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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6670303
(24)【登録日】2020年3月3日
(45)【発行日】2020年3月18日
(54)【発明の名称】阻害剤を除去するために有機溶媒を用いる核酸抽出
(51)【国際特許分類】
C12N 15/10 20060101AFI20200309BHJP
【ＦＩ】
C12N15/10 100Z
C12N15/10 120Z
【請求項の数】23
【全頁数】22
(21)【出願番号】特願2017-512765(P2017-512765)
(86)(22)【出願日】2015年9月4日
(65)【公表番号】特表2017-525383(P2017-525383A)
(43)【公表日】2017年9月7日
(86)【国際出願番号】US2015048628
(87)【国際公開番号】WO2016037099
(87)【国際公開日】20160310
【審査請求日】2018年8月1日
(31)【優先権主張番号】62/045,888
(32)【優先日】2014年9月4日
(33)【優先権主張国】US
(31)【優先権主張番号】14/845,124
(32)【優先日】2015年9月3日
(33)【優先権主張国】US
(73)【特許権者】
【識別番号】513273030
【氏名又は名称】テックラブ，インコーポレーテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100140109
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 新次郎
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100120112
【弁理士】
【氏名又は名称】中西 基晴
(74)【代理人】
【識別番号】100107386
【弁理士】
【氏名又は名称】泉谷 玲子
(72)【発明者】
【氏名】チェン，リー
(72)【発明者】
【氏名】スティーブンス，ジョディ
(72)【発明者】
【氏名】シュワブ，クリステン
(72)【発明者】
【氏名】ブーン，ジェームズ
(72)【発明者】
【氏名】リヤリー，デヴィッド
【審査官】
川合 理恵
(56)【参考文献】
【文献】
欧州特許出願公開第０１６６９４４９（ＥＰ，Ａ１）
【文献】
特開２０１１−２５０７５８（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開平１１−１１３５７３（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２０１４／０１７１８７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第００／００８１３６（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｎ １５／１０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
核酸抽出のために生物学的試料を処理するための方法であって：（ａ）生物学的試料を得て；（ｂ）３〜１０重量％の有機溶媒を含む抽出緩衝液中で生物学的試料を希釈して、混合物を形成し、ここにおいて、前記有機溶媒は、アセトンまたはエタノールの１またはそれより多くである；（ｃ）混合物を、１５℃〜３５℃の温度で、５秒間〜３０分間インキュベーションして、さらなるプロセシングのため、生物学的試料中に存在する核酸を生物学的試料の少なくとも一部から抽出し；（ｄ）核酸の少なくとも一部を生物学的試料から分離し；（ｅ）１またはそれより多い増幅反応緩衝液中で核酸の少なくとも一部を希釈して、増幅混合物を形成し；そして（ｆ）増幅混合物を２５℃〜７０℃で１〜１０分間インキュベーションする工程を含む、前記方法。
【請求項2】
核酸抽出のために生物学的試料を処理するための方法であって：（ａ）生物学的試料を得て；（ｂ）０．５〜２０重量％の有機溶媒を含む抽出緩衝液中で生物学的試料を希釈して、混合物を形成し、ここにおいて、前記有機溶媒は、ブタノールである；（ｃ）混合物を、１５℃〜３５℃の温度で、５秒間〜３０分間インキュベーションして、さらなるプロセシングのため、生物学的試料中に存在する核酸を生物学的試料の少なくとも一部から抽出し；（ｄ）核酸の少なくとも一部を生物学的試料から分離し；（ｅ）１またはそれより多い増幅反応緩衝液中で核酸の少なくとも一部を希釈して、増幅混合物を形成し；そして（ｆ）増幅混合物を２５℃〜７０℃で１〜１０分間インキュベーションする工程を含む、前記方法。
【請求項3】
前記生物学的試料が、１またはそれより多いヒト標本、細菌、ウイルス、寄生虫、糞便試料、体液、植物、または培養物を含む、請求項１または２の方法。
【請求項4】
生物学的試料から核酸の少なくとも一部を分離する工程が、混合物をフィルターで濾過する工程を含む、請求項１または２の方法。
【請求項5】
フィルターが５０μｍ〜２５０μｍの孔サイズを有する、請求項４の方法。
【請求項6】
フィルターが多孔性プラスチック、多孔性ポリマー繊維、または多孔性ガラス繊維の１またはそれより多くを含む、請求項４の方法。
【請求項7】
フィルターが、活性炭に包埋されたガラス繊維フィルターを含む、請求項６の方法。
【請求項8】
前記生物学的試料を２５℃〜７０℃で３〜５分間インキュベーションする、請求項１または２の方法。
【請求項9】
増幅反応緩衝液中で核酸の少なくとも一部を希釈する前に、核酸の少なくとも一部に、有機溶媒を、０．５〜２０重量％の濃度まで添加する工程をさらに含む、請求項１または２の方法。
【請求項10】
有機溶媒を核酸の少なくとも一部に添加する工程が、エタノールを核酸の少なくとも一部に添加する工程を含む、請求項９の方法。
【請求項11】
前記インキュベーション温度が５０℃〜６５℃の間である、請求項１または２の方法。
【請求項12】
有機溶媒の添加が、加熱、酵素消化、インキュベーション、分離、核酸沈殿、または溶出の１またはそれより多くの必要性を排除しうる、請求項１または２の方法。
【請求項13】
前記加熱が９５℃またはそれより高い温度である、請求項１２の方法。
【請求項14】
増幅反応緩衝液が、等温増幅、ＰＣＲ、配列決定、遺伝子型決定、およびハイブリダイゼーションに適した緩衝液である、請求項１または２の方法。
【請求項15】
等温増幅が、ニック形成酵素関連反応（ＮＥＡＲ）、レコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ループ仲介等温増幅（ＬＡＭＰ）、鎖置換増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、ローリングサークル増幅、および他の等温増幅法を含む、請求項１４の方法。
【請求項16】
増幅反応において核酸の少なくとも一部を増幅する工程をさらに含む、請求項１または２の方法。
【請求項17】
有機溶媒を含む抽出緩衝液を用いるが、加熱を行わずに、増幅を行う、請求項１６の方法。
【請求項18】
有機溶媒を含む抽出緩衝液を用いて、加熱を行い、増幅を行う、請求項１６の方法。
【請求項19】
抽出緩衝液が、核酸増幅に用いる抽出緩衝液を含む、請求項１または２の方法。
【請求項20】
