特許 6667437 最適な体重及び血糖を維持するための新規ポリペプチドホルモンの同定

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6667437

(24)【登録日】2020年2月27日

(45)【発行日】2020年3月18日

(54)【発明の名称】最適な体重及び血糖を維持するための新規ポリペプチドホルモンの同定

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/22 20060101AFI20200309BHJP

   A61P 1/14 20060101ALI20200309BHJP

   A61P 3/08 20060101ALI20200309BHJP

   C07K 14/575 20060101ALN20200309BHJP

   C12N 15/16 20060101ALN20200309BHJP

【ＦＩ】

   A61K38/22ZNA

   A61P1/14

   A61P3/08

   !C07K14/575

   !C12N15/16

【請求項の数】9

【全頁数】48

(21)【出願番号】特願2016-535713(P2016-535713)

(86)(22)【出願日】2014年11月24日

(65)【公表番号】特表2016-540763(P2016-540763A)

(43)【公表日】2016年12月28日

(86)【国際出願番号】US2014067162

(87)【国際公開番号】WO2015084625

(87)【国際公開日】20150611

【審査請求日】2017年11月22日

(31)【優先権主張番号】62/037,779

(32)【優先日】2014年8月15日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/073,501

(32)【優先日】2014年10月31日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/010,557

(32)【優先日】2014年6月11日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/910,498

(32)【優先日】2013年12月2日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】391058060

【氏名又は名称】ベイラー カレッジ オブ メディスン

【氏名又は名称原語表記】ＢＡＹＬＯＲ ＣＯＬＬＥＧＥ ＯＦ ＭＥＤＩＣＩＮＥ

(74)【代理人】

【識別番号】110000729

【氏名又は名称】特許業務法人 ユニアス国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】チョプラ、アトゥール

(72)【発明者】

【氏名】ムーア、デヴィッド ディー．

【審査官】 竹内 祐樹

(56)【参考文献】

【文献】 Am. J. Physiol. Renal Physiol., 2006, 290(6), pp.F1329-F1336

【文献】 Biochem. J., 2010, 432(2), pp.333-341

【文献】 J. Biol. Chem., 1999, 274(13), pp.8933-8940

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

個体の体重を増加させるための組成物であって、
配列番号１の配列を含む組換えアスプロシンポリペプチド、又は、
配列番号１と少なくとも９５％同一である配列を含む、その機能的誘導体ポリペプチド、若しくは、機能的フラグメント
を含有し、
該機能が、個体の体重を増加させることである、組成物。

【請求項2】

個体の食欲レベルを増加させるための組成物であって、
配列番号１の配列を含む組換えアスプロシンポリペプチド、又は、
配列番号１と少なくとも９５％同一である配列を含む、その機能的誘導体ポリペプチド、若しくは、機能的フラグメント
を含有し、
該機能が、個体の食欲レベルを増加させることである、組成物。

【請求項3】

個体の血中グルコースのレベルを増加させるための組成物であって、
配列番号１の配列を含む組換えアスプロシンポリペプチド、又は、
配列番号１と少なくとも９５％同一である配列を含む、その機能的誘導体ポリペプチド、若しくは、機能的フラグメント
を含有し、
該機能が、個体の血中グルコースのレベルを増加させることである、組成物。

【請求項4】

個体の食欲を刺激するための組成物であって、
配列番号１の配列を含む組換えアスプロシンポリペプチド、又は、
配列番号１と少なくとも９５％同一である配列を含む、その機能的誘導体ポリペプチド、若しくは、機能的フラグメント
を含有し、
該機能が、個体の食欲を刺激することである、組成物。

【請求項5】

前記ポリペプチド、その機能的誘導体ポリペプチド、又は、機能的フラグメントが、薬学的に許容できる担体に含まれる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項6】

前記機能的誘導体ポリペプチド、又は、そのフラグメントが、配列番号１と比較して１、２、３、４、５、６、又は、７のアミノ酸改変を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項7】

前記機能的誘導体ポリペプチド、又は、そのフラグメントが、１、２、３、４、又は５以下のアミノ酸の配列番号１のＮ末端トランケーションを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項8】

前記機能的誘導体ポリペプチド、又は、そのフラグメントが、１、２、３、４、又は５以下のアミノ酸の配列番号１のＣ末端トランケーションを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項9】

前記ポリペプチド、その機能的誘導体ポリペプチド、又は、機能的フラグメントが標識されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０１３年１２月２日に出願された米国特許仮出願第６１／９１０，４９８号、及び２０１４年６月１１日に出願された米国特許仮出願第６２／０１０，５５７号、及び２０１４年８月１５日に出願された米国特許仮出願第６２／０３７，７７９号、及び２０１４年１０月３１日に出願された米国特許仮出願第６２／０７３，５０１号に優先権を主張し、その出願の全てを、その全体において参照により本明細書に組み込む。

【0002】

本開示の実施形態は、少なくとも細胞生物学、分子生物学、内分泌学及び医学の分野を含む。

【背景技術】

【0003】

２０１３年に米国医学協会は、肥満が疾患であり（Ｍｏｒｇｅｎ及びＳｏｒｅｎｓｏｎ、２０１４年）、全世界で、予防可能な主要な死因であると分類し、その遺伝的及び分子的基盤をより明確に理解することが、これ程までに重要であったことはない（Ｍｏｒｇｅｎ及びＳｏｒｅｎｓｏｎ、２０１４年；Ｍａｌｉｋ、ら、２０１３年）。肥満は、エネルギー摂取と排出との不均衡によって起こる（Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ、ら、２００１年；Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ、ら、１９９６年）。これらの２つの過程に影響を与える器官の数及びエネルギーホメオスタシスの複雑さのため、肥満の研究は、依然として大きな科学的難題である（Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ、ら、２００１年）。歴史的には、ヒトにおける極端な変異の研究は、複雑な生物学的問題を解決し、疾患に対する治療標的を開発するための強力な道具であった（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、ら、２００９年；Ｆｒｉｅｄｍａｎ、ら、２００９年）。本開示は、新生児早老症様症候群（ＮＰＳ）として公知のヒトにおける、るい痩障害の表現型を駆動する分子機構として、脂肪量の維持及び関連する血糖制御に関与する新規の循環ポリペプチドホルモンの減少について記述する（Ｈｏｕ、ら、２００９年；Ｏ’Ｎｅｉｌｌ、ら、２００７年）。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本開示の実施形態は、個体の体重に影響を与える方法及び組成物に関し、特定の組成物は個体の体重を増加させるのに有用であり、特定の組成物は個体の体重を低下させるのに有用である。体重の減少又は増加は、なんらかの適当な手段により得られるが、特定の実施形態において、体重の減少若しくは増加は、対応する脂肪量の減少若しくは増加のためである。体重を増加させる個体は、少なくとも部分的には食欲の増加によってそうなる場合がある、しかし特定の実施形態において、その体重は、食欲の増加を伴わずに増加する。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本開示の実施形態は、本明細書でアスプロシンと称されるフィブリリン−１のＣ末端フラグメント、又はその機能的フラグメント若しくは機能的誘導体を包含する方法及び組成物を含む。循環アスプロシンなどアスプロシンの増加は、個体の体重を増加させるのに有用であるが、特定の実施形態において、アスプロシンの低下は、個体の体重を低下させるのに有用である。

【0006】

特定の実施形態において、脂肪量を増やす必要がある個体を含めた体重を増やす必要がある個体にアスプロシン又はその機能的フラグメント若しくは機能的誘導体を与える。そのような個体は、体重を増やす若しくは体重を保つことを妨げる病状が有るので、及び／又は生まれながらの低体重若しくは外因によるなど他の理由により体重を増やす若しくは保つことができない若しくはそうしないので、体重を増やす必要がある場合がある。特定の実施形態において、病状は、個体における１つ又は複数の遺伝的な異常のためである。特定の実施形態において、病状は、症状として悪液質を含む。

【0007】

特定の実施形態において、個体は、体重を減らす必要があり、従って、個体中にある天然のアスプロシンのインヒビターを有効量与える。インヒビターは、任意の性質のものであってよいが、特定の実施形態において、インヒビターは、例えばアスプロシンのＮ末端、アスプロシンのＣ末端、若しくはアスプロシンの内部領域にあるエピトープを標的する小分子を含めた抗体又は小分子である。

【0008】

本開示の実施形態において、個体は、グルコース制御を改善する必要があり、従って、個体中にある天然のアスプロシンのインヒビターを有効量与える。インヒビターは、任意の性質のものであってよいが、特定の実施形態において、インヒビターは、例えばアスプロシンのＮ末端、アスプロシンのＣ末端、若しくはアスプロシンの内部領域にあるエピトープを標的する小分子を含めた抗体又は小分子である。そのような個体は、任意の性質のものであってよいが、特定の実施形態において、個体は、糖尿病性、前糖尿病性（それは、空腹時血漿グルコース試験、経口グルコース負荷試験及び／若しくはヘモグロビンＡ１Ｃ試験によって決定できるいずれか）、インスリン抵抗性等である。特定の実施形態において、高血糖及びインスリン抵抗性個体に、１つ又は複数のアスプロシンインヒビターを有効量与える。特定の実施形態において、個体が、血糖の制御における改善を必要とする場合、個体に、アスプロシンインヒビターを有効量与え、アスプロシンインヒビターは、そのような改善のために個体に特に投与する。

【0009】

本開示の実施形態は、アスプロシン又はその機能的フラグメント若しくは機能的誘導体を含む食欲刺激薬を含む。本開示の実施形態は、アスプロシン、の１つ又は複数のインヒビターを含む食欲抑制薬も含む。

【0010】

一実施形態において、組換えアスプロシンポリペプチド又はその機能的誘導体若しくは機能的フラグメントがある。特定の実施形態において、アスプロシンポリペプチドは、配列番号１の配列を含む。特定の実施形態において、ポリペプチドは、薬学的に許容できる担体に含まれる。特定の実施形態において、機能的誘導体若しくはそのフラグメントは、配列番号１と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個以上のアミノ酸改変を含む。機能的誘導体若しくはその機能的フラグメントは、配列番号１のＮ末端トランケーションを含むことができ、特定の実施形態において、トランケーションは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００個以下のアミノ酸であってもよく、又は特定の実施形態において、トランケーションは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００個のアミノ酸である。特定の実施形態において、機能的誘導体若しくはその機能的フラグメントは、配列番号１のＣ末端トランケーションを含み、例えばトランケーションは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００個以下のアミノ酸、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００個のアミノ酸などである。いくつかの実施形態において、機能的誘導体若しくはその機能的フラグメントは、配列番号１内に内部欠失を含み、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００個以下のアミノ酸、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００個のアミノ酸である内部欠失などである。いくつかの場合において、アスプロシン機能的誘導体又はそのフラグメントは、配列番号１と少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％同一である配列を含むことができる。特定の実施形態において、ポリペプチドは標識されている。

【0011】

一実施形態において、個体において天然のアスプロシンのレベルを調節する工程を含む、個体の体重を調節する方法がある。特定の実施形態において、個体の体重が不十分な場合、天然のアスプロシンのレベルを増加させる。特定の実施形態において、個体の体重が過剰である場合、天然のアスプロシンのレベルを低下させる。特定の場合において、天然のアスプロシンのレベルは、アスプロシンの転写を調節することによって調節され及び／又はアスプロシンの翻訳を調節することによって調節される。特定の実施形態において、天然のアスプロシンのレベルは、細胞からのアスプロシンの分泌を調節することによって調節され及び／又はアスプロシンの安定性を調節することによって調節される。

【0012】

一実施形態において、個体に本明細書において考えられる任意のポリペプチドを有効量与える工程を含む、個体の体重を増加させる方法がある。特定の実施形態において、個体の食欲レベルが、増加される。

【0013】

一実施形態において、個体にアスプロシンのインヒビターを有効量与える工程を含む、個体の体重を低下させる方法がある。特定の実施形態においてはインヒビターは抗体であるが、小分子であってもよい。

【0014】

一実施形態において、個体にアスプロシンのインヒビターを有効量与える工程を含む、個体の血中グルコースのレベルを低下させる方法がある。

【0015】

特定の実施形態において、個体に本明細書において考えられる任意のポリペプチドを有効量与える工程を含む、個体の血中グルコースのレベルを増加させる方法がある。

【0016】

一実施形態において、本明細書において考えられる任意のポリペプチドを含むキットがあり、ポリペプチドは適切な容器に入れてある。

【0017】

一実施形態において、個体に本明細書において考えられる任意のポリペプチドを有効量与える工程を含む、個体の食欲を刺激する方法がある。

【0018】

特定の実施形態において、本明細書において考えられる任意のポリペプチドのインヒビターがある。

【0019】

以下に続く本発明の詳細な説明をより良く理解できるように、前述は、本発明の特徴及び技術的長所をある程度広く概説した。本発明の請求の範囲の主題を形成する本発明の追加の特徴及び利点を、以下に記述することとする。開示される概念及び特定の実施形態を、本発明と同じ目的を実施するために他の構造を修飾又は設計するための基礎として容易に利用できることは、当業者に認められるべきである。そのような同等の構築が、添付の請求の範囲において規定される本発明の精神及び範囲から逸脱しないことも、当業者に認識されるべきである。添付の図と関連させて考慮する場合、更なる目的並びに利点と合わせてその構成及び操作方法の両方について本発明の特質と考えられる新規の特徴は、以下の説明からより良く理解されることになる。しかしながら、図のそれぞれは、例証及び説明のためだけに提供され、本発明の範囲の定義を意図しないことは明示的に理解されることになる。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1A-1D】新生児早老性症候群は、ＦＢＮ１の３’末端におけるｄｅ ｎｏｖｏ、ヘテロ接合性、トランケーション突然変異に起因する ａ、関連する脂肪異栄養を示す２例のＮＰＳ患者の代表的な画像である、脂肪異栄養は、臀筋範囲を残して顔面及び四肢に主に影響を及ぼす。ｂ、２例のＮＰＳ患者のＦＢＮ１突然変異、肥満指数（ＢＭＩ）及び家系図を示す図である。ｃ、本開示の２例のＮＰＳ患者及び公開されている症例報告の５例のＮＰＳ患者における３’ＦＢＮ１突然変異を示す図である。患者＃２は、害がないと予測され、明確さのため図中に示さないＦＢＮ１におけるヘテロ接合性ミスセンス突然変異（ｃ．８２２２Ｔ＞Ｃ）も有する。ｄ、７つ全てのＮＰＳ突然変異が、Ｆｕｒｉｎ切断部位（赤色で示すＲＧＲＫＲＲモチーフ）の周りに集まっていることを示す図である。これら突然変異は、全ての又は大多数のＣ末端ポリペプチドのヘテロ接合性切除をもたらすと予測され、その突然変異をＲＧＲＫＲＲモチーフの後に黒色で示す。フレームシフトにより付加された非天然のアミノ酸を、青色で示す。野生型（ＷＴ）配列を、参照のために提示する。

【0021】

【図2A-2C】ＦＢＮ１は、白色脂肪組織において高く及び動的に発現される ａ、ＦＢＮ１発現を、マウス白色脂肪組織、褐色脂肪組織及び骨格筋において定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって測定した（各群ｎ＝５）図である。ｂ、７日間脂肪生成分化に供したヒト前脂肪細胞において、ＦＢＮ１発現を定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって測定した図である。ＣＥＢＰα発現を、脂肪生成分化のマーカーとして示す。ｃ、通常の食事又は１０週間高脂肪食に供した雄のＷＴマウスの鼠径部白色脂肪組織において、ＦＢＮ１発現を定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって測定した（各群ｎ＝５）図である。データを、平均±ＳＥＭで表す。対応のないスチューデントｔ−検定を使用して、統計的有意性を評価した。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、及び^＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【0022】

【図3A-3D】アスプロシンは、高度に保存されており、循環している、フィブリリン−１のＣ末端分解産物である ａ、ヒトＦＢＮ１遺伝子及びその進化的な保存を、ＵＣＳＣゲノムブラウザを使用して描画した図である。アスプロシンコード領域を四角で囲む。ｂ、アスプロシンコード領域に寄与するエクソン６５及び６６の拡大図を、ＵＣＳＣゲノムブラウザを使用して描画した図である。ｃ、通常の食事若しくは８週間高脂肪食に供した１４週齢ＷＴマウス、又はｏｂとして公知のレプチン自然突然変異に関してヘテロ接合性若しくはホモ接合性いずれかである８週齢の雄マウスの血漿において、アスプロシンに対して標的したウェスタンブロット分析を実行した図である。ｄ、肥満のヒト又は体重が正常に制御されている対象の血漿において、アスプロシンに対して標的したウェスタンブロット分析を実行した図である。

【0023】

【図4A-4H】アスプロシンは、ＮＰＳ関連脂肪生成分化異常をｉｎ ｖｉｔｒｏでレスキューする ａ、ＮＰＳ患者（変異体）又は７日間脂肪生成分化に供した非罹患対照対象（ＷＴ）のヒト皮膚線維芽細胞において、脂肪生成の初期及び後期マーカーのいくつかの発現を定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって測定した図である。ｂ、ＷＴフィブリリン−１（ＷＴ ＦＢＮ１）、シグナルペプチドのないアスプロシン（ＦＢＮ１ ＣＴ）、及び結合したシグナルペプチドを持つアスプロシン（ＦＢＮ１ ＣＴＳＰ）をＣＭＶプロモーターの制御下で発現する全ての発現構築物のアニメ化描写である。２７アミノ酸の天然のフィブリリン−１シグナルペプチドを赤で示す。ｃ、７日間脂肪生成誘導に曝露し、ＷＴフィブリリン−１（ＷＴ ＦＢＮ１）、シグナルペプチドのないアスプロシン（ＦＢＮ１ ＣＴ）、及び結合したシグナルペプチドを持つアスプロシン（ＦＢＮ１ ＣＴＳＰ）、又は対照として緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を駆動する発現構築物に曝露したＷＴヒト皮膚線維芽細胞の細胞培養培地において、アスプロシンに対して標的したウェスタンブロット分析を実行した図である。ｄ、ＮＰＳ患者（変異体）又は７日間脂肪生成分化に供し、同時にＷＴフィブリリン−１（ＷＴ ＦＢＮ１）若しくはＧＦＰを駆動する発現構築物に曝露した非罹患対照対象（ＷＴ）のヒト皮膚線維芽細胞において、脂肪生成の初期（ＣＥＢＰα）及び後期（ＡＰ２）マーカーの発現を定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって測定した図である。統計的比較を、変異体＋ＧＦＰ群と変異体＋ＷＴ ＦＢＮ１群とで示す。ｅ、ＮＰＳ患者（変異体）又は７日間脂肪生成分化に供し、同時にシグナルペプチド（ＦＢＮ１ ＣＴ）のないアスプロシン若しくはＧＦＰを駆動する発現構築物に曝露した非罹患対照対象（ＷＴ）のヒト皮膚線維芽細胞において、脂肪生成の初期（ＣＥＢＰα）及び後期（ＡＰ２）マーカーの発現を定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって測定した図である。統計的比較を、変異体＋ＧＦＰ群と変異体＋ＦＢＮ１ ＣＴ群とで示す。ｆ、ＮＰＳ患者（変異体）又は７日間脂肪生成分化に供し、同時に結合したシグナルペプチド（ＦＢＮ１ ＣＴＳＰ）を持つアスプロシン若しくはＧＦＰを駆動する発現構築物に曝露した非罹患対照対象（ＷＴ）のヒト皮膚線維芽細胞において、脂肪生成の初期（ＣＥＢＰα）及び後期（ＡＰ２）マーカーの発現を定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって測定した図である。統計的比較を、変異体＋ＧＦＰ群と変異体＋ＦＢＮ１ ＣＴＳＰ群とで示す。ｇ、７日間脂肪生成分化に供し、同時に６０ｎＭ組換えアスプロシン又はＧＦＰに曝露した非罹患の対照対象（ＷＴ）のヒト皮膚線維芽細胞において、脂肪生成の初期及び後期マーカーのいくつかの発現を定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって測定した図である。ＣＥＢＰα発現の誘導を、３０ｎＭ〜６２５ｎＭのアスプロシン用量の範囲で観察した。ｈ、ＮＰＳ患者（変異体）又は７日間脂肪生成分化に供し、同時に６０ｎＭ組換えアスプロシン若しくはＧＦＰに曝露した非罹患対照対象（ＷＴ）のヒト皮膚線維芽細胞において、脂肪生成の初期（ＣＥＢＰα）及び後期（ＡＰ２）マーカーの発現を定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって測定した図である。データを、平均±ＳＥＭで表す。対応のないスチューデントｔ−検定を使用して、統計的有意性を評価した。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１及び^＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【0024】

