特許 6671647 食肉熟成用の布及び熟成肉の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6671647

(24)【登録日】2020年3月6日

(45)【発行日】2020年3月25日

(54)【発明の名称】食肉熟成用の布及び熟成肉の製造方法

(51)【国際特許分類】

   A23L 13/00 20160101AFI20200316BHJP

【ＦＩ】

   A23L13/00 Z

   A23L13/00 A

【請求項の数】4

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2016-31727(P2016-31727)

(22)【出願日】2016年2月23日

(65)【公開番号】特開2017-147950(P2017-147950A)

(43)【公開日】2017年8月31日

【審査請求日】2019年1月17日

(73)【特許権者】

【識別番号】801000027

【氏名又は名称】学校法人明治大学

(74)【代理人】

【識別番号】100106909

【弁理士】

【氏名又は名称】棚井 澄雄

(74)【代理人】

【識別番号】100064908

【弁理士】

【氏名又は名称】志賀 正武

(74)【代理人】

【識別番号】100108578

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 詔男

(74)【代理人】

【識別番号】100126882

【弁理士】

【氏名又は名称】五十嵐 光永

(73)【特許権者】

【識別番号】516381633

【氏名又は名称】株式会社ミートエポック

(74)【代理人】

【識別番号】100106909

【弁理士】

【氏名又は名称】棚井 澄雄

(74)【代理人】

【識別番号】100126882

【弁理士】

【氏名又は名称】五十嵐 光永

(72)【発明者】

【氏名】高橋 結

(72)【発明者】

【氏名】村上 周一郎

(72)【発明者】

【氏名】跡部 美樹雄

【審査官】 西 賢二

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１５−１２３０５７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭６３−３１３５４１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１３／０１０１７００（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許第０３１３００５７（ＵＳ，Ａ）

【文献】 特開平０３−０４３０８３（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ２３Ｌ １３／００−１７／５０

Ｃ１２Ｎ １／００−７／０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＦＳＴＡ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

食肉上で生育可能で食肉の熟成を促進するヘリコスティラム属（Ｈｅｌｉｃｏｓｔｙｌｕｍ）又はタムニディウム属（Ｔｈａｍｎｉｄｉｕｍ）に属する好冷性菌（好冷菌）を備え、
前記好冷性菌が胞子の状態であることを特徴とする食肉熟成用の布。

【請求項2】

布の材質がレーヨンである、請求項１に記載の布。

【請求項3】

さらに、炭水化物を含む、請求項１又は２に記載の布。

【請求項4】

請求項１〜３のいずれか一項に記載の布を食肉に巻きつける工程を備えることを特徴とする熟成肉の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、食肉熟成用の布、熟成肉の製造方法及び布の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、熟成された食肉（以下、「熟成肉」と呼ぶ。）のブームなどを背景に、長期間保存することができ、且つ美味しい肉類に対する消費者の要求は高まりつつある。熟成肉の特徴としては、例えば、脂肪の口溶けが良く、肉質が柔らかくなり、独特の良い香りが生成し、旨みが増す等が挙げられる。

【0003】

また、冷凍された肉類は、通常は１〜２年間凍結させたまま、細菌や微生物などの繁殖を抑制しつつ、味、色相などの特性を保持して長期に亘り貯蔵することができるが、冷凍された肉類を調理する前には解凍が必要であり、また冷凍中は肉類の熟成が進行しないので、美味しい肉類を得るためには解凍後、最適な状態の熟成度が達成されるまで熟成する必要がある。また、肉類は屠殺後、一定の時間を経過すると、硬直する性状を備えている。そのため、冷蔵温度で長期間貯蔵し最適な状態の熟成度が達成されるまで熟成することにより、硬い肉が軟化して美味しい肉類が得られることも知られている。熟成とは、タンパク質分解酵素の作用による自己消化の過程を指し、タンパク質が分解されアミノ酸の量が増し、筋肉組織が柔軟性をおびると同時に風味が向上するため、商品価値を高める重要な役割を果たしている。

【0004】

一方で、筋肉タンパク質の自己消化が始まると、分解で生じたアミノ酸などを栄養源として、食肉表面に付着している微生物（細菌、カビ）が繁殖し始め、熟成の後期になると微生物は筋肉タンパク質を直接分解するようになり、その際生じる好ましくない分解物によって食肉は悪変し、腐敗に至る。従って、熟成肉は微生物が繁殖しやすい状態であり、腐敗に対して特に注意が必要となる。

【0005】

特許文献１には、この食肉表面に付着している微生物を利用して、熟成肉を製造する方法が記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開平６−３４３４５８号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

特許文献１に記載の方法では、操作が煩雑で実用性に乏しく、また微生物を食肉に直接塗布しており、均一に菌が繁殖しないため、熟成に偏りが出て、うまく熟成の管理をできない虞がある。

【0008】

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、より早く、品質が安定した熟成肉を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、食肉上で生育可能で食肉の熟成を促進する微生物が着生された布を用いることに着目し、本発明を完成させるに至った。

【0010】

本発明は、以下の態様を含む。
［１］食肉上で生育可能で食肉の熟成を促進するヘリコスティラム属（Ｈｅｌｉｃｏｓｔｙｌｕｍ）又はタムニディウム属（Ｔｈａｍｎｉｄｉｕｍ）に属する好冷性菌（好冷菌）を備え、前記好冷性菌が胞子の状態であることを特徴とする食肉熟成用の布。
［２］布の材質がレーヨンである、［１］に記載の布。
［３］さらに、炭水化物を含む、［１］又は[２]に記載の布。
［４］［１］〜［３］のいずれか一つに記載の布を食肉に巻きつける工程を備えることを特徴とする熟成肉の製造方法。