核酸抽出のために生物学的試料を処理するための方法であって：（ａ）生物学的試料を得て、該生物学的試料が糞便試料を含み；（ｂ）３〜１０重量％の有機溶媒を含む抽出緩衝液中で、生物学的試料を希釈して、混合物を形成し、ここにおいて、前記有機溶媒は、アセトンまたはエタノールの１またはそれより多くである；（ｃ）混合物を１５℃〜７０℃の温度で、５秒間〜３０分間インキュベーションして、さらなるプロセシングのため、生物学的試料中に存在する核酸を生物学的試料の少なくとも一部から抽出し：（ｄ）核酸の少なくとも一部を生物学的試料から分離し；そして（ｅ）１またはそれより多い増幅反応緩衝液中で核酸の少なくとも一部を希釈して、増幅混合物を形成する工程を含む、前記方法。
【請求項21】
核酸抽出のために生物学的試料を処理するための方法であって：（ａ）生物学的試料を得て、該生物学的試料が糞便試料を含み；（ｂ）０．５〜２０重量％の有機溶媒を含む抽出緩衝液中で、生物学的試料を希釈して、混合物を形成し、ここにおいて、前記有機溶媒は、ブタノールである；（ｃ）混合物を１５℃〜７０℃の温度で、５秒間〜３０分間インキュベーションして、さらなるプロセシングのため、生物学的試料中に存在する核酸を生物学的試料の少なくとも一部から抽出し：（ｄ）核酸の少なくとも一部を生物学的試料から分離し；そして（ｅ）１またはそれより多い増幅反応緩衝液中で核酸の少なくとも一部を希釈して、増幅混合物を形成する工程を含む、前記方法。
【請求項22】
核酸抽出のために生物学的試料を処理するための方法であって：（ａ）生物学的試料を得て、該生物学的試料が、糞便、血液、唾液、または尿の１またはそれより多くを含み；（ｂ）生物学的試料を、３〜１０重量％の有機溶媒を含む抽出緩衝液中で希釈して、混合物を形成し、ここにおいて、前記有機溶媒は、アセトンまたはエタノールの１またはそれより多くである；（ｃ）混合物を、１５℃〜３５℃の温度で、５秒間〜３０分間インキュベーションして、さらなるプロセシングのため、生物学的試料中に存在する核酸を生物学的試料の少なくとも一部から抽出し；（ｄ）生物学的試料から、核酸の少なくとも一部を分離し；（ｅ）有機溶媒を、核酸の少なくとも一部に、０．５〜２０重量％の濃度まで添加して、処理核酸を形成し；（ｆ）処理核酸の少なくとも一部を、１またはそれより多い増幅反応緩衝液中で希釈して、増幅混合物を形成し；そして（ｇ）増幅反応中の核酸の少なくとも一部を増幅する工程を含む、前記方法。
【請求項23】
核酸抽出のために生物学的試料を処理するための方法であって：（ａ）生物学的試料を得て、該生物学的試料が、糞便、血液、唾液、または尿の１またはそれより多くを含み；（ｂ）生物学的試料を、０．５〜２０重量％の有機溶媒を含む抽出緩衝液中で希釈して、混合物を形成し、ここにおいて、前記有機溶媒は、ブタノールである；（ｃ）混合物を、１５℃〜３５℃の温度で、５秒間〜３０分間インキュベーションして、さらなるプロセシングのため、生物学的試料中に存在する核酸を生物学的試料の少なくとも一部から抽出し；（ｄ）生物学的試料から、核酸の少なくとも一部を分離し；（ｅ）有機溶媒を、核酸の少なくとも一部に、０．５〜２０重量％の濃度まで添加して、処理核酸を形成し；（ｆ）処理核酸の少なくとも一部を、１またはそれより多い増幅反応緩衝液中で希釈して、増幅混合物を形成し；そして（ｇ）増幅反応中の核酸の少なくとも一部を増幅する工程を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
核酸増幅試験（ＮＡＡＴ）は、感染性疾患、腫瘍学、および薬理ゲノミクスを含む、現在の分子診断法で広く用いられてきている。該試験は、使用者にとってわかりやすく、そして正確な結果を提供し、そして伝統的な診断法に比較して、より時間が掛からない。分子診断研究、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および等温増幅を実行するため、生物学的材料、例えば糞便試料および血液試料から核酸を抽出する。核酸抽出のために、非常に多様な方法が開発されてきており、コスト、使用しやすさ、所要時間、用いる有害化学薬品を含む材料、ならびに抽出される核酸の量および品質の中で、多くの妥協を生じてきた。
【0002】
現在、利用可能な方法は、長時間の酵素消化、インキュベーション、分離および核酸沈殿または溶出を必要とする。また、煮沸工程が、未精製核酸調製物に関して用いられる最も一般的な方法である。多くの場合、単離核酸の品質および量は、核酸増幅などの下流適用に受け入れられない。特定のターゲットの増幅および検出前の核酸試料の調製は、分子診断法の最も困難な工程であり、これは、生物学的試料中に存在する非常に多様な化合物がＤＮＡポリメラーゼを分解し、そして変性させるか、あるいはＰＣＲまたは等温増幅反応において、ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を減少させるためである。したがって、最適な核酸精製法は、生物学的試料の構成要素による増幅の阻害を減少させるかまたは排除して、増幅成功を達成することも可能である。増幅阻害剤を含まない高品質核酸を産生するための、徹底的な試料プロセシングを必要とせず、そして臨床実験室にも適用可能である、単純でそして迅速な方法が必要である。
【発明の概要】
【0003】
本発明は、核酸抽出前、抽出中または抽出後に、試料を処理するための組成物および方法に関する。より具体的には、本発明は、核酸増幅の阻害剤を除去するため、低濃度の一般的な有機溶媒を用いる組成物および方法に関する。本発明（claimed invention）は、核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）を、細菌、ウイルス、寄生虫、ならびに限定されるわけではないが、糞便試料、体液、植物および培養物を含む、他の生物学的材料またはマトリックスから抽出するために使用可能である。本明細書に記載する方法は、迅速で低コストであり、そして実験室セッティングで使用することが容易である。本発明にしたがって抽出される核酸は、核酸増幅反応に使用可能である。本発明の目的は、増幅成功を達成するため、生物学的試料の構成要素による増幅阻害を減少させるかまたは排除するために、最適な核酸精製法を提供することである。
【0004】
１つの側面において、核酸抽出のために、生物学的試料を処理するための方法を提供する。該方法には、生物学的試料を得て、そして該生物学的試料を、０．５〜２０重量％の有機溶媒を含む抽出緩衝液中で希釈して、混合物を形成する工程が含まれる。該方法にはまた、混合物を、１５℃〜３５℃の温度で、５秒間〜３０分間インキュベーションして、さらなるプロセシングのため、生物学的試料中に存在する核酸を生物学的試料の少なくとも一部から抽出し；そして核酸の少なくとも一部を生物学的試料から分離する工程も含まれる。該方法にはさらに、１またはそれより多い増幅反応緩衝液中で核酸の少なくとも一部を希釈して、増幅混合物を形成し；そして増幅混合物を２５℃〜７０℃で１〜１０分間インキュベーションする工程が含まれる。
【0005】
別の側面において、生物学的試料を得て、該生物学的試料が糞便試料を含み；そして０．５〜２０重量％の有機溶媒を含む抽出緩衝液中で、生物学的試料を希釈して、混合物を形成する工程を含む、核酸抽出のために生物学的試料を処理するための方法を提供する。該方法にはまた、混合物を１５℃〜７０℃の温度で、５秒間〜３０分間インキュベーションして、さらなるプロセシングのため、生物学的試料中に存在する核酸を生物学的試料の少なくとも一部から抽出する工程も含まれる。該方法にはさらに、核酸の少なくとも一部を生物学的試料から分離し；そして１またはそれより多い増幅反応緩衝液中で核酸の少なくとも一部を希釈して、増幅混合物を形成する工程も含まれる。