【図5A-5J】高い循環アスプロシンは、肥満性及び糖尿病誘発性である ａ、ｂ、ｃ、核磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）並びに総体重を使用して、脂肪量及び非脂肪量を、ＦＢＮ１又はＧＦＰのｃＤＮＡ（ＣＭＶプロモーターの制御下にある）を保有するアデノウイルスのウイルス粒子１０^１１個の尾静脈注射を１回だけ受けたＷＴマウスにおいて測定した（各群ｎ＝６）図である。測定は指示した日に行った。ｄ、ｅ、ｆ、核磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）並びに総体重を使用して、脂肪量及び非脂肪量を、２．６μＭ組換えアスプロシン又はＧＦＰの毎日の皮下注射を１０日間受けたＷＴマウスにおいて測定した（各群ｎ＝６）図である。測定を、指示した日に行った。ｇ、ｉ、グルコース負荷試験及びインスリン負荷試験を、ＦＢＮ１又はＧＦＰのｃＤＮＡ（ＣＭＶプロモーターの制御下にある）を保有するアデノウイルスのウイルス粒子１０^１１個の尾静脈注射を１回だけ受けた絶食ＷＴマウスで実行した（各群ｎ＝６）図である。測定はアデノウイルス注射の１０日後に行った。ｈ、ｊ、グルコース負荷試験及びインスリン負荷試験を、２．６μＭ組換えアスプロシン又はＧＦＰの毎日の皮下注射を１０日間受けた絶食ＷＴマウスで実行した（各群ｎ＝６）図である。測定を、最初の注射の１０日後に行った。注目すべきは、ＧＦＰマウス（アデノウイルス及びペプチド媒介送達の両方）におけるインスリン負荷試験は、６０分時点で血糖計では「低すぎて測定できない」値を呈する重度の血糖低下によって悪化した。致命的な血糖低下を防ぐために、それらのマウスに外部からグルコースを注射しなければならなかった。しかしながら、図に示すようにＦＢＮ１アデノウイルス及びアスプロシン注射したマウスはその血糖レベルを維持した。データを、平均±ＳＥＭで表す。統計的有意性を評価するために、２つの群を比較するには対応のないスチューデントｔ−検定を使用し、３つ以上の群を比較するにはＡＮＯＶＡを使用した。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１及び^＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【0025】

【図6A-6D】トランケートされたプロフィブリリンの優性阻害効果 ａ、ＮＰＳ患者及び非罹患対照対象（ＷＴ）の血漿において、アスプロシンに対して標的したウェスタンブロット分析を実行した図である。ｂ、ＮＰＳ患者（ＮＰＳ）又は７日間脂肪生成誘導に曝露し、同時に分泌経路を遮断するためにビヒクル若しくはモネンシンに曝露した非罹患対照対象（ＷＴ）由来のヒト皮膚線維芽細胞の細胞培養培地において、アスプロシンに対して標的したウェスタンブロット分析を実行した図である。ｃ、ＷＴフィブリリン−１（ＷＴ ＦＢＮ１）又はフレームシフト及びＣ末端トランケーションを誘導するｃ．８２０７＿８２０８Ｉｎｓ１ｂｐ突然変異を保有する変異体プロフィブリリン（ＦＢＮ１ ＮＴ△）を発現する発現構築物のアニメ化描写である。ｄ、７日間脂肪生成誘導に曝露し、同時に分泌経路を遮断するためのビヒクル若しくはモネンシンと共にＧＦＰ若しくはトランケートされたプロフィブリリン（ＦＢＮ１ ＮＴ△）である変異体を駆動する発現構築物に曝露した非罹患対照対象（ＷＴ）由来のヒト皮膚線維芽細胞の細胞培養培地において、アスプロシンに対して標的したウェスタンブロット分析を実行した図である。

【0026】

【図7A-7B】ＦＢＮ１アデノウイルス又はアスプロシン注射が、循環アスプロシンの量を増加させる ａ、ＦＢＮ１又はＧＦＰのｃＤＮＡ（ＣＭＶプロモーターの制御下にある）を保有するアデノウイルスのウイルス粒子１０^１１個の尾静脈注射を１回だけ受けたＷＴマウスの血漿において、アスプロシンに対して標的したウェスタンブロット分析を実行した図である。測定はアデノウイルス注射の１０日後に行った。ｂ、２．６μＭ組換えアスプロシン又はＧＦＰの毎日の皮下注射を１０日間受けたＷＴマウスの血漿において、アスプロシンに対して標的したウェスタンブロット分析を実行した図である。測定は、最初の注射の１０日後に行った。

【0027】

【図8A-8B】より多い循環アスプロシンが、脂肪細胞サイズの増加をもたらす ａ、ＦＢＮ１又はＧＦＰのｃＤＮＡ（ＣＭＶプロモーターの制御下にある）を保有するアデノウイルスのウイルス粒子１０^１１個の尾静脈注射を１回だけ受けた４時間絶食したＷＴマウスのホルマリン固定鼠径部白色脂肪組織切片を、ヘマトキシリンエオジンで染色した図である。切片を、アデノウイルス注射の１０日後に取った。ｂ、２．６μＭ組換えアスプロシン又はＧＦＰの毎日の皮下注射を１０日間受けた４時間絶食したＷＴマウスのホルマリン固定鼠径部白色脂肪組織切片を、ヘマトキシリンエオジンで染色した図である。切片を、アデノウイルス注射の１０日後に取った。

【0028】

【図9A-9D】循環アスプロシンの増加は、より高い血漿レベルの脂肪由来ホルモンをもたらす ａ、ｂＦＢＮ１又はＧＦＰのｃＤＮＡ（ＣＭＶプロモーターの制御下にある）を保有するアデノウイルスのウイルス粒子１０^１１個の尾静脈注射を１回だけ受けた４時間絶食したＷＴマウスの血漿において、レプチン及びアディポネクチンを測定した（各群ｎ＝６）図である。測定を、アデノウイルス注射の１０日後に行った。ｃ、ｄ、２．６μＭ組換えアスプロシン又はＧＦＰの毎日の皮下注射を１０日間受けた４時間絶食したＷＴマウスの血漿において、レプチン及びアディポネクチンを測定した（各群ｎ＝６）図である。測定を、最初の注射の１０日後に行った。

【0029】

【図10A-10D】循環アスプロシンの増加は、より低い血漿脂質をもたらす ａ、ｂ、ＦＢＮ１又はＧＦＰのｃＤＮＡ（ＣＭＶプロモーターの制御下にある）を保有するアデノウイルスのウイルス粒子１０^１１個の尾静脈注射を１回だけ受けた４時間絶食したＷＴマウスの血漿において、トリグリセリド及び遊離脂肪酸を測定した（各群ｎ＝６）図である。測定を、アデノウイルス注射の１０日後に行った。ｃ、ｄ、２．６μＭ組換えアスプロシン又はＧＦＰの毎日の皮下注射を１０日間受けた４時間絶食したＷＴマウスの血漿において、トリグリセリド及び遊離脂肪酸を測定した（各群ｎ＝６）図である。測定を、最初の注射の１０日後に行った。

【0030】

【図11A-11D】循環アスプロシンの増加は、高血糖及びインシュリン過剰をもたらす ａ、ｂ、ＦＢＮ１又はＧＦＰのｃＤＮＡ（ＣＭＶプロモーターの制御下にある）を保有するアデノウイルスのウイルス粒子１０^１１個の尾静脈注射を１回だけ受けた４時間絶食したＷＴマウスの血漿において、グルコース及びインスリンを測定した（各群ｎ＝６）図である。測定を、アデノウイルス注射の１０日後に行った。ｃ、ｄ、２．６μＭ組換えアスプロシン又はＧＦＰの毎日の皮下注射を１０日間受けた４時間絶食したＷＴマウスの血漿において、グルコース及びインスリンを測定した（各群ｎ＝６）図である。測定を、最初の注射の１０日後に行った。

【0031】

【図12A-12B】より多い循環アスプロシンは、肝臓脂質蓄積の増加をもたらす ａ、ＦＢＮ１又はＧＦＰのｃＤＮＡ（ＣＭＶプロモーターの制御下にある）を保有するアデノウイルスのウイルス粒子１０^１１個の尾静脈注射を１回だけ受けた４時間絶食したＷＴマウスのホルマリン固定肝臓切片を、ヘマトキシリンエオジンで、及び中性脂質をＯｉｌ−Ｒｅｄ−Ｏ染色で染色した図である。切片を、アデノウイルス注射の１０日後に取った。ｂ、２．６μＭ組換えアスプロシン又はＧＦＰの毎日の皮下注射を１０日間受けた４時間絶食したＷＴマウスのホルマリン固定肝臓切片を、ヘマトキシリンエオジンで、及び中性脂質をＯｉｌ−Ｒｅｄ−Ｏ染色で染色した図である。切片を、アデノウイルス注射の１０日後に取った。

【0032】

【図13】フィブリリン−１分泌に対するトランケートされたプロフィブリリンの優性阻害効果 ７日間脂肪生成誘導に曝露し、同時に分泌経路を遮断するためのビヒクル若しくはモネンシンと共にＧＦＰ若しくはトランケートされたプロフィブリリン（ＦＢＮ１ ＮＴ△）である変異体を駆動する発現構築物に曝露した非罹患対照対象（ＷＴ）由来のヒト皮膚線維芽細胞の細胞培養培地において、フィブリリン−１に対して標的したウェスタンブロット分析を実行した図である。

【0033】

【図14】非罹患ヒト（ＷＴ）及びＮＰＳ患者（変異体）の皮膚線維芽細胞を、脂肪生成培地への７日間の曝露を使用して成熟脂肪細胞に分化させ、その後に遺伝子発現分析した図である。細胞を、ｃＤＮＡ挿入物を保有しないアデノウイルス又はシグナルペプチドに融合させたフィブリリン−１ Ｃ末端ポリペプチド（本明細書においてアスプロシンと称することもある）のｃＤＮＡ挿入物を保有するアデノウイルスに同時に７日間曝露した。ＡＰ２、ＣＥＢＰα、レプチン及びアディポネクチンは、脂肪生成マーカー遺伝子である。ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ１、ＣＣＬ３及びＴＬＲ２は、炎症誘発性マーカー遺伝子である。「Ｍｕｔ＋空ベクター」群と「Ｍｕｔ＋ＣＴポリペプチド」群との統計的比較だけを、明確にするために図に示す。対応のないスチューデントｔ−検定を、統計的分析に使用した。１つの星印はｐ＜０．０５を、２つの星印はｐ＜０．０１を、３つの星印はｐ＜０．００１を示す。

【0034】

【図15】非罹患ヒト（ＷＴ）及びＮＰＳ患者（変異体）の皮膚線維芽細胞を、脂肪生成培地への７日間の曝露を使用して成熟脂肪細胞に分化させ、その後に遺伝子発現分析した図である。細胞を、ビヒクル又はフィブリリン−１ Ｃ末端ポリペプチド１０μｇに同時に７日間曝露した。ＡＰ２、ＣＥＢＰα、レプチン及びアディポネクチンは、脂肪生成マーカー遺伝子である。ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ１、ＣＣＬ３及びＴＬＲ２は、炎症誘発性マーカー遺伝子である。「Ｍｕｔ＋ビヒクル」群と「Ｍｕｔ＋ＣＴポリペプチド」群との統計的比較だけを、明確にするために図に示す。対応のないスチューデントｔ−検定を、統計的分析に使用した。１つの星印はｐ＜０．０５を、２つの星印はｐ＜０．０１を、３つの星印はｐ＜０．００１を示す。

【0035】

【図16】フィブリリン−１ Ｃ末端を特異的に検出するマウスモノクローナル抗体を使用して正常又は高脂肪食のいずれかを給餌したＣ５７／Ｂｌ６マウスの血漿において、ウェスタンブロット分析を実行した図である。１６ｋｄのバンドは、フィブリリン−１ Ｃ末端の血漿画分に対応する。

【0036】

【図17】血漿ＣＴポリペプチド（アスプロシン）量の増加が、アスプロシンを注射したマウスにおける過食症を引き起こすことを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0037】

長年にわたる特許法に慣例に従って、単語「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、請求の範囲を含めた本明細書においてそれを含む単語と一緒に使用される場合、「１つ又は複数」を意味する。本発明のいくつかの実施形態は、１つ又は複数の要素、方法工程、及び／又は本発明の方法からなる又は基本的にそれからなることができる。本発明の精神と範囲から逸脱することなく本明細書に記述される任意の方法又は組成物が、開示される本明細書の実施形態に記述される他の任意の方法若しくは組成物に対して遂行され、同様の若しくは類似の結果を更に得られると考えられる。
Ｉ．アスプロシン

【0038】

本開示の実施形態は、アスプロシンに関連する方法及び組成物を含み、アスプロシンは、フィブリリン−１のＣ末端切断フラグメントである。天然のヒトアスプロシンの配列（フィブリリン−１のアミノ酸２７３２〜２８７１；配列番号１）は、以下の通りである：
ＳＴＮＥＴＤＡＳＮＩＥＤＱＳＥＴＥＡＮＶＳＬＡＳＷＤＶＥＫＴＡＩＦＡＦＮＩＳＨＶＳＮＫＶＲＩＬＥＬＬＰＡＬＴＴＬＴＮＨＮＲＹＬＩＥＳＧＮＥＤＧＦＦＫＩＮＱＫＥＧＩＳＹＬＨＦＴＫＫＫＰＶＡＧＴＹＳＬＱＩＳＳＴＰＬＹＫＫＫＥＬＮＱＬＥＤＫＹＤＫＤＹＬＳＧＥＬＧＤＮＬＫＭＫＩＱＶＬＬＨ。アスプロシンは、ヒト細胞から単離することができ、従ってもはや天然ではない、又は特定の実施形態において、それは組換えであってもよい。本明細書で称される通り、配列番号１の天然の配列が、組換え手段によって生成される場合、得られたポリペプチドは、組換えアスプロシンと称することができる。組換えアスプロシンの別の例の配列は、標識又はタグを含む。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における翻訳のための開始コドンを含むようにＮ末端のメチオニンを伴って結合しているＨｉｓタグ（配列番号２）は、以下の通りである：
ＭＨＨＨＨＨＨＳＴＮＥＴＤＡＳＮＩＥＤＱＳＥＴＥＡＮＶＳＬＡＳＷＤＶＥＫＴＡＩＦＡＦＮＩＳＨＶＳＮＫＶＲＩＬＥＬＬＰＡＬＴＴＬＴＮＨＮＲＹＬＩＥＳＧＮＥＤＧＦＦＫＩＮＱＫＥＧＩＳＹＬＨＦＴＫＫＫＰＶＡＧＴＹＳＬＱＩＳＳＴＰＬＹＫＫＫＥＬＮＱＬＥＤＫＹＤＫＤＹＬＳＧＥＬＧＤＮＬＫＭＫＩＱＶＬＬＨ。アスプロシンの実施形態は、機能的誘導体若しくはその機能的フラグメントを含み、有効量を与えたときに哺乳動物個体の食欲を増加させ及び／又は体重を増やす能力を有する場合、その誘導体若しくはフラグメントは機能的であると考え得る。そのような活性は、例えば脂肪量の増加を評価するためのＭＲＩスキャン又は体重計を使用する体重の測定を含めた任意の適切な手段によって測定することができる。特定の実施形態において、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏでの脂肪細胞分化の促進をアッセイすることによって、機能的活性を評価することができる。特定の実施形態において、アスプロシン又は機能的フラグメント若しくは機能的誘導体は、可溶性である。アスプロシン又は機能的フラグメント若しくは機能的誘導体は、融合タンパク質に含まれることができる。

【0039】

アスプロシンタンパク質性組成物は、標準的な分子生物学的技術によるタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドの発現、天然の供給源からのタンパク質性化合物の単離、又はタンパク質性材料の化学合成を含めた当業者に公知の任意の技術によって作製することができる。アスプロシンコード領域（フィブリリン−１から切り離されてもよいが、フィブリリン−１内の領域など）は、本明細書に開示する若しくは当業者に公知であるような技術を使用して増幅及び／又は発現させることができる。別法として、タンパク質、ポリペプチド及びペプチドの様々な市販調製物が、当業者に公知である。

【0040】

特定の実施形態において、アスプロシン（又はそのフラグメント若しくは誘導体）タンパク質性化合物は、精製することができる。一般に、「精製されている」とは、分画に供して他の様々なタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドを除去した特定の又はタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチド組成物のことを指すことになり、その組成物は、例えば、特定の若しくは所望のタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチド用として当業者に公知であるようなタンパク質アッセイによって評価できる活性を実質的に保持している。そのような誘導体及びフラグメントを含めたアスプロシンの生物学的機能的等価物を、利用することができる。本発明によるアスプロシンポリヌクレオチド並びに／又はタンパク質の構造内に修飾及び／若しくは変更を作製し、類似の又は改善された特徴を有する分子を得ることができるので、そのような生物学的機能的等価物も本発明の中に包含される。

【0041】

アスプロシン機能的誘導体又はそのフラグメントは、配列番号１と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個以上のアミノ酸改変を含むことができる。アスプロシン機能的誘導体又はそのフラグメントは、配列番号１のＮ末端トランケーションを含むことができ、例えばトランケーションは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００個以下のアミノ酸であるか、又はトランケーションは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００個のアミノ酸である。アスプロシン機能的誘導体又はそのフラグメントは、配列番号１のＣ末端トランケーションを含むことができ、トランケーションは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００個以下のアミノ酸、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００個のアミノ酸などである。アスプロシン機能的誘導体若しくはそのフラグメントは、配列番号１内に内部欠失を含むことができ、内部欠失は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００個以下のアミノ酸、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００個のアミノ酸などである。特定の実施形態において、アスプロシン機能的誘導体又はそのフラグメントは、配列番号１と少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％同一である配列を含むことができる。

【0042】

特定の実施形態において、食欲刺激薬は、アスプロシン又は機能的フラグメント又は機能的誘導体を含む。刺激薬をアスプロシンと特に製剤化して、哺乳動物個体の食欲を刺激することができる。そのような刺激薬は、低体重、栄養不良、栄養不足である個体、農業動物（ウシ、ブタ、子羊、鶏等など）の大きさを増加させるため、ボディービルダーのため等、量を増やそうとする個体に与えることができる。刺激薬組成物は、アスプロシン以外の他の刺激薬を有することができる。

