＣ ＣＴＡ ＣＡＡ ＣＴＴ ＣＡＡ ＧＣＡ−３’（配列番号１９）及びアンチセンスプライマー３’−ＴＧＣ ＴＴＧ ＡＡＧ ＴＴＧ ＴＡＧ ＧＣＡ ＧＡＴ ＧＴＧ ＡＧＧ ＧＴＣ ＧＣＴ−５’（配列番号２０）；

【0103】

７６番目メチオニンのコドンであるＡＴＧがシステインのコドンであるＴＧＣで置換時センスプライマー５’−ＡＡＣ ＣＧＴ ＴＡＣ ＣＴＧ ＧＣＴ ＴＧＣ ＡＡＧ ＧＡＡ ＧＡＴ ＧＧＡ ＡＧＡ−３’（配列番号２１）及びアンチセンスプライマー３’−ＴＣＴ ＴＣＣ ＡＴＣ ＴＴＣ ＣＴＴ ＧＣＡ ＡＧＣ ＣＡＧ ＧＴＡ ＡＣＧ ＧＴＴ−５’（配列番号２２）；

【0104】

１１７番目のアラニンのコドンであるＧＣＡがシステインのコドンであるＴＧＣで置換時センスプライマー５’−ＡＣＣ ＡＧＴ ＴＧＧ ＴＡＴ ＧＴＧ ＴＧＣ ＣＴＧ ＡＡＧ ＣＧＡ ＡＣＴ ＧＧＧ−３’（配列番号２３）及びアンチセンスプライマー３’−ＣＣＣ ＡＧＴ ＴＣＧ ＣＴＴ ＣＡＧ ＧＣＡ ＣＡＣ ＡＴＡ ＣＣＡ ＡＣＴ ＧＧＴ−５’（配列番号２４）；

【0105】

６７番目グリシンのコドンであるＧＧＡがシステインのコドンであるＴＧＣで置換時センスプライマー５’−ＧＴＴ ＧＴＧ ＴＣＴ ＡＴＣ ＡＡＡ ＴＧＣ ＧＴＧ ＴＣＴ ＧＣＴ ＡＡＣ ＣＧＴ−３’（配列番号２５）及びアンチセンスプライマー３’−ＡＣＧ ＧＴＴ ＡＧＣ ＡＧＡ ＣＡＣ ＧＣＡ ＴＴＴ ＧＡＴ ＡＧＡ ＣＡＣ ＡＡＣ−５’（配列番号２６）；

【0106】

６８番目バリンのコドンであるＧＴＧがシステインのコドンであるＴＧＣで置換センスプライマー５’−ＧＴＧ ＴＣＴ ＡＴＣ ＡＡＡ ＧＧＡ ＴＧＣ ＴＣＴ ＧＣＴ ＡＡＣ ＣＧＴ ＴＡＣ−３’（配列番号２７）及びアンチセンスプライマー３’−ＧＴＡ ＡＣＧ ＧＴＴ ＡＧＣ ＡＧＡ ＧＣＡ ＴＣＣ ＴＴＴ ＧＡＴ ＡＧＡ ＣＡＣ−５’（配列番号２８）；

【0107】

７０番目のアラニンのコドンであるＧＣＴがシステインのコドンであるＴＧＣで置換時センスプライマー５’−ＡＴＣ ＡＡＡ ＧＧＡ ＧＴＧ ＴＣＴ ＴＧＣ ＡＡＣ ＣＧＴ ＴＡＣ ＣＴＧ ＧＣＴ−３’（配列番号２９）及びアンチセンスプライマー３’−ＡＧＣ ＣＡＧ ＧＴＡ ＡＣＧ ＧＴＴ ＧＣＡ ＡＧＡ ＣＡＣ ＴＣＣ ＴＴＴ ＧＡＴ−５’（配列番号３０）；

