特許 6670963 細胞内抗原に対して指向された単一ドメイン抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6670963

(24)【登録日】2020年3月4日

(45)【発行日】2020年3月25日

(54)【発明の名称】細胞内抗原に対して指向された単一ドメイン抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/18 20060101AFI20200316BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20200316BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20200316BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20200316BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20200316BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20200316BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/18ZNA

   A61K39/395 N

   A61P35/00

   G01N33/53 N

   C12P21/08

   C12N15/13

【請求項の数】12

【外国語出願】

【全頁数】68

(21)【出願番号】特願2019-62231(P2019-62231)

(22)【出願日】2019年3月28日

(62)【分割の表示】特願2017-521577(P2017-521577)の分割

【原出願日】2015年10月23日

(65)【公開番号】特開2019-142885(P2019-142885A)

(43)【公開日】2019年8月29日

【審査請求日】2019年4月1日

(31)【優先権主張番号】62/067,908

(32)【優先日】2014年10月23日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/148,656

(32)【優先日】2015年4月16日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/188,353

(32)【優先日】2015年7月2日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/210,795

(32)【優先日】2015年8月27日

(33)【優先権主張国】US

【権利譲渡・実施許諾】特許権者において、権利譲渡・実施許諾の用意がある。

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】517136896

【氏名又は名称】シング バイオテクノロジー、エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】特許業務法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】シン、シュナンダ

【審査官】 田ノ上 拓自

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１４／１５３４９５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１４／０７０８６８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１３／０１７７９７９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 J. Biol. Chem., 2011年，Vol.286, No.5，p.3707-3716

【文献】 The EMBO J., 2007年，Vol.26, No.13，p.3250-3259

【文献】 Breast Cancer: Basic and Clinical Research, 2018年，Vol.12，p.1-7

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｐ ２１／０８

Ｇ０１Ｎ ３３／５３

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む、抗ＳＴＡＴ３単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）。

【請求項2】

配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。

【請求項3】

配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む、抗ＳＴＡＴ３単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）。

【請求項4】

配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。

【請求項5】

請求項１又は３に記載する抗ＳＴＡＴ３ ｓｄＡｂ又は請求項２又は４に記載するポリペプチドを含む、ＳＴＡＴ３によって媒介される疾患を治療するための薬学的組成物。

【請求項6】

治療対象が哺乳動物である、請求項５に記載の薬学的組成物。

【請求項7】

前記哺乳動物がヒトである、請求項６に記載の薬学的組成物。

【請求項8】

１つ以上の化合物と組み合わせて投与される、請求項５〜７の何れか１項に記載の薬学的組成物。

【請求項9】

前記１つ以上の化合物が転写阻害剤である、請求項８に記載の薬学的組成物。

【請求項10】

静脈内投与、筋肉内投与、経口投与、直腸投与、経腸投与、眼内投与、非経口投与、皮下投与、経皮投与、点眼薬としての投与、鼻腔スプレーとしての投与、吸入または噴霧による投与、局所投与、及び埋め込み型薬物としての投与の何れかで投与される、請求項５〜９の何れか１項に記載の薬学的組成物。

【請求項11】

対象由来の試料中の抗ＳＴＡＴ３ ｓｄＡｂの濃度を測定する方法であって、
前記抗ＳＴＡＴ３ ｓｄＡｂは、配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列を含み、
ａ．配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して指向されたマウスモノクローナル抗体を生成するステップと、
ｂ．前記対象から試料を得るステップと、
ｃ．前記マウスモノクローナル抗体及び前記試料を用いて定量的免疫アッセイを行って、対象におけるｓｄＡｂの量を決定するステップと、
ｄ．前記対象における前記ｓｄＡｂの量を定量するステップと、を含む、方法。

【請求項12】

前記定量的免疫アッセイが、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、特異的分析物標識再捕捉アッセイ（ＳＡＬＲＡ）、液体クロマトグラフィー、質量分析、蛍光活性化細胞選別、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本国際特許出願は、２０１４年１０月２３日出願の米国仮特許出願第６２／０６７，９０８号、２０１５年４月１６日出願の米国仮特許出願第６２／１４８，６５６号、２０１５年７月２日出願の米国仮特許出願第６２／１８８，３５３号、及び２０１５年８月２７日出願の米国仮特許出願第６２／２１０，７９５号の利益を主張するものであり、これらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表
本出願は、電子形式で配列表とともに出願されている。この配列表は、２０１５年９月３０日に作成され、２０１５年１０月２２日に最終更新された「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴＰ２５．ｔｘｔ」という題名のファイルとして提供されており、８３，０００バイトのサイズである。この配列表の電子形式での情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0003】

より大きいタンパク質またはポリペプチドにおける単一抗原結合タンパク質または抗原結合ドメインとしての単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）の使用により、従来の抗体または抗体断片の使用よりも有意な利点がいくつか提供される。ｓｄＡｂの利点としては、単一ドメインのみが高親和性及び高選択性を有する抗原に結合するよう要求されること、ｓｄＡｂが単一遺伝子から発現することができ、翻訳後修飾を必要としないこと、ｓｄＡｂが熱、ｐＨ、プロテアーゼ、及び他の変性剤または変性条件に対して高度に安定していること、ｓｄＡｂの調製が安価であること、ならびにｓｄＡｂが従来の抗体ではアクセス不能な標的及びエピトープにアクセスすることができることが挙げられる。

【0004】

ヌクレオチド及びタンパク質等の異常な細胞内または膜貫通成分によって引き起こされる癌等の疾患または状態がいくつか存在する。異常な成分の排除を使用して、これらの疾患または状態を予防または治療することができる。治療に利用可能な薬理学的化合物がいくつか存在するが、これらの化合物は、効果がないか、送達不能であるか、または罹患していない細胞に対して毒性があり得る。

【0005】

他の治療としては、外因性標的配列を含む治療用タンパク質または治療薬の使用が挙げられ、治療薬が細胞膜中の受容体によって認識され得、治療薬が細胞膜を通過してその細胞に進入することが可能になる。一旦治療薬がその細胞内に位置すると、治療薬は、標的成分と相互作用して、疾患を治療することができる。しかしながら、外因性標的配列の使用は、治療薬が標的とする細胞の種類を限定する場合があり、治療薬の製造費用を増大させる。

【0006】

前述の理由により、細胞に進入するために外因性標的配列または化学組成物に依存せず、かつ体内の罹患した細胞のみを標的とするのに有効な疾患を治療または予防する組成物及び方法が必要とされている。

【0007】

本発明は、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、これらのｓｄＡｂを含むタンパク質及びポリペプチドに関する。本ｓｄＡｂは、状態または疾患を引き起こす細胞内成分に対して指向される。本発明は、ｓｄＡｂ、タンパク質、及びポリペプチドをコードする核酸、ならびにｓｄＡｂを含む組成物も含む。本発明は、予防、治療、または診断目的のためのそれらの組成物、ｓｄＡｂ、タンパク質、またはポリペプチドの使用を含む。本発明は、本発明のｓｄＡｂを対象とするモノクローナル抗体の使用も含む。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明の一実施形態は、細胞内成分に対して指向された単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である。この細胞内成分は、例えば、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５ａ、ＳＴＡＴ５ｂ、ＳＴＡＴ６、ＴＮＦ−アルファ、及びＫＲＡＳであり得る。

【0009】

別の実施形態では、本発明は、抗ＳＴＡＴ３ ｓｄＡｂを対象とする。任意に、抗ＳＴＡＴ３ ｓｄＡｂは、配列番号３または配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む。

【0010】

別の実施形態では、本発明は、抗ＳＴＡＴ ｓｄＡｂをコードするアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、例えば、配列番号３または配列番号４に示されるポリペプチド等を対象とする。

【0011】

なお別の実施形態では、本発明は、宿主細胞を対象とし、この宿主細胞は、例えば、配列番号３または配列番号４に示されるアミノ酸等のｓｄＡｂのアミノ酸配列を発現する。

【0012】

本発明の一実施形態は、ｓｄＡｂまたはポリペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物である。任意に、ｓｄＡｂは、配列番号３または配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む抗ＳＴＡＴ３ ｓｄＡｂを含み、ポリペプチドは、配列番号３または配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを含む。

【0013】

本発明の別の実施形態は、対象におけるＳＴＡＴ３によって媒介される障害を診断するための方法であって、ａ）生体試料をｓｄＡｂまたはポリペプチドと接触させるステップと、ｂ）生体試料中のＳＴＡＴ３の量を決定するステップと、ｃ）ステップ（ｂ）で決定された量を標準と比較するステップとを含み、量の差が障害の存在を示す、方法である。

【0014】

本発明の別の実施形態は、ＳＴＡＴ３によって媒介される疾患もしくは障害を予防または治療するか、またはその疾患の再発を予防するか、または異常な細胞増殖によって引き起こされる癌もしくは疾患の治療に使用するための方法であって、抗ＳＴＡＴ３ ｓｄＡｂまたはポリペプチドを、それを必要とする対象に投与することを含む、方法である。任意に、ｓｄＡｂは、配列番号３または配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む抗ＳＴＡＴ３ ｓｄＡｂを含み、ポリペプチドは、配列番号３または配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを含む。

【0015】

本発明の一実施形態は、抗ＴＮＦ−アルファｓｄＡｂである。任意に、抗ＴＮＦ−アルファｓｄＡｂは、配列番号５、配列番号６、または配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む。本発明は、配列番号５、配列番号６、または配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドも含む。

【0016】

本発明の別の実施形態は、配列番号５、配列番号６、または配列番号７に示されるアミノ酸配列を発現する宿主細胞である。

【0017】

別の実施形態では、本発明は、ｓｄＡｂまたはポリペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物でもある。任意に、ｓｄＡｂは、配列番号５、配列番号６、または配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む抗ＴＮＦ−アルファｓｄＡｂを含み、ポリペプチドは、配列番号５、配列番号６、または配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを含む。

【0018】

本発明の別の実施形態は、対象におけるＴＮＦ−アルファによって媒介される障害を診断するための方法であって、ａ）生体試料をｓｄＡｂまたはポリペプチドと接触させるステップと、ｂ）生体試料中のＴＮＦ−アルファの量を決定するステップと、ｃ）ステップ（ｂ）で決定された量を標準と比較するステップとを含み、量の差が障害の存在を示す、方法である。

【0019】

一実施形態では、本発明は、ＴＮＦ−アルファによって媒介される疾患もしくは障害またはその疾患もしくは障害の再発を予防もしくは治療するか、または異常な細胞増殖によって引き起こされる癌もしくは疾患の治療に使用するための方法であって、抗ＴＮＦ−アルファｓｄＡｂまたはポリペプチドを、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、方法を記載する。任意に、抗ＴＮＦ−アルファｓｄＡｂは、配列番号５、配列番号６、または配列番号７に示されるアミノ酸配列を含み、ポリペプチドは、単離されたポリペプチドを含み、この単離されたポリペプチドは、配列番号５、配列番号６、または配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む。

【0020】

本発明の一実施形態は、抗ＫＲＡＳ ｓｄＡｂである。任意に、抗ＫＲＡＳ ｓｄＡｂは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む。一態様では、本発明は、単離されたポリペプチドを含み、この単離されたポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む。別の態様では、本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を発現する宿主細胞を含む。

【0021】

本発明の別の実施形態は、ｓｄＡｂまたはポリペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物である。任意に、ｓｄＡｂは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む抗ＫＲＡＳ ｓｄＡｂを含み、ポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを含む。

【0022】

本発明のさらなる実施形態は、対象におけるＫＲＡＳによって媒介される障害を診断するための方法であって、ａ）生体試料をｓｄＡｂまたはポリペプチドと接触させるステップと、ｂ）前記生体試料中のＫＲＡＳの量を決定するステップと、ｃ）ステップ（ｂ）で決定された量を標準と比較するステップとを含み、量の差が障害の存在を示す、方法である。任意に、ｓｄＡｂは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む抗ＫＲＡＳ ｓｄＡｂを含み、ポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを含む。

【0023】

本発明は、抗ＫＲＡＳ ｓｄＡｂを使用して疾患を治療する方法であって、有効量の抗ＫＲＡＳ ｓｄＡｂを、それを必要とする対象に投与することを含む、方法も含む。

【0024】

一実施形態では、本発明は、ＫＲＡＳによって媒介される疾患もしくは障害を治療するか、またはその疾患もしくは障害の再発を予防するか、または異常な細胞増殖によって引き起こされる癌もしくは疾患の治療に使用するための方法であって、抗ＫＲＡＳ ｓｄＡｂまたはポリペプチドを、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、方法を記載する。任意に、抗ＫＲＡＳ ｓｄＡｂは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、ポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを含む。

【0025】

一実施形態では、本発明は、本発明のｓｄＡｂを投与する方法であって、静脈内投与、筋肉内投与、経口投与、直腸投与、眼内投与、経腸投与、非経口投与、皮下投与、経皮投与、点眼薬としての投与、鼻腔スプレーとしての投与、吸入または噴霧による投与、局所投与、及び埋め込み型薬物としての投与を含む、方法を記載する。

【0026】

別の実施形態では、本発明は、本発明のｓｄＡｂを１つ以上の化合物と組み合わせて使用して、疾患を治療するか、疾患を予防するか、または疾患の再発を予防する方法を記載する。任意に、１つ以上の化合物は、転写阻害剤である。

【0027】

別の実施形態では、本発明は、ｓｄＡｂの濃度を測定する方法であって、ａ）ｓｄＡｂの１つ以上のドメインに対して指向されたマウスモノクローナル抗体を生成するステップと、ｂ）免疫アッセイを行って、対象におけるｓｄＡｂの量を決定するステップと、ｃ）対象におけるｓｄＡｂの量を定量するステップとを含む、方法を記載する。

【図面の簡単な説明】

【0028】

本発明のこれら及び他の特徴、態様、及び利点は、以下の記述、添付の特許請求の範囲、及び添付の図面に関してより良く理解されるであろう。

【図1】ＶＨＨ１３ 抗ＳＴＡＴ３ ｓｄＡｂ発現ベクターｐＴＴ２１−ｓｔｔ ＶＨＨ１３の概略マップである。

【図2】ＶＨＨ１４ 抗ＳＴＡＴ３ ｓｄＡｂ発現ベクターｐＴＴ２１−ｓｔｔ ＶＨＨ１４の概略マップである。

【図3】抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３ ＳＴＡＴ３（配列番号３）及び抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１４ ＳＴＡＴ３（配列番号４）を使用した免疫沈降アッセイの結果を示す。