【発明の効果】

【0011】

本発明によれば、より早く、品質が安定した熟成肉を得ることができる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】（Ａ）〜（Ｃ）実施例２におけるレーヨン、木綿ガーゼ及びエステルを用いてＪＷ−１株を培養した結果を示す画像である。

【図2】（Ａ）実施例３における熟成開始から０日目及び１０日目のコントロール布を巻きつけたブロック肉の外観を撮影した画像である。（Ｂ）実施例３における熟成開始から０日目及び１０日目の胞子付着布を巻きつけたブロック肉の外観を撮影した画像である。

【図3】実施例３における熟成開始から０日目及び１０日目のコントロール布又は胞子付着布を巻きつけたブロック肉の総脂肪の融点を示すグラフである。

【図4】（Ａ）〜（Ｄ）実施例３における熟成開始から０日目及び１０日目のコントロール布又は胞子付着布を巻きつけたブロック肉の総脂肪酸における主要な脂肪酸の組成を示すグラフである。

【図5】（Ａ）実施例３における熟成開始から０日目及び１０日目のコントロール布又は胞子付着布を巻きつけたブロック肉の歪率６０％における応力（「肉の歯ごたえ」の指標）を示すグラフである。（Ｂ）実施例３における熟成開始から０日目及び１０日目のコントロール布又は胞子付着布を巻きつけたブロック肉の最初の破断点が観察される歪率（「肉の噛みきり易さ（やわらかさ）」の指標）を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0013】

＜＜食肉熟成用の布＞＞
一実施形態において、本発明は、食肉上で生育可能で食肉の熟成を促進する微生物を備える、食肉熟成用の布を提供する。

【0014】

本実施形態の布は食肉上で生育可能で食肉の熟成を促進する微生物が着生されており、本実施形態の布によれば、均一に微生物を繁殖させることができ、より早く、品質が安定した熟成肉を得ることができる。また、特定の菌を優先的に繁殖させることができるため、その他の有害な菌による汚染リスクを下げることができる。

【0015】

本明細書において、「食肉」とは、一般に、家畜化された動物又は野生動物から得られる食用の肉を意味する。食肉として、具体的には、例えば、牛肉、豚肉、鶏肉（例えば、ニワトリ、アヒル、七面鳥、ホロホロチョウ、鳩等由来の肉）、馬肉、山羊肉、羊肉、猪肉、鹿肉、兎肉、熊肉、カンガルー肉、鯨肉、入鹿肉、海馬肉、鰐肉、蛙肉等が挙げられ、これらに限定されない。また、肉の部位についても、特別な限定はない。また、本明細書において、食肉には、魚類も包含する。

【0016】

本明細書において、「食肉の熟成」とは、上述の様々な種類の食肉において、食肉自身又は微生物が有する酵素の作用により、食肉に含まれる成分（例えば、タンパク質、脂質、糖質等）が分解されて、特殊な風味又は旨みが出る、又は食感が向上する状態を意味する。

【0017】

＜微生物＞
本実施形態の布に着生させる微生物は、菌糸体の状態であってもよく、胞子の状態であってもよい。流通のしやすさ、及び管理のしやすさから、微生物は、胞子の状態であることが好ましい。

【0018】

本実施形態の布に着生させる微生物としては、食肉上で生育可能で食肉の熟成を促進するものであれば、特別な限定はない。微生物としては、中でも、糸状菌であることが好ましい。一般的に、糸状菌とは、菌糸と呼ばれる管状の細胞から構成されている菌の総称である。糸状菌としては、例えば、ケカビ目に属する糸状菌等が挙げられ、より具体的には、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ヘリコスティラム属（Ｈｅｌｉｃｏｓｔｙｌｕｍ）、タムニディウム属（Ｔｈａｍｎｉｄｉｕｍ）等が挙げられる。中でも、微生物としては、ヘリコスティラム属（Ｈｅｌｉｃｏｓｔｙｌｕｍ）又はタムニディウム属（Ｔｈａｍｎｉｄｉｕｍ）であることが好ましい。

【0019】

また、本実施形態の布に着生させる微生物は、上述の種類の微生物の中でも、冷蔵状態であっても生育可能であることから、好冷性菌（好冷菌）であることが好ましい。好冷菌であることにより、０〜４℃等の低温であっても、生育することができ、食肉の熟成を促進することができる。

【0020】

＜布の材質＞
本実施形態における布の材質としては、食肉と接しても有害な成分等が染み出ることのないものであればよく、特別な限定はない。布の材質は、例えば、木綿、絹、麻、レーヨン、アセテート、キュプラ、ナイロン、ポリウレタン、ポリエステル、アクリル等が挙げられる。中でも、布の材質は、微生物が着生しやすく、また安価に手に入ることから、レーヨンが好ましい。

【0021】

＜その他成分＞
本実施形態における布は、微生物の他に、例えば、炭水化物、ミネラル等を含んでいてもよい。中でも、布は、炭水化物を含むことが好ましい。炭水化物を含むことにより、微生物が繁殖するための栄養分とすることができ、脂肪分の多い部位等微生物が繁殖しにくい食肉であっても、効率的に微生物を繁殖することができ、食肉をより早く安定的に熟成させることができる。

