特許 6671276 ＴＬ１Ａ機能および関連するシグナル経路の抑制による線維症および炎症の緩和および回復

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6671276

(24)【登録日】2020年3月5日

(45)【発行日】2020年3月25日

(54)【発明の名称】ＴＬ１Ａ機能および関連するシグナル経路の抑制による線維症および炎症の緩和および回復

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20200316BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20200316BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20200316BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20200316BHJP

   C07K 16/24 20060101ALN20200316BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/395 N

   A61K39/395 D

   A61P43/00 105

   A61P29/00

   A61P1/00

   !C07K16/24

【請求項の数】24

【全頁数】34

(21)【出願番号】特願2016-505570(P2016-505570)

(86)(22)【出願日】2014年3月27日

(65)【公表番号】特表2016-522164(P2016-522164A)

(43)【公表日】2016年7月28日

(86)【国際出願番号】US2014032054

(87)【国際公開番号】WO2014160883

(87)【国際公開日】20141002

【審査請求日】2017年3月24日

(31)【優先権主張番号】61/805,806

(32)【優先日】2013年3月27日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/872,020

(32)【優先日】2013年8月30日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】398062149

【氏名又は名称】セダーズ−シナイ メディカル センター

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】シー， デイビッド キュー．

(72)【発明者】

【氏名】ターガン， ステファン アール．

(72)【発明者】

【氏名】リ， ダリン

(72)【発明者】

【氏名】ビルスボロー， ジャニーン

【審査官】 参鍋 祐子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５２６７５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１２／００７９６１１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００９／０３１７３８８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 Gastroenterology，２００８年，Vol.135，pp.552-567

【文献】 INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR MEDICINE，２００７年，Vol.19，pp.941-946

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｐ １／００

Ａ６１Ｐ ２９／００

Ａ６１Ｐ ４３／００

Ｃ０７Ｋ １６／２４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

健常者におけるＩＬ３１ＲＡを含む遺伝子から発現される遺伝子発現産物のレベルと比較して高レベルの前記遺伝子発現産物を発現すると判定された対象における線維症の治療に使用するために前記遺伝子発現産物の発現を低減させるための組成物であって、前記組成物は、ＴＬ１Ａ−ＤＲ３シグナル伝達機能抑制物質を含み、前記ＴＬ１Ａ−ＤＲ３シグナル伝達機能抑制物質は、ＴＬ１Ａに直接結合することでＴＬ１Ａ機能を抑制するＴＬ１Ａ遮断抗体を含む、組成物。

【請求項2】

前記線維症から炎症前のレベルまで回復させるための、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記線維症が結腸の線維症である、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

前記対象における腸炎症を抑制するための、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

前記対象における線維芽細胞及び／または筋線維芽細胞の数を減少させるための、請求項１に記載の組成物。

【請求項6】

前記対象における原発性腸筋線維芽細胞の数を減少させるための、請求項１に記載の組成物。

【請求項7】

健常者におけるＩＬ３１ＲＡを含む遺伝子から発現される遺伝子発現産物のレベルと比較して高レベルの前記遺伝子発現産物を発現すると判定された対象における前記遺伝子発現産物の発現を低減させることにより線維症の回復に使用するための組成物であって、前記組成物は、ＴＬ１Ａ抑制物質を含み、前記ＴＬ１Ａ抑制物質は、ＴＬ１Ａに直接結合することでＴＬ１Ａ機能を抑制するＴＬ１Ａ遮断抗体を含む、組成物。

【請求項8】

健常者におけるＩＬ３１ＲＡを含む遺伝子から発現される遺伝子発現産物のレベルと比較して高レベルの前記遺伝子発現産物を発現すると判定された線維症を有する対象における前記遺伝子発現産物の発現を低減させるために使用するための組成物であって、前記組成物は、ＴＬ１Ａに直接結合することでＴＬ１Ａ機能を抑制するＴＬ１Ａ遮断抗体を含む、組成物。

【請求項9】

前記組成物が前記対象へ静脈注射によって投与されることを特徴とする、請求項８に記載の組成物。

【請求項10】

前記遺伝子発現産物がＲＮＡを含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項11】

前記遺伝子発現産物がタンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項12】

前記遺伝子発現産物がＲＮＡを含む、請求項７に記載の組成物。

【請求項13】

前記遺伝子発現産物がタンパク質を含む、請求項７に記載の組成物。

【請求項14】

前記遺伝子発現産物がＲＮＡを含む、請求項８に記載の組成物。

【請求項15】

前記遺伝子発現産物がタンパク質を含む、請求項８に記載の組成物。

【請求項16】

前記遺伝子が、ＩＦＮＧ、ＣＴＧＦ、ＩＬ１７、ＴＧＦＢ１、ＣＯＬＬＡ２及び／またはＩＧＦ１を更に含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項17】

前記遺伝子が、ＩＦＮＧ、ＣＴＧＦ、ＩＬ１７、ＴＧＦＢ１、ＣＯＬＬＡ２及び／またはＩＧＦ１を更に含む、請求項７に記載の組成物。

【請求項18】

前記遺伝子が、ＩＦＮＧ、ＣＴＧＦ、ＩＬ１７、ＴＧＦＢ１、ＣＯＬＬＡ２及び／またはＩＧＦ１を更に含む、請求項８に記載の組成物。

【請求項19】

前記対象における腸炎症の抑制のための、請求項７に記載の組成物。

【請求項20】

前記対象における線維芽細胞及び／または筋線維芽細胞の数を減少させるための、請求項７に記載の組成物。

【請求項21】

前記対象における原発性腸筋線維芽細胞の数を減少させるための、請求項７に記載の組成物。

【請求項22】

前記対象における腸炎症の抑制のための、請求項８に記載の組成物。

【請求項23】

前記対象における線維芽細胞及び／または筋線維芽細胞の数を減少させるための、請求項８に記載の組成物。

【請求項24】

前記対象における原発性腸筋線維芽細胞の数を減少させるための、請求項８に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＴＬ１Ａ機能及び線維症に関する状態の治療及び診断のための方法ならびに組成物を提供する。

【背景技術】

【0002】

本明細書に記載の全ての出版物は、個々の出版物または特許出願が参照によって特に及び個々に組み込まれるよう指示されたかのように、参照によって同程度まで組み込まれる。以下の記載には本発明の理解に役立ち得る情報が含まれる。これは、本明細書に提供される情報のいずれもが先行技術であることもしくは本願発明と関連していること、または特にもしくは暗黙的に参照されたあらゆる出版物が先行技術であることを承認するものではない。

【0003】

Ｃｒｏｈｎ病（ＣＤ）は、斑上の全層性炎症及び繊維性狭窄（ｆｉｂｒｏｓｔｅｎｏｓｉｓ）などの病理学的特徴を伴う慢性炎症状態である。強力な消炎症療法にも関わらず、ＣＤ患者の最大２０％が依然として外科的処置の必要な構造的合併症を発症する。線維症を制御する経路は、炎症を媒介する経路とは異なり得る。ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーであるＴＬ１Ａは、デスドメイン受容体３（ＤＲ３）と結合し、適応的免疫応答を調節する。ＴＬ１Ａは、ＣＤ、腸の繊維性狭窄、及びより高い外科手術の必要性に関連し得る。確立された線維症を回復するための療法を含む、ＴＬ１Ａ／ＤＲ３シグナル経路と関連する疾患、ＣＤ、ならびに関連する合併症を治療するための新規かつ効果的な療法が必要とされている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

本明細書に記載の様々な実施形態には、対象における線維症の治療方法が含まれ、これには１つ以上のＴＬ１Ａ機能抑制物質を含む組成物を提供すること、及び治療効果のある用量の組成物を対象へ投与することが含まれる。一実施形態において、組成物には１つ以上のＴＬ１Ａ遮断抗体が含まれる。別の実施形態において、組成物には１つ以上のＤｒ３遮断抗体が含まれる。別の実施形態において、組成物にはＴＬ１Ａと直接結合することでＴＬ１Ａ機能を抑制する１つ以上の化合物が含まれる。別の実施形態において、組成物には、Ｉｆｎｇａｍｍａ、ＩＬ１７、Ｃｔｇｆ、及びＩＬ３１Ｒａの抑制物質が１つ以上含まれる。別の実施形態において、組成物にはＴｇｆｂｅｔａ１及びＩｇｆ１の抑制物質が１つ以上含まれる。別の実施形態において、組成物にはＩＬ３１シグナル伝達抑制物質が１つ以上含まれる。別の実施形態において、治療効果のある用量の組成物を投与することで、線維症の炎症前のレベルまでの回復がもたらされる。別の実施形態において、線維症は腸の線維症である。別の実施形態において、治療効果のある用量の組成物を投与することで、対象における腸炎症の抑制が更にもたらされる。

【0005】

その他の実施形態には、対象における疾患の治療方法が含まれ、これにはＩＬ３１Ｒａシグナル伝達の抑制物質を含む組成物を提供すること、及び有効量の組成物を対象へ投与することが含まれる。別の実施形態において、疾患はＴＬ１Ａ関連疾患である。別の実施形態において、疾患は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である。別の実施形態において、疾患は小腸及び／または腸炎症において発生した狭窄と関係する。別の実施形態において、疾患は小腸及び大腸の繊維性狭窄である。別の実施形態において、疾患は線維症である。別の実施形態において、組成物には１つ以上のＴＬ１Ａ Ａｂが含まれる。別の実施形態において、組成物には、ＩＬ３１ＲＡ、Ｉｆｎｇａｍｍａ、ＩＬ１７、Ｃｔｇｆ、ＴｇｆＢ１、及び／またはＩｇｆ１シグナル伝達の抑制物質が１つ以上含まれる。

【0006】

その他の実施形態には、対象におけるＴＬ１Ａ関連疾患に対する感受性の診断方法が含まれ、これには、対象から試料を得ること、試料を試験して健常者と比べて高レベルなＩＬ３１Ｒａ発現が存在するかまたは存在しないかを判定すること、及び健常者と比べて高レベルなＩＬ３１ＲＡ発現の存在に基づいて、ＴＬ１Ａ関連疾患に対する感受性を診断することが含まれる。別の実施形態において、ＴＬ１Ａ関連疾患は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である。別の実施形態において、ＴＬ１Ａ関連疾患は、小腸及び／または腸炎症において発生した狭窄と関係する。別の実施形態において、ＴＬ１Ａ関連疾患は、小腸及び大腸の繊維性狭窄である。別の実施形態において、ＴＬ１Ａ関連疾患は線維症である。別の実施形態において、この方法には更に、健常者と比べて高レベルな、ＩＬ３１ＲＡ、Ｉｆｎｇａｍｍａ、ＩＬ１７、Ｃｔｇｆ、ＴｇｆＢ１、及び／またはＩｇｆ１の発現の存在を判定することが含まれる。

【0007】

様々な実施形態に、対象におけるＴＬ１Ａ関連疾患の診断方法が含まれており、これには、対象から試料を得ること、１つ以上のＴＬ１Ａ関連疾患と関連するリスクバリアント及び／またはマーカーが存在するかまたは存在しないかを判定すること、ならびにＴＬ１Ａ関連疾患と関連する１つ以上のリスクバリアント及び／またはマーカーの存在に基づいて、ＴＬ１Ａ関連疾患を診断することが含まれる。別の実施形態において、１つ以上のリスクバリアント及び／またはマーカーにはＩＬ３１ＲＡの高発現が含まれる。その他の実施形態には、Ｉｆｎｇａｍｍａ、ＩＬ１７、Ｃｔｇｆ、ＴｇｆＢ１、及び／またはＩｇｆ１の高発現を含む１つ以上のリスクバリアント及び／またはマーカーが含まれる。別の実施形態において、ＴＬ１Ａ関連疾患は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である。別の実施形態において、ＴＬ１Ａ関連疾患は、小腸及び／または腸炎症において発生した狭窄と関係する。別の実施形態において、ＴＬ１Ａ関連疾患は小腸及び大腸の繊維性狭窄である。別の実施形態において、ＴＬ１Ａ関連疾患は線維症である。別の実施形態において、この方法には更に、１つ以上のＴＬ１Ａ抑制物質を投与することでＴＬ１Ａ関連疾患を治療することが含まれる。別の実施形態において、この方法には更に、ＴＬ１Ａ抑制物質を投与することでＴＬ１Ａ関連疾患を治療することが含まれる。別の実施形態において、対象はヒトである。別の実施形態において、この方法には更に、Ｄｒ３抑制物質を投与することでＴＬ１Ａ関連疾患を治療することが含まれる。

【0008】

その他の実施形態には、対象における線維症の治療方法が含まれ、これにはＴＬ１Ａ抑制物質及びＤＲ３抑制物質を含む組成物を提供すること、ならびに治療効果のある用量の組成物を対象へ投与することが含まれる。別の実施形態において、ＴＬ１Ａ抑制物質はＴＬ１Ａ Ａｂである。

【0009】

その他の実施形態には、対象における線維症の回復方法が含まれ、これにはＴＬ１Ａ抑制物質及びＤＲ３抑制物質を含む組成物を提供すること、ならびに治療効果のある用量の組成物を対象へ投与することが含まれる。別の実施形態において、組成物には更に、Ｉｆｎｇａｍｍａ、ＩＬ１７、Ｃｔｇｆ、及び／またはＩＬ３１ＲＡシグナル伝達機能の抑制物質が含まれる。

【0010】

様々な実施形態に、炎症の治療方法が含まれ、これにはＴＬ１Ａ抑制物質及び／またはＤＲ３抑制物質を含む組成物を提供すること、ならびに治療効果のある用量の組成物を対象へ投与することが含まれる。別の実施形態において、組成物には更に、Ｉｆｎｇａｍｍａ、ＩＬ１７、Ｃｔｇｆ、及び／またはＩＬ３１ＲＡシグナル伝達機能の抑制物質が含まれる。

【0011】

その他の実施形態には、対象における疾患の治療方法が含まれ、これには、Ｉｆｎγ及びＩｌ−１７発現を抑制すること、Ｔｇｆβシグナル伝達を下方制御すること、及び／または線維芽細胞／筋線維芽細胞を減少させること、ならびに対象を治療することが含まれる。別の実施形態において、疾患は炎症性腸疾患である。別の実施形態において、疾患は線維症である。別の実施形態において、疾患は腸炎症である。別の実施形態において、疾患は炎症性腸疾患と関連する合併症である。

