特許 6672353 免疫測定方法及びそれに用いられる免疫測定用キット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6672353

(24)【登録日】2020年3月6日

(45)【発行日】2020年3月25日

(54)【発明の名称】免疫測定方法及びそれに用いられる免疫測定用キット

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/531 20060101AFI20200316BHJP

   G01N 33/552 20060101ALI20200316BHJP

   G01N 33/553 20060101ALI20200316BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/531 B

   G01N33/552

   G01N33/553

【請求項の数】6

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2018-25538(P2018-25538)

(22)【出願日】2018年2月16日

(65)【公開番号】特開2018-141779(P2018-141779A)

(43)【公開日】2018年9月13日

【審査請求日】2019年3月7日

(31)【優先権主張番号】特願2017-32862(P2017-32862)

(32)【優先日】2017年2月24日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000002288

【氏名又は名称】三洋化成工業株式会社

(72)【発明者】

【氏名】北川 隆啓

(72)【発明者】

【氏名】伴野 由季

【審査官】 三木 隆

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１６−１０５０６６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０６−２３５７３０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１６−１９４４４５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１７／００３０９０１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開２００４−１７７４０２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１３−２１０３９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１０−３３２６９７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 東西田奈都子，糖系非イオン性界面活性剤アルキルグルコシドの特性と応用，オレオサイエンス，２０１４年，Vol.14 No.11，Page.473-477

【文献】 深田和宏，糖型界面活性剤，日本油化学会誌，２０００年，Vol.49 No.10，Page.1035-1040

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／５３１

Ｇ０１Ｎ ３３／５５２

Ｇ０１Ｎ ３３／５５３

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

親水部が単糖（ａ）であるアルキルグリコシド（Ａ）の存在下で、固相担体としての磁性粒子（Ｂ）を用いて免疫反応を行う免疫測定方法。

【請求項2】

アルキルグリコシド（Ａ）が、疎水部として炭素数６〜３６のアルキル基を有するアルキルグリコシドである請求項１記載の免疫測定方法。

【請求項3】

アルキルグリコシド（Ａ）の濃度が０．００１〜５重量％の溶液中で免疫反応を行う請求項１又は２記載の免疫測定方法。

【請求項4】

磁性粒子（Ｂ）が、表面に抗原（Ｃ）又は抗体（Ｄ）を固定化した磁性粒子（Ｂ１）である請求項１〜３のいずれか記載の免疫測定方法。

【請求項5】

磁性粒子（Ｂ）が、体積平均粒子径が１〜２０ｎｍの超常磁性金属酸化物を６０〜９５重量％含有する磁性シリカ粒子である請求項１〜４のいずれか記載の免疫測定方法。

【請求項6】

固相担体試薬（Ｅ）及び標識試薬（Ｆ）を含む免疫測定用キットであって、固相担体試薬（Ｅ）が表面に抗原（Ｃ）又は抗体（Ｄ）を固定化した磁性粒子（Ｂ）を含有し、標識試薬（Ｆ）が標識物質により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ１）又は標識物質により標識された測定対象物質（Ｆ２）を含有し、固相担体試薬（Ｅ）又は標識試薬（Ｆ）の少なくともいずれか一方が親水部が単糖（ａ）であるアルキルグリコシド（Ａ）を含有する請求項１記載の免疫測定方法に用いられる免疫測定用キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、免疫測定方法及びこれに用いられる免疫測定用キットに関する。

【背景技術】

【0002】

免疫測定においては、血清検体を測定する際に、反応容器、固相担体表面及び固相担体表面に固定化した物質への検体由来の成分の非特異的な反応が特定の検体でみられ、これらの非特異反応が正確な測定を行う妨げとなり、問題となっている（例えば、非特許文献１）。非特異的反応を防止するため、種々の蛋白質、界面活性剤又は塩類等を含有させた免疫測定用試薬が提案されている（例えば、特許文献１〜３）。

【0003】

また、磁性粒子を用いた免疫測定においては、磁性粒子の表面に結合した抗体や抗原により磁力で粒子を回収した際に粒子同士が凝集し、再び分散させることが困難となることがある。その結果、凝集する粒子が存在する等の影響により測定値にばらつきが生じやすく、再現性が悪化する場合があり、特許文献１〜３に記載の方法では十分に対応できないという問題がある。また、多数検体同時迅速検査を目的とした自動化免疫測定装置の開発においては、再現性の良好な免疫測定用試薬の開発がますます重要な課題となっている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．２，Ｐ２０８−２１３，２０１１

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開２００４−１１７３４１号公報

【特許文献2】特開２０１０−１２７８２７号公報

【特許文献3】特開２０１０−２１６９７０号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明の目的は、固相担体表面、固相担体に固定化した物質及び反応容器内壁への検体由来の成分や標識物質の非特異的反応を効果的に減少させ、更に磁性粒子の分散性を向上させることにより高感度かつ再現性に優れた免疫測定方法及び免疫測定キットを提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は、親水部が単糖（ａ）であるアルキルグリコシド（Ａ）の存在下で、固相担体としての磁性粒子（Ｂ）を用いて免疫反応を行う免疫測定方法；固相担体試薬（Ｅ）及び標識試薬（Ｆ）を含む免疫測定用キットであって、固相担体試薬（Ｅ）が表面に抗原（Ｃ）又は抗体（Ｄ）を固定化した磁性粒子（Ｂ）を含有し、標識試薬（Ｆ）が標識物質により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ１）又は標識物質により標識された測定対象物質（Ｆ２）を含有し、固相担体試薬（Ｅ）又は標識試薬（Ｆ）の少なくともいずれか一方が親水部が単糖（ａ）であるアルキルグリコシド（Ａ）を含有する前記免疫測定方法に用いられる免疫測定用キットである。

【発明の効果】

【0008】

本発明の免疫測定方法を用いることにより、高感度かつ再現性高く測定対象物質を測定することができる。

【発明を実施するための形態】

【0009】

＜免疫測定方法＞
本発明の免疫測定方法は、親水部が単糖（ａ）であるアルキルグリコシド（Ａ）の存在下で、固相担体としての磁性粒子（Ｂ）を用いて免疫反応を行うことを特徴とする免疫測定方法である。
免疫反応を親水部が単糖（ａ）であるアルキルグリコシド（Ａ）の存在下で行うことにより、高感度かつ再現性に優れた測定が可能となる。

【0010】

本発明におけるアルキルグリコシド（Ａ）は、単糖（ａ）とアルキルアルコール又はアルキルチオールとがグリコシド結合したものである。
単糖（ａ）としては、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース及びヘプトース等が挙げられるが、再現性の観点から、ヘキソースが好ましい。
ヘキソースとしては、ケトヘキソース（フルクトース等）、アルドヘキソース（グルコース、マンノース及びガラクトース等）及びデオキシ糖（フコース、フクロース及びラムノース等）等が挙げられる。
これらの内、再現性の観点から、ヘキソースが好ましく、更に好ましいのはアルドヘキソース、特に好ましいのはグルコースである。

