特許 6670251 小胞体ストレス抑制剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6670251

(24)【登録日】2020年3月3日

(45)【発行日】2020年3月18日

(54)【発明の名称】小胞体ストレス抑制剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/745 20150101AFI20200309BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20200309BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20200309BHJP

【ＦＩ】

   A61K35/745

   A61P43/00 105

   A61P9/00

【請求項の数】2

【全頁数】11

(21)【出願番号】特願2016-560271(P2016-560271)

(86)(22)【出願日】2015年11月18日

(86)【国際出願番号】JP2015082424

(87)【国際公開番号】WO2016080449

(87)【国際公開日】20160526

【審査請求日】2018年6月5日

(31)【優先権主張番号】特願2014-234388(P2014-234388)

(32)【優先日】2014年11月19日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000006884

【氏名又は名称】株式会社ヤクルト本社

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100077562

【弁理士】

【氏名又は名称】高野 登志雄

(74)【代理人】

【識別番号】100096736

【弁理士】

【氏名又は名称】中嶋 俊夫

(74)【代理人】

【識別番号】100117156

【弁理士】

【氏名又は名称】村田 正樹

(74)【代理人】

【識別番号】100111028

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 博人

(72)【発明者】

【氏名】秋山 拓哉

(72)【発明者】

【氏名】大石 憲司

(72)【発明者】

【氏名】ウラールト アンディ

【審査官】 長谷川 茜

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１３／１４４０８０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開平０８−０５９４９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−２４２４３０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１２／０４３５３２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開平１１−０３２７６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 HORMANNSPERGER G., et al.，Molecular crosstalk of probiotic bacteria with the intestinal immune system: clinical relevance in the context of inflammatory bowel disease，Int. J. Med. Microbiol.，２０１０年，Vol.300 No.1，pp.63-73

【文献】 LE, Thi Kim Chung, et al.，Oral administration of Bifidobacterium spp. improves insulin resistance, induces adiponectin, and prevents inflammatory adipokine expressions，Biomed. Res.，２０１４年１０月，Vol.35 No.5，pp.303-310

【文献】 南野哲男ら，小胞体ストレス［小胞体ストレスと心臓病］，細胞，２０１３年，Vol.45 No.4，pp.180-183

【文献】 河野望ら，飽和脂肪酸と小胞体ストレス応答，医学のあゆみ，２０１４年 ３月，Vol.248 No.13，pp.1178-1183

【文献】 江川斉宏ら，小胞体ストレスと疾患 小胞体ストレスと神経疾患，月刊メディカル・サイエンス・ダイジェスト，２００７年，Vol.33 No.13，pp.1217-1220

【文献】 熊谷天哲ら，小胞体ストレス［小胞体ストレスと腎臓病］，細胞，２０１３年，Vol.45 No.4，pp.184-188

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３５／７４５

Ａ２３Ｌ ３３／１３５

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ビフィドバクテリウム・アドレセンティスの加熱死菌体を有効成分とする小胞体ストレス抑制剤。

【請求項2】

ビフィドバクテリウム・アドレセンティスが、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＹＩＴ４０１１株（ＡＴＣＣ１５７０３）である請求項１記載の小胞体ストレス抑制剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、心筋症等に関与している小胞体ストレスの抑制剤に関する。

【背景技術】

【0002】

種々の原因により高次構造に折り畳まれなかった異常蛋白(unfolded protein)が小胞体に集積すると小胞体ストレス反応が起こり、分子シャペロンなどの産生増加、一般の蛋白の翻訳抑制、ユビキチン−プロテアソーム系による異常蛋白の分解が亢進する。通常は、こうして小胞体への異常蛋白の集積が軽減されるが、この蛋白質処理管理機構の処理能力以上に異常蛋白が小胞体に集積すると、細胞内外で異常蛋白の凝集、集積が起こり、細胞機能不全、細胞死が起こると考えられている。このような小胞体ストレス反応は、心筋症等に深く関与していることが知られている。