【0006】
さらに別の側面において、核酸抽出のために生物学的試料を処理する方法を提供する。該方法には、生物学的試料を得て、該生物学的試料が、糞便、血液、唾液、または尿の１またはそれより多くを含み；そして生物学的試料を、０．５〜２０重量％の有機溶媒を含む抽出緩衝液中で希釈して、混合物を形成する工程が含まれる。該方法にはまた、混合物を、１５℃〜３５℃の温度で、５秒間〜３０分間インキュベーションして、さらなるプロセシングのため、生物学的試料中に存在する核酸を生物学的試料の少なくとも一部から抽出する工程も含まれる。該方法にはまた、生物学的試料から、核酸の少なくとも一部を分離する工程も含まれる。該方法にはさらに、有機溶媒を、核酸の少なくとも一部に、０．５〜２０重量％の濃度まで添加して、処理核酸を形成し；そして処理核酸の少なくとも一部を、１またはそれより多い増幅反応緩衝液中で希釈して、増幅混合物を形成する工程が含まれる。該方法にはまた、増幅反応中の核酸の少なくとも一部を増幅する工程も含まれる。
【図面の簡単な説明】
【0007】
本発明の例示的な側面を、付随する図に関連して、以下に詳細に記載する：【発明を実施するための形態】
【0008】
本発明の主題を、本明細書において、法令要件を満たすように具体的に記載する。しかし、説明自体は、本特許の範囲を限定するようには意図されない。むしろ、本発明者らは、本発明の主題がまた、他の現在のまたは将来の技術と併せて、本文書に記載するものと類似の異なる工程または工程の組み合わせを含む、他の方式でも具体化可能でありうることを意図している。
【0009】
スピードおよび低コストを目的として、より短い時間で核酸を抽出し、そして操作者の介入およびエラーのリスクを減少させる新規材料および方法に関する連続する必要性がある。ヒト標本、例えば糞便および血液には、多様な阻害剤が存在するため、下流分子適用前の試料調製のための大きな困難がある。さらに、核酸増幅のこれらの阻害剤を煮沸によって排除すると、加熱がＲＮＡの分解につながるため、精製ＲＮＡを必要とする分子試験には適していない。ヒト標本に見られ、そしてＰＣＲおよび等温増幅の両方に影響を及ぼす阻害剤には、胆汁酸塩、複合多糖、ヘモグロビン／ヘミン、ポリフェノール、色素、および尿素が含まれる。これらのＤＮＡ増幅阻害剤の問題を克服するために、試料調製法の開発に多くの努力が注がれてきており、そして阻害剤の影響を減少させるため、多様な技術が使用されてきている。例えば、水性二相系、濾過、希釈、および濾過が、ＤＮＡ増幅を容易にするために用いられてきている。１０分間の煮沸もまた、未精製細菌ＤＮＡ調製に用いられる非常に一般的な方法であり、これは細胞を溶解させて核酸を放出させ、そして下流増幅に対する阻害を減少させるために非常に有効である。しかし臨床実験室における試料の煮沸は安全でもまた好適でもない。したがって、存在する方法は労働集約的で、複雑であり、そして／またはコストが掛かるため、未精製核酸抽出のためのより安全でそしてより容易な方法が必要である。その結果、多くの臨床実験設定において、これらは実用的でない。したがって、生物学的標本から高品質の核酸を抽出する、単純で使用しやすい方法に関する緊急の必要性がある。
【0010】
生物学的材料から抽出された核酸において、阻害性因子を有効に排除するため、核酸抽出法において広く用いられている、煮沸および他の広範な工程（例えば酵素消化、インキュベーション、分離、沈殿、および溶出）に置き換わる、短時間でそしてより低い温度のインキュベーションと組み合わされた低濃度の有機溶媒を用いる、新規試料調製法を本明細書に記載する。本発明の方法を、異なる生物学的試料、例えば血液、糞便、尿、植物等で用いることも可能である。核酸抽出緩衝液中の低濃度の有機溶媒の添加は、未精製核酸調製物中の増幅阻害を排除するための煮沸がもはや必要でないため、ＤＮＡ調製およびＲＮＡ抽出に必要な温度を低下させる。核酸抽出法前、抽出法中、および抽出法後の、有機溶媒の添加を用いて、試料を処理することも可能である。単一の溶媒または溶媒の組み合わせを用いることも可能である。抽出緩衝液は、ロバストに細胞を溶解し、抽出緩衝液内への核酸の放出を生じる。有機溶媒は、未精製核酸調製物において、より低い温度での増幅阻害の減少または除去を補助する。活性炭または通常のフィルターのいずれかを通じた濾過と組み合わせて、試料中の阻害剤をフィルターに結合させおよび／または緩衝液中で溶解／変性させる。本発明の方法にしたがって抽出された核酸は、広く利用される技術、例えば核酸増幅における続く使用に適している。本明細書において、低濃度の有機溶媒は、あらかじめ決定された閾値より低い濃度を指す。例示的な量を本明細書に提供する。
【0011】
本発明の側面は、核酸増幅阻害剤を除去するため、低濃度の有機溶媒を用いた等温増幅およびＰＣＲとともに使用されることが意図される、生物学的試料を調製するためのプロセスに関する。
【0012】
生物学的試料には、生物学的組織、生物学的組織の抽出物、および生物学的排出物、血液または血液の一部、尿、糞便、唾液、痰、粘液、精液、またはホモジナイズされた組織が含まれる。したがって、ヒトまたは動物組織の生物学的試料、例えばホモジナイズした肉（例えばハンバーガーのミートパテ、子羊肉、豚肉、鶏肉、魚、卵）であることも可能である。また、固形標本の抽出物、例えば糞便試料または消費可能肉試料の水性抽出物であることも可能である。さらに、生物学的試料には、植物組織、培養細菌、培養ウイルス、培養寄生虫、ならびに培養哺乳動物および昆虫細胞が含まれる。
【0013】
本発明の１つの側面にしたがって、（ｉ）下流適用のための核酸使用に干渉しうる、生物学的材料中に存在する化合物を除去するかまたは不活性化し、そして（ｉｉ）生物学的試料から核酸を抽出することが可能な、組成物を提供する。
【0014】
図１を参照して、該プロセスには、加熱しない、特に９５℃またはそれより高く加熱しないオプションを可能にする、低い割合の有機溶媒を含有する、１つの水性核酸抽出緩衝液が含まれる。図１を参照して、工程１でスワブ試料を得る。工程２で、低い割合の有機溶媒を含む核酸抽出緩衝液を含有するスクイーズチューブに試料を添加し、そして刻み目の線で折る。やはり工程２で、活性炭フィルターチップをスクイーズチューブの最上部に配置し、そしてスクイーズチューブを１０秒間ボルテックスする。工程３で、濾過した抽出標本の１滴を反応チューブ内に絞り出す。キャップした反応チューブを６５℃で３分間インキュベーションし、そして工程４で１０秒間ボルテックスする。反応チューブ中の核酸は、次いで、下流適用のために用意が出来ている。例えば、工程５〜６に示すように、５０μｌの抽出標本または適切な体積の抽出標本を、等温増幅またはＰＣＲに用いることも可能である。図１は、事実上、単なる例示であり、そしてこれには、本発明のさらなる側面における修飾が含まれることも可能である。例えば、試料を加熱する時間量は、３〜５分間とは異なる範囲内に属することも可能である。
【0015】
ここで図２に移り、図２００は、本発明で用いる試料収集デバイスの組み立てを示す。試料収集デバイスは：試料を収集するスワブ２１０、抽出チューブ２３０の最上部に添加可能なフィルターチップ２２０を含む。抽出チューブ２３０は、核酸抽出に用いる抽出緩衝液を含有する。スワブを抽出チューブに添加し、そして刻み目の線２４０で折り、そして抽出チューブ２３０の内部に入れる。折ったスワブ２４０を抽出チューブ２３０の内部に入れた後、フィルターチップ２２０を抽出チューブ２３０の最上部に添加して、試料収集デバイス２５０を組み立てる。