【図4】抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３ ＳＴＡＴ３（配列番号３）を使用した免疫沈降アッセイの結果を示す。

【図5】０．５ｍｇ／ｋｇ／日で投薬したＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植モデルにおける抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂの成長阻害を図解する。

【図6】１ｍｇ／ｋｇ／１日２回〜２ｍｇ／ｋｇ／１日２回の範囲または２ｍｇ／ｋｇ／日の用量でのＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植モデルにおける抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂの成長阻害を図解する。

【図7】５ｍｇ／ｋｇ／１日２回で投薬したＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植モデルにおける抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂの成長阻害を図解する。

【図8】５ｍｇ／ｋｇ／１日２回で投薬したＤＵ１４５異種移植モデルにおける抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂの成長阻害を図解する。

【図9】５ｍｇ／ｋｇ／１日２回で投薬したＰＡＮＣ−１異種移植モデルにおける抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）の成長阻害を図解する。

【図10】１ｍｇ／ｋｇ／１日３回で投薬したＭＣＦ−７異種移植モデルにおける抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂの成長阻害を図解する。

【図11】１ｍｇ／ｋｇ／１日３回で投薬したＢＴ−４７４異種移植モデルにおける抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂの成長阻害を図解する。

【図12】Ｕ９３７細胞におけるＴＮＦ−アルファの細胞毒性を図解する。

【図13】Ｕ９３７細胞におけるスタウロスポリンの細胞毒性を図解する。

【図14】抗ＴＮＦ−アルファｓｄＡｂによるＴＮＦ−アルファ細胞毒性の阻害を図解する。

【発明を実施するための形態】

【0029】

本明細書で使用される場合、以下の用語及びそれらの変形は、異なる意味がかかる用語が使用される文脈によって明確に意図されない限り、以下に示される意味を有する。

【0030】

本明細書で使用される「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という用語、ならびに同様の指示対象は、文脈におけるそれらの使用の別段の指示がない限り、単数形及び複数形の両方を包含するよう解釈されるべきである。

【0031】

「抗原決定基」という用語は、抗原結合分子（本発明のｓｄＡｂまたはポリペプチド等）によって、より具体的には、抗原結合分子の抗原結合部位によって認識される抗原上のエピトープを指す。「抗原決定基」及び「エピトープ」という用語は、同義に使用されてもよい。特異的抗原決定基、エピトープ、抗原、またはタンパク質に結合することができ、それに対する親和性を有し、かつ／またはそれに対する特異性を有するアミノ酸配列は、それらの抗原決定基、エピトープ、抗原、またはタンパク質「に対する」または「に対して指向される」と考えられる。

【0032】

本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」等のこの用語の変形は、他の添加物、成分、整数、またはステップを排除するようには意図されていない。

【0033】

本明細書に記載のｓｄＡｂ、ポリペプチド、及びタンパク質は、アミノ酸残基が同様の化学構造を有する別のアミノ酸残基で置き換えられ、かつポリペプチドの機能、活性、または他の生物学的特性にほとんどまたは本質的に全く影響を及ぼさないアミノ酸置換と一般に言われ得るいわゆる「保存的」アミノ酸置換を含むことができることが企図される。保存的アミノ酸置換は、当該技術分野で周知である。保存的置換は、以下の基（ａ）〜（ｅ）、（ａ）小さい脂肪族、非極性、またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、及びＧｌｙ、（ｂ）極性の負荷電残基及びそれらの（非荷電）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、及びＧｌｎ、（ｃ）極性の正荷電残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、及びＬｙｓ、（ｄ）大きい脂肪族非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、及びＣｙｓ、ならびに（ｅ）芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、及びＴｒｐ内のあるアミノ酸が同一の基内の別のアミノ酸により置換される置換である。他の保存的置換としては、ＡｌａのＧｌｙもしくはＳｅｒへの置換、ＡｒｇのＬｙｓへの置換、ＡｓｎのＧｌｎもしくはＨｉｓへの置換、ＡｓｐのＧｌｕへの置換、ＣｙｓのＳｅｒへの置換、ＧｌｎのＡｓｎへの置換、ＧｌｕのＡｓｐへの置換、ＧｌｙのＡｌａもしくはＰｒｏへの置換、ＨｉｓのＡｓｎもしくはＧｌｎへの置換、ＩｌｅのＬｅｕもしくはＶａｌへの置換、ＬｅｕのＩｌｅもしくはＶａｌへの置換、ＬｙｓのＡｒｇ、Ｇｌｎ、もしくはＧｌｕへの置換、ＭｅｔのＬｅｕ、Ｔｙｒ、もしくはＩｌｅへの置換、ＰｈｅのＭｅｔ、Ｌｅｕ、もしくはＴｙｒへの置換、ＳｅｒのＴｈｒへの置換、ＴｈｒのＳｅｒへの置換、ＴｒｐのＴｙｒへの置換、ＴｙｒのＴｒｐへの置換、及び／またはＰｈｅのＶａｌ、Ｉｌｅ、もしくはＬｅｕへの置換が挙げられる。

【0034】

本明細書で使用される「ドメイン」は、一般に、抗体鎖の球状領域、具体的には、重鎖抗体の球状領域、またはかかる球状領域から本質的になるポリペプチドを指す。

【0035】

ｓｄＡｂのアミノ酸配列及び構造は、典型的には、４つのフレームワーク領域または「ＦＲ」で構成されており、これらは、それぞれ、「フレームワーク領域１」または「ＦＲ１」、「フレームワーク領域２」または「ＦＲ２」、「フレームワーク領域３」または「ＦＲ３」、及び「フレームワーク領域４」または「ＦＲ４」と称される。これらのフレームワーク領域は、３つの相補性決定領域または「ＣＤＲ」によって中断されており、これらは、それぞれ、「相補性決定領域１」または「ＣＤＲ１」、「相補性決定領域２」または「ＣＤＲ２」、及び「相補性決定領域３」または「ＣＤＲ３」と称される。

【0036】

本明細書で使用される場合、「ヒト化ｓｄＡｂ」という用語は、天然に存在するＶＨＨ配列のアミノ酸配列における１つ以上のアミノ酸残基が、ヒト由来の従来の４鎖抗体由来のＶＨドメインにおける対応する位置に生じるアミノ酸残基のうちの１つ以上に置き換えられたｓｄＡｂを意味する。これは、当該技術分野で周知の方法によって行うことができる。例えば、ｓｄＡｂのＦＲは、ヒト可変ＦＲに置き換えられ得る。

【0037】

本明細書で使用される場合、「単離された」核酸またはアミノ酸は、それが通常会合される少なくとも１つの他の成分、例えば、その源もしくは媒体、別の核酸、別のタンパク質／ポリペプチド、別の生物学的成分もしくは巨大分子、または汚染物質、不純物、もしくは微量成分から分離されている。

【0038】

「哺乳動物」という用語は、哺乳類クラスに属する個体として定義され、ヒト、家畜及び牧畜、ならびに動物園の動物、スポーツ用動物、及びペット動物、例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌ、及びネコが挙げられるが、これらに限定されない。

【0039】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、薬学的投与に適合するありとあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等を包含するよう意図されている。好適な担体については、本分野における標準的基準文書であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に記載されている。かかる担体または希釈剤の好ましい例としては、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、及び５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソーム、カチオン性脂質、及び固定油等の非水ビヒクルも使用され得る。薬学的に活性な物質のためのかかる媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。いずれの従来の媒体または薬剤も上で定義される治療薬に適合しない場合を除き、本発明の組成物におけるそれらの使用が企図される。

【0040】

「定量的免疫アッセイ」とは、抗体を使用して試料中に存在する抗原の量を測定する任意の手段を指す。定量的免疫アッセイを行うための方法としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、特異的分析物標識再捕捉アッセイ（ＳＡＬＲＡ）、液体クロマトグラフィー、質量分析、蛍光活性化細胞選別等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0041】

「溶液」という用語は、溶媒及び溶質を含む組成物を指し、真溶液及び懸濁液を包含する。溶液の例としては、固体、液体、または液体中溶解されたガス、及び液体中に懸濁された粒子状物質またはミセルが挙げられる。

【0042】

「特異性」という用語は、特定の抗原結合分子または抗原結合タンパク質分子が結合することができる異なる種類の抗原または抗原決定基の数を指す。抗原結合タンパク質の特異性は、親和性及び／または結合力に基づいて決定され得る。抗原の抗原結合タンパク質との解離の平衡定数（ＫＤ）によって表される親和性は、抗原結合タンパク質上の抗原決定基と抗原結合部位との間の結合強度の尺度であり、ＫＤ値が低いほど、抗原決定基と抗原結合分子との間の結合強度が強い（あるいは、親和性は、１／ＫＤである親和性定数（ＫＡ）としても表され得る）。当業者に明らかであるように、親和性は、目的とする特異的抗原に応じて決定され得る。結合力は、抗原結合分子と抗原との間の結合強度の尺度である。結合力は、抗原結合分子上の抗原決定基とその抗原結合部位との間の親和性にも抗原結合分子上に存在する関連結合部位の数にも関連している。抗原結合タンパク質の抗原または抗原決定基への特異的結合は、例えば、スキャッチャード分析及び／または競合的結合アッセイ、例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、及びサンドイッチ競合アッセイ等の任意の既知の様式によって決定され得る。

【0043】

本明細書で使用される場合、「組換え」という用語は、本発明のｓｄＡｂを産生するために使用される遺伝子操作方法（例えば、クローニング及び増幅）の使用を指す。

【0044】

「単一ドメイン抗体」、「ｓｄＡｂ」、または「ＶＨＨ」は、一般に、３つの相補性決定領域によって中断されている４つのフレームワーク領域から成るアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはタンパク質として定義され得る。これは、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４として表される。本発明のｓｄＡｂは、ｓｄＡｂアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはタンパク質も含む。典型的には、ｓｄＡｂは、ラマ等のラクダ科動物において産生されるが、当該技術分野で周知の技法を使用して合成的に生成することもできる。本明細書で使用される場合、天然に存在する重鎖抗体中に存在する可変ドメインは、それらを「ＶＨドメイン」と称される従来の４鎖抗体中に存在する重鎖可変ドメイン及び「ＶＬドメイン」と称される従来の４鎖抗体中に存在する軽鎖可変ドメインと区別するために「ＶＨＨドメイン」とも称される。「ＶＨＨ」及び「ｓｄＡｂ」は、本明細書では同義に使用される。ｓｄＡｂまたはポリペプチドのアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔら（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、ＵＳ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ、公開番号９１）によって提供される一般的なＶＨドメイン番号付けに従う。この番号付けに従って、ｓｄＡｂのＦＲ１は、１〜３０位にアミノ酸残基を含み、ｓｄＡｂのＣＤＲ１は、３１〜３６位にアミノ酸残基を含み、ｓｄＡｂのＦＲ２は、３６〜４９位にアミノ酸を含み、ｓｄＡｂのＣＤＲ２は、５０〜６５位にアミノ酸残基を含み、ｓｄＡｂのＦＲ３は、６６〜９４位にアミノ酸残基を含み、ｓｄＡｂのＣＤＲ３は、９５〜１０２位にアミノ酸残基を含み、ｓｄＡｂのＦＲ４は、１０３〜１１３位にアミノ酸残基を含む。

【0045】

「合成」という用語は、インビトロ化学または酵素合成による産生を指す。

【0046】

本明細書で使用される「標的」という用語は、ｓｄＡｂによって認識される任意の成分、抗原、または部分を指す。「細胞内標的」という用語は、細胞内に存在する任意の成分、抗原、または部分を指す。「膜貫通標的」とは、細胞膜内に位置する成分、抗原、または部分である。「細胞外標的」とは、細胞外に位置する成分、抗原、または部分を指す。

【0047】

本明細書で使用される「治療組成物」とは、薬学的組成物、遺伝子材料、生物製剤、及び他の物質等の治療効果を有するよう意図されている物質を意味する。遺伝子材料としては、遺伝子ベクター、遺伝子調節要素、遺伝子構造要素、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の直接または間接的遺伝子治療効果を有するよう意図されている物質が挙げられる。生物製剤としては、生き物であるか、または治療効果を有するよう意図されている生き物由来の物質が挙げられる。

【0048】

本明細書で使用される場合、「治療有効量」及び「予防有効量」とは、疾患または疾患の明らかな症状の治療、予防、または管理において治療利益を提供する量を指す。治療有効量は、疾患、疾患の症状、または疾患素因を治すか、治癒するか、緩和するか、軽減するか、変化させるか、矯正するか、改善するか、改良するか、またはそれに作用する目的で、疾患もしくは状態、疾患の症状、または疾患素因を治療することができる。特定治療有効量は、通常の医師によって容易に決定され得、当該技術分野で既知の要因、例えば、疾患の種類、患者の病歴及び年齢、病期、ならびに他の治療薬の投与等によって変動し得る。

【0049】

本発明は、細胞内成分に対して指向された単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ならびにこれらのｓｄＡｂを含むタンパク質及びポリペプチド、ならびにこれらのタンパク質及びポリペプチドをコードするヌクレオチドに関する。本発明は、細胞間、経細胞、及び細胞外標的または抗原に対して指向されたｓｄＡｂにも関し得る。本発明は、ｓｄＡｂ、タンパク質、及びポリペプチドをコードする核酸、ならびにｓｄＡｂを含む組成物も含む。本発明は、予防、治療、または診断目的のためのそれらの組成物、ｓｄＡｂ、タンパク質、またはポリペプチドの使用を含む。

【0050】

ｓｄＡｂは、ｓｄＡｂを機能的抗原結合ドメインまたはタンパク質としての使用に非常に有利にするいくつかの特有の構造特性及び機能特性を有する。ｓｄＡｂは、軽鎖可変ドメインの不在下で抗原に機能的に結合し、単一の比較的小さい機能的抗原結合構造単位、ドメイン、またはタンパク質として機能することができる。これは、ｓｄＡｂを、それら自体が抗原結合タンパク質またはドメインとして機能しないが、抗原に結合するためにＦａｂ断片またはＳｃＦｖ断片等の従来の抗体断片と結合されなければならない従来の抗体のドメインと区別する。

