特許 6671725 選択的平面照明顕微鏡法機器

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6671725

(24)【登録日】2020年3月6日

(45)【発行日】2020年3月25日

(54)【発明の名称】選択的平面照明顕微鏡法機器

(51)【国際特許分類】

   G02B 21/00 20060101AFI20200316BHJP

   G02B 21/06 20060101ALI20200316BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20200316BHJP

【ＦＩ】

   G02B21/00

   G02B21/06

   G01N21/64 E

【請求項の数】10

【全頁数】8

(21)【出願番号】特願2017-533907(P2017-533907)

(86)(22)【出願日】2015年12月8日

(65)【公表番号】特表2018-506733(P2018-506733A)

(43)【公表日】2018年3月8日

(86)【国際出願番号】US2015064512

(87)【国際公開番号】WO2016105934

(87)【国際公開日】20160630

【審査請求日】2018年11月22日

(31)【優先権主張番号】62/095,959

(32)【優先日】2014年12月23日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/109,245

(32)【優先日】2015年1月29日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】598041463

【氏名又は名称】グローバル・ライフ・サイエンシズ・ソリューションズ・ユーエスエー・エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100188558

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100154922

【弁理士】

【氏名又は名称】崔 允辰

(74)【代理人】

【識別番号】100207158

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 研二

(74)【代理人】

【識別番号】100137545

【弁理士】

【氏名又は名称】荒川 聡志

(74)【代理人】

【識別番号】100105588

【弁理士】

【氏名又は名称】小倉 博

(74)【代理人】

【識別番号】100129779

【弁理士】

【氏名又は名称】黒川 俊久

(74)【代理人】

【識別番号】100113974

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 拓人

(74)【代理人】

【識別番号】100115462

【弁理士】

【氏名又は名称】小島 猛

(74)【代理人】

【識別番号】100151286

【弁理士】

【氏名又は名称】澤木 亮一

(72)【発明者】

【氏名】クーパー，ジェレミー・アール

【審査官】 下村 一石

(56)【参考文献】

【文献】 独国特許出願公開第１０２０１２１１００７７（ＤＥ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１４／０１２６０４６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開平０５−１１９２６６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１１／０１１５８９５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１４／０３２０６０１（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０２Ｂ２１／００

Ｇ０２Ｂ２１／０６−２１／３６

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料支持部（１２０）の下方に取り付けられて使用時に前記試料支持部（１２０）で光の線または平面を提供する反転照明対物レンズ（１１０）と、前記支持部（１２０）の上方に取り付けられた第１の画像収集対物レンズ（１３０）及び第２の画像収集対物レンズ（１４０）と、を含み、前記反転照明対物レンズ（１１０）は、照明対物レンズ光軸（１１１）を有し、前記第１の画像収集対物レンズ（１３０）及び前記第２の画像収集対物レンズ（１４０）のそれぞれは、画像収集対物レンズ光軸（１３１）及び画像像収集対物レンズ光軸（１４１）を有する、選択的平面照明を提供する光学配置（１００）であって、切り替え可能な照明光（１３２）及び照明光（１４２）は、前記照明対物レンズ光軸（１１１）に対して互に平行であると共に前記照明対物レンズ光軸（１１１）に対してそれぞれ横方向にオフセットされて前記照明対物レンズ（１１０）に向かって伝搬するように構成され、それにより前記照明対物レンズ（１１０）から出る前記照明光（１３２）及び前記照明光（１４２）は、前記照明対物レンズ光軸（１１１）に対して斜めの角度で前記試料支持部（１２０）に向かって伝搬し、前記画像収集対物レンズ光軸（１３１）及び前記画像像収集対物レンズ光軸（１４１）はそれぞれ、前記照明対物レンズ光軸（１１１）に対して鈍角である角度αを成しており、前記試料支持部（１２０）で伝搬する光にほぼ垂直である、光学配置（１００）。

【請求項2】

前記角度αが、１００〜１７０度である、請求項１に記載の光学配置（１００）。

【請求項3】

前記照明光（１３２）及び前記照明光（１４２）が、前記第１または第２の画像収集対物レンズ（１３０，１４０）に交互に画像光を提供するように、それぞれの第１および第２の経路に沿って前記照明対物レンズ光軸（１１１）に対して互いに反対側に交互に伝搬するように構成される、請求項１または２に記載の光学配置（１００）。

【請求項4】

前記照明光（１３２）及び前記照明光（１４２）が、コヒーレント光であり、前記光学配置（１００）がさらに、光線に集光した、またはコリメートされた光の平面またはシートの形態の前記照明光（１３２）及び前記照明光（１４２）を提供する光学マニピュレータを含む、請求項１、２または３に記載の光学配置（１００）。

