特許 6674889 前立腺がんに対するバイオマーカー検出における使用のための方法とアレイ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6674889

(24)【登録日】2020年3月11日

(45)【発行日】2020年4月1日

(54)【発明の名称】前立腺がんに対するバイオマーカー検出における使用のための方法とアレイ

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/574 20060101AFI20200323BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20200323BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20200323BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20200323BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20200323BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/574 AZNA

   G01N33/543 541B

   G01N33/543 545A

   G01N33/543 575

   G01N33/53 U

   G01N33/53 M

   G01N37/00 102

   C12M1/00 A

【請求項の数】14

【全頁数】47

(21)【出願番号】特願2016-505813(P2016-505813)

(86)(22)【出願日】2014年4月2日

(65)【公表番号】特表2016-519767(P2016-519767A)

(43)【公表日】2016年7月7日

(86)【国際出願番号】EP2014056630

(87)【国際公開番号】WO2014161910

(87)【国際公開日】20141009

【審査請求日】2017年3月29日

(31)【優先権主張番号】1305940.7

(32)【優先日】2013年4月2日

(33)【優先権主張国】GB

(73)【特許権者】

【識別番号】510145945

【氏名又は名称】イムノヴィア・アクチエボラーグ

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(72)【発明者】

【氏名】カール アーネ クリステル・ボレバエック

(72)【発明者】

【氏名】クリステル ラーシュ ベルティル・ヴィングレン

【審査官】 三木 隆

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１０−５３８６５８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１２／０１４９０４３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 Quantibody(R) Mouse Cytokine Array 1 -Quantitative measurement of 20 Mouse cytokines，RayBiotech, Inc.，２００７年，特に、第１頁，ＵＲＬ，https://fnkprddata.blob.core.windows.net/domestic/data/datasheet/RAY/QAM-CYT-1.pdf

【文献】 TAZAKI Eri，Serum cytokine profiles in patients with prostate carcinoma，Experimental and Therapeutic Medicine，２０１１年 ６月１６日，887-891

【文献】 LIN D W，Genetic Variations in the LEPR, CRY1, RNASEL, IL4 and ARVCF Genes Are Prognostic Markers of Prostate Cancer-Specific Mortality，Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention，２０１１年 ８月１１日，vol20 no9，1928-1936

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／５７４

Ｃ１２Ｍ １／００

Ｇ０１Ｎ ３３／５３

Ｇ０１Ｎ ３３／５４３

Ｇ０１Ｎ ３７／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

個体の前立腺がん関連疾患状態を決定するための方法であって、
ａ）個体からの試験されるべき試料を用意する工程；
ｂ）表１において定義した群から選択される４個またはそれ以上のバイオマーカーの試験試料中の発現を測定することによって、試験試料のバイオマーカーサインを決定する工程
を含むか、またはからなる方法であって、
表１において定義した群から選択される４個またはそれ以上のバイオマーカーの試験試料中の発現が、個体の１個またはそれ以上の前立腺がん関連疾患状態の指標であり、ならびに
工程（ｂ）が、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−９およびＩＬ−１ａの試験試料中の発現を測定することを含む、方法。

【請求項2】

工程（ｂ）は、さらに：
（ａ）表１（Ｂ）において列記したバイオマーカーの１個またはそれ以上、例えば表１（Ｂ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５または６個の発現を測定することを含む；
（ｂ）表１（Ｃ）において列記したバイオマーカーからの１個またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表１（Ｃ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７または８個の発現を測定することを含む；
（ｃ）表１（Ｄ）において列記したバイオマーカーからの１個またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表１（Ｄ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８，９、１０または１１個の発現を測定することを含む；
（ｄ）表１（Ｅ）において列記したバイオマーカーからの１個またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表１（Ｅ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７または８個の発現を測定することを含む；
（ｅ）表１（Ｆ）において列記したバイオマーカーからの１個またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表１（Ｆ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７または８個の発現を測定することを含む；
（ｆ）表１（Ｇ）において列記したバイオマーカーからの１個またはそれ以上のバイオ
マーカー、例えば表１（Ｇ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７または８個の発現を測定することを含む；
（ｇ）表１（Ｈ）において列記したバイオマーカーからの１個またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表１（Ｈ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２、３、４または５個の発現を測定することを含む；および／または
（ｈ）表１（Ｉ）において列記したバイオマーカーからの１個またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表１（Ｉ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８または９つの発現を測定することを含む；
請求項１に記載の方法。

【請求項3】

工程（ｂ）は、さらに：
（ａ）表２（Ａ）において列記したバイオマーカーからの１個またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表２（Ａ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７または３８個の発現を測定することを含む；
（ｂ）表２（Ｂ）において列記したバイオマーカーからの１個またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表２（Ｂ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１または４２個の発現を測定することを含む；
（ｃ）表２（Ｃ）において列記したバイオマーカーからの１つまたはそれ以上のバイオマーカー、例えば表２（Ｃ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９個の発現を測定することを含む；
（ｄ）表２（Ｄ）において列記したバイオマーカーからの１個またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表２（Ｄ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２または３つの発現を測定することを含む；
（ｅ）表２（Ｅ）において列記したバイオマーカーからの１個またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表２（Ｅ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１または５２個の発現を測定することを含む；
（ｆ）表２（Ｆ）において列記したバイオマーカーからの１個またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表２（Ｆ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個の発現を測定することを含む；
（ｇ）表２（Ｇ）において列記したバイオマーカーからの１個またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表２（Ｇ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の発現を測定することを含む；
（ｈ）表２（Ｈ）において列記したバイオマーカーからの１個またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表２（Ｈ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５または４６個の発現を測定することを含む；
（ｉ）表２（Ｉ）において列記したバイオマーカーからの１個またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表２（Ｉ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３つの発現を測定することを含む；
（ｊ）表２（Ｊ）において列記したバイオマーカーからの１個またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表２（Ｊ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９個の発現を測定することを含む；および／または
（ｋ）表２（Ｋ）において列記したバイオマーカーからの１個またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表２（Ｋ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３個の発現を測定することを含む；
請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

１つまたはそれ以上の前立腺がん関連疾患状態の決定は、前立腺がんの予後のために臨床的に意義のある前立腺がんの発生の可能性を決定することを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

１つまたはそれ以上の前立腺がん関連疾患状態の決定は、前立腺がんの診断のために前立腺がんの存在または不在を決定することを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

工程（ｂ）は、表１に定義したバイオマーカーの全ての試験試料中の発現を測定することを含むか、またはからなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

工程（ｂ）は、表１に定義したバイオマーカーの全ての、および、表２に定義したバイオマーカーの全ての試験試料中の発現を測定することを含むか、またはからなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

工程（ｂ）は、抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはからなる、結合剤を使用して実行される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

工程（ｂ）、（ｄ）および／または工程（ｆ）は、アレイを使用して実行される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

（ｉ）試料中に存在するバイオマーカーをビオチンで標識する工程；
（ｉｉ）ビオチン標識タンパク質を、その表面上の個別の位置で固定化された複数のｓｃＦｖを含むアレイと接触させる工程であって、該ｓｃＦｖが、表１中のタンパク質の１つまたはそれ以上に対して特異性を有する、工程；
（ｉｉｉ）固定化ｓｃＦｖを、蛍光色素を含むストレプトアビジンコンジュゲートと接触させる工程；および
（ｉｖ）アレイ表面上の別個の位置での色素の存在を検出する工程
を含み、アレイ表面上の色素の発現が、試料中の表１からのバイオマーカーの発現の指標である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

工程（ｂ）は、４個またはそれ以上のバイオマーカーをコードしている核酸分子の発現を測定することを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

工程（ｂ）は、それぞれ、核酸分子を含むか、またはからなる、４つまたはそれ以上の結合部分を使用して実行される、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

工程（ｂ）において用意される試料は、非画分化血液、血漿、血清、組織液、前立腺組織、前立腺液、胆汁および尿からなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

Ａ）請求項８において定義された４つまたはそれ以上の結合剤、および／または、請求項１２において定義された４つまたはそれ以上の結合部分；
Ｂ）請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法を実行するための説明書
を含む、前立腺がんの存在を決定するためのキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、前立腺がん関連疾患状態を決定するための方法、ならびにそのような方法における使用のためのアレイおよびキットを提供する。

【背景技術】

【0002】

血液における前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を使用した前立腺がん（ＰＣ）の早期検出により、スクリーニングされていない男性においてＰＣ死亡が減少する。しかしながら、一般に使用されるカットオフでのＰＳＡ特異性が適度であるため、穏やかに上昇するＰＳＡを有する男性間で、増強したリスク分類に寄与しているさらなるバイオマーカーに対する差し迫った必要性が存在する。

【0003】

前立腺がん（ＰＣ）は、西洋の国々における、がん関連死の第二位の原因であり［１］、ＰＣ患者の予後を改善するために、早期かつ特異的な診断が極めて重要である。血液に基づくバイオマーカー前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）が、１９８０年代後期に臨床に導入され、今日、ＰＣに対するリスクの指標として、そして患者生検のさらなる試験のための１つのパラメータとして使用されている［２、３］。ＰＳＡの導入は、早期診断ＰＣ症例数の増加をもたらしたが、悪性疾患に対するＰＳＡの適度の特異性が、不要な生検のコストと、潜在的な副作用に関する、ならびに過剰診断および過剰処置のリスクに関する鍵となる心配を引き起こした［２〜４］。実際、総血清ＰＳＡレベル（ｔＰＳＡ）に基づいた生検に対して選択された男性の６５〜７５％（＞４ｎｇ／ｍｌ）が、ＰＣを有しない（ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ）。したがって、臨床医が、生検試験に対して、適切な患者を選択することを可能にするリスク分類を改善するために、さらなるおよび／またはより特異的なバイオマーカーが同定されることが必要である。

【0004】

ＰＣに対して試験する時に、特異性を改善するために、ｔＰＳＡ値を、経時的ＰＳＡ変化（ＰＳＡ速度）、前立腺体積に対するＰＳＡ（ＰＳＡ密度）、またはＰＳＡの年齢特異的範囲のような、他のパラメータと組み合わせることに対して種々の試みが行われてきた［２、３］。しかしながら、ｔＰＳＡアッセイの診断パワーの改善は全く、またはわずかの改善しか、ここまで観察されてきていない［２］。反対に、ｔＰＳＡと遊離（未結合）ＰＳＡ間を区別することが、特に、ｔＰＳＡの中程度範囲（４〜１０ｎｇ／ｍｌ）レベルに対して、アッセイ性能を増強することが証明された。事実、１８〜２５％より下の遊離ＰＳＡのｔＰＳＡに対する比（％ｆＰＳＡ）を有する男性が、ＰＣを有するより有意に高いリスクと関連することが示された［５〜７］。また、２５〜５０％のこの特定の患者群はＰＣを有さないが、それら全てが、生検試験に対して選択される［７、８］。最近、４つのカリクレインマーカーのパネルが、生検出力の潜在的予測子として示唆されており［９、１０］、ｔＰＳＡ、遊離ＰＳＡの、２ｐｒｏＰＳＡと呼ばれる遊離ＰＳＡ亜画分との組合せがまた、診断正確性を改善するであろうことが示唆された［１１］。

【0005】

しかしながら、とりわけ生検試験および／または治療の前に、リスクにしたがって前立腺がんを検出し、および／または前立腺がんを層別化するために使用することができるさらなるより特異的なバイオマーカーに対する大きなアンメットクリニカルニーズが依然としてある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

まず種々の古典的生物化学的技術を用いて、ＰＣと関連したさらなる新規の血清バイオマーカーを定義するために、主要な努力が実施されてもきた。今日までに、ヒトカリクレイン２［１２、１３］、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター［１４］［１１］トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦ−β１）［３、１５、１６］およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）［１６〜１８］が、潜在的血清マーカーとして特に示唆されてきた。前途有望であるが、これらのマーカーの予後的能力を探索および確認するために、さらなる検証試験が必要であろう［２〜４］。さらに、追加の潜在的ＰＣマーカーが、従来のプロテオーム技術を使用して示唆されてもきた［１９、２０］が、これらの観察は、独立した患者コホートを使用して実証されるべきままである［２１］。さらに、深刻な技術的問題がまた、アッセイ感度、ダイナミックレンジ、および／またはスループットに関して上がってきた［２２、２３］。この目的を達するために、アフィニティプロテオミクスが、多重、感度および迅速様式においいて、非画分化プロテオーム、例えば血漿および血清を標的化可能なハイスループット代替案として確立されてきた［２４〜２７］。