【0012】

その他の実施形態には、ＴＬ１Ａ、ＤＲ３、及びＩＬ３１ＲＡシグナル伝達機能の抑制物質を１つ以上含む組成物、ならびに薬剤的に許容可能な担体が含まれる。別の実施形態において、１つ以上のＴＬ１Ａ抑制物質はＴＬ１Ａ Ａｂである。別の実施形態において、１つ以上のＤＲ３抑制物質はＤＲ３抗体である。

【0013】

本明細書に記載の様々な実施形態には、ＩＢＤと関連する合併症の治療方法が含まれ、これにはＴＬ１Ａ、ＤＲ３、及びＩＬ３１ＲＡシグナル伝達機能の抑制物質を含む組成物を提供すること、ならびに治療効果のある用量の組成物を対象に投与することが含まれる。別の実施形態において、組成物は静脈注射によって対象へ投与される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
対象における線維症の治療方法であって、
ＴＬ１Ａ−ＤＲ３シグナル伝達機能抑制物質を１つ以上含む組成物を提供すること；及び
治療効果のある用量の組成物を前記対象へ投与することを含む、前記対象における線維症の治療方法。
（項目２）
前記組成物が１つ以上のＴＬ１Ａ遮断抗体を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記組成物が１つ以上のＤｒ３遮断抗体を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記組成物が、ＴＬ１Ａに直接結合することでＴＬ１Ａ機能を抑制する１つ以上の化合物を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記組成物が、Ｉｆｎｇａｍｍａ、ＩＬ１７、Ｃｔｇｆ、及びＩＬ３１Ｒａの抑制物質を１つ以上含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記組成物が、Ｔｇｆｂｅｔａ１及びＩｇｆ１の抑制物質を１つ以上含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記組成物が、ＩＬ３１シグナル伝達の抑制物質を１つ以上含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
治療効果のある用量の前記組成物を投与することで、前記線維症から炎症前のレベルまでの回復をもたらす、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記線維症が結腸の線維症である、項目１に記載の方法。
（項目１０）
治療効果のある用量の前記組成物を投与することで、前記対象における腸炎症の抑制を更にもたらす、項目１に記載の方法。
（項目１１）
治療効果のある用量の前記組成物を投与することで、前記対象における線維芽細胞及び／または筋線維芽細胞の数を減少させる、項目１に記載の方法。
（項目１２）
治療効果のある用量の前記組成物を投与することで、前記対象における原発性腸筋線維芽細胞の数を減少させる、項目１に記載の方法。
（項目１３）
対象における疾患の治療方法であって、
ＩＬ３１Ｒａシグナル伝達抑制物質を含む組成物を提供すること；及び、
有効量の前記組成物を前記対象へ投与することを含む、前記治療方法。
（項目１４）
前記疾患がＴＬ１Ａ関連疾患である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記疾患が炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
前記疾患が、前記小腸及び／または腸炎症において発生した狭窄と関係する、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
前記疾患が、小腸及び大腸の繊維性狭窄（ｆｉｂｒｏｓｔｅｎｏｓｉｓ）である、項目１３に記載の方法。
（項目１８）
前記疾患が線維症である、項目１３に記載の方法。
（項目１９）
前記組成物が１つ以上のＴＬ１Ａ Ａｂを含む、項目１３に記載の方法。
（項目２０）
前記組成物が、ＩＬ３１ＲＡ、Ｉｆｎｇａｍｍａ、ＩＬ１７、Ｃｔｇｆ、ＴｇｆＢ１、及び／またはＩｇｆ１シグナル伝達の抑制物質を１つ以上含む、項目１３に記載の方法。
（項目２１）
治療効果のある用量の前記組成物を投与することで、前記対象における線維芽細胞及び／または筋線維芽細胞を減少させる、項目１３に記載の方法。
（項目２２）
対象におけるＴＬ１Ａ関連疾患への感受性の診断方法であって、
前記対象から試料を得ること；
前記試料を試験して、健常者と比べて高レベルなＩＬ３１Ｒａ発現が存在するかまたは存在しないかを判定すること；及び、
健常者と比べて高レベルなＩＬ３１ＲＡ発現の存在に基づいて、前記ＴＬ１Ａ関連疾患に対する感受性を診断することを含む、前記対象におけるＴＬ１Ａ関連疾患への感受性の診断方法。
（項目２３）
前記ＴＬ１Ａ関連疾患が炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記ＴＬ１Ａ関連疾患が、前記小腸及び／または腸炎症において発生した狭窄と関係する、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
前記ＴＬ１Ａ関連疾患が、小腸及び大腸の繊維性狭窄である、項目２２に記載の方法。
（項目２６）
前記ＴＬ１Ａ関連疾患が線維症である、項目２２に記載の方法。
（項目２７）
健常者と比べて高レベルな、コラーゲン、ＩＬ３１ＲＡ、Ｉｆｎｇａｍｍａ、ＩＬ１７、Ｃｔｇｆ、ＴｇｆＢ１、及び／またはＩｇｆ１の発現の存在を判定することを更に含む、項目２２に記載の方法。
（項目２８）
対象におけるＴＬ１Ａ関連疾患の診断方法であって、
前記対象から試料を得ること；
前記試料を試験して、１つ以上の前記ＴＬ１Ａ関連疾患と関連するリスクバリアント及び／またはマーカーが存在するかまたは存在しないかを判定すること；ならびに、
前記ＴＬ１Ａ関連疾患と関連する１つ以上のリスクバリアント及び／またはマーカーの存在に基づいて、前記ＴＬ１Ａ関連疾患を診断することを含む、前記対象におけるＴＬ１Ａ関連疾患の診断方法。
（項目２９）
前記１つ以上のリスクバリアント及び／またはマーカーがＩＬ３１ＲＡの高発現を含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記１つ以上のリスクバリアント及び／またはマーカーが、Ｉｆｎｇａｍｍａ、ＩＬ１７、Ｃｔｇｆ、ＴｇｆＢ１、及び／またはＩｇｆ１の高発現を含む、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
前記ＴＬ１Ａ関連疾患が炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である、項目２８に記載の方法。
（項目３２）
前記ＴＬ１Ａ関連疾患が、前記小腸及び／または腸炎症において発生した狭窄と関係する、項目２８に記載の方法。
（項目３３）
前記ＴＬ１Ａ関連疾患が、小腸及び大腸の繊維性狭窄である、項目２８に記載の方法。
（項目３４）
前記ＴＬ１Ａ関連疾患が線維症である、項目２８に記載の方法。
（項目３５）
１つ以上のＴＬ１Ａ抑制物質を投与することで前記ＴＬ１Ａ関連疾患を治療することを更に含む、項目２８に記載の方法。
（項目３６）
ＴＬ１Ａ抑制物質を投与することで前記ＴＬ１Ａ関連疾患を治療することを更に含む、項目２８に記載の方法。
（項目３７）
前記対象がヒトである、項目２８に記載の方法。
（項目３８）
Ｄｒ３抑制物質を投与することで前記ＴＬ１Ａ関連疾患を治療することを更に含む、項目２８に記載の方法。
（項目３９）
対象における線維症の治療方法であって、
ＴＬ１Ａ抑制物質及びＤＲ３抑制物質を含む組成物を提供すること；ならびに、
治療効果のある用量の前記組成物を前記対象へ投与することを含む、前記対象における線維症の治療方法。
（項目４０）
前記ＴＬ１Ａ抑制物質がＴＬ１Ａ Ａｂである、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記ＤＲ３抑制物質がＤＲ３の発現を除去する、項目３９に記載の方法。
（項目４２）
前記線維症が減少する、項目３９に記載の方法。
（項目４３）
前記組成物がＴＬ１Ａ−ＤＲ３シグナル伝達機能を抑制する、項目３９に記載の方法。
（項目４４）
対象における線維症の回復方法であって、
ＴＬ１Ａ抑制物質及びＤＲ３抑制物質を含む組成物を提供すること；ならびに、
治療効果のある用量の前記組成物を前記対象へ投与することを含む、前記対象における線維症の回復方法。
（項目４５）
前記組成物が、Ｉｆｎｇａｍｍａ、ＩＬ１７、Ｔｇｆｂｅｔａ１、Ｃｔｇｆ、及び／またはＩＬ３１ＲＡシグナル伝達機能の抑制物質を更に含む、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記組成物がＴＬ１Ａ−ＤＲ３シグナル伝達機能を抑制する、項目４４に記載の方法。
（項目４７）
炎症の治療方法であって、以下：
ＴＬ１Ａ抑制物質及び／またはＤＲ３抑制物質を含む組成物を提供すること；ならびに、
治療効果のある用量の前記組成物を前記対象へ投与することを含む、前記炎症の治療方法。
（項目４８）
前記組成物が、Ｉｆｎｇａｍｍａ、ＩＬ１７、Ｃｔｇｆ、及び／またはＩＬ３１ＲＡシグナル伝達機能の抑制物質を更に含む、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記組成物がＴＬ１Ａ−ＤＲ３シグナル伝達機能を抑制する、項目４７に記載の方法。
（項目５０）
対象における疾患の治療方法であって、
Ｉｆｎγ及びＩｌ−１７発現を抑制すること、Ｔｇｆβシグナル伝達を下方制御すること、及び／または線維芽細胞／筋線維芽細胞を減少させること；ならびに、
前記対象を治療することを含む、前記対象における疾患の治療方法。
（項目５１）
前記疾患が炎症性腸疾患である、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記疾患が線維症である、項目５０に記載の方法。
（項目５３）
前記疾患が腸炎症である、項目５０に記載の方法。
（項目５４）
前記疾患が炎症性腸疾患と関連する合併症である、項目５０に記載の方法。
（項目５５）
組成物であって、以下：
１つ以上のＴＬ１Ａ、ＤＲ３、及びＩＬ３１ＲＡシグナル伝達機能の抑制物質；ならびに、
薬剤的に許容可能な担体を含む、前記組成物。
（項目５６）
前記１つ以上のＴＬ１Ａ抑制物質がＴＬ１Ａ Ａｂである、項目５５に記載の組成物。
（項目５７）
前記１つ以上のＤＲ３抑制物質がＤＲ３抗体である、項目５５に記載の組成物。
（項目５８）
ＩＢＤと関連する合併症の治療方法であって、
ＴＬ１Ａ、ＤＲ３、及びＩＬ３１ＲＡシグナル伝達機能の抑制物質を含む組成物を提供すること；ならびに、
治療効果のある用量の前記組成物を前記対象へ投与することを含む、前記ＩＢＤと関連する合併症の治療方法。
（項目５９）
前記組成物が前記対象へ静脈注射によって投与される、項目５８に記載の方法。

【0014】

例示的な実施形態を参照図にて説明する。本明細書に開示の実施形態及び図は制限よりも説明を目的とすることが意図される。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】図１は、本明細書に記載の実施形態に従い、Ｔｌ１ａ Ａｂ減少結腸疾患の特徴を示す。（Ａ）養子移植モデルに関するＴｌ１ａ Ａｂ治療の結線図；ベースラインＲａｇ−／−対照マウス（Ｒａｇ Ｃｏ）、ベースライン野生型対照マウス（ＷＴ Ｃｏ）、治療前群（Ｐｒｅ−Ｔｘ）、アイソタイプ抗体群（Ｉｓｏ Ａｂ）、治療後群（Ｐｏｓｔ−Ｔｘ）。（Ｂ）ＤＡＩはＩｓｏとＴｌ１ａ Ａｂ治療群との間で比較される。（Ｃ）結腸の代表的な外観（左図）を定量的な炎症スコア（右図）と共に示す。データは平均値±ＳＤとして表す。（Ｄ）全単核細胞数をＭＬＮ及びＬＰＭＣから単離した。各黒丸は独立したマウスを表す。Ｔｌ１ａ Ａｂ治療群はＰｒｅ−Ｔｘ及びＩｓｏ Ａｂ群と比較される。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図2】図２は、本明細書に記載の実施形態に従い、Ｔｌ１ａ Ａｂ治療逆確立大腸炎症を示す。（Ａ）拡大率２００倍の代表的なＨ＆Ｅ染色結腸中間部。（Ｂ）養子移植モデルに関する定量的組織診断スコア。少なくとも２０ヶ所の独立した場所をスコア化し、データを平均値±ＳＤとして表す。（Ｃ）ミエロペルオキシダーゼ活性を測定し、結腸のタンパク質抽出物のグラム（ｇ）毎の活性単位（ｕ）として表した。各黒丸は独立したマウスを表す。Ｔｌ１ａ Ａｂ治療群は、ベースラインＲａｇ Ｃｏ、Ｐｒｅ−Ｔｘ、及びＩｓｏ Ａｂ実験群と比較される。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図3】図３は、本明細書に記載の実施形態に従い、Ｔｌ１ａ Ａｂ減少Ｔｈ−１及び−１７免疫応答を示す。（Ａ）細胞内のＩｆｎγ及びＩｌ１７発現を染色したゲート開閉ＣＤ４＋細胞の代表的なフローサイトメトリー図を、ＭＬＮ（上図）及びＬＰＭＣ（下図）に関して示す。ＣＤ４＋Ｉｌ１７＋、ＣＤ４＋Ｉｆｎγ＋、及びＣＤ４＋Ｉｌ１７＋Ｉｆｎγ＋Ｔ細胞の割合を、ＭＬＮ（Ｂ）及びＬＰＭＣ（Ｃ）に関して定量化した。ＭＬＮ及びＬＰＭＣから単離した単核細胞を抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で刺激し、分泌されたＩｌ１７（Ｄ）及びＩｆｎγ（Ｅ）の濃度をＥＬＩＳＡによって評価した。各黒丸は独立したマウスから得た値を表す。Ｔｌ１ａ Ａｂ治療群は、Ｐｒｅ−Ｔｘ及びＩｓｏ Ａｂ実験群と比較される。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図4】図４は、本明細書に記載の実施形態に従い、養子移植モデルにおける確立した線維症のＴｌ１ａ Ａｂ療法による回復を示す。（Ａ）拡大率２００倍の結腸中間部におけるコラーゲン沈着の代表的なＳｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ染色。黒い矢印はコラーゲン沈着の厚さを示す。（Ｂ）結腸中間部由来のビメンチン（緑色）及びαＳＭＡ（赤色）の代表的な免疫蛍光染色を示す。オレンジ色の矢印は、ビメンチン及びαＳＭＡを同時発現する筋線維芽細胞を示す。結腸中間部由来のコラーゲン厚さ（Ｃ）及び活性化線維芽細胞の割合（Ｄ）の定量化が示され、平均値±ＳＤとして表される。群毎に少なくとも２０ヶ所の独立した場所をスコア化した。Ｔｌ１ａ Ａｂ治療群は、ベースラインＲａｇ Ｃｏ、Ｐｒｅ−Ｔｘ、及びＩｓｏ Ａｂ実験群と比較される。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図5】図５は、本明細書に記載の実施形態に従い、Ｄｒ３欠損を有する腸の線維芽細胞増殖の減少を示す。（Ａ）マウスＤｒ３内在性遺伝子座の略図及び遺伝子ターゲティングの戦略。（Ｂ）Ｄｒ３遺伝子型の代表的なポリメラーゼ連鎖反応を、５０６ｂｐにおける標的化（Ｄｒ３ ＫＯ）バンド、及び３５３ｂｐにおける内在性Ｄｒ３座位によって示す。（Ｃ）同腹仔ＷＴ及びＤｒ３−／−結腸（左図）より回収した腸の線維芽細胞の６枚の写真のうち代表的な写真、ならびに結腸毎の個々の総線維芽細数（右図）が図表化されている。（Ｄ）ＷＴ及びＤｒ３−／−マウス由来の増殖性線維芽細胞（上図）及びアポトーシスが進行中の線維芽細胞（下図）の定量化を示す、代表的なフローサイトメトリーのヒストグラム。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ蛍光強度の減少は、増殖を示す。アネキシンＶ染色の増殖は、アポトーシスを示す。同様の結果を伴う、少なくとも６つの独立した実験の代表的なフローサイトメトリーのヒストグラムが示されている。^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図6】図６は、本明細書に記載の実施形態に従い、Ｄｒ３を発現し、Ｔｌ１ａ刺激へ応答する、腸の線維芽細胞を示す。（Ａ）Ｄｒ３ ｍＲＮＡはＷＴにおいて検出されるが、Ｄｒ３−／−線維芽細胞（上図）では検出されない。ＮＤ＝検出せず。ＷＴ線維芽細胞の免疫蛍光染色により、陽性Ｄｒ３染色を赤色（下図）で示した。（Ｂ）原発性腸線維芽細胞を、Ｄｒ３、αＳＭＡ、及びビメンチンで染色した。αＳＭＡ陽性及び陰性線維芽細胞を示したようにゲート開閉したことで、Ｄｒ３染色がαＳＭＡ＋ＷＴにて見出されるが、Ｄｒ３−／−及びαＳＭＡ陰性細胞では見出されない。示したデータは、同様の結果を伴う少なくとも３つの独立した実験のうち代表的な実験である。（Ｃ）Ｔｌ１ａ刺激の増殖（０〜２００ｎｇ／ｍＬ）を伴うＷＴ原発性腸線維芽細胞におけるＣｏｌ１ａ２及びＩｌ３１Ｒａ ｍＲＮＡの発現を示し、平均値±ＳＤとして示した。（Ｄ）ＷＴ及びＤｒ３−／−腸におけるＣｏｌ１ａ２及びＩｌ３１ＲａｍＲＮＡのＴｌ１ａによる相対的な誘発であり、平均値±ＳＤとして示した。^＊ｐ＜０．０５。