【0108】

第８２ロイシンのコドンであるＴＴＡがシステインのコドンであるＴＧＣで置換時センスプライマー５’−ＡＡＧ ＧＡＡ ＧＡＴ ＧＧＡ ＡＧＡ ＴＧＣ ＣＴＧ ＧＣＴ ＴＣＴ ＡＡＡ ＴＣＴ−３’（配列番号３１）及びアンチセンスプライマー３’−ＡＧＡ ＴＴＴ ＡＧＡ ＡＧＣ ＣＡＧ ＧＣＡ ＴＣＴ ＴＣＣ ＡＴＣ ＴＴＣ ＣＴＴ−５’（配列番号３２）；

【0109】

８４番目のアラニンのコドンであるＧＣＴがシステインのコドンであるＴＧＣで置換時センスプライマー５’−ＧＡＴ ＧＧＡ ＡＧＡ ＴＴＡ ＣＴＧ ＴＧＣ ＴＣＴ ＡＡＡ ＴＣＴ ＧＴＴ ＡＣＧ−３’（配列番号３３）及びアンチセンスプライマー３’−ＣＧＴ ＡＡＣ ＡＧＡ ＴＴＴ ＡＧＡ ＧＣＡ ＣＡＧ ＴＡＡ ＴＣＴ ＴＣＣ ＡＴＣ−５’（配列番号３４）；

【0110】

１０８番目セリンのコドンであるＴＣＡがシステインのコドンであるＴＧＣで置換時センスプライマー５’−ＴＡＣ ＡＡＴ ＡＣＴ ＴＡＣ ＣＧＧ ＴＧＣ ＡＧＧ ＡＡＡ ＴＡＣ ＡＣＣ ＡＧＴ−３’（配列番号３５）及びアンチセンスプライマー３’−ＡＣＴ ＧＧＴ ＧＴＡ ＴＴＴ ＣＣＴ ＧＣＡ ＣＣＧ ＧＴＡ ＡＧＴ ＡＴＴ ＧＴＡ−５’（配列番号３６）；

【0111】

１３６番目のアラニンのコドンであるＧＣＴがシステインのコドンであるＴＧＣで置換時センスプライマー５’−ＧＧＡ ＣＣＴ ＧＧＧ ＣＡＧ ＡＡＡ ＴＧＣ ＡＴＡ ＣＴＴ ＴＴＴ ＣＴＴ ＣＣＡ−３’（配列番号３７）及びアンチセンスプライマー３’−ＴＧＧ ＡＡＧ ＡＡＡ ＡＡＧ ＴＡＴ ＧＣＡ ＴＴＴ ＣＴＧ ＣＣＣ ＡＧＧ ＴＣＣ−５’（配列番号３８）；

【0112】

１３７番目イソロイシンのコドンであるＡＴＡがシステインのコドンであるＴＧＣで置換時センスプライマー５’−ＣＣＴ ＧＧＧ ＣＡＧ ＡＡＡ ＧＣＴ ＴＧＣ ＣＴＴ ＴＴＴ ＣＴＴ ＣＣＡ ＡＴＧ−３’（配列番号３９）及びアンチセンスプライマー３’−ＣＡＴ ＴＧＧ ＡＡＧ ＡＡＡ ＡＡＧ ＧＣＡ ＡＧＣ ＴＴＴ ＣＴＧ ＣＣＣ ＡＧＧ−５’（配列番号４０）；

【0113】

１３８番目ロイシンのコドンであるＣＴＴがシステインのコドンであるＴＧＣで置換時センスプライマー５’−ＧＧＧ ＣＡＧ ＡＡＡ ＧＣＴ ＡＴＡ ＴＧＣ ＴＴＴ ＣＴＴ ＣＣＡ ＡＴＧ ＴＣＴ−３’（配列番号４１）及びアンチセンスプライマー３’−ＡＧＡ ＣＡＴ ＴＧＧ ＡＡＧ ＡＡＡ ＧＣＡ ＴＡＴ ＡＧＣ ＴＴＴ ＣＴＧ ＣＣＣ−５’（配列番号４２）；と