【0007】

本文脈において、本発明者らはすでに、複合体プロテオームのタンパク質発現プロファイリングのための、組換え一本鎖断片可変（ｓｃＦｖ）抗体マイクロアレイプラットフォームを先に設計した［２６、２８、２９］。本アフィニティプロテオーム技術プラットフォームを使用し、本発明者らは、迅速、感度および再現可能様式にて、血清、血漿、尿、無傷細胞、細胞溶解物および組織抽出物を含む広範囲の未精製、直接標識プロテオーム［２８、３０、３１］をプロファイルすることができた。本発明者らは、プラットフォームが、例えば診断、予後、分類のため、および証拠に基づく治療選別のために、候補バイオマーカーサインを同定するために使用可能であることを示した［３２〜３７］。

【0008】

本発明者らは、アフィニティプロテオミクスが、現在確立された臨床実施にしたがった４つの生化学的に定義されたリスク群に層別化されている患者試料でのルーチンＰＳＡ測定から血漿試料を標的とするリスク群分類を検証し、さらには改良するために使用可能であるかどうかを調査した［３８〜４１］。データは、血漿タンパク質サインが、ＰＣ（「悪性バイオマーカーサイン」）を正確に同定し、ＰＣリスクに関連した現在の、そして新規の亜群に患者を層別化することが可能であり、長期において、ＰＣのより個別化した処置に寄与する潜在力を有することを示した。

【課題を解決するための手段】

【0009】

したがって、本発明の第１の態様は、個体の前立腺がん関連疾患状態を決定するための方法であって、
ａ）個体からの試験されるべき試料を用意する工程；
ｂ）表１において定義した群から選択される１個またはそれ以上のバイオマーカーの試験試料中の発現を測定することによって、試験試料のバイオマーカーサインを決定する工程
を含むか、またはからなり、
表１において定義した群から選択される１個またはそれ以上のバイオマーカーの試験試料中の発現が、個体の１つまたはそれ以上の前立腺がん関連疾患状態の指標である、方法を提供する。

【0010】

「前立腺がん関連疾患状態」は、前立腺がんの存在、または不在、前立腺がん群または亜群（以下で定義した、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｃ１、Ｃ２またはＤ）および／または（好ましくは既定時間フレーム内で）個体にて発生している前立腺がんの可能性を意味する。

【0011】

「バイオマーカー」は、その測定が前立腺がん関連疾患状態、例えば前立腺がんの予後を決定することにおいて有用な情報を提供可能である、天然に存在する生物学的分子、またはその成分または断片を意味する。例えば、バイオマーカーは、天然に存在しているタンパク質または糖質部分、またはその抗原成分または断片であってよい。

【0012】

好ましくは、試験されるべき試料は、哺乳動物から得られる。哺乳動物は、任意の家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌ）または家畜（ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌ）であってよい。好ましくは、哺乳動物はラット、マウス、モルモット、ネコ、イヌ、ウマまたは霊長類である。最も好ましくは、哺乳動物はヒトである。好ましくは、試料は、未精製血液、前画分化血液、血漿、血漿細胞、前立腺細胞または等しく好ましく、血漿、血漿細胞または前立腺細胞を含むか、またはからなる細胞または組織試料に由来するタンパク質または核酸を含むか、またはからなる、細胞または組織試料（またはその派生物）である。好ましくは、試験および対照試料が、同一の種に由来する。

【0013】

１つの実施形態において、本発明の第１の態様による方法は、
ｃ）前立腺がんを患っていない個体からの１個またはそれ以上の対照試料を用意する工程；
ｄ）工程（ｂ）にて測定した１個またはそれ以上のバイオマーカーの対照試料中の発現を測定することによって、対照試料のバイオマーカーサインを決定する工程
をさらに含むか、またはからなり、
１つまたはそれ以上の前立腺がん関連疾患状態が、工程（ｂ）にて測定された１個またはそれ以上のバイオマーカーの試験試料中の発現が、工程（ｄ）にて測定された１個またはそれ以上のバイオマーカーの対照試料中の発現と異なるという事象において同定される。

【0014】

さらなる、または追加の実施形態において、方法は、
ｅ）前立腺がんを患っている個体からの対照試料を用意する工程；
ｆ）工程（ｂ）において測定された１個またはそれ以上のバイオマーカーの対照試料中の発現を測定することによって、対照試料のバイオマーカーサインを決定する工程
を含むか、またはからなり、
１つまたはそれ以上の前立腺がん関連疾患状態が、工程（ｂ）にて測定した１個またはそれ以上のバイオマーカーの試験試料中の発現が、工程（ｆ）にて測定した１個またはそれ以上のバイオマーカーの対照試料中の発現に相当するという事象において同定される。

【0015】

「対照試料中の存在および／または量に相当する」は、存在および量が、工程（ｃ）にて用意される対照試料（例えば陰性対照試料）に対して、（または同一のものを提示している先に定義した参照値に対して）よりも、工程（ｅ）にて用意される対照試料のものと同一であるか、または工程（ｅ）にて用意される対照試料（例えば陽性対照試料）のものと近いことを意味する。好ましくは、存在および／または量は、工程（ｅ）にて用意される対照試料のものの少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である。

【0016】

「対照試料中の存在および／または量と異なる」は、存在または量が、工程（ｃ）にて用意される対照試料のものから（もしくは同一のものを提示している先に定義した参照値に対して）異なることを意味する。好ましくは、存在および／または量は、前立腺がんを含むか、またはからなる対照試料のもののわずか４０％、例えば、わずか３９％、３８％、３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％または０％である。

【0017】

好ましくは、１つまたはそれ以上の対照試料は、試験されるべき個体に対して、年齢適合および／または性別適合する。言い換えれば、健康な個体はおおよそ同一の年齢（例えば５年以内）であり、試験されるべき個体と同一の性別である。

【0018】

好ましくは、工程（ｂ）にて測定した１個またはそれ以上のバイオマーカーの試験試料中の存在および／または量を、既定の参照値に対して比較する。

【0019】

したがって、工程（ｂ）に測定した１個またはそれ以上のバイオマーカーの試験試料内の存在および／または量が、工程（ｄ）にて測定した１個またはそれ以上のバイオマーカーの存在および／もしくは量、または既定の参照値から、有意に異なる（すなわち統計学的に異なる）ことが好ましい。したがって、工程（ｂ）で測定した１個またはそれ以上のバイオマーカーの試験試料中の存在および／または量が、工程（ｆ）で測定した１個またはそれ以上のバイオマーカーの存在および／もしくは量、または既定参照値に有意に相当する（すなわち統計学的に類似である）ことが好ましい。例えば、付随している実施例にて議論するように、試験および対照試料中の特定のバイオマーカーの存在および／または量の間の有意な差が、ｐ＜０．０５（例えばｐ＜０．０４、ｐ＜０．０３、ｐ＜０．０２またはｐ＜０．０１）と分類される。

【0020】

好ましくは、工程（ｂ）は、表１において定義した群から選択される１個またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表１において定義された群から選択される少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、ｌ３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６もしくは６７のバイオマーカーの試験試料中の存在および／または量を測定することを含むか、またはからなる。

【0021】

工程（ｂ）は、ＩＬ−４の発現を測定することを含むか、またはからなってよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩＬ−１２の発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩＬ−９の発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩＬ−１ａの発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＨＬＡ−ＤＲの発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩＬ−３の発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩＣＡＭの発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＣＤ４０の発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩＬ−１８の発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩＬ−１ｂの発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＧＬＰ−１の発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩＬ−１１の発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＶＥＧＦの発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、シスタチンＣの発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、Ｃ１−ＩＮＨの発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＭＣＰ−３の発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩＬ−１３の発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＴＮＦ−βの発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、Ｃ１ｓの発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、インテグリンα−１０の発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、Ｃ３の発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＧＬＰ−１Ｒの発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩｇＭの発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩＬ−１６の発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＴＭペプチドの発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ムチン−１の発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩＬ−２の発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩＦＮ−γの発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＣＤ４０リガンドの発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩＬ−１０の発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＧＭ−ＣＳＦの発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ファクターＢの発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、Ｃ４の発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、インテグリンα−１１の発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩＬ−８の発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＭＣＰ−４の発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＬＤＬ（１）の発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＴＮＦ−β（１）の発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩＬ−７の発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、エオタキシンの発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、Ｒａｎｔｅｓの発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、β−ガラクトシダーゼの発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、レプチンの発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ムチン１の発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＬＤＬ（２）の発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＪＡＫ３の発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩＬ−１βの発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、プロペルジンの発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩＬ−５の発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、Ａｐｏ−Ａ１の発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＬＤＬの発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＴＮＦ−αの発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＢＴＫの発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＴＮＦ−β（２）の発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＭＣＰ−４（１）の発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＭＣＰ−４（２）の発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＧＬＰの発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、アンジオモチンの発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＭＣＰ−１の発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩＬ−６の発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ルイスＸの発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、Ｃ１ｑの発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、シアリル・ルイスＸの発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＴＧＦ−βの発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩＬ−１ｒａの発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＴＧＦ−β１の発現を測定することを含むか、またはからなる。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＰＳＡの発現を測定することを含むか、またはからなる。

【0022】

したがって、工程（ｂ）は、ＩＬ−４の発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩＬ−１２の発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩＬ−９の発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩＬ−１ａの発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＨＬＡ−ＤＲの発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩＬ−３の発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩＣＡＭの発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＣＤ４０の発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩＬ−１８の発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩＬ−１ｂの発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＧＬＰ−１の発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩＬ−１１の発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＶＥＧＦの発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、シスタチンＣの発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、Ｃ１−ＩＮＨの発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＭＣＰ−３の発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩＬ−１３の発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＴＮＦ−βの発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、Ｃ１ｓの発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、インテグリンα−１０の発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、Ｃ３の発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＧＬＰ−１Ｒの発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩｇＭの発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩＬ−１６の発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＴＭペプチドの発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ムチン−１の発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩＬ−２の発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩＦＮ−γの発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＣＤ４０リガンドの発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩＬ−１０の発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＧＭ−ＣＳＦの発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ファクターＢの発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、Ｃ４の発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、インテグリンα−１１の発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩＬ−８の発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＭＣＰ−４の発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＬＤＬ（１）の発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＴＮＦ−β（１）の発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩＬ−７の発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、エオタキシンの発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、Ｒａｎｔｅｓの発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、β−ガラクトシダーゼの発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、レプチンの発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ムチン１の発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＬＤＬ（２）の発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＪＡＫ３の発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩＬ−１βの発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、プロペルジンの発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩＬ−５の発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、Ａｐｏ−Ａ１の発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＬＤＬの発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＴＮＦ−αの発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＢＴＫの発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＴＮＦ−β（２）の発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＭＣＰ−４（１）の発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＭＣＰ−４（２）の発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＧＬＰの発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、アンジオモチンの発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＭＣＰ−１の発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩＬ−６の発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ルイスＸの発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、Ｃ１ｑの発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、シアリル・ルイスＸの発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＴＧＦ−βの発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＩＬ−１ｒａの発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＴＧＦ−β１の発現を測定することを含まなくてよい。あるいは、またはさらに、工程（ｂ）は、ＰＳＡの発現を測定することを含まなくてよい。

【0023】

「発現」は、ｍＲＮＡもしくはタンパク質のような遺伝子産物のレベルまたは量を意味する。

【0024】

「ＴＭペプチド」は、以下の配列番号１（ＣＤＲ配列に下線を引く）のｓｃＦｖ抗体構造物が特異性を有する、１０ＴＭタンパク質から誘導されるペプチドを意味する。

【化1】

【0025】

したがって、本ｓｃＦｖを使用し、または任意の抗体もしくはその抗原結合断片は１０ＴＭタンパク質に結合することに関して、本ｓｃＦｖと競合する。例えば、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１に示したのと同一のＣＤＲを含んでよい。

【0026】

そのような抗体が、精製目的のために、アフィニティタグ（例えばＣ末端）で生成できることが当業者によって理解されるであろう。例えば、配列番号２のアフィニティタグを利用する。

【化2】

【0027】

タンパク質および／または核酸の濃度を検出するおよび／または測定する方法は、当業者に周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ、２００１、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。

