特許 6673847 癌治療に使用するためのアドレノメデュリンバインダー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6673847

(24)【登録日】2020年3月9日

(45)【発行日】2020年3月25日

(54)【発明の名称】癌治療に使用するためのアドレノメデュリンバインダー

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/30 20060101AFI20200316BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20200316BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20200316BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20200316BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/30ZNA

   A61P35/00

   A61P35/02

   A61K39/395 E

   A61K39/395 T

【請求項の数】12

【全頁数】32

(21)【出願番号】特願2016-560037(P2016-560037)

(86)(22)【出願日】2014年12月19日

(65)【公表番号】特表2017-508781(P2017-508781A)

(43)【公表日】2017年3月30日

(86)【国際出願番号】EP2014078870

(87)【国際公開番号】WO2015092021

(87)【国際公開日】20150625

【審査請求日】2017年10月5日

(31)【優先権主張番号】13199000.4

(32)【優先日】2013年12月20日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】516183794

【氏名又は名称】アンギオビオメト ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100077517

【弁理士】

【氏名又は名称】石田 敬

(74)【代理人】

【識別番号】100087871

【弁理士】

【氏名又は名称】福本 積

(74)【代理人】

【識別番号】100087413

【弁理士】

【氏名又は名称】古賀 哲次

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(74)【代理人】

【識別番号】100197169

【弁理士】

【氏名又は名称】柴田 潤二

(72)【発明者】

【氏名】アンドレアス ベルクマン

【審査官】 川合 理恵

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１３／０７２５１１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 J. Biol. Chem., 1996, Vol. 271, No. 38, pp. 23345-23351

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １６／００−１６／４６

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

癌を治療するための、ＡＤＭのＣ末端部分、ＡＤＭのａａ４２〜５２（配列番号１）：ＡＰＲＳＫＩＳＰＱＧＹ−ＮＨ２に結合する、抗ＡＤＭ ＩｇＧ抗体又は抗ＡＤＭ ＩｇＧ抗体フラグメントを含む医薬組成物。

【請求項2】

前記抗ＡＤＭ ＩｇＧ抗体又は抗ＡＤＭ ＩｇＧ抗体フラグメントが、結合するために、ＡＤＭのＣ末端部分、ＡＤＭのａａ４２〜５２（配列番号１）：ＡＰＲＳＫＩＳＰＱＧＹ−ＮＨ２内のＣ末端がアミド化されたチロシン残基の存在を必要とする、請求項１に記載の癌を治療するための抗ＡＤＭ ＩｇＧ抗体又は抗ＡＤＭ ＩｇＧ抗体フラグメントを含む医薬組成物。

【請求項3】

前記癌が、前立腺、乳房、結腸、肺、膀胱、皮膚、子宮、頸部、口腔及び咽頭、胃、卵巣、腎臓、膵臓、非ホジキンリンパ腫、白血病、肝臓、食道、精巣、甲状腺、中枢神経系、喉頭、胆嚢、形質細胞腫（ｐｌａｓｍｏｃｙｔｏｍｅ）、ホジキン病（ｍｏｒｂｕｓ ｈｏｄｇｅｋｉｎ）、からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の癌を治療するための抗ＡＤＭ ＩｇＧ抗体又は抗ＡＤＭ ＩｇＧ抗体フラグメントを含む医薬組成物。

【請求項4】

前記抗ＡＤＭ ＩｇＧ抗体又は抗ＡＤＭ ＩｇＧ抗体フラグメントが、単一特異的である、請求項１、２又は３に記載の癌を治療するための抗ＡＤＭ ＩｇＧ抗体又は抗ＡＤＭ ＩｇＧ抗体フラグメントを含む医薬組成物。

【請求項5】

前記抗体又はフラグメントが、ＡＤＭに対して少なくとも１０^-7の結合親和性を示すことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の、癌を治療するための抗ＡＤＭ ＩｇＧ抗体又は抗ＡＤＭ ＩｇＧ抗体フラグメントを含む医薬組成物。

【請求項6】

前記抗体又はフラグメントが、ＡＤＭ結合プロテイン−１（補体因子Ｈ）ではない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の癌を治療するための抗ＡＤＭ ＩｇＧ抗体又は抗ＡＤＭ ＩｇＧ抗体フラグメントを含む医薬組成物。

【請求項7】

前記抗体又はフラグメントが、ＡＤＭのａａ４２〜５２（配列番号１）：ＡＰＲＳＫＩＳＰＱＧＹ−ＮＨ２の配列内の、少なくとも４又は５アミノ酸の領域へ結合する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の癌を治療するための抗ＡＤＭ ＩｇＧ抗体又は抗ＡＤＭ ＩｇＧ抗体フラグメントを含む医薬組成物。

【請求項8】

他の抗癌剤と組み合わせて使用される、又は、単独療法（ｍｏｎｏ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｕｍ）として使用される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の、癌を治療するための抗ＡＤＭ ＩｇＧ抗体又は抗ＡＤＭ ＩｇＧ抗体フラグメントを含む医薬組成物。

【請求項9】

細胞増殖抑制剤、ＶＥＧＦ阻害剤、ＣＤ２０阻害剤、ＨＥＲ−２阻害剤、ＣＤ−５２阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤と組み合わせて使用される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の、癌を治療するための抗ＡＤＭ ＩｇＧ抗体又は抗ＡＤＭ ＩｇＧ抗体フラグメントを含む医薬組成物。

【請求項10】

細胞増殖抑制剤、ＶＥＧＦ阻害剤、ＣＤ２０阻害剤、ＨＥＲ−２阻害剤、ＣＤ−５２阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤と組み合わせて使用される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の癌を治療するための医薬組成物。

【請求項11】

ベバシズマブ（商品名 アバスチン（登録商標）；ロッシュ社）と組み合わせて使用される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の癌を治療するための医薬組成物。

【請求項12】

前記医薬組成物が、静脈内投与される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の癌を治療するための医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明の主題は、癌の治療に使用するための、ＡＤＭのＣ末端部分、ＡＤＭのａａ４３〜５２（配列番号１）：ＡＰＲＳＫＩＳＰＱＧＹ−ＮＨ２、に結合する抗ＡＤＭ抗体又は抗ＡＤＭ抗体フラグメント又は抗ＡＤＭ非Ｉｇスキャフォールドスキャフォールドである。

【0002】

本発明の主題は、一実施形態において、請求項１に記載の癌の治療に使用するための抗ＡＤＭ抗体又は抗ＡＤＭ抗体フラグメント又は抗ＡＤＭ非Ｉｇスキャフォールドであって、ここで抗ＡＤＭ抗体又は抗ＡＤＭ抗体フラグメント又は抗ＡＤＭ非Ｉｇスキャフォールドは、結合するために、ＡＤＭのＣ末端部分、ＡＤＭのａａ４３〜５２（配列番号１）：ＡＰＲＳＫＩＳＰＱＧＹ−ＮＨ２、内のＣ末端がアミド化されたチロシン残基の存在を必要とする。

【背景技術】

【0003】

ペプチドアドレノメデュリン（ＡＤＭ）は、５２アミノ酸を含む新規血圧降下ペプチドとして１９９３年に初めて記述され（Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，“Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ：Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｈｙｐｏｔｅｎｓｉｖｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌ．１９２（２），ｐｐ．５５３−５６０（１９９３））、それは、ヒト褐色細胞種（ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍｅ）から単離された（配列番号２）。同年に１８５個のアミノ酸を含む前駆体ペプチドをコードするｃＤＮＡ及びその前駆体ペプチドの完全なアミノ酸配列をもまた記載された。特に、Ｎ末端に２１アミノ酸のシグナル配列含む、前駆体ペプチドは、「プレプロアドレノメデュリン」（プレプロＡＤＭ）と呼ばれる。本明細書において、指定されたすべてのアミノ酸位置は、通常、１８５アミノ酸を含むプレプロＡＤＭに関する。ペプチドアドレノメデュリン（ＡＤＭ）は、５２個のアミノ酸（配列番号２）を含むペプチドであり、プレプロＡＤＭのアミノ酸９５〜１４６を含み、タンパク質分解切断によって形成される。現在まで、実質的に、わずかなプレプロＡＤＭの開裂で形成されたペプチドフラグメント、特に、生理活性ペプチドアドレノメデュリン（ＡＤＭ）及びプレプロＡＤＭのシグナルペプチドの２１アミノ酸に続く２０個のアミノ酸を含むペプチド（２２〜４１）「ＰＡＭＰ」しか、より正確に特徴付けされていない。１９９３年のＡＤＭの発見及び特徴付けは、集中的な研究活動を引き起こし、その結果は、様々なレビュー論文、本明細書の文脈、特にＡＤＭに貢献する「ペプチド」の問題で見出された論文となっている参照（論説、Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．，”Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｓｕ１１ｉｎ： ｆｒｏｍ ａ ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ ｔｏ ｔｈｅ ｅｙｅｓ”，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｖｏｌ．２２，ｐ．１６９１（２００１））及び（Ｅｔｏ，Ｔ．，”Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ ａｎｄ ｐｒｏａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ２０ ｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＡＭＰ），ｈｙｐｏｔｅｎｓｉｖｅ ａｎｄ ｖａｓｏｄｉｌａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｖｏｌ．２２，ｐｐ．１６９３−１７１１（２００１））でまとめられている。さらなる総説は、（Ｈｉｎｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，”Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ，ａ Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ”，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．２１（２），ｐｐ．１３８−１６７（２０００））である。これまでの科学的な研究では、特に、ＡＤＭは多機能調節ペプチドとみなされてもよいことが、見出されている。それは、グリシンによって伸長した非活性形態が循環器へ放出される（Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｋ．，Ｒｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｆｏｒｍ ｏｆ ｇｌｙｃｉｎｅ−ｅｘｔｅｎｄｅｄ ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ ｉｓ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ”，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．２４４（２），ｐｐ．５５１−５５５（１９９８）．要約のみ）。ＡＤＭに特異的であり、おそらく同様にＡＤＭの効果を調節する結合タンパク質も存在する（Ｐｉｏ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｆａｃｔｏｒ Ｈ ｉｓ ａ Ｓｅｒｕｍ−ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ，ａｎｄ ｔｈｅ Ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｂｏｔｈ Ｐａｒｔｎｅｒｓ”，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７６（ｌ５），ｐｐ．１２２９２−１２３００（２００１））。これまでのところ、調査において、第一に重要なＡＤＭ並びにＰＡＭＰのこれらの生理学的効果は、血圧に影響を与える効果であった。