【0022】

炭水化物としては、微生物が細胞内に取り込むことができるものであればよく、例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース等の単糖類；ラクトース、マルトース、スクロース等の二糖類；ラフィノース、マルトトリオース、フルクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、マンナンオリゴ糖等のオリゴ糖類；デンプン、セルロース、グリコーゲン等の多糖類；グリセロール、エリトリトール、ラクチトール、マルチトール、マンニトール、ソルビトール、キシリトール等の糖アルコール類等が挙げられる。また、ミネラルとしては、例えば、マグネシウムイオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン等が挙げられる。

【0023】

＜布の製造方法＞
本実施形態の布の製造方法としては、例えば、以下の方法等が挙げられる。
まず、微生物の懸濁液を調製し（懸濁液調製工程）、該懸濁液と、適当な大きさに裁断した布とを接触させて、微生物を布に着生させる（着生工程）。温度は、室温（例えば、２０℃以上３０℃以下）であることが好ましい。接触時間は布の大きさによって、適宜調整することができる。また、懸濁液は、微生物の栄養分となり得る成分（例えば、炭水化物、ミネラル等）を含んでいてもよい。また、布に霧吹き等を用いて、懸濁液を散布する方法により、微生物を着生させてもよいが、布に微生物を均一に着生させるために、懸濁液に布を浸す方法が好ましい。
続いて、乾燥機を用いて、微生物を着生させた布を乾燥させる（乾燥工程）ことにより、微生物を着生させた布を得ることができる。乾燥温度及び乾燥時間についても、布の大きさによって、適宜調整することができる。

【0024】

＜＜熟成肉の製造方法＞＞
一実施形態として、本発明は、上述の布を食肉に巻きつける工程を備える、熟成肉の製造方法を提供する。

【0025】

本実施形態の製造方法によれば、均一に微生物を繁殖させることができ、より早く、品質が安定した熟成肉を得ることができる。また、特定の菌を優先的に繁殖させることができるため、その他の有害な菌による汚染リスクを下げることができる。

【0026】

＜巻きつける工程＞
本実施形態の製造方法について、以下に詳細に説明する。
まず、食肉に上述の微生物が着生した布を巻きつける。本実施形態の製造方法において用いられる食肉は、上述の＜＜食肉熟成用の布＞＞と同様のものを用いることができる。食肉はブロックの状態でもよく、枝肉の状態であってもよい。布には微生物が均一に着生しているため、偏りなく均一に食肉を熟成させることができ、熟成肉の生産性が向上する。

【0027】

また、食肉の余分な水分を除去するために、前記巻きつける工程の前に食肉に塩を振りかける、又はすりこむ食肉の前処理工程を備えていてもよい。塩を振りかける、又はすりこむことにより、余分な水分を除去できるだけでなく、腐敗菌の繁殖を抑えることができる。この前処理工程は、水分の多い鶏肉等を熟成させる場合に、特に有用である。

【0028】

続いて、布を巻きつけた食肉を冷蔵庫にて、保冷し熟成させる。熟成期間は食肉の種類、大きさ、部位によって、適宜調整することができる。通常の熟成期間は１〜３ヶ月程度であるのに対し、本実施形態の製造方法では、微生物が予め布に均一に着生していることから、通常の１／２〜１／３程度の期間で、品質が安定した熟成肉を得ることができる。

【0029】

また、熟成温度は、使用する微生物の種類によって、適宜調整することができ、例えば０℃以上２０℃未満であってよく、例えば０℃以上１５℃以下であってよく、例えば４℃以上１０℃以下であってよい。中でも、熟成温度は、布に着生した微生物が繁殖しやすく、且つ、その他の空気中等に生息する有害な微生物が繁殖しにくいことから、０℃以上１５℃以下であることが好ましく、４℃以上１０℃以下であることがより好ましい。熟成温度が２０℃未満であることにより、有害な微生物が繁殖しにくく、腐敗が進行しにくくなる。

【0030】

以下、具体的実施例により、本発明についてより詳細に説明する。ただし、本発明は以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。

【実施例】

【0031】

［実施例１］
（１）熟成肉からの微生物のスクリーニング
（１−１）スクリーニング用培地の調製
２００ｍＬの三角フラスコに、３．９ｇのポテトデキストロース寒天培地（日水製薬（株）社製）及び１００ｍＬの蒸留水を加え、湯せんにより撹拌しながら加温溶解し、オートクレーブ処理（高圧蒸気滅菌処理：１２１℃、１５分）した。続いて、オートクレーブ処理した培地を、クリーンベンチ内で１５分間ＵＶ照射した後、滅菌済プラスチックシャーレ（直径９０ｍｍ）に分注して、スクリーニング用のポテトデキストロース寒天（ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ａｇａｒ；ＰＤＡ）平板培地を作製した。また、分離菌株の純粋分離に用いる培地として、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む同組成の平板培地も同様に作製した。また、分離菌株の採取及び保存用には、試験管に分注して作製したＰＤＡ培地（ＰＤＡスラント培地）を調製した。

【0032】

（１−２）微生物のスクリーニング
続いて、熟成庫内の熟成肉（枝肉）から、優先的に繁殖している微生物を乾熱滅菌済みのピンセット、又は白金耳を用いて、スクリーニング用のポテトデキストロース寒天平板培地に塗布した。４℃及び１５℃で３〜４日培養し、生育した糸状菌様微生物を採取し、純粋分離用の平板培地に塗布した。続いて、同様に生育した微生物を分離菌株としてＰＤＡ斜面培地に採取した。また、オートクレーブ処理した２０％（ｗ／ｖ）グリセロール溶液に胞子を懸濁したものをグリセロールストックとして−８０℃で保存した。