【0028】

タンパク質の検出および／または測定のための好ましい方法としては、ウエスタンブロット、ノザンブロット、ウエスタンブロット、免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、抗体マイクロアレイ、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）、免疫沈降、インサイチューハイブリッド形成および他の免疫組織化学技術、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、モノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体を使用するサンドイッチアッセイを含む免疫放射定量測定法（ＩＲＭＡ）および免疫酵素測定法（ＩＥＭＡ）が挙げられる。例示サンドイッチアッセイは、参照によって本明細書に組み入れる、米国特許第４，３７６，１１０号および同４，４８６，５３０号にて、Ｄａｖｉｄらによって記述される。スライド上の細胞の抗体染色が、当業者に周知のように、細胞学研究室診断試験にて周知の方法にて使用される。

【0029】

典型的に、ＥＬＩＳＡは、通常固相アッセイにて、着色した反応産物を与える、酵素の使用を含む。ホースラディッシュペルオキシダーゼおよびホスファターゼのような酵素が広く用いられてきた。ホスファターゼ反応を増幅する方法は、ここで第２の酵素システムのための共酵素として働く、ＮＡＤを発生させるために、基質としてＮＡＤＰを使用することである。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からのピロホスファターゼが、該酵素が組織内に存在しないので、良好なコンジュゲートを生成し、安定であり、良好な反応色を提供する。ルシフェラーゼのような酵素に基づく化学発光系も使用される。

【0030】

ビタミンビオチンとのコンジュゲーションが、それに大きな特異性とアフィニティにて結合するその酵素連結アビジンまたはストレプトアビジンとのその反応によって簡単に検出可能であることから、しばしば使用される。

【0031】

したがって、１つの実施形態において、工程（ｂ）は、表１（Ａ）において列記したバイオマーカーの１個またはそれ以上、例えば表１（Ａ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２、３または４つの発現を測定することを含むか、またはからなる。方法は、工程（ｂ）において、表１（Ａ）において列記した各バイオマーカーの発現を測定することを含むか、またはからなってよい。

【0032】

１つの実施形態において、工程（ｂ）は、表１（Ｂ）において列記したバイオマーカーの１個またはそれ以上、例えば表１（Ｂ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２、３，４，５または６個の発現を測定することを含むか、またはからなる。方法は、工程（ｂ）において、表１（Ｂ）において列記した各バイオマーカーの発現を測定することを含むか、またはからなってよい。

【0033】

代替のまたは追加の実施形態において、工程（ｂ）にて、方法は表１（Ｃ）において列記したバイオマーカーからの１個またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表１（Ｃ）において列記したバイオマーカーの少なくとも、２、３、４、５、６、７または８つの発現を測定することを含むか、またはからなる。方法は、工程（ｂ）にて、表１（Ｃ）において列記した各バイオマーカーの発現を測定することを含むか、またはからなる。

【0034】

代替のまたは追加の実施形態において、工程（ｂ）にて、方法は、表１（Ｄ）において列記したバイオマーカーからの１個またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表１（Ｄ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１個の発現を測定することを含むか、またはからなる。方法は、工程（ｂ）にて、表１（Ｄ）において列記した各バイオマーカーの発現を測定することを含むか、またはからなる。

【0035】

代替のまたは追加の実施形態において、工程（ｂ）にて、方法は、表１（Ｅ）において列記したバイオマーカーからの１個またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表１（Ｅ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７または８つの発現を測定することを含むか、またはからなる。方法は、工程（ｂ）にて、表１（Ｅ）において列記した各バイオマーカーの発現を測定することを含むか、またはからなる。

【0036】

代替のまたは追加の実施形態において、工程（ｂ）にて、方法は、表１（Ｆ）において列記したバイオマーカーからの１個またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表１（Ｆ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７または８つの発現を測定することを含むか、またはからなる。方法は、工程（ｂ）にて、表１（Ｆ）において列記したバイオマーカーの発現を測定することを含むか、またはからなる。

【0037】

代替のまたは追加の実施形態において、工程（ｂ）にて、方法は、表１（Ｇ）において列記したバイオマーカーからの１個またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表１（Ｇ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７または８つの発現を測定することを含むか、またはからなる。方法は、工程（ｂ）にて、表１（Ｇ）において列記した各バイオマーカーの発現を測定することを含むか、またはからなる。

【0038】

代替のまたは追加の実施形態において、工程（ｂ）にて、方法は、表１（Ｈ）において列記したバイオマーカーからの１個またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表１（Ｈ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２、３、４または５つの発現を測定することを含むか、またはからなる。方法は、工程（ｂ）にて、表１（Ｈ）において列記した各バイオマーカーの発現を測定することを含むか、またはからなる。

【0039】

代替のまたは追加の実施形態において、工程（ｂ）にて、方法は、表１（Ｉ）において列記したバイオマーカーからの１個またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表１（Ｉ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８または９つの発現を測定することを含むか、またはからなる。方法は、工程（ｂ）にて、表１（Ｉ）において列記した各バイオマーカーの発現を測定することを含むか、またはからなる。

【0040】

代替のまたは追加の実施形態において、工程（ｂ）にて、方法は、表２（Ａ）において列記したバイオマーカーからの１個またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表２（Ａ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７または３８個の発現を測定することを含むか、またはからなる。工程（ｂ）は、表２（Ａ）において列記したバイオマーカーの全ての発現を測定することを含むか、またはからなる。

【0041】

代替のまたは追加の実施形態において、工程（ｂ）は、表２（Ｂ）において列記したバイオマーカーからの１個またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表２（Ｂ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１または４２個の発現を測定することを含むか、またはからなる。工程（ｂ）は、表２（Ｂ）において列記したバイオマーカーの全ての発現を測定することを含むか、またはからなる。

【0042】

代替のまたは追加の実施形態において、工程（ｂ）は、表２（Ｃ）において列記したバイオマーカーからの１個またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表２（Ｃ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９つの発現を測定することを含むか、またはからなる。工程（ｂ）は、表２（Ｃ）において列記したバイオマーカーの全ての発現を測定することを含むか、またはからなる。

【0043】

代替のまたは追加の実施形態において、工程（ｂ）は、表２（Ｄ）において列記したバイオマーカーからの１個またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表２（Ｄ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２または３つの発現を測定することを含むか、またはからなる。工程（ｂ）は、表２（Ｄ）において列記したバイオマーカーの全ての発現を測定することを含むか、またはからなる。

【0044】

代替のまたは追加の実施形態において、工程（ｂ）は、表２（Ｅ）において列記したバイオマーカーからの１個またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表２（Ｅ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１または５２個の発現を測定することを含むか、またはからなる。工程（ｂ）は、表２（Ｅ）において列記したバイオマーカーの全ての発現を測定することを含むか、またはからなる。

【0045】

代替のまたは追加の実施形態において、工程（ｂ）は、表２（Ｆ）において列記したバイオマーカーからの１個またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表２（Ｆ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個の発現を測定することを含むか、またはからなる。工程（ｂ）は、表２（Ｆ）において列記したバイオマーカーの全ての発現を測定することを含むか、またはからなる。

【0046】

代替のまたは追加の実施形態において、工程（ｂ）は、表２（Ｇ）において列記したバイオマーカーからの１個またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表２（Ｇ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の発現を測定することを含むか、またはからなる。工程（ｂ）は、表２（Ｇ）において列記したバイオマーカーの全ての発現を測定することを含むか、またはからなる。

【0047】

代替のまたは追加の実施形態において、工程（ｂ）は、表２（Ｈ）において列記したバイオマーカーからの１個またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表２（Ｈ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５または４６個の発現を測定することを含むか、またはからなる。工程（ｂ）は、表２（Ｈ）において列記したバイオマーカーの全ての発現を測定することを含むか、またはからなる。

【0048】

代替のまたは追加の実施形態において、工程（ｂ）は、表２（Ｉ）において列記したバイオマーカーからの１個またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表２（Ｉ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３個の発現を測定することを含むか、またはからなる。工程（ｂ）は、表２（Ｉ）において列記したバイオマーカーの全ての発現を測定することを含むか、またはからなる。

【0049】

代替のまたは追加の実施形態において、工程（ｂ）は、表２（Ｊ）において列記したバイオマーカーからの１個またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表２（Ｊ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９個の発現を測定することを含むか、またはからなる。工程（ｂ）は、表２（Ｊ）において列記したバイオマーカーの全ての発現を測定することを含むか、またはからなる。

【0050】

代替のまたは追加の実施形態において、工程（ｂ）は、表２（Ｋ）において列記したバイオマーカーからの１個またはそれ以上のバイオマーカー、例えば表２（Ｋ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３個の発現を測定することを含むか、またはからなる。工程（ｂ）は、表２（Ｋ）において列記したバイオマーカーの全ての発現を測定することを含むか、またはからなる。

【0051】

代替のまたは追加の実施形態において、１つまたはそれ以上の前立腺がん関連疾患状態は、臨床的に意義のある前立腺がんの発生の可能性を決定することであるか、またはそれを含む。好ましくは、特定のタイムフレーム内の臨床的に意義のある前立腺がんの発生の可能性は、例えば、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１５年、２０年、２５年、３０年、３５年、４０年、５５年、６０年、７５年、８０年以内、または試験されている個体の天然のライフスパン内で決定される。

【0052】

代替のまたは追加の実施形態において、方法は、リスク群Ａ（低リスク）、リスク群Ｂ（中程度リスク）、リスク群Ｃ（増加リスク）、リスク亜群Ｃ１（中程度増加リスク）、リスク亜群Ｃ２（重度増加リスク）およびリスク群Ｄ（高リスク）間を区別するためである。

【0053】

１つの実施形態において、「低リスク」は、特定のタイムフレーム内で、臨床的に意義のある前立腺がんを有する、または発症している、２％以下機会、例えば≦１．５％、以下１．０％、≦０．５％、≦０．１％、≦０．０５％、≦０．０１％、≦０．００５％または≦０．００１％（もしくはそれらの点の任意の２つの間）を意味する。１つの実施形態において、「中程度リスク」は、特定のタイムフレーム内で、臨床的に意義のある前立腺がんを有する、または発症している、＞２％および≦１０％の機会、例えば≦９％、≦８％、≦７％、≦６％、≦５％、≦４％、≦３％または≦２．５％（もしくはそれらの点の任意の２つの間）を意味する。１つの実施形態において、「増加リスク」は、特定のタイムフレーム内で、臨床的に意義のある前立腺がんを有する、または発症している、＞１０％および≦５０％の機会、例えば≦４５％、≦４０％、≦３５％、≦３０％、≦２５％、≦２０％、≦１５％、≦１２．５％、≦１１．０％または≦１０．５％（もしくはそれらの点の任意の２つの間）を意味する。１つの実施形態において、「重度増加リスク」は、特定のタイムフレーム内で、臨床的に意義のある前立腺がんを有する、または発症している、＞５０％および≦８５％の機会、例えば≦８０％、≦７５％、≦７０％、≦６５％、≦６０％、≦５５％、≦５２．５％、≦５１．０％または≦５０．５％（もしくはそれらの点の任意の２つの間）を意味する。１つの実施形態において、「高リスク」は、特定のタイムフレーム内で、臨床的に意義のある前立腺がんを有する、または発症している、＞９０％および≦１００％の機会、例えば１００％、≦１００％、≦９９％、≦９８％、≦９７％、≦９６％、≦９５％、≦９２．５％、≦９０％、≦８７．５％、≦８６％、≦８５．５％、または≦８５．１％（もしくはそれらの点の任意の２つの間）を意味する。好ましくは、「低」、「中程度」、「増加」、「重度増加」および「高」リスク群は連続し、したがって１つのリスク群に対する中間値を使用する場合、隣接するリスク群が適切に調節される。例えば、≦１．０％の低リスクが使用される場合、中程度リスク群が、＞１．０％から広がるであろう。好ましくは、特定のタイムフレームは、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１５年、２０年、２５年、３０年、３５年、４０年、５５年、６０年、７５年、８０年以内、または試験されている個体の天然のライフスパン内である。最も好ましくは５年である。

【0054】

これらの群は、％遊離および総ＰＳＡのレベルに基づいて定義される。群Ａは、ｔＰＳＡ≦０．７０ｎｇ／ｍｌを有する。群Ｂは、％ｔＰＳＡ≧２７．９％での２．１〜８．０ｎｇ／ｍｌのｔＰＳＡを有する。群Ｃは、％ｔＰＳＡ≦１２．６％での５．０〜１０−３ｎｇ／ｍｌのｔＰＳＡを有する。および群Ｄは、２４．６〜７２４ｎｇ／ｍｌを有する。群ＡおよびＢ患者は、処置を必要としない。群Ｃは様々な群であって、亜群Ｃ１およびＣ２に分けることが可能である。群Ｃ１はより群ＡおよびＢに類似であり、すなわち前立腺がんに対するリスクが少なく、したがって、生検および処置の必要性が少ない／ない一方で、群Ｃ２はより群Ｄ、すなわちがん群に類似であり、したがって生検および処置の必要性を示唆する。