【0051】

ｓｄＡｂは、当該技術分野で周知の方法を使用して得ることができる。例えば、ｓｄＡｂを得るための一方法としては、（ａ）ラクダ科動物を１つ以上の抗原で免疫化すること、（ｂ）末梢リンパ球を免疫化されたラクダ科動物から単離し、全ＲＮＡを得て、対応するｃＤＮＡを合成すること、（ｃ）ＶＨＨドメインをコードするｃＤＮＡ断片のライブラリを構築すること、（ｄ）ＰＣＲを使用してステップ（ｃ）で得られたＶＨＨドメインコードｃＤＮＡをｍＲＮＡに転写し、このｍＲＮＡをリボソームディスプレイ形式に変換し、リボソームディスプレイによってＶＨＨドメインを選択すること、及び（ｅ）好適なベクターでＶＨＨドメインを発現させ、任意に発現したＶＨＨドメインを精製することが挙げられる。

【0052】

本発明のｓｄＡｂを得る別の方法は、核酸を合成し、続いてインビボまたはインビトロで核酸を発現させる技法を使用してｓｄＡｂをコードする核酸を調製することによる。さらに、本発明のｓｄＡｂ、ポリペプチド、及びタンパク質は、タンパク質、ポリペプチド、または他のアミノ酸配列を調製するための合成または半合成技法を使用して調製することができる。

【0053】

本発明のｓｄＡｂは、一般に、野生型標的における本発明のｓｄＡｂが結合する抗原決定基もしくはエピトープと本質的に同じ１つ以上の抗原決定基もしくはエピトープを含有する標的の全ての天然に存在するまたは合成の類似体、変異形、変異体、対立遺伝子、部分、及び断片に結合するか、またはそれらの標的の類似体、変異形、変異体、対立遺伝子、部分、及び断片に少なくとも結合する。本発明のｓｄＡｂは、本発明のｓｄＡｂが野生型標的に結合する親和性及び特異性と同じか、またはそれよりも高いもしくは低い親和性及び／または特異性を有する類似体、変異形、変異体、対立遺伝子、部分、及び断片に結合し得る。本発明のｓｄＡｂが、この標的のいくつかの類似体、変異形、変異体、対立遺伝子、部分、及び断片に結合するが、他には結合しないことも本発明の範囲内で企図される。加えて、本発明のｓｄＡｂは、ヒト化されてもよく、一価もしくは多価であってもよく、かつ／または多特異性であってもよい。さらに、本発明のｓｄＡｂは、標的タンパク質のリン酸化形態、ならびに標的タンパク質の非リン酸化形態に結合することができる。ｓｄＡｂは、アルブミン等の他の分子または他の巨大分子に連結されてもよい。

【0054】

加えて、ｓｄＡｂが多価である、すなわち、ｓｄＡｂが標的の２つ以上の異なるエピトープに対して指向された２つ以上のタンパク質またはポリペプチドを有し得ることは、本発明の範囲内である。かかる多価ｓｄＡｂでは、タンパク質またはポリペプチドは、例えば、同じエピトープ、実質的に同等のエピトープ、または異なるエピトープに対して指向され得る。異なるエピトープは、同じ標的上に位置し得るか、または２つ以上の異なる標的上に存在し得る。

【0055】

本発明の１つ以上のｓｄＡｂの配列が１つ以上のリンカー配列で接続または連結され得ることも企図される。このリンカーは、例えば、セリン、グリシン、及びアラニンの組み合わせを含有するタンパク質配列であり得る。

【0056】

本発明のｓｄＡｂの部分、断片、類似体、変異体、変異形、対立遺伝子、及び／または誘導体が所望の使用に好適である限り、これらを使用することも本発明の範囲内である。

【0057】

本発明のｓｄＡｂが治療及び／または診断使用に主に意図されているため、それらは、哺乳類標的、好ましくはヒト標的に対して指向される。しかしながら、本明細書に記載のｓｄＡｂが、他の種由来の標的、例えば、霊長類または他の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、またはイヌ）及び具体的には疾患及び標的に関連する疾患に関連する障害の動物モデルの１つ以上の他の種由来の標的と交差反応性であることも可能である。

【0058】

別の態様では、本発明は、本発明のｓｄＡｂをコードする核酸に関する。かかる核酸は、例えば、遺伝子構築物の形態であり得る。

【0059】

別の態様では、本発明は、本発明のｓｄＡｂを発現するか、またはそれを発現することができ、かつ／または本発明のｓｄＡｂをコードする核酸を含有する宿主もしくは宿主細胞に関する。ｓｄＡｂの配列を使用して任意の生物のゲノムに挿入し、遺伝子組換え生物（ＧＭＯ）を作製することができる。例としては、植物、細菌、ウイルス、及び動物が挙げられるが、これらに限定されない。

【0060】

本発明はさらに、ｓｄＡｂを調製または生成するための方法、ｓｄＡｂをコードする核酸、かかるｓｄＡｂを発現するか、またはそれを発現することができる宿主細胞、本発明のｓｄＡｂを含有する生成物及び組成物に関する。

【0061】

本発明はさらに、本明細書に記載のｓｄＡｂ、ｓｄＡｂをコードする核酸、宿主細胞、生成物、及び組成物の適用及び使用に関する。かかる生成物または組成物は、例えば、疾患の治療もしくは予防用の薬学的組成物、または診断に使用するための生成物もしくは組成物であり得る。ｓｄＡｂを様々なアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ及び質量分析アッセイに使用して、ｓｄＡｂの血清及び組織濃度を測定することができる。

【0062】

別の態様では、本発明の１つ以上のｓｄＡｂをコードする核酸が生物のゲノムに挿入されて、疾患を治療または予防することができる。

【0063】

本発明は、概して、ｓｄＡｂ、ならびに予防、治療、及び／または診断目的のために使用され得る、かかるｓｄＡｂのうちの１つ以上を含むか、またはそれらから本質的になるタンパク質またはポリペプチドに関する。

【0064】

本発明に詳述される方法及び組成物を使用して、本明細書に記載の疾患を治療することができ、これらの方法及び組成物を、本明細書に記載のまたはさもなければ既知のいずれの投薬量及び／または製剤とともに、かつ本明細書に記載のまたはさもなければ当業者に既知のいずれの投与経路で使用することができる。

【0065】

本発明のｓｄＡｂ、具体的には、本発明の抗ＳＴＡＴ３ＶＨＨ、抗ＫＲＡＳＶＨＨ、及び抗ＴＮＦ−アルファＶＨＨは、多発性骨髄腫、白血病（ＨＴＬＶ−１依存性、赤白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、及び大型顆粒リンパ球白血病（ＬＧＬ）、リンパ腫（ＥＢＶ関連／バーキット、菌状息肉腫、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、頭頸部癌、黒色腫、卵巣癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、肉腫、骨肉腫、カポジ肉腫、ユーイング肉腫、肝細胞癌、神経膠腫、神経芽細胞腫、星状細胞腫、結腸直腸癌、ウィルムス腫瘍、腎臓癌、膀胱癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、食道癌、皮膚扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、及び任意の転移性癌を含むが、これらに限定されない悪性疾患の治療及び予防のために使用され得る。ｓｄＡｂを癌患者に使用して、癌に起因する体重減少または悪液質を予防または低減する助けとなることができる。

【0066】

本発明のｓｄＡｂ、具体的には、抗ＳＴＡＴ３及び抗ＴＮＦ−アルファｓｄＡｂは、自己免疫疾患（例えば、リウマチ性関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、細菌誘導性大腸炎、喘息、強皮症、ループス、脳脊髄炎、動脈炎、血管炎、糸球体腎炎、ブドウ膜炎、ブドウ膜網膜炎、多発性硬化症）、多発性嚢胞腎、皮膚疾患（例えば、乾癬、円形脱毛症、アトピー性皮膚炎、ケロイド／肥厚性瘢痕、脂肪腫、パジェット病、及び光線性角化症）、汗腺膿瘍、移植（例えば、固形臓器、骨髄、手、顔、肢、任意の身体部分）、癌及び加齢に関連した筋ジストロフィー及び筋肉疲労、子宮内膜症、黄斑変性、網膜変性、発作、癲癇、外傷性脳及び脊髄損傷、高血圧症、心臓肥大、アルツハイマー病、肺動脈高血圧症、２型糖尿病、ならびに強直性脊椎炎等であるが、これらに限定されない疾患の治療及び予防にも使用され得る。さらに、ｓｄＡｂは、奇病を標的とすることができる。これらの稀な奇病の例としては、トリプルネガティブ乳癌、膵臓癌、ＡＭＬ（急性骨髄性白血病）、頭頸部癌、多発性骨髄腫、及び化学療法耐性癌が挙げられるが、これらに限定されない。

【0067】

ウイルス感染は、感染細胞中の細胞内ウイルスタンパク質を標的とすることによって治療することができる。ＨＩＶ逆転写酵素等のウイルスタンパク質は、ウイルス生活環を阻止することができる。本発明のｓｄＡｂは、エボラＶＰ２４等の細胞内ウイルスタンパク質も標的とすることができ、それ故に、宿主の抗ウイルス免疫応答を停止するエボラの能力を阻止することができる。細胞内分子の過剰発現が存在する場合、本発明のｓｄＡｂを使用して、疾患を標的とすることができる。ハンチントン病は、ｓｄＡｂで治療することができる。

【0068】

本発明のｓｄＡｂは、１つ以上の化合物とともに使用され得る。例えば、本発明のｓｄＡｂは、例えば、クルクミン、レスベラトロル、ククルビタシンＡ、Ｂ、Ｅ、Ｉ、Ｑ、フラボピリドール、デオキシテトランゴマイシン、シクロペンテノン誘導体、Ｎ−アシルホモセリンラクトン、インジルビン誘導体、メイソインジゴ、チルホスチン、白金含有化合物（例えば、ＩＳ３−２９５）、ペプチド模倣薬、アンチセンスオリゴヌクレオチド、Ｓ３Ｉ−２０１、ホスホチロシントリペプチド誘導体、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤（例えば、ネルフィナビル、インジナビル、サキナビル、及びリトナビル）、ＪＳＩ−１２４、ＸｐＹＬ、Ａｃ−ｐＹＬＰＱＴＶ−ＮＨ２、ＩＳＳ ６１０、ＣＪ−１３８３、ピリメタミン、メトホルミン、アチプリモド、Ｓ３Ｉ−Ｍ２００１、ＳＴＸ−０１１９、Ｎ−［２−（１，３，４−オキサジアゾリル）］−４キノリンカルボキサミド誘導体、Ｓ３Ｉ−１７５７、ＬＹ５、５，８−ジオキソ−６（ピリジン−３−イルアミノ）−５，８，−ジヒドロ−ナフタレン−１−スルホンアミド、ウィサシンスチン（ｗｉｔｈａｃｉｎｓｔｉｎ）、Ｓｔａｔｔｉｃ、ＳＴＡ−２１、ＬＬＬ−３、ＬＬＬ１２、ＸＺＨ−５、ＳＦ−１０６６、ＳＦ−１０８７、１７ｏ、クリプトタンシノン、ＦＬＬ３２、ＦＬＬ６２、Ｃ１８８−９、ＢＰ−１１０８、及びＢＰ−１０７５、ガリエララクトン、ＪＱ１、５、１５ ＤＰＰ、ＷＰ１０６６、ニクロサミド、ＳＤ１００８、ニフロキサジド、クリプトタンシノン、ＢＢＩキノン、ならびにルキソリトニブリン酸塩等のＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤とともに使用され得る。１つ以上の化合物は、治療応答を増大させ、本発明のｓｄＡｂの有効性を増補し得る。加えて、ｓｄＡｂの有効性は、それをペプチド、ペプチド模倣薬、及び他の薬物（例えば、シメチジン、アトルバスタチン、セレコキシブ、メトホルミン、及びシメチジン等であるが、これらに限定されない）と組み合わせることによって増大し得る。加えて、抗ＳＴＡＴ３ ｓｄＡｂは、放射線療法に関して放射線抵抗性癌を放射線感受性癌に変換し得る。

【0069】

本発明の１つ以上のｓｄＡｂを組み合わせることができるか、または本発明のｓｄＡｂを他のｓｄＡｂと組み合わせることができることも企図される。

【0070】

本発明のある特定のｓｄＡｂが、ｓｄＡｂ上のさらなる標的タンパク質配列を用いることなく、かつ細胞表面受容体に結合して細胞膜を通過するようにｓｄＡｂを指向する外因性化合物を用いることなく、細胞膜を通過してその細胞に進入することができることが企図される。

【0071】

細胞膜を通過した後、これらのｓｄＡｂは、膜貫通または細胞内分子または抗原を標的とすることができる。これらの細胞内または膜貫通標的は、例えば、タンパク質、炭水化物、脂質、核酸、変異タンパク質、ウイルスタンパク質、及びプリオンであり得る。ｓｄＡｂ標的は、酵素、その細胞の構造タンパク質、細胞膜分子の細胞内部分、細胞小器官の膜内の分子、任意の種類のＲＮＡ分子、任意のＤＮＡまたは染色体領域、メチル化または非メチル化核酸、その細胞の合成機構内の部分的に集合した分子、二次メッセンジャー分子、及び細胞シグナル伝達機構内の分子として機能し得る。標的は、細胞質、核、細胞小器官、及び細胞膜内の全ての分子を含み得る。細胞膜において分泌されるか、または置き換えられる運命にある分子は、その細胞を出る前に細胞質内で標的とされ得る。