【0043】

Ａ．修飾ポリヌクレオチド及びポリペプチド
アスプロシンの生物学的機能的等価物は、「野生型」又は標準的なタンパク質をコードするする能力を保持すると同時に固有の配列を含有するように操作されたポリヌクレオチドから産生することができる。これは、遺伝暗号の変質、即ち、同じアミノ酸をコードする複数のコドンの存在によって達成することができる。一例において、当業者は、ポリヌクレオチドがタンパク質をコードする能力を損なうことなくそのポリヌクレオチドに制限酵素認識配列を導入したいと思うことができる。

【0044】

別の例において、アスプロシンポリヌクレオチドは、より著しい変更を含む生物学的機能的等価物である（及びコードする）ことができる。タンパク質構造において特定のアミノ酸を、例えば抗体の抗原結合領域、基質分子に対する結合部位、受容体などのような構造との相互作用的結合能を大きく減少することなく他のアミノ酸と置換することができる。いわゆる「保存的な」変更は、構造変化が、設計された機能を実施するタンパク質の能力に影響を与えないものなので、タンパク質の生物活性を損なわない。従って、本明細書に開示される遺伝子及びタンパク質の配列に様々な変更を作製し、同時に本発明の目的を実現できることが本発明者によって考えられる。

【0045】

機能的等価物に関しては、「生物学的機能的等価物」の定義に内在するタンパク質及び／又はポリヌクレオチドは、許容可能なレベルの同等な生物活性を持つ分子を保持していても、分子の定義済みの部分に作製できる変更の数に制限があるという概念であることは、当業者にはよく理解される。従って生物学的機能的等価物は、選択されたアミノ酸（又はコドン）において置換できるタンパク質（及びポリヌクレオチド）であると本明細書において定義される。

【0046】

一般に、分子の長さが短いほど、機能を保持していても分子内に少ない変更しか作製できない。より長いドメインは、中間の数の変更を有することができる。全長タンパク質は、更に多くの変更に対して最大の許容範囲を有することになる。しかしながら、構造に強く左右される特定の分子若しくはドメインは、修飾をほとんど又はまったく許容できないことを認識しなければならない。

【0047】

一般にアミノ酸置換は、アミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、サイズ及び／又はなどに基づく。アミノ酸側鎖置換基のサイズ、形状及び／若しくは型の分析から、アルギニン、リジン及び／若しくはヒスチジンは全て正に荷電した残基であり；アラニン、グリシン及び／若しくはセリンは全て類似のサイズであり；並びに／又はフェニルアラニン、トリプトファン及び／若しくはチロシンは全て概ね類似の形状を有することが明らかになる。従って、これらの考慮すべき点に基づいて、アルギニン、リジン及び／若しくはヒスチジン；アラニン、グリシン及び／若しくはセリン；並びに／又はフェニルアラニン、トリプトファン及び／若しくはチロシン；は、本明細書において生物学的機能的等価物と定義される。

【0048】

より定量的な変化を得るために、アミノ酸の水治療法インデックスを考えることができる。各アミノ酸は、その疎水性及び／若しくは電荷特性に基づいて水治療法インデックスが割り当てられ、これらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（０．４）；トレオニン（０．７）；セリン（０．８）；トリプトファン（０．９）；チロシン（１．３）；プロリン（１．６）；ヒスチジン（３．２）；グルタミン酸（３．５）；グルタミン（３．５）；アスパラギン酸（３．５）；アスパラギン（３．５）；リジン（３．９）；並びに／又はアルギニン（４．５）である。

【0049】

タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与する水治療法アミノ酸インデックスの重要性は、当技術分野において一般に理解される（Ｋｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２年、参照により本明細書に組み込む）。特定のアミノ酸を、類似の水治療法インデックス及び／若しくはスコアを有する他のアミノ酸と置換することができ、並びに／又は類似の生物活性をなお保持することは公知である。水治療法インデックスに基づく変更を作製する際に、水治療法インデックスが±２以内にあるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内が特に好ましく、及び／又は±０．５以内が更により一層好ましい。

【0050】

本発明の特定の実施形態の場合のように、類似のアミノ酸の置換を、特にそれによって作られる生物学的機能的等価物のタンパク質及び／又はペプチドが免疫学的実施形態において使用されるように意図される場合、親水性に基づいて効果的に作製できることも当技術分野において理解される。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，５５４，１０１号は、隣接するアミノ酸の親水性によって決定されるタンパク質の最大局所平均親水性が、その免疫原性及び／又は抗原性、即ちタンパク質の生物学的特性と相関すると述べている。

【0051】

米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されるように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられた：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸塩（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（０．５）；ヒスチジン（０．５）；システイン（１．０）；メチオニン（１．３）；バリン（１．５）；ロイシン（１．８）；イソロイシン（１．８）；チロシン（２．３）；フェニルアラニン（２．５）；トリプトファン（３．４）。類似の親水性値に基づく変化を作製する際に、親水性値が±２以内にあるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内が特に好ましく、及び／又は±０．５以内が更により一層好ましい。

【0052】

Ｂ．改変アミノ酸
本発明は、多くの態様において、適切なポリヌクレオチドの転写及び翻訳による、細胞でのペプチド並びにポリペプチドの合成を利用する。これらのペプチド並びにポリペプチドは、２０種「天然の」アミノ酸及びその翻訳後修飾を含むことになる。しかしながら、ｉｎ ｖｉｔｒｏペプチド合成は、修飾及び／又は異常アミノ酸の使用を可能にする。例示的な修飾及び／又は異常アミノ酸は、当技術分野において公知であるが、それに限定されない。

【0053】

Ｃ．模倣体
上述の生物学的機能的等価物に加えて、本発明者らは、構造的若しくは機能的に類似の化合物を製剤化して、本発明のペプチド又はポリペプチドの重要な部分を模倣できることも考える。ペプチド模倣体と称されることがあるそのような化合物は、本発明のペプチドと同じ様式で使用することができ、それ故に、また機能的等価物である。特定の実施形態において、模倣体は、アスプロシンのβプリーツを１つ又は複数含む。

【0054】

タンパク質の２次、３次構造の要素を模倣する特定の模倣体については、Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９３年）に記述されている。ペプチド模倣体の使用の背後にある基礎的な論拠は、タンパク質のペプチド骨格が、抗体及び／又は抗原の分子間相互作用などを容易にするようにアミノ酸側鎖を方向付けるように主に存在しているということである。従ってペプチド模倣体は、天然の分子と類似の分子間相互作用ができるように設計される。そのようなペプチド模倣体には、天然アミノ酸又はアミノ酸側鎖を全く組み込まないが、アスプロシンペプチド配列に基づいて設計され、アスプロシンを機能的に置きかえる能力を有する化合物がある。

【0055】

ＩＩ．アスプロシン又はアスプロシン受容体のインヒビター
本開示の実施形態は、アスプロシンの、１つ又は複数のインヒビターを含む。特定の実施形態において、ある場合にはインヒビターは抗体でないが、インヒビターは抗体である。特定の実施形態において、インヒビターは、１つ又は複数の小分子、１つ又は複数のアプタマー、１つ又は複数の非抗体ファージディスプレイ由来ペプチド、その組合せなどであってもよい。特定の実施形態において、アスプロシンのインヒビターは、アスプロシンに特異的に結合し、それを不活性化する。特定の実施形態において、インヒビターは可溶性である。いくつかの実施形態において、アスプロシンの可溶性受容体媒介阻害の方法及び組成物がある。特定の実施形態において、ＲＮＡｉ及び／又はマイクロＲＮＡ媒介阻害を利用することができ、例えば、特定の実施形態において、アスプロシンは、ＦＢＮ１から分離して自身の転写単位を有する。

【0056】

本開示の実施形態は、アスプロシン受容体の、１つ又は複数のインヒビターを含む。特定の実施形態において、ある場合にはインヒビターは抗体でないが、インヒビターは抗体である。特定の実施形態において、インヒビターは、１つ若しくは複数の小分子、１つ若しくは複数のアプタマー、１つ若しくは複数の非抗体ファージディスプレイ由来ペプチド、ＲＮＡｉ若しくはマイクロＲＮＡ媒介インヒビター、その下流にあるシグナル伝達の特異的インヒビター、又はその組合せなどであってもよい。特定の実施形態において、アスプロシン受容体のインヒビターは、アスプロシンに特異的に結合し、それを不活性化する。特定の一実施形態において、それはその発現を特異的に遮断する、さもなければ機能的活性を低下させる。特定の実施形態において、インヒビターは可溶性である。

【0057】

特定の実施形態において、インヒビターは、構造的又は機能的モチーフを標的し、インヒビターのアスプロシン標的部位は、公知である場合も又は公知でない場合もある。特定の実施形態において、インヒビターは、アスプロシンの、１つ又は複数のβプリーツを標的する。特定の実施形態において、アスプロシンのインヒビターは、アスプロシンに対する受容体のインヒビターである。

【0058】

特定の実施形態において、１つ又は複数のアスプロシンインヒビターを含む食欲抑制薬がある。抑制薬組成物は、アスプロシン以外の他の抑制薬を有することができる。抑制薬をアスプロシンと特に製剤化して、哺乳動物個体の食欲を抑制することができる。そのような抑制薬は、過体重、肥満である、糖尿病である、過体重になるリスクがある、肥満になるリスクがあるなどの個体に与えることができる。

【0059】

特定の実施形態において、インヒビターは抗体である。本明細書で使用される場合、用語「抗体」とは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥなど広く任意の免疫学的結合剤を指すものとする。一般に、ＩｇＧ及び／又はＩｇＭは、生理的状況において最も一般的な抗体であり、実験室環境において最も容易に作製されるので、それらが好ましい。用語「抗体」は、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子を指すために使用され、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）などのような抗体フラグメントを含む。様々な抗体に基づく構築物及びフラグメントを調製し、使用する技術は、当技術分野において周知である。抗体を調製し、特徴づける手段も、当技術分野において周知である（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８年、を参照のこと；参照により本明細書に組み込む）。

【0060】

Ａ．ポリクローナル抗体
一般にアスプロシンに対するポリクローナル抗体は、アスプロシン若しくはそのフラグメント及びアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）又は腹膜内（ｉｐ）注射により、動物に産生させることができる。二官能性又は誘導体化剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介するコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ_２又はＲ^１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、Ｒ及びＲ^１は、異なるアルキル基である）を使用して、標的アミノ酸配列を含有するアスプロシン若しくはフラグメントを、免疫される種において免疫原性であるタンパク質、例えばスカシガイヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン又は大豆トリプシンインヒビターにコンジュゲートすることは有用であり得る。

【0061】

動物を、コンジュゲート１ｍｇ又は１μｇ（それぞれウサギ又はマウス用）をフロイト完全アジュバント３体積と混合し、複数部位で皮内に溶液を注射することによって免疫原性コンジュゲート若しくは誘導体に対して免疫することができる。１か月後に、動物を、複数部位での皮下注射によりフロイト完全アジュバント中に最初の量の１／５〜１／１０のコンジュゲートで追加免疫した。７〜１４日後に、動物を採血し、血清を抗アスプロシン抗体価についてアッセイする。力価がプラトーになるまで動物を追加免疫する。好ましくは、動物を、同じアスプロシンのコンジュゲートであるが、異なるタンパク質に及び／又は異なる架橋試薬によってコンジュゲートされたもので追加免疫した。コンジュゲートは、タンパク質融合として組換え細胞培養において作製することもできる。また、ミョウバンなど凝集剤を使用して、免疫応答を増強する。

【0062】

Ｂ．モノクローナル抗体
特定の実施形態において、モノクローナル抗体は、個体において体重を減らすために使用するアスプロシンのインヒビターとして生成し、利用することができる。モノクローナル抗体のための免疫原は、アスプロシンポリペプチド全長であることができ、又はそのフラグメントであってもよい。モノクローナル抗体の生成に利用できる免疫原の例示的な配列は、以下の通りである：

【0063】

ＨｕＦｂｎ１−２７４６：２７７０ ＥＴＥＡＮＶＳＬＡＳＷＤＶＥＫＴＡＩＦＡＦＮＩＳＨ（配列番号３）

【0064】

ＨｕＦｂｎ１ ２８３８：２８６５ ＫＫＫＥＬＮＱＬＥＤＫＹＤＫＤＹＬＳＧＥＬＧＤＮＬＫＭＫ（配列番号４）

【0065】

モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団から得られ、即ち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在する場合がある起こり得る天然に存在する突然変異を除いて同一である。従って、修飾語句「モノクローナル」は、別々の抗体の混合物ではない抗体の特徴を示す。

【0066】

例えば、本発明の抗アスプロシンモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５年）によって最初に記述されたハイブリドーマ方法を使用して作ることができ、又は組換えＤＮＡ方法（Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製することができる。ハイブリドーマ方法において、先述の通り、マウス又はハムスターなど他の適切な宿主動物を免疫して、免疫化に使用されるタンパク質に特異的に結合することになる抗体を産生する若しくは産生することができるリンパ球を生じさせる。別法として、リンパ球はｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫することができる。次いでリンパ球を、ポリエチレングリコールなど適切な融合剤を使用して骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９〜１０３頁［Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８６年］）。

【0067】

このようにして、調製したハイブリドーマ細胞を、融合していない親骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する１つ若しくは複数の物質を好ましくは含有する適切な培地に播種し、増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシル転移酵素（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠いている場合、ハイブリドーマ用の培地は、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（ＨＡＴ培地）を一般に含むことになり、その物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨げる。

【0068】

好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択した抗体産生細胞による抗体の安定な高レベル発現を支持し、ＨＡＴ培地などの培地に感受性があるものである。これらの中で、好ましい骨髄腫細胞系は、ソーク研究所セルディストリビューションセンター、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍、並びにアメリカンタイプカルチャーコレクション、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．ＵＳＡから入手可能なＳＰ−２細胞から得られるそれらなどのマウス骨髄腫系である。

【0069】

ハイブリドーマ細胞を増殖させる培地を、アスプロシンに対して作られるモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又は放射免疫測定法（ＲＩＡ）若しくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイによって決定される。

【0070】

モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ及びＰｏｌｌａｒｄ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０頁（１９８０年）のスキャッチャード分析によって決定できる。

【0071】

所望の特異性、親和性及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、そのクローンを限界希釈手順によってサブクローニングし、標準的な方法によって増殖させることができる。Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９〜１０４頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８６年）。この目的のために適切な培地には、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地又はＲＰＭＩ−１６４０培地がある。加えて、ハイブリドーマ細胞を、動物において腹水腫瘍としてｉｎ ｖｉｖｏ増殖させることができる。

【0072】

サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又は親和性クロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって培地、腹水若しくは血清から最適に分離される。

【0073】

本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することによる）を使用して容易に単離され、配列決定される。本発明のハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として働く。一旦単離したら、ＤＮＡを発現ベクターに入れることができ、次いでそのベクターをサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は免疫グロブリンタンパク質を特に産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得る。ＤＮＡも、例えば、相同なマウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１、６８５１頁、（１９８４年）、又は非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全て若しくは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合させることにより修飾することができる。その方式で、本明細書の抗アスプロシンモノクローナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」又は「ハイブリッド」抗体を調製する。

【0074】

一般に、そのような非免疫グロブリンポリペプチドを、本発明の抗体の定常ドメインと置換する、又は本発明の抗体の抗原結合部位の１方の可変ドメインと置換して、アスプロシンに対する特異性を有する１つの抗原結合部位及び異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作る。

【0075】

キメラ又はハイブリッド抗体は、架橋剤を伴う方法を含めた、合成タンパク質化学において公知の方法を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで調製することもできる。例えば、抗毒素は、ジスルフィド交換反応を使用して又はチオエーテル結合を形成することによって構築することができる。この目的に適切な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル４メルカプトブチルイミダートがある。

【0076】

診断適用の場合、本発明の抗体は、通常、検出可能な部分を用いて標識することができる。検出可能な部分は、直接又は間接的のいずれかで、検出可能なシグナルを産生することが可能な任意のものであってもよい。例えば、検出可能な部分は、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ若しくは^１２５Ｉなどの放射性同位元素、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン若しくはルシフェリンなどの蛍光又は化学発光化合物；ビオチン；放射性アイソトープ標識、例えば^１２５Ｉ、^３２Ｐ、^１４Ｃ、若しくは^３Ｈなど、又はアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ若しくはホースラディッシュペルオキシダーゼなどの酵素であってもよい。

【0077】

Ｈｕｎｔｅｒ、ら、Ｎａｔｕｒｅ １４４：９４５頁（１９６２年）；Ｄａｖｉｄ、ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：１０１４頁（１９７４年）；Ｐａｉｎ、ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４０：２１９頁（１９８１年）；及びＮｙｇｒｅｎ、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３０：４０７頁（１９８２年）によって記述される方法を含めて、当技術分野において公知の、検出可能な部分に抗体を別々にコンジュゲートするための任意の方法を利用することができる。

【0078】

本発明の抗体は、競合結合アッセイ、直接及び間接的サンドイッチアッセイ、並びに免疫沈降アッセイなど任意の公知のアッセイ方法で利用することができる。Ｚｏｌａ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４７〜１５８頁（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．１９８７年）。

【0079】

競合結合アッセイは、標識した標準（アスプロシン又はその免疫学的反応部分であってもよい）が、限られた量の抗体との結合について試験サンプル分析物（アスプロシン）と競合する能力を利用する。試験サンプル中のアスプロシンの量は、抗体に結合することになる標準の量に反比例する。結合することになる標準の量の決定を容易にするために、抗体に結合している標準及び分析物を結合せずに残っている標準並びに分析物から都合よく分離できるように、競合の前か後に抗体は一般に不溶化される。

【0080】

サンドイッチアッセイは、検出しようとするタンパク質の異なる免疫原性部分又はエピトープにそれぞれ結合することが可能な２つの抗体の使用を含む。サンドイッチアッセイにおいて、試験サンプル分析物は、固体支持体上に固定されている第１の抗体に結合され、その後第２の抗体が分析物に結合し、従って不溶性の３つの部分の複合体を形成する。Ｄａｖｉｄ及びＧｒｅｅｎｅ、米国特許第４，３７６，１１０号。第２の抗体は、それ自体が検出可能な部分を用いて標識されてもよく（直接サンドイッチアッセイ）又は検出可能な部分を用いて標識された抗免疫グロブリン抗体を使用して測定されてもよい（間接サンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアッセイの１つの型はＥＬＩＳＡアッセイであり、その場合に、検出可能な部分は酵素である。

【0081】

Ｃ．ヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当技術分野において周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入されたアミノ酸残基を１つ又は複数有する。これらの非ヒトアミノ酸残基を、「移入」（import）可変ドメインから一般に取り出される「移入」残基としばしば称する。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１、５２２〜５２５頁［１９８６年］；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２、３２３〜３２７頁［１９８８年］；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９、１５３４〜１５３６頁［１９８８年］）の方法に従って齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列で置換することにより基本的に実行することができる。従って、そのような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体（Ｃａｂｉｌｌｙ、上記）であり、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ないドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。実際に、一般にヒト化抗体は、いくつかのＣＤＲ残基及び場合によりいくつかのＦＲの残基が齧歯類抗体中の類似部位由来の残基によって置換されているヒト抗体である。