【0016】
本発明の１つの側面は、生物学的試料、特に、糞便、血液、唾液、尿、または植物組織の試料から核酸を調製するための方法を開示する。生物学的試料を、低い割合（重量約０．５％〜２０％）の一般的な有機溶媒を含有する抽出緩衝液中で希釈することも可能である。
【0017】
この本発明の実施において、核酸抽出緩衝液に包含するには、低い割合の一般的な有機溶媒が適切である。例は、限定されるわけではないが、エタノール、アセトン、メタノール、イソプロパノール、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である。これらの有機溶媒は、個々にまたは混合物としてともに、特に関心が持たれる。生物学的試料を曝露する有機溶媒の濃度は多様であることも可能であるが、阻害を有効に排除しうる濃度は、一般的に、いずれも重量で、約０．５％〜約２０％、そして多くの場合、約３％〜約１０％の範囲であろう。また、核酸抽出前に生物学的試料を前処理するために有機溶媒を用いるか、または抽出緩衝液に添加するか、または増幅前の希釈前に添加するか、いずれも可能である。０．５〜２０％の範囲外の有機溶媒の添加は、核酸増幅を抑制するため、好適ではない。
【0018】
抽出緩衝液中の生物学的試料を約１５℃〜約３５℃の温度で、約５秒間〜約３０分間インキュベーションして、試料液体内への核酸放出を引き起こす。活性炭フィルター、例えば活性炭に包埋されたＰｏｒｅｘガラス繊維フィルターをフィルターとして用いる（活性炭フィルターの孔サイズは、５０μｍより大きく、そして２５０μｍより小さい）。放出された核酸を、ＰＢＳまたは水または下流適用に適切な増幅反応緩衝液中で希釈し、そして混合物を２５℃〜７０℃で１〜１０分間インキュベーションする。
【0019】
下流適用には、限定されるわけではないが、等温増幅、ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲまたは慣用的ＰＣＲ）、配列決定、遺伝子型決定、およびハイブリダイゼーションが含まれる。等温増幅には、限定されるわけではないが、ニック形成酵素関連反応（ＮＥＡＲ）、レコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ループ仲介等温増幅（ＬＡＭＰ）、鎖置換増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、ローリングサークル増幅、および他の等温増幅法が含まれる。増幅は、加熱を伴いまたは伴わず、低濃度の有機溶媒を含有する抽出試料で行われる。核酸抽出緩衝液は、典型的に用いられる緩衝液構成要素からなることも可能である。
【0020】
以下の例示的な側面の列挙は、本明細書に提供する考察および実施例を支持し、そしてこれらによって支持される。側面１
核酸抽出のために生物学的試料を処理するための方法であって：（ａ）生物学的試料を得て；（ｂ）０．５〜２０重量％の有機溶媒を含む抽出緩衝液中で生物学的試料を希釈して、混合物を形成し；（ｃ）混合物を、１５℃〜３５℃の温度で、５秒間〜３０分間インキュベーションして、さらなるプロセシングのため、生物学的試料中に存在する核酸を生物学的試料の少なくとも一部から抽出し；（ｄ）核酸の少なくとも一部を生物学的試料から分離し；（ｅ）１またはそれより多い増幅反応緩衝液中で核酸の少なくとも一部を希釈して、増幅混合物を形成し；そして（ｆ）増幅混合物を２５℃〜７０℃で１〜１０分間インキュベーションする工程を含む、前記方法。
【0021】
側面２核酸抽出のために生物学的試料を処理するための方法であって：（ａ）生物学的試料を得て、該生物学的試料が糞便試料を含み；（ｂ）０．５〜２０重量％の有機溶媒を含む抽出緩衝液中で、生物学的試料を希釈して、混合物を形成し；（ｃ）混合物を１５℃〜７０℃の温度で、５秒間〜３０分間インキュベーションして、さらなるプロセシングのため、生物学的試料中に存在する核酸を生物学的試料の少なくとも一部から抽出し：（ｄ）核酸の少なくとも一部を生物学的試料から分離し；そして（ｅ）１またはそれより多い増幅反応緩衝液中で核酸の少なくとも一部を希釈して、増幅混合物を形成する工程を含む、前記方法。
【0022】
側面３核酸抽出のために生物学的試料を処理するための方法であって：（ａ）生物学的試料を得て、該生物学的試料が、糞便、血液、唾液、または尿の１またはそれより多くを含み；（ｂ）生物学的試料を、０．５〜２０重量％の有機溶媒を含む抽出緩衝液中で希釈して、混合物を形成し；（ｃ）混合物を、１５℃〜７０℃の温度で、５秒間〜３０分間インキュベーションして、さらなるプロセシングのため、生物学的試料中に存在する核酸を生物学的試料の少なくとも一部から抽出し；（ｄ）生物学的試料から、核酸の少なくとも一部を分離し；（ｅ）有機溶媒を、核酸の少なくとも一部に、０．５〜２０重量％の濃度まで添加して、処理核酸を形成し；（ｆ）処理核酸の少なくとも一部を、１またはそれより多い増幅反応緩衝液中で希釈して、増幅混合物を形成し；そして（ｇ）増幅反応中の核酸の少なくとも一部を増幅する工程を含む、前記方法。
【0023】
側面４前記生物学的試料が、１またはそれより多いヒト標本、細菌、ウイルス、寄生虫、糞便試料、体液、植物、または培養物を含む、側面１記載の方法。
【0024】
側面５前記有機溶媒が、アセトン、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の１またはそれより多くを含む、側面１、２、または３記載の方法。
【0025】
側面６抽出緩衝液が３重量％〜１０重量％の有機溶媒を含み、有機溶媒がエタノール、アセトン、またはその組み合わせを含む、側面１、２、または３記載の方法。
【0026】
側面７生物学的試料から核酸の少なくとも一部を分離する工程が、混合物をフィルターで濾過する工程を含む、側面１、２、または３記載の方法。
【0027】
側面８フィルターが５０μｍ〜２５０μｍの孔サイズを有する、側面１、２、または３記載の方法。
【0028】
側面９フィルターが多孔性プラスチック、多孔性ポリマー繊維、または多孔性ガラス繊維の１またはそれより多くを含む、側面１、２、または３記載の方法。
【0029】
側面１０フィルターが、活性炭に包埋されたガラス繊維フィルターを含む、側面１、２、または３記載の方法。
【0030】
側面１１前記生物学的試料を２５℃〜７０℃で３〜５分間インキュベーションする、側面１、２、または３記載の方法。
【0031】
側面１２増幅反応緩衝液中で核酸の少なくととも一部を希釈する前に、核酸の少なくとも一部に、有機溶媒を、０．５〜２０重量％の濃度まで添加する工程をさらに含む、側面１または２記載の方法。
【0032】
側面１３有機溶媒を核酸の少なくとも一部に添加する工程が、エタノールを核酸の少なくとも一部に添加する工程を含む、側面１２記載の方法。
【0033】
側面１４前記インキュベーション温度が５０℃〜６５℃の間である、側面１、２、または３記載の方法。
【0034】
側面１５有機溶媒の添加が、加熱、酵素消化、インキュベーション、分離、核酸沈殿、または溶出の１またはそれより多くの必要性を排除しうる、側面１、２、または３記載の方法。
【0035】
側面１６前記加熱が９５℃またはそれより高い温度である、側面１５記載の方法。
側面１７
増幅反応緩衝液が、等温増幅、ＰＣＲ、配列決定、遺伝子型決定、およびハイブリダイゼーションに適した緩衝液である、側面１、２、または３記載の方法。
【0036】