【0072】

ｓｄＡｂ標的は、ヒト、動物、植物、真菌、寄生生物、原生生物、細菌、ウイルス、プリオン、原核細胞、及び真核細胞に存在し得る。本発明のｓｄＡｂによって標的とされ得る細胞間及び細胞内シグナル伝達分子及びタンパク質群のいくつかの例は、癌遺伝子産物、ホルモン、サイトカイン、成長因子、神経伝達物質、キナーゼ（チロシンキナーゼ、セリンキナーゼ、及びスレオニンキナーゼ等）、ホスファターゼ、ユビキチン、環状ヌクレオチド、シクラーゼ（アデニリル及びグアニリル）、Ｇタンパク質、ホスホジエステラーゼ、ＧＴＰアーゼスーパーファミリー、免疫グロブリン（抗体、Ｆａｂ断片、結合剤、ｓｄＡｂ）、免疫グロブリンスーパーファミリー、イノシトールリン酸脂質、ステロイド受容体、カルモジュリン、ＣＤ群（例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８等）、転写因子、ＴＧＦ−ベータ、ＴＮＦ−アルファ及びベータ、ＴＮＦリガンドスーパーファミリー、Ｎｏｔｃｈ受容体シグナル伝達分子、ヘッジホッグ受容体シグナル伝達分子、Ｗｎｔ受容体シグナル伝達分子、Ｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達分子、カスパーゼ、アクチン、ミオシン、ミオスタチン、１２−リポキシゲナーゼ、１５−リポキシゲナーゼ、リポキシゲナーゼスーパーファミリー、逆転写酵素、ウイルス及びそれらのタンパク質、アミロイドタンパク質、コラーゲン、Ｇタンパク質共役型受容体、変異正常タンパク質、プリオン、Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍｙｃ、Ｓｒｃ、ＢＣＲ／ＡＢＬ、ＭＥＫ、Ｅｒｋ、Ｍｏｓ、Ｔｐｌ２、ＭＬＫ３、ＴＡＫ、ＤＬＫ、ＭＫＫ、ｐ３８、ＭＡＰＫ、ＭＥＫＫ、ＡＳＫ、ＳＡＰＫ、ＪＮＫ、ＢＭＫ、ＭＡＰ、ＪＡＫ、ＰＩ３Ｋ、シクロオキシゲナーゼ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５ａ、ＳＴＡＴ５ｂ、ＳＴＡＴ６、Ｍｙｃ、ｐ５３、ＢＲＡＦ、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ならびにケモカインである。

【0073】

ＫＲＡＳは、哺乳類ｒａｓ遺伝子ファミリー由来のＫｉｒｓｔｅｎ ｒａｓ癌遺伝子ホモログである。ＫＲＡＳは、小ＧＴＰアーゼスーパーファミリーのメンバーであるタンパク質をコードする。このタンパク質は、肺腺癌、粘液性癌、膵臓腺管癌、及び結腸直腸癌等の様々な悪性腫瘍に関与する。正常な条件下で、Ｒａｓファミリーメンバーは、細胞内膜区画化に基づくシグナル伝達系における細胞成長及び分化事象に影響を及ぼす。しかしながら、発癌性Ｒａｓは、細胞増殖及びアポトーシスの両方を制御するプロセスを調節解除し得る。

【0074】

抗ＫＲＡＳ ｓｄＡｂを、悪性細胞、例えば、結腸直腸癌、膵臓癌、胆道癌、肺癌、白血病、及び他の転移性悪性腫瘍に関与する細胞等におけるその役割を崩壊させるために野生型及び変異ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）を標的とするように開発した。特定の機構によって束縛されることなく、抗ＫＲＡＳ ｓｄＡｂがＫＲＡＳに結合し、悪性細胞におけるＫＲＡＳの下流シグナル伝達を阻止すると考えられる。さらに、抗ＫＲＡＳ ｓｄＡｂは、抗ＥＧＦＲ生物製剤（例えば、セツキシマブ及びパニツムマブ）に耐性を示す悪性腫瘍の治療に成功し得る。

【0075】

組換えヒト変異体ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）タンパク質を使用して、ＫＲＡＳもしくは変異体ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）のエピトープまたは他のＫＲＡＳ変異体に対して指向されるか、またはそれに結合することができるｓｄＡｂを、当該技術分野で周知の方法を使用して生成した。さらに、他のＫＲＡＳ変異体に対するｓｄＡｂも生成することができる。抗ＫＲＡＳ ｓｄＡｂを生成するために、組換え全長ヒトＫＲＡＳ（遺伝子ＩＤ：３８４５）を大腸菌で発現させた。

【0076】

いくつかのｓｄＡｂを得て、スクリーニングした。ＫＲＡＳ＿１３（配列番号１）と名付けられた１つの抗ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）ｓｄＡｂのＤＮＡ配列を以下に示す。

【化1】

【0077】

抗ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）ｓｄＡｂのアミノ酸配列（配列番号２）、ＫＲＡＳ＿１３を以下に示し、ＣＤＲには下線が引かれている。

【化2】

【0078】

さらに、本発明は、本発明の抗ＫＲＡＳ ｓｄＡｂの１つ以上のドメインに対して指向された１つ以上のマウスモノクローナル抗体を含む。このマウスモノクローナル抗体は、当業者に既知の方法によって生成することができ、例えば、このマウスモノクローナル抗体は、マウスハイブリドーマによって産生することができる。このマウスモノクローナル抗体を診断アッセイに使用することができ、例えば、この抗体をＥＬＩＳＡまたは質量分析アッセイ等の免疫アッセイに使用して、患者の血清中に存在する抗ＫＲＡＳ ｓｄＡｂの量を測定することができる。以下に記載されるように、ＰＡＮＣ−１ヒト膵臓癌細胞におけるＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）ｓｄＡｂの細胞毒性を試験した。

【0079】

ＳＴＡＴ３は、シグナル伝達及び転写機能の活性化の両方を保有するタンパク質のシグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ）ファミリーのメンバーである。ＳＴＡＴ３は、広範に発現され、ＥＧＦ、ＩＬ−６、ＰＤＧＦ、ＩＬ−２、及びＧ−ＣＳＦ等の様々なサイトカイン及び成長因子に応答してＤＮＡ結合タンパク質としてチロシン及び／またはセリンにおけるリン酸化によって活性化される。ＳＴＡＴ３リンタンパク質は、ＳＴＡＴファミリーの他のメンバーとともにホモ二量体及びヘテロ二量体を形成し、核に移動して様々な遺伝子の転写を調節し、結果として、細胞成長、アポトーシス、血管新生、免疫回避、及び生存等の多くの細胞過程において重要な役割を果たす。

【0080】

抗ＳＴＡＴ３ ｓｄＡｂは、患者及び他の生物に与えられて、リン酸化及び非リン酸化ＳＴＡＴ３によって引き起こされる疾患を治療し、かつ疾患の発症または疾患の再発を予防することができる。例えば、臓器移植及び骨髄移植を受けた患者は、彼らが服用する免疫抑制薬剤のため、皮膚ＳＣＣＡ及びＢＣＣＡにかかる危険性がより高い。抗ＳＴＡＴ３ ｓｄＡｂの投与により、この危険性を低減または排除することができる。再発の危険性がある悪性腫瘍の治療を受けた患者は、抗ＳＴＡＴ３ ｓｄＡｂでの治療から恩恵を受ける。家族病歴及びＨＬＡ型に基づいて、一部の個体は、ある種類の自己免疫疾患にかかる危険性が高く、その自己免疫疾患を発症する危険性を低減するためのｓｄＡｂでの治療から恩恵を受けることができる。乳癌の危険性は、近年のＮＣＩ研究で実証されているように、ＧＬＧ−３０２等の抗ＳＴＡＴ３薬剤の投与により低減され得る。

【0081】

ＳＴＡＴ３の阻害に加えて、抗ＳＴＡＴ３ ｓｄＡｂは、これらの分子間の相同性が高いという理由から、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５ａ、ＳＴＡＴ５ｂ、及びＳＴＡＴ６も阻害することができる。

【0082】

組換えヒトＳＴＡＴ３タンパク質を使用して、ＳＴＡＴ３のエピトープに対して指向されるか、またはそれに結合することができる抗ＳＴＡＴ ｓｄＡｂを産生した。抗ＳＴＡＴ３ ｓｄＡｂを生成するために、組換え全長ヒトＳＴＡＴ３（遺伝子ＩＤ：６７７４）をＳｆ９昆虫細胞でバキュロウイルスによって発現させた。この抗ＳＴＡＴ ｓｄＡｂを、図１及び２に示されるように、細菌細胞及び哺乳類細胞の両方で発現されたベクターにクローニングした。

【0083】

細胞成長、例えば、癌細胞成長の抑制等を阻害するために、本発明の抗ＳＴＡＴ３ ｓｄＡｂを使用して、細胞内のＳＴＡＴ３及び全ての他のＳＴＡＴ分子を標的とすることができる。加えて、抗ＳＴＡＴ３ ｓｄＡｂは、ＶＥＧＦによる乾癬及び黄斑変性等の他の増殖性疾患における細胞成長を阻害することができる。

【0084】

特定の作用機構に限定されることなく、抗ＳＴＡＴ３ ｓｄＡｂが、抗原提示細胞、例えば、宿主樹状細胞等中のＳＴＡＴ３濃度を低減することによって、癌誘発性免疫抑制を排除することができると考えられる。ＳＴＡＴ３阻害は、患者の先天性及び適応性免疫系（すなわち、樹状細胞、マクロファージ、好中球、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びＢ細胞）により抗癌応答を促進することができる。

【0085】

当該技術分野で周知の方法を使用して、いくつかの抗ＳＴＡＴ ｓｄＡｂを得て、以下に記載されるように、癌細胞成長を抑制し、かつ癌細胞株におけるアポトーシスを誘発する能力についてスクリーニングした。抗ＳＴＡＴ３ ｓｄＡｂの細胞毒性及び抗増殖性活性を試験した。加えて、抗ＳＴＡＴ３ ｓｄＡｂの耐性をインビトロ及びインビボで試験した。抗ＳＴＡＴ ｓｄＡｂの１つ以上のドメインに対して指向されたマウスモノクローナル抗体が以下に記載される。

【0086】

ＶＨＨ１３（配列番号３）と名付けられた１つの抗ＳＴＡＴ３ ｓｄＡｂのアミノ酸配列を以下に示す。

【化3】

３つのＣＤＲには下線が引かれている。

【0087】

ＶＨＨ１４（配列番号４）と名付けられた第２の抗ＳＴＡＴ３ ｓｄＡｂのアミノ酸配列を以下に示す。

【化4】

【0088】

この場合も同様に、３つのＣＤＲには下線が引かれている。得られた他の抗ＳＴＡＴ３ ｓｄＡｂのタンパク質配列は、以下のとおりである。
ＳＴＡＴ３＿１０（配列番号５）：

【化5】

ＳＴＡＴ３＿３４（配列番号６）：

【化6】

ＳＴＡＴ３＿１９（配列番号７）：

【化7】

ＳＴＡＴ３＿１４（配列番号８）：

【化8】

ＳＴＡＴ３＿３５（配列番号９）：

【化9】

ＳＴＡＴ３＿９（配列番号１０）：

【化10】

ＳＴＡＴ３＿３０（配列番号１１）：

【化11】

ＳＴＡＴ３＿２３（配列番号１２）：

【化12】

ＳＴＡＴ３＿２４（配列番号１３）：

【化13】

ＳＴＡＴ３＿３６（配列番号１４）：

【化14】

ＳＴＡＴ３＿１２（配列番号１５）：

【化15】

ＳＴＡＴ３＿１６（配列番号１６）：

【化16】

ＳＴＡＴ３＿１１（配列番号１７）：

【化17】

ＳＴＡＴ３＿２０（配列番号１８）：

【化18】

ＳＴＡＴ３＿２（配列番号１９）：

【化19】

ＳＴＡＴ３＿１５（配列番号２０）：

【化20】

ＳＴＡＴ３＿６（配列番号２１）：

【化21】

ＳＴＡＴ３＿３３（配列番号２２）：

【化22】

ＳＴＡＴ３＿１７（配列番号２３）：

【化23】

ＳＴＡＴ３＿２５（配列番号２４）：

【化24】

ＳＴＡＴ３＿３２（配列番号２５）：

【化25】

ＳＴＡＴ３＿１３（配列番号２６）：

【化26】

ＳＴＡＴ３＿３９（配列番号２７）：

【化27】

ＳＴＡＴ３＿４（配列番号２８）：

【化28】

ＳＴＡＴ３＿２９（配列番号２９）：

【化29】

【0089】

対応する抗ＳＴＡＴ３ ＤＮＡ配列は、以下のとおりである。

【化30】

【化31】

【化32】

【化33】

【化34】

【化35】

【化36】

【化37】

【化38】

【化39】

【化40】

【化41】

【化42】

【化43】

【化44】

【0090】

さらに、本発明は、本発明の抗ＳＴＡＴ３ ｓｄＡｂの１つ以上のドメインに対して指向された１つ以上のマウスモノクローナル抗体を含む。このマウスモノクローナル抗体は、当業者に既知の方法によって生成することができ、例えば、このマウスモノクローナル抗体は、マウスハイブリドーマによって産生することができる。このマウスモノクローナル抗体を診断アッセイに使用することができ、例えば、この抗体をＥＬＩＳＡ等の免疫アッセイに使用して、患者の血清中に存在する抗ＳＴＡＴ３ ｓｄＡｂの量を測定することができる。この方法が抗ＳＴＡＴ３ ｓｄＡｂに限定されず、この方法を使用して、本発明のｓｄＡｂのうちのいずれかに指向されたマウス抗体を産生することができることを理解されたい。

【0091】

ＴＮＦ−アルファ遺伝子は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーに属する多機能性炎症誘発性サイトカインをコードする。このサイトカインは、主にマクロファージによって分泌される。このサイトカインは、成長調節、分化、炎症、ウイルス複製、腫瘍形成、及び自己免疫疾患、ならびにウイルス、細菌、真菌、及び寄生虫感染を含む広範囲の生物学的過程の調節に関与する。腫瘍の出血性壊死の誘発に加えて、ＴＮＦが、腫瘍形成、腫瘍転移、ウイルス複製、敗血症性ショック、発熱、炎症、悪液質、及び自己免疫疾患、例えば、クローン病、及びリウマチ性関節炎、ならびに移植片対宿主疾患に関与することが見出された。

【0092】

本発明は、細胞によるＴＮＦ−アルファの分泌を阻止するように、細胞または細胞膜内のＴＮＦ−アルファ、具体的には、ヒトＴＮＦ−アルファに対して指向されたｓｄＡｂ、タンパク質、及びポリペプチドを提供する。

【0093】

本発明の抗ＴＮＦ−アルファｓｄＡｂ及びポリペプチドが、ＴＮＦ−アルファに関連し、かつ／またはそれによって媒介される疾患及び障害、例えば、炎症、リウマチ性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸症候群、多発性硬化症、アジソン病、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、１型糖尿病、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、男性不妊、多発性硬化症、重症筋無力症、天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、リウマチ性関節炎、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、血管炎、ならびに癌に起因する体重減少及び悪液質の予防及び／または治療のために使用され得ることが企図される。