【0011】

アルキルアルコールとしては、炭素数６〜３６のアルキル基を有するアルコール［直鎖アルキル基を有するアルコール（ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール、ウンデシルアルコール、ラウリルアルコール、トリデシルアルコール、ミリスチルアルコール、ペンタデシルアルコール、テトラデシルアルコール、ヘキサデシルアルコール、オクタデシルアルコール、ノナデシルアルコール及びベヘニルアルコール等の飽和直鎖アルキル基を有するもの、オクテニルアルコール、デセニルアルコール、ドデセニルアルコール、トリデセニルアルコール、ペンタデセニルアルコール、オレイルアルコール、ガドレイルアルコール及びリノレイルアルコール等の不飽和直鎖アルキル基を有するもの等）及び分岐アルキル基を有するアルコール（イソステアリルアルコール等）］等が挙げられる。
これらの内、溶解度及び洗浄性の観点から、炭素数６〜３６の直鎖アルキル基を有するアルコールが好ましく、更に好ましいのは炭素数６〜１８の直鎖アルキル基を有するアルコールである。

【0012】

アルキルチオールとしては、炭素数６〜３６のアルキル基を有するチオール［直鎖アルキル基を有するチオール｛ヘキシルチオール、オクチルチオール、ノニルチオール、デシルチオール（デカンチオール）、ウンデシルチオール、ドデシルチオール（ドデカンチオール）、テトラデシルチオール（テトラデカンチオール）、ヘキサデカンチオール及びオクタデシルチオール等の飽和直鎖アルキル基を有するもの、７−オクテン−１−チオール及び９−デセンー１−チオール等の不飽和直鎖アルキル基を有するもの等｝及び分岐アルキル基を有するチオール（ｔ−ドデカンチオール等）］等が挙げられる。
これらの内、溶解度及び洗浄性の観点から、炭素数６〜３６の直鎖アルキル基を有するチオールが好ましく、更に好ましいのは炭素数６〜１８の直鎖アルキル基を有するチオールである。

【0013】

アルキルグリコシド（Ａ）の具体例としては、Ｏ−グリコシド結合を有するもの（炭素数６〜３６のアルキル基を有するもの、具体的には、ｎ−ヘキシルβ−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ヘプチルβ−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ノニルβ−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−デシルβ−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ドデシルβ−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−テトラデシルβ−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ヘキサデシルβ−Ｄ−グルコピラノシド及びｎ−オクタデシルβ−Ｄ−グルコピラノシド等）及びＳ−グリコシド結合を有するもの（炭素数６〜３６のアルキル基を有するもの、具体的には、ｎ−ヘキシルβ−Ｄ−チオグリコシド、ｎ−ヘプチルβ−Ｄ−チオグリコシド、ｎ−オクチルβ−Ｄ−チオグリコシド、ｎ−ノニルβ−Ｄ−チオグリコシド、ｎ−デシルβ−Ｄ−チオグリコシド、ｎ−ドデシルβ−Ｄ−チオグリコシド、ｎ−テトラデシルβ−Ｄ−チオグリコシド、ｎ−ヘキサデシルβ−Ｄ−チオグリコシド及びｎ−オクタデシルβ−Ｄ−チオグリコシド等）等が挙げられる。

【0014】

（Ａ）としては、感度及び再現性の観点から、疎水部として炭素数６〜３６のアルキル基を有するアルキルグリコシドが好ましく、更に好ましいのは炭素数６〜１８の直鎖アルキル基を有するアルキルグリコシドであり、特に好ましいのは炭素数６〜１８の直鎖アルキル基を有しＯ−グリコシド結合を有するアルキルグリコシドである。アルキルグリコシド（Ａ）は、１種を単独で用いても２種以上を併用してもよい。

【0015】

本発明の免疫測定方法には、固相担体試薬（Ｅ）及び標識試薬（Ｆ）が用いられる。
本発明における固相担体としての磁性粒子（Ｂ）は、その表面に抗原（Ｃ）又は抗体（Ｄ）を固定化した磁性粒子（Ｂ１）として固相担体試薬（Ｅ）に用いられる。

【0016】

磁性粒子（Ｂ）は、一般的に免疫測定の分野で用いられるものであれば特に限定はされないが、免疫測定における測定時間の短時間化の観点から、特開２０１４−２１０６８０号公報及び特開２０１３−０１９８８９号公報等に記載の磁性シリカ粒子が好ましい。

【0017】

固相担体として磁性粒子（Ｂ）を用いる場合、磁石による集磁及び分散が繰り返されるが、分散性が悪い場合、凝集する粒子が存在する等の影響により測定値にばらつきが生じやすく、再現性が低下する。一方、免疫測定時にアルキルグリコシド（Ａ）を使用ことにより、磁性粒子の分散性が良好となり、再現性を向上させることができる。

【0018】

磁性シリカ粒子としては、免疫測定において測定時間の短時間化の観点から、シリカのマトリックス中に体積平均粒子径が１〜２０ｎｍで超常磁性を有する金属酸化物が分散されているものが好ましい。超常磁性とは、外部磁場の存在下で物質の個々の原子磁気モーメントが整列し誘発された一時的な磁場を示し、外部磁場を取り除くと、部分的な整列が損なわれ磁場を示さなくなることをいう。
尚、本発明における金属酸化物及び磁性シリカ粒子の体積平均粒子径は、任意の２００個の粒子について走査型電子顕微鏡（日本電子株式会社製「ＪＳＭ−７０００Ｆ」）で観察して測定された粒子径の平均値である。

【0019】

体積平均粒子径が１〜２０ｎｍで超常磁性を示す超常磁性金属酸化物としては、鉄、コバルト、ニッケル及びこれらの合金等の酸化物が挙げられるが、磁界に対する感応性が優れていることから、酸化鉄が特に好ましい。超常磁性金属酸化物は、１種を単独で用いても２種以上を併用してもよい。

【0020】

磁性シリカ粒子中の超常磁性金属酸化物の含有量の下限は、６０重量％が好ましく、更に好ましくは６５重量％であり、上限は９５重量％が好ましく、更に好ましくは８０重量％である。
超常磁性金属酸化物の含有量が６０重量％以上であると、得られた磁性シリカ粒子の磁性が十分であるため、実際の用途面における分離操作に時間がかからない。９５重量％以下のものは合成が容易である。
尚、磁性シリカ粒子中の超常磁性金属酸化物の含有量が上記範囲であると、磁性が強いため、磁石による集磁及び分散が繰り返されることによる測定値のばらつきが更に起こりやすくなるが、このような場合でも免疫測定時にアルキルグリコシド（Ａ）を使用することにより、磁性シリカ粒子の分散性が良好となり、再現性を向上させることができる。