【図7】図７は、本明細書に記載の実施形態に従い、慢性的なＤＳＳ投与によるＴｌ１ａ Ａｂ減少炎症性疾患活性を示す。（Ａ）ＤＡＩは、アイソタイプＡｂ（ｎ＝１４）及びＴｌ１ａ Ａｂ（ｎ＝９）治療群間にて比較される。（Ｂ）結腸の代表的な外観（左図）を定量的炎症スコア（右図）と共に示す。データは平均値＋／−ＳＤとして表す。（Ｃ）総単核細胞数をＭＬＮ及びＬＰより単離した。各黒塗りの記号は独立したマウスを表す。Ｔｌ１ａ Ａｂ治療群はＰｒｅ−Ｔｘ及びＩｓｏ Ａｂ群と比較される。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、＊^＊＊Ｐ＜０．００１。

【図8】図８は、本明細書に記載の実施形態に従い、慢性ＤＳＳモデルにおけるＴｌ１ａ Ａｂ逆確立大腸炎症を示す。（Ａ）拡大率２００倍で代表的なＨ＆Ｅ染色結腸中間部を示す。（Ｂ）少なくとも２０ヶ所の独立した結腸中間部由来の組織炎症の定量化をスコア化し、データを平均値＋／−ＳＤとして表す。（Ｃ）ミエロペルオキシダーゼ活性を測定し、結腸のタンパク質抽出物のグラム（ｇ）毎の活性単位（ｕ）として表した。Ｔｌ１ａ Ａｂ治療群は、ベースラインＷＴ Ｃｏ、Ｐｒｅ−Ｔｘ、及びＩｓｏ Ａｂ実験群と比較される。各黒丸は独立した結腸からのＭＰＯ活性を表す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【図9】図９は、本明細書に記載の実施形態に従い、慢性ＤＳＳ大腸炎モデルにおけるＴｌ１ａ Ａｂ減少Ｔｈ−１及び−１７免疫応答を示す。（Ａ）細胞内のＩｆｎγ及びＩｌ−１７を染色した、（上図）からのゲート開閉ＣＤ４＋細胞及びＬＰＭＣ（下図）の代表的なフローサイトメトリー図。ＣＤ４＋Ｉｌ１７＋、ＣＤ４＋Ｉｆｎγ＋、及びＣＤ４＋Ｉｌ１７＋Ｉｆｎγ＋Ｔ細胞の割合を、ＭＬＮ（Ｂ）及びＬＰＭＣ（Ｃ）に関して定量化した。ＭＬＮ及びＬＰＭＣから単離した単核細胞を抗ＣＤ３ε及び抗ＣＤ２８で刺激し、分泌されたＩｌ１７（Ｄ）及びＩｆｎγ（Ｅ）の濃度をＥＬＩＳＡによって評価した。各黒丸は独立シタマウスから得られた値を表す。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図10】図１０は、本明細書に記載の実施形態に従い、慢性ＤＳＳ大腸炎モデルにおける確立した線維症のＴｌ１ａ Ａｂによる回復を示す。（Ａ）拡大率２００倍の結腸中間部におけるコラーゲン沈着の代表的なＳｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ染色を示す。黒い矢印はコラーゲン沈着の厚さを示す。（Ｂ）結腸中間部由来のビメンチン（緑色）及びαＳＭＡ（赤色）の代表的な免疫蛍光染色を示す。オレンジ色の矢印は、ビメンチン及びαＳＭＡを同時発現する筋線維芽細胞を示す。結腸中間部由来のコラーゲン厚さ（Ｃ）及び活性化線維芽細胞の割合（Ｄ）の定量化が示され、平均値±ＳＤとして表される。群毎に少なくとも２０ヶ所の独立した場所をスコア化した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図11-1】図１１は、本明細書に記載の実施形態に従い、Ｔｌ１ａ Ａｂ減少筋線維芽細胞数、ならびにＤｒ３及びＴｌ１ａの発現を示す。養子移植モデル（ａ）ならびに慢性ＤＳＳモデル（ｂ）からの結腸中間部由来のビメンチン（緑色）及びαＳＭＡ（赤色）の、代表的な免疫蛍光染色を拡大率６３０倍で示す。オレンジ色の矢印は、ビメンチン及びαＳＭＡを同時発現する筋線維芽細胞を示す。結腸中間部由来の筋線維芽細胞の割合を定量化し、平均値±ＳＤとして養子移植モデル（ａ、右図）及び慢性ＤＳＳモデル（ｂ、右図）に関して表した。少なくとも１０ヶ所の独立した場所を、群毎に（ａ）及び（ｂ）についてスコア化した。結腸中間部由来のビメンチン（緑色）及びＤｒ３（赤色）の代表的な免疫蛍光染色を、養子移植モデル（ｃ）及び慢性ＤＳＳモデル（ｄ）から示す。（ｃ）及び（ｄ）の挿入図は、拡大率２００倍で得られた画像の更に大きな画像である。少なくとも８ヶ所の独立した場所を群毎に定量化し、強拡大視野（ＨＰＦ）毎にＤｒ３＋細胞として図表化した。結腸のＤｒ３（ｅ）及びＴｌ１ａ（ｆ）ｍＲＮＡを定量化し、平均値±ＳＤ（ｎ＝５〜１４）として示す。Ｔｌ１ａ Ａｂ治療群は、ベースラインＲａｇ Ｃｏ、Ｗｔ Ｃｏ、Ｐｒｅ−Ｔｘ、及びＩｓｏ Ａｂ実験群と比較される。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。特に、図１１（ｃ）及び（ｄ）は、治療前群及びアイソタイプ抗体群（どちらも高いコラーゲン沈着と関係する）における線維芽細胞のＤｒ３染色の増加を、Ｔｌ１ａ Ａｂ治療群（低いコラーゲン沈着と関係する）と比較して示す。その上、図１１（ｅ）及び（ｆ）は、ＲＴ−ＰＣＲ発現分析によって、アイソタイプ群（高コラーゲン沈着と関係）と比較してＴｌ１ａ及びＤｒ３発現がどちらもＴｌ１ａ Ａｂ群（低コラーゲン沈着と関係）にて下方制御されていることを示す。

【図11-2】図１１は、本明細書に記載の実施形態に従い、Ｔｌ１ａ Ａｂ減少筋線維芽細胞数、ならびにＤｒ３及びＴｌ１ａの発現を示す。養子移植モデル（ａ）ならびに慢性ＤＳＳモデル（ｂ）からの結腸中間部由来のビメンチン（緑色）及びαＳＭＡ（赤色）の、代表的な免疫蛍光染色を拡大率６３０倍で示す。オレンジ色の矢印は、ビメンチン及びαＳＭＡを同時発現する筋線維芽細胞を示す。結腸中間部由来の筋線維芽細胞の割合を定量化し、平均値±ＳＤとして養子移植モデル（ａ、右図）及び慢性ＤＳＳモデル（ｂ、右図）に関して表した。少なくとも１０ヶ所の独立した場所を、群毎に（ａ）及び（ｂ）についてスコア化した。結腸中間部由来のビメンチン（緑色）及びＤｒ３（赤色）の代表的な免疫蛍光染色を、養子移植モデル（ｃ）及び慢性ＤＳＳモデル（ｄ）から示す。（ｃ）及び（ｄ）の挿入図は、拡大率２００倍で得られた画像の更に大きな画像である。少なくとも８ヶ所の独立した場所を群毎に定量化し、強拡大視野（ＨＰＦ）毎にＤｒ３＋細胞として図表化した。結腸のＤｒ３（ｅ）及びＴｌ１ａ（ｆ）ｍＲＮＡを定量化し、平均値±ＳＤ（ｎ＝５〜１４）として示す。Ｔｌ１ａ Ａｂ治療群は、ベースラインＲａｇ Ｃｏ、Ｗｔ Ｃｏ、Ｐｒｅ−Ｔｘ、及びＩｓｏ Ａｂ実験群と比較される。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。特に、図１１（ｃ）及び（ｄ）は、治療前群及びアイソタイプ抗体群（どちらも高いコラーゲン沈着と関係する）における線維芽細胞のＤｒ３染色の増加を、Ｔｌ１ａ Ａｂ治療群（低いコラーゲン沈着と関係する）と比較して示す。その上、図１１（ｅ）及び（ｆ）は、ＲＴ−ＰＣＲ発現分析によって、アイソタイプ群（高コラーゲン沈着と関係）と比較してＴｌ１ａ及びＤｒ３発現がどちらもＴｌ１ａ Ａｂ群（低コラーゲン沈着と関係）にて下方制御されていることを示す。

【図12】図１２は、本明細書に記載の実施形態に従い、Ｄｒ３欠損を有する腸の線維芽細胞の減少を示す。（ａ）拡大率１００倍の代表的なＨ＆Ｅ染色結腸を炎症の定量化と共に、上図に示す。拡大率２００倍の代表的なビメンチン／αＳＭＡ染色結腸（挿入画像は拡大率２００倍のより大きな画像）を、ＨＰＦ毎の線維芽細胞の定量化と共に中間図に示す。同腹仔のＷＴ及びＤｒ３−／−結腸から回収した腸の線維芽細胞、ならびに個々の結腸毎の総線維芽細胞の代表的な画像を示す（ａ、下図）。ＷＴ及びＤｒ３−／−マウス由来の増殖性線維芽細胞（ｂ）及びアポトーシスが進行中の線維芽細胞（ｃ）由来の代表的なフローサイトメトリーのヒストグラムを示す。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ蛍光強度の減少は、増殖を示す。アネキシンＶ染色の増加は、アポトーシスを示す。同様の結果を伴う、少なくとも６つの独立した実験の代表的なフローサイトメトリーのヒストグラムが示されている。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。特に、１２（ａ）に関して、上図は、Ｄｒ３ＫＯ結腸中の線維芽細胞数の減少を引き起こしている進行中の炎症ではないことを説明する、野生型及びＤｒ３ＫＯ結腸間の組織炎症には違いが無いことを示す。１２（ａ）の中間図は、結腸部の直接染色（図１２ａ、中間図）にて、Ｄｒ３欠損結腸においてビメンチン陽性細胞の減少が存在することを示し、これは、結腸から線維芽細胞を単離するより前に結腸中には既に線維芽細胞の減少が存在していたことを示すため、重要である。