【0082】

抗体は、抗原に対する高い親和性及び他の好ましい生物学的特性を保持したままでヒト化されることが重要である。この目的を達成するために、好ましい方法によると、ヒト化抗体は、親並びにヒト化配列の３次元モデルを使用して親配列及び様々な概念上のヒト化産物を分析する過程によって調製される。３次元免疫グロブリンモデルが一般に利用可能であり、当業者によく知られている。選択した候補免疫グロブリン配列の予想される３次元立体配座構造を例示し、表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これら表示の点検により、候補免疫グロブリン配列の機能性において可能性がある残基の役割の分析、即ちその抗原を結合する候補免疫グロブリンの能力に影響する残基の分析が可能になる。このようにして、標的抗原に対する親和性の増加など、所望の抗体の特徴を実現するように、ＦＲ残基をコンセンサス及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に与える影響において直接且つ最も実質的に関係する。更なる詳細については、１９９１年６月１４日に出願の出願第０７／７１５，２７２号の一部継続出願である１９９２年８月２１日に出願の米国特許出願第０７／９３４，３７３号を参照のこと。

【0083】

Ｄ．ヒト抗体
ヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ方法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒト骨髄腫及びマウスヒトヘテロ骨髄腫細胞系については、例えば、Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３、３００１頁（１９８４年）、及びＢｒｏｄｅｕｒ、ら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１〜６３頁（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７年）に記述されている。

【0084】

免疫化により、内在性免疫グロブリン産生がない場合にヒト抗体レパートリーを産生する能力のあるトランスジェニック動物（例えばマウス）を産生することが、現在では可能である。例えば、キメラの及び生殖細胞系変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域遺伝子のホモ接合性欠失（Ｊ．ｓｕｂ．Ｈ）が、内在性抗体生成の完全な阻害をもたらすことが記述された。そのような生殖細胞系変異体マウスにおけるヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの移行は、抗原チャレンジによりヒト抗体の産生をもたらすことになる。例えばＪａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０、２５５１〜２５５頁（１９９３年）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３６２、２５５〜２５８頁（１９９３年）を参照のこと。

【0085】

別法として、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８、５５２〜５５３頁［１９９０年］）を使用して、免疫していないドナーの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト抗体及び抗体フラグメントを産生することができる。この技術により、抗体Ｖドメイン遺伝子は、Ｍ１３又はｆｄのような繊維状バクテリオファージのメジャー若しくはマイナーコートタンパク質遺伝子にインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面上に機能的抗体フラグメントとして提示される。

【0086】

繊維状粒子は、ファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するので、抗体の機能特性に基づく選択の結果、その特性を呈する抗体をコードしている遺伝子が選択される。従って、ファージは、Ｂ細胞の特性のいくつかを模倣する。ファージディスプレイは、様々な形式で実行することができ；その総説については、例えばＪｏｈｎｓｏｎ、Ｋｅｖｉｎ Ｓ．及びＣｈｉｓｗｅｌｌ、Ｄａｖｉｄ Ｊ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３、５６４〜５７１頁（１９９３年）を参照のこと。Ｖ遺伝子区分のいくつかの供給源を、ファージディスプレイに使用できる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２、６２４〜６２８頁（１９９１年）は、免疫化したマウスの脾臓から得られるＶ遺伝子の小さいランダムな組合せライブラリから抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。Ｍａｒｋｓら、Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２、５８１〜５９７頁（１９９１年）、又はＧｒｉｆｆｉｔｈら、ＥＭＢＯ Ｊ．１２、７２５〜７３４頁（１９９３年）に記述される技術に基本的に従って、免疫していないヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、抗原（自己抗原を含める）の多様なアレイに対する抗体を、単離することができる。自然免疫応答において、抗体遺伝子は高率で突然変異を蓄積する（体細胞超変異）。導入された変更のいくつかは、より高い親和性を付与されることになり、高親和性表面免疫グロブリンを提示しているＢ細胞は、以降の抗原チャレンジの間に優先的に複製され、区別される。この天然の過程は、「チェーンシャッフリング」として公知の技術を利用することによって模倣することができる（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０、７７９〜７８３頁［１９９２年］）。この方法において、ファージディスプレイによって得られる「初代」ヒト抗体の親和性は、免疫していないドナーから得られるＶドメイン遺伝子の天然に存在するバリアント（レパートリー）のレパートリーで重鎖及び軽鎖Ｖ領域遺伝子を順次置きかえることによって改善することができる。この技術により、ｎＭ範囲の親和性を持つ抗体及び抗体フラグメントの産生が可能になる。ファージ抗体の非常に大きなレパートリー（別名「全体の母ライブラリ」［mother-of-all libraries］）を作製するための戦略については、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１、２２６５〜２２６６頁（１９９３年）に記述されており、そのようなファージの大きなライブラリからの高親和性ヒト抗体の直接単離については、Ｇｒｉｆｆｉｔｈら、ＥＭＢＯ Ｊ．（１９９４年）印刷中、に報告されている。ヒト抗体が、初発齧歯類抗体と類似の親和性及び特異性を有する場合、遺伝子シャフリングを使用して、齧歯類抗体からヒト抗体を得ることもできる。「エピトープインプリンティング」とも称されるこの方法により、ファージディスプレイ技術によって得られる齧歯類抗体の重鎖又は軽鎖Ｖドメイン遺伝子は、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置きかえられ、齧歯類−ヒトキメラが作られる。抗原に対する選択により、機能的抗原結合部位を復元する能力があるヒト可変部分を単離する、即ちエピトープが、パートナーの選択肢を決定する（インプリント）。残っている齧歯類Ｖドメインを置きかえるためにこの過程を繰り返すと、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日に公開されたＰＣＴ特許出願ＷＯ９３／０６２１３を参照のこと）。ＣＤＲ移植による齧歯類抗体の伝統的なヒト化とは異なり、この技術は、齧歯類起源のフレームワーク又はＣＤＲ残基を全く持たない完全なヒト抗体を提供する。

【0087】

Ｅ．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル、好ましくはヒト又はヒト化抗体である。この場合、結合特異性の１方は、アスプロシンに対してであり、他方は、他の任意の抗原、好ましくは別の受容体又は受容体サブユニットに対してである。例えば、アスプロシン及びアスプロシン受容体又は異なる２つのアスプロシン受容体を特異的に結合する二重特異性抗体は、本発明の範囲内である。

【0088】

二重特異性抗体を作製する方法は、当技術分野において公知である。伝統的に、２つの重鎖が異なる特異性を有する場合、二重特異性抗体の組換え産生は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づく（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ及びＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ ３０５、５３７〜５３９頁［１９８３年］）。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダムに組み合わさることにより、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１つだけが正しい二重特異性構造を有する１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を産生する。通常親和性クロマトグラフィー工程によって行われる正しい分子の精製は、かなり煩雑であり、産物収量が低い。類似の手順が、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９３／０８８２９（１９９３年５月１３日に公開される）、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ １０、３６５５〜３６５９頁（１９９１年）に開示されている。

【0089】

異なるより好ましい手法によると、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を持つ抗体可変ドメインは、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインと融合される。融合体の少なくとも１つに存在する軽鎖結合に必要な部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体、及び必要に応じて免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別々の発現ベクターに挿入し、適切な宿主生物に同時トランスフェクトする。こうすることで、構築において使用した３つのポリペプチド鎖の比が不均等だと収量が最適となる実施形態において、３つのポリペプチドフラグメントの相互の割合を調整する上で大きな柔軟性が得られる。しかしながら、少なくとも２つのポリペプチド鎖の等しい比での発現が、高い収量をもたらす場合、又は比が特に重要でない場合、１つの発現ベクターに２つ若しくは３つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を挿入することが可能である。この手法の好ましい実施形態において、二重特異性抗体は、一方のアームにある第１の結合特異性を持つハイブリッド免疫グロブリン重鎖、及び他方のアームにあるハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性を提供する）からなる。二重特異的分子の片方にしか免疫グロブリン軽鎖がないことにより簡易な分離方法が可能になるので、この非対称の構造が、免疫グロブリン鎖の不要な組合せと所望の二重特異性化合物との分離を容易にすることが判明した。この手法は、１９９２年８月１７日に出願の同時係属出願第０７／９３１，８１１号に開示されている。

【0090】

二重特異性抗体の生成についての更なる詳細は、例えばＳｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１、２１０頁（１９８６年）を参照のこと。

【0091】

Ｆ．ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体も、本発明の範囲内である。ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。そのような抗体は、例えば、不要な細胞へ免疫系細胞を標的すること（米国特許第４，６７６，９８０号）、及びＨＩＶ感染の治療（ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９１／００３６０及びＷＯ９２／２００３７３；欧州特許第０３０８９号）に提唱された。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の都合のいい架橋方法を使用して作製することができる。適切な架橋剤は当技術分野において周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号においていくつかの架橋技術と一緒に開示されている。

【0092】

ＩＩＩ．体重増進を必要とする個体
本開示の実施形態は、体重増進を必要とする個体において体重を増加させる方法及び組成物を含む。個体は、例えば脂肪量の増加を必要とする場合がある。個体は、病状若しくは病態を含めた様々な理由又は別の理由により体重増進を必要とする場合がある。個体が、病状により低体重である場合、病状は、遺伝的な状態である場合もそうでない場合もあり、又は遺伝性の状態である場合もそうでない場合もある。特定の実施形態において、低体重の原因は、遺伝、代謝及び／又は疾患によるものであり得る。特定の実施形態において、病状は、症状として低体重である。いくつかの場合において、低体重になる症状は、その病状の全ての個体に存在するが、その病状の全てではない個体に存在する場合もある。低体重になる症状は、脂肪代謝調節、脂肪貯蔵及び炎症過程と関係のある経路の異常による場合があるが、いくつかの場合には、低体重は、脂肪代謝調節、脂肪貯蔵及び炎症過程と直接関係しない。個体は、いくつかの場合には、新生児早老症様症候群、マルファン症候群、ＨＩＶ感染、甲状腺機能亢進症、癌、結核、胃腸若しくは肝臓問題、医薬副作用、又は神経性食欲不振症若しくは神経性過食症などの精神病により低体重になる場合がある。例えば、悪液質を有する個体は、本開示の方法及び組成物に供することができる。悪液質は、例えば、癌、ＡＩＤＳ、慢性閉塞性肺疾患、多発性硬化症、うっ血性心不全、結核、家族性アミロイド多発神経障害、水銀中毒、ホルモン不全症などを含めた任意の理由の結果であり得る。

【0093】

特定の実施形態において、体重増進を必要とする個体は、１８．５未満の肥満指数（ＢＭＩ）又は年齢及び身長群に対して正常より１５％〜２０％低い体重の個体である。本開示の方法及び組成物に供される個体は、先ずは体重増進を必要とすると開業医によって同定されることができ、体重を増加させるという特定の目的のために個体に治療用組成物を送達することができる。

【0094】

ＩＶ．体重増進を必要とする個体の治療
本開示の実施形態において、個体は、その体重を測定する及び／若しくはそのＢＭＩを測定する並びに／又は脂肪量の測定のためにＭＲＩ及び／若しくは二重エネルギーＸ線吸収測定（ＤＥＸＡ）スキャンを行うなどによって体重増進を必要とするか決定される。個体は、体重増進を必要とすることが公知である又は体重増進が必要になる疑いがある若しくは体重増進が必要になるリスクがある場合がある。個体は、体重増進を必要とすることを自身で決定してもよく、及び／又は適切な開業医によって決定されてもよい。

【0095】

個体が、体重増進を必要とすることが公知である又は体重増進が必要になるリスクがある若しくはなりやすいことが公知になった時点で、アスプロシン若しくは機能的誘導体若しくは機能的フラグメントのその個体に適切且つ有効な量を与えることができる。特定の実施形態において、アスプロシン又は機能的誘導体若しくは機能的フラグメントの１つ若しくは複数を、例えば１つの組成物若しくは複数の組成物として個体に与える。アスプロシン又は機能的誘導体若しくは機能的フラグメントを含む組成物を、治療適用として特に製剤化することができる。

【0096】

個体に適切な用量のアスプロシンを、必要に応じて又は通常の治療計画の一部として与えることができる。個体は、アスプロシン又は機能的誘導体若しくは機能的フラグメントを取ることに加えて、体重を増やすために、他の方策及び／又は組成物を取ることもできる。個体は、毎日、毎週、毎月等で、アスプロシン又は機能的誘導体若しくは機能的フラグメントを取ることができる。個体は、飲食ありで又は空腹時にアスプロシン又は機能的誘導体若しくは機能的フラグメントを取ることができる。

【0097】

個体は、アスプロシン又は機能的誘導体若しくは機能的フラグメント治療計画の間中開業医によって監視されてもされなくてもよい。個体は、所望の体重が実現されたらアスプロシン又は機能的誘導体若しくは機能的フラグメントを取ることを中止でき、個体が、後の時点で体重を増やすことが必要になる場合、アスプロシン又は機能的誘導体若しくは機能的フラグメントを取ることを再開できる。過度に体重を増やす目的で、個体が、適切な量のアスプロシン又は機能的誘導体若しくは機能的フラグメントを超える際には、個体は、例えば運動、カロリー摂取量を減少させる、及び／若しくはアスプロシンのインヒビターを取ることを含めた任意の適切な手段によってその体重を減少させることができる。

【0098】

Ｖ．体重減少を必要とする及び／又はグルコース制御の改善を必要とする個体
本開示の実施形態は、体重減少を必要とする個体において体重を低下させる方法及び組成物を含む。個体は、例えば脂肪量の低下を必要とする場合がある。個体は、病状若しくは病態を含めた様々な理由又は別の理由により体重減少を必要とする場合がある。個体が、病状により体重減少を必要とする場合、病状は、遺伝的な状態である場合もそうでない場合もあり、及び遺伝性の状態である場合もそうでない場合もある。体重減少を必要とする原因は、遺伝、代謝及び／又は病気によるものであり得る。特定の実施形態において、病状は、症状として過体重又は肥満である。いくつかの場合において、過体重又は肥満になる症状は、その病状の全ての個体に存在するが、その病状の全てではない個体に存在する場合もある。過体重又は肥満になる症状は、脂肪代謝調節、脂肪貯蔵及び炎症過程と関係のある経路の異常による場合があるが、いくつかの場合には、過体重又は肥満は、脂肪代謝調節、脂肪貯蔵及び炎症過程と直接関係しない。個体は、糖尿病；甲状腺機能低下；メタボリックシンドロームを含めた代謝障害；医薬物による副作用；アルコール中毒；摂食障害；睡眠不足；運動不足；坐業的な生活様式；栄養不足；依存症停止；及び／又はストレスのせいで過体重若しくは肥満である場合があるが；いくつかの実施形態において、そのような状態は過体重又は肥満の結果である。

【0099】

特定の実施形態において、個体は、グルコース制御に異常が有り、そのような異常の改善を必要とすることが決定される。特定の実施形態において、グルコース制御における異常とは、個体の血中に過剰な量のグルコースがあるということである。特定の実施形態において、個体は、糖尿病若しくは前糖尿病性であり、過体重又は肥満である場合もそうでない場合もある。特定の実施形態において、個体に、アスプロシンの任意のインヒビターの１つ又は複数を有効量与えて、過剰な血糖のレベルを減少させることを含め血糖制御を改善する。このような治療を糖尿病性又は前糖尿病性個体に施すと、血糖制御の改善が見られる。血糖レベルの低下は、正常な血糖レベルである場合も又はそうでない場合もある。特定の実施形態において、血糖制御における改善に加えて、糖尿病又は前糖尿病の症状の１つ若しくは複数は、アスプロシンの１つ若しくは複数のインヒビターの投与により改善する。前糖尿病性個体の場合、糖尿病の発症は、アスプロシンの、１つ又は複数のインヒビターの使用により予防される。インスリン抵抗性個体の場合、アスプロシン阻害によりインスリン感受性の回復又は改善が得られ、特定の実施形態において、より良好なグルコースクリアランスを得られる。

【0100】

特定の実施形態において、体重減少を必要とする個体は、過体重（ＢＭＩ ２５〜２９）又は肥満である（ＢＭＩ ３０以上）。本開示の方法及び組成物に供される個体は、先ずは体重減少を必要とすると開業医によって同定されることができ、体重を低下させるという特定の目的のために個体に治療用組成物を送達することができる。

【0101】

本開示の実施形態において、個体へのアスプロシン又は機能的誘導体若しくは機能的フラグメントの投与により、個体における糖尿病の発症はない。特定の実施形態において、個体は糖尿病である又は糖尿病でない。

【0102】

ＶＩ．体重減少を必要とする個体の治療
本開示の実施形態において、個体は、その体重を測定する及び／若しくはそのＢＭＩを測定する並びに／又は脂肪量の判定のためにＭＲＩ及び／若しくはＤＥＸＡスキャンを行うなどによって体重減少を必要とするか決定される。個体は、体重減少を必要とすることが公知である又は体重減少が必要になる疑いがある若しくは体重減少が必要になるリスクがある場合がある。個体は、体重減少を必要とすることを自身で決定してもよく、及び／又は適切な開業医によって決定されてもよい。

【0103】

個体が、体重減少を必要とすることが公知である又は体重減少が必要になるリスクがある若しくはなりやすいことが公知になった時点で、アスプロシンのインヒビターのその個体に適切且つ有効な量を与えることができる。特定の実施形態において、アスプロシンインヒビターの１つ又は複数を、例えば１つの組成物若しくは複数の組成物として個体に与える。アスプロシンインヒビターを含む組成物を、治療適用として特に製剤化することができる。

【0104】

個体に適切な用量のアスプロシンインヒビターを、必要に応じて又は通常の治療計画の一部として与えることができる。個体は、アスプロシンインヒビターを取ることに加えて、体重を減らすために、他の方策及び／又は組成物を取ることもできる。個体は、毎日、毎週、毎月等で、アスプロシンインヒビターを取ることができる。個体は、飲食ありで又は空腹時にアスプロシンインヒビターを取ることができる。

【0105】

個体は、アスプロシンインヒビター治療計画の間中開業医によって監視されてもされなくてもよい。個体は、所望の体重が実現されたらアスプロシンインヒビターを取ることを中止でき、個体が、後の時点で体重を減らすことが必要になる場合、アスプロシンインヒビターを取ることを再開できる。過度に体重を減らす目的で、個体が、適切な量のアスプロシンインヒビターを超える際には、個体は、例えばカロリー摂取量を増加させる及び／又はアスプロシン若しくは機能的フラグメント若しくは機能的誘導体を取ることを含めた任意の適切な手段によってその体重を増加させることができる。

【0106】

ＶＩＩ．体重調節を必要とする個体の診断
特定の実施形態において、個体は、体内（例えば血漿中を含める）のアスプロシンのレベルに基づいて体重の増加が必要であると診断される又は体重の増加を必要としやすいと診断される。適切なサンプルは、個体から得ることができ、サンプルを得た当事者又は第３の当事者によって加工することができる。サンプルは、分析の前に適切な条件下で保管及び／又は運搬されることができる。特定の実施形態において、アスプロシンのレベルが特定のレベルより低いことが決定される場合、個体が、体重増進を必要とすることが公知である又は体重増進が必要になりやすいことが公知であり、適切な量のアスプロシン又はその機能的フラグメント若しくは機能的誘導体を個体に与える。特定の実施形態において、診断は、個体が体重増進を必要とする若しくは体重増進が必要になりやすいことを同定するためではなく、むしろ体重増進が必要になる又はそれに感受性になる原因を同定するために、アスプロシンレベルに基づいて行われる。