側面１８等温が、ニック形成酵素関連反応（ＮＥＡＲ）、レコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ループ仲介等温増幅（ＬＡＭＰ）、鎖置換増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、ローリングサークル増幅、および他の等温増幅法を含む、側面１７記載の方法。
【0037】
側面１９増幅反応において核酸の少なくとも一部を増幅する工程をさらに含む、側面１または２記載の方法。
【0038】
側面２０有機溶媒を含む抽出緩衝液を用いるが、加熱を行わずに、増幅を行う、側面３または１９記載の方法。
【0039】
側面２１有機溶媒を含む抽出緩衝液を用いて、加熱を行い、増幅を行う、側面３または１９記載の方法。
【0040】
側面２２抽出緩衝液が、核酸増幅に用いる抽出緩衝液を含む、側面１、２、または３記載の方法。
【0041】
本発明の例示的側面を、続く実施例に関連して以下に詳細に記載するが、該実施例は例示のためにのみ提供され、そしていかなる方式でも本発明を限定することを意図しない。以下に記載するＰＣＲおよび等温増幅を利用して、抽出した核酸の品質および量を評価する。
【実施例】
【0042】
実施例１核酸等温増幅の阻害剤を減少させるかまたは除去するための、有機溶媒を含むより低温の加熱に対する煮沸の比較
商業的なＣ．ディフィシレ試験を用いて、核酸抽出の記載する方法を評価した。等温増幅用に糞便標本から核酸を調製するため、煮沸、加熱なし、あるいは３％の有機溶媒を含むまたは含まない６５℃を含む、異なる抽出条件を試験した。この試験は、図３に例示するように、ターゲット（ｔｃｄＢ遺伝子）および内部対照（ＩＣ）の増幅を含有する。図３Ａは、列挙する条件下でのＣ．ディフィシレ陽性糞便試料（試料１０２３３）から抽出した未精製ＤＮＡを用いた等温増幅を例示する。加熱ブロック上で反応を行い、そして増幅産物を１％アガロースゲル上で分離した。結果を図３Ａ（試料１０２３３）および３Ｂ（試料１６）に提供する。ＤＮＡを加熱せずに調製した場合（レーン３）、ｔｃｄＢ遺伝子のアンプリコンはまったく観察されなかった（図３Ａに例示するとおり）。図３Ａにおいて、煮沸を用いることによって（レーン２）、３％エタノールを添加する（レーン４）か、または有機溶媒を添加せずに（レーン５）６５℃で３分間加熱することによって、ＤＮＡを調製した場合、増幅ＤＮＡ断片の強度は、ゲル中で同様であった。図３Ｂは、示す条件下で、試料１６から抽出した未精製ＤＮＡを用いた等温増幅を示す。ｔｃｄＢ遺伝子の増幅を図３ＢのレーンＡ〜Ｃで調べた。内部対照の増幅を図３ＢのレーンＤ〜Ｆで評価した。増幅産物を１％アガロースゲル上で分離した。図３Ｂに示すように、試料１６を、抽出緩衝液中の３％エタノールで、６５℃で３分間処理した際、ｔｃｄＢ遺伝子および内部対照は、強い増幅を示した（図３Ｂ、レーンＡおよびＤ）。しかし、試料１６を、３％エタノールで加熱を伴わずに、または６５℃の加熱のみで処理した際、ｔｃｄＢ増幅はまったく起こらなかった（図３Ｂ、レーンＢおよびＣ）。この結果は、３％エタノールを、６５℃で３〜５分間のインキュベーションと組み合わせたものが、ＤＮＡ増幅のために標本から阻害を減少させる際、最適であり、そして煮沸に匹敵することを示した。いくつかの試料において、加熱工程を伴わない抽出緩衝液中の有機溶媒の添加は、煮沸法に比較した際、同じ量のアンプリコンを示す。
【0043】
実施例２ヒト糞便試料を用いた、エタノールを含みまたは含まずに抽出した核酸の等温増幅
レコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）およびニック形成酵素関連反応（ＮＥＡＲ）等温増幅を用いて、核酸増幅に対する阻害効果を減少させる際の有機溶媒を評価した。未精製糞便ＤＮＡを、図１に示す方法にしたがって、Ｃ．ディフィシレ感染（ＣＤＩ）患者から調製した。試料６６５４にはＲＰＡ Ｃ．ディフィシレ試験を用い、そして試料９６３７、９６３８、９６４８、９６６５、および９６６９にはＮＥＡＲ Ｃ．ディフィシレ試験を適用した。３％エタノールの添加を伴いまたは伴わずに、抽出緩衝液を用い、そして６５℃で５分間インキュベーションした。ＲＰＡおよびＮＥＡＲ等温増幅を用いることによって、Ｃ．ディフィシレ毒素Ｂ遺伝子（ｔｃｄＢ）を抽出ＤＮＡ試料から増幅した。Ａｘｘｉｎ Ｔ１６蛍光読み取り装置を用いることによって、増幅産物の相対量（ＲＦＵ：相対蛍光単位（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｕｎｉｔ））を測定した。図４および図５に結果を提供する。図４は、Ｃ．ディフィシレＲＰＡ等温増幅アッセイにおける未精製ＤＮＡの分析を例示する。３％エタノールを補充した抽出緩衝液（実線）または抽出緩衝液のみ（破線）を用いて、試料６６５４からＤＮＡを抽出し、一方、図５は、ＮＥＡＲ等温増幅を用いて、糞便試料から抽出したＤＮＡの分析を示す。抽出緩衝液中にエタノールを含まず（図５Ａ）または含み（図５Ｂ）、５つの糞便試料（試料９６３７、９６３８、９６４８、９６６５、および９６６９）から未精製ＤＮＡを抽出した。Ａｘｘｉｎ Ｔ１６蛍光読み取り装置を用いることによって、ｔｃｄＢの増幅を測定した。図５中のＮＴＣは、テンプレート不含対照を意味し、したがって、この反応にはテンプレートはまったく添加されなかった。
【0044】
有機溶媒を含有する抽出緩衝液から精製したＤＮＡ（図４実線および図５Ｂ）は、抽出緩衝液中に有機溶媒を含まずに精製したＤＮＡ（図４破線および図５Ａ）に比較して、より強いシグナルおよび迅速な増幅を生じた。これらの結果は、ＤＮＡ増幅の阻害が、抽出緩衝液中に３％エタノールを添加し、そして６５℃でインキュベーションすることによって、実質的に減少することを示す。
【0045】
実施例３細菌および寄生虫を含有するヒト糞便試料を用いた、有機溶媒を伴いまたは伴わずに抽出したＤＮＡの増幅の比較
本実施例で用いるヒト糞便試料は、Ｃ．ディフィシレ、志賀様毒素産生大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ジアルディア属（Ｇｉａｒｄｉａ）、クリプトスポリジウム属（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、およびＥ．ヒストリティカ（Ｅ． ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）に感染した患者由来であった。図１に関連して記載する方法を用いて、これらの臨床試料からＤＮＡを抽出した。Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ ｅａｓｙＭＡＧ自動化装置を用いることによってもまた、これらの試料からＤＮＡを精製し、そして比較のための対照として用いた。ＰＣＲ、レコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、およびニック形成酵素関連反応（ＮＥＡＲ）等温増幅を利用して、抽出核酸の品質および量を評価した。
【0046】
ＰＣＲ増幅：ＩＱパワーミックス（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）またはＳＹＢＲグリーナーマスターミックス（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のいずれかを用いて、２０μｌ体積で試験管または９６ウェルプレート中で、ＰＣＲ反応を行った。各病原体に対する特異的プライマーおよび／またはプローブを反応に使用した。ＳＹＢＲマスターミックスに関しては、ＰＣＲ増幅後、融解曲線分析を行った。