【請求項5】

試料を照明してＳＰＩＭを提供する方法であって、
ａ）請求項３または４に記載の光学配置（１００）を提供するステップと、
ｂ）コヒーレントな照明光（１３２）及び照明光（１４２）を照明の方向に伝搬させるステップと、
ｃ）前記第１および第２の画像収集対物レンズ（１３０，１４０）によって収集された１つまたは複数の画像を捕捉するステップと、
を含む、方法。

【請求項6】

請求項１〜４のいずれか１項に記載の光学配置（１００）を含む、ＳＰＩＭ機器（１０）。

【請求項7】

ＳＩＭ、ＴＩＲＦおよびＰＫ顕微鏡法技術の任意の１つまたは複数をさらに実行するように適合可能な、請求項６に記載のＳＰＩＭ機器（１０）。

【請求項8】

前記照明対物レンズ（１１０）と前記試料支持部（１２０）との間に空間があり、前記空間が、液体によって架橋される、請求項６または７に記載のＳＰＩＭ機器（１０）。

【請求項9】

前記試料支持部（１２０）が、好ましくは連続動作で前記照明対物レンズ光軸（１１１）に垂直に移動可能である、請求項６、７または８に記載のＳＰＩＭ機器（１０）。

【請求項10】

照明対物レンズ光軸（１１１）を有する照明対物レンズ（１１０）と、前記照明対物レンズ光軸（１１１）に垂直な方向に前記光軸（１１１）に対して、好ましくは連続動作で移動可能な試料支持部（１２０）とを含む、ＳＰＩＭ機器（１０）。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、選択的平面照明顕微鏡法（ＳＰＩＭ）に関し、具体的には、これに限定されないが、ＳＰＩＭを含む２つ以上の顕微鏡法技術を用いるのに適合可能な顕微鏡法機器に関する。

【背景技術】

【0002】

ＳＰＩＭは、従来の顕微鏡法技術と比較して、光毒性および光退色の著しい低下による生きた動的試料の拡大撮像を可能にする蛍光顕微鏡法撮像技術である。ＳＰＩＭは、たとえばシリンドリカルレンズによって生成された励起照明（光シートと呼ばれることもある）の線または平面と、試料の光学的にセクション化された検査を可能にする垂直検出幾何学的形状を用いる。さらに、ＳＰＩＭ照明は、三次元標本の画質を大幅に向上させる、縮小された焦点外の背景信号を生成する。ＳＰＩＭの一例が、米国特許第７５５４７２５号明細書に示されている。

【0003】

ＳＰＩＭのほとんどの実装では、ＳＰＩＭシステムは標本の周りに設計されており、それにより、試料をアガロースゲルに埋めるなどの新規の試料の調製が必要となり、これは多くの従来の顕微鏡で使用されているガラスカバースリップのような従来の試料台の使用を排除する。斜面顕微鏡法（ＯＰＭ）のような他のタイプの顕微鏡法は、標本を照明して検出するために同じ対物レンズを使用し、上記の新規の試料の調製に対応することができるが、このような顕微鏡法システムは、他の方法論に比べて開口数が低く、したがって、光シートが顕微鏡の検出平面に対して傾いていることに起因する収差を補正するために広範囲の光学系を必要とする。その結果、既存の従来の顕微鏡を容易に転換してＳＰＩＭに対応することができることが望ましい。このような転換は、国際公開第２０１２１２２０２７号パンフレットに示されている。

【0004】

国際公開第２０１２１２２０２７号パンフレットに示される転換を含む、ＳＰＩＭを利用する以前の機器の有害な特徴は、２つの主要な欠点となる対物レンズの非従来的な配置である。第１に、試料の調製、試料の装填、および試料の取り出しは、煩雑で困難である。以前の試みは、これらに限定されないが、ＳＩＭ（構造化照明顕微鏡法）およびＴＩＲＦ（全反射蛍光顕微鏡法）を含む他の強力な顕微鏡法撮像モードの撮像機能を維持するために、従来の機器を適合させることはできなかった。これを行う１つの方法は、照明および撮像対物レンズの光軸を再配置することである。このような再配置における１つの試みが、米国特許第８４７２１１３号明細書に示されている。しかし、米国特許第８４７２１１３号明細書および国際公開第２０１２１２２０２７号パンフレットに示される配置は、上方からの照明を使用し、その結果、取り扱い空間が非常に限定されるので、試料の装填および取り出しを妨げる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】米国特許出願公開第２０１２／００９８９４９Ａ１号明細書