【0107】

特定の実施形態において、個体は、体内（例えば血漿中を含める）のアスプロシンのレベルに基づいて体重の低下が必要であると診断される又は体重の低下を必要としやすいと診断される。適切なサンプルは、個体から得ることができ、サンプルを得た当事者又は第３の当事者によって加工することができる。サンプルは、分析の前に適切な条件下で保管及び／又は運搬されることができる。特定の実施形態において、アスプロシンのレベルが特定のレベルより高いことが決定される場合、個体が、体重減少を必要とすることが公知である又は体重減少が必要になりやすいことが公知であり、適切な量の１つ又は複数のアスプロシンインヒビターが個体に与える。特定の実施形態において、診断は、個体が体重減少を必要とする若しくは体重減少が必要になりやすいことを同定するためではなく、むしろ体重減少が必要になる又はそれに感受性になる原因を同定するために、アスプロシンレベルに基づいて行われる。特定の場合において、肥満の個体は、過剰なアスプロシンの産生を引き起こす、フィブリリン−１（又はその領域）の複製を有することができる。

【0108】

体内のアスプロシンのレベルを同定する任意の適切な手段を、利用することができる。特定の実施形態において、サンドイッチＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、競合放射性標識結合アッセイ、受容体活性アッセイ、及び／又はアスプロシン誘導細胞内／細胞外シグナル伝達カスケードの測定を利用して、アスプロシンの血漿レベルを同定する。

【0109】

ＶＩＩＩ．医薬調製物
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容できる担体に溶解若しくは分散させた１つ若しくは複数のアスプロシン（又は機能的フラグメント又は機能的誘導体）又は１つ若しくは複数のアスプロシンインヒビターを有効量含む。句「薬学的又は薬理学的に許容できる」とは、必要に応じて例えばヒトなどの動物に投与した場合に、副、アレルギー又は他の有害反応を生じない分子的実体及び組成物のことを指す。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版 Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ及びＷｉｌｋｉｎｓ、２００５年に例示されるように、少なくとも１つのアスプロシン（又は機能的フラグメント又は機能的誘導体）又は少なくとも１つのアスプロシンインヒビターを含有する医薬組成物の調製は、本開示に照らして当業者に公知になり、参照により本明細書に組み込む。更に、動物（例えば、ヒト）投与の場合、調製物は、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔａｎｄａｒｄｓ（FDA Office of Biological standards）による要求に応じて無菌性、発熱性、一般的な安全性及び純度水準を満たすべきであることは理解されよう。

【0110】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容できる担体」は、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、薬物、薬安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、香料、色素、当業者に公知のそのような材料及びその組合せを含む（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版 Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ社、１９９０年、１２８９〜１３２９頁を参照のこと、参照により本明細書に組み込む）。従来の任意の担体が有効成分と適合しない場合を除き、医薬組成物におけるその使用が考えられる。

【0111】

アスプロシン（又は機能的フラグメント又は機能的誘導体）又はアスプロシンインヒビターは、それが固体、液体若しくはエアゾール形態で投与されるかどうか、それが注射のような投与経路のために無菌である必要があるかどうかによって、異なる型の担体を含むことができる。本発明は、静脈内、皮内、経皮的、くも膜下腔内、動脈内、腹膜内、鼻腔内、腟内、直腸内、局所、筋肉内、皮下、粘膜、経口、局所、局部的、吸入（例えばエアゾール吸入）、注射、注入、持続注入、標的細胞を直接浸す局所灌流、カテーテルによって、胃洗浄によって、クリームで、脂質組成物（例えば、リポソーム）で、又は当業者に公知の他の方法若しくは先述の任意の組合せによって投与することができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版 Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ社、１９９０年を参照のこと、参照により本明細書に組み込む）。

【0112】

アスプロシン（又は機能的フラグメント又は機能的誘導体）又はアスプロシンインヒビターは、遊離塩基、中性若しくは塩形態で組成物へと製剤化することができる。薬学的に許容できる塩は、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基と形成される塩を含み、或は薬学的に許容できる塩は、例えば、塩酸若しくはリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸のような有機酸と形成される。遊離カルボキシ基と形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム若しくは水酸化第二鉄などの無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン若しくはプロカインのような有機塩基から得ることもできる。製剤において、溶液は、投与製剤に適合する方式で及び治療上有効になるような量で投与されることになる。製剤は、注射可能な溶液、若しくは肺へ送達するためのエアゾールのような非経口投与用として製剤化され、又は薬物放出カプセル剤等のような消化性投与用として製剤化されるなど様々な剤形で容易に投与される。

【0113】

更に本発明によると、投与に適切な本発明の組成物は、不活性希釈剤を含む又は含まない薬学的に許容できる担体中で提供される。担体は、吸収可能であるべきであり、液体、半固形、即ちペースト、又は固形担体を含む。任意の通常媒体、薬剤、希釈剤又は担体が、レシピエント若しくはそこに含有される組成物の治療有効性に不利益になる場合を除いて、本発明の方法を実践するのに使用する投与可能な組成物の使用は適当である。担体若しくは希釈剤の例には、脂肪、油、水、食塩水、脂質、リポソーム、樹脂、結合剤、充填剤等、又はその組合せがある。組成物は、１つ又は複数の成分の酸化を遅延させるために様々な酸化防止剤を含むこともできる。加えて、微生物活動の防止は、パラベン（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール又はその組合せを含むがこれに限定されない様々な抗菌剤及び抗真菌剤などの防腐剤によってもたらすことができる。

【0114】

本発明によると、組成物は、都合よく実用的な任意の様式、即ち溶液、懸濁液、乳化、混合物、封入、吸収等により担体と組み合わされる。そのような手順は、当業者にとって所定の仕事である。

【0115】

本発明の特定の実施形態において、組成物は、半固形若しくは固形担体と組み合わされる又は十分に混合される。混合は、粉砕など任意の都合の良い様式で実施することができる。組成物を治療活性の減少、即ち胃における変性から保護するために、混合過程において安定剤を添加することもできる。組成物用の安定剤の例には、緩衝液、グリシン及びリジンのようなアミノ酸、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトース、ソルビトール、マンニトール等のような炭水化物がある。

【0116】

更なる実施形態において、本発明は、アスプロシン（又は機能的フラグメント又は機能的誘導体）又はアスプロシンインヒビター、１つ又は複数の脂質、及び水性溶媒を含む医薬品脂質ビヒクル組成物の使用に関することができる。本明細書で使用される場合、用語「脂質」は、特徴として水に不溶性であり有機溶剤で抽出可能な広範な任意の物質を含むと定義されることになる。この幅広いクラスの化合物は、当業者に周知であり、本明細書において用語「脂質」が使用されるように、どんな特定の構造にも限定されない。例には、長鎖脂肪族炭化水素及びその誘導体を含有する化合物がある。脂質は、天然に存在することができ、又は合成、（即ち、人間によって設計又は産生される）こともできる。しかしながら、脂質は通常生体物質である。生体脂質は当技術分野において周知であり、例えば、中性脂肪、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、リゾ脂質、スフィンゴ糖脂質、糖脂質、サルファタイド、エーテル及びエステル連結した脂肪酸を含む脂質及び重合性脂質、並びにその組合せがある。当然ながら、当業者によって脂質と理解される本明細書において特に記述したもの以外の化合物も、本発明の組成物及び方法に包含される。

【0117】

当業者は、脂質ビヒクルに組成物を分散させるために利用できる様々な技術に精通している。例えば、アスプロシン（又は機能的フラグメント又は機能的誘導体）又はアスプロシンインヒビターは、脂質を含有する溶液に分散され、脂質で溶解され、脂質で乳化され、脂質と混合され、脂質と組み合わせられ、脂質に共有結合され、脂質中に懸濁液として含有され、ミセル若しくはリポソームを含有する又はそれと複合体形成され、さもなければ当業者に公知のあらゆる手段によって脂質若しくは脂質構造と関連付けることができる。分散は、リポソームの形成を生じる場合も又は生じない場合もある。

【0118】

動物患者に投与される本発明の組成物の実際の投与量は、体重、状態の重症度、治療される疾患の型、以前の又は並列の治療的介入、患者の特発性疾患など身体的及び生理的因子並びに投与経路によって決定することができる。投与量並びに投与経路に応じて、好ましい投与量及び／又は有効量の投与の回数は、対象の応答によって変化し得る。投与に関して責任がある開業医は、いかなる場合も組成物中の有効成分の濃度及び個々の対象に対して適当な用量を決定することになる。

【0119】

特定の実施形態において、医薬組成物は、例えば少なくとも約０．１％の活性化合物を含むことができる。他の実施形態において、活性化合物は、単位体重で約２％〜約７５％、又は約２５％〜約６０％、例えば、これらから導き出せる任意の範囲を含むことができる。当然、適切な投与量が、所与の任意の単位用量の化合物で得られるように、治療上有用な各組成物において活性化合物の量を調製することができる。可溶性、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、産物貯蔵寿命、並びに他の薬理学的に考慮すべき点などの因子が、そのような医薬製剤を調製する当業者によって検討されることになり、従って、様々な投与量及び治療計画が望ましいものであり得る。

【0120】

他の非限定的な例において、用量は、投与当たり約１μｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重、約１０μｇ／ｋｇ／体重、約５０μｇ／ｋｇ／体重、約１００μｇ／ｋｇ／体重、約２００μｇ／ｋｇ／体重、約３５０μｇ／ｋｇ／体重、約５００μｇ／ｋｇ／体重、約１ｍｇ／ｋｇ／体重、約５ｍｇ／ｋｇ／体重、約１０ｍｇ／ｋｇ／体重、約５０ｍｇ／ｋｇ／体重、約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約２００ｍｇ／ｋｇ／体重、約３５０ｍｇ／ｋｇ／体重、約５００ｍｇ／ｋｇ／体重から、約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重以上まで、及びこれらから導き出せる任意の範囲を含むこともできる。本明細書に挙げた数から導き出せる範囲の非限定的な例において、上記の数に基づいて、約５ｍｇ／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重〜約５００ｍｇ／ｋｇ／体重等の範囲を投与することができる。

【0121】

Ａ．消化性組成物及び製剤
本発明の好ましい実施形態において、アスプロシン（又は機能的フラグメント又は機能的誘導体）又はアスプロシンインヒビターは、消化性経路によって投与するために製剤化される。消化性経路とは、組成物が消化管と直接接触する投与の考え得る全ての経路を含む。特に、本明細書に開示する医薬組成物は、経口、頬側、直腸又は舌下に投与することができる。従って、これらの組成物を、不活性希釈剤若しくは吸収可能な食用担体と共に製剤化することができ、又はそれらを堅い又は柔らかい殻のゼラチンカプセルに封入することができ、又はそれらを錠剤に圧縮することができ、又はそれらを治療食の食物に直接入れることができる。

【0122】

特定の実施形態において、活性化合物を賦形剤と組み合わせ、摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル、懸濁剤、シロップ、ウエハー等の形態で使用することができる（Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚら、１９９７年；Ｈｗａｎｇら、１９９８年；米国特許第５，６４１，５１５号；第５，５８０，５７９号及び第５，７９２，４５１号、各々特に参照によりその全体を本明細書に組み込む）。錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤等は：結合剤、例えばトラガカントゴム、アカシア、コーンスターチ、ゼラチン又はその組合せなど；賦形剤、例えばリン酸二カルシウム、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム又はその組合せなど；崩壊剤、例えばコーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸又はその組合せなど；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムなど；甘味剤、例えばスクロース、ラクトース、サッカリン又はその組合せなど；賦香剤、例えばペパーミント、冬緑油、チェリー香味料、オレンジ香味料等などを含有することもできる。単位投与量形態がカプセルである場合、それは、上記の型の材料に加えて、液状担体を含有することができる。コーティングとして、さもなければ単位投与量の物理的な形態を修飾するために他の様々な材料が存在し得る。例えば、錠剤、丸剤又はカプセル剤は、セラック、糖、又は両方でコーティングすることができる。剤形がカプセルである場合、それは、上記の型の材料に加えて、液状担体などの担体を含有することができる。ゼラチンカプセル剤、錠剤又は丸剤は、腸溶性にコートすることができる。腸溶性のコーティングは、ｐＨが酸性である胃又は上部腸における組成物の変性を防止する。米国特許第５，６２９，００１号を参照のこと。小腸に達すると同時に、その中の塩基性ｐＨは、コーティングを溶解させ、組成物の放出並びに特殊化した細胞、例えば上皮腸細胞及びパイエル板Ｍ細胞による吸収を可能にする。エリキシルのシロップは、活性化合物、甘味剤としてスクロース、防腐剤としてメチル及びプロピルパラベン、色素並びにチェリー又はオレンジ風味などの香味料を含有することができる。当然ながら、任意の単位投与量形態を調製するのに使用される任意の材料は、薬学的に高純度であり、利用する量で実質的に非毒性であるべきである。加えて、活性化合物は、徐放性調製物及び製剤に組み入れることができる。

【0123】

別法として経口投与の場合、本発明の組成物は、１つ若しくは複数の賦形剤と共に、うがい薬、歯磨き剤、口腔錠、経口スプレー、又は舌下剤といった経口的に投与される製剤形態に組み入れることができる。例えば、うがい薬は、ホウ酸ナトリウム溶液（Ｄｏｂｅｌｌの溶液）など、適当な溶媒中に必要とされる量で有効成分を入れて調製することができる。別法として、有効成分は、ホウ酸ナトリウム、グリセリン及び重炭酸カリウムを含有している、若しくは歯磨き剤に分散されている、又は水、結合剤、研磨材、賦香剤、発泡剤及び湿潤剤を含むことができる組成物に治療上有効な量で添加されているなどの経口溶液に入れることができる。別法として、組成物は、舌下に置く、さもなければ口の中で溶解することができる錠剤又は液状に作ることができる。

【0124】

消化性の投与の他の様式に適している追加の製剤には、坐剤がある。坐剤は、様々な体重及び形状の固体剤形であり、直腸への挿入により通常投薬される。挿入後に、坐剤は、腔体液中で軟化、解ける又は溶解する。一般に、坐剤の場合、従来の担体は、例えば、ポリアルキレングリコール、トリグリセリド又はその組合せを含むことができる。特定の実施形態において、坐剤は、例えば、約０．５％〜約１０％、及び好ましくは約１％〜約２％の範囲で有効成分を含有する混合物から形成することができる。

【0125】

Ｂ．非経口組成物及び製剤
更なる実施形態において、アスプロシン（又は機能的フラグメント又は機能的誘導体）又はアスプロシンインヒビターは、非経口経路によって投与することができる。本明細書で使用される場合、用語「非経口的」は、消化管を迂回する経路を含む。特に、本明細書に開示する医薬組成物は、例えば、それだけには限らないが、静脈内、皮内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、皮下、又は腹膜内に投与することができる、米国特許第６，７５３７，５１４号、第６，６１３，３０８号、第５，４６６，４６８号、第５，５４３，１５８号；第５，６４１，５１５号；及び第５，３９９，３６３号（各々を特に参照によりその全体を本明細書に組み込む）。

【0126】

遊離塩基又は薬理学的に許容できる塩である活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と最適に混合された水に調製することができる。分散剤は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びその混合物並びに油中に調製することもできる。貯蔵及び使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するための防腐剤を含有する。注射可能な使用に適した医薬形態には、無菌の水溶液若しくは分散剤及び無菌の注射可能な液剤又は分散剤の即時調製用の無菌の散剤がある（米国特許第５，４６６，４６８号、特にその全体を参照により本明細書に組み込む）。全ての場合において、形態は、無菌でなければならず、簡単な注射能力が存在する程度に液性でなければならない。それは、製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌など、微生物の汚染作用に備えて保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、多価アルコール（即ち、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、その適当な混合物並びに／又は植物油を含有する溶媒若しくは分散媒であってもよい。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散剤の場合には必要とされる粒子サイズを維持することにより、及び界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によって得ることができる。多くの場合、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましくなる。注射可能な組成物の持続的吸収は、組成物における遅延吸収薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によって得ることができる。

【0127】

水溶液での非経口投与の場合、例えば、溶液は、必要に応じて適当に緩衝され、液体希釈剤は充分な生理食塩水又はグルコースで先ず等張性にするべきである。これらの特定の水溶液は、特に静脈内、筋肉内、皮下及び腹膜内投与に適している。これに関して、利用できる滅菌水性媒体は、本開示に照らして当業者に公知になる。例えば、１投与量を、等張性ＮａＣｌ溶液に溶解し、皮下注入液を添加するか又は提唱された注入の部位で注射するかいずれかが可能である（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１５版、１０３５〜１０３８頁及び１５７０〜１５８０頁を参照のこと）。投与量のいくつかの変形は、治療される対象の状態によって必然的に生ずることになる。投与に関して責任がある者は、いかなる場合も、個々の対象に対して適当な用量を決定することになる。更に、ヒト投与の場合、調製物は、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ｓｔａｎｄａｒｄｓ（FDA Office of Biologics standards）による要求に応じて無菌性、発熱性、一般的な安全性及び純度水準を満たすべきである。

【0128】

無菌の注射可能な溶液は、上に挙げた他の様々な成分を含む適当な溶媒に活性化合物を必要量入れ、必要に応じてその後ろ過殺菌することにより調製される。一般に、分散剤は、無菌化した様々な有効成分を、塩基性分散媒及び上に挙げた他の成分から必要とされるものを含有する無菌のビヒクルに入れることによって調製される。無菌の注射可能な溶液を調製するための無菌の散剤の場合、好ましい調製の方法は、有効成分の粉末＋事前に無菌ろ過した溶液から追加の所望の任意の成分を産する真空乾燥及び凍結乾燥技術である。粉末状の組成物は、安定剤を含む又は含まない液状担体、例えば水又は食塩水などと組み合わせられる。

【0129】

Ｃ．多岐にわたる医薬組成物及び製剤
本発明の他の好ましい実施形態において、活性化合物アスプロシン（又は機能的フラグメント又は機能的誘導体）又はアスプロシンインヒビターは、様々な多岐にわたる経路、例えば局所（即ち、経皮的）投与、粘膜投与（鼻腔内、膣等）及び／若しくは吸入による投与用として製剤化することができる。

【0130】

局所投与用の医薬組成物は、軟膏、パスタ剤、クリーム又は散剤など医薬用途のために製剤化された活性化合物を含むことができる。軟膏剤は、局所適用のための油性、吸着性、乳液性及び水溶性全てに基づく組成物を含むが、クリーム及びローション剤は、乳液性基材だけを含む組成物のものである。局所的に投与する医薬物は、表皮を経由する有効成分の吸着を容易にするための浸透促進剤を含有することができる。適切な浸透促進剤には、グリセリン、アルコール、アルキルメチルスルホキシド、ピロリドン及びラウロカプラムがある。局所適用のための組成物用として可能な基剤には、ポリエチレングリコール、ラノリン、コールドクリーム及びワセリン並びに他の任意の適切な吸収性、乳液性又は水溶性軟膏基剤がある。局所調製物は、有効成分を保存し、混合物が均質になるようにするために、必要に応じて乳化剤、ゲル化剤及び抗菌性防腐剤を含むこともできる。本発明の経皮投与は、「パッチ剤」の使用を含むこともできる。例えば、パッチ剤は、既定の速度で及び一定の期間にわたり連続的な様式で１つ又は複数の活性物質を供給することができる。

【0131】

特定の実施形態において、医薬組成物は、点眼薬、鼻腔内スプレー、吸入及び／又は他のエアゾール送達ビヒクルによって送達することができる。例えば、鼻エアゾールスプレーにより肺に組成物を直接送達する方法は、米国特許第５，７５６，３５３号及び第５，８０４，２１２号に記述されている（各々を特にその全体を参照により本明細書に組み込む）。同様に、鼻腔内微小粒子樹脂（Ｔａｋｅｎａｇａら、１９９８年）及びリゾホスファチジルグリセロール化合物（米国特許第５，７２５，８７１号、特にその全体を参照により本明細書に組み込む）を使用する薬物の送達も、医薬品技術分野において周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックスの形態での経粘膜薬物送達については、米国特許第５，７８０，０４５号に記述されている（特にその全体を参照により本明細書に組み込む）。