【0003】

小胞体ストレスに起因する疾患の予防治療薬としては、ＡＳＫ１阻害剤（特許文献１）、桑黄由来の脂溶性抽出成分（特許文献２）、抑肝散（特許文献３）等が報告されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】国際公開第２００２／３８１７９号

【特許文献2】特開２００６−３４２０７７号公報

【特許文献3】特開２０１１−０３７７２２号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかしながら、前記の小胞体ストレス抑制剤は、その効果が明らかでなかったり、安全性の面で不明なものが多かった。また、プロバイオティクスが小胞体ストレス抑制作用を有することは全く報告されていなかった。
従って、本発明の課題は、安全でかつ優れた効果を有する小胞体ストレス抑制剤を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0006】

そこで本発明者は、プロバイオティクスに着目して小胞体ストレス抑制剤を探索したところ、ビフィドバクテリウム属細菌が強い小胞体ストレス抑制作用を有することを見出し、本発明を完成した。

【0007】

すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔１２〕を提供するものである。
〔１〕ビフィドバクテリウム属細菌及び／又はその菌体処理物を有効成分とする小胞体ストレス抑制剤。
〔２〕ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム及びビフィドバクテリウム・ロンガムから選ばれる１種以上である〔１〕記載の小胞体ストレス抑制剤。
〔３〕ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１２２７２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３２０）、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１０００１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−８２０５）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＹＩＴ４０１１株（ＡＴＣＣ１５７０３）、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＹＩＴ１０３４７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６１３）及びビフィドバクテリウム・ロンガムＹＩＴ４０２１株（ＡＴＣＣ１５７０７）から選ばれる１種以上である〔１〕又は〔２〕記載の小胞体ストレス抑制剤。
〔４〕小胞体ストレス抑制剤製造のための、ビフィドバクテリウム属細菌及び／又はその菌体処理物の使用。
〔５〕ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム及びビフィドバクテリウム・ロンガムから選ばれる１種以上である〔４〕記載の使用。
〔６〕ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１２２７２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３２０）、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１０００１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−８２０５）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＹＩＴ４０１１株（ＡＴＣＣ１５７０３）、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＹＩＴ１０３４７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６１３）及びビフィドバクテリウム・ロンガムＹＩＴ４０２１株（ＡＴＣＣ１５７０７）から選ばれる１種以上である〔４〕又は〔５〕記載の使用。
〔７〕小胞体ストレスを抑制するための、ビフィドバクテリウム属細菌及び／又はその菌体処理物。
〔８〕ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム及びビフィドバクテリウム・ロンガムから選ばれる１種以上である〔７〕記載の細菌及び／又はその菌体処理物。
〔９〕ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１２２７２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３２０）、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１０００１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−８２０５）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＹＩＴ４０１１株（ＡＴＣＣ１５７０３）、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＹＩＴ１０３４７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６１３）及びビフィドバクテリウム・ロンガムＹＩＴ４０２１株（ＡＴＣＣ１５７０７）から選ばれる１種以上である〔７〕又は〔８〕記載の細菌及び／又はその菌体処理物。
〔10〕ビフィドバクテリウム属細菌及び／又はその菌体処理物の有効量を投与することを特徴とする、小胞体ストレスの抑制方法。
〔11〕ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム及びビフィドバクテリウム・ロンガムから選ばれる１種以上である〔１０〕記載の方法。
〔12〕ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１２２７２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３２０）、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１０００１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−８２０５）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＹＩＴ４０１１株（ＡＴＣＣ１５７０３）、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＹＩＴ１０３４７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６１３）及びビフィドバクテリウム・ロンガムＹＩＴ４０２１株（ＡＴＣＣ１５７０７）から選ばれる１種以上である〔１０〕又は〔１１〕記載の方法。

【発明の効果】

【0008】

本発明の小胞体ストレス抑制剤は、安全性が高く、かつ強い小胞体ストレス抑制作用を有していることから、心筋症等の予防治療剤として有用である。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】ツニカマイシン１０μｇ／ｍＬ添加によるＣａｃｏ−２単層のＴＥＥＲ値の変化を示す。