【発明の概要】

【0006】

一態様によれば、本発明は、試料支持部の下方に取り付けられて使用時に試料支持部で光の線または平面を提供する反転照明対物レンズと、支持部の上方に取り付けられた少なくとも１つの画像収集対物レンズとを含み、前記反転照明対物レンズは、照明対物レンズ光軸を有し、前記画像収集対物レンズは、画像収集対物レンズ光軸を有する、選択的平面照明を提供する光学配置を提供し、照明光は、照明対物レンズ光軸に対して横方向にオフセットされた照明対物レンズに向かって伝搬するように構成され、それにより照明対物レンズから出る照明光は、照明対物レンズ光軸に対して斜めの角度で試料支持部に向かって伝搬し、画像対物レンズ光軸は、照明対物レンズ光軸に鈍角であり、試料支持部で伝搬する光にほぼ垂直である角度αを有する。

【0007】

したがって、光学配置は、照明が下方からのものであり、これは他の高解像度顕微鏡法機器を簡便に適合させることを可能にする。本明細書に記載の実施形態の主要な進歩は、追加の蛍光顕微鏡法撮像モードに容易に適合可能な反転構成に配置された、従来の油または水浸対物レンズを使用するＳＰＩＭの提供である。また、撮像光学系は、簡便な試料の調製のために途中で上に移動させることができ、または調製された試料の装填／取り出しを容易にすることができる。

【0008】

改良形態では、照明対物レンズ光軸の各側に一対の撮像対物レンズを用いて、三次元試料の容積全体にわたって等方性高解像度撮像を行うことができる。

【0009】

第２の態様によれば、本発明は、照明対物レンズ光軸を有する照明対物レンズと、照明対物レンズ光軸に垂直な方向に前記軸に対して移動可能な、好ましくは連続動作で移動可能な試料支持部とを含むＳＰＩＭ顕微鏡法機器を提供する。

【0010】

本発明は、請求項１に従属する請求項によって定義される好ましい特徴を有する、請求項１に記載の光学配置を提供する。本発明はまた、請求項５によって定義される試料を照明する方法、および請求項６〜９に記載の顕微鏡法機器を提供する。本発明はまた、請求項１０に記載のＳＰＩＭ機器を提供する。

【0011】

本発明は、このような組み合わせが本明細書において明示的に言及されているか否かに関わらず、本明細書で開示される特徴の任意の組み合わせにまで及ぶ。さらに、２つ以上の特徴が組み合わされて言及される場合、このような特徴は、本発明の範囲を拡張することなく、別個に特許請求され得ることが意図される。

【0012】

本発明は、多数の方法で実施することができ、その例示的な実施形態を図面を参照して以下に説明する。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1a】ＳＰＩＭの光学配置の概略図である。

【図1b】図１ａの光学配置を用いる顕微鏡法機器を示す図である。

【図2】図１ａに示す光学配置の第１の光ビーム経路モデルを示す図である。

【図3】図１ａに示す光学配置の第２の光ビーム経路モデルを示す図である。

【図4】移動する試料支持部を用いる概略図である。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本発明は、その目的およびその利点と共に、以下の説明を添付の図面と併せて参照することによってより理解することができ、図中の同様の参照符号は同様の要素を指す。

【0015】

図１ａを参照すると、光学配置１００が断面図で概略的に示されており、ＳＰＩＭ機器１０が図１ａの光学配置を組み込んで図１ｂに示されている。ＳＰＩＭ照明対物レンズ１１０が示されており、これは光の線、または平面／シート（本明細書では線と呼ばれる）を提供し、線は、紙に垂直な方向に紙へと延びる。照明対物レンズ１１０は、高解像度および超解像度蛍光顕微鏡の通常の構成に適合するように、反転構成で試料支持部１２０の下方に配置される。照明対物レンズ１１０は、照明対物レンズ光軸１１１を有する。２つの別個の画像収集対物レンズ１３０および１４０が、試料支持部１２０の上方に配置され、それぞれ画像収集対物レンズ光軸１３１および１４１を有する。照明対物レンズ光軸と画像収集対物レンズ光軸１３１および１４１の各々との間の角度αは、約１３５度である。したがって、画像収集対物レンズの光軸１３１および１４１は、反転照明対物レンズの光軸１１１に対して＋１３５度および−１３５度にある。

【0016】

使用時には、光線の形態のコヒーレントレーザ光ビーム１３２，１４２が、交互に照明対物レンズ１１０に向かって導かれる。各ビームは平行であるが、光軸１１１に対して距離ｘだけ横方向にオフセットされており、それにより各ビームは、対物レンズ１１０で屈折され、試料支持部１２０の試料保持領域１２２において光軸１１１に対して斜めに伝搬する。

【0017】

試料Ｓは、試料領域１２２においてビーム１３２および１４２の斜め位相によって照明することができる。照明線は、試料を通るセクションを選択的に照明するために使用され、拡散画像光は、ビーム１３２および１４２の光線の伝搬方向にほぼ垂直に取り付けられたそれぞれの画像収集対物レンズ１３０および１４０によって収集され、それにより光線は、一般に、画像収集対物レンズの焦点面にとどまるようになる。