【図13-1】図１３は、本明細書に記載の実施形態に従い、Ｄｒ３を発現し、Ｔｌ１ａ刺激に応答する、腸の線維芽細胞を示す。（ａ）原発性腸線維芽細胞を、Ｄｒ３、αＳＭＡ、及びビメンチンで染色し、フローサイトメトリーで分析した。高、中、及び低αＳＭＡ発現線維芽細胞を、示したようにゲート開閉した。Ｄｒ３染色は、αＳＭＡにおいて高＞中間＞低で見出されている。３つの独立した実験を実施した。特に、図１３（ａ）は、Ｄｒ３発現とαＳＭＡ発現との間に直接的な相関関係が存在することを占めす。より高いαＳＭＡ発現（より活性な線維芽細胞）を有する線維芽細胞がより高発現（Ｄｒ３発現）であることを示すためにこれは重要であり、これらのより活性な線維芽細胞はＴｌ１ａシグナル伝達に対してより受容性であることを示す。この実験に関して、発明者らはαＳＭＡ低、中、及び高発現筋線維芽細胞を別々にゲート開閉させ、その後Ｄｒ３を発現する細胞の割合を示した（図１３ａ）。図は、Ｄｒ３がαＳＭＡ高＞αＳＭＡ中＞αＳＭＡ低線維芽細胞にて発現されることを説明している。（ｂ）データは、拡大率２００倍にて独立して選別された３つのαＳＭＡ陽性筋線維芽細胞を示す。ＷＴにはＤｒ３の共染色が存在するが、Ｄｒ３欠損αＳＭＡ陽性筋線維芽細胞には存在しない。特に、図１３（ｂ）は、Ｔｌ１ａの受容体であるＤｒ３が筋線維芽細胞上にて発現されることを直接示している。線維症を媒介する筋線維芽細胞がＴｌ１ａからのシグナル伝達を受けることができることを示すため、これは重要である。この実験を行うために、発明者らは抗αＳＭＡ及びＤＲ３抗体で染色したαＳＭＡ陽性細胞を選別した。その後、発明者らは、Ｄｒ３がαＳＭＡ陽性ＷＴ上で発現されるが、ＤＲ３ ＫＯ筋線維芽細胞では発現されないことを、免疫蛍光顕微鏡を用いて示した（図１３ｂ）。（ｃ）Ｔｌ１ａ刺激の増加（０〜２００ｎｇ／ｍＬ）を伴うＷＴ原発性腸線維芽細胞におけるＣｏｌ１ａ２及びＩｌ３１Ｒａ ｍＲＮＡの発現であって、平均値±ＳＤとして表される（ｎ＝３）。（ｄ）ＷＴならびにＤｒ３−／−腸における、Ｔｌ１ａ、Ｔｇｆβ／Ｉｇｆ１、及びＴｎｆαによるＣｏｌ１ａ２及びＩｌ３１Ｒａ ｍＲＮＡの誘導が示され、平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表される。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１。特に、図１３（ｄ）はインビトロ実験を促進するためのさらなる実験を示す（図１３ｄ）。発明者らはＴｇｆβ及びＩｇｆ１を原型の線維芽細胞増殖因子として使用し、ＷＴ及びＤｒ３欠損原発性腸線維芽細胞間にはＣｏｌ１ａ２及びＩｌ３１Ｒａ発現の誘導における差が存在しないことを示した（図１３ｄ）。発明者らはＴｎｆαを原型の炎症誘発性刺激として使用し、ＷＴ及びＤｒ３欠損原発性腸線維芽細胞と比較してＣｏｌ１ａ２及びＩｌ３１Ｒａの誘導に差がないことを示した。これは、Ｄｒ３欠損原発性腸線維芽細胞と比較して、ＷＴにおけるＣｏｌ１ａ２及びＩｌ３１Ｒａ発現の有意な誘導が存在するＴｌ１ａでの刺激と対照的である。

【図13-2】図１３は、本明細書に記載の実施形態に従い、Ｄｒ３を発現し、Ｔｌ１ａ刺激に応答する、腸の線維芽細胞を示す。（ａ）原発性腸線維芽細胞を、Ｄｒ３、αＳＭＡ、及びビメンチンで染色し、フローサイトメトリーで分析した。高、中、及び低αＳＭＡ発現線維芽細胞を、示したようにゲート開閉した。Ｄｒ３染色は、αＳＭＡにおいて高＞中間＞低で見出されている。３つの独立した実験を実施した。特に、図１３（ａ）は、Ｄｒ３発現とαＳＭＡ発現との間に直接的な相関関係が存在することを占めす。より高いαＳＭＡ発現（より活性な線維芽細胞）を有する線維芽細胞がより高発現（Ｄｒ３発現）であることを示すためにこれは重要であり、これらのより活性な線維芽細胞はＴｌ１ａシグナル伝達に対してより受容性であることを示す。この実験に関して、発明者らはαＳＭＡ低、中、及び高発現筋線維芽細胞を別々にゲート開閉させ、その後Ｄｒ３を発現する細胞の割合を示した（図１３ａ）。図は、Ｄｒ３がαＳＭＡ高＞αＳＭＡ中＞αＳＭＡ低線維芽細胞にて発現されることを説明している。（ｂ）データは、拡大率２００倍にて独立して選別された３つのαＳＭＡ陽性筋線維芽細胞を示す。ＷＴにはＤｒ３の共染色が存在するが、Ｄｒ３欠損αＳＭＡ陽性筋線維芽細胞には存在しない。特に、図１３（ｂ）は、Ｔｌ１ａの受容体であるＤｒ３が筋線維芽細胞上にて発現されることを直接示している。線維症を媒介する筋線維芽細胞がＴｌ１ａからのシグナル伝達を受けることができることを示すため、これは重要である。この実験を行うために、発明者らは抗αＳＭＡ及びＤＲ３抗体で染色したαＳＭＡ陽性細胞を選別した。その後、発明者らは、Ｄｒ３がαＳＭＡ陽性ＷＴ上で発現されるが、ＤＲ３ ＫＯ筋線維芽細胞では発現されないことを、免疫蛍光顕微鏡を用いて示した（図１３ｂ）。（ｃ）Ｔｌ１ａ刺激の増加（０〜２００ｎｇ／ｍＬ）を伴うＷＴ原発性腸線維芽細胞におけるＣｏｌ１ａ２及びＩｌ３１Ｒａ ｍＲＮＡの発現であって、平均値±ＳＤとして表される（ｎ＝３）。（ｄ）ＷＴならびにＤｒ３−／−腸における、Ｔｌ１ａ、Ｔｇｆβ／Ｉｇｆ１、及びＴｎｆαによるＣｏｌ１ａ２及びＩｌ３１Ｒａ ｍＲＮＡの誘導が示され、平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表される。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１。特に、図１３（ｄ）はインビトロ実験を促進するためのさらなる実験を示す（図１３ｄ）。発明者らはＴｇｆβ及びＩｇｆ１を原型の線維芽細胞増殖因子として使用し、ＷＴ及びＤｒ３欠損原発性腸線維芽細胞間にはＣｏｌ１ａ２及びＩｌ３１Ｒａ発現の誘導における差が存在しないことを示した（図１３ｄ）。発明者らはＴｎｆαを原型の炎症誘発性刺激として使用し、ＷＴ及びＤｒ３欠損原発性腸線維芽細胞と比較してＣｏｌ１ａ２及びＩｌ３１Ｒａの誘導に差がないことを示した。これは、Ｄｒ３欠損原発性腸線維芽細胞と比較して、ＷＴにおけるＣｏｌ１ａ２及びＩｌ３１Ｒａ発現の有意な誘導が存在するＴｌ１ａでの刺激と対照的である。

【発明を実施するための形態】

【0016】

本明細書に引用される全ての参照は、その内容が全て記載されているのと同様に参照によって組み込まれる。特に断りがない限り、本明細書にて用いられる技術的及び化学的用語は、本発明が属する当該技術分野にて当業者に通常理解されている意味と同じ意味を持つ。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４ｔｈ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ ２０１２）；Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５ｔｈ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ ２００１）；及び、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ ２０１２）；は、当業者に本出願にて用いられる用語の多くに関する一般的な指針を提供する。当業者は、本発明の実施に使用することができた本明細書にて説明される方法及び物質と、同様または等価である方法及び物質を理解するであろう。実際に、本発明は記載された方法及び物質を制限するものでは決してない。

【0017】

本明細書にて説明の通り、腸繊維性狭窄は重症なＣｒｏｈｎ病の特徴の１つである。ある特定のＴＮＦＳＦ１５バリアントを有する患者はＴＬ１Ａを過剰発現し、小腸で狭窄が発生する危険性がより高い。その上、長時間のＴｌ１ａ発現を有するマウスは、腸炎惹起状態下において小腸及び大腸の繊維性狭窄に至った。発明者らは、Ｔｌ１ａ機能を中和することで確立されたマウスの大腸炎及び結腸線維症を回復することができるかどうかを調査した。

【0018】

本明細書に更に開示されるように、Ｔｌ１ａ遮断抗体（１２Ｆ６Ａ）またはアイソタイプ対照Ｉｇを確立された慢性マウス大腸炎及び結腸線維症に罹ったマウスへ投与した。Ｄｒ３欠損（Ｄｒ３−／−）を伴うマウスを作成した。原発性マウス腸線維芽細胞を単離した。組織染色及び免疫蛍光染色、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ならびにｍＲＮＡレベルを使用して、炎症及び線維症の程度を比較した。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ及びアネキシンＶ染色を使用して、細胞増殖及びアポトーシスを各々測定した。発明者らは、Ｔｌ１ａ抗体による治療がマウス大腸炎を緩和し、結腸線維症を本来の炎症前のレベルまで回復したことを見出した。これは、Ｉｆｎγ、Ｉｌ１７、Ｃｔｇｆ、Ｉｌ３１Ｒａ発現の低下、ならびにＴｇｆβ１及びＩｇｆ１シグナル伝達の下方制御によるものであり得る。くわえて、Ｔｌ１ａ機能の遮断は線維芽細胞及び筋線維芽細胞の数の減少をもたらした。原発性腸筋線維芽細胞はＤｒ３を発現し、コラーゲン及びＩｌ３１Ｒａ発現を増加させることで直接Ｔｌ１ａシグナル伝達へと機能的に応答することができる。要するに、ＴＬ１Ａシグナル伝達の調節は腸炎症及び線維症の両方を抑制する。

【0019】

一実施形態において、本発明は対象における疾患の治療方法を提供し、これにはＩＬ３１シグナル伝達の抑制物質を含む組成物を提供すること、及び有効量の組成物を対象へ投与することが含まれる。別の実施形態において、疾患はＴＬ１Ａ関連疾患である。別の実施形態において、疾患は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である。別の実施形態において、疾患は小腸及び／または腸炎症において発生した狭窄と関係する。別の実施形態において、疾患は小腸及び大腸繊維性狭窄である。別の実施形態において、疾患は線維症である。別の実施形態において、組成物には１つ以上のＴＬ１Ａ抗体が含まれる。別の実施形態において、組成物には、ＩＬ３１ＲＡ、Ｉｆｎｇａｍｍａ、ＩＬ１７、Ｃｔｇｆ、ＴｇｆＢ１、及び／またはＩｇｆ１シグナル伝達の抑制物質のうち１つ以上が含まれる。

【0020】

別の実施形態において、本発明は対象における疾患の治療方法を提供し、これにはＩＬ３１Ｒａシグナル伝達の抑制物質を含む組成物を提供すること、及び有効量の組成物を対象へ投与することが含まれる。別の実施形態において、疾患はＴＬ１Ａ関連疾患である。別の実施形態において、疾患は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である。別の実施形態において、疾患は、小腸及び／または腸炎症において発生した狭窄と関係する。別の実施形態において、疾患は小腸及び大腸の繊維性狭窄である。別の実施形態において、疾患は線維症である。別の実施形態において、組成物には１つ以上のＴＬ１Ａ抗体が含まれる。別の実施形態において、組成物には、ＩＬ３１ＲＡ、Ｉｆｎｇａｍｍａ、ＩＬ１７、Ｃｔｇｆ、ＴｇｆＢ１、及び／またはＩｇｆ１シグナル伝達の抑制物質のうち１つ以上が含まれる。別の実施形態において、治療効果のある用量の組成物を投与することで、対象における線維芽細胞及び／または筋線維芽細胞の数が減少する。

【0021】

一実施形態において、本発明は対象におけるＴＬ１Ａ関連疾患に対する感受性の診断方法を提供し、これには、対象から試料を得ること、試料を試験して健常者と比べて高レベルなＩＬ３１発現が存在するかまたは存在しないかを判定すること、及び健常者と比べて高レベルなＩＬ３１発現の存在に基づいてＴＬ１Ａ関連疾患に対する感受性を診断することが含まれる。別の実施形態において、ＴＬ１Ａ関連疾患は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である。別の実施形態において、ＴＬ１Ａ関連疾患は、小腸及び／または腸炎症において発生した狭窄と関係する。別の実施形態において、ＴＬ１Ａ関連疾患は小腸及び大腸の繊維性狭窄である。別の実施形態において、ＴＬ１Ａ関連疾患は線維症である。別の実施形態において、方法には更に、健常者と比べて高レベルな、ＩＬ３１ＲＡ、Ｉｆｎｇａｍｍａ、ＩＬ１７、Ｃｔｇｆ、ＴｇｆＢ１、及び／またはＩｇｆ１の発現の存在を判定することが含まれる。

【0022】

対象におけるＴＬ１Ａ関連疾患に対する感受性の診断方法であって、これには、対象から試料を得ること、試料を試験して健常者に比べて高レベルなＩＬ３１Ｒａ発現が存在するかまたは存在しないかを判定すること、及び健常者と比べて高レベルなＩＬ３１ＲＡ発現の存在に基づいて、ＴＬ１Ａ関連疾患に対する感受性を診断することが含まれる。別の実施形態において、ＴＬ１Ａ関連疾患は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である。別の実施形態において、ＴＬ１Ａ関連疾患は、小腸及び／または腸炎症において発生した狭窄と関係する。別の実施形態において、ＴＬ１Ａ関連疾患は、小腸及び大腸の繊維性狭窄である。別の実施形態において、ＴＬ１Ａ関連疾患は線維症である。別の実施形態において、本発明には更に、健常者と比べて高レベルな、コラーゲン、ＩＬ３１ＲＡ、Ｉｆｎｇａｍｍａ、ＩＬ１７、Ｃｔｇｆ、ＴｇｆＢ１、及び／またはＩｇｆ１の発現の存在を判定することが含まれる。

【0023】

別の実施形態において、本発明は対象におけるＴＬ１Ａ関連疾患の診断方法を提供し、これには、対象から試料を得ること、試料を試験して１つ以上の前記ＴＬ１Ａ関連疾患と関連するリスクバリアント及び／またはマーカーが存在するかまたは存在しないかを判定すること、ならびにＴＬ１Ａ関連疾患と関連する１つ以上のリスクバリアント及び／またはマーカーの存在に基づいて、ＴＬ１Ａ関連疾患を診断することが含まれる。別の実施形態において、１つ以上のリスクバリアント及び／またはマーカーには、ＩＬ３１ＲＡの高発現が含まれる。別の実施形態において、１つ以上のリスクバリアント及び／またはマーカーには、Ｉｆｎｇａｍｍａ、ＩＬ１７、Ｃｔｇｆ、ＴｇｆＢ１、及び／またはＩｇｆ１の高発現が含まれる。別の実施形態において、ＴＬ１Ａ関連疾患は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である。別の実施形態において、ＴＬ１Ａ関連疾患は、小腸及び／または腸炎症において発生した狭窄と関係する。別の実施形態において、ＴＬ１Ａ関連疾患は、小腸及び大腸の繊維性狭窄である。別の実施形態において、ＴＬ１Ａ関連疾患は線維症である。別の実施形態において、方法には更に、１つ以上のＴＬ１Ａ抑制物質を投与してＴＬ１Ａ関連疾患を治療することが含まれる。別の実施形態において、方法には更に、ＴＬ１Ａ抑制物質を投与してＴＬ１Ａ関連疾患を治療することが含まれる。別の実施形態において、対象はヒトである。別の実施形態において、方法には更に、Ｄｒ３抑制物質を投与してＴＬ１Ａ関連疾患を治療することが含まれる。