【0004】

従って、ＡＤＭは有効な血管拡張剤であり、従って、ＡＤＭのＣ末端部分の特定のペプチドセグメントと降圧効果とを関連付けることが可能である。さらに、プレプロＡＤＭから形成された上述のさらなる生理活性ペプチドＰＡＭＰは、ＡＤＭとは異なる作用機序を有するような場合でさえ、同様に血圧降下作用を示すことが見出されている（参照 上記の総説論文（（Ｅｔｏ，Ｔ．，“Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ ａｎｄ ｐｒｏａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ２０ ｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＡＭＰ），ｈｙｐｏｔｅｎｓｉｖｅ ａｎｄ ｖａｓｏｄｉｌａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｖｏｌ．２２，ｐｐ．１６９３−１７１１（２００１））及び（Ｈｉｎｓｏｎ，ｅｔ．ａｌ．，“Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ， ａ Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ．Ｐｅｐｔｉｄｅ”，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．２１（２），ｐｐ．１３８〜１６７（２０００））に加えて、（Ｋｕｗａｓａｋｏ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，”Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＡＭＰ−１２（ＰＡＭＰ−２０）ｉｎ ｐｏｒｃｉｎｅ ａｄｒｅｎａｌ ｍｅｄｕｌｌａ ａｓ ａ ｍａｊｏｒ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅ”，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，Ｖｏｌ．４１４（１），ｐｐ．１０５−１１０（１９９７）．要約のみ）、（Ｋｕｗａｓａｋｉ，Ｋ，ｅｔ ａｌ，“Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ２０ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ”，Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．３６（Ｐｔ．５），ｐｐ．６２２−６２８（１９９９）．要約のみ）、又は、（Ｔｓｕｒｕｄａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ，”Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ２０ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒｏｍ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｎｅｏｎａｔａｌ ｒａｔ ｃａｒｄｉａｃ ｃｅｌｌｓ”，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．６９（２），ｐｐ．２３９−２４５（２００１）．要約のみ）及び、欧州特許出願公開第０６２２４５８号明細書を参照）。さらに、循環及び他の生物学的液体中で測定可能なＡＤＭの濃度は、病理学的状態の数において、健常の対照者内で見出される濃度よりも有意に高いことが見出された。従って、急性期ショック及び敗血症及び敗血症性ショックにおける、うっ血性心不全、心筋梗塞、腎疾患、高血圧性疾患、糖尿病患者におけるＡＤＭレベルは、異なる程度までではあるが、有意に増加する。ＰＡＭＰ濃度は、前記病理学的状態の一部でも増加するが、血漿レベルはＡＤＭと比較してより低い（Ｅｔｏ，Ｔ．，“Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ ａｎｄ ｐｒｏａｄｒｅｎｏｍｅｄｕＵｉｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ２０ ｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＡＭＰ），ｈｙｐｏｔｅｎｓｉｖｅ ａｎｄ ｖａｓｏｄｉｌａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｖｏｌ．２２，ｐｐ．１６９３−１７１１（２００１））；ｐａｇｅ １７０２））。さらに、ＡＤＭの異常に高い濃度が敗血症で観察され、敗血症性ショックで最高濃度が観察されることが知られている（（Ｅｔｏ，Ｔ．，”Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ ａｎｄ ｐｒｏａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ２０ ｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＡＭＰ），ｈｙｐｏｔｅｎｓｉｖｅ ａｎｄ ｖａｓｏｄｉｌａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｖｏｌ．２２，ｐｐ．１６９３−１７１１（２００１））及び（Ｈｉｒａｔａ， ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ， ａ Ｎｏｖｅｌ Ｖａｓｏｄｉｌａｔｏｒｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ， ｉｎ Ｓｅｐｓｉｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，Ｖｏｌ．８１（４），ｐｐ．１４４９−１４５３（１９９６））、（Ｅｈｌｅｎｚ， Ｋ．，ｅｔ ａｌ，”Ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ ｉｎ ｓｅｖｅｒｅ ｉｌｌｎｅｓｓ：Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ａｄｒｅｎａｌ ｍｅｄｕｌｌａ ａｓ ｓｉｔｅ ｏｆ ｏｒｉｇｉｎ”，Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｄｉａｂｅｔｅｓ， Ｖｏｌ．１０５，ｐｐ．１５６−１６２（１９９７））、（Ｔｏｍｏｄａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ，“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ”，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｖｏｌ．２２，ｐｐ．１７８３−１７９４（２００１））、（Ｕｅｄａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ，“Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｐｌａｓｍａ Ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ”， Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．１６０，ｐｐ．１３２−１３６（１９９９））及び（Ｗａｎｇ，Ｐ．，”Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ ａｎｄ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｓｅｐｓｉｓ”，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｖｏｌ．２２，ｐｐ．１８３５−１８４０（２００１）を参照）

【0005】

当技術分野で公知であることは、診断目的、特に、敗血症の診断、心臓の診断及び癌の診断の範囲内において、生物学的液体中のアドレノメデュリン免疫反応性を識別するためのさらなる方法である。国際公開第２００４／０９０５４６号によれば、全体のプレプロアドレノメデュリンのアミノ酸（４５〜９２）を含むプロアドレノメデュリンの中間領域部分ペプチドが、特に、中央のプロＡＤＭの配列を特異的に認識する少なくとも１つの標識された抗体で働くイムノアッセイを用いて測定される（国際公開第２００４／０９０５４６号）。

【0006】

国際公開第２００４／０９７４２３号は、診断、予後、及び心血管疾患の治療のためのアドレノメデュリンに対する抗体の使用を記載している。ＡＤＭ受容体を遮断することによる疾患の治療は、当技術分野で記載されており（例えば、国際公開第２００６／０２７１４７、ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１２８４４）、前記疾患が、敗血症、敗血症性ショック、心臓血管疾患、感染症、皮膚疾患、内分泌疾患、代謝性疾患、消化器疾患、癌、炎症、血液疾患、呼吸器疾患、筋骨格疾患、神経系疾患、泌尿器疾患であってもよい。

【0007】

ペプチド（ＡＤＭ２２−５２）［１］及び小分子ＡＤＭ受容体アンタゴニスト［２］並びにＡＤＭ受容体［３］若しくはＡＤＭ［４］のいずれかに対する抗体の使用を含む、腫瘍細胞の成長を抑制するためのＡＤＭシグナル系を調節することの可能性が記載されている。より詳細には、抗ＡＤＭ抗体の使用が以下に記載されている：ポリクローナル抗ＡＤＭ１−５２抗体を用いるアドレノメデュリンの中和がインビトロにおけるヒト神経膠芽腫の成長を阻害し、インビボで、腫瘍異種移植片の成長を抑制することが記載されている［５］。使用した抗体は、全長ＡＤＭ １−５２に対してのみ完全な反応性を示し、一方で、Ｎ末端が切断されたＡＤＭペプチド改変体に対しては顕著に減少した。

【0008】

モノクローナル抗ＡＤＭ抗体（ＭｏＡｂ−Ｇ６）は、１００μｇ／ｍＬで適用した場合、いくつかの腫瘍細胞株（ＮＣＩ−Ｈ１５７、ＮＣＩ−Ｈ７２０、ＭＣＦ−７、ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ−３）の成長を３０〜５０％抑制することが示された［６］。ＭｏＡｂ−Ｇ６は、ペプチドのプレプロＡＤＭ１１６〜１４６（Ｔ−Ｖ−Ｑ−Ｋ−Ｌ−Ａ−Ｈ−Ｑ−Ｉ−Ｙ−Ｑ−Ｆ−Ｔ−Ｄ−Ｋ−Ｄ−Ｋ−Ｄ−Ｎ−Ｖ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｓ−Ｋ−Ｉ−Ｓ−Ｐ−Ｑ−Ｇ−Ｙ−ＮＨ２（配列番号３））（Ｐ０７２とも呼ばれる）で免疫して開発されたＩｇＡ型抗体である［７］。モノクローナル抗体ＭｏＡｂ−Ｇ６の正確なエピトープは知られていない。

【0009】

モノクローナル抗体ＭｏＡｂ−Ｇ６は、ＡＤＭの生物活性を中和すると言われ（米国特許第７９３９６３９号）、その受容体へＡＤＭが結合することを完全に阻害することが示された。国際公開第２００６／０２７１４７号は、ＡＤＭ受容体に対するバインダー（抗体を含む）で癌を治療するアプローチを記述する。

【発明の概要】

【0010】

本発明の主題は、癌の治療に使用するための、ＡＤＭのＣ末端部分、ＡＤＭのａａ４３〜５２（配列番号１）：ＡＰＲＳＫＩＳＰＱＧＹ−ＮＨ２に結合する抗ＡＤＭ抗体又は抗ＡＤＭ抗体フラグメント又は抗ＡＤＭ非Ｉｇスキャフォールドである。

【0011】

ＡＤＭのＣ末端部分、ＡＤＭのａａ４３〜５２（配列番号１）：ＡＰＲＳＫＩＳＰＱＧＹ−ＮＨ２に結合する抗ＡＤＭ抗体又は抗ＡＤＭ抗体フラグメント又は抗ＡＤＭ非Ｉｇスキャフォールドは、癌を治療する場合に、公知の抗体と比較して、良好な特性を示す。ＡＤＭのＣ末端部分、ＡＤＭのａａ４３〜５２（配列番号１）：ＡＰＲＳＫＩＳＰＱＧＹ−ＮＨ２に結合する抗ＡＤＭ抗体又は抗ＡＤＭ抗体フラグメント又は抗ＡＤＭ非Ｉｇスキャフォールドは、公知のＡＤＭ抗体と比較して有意に腫瘍増殖を減少させる能力を有する。