【0132】

用語エアゾールとは、液状又は加圧ガス噴射剤中に分散された液体粒子の微粉化した固体のコロイド系のことを指す。吸入用としての本発明の典型的なエアゾールは、液体噴射剤、又は液体噴射剤及び適切な溶媒の混合物中の有効成分の懸濁液からなることになる。適切な噴射剤には、炭化水素及び炭化水素エーテルがある。適切な容器は、噴射剤の圧力要件により異なることになる。エアゾールの投与は、対象の年齢、体重並びに症状の重症度及び応答によって変わることになる。

【0133】

ＩＸ．本開示のキット
本明細書に記述される組成物のいずれかが、キットに含まれ得る。非限定的な例において、アスプロシン（又は機能的フラグメント若しくは機能的誘導体）及び／又はアスプロシンインヒビターが、キットに含まれ得る。従ってキットは、適切な容器手段中に、アスプロシン（又は機能的フラグメント若しくは機能的誘導体）及び／又はアスプロシンインヒビターを含むことになる。

【0134】

キットの成分は、水性媒体又は凍結乾燥形態で梱包することができる。キットの容器手段は、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、注射器又は他の容器手段を一般に含むことになり、その中に成分は入れられ、好ましくは適当にアリコートされ得る。２つ以上の成分がキットの中にある場合、キットは、追加の成分を別々に入れることができる第２、第３又は他の追加の容器を一般に含有することにもなる。しかしながら、様々な組合せの成分をバイアルに含めることができる。本発明のキットは、商品販売用として厳重に封をした、アスプロシン（又は機能的フラグメント若しくは機能的誘導体）及び／又はアスプロシンインヒビター並びに他の任意の試薬容器を含有する手段も一般に含むことになる。そのような容器には、注射又は所望のバイアルが保持されるブロー成形したプラスチック容器があり得る。

【0135】

キットの成分が、１つ及び／又はより多くの液体として提供される場合、液体は水溶液であり、無菌の水溶液が特に好ましい。アスプロシン（又は機能的フラグメント又は機能的誘導体）又はアスプロシンインヒビター組成物は、注射可能な組成物に製剤化することもできる。その場合、容器手段は、それ自体が注射器、ピペット及び／若しくは他のそのような装置であってよく、製剤を、それらから身体の感染域に適用し、動物に注射し、並びに／又はキットの他の成分に適用する及び／若しくはそれと混合することさえできる。

【0136】

しかしながら、キットの成分は、乾燥粉末として提供することができる。試薬及び／又は成分が乾燥粉末として提供される場合、粉末は、適切な溶媒の添加によって再構成できる。溶媒も別の容器手段で提供され得ることが想定される。

【0137】

本発明のキットは、例えば、注射及び／又は所望のバイアルが保持されるブロー成形プラスチック容器など、商品販売用として厳重に封をしてバイアルを含有するための手段を一般に含むことになる。

【0138】

キットは、それぞれ、食欲刺激薬又は食欲抑制薬として製剤化されたアスプロシン（又は機能的フラグメント又は機能的誘導体）若しくはアスプロシンインヒビターを含むことができる。

【0139】

特定の実施形態において、キットは、例えば食欲抑制薬若しくは食欲刺激薬を含めた、体重減少若しくは体重増進のための１つ又は複数の組成物を更に含む。特定の実施形態において、キットは、個体並びに／若しくはその処理工程からサンプルを得るための１つ又は複数の装置及び／若しくは試薬を含む。

【実施例】

【0140】

以下の実施例を、本発明の好ましい実施形態を実証するために含める。続く実施例において開示される技術は、本発明の実践においてよく機能するように本発明者によって発見された技術を表し、従って、その実践に対して好ましい様式を構成すると考え得ることを当業者は認識するべきである。しかしながら、本開示に照らして、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、開示されている特定の実施形態に多くの変更を施してもなお、同様の又は類似の結果を得られることを当業者は認識するべきである。

【0141】

実施例１
最適な脂肪量を維持するために重要な脂肪由来ポリペプチドホルモン
新生児早老症様症候群（ＮＰＳ）関連脂肪異栄養症
ＮＰＳは、顔面及び四肢に主に影響を及ぼす皮下脂肪組織の減少による先天性のるい痩によって特徴づけられる（Ｈｏｕ、ら、２００９年；Ｏ’Ｎｅｉｌｌ、ら、２００７年）。表現型は、皮下脂肪の不足によりやせた表皮及び浮き出た脈管構造により出生時に（及び子宮内成長遅延として出生前でも）一般に明らかである（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ、ら、２００７年）。患者は、全ての年齢で、年齢における正常より、標準偏差の数倍だけ低い肥満指数（ＢＭＩ）を示す（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ、ら、２００７年）。ＮＰＳ患者は、顔面異形の特徴及び皮下脂肪の減少ため早老性のように見えるが、白内障、若白髪又はインスリン抵抗性など真性の早老症の通常の特徴を有さない（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ、ら、２００７年）。臨床検査によって、２名の個体をＮＰＳと同定し、そのるい痩表現型を駆動する機序が本明細書において特徴づけられる。両方の患者のＢＭＩは極度に低く（図１ｂ）、臀筋範囲を相対的に残して顔面及び四肢に主に影響を及ぼす皮下脂肪の減少を肉眼的に示す（図１ａ）。両方の患者の空腹時血漿グルコース及びインスリンレベルが正常なことは、その患者のインスリン感受性及びグルコース処理が正常であることを示唆する（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ、ら、２００７年）。その患者が、家族でただ一人の罹患したメンバーであることから、潜在的ｄｅ ｎｏｖｏ突然変異又は劣性遺伝であることがまず示唆される（図１ｂ）。

【0142】

全エキソーム配列決定により、ＮＰＳにおける３’ＦＢＮ１突然変異が同定される
全エキソーム及びサンガー配列決定の組合せにより、両方の患者のＦＢＮ１遺伝子におけるｄｅ ｎｏｖｏヘテロ接合性、３’突然変異が同定された（図１ｂ、１ｃ）。類似の症例に関する文献検索により、同一の表現型とＦＢＮ１ ３’トランケーション突然変異の両方について記述している５つの症例報告が発見された（Ｇｒａｕｌ−Ｎｅｕｍａｎｎ、ら、２０１０年；Ｈｏｒｎ及びＲｏｂｉｎｓｏｎ、ら、２０１１年；Ｇｏｌｄｂｌａｔｔ、ら、２０１１年；Ｔａｋｅｎｏｕｓｃｈｉ、ら、２０１３年；Ｊａｃｑｕｉｎｅｔ、ら、２０１４年）。７例全ての患者（本開示のそれを含む）が、ＮＰＳと診断され、全員が、およそ８６００塩基対のコード領域の７１塩基対区分内にトランケーション突然変異を有していた（図１ｃ）。最後から２番目のエクソンの３’ ５０ヌクレオチドに起こる突然変異の７つ全て（図１ｃ）で、ナンセンス変異依存分解が回避されており、フレームシフトによりフィブリリン−１タンパク質のＣ末端トランケーションを生ずると予測される（図１ｄ）。ＦＢＮ１は、眼、大動脈など大血管及び骨格に一般に影響を及ぼす結合組織障害であるマルファン症候群と関連する遺伝子である（Ｐｙｅｒｉｔｚ、ら、２００９年）。患者は、一般に長身で、痩せており、その高さと比較して指端距離が長い（Ｐｙｅｒｉｔｚ、ら、２００９年）。本開示の患者は、古典的なマルファン症候群患者と大きく異なるように見えたが、注意深い身体的検査により、本開示の患者においてマルファン症候群の診断のための改定されたＧｈｅｎｔ疾病分類に基づくマルファン症候群の特徴のを有することが分かった（Ｌｏｅｙｓ、ら、２０１０年）。これは、ＦＢＮ１に３’突然変異を持つＮＰＳに関連する、公開されている５つの症例報告によって確証された（Ｇｒａｕｌ−Ｎｅｕｍａｎｎ、ら、２０１０年；Ｈｏｒｎ及びＲｏｂｉｎｓｏｎ、ら、２０１１年；Ｇｏｌｄｂｌａｔｔ、ら、２０１１年；Ｔａｋｅｎｏｕｓｃｈｉ、ら、２０１３年；Ｊａｃｑｕｉｎｅｔ、ら、２０１４年）。従って、これらのＮＰＳ患者は、マルファン症候群の表現型（脈管、眼、骨格の特徴）と部分的な脂肪異栄養とを兼ね備える。脂肪異栄養は、ＮＰＳ患者に固有の外見を与えるため、関連するマルファン症候群を診断する作業が相対的に難しい。これにより、これら患者においてＦＢＮ１突然変異が同定されるまでの数十年にわたって、ＮＰＳが、マルファン症候群とつながりのないそれ自身の固有の臨床的存在であると記述されいた理由が説明できる（ＯＭＩＭ ２６４０９０）。フィブリリン−１は、モジュラータンパク質であり、その中で異なるモジュールに影響を及ぼす突然変異が、異なる表現型（マルファン症候群、先端短肢異形成症、幸福顔貌骨異形成症、スティッフスキン症候群［Stiff skin syndrome］、ヴェィユ−マルケサーニ症候群）をもたらす（Ｐｙｅｒｉｔｚ、ら、２００９年；Ｄａｖｉｓ、ら、２０１２年）。従って、更に別の症候群とフィブリリン−１突然変異との関連は、意外でない。臨床及び分子診断の確定により、本実施例は、フィブリリン−１ Ｃ末端トランケーション突然変異が脂肪異栄養をもたらす機序を解明する。

【0143】

ＦＢＮ１は、白色脂肪組織において高く及び動的に発現される
ＦＢＮ１は、皮下脂肪の減少したＮＰＳ表現型と一致して、ヒト脂肪組織において高レベルで発現する（Ｂｉｏｇｐｓ．ｏｒｇ、ホモサピエンスプローブセット：２０２７６５＿ｓ＿ａｔ）。マウスにおいて、Ｆｂｎ１は、褐色脂肪組織及び骨格筋と比較して白色脂肪組織において特異的に発現する（図２ａ）。脂肪細胞へのヒト前脂肪細胞の分化は、ＦＢＮ１発現の増加をもたらした（図２ｂ）、一方で高脂肪食に数週間曝露したマウスにおいて鼠径部脂肪組織におけるＦｂｎ１発現の減少が、観察された（図２ｃ）。

【0144】

アスプロシンは、循環する、プロフィブリリンのＣ末端切断産物である
フィブリリン−１は、２８７１アミノ酸プロタンパク質として作製され、細胞から分泌され、フーリンと呼ばれる細胞外プロテアーゼによってＣ末端で切断される（Ｍｉｌｅｗｉｃｚ、ら、１９９５年；Ｒｉｔｔｙ、ら、１９９９年；Ｒａｇｈｕｎａｔｈ、ら、１９９９年；Ｗａｌｌｉｓ、ら、２００３年）。これにより、１４０アミノ酸のＣ末端切断産物（ＣＴポリペプチド）が放出され、細胞外基質成分として働く成熟フィブリリン−１が得られる（Ｍｉｌｅｗｉｃｚ、ら、１９９５年；Ｒｉｔｔｙ、ら、１９９９年；Ｒａｇｈｕｎａｔｈ、ら、１９９９年；Ｗａｌｌｉｓ、ら、２００３年）。７つ全てのＮＰＳ突然変異は、切断部位の周りに集中しており、ＣＴポリペプチドにヘテロ接合性の欠失を生じる（図１ｄ）。ＣＴポリペプチドは、タンパク質の他の部分と比較して最も高い進化的な保存性を示し、他の種と比較した場合、生物学的に重要な役割を示唆する（図３ａ、３ｂ）。正常な生理的条件下で、ＣＴポリペプチドは、安定なままであり、ＮＰＳ表現型に関連して独立した機能を有すると考えられた。ウェスタンブロッティングにより、ヒト及びマウスの血漿において固有の、少しの１６ｋＤａ交差反応実体の存在が確認された（図３ｃ、３ｄ）。肥満マウス及びヒトからの血漿を使用すると、両方の種においてＣＴポリペプチドのレベルが、体脂肪蓄積に比例していることが判明した（図３ｃ、３ｄ）。ＦＢＮ１は、白色脂肪組織において高発現し、ＮＰＳ表現型は、白色脂肪量の減少によって臨床的に区別されるので、ＣＴポリペプチドは、ギリシア語の「白」であるＡｓｐｒｏｓに因んでアスプロシンと命名された。

【0145】

アスプロシンは、ＮＰＳ関連脂肪生成分化異常をｉｎ ｖｉｔｒｏでレスキューする
ＮＰＳ突然変異の影響を、ＮＰＳ患者及び非罹患の対照対象の皮膚線維芽細胞を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞の脂肪生成分化に関して試験した。細胞を、いくつかの転写因子及び脂肪特異的遺伝子の発現の増加を誘導する脂肪生成誘導カクテルに７日間曝露した（Ｊａａｇｅｒ、ら、２０１２年）。ＷＴ細胞と比較して、ＮＰＳ変異体線維芽細胞は、脂肪生成分化が著しく損なわれていた（図４ａ）。この異常は、ＷＴ ＦＢＮ１又は分泌形態のアスプロシンのいずれかの過剰発現によってレスキューできるが（図４ｄ）、シグナルペプチド無しで発現し結果として細胞内にトラップされるアスプロシンではレスキューされない（図４ｃ、４ｅ、４ｆ）。アスプロシンの脂肪生成効果が作用するのが細胞外であることを確認するために、組換えアスプロシンを、大腸菌に生成させた。培地への組換えアスプロシンの添加は、ＷＴ細胞における脂肪生成分化を促進し（図４ｇ）、ＮＰＳ変異体細胞における脂肪生成異常をレスキューするのに十分であった（図４ｈ）。

【0146】

高い循環アスプロシンは、肥満性及び糖尿病誘発性である
先ずはｉｎ ｖｉｖｏでのアスプロシンの効果を試験するために、それを、標準的な食事を給餌したＷＴマウスにおいてＣＭＶプロモーターの制御下にＷＴ ＦＢＮ１又はＧＦＰのｃＤＮＡを保有するアデノウイルスを使用して肝臓で発現させた。大量のアスプロシンが、ＦＢＮ１アデノウイルスに曝露したマウスの循環血液中に存在していた（図７）ことは、肝臓によるプロフィブリリンの正しい分泌及び切断を示唆した。アデノウイルス注射の１０日後、マウスに対するＭＲＩスキャンは、循環アスプロシンがより多いマウスにおいて２．５倍の脂肪量の増加を示したが（図５ａ）、非脂肪量に変化はなかった（図５ｂ）。そのようなマウスの体重は、対照マウスのそれと比べて比例して増加した（図５ｃ）。

【0147】

第２の手法は、標準的な食事を給餌したＷＴマウスにおいて１０日間の高度に精製した組換えアスプロシン又はＧＦＰの毎日の皮下注射を利用した。アデノウイルス手法と同様に、１０日間毎日の皮下アスプロシン注射は、ＧＦＰ注射と比較して脂肪量の著しい増加を引き起こした（図５ｄ）。アデノウイルス実験に対して、アスプロシン及びＧＦＰ注射されたマウスの両方の非脂肪量は、わずかであるが、著しい低下（図５ｅ）を示し、これは毎日の取扱い並びに注射によりマウスに掛かったストレスを反映した可能性がある。とにかく、両方の手法により、循環アスプロシン量の急速な増加が、ｉｎ ｖｉｖｏで脂肪増加を駆動することが実証された。両方の実験において、鼠径部白色脂肪の顕微鏡検査は、アスプロシンに曝露したマウスにおいてより大きな脂肪細胞体積を示した（図８）。これらのマウスにおけるより多い体脂肪蓄積と整合して、より高レベルの血漿レプチン及びアディポネクチンが存在していた（図９）。これらは、循環レベルが脂肪量に正比例することが公知の脂肪由来ホルモンである。同時に、より低レベルの血漿トリグリセリド及び遊離脂肪酸が存在していたが（図１０）、これは、より大きな脂肪細胞におけるより大きな脂質貯留を反映している可能性がある。

【0148】

より多くの循環アスプロシンに曝露したマウスにおいて肥満が始まったと考えて、これらの動物においてグルコースホメオスタシスをアッセイした。絶食し、アスプロシン処理したマウスが、高血糖及び高インスリン血症を示したことは（図１１）、インスリン抵抗性を示唆した。グルコース及びインスリン負荷試験の両方が、高い循環アスプロシンの糖尿病誘発性効果と整合した（図５ｇ、５ｈ、５ｉ、５ｊ）。肥満及びインスリン抵抗性の状態と一致して、より多くの循環アスプロシンに曝露した動物の肝臓において脂質蓄積は増加した（図１２）。要約すると、循環アスプロシンの急速な増加は、マウスにおいて強力な肥満性及び糖尿病誘発性効果を有することが判明した。

【0149】

トランケートされたプロフィブリリンの優性阻害効果
極度に無脂肪であることに加えて、ＮＰＳ患者は、インスリン感受性でもある（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ、ら、２００７年）。過度の循環アスプロシンに曝露したマウスの反対の生理的プロファイルは、ＮＰＳ表現型が、循環アスプロシンレベルの減少による可能性があることを裏付ける。そのヘテロ接合遺伝子型からは、ＮＰＳ患者が、非罹患の対照と比較して半分の循環アスプロシンを有するはずであることが予測されるが、これらの患者において循環アスプロシンは検出できなかった（図６ａ）。ＣＴポリペプチドは、細胞からのプロフィブリリン分泌に必要であることが最近示された（Ｊｅｎｓｅｎ、ら、２０１４年）。その非存在下では、ナンセンス変異依存分解を回避した、トランケートされたプロフィブリリンは、細胞内にトラップされたままである（Ｊｅｎｓｅｎ、ら、２０１４年）。従って、ＮＰＳにおける変異体であるトランケートされたプロフィブリリンは、優性阻害様式で作用して、ＷＴ対立形質のプロフィブリリンの分泌を妨げると考えられた。これは、少なくとも、ナンセンス変異依存分解を受ける、又は遺伝子全体が欠失される（その両方ともトランケートされたプロフィブリリンを発現できない）、よりＮ末端側でのトランケーションがある患者において、ＮＰＳ表現型が古典的なマルファン症候群と異なる理由も説明できる。この理論を試験するために、アスプロシンのレベルを、ＮＰＳ細胞及びトランケートされたプロフィブリリン変異体の過剰発現があるＷＴ細胞からの細胞培養培地でアッセイした。両方の例において、予想通り、培地中のアスプロシンレベルが著しく減少した（図６ｂ、６ｄ）。加えて、ＷＴ細胞における変異体プロフィブリリンの過剰発現が、培地へのフィブリリン−１分泌の量を減少させるのに十分だったことは、ＮＰＳで見られるマルファン症候群表現型に対する病因の優性阻害様式を示唆した（図１３）。

【0150】

方法
研究対象及び倫理記載
ベイラー医科大学における施設内倫理委員会に承認された３つのプロトコールのうち１つの下で、参加の前に全ての対象からインフォームドコンセントを得た。

【0151】

臨床評価
臨床医は、直接の既往歴、物理学的検査及び家族の既往歴の分析によって研究対象を評価した。医療記録及び注釈の形態で臨床情報を再検討した。これらの対象との問診は、電話によっても行った。家族を、患者と一緒に面談した。利用可能である場合はいつでも、以前の診断研究、手術の報告又は放射線学的研究からの報告を再検討した。インフォームドコンセントの後に、皮膚線維芽細胞を単離するための皮膚生検を、適当な麻酔及び一般的な予防措置下で実行した。