【0055】

１つの実施形態において、方法は、リスク群Ａ（低リスク）およびリスク群Ｄ（高リスク）間を区別するためであるか、または区別することを含む。他のまたは追加の実施形態において、方法は、リスク群Ｂ（中程度リスク）およびリスク群Ｄ（高リスク）間を区別するためであるか、または区別することを含む。他のまたは追加の実施形態において、方法は、リスク群Ｃ（増加リスク）およびリスク群Ｄ（高リスク）間を区別するためであるか、または区別することを含む。他のまたは追加の実施形態において、方法は、リスク群Ａ（低リスク）およびリスク群Ｂ（中程度リスク）間を区別するためであるか、または区別することを含む。他のまたは追加の実施形態において、方法は、リスク亜群Ｃ１（中程度増加リスク）およびリスク亜群Ｃ２（重度増加リスク）間を区別するためであるか、または区別することを含む。他のまたは追加の実施形態において、方法は、リスク亜群Ｃ１（中程度増加リスク）およびリスク群Ａ（低リスク）間を区別するためであるか、または区別することを含む。他のまたは追加の実施形態において、方法は、リスク亜群Ｃ１（中程度増加リスク）およびリスク群Ｂ（中程度リスク）間を区別するためであるか、または区別することを含む。他のまたは追加の実施形態において、方法は、リスク亜群Ｃ１（中程度増加リスク）およびリスク群Ｄ（高リスク）間を区別するためであるか、または区別することを含む。他のまたは追加の実施形態において、方法は、リスク亜群Ｃ２（重度増加リスク）およびリスク群Ａ（低リスク）間を区別するためであるか、または区別することを含む。他のまたは追加の実施形態において、方法は、リスク亜群Ｃ２（重度増加リスク）およびリスク群Ｂ（中程度リスク）間を区別するためであるか、または区別することを含む。他のまたは追加の実施形態において、方法は、リスク亜群Ｃ２（重度増加リスク）およびリスク群Ｄ（高リスク）間を区別するためであるか、または区別することを含む。

【0056】

しかしながら、他のまたは追加の実施形態において、１つまたはそれ以上の前立腺がん関連疾患状態は、前立腺がんの存在または不在を決定すること（すなわち、前立腺がんの診断）であるか、または含む。好ましくは、前立腺がんの診断は、工程（ｂ）において、表１（Ａ）において列記したバイオマーカーの１個またはそれ以上、例えば表１（Ａ）において列記したバイオマーカーの少なくとも２、３または４個の発現を測定することを含むか、またはからなる。方法は、工程（ｂ）において、表１（Ａ）において列記した各バイオマーカーの発現を測定することを含むか、またはからなってよい。１つの実施形態において、前立腺がんの存在は、リスク亜群Ｃ２またはＤでの分類によって示唆される。１つの実施形態において、前立腺がんの存在は、リスク亜群Ｃ２での分類によって示唆される。１つの実施形態において、前立腺がんの存在は、リスク亜群Ｄでの分類によって示唆される。前立腺がんの存在が示唆される１つの実施形態において、方法には、現在の推奨にしたがった前立腺がんに対する患者の生検および／または処置（例えばがん細胞の外科的除去、放射線療法および／または化学療法）が含まれる。

【0057】

本発明の第１の態様の１つの実施形態において、工程（ｂ）は、表１および／または表２において定義した全てのバイオマーカーの試験試料中の発現を測定することが含まれるか、またはからなる。

【0058】

さらなる、または追加の実施形態において、（工程（ｃ）の）前立腺がんを患っていない個体は、任意の他の前立腺関連障害を患っていない。好ましくは、前立腺がんを患っていない個体は、任意の疾患または状態を患っていない。最も好ましくは、前立腺がんを患っていない個体は、健康な個体である。

【0059】

さらなる、または追加の実施形態において、（工程（ｅ）の）前立腺がんを患っている個体は、任意の他の前立腺関連障害を患っていない。好ましくは、前立腺がんを患っている個体は、任意の他の疾患または状態を患っていない。最も好ましくは、前立腺がんを患っている個体は、そうでなければ健康な個体である。１つの実施形態において、前立腺がんを患っている個体は、群Ａ、群Ｂ、群Ｃ、群Ｃ１、亜群Ｃ１、亜群Ｃ２または亜群Ｄを患っている。好ましくは、工程（ｅ）は、これらの群のそれぞれから、またはこれらの任意の組合せからの、１つまたはそれ以上の個体からの対照試料を用意することを含む。

【0060】

さらなる、または追加の実施形態において、工程（ｂ）、（ｄ）および／または工程（ｆ）は、１個またはそれ以上のバイオマーカーに結合可能な、第１の結合剤を用いて実施する。

【0061】

好ましくは第１の結合剤は、抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはからなる。

【0062】

用語「抗体」には、免疫グロブリン軽および／もしくは重鎖可変ならびに／もしくは定常領域のファージディスプレイによって生成された一本鎖抗体分子、または当業者に公知である免疫アッセイフォーマットにて、抗体に結合可能な他の免疫相互作用分子のような、しかし限定はされない、任意の合成抗体、組換え抗体または抗体ハイブリッドが含まれる。

【0063】

本発明者らはまた、アフィボディおよびアプタマーのような、抗体様結合剤の使用も含む。

【0064】

それらの特異的結合部位を維持する、抗体断片の合成に関与する技術の一般概説は、Ｗｉｎｔｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３４９、２９３〜２９９に見い出だせる。

【0065】

さらに、またはあるいは、１つまたはそれ以上の第１の結合分子は、アプタマーである（Ｃｏｌｌｅｔｔら、２００５、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３７：４〜１５頁を参照のこと）。

【0066】

抗体ライブラリー（Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ ３５２、６２４〜６２８頁；Ｍａｒｋｓら、１９９１、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２２（３）：５８１〜９７頁）、ペプチドライブラリー（Ｓｍｉｔｈ、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８（４７０５）：１３１５〜７頁）、発現ｃＤＮＡライブラリー（Ｓａｎｔｉら（２０００）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９６（２）：４９７〜５０８頁）、アフィボディのような、抗体フレームワーク以外の足場上のライブラリー（Ｇｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎら、１９９９、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６５（９）：４１３４〜４０頁）またはアプタマーに基づいたライブラリー（Ｋｅｎａｎら、１９９９、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １１８、２１７〜３１頁）が、そこからの所与のモチーフに対して特異的な結合分子が、本発明の方法における使用のために選択される供給源として使用される。

【0067】

分子ライブラリーは、原核細胞（Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１、ｏｐ．ｃｉｔ．；Ｍａｒｋｓら、１９９１，ｏｐ．ｃｉｔ．）もしくは真核細胞（Ｋｉｅｋｅら、１９９９、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９６（１０）：５６５１〜６頁）中、インビボにて発現され、または細胞の関与なしに、インビトロで発現される（Ｈａｎｅｓ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、１９９７、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４（１０）：４９３７〜４２頁；Ｈｅ ＆ Ｔａｕｓｓｉｇ、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５（２４）：５１３２〜４頁；Ｎｅｍｏｔｏら、１９９７、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、４１４（２）：４０５〜８頁）。

【0068】

タンパク質に基づくライブラリーが使用される場合、潜在的結合分子のライブラリーをコードしている遺伝子が、しばしばウイルス内にパッケージされ、潜在的結合分子が、ウイルスの表面に提示される（Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１、上記；Ｍａｒｋｓら、１９９１、上記；Ｓｍｉｔｈ、１９８５、上記）。

【0069】

おそらく、最も一般的に使用されるディスプレイシステムは、それらの表面に抗体断片を提示しているフィラメント状バクテリオファージであり、抗体断片は、バクテリオファージのマイナーコートタンパク質への融合として発現される（Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１、上記；Ｍａｒｋｓら、１９９１、上記）。しかしながら、提示のための他の好適なシステムとしては、他のウイルス（ＥＰ３９５７８）、細菌（Ｇｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎら、１９９９、上記；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、１９９８、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １１（９）：８２５〜３２頁；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、１９９９、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １２（７）：６１３〜２１頁）および酵母（Ｓｈｕｓｔａら、１９９９、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９２（５）：９４９〜５６頁）が挙げられる。

【0070】

さらに、提示システムは、リボソームディスプレイシステムと呼ばれるなかで、そのコードしているｍＲＮＡに対するポリペプチド産物の連結（Ｈａｎｅｓ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、１９９７、上記；Ｈｅ ＆ Ｔａｕｓｓｉｇ、１９９７、上記；Ｎｅｍｏｔｏら、１９９７、上記）、またはコードＤＮＡに対する代替的なポリペプチド産物の連結（米国特許第５，８５６，０９０号およびＷＯ９８／３７１８６を参照のこと）を利用して開発されてきた。

【0071】

抗体の可変重（Ｖ_Ｈ）および可変軽（Ｖ_Ｌ）ドメインが、抗原認識に関与し、事実はまず、早期プロテアーゼ消化実験によって認識された。さらなる確認が、齧歯類抗体の「ヒト化」で発見された。齧歯類由来の可変ドメインは、得られた抗体が、齧歯類親抗体の抗原特異性を維持するように、ヒト由来の定常ドメインに融合される（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１、６８５１〜６８５５頁）。

【0072】

抗原特異性は、可変ドメインによって付与され、定常ドメインから独立しており、全て１つまたはそれ以上の可変ドメインを含む、抗体断片の細菌発現を含む実験より公知である。これらの分子には、Ｆａｂ様分子（Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０、１０４１頁）；Ｆｖ分子（Ｓｋｅｒｒａら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０、１０３８頁）；Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌパートナードメインが、可変オリゴペプチドを介して連結する、一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）分子（Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２、４２３頁；Ｈｕｓｔｏｎｏ ｅｔ ａｌ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５、５８７９頁）および単離Ｖドメインを含む単一ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）（Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１、５４４頁）が含まれる。それらの特異的結合部位を維持する抗体断片の合成に関与する技術の一般概説は、Ｗｉｎｔｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３４９、２９３〜２９９頁に見出だせる。

【0073】

抗体または抗原結合断片は、無傷抗体、Ｆｖ断片（例えば一本鎖Ｆｖおよびジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ様断片（例えばＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片およびＦ（ａｂ）_２断片）、単一可変ドメイン（例えばＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメイン）およびドメイン抗体（ｄＡｂ、一本および二本フォーマットを含む［すなわちｄＡｂ−リンカーｄＡｂ］）からなる群から選択される。好ましくは、抗体または抗原結合断片は、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。

【0074】

１つまたはそれ以上の結合部分は代替的に抗体様結合剤、例えばアフィボディまたはアプタマーを含むか、またはからなってよい。

【0075】

「ｓｃＦｖ分子」は、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌパートナードメインが、可動性オリゴペプチドを介して連結される分子を意味する。

【0076】

抗体全体ではなく、抗体断片を使用する利点は、数倍である。断片のより小さなサイズが、より良好な固体組織の浸潤のような、改善された薬理学的性質を導いて良い。補体結合のような、全体抗体のエフェクター機能が除去される。Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂ抗体断片は全て、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現し、大腸菌から分泌され、したがって大量の前記断片の容易な生成が許容される。

【0077】

全体抗体、およびＦ（ａｂ’）２断片は、「二価」である。「二価」は、前記抗体とＦ（ａｂ’）_２断片が、２つの抗原結合部位を有することを意味する。一方、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂ断片は一価であり、ただ１つの抗原結合部位を有する。

【0078】

抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。好適なモノクローナル抗体は、公知の技術、例えば、どちらも参照によって本明細書に組み入れる、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｈ Ｚｏｌａ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９８８）および「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｊ Ｇ Ｒ Ｈｕｒｒｅｌｌ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９８２）にて開示されるもの、によって調製される。

【0079】

潜在的結合分子をライブラリーから選択する場合、定義されたモチーフを有する１つまたはそれ以上のセレクタペプチドを通常用いる。ペプチド中の可撓性を減少させる構造、または荷電した、結合分子との相互作用を許容する極性もしくは疎水性側鎖を提供するアミノ酸残基を、セレクタペプチドのためのモチーフのデザインにて使用する。例えば、
（ｉ）プロリンは、その側鎖がα炭素ならびに窒素の両方に結合するので、ペプチド構造を安定化させて良い；
（ｉｉ）フェニルアラニン、チロシンおよびトリプロファンは、芳香族側鎖を有し、非常に疎水性である、一方でロイシンおよびイソロイシンは、脂肪族側鎖を有し、また疎水性である；
（ｉｉｉ）リシン、アルギニンおよびヒスチジンは塩基性側鎖を有し、中性ｐＨにて正に帯電し、一方でアスパラギン酸およびグルタミン酸は、酸性側鎖を有し、中性ｐＨにて負に帯電する；
（ｉｖ）アスパラギン酸およびグルタミン酸は中性ｐＨでニュートラルであるが、水素結合に参加してよいアミド基を含む；
（ｖ）セリン、スレオニンおよびチロシン側鎖は、ヒドロキシル基を含み、これは水素結合に参加してよい。