【0012】

このような抗体は、ＣＴ−Ｈ、ＣＴ−Ｈ−１、ＣＴ−Ｈ−２、ＣＴ−Ｈ−３、ＣＴ−Ｈ−Ｇｌｙ、ＣＴ−Ｈ−ＯＨ（表３）からなる群から選択されてもよく、それは、以下に記載されている：
・群ＣＴ−Ｈ、ＣＴ−Ｈ−１、ＣＴ−Ｈ−２、ＣＴ−Ｈ−３からの抗体は、ＡＤＭのＣ末端部分、ＡＤＭのａａ４３〜５２（配列番号１）：ＡＰＲＳＫＩＳＰＱＧＹ−ＮＨ２に結合する抗ＡＤＭ抗体又は抗ＡＤＭ抗体フラグメント又は抗ＡＤＭ非Ｉｇスキャフォールドスキャフォールドであって、ビオチン−ＦＴＤＫＤＫＤＮＶＡＰＲＳＫＩＳＰＱＧＹ−ＮＨ２（配列番号４）に結合し、比較可能な条件下において、ビオチン−ＦＴＤＫＤＫＤＮＶＡＰＲＳＫＩＳＰＱＧＹ−ＮＨ２（配列番号４）への結合と比較して、ビオチン−ＦＴＤＫＤＤＮＶＡＰＲＳＫＩＳＰＱＧＹＧ−ＯＨ（配列番号５）へ２０％の未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満、及び、最も好ましくは１％未満結合するものとして、定義される。
・抗体ＣＴ−Ｈ−Ｇｌｙは、ＡＤＭのＣ末端部分、ＡＤＭ（配列番号１）のａａ４３〜５２に結合する抗ＡＤＭ抗体又は抗ＡＤＭ抗体フラグメント又は抗ＡＤＭ非Ｉｇスキャフォールドスキャフォールドとして定義され、ビオチン−ＦＴＤＫＤＫＤＮＶＡＰＲＳＫＩＳＰＱＧＹ−ＮＨ２（配列番号４）に結合し、比較可能な条件下において、ビオチン−ＦＴＤＫＤＫＤＮＶＡＰＲＳＫＩＳＰＱＧＹ−ＮＨ２（配列番号４）への結合と比較して、ビオチン−ＦＴＤＫＤＤＮＶＡＰＲＳＫＩＳＰＱＧＹＧ−ＯＨ（配列番号５）へ１００％以上、好ましくは２００％以上、より好ましくは３００％以上、及び、最も好ましくは４００％以上結合する。
・抗体ＣＴ−Ｈ−ＯＨ、ＡＤＭのＣ末端部分、ＡＤＭ（配列番号１）のａａ４３〜５２に結合する抗ＡＤＭ抗体又は抗ＡＤＭ抗体フラグメント又は抗ＡＤＭ非Ｉｇスキャフォールドスキャフォールドとして定義され、ビオチン−ＦＴＤＫＤＫＤＮＶＡＰＲＳＫＩＳＰＱＧＹ−ＮＨ２（配列番号４）に結合し、比較可能な条件下において、ビオチン−ＦＴＤＫＤＫＤＮＶＡＰＲＳＫＩＳＰＱＧＹ−ＮＨ２（配列番号．．）への結合と比較して、ビオチン−ＦＴＤＫＤＫＤＮＶＡＰＲＳＫＩＳＰＱＧＹ−ＯＨ（配列番号４）へ５００％以上、好ましくは１０００％以上、より好ましくは１５００％以上、及び、最も好ましくは２５００％以上結合する。

【0013】

明細書全体を通して、ＡＤＭはアドレノメデュリンを意味する。明細書を通じて、本発明の「抗体」又は「抗体フラグメント」又は「非Ｉｇスキャフォールド」はＡＤＭに結合することが可能であり、従って、ＡＤＭに指向し、従って、「抗ＡＤＭ抗体」、「抗ＡＤＭ抗体フラグメント」又は「抗ＡＤＭ非Ｉｇスキャフォールド」と呼ぶことができる。

【0014】

本発明の別の実施形態において、本発明によって提供される、抗ＡＤＭ抗体、抗ＡＤＭ抗体フラグメント、又は抗ＡＤＭ非Ｉｇスキャフォールドは、循環しているＡＤＭへ結合することが可能であり、従って、循環するＡＤＭに向けられる。

【0015】

抗アドレノメデュリン（ＡＤＭ）抗体はＡＤＭに特異的に結合する抗体であり、抗アドレノメデュリン抗体フラグメントは、ＡＤＭ抗体のフラグメントであって、前記フラグメントはＡＤＭに特異的に結合する。抗ＡＤＭ非Ｉｇスキャフォールドは、ＡＤＭに特異的に結合する非Ｉｇスキャフォールドである。ＡＤＭへの特異的な結合は、他の抗原に結合することを同様に許容する。これは、当該特異性が、抗体が惹起されたもの以外の他のポリペプチドと交差反応できることを排除しないことを意味する。これはまた、本発明の抗ＡＤＭ抗体フラグメント又は抗ＡＤＭ非Ｉｇスキャフォールドの特異性にも関係する。

【0016】

本発明の主題は、一実施形態において、抗ＡＤＭ抗体又は抗ＡＤＭ抗体フラグメント又は抗ＡＤＭ非Igスキャフォールドが、癌の治療に使用するためのものであって、ここで、前記抗ＡＤＭ抗体又は抗ＡＤＭ抗体フラグメント又は抗ＡＤＭ非Ｉｇスキャフォールドが、結合のために、ＡＤＭのＣ末端部分、ＡＤＭのａａ４３〜５２（配列番号１）：ＡＰＲＳＫＩＳＰＱＧＹ−ＮＨ２内のＣ末端がアミド化されたチロシン残基の存在を必要とする。

【0017】

結合するために、ＡＤＭのＣ末端部分、ＡＤＭのａａ４３〜５２（配列番号１）：ＡＰＲＳＫＩＳＰＱＧＹ−ＮＨ２内のＣ末端がアミド化されたチロシン残基の存在を必要とする抗体は、以下のように定義される：ビオチン−ＦＴＤＫＤＫＤＮＶＡＰＲＳＫＩＳＰＱＧＹ−ＮＨ２（配列番号４）に結合し、比較可能な条件下において、ビオチン−ＦＴＤＫＤＫＤＮＶＡＰＲＳＫＩＳＰＱＧＹ−ＮＨ２（配列番号４）への結合と比較して、ビオチン−ＦＴＤＫＤＤＮＶＡＰＲＳＫＩＳＰＱＧＹＧ−ＯＨ（配列番号５）へ２０％の未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満、及び、最も好ましくは１％未満結合する抗体である。

【0018】

換言すれば、本発明の主題は、一実施形態において、癌の治療に使用するための抗ＡＤＭ抗体又は抗ＡＤＭ抗体フラグメント又は抗ＡＤＭ非Ｉｇスキャフォールドであって、ここで、前記抗ＡＤＭ抗体又は抗ＡＤＭ抗体フラグメント又は抗ＡＤＭ非Ｉｇスキャフォールドは、ＡＤＭのＣ末端部分、ＡＤＭのａａ４３〜５２（配列番号１）：ＡＰＲＳＫＩＳＰＱＧＹ−ＮＨ２内のＣ末端がアミド化されたチロシン残基へ結合し、比較可能な条件下において、ビオチン−ＦＴＤＫＤＫＤＮＶＡＰＲＳＫＩＳＰＱＧＹ−ＮＨ２（配列番号４）への結合と比較して、ビオチン−ＦＴＤＫＤＤＮＶＡＰＲＳＫＩＳＰＱＧＹＧ−ＯＨ（配列番号５）へ２０％の未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満、及び、最も好ましくは１％未満結合する。比較可能な条件とは、実施例１に記載されているアッセイのような、同一の結合アッセイの使用を意味する。

【0019】

ＡＤＭのＣ末端部分のＣ末端アミド化されたチロシン残基の存在を必要とする抗体は、ＡＤＭの遊離Ｃ末端アミド化チロシン残基（ＡＤＭの位置５２）を含む、ＡＤＭのＣ末端部分を含む抗原で免疫することによって開発され得る。そのような免疫後、ＡＤＭのＣ末端部分のＣ末端アミド化されたチロシン残基の存在を必要とする抗体は、ＡＤＭの遊離Ｃ末端アミド化チロシン残基（ＡＤＭの位置５２）を含むＡＤＭのＣ末端部分、及び、関連するペプチドへの結合を試験することによる、この免疫工程より選択され得る（モノクローナル抗体の開発の場合、代表的なハイブリドーマ細胞株から選択された抗体が試験される）。このような抗体は、遊離Ｃ末端アミド化チロシンを含むＡＤＭのＣ末端部分に結合しなければならないが、Ｃ末端がアミド基の代わりにＣＯＯＨ基を有するＣ末端のチロシン残基（ＡＤＭの位置５２）を含むＡＤＭのＣ末端部分には結合してはならない。それはまた、少なくともＣ末端チロシン残基（ＡＤＭの位置５２）を欠くＡＤＭのＣ末端部分に結合してはならない。

【0020】

Ｃ末端がアミド化された生物学的に活性があるアドレノメデュリンの血漿中濃度は、Ｃ末端グリシンが伸長した生物学的に不活性なアドレノメデュリンバリアントよりも、約５倍少ないことが記載されている（１ Ｋｉｔａｍｕｒａ Ｋ，Ｋａｔｏ Ｊ，Ｋａｗａｍｏｔｏ Ｍ，Ｔａｎａｋａ Ｍ，Ｃｈｉｎｏ Ｎ，Ｋａｎｇａｗａ Ｋ，Ｅｔｏ Ｔ．Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｆｏｒｍ ｏｆ ｇｌｙｃｉｎｅ−ｅｘｔｅｎｄｅｄ ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ ｉｓ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １９９８；２４４：５５１−５．）。従って、Ｃ末端がアミド化された生物学的に活性があるアドレノメデュリンに特異的に結合し、本質的にはＣ末端のグリシンが伸長した生物学的に不活性なアドレノメデュリンバリアントに結合しない抗体は、インビボでＣ末端アミド化された生物学的に活性なアドレノメデュリンと同様に結合を達成するために、この差動（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）結合特異性のない抗体と比較して、少なくとも約５倍少ない量が適用され得る。さらに、アミド化されたＣ末端に特異的に結合しない抗体はまた、プロ又はプレプロアドレノメデュリンへ結合してもよく、予測不可能に早い速度で、この結合によって消費されてもよい。従って、及びアミド化されたＣ末端に対する結合特異性を有する抗体は、インビボでＣ末端がアミド化された生物学的に活性なアドレノメデュリンと同様の結合を達成するために、この差動結合特異性のない抗体と比較して、少なくとも約５倍少ない量が適用され得ることが期待される。より少ない用量の治療用化合物を適用することは、より少ない副作用と関連し、また、よりコスト効果的である。

【0021】

ＡＤＭは、種々の腫瘍で発現しており、そこで、分裂促進的細胞の分子及び生理学的特徴のいくつかを悪化させる。ＡＤＭは、いくつかの癌タイプで成長を刺激する分裂促進因子であって、より攻撃的な腫瘍表現型を促進することが示されている。また、ＡＤＭは、癌細胞に対するアポトーシス生存因子及び免疫応答の間接的な抑制因子である。ＡＤＭは、固形腫瘍近傍の典型的な特徴である、低酸素圧に曝された環境で重要な役割を果たしている。これらの条件下で、ＡＤＭは、低酸素誘導因子１（ＨＩＦ−１）依存性経路を介してアップレギュレートされ、血管新生を促進する強力な血管新生因子として働く［８、９］。

【0022】

本発明の特定の実施形態において、前記抗ＡＤＭ抗体又は抗ＡＤＭ抗体フラグメント又は抗ＡＤＭ非Ｉｇスキャフォールドは、癌の治療における使用のためであって、ここで、前記癌は：前立腺、乳房、結腸、肺、膀胱、皮膚、子宮、頸部、口腔及び咽頭、胃、卵巣、腎臓、膵臓、非ホジキンリンパ腫、白血病、肝臓、食道、精巣、甲状腺、中枢神経系、喉頭、胆嚢、形質細胞腫（ｐｌａｓｍｏｃｙｔｏｍｅ）、並びにホジキン病（ｍｏｒｂｕｓ ｈｏｄｇｅｋｉｎ）からなる群から選択される。