【0047】
図１に関連して記載する方法で精製したＤＮＡを用いることによって、多重リアルタイムＰＣＲを行って、ジアルディア属、クリプトスポリジウム属、およびＥ．ヒストリティカを検出した。ジアルディア属、クリプトスポリジウム属、またはＥ．ヒストリティカ陽性試料に関しては、３％エタノールで精製した未精製ＤＮＡおよびＢｉｏｍｅｒｉｅｕｘ ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ ｅａｓｙＭＡＧ自動化装置によって精製したＤＮＡは、類似のＤＮＡ増幅を示した。
【0048】
ニック形成酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）：Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）またはＭａｎｔａ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）を用いて、５０μｌ体積中でＮＥＡＲ反応を行った。Ｃ．ディフィシレ毒素Ｂ遺伝子、志賀毒素ｓｔｘ１遺伝子および志賀毒素ｓｔｘ２遺伝子をターゲティングする特異的プライマーおよびプローブを反応中で用いた。増幅シグナルを検出するため、Ａｘｘｉｎ Ｔ１６蛍光読み取り装置を用いた。ＮＥＡＲ試験を用いた、Ｃ．ディフィシレ陽性糞便試料に関する例を実施例２に示している。
【0049】
レコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）：[0085]ＴｗｉｓｔＤｘによって調製された凍結乾燥材料を用いて、５０μｌ体積中、ＲＰＡ反応を行った。Ｃ．ディフィシレ毒素Ｂ遺伝子、志賀毒素ｓｔｘ１遺伝子、志賀毒素ｓｔｘ２遺伝子、カンピロバクター属１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、およびサルモネラ属ｉｎｖＡ遺伝子をターゲティングする特異的プライマーおよびプローブを反応中で用いた。増幅シグナルを検出するため、Ａｘｘｉｎ Ｔ１６蛍光読み取り装置を用いた。低い割合の有機溶媒を用いることによって精製したＤＮＡ由来の毒素Ｂ遺伝子、志賀毒素ｓｔｘ１遺伝子、志賀毒素ｓｔｘ２遺伝子、カンピロバクター属１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、およびサルモネラ属ｉｎｖＡ遺伝子の増幅シグナルは、煮沸法を用いることによって、または商業的核酸精製系、Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ ｅａｓｙＭＡＧ自動化装置を用いることによって精製したＤＮＡテンプレートと同じ強度を示した。サルモネラ属ｉｎｖＡ遺伝子（試料３、４、６、７、および８）および志賀毒素ｓｔｘ２遺伝子（試料３および１２）に関するＲＰＡ試験を、図６および７に示す。図６は、糞便試料から抽出したＤＮＡを用いたサルモネラ属ＲＰＡ試験を示す。煮沸法（図６Ａに例示するとおり）または６５℃で３分間のインキュベーションを伴う３％エタノールを含有する抽出緩衝液（図６Ｂに例示するとおり）を用いて、５つのサルモネラ属陽性試料（試料３、４、６、７、および８）から未精製ＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ試料からのサルモネラ属ｉｎｖＡの増幅曲線を示す。ＮＴＣ：テンプレート不含対照。
【0050】
図７Ａおよび７Ｂは、糞便試料から抽出したＤＮＡにおける志賀毒素ｓｔｘ２遺伝子を検出するＲＰＡ試験を例示する。煮沸法（図７Ａに例示するとおり）または６５℃で３分間のインキュベーションを伴う３％エタノールを含有する抽出緩衝液（図７Ｂに例示するとおり）を用いて、２つのｓｔｘ２陽性試料（試料３および１２）から未精製ＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ試料からの志賀ｓｔｘ２遺伝子の増幅曲線を示す。
【0051】
煮沸法または本発明に記載する方法から調製したＤＮＡ試料に関して、増幅曲線上の増幅出発時間および最高終点読み取りは匹敵した。本発明に提示する組成物および方法を用いて、結果は、細菌および寄生虫を含有するヒト糞便試料から抽出したＤＮＡの品質および量が、ＰＣＲおよび等温増幅に十分であることを例示する。
【0052】
実施例４ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含有する培養物およびヒト糞便試料を用いた、エタノールを伴いまたは伴わずに抽出した核酸の増幅の比較
ウイルス核酸抽出のための緩衝液および方法の効率を評価するため、本実施例を提供する。アデノウイルスおよびノロウイルス陽性臨床糞便試料を本実施例で用いた。図１に関連して記載する方法を用いて、これらの試料から核酸を抽出した。抽出核酸、およびアデノウイルスのヘキソン（ｈｅｘｏｎ）遺伝子（カプシドタンパク質ＩＩ）をターゲティングする特異的プライマーを用いて、リアルタイムＰＣＲを実行して、アデノウイルス陽性試料から抽出した核酸の品質および量を評価した。アデノウイルス陽性試料から抽出した未精製ＤＮＡは、アデノウイルスカプシドタンパク質ＩＩ遺伝子の非常に強い増幅を示した。リアルタイムＰＣＲで、同じ量のＤＮＡを用いた際、図１に関連して記載する方法を用いることによって精製されたＤＮＡに関する閾値サイクル（Ｃｔ）値は、ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ ｅａｓｙＭＡＧ自動化装置で精製したＤＮＡとほぼ同じであった。
【0053】
図８は、ノロウイルス陽性糞便試料から抽出されたＲＮＡの逆転写およびＰＣＲ分析を例示する。本発明で提示する、３％エタノールを含む抽出緩衝液を用いて、ノロウイルス陽性試料から抽出したＲＮＡを、煮沸、煮沸なし、または有機溶媒を含まない６５℃でのインキュベーションで抽出したＲＮＡに比較した。ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ ｅａｓｙＭＡＧ自動化装置を用いてもまたＲＮＡを抽出し、そして対照として利用した。次いで、逆転写のために、ｄｓＤＮアーゼとともに、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｍａｘｉｍａ Ｈマイナス第一鎖ｃＤＮＡ合成キットを用いた。逆転写後、ノロウイルスのＯＲＦ１領域の３’端をターゲティングする特異的プライマーをリアルタイムＰＣＲで用いた。有機溶媒処理試料由来のノロウイルスのターゲット領域の３３１ｂｐバンドを、図８に例示するように増幅した。ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ ｅａｓｙＭＡＧ自動化装置で精製したＲＮＡを５倍多い出発材料量で対照として用いた。煮沸工程は、３％エタノールでのみ処理した試料に比較して、生物学的試料からのＲＮＡの収率を劇的に減少させた。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で分離した。結果は、本発明で提示する抽出緩衝液および方法が、ウイルスをロバストに溶解し、ＰＣＲおよび逆転写ＰＣＲに非常に適した核酸を放出させうることを立証する。
【0054】
実施例５本明細書に開示する核酸調製法を植物組織に適用することも可能である