【0080】

典型的に、結合分子の選択は、結合分子の型に相当するスポットに対する結合を解析するために、アレイ技術とシステムの使用を含んでよい。

【0081】

したがって、第１の結合剤は例えば、組換え抗体またはその抗原結合断片であってよい。好ましくは、抗体またはその抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、免疫グロブリン分子の結合ドメインからなる群から選択される。

【0082】

第１の結合剤は、表面上に固定される。

【0083】

場合により、試験試料中の１個またはそれ以上のバイオマーカーは、検出可能部分で標識される。対照試料中の１個またはそれ以上のバイオマーカーは、あるいはまたはさらに、検出可能部分で標識されてよい。

【0084】

「検出可能部分」は、その存在および／または相対量および／または位置（例えば、アレイ上の位置）を直接的または間接的いずれかで決定可能とする部分を含む。

【0085】

好適な検出可能部分は、本技術分野で周知である。

【0086】

例えば、検出可能部分は、特定の条件に曝露した時に、検出される、蛍光および／または発光および／または化学発光部分であってよい。そのような蛍光部分は、蛍光部分の励起を引き起こすために、特定の波長および強度で、放射線（すなわち光）に曝露する必要があってよく、これによって、検出される特定の波長にて、検出可能な蛍光を発することが可能となる。

【0087】

あるいは、（好ましくは検出されていない）基質を、検出可能部分は、可視化および／または検出可能である検出可能製品に変換可能である酵素である。好適な酵素の例は、例えばＥＬＩＳＡアッセイに関して、以下でより詳細に議論される。

【0088】

好ましくは、検出可能部分は、蛍光部分、発光部分、化学発光部分、放射活性部分、酵素部分からなる群から選択される。最も好ましくは、検出可能部分はビオチンである。

【0089】

明確に、（例えば、本明細書で記述した試験試料および／または対照試料中の１個またはそれ以上のバイオマーカー、および／または選択されたタンパク質を検出することにおける使用のための抗体分子のような）検出されるべき薬剤は、検出可能部分を、簡単に検出可能にするために、適切な原子アイソトープを十分に有しなければならない。

【0090】

さらなる、または追加の実施形態において、工程（ｂ）、（ｄ）および／または工程（ｆ）を、１個またはそれ以上のバイオマーカーに結合可能な第２の結合剤を含むアッセイを使用して実施し、第２の結合剤は、検出可能部分を含む。

【0091】

放射または他の標識を、公知の手段にて、本発明の方法の試料中に存在するバイオマーカー、および／または本発明の結合部分に組み入れる。例えば、結合剤がポリペプチドである場合、生合成されるか、または例えば水素の代わりにフッ素−１９を含む、適切なアミノ酸前駆体を使用する化学アミノ酸合成によって合成される。^９９ｍＴｃ、^１２３Ｉ、^１８６Ｒｈ、^１８８Ｒｈおよび^１１１Ｉｎのような標識が例えば、結合部分中のシステイン残基を介して結合される。イットリウム−９０は、リシン残基を介して結合される。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｆｒａｋｅｒら（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．８０、４９〜５７頁）を使用して^１２３Ｉを組み込むことが可能である。参照（「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」、Ｊ−Ｆ Ｃｈａｔａｌ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）が、詳細に他の方法を記述する。（酵素、蛍光、発光、化学発光または放射活性部分のような）他の検出可能部分をタンパク質にコンジュゲートするための方法が、本技術分野で周知である。

【0092】

試験されるべき試料中のバイオマーカーが、前記タンパク質の存在、量および／または位置を決定することを間接的に補助する部分で標識されることは当業者に理解されよう。したがって、部分は、多成分検出可能部分の１つの成分を構築してよい。例えば、試験すべき試料中のバイオマーカーは、ビオチンで標識され、これにより、検出可能な標識に融合、またはさもなければ接合したストレプトアビジンを使用して、それらの続く検出を可能にする。

【0093】

好ましくは、第２の結合剤は、抗体またはその抗原結合断片、例えば組換え抗体またはその抗原結合断片を含むか、またはからなる。好ましくは、抗体またはその抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、免疫グロブリン分子の結合ドメインからなる群から選択される。

【0094】

１つまたはそれ以上の第２の結合剤を、検出可能部分で標識し、例えば検出可能部分は、蛍光部分、発光部分、化学発光部分、放射活性部分、酵素部分からなる群から選択される。好ましくは、検出可能部分は蛍光部分（例えばＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素、例えばＡｌｅｘａ６４７）である。

【0095】

本発明の第１の態様の１つの実施形態において、方法は、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫吸着測定法）を含むか、またはからなる。

【0096】

血清または血漿タンパク質を検出するための好ましいアッセイとしては、モノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体を使用するサンドイッチアッセイを含む、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、免疫放射定量測定法（ＩＲＭＡ）および免疫酵素測定法（ＩＥＭＡ）が挙げられる。例示サンドイッチアッセイは、参照によって本明細書に組み入れる、米国特許第４，３７６，１１０号および同４，４８６，５３０号にて、Ｄａｖｉｄらによって記述される。スライド上の細胞の抗体染色が、当業者に周知のように、細胞学研究室診断試験にて周知の方法にて使用される。

【0097】

したがって１つの実施形態において、アッセイは、典型的に、通常固相アッセイにて、着色した反応産物を与える、酵素の使用を含むＥＬＩＳＡ（酵素免疫吸着測定法）である。ホースラディッシュペルオキシダーゼおよびホスファターゼのような酵素が広く用いられてきた。ホスファターゼ反応を増幅する方法は、ここで第２の酵素システムのための共酵素として働く、ＮＡＤを発生させるために、基質としてＮＡＤＰを使用することである。大腸菌由来のピロホスファターゼが、該酵素が組織内に存在しないので、良好なコンジュゲートを生成し、安定であり、良好な反応色を提供する。ルシフェラーゼのような酵素に基づく化学発光系も使用される。

【0098】

ビタミンビオチンとのコンジュゲーションが、それに大きな特異性とアフィニティにて結合するその酵素連結アビジンまたはストレプトアビジンとのその反応によって簡単に検出可能であることから、しばしば使用される。

【0099】

代替実施形態において、タンパク質検出のために使用するアッセイは、従来通り、蛍光アッセイである。したがって、第２の結合剤の検出可能部分は、Ａｌｅｘａ蛍光色素分子（例えばＡｌｅｘａ−６４７）のような、蛍光部分であってよい。

【0100】

好ましくは、ＲＯＣ ＡＵＣ値によって決定されるような、方法の叙述的正確さは、少なくとも０．５０、例えば少なくとも０．５５、０．６０、０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８または少なくとも０．９９である。より好ましくは、ＲＯＣ ＡＵＣ値によって決定されるような、方法の叙述的正確さは、少なくとも０．８０（最も好ましくは１）である。

【0101】

本発明の第１の態様の方法において、工程（ｂ）は、ビーズに基づくアレイ、または表面に基づくアレイのようなアレイを使用して実施される。好ましくは、アレイは、マクロアレイ、マイクロアレイ、ナノアレイからなる群から選択される。

【0102】

前立腺がん関連疾患状態を決定するための方法は、ｈｔｔｐ：／／ｃｒａｎ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／ｗｅｂ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｅ１０７１／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌから入手可能なもの（例えばｅ１０７１ １．５〜２４）のような、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）を使用して実施する。しかしながら、任意の他の適切な手段も使用する。ＳＶＭはまた、本明細書で定義した１個またはそれ以上の表１バイオマーカーを含むか、またはからなる、バイオマーカーサインのＲＯＣ ＡＵＣを決定するために使用する。

【0103】

サポートベクターマシン（ＳＶＭ）は、分類および回帰のために使用される、一組の関連した、教師あり学習法である。一組のトレーニング例を考慮すると、２つのカテゴリーの内の１つに属しているとして各々マークすると、ＳＶＭトレーニングアルゴリズムが、新規の例が１つのカテゴリーに入るのか、他なのかを予測するモデルを構築する。直感的にＳＶＮモデルは、別のカテゴリーの例が、可能な限り広い明確なギャップによって分けられるようにマップされた、空間中の点としての例の代表である。新しい例をついで、その同一の空間にマップし、どちらのギャップの側にそれらが入るのかに基づいて、カテゴリーに属することを予測する。

【0104】

より正式に、サポートベクターマシンは、高または無限次元空間にて、超平面または超平面の組を構築し、分類、回帰または他のタスクのために使用される。一般に、マージンが大きいほど、分類子の一般化エラーは小さいので、直感的に、良好な分離が、（機能的マージンと呼ばれる）任意のクラスの最も近いトレーニングデータポイントに対する最も大きな距離を有する超平面によって達成される。ＳＶＭにおける更なる情報は、例えば、Ｂｕｒｇｅｓ、１９９８、Ｄａｔａ Ｍｉｎｉｎｇ ａｎｄ Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ２：１２１〜１６７頁を参照のこと。

【0105】

本発明の１つの実施形態において、ＳＶＭは、公知の薬剤（すなわち、公知の組織学的グレードの前立腺がん細胞、または公知の遠隔転移なしの生存を有する前立腺がん患者からの前立腺がん細胞）のバイオマーカープロファイルを使用して、本発明の方法を実施する前に、「トレーニング」する。そのようなトレーニング試料を走らせることによって、ＳＶＭは、何のバイオマーカープロファイルが、特定の性質に関連するかを学習することができる。トレーニングプロセスが完了すると、ＳＶＭは、試験したバイオマーカー試料が、特定の前立腺がん試料型（すなわち特定の前立腺がん関連疾患状態）からのものであるかを可能にする。

【0106】

しかしながら、このトレーニング手順は、必要なトレーニングパラメータで、ＳＶＭを前プログラムすることによって、迂回することが可能である。例えば、特定の前立腺がん関連疾患状態に属している細胞を、以上の例にて詳述した値および／または制御パターンを使用して、表１および／または表２において列記したバイオマーカーの測定を使用して、公知のＳＶＭパラメータにしたがって同定可能である。

【0107】

適したデータの選択（すなわち公知の前立腺がん状態の細胞、前立腺がんサブタイプ状態および／または公知の前立腺がんリスク群からのバイオマーカーの測定）でＳＶＭ機械を訓練することによって、表１および／または表２において列記したバイオマーカーの任意の組合せに対して、適切なＳＶＭパラメータを決定可能であることが当業者によって理解されるであろう。

【0108】

あるいは、表１および／または表２データを、本技術分野で公知の任意の他の適切な統計学的方法にしたがって、特定の前立腺がん関連疾患状態を決定するために使用する。

【0109】

好ましくは、本発明の方法は、少なくとも６５％の正確さ、例えば６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％正確さを有する。

【0110】

好ましくは、本発明の方法は、少なくとも６５％の感度、例えば６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％感度を有する。

【0111】

好ましくは、本発明の方法は、少なくとも６５％の特異性、例えば６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％特異性を有する。

【0112】

「正確さ」は、方法の正確な結果の割合を意味し、「感度」は、陽性として正確に分類される全ての陽性化学物質の割合を意味し、「特異性」は、陰性として正確に分類される全ての陰性化学物質の割合を意味する。