【0023】

本発明の別の特定の実施形態において、前記抗ＡＤＭ抗体又は抗ＡＤＭ抗体フラグメント又は抗ＡＤＭ非Ｉｇスキャフォールドは、癌の治療における使用のためであって、ここで、前記癌は：前立腺、乳房、結腸、肺、膀胱、皮膚、子宮、頸部、腎臓、膵臓、口腔及び咽頭、胃、並びに卵巣からなる群から選択される。

【0024】

特定の実施形態において、治療される癌は、Ｋ−ＲＡＳ陽性の癌である。 ＲＡＳタンパク質は、細胞内シグナルを伝達する小さなＧＴＰアーゼ酵素である。細胞の増殖及び生存に中心的な役割を果たすため、それらは細胞に重要である。ほぼ３０年前に発見されたこれらの遺伝子の一つである、Ｋ−ＲＡＳは、膵臓癌の９０％、結腸癌の４０％、及び非小細胞肺癌の２０％を含む、ヒトの腫瘍の３０％で変異している。

【0025】

活性化しているＫ−ＲＡＳの変異は、ヒトの癌において最も頻度の高い発癌性変異である。Ｋ−ＲＡＳ変異を有する癌は高悪性であり、標準的な治療にほとんど反応しない。Ｋ−ＲＡＳの持続的な活性化及びシグナル伝達経路の下流の刺激は、多くの癌の特徴である、持続的増殖、代謝再プログラミング、抗アポトーシス、腫瘍微小環境の再構築、免疫応答の浸潤、細胞遊走および転移を駆動する（Ｐｙｌａｙｅｖａ−Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ，２０１１）。Ｐｙｌａｙｅｖａ−Ｇｕｐｔａ Ｙ，Ｇｒａｂｏｃｋａ Ｅ，Ｂａｒ−Ｓａｇｉ Ｄ（２０１１） ＲＡＳ 発がん遺伝子：ｗｅａｖｉｎｇ ａ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ ｗｅｂ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ １１：７６１−７７４．

【0026】

臨床の現場では、Ｋ−ＲＡＳ変異は、予後が一般に不良であり、治療の選択肢が限られている人患者のサブセットを定義する。ＲＡＳタンパク質を直接又は間接的に標的とする薬剤が存在せず、ＲＡＳ駆動型癌に効果的な治療が存在しない。従って、ＲＡＳ及びＫ＿ＲＡＳ癌は、標的療法を用いる治療から除外されている。

【0027】

単一のアミノ酸置換、特に、Ｋ−Ｒａｓ遺伝子における単一ヌクレオチド置換は、突然変異を活性化する原因である。ほとんどのＫＲＡＳ変異は、遺伝子のコドン１２又は１３で起こる。種々の実験室での方法は、ＫＲＡＳ遺伝子の変異の状態を評価するために開発されている。対立遺伝子特異的ＰＣＲ、溶融曲線分析を用いるリアルタイムＰＣＲ法及び核酸配列決定法を含むこれらの方法の多くは、ＫＲＡＳ変異のためのアンダーソンＳＭ実験方法、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ．２０１１ Ｊｕｌ；１１（６）：６３５−４２．で記述されるような、腫瘍サンプル中の組織不均一性に対処するための適切な分析性能を提供する。Ｋ−ＲＡＳ試験の現在のゴールドスタンダードは、ＰＣＲ増幅産物の直接的シークエンシングのままである（Ｎｏｌｌａｕ Ｐ，Ｗａｇｅｎｅｒ Ｃ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ａｎｄ ｑｕａｌｉｔｙ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ．ＩＦＣＣ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ １９９７，４３：１１１４−１１２８）。

【0028】

アドレノメデュリン（ＡＤＭ）は、Ｗａｎｇら（２０１４）［Ｗａｎｇ Ｌ，Ｇａｌａ Ｍ，Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｍ，Ｐｉｎｏ ＭＳ，Ｋｉｋｕｃｈｉ Ｈ，Ｓｈｕｅ ＤＳ，Ｓｈｉｒａｓａｗａ Ｓ，Ａｕｓｔｉｎ ＴＲ，Ｌｙｎｃｈ ＭＰ，Ｒｕｅｄａ ＢＲ，Ｚｕｋｅｒｂｅｒｇ ＬＲ，Ｃｈｕｎｇ ＤＣ：Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ ｉｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：１３４，２０４１−２０５０（２０１４）］によって、特に、固形腫瘍で発生する低酸素条件下で、ＫＲＡＳ癌遺伝子を発現するヒト大腸癌細胞株の中で最も大幅にアップレギュレートされた遺伝子の一つとして同定された。結腸腫瘍異種移植片において、ＡＤＭの様々なコード領域に対する短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）によるＡＤＭのインビボノックダウンは、血管新生をブロックし、アポトーシスを刺激し、腫瘍抑制をもたらした。ＣＲＣを有する５６人の患者のうち、有意に高いＡＤＭの発現レベルが、ＫＲＡＳ変異を保有するサンプルにおいて観察された。変異ＫＲＡＳは、低酸素環境での腫瘍の生存に特異的な役割を果たし、ＡＤＭをアップレギュレートするために相乗的に作用し得ることが示唆されている。まとめると、変異Ｋ−ＲａｓによるＡＤＭの活性化増強は、結腸腫瘍の低酸素ストレス条件への適応に重要な役割を果たしている可能性がある。

【0029】

本発明の抗ＡＤＭ抗体又は抗アドレノメデュリン抗体フラグメント又は抗ＡＤＭ非Ｉｇスキャフォールドは、ヒトＡＤＭに対し、親和性定数（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｏｎｓｔａｎｔ）が１０^-7Ｍ未満、好ましくは１０^-8Ｍ未満、好ましい親和性定数は１０^-9Ｍ未満、最も好ましくは１０^-10Ｍ未満であるような親和性を示す。当業者は、高用量の化合物を適用することによって、低親和性を補償することも考えられ、この測定値が、本発明の範囲外を導かないであろうことを知っている。親和性定数は、実施例１に記載の方法に従って決定されてもよい。

【0030】

本発明の抗体は、特異的に抗原に結合する免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる１以上のポリペプチドを含むタンパク質である。認識される免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ（ＩｇＡ）、ガンマ（ＩｇＧ₁、ＩｇＧ₂、ＩｇＧ₃、ＩｇＧ₄）、デルタ（ＩｇＤ）、イプシロン（ＩｇＥ）及びミュー（ＩｇＭ）定常領域遺伝子、並びに、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。全長免疫グロブリン軽鎖は、一般的に約２５Ｋｄ又は長さが２１４アミノ酸である。全長免疫グロブリン重鎖は、一般に、約５０Ｋｄ又は長さが４４６アミノ酸である。軽鎖は、ＮＨ２末端で可変領域遺伝子（長さが約１１０アミノ酸）及びＣＯＯＨ末端のカッパ又はラムダ定常領域遺伝子によってコードされている。重鎖は、同様に可変領域遺伝子（長さ約１１６アミノ酸）及び他の定常領域遺伝子の一つによりコードされている。

【0031】

抗体の基本構造単位は、一般的に同一免疫グロブリン鎖の２つの対からなる四量体であって、各ペアが、１つの軽鎖及び１つの重鎖を有する。各対において、軽鎖及び重鎖可変領域は抗原に結合し、定常領域は、エフェクター機能を媒介する。免疫グロブリンは、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、及びＦ（ａｂ’）２並びに二機能性（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）ハイブリッド抗体及び一本鎖を含む、様々な他の形態も示す（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１０５，１９８７；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：５８７９−５８８３，１９８８； Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６，１９８８；Ｈｏｏｄ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｎ．Ｙ．，２ｎｄ ｅｄ．，１９８４；Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｈｏｏｄ，Ｎａｔｕｒｅ ３２３：１５−１６，１９８６）。免疫グロブリンの軽鎖又は重鎖の可変領域はまた、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる、３つの超可変領域によって中断されるフレームワーク領域を含む（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｅ．Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８３ 参照）。上述のように、ＣＤＲは抗原のエピトープへの結合に主に関与している。免疫複合体は、抗体、例えば、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体又は機能的抗体フラグメントであって、抗原に特異的に結合する。

【0032】

キメラ抗体は、その軽鎖及び重鎖遺伝子が、異なる種に属する免疫グロブリン可変及び定常領域遺伝子から、典型的には遺伝子工学によって構築された抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体由来の遺伝子の可変セグメントは、ヒト定常セグメント、例えばカッパ及びガンマ１又はガンマ３へ結合され得る。一実施例において、治療用キメラ抗体は、従って、マウス抗体由来の可変若しくは抗原結合ドメイン、及び、ヒト抗体（他の哺乳動物種を使用することができるが）からの定常若しくはエフェクタードメインから構成されるハイブリッドタンパク質である、又は、可変領域が分子技術によって製造され得る。キメラ抗体を作製する方法は当技術分野でよく知られている。例えば、米国特許第５８０７７１５号を参照。「ヒト化」免疫グロブリンは、ヒトフレームワーク領域及び非ヒト（例えば、マウス、ラット、又は合成等）免疫グロブリン由来の１以上のＣＤＲを含む免疫グロブリンである。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは、「アクセプター」と呼ばれる。一実施形態では、全てのＣＤＲは、ヒト化免疫グロブリンにおけるドナー免疫グロブリンに由来する。定常領域は存在する必要はないが、それらがある場合、それらはヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一でなければならず、すなわち、少なくとも約８５〜９０％、例えば約９５％以上同一である。従って、ヒト化免疫グロブリンの全ての部分は、おそらくＣＤＲを除いて、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。「ヒト化抗体」は、ヒト化軽鎖及びヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体である。ヒト化抗体は、ＣＤＲを提供するドナー抗体と同じ抗原に結合する。ヒト化免疫グロブリン又は抗体のアクセプターフレームワークは、ドナーフレームワークから採取したアミノ酸による置換数が限定されてもよい。ヒト化又は他のモノクローナル抗体は、抗原結合又は他の免疫グロブリン機能に実質的に影響を及ぼさない追加の保存的アミノ酸置換を有し得る。典型的な保存的置換は、ｇｌｙ、ａｌａ；ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ；ａｓｐ、ｇｌｕ；ａｓｎ、ｇlｎ；ｓｅｒ、ｔｈｒ；ｌｙｓ、ａｒｇ；及びｐｈｅ、ｔｙｒ等である。ヒト化免疫グロブリンは、遺伝子工学によって構築することができる（例えば、米国特許第５５８５０８９を参照のこと）。ヒト抗体は、軽鎖及び重鎖遺伝子がヒト起源である、抗体である。