植物組織を用いて、本発明で提示する抽出緩衝液の能力を試験するために、本実施例を提供する。図９は、ベンサミアナタバコの葉から抽出した未精製ＤＮＡを用いたＰＣＲ増幅を例示する。本発明で記載する方法を用いて、未精製植物ＤＮＡを抽出した。アクチン遺伝子の増幅を実線で示す。点線は、テンプレート不含対照（ＮＴＣ）を示す。ベンサミアナタバコ植物の葉から生体材料を得た。乳鉢を用いることによって、葉をすりつぶし、そして３％エタノールを含有する抽出緩衝液を用いて、スクイーズイージーチューブに移した（１００μｇ）。チューブをボルテックスし、そして活性炭フィルターチップを通じて、５００μｌのＰＢＳを含有する１．５ｍｌエッペンドルフチューブ内に、緩衝液１滴を絞り出した。エッペンドルフチューブを６５℃で３〜５分間インキュベーションした。抽出したＤＮＡ、およびベンサミアナタバコのアクチン遺伝子を特異的にターゲティングするプライマーを用いて、ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ上でリアルタイムＰＣＲ分析を行った。植物アクチン遺伝子のＰＣＲ増幅の成功は、本発明に記載する方法で植物組織から抽出したＤＮＡテンプレートを、ＰＣＲ反応に使用可能であることを立証した（図９に例示するとおり）。
【0055】
実施例６本明細書に開示するＤＮＡ抽出法を用いて、血液試料中の増幅阻害剤を排除するかまたは減少させることも可能である
血液によるＤＮＡ増幅の阻害を試験するため、本実施例を提供する。ヒト血液を５％の濃度でスパイク処理したＣ．ディフィシレ陽性臨床糞便試料をこの方法で用いた。抽出緩衝液および図１に関連して記載する方法を用い、スパイクした試料から抽出したＤＮＡを用いて、等温反応を実行した。３％エタノールを含む抽出緩衝液を含有するスクイーズチューブに、血液試料スワブを添加して、そして刻み目のマーカーで、スワブを折った。活性炭フィルターチップをスクイーズチューブの最上部に配置した後、１滴の抽出緩衝液を反応チューブ外に絞り出した。反応チューブを６５℃で３分間インキュベーションした後、５０μｌの抽出ＤＮＡをＣ．ディフィシレＲＰＡ反応に用いた。抽出核酸は、等温増幅反応において、ｔｃｄＢ遺伝子および内部対照を増幅可能であった。しかし、５％ヒト血液でスパイク処理した試料に関して、エタノールを含まない抽出緩衝液を用いた場合、未精製ＤＮＡからのＣ．ディフィシレのｔｃｄＢ遺伝子および内部対照の増幅は、ＲＰＡ試験において完全に抑制された。結果は、本発明が、血液試料から阻害剤を有効に除去したことを示す。
【0056】
実施例７低い割合の有機溶媒を、核酸抽出プロセス中の、溶解工程前、溶解工程中、および溶解工程後に添加することも可能である
この方法で用いるヒト糞便試料は、Ｃ．ディフィシレに感染した患者由来であった。有機溶媒を、核酸抽出中の異なる工程で添加した。最初の実験群において、有機溶媒を糞便試料に直接添加した。３％エタノールを含む２５０μｌのＰＢＳを含有するエッペンドルフチューブに、糞便試料（１００μｌ）を添加し、そして１０秒間ボルテックスした。次いで、これらを、エタノールを含まない抽出緩衝液を含有するスクイーズイージーチューブに移した。その後、図１に関連して記載する方法にしたがって、ＤＮＡを抽出した。第二の実験群において、糞便試料を溶解した後に、エタノールを添加した。エタノールを含まない抽出緩衝液を含有するスクイーズイージーチューブに糞便試料（１００μｌ）を添加し、そしてフィルターチップをチューブの最上部で折った。スクイーズイージーチューブをボルテックスし、そして約１００μｌの溶解試料をチューブから絞り出した。３％エタノールを１００μｌの溶解試料に添加し、そしてボルテックスした。溶解試料１滴（約２５〜３０μＬ）を反応チューブ中で希釈し、そして６５℃で３分間インキュベーションした。次いで、未精製ＤＮＡを直接ＰＣＲ増幅に用いた。第三の実験群において、有機溶媒を抽出緩衝液に添加した。図１に関連して記載する方法にしたがって、３％エタノールを含有する抽出緩衝液を用いて、糞便試料から未精製ＤＮＡを抽出した。
【0057】
上記に言及する方法を用いて調製した未精製ＤＮＡ、およびＴｗｉｓｔＤｘによって調製した凍結乾燥材料を用いて、５０μｌ体積中、ＲＰＡ反応を行った。Ｃ．ディフィシレ毒素Ｂ遺伝子をターゲティングする特異的プライマーおよびプローブを反応に用いた。ＤＮＡ増幅からのシグナルを検出するために、Ａｘｘｉｎ Ｔ１６蛍光読み取り装置を用いた。核酸抽出中の異なる工程でのエタノールの添加は、抽出されたＤＮＡからの増幅のシグナル強度にまったく相違を生じず；異なる方法で抽出したすべての未精製ＤＮＡで増幅成功が達成された（図１０に例示するとおり）。
【0058】
図１０は、核酸抽出中の異なる工程で、有機溶媒を添加することによって、増幅阻害剤が排除可能であることを例示する。未精製ＤＮＡをヒト糞便試料から抽出した。エタノール（３％）を抽出緩衝液（実線）に、希釈糞便試料（破線）に、または糞便試料溶解物（点線）に添加して、その後、６５℃で３分間インキュベーションした。抽出ＤＮＡ中のＣ．ディフィシレ毒素Ｂ遺伝子の増幅を、Ｃ．ディフィシレＲＰＡアッセイで測定した。結果は、ヒト糞便試料から、本発明の方法を用いて抽出したＤＮＡの品質および量が、ＰＣＲおよび等温増幅に適しており、そして有機溶媒処理は、核酸抽出前、抽出中、または抽出後、ＰＣＲまたは等温反応緩衝液中で希釈する前に、適用可能であることを示す。
【0059】
実施例８核酸抽出緩衝液におけるエタノールに対する代替物
本発明で提示する核酸抽出緩衝液中のエタノールに対する代替物として、有機溶媒群を試験した；例には、アセトン、メタノール、イソプロパノール、ブタノール、およびＤＭＳＯが含まれる。２つの陽性（試料６６５４および６７９９）および２つの陰性Ｃ．ディフィシレ試料（試料４２６８および６９０１）から、図１に関連して記載する方法を用いることによって、未精製ＤＮＡを抽出した。これらの４つの試料から、有機溶媒の添加を伴わずに調製した未精製ＤＮＡは、増幅の強い阻害効果を提示し、内部対照の増幅失敗を生じた（表１、カラム２）。各有機溶媒を用いて、抽出緩衝液中のエタノールを置換した。Ｃ．ディフィシレＲＰＡ試験を使用して、異なる有機溶媒で抽出したＤＮＡの品質および量を評価した。Ｃ．ディフィシレＲＰＡ試験を（１）失敗−検出可能な増幅シグナルなし、（２）損なわれた（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ）−対照に比較してより少ないアンプリコンシグナル、または（３）満足できる（ｎｏｍｉｎａｌ）−対照と同様のアンプリコンとスコア付けした。すべての有機溶媒は、既知の陽性試料で強いシグナルを生じた（表１）。これらの結果は、エタノール、アセトン、ブタノール、ＤＭＳＯを含むがこれらの有機溶媒に限定されない有機溶媒が、本発明で使用可能であることを立証する。
【0060】
表１． Ｃ．ディフィシレＲＰＡアッセイにおける、エタノールに対する代替物試験
【0061】
【表1】
【0062】
表２． ０．５％〜１５％の範囲のエタノール濃度でのＤＮＡ増幅
【0063】
【表2】
【0064】
さらに、異なる濃度の有機溶媒（０．５％〜２０％）を抽出緩衝液中で試験した。未精製ＤＮＡ抽出物由来のＣ．ディフィシレのｇｌｕＤおよびｔｃｄＢ遺伝子の増幅（試料４および１６）は、有意な相違を示さなかった。リアルタイムＰＣＲのＣｔ値は、異なる濃度のエタノールで抽出した未精製ＤＮＡに関して同様であった（表２）。ＲＰＡ結果は、抽出緩衝液中、０．５％〜１５％の範囲のエタノール濃度が、ＤＮＡ増幅に干渉しなかったことを示す（表２）。