【0114】

１４４番目のアラニンのコドンであるＧＣＴがシステインのコドンであるＴＧＣで置換時センスプライマー５’−ＴＴＴ ＣＴＴ ＣＣＡ ＡＴＧ ＴＣＴ ＴＧＣ ＡＡＧ ＡＧＣ ＴＧＡ ＴＧＡ−３’（配列番号４３）及びアンチセンスプライマー３’−ＴＣＡ ＴＣＡ ＧＣＴ ＣＴＴ ＧＣＡ ＡＧＡ ＣＡＴ ＴＧＧ ＡＡＧ ＡＡＡ−５’（配列番号４４）。

【0115】

５０番目のヒスチジンのコドンであるＣＡＣがチロシンのコドンであるＴＡＴで置換時センスプライマー５’−ＧＡＧ ＡＡＧ ＡＧＣ ＧＡＣ ＣＣＴ ＴＡＴ ＡＴＣ ＡＡＧ ＣＴＡ ＣＡＡ ＣＴＴ −３’（配列番号４５）及びアンチセンスプライマー３’−ＡＡＧ ＴＴＧ ＴＡＧ ＣＴＴ ＧＡＴ ＡＴＡ ＡＧＧ ＧＴＣ ＧＣＴ ＣＴＴ ＣＴＣ−５’（配列番号４６）。

【0116】

＜実施例５：ｂＦＧＦ変異体の生産及び精製＞
前記ｂＦＧＦ変異体の発現プラスミドのそれぞれに、実施例２と同じ方法でＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させ、ストックを作製し、ＬＢ培地（ＬＢ／アンピシリン）５００ｍｌに培養して、実施例３と同じ方法で精製して、それぞれ約１８ＫＤａの大きさのｂＦＧＦを得た。このとき得られた変異体の量は、変異体によってその差があり、変異体によって約４〜１２ｍｇのｂＦＧＦを得ることができ、純度は９８％以上であった。

【0117】

前記各ｂＦＧＦ変異体は、以下の通りである。

【0118】

配列番号１の６９番目及び８７番目のシステインがセリンに置換され、３４番目イソロイシン及び６７番目グリシンがシステインに置換された変異体

【0119】

配列番号１の６９番目及び８７番目のシステインがセリンに置換され、３４番目イソロイシン及び７０番目のアラニンがシステインに置換された変異体

【0120】

配列番号１の６９番目及び８７番目のシステインがセリンに置換され、３４番目イソロイシン及び８４番目のアラニンがシステインに置換された変異体

【0121】

配列番号１の６９番目及び８７番目のシステインがセリンに置換され、４０番目バリン及び８２番目ロイシンがシステインに置換された変異体

【0122】

配列番号１の６９番目及び８７番目のシステインがセリンに置換され、４０番目バリン及び８４番目のアラニンがシステインに置換された変異体

【0123】

配列番号１の６９番目及び８７番目のシステインがセリンに置換され、５０番目のヒスチジン及び６９番目のシステインがシステインに置換された変異体

【0124】

配列番号１の６９番目及び８７番目のシステインがセリンに置換され、５２番目のリジン及び６８番目バリンがシステインに置換された変異体

【0125】

配列番号１の６９番目及び８７番目のシステインがセリンに置換され、７６番目のメチオニン及び１０８番目セリンがシステインに置換された変異体

【0126】

配列番号１の６９番目及び８７番目のシステインがセリンに置換され、１１７番目のアラニン及び１３６番目のアラニンがシステインに置換された変異体

【0127】

配列番号１の６９番目及び８７番目のシステインがセリンに置換され、１１７番目のアラニン及び１３７番目イソロイシンがシステインに置換された変異体

【0128】

配列番号１の６９番目及び８７番目のシステインがセリンに置換され、７５番目のアラニンがシステインに置換された変異体

【0129】

配列番号１の６９番目及び８７番目のシステインがセリンに置換され、２６番目のリジン及び８７番目のシステインがシステインに置換された変異体

【0130】

配列番号１の６９番目及び８７番目のシステインがセリンに置換され、１３８番目ロイシンがシステインに置換された変異体

【0131】

配列番号１の６９番目及び８７番目のシステインがセリンに置換され、５２番目のリジン及び１４４番目のアラニンがシステインに置換された変異体

【0132】

配列番号１の６９番目及び８７番目のシステインがセリンに置換され、７５番目のアラニンがシステインに置換され、５０番目のヒスチジンがチロシンに置換された変異体

【0133】

天然型と変異体の精製は、ＳＰ−ｓｅｐｈｒｏｓｅとヘパリン親和性カラムを介して精製が可能である。二種のいずれもＳＰカラムから約４００ｍＭ ＮａＣｌ濃度で溶出され、ヘパリンカラムの場合１．５Ｍ ＮａＣｌで溶出された。最終ヘパリン親和性カラム精製を行った後、ＳＤＳ Ｐａｇｅ分析を行った。