【図2】ツニカマイシン刺激後のＣａｃｏ−２単層におけるＧｒｐ７８の発現のウエスタンブロッティングを示す。下段はβＡｃｔｉｎ（ローディング・コントロール）の発現のウエスタンブロッティング。

【図3】小胞体ストレスによって引き起こされるＣａｃｏ−２単層の膜透過性の亢進に対するビフィドバクテリウム（ＹＩＴ１０００１株）の効果を示す（頂端側からツニカマイシン刺激）。

【図4】小胞体ストレスによって引き起こされるＣａｃｏ−２単層の膜透過性の亢進に対するビフィドバクテリウム（ＹＩＴ１０００１株）の効果を示す（基底側からツニカマイシン刺激）。

【図5】小胞体ストレスによって引き起こされるＣａｃｏ−２単層の膜透過性の亢進に対する各種ビフィドバクテリウムの効果を示す（頂端側からツニカマイシン刺激）。

【図6】小胞体ストレスマーカー（ＣＨＯＰ）の発現に対するビフィドバクテリウム（ＹＩＴ４００１株、ＹＩＴ１０３４７株）の効果を示す。下段はβＡｃｔｉｎ（ローディング・コントロール）の発現のウエスタンブロッティング。

【図7】各種ビフィドバクテリウムのＣａｃｏ−２単層内のＵＧＧＴ ｍＲＮＡの発現に対する効果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0010】

本発明の小胞体ストレス抑制剤の有効成分は、ビフィドバクテリウム属細菌及び／又はその菌体処理物である。

【0011】

ビフィドバクテリウム属細菌としては、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム及びビフィドバクテリウム・ロンガムから選ばれる１種以上が好ましい。これらのビフィドバクテリウム属細菌のうち、さらにビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１２２７２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３２０）、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１０００１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−８２０５）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＹＩＴ４０１１株（ＡＴＣＣ１５７０３）、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＹＩＴ１０３４７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６１３）及びビフィドバクテリウム・ロンガムＹＩＴ４０２１株（ＡＴＣＣ１５７０７）から選ばれる１種以上が好ましい。

【0012】

本発明で用いるビフィドバクテリウム属細菌の調製方法は、特に限定されるものではなく、常法に従って行えばよい。
例えば、本発明に用いるビフィドバクテリウム属細菌は、当該細菌の種菌を増殖可能な培地に接種して培養し、培養後遠心分離やろ過等の菌体を単離・精製する手段を用いて調製することができる。また、当該細菌は、得られる生菌体をそのままで使用できる他、菌体を凍結乾燥した物、生菌体に加熱処理やアルコール処理等を施した死菌体、当該菌体を含む培養物、菌体からの抽出物やその分画物或いは更にそれらを粉砕等により加工した物ならびにこれらの混合物等に調製し、使用できる。
また、ビフィドバクテリウム属細菌の調製の際に増殖可能な培地として経口的に摂取可能な培地を用いる場合には、当該細菌を含む培養物をそのまま或いは加熱処理などの加工処理を施したものを本発明の小胞体ストレス抑制剤の有効成分として使用してもよい。

【0013】

ここで、ビフィドバクテリウム属細菌の増殖可能な培地としては、特に制限されるものではなく、有機・無機の各種栄養源から構成される栄養培地、例えば、ＧＡＭ培地、ＭＲＳ培地、ＢＬ培地等を挙げることができる。また、これら以外にも、牛乳、山羊乳等の獣乳や脱脂乳、粉乳、脱脂粉乳、生クリーム等の乳製品、豆乳、大豆粉等の大豆加工品を好適な培地として用いることができ、これらはそのまま或いは必要に応じて適当な濃度に希釈または濃縮等して使用すればよい。なお、培地のｐＨは、特に制限されない。