【0094】

ＴＮＦ−アルファは、異なる形態で存在し、単量体及び三量体形態等の多量体形態がある。本発明のｓｄＡｂ、タンパク質、及びポリペプチドが、ＴＮＦ−アルファの異なる形態、すなわち、単量体及び多量体形態に結合することは本発明の範囲内である。したがって、本発明のｓｄＡｂ、タンパク質、及びポリペプチドがＴＮＦ−アルファに指向される場合、これが、ＴＮＦ−アルファの三量体形態に対して指向されたｓｄＡｂ、タンパク質、及びポリペプチドも含むことを理解されたい。

【0095】

ＴＮＦによるシグナル伝達が、３つの受容体結合部位を含有するＴＮＦ分子の三量体によるＴＮＦ受容体による架橋を伴うことが知られている（例えば、Ｐｅｐｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７４（１９９１），１４８３−１４８９を参照のこと）。

【0096】

組換えヒトＴＮＦ−アルファタンパク質を使用して、ＴＮＦ−アルファのエピトープに対して指向されるか、またはそれに結合することができるｓｄＡｂを生成した。抗ＴＮＦ−アルファｓｄＡｂを生成するために、組換え全長ヒトＴＮＦ−アルファ（遺伝子ＩＤ：７１２４）を大腸菌で発現させ、標的抗原として使用した。

【0097】

ＴＮＦ−アルファタンパク質に対するｓｄＡｂを３５個得た。これらの抗ＴＮＦ−アルファ抗体を配列相同性に基づいて３つの群に分けた。

【0098】

ＴＮＦ−アルファＶＨＨ６６と名付けられた第１の抗ＴＮＦ−アルファｓｄＡｂのアミノ酸配列（配列番号４５）ｓｄＡｂを以下に示す。

【化45】

３つのＣＤＲには下線が引かれている。

【0099】

ＴＮＦ−アルファＶＨＨ６９と名付けられた第２の抗ＴＮＦ−アルファｓｄＡｂのアミノ酸配列（配列番号４６）ｓｄＡｂを以下に示す。

【化46】

３つのＣＤＲには下線が引かれている。

【0100】

ＴＮＦ−アッファＶＨＨ６２と名付けられた第３の抗ＴＮＦ−アルファｓｄＡｂのアミノ酸配列（配列番号４７）ｓｄＡｂを以下に示す。

【化47】

【0101】

３つのＣＤＲには下線が引かれている。見つけられた他の抗ＴＮＦ−アルファｓｄＡｂは以下の配列を含み、この場合も同様に、ＣＤＲには下線が引かれている。
ＴＮＦ＿２（配列番号４８）：

【化48】

ＴＮＦ＿４６（配列番号４９）：

【化49】

ＴＮＦ＿７１（配列番号５０）：

【化50】

ＴＮＦ＿２１（配列番号５１）：

【化51】

ＴＮＦ＿３８（配列番号５２）：

【化52】

ＴＮＦ＿１８（配列番号５３）：

【化53】

ＴＮＦ＿３７（配列番号５４）：

【化54】

ＴＮＦ＿６６（配列番号５５）：

【化55】

ＴＮＦ＿６８（配列番号５６）：

【化56】

ＴＮＦ＿７８（配列番号５７）：

【化57】

ＴＮＦ＿６７（配列番号５８）：

【化58】

ＴＮＦ＿６（配列番号５９）：

【化59】

ＴＮＦ＿７（配列番号６０）：

【化60】

ＴＮＦ＿１３（配列番号６１）：

【化61】

ＴＮＦ＿６０（配列番号６２）：

【化62】

ＴＮＦ＿７３（配列番号６３）：

【化63】

ＴＮＦ＿６９（配列番号６４）：

【化64】

ＴＮＦ＿７６（配列番号６５）：

【化65】

ＴＮＦ＿６２（配列番号６６）：

【化66】

ＴＮＦ＿４３（配列番号６７）：

【化67】

ＴＮＦ＿１５（配列番号６８）：

【化68】

ＴＮＦ＿１１（配列番号６９）：

【化69】

ＴＮＦ＿１７（配列番号７０）：

【化70】

ＴＮＦ＿６３（配列番号７１）：

【化71】

ＴＮＦ＿２０（配列番号７２）：

【化72】

ＴＮＦ＿５８（配列番号７３）：

【化73】

ＴＮＦ＿２７（配列番号７４）：

【化74】

ＴＮＦ＿２８（配列番号７５）：

【化75】

ＴＮＦ＿４（配列番号７６）：

【化76】

ＴＮＦ＿１４（配列番号７７）：

【化77】

ＴＮＦ＿３（配列番号７８）：

【化78】

ＴＮＦ＿１（配列番号７９）：

【化79】

ＴＮＦ＿４５（配列番号８０）：

【化80】

ＴＮＦ＿２２（配列番号８１）：

【化81】

【0102】

以下に記載されるように、いくつかのＴＮＦ−アルファｓｄＡｂのインビトロ成長阻害を試験した。さらに、本発明は、本発明の抗ＴＮＦ−アルファｓｄＡｂの１つ以上のドメインに対して指向された１つ以上のマウスモノクローナル抗体を含む。このマウスモノクローナル抗体は、上述のように、当業者に既知の方法によって生成することができる。このマウスモノクローナル抗体を、診断アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ等の免疫アッセイ等に使用して、患者の血清中に存在する抗ＴＮＦ−アルファｓｄＡｂの量を測定することができる。

【0103】

ＲＡＦタンパク質は、細胞外シグナルを、細胞成長、分化、及び生存を制御するマイトジェン活性化タンパク質キナーゼカスケードに伝達する際に中央中間体としての役割を果たすセリン／トレオニン特異的キナーゼのファミリーである。ＢＲＡＦは、成長因子誘発刺激時にＲａｓファミリーのメンバーによって活性化されるＲＡＦファミリーのメンバーである。活性Ｒａｓは、ｃＲａｆ及びＢＲＡＦのヘテロ二量体化を誘導し、これにより、成長因子シグナルに応答する細胞におけるｃＲａｆ及びＢＲａｆの協同性の観察が説明され得る。ＢＲＡＦ遺伝子における活性化変異は、ヒト悪性黒色腫の大きな割合及び結腸癌のある割合に存在する。これらの変異の大半は、ＢＲＡＦの活性化区分内の残基５９９にバリンからグルタミン酸への変化をもたらす。

【0104】

抗ＢＲＡＦ ｓｄＡｂを、悪性細胞、例えば、結腸癌及び他の悪性腫瘍に関与する細胞等におけるその役割を崩壊させるために野生型及び変異ＢＲＡＦを標的とするように開発した。

【0105】

組換えヒトＢＲＡＦタンパク質を使用して、ＢＲＡＦのエピトープに対して指向されるか、またはそれに結合することができるｓｄＡｂを、当該技術分野で周知の方法を使用して生成した。

【0106】

さらに、本発明は、本発明の抗ＢＲＡＦ ｓｄＡｂの１つ以上のドメインに対して指向された１つ以上のマウスモノクローナル抗体を含む。このマウスモノクローナル抗体は、当業者に既知の方法によって生成することができる。このマウスモノクローナル抗体を診断アッセイに使用することができ、例えば、この抗体をＥＬＩＳＡ等の免疫アッセイに使用して、患者の血清中に存在する抗ＢＲＡＦ ｓｄＡｂの量を測定することができる。

【実施例】

【0107】

例１：抗ＳＴＡＴ３ ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂは、ＳＴＡＴ３に結合する
この例では、オクテットに基づく無標識アッセイを使用して、ＳＴＡＴ３に対する２つのＶＨＨ標的の親和性を測定した。抗ＳＴＡＴ３ ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂ、抗ＫＲＡＳ（陰性対照）、及びＧＳＴ−ＳＴＡＴ３（１６ｋＤａ一価抗原、Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＢｉｏＭａｒｔ ＃ＳＴＡＴ３−１４７６Ｈ）を、このアッセイで抗原プローブとして使用した。疎水性タンパク質専用のアミノプロピルシラン（ＡＰＳ）浸漬及び読み取りバイオセンサーを使用して、ＧＳＴ−ＳＴＡＴ３タンパク質をＰＢＳ中２０μｇ／ｍＬで捕捉した。その後、これらのプローブを、指示される濃度でＧＳＴ−ＳＴＡＴ３タンパク質、抗ＳＴＡＴ３ ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂ、または抗ＫＲＡＳを有するウェル中に浸漬させた。抗原の会合速度（オン速度）を測定した。これらのセンサーを水中１％ＢＳＡでクエンチした。これらのプローブをアッセイ緩衝液（ＰＢＳ）中に浸漬させ、解離速度（オフ速度）を測定した。

【0108】

抗原の抗原結合タンパク質との解離の平衡定数（ＫＤ）によって表される親和性を得られた親和性定数（ＫＡ）から決定し、ＫＤには、以下の表１に示されるように１：１グローバルフィット分析Ｆｏｒｔｅｂｉｏソフトウェアを使用した。０．９５を超えるＲ２値を有する曲線のＫＤ値を平均化することによって親和性を決定した。２５０ｎＭの抗ＳＴＡＴ３ ＶＨＨ１３データ点が外れ値であるため、これを除外した。抗ＳＴＡＴ３ ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂの親和性が１．１６×１０^−７であると決定した。抗ＫＲＡＳ ＶＨＨの親和性は決定されなかった。

【表1】

【0109】

例２：免疫沈降研究
ＳＴＡＴ３ ｓｄＡｂの特異性をヒト乳癌細胞でアッセイした。この例では、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞を５０％〜７０％コンフルエンスまで成長させた。その後、これらの細胞を、新たに調製した氷上の氷冷溶解緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、４００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＮＰ−４０、１０％グリセロール、１ｍＭバナジウム酸ナトリウム、１ｍＭフッ化ナトリウム、１ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、１０μｇ／ｍＬアプロチニン、１０μｇ／ｍＬロイペプチン）中で４５分間にわたって破壊した。その後、溶解物を遠心分離し、上清を収集し、修正ローリー法（Ｂｉｏ Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用してタンパク質濃度を決定した。総タンパク質（１ｍｇ）を、ＳＴＡＴ３に対するｓｄＡｂを有する１．５ｍｇのダイナビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、陽性対照（ＳＴＡＴ３、カタログ番号ＳＣ−４８２、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）、または陰性対照（ＳＴＡＴ−１、カタログ番号９１７２、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）とともに４℃で１時間インキュベートした。その後、ビーズを洗浄した。最終洗浄後、６０μＬの溶解緩衝液を添加し、結果として生じた上清をウエスタンブロット分析に供した。簡潔に、試料を１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロース膜に移した。これらの膜をブロックし、その後、適切な一次及び二次抗体とともにインキュベートした。陽性対照として使用した抗ＳＴＡＴ３抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（カタログ番号４９０４、Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）からのものであった。Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）のＥＣＬシステムを使用して化学発光反応を行った。

【0110】

図３に図解されるように、内因性ＳＴＡＴ３は、異なる量で試験した全てのｓｄＡｂで免疫沈降した。Ｍは、マーカーを含有するマーカーレーンであり、レーン１は、哺乳類細胞から産生及び単離されたＳＴＡＴ３ ＶＨＨ１３（配列番号３）を含有し、レーン２は、哺乳類細胞から産生及び単離されたＳＴＡＴ３ ＶＨＨ１４（配列番号４）を含有し、レーン３は、細菌細胞から産生及び単離されたＳＴＡＴ３ ＶＨＨ１３（配列番号３）を含有し、レーン４は、哺乳類細胞から産生及び単離されたＳＴＡＴ３ ＶＨＨ１４（配列番号４）を含有し、レーン５は、陽性ＳＴＡＴ３抗体であり、陰性対照としてＳＴＡＴ−１を使用したレーン６は、バンドを示さなかった。

【0111】

例３：抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３は、構成的に活性化されたＳＴＡＴ３を含有する細胞株に高親和性で結合する
ヒト（ＰＡＮＣ−１及びＤＵ１４５）及びマウス（４Ｔ１）細胞株における構成的に活性化されたＳＴＡＴ３を使用して、細菌性抗ＳＴＡＴ３ ＶＨＨ１３（配列番号３）の特異性をアッセイした。市販のＨｅＬａ細胞もインターフェロンガンマ（ＩＮＦΓ）で処理して、リン酸化ＳＴＡＴ３を誘導した。ＰＣ−３ ＳＴＡＴ３ヌル細胞株を陰性対照として使用した。

【0112】

これらの細胞を５０％〜７０％コンフルエンスまで成長させ、その後、上述のように、新たに調製した氷上の氷冷溶解緩衝液中で４５分間にわたって破壊した。その後、溶解物を遠心分離し、上清を収集し、上述のようにタンパク質濃度を決定した。総タンパク質（１ｍｇ）を、細菌性抗ＳＴＡＴ３ ＶＨＨ１３（配列番号３）を含有する１．５ｍｇのダイナビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または陰性対照（ＫＲＡＳ、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｓｈｉｒｌｅｙ，ＮＹ）とともに４℃で１時間インキュベートした。その後、ビーズを洗浄した。最終洗浄後、例２に記載されるように、６０μＬの溶解緩衝液を添加し、結果として生じた上清をウエスタンブロット分析に供した。

【0113】

図４に図解されるように、内因性ＳＴＡＴ３を、構成的に活性化されたＳＴＡＴ３細胞株：ＰＡＮＣ−１（レーン１）、ＤＵ１４５（レーン２）、及び４Ｔ１（レーン４）において細菌性ＶＨＨ１３ ＳＴＡＴ３（配列番号３）で免疫沈降した。さらに、細菌性ＶＨＨ１３ ＳＴＡＴ３（配列番号３）は、ＨｅＬａ溶解物中のリン−ＳＴＡＴ３（レーン３）に結合した。ＰＡＮＣ−１ ＫＲＡＳ（レーン３）及びＰＣ−３（陰性対照）（レーン６）のいずれのバンドも見られなかった。