【0024】

本明細書に開示の通り、２つの異なる慢性大腸炎モデルにおいて、Ｔｌ１ａ Ａｂは結腸疾患を寛解させ、腸線維症を回復させたことが示された。ＴＬ１Ａシグナル伝達の調節は、腸炎症及び線維症の両方を治療することでＣｒｏｈｎ病の自然史を変化させることができる。ＴＬ１Ａ／ＤＲ３シグナル経路を遮断することで、確立した線維症の回復を含むＣｒｏｈｎ病及びその関連合併症の治療に対する治療手段が提供される。

【0025】

一実施形態において、本発明は、対象において線維症を診断し、その後ＴＬ１Ａ−ＤＲ３シグナル伝達機能の１つ以上抑制物質を投与すること、例えば、治療効果のあるＴＬ１Ａ抗体を投与すること、またはＤＲ３発現もしくはＴＬ１Ａ発現（ＴＮＦＳＦ１５の発現）をコード化するｄｓＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡを除去することなどによって、対象における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と関連する線維症の治療方法を提供する。または、一実施形態において、ＴＬ１Ａ−ＤＲ３下流の１つ以上の分子を抑制することによって、該治療方法を提供する。

【0026】

一実施形態において、本発明は、治療効果のある用量のＴＬ１Ａ抑制物質及び／またはＤＲ３抑制物質を含む組成物を対象へ投与することで、疾患を治療する方法を提供する。別の実施形態において、疾患は線維症である。別の実施形態において、疾患は炎症性腸疾患である。別の実施形態において、疾患はＣｒｏｈｎ病である。別の実施形態において、疾患は大腸炎である。別の実施形態において、対象はヒトである。別の実施形態において、ＴＬ１Ａ抑制物質はＴＬ１Ａ抗体である。別の実施形態において、ＤＲ３抑制物質はＤＲ３抗体である。

【0027】

別の実施形態において、本発明は、治療効果のある用量のＴＬ１Ａ抑制物質及び／またはＤＲ３抑制物質を含む組成物を対象へ投与することによる、個体における線維症の回復方法を提供する。

【0028】

別の実施形態において、本発明は対象における線維症の治療方法を提供し、これにはＴＬ１Ａ−ＤＲ３シグナル伝達機能の１つ以上の抑制物質を含む組成物を提供すること、及び治療効果のある用量の組成物を対象へ投与することが含まれる。別の実施形態において、組成物には１つ以上のＴＬ１Ａ遮断抗体が含まれる。別の実施形態において、組成物には１つ以上のＤｒ３遮断抗体が含まれる。別の実施形態において、組成物には、ＴＬ１Ａに直接結合することでＴＬ１Ａ機能を抑制する１つ以上の化合物が含まれる。別の実施形態において、組成物には、Ｉｆｎｇａｍｍａ、ＩＬ１７、Ｃｔｇｆ、及びＩＬ３１Ｒａの１つ以上が含まれる。別の実施形態において、組成物にはＴｇｆｂｅｔａ１及びＩｇｆ１の抑制物質が１つ以上含まれる。別の実施形態において、組成物にはＩＬ３１シグナル伝達の抑制物質が１つ以上含まれる。別の実施形態において、治療効果のある用量の組成物を投与することで、線維症の炎症前のレベルまでの回復がもたらされる。別の実施形態において、線維症は腸線維症である。別の実施形態において、治療効果のある用量の組成物を投与することで、対象における腸炎症の抑制が更にもたらされる。別の実施形態において、治療効果のある用量の組成物を投与することで、対象における線維芽細胞及び／または筋線維芽細胞が減少する。別の実施形態において、治療効果のある用量の組成物を投与すること、対象における原発性腸筋線維芽細胞の数が減少する。

【0029】

一実施形態において、本発明は対象における線維症の治療方法を提供し、これにはＴＬ１Ａ抑制物質及びＤＲ３抑制物質を含む組成物を提供すること；ならびに、治療効果のある用量の組成物を対象へ投与することが含まれる。別の実施形態において、ＴＬ１Ａ抑制物質はＴＬ１Ａ抗体である。別の実施形態において、ＤＲ３抑制物質はＤＲ３の発現を除去する。別の実施形態において、線維症は減少する。別の実施形態において、組成物はＴＬ１Ａ−ＤＲ３シグナル伝達機能を抑制する。

【0030】

一実施形態において、本発明は対象における線維症の回復を提供し、これにはＴＬ１Ａ抑制物質及びＤＲ３抑制物質を含む組成物を提供すること、ならびに治療効果のある用量の組成物を対象へ投与することが含まれる。別の実施形態において、組成物には更に、Ｉｆｎｇａｍｍａ、ＩＬ１７、Ｔｇｆｂｅｔａ１、Ｃｔｇｆ、及び／またはＩＬ３１ＲＡシグナル伝達機能の抑制物質が含まれる。別の実施形態において、組成物はＴＬ１Ａ−ＤＲ３シグナル伝達機能を抑制する。

【0031】

一実施形態において、本発明は炎症の治療方法を提供し、これにはＴＬ１Ａ抑制物質及び／またはＤＲ３抑制物質を含む組成物を提供すること、ならびに治療効果のある用量の組成物を対象へ投与することが含まれる。別の実施形態において、組成物には更に、Ｉｆｎｇａｍｍａ、ＩＬ１７、Ｃｔｇｆ、及び／またはＩＬ３１ＲＡシグナル伝達機能の抑制物質が含まれる。別の実施形態において、組成物はＴＬ１Ａ−ＤＲ３シグナル伝達機能を抑制する。

【0032】

一実施形態において、本発明は対象における疾患の治療方法を提供しこれには、Ｉｆｎγ及びＩｌ−１７発現を抑制すること、Ｔｇｆβシグナル伝達を下方制御すること、及び／または線維芽細胞／筋線維芽細胞を減少させること、及び対象を治療することが含まれる。別の実施形態において、疾患は炎症性腸疾患である。別の実施形態において、疾患は線維症である。別の実施形態において、疾患は腸炎症である。別の実施形態において、疾患は炎症性腸疾患に関係する合併症である。

【0033】

一実施形態において、本発明はＩＢＤに関連する合併症の治療方法を提供し、これにはＴＬ１Ａ、ＤＲ３、及びＩＬ３１ＲＡシグナル伝達機能の抑制物質を含む組成物を提供すること、ならびに治療効果のある用量の組成物を対象へ投与することが含まれる。別の実施形態において、組成物は対象へ静脈注射によって投与される。

【0034】

一実施形態において、本発明は、１つ以上のＴＬ１Ａ抑制物質及び／または１つ以上のＤＲ３抑制物質を含む組成物、ならびに薬剤的に許容可能な単体を提供する。別の実施形態において、１つ以上のＴＬ１Ａ抑制物質はＴＬ１Ａ抗体である。別の実施形態において、１つ以上のＤＲ３抑制物質はＤＲ３抗体である。

【0035】

別の実施形態において、本発明は、治療効果のある用量のＴＬ１Ａ抑制物質及び／またはＤＲ３抑制物質を含む組成物を対象へ投与することによる、対象における炎症の低減方法を提供する。

【0036】

別の実施形態において、本発明は、Ｉｆｎγ及びＩｌ−１７発現を抑制すること、Ｔｇｆβシグナル伝達を下方制御すること、ならびに／または線維芽細胞／筋線維芽細胞を減少させることによる、線維症と関連する状態の抑制方法を提供する。

【0037】

一実施形態において、本発明は、ＴＬ１Ａ、ＤＲ３、及びＩＬ３１ＲＡシグナル伝達機能の１つ以上の抑制物質、ならびに薬剤的に許容可能な担体を含む組成物を提供する。別の実施形態において、１つ以上のＴＬ１Ａ抑制物質はＴＬ１Ａ抗体である。別の実施形態において、１つ以上のＤＲ３抑制物質はＤＲ３抗体である。

【0038】

ポリペプチド、もしくはタンパク質マイクロアレイを含むその他のマーカー／生物マーカーの存在または非存在を検出する場で容易に使用可能な技術が多くある。例えば、この目標のために使用することのできる検出規範のいくつかには、光学的方法、電気化学的方法（ボルタメトリー及び電流測定技術）、原子間力顕微鏡、ならびに高周波法、例えば多極共鳴分光法（ｍｕｌｔｉｐｏｌａｒ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）が含まれる。光学的方法の説明は、顕微鏡検査に加え、共焦点及び非共焦点のどちらも、蛍光、発光、化学発光、吸光度、反射率、透過率、及び複屈折または屈折率（例えば、表面プラズモン共鳴法、偏光解析法、共鳴ミラー法、格子カプラー導波管法、もしくは干渉法）の検出である。

【0039】

同様に、生物マーカーの単離及び／または分画に用いることのできる多くの技術が存在する。例えば、生物マーカーは、抗体、アプタマー、または生物マーカーを認識する抗体、及びその変形した形態などの生体分子特異的な捕獲試薬を用いて捕獲することができる。この方法はまた、タンパク質へ結合するか、または抗体によって別様に認識される、及びそれら自身が生物マーカーであり得る、タンパク質インタラクターの捕獲をもたらし得る。生体分子特異的な捕獲試薬はまた、固相とも結合し得る。そして、捕獲されたタンパク質は、ＳＥＬＤＩ質量分析法によって、またはｂｙ 捕獲試薬からタンパク質を溶出し、従来のＭＡＬＤＩもしくはＳＥＬＤＩで溶出されたタンパク質を検出することによって、検知することができる。ＳＥＬＤＩの一例は、「親和性捕獲質量分析法」、または「表面増強親和性捕獲」もしくは「ＳＥＡＣ」と呼ばれ、これは、物質と分析物との間の非共有結合性親和性相互作用（吸着）を通じて分析物を捕獲するプローブ表面上に物質を有する、プローブの使用に関する。質量分析計のいくつかの例として、飛行時間型、磁場型、四重極フィルター型、イオントラップ型、イオンサイクロトロン共鳴型、静電セクター分析系、及びこれらの複合が挙げられる。

【0040】

あるいは、例として、ポリペプチドなどの生物マーカーの存在は従来の免疫測定法を用いて検出することができる。免疫測定法は、分析物の捕獲のために抗体などの生体分子特異的な捕獲試薬を必要とする。アッセイはまたタンパク質とタンパク質の変形形態と特に区別するよう設計してもよく、これはサンドイッチ分析を用いて行うことができる。この分析では、１つの抗体が２つ以上の形態を捕獲し、第２の明確に標識された抗体が特異的に結合し、様々な形態の明確な検出を提供する。抗体は生体分子で免疫化動物によって作成することができる。従来の免疫測定法にはまた、ＥＬＩＳＡまたは蛍光ベースの免疫測定法、及びその他の酵素免疫測定法を含む、サンドイッチ免疫測定法が含まれ得る。

【0041】

検出に先んじて、生物マーカーを分画して、溶液中のその他の成分、または検出に干渉し得る血液の成分から生物マーカーを単離してもよい。分画には、クロマトグラフィー、親和性精製、１次元及び２次元マッピング、ならびに当業者に既知である精製のためのその他の方法論などを用いる、他の血液成分からの血小板単離、血小板成分の細胞下分画、及び／または血小板中にて見出される他の生体分子からの所望の生物マーカーの分画が含まれ得る。一実施形態において、試料をバイオチップによる方法で分析する。バイオチップは一般的に固体の基質を含み、概して捕獲試薬（吸着剤または親和性試薬とも呼ばれる）が結合するための平面を持つ。しばしば、バイオチップの表面には複数のアドレス可能な位置が含まれ、各位置はそこに結合する捕獲試薬を有する。

【0042】

上に記載の様々な方法及び技術は、本発明を実行するためのいくつかの方法を提供する。もちろん、記載される全ての目的または利点が、必ずしも本明細書に記載のあらゆる特定の実施形態に従って達成され得はしないことを理解されたい。したがって、例えば、本明細書にて教示または示唆され得る限りに必ずしも他の目的もしくは利点を達成することなく本明細書に教示されるある１つの利点もしくは１群の利点を達成または最適化する方法で、方法を実施することができることを、当業者は理解されたい。種々の有益な及び不利益な代替物が本明細書にて言及される。いくつかの好ましい実施形態は特に、１つの、別の、またはいくつかの有益な特徴を含み、一方でその他は特に、１つの、別の、またはいくつかの不利益な特徴を除外するが、更にその他は特に、１つの、別の、またはいくつかの有利な特徴を包含することで、本発明の不利益な特徴を軽減することを、理解されたい。

【0043】

更に、当業者は異なる実施形態から様々な特徴の適応性を認識するであろう。同様に、上で開示された様々な要素、特徴、及びステップ、ならびにそのような要素、特徴、またはステップの各々とのその他の既知の等価物は、本明細書に記載の原理に従って方法を実施するために、当業者が混合し、一致させることができる。様々な要素、特徴、及びステップ間で、いくつかは多種多様な実施形態中に特に含まれ、その他は特に除外される。

【0044】

本発明はある特定の実施形態及び実施例に関して開示されているが、本発明の実施形態は特に開示された実施形態を超えて、その他の別の実施形態及び／または使用、ならびにその修正及び等価物にまで及ぶことを、当業者は理解するであろう。

【0045】

多くのバリエーション及び別の要素が本発明の実施形態にて開示されている。また、さらなるバリエーション及び別の要素が当業者には明らかとなるであろう。これらのバリエーション間から、非限定的に、本発明の組成物、ならびにそれによって診断、予測、または治療され得る疾患、及びその他の病態に対する構成モジュールが選択される。本発明の様々な実施形態は特に、これらのバリエーションもしくは要素のいずれかを含むかまたは除外し得る。