【0014】

一般に、ビフィドバクテリウム属細菌は、培地の種類によって、増殖性が必ずしも良好でない場合があるため、必要に応じて前記培地に、酵母エキス、大豆ペプチド、その他発酵助剤となり得る公知のビフィドバクテリウム属細菌の生育促進物質やビタミンＣ等の還元剤を添加することが好ましい。

【0015】

また、前記培地を用いたビフィドバクテリウム属細菌の培養は、通常の培養条件をそのまま適用すればよく、特に限定されるものではない。すなわち、培地に接種するビフィドバクテリウム属細菌に適した温度、時間、培養雰囲気等の各種条件を適宜設定して行えばよい。例えば、培養温度は、２５〜４６℃、好ましくは３５〜４２℃、培養時間は６〜１２０時間、好ましくは２４〜７２時間とすればよい。また、培養雰囲気は、嫌気的な条件で行うことが好ましく、培養方法については静置、攪拌、振盪等、特に制限されることはなく、いずれを選択してもよい。

【0016】

本発明の小胞体ストレス抑制剤の有効成分として用いるビフィドバクテリウム属細菌について、これらの微生物の多くは、従来、ヨーグルト等の各種発酵食品の製造に用いられているので、常時経口的に摂取しても安全なものであり、後記実施例に示すように、優れた小胞体ストレス抑制作用を有することから、小胞体ストレスに起因する疾患、例えば心筋症等の予防治療薬として利用できる。

【0017】

本発明の小胞体ストレス抑制剤の有効成分として用いるビフィドバクテリウム属細菌は、種々の小胞体ストレス応答因子（ＣＨＯＰ、ＧＲＰ７８、ＥＲｄｊ４、ＸＢＰ１ｓ等）の発現を抑制する作用を有することから、小胞体ストレス応答因子発現抑制剤、またはＣＨＯＰ、ＧＲＰ７８、ＥＲｄｊ４およびＸＢＰ１ｓから選ばれる１種以上のタンパクの発現抑制剤等として使用することができる。
また、ビフィドバクテリウム属細菌は、小胞体内の折り畳み不全の糖タンパクを再び折り畳みサイクルへと還元させる酵素であるＵＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ：ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＵＧＧＴ）のｍＲＮＡ発現を亢進する。従って、ビフィドバクテリウム属細菌による小胞体酸化ストレス抑制作用の機序は、ＵＧＧＴ発現促進作用によるものと考えられる。また、ビフィドバクテリウム属細菌は、ＵＧＧＴ発現促進剤として有用である。

【0018】

また、本発明に用いるビフィドバクテリウム属細菌は、生菌体及び／又は死菌体の状態に関係なく、経口的に摂取することにより、上記所望の効果を得ることができる。そのため、本発明で用いるビフィドバクテリウム属細菌は、必ずしも全て生菌体として用いる必要はなく、保存等による内外的な要因により、全部または一部が死滅した菌体を用いても上記所望の効果を得ることができるので、種々の加工（処理）を施した医薬用等の形態とすることができる。また、ビフィドバクテリウム属細菌は、小胞体ストレス抑制用の飲食品としても使用することができる。

【0019】

本発明の小胞体ストレス抑制剤は、常法に従って、薬学的に許容される担体とともに種々の剤型の医薬組成物とすることができる。また、飲食品の形態としては、機能性食品、健康食品、特定保健用食品等が挙げられる。
例えば、上記菌株またはその加工物（処理物）等に、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤、水、エタノール、プロパノール、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤、アルギン酸ナトリウム、カテキン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム等の崩壊剤、グリセリン、デンプン等の保湿剤、精製タルク、ステアリン酸塩、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等を加え、常法により顆粒剤、錠剤、カプセル剤等を製造することができる。更に、錠剤については、必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠或いは二重錠、多重錠とすることもできる。飲食品の具体的な形態としては、ヨーグルト、飲料等が挙げられる。