【0021】

本発明における抗原（Ｃ）としては、一般的に免疫測定の分野で用いられるものであれば特に限定はされず、具体的には、ヌクレオチド鎖（オリゴヌクレオチド鎖、ポリヌクレオチド鎖）；染色体；ペプチド鎖（例えばＣ−ペプチド、アンジオテンシンＩ等）、タンパク質〔例えばプロカルシトニン、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）、β２−ミクログロブリン、アルブミン、これらの分解産物、フェリチン等の血清タンパク質〕；酵素〔例えばアミラーゼ（例えば膵型、唾液腺型、Ｘ型等）、アルカリホスファターゼ（例えば肝性、骨性、胎盤性、小腸性等）、酸性ホスファターゼ（例えばＰＡＰ等）、γ−グルタミルトランスファラーゼ（例えば腎性、膵性、肝性等）、リパーゼ（例えば膵型、胃型等）、クレアチンキナーゼ（例えばＣＫ−１、ＣＫ−２、ｍＣＫ等）、乳酸脱水素酵素（例えばＬＤＨ１〜ＬＤＨ５等）、グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（例えばＡＳＴｍ、ＡＳＴｓ等）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（例えばＡＬＴｍ、ＡＬＴｓ等）、コリンエステラーゼ（例えばＣｈＥ１〜ＣｈＥ５等）、ロイシンアミノペプチダーゼ（例えばＣ−ＬＡＰ、ＡＡ、ＣＡＰ等）、レニン、プロテインキナーゼ、チロシンキナーゼ等〕及びこれら酵素のインヒビター、ホルモン（例えばＰＴＨ、ＴＳＨ、インシュリン、ＬＨ、ＦＳＨ、プロラクチン等）、レセプター（例えばエストロゲン、ＴＳＨ等に対するレセプター）；リガンド（例えばエストロゲン、ＴＳＨ等）；例えば細菌（例えば結核菌、肺炎球菌、ジフテリア菌、髄膜炎菌、淋菌、ブドウ球菌、レンサ球菌、腸内細菌、大腸菌、ヘリコバクター・ピロリ等）、ウイルス（例えばルベラウイルス、ヘルペスウイルス、肝炎ウイルス、ＡＴＬウイルス、ＡＩＤＳウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、ポリオウイルス、ＥＢウイルス、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ等）、真菌（例えばカンジダ、クリプトコッカス等）、スピロヘータ（例えばレプトスピラ、梅毒トレポネーマ等）、クラミジア、マイコプラズマ等の微生物；当該微生物に由来するタンパク質又はペプチド或いは糖鎖抗原；気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎等のアレルギーの原因となる各種アレルゲン（例えばハウスダスト、例えばコナヒョウダニ、ヤケヒョウダニ等のダニ類、例えばスギ、ヒノキ、スズメノヒエ、ブタクサ、オオアワガエリ、ハルガヤ、ライムギ等の花粉、例えばネコ、イヌ、カニ等の動物、例えば米、卵白等の食物、真菌、昆虫、木材、薬剤、化学物質等に由来するアレルゲン等）；脂質（例えばリポタンパク質等）；プロテアーゼ（例えばトリプシン、プラスミン、セリンプロテアーゼ等）；腫瘍マーカータンパク抗原（例えばＰＳＡ、ＰＧＩ、ＰＧＩＩ等）；糖鎖抗原〔例えばＡＦＰ（例えばＬ１からＬ３等）、ｈＣＧ（ｈＣＧファミリー）、トランスフェリン、ＩｇＧ、サイログロブリン、Ｄｅｃａｙ−ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ−ｆａｃｔｏｒ（ＤＡＦ）、癌胎児性抗原（例えばＣＥＡ、ＮＣＡ、ＮＣＡ−２、ＮＦＡ等）、ＣＡ１９−９、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ、ＣＡ１２５、前立腺特異抗原、癌細胞が産生する特殊な糖鎖を有する腫瘍マーカー糖鎖抗原、ＡＢＯ糖鎖抗原等〕；糖鎖（例えばヒアルロン酸、β−グルカン、上記糖鎖抗原等が有する糖鎖等）；糖鎖に結合するタンパク質（例えばヒアルロン酸結合タンパク、βグルカン結合タンパク等）；リン脂質（例えばカルジオリピン等）；リポ多糖（例えばエンドトキシン等）；化学物質（例えばＴ３、Ｔ４、例えばトリブチルスズ、ノニルフェノール、４−オクチルフェノール、フタル酸ジ−ｎ−ブチル、フタル酸ジシクロヘキシル、ベンゾフェノン、オクタクロロスチレン、フタル酸ジ−２−エチルヘキシル等の環境ホルモン）；人体に投与・接種される各種薬剤及びこれらの代謝物；アプタマー；核酸結合性物質等が挙げられる。

【0022】

本発明における抗体（Ｄ）としては、一般的免疫測定の分野で用いられるものであれば特に限定はされず、具体的には、抗原（Ａ）として例示したものに対する抗体が挙げられる。尚、本発明において用いられる抗体には、パパインやペプシン等の蛋白質分解酵素、或いは化学的分解により生じるＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント等の分解産物も包含される。

【0023】

本発明において、磁性粒子（Ｂ）に抗原（Ｃ）又は抗体（Ｄ）を固定化して磁性粒子（Ｂ１）とする方法としては、磁性粒子（Ｂ）に、抗原（Ｃ）又は抗体（Ｄ）を物理吸着させる方法が挙げられるが、より効率良く抗原（Ｃ）又は抗体（Ｄ）を固定化させる観点から、グルタルアルデヒド、アルブミン、カルボジイミド、ストレプトアビジン、ビオチン及び官能基を有するアルキルアルコキシシランからなる群から選ばれる少なくとも１種の有機化合物を磁性粒子（Ｂ）の表面に結合させ、それらを介して、抗原（Ｃ）又は抗体（Ｄ）を磁性粒子（Ｂ）に固定化させることが好ましく、更に好ましいのは官能基を有するアルキルアルコキシシランを介して固定化させることである。
このような官能基を有するアルキルアルコキシシランとしては、ビニルトリメトキシシラン、ビニルトリエトキシシラン、２−（３，４−エポキシシクロヘキシル）エチルトリメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、ｐ−スチリルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−２−（アミノエチル）−３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−２−（アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−トリエトキシシリル−Ｎ−（１，３−ジメチル−ブチリデン）プロピルアミン、Ｎ−フェニル−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、トリス−（トリメトキシシリルプロピル）イソシアヌレート、３−ウレイドプロピルトリアルコキシシラン、３−メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン及び３−イソシアネートプロピルトリエトキシシラン等が挙げられる。

【0024】

固相担体試薬（Ｅ）は、固相担体としての磁性粒子（Ｂ）以外に水性溶媒［水、生理食塩水、各種緩衝液（リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液及びＴｒｉｓ緩衝液等）、アルブミン溶液、デキストラン溶液、正常ヒト又は動物血清溶液及び合成高分子溶液並びにこれらの２種以上の混合溶液等］等を含有することができる。

【0025】

固相担体試薬（Ｅ）中の磁性粒子（Ｂ）の含有量は、固相担体試薬（Ｅ）の重量を基準として、粒子の洗浄性の観点から、０．０００１〜１０重量％が好ましく、更に好ましくは０．００１〜１重量％である。

【0026】

標識試薬（Ｆ）は、標識物質により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ１）又は標識物質により標識された測定対象物質（Ｆ２）を含有する。