【0134】

図８に示すように、天然型の場合、ダイマー（Ｄｉｍｅｒ）とトリマー（ｔｒｉｍｅｒ）が観察されるのに対し、変異体の場合、モノマー（ｍｏｎｏｍｅｒ）サイズに単一バンド形態で存在することが確認できた。これは活性のないダイマー、トリマーが完全に除去され、モノマーの状態で存在することがわかった。

【0135】

図８に、最終精製後、天然型（Ａ）と変異体（Ｂ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示した。

【0136】

＜実験例１：天然型と変異体ｂＦＧＦの円偏光二色性を用いた構造分析＞
Ｊ−８１０分光計（ＪＡＳＣＯ）を使用して円偏光二色性分析を通じて、実施例５の精製されたｂＦＧＦ変異体の構造と熱安定性を測定した。天然型ｂＦＧＦは、実施例３で精製されたｂＦＧＦを使用した。構造分析のために、それぞれのｂＦＧＦを２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）に溶かし、最終濃度が０．１ｍｇ／ｍｌになるように一定にする。そして０．１ｃｍ ｃｅｌｌに入れ１９０ｎｍ〜２５０ｎｍの領域にバンド幅１ｎｍ、応答０．２５秒、データピッチ０．１ｎｍ、スキャン速度２０ｎｍ／ｍｉｎ、セル長１ｃｍ、蓄積（ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）８回、温度は２０℃の条件で構造を分析した。

【0137】

熱安定性を分析するためにＴｍ（融解温度）は、２０℃と９５℃でのｆａｒ−ＵＶを比較分析して２０８ｎｍの波長を決定し、０．１ｃｍ ｃｅｌｌに０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で行った。条件は、１℃／分の条件で、２０℃〜９５℃まで測定した。その結果は、表２に示した。

【0138】

【表2】

【0139】

表２は、天然型ｂＦＧＦとｂＦＧＦ変異体の構造変化の程度と熱安定性の測定実験である円偏光二色性分析中２０８ｎｍの波長で温度別ほどけ構造の割合（ｆｒａｃｔｉｏｎ ｕｎｆｏｌｄｅｄ）を測定した結果を示した値である。折り畳み−ほどけ現象が起こるときには２０８ｎｍ付近の区間で構造の変化を見せるが、これを用いて２０〜９５℃の範囲内でＴｍ（融解温度）を測定し、正確なＴｍ値を分析した。

【0140】

前記ｂＦＧＦ変異体は、配列番号１の６９番目及び８７番目のシステインをセリンに置換した後、さらに、それぞれの該当位置の残基をシステインに置換して、分子内ジスルフィド結合を誘導させた変異体である。

【0141】

その結果、構造変化ではほとんどが天然型ｂＦＧＦと同じ構造を示して変化がほとんどなく、ジスルフィド結合を追加した変異体で特別な構造を持たなかった。熱安定性を示すＴｍは５８℃である天然型ｂＦＧＦと比較してほとんどがｂＦＧＦ変異体と同一であり、そのうちＫ７５変異体で６２℃まで熱安定性が改善されたことを確認できた。これはアミノ酸１個をシステインに置換させてジスルフィド結合を人為的に追加することにより熱安定性が増加したことを意味する。