【0033】

ヒト抗体は、当技術分野で公知の方法を用いて作製することができる。ヒト抗体は、目的の抗体を分泌するヒトＢ細胞を不死化することにより製造することができる。不死化は、例えば、ＥＢＶ感染によって、又はトリオーマ細胞を産生するために骨髄腫若しくはハイブリドーマ細胞とヒトＢ細胞とを融合することによって達成することができる。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイ法で製造（例えば、Ｄｏｗｅｒら、国際出願公開第９１／１７２７１号；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，国際出願公開第９２／００１０４７号；及び、Ｗｉｎｔｅｒ，国際出願公開第９２／２０７９１号）又は、ヒトコンビナトリアルモノクローナル抗体ライブラリーから選択され得る（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓのウェブサイトを参照）。ヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニック動物を用いて調製することができる（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇら、国際出願公開第９３／１２２２７号、及び、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ、国際出願公開第９１／１０７４１号を参照）。

【0034】

従って、抗ＡＤＭ抗体は、当技術分野で既知のフォーマットを有してもよい。例としては、ヒト抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体である。好適な実施形態において、本発明に係る抗体は、組換えにより製造した抗体、例えばＩｇＧ、典型的な完全長の免疫グロブリン、又は、重鎖及び／又は軽鎖の少なくともＦ−可変ドメインを含む抗体フラグメント、例えば、これに限定されないが、Ｆａｂミニボディ、短鎖Ｆａｂ抗体、エピトープタブを有する一価Ｆａｂ抗体、例えばＦａｂ−Ｖ５Ｓｘ２；ＣＨ３ドメインと二量体化した二価Ｆａｂ（ミニ抗体）；二価Ｆａｂ若しくは多価Ｆａｂ、例えば、異種ドメインの助けを借りた多量体を介して形成された、例えば、ｄＨＬＸドメイン（例えば、Ｆａｂ−ｄＨＬＸ−ＦＳｘ２）の二量体化を介した；Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、多量体化した多価及び／又は多特異的ｓｃＦｖフラグメント、二価及び／又は二重特異的抗体、ＢＩＴＥ（登録商標）（二重特異的Ｔ細胞エンゲージャ（ｅｎｇａｇｅｒ））、三重機能抗体、多価抗体、例えば、Ｇ以外異なるクラス由来；シングルドメイン抗体、例えば、ラクダ科若しくは魚類免疫グロブリン及び多数由来のナノボディ、を含む化学的に結合した抗体（フラグメント抗原結合）である。

【0035】

好ましい実施形態において、抗ＡＤＭ抗体フォーマットは、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）₂フラグメント及びｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質からなる群から選択される。他の好ましい実施形態では、抗体フォーマットは、ｓｃＦａｂフラグメント、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント及びバイオアベイラビリティ（ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）最適化コンジュゲート、例えばＰＥＧ化フラグメントを含む群から選択される。最も好ましいフォーマットの１つは、ｓｃＦａｂフォーマットである。

【0036】

抗ＡＤＭ抗体に加えて、他の生体高分子スキャフォールドは、ターゲット分子を複合化することが当該分野で知られており、高度に標的特異的な生体高分子を生成するために使用されてきた。例としては、アプタマー、スピーゲルマー、アンチカリン及びコノトキシンである。アプタマーは、特定の標的分子に結合するオリゴヌクレオチド酸又はペプチド分子である。シュピーゲルマーは、特定の標的分子に結合するＬ−リボース単位から構築されたＲＮＡ様分子である。アンチカリンは、特定の標的分子に結合する人工的なタンパク質である。これらは、天然に結合するタンパク質のファミリーであるヒトリポカリンに由来する。アンチカリンは、モノクローナル抗体の代わりに使用されているが、約１８０アミノ酸のサイズで、約２０ｋＤａを有し、約８倍小さい（Ｇｅｂａｕｅｒ Ｍ，Ｓｋｅｒｒａ Ａ：Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ａｓ ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ． Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ２００９，１３（３）：２４５−２５５．；Ｗｕｒｃｈ Ｔ，Ｐｉｅｒｒｅ Ａ，Ｄｅｐｉｌ Ｓ：Ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ａｓ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ： ｆｒｏｍ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｔｏ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒｏｏｆ−ｏｆ−ｃｏｎｃｅｐｔ． Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１２，３０（ｌｌ）：５７５−５８２．，Ｓｋｅｒｒａ Ａ（Ｊｕｎｅ ２００８）．“Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ − ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ ｌｉｇａｎｄ ｐｏｃｋｅｔ ｔｏ ｅｎｇｉｎｅｅｒ ｎｏｖｅｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ”．ＦＥＢＳ Ｊ．２７５（１１）：２６７７−８３．）。

【0037】

非Ｉｇスキャフォールドは、タンパク質スキャフォールド又はペプチドスキャフォールドであってもよく、それらはリガンド又は抗原に結合することが可能であるように、抗体模倣物として使用されてもよい。非Ｉｇスキャフォールドは、テトラネクチンベース非Ｉｇスキャフォール（例えば、米国特許出願公開第２０１０／００２８９９５号明細書に記載）、フィブロネクチンスキャフォールド（例えば、欧州特許第１２６６０２５号明細書に記載）、リポカリンベーススキャフォールド（例えば、国際公開第２０１１／１５４４２０号に記載）、ユビキチンスキャフォールド（例えば、国際公開第２０１１／０７３２１４号に記載）、トランファースキャフォールド（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）（例えば、米国特許出願公開第２００４／００２３３３４号明細書に記載）、プロテインＡスキャフォールド（例えば、欧州特許出願公開第２２３１８６０号明細書に記載）、アンキリンリピートベーススキャフォールド（例えば、国際公開第２０１０／０６０７４８号に記載）、マイクロプロテイン、好ましくはシスチンノットを形成するマイクロプロテインスキャフォールド（例えば、欧州特許出願公開第２３１４３０８号明細書に記載）、Ｆｙｎ ＳＨ３ドメインベーススキャフォールド（例えば、国際公開第２０１１／０２３６８５号に記載）、ＥＧＦＲ−Ａ−ドメインベーススキャフォールド（例えば、国際公開第２００５／０４０２２９号に記載）及びクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ドメインベーススキャフォールド（例えば、欧州特許第１９４１８６７号明細書に記載）、からなる群から選択されてもよい。

【0038】

さらに、本発明の一実施形態において、抗アドレノメデュリン（ＡＤＭ）抗体又は抗アドレノメデュリン抗体フラグメント又は抗ＡＤＭ非Ｉｇスキャフォールドは、単一特異的である。単一特異的抗アドレノメデュリン（ＡＤＭ）抗体又は単一特異的抗アドレノメデュリン抗体フラグメント又は単一特異的非Ｉｇスキャフォールドとは、標的ＡＤＭ内の好ましくは少なくとも４、又は少なくとも５アミノ酸を包含する一つの特異的領域に結合する抗体又は抗体フラグメント又は非Ｉｇスキャフォールドを意味する。単一特異的抗アドレノメデュリン（ＡＤＭ）抗体又は単一特異的抗アドレノメデュリン抗体フラグメント又は単一特異的非Ｉｇスキャフォールドとは、同一の抗原に対して全て親和性を有する抗アドレノメデュリン（ＡＤＭ）抗体又は抗アドレノメデュリン抗体フラグメント又は抗ＡＤＭ非Ｉｇスキャフォールドである。別の特別な実施形態において、抗ＡＤＭ抗体又はＡＤＭに結合する抗体フラグメントは、単一特異的抗体である。単一特異的とは、前記抗体若しくは抗体フラグメントが、標的ＡＤＭ内の好ましくは少なくとも４又は好ましくは少なくとも５アミノ酸を包含する１つの特異的領域へ結合することを意味する。単一特異的抗体又はフラグメントは、同一の抗原に対して全て親和性を有する抗体又はフラグメントである。モノクローナル抗体は、単一特異的であるが、単一特異的抗体はまた、一般的な生殖細胞からそれらを製造する以外の手段によって製造されてもよい。

【0039】

本発明の特定の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体又はそのフラグメントである。本発明の一実施形態において、抗ＡＤＭ抗体又は抗ＡＤＭ抗体フラグメントは、ヒト若しくはヒト化抗体である又はそれに由来する。特定の一実施形態において、一以上の（マウス）ＣＤＲが、ヒト抗体又は抗体フラグメントに移植される。

【0040】

本発明の１つの好ましい実施態様において、本発明にかかる抗体は、以下のように製造されてもよい：

【0041】

Ｂａｌｂ／ｃマウスは、１００μｇのペプチド−ＢＳＡコンジュゲート（Ｐｅｐｔｉｄｅ−ＢＳＡ−Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）（表１参照）を０日目及び１４日目（１００μＬの完全フロイントアジュバント中で乳化させたもの）、及び、５０μｇを２１日目及び２８日目（１００μＬの不完全フロイントアジュバント中で乳化させたもの）に免疫した。融合実験の３日前に、１００μＬ生理食塩水に溶解したコンジュゲート５０μｇを、動物１匹は腹腔内に、１匹は静脈内に、注射で与えられた。

【0042】

免疫したマウスの脾細胞と、骨髄腫細胞株ＳＰ２／０細胞を３７℃で３０秒間１ｍＬの５０％ポリエチレングリコールを用いて融合させた。洗浄後、細胞を９６ウェル細胞培養プレートに播種した。ハイブリッドクローンは、ＨＡＴ培地［２０％ウシ胎児血清及びＨＡＴサプリメントを補充したＲＰＭＩ１６４０培地］中で成長するものとして選択された。２週間後、ＨＡＴ培地をＨＴ培地と交換し、３継代後に、通常の細胞培養培地に戻した。

【0043】

細胞培養上清は、融合の三週間後の抗原特異的ＩｇＧ抗体について最初にスクリーニングを行った。ＣＴ−Ｈ抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を選択するための基準は、ペプチドＡＰＲＳＫＩＳＰＱＧＹ−ＮＨ₂（配列番号１）に対して陽性結合であるが、ペプチドＡＰＲＳＫＩＳＰＱＧＹ−ＣＯＯＨ（配列番号１）に対して結合ネガティブであった。

【0044】

陽性反応を示したマイクロ培養物は、増殖のために２４ウェルプレートに移した。再試験後に選択した培養物はクローン化され、限界希釈法を用いて再クローニングし、アイソタイプを決定した。

【0045】

（Ｌａｎｅ，Ｒ．Ｄ．“Ａ ｓｈｏｒｔ−ｄｕｒａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｆｕｓｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ”，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．８１：２２３−２２８；（１９８５），Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．“Ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（ＧＡＤ） ｉｓ ｎｏｔ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｒａｔ ｉｓｌｅｔ ｃｅｌｌｓ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＧＡＤ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．２８：１１−１５，（１９９６））。