【0113】

あるいは、またはさらに、工程（ｂ）、（ｄ）および／または工程（ｆ）を、アレイを用いて実施する。

【0114】

アレイは本質的に本技術分野で周知である。典型的に、これらは、固体支持体の表面上に形成された、それぞれが有限な面積を有する、空間的に離れた（すなわち異なる）領域（「スポット」）を有する直線または二次元構造から形成される。アレイはまた、各ビーズが、分子コードもしくはカラーコードによって同定可能であるか、または連続フロー中で同定可能である、ビーズ構造でもあり得る。解析はまた、試料を、それぞれ溶液から分子のクラスを吸着する、一連のスポット上を通過させて、連続して実施可能である。固体支持体は典型的に、ガラスまたはポリマーであり、最も一般的に使用されるポリマーは、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、塩化ポリビニルまたはポリプロピレンである。固体支持体は、チューブ、ビーズ、ディスク、シリコンチップ、マイクロプレート、ポリビニリデン、ジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、他の多孔性膜、非多孔性膜（例えばプラスチック、ポリマー、パースペック、シリコンなど）、複数の重合性ピン、または複数のマイクロタイターウェル、またはタンパク質、ポリヌクレオチドおよび他の適切な分子を固定化するために、および／または免疫アッセイを実施するために適切な任意の他の表面の形体であってよい。結合方法は、本技術分野で周知であり、一般に、タンパク質分子、ポリヌクレオチドなどを、固体支持体に、架橋、共有結合または物理的に吸着することからなる。あるいは、アフィニティ−タグまたは同様の構造物を介したプローブのアフィニティ結合が利用される。接触または非接触印刷、マスキングまたはフォトリソグラフィーのような、よく公知の技術を使用することによって、各スポットの位置が定義可能である。概説のために、Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｒ．Ｅ．、Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ、Ｓ．Ｒ．（２００１、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２、１３〜２９頁）およびＬａｌ ら（２００２、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ １５；７（１８ Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ１４３〜９頁）を参照のこと。

【0115】

典型的に、アレイはマイクロアレイである。「マイクロアレイ」は、少なくとも約１００／ｃｍ^２、好ましくは少なくとも約１０００／ｃｍ^２の、別個の領域の密度を有する領域のアレイの意味を含める。マイクロアレイ中の領域は、典型的な寸法、例えば約１０〜２５０μｍの範囲内の直径を有し、およそ同一の距離によって、アレイ中の他の領域から離れている。アレイはあるいは、マクロアレイまたはナノアレイである。

【0116】

一旦（以上で議論した）適切な結合分子が同定され、単離されたならば、当業者は、分子生物学の技術分野でよく公知の方法を使用してアレイを製造可能である。以下の実施例を参照のこと。

【0117】

アレイは、ビーズに基づくアレイでもよいが、好ましくは表面に基づいたアレイ、例えばマクロアレイ、マイクロアレイおよびナノアレイからなる群から選択されるアレイである。

【0118】

しかしながら、本方法は、
（ｉ）試料中に存在するバイオマーカーをビオチンで標識する工程；
（ｉｉ）ビオチン標識タンパク質を、その表面上の個別の位置で固定化された複数のｓｃＦｖを含むアレイと接触させる工程であって、ｓｃＦｖが、表１中のタンパク質の１つまたはそれ以上に対して特異性を有する、工程；
（ｉｉｉ）固定化ｓｃＦｖを、蛍光色素を含むストレプトアビジンコンジュゲートと接触させる工程；および
（ｉｖ）アレイ表面上の別個の位置での色素の存在を検出する工程
を含んでもよく、アレイ表面上の色素の発現が、試料中の表１からのバイオマーカーの発現の指標である。

【0119】

本発明の第１の態様の方法は、工程（ｂ）、（ｄ）および／または（ｆ）にて、１個またはそれ以上のバイオマーカーをコードしている核酸分子の発現を測定することを含んでもよい。

【0120】

好ましくは、核酸分子は、ｃＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子（最も好ましくはｍＲＮＡ分子）である。

【0121】

工程（ｂ）、（ｄ）および／または（ｆ）での１個またはそれ以上のバイオマーカーの発現は、サザンブロットハイブリダイゼーション、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、ナノアレイ、マイクロアレイ、マクロアレイ、オートラジオグラフィーおよびインサイチューハイブリダイゼーションからなる群から選択される方法を使用して実行される。好ましくは、工程（ｂ）において、１個またはそれ以上のバイオマーカーの発現は、ＤＮＡマイクロアレイを使用して決定される。

【0122】

したがって、工程（ｂ）、（ｄ）および／または（ｆ）において、１個またはそれ以上のバイオマーカーの発現を測定することは、それぞれが個々に、表１にて同定されたバイオマーカーの１つをコードしている核酸分子に選択的に結合可能である、１つまたはそれ以上の結合部分を使用して実施される。１つまたはそれ以上の結合部分はそれぞれ、核酸分子を含むか、またはからなる。

【0123】

１つまたはそれ以上の結合部分はそれぞれ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＧＮＡ、ＴＮＡまたはＰＭＯ（好ましくはＤＮＡ）を含むか、またはからなる。好ましくは、１つまたはそれ以上の結合部分は、５〜１００ヌクレオチドの長さである（例えば１５〜３５ヌクレオチドの長さである）。

【0124】

１つの実施形態において、結合部分は、検出可能部分、例えば、蛍光部分、発光部分、化学発光部分、放射活性部分（例えば放射活性原子）または酵素部分からなる群から選択される検出可能部分を含む。好ましくは、検出可能部分は、放射活性原子を含むか、またはからなり、例えば放射活性原子は、テクネチウム−９９ｍ、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、リン−３２、硫黄−３５、重水素、トリチウム、レニウム−１８６、レニウム−１８８およびイットリウム−９０からなる群から選択される。

【0125】

しかしながら、部分は、蛍光部分であってよい。

【0126】

１つの実施形態において、工程（ｂ）、（ｄ）および／または（ｆ）において用意される試料は、非画分化血液、血漿、血清、組織液、前立腺組織、前立腺液、胆汁および尿からなる群から選択され、好ましくは、非画分化血液、血漿、血清からなる群から選択される。最も好ましくは、工程（ｂ）、（ｄ）および／または（ｆ）において用意される試料は、血漿である。

【0127】

本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様またはその任意の実施形態もしくは実施形態の組合せにおいて定義された１つまたはそれ以上の結合剤を含む、個体の前立腺がんの存在を決定するためのアレイを提供する。

【0128】

好ましくは、アレイは、表１において定義したタンパク質それぞれに対する、１つまたはそれ以上の結合剤を含む。

【0129】

本発明の第３の態様は、予後および／または診断マーカーとしての、本発明の第１の態様、またはその任意の実施形態もしくは実施形態の組合せにおいて定義した群から選択される１個またはそれ以上のバイオマーカーの使用を提供する。

【0130】

好ましくは、表１において定義したバイオマーカーの全ては、予後および／または診断マーカーとして使用される。

【0131】

本発明の第４の態様は、本発明の第１の態様において定義した、予後および／または診断マーカーとしての使用のための、本発明の第１の態様、またはその任意の実施形態もしくは実施形態の組合せにおいて定義した単離された結合剤を提供する。

【0132】

本発明の第５の態様は、
Ａ）本発明の第１の態様、もしくはその任意の実施形態もしくは実施形態の組合せにおいて定義した１つまたはそれ以上の第１の結合剤、または本発明の第２の態様、もしくは任意の実施形態またはその実施形態の組合せによるアレイ；
Ｂ）本発明の第１の態様、または任意の実施形態もしくはその実施形態の組合せにおいて定義した方法を実行するための説明書
を含む、前立腺がんの存在を決定するためのキットを提供する。

【0133】

１つの実施形態において、キットは、本発明の第１の態様、または任意の実施形態もしくはその実施形態の組合せにおいて定義した第２の結合剤を含む。

【0134】

本発明の第６の態様は、実質的に本明細書に記載されている、個体の前立腺がん関連疾患状態の存在を決定するための方法または使用を提供する。

【0135】

実質的に本明細書に記載されている、個体の前立腺がん関連疾患状態の存在を決定するためのアレイまたはキット。

【0136】

本発明の特定の態様を具体化する、好ましい非限定例をここで、以下の図面および表を参照して記述する。

【図面の簡単な説明】

【0137】

【図1-1】組換えｓｃＦｖ抗体マイクロアレイの評価を表す図である。Ａ）１４４０データ点（対照を含む１８０プローブ×８複製）を含む、代表的マイクロアレイのスキャンイメージ。本イメージは、８０％レーザー出力および８０％ＰＭＴ−ゲインにてスキャンした。Ｂ）アッセイ間の再現性、すなわちスポット対スポット変化。１６２の異なる抗体と８スポット複製に基づくデータ。Ｃ）アッセイ間の再現性、すなわちアレイ対アレイ変化。それぞれ１６２の異なる抗体を含む、２つの独立したアレイ上で解析した１つの試料に基づくデータ。

【図1-2】図１−１の続き。

【図2】ＰＣを有する増加リスクのある患者群のタンパク質発現プロファイリングを表す図である。Ａ（最低リスク）〜Ｄ（最高リスク）と記した４つのリスク群を、ｔＰＡＳと％遊離ＰＳＡに基づいて推測的に定義した。Ａ）有意に示差的に発現した解析物（ｐ＜０．０５）を、ウイルコクソンの符号付き検定を使用して同定し、ヒートマップにて提示する；緑−ダウンレギュレート、赤−アップレギュレートおよび黒−等レベル。Ｂ）各患者コホートを、トレーニング組（試料の７５％）と試験組（試料の２５％）に分けた。Ｃ）全ての１６２抗体を使用したＳＶＭに基づくアプローチを使用した、患者コホートＡ〜Ｄの分類、すなわちフィルター処理なしのデータ。ＳＶＭモデルを、トレーニング組でトレーニングし、独立した試験組上で試験し、ＲＯＣ ＡＵＣ値に関して表現する。

【図3-1】図３は、リスク群Ｃ（中程度範囲ｔＰＳＡおよび低％遊離ＰＳＡ）の統計学を示す図である。Ａ）すなわち編集なしデータを使用した、全ての１６２抗体に基づく教師なし階層的クラスタリングは、Ｃ１（黄色）およびＣ２（青色）と記した、２つの亜群への分離をもたらした。Ｂ）編集なしデータに基づく主要コンポーネント解析（ＰＣＡ）は、亜群Ｃ１（黄色）とＣ２（青色）への層別化を確認した。Ｃ）有意に示差的に発現した解析物（ｐ＜０．０５）を、ウイルコクソンの符号付き検定を使用して同定し、ヒートマップにて提示する；緑−ダウンレギュレート、赤−アップレギュレートおよび黒−等レベル。Ｄ〜Ｅ）１０−ｐｌｅｘサイトカインサンドイッチ抗体アッセイ（ＭＳＤ）を使用した、選択した分子の抗体マイクロアレイデータの検証。データは、観察されたシグナルの主要部が、ＭＳＤアッセイに対する検出の下限よりも上である、２つの解析物、ＴＮＦ−ａ（Ｄ）とＩＬ−８（Ｅ）に対してのみ示す。ＭＳＤデータを、これらの２つの解析物が、示差的に発現していることが示唆される、これらの場合（Ｃ１対Ｃ２）における相当するマイクロアレイデータと比較する。

【図3-2】図３−１の続き。

【図4-1】亜群Ｃ１およびＣ２対本来のリスク群Ａ、ＢおよびＤのタンパク質発現プロファイリングの図である。試料を、ＳＶＭ−ＬＯＯ交差検証を使用して分類し、ＲＯＣ ＡＵＣ−値を決定した。有意に示差的に発現したバイオマーカー（ｐ＜０．０５）を、ウイルコクソンの符号付き検定を使用して同定し、ヒートマップにて提示する；赤−アップレギュレート、緑−ダウンレギュレートおよび黒−等レベル。Ａ）それぞれＣ１対Ａ、Ｂ、およびＤのＳＶＭ−ＬＯＯ交差検証。Ｂ）それぞれＣ１対Ａ、ＢおよびＤに対する、有意に示差的に発現した解析物（ｐ＜０．０５）を表しているヒートマップ。Ｃ）それぞれＣ２対Ａ、Ｂ、およびＤのＳＶＭ−ＬＯＯ交差検証。Ｄ）それぞれＣ２対Ａ、ＢおよびＤに対する、有意に示差的に発現した解析物（ｐ＜０．０５）を表しているヒートマップ。Ｅ）Ａ対Ｄを区別している悪性サインの、Ｃ１対Ｃ２、Ｃ１対Ｄ、Ａ対Ｃ２およびＢ対Ｃ２に対応するマーカーの発現レベルとの比較。