【0142】

一方、本発明の特定位置の配列番号１の６９番目及び８７番目のシステインがセリンに置換され、７５番目のアラニンがシステインにさらに置換されたＫ７５変異体の顕著性を確認するために、配列番号１の天然型ｂＦＧＦ、配列番号１の６９番目及び８７番目のシステインのみがセリンに置換されたｂＦＧＦ変異体（Ｃｙｓ→Ｓｅｒ変異体）、配列番号１の７５番目のアラニンのみがシステインに置換されたｂＦＧＦ変異体（天然型＋ジスルフィド結合）及びＫ７５変異体（Ｃｙｓ→Ｓｅｒ変異体＋ジスルフィド結合、配列番号１の６９番目及び８７番目のシステインがセリンに置換され、７５番目のアラニンがシステインに置換されたｂＦＧＦ変異体）の熱安定性を比較して確認した。

【0143】

その結果、図５に示すように、天然型ｂＦＧＦのＴＭは、約５７．５度、Ｃｙｓ→Ｓｅｒ変異体のＴＭは５８℃、天然型＋ジスルフィド結合のＴＭは６１．５℃、Ｋ７５変異体（Ｃｙｓ→Ｓｅｒ変異体＋ジスルフィド結合）のＴＭは６２℃と確認され、これはＫ７５変異体の熱力学的安定性が増加したことを意味する。

【0144】

さらに実験で配列番号１の６９番目及び８７番目のシステインがセリンに置換され、７５番目のアラニンがシステインにさらに置換されたＫ７５変異体に、５０番目のヒスチジンがチロシンに置換されたＨｓｂＦＧＦの熱安定性を示すＴｍは５８℃の天然型ｂＦＧＦと６２℃Ｋ７５変異体と比較して６５℃まで熱安定性が向上されたことを確認できた。これは、表面に存在するアミノ酸１個をチロシンに置換させて、タンパク質の内部のキャビティの安定化をもたらして新たに形成された水素結合とファンデルワールス相互作用による熱安定性が増加したことを意味する。

【0145】

その結果、図９に示すように、天然型ｂＦＧＦのＴＭは約５７．５℃、Ｋ７５変異体（Ｃｙｓ→Ｓｅｒ変異体＋ジスルフィド結合）のＴＭは６２℃と確認され、ＨｓｂＦＧＦ（Ｋ７５＋Ｈｉｓ→Ｔｙｒ）ＴＭは６５℃で変異体の熱力学的安定性が増加したことを意味する。

【0146】

＜実験例２：天然型と変異体ｂＦＧＦの細胞増殖検定＞
作製された天然型ｂＦＧＦと変異体のうち可溶性と円偏光二色性を用いた構造とＴｍの結果の分析を通じて、良い結果をｂＦＧＦを選定して、細胞増殖検定を実施した。細胞増殖検定は、（株）ジェネウェルに依頼してｂＦＧＦの敏感な皮膚細胞であるＮＩＨ３Ｔ３細胞株をもって行った。実験方法としては、ＮＩＨ−３Ｔ３ ｃｅｌｌを１０％熱不活性化されたウシ胎児血清、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ完全培地を用いて維持した。９６ｗｅｌｌ培養プレートに２×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌのＮＩＨ−３Ｔ３ ｃｅｌｌを播種した。２４時間培養したＮＩＨ−３Ｔ３ ｃｅｌｌは無血清ＤＭＥＭ培地で飢餓させた後、０．５％ＦＢＳが含まれたＤＭＥＭ培地にサンプル溶液をそれぞれの濃度別に処理し、７２時間培養した。培養後、１０ｕｌのＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド］溶液を添加し、２時間反応させた後に用いて、１００ｕｌのＤＭＳＯにホルマザン結晶を溶解させた。吸光度は分光光度計を用いて５４０ｎｍの波長で測定した。薬剤に対する感受性は、薬剤を処理していないｗｅｌｌ（対照群）の吸光度に対する薬剤処理ｗｅｌｌでの割合で比較した。図６及び図１２に示すようにｂＦＧＦ変異体が天然型ｂＦＧＦと同様の細胞増殖能力を示している。