【0027】

標識物質により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ１）及び標識物質により標識された測定対象物質（Ｆ２）における標識物質は、測定対象物質と特異的に結合する物質又は測定対象物質を標識するために用いられるものであり、例えば酵素免疫測定法（ＥＩＡ）において用いられるアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ（以下、ＰＯＤと略記することがある）、マイクロペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ルシフェラーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼ等の酵素類、例えば放射免疫測定法（ＲＩＡ）において用いられる９９ｍＴｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、１４Ｃ、３Ｈ、３２Ｐ等の放射性同位元素、例えば蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）において用いられるフルオレセイン、ダンシル、フルオレスカミン、クマリン、ナフチルアミン又はこれらの誘導体、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光性物質、例えばルシフェリン、イソルミノール、ルミノール、ビス（２，４，６−トリフロロフェニル）オキザレート等の発光性物質、例えばフェノール、ナフトール、アントラセン又はこれらの誘導体等の紫外部に吸収を有する物質、例えば４−アミノ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル、３−アミノ−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル、２，６−ジ−ｔ−ブチル−α−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−オキソ−２，５−シクロヘキサジエン−１−イリデン）−ｐ−トリオキシル等のオキシル基を有する化合物に代表されるスピンラベル化剤としての性質を有する物質等が挙げられる。
これらの内、感度等の観点から、酵素、蛍光性物質が好ましく、更に好ましいのはアルカリホスファターゼ、ＰＯＤ及びグルコースオキシダーゼであり、特に好ましいのはＰＯＤである。

【0028】

標識物質を測定対象物質と特異的に結合する物質又は測定対象物質に結合させるには、一般的に免疫測定の分野で用いられる方法、例えば公知のＥＩＡ、ＲＩＡ或はＦＩＡ等において一般に行われている公知の標識方法［例えば、医化学実験講座、第８巻、山村雄一監修、第１版、中山書店、１９７１；図説 蛍光抗体、川生明著、第１版、（株）ソフトサイエンス社、１９８３；酵素免疫測定法、石川栄治、河合忠、室井潔編、第２版、医学書院、１９８２等］等を利用すればよい。

【0029】

標識物質の使用量は、用いる標識物質の種類により異なるため一概には言えないが、例えばＰＯＤを標識物質として使用する場合には、測定対象物質と特異的に結合する物質又は測定対象物質と標識物質とを、例えば好ましくは１：１〜２０（更に好ましくは１：１〜１０、特に好ましくは１：１〜２）のモル比となるように、緩衝液中に含有させて用いればよい。
緩衝液としては、一般的に免疫測定の分野で用いられている、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液及びグッド緩衝液等が挙げられ、そのｐＨは、抗原抗体反応を抑制しない範囲であればよく、５〜１０が好ましい。
また、このような緩衝液中には、目的の抗原抗体反応を阻害しないものであれば、例えばアルブミン、グロブリン、水溶性ゼラチン、ポリエチレングリコール等の安定化剤、界面活性剤及び糖類等を含有させておいてもよい。

【0030】

標識物質により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ１）又は標識物質により標識された測定対象物質（Ｆ２）における測定対象物質としては後述の測定対象物質が挙げられ、（Ｆ１）における測定対象物質と特異的に結合する物質は、測定対象物質が「抗原」であるときは測定対象物質結合物質は「抗体」であり、測定対象物質が「抗体」であるときは測定対象物質結合物質は「抗原」である。

【0031】

標識試薬（Ｆ）中の標識物質により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ１）及び標識物質により標識された測定対象物質（Ｆ２）の含有量は、感度の観点から、０．０１〜４０μｇ／ｍＬが好ましく、更に好ましくは０．１〜２０μｇ／ｍＬである。

【0032】

固相担体試薬（Ｅ）及び標識試薬（Ｆ）中には、免疫反応を妨げない範囲で、その他の成分｛（Ａ）以外の糖類（グルコース、シュークロース等）、無機塩（塩化ナトリウム等）、（Ａ）以外の界面活性剤（モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン等）、防腐剤（アジ化ナトリウム等）及び非特異反応防止剤等（正常動物由来のＩｇＧ抗体等）からなる群より選ばれる少なくとも１種等｝を含有させてもよい。
固相担体試薬（Ｅ）及び／又は標識試薬（Ｆ）中糖類、無機塩、界面活性剤、防腐剤及び非特異反応防止剤を含む場合、それぞれの含有量は、（Ｅ）又は（Ｆ）それぞれの重量に基づいて、糖類の含有量は０．１〜１０重量％、無機塩の含有量は０．０１〜５重量％、界面活性剤の含有量は０．０２〜５重量％、防腐剤の含有量は０．００１〜０．１重量％、非特異反応防止剤の含有量は０．００１〜５重量％が好ましい。

【0033】

本発明の免疫測定方法は、免疫反応時に親水部が単糖（ａ）であるアルキルグリコシド（Ａ）を用いること以外は、公知の免疫測定方法［例えば、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、蛍光酵素免疫測定法（ＦＥＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、ラッテックス光学免疫測定法（ＬＰＩＡ）及びラッテックス粒子計数免疫凝集測定法（ＣＩＡ）］に準じて行うことができる。
また、免疫反応の方法としては、免疫測定の分野で一般的に行われる文献［例えば、酵素免疫測定法第２版（石川栄治ら編集、医学書院）１９８２年］記載のサンドイッチ法、競合法及び特開平６−１３００６３号公報記載の方法、具体的には以下の３種の方法が含まれる。

【0034】

＜第１の方法：サンドイッチ法＞
磁性粒子（Ｂ）（好ましくは磁性シリカ粒子）が、測定対象物質と特異的に結合する物質（測定対象物質結合物質）としての抗原（Ｃ）又は抗体（Ｄ）をその表面に固定化しているもの［磁性粒子（Ｂ１）］であって、測定対象物質を含む試料（例えば生体試料）と、磁性粒子（Ｂ１）と、標識物質により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質（標識測定対象物質結合物質）（Ｆ１）又は標識物質により標識された測定対象物質（標識測定対象物質）（Ｆ２）とを接触させて、磁性粒子（Ｂ）上に測定対象物質結合物質としての抗原（Ｃ）又は抗体（Ｄ）と測定対象物質と標識測定対象物質結合物質（Ｆ１）又は標識測定対象物質（Ｆ２）との複合体（標識複合体）を形成させ、標識複合体を担持した磁性粒子（Ｂ）をＢ／Ｆ分離して、標識複合体中の標識物質量を測定し、その結果に基づいて試料中の測定対象物質を測定する。

【0035】

＜第２の方法：競合法１＞
磁性粒子（Ｂ）（好ましくは磁性シリカ粒子）が、測定対象物質又は測定対象物質の類似物質としての抗原（Ｃ）又は抗体（Ｄ）をその表面に固定化しているもの［磁性粒子（Ｂ１）］であって、測定対象物質を含む試料（例えば生体試料）と、標識物質により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質（標識測定対象物質結合物質）（Ｆ１）と、磁性粒子（Ｂ１）とを接触させて、標識測定対象物質結合物質（Ｆ１）に、磁性粒子（Ｂ）に固定化した抗原（Ｃ）又は抗体（Ｄ）と試料中の測定対象物質とを競合反応させ、磁性粒子（Ｂ）上に抗原（Ｃ）又は抗体（Ｄ）と標識測定対象物質結合物質（Ｆ１）との複合体（標識複合体）を形成させた後、標識複合体を担持した磁性粒子（Ｂ）をＢ／Ｆ分離して、標識複合体中の標識物質量を測定し、その結果に基づいて試料中の測定対象物質を測定する。