【0114】

例４：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１癌細胞株における抗ＳＴＡＴ３ ｓｄＡｂの細胞毒性研究
この例では、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を使用して、抗ＳＴＡＴ３ ｓｄＡｂの抗増殖効果をアッセイした。この実験のために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞が９０％コンフルエンスに達するまでこれらの細胞を成長させた。その時点で、細胞を洗浄し、トリプシン処理し、Ｃｏｕｌｔｅｒ計数器（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）を使用して計数した。３−［４，５−ジメチルチアオールイル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物（ＭＴＴ）アッセイを使用して増殖試験を行った。このアッセイのために、細胞を製造業者（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）によって指示されるように９６ウェルプレートに５×１０^３／ウェルの密度で播種した。細胞を２４時間接着させ、その後、ｓｄＡｂを適切な濃度（すなわち、０、０．５、１．０、１０．０、または１００μｇ／ｍＬ）で添加した。細胞を３日目に計数した。５日間処理された細胞の場合、ｓｄＡｂを含有する新鮮培地を３日目に新鮮なものに取り換えた。終了時、製造業者によって指示されるように、１０μＬのＭＴＴ試薬（０．５ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加した。４時間インキュベートした後、１００μＬの可溶化溶液を添加し、プレートをインキュベーター内に一晩設置した。Ｂｉｏｔｅｋプレートリーダー（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を使用して全てのプレートを５７０ｎｍの波長で読み取った。

【0115】

ＧｒａｐｈＰａｄ ＩｎＳｔａｔ ３（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して全てのデータを分析した。一方向ＡＮＯＶＡを使用して処理群をビヒクル対照群と比較した。有意差（ｐ＜０．０５）が観察された場合、チューキー・クレーマー多重比較検定を行った。

【0116】

ＭＴＴ実験に基づいて、以下の表２〜５に示されるように、細菌性ＶＨＨ１３ 抗ＳＴＡＴ３（配列番号３）ｓｄＡｂが処理後３日目及び５日目の細胞成長の阻害に有効であることが見出された。

【表2】

【表3】

【表4】

【表5】

【0117】

例５：ヒト乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）及び膵臓癌（ＰＡＮＣ−１）細胞株における抗ＳＴＡＴ３ ｓｄＡｂの細胞毒性研究
この例では、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びヒト膵臓癌細胞株ＰＡＮＣ−１を使用して、抗ＳＴＡＴ３ ＶＨＨ１３（配列番号３）及びＶＨＨ１４（配列番号４）ｓｄＡｂの抗増殖効果をアッセイした。この実験のために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞及びＰＡＮＣ−１細胞を９０％コンフルエンスに達するまでこれらの細胞を成長させた。その時点で、細胞を洗浄し、トリプシン処理し、Ｃｏｕｌｔｅｒ計数器（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）を使用して計数した。上述のＭＴＴアッセイを使用して増殖研究を行った。５日間処理された細胞の場合、抗ＳＴＡＴ３ ｓｄＡｂを含有する新鮮培地を３日目に新鮮なものに取り換えた。

【0118】

ＧｒａｐｈＰａｄ ＩｎＳｔａｔ ３を使用して全てのデータを分析した。一方向ＡＮＯＶＡを使用して処理群をビヒクル対照群と比較した。有意差（ｐ＜０．０５）が観察された場合、チューキー・クレーマー多重比較検定を行った。

【0119】

ＭＴＴ実験に基づいて、以下の表６〜１３に示されるように、ＶＨＨ１３（配列番号３）及びＶＨＨ１４（配列番号４）がＭＤＡ−ＭＢ−２３１癌細胞及びＰＡＮＣ−１癌細胞の両方において細胞成長を阻害することが見出された。

【表6】

【表7】

【表8】

【表9】

【表10】

【表11】

【表12】

【表13】

【0120】

例６：ヒト乳癌及びヒト前立腺癌細胞株におけるＳＴＡＴ３ ｓｄＡｂの抗増殖作用
ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びヒト前立腺癌細胞株ＤＵ１４５におけるＳＴＡＴ３ ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂの抗増殖効果をアッセイした。この実験のために、癌細胞が９０％コンフルエンスに達するまでこれらの細胞を成長させた。その時点で、細胞を洗浄し、トリプシン処理し、Ｃｏｕｌｔｅｒ計数器（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）を使用して計数した。上述のＭＴＴアッセイを使用して増殖研究を行った。

【0121】

ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対する抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂの抗増殖特性をＤＵ１４５細胞に対するその作用と比較した。表１４に示されるように、抗ＳＴＡＴ３（配列番号３）ｓｄＡｂで処理されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、それぞれ、５０．０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬで２９．６及び９１．２の平均成長阻害を示した。ＤＵ１４５細胞において、表１５に示されるように、同様の成長阻害（それぞれ、５０．０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬで３１．２％及び９２．１％）が見られた。

【表14】

【表15】

【0122】

例７：ヒト癌細胞株に対するＳＴＡＴ３ ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂの抗増殖効果
表１６に示されるように、ヒト癌細胞株：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＣＦ−７、ＢＴ４７４、及びＤＵ１４５を使用してＳＴＡＴ３ ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂの抗増殖効果を試験するために。

【0123】

全てのヒト癌細胞株をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。細胞株を、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＣＦ−７、ＢＴ４７４）、または１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、ならびに１％抗菌抗真菌溶液（１０単位／ｍＬペニシリン、１０μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び２５μｇ／ｍＬアムホテリシンＢ）を含有するＭＥＭ−Ｅ（ＤＵ１４５）中に維持及び培養した。細胞を、５％ＣＯ_２の加湿環境下で、３７℃で保った。細胞培養供給物をＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）から入手した。ＭＴＴ試薬をＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。

【0124】

この実験のために、癌細胞を９０％コンフルエンスに達するまでこれらの細胞を成長させた。その時点で、細胞を洗浄し、トリプシン処理し、Ｃｏｕｌｔｅｒ計数器（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）を使用して計数した。上述のＭＴＴアッセイを使用して増殖研究を行った。

【0125】

様々な分類を表す５つの乳癌細胞に対する抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂの抗増殖特性を評価した（表３４）。表１７に示されるように、処理後７２時間時点の細胞株は全て著しい成長阻害を示した。最も高い成長阻害は、全ての細胞株において１００μｇ／ｍＬ及び２００μｇ／ｍＬ用量で見られた。試験した細胞株における成長の半数阻害濃度（ＩＣ_５０）は、それぞれ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞株、ＭＣＦ−７細胞株、及びＢＴ４７４細胞株において、１０．１±２．４、１２．３６±１．５、１４．８±１．６、及び２５．２±１４．７であった。これらのデータは、トリプルネガティブ乳癌細胞株が、エストロゲン／プロゲステロン陽性細胞株（すなわち、ＭＣＦ−７）またはＨＥＲ２増幅細胞株（すなわち、ＢＴ４７４）と比較して、ＩＣ_５０を達成するのに最も低いＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂ濃度しか必要としないことを示唆する。

【表16】

【表17-1】

【表17-2】

【0126】

表１８に示されるように、ヒト前立腺癌細胞株ＤＵ１４５における抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂの作用も評価した。抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂは、試験した全ての癌細胞において用量依存的成長阻害を示した。

【表18】

【0127】

例８：ＢＡＬＢ／Ｃマウスにおける抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）の最大耐量
この例では、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を使用して試験動物における抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂの耐性をアッセイした。この実験のために、合計９匹のＢＡＬＢ／Ｃ雌ヌードマウス（６〜７週齢）を体重に従って３つの群に分けた。（表１９）マウス（ｎ＝３）に、ビヒクル（ＰＢＳ）または抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂのいずれかを２５０μｇ／ｋｇ体重／日または５００μｇ／ｋｇ体重／日で５日間与えた。この研究中、死亡率／罹患率を１日２回測定した。体重をこの研究の１日目、４日目、及び６日目、ならびに研究終了日（１３日目）に記録した。毒性を体重測定結果により評価し、マウスの挙動をビヒクル対照マウスと比較した。処理期が終了した時点で、これらの動物をさらに１週間観察して、処理後の体重及び／または全体的な健康のいかなる異常も記した。

【表19】

【0128】

表２０に図解されるように、これらの群間で有意な体重差はなく、抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂは、いずれの投薬レベルでもいかなる薬物関連死にも関連しなかった。さらに、対照マウスと比較して抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂで処理された動物の挙動変化は観察されなかった。

【表20】

【0129】

例９：ＢＡＬＢ／Ｃヌードマウス異種移植片ならびにヒト乳癌及びヒト膵臓癌細胞における細菌性抗ＳＴＡＴ３ ＶＨＨ１３（配列番号３）の活性
この例では、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を使用してマウスにおける抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂの活性を評価した。簡潔に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌異種移植モデル及びＰＡＮＣ−１ヒト膵臓癌異種移植モデルを使用して抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂの活性を評価した。投薬スケジュールは、以下のとおりであった：第１群（ｎ＝６、ＰＢＳ、腹腔内）１日１回１４日間［ＱＤ×１４］、及び第２群（ｎ＝１２、５００μｇ／ｋｇ体重、腹腔内）１４日間毎日［ＱＤ×１４］。薬物投与後５日間観察した。

【0130】

ヒト乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＰＡＮＣ−１）をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、１０％ＦＢＳ（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｆｌｏｗｅｒｙ Ｂｒａｎｃｈ，ＧＡ）及びペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を補充したＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で成長させた。ＰＡＮＣ−１細胞を、１０％ＦＢＳ及びペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で成長させた。全ての細胞を５％ＣＯ_２の存在下で３７℃のインキュベーター内で成長させた。

【0131】

４〜５週齢の無胸腺Ｆｏｘｎｌ^ｎｕ雄ヌードマウスをＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から購入した。これらの動物を１週間隔離し、１２時間明暗サイクル及び５０％の相対湿度で１つのケージに５匹のマウスを収容した。飲用水及び食べ物をこれらの動物に自由に供給した。全ての動物を、病原体を含まない条件下で収容し、ＩＩＴ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ａｎｉｍａｌ Ｕｓｅ ａｎｄ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに従って実験を行った。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植研究の場合、最終体積１００μＬのＭＥＭ培地中の細胞（４×１０^６）をマウスの右側腹部に皮下注入した。ＰＡＮＣ−１異種移植研究の場合、最終体積１００μＬのＲＰＭＩ培地中の細胞（５×１０^６）をマウスの右側腹部に皮下注入した。腫瘍が触診可能になった直後に両モデルの腫瘍測定を開始した。その後、腫瘍を週に２回測定した。腫瘍が７５〜１７５ｍｍ^３のサイズ範囲に達したときにこれらの動物を無作為化し、層化無作為サンプリングアルゴリズムを使用して対照群（ｎ＝６）及び処理群（ｎ＝１２）を無作為化した。無作為化の翌日に処理（抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂ）またはビヒクル（ＰＢＳ）を開始した。処理に良好な耐性を示し、薬物関連死には関連しなかった。著しい体重減少は見られなかった。

【0132】

ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植研究の場合、対照群及び処理群の無作為化平均（±標準誤差）腫瘍サイズは、それぞれ、１０３．０１±１１．８９及び１０２．６１±９．６０であった。第１群及び第２群の無作為化時の平均体重（±標準誤差）は、それぞれ、３２．０８±０．７６及び３０．２７＋０．７５であった。表２１は、全研究の平均体重（±標準誤差）を示す。

【表21】

【0133】

投薬１４日目に、対照群の平均腫瘍サイズ（±標準誤差）が１７９．１１±１９．３９であったのに対し、処理群は１１８．８６±１５．９４であった。第１群及び第２群の終了時の平均体重（±標準誤差）は、それぞれ、３１．９８±０．７１及び３０．５５±０．７４であった。表２２は、全研究の腫瘍体積（±標準誤差）を要約する。処理群における平均腫瘍成長阻害％は、３３．６４％であった。腫瘍倍増時間は、以下のとおりであった：第１群では４４．２７日間、第２群では６１．０６日間。図５は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植モデルにおける抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂの成長阻害を図解する。抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂは、著しい成長阻害（ｐ＝０．０４７）を示した。したがって、抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌モデル系において化学療法活性を有する。

【表22】

【0134】

ＰＡＮＣ−１異種移植研究の場合、無作為化平均（＋標準誤差）腫瘍サイズは、対照群では１０７．０１±４．５４であり、処理群では１１０．５８±６．１８であった。第１群及び第２群の無作為化時の平均体重（±標準誤差）は、それぞれ、２９．０±０．８１及び２８．５±０．７０であった。第１群及び第２群の終了時の平均体重（±標準誤差）は、それぞれ、３１．２±０．９９及び３０．１±０．７５であった。表２３は、全研究の平均体重（±標準誤差）を要約する。投薬１４日目に、対照群の平均腫瘍サイズ（±標準誤差）が２８７．３０±３３．９４であったのに対し、処理群は３１８．７４＋２９．７６であった。表２４は、全研究の腫瘍体積（±標準誤差）を要約する。

【表23】

【0135】

腫瘍倍増時間は、以下のとおりであった：第１群では２２．４４日間、第群では２３．０２日間。抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂは、ＰＡＮＣ−１ヒト膵臓癌モデル系において著しい成長阻害を示さなかった。

【表24】

【0136】

例１０：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植研究
この例では、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳房異種移植モデルにおける抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂの有効性をさらに評価した。投薬スケジュールは、以下のとおりであった：第１群（ｎ＝４、ＰＢＳ、腹腔内）１日２回１４日間［ＢＩＤ×１４］、第２群（ｎ＝４、１ｍｇ／ｋｇ体重、腹腔内）、１日２回１４日間［ＢＩＤ×１４］、第３群（ｎ＝４、２ｍｇ／ｋｇ体重、腹腔内）１日２回１４日間［ＢＩＤ×１４］、及び第４群（ｎ＝４、２ｍｇ／ｋｇ体重、腹腔内）１日１回１４日間［ＱＤ×１４］。投与後７日間観察した。

【0137】

ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及び無胸腺Ｆｏｘｎ１^ｎｕ雌ヌードマウスは、上述のものであった。

【0138】

５×１０^６の密度のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＭＥＭ培地中最終体積１００μＬでマウスの右側腹部に皮下注入した。腫瘍が触診可能になった直後に腫瘍測定を開始した。その後、腫瘍を週に２回測定した。腫瘍が５５〜１５０ｍｍ^３のサイズ範囲に達したときに、層化無作為サンプリングアルゴリズムを使用してこれらの動物を無作為化した。無作為化の翌日に処理（抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂ）またはビヒクル（ＰＢＳ）を開始した。

【0139】

第１群、第２群、第３群、及び第４群の無作為化平均（±標準誤差）腫瘍サイズは、それぞれ、９２．０８±１３．２４、８２．３８±５．１７、７７．４７±７．１７、及び１０４．７１±１４．６４であった。表２５に示されるように、第１群、第２群、第３群、及び第４群の無作為化時の平均体重（±標準誤差）は、それぞれ、２３．６５±０．７２、２３．４５±０．６６、２３．１０±０．２０、及び２２．４５±１．２５であった。