【0152】

全エキソームの捕捉及び配列決定
患者番号１及び彼女の両親からのゲノムＤＮＡを、全エキソーム配列決定に供した（トリオ分析）。全エキソーム配列決定に利用される方法は、以前に詳細に記載されている（Ｌｕｐｓｋｉ、ら、２０１３年）。要約すれば、ゲノムＤＮＡ １ｍｇを、Ｃｏｖａｒｉｓプレート（Ｃｏｖａｒｉｓ、Ｉｎｃ．Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）中で超音波処理により断片化した。ゲノムＤＮＡサンプルを、記述されている通りＩｌｌｕｍｉｎａペアエンドライブラリに構築した（Ｌｕｐｓｋｉ、ら、２０１３年）。前捕捉ライブラリを、ＢＣＭ−ＨＧＳＣ ＣＯＲＥ ｅｘｏｍｅ ｃａｐｔｕｒｅ ｄｅｓｉｇｎと一緒にプールし、溶液中でハイブリダイズさせた（Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ、ら、２０１１年）（５２Ｍｂ、Ｎｉｍｂｌｅ−Ｇｅｎ）。捕捉したＤＮＡフラグメントを、１サンプルにつき９〜１０Ｇｂ産生するＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２０００プラットフォームで配列決定し、２０６以上の最少深度までカバーされる標的エキソーム塩基を平均９０％達成した。

【0153】

データ分析
産生した配列リードを、ＨＧＳＣ Ｍｅｒｃｕｒｙ分析パイプラインを使用してＧＲＣｈ３７（ｈｇ１９）ヒトゲノム参照アセンブリにマップし、整列した。Ａｔｌａｓ２スイートを使用してバリアントを決定し、コールして、バリアントコールファイル（ＶＣＦ）を産生した高品質のバリアントを、組織内で開発したアノテーションツールのスイートを使用してアノテーションした。

【0154】

サンガー配列決定
患者番号２のゲノムＤＮＡを、サンガー配列決定に供した。プライマー３を使用してＦＢＮ１遺伝子のイントロン−エクソン境界を含むエクソン６５及び６６を包含するようにプライマーを設計した。サンガーリードを、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ Ｓｅｑｍａｎソフトウェアを使用して分析した。

【0155】

動物
１０週齢の雄のＷＴ Ｃ５７／Ｂｌ６マウスを、全てのｉｎ ｖｉｖｏ研究に使用した。マウスを、檻当たり２〜５匹で、１２時間の明／１２時間の暗周期で、飼料及び水への不断の接近ありで飼育した。尾静脈注射により、マウスを、アデノウイルス媒介遺伝子導入（マウス当たり１０^１１個ウイルス粒子）に曝露した。皮下注射により、マウスに、２．６μＭ Ｈｉｓタグ組換えアスプロシン又は組換えＧＦＰを１０日間、毎日注射した。ウイルス注入又はペプチド注射の１０日間後にマウスを屠殺し、血漿及び様々な器官を摘出した。ベイラー医科大学動物飼育利用委員会は、全ての実験を承認した。

【0156】

ＦＢＮ１及びＧＦＰアデノウイルス
ＦＢＮ１ ｃＤＮＡを保有するアデノウイルスを、標準的なＡｄ５ベクター系を使用してＣＭＶプロモーターの制御下にＦＢＮ１コード領域をクローニングすることにより作った。対応するＧＦＰアデノウイルスを、ベイラー医科大学ベクター開発コアから購入した。

【0157】

組換えアスプロシン及びＧＦＰ
ヒトＦＢＮ１（２７３２〜２８７１アミノ酸）ｃＤＮＡを、クローニングし、大腸菌において発現させるためにｐＳＰＥプラスミドにその後サブクローニングした。大腸菌に発現させた融合タンパク質は、Ｎ末端に６個のアミノ酸Ｈｉｓタグ及び１４０アミノ酸の野生型Ｃ末端ＦＢＮ１（２７３２〜２８７１アミノ酸）から構成される長さ１４６アミノ酸である。ＨｉｓタグＧＦＰを、対照ポリペプチドとしてＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。

【0158】

身体組成及び血清分析
身体組成を、ＥＣＨＯ−ＭＲＩシステム（Ｅｃｈｏ ｍｅｄｉｃａｌ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｅｘａｓ）で分析した。マウス血清を、心穿刺によって得られる血液から調製し、ＣＯＢＡＳ Ｉｎｔｅｇｒａ ４００ ｐｌｕｓ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）で分析した。マウスレプチンＥＬＩＳＡキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＮＥＦＡ Ｃ テストキット（Ｗａｋｏ）、マウスアディポネクチンＥＬＩＳＡキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）及び血清／血漿トリグリセリド検出キット（Ｓｉｇｍａ）を使用することにより、血漿レプチン、ＦＦＡ、アディポネクチン及びトリグリセリドレベルをそれぞれ測定した。

【0159】

組織検査
マウス鼠径部脂肪組織サンプルを、Ｈ＆Ｅ染色のために１０％ホルムアルデヒドに固定した。凍結肝臓をオイルレッドＯ染色に使用して、肝臓トリグリセリド含有量を評価した。

【0160】

グルコース負荷試験（ＧＴＴ）及びインスリン負荷試験（ＩＴＴ）
ＧＴＴの場合、空腹期間の６時間後に１．５ｇグルコース／ｋｇ体重の腹腔内注射を実行した。ＩＴＴの場合、空腹期間の４時間後にレギュラーインスリン（ヒューマリンＲ；０．７５単位／ｋｇ体重）の腹腔内注射を投与した。血糖値を、血糖計（Ｌｉｆｅ Ｓｃａｎ）を使用して測定した。

【0161】

発現ベクター
ＷＴ ＦＢＮ１（アミノ酸１〜２８７１）、１４０アミノ酸アスプロシン（アミノ酸２７３２〜２８７１）及びＮ末端で天然の２７アミノ酸のＦＢＮ１シグナルペプチドと結合したアスプロシン（アミノ酸１〜２７＋アミノ酸２７３２〜２８７１）を、ｐＣＭＶ６−Ｎｅｏベクター系を使用してＣＭＶプロモーターの制御下にサブクローニングした。ＧＦＰを発現する同じベクター又は空のベクターを、対照として使用した。

【0162】

細胞培養
ＮＰＳ対象から単離したヒト皮膚線維芽細胞又は非罹患の対照対象由来ＷＴ皮膚線維芽細胞を、標準的なプロトコールを使用して脂肪生成分化に供した。脂肪生成を刺激するために、培地を２μＭインスリン、１μＭデキサメタゾン、０．２５ｍＭイソブチルメチルキサンチン及び１０−７Ｍロシグリタゾンで７日間補充した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ遺伝子導入には、発現プラスミドを用いる標準的なトランスフェクション方法を使用した。

【0163】

ＲＮＡ及びタンパク質分析
標準的なＲＮＡ抽出手順（Ｑｉａｇｅｎ製ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）を利用した。逆転写を、製造者のプロトコールを使用してＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して実施した。遺伝子発現分析の場合、ＱＰＣＲを、Ｒｏｃｈｅ製配列特異的プライマー及びプローブ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｌｉｂｒａｒｙ）を使用して実行した。ＴＢＰを、全ての遺伝子発現アッセイの内部対照として使用した。ウェスタンブロッティングを、アスプロシンに対した作られたマウスモノクローナル抗体を使用して血漿又は細胞培養培地に対して標準的な方法を使用して実行し、その抗体はＡｂｎｏｖａ（カタログ番号Ｈ００００２２００−Ｍ０１）から購入した。フィブリリン−１に対するマウスモノクローナル抗体を、Ａｂｃａｍ（カタログ番号ａｂ３０９０）から購入した。培地に対するウェスタンブロッティングの場合、細胞を７日間脂肪生成分化に供し、続いて誘導培地をＭｅｄｉａｔｅｃｈ製のＣｅｌｌｇｒｏ ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン、セレニウム）で補充した無血清ＤＭＥＭで３日間置き換える。そのとき、ウェスタンブロッティングを始める前に、培地を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−２ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒ ｕｎｉｔを使用して濃縮した。

【0164】

統計的方法
全ての結果を、平均±ＳＥＭとして示した。必要に応じて、Ｐ値を、対応のないスチューデントｔ−検定又はＡＮＯＶＡによって算出した。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１及び^＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【0165】

実施例２
フィブリリン−１ Ｃ末端ポリペプチドの機能獲得のｉｎ ｖｉｖｏ影響の決定。
フィブリリン−１タンパク質は、５０年前に同定された（Ｇｕｂａ、ら、１９６４年）。細胞外基質の維持におけるその機能（特に大動脈平滑筋における）並びに健康及び疾患におけるその役割について多くが公知である（Ｄａｖｉｓ及びＳｕｍｍｅｒｓ、ら、２０１２年；Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ、ら、１９９５年）。その構造は「モジュール状」であることが知られており、つまり、タンパク質の異なる部分における突然変異が異なる臨床予後をもたらす。そのように、その突然変異は、マルファン症候群、先端短肢異形成症、幸福顔貌骨異形成症、スティッフスキン症候群及びヴェィユ−マルケサーニ症候群と関連する（Ｄａｖｉｓ及びＳｕｍｍｅｒｓ、２０１２年）。全エキソーム配列決定及び既存の文献を使用して、それは、新生児早老症様症候群（ＮＰＳ）として公知の稀な、るい痩障害とも関連する。

【0166】

ＮＰＳは、皮下脂肪組織の急激な減少によりるい痩をもたらす常染色体優性遺伝性障害である（図１）（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ、ら、２００７年；Ｈｏｕ、ら、２００９年）。患者の表現型は、特にその脂肪異栄養に関して、古典的なマルファン症候群とは別であるが重複する（Ｇｒａｕｌ−Ｎｅｕｍａｎｎ、ら、２０１０年；Ｔａｋｅｎｏｕｃｈｉ、ら、２０１３年；Ｈｏｒｎ、ら、２０１１年；Ｇｏｌｄｂｌａｔｔ、ら、２０１１年）。従って、突然変異の部位及び型を、差異を説明するために特徴づけた。本開示において２例の患者を同定し、４例は以前に記載されており（Ｇｒａｕｌ−Ｎｅｕｍａｎｎ、ら、２０１０年；Ｔａｋｅｎｏｕｃｈｉ、ら、２０１３年；Ｈｏｒｎ、ら、２０１１年；Ｇｏｌｄｂｌａｔｔ、ら、２０１１年）全てが、ＦＢＮ１の最後から２番目のエクソンにおけるＣ末端トランケーション突然変異を有していた。これらの６つのトランケーション突然変異は、約８６００ｂｐの遺伝子において互いに７０ｂｐ以内ある。特に、脂肪異栄養は、ＦＢＮ１の他の部分に見つかった突然変異と関連して記述されてこなかったので、これらの変異体タンパク質の中で共有される特徴が、脂肪生物学に何らかの影響を及ぼすことは明らかである。これらの研究は、通常親タンパク質から切断され（Ｒｉｔｔｙ、ら、１９９９年；Ｒａｇｈｕｎａｔｈ、ら、１９９９年；Ｗａｌｌｉｓ、ら、２００３年；Ｍｉｌｅｗｉｃｚ、ら、１９９５年）、その後細胞から分泌されるそれぞれ独立に機能するフィブリリン−１ Ｃ末端ポリペプチドを明らかにした。予備実験は、Ｃ末端ポリペプチドのハプロ不全が、異常脂肪分化をもたらすことを示した。目的は、このポリペプチドの過剰発現が、ＷＴ及び脂肪異栄養症マウスの脂肪量を増やすのに十分かどうか特徴づけることである。これは、脂肪量の減少をもたらす全身性及び局所性両方の脂肪異栄養症状態に対し直接的な治療的意味を持ち得る。

【0167】

ｉｎ ｖｉｖｏ脂肪ホメオスタシスにおいてフィブリリン−１ Ｃ末端ペプチドが十分であるとする予測を吟味することができる。これらの研究は、脂肪増大能力に対するＣ末端ペプチドの影響を、組換えＣ末端ポリペプチド及びそのｃＤＮＡを保有するアデノウイルスで処理したマウスにおいて評価することができる。包括的な遺伝子発現及び代謝学データセットを得、それらに対しデータマイニングを行って、フィブリリン−１ Ｃ末端ポリペプチドによって利用される経路について試験可能な仮説を構築することができる。

【0168】

実験手法：
Ａ．マウスにおいて組換えフィブリリン−１ Ｃ末端ポリペプチド及びＧＦＰを注射する：
８週齢のＣ５７／Ｂｌ６ ＷＴ及びＰＰＡＲγヌル（脂肪異栄養症）マウスに、組換えＣ末端ポリペプチド又は組換えＧＦＰ ２０μｇを、皮下手法を使用して２日毎に合計５用量それぞれ注射する。組換えポリペプチドは、細菌発現その後の精製及びエンドトキシン除去を使用して以前に生成された。マウスにおける内在性血漿レベルを評価した予備データに基づいてそれぞれ２０μｇの用量を決定した。注射の１０日後に、性別を一致させた各群のマウス８匹を全てのアッセイにおいて比較した。

【0169】

Ｂ．マウスにおいてフィブリリン−１ Ｃ末端ポリペプチド及びＧＦＰを保有するアデノウイルスベクターを注射する：８週齢のＣ５７／Ｂｌ６ ＷＴ及びＰＰＡＲγヌル（脂肪異栄養症）マウスに、以前に生成した、シグナルペプチドに融合したＣ末端ポリペプチド（図１４）を発現するアデノウイルス又はＧＦＰを発現するアデノウイルスのそれぞれ１０１１個のウイルス粒子を注射した。この技術を使用する過去の経験に基づくと、アデノウイルス感染量の大部分は、肝臓を感染させることになる（Ｃｈｏｐｒａ、ら、２００８年；Ｃｈｏｐｒａ、ら、２０１１年）。肝細胞による過剰発現の後に、天然のフィブリリン−１シグナルペプチドと融合されたＣ末端ポリペプチドは、細胞によって分泌されるべきである。注射後２週間に、性別を一致させた各群のマウス８匹を、ポリペプチドの血漿レベルについて比較し、その後他の下流のアッセイを行った。

【0170】

Ｃ．体脂肪蓄積に対するＣ末端ポリペプチドの過剰発現の影響を測定する：
マウスを麻酔し、体重及び長さを記録する。それらをＤＥＸＡアナライザ（Ｏｏｓｔｉｎｇ、ら、２０１２年）に入れ、正確な測定スキャンを実行する前にスカウトスキャンを実行する。マウス当たりの照射線量を、３００μＳｖでセットする。データの分析にあたって、対象の領域を定義する。分析は、頭部範囲を除く全身測定を含むことができる。ソフトウェアによりカウントデータを、骨及び非骨成分に転換する。情報は、各マウスの体重、身長、骨及び脂肪量、骨量密度並びに非脂肪量について生成される。ＤＥＸＡ測定及び分析は、ＢＣＭの「Ｍｏｕｓｅ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ」で実行する。安楽死後に、鼠径部脂肪体を抽出し、撮影し、計量する。

【0171】

Ｄ．不偏的な血漿代謝物質プロファイリングを実行することにより包括的な代謝変化に対するＣ末端ポリペプチドの過剰発現の影響を測定する：
フィブリリン−１ Ｃ末端ポリペプチドの過剰発現の結果として生物全体での、代謝変化を同定するために、ＲＮＡｓｅｑを利用する。絶食及び給餌したマウスからのＥＤＴＡ血漿を、瀉血によって採集する。凍結し、暗号化したサンプルを、Ｍｅｔａｂｏｌｏｎ、Ｉｎｃ．（Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）に送り、本来の供給源とだけ関連する固有の識別子によってＭｅｔａｂｏｌｏｎシステムに登録する。品質管理の目的で回収標準を抽出過程の第１の工程の前に添加する。サンプル調製は、小分子の回収を最大にしつつタンパク質を除去するための一連の専用の有機及び水性抽出を使用する。抽出したサンプルを、ガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）及び液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）プラットフォームによる分析用として等量ずつに分ける。操作に関するいくつかの反復サンプルを、各サンプルを少量含有する均一なプールから作る。生のＭＳデータファイルを、リレーショナルデータベースにロードする。ピークを、Ｍｅｔａｂｏｌｏｎの専用のピーク組み込みソフトウェアを使用して同定し、コンポーネント部分を、別々の特別に設計された複合データ構造体に保管する。化合物を、精製した標準のライブラリ項目又は反復性の未知の物質に対する比較によって同定する。公知の化学物質の同定は、ＬＣ及びＧＣ両方のプラットフォームへの配布のためにＬＩＭＳに登録されている市販され、精製されている１，０００個超の標準化合物との比較に基づく。実態的統計学は、分類変数及び連続変数に対する平均±標準偏差（平均±ＳＤ）の度数によって示され、その後ボンフェローニ事後検定分析して統計的有意性を得る。この技術を使用して、様々なクラス（アシルカルニチン、有機酸、アミノ酸、ペプチド、イオン等）のおよそ３０００個の別々の血漿代謝産物を、不偏的様式で同時にアッセイすることができる。

【0172】

Ｅ．ＲＮＡｓｅｑを使用して包括的な遺伝子発現のレベルで、脂肪ホメオスタシスに対するＣ末端ポリペプチドの脂肪特異的過剰発現の影響を評価する：
フィブリリン−１ Ｃ末端ポリペプチドの過剰発現の結果として脂肪組織におけるゲノム全体での、転写変化を同定するために、ＲＮＡｓｅｑを利用する。総ＲＮＡを、以前に急速冷凍した鼠径部脂肪組織から単離する。配列決定反応を、個別の５匹のマウス鼠径部白色脂肪細胞に由来のプールしたＲＮＡサンプルで行う。４レーンのフローセルを、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩによるサンプルの配列決定に使用する。Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＧＡ）は、３８サイクル行う。サイクル１〜３８におけるＧＡからの画像をＧＡパイプラインソフトウェア（ｖ１．３、Ｉｌｌｕｍｉｎａソフトウェア）で分析して、画像分析、ベースコール及び参照ゲノムに対する配列整列化を行う。配列は、ＥＬＡＮＤソフトウェアで整列化する。整列させたリードをＩｌｌｕｍｉｎａ ＣＡＳＡＶＡプログラム（ｖ１．０）の入力として使用して、参照ゲノムの遺伝子、エクソン及びスプライス結合部位に整列する配列リードを計数する。諸特徴（遺伝子、エクソン及びスプライス結合部位）に整列している配列の生の計数を、対応するその特徴の長さで生の計数を割ることによりＣＡＳＡＶＡによって標準化する。ＤＥＧｓｅｑ及びＤＥｓｅｑの入力として遺伝子当たりのリード計数を使用して、差次的に発現している遺伝子を同定する。両方のツールが、統計パッケージＲ及びＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒによって利用可能である。ＤＥＧｓｅｑ及びＤＥＳｅｑは、異なる統計的手法（ポアソン分布、負の二項分布）を使用して、差次的遺伝子発現の確率を評価する。Ｐ≦０．００１及び発現レベルにおける２倍の変化（標準化した）を、カットオフ基準として使用する。