【0036】

＜第３の方法：競合法２＞
磁性粒子（Ｂ）（好ましくは磁性シリカ粒子）が、測定対象物質と特異的に結合する物質（測定対象物質結合物質）としての抗原（Ｃ）又は抗体（Ｄ）をその表面に固定化しているもの［磁性粒子（Ｂ１）］であって、測定対象物質を含む試料（例えば生体試料）と、標識物質により標識された測定対象物質（Ｆ２）又は標識物質により標識された測定対象物質の類似物質（Ｆ３）［標識測定対象物質（Ｆ２）又はその類似物質（Ｆ３）］と、磁性粒子（Ｂ１）とを接触させて、磁性粒子（Ｂ）に固定化した抗原（Ｃ）又は抗体（Ｄ）に、測定対象物質と標識測定対象物質（Ｆ２）又はその類似物質（Ｆ３）とを競合反応させ、磁性粒子（Ｂ）上に測定対象物質結合物質と標識測定対象物質（Ｆ２）又はその類似物質（Ｆ３）との複合体（標識複合体）を形成させた後、標識複合体を担持した磁性粒子（Ｂ）をＢ／Ｆ分離して、標識複合体中の標識物質量を測定し、その結果に基づいて試料中の測定対象物質を測定する。

【0037】

本発明の免疫測定方法における測定対象物質としては、一般的に免疫測定の分野で測定されるものであれば特に限定はされず、例えば血清、血液、血漿、尿等の生体体液、リンパ液、血球、各種細胞類等の生体由来の試料中に含まれるヌクレオチド鎖、ペプチド鎖、タンパク質、脂質タンパク質、核酸、免疫グロブリン、血液凝固関連因子、抗体、酵素、ホルモン、癌マーカー、心疾患マーカー及び各種薬物等が代表的なものとして挙げられる。更に具体的には、例えばＣ−ペプチド、アンジオテンシンＩ等のペプチド鎖、例えばアルブミン、ヘモグロビン、ミオグロビン、トランスフェリン、プロテインＡ、Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）等のタンパク質、例えばＣ−ペプチド、アンジオテンシンＩ等のペプチド鎖、例えば高比重リポ蛋白質（ＨＤＬ）、低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）、超低比重リポ蛋白質等の脂質蛋白質、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）等の核酸、例えばアルカリ性ホスファターゼ、アミラーゼ、酸性ホスファターゼ、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（γ−ＧＴＰ）、リパーゼ、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）、レニン、プロテインキナーゼ（ＰＫ）、チロシンキナーゼ等の酵素、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等の免疫グロブリン（或はこれらの、例えばＦｃ部、Ｆａｂ部、Ｆ（ａｂ）２部等の断片）、例えばフィブリノーゲン、フィブリン分解産物（ＦＤＰ）、プロトロンビン、トロンビン等の血液凝固関連因子、例えば抗ストレプトリジンＯ抗体、抗ヒトＢ型肝炎ウイルス表面抗原抗体（ＨＢｓ抗原）、抗ヒトＣ型肝炎ウイルス抗体、抗リュウマチ因子等の抗体、例えば甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、甲状腺ホルモン（ＦＴ３、ＦＴ４、Ｔ３、Ｔ４）、インスリン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）エストラジオール（Ｅ２）等のホルモン、例えばα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１９−９、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）等の癌マーカー、例えばトロポニンＴ（ＴｎＴ）、ヒト脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｎ端フラグメント（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）等の心疾患マーカー、例えば抗てんかん薬、抗生物質、テオフィリン等の薬物等が挙げられる。
上記したものの中でも、抗原（Ｃ）又は抗体（Ｄ）の安定性の観点から、抗体、ペプチド鎖、ホルモン、癌マーカー及び心疾患マーカーからなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく、更に好ましいのはペプチド鎖、ホルモン、癌マーカー及び心疾患マーカーからなる群より選ばれる少なくとも１種である。

【0038】

本発明の免疫測定方法において、免疫反応を行う際の溶液中のアルキルグリコシド（Ａ）の濃度は、感度及び再現性の観点から反応溶液の重量を基準として、０．００１〜５重量％が好ましく、更に好ましくは０．０１〜１重量％である。
アルキルグリコシド（Ａ）は、予め固相担体試薬（Ｅ）又は標識試薬（Ｆ）のいずれか一方又は両方に混合しておいてもよいし、免疫反応を行う際に固相担体試薬（Ｅ）及び標識試薬（Ｆ）と共に添加してもよいが、再現性の観点から予め標識試薬（Ｆ）に混合しておくことが好ましい。また、（Ｅ）又は（Ｆ）と事前混合せずに（Ａ）を用いる場合、上記水性溶媒に溶解して用いてもよい。
また、免疫反応行う際の溶液のｐＨは、免疫反応の反応性の観点から、５〜１０が好ましい。

【0039】

標識複合体中の標識物質量の測定方法は用いた標識物質に基づいて選択され、例えば公知の化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、蛍光酵素免疫測定法（ＦＥＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、ラッテックス光学免疫測定法（ＬＰＩＡ）及びラッテックス粒子計数免疫凝集測定法（ＣＩＡ）等で用いられる方法に基づいて行うことができる。

【0040】

例えば、標識物質量の測定を化学発光法により行う場合、化学発光試薬（Ｇ）を用いる。
化学発光試薬（Ｇ）は、用いた標識物質に基づき選択され、例えば、標識物質がペルオキシダーゼである場合、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物及び化学発光増強剤を必須構成成分とする化学発光試薬第１液と、酸化剤及び水を必須構成成分とする化学発光試薬第２液とを含む。

【0041】

２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物としては、例えば、特開平２−２９１２９９号公報、特開平１０−３１９０１５号公報及び特開２０００−２７９１９６号公報等に記載の公知の２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物及びこれらの混合物等が使用できる。
これらの内、感度の観点から、ルミノール、イソルミノール、Ｎ−アミノヘキシル−Ｎ−エチルイソルミノール（ＡＨＥＩ）、Ｎ−アミノブチル−Ｎ−エチルイソルミノール（ＡＢＥＩ）及びこれらの金属塩（アルカリ金属塩等）が好ましく、更に好ましいのはルミノール及びその金属塩、特に好ましいのはルミノールのナトリウム塩である。

【0042】

化学発光増強剤としては、例えば、特開昭５９−５００２５２号公報、特開昭５９−１７１８３９号公報及び特開平２−２９１２９９号公報等に記載の公知の化学発光増強剤及びこれらの混合物等が使用できる。これらの内、化学発光増強効果等の観点から、フェノールが好ましく、更に好ましいのはＰ−ヨードフェノール、４−（シアノメチルチオ）フェノール及び４−シアノメチルチオ−２−クロロフェノール、特に好ましいのは４−（シアノメチルチオ）フェノールである。

【0043】

化学発光試薬第１液は、水及び各種緩衝液（リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液及びＴｒｉｓ緩衝液等）を含有することができる。

【0044】

化学発光試薬第１液は、酵素の蛍光強度の観点からはアルカリ性であることが好ましく、第１液のｐＨは、７〜１１が好ましく、更に好ましくは８〜１０である。
尚、ｐＨは、ＪＩＳ Ｋ０４００−１２−１０：２０００に準拠して測定温度２５℃で測定される。