【0033】

（２）分離菌株の同定
（２−１）菌株同定用培地の調製
糸状菌様微生物の菌体回収用の培地として、２００ｍＬ用の三角フラスコに、１ｇの酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）、１ｇのポリペプトン（日本製薬（株）社製）、２ｇのＤ−グルコース、及び８０ｍＬの蒸留水を加え、撹拌して完全に溶解した後、１００ｍＬになるよう定容した。続いて、１００ｍＬの培地を試験管に５ｍＬずつ分注し、オートクレーブ処理したものを分離菌株の菌体回収用のＰＧＹ（Ｐｅｐｔｏｎｅ，Ｇｌｕｃｏｓｅ，Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ）液体培地として用いた。

【0034】

また、同定実験に用いる大腸菌形質転換株用の培地として、０．５ｇの酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）、１ｇのポリペプトン（日本製薬（株）社製）、１ｇの塩化ナトリウム、及び８０ｍＬの蒸留水を加え、撹拌して溶解した。続いて、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐＨを６．８〜７．０に調整した。続いて、１００ｍＬになるよう定容し、試験管に２ｍＬずつ分注した。
寒天培地を作製する場合は、定容後に１．５ｇの寒天を加え、湯せんで溶解した。オートクレーブ処理後、寒天培地には、１５分間ＵＶ照射したクリーンベンチ内で、終濃度が括弧内の濃度になるように、アンピシリンナトリウム（５０μｇ／ｍＬ）、イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（１ｍＭ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（０．０４％）を加え、滅菌済プラスチックシャーレに分注して、形質転換株獲得用のＬＢ寒天平板培地とした。
２ｍＬのＬＢ液体培地は、プラスミド回収の培養の前に、終濃度が５０μｇ／ｍＬになるようアンピシリンナトリウムを加えてから培養に用いた。

【0035】

（２−２）菌株の同定
分離菌株の同定は、以下に示した方法により、２８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列及びＩｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （ＩＴＳ：後述）に基づいて同定した。

【0036】

（２−２−ａ）菌体からのＤＮＡの調製
菌体の回収は、分離菌株を菌体回収用のＰＧＹ液体培地を用いて１５℃で２日間振とう培養し、ミラクロスをセットしたブフナーロートを用いた吸引ろ過によって行った。続いて、従来の方法（参考文献：浜本牧子、「微生物の分類・同定実験法−分子遺伝学・生物学的手法を中心に−」、２.ＤＮＡの調製 ２．２．酵母・糸状菌 ２．２．３．小スケール法、ｐ．２６−２７、シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社、２００１年）に従って、菌体からＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡの濃度は１％アガロースゲル電気泳動により確認した。サイズマーカーはＨｉｎｄＩＩＩで消化したλ−ＤＮＡを用いた。

【0037】

（２−２−ｂ）ＰＣＲによる２８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の増幅
続いて、従来の方法（参考文献：Sandhu, G.S., Kline, B.C., Stockman, L. and Roberts, G.D., “Molecular probes for diagnosis of fungal-infections.” Journal of Clinical Microbiology, 33, 2913-2919, 1995.）に従って、前記（２−２−ａ）で調製したＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法により２８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の一部分を増幅した。プライマーとして、真菌の２８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に特異的な配列であるＰ１プライマー（配列番号１：５’−ＡＴＣＡＡＴＡＡＧＣＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧ−３’）、及びＰ４プライマー（配列番号２：５’−ＡＣＴＣＣＴＴＧＧＴＣＣＧＴＧＴＴＴＣＡ−３’）を用いた。増幅の確認は、２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動により行った。サイズマーカーは、１００ｂｐ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社製）を用いた。

【0038】

（２−２−ｃ）ＰＣＲ増幅産物の精製
ＦａｖｏｒＰｒｅｐ ＧＥＬ／ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＦＡＶＯＲＧＥＮ社製）を用いて、ＰＣＲ増幅産物を精製した。続いて、以下に示したエタノール沈殿操作を行った。前記（２−２−ｂ）で得られたＰＣＲ増幅産物に、１／１０容量の３Ｍ ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ５．２）、２．５容量の９９．５％ ＥｔＯＨを加え、２５℃で１５分間静置した後、遠心分離（１５，４００×ｇ、１５分、２５℃）した。続いて、上清を除去し、７０％エタノールを１００μＬ加え、遠心分離（１５，４００×ｇ、１０分、２５℃）した。続いて、上清を除去し、１０分間減圧下で乾燥させた（以後、本操作を「エタノール沈殿」と呼ぶ。）。続いて、得られた沈殿物を４μＬのＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した。そのうち、１μＬを２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、精製されたＰＣＲ増幅産物の回収を確認した。

【0039】

（２−２−ｄ）ベクターと精製ＰＣＲ増幅産物のライゲーション
精製ＰＣＲ増幅産物及びｐＧＥＭ Ｔ−Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、１２℃で１晩インキュベートし、ライゲーション反応を行った。