【0147】

＜実験例３：天然型と変異体ｂＦＧＦのインキュベーションによるタンパク質の定量分析＞
天然型ｂＦＧＦと変異体［配列番号１の６９番目及び８７番目のシステインのみがセリンに置換されたｂＦＧＦ変異体（Ｃｙｓ→Ｓｅｒ変異体）、配列番号１の７５番目のアラニンのみがシステインに置換されたｂＦＧＦ変異体（天然型＋ジスルフィド結合）及びＫ７５変異体（Ｃｙｓ→Ｓｅｒ変異体＋ジスルフィド結合、配列番号１の６９番目及び８７番目のシステインがセリンに置換され、７５番目のアラニンがシステインに置換されたｂＦＧＦ変異体）の安定性を確認するために、３７℃短期間インキュベーションテストを行った。人体の状態に最も近いＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ）状態で天然型ｂＦＧＦと変異体を０．５ｍｇ／ｍｌに溶かした後、３７℃であるｗａｔｅｒ ｂａｔｈでインキュベーションした。４８時間、７日、１０日単位でサンプリングして１３０００ｒｐｍで１５分間、４℃で遠心分離して上清のみを得、Ｎａｎｏ ｄｒｏｐを用いて、タンパク質を定量した。時間が経つにつれ、天然型ｂＦＧＦと変異体の濃度を定量し、天然型ｂＦＧＦが変異体に比べてより大きな減少を示した。前記の結果を表３に示した。

【0148】

【表3】

【0149】

また、前記結果を基に、熱安定性が増加したＫ７５変異体を用いて、人体の状態に最も近いＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ）状態で天然型ｂＦＧＦと比較してＫ７５変異体が長期間保存安定性を有するか否かを確認した。まず、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ）状態に天然型ｂＦＧＦとＫ７５変異体を同じ濃度で溶かした後、２０日間、２５℃でインキュベーションした。そして遠心分離して上清のみをもってＨＰＬＣを用いて定量分析した。

【0150】

その結果、図７に示すように、インキュベーションのうちＫ７５変異体が天然型ｂＦＧＦに比べ安定性が格段に高く、これは本発明のＫ７５変異体の優秀性を示す結果である。

【0151】

＜実験例４：天然型と変異体ｂＦＧＦの５０、６０℃インキュベーションによるＨＰＬＣ分析＞
天然型ｂＦＧＦとＫ７５変異体（Ｃｙｓ→Ｓｅｒ変異体＋ジスルフィド結合、配列番号１の６９番目及び８７番目のシステインがセリンに置換され、７５番目のアラニンがシステインに置換されたｂＦＧＦ変異体）及びＨｓｂＦＧＦ Ｋ７５変異体（Ｃｙｓ→Ｓｅｒ変異体＋ジスルフィド結合、配列番号１の６９番目及び８７番目のシステインがセリンに置換され、７５番目のアラニンがシステインに置換されて、５０番目のヒスチジンがチロシンに置換されたｂＦＧＦ変異体）の安定性を確認するために、５０℃で１週間、６０℃で５日間インキュベーションテストを行った。ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ）でそれぞれの天然型ｂＦＧＦと変異体を０．５ｍｇ／ｍｌに溶かした後、５０℃、６０℃のｗａｔｅｒ ｂａｔｈでインキュベーションした。日付によるサンプリングをして１３０００ｒｐｍで１５分間、４℃で遠心分離して上清のみを得てＨＰＬＣ及びＵＶ分光計を用いてタンパク質を分析した。

【0152】

その結果、図１０に示すようにｕｖ分光計を用いた定量では、５日後から天然型ｂＦＧＦは、定量をすることができず、Ｋ７５変異体の場合、７日後３８％残っており、ｈｓｂＦＧＦの場合は７２％を維持することが示された。

【0153】

また、図１１に示すように６０℃ＵＶ分光計を用いた定量で天然型ｂＦＧＦの場合、３日後からはほぼ確認できず、Ｋ７５の場合、５日後２２％のみが残っており、ＨｓｂＦＧＦの場合、５日後４０％を維持することが示された。

【0154】

図１２に示されている結果を用いてＨＰＬＣの分析で７日後、天然型ｂＦＧＦの場合、ＨＰＬＣで定量することができず、Ｋ７５の場合３０％、ＨｓｂＦＧＦの場合６０％以上残っていることが確認できた。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]