【0046】

いくつかの実施形態において、成分の含量、濃度及び反応条件といった特徴の表す数字は、本発明のある特定の実施形態を説明及び特許請求するために使用され、いくつかの場合においては「約」という用語で修正されていることを理解されたい。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書及び添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメーターは、特定の実施形態によって得られるよう求められた所望の特徴に応じて変化し得る近似値である。いくつかの実施形態において、数値パラメーターは報告されている有効桁の数を考慮して、通常の丸め方法を適用することで解釈されるべきである。広範にわたる本発明のいくつかの実施形態を説明する数値範囲及びパラメーターは近似値であるが、特定の実施例に記載の数値は実行可能なよう正確に報告されている。本発明のいくつかの実施形態に示される数値は、それら各々の試験測定値にて見出される標準偏差に必ず由来するある特定の誤差を含有していてもよい。

【0047】

いくつかの実施形態において、「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」という用語、ならびに本発明の特定の実施形態を説明する文脈にて（特に、以下のある特定の特許請求の範囲の文脈にて）使用される同様の言及は、単数及び複数の両方を包含するよう解釈することができる。本明細書における値の範囲の詳説は単に、その範囲に含まれる別々の各値へ個々に言及する省略の方法として働くよう意図されているものである。本明細書にて特に示されない限り、個別の各値は、それが本明細書中に個々に列挙されたかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の全ての方法は、本明細書に特に示されない限り、または文脈で明確に矛盾しない限り、あらゆる適切な順序で実施することができる。本明細書のある特定の実施形態に対して提供される、いずれかもしくは全ての実施例、または例示的な言い回し（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をより良く説明することを意図しており、別に特許請求される本発明の範囲の制限を提起するものではない。本明細書における言い回しはいずれも、本発明の実施に欠かせないあらゆる非特許請求要素を示すように解釈されるべきではない。

【0048】

本明細書に開示される本発明の別の要素または実施形態の分類は、制限として解釈するものではない。各群のメンバーは、群のその他のメンバーもしくは本明細書に見出される他の要素を指し示すことができ、かつ個々にまたはそれらとのあらゆる組み合わせで特許請求され得る。群の１つ以上のメンバーは、便宜及び／または特許性の理由のための群に含まれても、またはそこから削除されてもよい。あらゆるそのような包含または削除が起こった場合、本明細書は群を修正されたものとして含有するよう本明細書中で見なされるため、添付の特許請求の範囲で使用された全てのマルクーシュ群の明細書を満たす。

【0049】

本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載されており、これには、発明者らに既知である本発明を実施するための最良の様式が含まれる。それらの好ましい実施形態のバリエーションは、先の記述を読むことで当業者に明らかとなるであろう。熟練した技術者はそのようなバリエーションを適切に使用することができ、本発明は本明細書に特に記載されたものとは別様に実施することができることを考慮されたい。したがって、本発明の多くの実施形態には、準拠法により許可されるように、本明細書に添付の特許請求の範囲に列挙される主題の全ての修正及び等価物が含まれる。そのうえ、全ての可能性のあるバリエーションにおける上記要素のあらゆる組合せは、本明細書にて特に指示されない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、本発明に包含される。

【0050】

更に、多数の参照は、本明細書全体を通して特許及び刊行物となっている。上記の参照及び刊行物の各々は、参照によりそれらの全体が個々に本明細書に組み込まれる。

【0051】

最後に、本明細書にて開示の本発明の実施形態は本発明の原理の説明であることを理解されたい。使用することのできるその他の修正は本発明の範囲内であり得る。したがって、例として、非制限的に、本発明の別の構成を本明細書の教示に従って利用することができる。したがって、本発明の実施形態は正確に示されているもの及び説明されているものに限られない。

【実施例】

【0052】

以下の実施例は、請求された発明をよりよく説明するために提供され、本発明の範囲を限定するとは解釈されない。具体的な材料が言及されているという点で、単に説明の目的であり、発明を限定することを意図されない。当業者は、独創性のキャパシティーの実施なく、または本発明の範囲を逸脱することなく、同等の手段または反応物質を開発し得る。

【0053】

実施例１
慢性大腸炎の誘導及び治療
Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。慢性のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）大腸炎が記載されるように導入された。１０養子移植モデルにおいて、大腸炎は、Ｒａｇ１−／−マウスに、ＷＴマウスから分離された５００，０００のＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｈｉのナイーブなＴ細胞の腹腔内注入により誘導された。ハムスター抗マウスＴｌ１ａ Ａｂ（１２Ｆ６Ａ，ＴＥＶＡ，Ｎｏｒｔｈ Ｗａｌｅｓ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）は、Ｔｌ１ａの機能を抑制し、２０または８０ｍｇ／ｋｇで投与され、または対照免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇ（Ｌｅｉｎｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）が８０ｍｇ／ｋｇ投与量で、慢性のＤＳＳの１５日目及び養子移植モデルの２９日目で開始し、１週間に２回マウスに腹腔内に注入された（図１Ａ）。ベースラインの対照（Ｒａｇ Ｃｏ ｏｒ ＷＴ Ｃｏ）は、ナイーブなＴ細胞のＤＳＳ治療または養子移植前に分析されたマウスであった。治療前（Ｐｒｅ−Ｔｘ）対照は、慢性のＤＳＳモデルの１４日目及び養子移植モデルの２８日目で分析されたマウスであった。治療群は、慢性のＤＳＳモデルについて２８日目に及び養子移植モデルについて５６日目に分析されたマウスであった（図１Ａ）。全てのマウスは、Ｃｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＳＭＣ）の動物施設（Ａｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）で、特定の病原体フリー条件下で維持された。本研究は、米国国立衛生研究所の実験動物の実験についてのガイドに従って厳密に行われた。動物実験は、ＣＳＭＣ動物実験委員会により承認された（プロトコル３８１３）。

【0054】

実施例２
疾患活動性の指標、ミエロペルオキシダーゼ、巨視的及び病理組織学的分析
疾患活動性の指標（ＤＡＩ）スコアが、ＤＳＳモデルについて一日おきに、養子移植モデルについて１週間に２回、記載されるように測定された。ミエロペルオキシダーゼ活性が、製造元（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）のプロトコルに従ってミエロペルオキシダーゼ蛍光検出キットを用いて評価された。炎症の巨視的証拠が確立された分類を用いて盲検でスコア付けされた。組織サンプルは、ＣＳＭＣヒストロジーコア（Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ−Ｃｏｒｅ）により、処理されてヘマトキシリン−エオジン（Ｈ＆Ｅ）により染色された。シリウスレッド染色が、製造元（ＩＨＣ Ｗｏｒｌｄ，Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ，ＭＤ）のプロトコルに従ってＮｏｖａＵｌｔｒａのシリウスレッド染色キットを用いて行われた。免疫蛍光染色法が、１０％ホルマリンで固定された４μＭ凍結切片で行われ、１：１００希釈でα−ＳＭＡ Ａｂ及び１：２０００希釈でα−ビメンチンＡｂ（Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により、ロバα−ウサギＩｇＧ及びヤギα−トリＩｇＹ（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）二次Ａｂにより染色された。病理組織学的スコアは、記載されるように、２人の訓練された動物病理学者（ＤＱＳ及びＪＣ）により盲検の態様で付与された。マウスあたりの腸の領域あたりに５以上の異なる視野の観察が、２００の倍率で組織学的スコア及びコラーゲン沈着を測定するために、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ分光共焦点顕微鏡を用いて６３０の倍率で繊維芽細胞／筋線維芽細胞数をカウントするために使用された。

【0055】

実施例３
Ｄｒ３−／−マウスの作成
Ｄｒ３標的ベクターのクローニング及びＤｒ３＋／−ファウンダーマウスの作成はｇｅｎＯｗａｙ（ｇｅｎＯｗａｙ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）とのコラボレーションで行われた。簡潔には、エクソン１の上流１．５ｋｂ及びエクソン８の下流３ｋｂを含むＤｒ３の内在性位置が、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスからゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ増幅により生成され、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターにクローニングされた（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）。その後、２つのｌｏｘＰ部位が隣接するＤｒ３エクソン２から５に挿入された（図５Ａ）。ＦＲＴ部位により隣接されるポジティブ選択ネオマイシン遺伝子が、標的ベクターを作成するためにエクソン１と２の間のイントロンに挿入された（図５Ａ）。クローニングプロセスのそれぞれのステップが限定解析及びシーケンシングにより検証された。Ｄｒ３遺伝子標的構造は、直線化され、エレクトロポレーションによりＣ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドで、ｇｅｎＯｗａｙ所有の胚性幹（ＥＳ）細胞にトランスフェクトされた。相同組換え体がＧ４１８により選択され、サザンブロット解析により確認された。正しい５及び３’組換えＥＳクローンは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ胚盤胞にマイクロインジェクトされ、偽妊娠のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに導入された。雄のキメラの子孫が、生殖細胞系突然変異マウスを得るために繁殖され、その後、ネオマイシンカセットを取り除くためにＦｌｐｅ欠損マウス種へと繁殖され、その後、ｌｏｘＰに隣接する配列を切除するためにＣｒｅ欠損マウスへと繁殖され（図５Ａ）、サザンブロットにより確認され、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの遺伝的背景が維持された。

【0056】

実施例４
発現の分析
総ＲＮＡがＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて分離され、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）がＲＴ２ ＨＴ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄを用いて行われ、遺伝子発現が、製造元のプロトコルに従って、ＲＴ２ Ｃｕｓｔｏｍ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ Ａｒｒａｙ ＣＡＰＭ１１２４８（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）キットを用いて測定された。サイトカインの濃度は、複合的な免疫測定、製造元のプロトコルに従って、マウスＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７／Ｔｈ２２ １３ｐｌｅｘキットＦｌｏｗＣｙｔｏｍｉｘ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてアッセイされた。検証されたＤｒ３ ｑＰＣＲアッセイＭｍ．ＰＴ．５１．１７３２１４３９、Ｉｌ３１Ｒａ ｑＰＣＲアッセイＭｍ．ＰＴ．５６ａ．３２７８７３２６及びβアクチンｑＰＣＲアッセイＭｍ．ＰＴ．３９ａ．２２２１４８４３が、ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （Ｓｋｏｋｉｅ，ＩＬ）から購入された。

【0057】

実施例５
細胞の分離、培養、細胞内のサイトカインの発現、及びフローサイトメトリー
粘膜固有層の単核細胞（ＬＰＭＣ）、腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）、及び脾細胞の分離と培養、並びにそれらのその後の抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ３εによる刺激が行われた。発明者らは、ＬＰＭＣの分離のために結腸全体及び回腸の端部１０ｃｍを使用した。マウスの原発性結腸繊維芽細胞が、３７℃で１５分間、１ｍＭのＤＴＴ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｔｕｓｔｉｎ，ＣＡ）で、その後、３７℃で３０分間５ｍＭのＥＤＴＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を含む１ｍＭのＤＴＴでインキュベートされた結腸から分離された。残っている結腸の組織は、１×ＨＢＳＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｅｌｌｇｒｏ，Ｓｗｅｄｅｓｂｏｒｏ，ＮＪ）でリンスされ、刻まれ、その後、ＤＭＥＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｅｌｌｇｒｏ，Ｓｗｅｄｅｓｂｏｒｏ，ＮＪ）中の１．５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＮＪ）、０．３ｍｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ及び３ｍｇ／ｍＬのヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で、３０分間３７℃で消化された。分離された細胞は、１０％ＦＣＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン（１００ＩＵ／ｍＬ）、ファンギゾン（０．５μｇ／ｍＬ）が添加されたＤＭＥＭで培養された。原発性腸繊維芽細胞はパッセージ２で使用された。細胞は、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで取得され（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）、ＦｌｏｗＪｏ分析ソフトウェアを用いて分析された。

【0058】

実施例６
エクスビボの腸の繊維芽細胞の増殖及びアポトーシスアッセイ
原発性腸繊維芽細胞が分離され、製造元の指示に従ってＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）により染色された。染色された細胞は、その後、１０％ＦＣＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン（１００ＩＵ／ｍＬ）、及びファンギゾン（０．５μｇ／ｍＬ）が添加されたＤＭＥＭで、１００ｎｇ／ｍＬのＴｌ１ａとともにインキュベートされた。４８時間後、培養された腸の繊維芽細胞は、製造元の指示に従ってアネキシンＶ染色検出キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて染色された。アネキシンＶ染色後、繊維芽細胞は回収されて、洗浄され、２％パラホルムアルデヒドで固定され、ＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメーターによりフローサイトメトリック分析に供され、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより分析された。

【0059】

実施例７
統計的分析
データは平均±標準偏差（ＳＤ）として示される。２つの群間の比較は、カテゴリー変数についての両側のフィッシャー直接検定及び連続変数についてのスチューデントｔ検定により行われた。パラメータテスト及び非パラメータテストが試験の前提の遂行に応じて使用された。３つの群間の比較は、ＡＮＯＶＡを用いてなされ、その後、多重比較のためのターキーのＨＳＤ及びベーレンス−フィッシャーの検定の修正による対でのポストｈｏｃ分析が続いた。ｐ＜０．０５が有意であると考えられた。

【0060】

実施例８
確立された慢性大腸炎の疾患活動性及び全体的な炎症を弱毒化したＴｌ１ａＡｂ投与
慢性のマウスの大腸炎におけるＴｌ１ａ機能を中和する効果が、ナイーブなＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｈｉ Ｔ細胞で養子性にトランスファーされた免疫不全のＲａｇ１−／−マウスにおけるＴｌ１ａ Ａｂを用いて評価された。２０及び８０ｍｇ／ｋｇのＴｌ１ａ Ａｂまたは８０ｍｇ／ｋｇでアイソタイプ対照Ａｂ（Ｉｓｏ Ａｂ）が、大腸炎が確立されたときに（図１Ａ）、トランスファー後２９日目で開始し、１週間に２回投与された。６週目まで及び８週目で実験の最後にわたって継続して、Ｔｌ１ａ Ａｂで治療されたマウスの疾患活動性の指標（ＤＡＩ）がＩｓｏ Ａｂを受けたマウスよりも有意に低かった（図１Ｂ）。Ｉｓｏ Ａｂ群と比較して、全体的な結腸の炎症が、両方の投与量でＴｌ１ａ Ａｂを受けたマウスにおいて有意に減少した（図１Ｃ）。また、腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）及び粘膜固有層（ＬＰ）から回収される単核細胞の数は、Ｉｓｏ Ａｂ群と比較して、Ｔｌ１ａ Ａｂ治療により減少した（図１Ｄ）。Ｔｌ１ａ ８０−ｍｇ／ｋｇＡｂで治療されたマウスでは、確立された大腸炎及び細胞浸潤の寛解が、重篤な全体的な結腸の炎症が少なくなること及びＰｒｅ−Ｔｘ群よりもＬＰ単核細胞（ＬＰＭＣ）有意に数が低減することにより実証された（図１Ｃ及びＤ）。