【0046】

抗体は、以下の手順に従って、ファージディスプレイを用いて製造されてもよい：

【0047】

ヒトナイーブ抗体遺伝子ライブラリーＨＡＬ７／８を、アドレノメデュリンペプチドに対する組換え単鎖Ｆ−可変ドメイン（ｓｃＦｖ）の単離のために使用した。抗体遺伝子ライブラリーは、アドレノメデュリンペプチド配列へ２つの異なるスペーサを介して連結されたビオチンタグを含むペプチドの使用を含むパニング戦略を用いてスクリーニングした。非特異的結合抗原及びストレプトアビジン結合抗原を使用するパニングラウンドの混合が、非特異的バインダーのバックグラウンドを最小化するために使用された。パニングの第三ラウンドで溶出したファージは、モノクローナルｓｃＦｖを発現する大腸菌株の生成のために使用された。これらのクローン株の培養物からの上清を、直接、抗原ＥＬＩＳＡ試験に使用した（Ｈｕｓｔ，Ｍ．，Ｍｅｙｅｒ，Ｔ．，Ｖｏｅｄｉｓｃｈ，Ｂ．，Ｒｉｉｌｋｅｒ，Ｔ，，Ｔｈｉｅ，Ｈ．，Ｅｌ−Ｇｈｅｚａｌ，Ａ．，Ｋｉｒｓｃｈ，Ｍ．Ｉ．，Ｓｃｈｕｔｔｅ，Ｍ．，Ｈｅｌｍｓｉｎｇ，Ｓ．，Ｍｅｉｅｒ，Ｄ．，Ｓｃｈｉｒｒｍａｎｎ，Ｔ．，Ｄｉｉｂｅｌ，Ｓ．，２０１１．Ａ ｈｕｍａｎ ｓｃＦｖ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｐｉｐｅｌｉｎｅ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５２，１５９−１７０；Ｓｃｈｕｔｔｅ，Ｍ．，Ｔｈｕｌｌｉｅｒ，Ｐ．，Ｐｅｌａｔ，Ｔ．，Ｗｅｚｌｅｒ，Ｘ．，Ｒｏｓｅｎｓｔｏｃｋ，Ｐ．，Ｈｉｎｚ，Ｄ．，Ｋｉｒｓｃｈ，Ｍ．Ｉ．，Ｈａｓｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｆｒａｎｋ，Ｒ．， Ｓｃｈｉｒｒｍａｎｎ， Ｔ．，Ｇｕｎｚｅｒ，Ｍ．，Ｈｕｓｔ，Ｍ．，Ｄｉｉｂｅｌ，Ｓ．，２００９．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｕｔａｔｉｖｅ Ｃｒｆ ｓｐｌｉｃｅ ｖａｒｉａｎｔ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ．ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ４，ｅ６６２５、も参照）。

【0048】

マウス抗体のヒト化は、以下の手順に従って行っても良い：マウス起源の抗体のヒト化するために、相補性決定領域（ＣＤＲ）及び抗原を有するフレームワーク領域（ＦＲ）の構造的相互作用のために、抗体配列をモデリングする。構造モデリングに基づいて、ヒト起源の適切なＦＲを選択し、マウスのＣＤＲ配列がヒトＦＲに移植される。ＣＤＲ又はＦＲのアミノ酸配列の変異が、ＦＲ配列に対する種の変更によって廃止された構造的な相互作用を回復するために導入されてもよい。構造的な相互作用のこの回復は、ファージディスプレイライブラリーを用いるランダムなアプローチによって、又は、分子モデリングによって導かれる直接アプローチを介して達成されてもよい（Ａｌｍａｇｒｏ ＪＣ，Ｆｒａｎｓｓｏｎ Ｊ．，２００８．Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．２００８ Ｊａｎ １；１３：１６１９−３３）。

【0049】

好ましい実施形態では、ＡＤＭ抗体フォーマットは、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）₂フラグメント及びｓｃＦｖ−Ｆｃ融合プロテインからなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、抗体フォーマットは、ｓｃＦａｂフラグメント、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント及びその生体利用能最適化コンジュゲート、例えば、ＰＥＧ化フラグメントを含む群から選択される。

【0050】

最も好適なフォーマットの一つは、ヒト化抗体である。

【0051】

別の好ましい実施形態では、抗ＡＤＭ抗体、抗ＡＤＭ抗体フラグメント、又は抗ＡＤＭ非Ｉｇスキャフォールドは、完全長抗体、抗体フラグメント、又は非Ｉｇスキャフォールドである。

【0052】

好ましい実施形態において、抗アドレノメデュリン抗体又は抗アドレノメデュリン抗体フラグメント又は抗アドレノメデュリン非Ｉｇスキャフォールドは、ＡＤＭに含まれる少なくとも長さ５アミノ酸のエピトープに対するものであり、結合することができる。

【0053】

特定の実施形態において、抗アドレノメデュリン抗体又は抗アドレノメデュリン抗体フラグメント又は抗アドレノメデュリン非Ｉｇスキャフォールドは、ＡＤＭに含まれる少なくとも長さ４アミノ酸のエピトープに対するものであり、結合することができる。

【0054】

特定の一実施形態において、前記抗アドレノメデュリン抗体又は抗アドレノメデュリン抗体フラグメント又は抗アドレノメデュリン非Ｉｇスキャフォールドは、癌の治療に使用するものであって、ここで、前記抗体又はフラグメント又はスキャフォールドは、ＡＤＭ結合タンパク質１（補体因子Ｈ）ではない。

【0055】

特定の一実施形態において、前記抗アドレノメデュリン抗体又は抗アドレノメデュリン抗体フラグメント又は抗アドレノメデュリン非Ｉｇスキャフォールドは、癌の治療に使用するものであって、ここで、前記抗体又は抗体フラグメント又は非Ｉｇスキャフォールドは、ＡＤＭのａａ４３〜５２（配列番号１）：ＡＰＲＳＫＩＳＰＱＧＹ−ＮＨ２の配列内の少なくとも４又は５アミノ酸の領域と結合する。

【0056】

特定の一実施形態において、前記抗アドレノメデュリン抗体又は抗アドレノメデュリン抗体フラグメント又は抗アドレノメデュリン非Ｉｇスキャフォールドは、他の癌の薬剤と組み合わせて使用される、癌の治療に使用するものである。特定の一実施形態において、前記抗アドレノメデュリン抗体又は抗アドレノメデュリン抗体フラグメント又は抗アドレノメデュリン非Ｉｇスキャフォールドは、ジトスタチカ（Ｚｙｔｏｓｔａｔｉｋａ）、ＣＤ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ＴＮＦＲ阻害剤又はチロシンキナーゼ阻害剤と組み合わせて使用される、癌の治療に使用するものである。別の実施形態において、前記抗アドレノメデュリン抗体又は抗アドレノメデュリン抗体フラグメント又は抗アドレノメデュリン非Ｉｇスキャフォールドは、単独療法（ｍｏｎｏ−ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｕｍ）として使用される。

【0057】

ジトスタチカ（Ｚｙｔｏｓｔａｔｉｋａ）は、化学療法剤であり、当業者に知られており、以下を含む群から選択されてもよい：

【0058】

アビラテロン、アファチニブ、アリトレチノイン、アナストロゾル（Ａｎａｓｔｒｏｚｏｌ）、バゼドキシフェン（Ｂａｚｅｄｏｘｉｆｅｎ）、ベバシズマブ、ビカルタミド（Ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄ）、ブレオマイシン、カペシタビン、カルボプラチン、セツキシマブ、シスプラチン、クロミフェン（Ｃｌｏｍｉｆｅｎ）、クリゾチニブ（Ｃｒｉｚｏｔｉｍｂ）、シクロホスファミド、シプロテロン（Ｃｙｐｒｏｔｅｒｏｎ）、ダブラフェニブ（Ｄａｂｒａｆｅｎｉｂ）、ダカルバジン（Ｄａｃａｒｂａｚｉｎ）、ダサチニブ、ドセタキセル、ドキソルビシン、エンザルタミド、エピルビシン、エリブリン、エルロチニブ、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルオロウラシル、フルベストラント、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド（Ｈｙｄｒｏｘｙｃａｒｂａｍｉｄ）、イホスファミド、イマチニブ、イピリムマブ、イリノテカン、ラパチニブ、レナリドミド、レトロゾル（Ｌｅｔｒｏｚｏｌ）、メトトレキサート、マイトマイシン、ニロチニブ、オビヌツズマズ（Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ）、オファツムマブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パニツムマブ、ペルメトレクセド（Ｐｅｒｍｅｔｒｅｘｅｄ）、ペルツズマブ、ポマリドミド、ポナチニブ（Ｐｏｎａｔｉｎｉｂ）、ラロキシフェン、レゴラフェニブ、タモキシフェン、テモゾロミド、トラスツズマブ、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンフルニン（Ｖｉｎｆｌｕｎｉｎ）、ビノレルビン、ビスモデギブ。

【0059】

一実施形態において、前記抗アドレノメデュリン抗体又は抗アドレノメデュリン抗体フラグメント又は抗アドレノメデュリン非Ｉｇスキャフォールドは、ＣＤ阻害剤と組み合わせて使用される、癌の治療に使用するものであって、ここで、前記ＣＤ阻害剤が、アフツズマブ、アレムツズマブ、ビバツズマブメルタンシン（Ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）、ブレンツキシマブベドチン、ダセツズマブ（Ｄａｃｅｔｕｚｕｍａｂ）、エプラツズマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、イブリツモマブチウキセタン、イノツズマブ（Ｉｎｏｔｕｚｕｍａｂ）オゾカマイシン、インテツムマブ（Ｉｎｔｅｔｕｍｕｍａｂ）、イラツムマブ（Ｉｒａｔｕｍｕｍａｂ）、リンツズマブ（Ｌｉｎｔｕｚｕｍａｂ）、ロルボツズマブメルタシン（Ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、ルカツムマブ（Ｌｕｃａｔｕｍｕｍａｂ）、ルミリキシマブ（Ｌｕｍｉｌｉｘｉｍａｂ）、ミラツズマブ（Ｍｉｌａｔｕｚｕｍａｂ）、モキセツモマブパスドトクス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂ ｐａｓｕｄｏｔｏｘ）、オカラツズマブ（Ｏｃａｒａｔｕｚｕｍａｂ）、オファツムマブ、リツキシマブ、サマリズマブ（Ｓａｍａｌｉｚｕｍａｂ）、タプリツモマブパプトクス（Ｔａｐｌｉｔｕｍｏｍａｂ ｐａｐｔｏｘ）、テプロツムマブ（Ｔｅｐｒｏｔｕｍｕｍａｂ）、トシツモマブ（ベキサール）、ベルツズマブ及びボルセツズマブマフォドチン（Ｖｏｒｓｅｔｕｚｕｍａｂ ｍａｆｏｄｏｔｉｎ）、を含む群から選択される。