【図4-2】図４−１の続き。

【図4-3】図４−２の続き。

【発明を実施するための形態】

【0138】

【表1】

【0139】

【表2】

【0140】

【表3】

【0141】

【表4】

【0142】

【表5】

【0143】

【表6】

【0144】

【表7】

【0145】

【表8】

【実施例】

【0146】

イントロダクション
血中の前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を使用した前立腺がん（ＰＣ）の早期検出が、スクリーンされていない男性間で、ＰＣ−死を減少させる。しかしながら、一般に使用されるカットオフでの、ＰＳＡの特異性が適度であるため、穏やかに上昇するＰＳＡを有する男性間で、増強したリスク分類に寄与しているさらなるバイオマーカーに対する差し迫った必要性が存在する。本研究では、組換え抗体マイクロアレイを、ルーチンのＰＳＡ−測定からの８０個の血漿試料のタンパク質発現プロファイリングのために適用し、総および％遊離ＰＳＡのレベルに基づいて、推測的に４つのリスク群に分けた。結果は、血漿タンパク質プロファイルが、ＰＣ（悪性バイオマーカーサイン）を正確に示すこと、および最も重要なことに、生化学的に定義されたＰＣリスク群と、中〜高相関を示したことを、同定可能であることを実証した。とりわけ、データはまた、推測的に異質であると公知の、中程度範囲ＰＳＡと低％遊離ＰＳＡを有するリスク群がさらに、それぞれ最も低いおよび最も高いリスク群とより共通点のある、２つの亜群に層別化可能であったことを暗示した。結論として、この概念実証研究において、本発明者らはしたがって、ＰＣのリスク群に関連した、血漿タンパク質バイオマーカーサインが、アフィニティプロテオミクスを使用して、未精製血漿試料から同定可能であったことを示した。本アプローチは、より長期の視点において、ＰＣ患者の改善されたリスク分類のための新規の機会を提供可能であった。

【0147】

材料と方法
臨床試料
本発明者らは、Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｓｋａｎｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｍａｌｍｏ，Ｓｗｅｄｅｎでの、日常的に実施されたＰＳＡ試験を参照して、５０〜７０歳の８０人の男性からの、非特定化ＥＤＴＡ抗凝固血液試料を使用した。臨床情報または患者同定子は、これらの試料に対して保持されておらず、試料を使用まで−８０℃にて保存した（表３）。遊離およびｔＰＳＡのレベルを、ＷＨＯ９６／６７０（ＰＳＡ−ＷＨＯ）およびＷＨＯ６８／６６８（遊離ＰＳＡ−ＷＨＯ）較正器に対して較正した、二重標識ＤＥＬＦＩＡ Ｐｒｏｓｔａｔｕｓ（Ｃ）総／遊離ＰＳＡ−アッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｔｕｒｋｕ、Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して決定した。検出可能範囲は、ｔＰＳＡに対して０．１０〜２５０ｎｇ／ｍｌ、遊離ＰＳＡに対して０．０４〜２５０ｎｇ／ｍｌであった。ｔＰＳＡを測定することに対する変化係数（ＣＶ）は、ｔＰＳＡに対して≦１０．６％、遊離ＰＳＡに対して≦７．３％であった。試料を、％遊離および総ＰＳＡのレベルに基づいて４つの群に分けた。Ａ（ｎ＝２０）はｔＰＳＡ≦０．７０ｎｇ／ｍｌを有した；Ｂ（ｎ＝２０）は、％ｆＰＳＡ≧２７．９％で２．１〜８．０ｎｇ／ｍｌのｔＰＳＡを有した；Ｃ（ｎ＝２０）は、％ｆＰＳＡ≦１２．６％で５．０〜１０−３ｎｇ／ｍｌのｔＰＳＡを有した；およびＤ（ｎ＝２０）は、２４．６〜７２４ｎｇ／ｍｌのｔＰＳＡを有した。非特定化試料のこれらの４群は、非常に異なったＰＣ診断または結果のリスクのカテゴリーを反映し、群Ａは、意義のあるＰＣの非常に低い長期リスクを有し、群Ｂは、前立腺疾患の中程度増加リスクを有するが、臨床的に意義のあるＰＣの可能性は低く、群Ｃは、ＰＣの重度の増加リスクを有し、群Ｄは、臨床的に意義のあるまたは進行ステージのＰＣの非常に高リスクを有する［３８〜４１］。従った手順は、１９７５のＨｅｌｓｉｎｋｉ Ｄｅｃｌａｒａｔｉｏｎによった。

【0148】

血漿試料の標識
ＥＤＴＡ抗凝固血漿試料を、１つのマイナーな調整を加えて、血清プロテオームに対して、先に最適化されたプロトコル［２８、２９］にしたがって標識した。血漿試料を、凝固することからの防ぐために、ＥＤＴＡを、プロトコルを通して使用したＰＢＳ緩衝液に、４ｍＭの最終濃度まで加えた。簡単には、試料を、１６０００×ｇにて２０分間、４℃にて遠心し、５μｌの試料をついで、４５回、４ｍＭ ＥＤＴＡ ＰＢＳ中に希釈し、約２ｍｇ／ｍｌの総タンパク質濃度を得た。希釈試料を、０．６ｍＭ ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）とともに、２時間氷上でインキュベートし、その後未反応ビオチンを、４ｍＭ ＥＤＴＡ−ＰＢＳに対して、７２時間４℃にて透析することによって除去した。最後に、試料を分液し、マイクロアレイ実験での使用の前に−２０℃で保存した。

【0149】

ｓｃＦｖの生成と精製
主に免疫制御に関与する６２つの異なる解析物に対して指向する１６２個のヒト組換えｓｃＦｖ抗体断片を、ｎ−ＣｏＤｅＲライブラリー［４２］から選択し、Ｂｉｏｉｎｖｅｎｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢ（１５７個のｓｃＦｖクローン；Ｌｕｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎ）およびＭ．Ｏｈｌｉｎ博士（５つのムチン−１特異的クローン、Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌｕｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｌｕｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎ）より好意に提供された（サポート情報表３）。これらのファージディスプレイ誘導ｓｃＦｖ抗体の特異性、アフィニティ（１〜１０ｎＭ範囲内）およびオンチップ機能性を、（ｉ）厳重ファージディスプレイ選別プロトコル［４２］、（ｉｉ）多重クローン（≦４）／標的解析物および（ｉｉｉ）マイクロアレイ適用に対して適合した分子デザイン［２６、２７］を使用して確かにした。さらに、種々の抗体の特異性／反応性パターンは、十分に特徴付けられた血漿試料と、ＥＬＩＳＡ、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）、サイトメトリビーズアレイ（ＣＢＡ）および質量分析（ＭＳ）のような直交法を用いて、ならびにスパイキングおよびブロッキング実験を使用しすでに確認されてきた（サポート情報表３）［３１、３３、３４、３６］。全てのｓｃＦｖを、１００ｍｌ大腸菌培養液中で生成し、Ｎｉ^２＋−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上のアフィニティクロマトグラフィーを使用して、発現上清から精製した。結合した分子を、２５０ｍＭイミダゾール（Ｓａｖｅｅｎ Ｗｅｒｎｅｒ、Ｍａｌｍｏ，Ｓｗｅｄｅｎ）にて溶出し、ＰＢＳに対して透析し、ついで、マイクロアレイ実験にて、使用の前に４℃にて保存した。ｓｃＦｖの完全性と純度を、１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって評価した。タンパク質濃度を、２８０ｎｍでの吸収を測定することによって決定した。

【0150】

抗体マイクロアレイの生成と処理
簡単に、ｓｃＦｖマイクロアレイを、被接触ディスペンサ（ＳｃｉＦｌｅｘａｒｒａｙｅｒ Ｓ１１、Ｓｃｉｅｎｉｏｎ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して生成し、先に最適化されたセットアップにしたがって処理した［２８、２９］。合計において、１８０個のｓｃＦｖと対照を、８複製にて、Ｂｌａｎｋ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｍａｘｉｓｏｒｐスライド（ＮＵＮＣ Ａ／Ｓ、Ｒｏｓｋｉｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）上に、０．０５〜０．４ｍｇ／ｍｌのｓｃＦｖ濃度にて、各位置に一滴（３００ｐＬ）で、アレイした。１８０個のプローブを、それぞれ６０列を含む３つのカラム内にアレイした（図１Ａ）。ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ−６４７標識ストレプトアビジン（１０ｕｇ／ｍｌ）を陽性対照としてプリントし、プリンティング緩衝液（ＰＢＳ）を陰性対照として含んだ。プリンティングの後、スライドを乾燥させ、ＰＢＳ中５％（ｗ／ｖ）無脂肪牛乳（Ｓｅｍｐｅｒ ＡＢ、Ｓｕｎｄｂｙｂｅｒｇ、Ｓｗｅｄｅｎ）中で、ｏ／ｎでブロックした。スライドをついで、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｒｒａｙ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ ＆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）中に配置し、ＰＢＳ中０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）で、４分間洗浄した。次に、１％（ｗ／ｖ）無脂肪牛乳粉末と１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−ＭＴ）中１：２希釈した７０μｌの標識試料を注射し、６０分間撹拌しながらインキュベートした。第２の洗浄後、アレイを、ＰＢＳ−ＭＴ中３５０μｌの１μｇ／ｍｌ Ａｌｅｘａ−６４７コンジュゲートストレプトアビジンとともに６０分間インキュベートした。洗浄後、アレイを、窒素気体流下乾燥させ、５つの異なるスキャナ設定（５０％ＰＭＴゲインおよび７０％レーザー出力（５０／７０）、７０／７０、８０／８０、８０／９０および９０／９０）を使用して、共焦点マイクロアレイスキャナ（ＳｃａｎＡｒｒａｙ Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ ＆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、５μｍ解析度でスキャンした。シグナル強度を、ＳｃａｎＡｒｒａｙ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア・バージョン４．０（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ ＆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して定量化した。局所バックグラウンドを差し引き、任意の潜在的局所欠陥に対して補償するために、２つの最も高い、および最も低い複製を自動的に除外した。提示したシグナル強度は、残りの４つの複製スポットに対する平均値を提示している。不飽和スポットのみが、解析のために考慮された。

【0151】

マイクロアレイデータ標準化
データ組のチップ間標準化を、ＤＮＡマイクロアレイに対して開発された標準化と類似の、半グローバル標準化アプローチ［３２、３３］を使用して実施した。変化係数（ＣＶ）をまず、各解析物に対して計算し、ランク付けした。全ての試料にわたり、最も低いＣＶ−値を表示した１５パーセントの解析物を同定し、２４個の解析物が相当し、各試料に対して、チップ間標準化因子を計算するために使用した。標準化因子Ｎｉを、式Ｎｉ＝Ｓｉ／μによって計算し、式中Ｓｉは各試料に対して、２４個の解析物に対するシグナル強度の合計であり、ｉは、全ての試料にわたり平均化した、２４個の解析物に対するシグナル強度の合計である。１つの試料から生成した各データ組を、標準化因子Ｎｉで割った。シグナル強度のＬｏｇ２値をさらなる解析のために使用した。

【0152】

データ解析
８０個の患者試料を、ｔＰＳＡと％ｆＰＳＡの値に基づいて、４つの群（ｎ＝２０）に分けた。初期分類解析のために、各４つのリスク群を、トレーニング組（ｎ＝１５）および試験組（ｎ＝５）に分けた。試料を分類するために、本発明者らは、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、Ｒにおける教師あり学習法を使用した［４３］。教師付き分類を、直線カーネルを使用して実施し、制約のコストを１に設定し、Ｒ機能ＳＶＭにおけるデフォルト値であり、オーバーフィッティングを避けるために、それを調節するための試みは実施しなかった。ＳＶＭモデルを、トレーニング組を使用してトレーニングし、ついで凍結し、試験組に適用した。データのフィルター処理は、ＳＶＭのトレーニングの前に実施せず、すなわちアレイ上の全ての抗体からのデータを、解析に含めた。さらに、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を、ＳＶＭ決定値を使用して構築し、曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。Ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎｄ Ｔｒｅｅｖｅｉｗ［４４］中の教師なし階層的クラスタリングを使用して、Ｃ群を、Ｃ１（ｎ＝１０）とＣ２（ｎ＝１０）と記される２つの亜群に分けることができた。より小さな試料数のために、トレーニングと試験組への分離は、この場合不可能であり、ＳＶＭをしたがって、リーブ・ワン・アウト交差検証手順を用いてトレーニングした。有意にアップまたはダウンレギュレートされた血漿タンパク質（ｐ＜０．０５）を、相対タンパク質レベルに基づいて定義し、ウイルコクソンの符号付き検定を使用して同定した。試料を、主要成分解析（ＰＣ）ソフトウェアプログラム（Ｑｌｕｃｏｒｅ Ｏｍｉｃｓ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ、Ｌｕｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎ）および／またはＣｌｕｓｔｅｒ ａｎｄ Ｔｒｅｅｖｉｅｗを使用して可視化した。