【0020】

更に、本発明の小胞体ストレス抑制剤は、経口摂取が可能であって生体に有益な機能を与える乳酸菌を含むものであってもよい。

【0021】

本発明の小胞体ストレス抑制剤におけるビフィドバクテリウム属細菌の１日当たりの使用量は、対象者の症状、年齢、体重等によっても異なるため、一概に決定することは出来ないが、生菌および／または死菌の菌数としておよそ１０³〜１０¹³個程度或いは菌体処理物として前記菌数の菌体を処理して得られる量とすればよい。

【実施例】

【0022】

以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例になんら制約されるものではない。

【0023】

実施例１
Ａ．材料と方法
（１）加熱死菌体の調製
ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１０００１株、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１２２７２、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＹＩＴ４０１１^T、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＹＩＴ１０３４７およびビフィドバクテリウム・ロンガムＹＩＴ４０２１^Tの各菌株を一晩培養し、遠心分離で菌体を回収後、滅菌水を用いて２回洗浄した。洗浄後の菌体を滅菌水中に懸濁し、沸騰水浴中で３０分間加熱することにより加熱死菌体を調製した。加熱死菌体を含む懸濁液の一部をＤＡＰＩ（４’，６−diamidino−２−phenylindole）で染色し、蛍光顕微鏡を用いて細菌数を測定した。加熱死菌体は凍結乾燥し、５¹⁰ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度となるようにＰＢＳに懸濁後、小分けにして−８０℃で保管した。

【0024】

（２）細胞培養および経上皮膜間電気抵抗（ＴＥＥＲ）試験
ヒト結腸癌由来上皮細胞株（Ｃａｃｏ−２）は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１％非必須アミノ酸、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ−グルタミンを添加した培地にて、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ₂、多湿下で培養した。経上皮膜間電気抵抗（ＴＥＥＲ）試験は、Ｂｉｏｃｏａｔ ＨＴＳ Ｃａｃｏ−２アッセイシステム（Beckton Dickinson社）のプロトコルを一部改変して行った。初日にＣａｃｏ−２細胞を線維性コラーゲン皮膜処置済みカルチャーインサート（孔１μｍ、表面積０．３ｃｍ²）に１０⁵または２×１０⁵／インサートの細胞密度で、上述の培地に懸濁した細胞を播種した。３日目に頂端側（腸上皮細胞の管腔側に相当）および基底側（腸上皮細胞の粘膜固有層側に相当）の培地を、Ｍｉｔｏ＋Ｓｅｒｕｍ Ｅｘｔｅｎｄｅｒを添加したＥｎｔｅｒｏ−Ｓｔｉｍ分化培地に交換した。４日目に同培地を新鮮な培地に交換し、各種ビフィズス菌の加熱死菌体と共に前培養を開始した。前培養１２時間後（５日目）にＴＥＥＲ値を測定することで分化が正常に完了したことを確認し、実験を開始した。

【0025】

（３）小胞体ストレスの誘導
１ｍｇ／ｍＬツニカマイシン（Sigma社）ストック溶液は２５ｍＭ 水酸化ナトリウムを用いて調製した。ツニカマイシンを１０μｇ／ｍＬの濃度でＣａｃｏ−２単層に添加することにより小胞体ストレスを誘導し、Ｃａｃｏ−２単層のＴＥＥＲ値を１２時間毎に４８時間測定した。なお、対照ウェルには溶媒を等量添加した。

【0026】

（４）イムノブロッティング
Ｃａｃｏ−２単層をLaemmli bufferで溶解し、１５分間煮沸した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（Biorad社）にサンプルを等量ずつ供し、変性電気泳動法によりタンパクを分離した。分離されたタンパクをウェット式電気泳動法によりＰＶＤＦ（Millipore社）に転写した後、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０入りＴＢＳ溶液に５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを添加した溶液中でブロッキング処理を行った。試験に用いた一次抗体と濃度は以下の通り：抗ＣＨＯＰ抗体（１：１０００、Cell Signaling社）、抗ＧＲＰ７８抗体（１：１０００、Cell Signaling社）、抗ＸＢＰ１ｓ抗体（１：１０００、BioLegend社）、抗β−ａｃｔｉｎ抗体（１：１０００、Santa Cruz社）。ブロッキング処理したＰＶＤＦを各一次抗体と４℃で一晩インキュベートし、洗浄した後、マウス、ウサギまたはヤギ由来のＨＲＰ結合二次抗体（Abcam社）とインキュベートした。タンパクのバンドはＥＣＬ（Enhanced chemiluminescent:Pierce社）およびＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰシステム（Biorad社）で検出した。