【0140】

表２６に示されるように、投薬１４日目に、対照群の平均腫瘍サイズ（±標準誤差）が２２１．５１±５７．３２であったのに対し、処理第２群、第３群、及び第４群は、それぞれ、６７．１２±１０．６６、５８．２７±２２．５４、及び１３１．４４±２２．８６であった。終了時（４２日目）、第１群、第２群、第３群、及び第４群の平均腫瘍サイズ（±標準誤差）は、それぞれ、２５５．４２±６５．４６、５５．９８±６．９４、４１．１５±１３．２１、及び１４５．５１±５２．３２であった。第１群、第２群、第３群、及び第４群の終了時の平均体重（±標準誤差）は、それぞれ、２４．８０±０．４９、２３．２５±１．２０、２４．００±０．３２、及び２３．２±１．４６であった。第１群、第２群、第３群、及び第４群の最大平均正味体重減少％（日）は、それぞれ、０．７（３６）、１．５（２３）、１．８（３６）、及び２．２（２９）であった。

【0141】

同様に表２６に示されるように、処理第２群、第３群、及び第４群における平均成長阻害は、それぞれ、７８．３、７５．２、及び５５．９であった。腫瘍倍増時間は、第１群では２０．５６日間であり、第２群では３４．５４日間であり、第３群では３０．０７日間であり、第４群では２７．１７日間であった。第２群、第３群、及び第４群の成長遅延は、それぞれ、１３．９９日間、９．５２日間、及び６．６１日間であった。処理群の処理／対照値％は、第２群では−３３．７５（腫瘍停滞）であり、第３群では−５４．４（腫瘍退行）であり、第４群では１０．２８（腫瘍阻害）であった。図６は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植モデルにおける抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂの成長阻害を図解する。

【0142】

抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂの投与は、第２群（ｐ＝０．０２）［１ｍｇ／ｋｇ、ＢＩＤ×１４］及び第３群（ｐ＝０．０２）［２ｍｇ／ｋｇ、ＢＩＤ×１４］における著しい成長阻害と関連した。さらに、４つの腫瘍のうち３つは、著しい退行を示した。これらのデータに基づいて、抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂがＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌モデル系において化学療法活性を有すると結論付けられる。

【表25】

【表26-1】

【表26-2】

【0143】

例１１：３匹のヒト癌異種移植モデルに対する抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂの有効性
この例では、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌、ＰＡＮＣ−１膵臓癌、及びＤＵ１４５前立腺癌異種移植モデルにおける抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂの有効性を評価した。

【0144】

無胸腺Ｆｏｘｎ１^ｎｕヌードマウス、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞、ＰＡＮＣ−１膵臓癌細胞株、及びＤＵ１４５前立腺癌細胞株は、上述のものであった。研究１日目のマウスの体重は、１７〜１９ｇ（雌３４匹）及び２１〜２３ｇ（雄１６匹）の範囲であった。

【0145】

初期継代（４〜１０）細胞をマウスへの移植に使用し、対数期成長中に採取した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（５×１０^６）、ＤＵ１４５（５×１０^６）、及びＰＡＮＣ−１（１．５×１０^６）を最終体積１００μＬの培地でマウスの右側腹部に皮下注入した。腫瘍が触診可能になった直後に腫瘍測定を開始した。その後、腫瘍を週に２回測定した。

【0146】

腫瘍が７４〜１２０ｍｍ^３（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、８９〜１４６ｍｍ^３（ＤＵ１４５）、または６０〜１６０ｍｍ^３（ＰＡＮＣ−１）のサイズ範囲に達したときに、層化無作為サンプリングアルゴリズムを使用してこれらの動物を無作為化した。１日目と称する無作為化の翌日に処理（抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂを含有し、本明細書でＳＢＴ−１００と称されるもの）またはビヒクル（ＰＢＳ）を開始した。

【0147】

抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂを０．６５１ｍｇ／ｍＬの濃度で事前に製剤化された溶液として供給し、使用するまで−２０℃で保管した。このストック溶液を滅菌ＰＢＳ（ｐＨ７．６）中に希釈して、１０ｍＬ／ｋｇの投薬体積中５ｍｇ／ｋｇを得た。この希釈標準溶液を７日毎に調製し、７つのバイアルに一定分量ずつ入れ、４℃で保管した。各処理日に、必要なバイアルのみを室温にした。次の投薬の必要に応じて残ったｓｄＡｂ材料を全て４℃で維持した。８日目に、いずれの残りのｓｄＡｂ材料も廃棄し、新鮮なバッチを調製した。

【0148】

表２７に示されるプロトコルに従って、１腫瘍モデル当たり２つのマウス群（対照及びＳＢＴ−１００）に投薬した。投薬スケジュールは、以下のとおりであった：第１群（ｎ＝４、ＰＢＳ）１日２回１４日間［ＢＩＤ×１４］、第２群（ｎ＝４、ＳＢＴ−１００、５ｍｇ／ｋｇ体重）１日２回１４日間［ＢＩＤ×１４］。ビヒクル（ＰＢＳ（ｐＨ７．６））及びＳＢＴ１００の両方を６時間間隔で１日２回１４日間腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。個々の動物の体重に従って投薬を行った。投与後７日間回復に要した。

【表27】

【0149】

Ｓｔｕｄｙ Ｌｏｇ Ｓｔｕｄｙ Ｄｉｒｅｃｔｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｓｔｕｄｙ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を使用して、これらの動物を無作為化し、データ（例えば、投薬、体重、腫瘍測定値、臨床的観察）を収集し、データ分析を行った。

【0150】

ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍異種移植モデルにおいて、これらの動物を接種後２３日目に無作為化し、第１群及び第２群の平均（±標準誤差）腫瘍サイズは、それぞれ、７７．９８±２１．５８及び８４．７１±５．５６であった。第１群及び第２群の無作為化時の平均体重（±標準誤差）は、それぞれ、２０．０４±０．６２及び２３．７±１．８４であった。表２８は、全研究の平均体重（±標準誤差）を要約する。投薬最終日（１４日目）、対照群の平均腫瘍サイズ（±標準誤差）が１６８．２８±５１．５７であったのに対し、ＳＢＴ−１００処理マウスは８３．８１±２２．６５であった。表２９は、全研究の腫瘍体積（±標準誤差）を要約する。終了時（２８日目）、第１群及び第２群の平均腫瘍サイズ（±標準誤差）は、それぞれ、２７０．４９±１１２．３５及び９１．７２±３３．１７であった。第１群及び第２群の終了時の平均体重（±標準誤差）は、それぞれ、２５．３６±１．０７及び２４．２５±１．６８であった。研究終了時、ＳＢＴ−１００処理群における平均腫瘍成長阻害は、８５．８％（ｐ＝０．００６）であった。図７は、平均腫瘍体積を図解する。第１群及び第２群の腫瘍倍増時間は、それぞれ、２５．７８日間及び１１１．６日間であった。第２群の処理／対照％は、１３．３５（腫瘍阻害）であった。

【表28】

【表29】

【0151】

ＤＵ１４５腫瘍異種移植モデルにおいて、これらの動物を接種後１７日目に無作為化し、第１群及び第２群の平均（±標準誤差）腫瘍サイズは、それぞれ、１１１．８７±２０．５３及び１１１．２３±２５．１６であった。第１群及び第２群の無作為化時の平均体重（±標準誤差）は、それぞれ、２９．１０±１．９４及び３０．６８±１．５６であった。表３０は、全研究の平均体重（±標準誤差）を要約する。投薬最終日（１４日目）、対照群の平均腫瘍サイズ（±標準誤差）が６２１．８１±２７６．２５であったのに対し、ＳＢＴ−１００処理マウスは３６４．１４±５１．６４であった。表３１は、全研究の腫瘍体積（±標準誤差）を要約する。終了時（２８日目）、第１群及び第２群の平均腫瘍サイズ（±標準誤差）は、それぞれ、８１９．４２±３５１．８８及び６０１．８３±１３１．５１であった。第１群及び第２群の終了時の平均体重（±標準誤差）は、それぞれ、２９．２０±２．３３及び２９．６０±１．０４であった。研究終了時、ＳＢＴ−１００処理群における平均腫瘍成長阻害は、２６．６％（ｐ＝０．２９）であった。図８は、平均腫瘍体積を図解する。第１群及び第２群の腫瘍倍増時間は、それぞれ、１４．５７日間及び１８．１９日間であった。第２群の処理／対照％は、７４．８であった。

【表30】

【表31】

【0152】

ＰＡＮＣ−１腫瘍異種移植モデルにおいて、これらの動物を接種後２２日目に無作為化し、第１群及び第２群の平均（±標準誤差）腫瘍サイズは、それぞれ、７８．７４±４０．２１及び９３．８４±３６．３１であった。第１群及び第２群の無作為化時の平均体重（±標準誤差）は、それぞれ、２２．５０±１．４７及び２４．２３±１．６３であった。表３２は、全研究の平均体重（±標準誤差）を要約する。投薬最終日（１４日目）、対照群の平均腫瘍サイズ（±標準誤差）が２０４．９５±１７８．９０であったのに対し、ＳＢＴ−１００処理マウスは１５９．０３±２８．０１であった。表３３は、全研究の腫瘍体積（±標準誤差）を要約する。終了時（２８日目）、第１群及び第２群の平均腫瘍サイズ（±標準誤差）は、それぞれ、２８４．７７±２８８．８８及び２０３．０２±３０．３４であった。第１群及び第２群の終了時の平均体重（±標準誤差）は、それぞれ、２７．３８±１．０７及び２６．２３±１．１９であった。研究終了時、ＳＢＴ−１００処理群における平均腫瘍成長阻害は、４１．７８％（ｐ＝０．３５）であった。図９は、平均腫瘍体積を図解する。第１群及び第２群の腫瘍倍増時間は、それぞれ、１８．５１日間及び３５．７０日間であった。第２群の処理／対照％は、５２．７９であった。

【表32】

【表33】

【0153】

例１２：ＥＲ＋／ＰＲ＋（ＭＣＦ−７）ヒト乳房腫瘍異種移植モデルにおける抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂの有効性
この例は、ヌードマウスのＭＣＦ−７ヒト乳房腫瘍異種移植モデルにおける抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂの有効性を実証する。

【0154】

研究１日目の無胸腺雌ヌードマウス（Ｃｒｌ：ＮＵ（Ｎｃｒ）−Ｆｏｘｎ１^ｎｕ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）は、１２週齢であり、体重（ＢＷ）２３．０〜３０．１ｇの範囲であった。これらの動物に上述のように食物を与え、収容した。

【0155】

ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞を入手し、上述のように培養し、マウス異種グラフに使用した。腫瘍細胞移植の３日前に、滅菌外套針を使用してエストロゲンペレット（０．３６ｍｇエストラジオール、６０日間放出、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ）を各試験動物の肩甲骨間に皮下移植した。

【0156】

移植に使用した腫瘍細胞を対数期成長中に採取し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に１×１０^８細胞／ｍＬの濃度で再懸濁した。移植日に、各試験マウスに１×１０^７個のＭＣＦ−７細胞（０．１ｍＬ細胞懸濁液）を右側腹部に皮下移植し、平均サイズが１００〜１５０ｍｍ^３の目標範囲に達したとき腫瘍成長を監視した。研究１日目と指定した２１日後、これらの動物を２つの群に分け、各々、個々の腫瘍体積１０８〜１４４ｍｍ^３及び群平均腫瘍体積１１７〜１２３ｍｍ^３を有する４匹のマウスからなった。

【0157】

抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂを１ｍＬの一定分量中０．４１８６７ｍｇ／ｍＬの濃度で事前に製剤化された投薬準備の整った溶液として提供し、必要になるまで−２０℃で保管した。０．４１８６７ｍｇ／ｍＬの溶液は、２３．８８ｍＬ／ｋｇの投薬体積中１ｍｇ／ｋｇの投薬量を提供した。各処理日に、必要な抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂバイアルのみを解凍して室温にした。次の投薬の必要に応じて残った懸濁液を全て４℃で維持した。

【0158】

表３４に示されるプロトコルに従って、２つの無胸腺ヌードマウス群に投薬した。全てのビヒクル（対照）及び抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂ用量を６時間間隔で１日３回１４日間腹腔内（ｉ．ｐ．）投与し、２用量を１日目に送達し、１用量を１５日目の朝に送達した（ｔｉｄ×１４、１日目２用量）。ビヒクル及び抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂの投薬体積は、０．４７８ｍＬ／２０グラム体重（２３．８８ｍＬ／ｋｇ）であり、個々の動物の各々の体重に調整した。第１群にビヒクルを与え、腫瘍生着及び進行のベンチマーク群、ならびに対照とした。第２群に抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂを１ｍｇ／ｋｇで与えた。

【表34】

【0159】

腫瘍を週に２回測定し、各動物を、その新生物が所定の終点体積（１０００ｍｍ^３）に達したときまたは研究終了時（３９日目）のいずれか早い方に安楽死させた。腫瘍が終点体積に達したときに、その動物を、安楽死の日付とともに腫瘍進行（ＴＰ）の理由から安楽死させたと記録した。各マウスの終点までの時間（ＴＴＥ）を以下の等式により計算した。

【数1】

式中、ＴＴＥは日数で表され、終点体積はｍｍ^３で表され、ｂは切片であり、ｍは対数変換腫瘍成長データセットの線形回帰によって得られた線の勾配である。このデータセットは、分析に使用される終点体積を上回る１回目の観察及びこの終点体積に達する直前の３回連続の観察からなる。計算されたＴＴＥは、通常、動物を腫瘍サイズの理由から安楽死させた日であるＴＰ日付未満である。終点体積に達しなかった動物に研究最終日（３９日目）に等しいＴＴＥ値を割り当てた。処理に関連した（ＴＲ）原因で死亡したと分類されたいずれの動物にも死亡日に等しいＴＴＥ値を割り当てた。処理に関連しない（ＮＴＲ）原因で死亡したと分類されたいずれの動物もＴＴＥ計算から除外した。