【0045】

化学発光試薬第２液が含有する酸化剤としては、例えば、特開平８−２６１９４３号公報及び特開２０００−２７９１９６号公報等に記載の公知の酸化剤等［無機の過酸化物（過酸化水素、過ホウ酸ナトリウム及び過ホウ酸カリウム等）、有機過酸化物（過酸化ジアルキル及び過酸化アシル等）及びペルオクソ酸化合物（ペルオクソ硫酸及びペルオクソリン酸等）等］が挙げられる。
これらの内、保存安定性等の観点から、過酸化水素、過ホウ酸ナトリウム及び過ホウ酸カリウムが好ましく、更に好ましいのは過酸化水素である。

【0046】

＜免疫測定用キット＞
本発明の免疫測定用キットは本発明の免疫測定方法に用いられる上述の各種試薬及びアルキルグリコシド（Ａ）から構成される試薬キットであり、固相担体試薬（Ｅ）及び標識試薬（Ｆ）を必須の構成試薬として固相担体試薬（Ｅ）又は標識試薬（Ｆ）の少なくともいずれか一方にアルキルグリコシド（Ａ）を含有させておくことが好ましいが、（Ａ）を（Ｅ）及び（Ｆ）とは別の構成品としてキット化することも可能である。
免疫測定用キットにおけるアルキルグリコシド（Ａ）の量は、本発明の免疫測定用キットを使用して免疫反応させる際の溶液における濃度が０．００１〜５重量％となる範囲であることが好ましい。
また、免疫測定用キットにおけるアルキルグリコシド（Ａ）並びに固相担体試薬（Ｅ）及び標識試薬（Ｆ）における各構成成分の組成、含有量及びこれらの好ましい範囲等は上述の免疫測定方法で説明したものと同様である。

【0047】

本発明の免疫測定用キットには、固相担体試薬（Ｅ）及び標識試薬（Ｆ）以外に、化学発光試薬（Ｇ）、標準試薬（濃度既知の測定対象物溶液等）、希釈用試薬（高濃度検体の希釈用試薬等）、洗浄試薬（反応容器の洗浄用試薬等）等を含んでもよく、更に取り扱い説明書、測定に必要な治具等（例えば検体容器等）を含んでもよい。

【実施例】

【0048】

以下、実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。以下、特に定めない限り、部は重量部を示す。

【0049】

＜実施例１＞
以下により、固相担体試薬（抗ＣＥＡ抗体結合磁性シリカ粒子含有試薬）、標識試薬（ＰＯＤ標識抗ＣＥＡ抗体含有試薬）、化学発光試薬第１液及び化学発光試薬第２液から構成される本発明の免疫測定用キット（Ｓ１）を得た。

【0050】

磁性シリカ粒子の作製：
反応容器に塩化鉄（ＩＩＩ）６水和物１８６部、塩化鉄（ＩＩ）４水和物６８部及び水１２８８部を仕込んで溶解させて５０℃に昇温し、撹拌下温度を５０〜５５℃の保持しながら、２５重量％アンモニア水２８０部を１時間かけて滴下し、水中にマグネタイト粒子を得た。得られたマグネタイト粒子に分散剤であるオレイン酸６４部を加え、２時間撹拌を継続した。室温に冷却後、デカンテーションにより固液分離して得られたオレイン酸が吸着したマグネタイト粒子を水１０００部で洗浄する操作を３回行い、更にアセトン１０００部で洗浄する操作を２回行い、４０℃で２日間乾燥させることで、体積平均粒子径が１５ｎｍの超常磁性金属酸化物粒子を得た。

【0051】

超常磁性金属酸化物粒子８０部をテトラエトキシシラン２４０部に加えて分散し、分散液（１）を調製した。次に、反応容器に水５０５０部、２５重量％アンモニア水溶液３５００部、非イオン界面活性剤［（三洋化成工業（株）製「ＮＳＡ−１７」］４００部を加えてクリアミックス［エムテクニック（株）製］を用いて混合し溶液（２）を得た。５０℃に昇温後、クリアミックスを回転数６，０００ｒｐｍで攪拌しながら、上記分散液（１）を溶液（２）に１時間かけて滴下後、５０℃で１時間反応させた。反応後、２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して微粒子の存在する上清を除き、コア層を得た。

【0052】

反応容器にコア層８０部、脱イオン水２５００部、２５重量％アンモニア水溶液２６０部、エタノール２５００部、テトラエトキシシラン１２００部を加えてクリアミックス［エムテクニック（株）製］を用いて混合し、クリアミックスの回転数６，０００ｒｐｍで攪拌しながら２時間反応させた。反応後、２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して微粒子の存在する上清を除き、磁石を用いて粒子を集磁し上清を除く操作を１０回行った。次に、得られた固相に水５０００部を加えて粒子を分散させて６００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、微粒子の存在する上清を除く操作を２０回行い、続いて得られた固相に水５０００部を加えて粒子を分散させて３００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより、大きな粒子径の粒子を沈降させて除去することで分級を行った。更に、磁石を用いて粒子を集磁し上清を除く操作を１０回行い、目的とする体積平均粒子径２．０μｍの磁性シリカ粒子を得た。得られた磁性シリカ粒子中の超常磁性金属酸化物粒子の含有量を測定した結果、含有量は８１重量％であった。

【0053】

＜超常磁性金属酸化物粒子の含有量の測定方法＞
磁性シリカ粒子の任意の２０個について、走査型電子顕微鏡［型番ＪＳＭ−７０００Ｆ、メーカー名日本電子（株）］で観察し、エネルギー分散型Ｘ線分光装置（型番ＩＮＣＡ Ｗａｖｅ／Ｅｎｅｒｇｙ、メーカー名オックスフォード社）により超常磁性金属酸化物粒子の含有量を測定し、その平均値を含有量Ｓとした。また、同測定にてシリカの含有量を測定し、その平均値を含有量Ｔとした。以下の計算式（１）にて、超常磁性金属酸化物粒子の含有量を求めた。
超常磁性金属酸化物粒子の含有量（重量％）＝｛（Ｓ）／（Ｓ＋Ｔ）｝×１００・・・（１）

【0054】

固相担体試薬の作製：
１重量％γ−アミノプロピルトリエトキシシラン含有アセトン溶液４０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に製造した磁性シリカ粒子４０ｍｇを加え、２５℃で１時間反応させ、ネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去した。次いで脱イオン水４０ｍＬを加えて蓋をし、ポリスチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌した後、ネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去して磁性シリカ粒子を洗浄した。この洗浄操作を５回行った。次いで、この洗浄後の磁性シリカ粒子を２重量％グルタルアルデヒド含有水溶液４０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で１時間反応させた。そして、脱イオン水４０ｍＬを加えて蓋をし、ポリスチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌したのち、ネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去して磁性シリカ粒子を洗浄した。この洗浄操作を１０回行った。更にこの洗浄後の磁性シリカ粒子を抗ＣＥＡモノクローナル抗体［ダコジャパン（株）製］を１０μｇ／ｍＬの濃度で含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．７）１２０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で１時間反応させた。反応後、ネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を集磁後、抗ＣＥＡモノクローナル抗体含有リン酸緩衝液を除去した。次いで、磁性シリカ粒子を１重量％の牛血清アルブミン含有の０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で１２時間浸漬させたのち、ネオジウム磁石でシリカ粒子を集磁後、１重量％の牛血清アルブミン含有のリン酸緩衝液を除去した。抗ＣＥＡ抗体結合磁性シリカ粒子濃度として１．０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように０．８５重量％のＮａＣｌ及び０．０１重量％ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシドを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈し、固相担体試薬（抗ＣＥＡ抗体結合磁性シリカ粒子含有試薬）（Ｅ−１）を調製し、冷蔵（２〜１０℃）で保存した。