【0061】

同様な見解が慢性のＤＳＳ大腸炎モデルを用いて得られた。このモデルでは、Ｔｌ１ａ Ａｂ（２０−ｍｇ／ｋｇ）が、大腸炎が確立されたときから１５日目で開始し、１週間に２回投与された（図１Ａ）。Ｉｓｏ Ａｂ群と比較して、我々は、より低いＤＡＩ（図７Ａ）、低減された全体的な炎症（図７Ｂ）、及びＭＬＮ及びＬＰから回収される単核細胞がわずかである（図７Ｃ）ことを観察した。また、ＤＡＩ及び単核細胞の低減は、Ｐｒｅ−Ｔｘ群よりも少なかった。これらのデータは、Ｔｌ１ａ Ａｂによる治療が炎症の減少された全体的なインジケータ及び腸における炎症性細胞の蓄積の低減をもたらすことを示した。

【0062】

実施例９
Ｔｌ１ａ Ａｂ投与が確立されたマウスの大腸炎の病理組織学的な特徴を緩和した。
結腸の組織学的実験は、養子移植モデルにおけるＩｓｏ Ａｂ群と比較して、Ｔｌ１ａＡｂ治療による低減された細胞浸潤、ムチンの減損、陰窩膿瘍、及び構造上の変化により特徴づけられる低減された炎症を明らかにした（図２Ａ及びＢ）。組織学的炎症の低減は、また、４週間目のＰｒｅ−Ｔｘ群と比較して有意に低減し（図２Ａ及びＢ）、部分的に回復された炎症を示した。一貫して、結腸のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性が、Ｉｓｏ Ａｂ群と比較してＴｌ１ａ Ａｂ投与の両方の投与量で、及びＰｒｅ−Ｔｘ群と比較して８０−ｍｇ／ｋｇのＴｌ１ａ Ａｂで有意に低減した（図２Ｃ）。Ｔｌ１ａ Ａｂ投与による結腸のＭＰＯ活性における低減がＲａｇベースライン対照（Ｒａｇ Ｃｏ）群と有意に異ならないレベルに達した場合に、大腸炎の粘膜の分解が示唆された（図２Ｃ）。

【0063】

同様に、慢性のＤＳＳモデルにおけるＩｓｏ Ａｂ及びＰｒｅ−Ｔｘ群の両方と比較して、Ｔｌ１ａ Ａｂによる改善された結腸の組織病理があった（図８Ａ及びＢ）。Ｔｌ１ａ Ａｂ治療による組織学的炎症における低減はあったが、結腸の炎症は、まだ、ベースラインＷＴ Ｃｏ群と比較して有意に高かった（図８Ｂ）。また、結腸のＭＰＯ活性は、Ｉｓｏ Ａｂ及びＰｒｅ−Ｔｘ群の両方と比較して、Ｔｌ１ａ Ａｂ治療により優位に低かった（図８Ｃ）。これらの結果は、Ｔｌ１ａ Ａｂの投与が結腸の組織病理学の正常化をもたらすことを示した。

【0064】

実施例１０
Ｔｌ１ａ Ａｂは、Ｔｈ−１及び−１７免疫応答を阻害した。
２つの腸炎惹起性のモデルにおける確立されたマウスの大腸炎を低減する潜在的免疫メカニズムを評価するために、Ｉｆｎγ、Ｉｌ１３、及びＩｌ１７の発現が測定された。Ｔｌ１ａ Ａｂは、養子移植モデルにおけるＩｓｏ Ａｂ群及びＰｒｅ−Ｔｘ群の両方と比較してＭＬＮ及びＬＰＭＣにおけるＣＤ４＋Ｉｌ１７＋Ｔ細胞の頻度を低減した（図３Ａ及びＢ）。ＣＤ４＋Ｉｆｎγ＋Ｔ細胞は、同様に、Ｔｌ１ａ Ａｂを２０−ｍｇ／ｋｇで投与したＬＰＭＣを除いてＴｌ１ａ Ａｂ治療の両方の投与量で低減され、Ｐｒｅ−Ｔｘ群と比較して有意な低減をもたらさなかった（図３Ａ及びＣ）。更に、発明者らは、またＭＬＮ及びＬＰＭＣの両方で、Ｐｒｅ−Ｔｘ及びＩｓｏ Ａｂ群と比較して、Ｔｌ１ａ Ａｂ治療によりＩｆｎγ＋及びＩｌ１７＋ダブルポジティブＣＤ４＋Ｔ細胞を有意に低減したことを見出した（図３Ｂ及びＣ、右のパネル）。ＣＤ３／ＣＤ２８により刺激されたＭＬＮ及びＬＰＭＣ細胞を用いて、より低いＩｌ１７産生が、Ｉｓｏ Ａｂ及びプレ治療群を受けたマウスと比較して、Ｔｌ１ａ Ａｂにより治療されたマウスでみられた（図３Ｄ）。ＭＬＮを除いて、Ｔｌ１ａ Ａｂ治療は、両方の投与量で、Ｉｓｏ Ａｂ及びＰｒｅ−Ｔｘ群と比較してより低いＩｆｎγ分泌を導いた（図３Ｅ）。ＣＤ４＋Ｉｌ１３＋Ｔ細胞及びＩｌ１３産生のパーセンテージは、群間で有意に異ならなかった。慢性のＤＳＳ大腸炎モデルでは、ＣＤ４＋Ｉｌ１７＋、ＣＤ４＋Ｉｆｎγ＋及びＣＤ４＋Ｉｌ１７＋Ｉｆｎγ＋Ｔ細胞の低減が、Ｔｌ１ａ Ａｂ治療によるＭＬＮ及びＬＰＭＣにおいて同様に観察された（図９ＡからＣ）。一貫して、Ｔｌ１ａ Ａｂ治療は、ＣＤ３／ＣＤ２８により刺激された、分離されたＭＬＮ及びＬＰＭＣ細胞におけるＩｌ１７及びＩｆｎγのより低い産生をもたらした（図９Ｄ及びＥ）。ＣＤ４＋Ｉｌ１３＋Ｔ細胞及びＩｌ１３産生のパーセンテージは、慢性のＤＳＳ大腸炎モデルにおける群間で異ならなかった。これらのデータは、Ｔｌ１ａ ＡｂがＴｈ−１及び−１７炎症誘発免疫応答を低減することを示唆した。

【0065】

実施例１１
Ｔｌ１ａ Ａｂは確立された結腸の線維症を逆戻りさせた。
恒常的なＴｌ１ａ発現を有するマウスは、これまでに、消化管線維症の増加を発達させることが示された。Ｔｌ１ａシグナル伝達を抑制することが結腸の線維症を低減し得るのかどうかを評価するために、我々は、コラーゲン沈着の程度を測定するためにシリウスレッド染色を行った。発明者は、ベースラインＲａｇ Ｃｏ群と比較して、ナイーブなＴ細胞がＰｒｅ−Ｔｘ群においてトランスファーした後４週間までに増加したコラーゲン沈着をみつけた（図４Ａ及びＣ）。コラーゲン沈着の程度は、対照Ｉｓｏ Ａｂを受けたマウスにおいて８週目までにより多くなった。しかしながら、Ｔｌ１ａ Ａｂによる治療は、Ｉｓｏ ＡｂまたはＰｒｅ−Ｔｘ群を受けたマウスと比較される場合に、コラーゲン沈着において有意な低減を導いた（図４Ａ及びＣ）。とりわけ、コラーゲン沈着は、８０ｍｇ／ｋｇのＴｌ１ａ治療が正常なＲａｇ Ｃｏマウスと比較された場合に、有意に異ならなかった（図４Ｃ）。慢性のＤＳＳモデルにおいて、Ｔｌ１ａ Ａｂ治療による、コラーゲン沈着における同様の低減が、Ｉｓｏ ＡｂまたはＰｒｅ−Ｔｘ群と比較して観察された（図４Ａ及びＣ）。また、Ｔｌ１ａ治療は、ＷＴベースライン対照と有意に異ならないレベルにコラーゲン沈着における低減を導いた（図４Ａ及びＣ）。ともに、これらのデータは、Ｔｌ１ａシグナル伝達を抑制することが、炎症の発症前と同様のレベルにコラーゲン沈着を逆戻りさせることを示唆した。

【0066】

実施例１２
Ｔｌ１ａ−Ｄｒ３シグナル伝達を抑制することが、腸の繊維芽細胞及び筋線維芽細胞数を低減させた。
Ｔｌ１ａ Ａｂによるコラーゲン沈着低減のメカニズムを研究することを開始するために、腸の繊維芽細胞及び筋線維芽細胞の出現頻度が測定された。腸の筋線維芽細胞は、腸の線維形成に伴われる細胞群である。ビメンチン陽性細胞は、繊維芽細胞であり、α平滑筋アクチン（αＳＭＡ）の共発現に関し、筋線維芽細胞を表す。データは、ナイーブなＴ細胞をトランスファーした４週間後に（Ｐｒｅ−Ｔｘ群）、繊維芽細胞及び筋線維芽細胞の数が増加することを示した（図４Ｂ及びＤ）。繊維芽細胞及び筋線維芽細胞の数は、Ｉｓｏ Ａｂを受けたマウスで８週目までに更に増加した。しかしながら、Ｔｌ１ａ Ａｂによる治療は、正常なＲａｇ Ｃｏと同様のレベルまで、繊維芽細胞及び筋線維芽細胞の数における低減を導いた（図４Ｂ及びＤ）。興味深いことに、８０−ｍｇ／ｋｇのＴｌ１ａ Ａｂを受けたマウスにおける筋線維芽細胞の低減は、Ｒａｇ Ｃｏマウスと統計的に異ならないレベルに達し（図４Ｂ及びＤ）、線維形成の反転を示唆した。

【0067】

慢性のＤＳＳモデルでは、アイソタイプまたはＰｒｅ−Ｔｘ群と比較した場合、Ａｂ治療による繊維芽細胞及び筋線維芽細胞の数の同様の低減が観察された（捕捉の図４Ｂ及びＤ）。養子移植モデルと一貫して、Ｔｌ１ａ Ａｂ治療による腸の繊維芽細胞及び筋線維芽細胞の数の低減は、ＷＴベースライン対照とは統計学的に異ならないレベルに達した（図１０Ｂ及びＤ）。

【0068】

発明者らは、腸の繊維芽細胞及び筋線維芽細胞の数の低減が直接的なＴｌ１ａ−Ｄｒ３シグナル伝達によるかどうかを描写するために、Ｄｒ３欠損（Ｄｒ３−／−）マウス（図５Ａ及びＢ）を作製した。野生型同腹子ベースライン（非大腸炎性）マウスと比較して、Ｄｒ３−／−において有意に腸の繊維芽細胞が少なかった（図５Ｃ）。次に、発明者らは、ＷＴ及びＤｒ３−／−マウス間の腸の繊維芽細胞における差が、増殖及び／またはアポトーシスに起因するのかどうかを測定するために、エクスビボＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔアッセイ及びアネキシンＶ染色をそれぞれ行った。フローサイトメトリックな分析は、ＷＴ及びＤｒ３−／−腸の繊維芽細胞間の重複したＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ強度により明白に同様の増殖率を示した（図５Ｄ、上のパネル）。野生型及びＤｒ３−／−腸の繊維芽細胞間のアポトーシス割合の差は観察されなかった（図５Ｄ、下のパネル）。

【0069】

実施例１３
Ｔｌ１ａ Ａｂ治療による線維形成の反転
Ｔｌ１ａ Ａｂによる確立された腸の線維症の反転の分子メカニズムを研究するために、コラーゲンの発現、線維形成性プログラムメディエータ（Ｔｇｆβ１、Ｃｔｇｆ、Ｉｇｆ１、Ｐｔｅｎ、及びＩｌ３１Ｒａ）、及び細胞外マトリクス（ＥＣＭ）リモデリングを伴う因子（Ｍｍｐ及びＴｉｍｐ）が測定された。より低いレベルのコラーゲン発現が、養子移植及び慢性のＤＳＳモデルの両方で見られた（本明細書の表１及び表２）。Ｔｌ１ａ Ａｂによる線維形成性プログラムの正常化が、養子移植及び慢性のＤＳＳモデルの両方で並びに養子移植モデルにおけるＩｇｆ１でＴｇｆβ１及びＩｌ３１Ｒａを含む前繊維性のメディエータのより低い発現により観察された（表１及び表２）。結合組織増殖因子（Ｃｔｇｆ）、Ｔｇｆβシグナル伝達の下流メディエータの発現が、養子移植モデルにおけるＰｒｅ−Ｔｘ及びＩｓｏ Ａｂ群と比較して、Ｔｌ１ａ Ａｂ投与により低減された。ＥＣＭリモデリングは、メタロプロテアーゼ（Ｍｍｐ）及びメタロプロテアーゼの組織インヒビタ（Ｔｉｍｐ）の発現を測定することにより評価された。アイソタイプＡｂ群と比較して、ＥＣＭ劣化を伴う遺伝子の発現は、養子移植モデルにおけるＴｌ１ａ Ａｂにより治療されたマウス（Ｍｍｐ２、Ｍｍｐ３；表１）において、及び慢性のＤＳＳモデル（Ｍｍｐ２、Ｍｍｐ３、Ｍｍｐ１３；表２）において低減された。とりわけ、Ｔｉｍｐの発現は、養子移植モデル（Ｔｉｍｐ２，表１）において及び慢性のＤＳＳモデル（Ｔｉｍｐ１、Ｔｉｍｐ２；表２）において、Ｔｌ１ａ治療により、より低くなった。これらの結果は、低減されたコラーゲン合成を導くＴｌ１ａ Ａｂによる線維形成性プログラムにおける低減があることを論証する。Ｍｍｐ及びＴｉｍｐの両方のより低い発現が、組織の損傷を誘導するよりもむしろ確立されたＥＣＭコンポーネントの増強された除去に寄与するかもしれない。このように、データは、Ｔｌ１ａ Ａｂによる確立された繊維症の反転が、低減された線維形成性プログラム及びおそらくＭｍｐ及びＴｉｍｐの両方の低減の最終結果であることを示唆する。