【0040】

（２−２−ｅ）大腸菌の形質転換及びプラスミドの回収
ＥＣＯＳ（登録商標） Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ニッポンジーン社製）を製品マニュアルに従い、前記（２−２−ｄ）で調製したライゲーション反応液を用いて形質転換した。続いて、得られた形質転換株をＬＢ寒天平板培地で３７℃、２０時間培養した。続いて、生育したコロニーを滅菌した爪楊枝を用いて２ｍＬのＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で１６時間振とう培養した。続いて、従来の方法（参考文献：Sambrook, J. and Russell, D. W., Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd ed., “Preparation of plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS: Minipreparation”, p. 1.32-1.34, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001.）に従って、アルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを回収した。続いて、回収したプラスミドＤＮＡを、０．２μＬのＲＮａｓｅ Ａ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含む４０ μＬのＴＥ ｂｕｆｆｅｒに溶解した。続いて、３７℃で５分間インキュベートした後、そのうち、１μＬを１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、目的サイズのプラスミドＤＮＡの回収を確認した。サイズマーカーとしてＨｉｎｄＩＩＩで消化したλ−ＤＮＡを用いた。

【0041】

（２−２−ｆ）ＤＮＡシークエンシング
続いて、前記（２−２−ｅ）で回収したプラスミドＤＮＡをＦａｖｏｒＰｒｅｐ ＧＥＬ／ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＦＡＶＯＲＧＥＮ社製）を用いて精製した。精製したプラスミドＤＮＡ溶液のうち、１μＬのサンプルを１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、プラスミドＤＮＡの回収を確認した。続いて、残りの精製プラスミドＤＮＡのうち、４μＬをシークエンシングに用いた。ＢｉｇＤｙｅ（登録商標） Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、サイクルシークエンシングを行った。まず、プラスミドＤＮＡをＰＣＲ反応により増幅した。ＰＣＲ反応条件は、９６℃で１分間加熱した後、９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間、６０℃で４分間のサイクルを３５回繰り返した。続いて、ＰＣＲ増幅産物を含む反応液をエタノール沈殿し、１５μＬのＨｉｄｉ ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）に溶解し、得られた試料を３１３０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）に供し、ＤＮＡ配列を得た。得られたデータをＣｈｒｏｍａｓ ＬＩＴＥ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０１（Ｔｅｃｈｎｅｌｙｓｉｕｍ Ｐｔｙ社製）、及びＧＥＮＥＴＹＸ（登録商標）−ＷＩＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１．０（Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ社製）を用いて解析した。決定した塩基配列と同一性を示す配列を、ｆａｓｔａプログラムを用いて、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（http://www.ebi.ac.uk/embl/）のデータベースを検索した。同一性の高さに基づいて、分離菌株を同定した。

【0042】

形態及び２８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の解析結果から、ケカビ目ケカビ科（Ｍｕｃｏｒａｃｅａｅ）のいくつかの属種の菌株を高い同一性を示した。同一性が高かった候補の属種から、ＪＷ−１株がどの属種かを同定するため、Ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＩＴＳ）領域を用いて同定を進めた。参考文献（Walther et al., “DNA barcoding in Mucorales: an inventory of biodiversity”, Persoonia, 30, 2013: 11-47）に示されている属種を基に候補株を選定した。具体的な方法としては、前記菌体からのＤＮＡの調製、ＰＣＲ、ＰＣＲ増幅産物の精製、ＤＮＡシークエンシングから成るダイレクトシークエンス法により行った。ＰＣＲに用いたプライマーは、高い同一性を示した菌株のＩＴＳ領域の塩基配列の増幅に特異的なプライマーを作製し（ＪＷ−ＩＴＳ−Ｆ（配列番号３）：５’−ＣＡＡＣＧＧＡＴＣＴＣＴＴＧＧＴＴＣＴＣ−３’、ＪＷ−ＩＴＳ−Ｒ（配列番号４）：５’−ＣＣＣＧＣＣＴＧＡＴＴＴＣＡＧＡＴＣ−３’）し、使用した。結果を表１に示す。

【0043】

【表1】

【0044】

表１から、ヘリコスティラム属（Ｈｅｌｉｃｏｓｔｙｌｕｍ）の両種との同一性が９９．５％以上、タムニジウム属（Ｔｈａｍｎｉｄｉｕｍ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）及びピレラ属（Ｐｉｒｅｌｌａ）との同一性が９４．５％以下であることが判明した。このから、ＪＷ−１株をヘリコスティラム属（Ｈｅｌｉｃｏｓｔｙｌｕｍ）と同定した。

【0045】

［実施例２］
（１）胞子懸濁液調製用の培地の調製
３００ｍＬの三角フラスコに１ｇの酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）、１ｇのポリペプトン（日本製薬（株）社製）、２ｇのＤ−グルコース、１．５ｇの寒天、及び１００ｍＬの蒸留水を加え、湯せんにより撹拌しながら加温溶解した。続いて、オートクレーブ処理（高圧蒸気滅菌処理：１２１℃、１５分）した後、クリーンベンチ内で１５分間ＵＶ照射した。続いて、滅菌済プラスチックシャーレ（直径９ｃｍ）に分注して、ＰＧＹ平板培地を作製した。