【0160】

対照群と比較した処理群の処理有効性を、日数単位でのＴＴＥ中央値の増加として定義される腫瘍成長遅延（ＴＧＤ）から決定した。

【数2】

対照群に対するＴＴＥ中央値の増加パーセントは、以下のとおりであり、

【数3】

式中、Ｔは処理群のＴＴＥ中央値であり、
Ｃは指定された対照群のＴＴＥ中央値である。

【0161】

各群における処理有効性を腫瘍体積中央値ＭＴＶ（ｎ）で示すことができ、これを腫瘍が終点体積に達しなかった残りの動物の数（ｎ）における研究最終日（３９日目）の腫瘍体積中央値として定義した。

【0162】

処理有効性を本研究中に観察された退行応答出現及び程度から決定することもできる。処理は、動物における腫瘍の部分退行（ＰＲ）または完全退行（ＣＲ）を引き起こし得る。ＰＲ応答では、腫瘍体積は、本研究過程中の３連続測定ではその１日目体積の５０％以下であり、これらの３回の測定のうちの１回以上では１３．５ｍｍ^３以上であった。ＣＲ応答では、腫瘍体積は、本研究過程中の３連続測定では１３．５ｍｍ^３未満であった。研究終了時にＣＲ応答を有したいずれの動物も、無腫瘍生存体（ＴＦＳ）としてさらに分類した。

【0163】

動物の体重を最初の５日間は１日１回、その後、残りの研究期間中は週に２回量った。これらのマウスを健康及びいずれの不利な処理関連ＴＲ副作用の明白な兆候について頻繁に観察し、注目すべき臨床的観察を記録した。個々の体重減少をプロトコルに従って監視し、１回の測定で３０％を超えるか、または３回の測定で２５％を超えて体重減少したいずれの動物も健康状態の理由からＴＲ死として安楽死させた。群平均体重が回復した場合、その群に投薬を再開してもよいが、より低い用量または低頻度の投薬スケジュールで投薬する。許容される毒性を、本研究中２０％未満の群平均体重減少及び１０匹の処理動物中１つのＴＲ死または１０％を超えないＴＲ死として定義した。より高い毒性をもたらすいずれの投薬レジメンも最大耐量（ＭＴＤ）を超えるものと見なす。死亡を、それが臨床的兆候及び／または解剖によって証明される処理による副作用に起因した場合にＴＲとして分類し、投薬期間中または最終投薬の１４日以内の原因不明の理由による場合もＴＲとして分類することができる。死亡が処理関連ではなく腫瘍モデルに関連したことが証明される場合、死亡をＮＴＲとして分類した。ＮＴＲ死を、ＮＴＲａ（事故または人的エラーによるもの）、ＮＴＲｍ（浸潤または転移による解剖で確認された腫瘍散在によるもの）、及びＮＴＲｕ（原因不明の理由によるもの）としてさらに分類した。

【0164】

Ｗｉｎｄｏｗｓ用Ｐｒｉｓｍ６．０７（ＧｒａｐｈＰａｄ）をグラフィック分析に用いた。試料サイズが小さかったため、統計値を用いなかった。

【0165】

群別の個々のマウスのＴＴＥ値を示すための散布プロットを構築し、このプロットは、全ての他の図から排除したＮＴＲ死を示す。個々の動物、群腫瘍体積中央値、及び平均腫瘍体積を時間の関数としてプロットした。動物が腫瘍サイズまたはＴＲ死の理由から本研究を去ったときに、その最後に記録した腫瘍体積を、その後の時点の体積中央値を計算するために使用したデータとともに含めた。時間に対する本研究に残っている各群の動物の割合を示すためのカプラン・マイヤープロットを構築した。２つのＴＲ死が同じ群で起こった後に腫瘍成長曲線を切断した。本研究にわたる群平均体重変化を１日目からの変化パーセント±平均標準誤差でグラフにした。ある群の評価可能なマウスの半数以上が本研究を去った後に腫瘍成長及び体重変化曲線を切断した。図１０は、本研究における平均腫瘍体積を図解する。

【0166】

表３５は、マウスの平均体重減少、ＴＲ死、及びＮＴＲ死を提供する。表３６〜３８に示されるように、観察時に臨床的兆候を記録した。ＴＲ死は本研究では起こらなかった。体重減少は変化しやすく、各群における１匹の動物では重度であり、エストロゲン作用に起因するものであった。体重減少、拡大した子宮角、及び膀胱結晶等の臨床的観察は、両群に存在し、これらもエストロゲン作用に起因するものであった。エストロゲン毒性は、各群につき２つの処理に関連しない死をもたらした。本研究で評価した処理に許容できる耐性を示した。

【表35】

【表36】

【表37】

【表38】

【0167】

対照群及び処理群における４匹のマウスのうち２匹がエストロゲン毒性により死亡したため、統計的結論を下すことができなかった。利用可能なデータをもとに、腫瘍成長中央値及び平均腫瘍体積が対照群と比較して処理群で低下した。この差は１４日間の処理中に見られ、本研究の２５日目まで見られた。対照群が１０００ｍｍ^３の腫瘍体積に達するのに２５日かかった一方で、処理群が１０００ｍｍ^３の腫瘍体積に達するのに３６日かかった。これは、抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂがインビボでのＭＣＦ−７腫瘍の成長を遅らせることを示唆する。本研究を通じて、対照群も処理群もいずれも同様の体重を維持した。これは、抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂが体重減少に関して毒性を引き起こさなかったことを示唆する。

【0168】

例１３：異種移植マウスにおけるヒトＨＥＲ２＋（ＢＴ４７４）乳癌の抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂでの処理
この例では、ＣＢ．１７ ＳＣＩＤマウスのＢＴ４７４ヒト乳房腫瘍異種移植片における抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂの有効性を決定した。

【0169】

腫瘍が１００〜１５０ｍｍ^３の平均サイズに達したときに、表３９に示されるプロトコルに従って、１ｍｍ^３のＢＴ４７４腫瘍断片の異種グラフを側腹部に有する８〜１２週齢のＣＢ．１７ ＳＣＩＤマウスの２つの群を処理した。全てのビヒクル（ＰＢＳ対照）及び抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂ（ＳＢ−０１として表３９に示される）用量を６時間間隔で１日３回１４日間腹腔内（ｉ．ｐ．）投与し、２用量を１日目に送達した（ｔｉｄ×１４、１日目２用量）。ビヒクル及び抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂの投薬体積は、０．４７８ｍＬ／２０グラム体重（２３．８８ｍＬ／ｋｇ）であり、個々の動物の各々の体重に調整した。第１群にビヒクルを与え、腫瘍生着及び進行のベンチマーク群、ならびに対照とした。第２群に抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂを１ｍｇ／ｋｇで与えた。

【表39】

【0170】

研究の最初の１４日間にわたって、処理群に抗ＳＴＡＴ３ Ｂ ＶＨＨ１３を与え、対照群にはビヒクルのみを与えた。表４０に示されるように、この期間中、処理群が本研究を通じて体重を維持し、増量した一方で、対照群は、本研究を通じてより少ない体重を有した。これは、処理群が体重減少に関して抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂからの毒性を経験しなかったことを示唆する。両群の平均腫瘍体積及び腫瘍体積中央値は同様であり、研究の１５日目に全く同じであった。研究の５９日目に、両群が７００立方ｍｍ^３の腫瘍体積に達した。これは、抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂが対照群と比較してインビボでのＢＴ４７４腫瘍の成長を低下させなかったことを示唆する。図１１は、群平均腫瘍体積を図解する。

【表40】

【0171】

例１４：抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂに対して指向されたマウスモノクローナル抗体の産生
この例では、本発明のｓｄＡｂに対するマウスモノクローナル抗体を生成した。使用した動物は、８〜１０週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスであった。水溶性アジュバントを使用した（ＣＢＬ）。使用したＨＡＴ及びＨＴは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈからのものであった。

【0172】

抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂを使用して３匹のマウスを免疫化し、ハイブリドーマ細胞株を作製した。これらのマウスを各々水溶性アジュバントで３回免疫化した。１匹のマウスにおいて、血清力価が１／５１２００に達した。このマウスを屠殺し、脾臓細胞を骨髄腫細胞株Ｓｐ２／０と融合させることによってハイブリドーマ細胞株を作製した。

【0173】

この融合した細胞を限界希釈により９６ウェルプレートに播種した。この融合した細胞をＨＡＴの存在下で培養し、６５１個の単一クローンを試験した。６５１個の単一クローンのうち２７個の陽性クローンが抗ＳＴＡＴ３細菌性ＶＨＨ１３（配列番号３）ｓｄＡｂ抗原に特異的に結合すると特定された。

【0174】

例１５：ＰＡＮＣ−１ヒト膵臓癌細胞におけるＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）単一ドメイン抗体の細胞毒性
この例は、ヒト膵臓癌細胞株ＰＡＮＣ−１を使用して抗ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）（配列番号２）ｓｄＡｂの抗増殖効果を実証する。この実験のために、ＰＡＮＣ−１細胞が９０％コンフルエンスに達するまでこれらの細胞を成長させた。この時点で、上述のＭＴＴアッセイを使用して増殖研究を行った。

【0175】

処理３日後のＰＡＮＣ−１細胞における抗ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）（配列番号２）ｓｄＡＢの抗増殖特性を表４１に示す。抗ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）（配列番号２）ｓｄＡｂで処理したＰＡＮＣ−１細胞は、それぞれ、５０．０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬで１９．９及び３７．７の平均成長阻害を示した。

【表41】

【0176】

したがって、抗ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）（配列番号２）ｓｄＡｂは、ＰＡＮＣ−１ヒト膵臓癌細胞において用量依存的成長阻害を示した。

【0177】

例１６：ＴＮＦ−アルファｓｄＡｂによるインビトロ成長阻害
この例は、ＴＮＦ−アルファの濃度を決定するために開発された方法及びＴＮＦ−アルファ機能の阻害を評価する方法を実証する。Ｕ９３７ヒト肺リンパ芽球細胞株における活性の測定可能な調節を示すのに必要なＴＮＦ−アルファの濃度を、ＰｒｏｍｅｇａのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−ＧＪｏ（登録商標）発光細胞生存アッセイを使用して代謝的に活性な細胞の存在をシグナル伝達するＡＴＰの存在を定量することによって評価した。

【0178】

Ｕ９３７細胞を、全体積９０μＬ／ウェルの透明なポリスチレン９６ウェルマイクロ培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）９６ウェル平底プレート、カタログ番号３９９７）に播種した。５％Ｃ０_２及び９５％空気を有する３７℃の加湿インキュベーター内で２４時間インキュベートした後、成長培地中の５μＬの２０倍連続希釈ＴＮＦ−アルファを各ウェルに二連で添加した（１０点用量応答、最大濃度２０ｎｇ／ｍＬ）。さらに、成長培地中の５μＬの２０倍希釈スタウロスポリンを各ウェルに二連で添加した（濃度１ｎＭ）。

【0179】

試験薬剤の存在下で２４時間培養した後、Ｕ９３７細胞株におけるＴＮＦ−アルファ活性の測定可能な調節を示すのに必要な化合物の濃度を、ＡＴＰの存在を定量することによって評価した。細胞成長パーセントを未処理対照ウェルに対して計算した。全ての試験を各濃度レベルで、二連で行った。

【0180】

以下の４パラメータロジスティック等式を使用してデータを曲線フィッティングすることによって、Ｐｒｉｓｍ ６．０５を使用して試験薬剤のＥＣ_５０値を推定した。

【数4】

式中、Ｔｏｐは対照吸光度の最大％であり、Ｂｏｔｔｏｍは最大薬剤濃度での対照吸光度の最小％であり、Ｙは対照吸光度％であり、Ｘは薬剤濃度であり、ＩＣ_５０は対照細胞と比較して細胞成長を５０％阻害する薬剤の濃度であり、ｎは曲線の勾配である。

【0181】

図１２及び１３は、ＴＮＦ−アルファがＵ９３７細胞に細胞毒性であることを実証する。Ｕ９３７に対するＴＮＦ−アルファのＩＣ_５０は、９５．１０ｐｇ／ｍＬである。ＴＮＦ−アルファ曲線は、用量漸増死滅作用（ｄｏｓｅ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｋｉｌｌｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ）を示す。

【0182】

図１４は、Ｕ９３７に対するＴＮＦ−アルファ細胞毒性が３つの異なる抗ＴＮＦ−アルファＶＨＨによって阻害されることを実証する。抗ＴＮＦ−アルファＶＨＨ６２（配列番号４７）ｓｄＡｂ、抗ＴＮＦ−アルファＶＨＨ ６６（配列番号４５）ｓｄＡｂ、及び抗ＴＮＦ−アルファＶＨＨ６９（配列番号４６）ｓｄＡｂを一定用量のＴＮＦ−アルファとともにＥＣ_５０でインキュベートしたときに、３つ全ての抗ＴＮＦ−アルファＶＨＨがＴＮＦ−アルファによるＵ９３７の死滅を阻害する。抗ＴＮＦ−アルファＶＨＨ６２（配列番号４７）ｓｄＡｂのＩＣ_５０は、およそ７１３．６ｕｇ／ｍＬであった。抗ＴＮＦ−アルファＶＨＨ６９（配列番号４６）ｓｄＡｂのＩＣ_５０は、２０８．０５５ｕｇ／ｍＬを超えた。抗ＴＮＦ−アルファＶＨＨ６６（配列番号４５）ｓｄＡｂが約１×１０^２ｕｇ／ｍＬ〜１×１０^２ｕｇ／ｍＬの抗ＴＮＦ−アルファＶＨＨ６６（配列番号４５）ｓｄＡｂ濃度でＴＮＦ−アルファの細胞毒性を完全に阻害したため、抗ＴＮＦ−アルファＶＨＨ６６（配列番号４５）ｓｄＡｂのＩＣ_５０を決定することができなかった。この抗ＴＮＦ−アルファＶＨＨ６６（配列番号４５）ｓｄＡｂ濃度範囲内で、Ｕ９３７細胞成長が増大し、それ故にＴＮＦ−アルファ活性を完全に阻害する。

【0183】

本発明がある特定の好ましい実施形態を参照してかなり詳細に説明されているが、他の実施形態も可能である。例えば、本方法の開示されるステップは、限定することを意図するものでも、各ステップが本方法に必ず必要であると示すことを意図するものでもなく、むしろ例示のステップにすぎない。したがって、添付の特許請求の範囲は、本開示に含まれる好ましい実施形態の記述に限定されるべきではない。本明細書で引用される全ての参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]