【0065】
実施例９多重ＰＣＲおよび多重等温増幅における、自動化系に対する、本発明にしたがって抽出した核酸の品質および量の比較
志賀毒素遺伝子ｓｔｘ１およびｓｔｘ２に関して陽性である臨床糞便試料から、本発明に提示するＤＮＡ抽出緩衝液を用い、そして図１に関して記載する方法にしたがうことによって、ＤＮＡを抽出した。さらに、Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ ｅａｓｙＭＡＧから精製したＤＮＡが対照として働いた。ｓｔｘ１およびｓｔｘ２遺伝子をターゲティングする特異的プライマーを多重ＰＣＲおよび多重ＲＰＡ反応において利用した。これらの試料から抽出したＤＮＡを用いて、ｓｔｘ１およびｓｔｘ２遺伝子両方の増幅シグナルを、ＰＣＲ装置によって多重ＰＣＲにおいて、そしてＡｘｘｉｎ Ｔ１６蛍光読み取り装置によって多重ＲＰＡ反応において、検出した。本発明に提示する３％のエタノールを用いて抽出したＤＮＡは、Ｂｉｏｎｅｒｉｅｕｘ ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ ｅａｓｙＭＡＧから精製したＤＮＡと同じ、ｓｔｘ１およびｓｔｘ２の増幅シグナルを生じた。これは、本発明の方法を用いることによって抽出した未精製核酸の品質および量が、Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ ｅａｓｙＭＡＧ自動化装置から精製したＤＮＡと同等であることを示した。
【0066】
本発明は、特定の側面に関連して記載されてきており、これらはすべての観点で、限定ではなく例示であることが意図される。本発明の範囲から逸脱することなく、本発明の多くのありうる側面が作製可能であるため、本明細書に示すすべてのものは、例示であり、そして限定の意味ではないと解釈されることが理解されるものとする。本発明が関連する技術分野の一般の当業者には、その範囲から逸脱することのない、代替の側面が明らかであろう。
【0067】
前述から、本発明が、上述のすべての目標および目的を達成するようによく適応されたものであることがわかるであろう。特定の特徴およびサブコンビネーションが有用であり、そして他の特徴およびサブコンビネーションに関わりなく使用可能であることが理解されるであろう。これが意図され、そして特許請求の範囲内である。本発明は、非限定的に以下の態様を含む。
［態様１］
核酸抽出のために生物学的試料を処理するための方法であって：（ａ）生物学的試料を得て；（ｂ）０．５〜２０重量％の有機溶媒を含む抽出緩衝液中で生物学的試料を希釈して、混合物を形成し；（ｃ）混合物を、１５℃〜３５℃の温度で、５秒間〜３０分間インキュベーションして、さらなるプロセシングのため、生物学的試料中に存在する核酸を生物学的試料の少なくとも一部から抽出し；（ｄ）核酸の少なくとも一部を生物学的試料から分離し；（ｅ）１またはそれより多い増幅反応緩衝液中で核酸の少なくとも一部を希釈して、増幅混合物を形成し；そして（ｆ）増幅混合物を２５℃〜７０℃で１〜１０分間インキュベーションする工程を含む、前記方法。
［態様２］
前記生物学的試料が、１またはそれより多いヒト標本、細菌、ウイルス、寄生虫、糞便試料、体液、植物、または培養物を含む、態様１の方法。
［態様３］
前記有機溶媒が、アセトン、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の１またはそれより多くを含む、態様１の方法。
［態様４］
抽出緩衝液が３重量％〜１０重量％の有機溶媒を含み、有機溶媒がエタノール、アセトン、またはその組み合わせを含む、態様１の方法。
［態様５］
生物学的試料から核酸の少なくとも一部を分離する工程が、混合物をフィルターで濾過する工程を含む、態様１の方法。
［態様６］
フィルターが５０μｍ〜２５０μｍの孔サイズを有する、態様５の方法。
［態様７］
フィルターが多孔性プラスチック、多孔性ポリマー繊維、または多孔性ガラス繊維の１またはそれより多くを含む、態様５の方法。
［態様８］
フィルターが、活性炭に包埋されたガラス繊維フィルターを含む、態様７の方法。
［態様９］
前記生物学的試料を２５℃〜７０℃で３〜５分間インキュベーションする、態様１の方法。
［態様１０］
増幅反応緩衝液中で核酸の少なくととも一部を希釈する前に、核酸の少なくとも一部に、有機溶媒を、０．５〜２０重量％の濃度まで添加する工程をさらに含む、態様１の方法。
［態様１１］
有機溶媒を核酸の少なくとも一部に添加する工程が、エタノールを核酸の少なくとも一部に添加する工程を含む、態様１０の方法。
［態様１２］
前記インキュベーション温度が５０℃〜６５℃の間である、態様１の方法。
［態様１３］
有機溶媒の添加が、加熱、酵素消化、インキュベーション、分離、核酸沈殿、または溶出の１またはそれより多くの必要性を排除しうる、態様１の方法。
［態様１４］
前記加熱が９５℃またはそれより高い温度である、態様１３の方法。
［態様１５］
増幅反応緩衝液が、等温増幅、ＰＣＲ、配列決定、遺伝子型決定、およびハイブリダイゼーションに適した緩衝液である、態様１の方法。
［態様１６］
等温が、ニック形成酵素関連反応（ＮＥＡＲ）、レコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ループ仲介等温増幅（ＬＡＭＰ）、鎖置換増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、ローリングサークル増幅、および他の等温増幅法を含む、態様１５の方法。
［態様１７］
増幅反応において核酸の少なくとも一部を増幅する工程をさらに含む、態様１の方法。
［態様１８］
有機溶媒を含む抽出緩衝液を用いるが、加熱を行わずに、増幅を行う、態様１７の方法。
［態様１９］
有機溶媒を含む抽出緩衝液を用いて、加熱を行い、増幅を行う、態様１７の方法。
［態様２０］
抽出緩衝液が、核酸増幅に用いる抽出緩衝液を含む、態様１の方法。
［態様２１］
核酸抽出のために生物学的試料を処理するための方法であって：（ａ）生物学的試料を得て、該生物学的試料が糞便試料を含み；（ｂ）０．５〜２０重量％の有機溶媒を含む抽出緩衝液中で、生物学的試料を希釈して、混合物を形成し；（ｃ）混合物を１５℃〜７０℃の温度で、５秒間〜３０分間インキュベーションして、さらなるプロセシングのため、生物学的試料中に存在する核酸を生物学的試料の少なくとも一部から抽出し：（ｄ）核酸の少なくとも一部を生物学的試料から分離し；そして（ｅ）１またはそれより多い増幅反応緩衝液中で核酸の少なくとも一部を希釈して、増幅混合物を形成する工程を含む、前記方法。
［態様２２］
核酸抽出のために生物学的試料を処理するための方法であって：（ａ）生物学的試料を得て、該生物学的試料が、糞便、血液、唾液、または尿の１またはそれより多くを含み；（ｂ）生物学的試料を、０．５〜２０重量％の有機溶媒を含む抽出緩衝液中で希釈して、混合物を形成し；（ｃ）混合物を、１５℃〜３５℃の温度で、５秒間〜３０分間インキュベーションして、さらなるプロセシングのため、生物学的試料中に存在する核酸を生物学的試料の少なくとも一部から抽出し；（ｄ）生物学的試料から、核酸の少なくとも一部を分離し；（ｅ）有機溶媒を、核酸の少なくとも一部に、０．５〜２０重量％の濃度まで添加して、処理核酸を形成し；（ｆ）処理核酸の少なくとも一部を、１またはそれより多い増幅反応緩衝液中で希釈して、増幅混合物を形成し；そして（ｇ）増幅反応中の核酸の少なくとも一部を増幅する工程を含む、前記方法。