【0046】

（２）ＪＷ−１株の胞子懸濁液の調製
続いて、（１）で調製した１枚のＰＧＹ平板培地に、滅菌水に懸濁したＪＷ−１株の胞子を塗沫し、１５℃で４日間培養した。続いて、培地一面に生育し、胞子形成が見られる菌体に、滅菌水を各平板培地に５ｍＬ加え、胞子懸濁液を調製した。５枚のＰＧＹ平板培地から調製した胞子懸濁液の胞子濃度は、１ｍＬあたり１．７×１０^６個 となるように滅菌水の量を調節した。胞子数のカウントは、顕微鏡観察下（×４００倍）でトーマ氏血球計算盤を用いて行い、１ｍＬあたりの胞子数を算出した。

【0047】

（３）胞子が着生した布の作製
続いて、１８０℃、３０分間乾熱殺菌したシャーレ（直径９ｃｍ）に、５ｍＬの（２）で調製した胞子懸濁液を移し、各１．５×１．５ｃｍの大きさに裁断し、オートクレーブ処理したレーヨン、木綿ガーゼ及びエステルを浸し、軽く振とうした。続いて、浸した各布を乾熱殺菌したシャーレに移し、通風乾燥機を用いて40℃で一晩乾燥させた。続いて、乾燥させた各布をＰＤＡ平板培地に接種した後、１５℃で４日間インキュベートし、ＪＷ−１株の増殖を目視で観察した。結果を図１に示す。

【0048】

図１から、いずれの材質の布においても、ＪＷ−１株の増殖が確認でき、レーヨンを用いた場合において、ＪＷ−１株が一番多く増殖することが明らかとなった。

【0049】

［実施例３］
（１）胞子懸濁液調製用の培地の調製
５００ｍＬの三角フラスコに３ｇの酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）、３ｇのポリペプトン（日本製薬（株）社製）、６ｇのＤ−グルコース、４．５ｇの寒天、及び３００ｍＬの蒸留水を加え、湯せんにより撹拌しながら加温溶解した。続いて、オートクレーブ処理（高圧蒸気滅菌処理：１２１℃、１５分）した後、クリーンベンチ内で１５分間ＵＶ照射した。続いて、滅菌済プラスチックシャーレ（直径９ｃｍ）に分注してＰＧＹ平板培地を作製した。

【0050】

（２）ＪＷ−１株の胞子懸濁液の調製
続いて、（１）で調製した１５枚のＰＧＹ平板培地に、滅菌水に懸濁したＪＷ−１株の胞子を塗沫し、１５℃で４日間培養した。続いて、培地一面に生育し、胞子形成が見られる菌体に、滅菌水を各平板培地に５ｍＬ加え、胞子懸濁液を調製した。続いて、調製した胞子懸濁液の胞子濃度は、１ｍＬあたり８．５×１０^５個 となるように、滅菌水の量を調節した。胞子数のカウントは、顕微鏡観察下でトーマ氏血球計算盤を用いて行い、１ｍＬあたりの胞子数を算出した。

【0051】

（３）胞子が着生した布の作製
続いて、シャーレ（直径１２ｃｍ）に、２２ｍＬの（２）で調製した胞子懸濁液を移し、レーヨン（２４ｃｍ×１８ｃｍ）を浸し、軽く振とうした。続いて、浸した布を殺菌済みのタッパーに移し、通風乾燥機を用いて４０℃で一晩乾燥させた（以下、「胞子付着布」と呼ぶ。）。また、実験のコントロール用として、オートクレーブ処理後、胞子を付着させずに、同様に一晩乾燥させた布を作製した（以下、「コントロール布」と呼ぶ。）。

【0052】

（４）熟成肉の製造
屠殺から６日後（黒毛和種、去勢雄、２才）の牛ブロック肉（使用した部位：シキンボ）約３４０〜３８０ｇ（０日目の試料とする）に、（３）で作製した布をブロック肉全体が覆われるように巻きつけ、胞子付着布を巻きつけたブロック肉、及びコントロール布を巻きつけたブロック肉を準備した。続いて、各布を巻きつけた熟成肉を製造している熟成庫内（４．７℃、湿度７２％）で１０日間、熟成させた（１０日目の試料とする）。

【0053】

（５）熟成肉の各種分析
（５−１）経過観察
熟成開始から０日目及び１０日目に、菌糸の生育及び胞子形成の程度を目視で観察した。結果を図２に示す。

【0054】

図２から、０日目ではいずれの布を巻きつけたブロック肉においても、菌糸の生育は観察されなかったが、１０日目ではどちらの布を巻きつけたブロック肉においても菌糸の生育が観察された。コントロール布を巻きつけたブロック肉に対し、胞子付着布を巻きつけたブロック肉では全面に均一に菌糸の生育が観察された。また、１０日目のコントロール布を巻きつけたブロック肉においても菌糸の生育が確認されたのは、熟成庫内に存在する菌が付着し、繁殖したものであると推察できる。