【0027】

（５）各mRNAを標的とした定量的PCR
Caco-2単層をTRIzol（Life technologies社）で溶解後、RNeasy kit（Qiagen社）に供することでRNAを抽出した。得られたRNAの濃度をNanodrop（Thermo Scientific社）で測定し、gDNA（Genomic DNA）のコンタミネーションが無いことをβ-actinに対するPCRを実施することで確認した。１μｇのRNAを鋳型とし、iScript cDNA synthesis kit（BioRad社）を用いてcDNAを合成した。得られたcDNAをnuclease free H₂Oを用いて５ｎｇ/μＬに調製し、２μＬ（１０ｎｇ）を３８４穴プレートを用いたTaqMan gene expression assay（Applied Biosystems 社）に供してRT-qPCRを実施した。各mRNAの発現レベルは、ΔΔCt 法により、レファレンス遺伝子であるTbpに対する相対的な発現量を求めることで比較した。解析に用いたプローブは以下の通り：Tbp; Hs00427620_mL、GRP78; Hs00607129_gH、CHOP; Hs00358796_gL、ERdj4; Hs01052402_mL。

【0028】

Ｂ．結果
（１）ビフィドバクテリウム属細菌の小胞体ストレスに対する効果
ｉ）小胞体ストレス誘導がＣａｃｏ−２単層の膜透過性に及ぼす影響についての検証
Ｃａｃｏ−２単層の膜透過性が小胞体ストレスにより亢進するか否かを検証した。小胞体ストレス誘導物質であるツニカマイシンを１０μｇ／ｍＬの濃度でＣａｃｏ−２単層の頂端側に添加した結果、ＴＥＥＲ値が漸次低下し、４８時間インキュベート後には初期値の３２％に至った（図１）。本結果は、頂端側への１０μｇ／ｍＬのツニカマイシン添加により、Ｃａｃｏ−２単層の膜透過性が亢進したことを示している。小胞体ストレスの誘導が、実際の腸管上皮の透過性に影響を及ぼす可能性が示唆された。

【0029】

ツニカマイシンの刺激によるＣａｃｏ−２単層の膜透過性の亢進が、小胞体ストレスマーカーの変動と伴っているかを検証するため、Ｇｒｐ７８（小胞体ストレスマーカーの一種）の発現をウェスタンブロッティングで評価した。Ｃａｃｏ−２単層を１０μｇ／ｍＬのツニカマイシンで頂端側から種々の時間刺激した後、総細胞の溶解液を調製した。この溶解液を、βＡｃｔｉnの発現をローディング・コントロール（ウェスタンブロッティングにおける陽性対照）としてウェスタンブロッティングで分析した結果、ツニカマイシン刺激の開始から２４時間後および４８時間後にＧｒｐ７８タンパクの発現量は顕著に増大した（図２）。なお、図１に示した通り、これらの刺激時間では、Ｃａｃｏ−２単層の透過性の亢進が認められている。