【0173】

特定の実施形態において、本明細書に記述される研究は、対をなす過程、つまり脂肪増大及び炎症にとって、フィブリリン−１ Ｃ末端ポリペプチドが十分であることを確立すると期待できる。同じ評価項目を評価する目的で、２つの機能獲得手法が本明細書に記述される。一方の手法が失敗しても、他方が決定的結果を与えると期待される。血漿中の天然のポリペプチドの半減期に関する情報の不足により、ペプチドの大部分が速やかに分解する場合、組換えポリペプチド実験は失敗する可能性がある。その場合、アデノウイルス媒介遺伝子導入手法は、十分量のポリペプチドを一定に産生することによりこの問題を回避して、機能獲得をもたらすと期待される。まさしくその性質により、過剰発現実験は、試験されるタンパク質の真の機能を反映しない生理的状態を作り出してしまう可能性を有する。従って、それらは注意深く解釈し、可能ならば、同時に行う機能消失研究との関連で解釈する必要がある。本明細書に提唱される機能獲得及び機能消失研究の総体的な解釈により、フィブリリン−１ Ｃ末端ポリペプチドの真のｉｎ ｖｉｖｏ機能について正しい結論を導き出すことを可能にすることができる。

【0174】

実施例３
フィブリリン−１ Ｃ末端ポリペプチドの機能消失のｉｎ ｖｉｖｏの影響を決定する。
フィブリリン−１タンパク質は、酵素のフーリン／ＰＡＣＥファミリーによるタンパク質分解プロセッシングを受けることが示されているＣ末端切断部位（ＲＧＲＫＲＲモチーフ）を含有する（Ｒｉｔｔｙ，ら、１９９９年；Ｒａｇｈｕｎａｔｈ、ら、１９９９年；Ｗａｌｌｉｓ、ら、２００３年；Ｍｉｌｅｗｉｃｚ、ら、１９９５年）。この結果、２つのフラグメント、即ち細胞外基質への適当な挿入のための切断事象によって決まる機能的フィブリリン−１（約２５００アミノ酸）（Ｒａｇｈｕｎａｔｈ、ら、１９９９年；Ｍｉｌｅｗｉｃｚ、ら、１９９５年）、及びそれ独自の機能が未知のより小さいＣ末端ポリペプチド（約１４０アミノ酸）を得られる。ＮＰＳ表現型をもたらすＦＢＮ１におけるヘテロ接合性突然変異の６つ全てに共通の結果は、Ｃ末端ポリペプチドの大多数の減少である。実際にＣ末端フラグメントのハプロ不全が表現型に関与する場合、そのフラグメントをその正常レベルに復元することにより、表現型をレスキューするはずである。この考えがｉｎ ｖｉｔｒｏで検討され、Ｃ末端ポリペプチドの発現を回復させること、並びに単純に培地に添加することによってＣ末端ポリペプチドに変異体細胞を曝露することが、ＮＰＳ関連の脂肪分化及び炎症誘発性異常をレスキューすることが判明した（図１５）。

【0175】

類似の手法が、ｉｎ ｖｉｖｏ利用される。循環Ｃ末端ポリペプチド（図１６）を、モノクローナル抗体を使用して免疫学的に捕捉して、脂肪増大の必要性並びに肥満及びメタボリックシンドロームに対する予防の可能性を解明する。これは、純然たる脂肪増大に起因する状態である、肥満及びメタボリックシンドロームの両方に対して直接的な治療的意味を有する。

【0176】

実験的な手法：
Ａ．ＷＴ及び遺伝的肥満マウスを、フィブリリン−１ Ｃ末端ポリペプチドを標的にしているモノクローナル抗体に曝露する：
８週齢のＣ５７／Ｂｌ６ ＷＴ及びｏｂ／ｏｂ（機能消失レプチン突然変異で肥満マウス）マウスに、抗−ＣＴ−フィブリリン−１ ＩｇＧ又は非特異的ＩｇＧ ５００μｇを、腹膜内手法を使用して毎日、合計５用量注射する。フィブリリン−１ Ｃ末端抗体を標的しているモノクローナル抗体は、Ｓｉｇｍａ Ｉｎｃ．から以前に入手し、組織内で確認した。注射の１０日後に、性別を一致させた各群のマウス８匹を全てのアッセイにおいて比較した。

【0177】

Ｂ．体脂肪蓄積に対するＣ末端ポリペプチドの減少の影響を測定する：
体脂肪蓄積に対するフィブリリン−１ Ｃ末端ポリペプチドの中和の影響は、目的１Ｃに記載の通りＤＥＸＡスキャン及び鼠径部脂肪パッド体重を使用して測定される。抗−ＣＴ−フィブリリン−１ ＩｇＧ及び対照ＩｇＧに曝露した性別を一致させた８週齢のＷＴ並びにｏｂ／ｏｂマウス８匹を、評価する。

【0178】

Ｃ．不偏的な血漿代謝物質プロファイリングを実行することにより包括的な代謝変化に対するＣ末端ポリペプチドの減少の影響を測定する：
抗−ＣＴ−フィブリリン−１ ＩｇＧ及び対照ＩｇＧに曝露した性別を一致させた８週齢のＷＴ並びにｏｂ／ｏｂマウス８匹に由来のＥＤＴＡ血漿を、瀉血によって採集する。代謝学分析を、目的１Ｄに記載の通り実行する。

【0179】

Ｄ．ＲＮＡｓｅｑを使用して包括的な遺伝子発現のレベルで、脂肪ホメオスタシスにおけるフィブリリン−１ Ｃ末端ポリペプチドの減少の影響を評価する：
総ＲＮＡを、抗−ＣＴ−フィブリリン−１ ＩｇＧ及び対照ＩｇＧに曝露した性別を一致させた８週齢のＷＴ並びにｏｂ／ｏｂマウス１５匹に由来の以前に急速冷凍した鼠径部脂肪組織から単離する。配列決定反応を、個別の５匹のマウス鼠径部白色脂肪細胞に由来のプールしたＲＮＡサンプルで行う（Ｎ＝３）。本明細書の他の部分に記述されるように、ＲＮＡｓｅｑ分析を行う。

【0180】

特定の実施形態において、本明細書に記述される研究は、フィブリリン−１ Ｃ末端ポリペプチドが脂肪増大のために必要であり、肥満に対して予防的であることを確立すると期待することができる。フィブリリン−１ Ｃ末端ポリペプチドを標的とするモノクローナル抗体を使用して検討された研究は、それが遺伝子除去研究であった場合ほどには明快ではない。しかしながら、目的が、肥満に対する治療法としてそのようなモノクローナル抗体の使用を研究することであるとすると、少なくともいくつかの実施形態において、非特異的抗体と比較してこれを試験することは重要である。この手法が、肥満に対するそのような抗体の予防的役割を確立する実施形態において、それらの結果は、例えば遺伝的なノックアウト研究で確認される。

【0181】

実施例４
図１７は、血漿ＣＴポリペプチド（アスプロシン）量の増加が、アスプロシンを注射したマウスにおける過食症を引き起こすことを示す。本開示の実施形態において、方法は、体重を増やす又は脂肪量を増加させる必要がある個体にＣＴポリペプチドを有効量与えることを含む。

【0182】

ＮＰＳ若しくは不十分な脂肪量を有する個体の別の病状の個体において、個体は、ＮＰＳ又はそのような病状がない別の個体と比較して、毎日のカロリー負荷の消費が減少している可能性がある。これらの個体に関する特定の実施形態において、これらの個体の食欲を増加させることによるなど毎日のカロリー負荷を増加させるために、その実施形態では、これらの個体に、アスプロシン又はその機能的誘導体を有効量与えることができる。

【0183】

実施例５
本開示の実施形態の重要性
レプチンの発見は、極端な体重をもたらす遺伝性障害が、肥満、糖尿病及びメタボリックシンドロームの理解において非常に有益になる可能性があることを示す（Ｆｒｉｅｄｍａｎ、２００９年）。最適な脂肪量の維持に必要であり、その起源が細胞外基質タンパク質であるフィブリリン−１と関連する新規のポリペプチドホルモン、アスプロシンについて本明細書に記述する。この点では、アスプロシンは、エンドスタチン、即ち異なる細胞外基質タンパク質であるコラーゲンＸＶＩＩＩのＣ末端切断産物である血管形成調節因子に似ている（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ、ら、１９９７年）。従って、いくつかの細胞外基質成分が、親タンパク質とは別の機能があるＣ末端切断産物の担体として進化した可能性があると考えることは合理的であり得る。

【0184】

これまでのいくつかの研究は、どのようにプロフィブリリンが分泌され、フーリンプロテアーゼ系によって細胞外で切断される可能性が高いかを示した（Ｇｒａｕｌ−Ｎｅｕｍａｎｎ、ら、２０１０年；Ｈｏｒｎ及びＲｏｂｉｎｓｏｎ、２０１１年；Ｇｏｌｄｂｌａｔｔ、ら、２０１１年；Ｔａｋｅｎｏｕｃｈｉ、ら、２０１３年；Ｊａｃｑｕｉｎｅｔ、ら、２０１４年）。この切断事象は、フィブリリン−１の正しいプロセッシング及び細胞外基質への挿入に必要である（Ｇｒａｕｌ−Ｎｅｕｍａｎｎ、ら、２０１０年；Ｈｏｒｎ及びＲｏｂｉｎｓｏｎ、２０１１年；Ｇｏｌｄｂｌａｔｔ、ら、２０１１年；Ｔａｋｅｎｏｕｃｈｉ、ら、２０１３年；Ｊａｃｑｕｉｎｅｔ、ら、２０１４年）。しかしながら、他の切断産物、１４０アミノ酸Ｃ末端ポリペプチドの消長は、依然として未知であった。本開示の実施形態において、ＮＰＳ患者の遺伝子型は、Ｃ末端ポリペプチドであるアスプロシンが、脂肪生物学において重要な役割を有する可能性を示唆した。この開示のデータは、アスプロシンが循環血液中に存在し、最適な脂肪量の維持に必要であることを示す。マウスにおいて過度のアスプロシンは、脂肪増加並びに肥満及び低い代謝健全性の特徴であるグルコース不耐性の発症をもたらすが、ヒトにおいてアスプロシンの減少は脂肪異栄養をもたらす。実際、マウス及びヒトで低い代謝健全性と相関する肥満状態において、循環アスプロシンのレベルは上昇している。反対に、皆無かそれに近い循環アスプロシンを有するＮＰＳ患者の表現型がるい痩及びインスリン感受性を示すことは、いくつかの実施形態において、アスプロシンを低下させることが、正の代謝性プロファイルに有利に働くことを示す。これは、インスリン抵抗性をもたらすいくつかの型の脂肪異栄養と対照的である（Ｎｏｌｉｓ、ら、２０１３年）。

【0185】

一実施形態において、ＮＰＳにおけるインスリン感受性が保持されるということは、おそらくインスリンに応答するグルコース取り込み能力を保持する特定の脂肪細胞、特に臀筋範囲が残っているのである。別の実施形態において、マウスにおいてアスプロシン自体がインスリン抵抗性を促進し、従って、ＮＰＳにおけるその不在は、直接のインスリン感作効果を有し得る。

【0186】

データは、ＮＰＳにおける循環アスプロシンの、ＮＰＳ遺伝子型から予測されるそれを越える極度の減少が、少なくとも部分的には、ナンセンス変異依存分解を回避し細胞内にトラップされた変異体プロフィブリリンの優性阻害効果の結果であることを示す。特定の実施形態において、これが、遺伝子全体の欠失、非トランケーション突然変異又はフーリン切断部位に近位のトランケーション突然変異によりマルファン症候群を引き起こすが、ＮＰＳを特徴づける脂肪異栄養の追加の特徴を生じない理由である（Ｐｙｅｒｉｔｚ、ら、２００９年）。

【0187】

アスプロシンは、２つの理由で注目すべきである。外部からのアスプロシンに曝露したマウスは、ちょうど１０日間で脂肪量及びインスリン抵抗性の増加を示した。注目すべきは、これは高脂肪食ではなく標準の食事で達成された。第２には、そのコード領域は、プロフィブリリンの残りと比較して極めて高い進化的保存を示す。これは、細胞表面レセプターによって媒介される可能性がある高度に保存された機能を示す。そのような仮定の受容体の同一性は、まだ公知でない。その発現プロファイルに基づくと、脂肪組織はアスプロシン産生及び分泌のより優性な部位の１つである可能性が高いので、アスプロシンが、脂肪細胞分化にも必要であることは逆説的のように思われる。しかしながら、自身を産生する器官を調節するのに役立つ分子の例は無数にある。脂肪生成分化並びに脂肪量の増加の他に、いくつかの実施形態において、アスプロシンは、脂肪及びおそらく他の組織の他の機能も調節する。実際、グルコースホメオスタシスがアスプロシンの媒介で妨げられることが、脂肪量の改変又は脂肪活性の改変による効果なのかは、依然として不明である。

【0188】

結果は、興味深い治療的手立てを提供する。最も明らかなものは、ＮＰＳ患者における欠損を単に修正することである。しかしながら、組換えアスプロシンは、例えば高齢、癌、ＨＩＶ感染等のような、多様な病因に伴う悪液質がある患者に有用である。そのような患者は、他の原因の中でも特に脂肪量減少により著しく虚弱になり（Ｍｕｅｌｌｅｒ、ら、２０１４年；Ｐｕｒｅｚａ及びＦｌｏｒｅａ、２０１３年；Ｇｅｌａｔｏ、ら、２００７年；Ａｇａｒｗａｌ、ら、２０１３年；Ｋｕｌｓｔａｄ及びＳｃｈｏｅｌｌｅｒ、２００７年）、アスプロシンによって与えられる脂肪増加の恩恵をうける可能性がある。反対に、循環アスプロシンを低下させると、肥満及び糖尿病の患者における脂肪量の減少並びに血糖制御の改善がもたらされる可能性がある。特定の実施形態において、ＮＰＳ関連脂肪異栄養及び肥満は、一方でほとんど無く、他方で過大な結果になるアスプロシン方程式の２つの結果である。いずれにせよ、本開示の特定の実施形態で、病理学的に改変された脂肪量の状態における循環アスプロシンレベルを修正することにより、著しい治療的有用性が得られる。

【0189】

参照文献
本明細書に記載の特許及び刊行物の全ては、本発明に関係する当業者のレベルの指標となる。特許並びに刊行物の全ては、各個の刊行物が参照により組み込まれることが特別に及び個々に示される場合と同程度に参照により本明細書に組み込む。
Ａｇａｒｗａｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｍａｔｕｒｉｔａｓ ７６，２９６−３０２（２０１３）．
Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１２，Ｒ６８（２０１１）．
Ｃｈｏｐｒａ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２：１３９５−９９（２００８）．
Ｃｈｏｐｒａ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．１３：３５−４３（２０１１）．
Ｄａｖｉｓ＆Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ １０７，６３５−６４７（２０１２）．
Ｅｓｐｏｓｉｔｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｔｉｃ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃ Ｓｕｒｇ．１１８：１０４８−１０５７（２００６）．
Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ８９，９７３Ｓ−９７９Ｓ（２００９）．
Ｇｅｌａｔｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｔｈｅｒ．２９（１１）：２２６９−８８，２００７．
Ｇｏｌｄｂｌａｔｔ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．Ａ １５５，７１７−７２０（２０１１）．
Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ＆Ｂｒｏｗｎ，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２９，４３１−４３８（２００９）．
Ｇｒａｕｌ−Ｎｅｕｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．Ａ １５２Ａ，２７４９−２７５５（２０１０）．
Ｇｕｂａ＆Ｈａｒｓａｎｙｉ，Ｋｉｓｅｒｌｅｔｅｓ ｏｒｖｏｓｔｕｄｏｍａｎｙ １６：２８−３４（１９６４）．
Ｈｏｒｎ＆Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．Ａ １５５，７２１−７２４（２０１１）．
Ｈｏｕ，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ ａｎｄ ｎｅｏｎａｔｏｌｏｇｙ ５０，１０２−１０９（２００９）．
Ｊａａｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７，ｅ３８８３３（２０１２）．
Ｊａｃｑｕｉｎｅｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ ５７，２３０−２３４（２０１４）．
Ｊｅｎｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １１１，１０１５５−１０１６０（２０１４）．
Ｋｕｌｓｔａｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ Ｍｅｔａｂ Ｃａｒｅ．１０（４）：４８８−９３，２００７．
Ｌｏｅｙｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．４７，４７６−４８５（２０１０）．
Ｌｕｐｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄ ５，５７（２０１３）．
Ｍａｌｉｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ９，１３−２７（２０１３）．
Ｍｉｌｅｗｉｃｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５，２３７３−２３７８（１９９５）．
Ｍｏｒｇｅｎ＆Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １０，５１３−５１４（２０１４）．
Ｍｕｅｌｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｒｏｌ．２０（２８）：９３６１−７３，２０１４．
Ｎｏｌｉｓ，Ｊ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔ．５９，１６−２３（２０１３）．
Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．Ａ １４３Ａ，１４２１−１４３０（２００７）．
Ｏｏｓｔｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｄ Ｒｅｓ．７２：３６２−９（２０１２）．
Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ８８，２７７−２８５（１９９７）．
Ｐｕｒｅｚａ＆Ｆｌｏｒｅａ，Ｃｕｒｒ Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌ Ｒｅｐ １０，３０７−３１４（２０１３）．
Ｐｙｅｒｉｔｚ，Ｈｅａｒｔ ９５，１７３−１７５（２００９）．
Ｒａｇｈｕｎａｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｌｌ ｓｃｉｅｎｃｅ １１２（Ｐｔ ７），１０９３−１１００（１９９９）．
Ｒａｊａｌａ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．１４４：３７６５−７３（２００３）．
Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ．１９２：１３８−４３，ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ １４３−１２７（１９９５）．
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０．
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５．
Ｒｉｔｔｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７４，８９３３−８９４０（１９９９）．
Ｒｏｃｈａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｒｄｉｏｌ ６：３９９−４０９（２００９）．
Ｓｈｏｅｌｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｒｏｌ．１３２：２１６９−８０（２００７）．
Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ＆Ｆｌｉｅｒ，Ｃｅｌｌ １０４，５３１−５４３（２００１）．
Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ＆Ｆｌｉｅｒ，Ｃｅｌｌ ８７，３７７−３８９（１９９６）．
Ｔａｋｅｎｏｕｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．Ａ １６１，３０５７−３０６２（２０１３）．
Ｔｒａｙｈｕｒｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｕｔｒ．１３６：１９３５Ｓ−３９Ｓ（２００６）．
Ｗａｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９０，６４１−６５２（２００３）．
Ｘｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１１２：１８２１−３０（２００３）．
Ｚｅｙｄａ＆Ｓｔｕｌｎｉｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｒｏｎｔｏｌ ５５：３７９−８６（２００９）．

【0190】

本発明及びその利点を詳細に記述したが、添付の請求の範囲によって定義される通り本発明の精神と範囲から逸脱することなく本明細書に様々な変化、置換及び変更を作り得ることを理解すべきである。更に、本出願の範囲は、本明細書に記述される過程、機械、製造、組成物、手段、方法及び工程の特定の実施形態に限定されることを意図していない。当業者が本発明の開示から容易に認識することになるように、本明細書に記述される対応する実施形態と実質的に同じ機能を実行する又は実質的に同じ結果を達成する現存の若しくは後に開発される過程、機械、製造、組成物、手段、方法、若しくは工程は、本発明に従って利用され得る。従って、添付の請求の範囲は、そのような過程、機械、製造、組成物、手段、方法、又は工程をその範囲内に含むことを意図される。

【図1A-1D】

【図2A-2C】

【図3A-3D】

【図4A-4H】

【図5A-5J】

【図6A-6D】

【図7A-7B】

【図8A-8B】

【図9A-9D】

【図10A-10D】

【図11A-11D】

【図12A-12B】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]