【0060】

一実施形態において、前記抗アドレノメデュリン抗体又は抗アドレノメデュリン抗体フラグメント又は抗アドレノメデュリン非Ｉｇスキャフォールドは、ＥＧＦＲ阻害剤と組み合わせて使用される、癌の治療に使用するものであって、ここで、前記ＥＧＦＲ阻害剤が、セツキシマブ、エルツマキソマブ（Ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）、イムガツズマブ（Ｉｍｇａｔｕｚｕｍａｂ）、マツズマブ、ネシツムマブ（Ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ）、ニモツズマブ、パニツムマブ、パトリツマブ（Ｐａｔｒｉｔｕｍａｂ）、ペルツズマブ、トラスツズマブ、ザルツムマブ及びザツキシマブ（Ｚａｔｕｘｉｍａｂ）を含む群から選択される。

【0061】

一実施形態において、前記抗アドレノメデュリン抗体又は抗アドレノメデュリン抗体フラグメント又は抗アドレノメデュリン非Ｉｇスキャフォールドは、ＶＥＧＦＲ阻害剤と組み合わせて使用される、癌の治療に使用するものであって、ここで、前記ＶＥＧＦＲ阻害剤が、アラシズマブペゴル（Ａｌａｃｉｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、イクルクマブ（Ｉｃｒｕｃｕｍａｂ）及びラムシルマブを含む群から選択される。

【0062】

一実施形態において、前記抗アドレノメデュリン抗体又は抗アドレノメデュリン抗体フラグメント又は抗アドレノメデュリン非Ｉｇスキャフォールドは、癌の治療に使用するものであって、ここで、前記ＴＮＦＲ阻害剤が、コナツムマブ（Ｃｏｎａｔｕｍｕｍａｂ）、レキサツムマブ（Ｌｅｘａｔｕｍｕｍａｂ）、マパツムマブ及びチガツズマブ（Ｔｉｇａｔｕｚｕｍａｂ）を含む群から選択される。

【0063】

特定の一実施形態では、前記抗アドレノメデュリン抗体又は抗アドレノメデュリン抗体フラグメント又は抗アドレノメデュリン非Ｉｇスキャフォールドは、ブレンツキシマブベドチン、ゲムツズマブオゾガマイシン、イブリツモマブチウキセタン、オファツムマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、リツキシマブ、トシツモマブ（ベキサール）及びトラスツズマブを含む群から選択される薬剤と組み合わせて使用する、癌の治療に使用するためのものである。

【0064】

別の好ましい実施形態では、前記抗アドレノメデュリン抗体又は抗アドレノメデュリン抗体フラグメント又は抗アドレノメデュリン非Ｉｇスキャフォールドは、アレムツズマブ、ベバシズマブ、ブレンツキシマブ（Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）、カツマキソマブ（Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ）、セツキシマブ、イブリツモマブ−チウキセタン、オファツムマブ、パニツムマブ、リツキシマブ、トラスツズマブを含む群から選択される薬剤と組み合わせて使用する、癌の治療に使用するためのものである。

【0065】

本発明の主題は、本発明にかかる、すなわち、本明細書に記載の実施態様の抗アドレノメデュリン抗体又は抗アドレノメデュリン抗体フラグメント又は抗アドレノメデュリン非Ｉｇスキャフォールドを含む医薬組成物である。本発明の主題は、単独療法として使用される、前記医薬組成物である。

【0066】

本発明の主題は、一実施形態において、ジトスタチカ（Ｚｙｔｏｓｔａｔｉｋａ）、ＣＤ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ＴＮＦＲ阻害剤又はチロシンキナーゼ阻害剤と組み合わせて使用する、癌の治療に使用するための医薬組成物である。

【0067】

ジトスタチカ、ＣＤ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ＴＮＦＲ阻害剤又はチロシンキナーゼ阻害剤は、上記に開示したものから選択されてもよい。

【0068】

一実施形態において、本発明の主題は、癌の治療に使用するための医薬組成物であり、アレムツズマブ、ベバシズマブ、ブレンツキシマブ、カツマキソマブ、セツキシマブ、イブリツモマブ−チウキセタン、オファツムマブ、パニツムマブ、リツキシマブ、トラスツズマブと組み合わせて使用される。

【0069】

一実施態様における本発明の主題は、上述のような、癌の治療で使用するための医薬組成物であって、ここで、前記医薬組成物が、例えば、静脈内に投与され得る。

【0070】

本発明の主題は、癌を治療する方法であって、ここで、治療上有効な量の前記抗ＡＤＭ抗体又は抗ＡＤＭ抗体フラグメント又は抗ＡＤＭ非Ｉｇスキャフォールドが、それを必要とする患者に投与される。前記抗ＡＤＭ抗体又は抗ＡＤＭ抗体フラグメント又は抗ＡＤＭ非Ｉｇスキャフォールドは、上述の他の抗癌剤と共に、又は、無しで投与されてもよい。本発明の主題は、癌を治療する方法であって、ここで、前記抗ＡＤＭ抗体又は抗ＡＤＭ抗体フラグメント又は抗ＡＤＭ非Ｉｇスキャフォールドを含む治療上有効な量の医薬組成物が必要とする患者に投与される。前記医薬組成物は、上記のような他の抗癌剤を含んでもよい。

【0071】

前記抗ＡＤＭ抗体又は抗ＡＤＭ抗体フラグメント又は抗ＡＤＭ非Ｉｇスキャフォールドは、循環するＡＤＭを過剰に超えるモル濃度をもたらす用量を投与してもよい。これは、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。長い時間にわたって所望の濃度範囲を維持するためには、インビボでのその半減期に依存する間隔で繰り返し適用し得る。これらの間隔は２〜７日の間とすることができる。前記抗ＡＤＭ抗体又は抗ＡＤＭ抗体フラグメント又は抗ＡＤＭ非Ｉｇスキャフォールドは、好ましくは、生理食塩水ベースの溶液として処方され、好ましくは静脈内にボーラス注射又は注入して適用される。

【0072】

概念的には、その腫瘍にＡＤＭ及び／又はＡＤＭ受容体を過剰発現する癌患者は、前記抗ＡＤＭ抗体又は抗ＡＤＭ抗体フラグメント又は抗ＡＤＭ非Ｉｇスキャフォールドを用いた治療から最も利益を得ることが期待される。従って、患者は、腫瘍生検からＡＤＭ及び／又はＡＤＭ受容体の発現レベルを決定することによって階層化することが可能である。

【図面の簡単な説明】

【0073】

【図1】化合物を用いた治療に依存した時間経過における腫瘍体積の増加。研究中の化合物は、ＮＴ−Ｈ（ヒトアドレノメデュリンのＮ末端部分に対して惹起されたモノクローナル抗体）、ＭＲ−Ｈ（ヒトアドレノメデュリンの中間部分に対して惹起されたモノクローナル抗体）、ＣＴ−Ｈ（ヒトアドレノメデュリンのＣ末端部分に対して惹起されたモノクローナル抗体）及びＣｏｎ（非特異的コントロール抗体）であった。腫瘍増殖の減少はＣＴ−Ｈに有意であった（Ｐ＝０．０３８）。ＮＴ−ＨとＭＲ−Ｈに対しては有効性の傾向はあったが、効果は統計的に有意ではなかった。

【実施例】

【0074】

実施例１
抗体の作製と特性評価アドレノメデュリンの異なる部分に対するいくつかのモノクローナル抗体を作製し、それらの親和性定数を決定した。

【0075】

抗体は、以下の方法に従って作製した：Ｂａｌｂ／ｃマウスは、１００μｇのペプチド−ＢＳＡコンジュゲート（Ｐｅｐｔｉｄｅ−ＢＳＡ−Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）（表１参照）を０日目及び１４日目（１００μＬの完全フロイントアジュバント中で乳化させたもの）、及び、５０μｇを２１日目及び２８日目（１００μＬの不完全フロイントアジュバント中で乳化させたもの）に免疫した。融合実験の３日前に、１００μＬ生理食塩水に溶解したコンジュゲート５０μｇを、動物１匹は腹腔内に、１匹は静脈内に注射で与えた。

【0076】

免疫したマウスの脾細胞と、骨髄腫細胞株ＳＰ２／０細胞を３７℃で３０秒間１ｍＬの５０％ポリエチレングリコールを用いて融合させた。洗浄後、細胞を９６ウェル細胞培養プレートに播種した。ハイブリッドクローンは、ＨＡＴ培地［２０％ウシ胎児血清及びＨＡＴサプリメントを補充したＲＰＭＩ１６４０培地］中で成長するものとして選択された。２週間後、ＨＡＴ培地をＨＴ培地と交換し、３継代後に、通常の細胞培養培地に戻した。

【0077】

細胞培養上清は、融合の三週間後、抗原特異的ＩｇＧ抗体について最初にスクリーニングを行った。ＣＴ−Ｈ抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を選択するための基準は、ペプチドＡＰＲＳＫＩＳＰＱＧＹ−ＮＨ₂（配列番号１）に対しては陽性結合、ペプチドＡＰＲＳＫＩＳＰＱＧＹ−ＣＯＯＨ（配列番号１）に対して陰性結合であった。

【0078】

陽性反応を示したマイクロ培養物は、増殖のために２４ウェルプレートに移した。再試験後に選択した培養物はクローン化され、限界希釈法を用いて再クローニングし、アイソタイプを決定した。

【0079】

（Ｌａｎｅ，Ｒ．Ｄ．“Ａ ｓｈｏｒｔ−ｄｕｒａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｆｕｓｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ”，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．８１：２２３−２２８；（１９８５），Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．“Ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（ＧＡＤ）ｉｓ ｎｏｔ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｒａｔ ｉｓｌｅｔ ｃｅｌｌｓ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＧＡＤ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．２８：１１−１５，（１９９６））。

【0080】

モノクローナル抗体産生：
抗体は、標準的な抗体産生方法を介して産生され（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｃｕｔｉｏｎ，ＡＴＬＡ ２５，１２１，１９９７）、プロテインＡを使用して精製された。抗体の純度は、ＳＤＳゲル電気泳動分析に基づいて＞９５％であった。

【0081】

親和性定数
アドレノメデュリンに対する抗体の親和性を決定するために、固定化抗体に対するアドレノメデュリンの結合のカイネティクス（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）は、ビアコア２０００システム（ＧＥヘルスケアヨーロッパ社、フライブルク、ドイツ）を使用して、標識無し表面プラズモン共鳴で測定した。抗体の可逆的固定化は、製造業者の説明書（マウス抗体捕捉キット；ＧＥヘルスケア社）に従って、ＣＭ５センサー表面に高密度に共有結合的に結合した抗マウスＦｃ抗体を用いて行った（Ｌｏｒｅｎｚ ｅｔ ａｌ．，“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＩｓａＡ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ａｕｇｍｅｎｔ Ｈｏｓｔ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ Ｏｐｅｎ Ｎｅｗ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ”；Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２０１１ Ｊａｎｕａｒｙ；５５（１）：１６５−１７３．）。