【0055】

（５−２）水分量の測定
熟成開始から０日目及び１０日目に、ブロック肉の重量を測定し、減少した重量を熟成過程で失われた水分量とした。結果を表２に示す。

【0056】

【表2】

【0057】

表２から、胞子付着布を巻きつけたブロック肉と、コントロール布を巻きつけたブロック肉とで、水分の減少率に差がないことが明らかとなった。

【0058】

（５−３）脂質の融点測定
（５−３−ａ）熟成肉からの総脂質の抽出
熟成開始から０日目の牛ブロック肉、及び肉表面をトリミングした熟成開始から１０日目のブロック肉（コントロール布及び胞子付着布で製造したもの）をカットし、その一部を脂質の抽出操作に用いた。脂質の抽出はＦｏｌｃｈらの方法（参考文献：Folch, J., Lees, M., and Sloane-Stanley, G.H., “A Simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues”, J. Biol. Chem., 226, 497-509, 1957）を参考に以下の方法で行った。まず、ミンチ状にカットした２ｇの肉に３０ｍＬのクロロホルム−メタノール（体積比＝２：１）を加え、ホモジナイザーＳＸ１０（三井電気精機（株）社製）を用いて３０秒間ホモジナイズした。続いて、Ｎｏ．２ろ紙（アドバンテック東洋（株）社製）をセットしたＴＦ目皿板（５５ｍｍ）及びガラス製ろ過器を用いて、吸引ろ過した。続いて、ろ液を回収し、残渣に３０ｍＬのクロロホルム−メタノール（体積比＝２：１）を加え、ホモジナイズ及びろ過する操作を２回行った。３回目のろ紙上の残渣に１０ｍＬのクロロホルム−メタノール（体積比＝２：１）を加えて洗浄ろ過し、全てのろ液と洗浄液を合わせて、キャップ付ガラス試験管に移した。続いて、０．２容量の蒸留水を加え、３０秒間振とうし、遠心分離（１１００×ｇ、３０分）した。続いて、上層を除き、下層を２００ｍＬのナス型フラスコに移した。続いて、ロータリーバキュームエバポレーター（型式：Ｎ−１、東京理化器機械（株）社製）を用いて濃縮し、最小量のヘキサンに溶解して１０ｍＬのキャップ付ガラス試験管に移した。続いて、Ｎ_２ガスを噴きつけて有機溶媒を除去し、一部試料中に残存する有機溶媒を、オイルポンプを用いて除去した。

【0059】

（５−３−ｂ）融点の測定
（５−３−ａ）で抽出された脂質を、予め１ｃｍのところに印をつけた毛細管（外径：１．０±０．０５ｍｍ、内径：０．５８±０．０５ｍｍ）を用いて、毛細管現象により１ｃｍまで吸い上げた。これを繰り返し、１つの脂質試料あたり１０本の毛細管を作製した。続いて、毛細管を氷冷した１０ｍＬのキャップ付ガラス試験管に移し、−２０℃で一晩保存した。続いて、５００ｍＬのビーカーに水道水を約５００ｍＬ及びスターラーバーを入れ、デジタル温度計の先端を水中に入れて固定した。続いて、水に氷を入れ、約５度まで水温を下げた。続いて、−２０℃で一晩保存した毛細管を温度計等の棒状のものにテープ等で取り付け、水中に浸した。続いて、ホットスターラーを用いて、ビーカー内の水が２分間に約１℃上昇するくらいの程度で撹拌しながら加熱した。続いて、毛細管中の脂質が融解し、毛細管内で１ｃｍ上昇したときのデジタル温度計の温度を融点として記録した。６本の平均値を算出し、脂質の融点とした。結果を図３に示す。

【0060】

図３から、熟成開始から１０日目の胞子付着布を巻きつけたブロック肉では、熟成開始から０日目のブロック肉及び熟成開始から１０日目のコントロール布を巻きつけたブロック肉に対して、有意に融点が下がることが明らかとなった。これは、菌の増殖に伴い、脂肪酸の鎖長（炭素数）が短くなる（少なくなる）、又は脂肪酸の不飽和度が高くなる（炭素間の２重結合が増える）等、脂肪酸の組成が変化したためであると推察できる。次に、脂肪酸の組成の変化の有無を確かめるために、総脂肪酸の組成を分析した。

【0061】

（５−４）総脂肪酸組成の分析
各熟成肉に含まれる脂質を、総脂肪酸として抽出し、メチルエステル化した後、ＧＣ−ＭＳにより分析した。方法を以下に示す。

【0062】

（５−４−ａ）熟成肉からの総脂肪酸の抽出
熟成開始から０日目の牛ブロック肉、及び肉表面をトリミングした熟成開始から１０日目のブロック肉（コントロール布及び胞子付着布で製造したもの）をカットし、液体窒素で急冷し、一度−８５℃で凍結保存した後、解凍した試料を総脂肪酸の抽出操作に用いた。続いて、ミンチ状に破砕した１．０ｇの肉試料、０．５ｇのピロガロール、５粒の沸騰石（ナカライテスク社製）、及び５０ｍＬの１Ｍ水酸化カリウム／エタノール溶液を２００ｍＬのナス型フラスコに加えたものを３点用意した。これにリービッヒ冷却管を装着し、マントルヒーターで加温しながら、３０分間沸騰させた。続いて、ナス型フラスコ内の試料液が室温になった後に、１５０ｍＬの蒸留水を加えた。続いて、３０％（ｖ／ｖ）硫酸を用いて、ｐＨを２に調整し、５００ｍＬの分液ロートに移した。５０ｍＬのジエチルエーテル−ヘキサン（体積比＝１：１）を加えて、５分間振とう抽出し、下層を除去した。さらに、これを繰り返した。続いて、上層（有機溶媒層）に４０ｍＬの蒸留水を加え、５分間振とう抽出し、下層を除去した。さらに、これを３回繰り返した。続いて、上層（有機溶媒層）を２００ｍＬの三角フラスコに移し、硫酸ナトリウムを適当量加えて撹拌し、残存している水分を有機溶媒層から除去した。続いて、脱脂綿及びガラスロートを用いてろ過し、ろ液を２００ｍＬのナス型フラスコに移した。続いて、ロータリーバキュームエバポレーター（Ｎ−１型、東京理化器機械（株）社製）を用いて溶媒を除去した。得られた固形分を５ｍＬのヘキサンに溶解し、１０ｍＬのキャップ付ガラス試験管に移した。