【0030】

以上の結果は、Ｃａｃｏ−２単層を１０μｇ／ｍＬツニカマイシンで刺激したときの膜透過性の亢進が小胞体ストレスの誘導と関連していることを示している。

【0031】

ii）小胞体ストレス誘導によって引き起こされるＣａｃｏ−２単層の膜透過性の亢進にビフィドバクテリウム属細菌が与える効果の検証
ｉ）では、小胞体ストレスを誘導するとＣａｃｏ−２単層の膜透過性が亢進することを明らかにした。続いて、Ｃａｃｏ−２単層をビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１０００１株と前培養することにより、この過程がどのような影響を受けるか検証した。加熱死菌体の添加量を種々の濃度で検討し、１０⁹／ｍＬを至適試験菌数と決定した。Ｃａｃｏ−２単層に同濃度（１０⁹／ｍＬ）のビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１０００１株の加熱死菌体を添加し１２時間前培養した後、ツニカマイシンを１０μｇ／ｍＬの濃度でＣａｃｏ−２単層の頂端側に添加し、小胞体ストレスの誘導を開始した。菌体と前培養していない対照のＣａｃｏ−２単層では、ツニカマイシン添加４８時間後にＴＥＥＲ値が初期値の２７％にまで低下した。一方、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１０００１株と前培養したＣａｃｏ−２単層ではツニカマイシン添加４８時間後においてもＴＥＥＲ値が初期値の４６％に留まった（図３）。以上より、ツニカマイシンを４８時間作用させて誘導した小胞体ストレスによるＣａｃｏ−２単層の膜透過性の亢進が、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１０００１株加熱死菌体との１２時間の前培養により有意に抑制されることが明らかとなった。データは示さないが、Ｃａｃｏ−２単層をビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１０００１株と前培養後にツニカマイシンの溶解に用いた溶媒のみを添加してもＴＥＥＲ値に変化は認められなかった。本結果は、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１０００１株が平常時のＣａｃｏ−２単層の膜透過性に影響を与えないことを示している。

【0032】

iii)ツニカマイシンで誘導したＣａｃｏ−２単層の膜透過性の亢進に対するビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１０００１株の抑制効果メカニズムの検証
ツニカマイシン刺激によるＣａｃｏ−２単層の膜透過性の亢進に対するビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１０００１株の抑制効果のメカニズムを評価するため、本菌が単層頂端側においてツニカマイシンの取り込みを阻害している可能性を検討した。ツニカマイシンをＣａｃｏ−２単層の基底側に添加し、頂端側の菌体がツニカマイシンの取り込みに与え得る影響を排除してＴＥＥＲ試験を行った。１０⁹／ｍＬのビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１０００１株とＣａｃｏ−２単層を前培養した場合には、基底側からのツニカマイシンの刺激により誘導された膜透過性の亢進を抑制する傾向（ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１０００１株処置および対照でのツニカマイシン刺激４８時間後の各ＴＥＥＲ値は初期値の６９％および５５％）が認められた（図４）。ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１０００１株が空間的に小胞体ストレス誘導物質から離れていてもツニカマイシン刺激による膜透過性の亢進を抑制したことから、本菌の効果が菌体による化学物質の取り込みの阻害によるものではないことが示唆された。

【0033】

（２）ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１０００１株以外のビフィドバクテリウム属細菌の小胞体ストレスに対する作用
前記のii）と同様にして、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１２２７２株、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＹＩＴ４０１１株、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＹＩＴ１０３４７株及びビフィドバクテリウム・ロンガムＹＩＴ４０２１株の小胞体ストレスによる膜透過性の亢進に対する抑制作用を検討した。
その結果、図５に示すように、ビフィドバクテリウム属細菌が優れた小胞体ストレス抑制作用を示すことが判明した。

【0034】

また、ビフィドバクテリウム属細菌が小胞体ストレスマーカーの発現を抑制するか否かを検証するため、ＣＨＯＰタンパク（小胞体ストレスマーカーの一種）の発現をウェスタンブロットで解析した。その結果、１０⁹／ｍＬのビフィドバクテリウム・アドレセンティスＹＩＴ４０１１株及びビフィドバクテリウム・ビフィダムＹＩＴ１０３４７株と１２時間前培養したＣａｃｏ−２単層内では、ツニカマイシン刺激開始から６時間後および１２時間後のＣＨＯＰタンパクの発現が抑制されることが明らかとなった（図６）。
さらに、データは示さなかったが、本発明の菌株が、他の小胞体ストレスマーカー（ＧＲＰ７８、ＸＢＰ１ｓ）の発現を抑制することを確認した。