【0055】

標識試薬の作製：
抗ＣＥＡモノクローナル抗体［ダコジャパン（株）製］、西洋ワサビ由来ＰＯＤ［東洋紡（株）製］を用い、文献（エス・ヨシタケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、エトール；ジェイ．バイオケム，Ｖｏｌ．９２，１９８２，１４１３−１４２４）に記載の方法でＰＯＤ標識抗ＣＥＡ抗体を調製した。これを０．５重量％の牛血清アルブミン及び界面活性剤として１重量％ナロアクティーＣＬ−１００を含有する０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で、ＰＯＤ標識抗ＣＥＡ抗体濃度として１００ｎＭの濃度に希釈し、標識試薬（Ｆ−１）を調製し、冷蔵（２〜１０℃）で保存した。

【0056】

化学発光試薬第１液の調製：
ルミノールのナトリウム塩［シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製］０．７ｇ及び４−（シアノメチルチオ）フェノール０．１ｇを１，０００ｍＬメスフラスコに仕込んだ。３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）を溶液の容量が１，０００ｍＬになるように仕込み、２５℃で均一混合して化学発光試薬第１液（Ｇ−１）を調製した。測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）保存した。

【0057】

化学発光試薬第２液の調製：
１，０００ｍＬ及び過酸化水素［和光純薬工業（株）製、試薬特級、濃度３０重量％］６．６ｇを１，０００ｍＬメスフラスコに仕込んだ。脱イオン水を溶液の容量が１，０００ｍＬになるように仕込み、２５℃で均一混合して化学発光試薬第２液（Ｇ−２）を調製した。測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）保存した。

【0058】

＜実施例２〜１３及び比較例１〜５＞
使用原料の種類及び／又は使用量を表１に示すものに変更する以外は実施例１と同様にして、固相担体試薬（Ｅ−２）〜（Ｅ−１３）及び比較用の固相担体試薬（ＨＥ−１）〜（ＨＥ−５）、標識試薬（Ｆ−２）〜（Ｆ−１３）及び比較用の標識試薬（ＨＦ−１）〜（ＨＦ−５）を作製し、これらと化学発光試薬第１液（Ｇ−１）及び化学発光試薬第２液（Ｇ−２）とを組み合わせて免疫測定用キット（Ｓ２）〜（Ｓ１３）及び比較用の免疫測定用キット（Ｈ１）〜（Ｈ５）を得た。

【0059】

【表1】

【0060】

尚、表１において、各成分は下記を用いた。
○親水部が単糖であるアルキルグリコシド（Ａ）
ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド：和光純薬工業（株）製
ｎ−ドデシルβ−Ｄ−グルコピラノシド：シグマアルドリッチ社製
○親水部が二糖であるアルキルグリコシド
ｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトピラノシド：和光純薬工業（株）製
ｎ−オクチルβ−Ｄ−マルトピラノシド：和光純薬工業（株）製
○（Ａ）以外の界面活性剤
ナロアクティーＣＬ−１００：三洋化成工業（株）製「ナロアクティーＣＬ−１００」
○抗体（Ｄ）
ＣＥＡ：抗ＣＥＡモノクローナル抗体［ダコジャパン（株）製］
ＰＳＡ：抗ＰＳＡポリクローナル抗体［ダコ・サイトメーション（株）製］
ＣＡ１９−９：抗ＣＡ１９−９抗体［ダコジャパン（株）製］

【0061】

＜実施例１４〜２４＞
得られた免疫測定用キット（Ｓ１）〜（Ｓ１１）を用いて、以下の方法により免疫測定における感度及び同時再現性を評価した。結果を表１に示す。

【0062】

＜免疫測定における感度及び同時再現性の評価方法＞
固相担体試薬（Ｅ−１）〜（Ｅ−１１）を用いて、それぞれ固相担体試薬０．０２５ｍＬと０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で調製したＣＥＡ濃度が１．０ｎｇ／ｍＬの標準ＣＥＡ液０．０２５ｍＬを試験管に入れて混合し、試験管中で３７℃３分間反応させ、抗ＣＥＡ抗体結合磁性シリカ粒子／ＣＥＡ複合体を形成させた。反応後、試験管の外側からネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を１０秒間集め、試験管中の液をアスピレーターで除き、ネオジウム磁石を側面から十分に離し、生理食塩水０．５ｍＬを加えて磁性シリカ粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液を除く洗浄操作を３回行った。

【0063】

続いて、固相担体試薬に対応する０．５重量％の牛血清アルブミン含有する標識試薬（Ｆ−１）〜（Ｆ−１１）を用いて、それぞれ標準試薬０．０２５ｍＬを試験管に注入し、試験管中で３７℃３分間反応させ、抗ＣＥＡ抗体結合磁性シリカ粒子／ＣＥＡ／ＰＯＤ標識抗ＣＥＡ抗体複合体を形成させた。反応後、試験管の外側からネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を１０秒間集め、試験管中の液をアスピレーターで除き、ネオジウム磁石を側面から十分に離し、生理食塩水０．５ｍＬを加えて磁性シリカ粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液を除く洗浄操作を２回行った。
最後に、化学発光試薬第１液（Ｇ−１）０．０７ｍＬと化学発光試薬第２液（Ｇ−２）０．０７ｍＬとを同時に加え、３７℃で４３秒間発光反応させ、化学発光試薬を添加後４３〜４５秒の平均発光量をルミノメーター［ベルトールドジャパン（株）製「Ｌｕｍａｔ ＬＢ９５０７」］で測定した。尚、ＣＥＡ濃度が１．０ｎｇ／ｍＬの標準ＣＥＡ液の代わりにＣＥＡ濃度が０ｎｇ／ｍＬの標準ＣＥＡ液を使用して上記と同様の操作を行いバックグラウンドとして用いた。

【0064】

感度については、ＣＥＡ濃度が１．０ｎｇ／ｍＬと０ｎｇ／ｍＬの標準溶液を用いた免疫測定を行った場合の発光量の比｛（１．０ｎｇ／ｍＬの標準溶液を用いた場合の発光量）／（０ｎｇ／ｍＬの標準溶液を用いた場合の発光量）｝を感度として表１に記載した。

【0065】

同時再現性については、ＣＥＡ濃度が１ｎｇ／ｍＬの標準溶液を用いて免疫測定を行い、それを１０回繰り返し、平均発光量（Ｘ１）と標準偏差（Ｘ２）から以下の計算式で変動係数（ＣＶ）を算出した。
ＣＶ（％）＝（Ｘ２／Ｘ１）×１００