【0063】

（５−４−ｂ）メチルエステル化及びＧＣ−ＭＳ分析
続いて、（５−４−ａ）で調製した総脂肪酸１ｍＬを１０ｍＬのキャップ付ガラス試験管に移し、Ｎ_２ガスで溶媒を除去した。続いて、１ｍＬの三ふっ化ほう素メタノール錯体メタノール溶液（ガスクロマトグラフ用、和光純薬工業（株）社製）を加え、１００℃で７分間、ときどき撹拌しながら加熱した。続いて、流水で室温まで冷却し、１．５ｍＬのヘキサンを加え、３０秒間激しく振とうして撹拌し（以下、「振とう抽出」と呼ぶ。）、２．５ｍＬの飽和塩化ナトリウム溶液（３．５ｇの塩化ナトリウム／１０ｍＬ蒸留水）を加え、同様に振とう抽出した。続いて、遠心分離（７００×ｇ、２分間）後、上層（ヘキサン層）を回収した。残った下層にさらに１ｍＬのヘキサンを加え、同様に振とう抽出し、上層を先ほど回収した上層に合わせて回収した。なお、試薬又は溶液類を加える操作毎に、試験管内の気相をＮ_２ガスで置換してから、次の操作を行った。回収した上層を総脂肪酸として、ＧＣ−ＭＳ（ＧＣＭＳ−ＱＰ２０１０ ＳＥ、（株）島津製作所社製）を用いて、脂肪酸組成を分析した。ＧＣ−ＭＳの分析条件は、キャリアガスにＨｅガス、Ｒｔｘ−５ＭＳカラムを用い、カラム流量２００ｍＬ／分、カラムオーブン温度は６０℃、気化室温度２５０℃、６０℃１分保持した後、６℃／１分の昇温条件で１６０℃までカラム温度を上昇させた後、４℃／1分の昇温条件で２４０℃まで昇温した後、２４０℃で１０分間保持した。結果を図４（Ａ）〜（Ｄ）に示す。図４（Ａ）において、Ｃ_１６＋Ｃ_１７＋Ｃ_１８とは、炭素数が１６、１７及び１８である飽和脂肪酸（それぞれパルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸）の総量を示している。また、図４（Ｂ）において、Ｃ_１４は、炭素数が１４である飽和脂肪酸（ミリスチン酸）の総量を示している。また、図４（Ｃ）において、Ｃ_１６：１は、炭素数が１６であり、二重結合を一つ有する脂肪酸（パルミトレイン酸）の総量を示している。また、図４（Ｄ）において、Ｃ_１８：１は、炭素数が１８であり、二重結合を一つ有する脂肪酸（オレイン酸及びバクセン酸）の総量を示している。

【0064】

図４から、熟成開始から１０日目の胞子付着布を巻きつけたブロック肉では、鎖長（炭素数）の長い（多い）脂肪酸が減少し、鎖長の短い脂肪酸が増加することが明らかとなった。また、熟成開始から１０日目の胞子付着布を巻きつけたブロック肉では、熟成開始から０日目のブロック肉及び熟成開始から１０日目のコントロール布を巻きつけたブロック肉に対して、不飽和脂肪酸が有意に増加することが明らかとなった。

【0065】

（５−５）熟成肉のテクスチャーの分析
熟成開始から０日目の牛ブロック肉、及び肉表面をトリミングした熟成開始から１０日目のブロック肉（コントロール布及び胞子付着布で製造したもの）を、筋繊維の伸びている方向に平行になるように、厚さ１ｃｍ、２．５ｃｍ四方に切り分けた。各肉について、１０サンプルずつ用意した。続いて、切り分けた肉を、Ｒｈｅｏｎｅｒ ＩＩ クリープメーターＲＥ２−３３００５ Ｓ（（株）山電社製）の試料台に乗せた。続いて、治具として円柱型（φ５ｍｍ）を用い、治具の肉への接触面には、可能な限り脂肪の塊が接触しないように肉を置いた。続いて、治具を肉表面に接触させ、肉の厚み（歪率０％）を測定した後、１ｍｍ／秒で試料台を歪率９０％まで上昇させた。試料台の上昇に伴って発生する応力と破断点をモニターし、歪率６０％における応力を「肉の歯ごたえ」の指標、また、最初の破断点が観察される歪率を「肉の噛みきり易さ（やわらかさ）」の指標として評価した。なお、各肉１０サンプルの測定値の平均値及び標準偏差を算出した。結果を図５に示す。

【0066】

図５から、熟成開始から１０日目のブロック肉は、コントロール布及び胞子付着布で製造したもの共に、肉が硬くなり歯ごたえが増す傾向であった。また、熟成開始から１０日目の胞子付着布を巻きつけたブロック肉では、熟成開始から０日目のブロック肉及び熟成開始から１０日目のコントロール布を巻きつけたブロック肉に対して、有意に筋線維が切れやすく（噛みきり易く）なることが明らかとなった。

【0067】

以上のことから、本発明の製造方法によれば、従来の製造方法よりも、食肉の熟成が速く、生産性が向上することが確かめられた。

【産業上の利用可能性】

【0068】

本発明によれば、より早く、品質が安定した熟成肉を得ることができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]