【0018】

二重画像収集対物レンズ１３０および１４０の目的は、三次元試料の容積全体にわたって等方性高解像度撮像を行うことである。構造化された画像は、左と右の照明の両方からの一連の画像から作製することができる。

【0019】

上述の光学配置は、反転対物レンズ１１０を通って上向きに、レンズの光軸１１１に対してわずかな横方向のオフセットｘで伝播する細い照明線を提供し、それによりレンズを出るビームは、画像収集対物レンズ１３０または１４０の焦点面の角度に正確に偏向される。すなわち、画像収集対物レンズの光軸１３１および１４１に直交する。このようにして、撮像レンズに対して焦点が合っている試料の薄いセクションのみが、照明ビーム１３２または１４２によって励起される。画像収集対物レンズ１３０および１４０の両方に照明を提供するために、照明ビームの前述の横方向のオフセットｘは、反転照明対物レンズ１１０の光軸１１１の同一側および反対側にある２つの別々の横方向のオフセット位置の間で交互になる。２つの別々の横方向のオフセット位置の間のビームの切り替えは、これらに限定されないが、ガルボミラー、ピエゾミラー、またはフリッパミラーを含む光学−機械的スイッチング機構などの様々な光マニピュレータによって達成することができる。同様に、試料平面の視界全体にわたるビームの走査は、これらに限定されないが、ガルボミラー、ピエゾミラー、または回転多面鏡を含む様々な光学−機械的走査機構によって達成することができる。照明モード（ＳＰＩＭ、ＳＩＭ、ＴＩＲＦ、ＰＫなど）間の切り替えは、たとえば、その内容が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３０７４０３３Ａ１号パンフレットに以前に記載されているように、各支持されるモードの関連するビーム迂回経路で、ガルボミラーからの多重反射を利用することによって達成することができる。

【0020】

図２および図３は、２つの照明ビーム経路１３２および１４２のビーム経路モデルを示しており、具体的には、画像収集対物レンズが、照明経路にほぼ垂直な試料領域１２２から伝搬する光を収集することを示している。

【0021】

図４は、光学配置をより詳細に示しており、本発明の第２の態様をより明確に示している。この実施形態では、試料支持部１２０は、３つの対物レンズ１１０，１３０および１４０の光軸によって画定されたＸ平面で移動可能である。この移動は、照明ビームを複数の隣接する画像平面にわたって走査する必要なしに、三次元試料容積を区切るための方法を提供する。この技術は、試料支持部１２０の移動を伴い、これは好ましくは線形摺動路、または２つの直交して対向する摺動路および電動モータ駆動装置（複数化）によって行われる。走査は、試料を移動させることによって水平に行われる。理想的には、走査は、別々の横方向の摂動に影響を受けやすい試料媒体の振動を最小限にするために、別々のステップではなく連続的に行われる。この手法は、３つの明確な利点を有する。第１に、これは照明ビームの走査制御機構の数を低減する。第２に、これは走査中に画像収集対物レンズの光学−機械的深度制御を行う必要を排除する。これらの最初の２つの利点は、光学−機械的システム設計を大幅に簡略化すると同時に、システムの安定性および配向性も改善する。第３の利点は、提案された試料の水平走査が、線虫（ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）のような細長い標本に対応するために、１つの横軸に沿って無制限の視界を可能にするという機能的なものである。このＳＰＩＭ光学配置を他の公知の高解像度顕微鏡法技術に適合させるために、試料支持部１２０と照明対物レンズ１１０との間の空間は、流体、この場合は浸漬油１２４によって架橋される。

【0022】

２つの実施形態を説明し図示してきたが、特許請求される本発明の範囲から逸脱することなく、それらの実施形態に追加、省略、および修正が可能であることは当業者には明らかであろう。たとえば、光軸１１１および１３１、または軸１１１および１４１の間の角度αは、原則として約１００度〜約１７０度の範囲内のどこでもよいが、１３５度は最大の集光能力を支持するので最適と考えられ、１２５〜１４５度が満足できるものである。

【符号の説明】

【0023】

１０ ＳＰＩＭ機器
１００ 光学配置
１１０ ＳＰＩＭ照明対物レンズ、反転照明対物レンズ
１１１ 照明対物レンズ光軸
１２０ 試料支持部
１２２ 試料保持領域
１２４ 浸漬油
１３０ 画像収集対物レンズ
１３１ 画像収集対物レンズ光軸
１３２ コヒーレントレーザ光ビーム、照明ビーム、照明ビーム経路
１４０ 画像収集対物レンズ
１４１ 光軸
１４２ コヒーレントレーザ光ビーム、照明ビーム、照明ビーム経路

【図1a】

【図1b】

【図2】

【図3】

【図4】