【0070】

実施例１４
腸の繊維芽細胞がＤｒ３を発現し、Ｔｌ１ａ刺激に反応する。
発明者らは、腸の繊維芽細胞が、直接Ｔｌ１ａシグナル伝達に対して機能的に反応し得るのかどうかを調査した。Ｄｒ３のｍＲＮＡレベル、Ｔｌ１ａの唯一の既知のレセプターが測定され、ＷＴでは低レベルで発現されるが、Ｄｒ３欠損原発性腸繊維芽細胞では発現されないことをみいだした（図６Ａ、上のパネル）。一貫して、免疫蛍光染色法は、Ｄｒ３は、ＷＴ原発性腸繊維芽細胞で発現されることを示した（図６Ａ、下のパネル）。フローサイトメトリーを用いて、発明者らは、Ｄｒ３が、αＳＭＡ発現なしの繊維芽細胞と比較して、αＳＭＡと供発現する繊維芽細胞で優先的に発現されることを見出した（図６Ｂ）。発明者らは、腸の繊維芽細胞がＴｌ１ａ刺激に反応し得るかどうかを次に確認し、繊維芽細胞活性化のマーカーとしてコラーゲン（Ｃｏｌ１ａ２）及びＩｌ３１レセプター（Ｉｌ３１Ｒａ）を使用した。発明者らは、Ｔｌ１ａが、エクスビボでマウスの原発性腸繊維芽細胞におけるＣｏｌ１ａ２及びＩｌ３１Ｒａの発現を投与量に依存して増加させ得ることを示した（図６Ｃ）。Ｔｌ１ａ刺激の特性は、エクスビボでＤｒ３−／−マウスの腸の繊維芽細胞におけるＣｏｌ１ａ２及びＩｌ３１Ｒａの平滑末端化されたＴｌ１ａ誘導により論証される（図６Ｄ）。これらのデータは、腸の繊維芽細胞がＤｒ３を発現し、直接Ｔｌ１ａシグナル伝達に機能的に反応し得ることを示す。

【0071】

実施例１５
線維症メディエータの発現分析の結果
表１ 養子移植大腸炎モデルにおける線維症メディエータの発現分析

【表1】

ｎｓ＝有意ではない

【0072】

表２ ＤＳＳモデルにおける線維症メディエータの発現分析

【表2】

ｎｓ＝有意ではない

【0073】

実施例１６
ＴＬ１Ａ−Ｄｒ３シグナル伝達を抑制することは、腸の繊維芽細胞及び筋線維芽細胞の数を低減した。−追加の結果
結腸の筋線維芽細胞は、腸の線維形成をともなう細胞群である。Ｔｌ１ａＡｂによるコラーゲン沈着低減の細胞メカニズムを研究するために、繊維芽細胞発現のビメンチン及び筋線維芽細胞共発現のビメンチン及びα平滑筋アクチン（αＳＭＡ）が、これらの細胞タイプの数を評価するために測定された。Ｐｒｅ−Ｔｘ及びＩｓｏ Ａｂ群の両方でナイーブなＴ細胞がトランスファーした後に、結腸の繊維芽細胞及び筋線維芽細胞の数が増加した（図１１ａ）。しかしながら、Ｔｌ１ａＡｂによる治療は、正常なＲａｇＣｏと同様のレベルにまで繊維芽細胞及び筋線維芽細胞の数における低減を導いた（図１１ａ）。

【0074】

慢性のＤＳＳモデルにおいて、Ｔｌ１ａ Ａｂで治療されたマウスは、ＩｓｏまたはＰｒｅ−Ｔｘ群と比較して、結腸の繊維芽細胞及び筋線維芽細胞の数における同様の低減を示した（図１１ｂ）。養子移植モデルで観察されたことと一貫して、Ｔｌ１ａ Ａｂ治療による腸の繊維芽細胞及び筋線維芽細胞の数は、ＷＴベースライン対照と統計学的に異ならないレベルにまで低減した（図１１ｂ）。慢性のＤＳＳ大腸炎モデルにおけるＷＴ Ｃｏ群と比較して、Ｔｌ１ａ Ａｂ治療で、まだ有意に悪化された大腸炎があったため、筋線維芽細胞及び繊維芽細胞の低減された数は、低減された炎症による単なる二次的な効果よりもむしろ少なくとも部分的にＴｌ１ａを中和する直接的な結果と一貫性があった。

【0075】

慢性大腸炎のこれらのマウスのモデルにおける線維症の変化に関連するＤｒ３発現の変化があるかどうかを次に評価した。免疫蛍光染色法は、養子移植及び慢性のＤＳＳ大腸炎モデルの両方におけるベースライン対照群（Ｒａｇ Ｃｏ及びＷＴ Ｃｏ）及びＴｌ１ａ Ａｂ治療群の両方と比較して、Ｐｒｅ−Ｔｘ及びＩｓｏ Ａｂ群における増加したＤｒ３発現を明らかにした（図１１ｃ、ｄ）。とりわけ、Ｐｒｅ−Ｔｘ及びアイソタイプＡｂ群での繊維芽細胞のパーセンテージにおけるＤｒ３の発現があった（図１１ｃ、ｄ）。リアルタイム定量逆転写酵素ＰＣＲ分析は、Ｄｒ３の発現が、両方のモデルにおける、ベースライン対照（Ｒａｇ Ｃｏ及びＷＴ Ｃｏ）及びＴｌ１ａ Ａｂ治療群の両方におけるマウスと比較して、Ｉｓｏ Ａｂ群で有意により高かったことを示した（図１１ｅ）。更に、Ｔｌ１ａのｍＲＮＡ発現は、養子移植及び慢性のＤＳＳ大腸炎モデルの両方における、非炎症性の対照（Ｒａｇ Ｃｏ及び ＷＴ Ｃｏ）及びＴｌ１ａ Ａｂ治療群と比較して、Ｉｓｏ Ａｂ群における有意な増加があった（図１１ｆ）。これらの結果は、腸の線維症の増加とＤｒ３−Ｔｌ１ａ発現の直接的な関係と一貫性があった。

【0076】

腸の繊維芽細胞及び筋線維芽細胞の数における低減が、直接的にＴｌ１ａ−Ｄｒ３シグナル伝達に起因し得るのかどうかを測定するために、Ｄｒ３欠損（Ｄｒ３−／−）マウスが作成された。８週齢までのＷＴまたはＤｒ３−／−マウスにおける自然な大腸炎はなかったが（図１２ａ、上のパネル）、ビメンチンの免疫蛍光染色法（図１２ａ、中央のパネル）及び結腸あたりの合計の回復した繊維芽細胞の定量（図１２ａ、下のパネル）により示されるように、ＷＴ同腹子マウスと比較して、Ｄｒ３−／−における腸の繊維芽細胞は有意に少なかった。ビメンチン及びαＳＭＡ（図１２ａ、中央のパネル）によりまたは光学顕微鏡（図１２ａ、下のパネル）による免疫蛍光染色法により、ＷＴ及びＤｒ３−／−繊維芽細胞間に形態学的差異はなかった。エクスビボＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔアッセイ及びアネキシンＶ染色が、ＷＴ及びＤｒ３−／−マウス間の腸の繊維芽細胞の数の差が増殖及び／またはアポトーシスにそれぞれ起因するのかどうかを測定するために使用された。フローサイトメトリックな分析は、ＷＴ及びＤｒ３−／−腸の繊維芽細胞間の重複するＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ強度により証明されるように、同様の増殖率を示した（図１２ｂ）。ＷＴ及びＤｒ３−／−腸の繊維芽細胞間でアポトーシスの割合における差異はみられなかった（図１２ｃ）。

【0077】

実施例１７
腸の繊維芽細胞はＤｒ３を発現し、ＴＬ１Ａ刺激に対して反応する。−追加の結果
腸の繊維芽細胞が直接的なＴｌ１ａシグナル伝達に対して機能的に反応するかどうかを測定するために、Ｄｒ３のｍＲＮＡレベルが測定されて、Ｄｒ３欠損原発性腸繊維芽細胞では検出できないが、ＷＴ（０．００１８±０．００１％βアクチン）では低いレベルで発現されることが分かった。フローサイトメトリックな分析が、Ｄｒ３がビメンチン＋αＳＭＡ−繊維芽細胞またはビメンチン＋αＳＭＡ＋筋線維芽細胞（ｍｙｏｆｌｂｒｏｂｌａｓｔ）で発現されるかどうかを測定するために行われた。結果は、Ｄｒ３が、ビメンチン＋αＳＭＡ−繊維芽細胞と比較して、ビメンチン＋αＳＭＡ＋筋線維芽細胞で優先的に発現することを示した。更に、筋線維芽細胞でのαＳＭＡレベルと、最も高いαＳＭＡ発現との筋線維芽細胞でのＤｒ３発現のより高い比率と、Ｄｒ３発現の直接的な相関関係があった（図１３ａ）。更に、αＳＭＡ及びＤｒ３により免疫染色された、ソートされたαＳＭＡ陽性の原発性腸繊維芽細胞は、ＷＴにおけるＤｒ３の供染色を示したが、Ｄｒ３欠損筋線維芽細胞では示されず、Ｄｒ３はαＳＭＡ陽性の原発性腸繊維芽細胞で発現されることを示した（図１３ｂ）。

【0078】

腸の繊維芽細胞が直接的なＴｌ１ａ刺激と反応し得るかどうかを測定するために、コラーゲン（Ｃｏｌ１ａ２、繊維芽細胞機能についてのマーカー）及びＩｌ３１Ｒａ（Ｉｌ３１Ｒａは繊維芽細胞で発現される）の発現における変化が、外因性のＴｌ１ａタンパク質の添加により測定された。結果は、エクスビボでのマウスの原発性腸繊維芽細胞におけるＣｏｌ１ａ２及びＩｌ３１Ｒａの発現において、Ｔｌ１ａ投与量依存的な増加を示した（図１３ｃ）。Ｔｌ１ａ刺激の特異性は、エクスビボでＤｒ３−／−マウスの腸の繊維芽細胞におけるＣｏｌ１ａ２及びＩｌ３１Ｒａの平滑末端化されたＴｌ１ａ誘導により論証された（図１３ｄ）。これに対し、Ｃｏｌ１ａ２またはＩｌ３１Ｒａの分化誘導は、既知の繊維芽細胞増殖因子（Ｔｇｆβ及びＩｇｆ１）または炎症誘発刺激（Ｔｎｆα）を用いてもみられなかった（図１３ｄ）。これらのデータは、腸の繊維芽細胞がＤｒ３を発現し、直接的にＴｌ１ａシグナル伝達に機能的に反応し得ることを示した。

【0079】

実施例１８
全般
腸の線維狭窄は、とりわけ重篤なＣｒｏｈｎ病の顕著な特徴である。所定のＴＮＦＳＦ１５（遺伝子名ＴＬ１Ａ）変異体を有する患者はＴＬ１Ａを過剰に発現し、小腸で狭窄を発症するより高いリスクを有する。更に、マウスにおける持続性のＴｌ１ａ発現は、腸炎惹起性の状況下に小及び大腸を導く。発明者らは、確立されたマウスの結腸の線維症が、Ｔｌ１ａ抗体により逆戻りし得るかどうかを測定した。Ｔｌ１ａ抗体を中和する治療は、結合組織増殖因子（Ｃｔｇｆ）、Ｉｌ３１Ｒａ、形質転換増殖因子（Ｔｇｆ）β１及びインスリン様増殖因子１（Ｉｇｆ１）のより低い発現の結果として、もとの前炎症性のレベルに結腸の線維症を逆戻りさせた。更に、Ｔｌ１ａ抗体を中和またはデスドメインレセプタ３（Ｄｒ３）の欠失のいずれかによりＴｌ１ａ機能を抑制することは、繊維芽細胞及び筋線維芽細胞、組織の繊維症を媒介する原発性の細胞タイプの数を低減させた。原発性腸筋線維芽細胞がＤｒ３を発現し、コラーゲン及びＩｌ３１Ｒａ発現を増加させることにより直接的なＴｌ１ａシグナル伝達に機能的に反応した。これらのデータは、組織線維症におけるＴＬ１Ａ−ＤＲ３シグナル伝達の直接的な役割、及びＴＬ１Ａ−ＤＲ３シグナル伝達の変調が消化管線維症を阻害することを論証した。

【0080】

本発明の種々の実施形態が上記の詳細な説明で述べられる。これらの記載は、上記実施形態を直接的に記載しているが、当業者は、本明細書に示されかつ記載される特定の実施形態に対して変更及び／またはバリエーションを着想することが理解される。本記載の範囲内であるあらゆるこのような変更及びバリエーションは、同様に本明細書に含まれることが意図される。特に記載されない限り、明細書及び請求の範囲における文言及びフレーズは、当業者にとって通常の慣用されている意味を付与されることが発明者の意図である。出願時に出願人に知られている発明の種々の実施形態の上述の記載は、説明及び記載の目的で存在し、意図される。本記載は、開示されている正確な形態に本発明を徹底または限定する意図はなく、多くの変更及びバリエーションが上記の教示に照らして可能である。記載される実施形態は、本発明の原理及びその実際の応用を説明するため、及び当業者が種々の実施形態で、及び考慮される特定の使用に適するように種々の変更をもってその発明を利用できるように提供される。よって、本発明は、本発明を実施するために開示された特定の実施形態に限定されないことが意図される。

【0081】

本発明の特定の実施形態が示されて記載され、一方、当業者にとって、本明細書での教示に基づいて変化や変更が、本発明及びその広い態様から逸脱することなくなされることは自明であり、よって、添付の請求の範囲は、本発明の真の精神及び範囲内であるとして、全てのこのような変化及び変更はそれらの範囲内に包含されるべきである。全般に、本明細書で使用される用語は、概して、「オープン」な用語（例えば、「含んでいる」は、「含んでいるがこれに限定されない」と解釈されるべきであり、用語「有している」は「少なくとも有している」と解釈されるべきであり、用語「含む」は「含むがこれに限定されない」と解釈されるべきである等）として意図されることが当業者により理解されるであろう。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11-1】

【図11-2】

【図12】

【図13-1】

【図13-2】