【0035】

（３）種々の小胞体ストレスマーカーの発現に対する作用
データは示さなかったが、各mRNAを標的とした定量的PCRの結果においても、本発明の菌株が、種々の小胞体ストレスマーカー（ＣＨＯＰ、ＧＲＰ７８、ＥＲｄｊ４）の発現を抑制することを確認した。

【0036】

実施例２（ＵＧＧＴ発現促進作用）
（１）Ｃａｃｏ−２単層をＴＲＩｚｏｌ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で溶解後、ＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）に供することでＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡの濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で測定し、ｇＤＮＡ（Genomic DNA）のコンタミネーションが無いことをβ−ａｃｔｉｎに対するＰＣＲを実施することで確認した。１μｇのＲＮＡを鋳型とし、ｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ＢｉｏＲａｄ社）を用いてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡをｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ Ｈ₂Ｏを用いて５ｎｇ／μｌに調製し、２μｌ（１０ｎｇ）を３８４穴プレートを用いたＴａｑＭａｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）に供してＲＴ−ｑＰＣＲを実施した。各ｍＲＮＡの発現レベルは、ΔΔＣｔ法により、レファレンス遺伝子であるＴｂｐに対する相対的な発現量を求めることで比較した。解析に用いたプローブは以下の通り：Tbp; Hs00427620_m1、UGGT; Hs00917255_m1。

【0037】

（２）糖タンパク質の折り畳みは、小胞体内の「Ｃａｌｎｅｘｉｎ／Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ（ＣＮＸ／ＣＲＴ）サイクル」と呼ばれる経路上で行われることが知られている。小胞体内に糖タンパク質の基となるペプチド鎖が合成されると、第一に、Ｎ−ｘ−Ｓ／Ｔというアミノ酸配列のアスパラギン（Ｎ）に、グルコース残基を末端に持つマンノース糖鎖（Ｇｌｃ１Ｍａｎ５−９ＧｌｃＮＡｃ２）が付加される。続いて、本オリゴ糖が付加されたペプチド鎖は、ＣａｌｎｅｘｉｎやＣａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎをはじめとする分子シャペロンによる認識を受け、折り畳みが開始される。折り畳みがある程度完了すると、オリゴ糖末端のグルコースはＧｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ＩＩと呼ばれる酵素により除去され、タンパク質は分子シャペロンから解離する。この段階で（ｉ）糖タンパクの折り畳みが正常に完了していた場合、タンパク質は小胞体外へと排出され、場合によってはゴルジ体にて更なる修飾を受けた後、細胞外や細胞膜上へと輸送される。一方、折り畳みが不完全だった場合、糖タンパク質は(ii）不良タンパク分解因子の補助を受けながら分解機構へと輸送されるか、（iii）ＵＧＧＴ（ＵＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ：ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）と呼ばれる酵素によりオリゴ糖鎖の末端に再びグルコース残基が付加されることで、再度タンパク質の折り畳みサイクルへと還元される。このように、Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ＩＩおよびＵＧＧＴにより駆動されるサイクルが、ＣＮＸ／ＣＲＴサイクルである。

【0038】

実施例１と同条件でビフィズス菌の加熱死菌体と１２時間前培養したＣａｃｏ−２単層内におけるＵＧＧＴのｍＲＮＡ発現を解析した結果、Ｂ．ｂｒｅｖｅ ＹＩＴ １２２７２、Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＹＩＴ ４０１１、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ ＹＩＴ １０３４７がＵＧＧＴのｍＲＮＡ発現を亢進させることが明らかとなった（図７）。本結果は、ビフィズス菌の加熱死菌体と共培養したＣａｃｏ−２単層内では、ＵＧＧＴの発現が誘導されることで、折り畳み不全のタンパクを折り畳み機構へと還元させる経路が増強されていることを示唆している。ビフィズス菌は、本効果を一因としてＣａｃｏ−２単層の小胞体ストレスに対する耐性を向上させ、単層内での同ストレスを抑制したことが推察された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】