【0082】

モノクローナル抗体は、ヒトＡＤＭの下記に示す領域に対して惹起された。以下の表１は、さらに実験で使用した得られた抗体の選択を表す。

【0083】

【表1】

【0084】

抗体ＣＴ−Ｈのエピトープマッピング
ＡＤＭのＣ末端領域に関連するいくつかのペプチドを合成した（表２）。

【0085】

【表2】

【0086】

標識の手順：
１００μｇ（１００ｕＬ）の抗体ＣＴ−Ｈ（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）は、１０μＬのアクリジニウム（Ａｋｒｉｄｉｎｒｕｍ）ＮＨＳエステル（アセトニトリル中１ｍｇ／ｍＬ、インベント社、ドイツ）と混合し、２０分間室温でインキュベートした。標識されたＣＴ−Ｈは、Ｂｉｏ−Ｓｉｌ（登録商標）ＳＥＣ４００−５（バイオ・ラッド社、米国）でゲル濾過ＨＰＬＣによって精製された。精製された標識抗体は、（３００ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸カリウム、１００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ−ＥＤＴＡ、５ｇ／Ｌウシ血清アルブミン、ｐＨ７．０）中で希釈された。最終濃度は、３００μＬ毎に、約８００．０００相対光単位（ＲＬＵ）の標識抗体（約２０ｎｇ標識抗体）であった。アクリジニウムエステル（Ａｋｒｉｄｉｎｉｕｍｅｓｔｅｒ）化学発光は、ＡｕｔｏＬｕｍａｔ ＬＢ９５３（ベルトールドテクノロジーズ社、ＫＧ）を用いて測定した。

【0087】

固相：
ポリスチレンチューブ（グライナーバイオワンインターナショナルＡＧ、オーストリア）をストレプトアビジン（１．５μｇ／０．３ｍＬ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ トリス／塩酸、ｐＨは７．８）で被覆した（１８時間室温）。コーティング溶液を吸引し、チューブを３％カリオンＦＰ（Ｋａｒｉｏｎ ＦＰ）、０．５％ウシ血清アルブミンでブロッキングし、１時間インキュベーションした。ブロッキング溶液を廃棄した。表２に列挙されたペプチドは、３００ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸カリウム、１００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ−ＥＤＴＡ、０．５％ウシ血清アルブミン；２０錠／Ｌ完全プロテアーゼインヒビターカクテル錠（ロシュ社）；ｐＨ７．０に、各１０ｎｇ／０．３ｍＬの濃度で溶解し、ペプチド溶液毎に０．３ｍＬをストレプトアビジンチューブごとにピペットで移した。ペプチド溶液を攪拌しながら２２℃、２時間、チューブ中でインキュベートし、ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４で２回洗浄した。

【0088】

結合アッセイ：
標識されたＣＴ−Ｈ抗体は、（３００ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸カリウム、１００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ−ＥＤＴＡ、５ｇ／Ｌウシ血清アルブミン、ｐＨ７．０）中で希釈した。最終濃度は、３００μＬあたり、約８００．０００相対光単位（ＲＬＵ）の標識抗体（約２０ｎｇの標識抗体）であった。この溶液３００μＬをそれぞれペプチド／ストレプトアビジンチューブにピペットで移し、攪拌しながら２時間２２℃チューブをインキュベートした。非結合トレーサーを洗浄液（２０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．１％トリトンＸ−１００）で５回（各１ｍＬ）洗浄することにより除去した。チューブに結合した化学発光を、ＬＢ ９５３ルミノメーター（ベルソルド）を用いて測定した。各ペプチドへのＣＴ−Ｈの結合は、ペプチドＰ３３−５２ＮＨ２に対して得られた結合と比較して観察された結合のパーセンテージとして表した（表２）。

【0089】

ＣＴ−Ｈ抗体は、特異的にペプチドＰ３３−５２ＮＨ２ペプチドに著しく結合することが表２から明らかである。Ｃ末端アミド官能基がカルボキシル基（Ｐ３３−５２ ＣＯＯＨ）で置換された場合、実質的に同じペプチドに対して結合が検出されなかった。同様に、より長いペプチド又はより短いペプチドのいずれかを試験した場合、実質的には結合が観察されなかった。これらの結果は、抗体ＣＴ−Ｈは特異的にＡＤＭのＣ末端領域に結合し、結合に、遊離アミド化チロシン残基（ＡＤＭ内の位置５２）を必要とすることを示している。

【0090】

ＣＴ−Ｈ抗体に加えて、追加の抗体は、ＣＴ−Ｈで使用された同じ免疫化手順によって作製され、ペプチドＡＰＲＳＫＩＳＰＱＧＹ−ＮＨ２（配列番号１）に結合する能力によって選択された。ＣＴ−Ｈ抗体について上述したように、それらのエピトープ特異性は、同じ方法で測定された。各ペプチドに対する抗体の結合は、ペプチドＰ３３−５２ＮＨ２に対して得られた結合と比較して観察された結合のパーセンテージとして表した（表３）。

【0091】

【表3】

【0092】

実施例２
異種移植乳房腫瘍モデル

【0093】

十分に確立された乳癌細胞株である単層ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ＣＰＱ−８２、Ｐｒｏｑｉｎａｓｅ社）は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中で増殖させた。細胞は３７℃で９０％空気及び１０％二酸化炭素の加湿雰囲気中で培養した。培地は、日常的に３日ごとに交換した。トリプシン／ＥＤＴＡを使用して、３〜４日ごとにコンフルエント培養物を１：３に分け、約３〜４×１０⁶細胞／１５ｃｍ²の密度＋２５ｍL培地で播種した。

【0094】

出産後４〜５週齢で、体重約１５〜１８ｇの体重の雌のＢＡＬＢ／ｃヌード（ＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１^nu／Ｃｒｌ）マウス（チャールズリバー社、スルツフェルド、ドイツ）は、最適な衛生条件、１時間あたり１０〜１５回空気を交換する空調、継続的に監視された温度２２±３℃の標的範囲、相対湿度３０〜７０℃、１２時間は人工蛍光灯／１２時間は闇の下で、飼育された。最大４匹の動物を個々の換気ケージ（ＩＶＣ）で飼育し、Ｍ−Ｚｕｃｈｔ（スニッフ スペチアルディアテン（ｓｓｎｉｆｆ Ｓｐｅｚｉａｌｄｉａｔｅｎ）社）及びオートクレーブ処理コミュニティタブ水を含む餌を供給した。

【0095】

５日（０日目）の馴化期間後、１００μＬＰＢＳ緩衝液中の５×１０⁶ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を、２９Ｇ針注射器を用いてメスのＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの左脇腹に皮下移植した。続いて、動物の体重を測定した（天秤：メトラー トレドＰＢ６０２−Ｌ）。原発腫瘍の体積は、ノギス（ｃａｌｌｉｐｅｒｉｎｇ）にて測定した（手動キャリパー、ＯＭＣフォンタナ）。腫瘍体積は、式 Ｗ²×Ｌ／２（Ｌ＝長さ、Ｗ＝腫瘍の垂直幅、Ｌ＞Ｗ）に従って計算した。４０日後、約１５０ｍｍ³の平均腫瘍体積に到達し、腫瘍を有する動物を４群に無作為に分けた。次の日（４１日目）、抗アドレノメデュリン抗体及びコントロールとして非特異的マウスＩｇＧの（表４）の投与を開始した。

【0096】

抗体は、２日毎スケジュールで静脈内（ｉ．ｖ．）に投与した。抗体は、ＰＢＳ緩衝液中に溶解し、適用前に無菌濾過した。

【0097】

【表4】

【0098】

動物の行動や福祉は週５回（営業日）観察した。動物の体重は、無作為化後、週三回（毎週月曜日、水曜日、金曜日）測定した。原発腫瘍の増殖は、ランダム化した後、ノギス測定により週二回（月曜日と金曜日）記録した。

【0099】

スケジュールした研究期間（５６日目）の終わりまで、いずれの動物も死亡しなかった。５６日目に研究を終了した。全ての動物を屠殺し、剖検を行った。

【0100】

統計分析 すべてのデータ分析は、グラフパッドソフトウエア社、サンディエゴ、米国のグラフパッドプリズム５、及び、ＩＢＭ社、ニューヨーク、米国のＩＢＭ ＳＰＳＳ統計スタンダードを使用して行った。

【0101】

グループあたりの平均絶対腫瘍体積を計算した。腫瘍成長は、処置の最初の日（４１日目）の腫瘍体積と比較して、ｘ日の腫瘍体積の相対的な変化として計算した。

【0102】

【数1】

【0103】

抗アドレノメデュリン抗体処置群の各々についての相対腫瘍増殖を、非特異的マウスＩｇＧで処置した群における腫瘍増殖と比較した。

【0104】

結果
アドレノメデュリンのＮ末端及び中間領域部分に対する抗体は、腫瘍の増殖にわずかであるが統計的に有意ではない効果を示した（図１）。抗中間領域抗体の効果は、抗Ｎ末端抗体よりも、より顕著であった（図１）。対照的に、アドレノメデュリンのＣ末端に対する抗体は、コントロール群と比較して有意に腫瘍増殖を減少させた（図１）。

【0105】

詳細データは以下の通りである：各グループ（ＮＴ−Ｈ、ＭＲ−Ｈ、ＣＴ−Ｈ、コントロール抗体でそれぞれ処理したもの）の腫瘍体積は、以下の表５〜８に示した。

【0106】

【表5】

【0107】

【表6】

【0108】

【表7】

【0109】

【表8】

【0110】

【表9-1】

【表9-2】

【0111】

図の説明
図１は、化合物を用いた治療に依存した時間経過における腫瘍体積の増加を示している。研究中の化合物は、ＮＴ−Ｈ（ヒトアドレノメデュリンのＮ末端部分に対して惹起されたモノクローナル抗体）、ＭＲ−Ｈ（ヒトアドレノメデュリンの中間部分に対して惹起されたモノクローナル抗体）、ＣＴ−Ｈ（ヒトアドレノメデュリンのＣ末端部分に対して惹起されたモノクローナル抗体）及びＣｏｎ（非特異的コントロール抗体）であった。腫瘍増殖の減少はＣＴ−Ｈに有意であった（Ｐ＝０．０３８）。ＮＴ−ＨとＭＲ−Ｈに対しては有効性の傾向はあったが、効果は統計的に有意ではなかった。

【図1】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]