【0066】

＜実施例２５＞
得られた免疫測定用キット（Ｓ１２）を用いて、以下の方法により免疫測定における感度及び同時再現性を評価した。結果を表１に示す。

【0067】

＜免疫測定における感度及び同時再現性の評価方法＞
固相担体試薬（Ｅ−１２）０．０２５ｍＬと０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で調製したＰＳＡ濃度が５０ｍＡＵ／ｍＬの標準ＰＳＡ液０．０２５ｍＬを試験管に入れて混合し、試験管中で３７℃３分間反応させ、抗ＰＳＡ抗体結合磁性シリカ粒子／ＰＳＡ複合体を形成させた。反応後、試験管の外側からネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を１０秒間集め、試験管中の液をアスピレーターで除き、ネオジウム磁石を側面から十分に離し、生理食塩水０．５ｍＬを加えて磁性シリカ粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液を除く洗浄操作を３回行った。

【0068】

続いて、０．５重量％の牛血清アルブミン含有した標識試薬（Ｆ−１２）０．０２５ｍＬを試験管に注入し、試験管中で３７℃３分間反応させ、抗ＰＳＡ抗体結合磁性シリカ粒子／ＰＳＡ／ＰＯＤ標識抗ＰＳＡ抗体複合体を形成させた。反応後、試験管の外側からネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を１０秒間集め、試験管中の液をアスピレーターで除き、ネオジウム磁石を側面から十分に離し、生理食塩水０．５ｍＬを加えて磁性シリカ粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液を除く洗浄操作を２回行った。
最後に、化学発光試薬第１液（Ｇ−１）０．０７ｍＬと化学発光試薬第２液（Ｇ−２）０．０７ｍＬとを同時に加え、３７℃で４３秒間発光反応させ、化学発光試薬を添加後４３〜４５秒の平均発光量をルミノメーター［ベルトールドジャパン（株）製「Ｌｕｍａｔ ＬＢ９５０７」］で測定した。尚、ＰＳＡ濃度が０．０１ｎｇ／ｍＬの標準ＰＳＡ液の代わりにＰＳＡ濃度が０ｎｇ／ｍＬの標準ＰＳＡ液を使用して上記と同様の操作を行いバックグラウンドとして用いた。

【0069】

感度については、ＰＳＡ濃度が０．０１ｎｇ／ｍＬと０ｎｇ／ｍＬの標準溶液を用いた免疫測定を行った場合の発光量の比｛（０．０１ｎｇ／ｍＬの標準溶液を用いた場合の発光量）／（０ｎｇ／ｍＬの標準溶液を用いた場合の発光量）｝を感度として表１に記載した。

【0070】

同時再現性については、ＰＳＡ濃度が０．０１ｎｇ／ｍＬの標準溶液を用いて免疫測定を行い、それを１０回繰り返し、平均発光量（Ｘ３）と標準偏差（Ｘ４）から以下の計算式で変動係数（ＣＶ）を算出した。
ＣＶ（％）＝（Ｘ４／Ｘ３）×１００

【0071】

＜実施例２６＞
得られた免疫測定用キット（Ｓ１３）を用いて、以下の方法により免疫測定における感度及び同時再現性を評価した。結果を表１に示す。

【0072】

＜免疫測定における感度及び同時再現性の評価方法＞
固相担体試薬（Ｅ−１３）０．０２５ｍＬと０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で調製したＣＡ１９−９濃度が１．０Ｕ／ｍＬの標準ＣＡ１９−９液０．０２５ｍＬを試験管に入れて混合し、試験管中で３７℃３分間反応させ、抗ＣＡ１９−９抗体結合磁性シリカ粒子／ＣＡ１９−９複合体を形成させた。反応後、試験管の外側からネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を１０秒間集め、試験管中の液をアスピレーターで除き、ネオジウム磁石を側面から十分に離し、生理食塩水０．５ｍＬを加えて磁性シリカ粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液を除く洗浄操作を３回行った。

【0073】

続いて、０．５重量％の牛血清アルブミン含有した標識試薬（Ｆ−１３）０．０２５ｍＬを試験管に注入し、試験管中で３７℃３分間反応させ、抗ＣＡ１９−９抗体結合磁性シリカ粒子／ＣＡ１９−９／ＰＯＤ標識抗ＣＡ１９−９抗体複合体を形成させた。反応後、試験管の外側からネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を１０秒間集め、試験管中の液をアスピレーターで除き、ネオジウム磁石を側面から十分に離し、生理食塩水０．５ｍＬを加えて磁性シリカ粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液を除く洗浄操作を２回行った。
最後に、化学発光試薬第１液（Ｇ−１）０．０７ｍＬと化学発光試薬第２液（Ｇ−２）０．０７ｍＬとを同時に加え、３７℃で４３秒間発光反応させ、化学発光試薬を添加後４３〜４５秒の平均発光量をルミノメーター［ベルトールドジャパン（株）製「Ｌｕｍａｔ ＬＢ９５０７」］で測定した。尚、ＣＡ１９−９濃度が１．０Ｕ／ｍＬの標準ＣＡ１９−９液の代わりにＣＡ１９−９濃度が０Ｕ／ｍＬの標準ＣＡ１９−９液を使用して上記と同様の操作を行いバックグラウンドとして用いた。

【0074】

感度については、ＣＡ１９−９濃度が１．０Ｕ／ｍＬと０Ｕ／ｍＬの標準溶液を用いた免疫測定を行った場合の発光量の比｛（１．０Ｕ／ｍＬの標準溶液を用いた場合の発光量）／（０Ｕ／ｍＬの標準溶液を用いた場合の発光量）｝を感度として表１に記載した。

【0075】

同時再現性については、ＣＡ１９−９濃度が１Ｕ／ｍＬの標準溶液を用いて免疫測定を行い、それを１０回繰り返し、平均発光量（Ｘ５）と標準偏差（Ｘ６）から以下の計算式で変動係数（ＣＶ）を算出した。
ＣＶ（％）＝（Ｘ５／Ｘ６）×１００

【0076】

＜比較例６〜１０＞
実施例１４において、「免疫測定用キット（Ｓ１）」に代えて「比較用の免疫測定用キット（Ｈ１）〜（Ｈ５）」を用いる以外は実施例１４と同様にして免疫測定における感度及び同時再現性を評価した。結果を表１に示す。

【0077】

表１において、免疫測定用試薬である固相担体試薬及び／又は標識試薬中にアルキルグリコシド（Ａ）を含有する本発明の実施例１〜１３の免疫測定用キットを用いた実施例１４〜２６の免疫測定方法では、変動係数が２．４％以下であり、アルキルグリコシド（Ａ）を含まない比較例１〜５の免疫測定用キットを用いた比較例６〜１０の免疫測定方法の変動係数４．４〜６．２と比較して、変動係数が小さく、再現性が優れていることがわかる。また、実施例１４〜２６の免疫測定方法における感度も２．５以上と比較例と同等以上であり、高感度かつ再現性に優れていることがわかる。更に、標識試薬中にアルキルグリコシド（Ａ）を含有する実施例８〜１１においては、変動係数が１．５〜１．７と極めて小さく、再現性に極めて優れていることがわかる。

【産業上の利用可能性】

【0078】

本発明の免疫測定方法及び免疫測定用キットは、高感度かつ再現性に優れていることから、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法及び化学発光免疫測定法等の臨床検査に幅広く適用できる。