【0153】

検証実験
抗体マイクロアレイ結果を検証することの試みにおいて、ヒトＴｈ１／Ｔｈ２ １０−ｐｌｅｘ ＭＳＡ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）アッセイを、全ての８０個のＥＤＴＡ−血漿試料に対して実行した。ＭＳＤ ９６−プレートの各ウェルを、空間的に異なる電極スポットにて、ＩＦＮ−ａ、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３およびＴＮＦ−ａに対する抗体で、前機能化した。アッセイを、製造業者によって提供されたプロトコルにしたがって実行し、電気化学発光に基づくリードアウトを、ＭＳＤ ＳＥＣＴＯＲ（登録商標）器具にて実施した。検出の制限を、標準曲線中のゼロポイントにわたる、標準偏差の２．５倍シグナルとして定義した。

【0154】

結果
本研究において、本発明者らは、本発明者らの組織内で開発した組換え抗体マイクロアッセイを使用して、ＰＣを有する種々のレベルのリスクでの、８０人の患者からの非画分化、ビオチン化ＥＤＴＡ−血漿試料の、タンパク質発現プロファイリングを実施した。試料を推論的に、異なるカテゴリーのＰＣ診断または結果のリスクを反映している、ｔＰＳＡおよび％ｆＰＳＡに基づいた、４つのリスク群に分けた（表３）。

【0155】

ｓｃＦｖマイクロアレイの評価
代表的マイクロアレイイメージを、図１Ａにて示し、これは、同質スポット形態学、高シグナル対ノイズ比、および動的シグナル強度を得たことを示している。全ての８０個の試料を首尾良くプロファイルし、したがって、全ての８０個の試料からのアレイデータを、続く統計学的解析に使用可能であった。アッセイ内再現性を、スポット対スポット検証を解析することによって査定し、０．９５の決定の平均係数（Ｒ２）をもたらした（図１Ｂ）。アッセイ内再現性、すなわちアレイ対アレイ変化を、独立したアレイ上の単一試料を解析することによって評価し、０．９６のＲ２−値が得られた（図１Ｃ）。

【0156】

リスク群の分類
まず、本発明者らは、Ａ〜Ｄと記した４つの前立腺がんリスク群の、焦点をあてた（６２個の解析物）血漿プロテオームプロファイルを決定し（表３）、群Ａは最も低いリスクを提示し、群Ｄは最も高いリスクを提示する。ウイルコクソンの符号付き検定を使用して、３〜４４個の示差的に発現した（ｐ＜０．０５）血漿解析物を同定し、図２Ａ中のヒートマップとして示す。データは、３つの解析物のみが、２つの最も低いリスク群ＡおよびＢの間で示差的に発現したことを示した。したがって、臨床的観点から推定可能であるように、データは、２つの最も低いリスク群間で小さな差違のみを暗示した。対照的に、３７個、４４個および３０個の脱制御解析物が、最も高いリスク群Ｄに対して、群Ａ、ＢまたはＣに関して観察され、これは、大きい（より大きい）差にて示唆している。より詳細には、種々の補体タンパク質（例えばＣ３、Ｃ４、Ｃ１ｑ、ファクターＢおよびプロペルジン）が、高リスク群Ｄにてダウンレギュレートされることが見い出され、一方でアップレギュレートされた解析物は、ＴＨ１（例えばＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＮＦ−ａ）とＴＨ２（例えばＩＬ−４、ＩＬ−１０）サイトカイン両方の複雑なパターンを提示した。最も重要なことに、群Ａ（非常に低いＰＣ−リスク）対群Ｄ（ＰＣの臨床的に意義のあるまたは進行したステージの非常に高いリスク）を区別しているバイオマーカーサインが、ＰＣを特定している悪性バイオマーカーサインとして見ることができた。

【0157】

次に、本発明者らは、観察されたタンパク質発現プロファイルに基づいた、４つのリスク群（Ａ〜Ｄ）を分類するための、アレイプラットフォームの能力を評価した。本目的を達成するために、各患者群を、トレーニング組（試料の７５％）と試験組（試料の２５％）に分けた（図２Ｂ）。したがって、ＳＶＭモデルを、トレーニング組でトレーニングし、次いで独立した試験組に適用した。結果は、リスク群が、異なる正確さで区別可能であることを示し、群ＢおよびＤは、０．６８のＡＵＣを提示し、群ＡおよびＢは、０．８４のＡＵＣを提示し（３つの解析物のみに基づく）、群ＡおよびＤは、０．７２のＡＵＣを提示した（図２Ｃ）。したがって、データは、悪性サインが、群Ａ（非常に低リスク）対群Ｄ（ＰＣの臨床的に意義のあるまたは進行ステージの非常に高リスク）をよく区別するために使用可能であることを示した（図２Ａおよび２Ｃ参照）。対照的に、Ｃ群は、３つの他のリスク群のいずれかからも区別できなかった（全ての場合でＡＵＣ＝０．５）。この文脈において、全てが生検試験に対して選別されるけれども、Ｃ群が、その２５〜５０％のみが実際にＰＣを有した、異種患者群（中程度範囲ｔＰＳＡ、低％遊離ＰＳＡ）を表すことに留意すべきである。したがって、この異種患者群の層別化は実質的に、ＰＣを発症しているより高い、またはより低い患者を同定するための、鍵となる手段でありうる。

【0158】

リスク群Ｃの層別化
Ｃリスク群をさらに層別化可能であったかどうか調査するために、本発明者らは、フィルター処理なしのデータに基づいて、すなわち、アレイ上に含まれたすべての抗体からのデータを使用して、教師なし階層的クラスタリングを実施した。結果は、Ｃリスク群が実際に、Ｃ１およびＣ２と記す、２つの異なる亜群に層別化可能であったことを示した（図３Ａ）。同様に、主要要素解析（ＰＣＡ）を使用して、Ｃコホートの明確な亜分割も観察された（図３Ｂ）。さらに、４９個の有意に示差的に（ｐ＜０．０５）発現した血漿解析物を、Ｃ１対Ｃ２に対して観察した（図３Ｃ）。より詳細には、３つの補体タンパク質が、Ｃ１にてアップレギュレートされ（Ｃ１ｑ、ファクターＢおよびＣ４）、一方でＣ１において、示差的に発現したタンパク質がダウンレギュレートされたままである。解析物の後者群には、多数のサイトカイン（例えばＩＬ−６およびＩＬ−４）、補体タンパク質（例えばＣ１−ＩＮＨおよびＣ１ｓ）、ならびに細胞表面タンパク質（例えばＩＣＡＭ、ＨＬＡ−ＤＲ、ムチン−１およびＣＤ−４０）が含まれた。合わせると、データは、異質リスク群Ｃが、多数の脱制御解析物にて、２つの異なる亜群、Ｃ１およびＣ２に層別化可能であったことを示した。

【0159】

アレイデータを検証するために、独立した１０−ｐｌｅｘサイトカインサンドイッチ抗体マイクロアレイ（ＭＳＤ）を適用した（図３Ｄおよび３Ｅ）。Ｃ１対Ｃ２にてＴＮＦ−α（図３Ｄ）およびＩＬ−８（ＩＬ−８）（図３Ｅ）の観察されたダウンレギュレーションを、ＭＳＤデータによって検証可能であった。

【0160】

亜群Ｃ１およびＣ２のリスク分類
リスク群Ｃの層別化された再分割の生物学的インパクトを査定するために、亜群Ｃ１およびＣ２のタンパク質発現プロファイルを、他の３つの本来のリスク群Ａ、ＢおよびＤのものと比較した。Ｃ１の場合、結果は、Ｃ１が、リスク群Ｄとよく区別される（ＡＵＣ＝０．８２）が、リスク群ＡおよびＢからは区別されない（両方の場合でＡＵＣ＝０．５）ことを示した（図４Ａ）。さらに、４７個の示差的に発現した解析物が、Ｃ１対Ｄに対して観察されたが、Ｃ１対ＡおよびＢではそれぞれ、１６個および１５個のみであった（図４Ｂ）。前者の場合、アップレギュレートされた補体タンパク質（例えばＣ１ｑ、Ｃ３およびファクターＢ）と、ダウンレギュレートされたサイトカイン（例えばＴＧＦ−ａ１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６およびＭＣＰ−１）および細胞表面マーカー（例えばＩＣＡＭ、ＣＤ４０およびルイスＸ）のパターンが、Ｃ１対Ｄにて観察された。

【0161】

対照的に、結果は、Ｃ２が、リスク群Ａ（ＡＵＣ＝０．７２）およびＢ（ＡＵＣ＝０．７５）両方からからよく区別されるが、リスク群Ｄ（ＡＵＣ＝０．５７）からは区別されないことを示した（図４Ｃ）。この場合、２２個および２８個の脱制御解析物が、Ｃ２対ＡおよびＢでそれぞれ観察されたが、Ｃ２対Ｄに対してはたった５個であった（図４Ｄ）。２つのダウンレギュレートされた解析物のみ（Ｃ１ｑおよびＩＬ−４）が、Ｃ２対Ａで観察される一方で、アップレギュレートされたサイトカイン（例えばＩＬ−１ｒａ、ＭＣＰ−１およびＩＬ−６）と細胞表面マーカー（例えばＣＤ４０、ルイスＸおよびシアリル・ルイスＸ）のパターンが、Ｃ２対ＡおよびＢ両方で観察された。一緒にすると、結果は、Ｃ１が、最も低リスク群ＡおよびＢにより類似であり、一方でＣ２は、最も高いリスク群Ｄにより高い類似性を提示し、これは、Ｃ１群が、低リスク患者を表し、Ｃ２群が高リスク患者を表すことを示唆する。

【0162】

最後に、生物学的関連性をさらに強調するために、本発明者らは、リスク群Ａ（非常に低リスク）対リスク群Ｄ（ＰＣの臨床的に意義のあるまたは進行したステージの非常に高リスク）を区別している悪性サイン（３３個のバイオマーカー）（図２Ａ）の、以上のサインの相当するマーカーの発現レベル（図４Ｅ）との重なりを比較した。データは、悪性バイオマーカーサインの有意な部分がまた、Ｃ１対Ｃ２（３３個の内２７バイオマーカー）、およびＣ１対Ｄ（３３個の内２９バイオマーカー）の場合に示差的に発現された一方で、Ａ対Ｃ２およびＢ対Ｃ２を区別しているサインとの重なりが、有意により小さいことを示した。したがって、データはさらに、悪性バイオマーカーサインの生物学的関連性が、ＰＣを特定していることをさらに示唆した。

【0163】

議論
血液血漿は最小限に侵襲的であり、ＰＣの早期検出とリスク分離のためのバイオマーカーの理想的な供給源であろう臨床的によく確立された試料フォーマットである。その結果として、多数の大規模プロテオミクス効果において、本目的のために査定されてもきた［１９、２０］。しかしながら、タンパク質数およびダイナミックレンジに関して、血漿試料の固有の複雑性により、非画分化試料の古典的プロテオミクス解析は、ＰＣを分類するために有用でありそうにないということが議論されてきた［２１］。前画分化が、試料の複雑性を減少させるけれども、同時に、湾曲されたタンパク質収率／回収、ならびに再現性および感度に関する重大な問題に関連する［２２、２３］。この文脈において、本発明者らは最近、組換え抗体マイクロアレイによって表される、アフィニティプロテオミクスが、未精製プロテオーム中の、高くおよび低く不足している解析物をプロファイルするために使用可能であることを示した［２６、２７］。先に、単一血清マーカートロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）が、抗体マイクロアレイを使用して、良性および悪性前立腺疾患間を区別することが可能であることを示した［４５］。本概念実証試験において、本発明者らは、ＰＣのリスク群に関連した、第１の多重化候補血漿タンパク質バイオマーカーサインを解釈するために、未精製血漿試料を標的としているアフィニティプロテオミクスを使用した。したがって、ＰＣの組換え抗体マイクロアレイに基づく解析が、次世代のＰＣ−関連バイオマーカーを定義することに対する、潜在的経路を実証した。

【0164】

血液血漿プロテオームは、古典的血漿タンパク質と、組織漏出タンパク質両方からなる。ヒト免疫系の、細菌感染から腫瘍の増殖までの範囲の、体のホメオスタシスにおける微小な変化でさえ感知する、ヒト免疫系の固有の能力が、疾患の遠隔および早期センサとして、免疫系を使用する特有の可能性を提供する［４６］。実際、とりわけ、腫瘍発達における重要な因子として免疫学的監視を示している最近の研究［４８］により、イムノシグネチャリングは、明らかな興味を獲得してきた［４７］。この目的を達成するために、本発明者らは、主として免疫調節解析物を標的としている組換え抗体マイクロアレイを設計し、適用した［２６、２７］。先に、本発明者らは、がん診断に対する本発明者らのアレイデザイン［３２、３３］、証拠に基づく治療選択［３５］、ならびに乳がん再発に対するリスクの予測［３７］の潜在力を明示した。本探索研究において、本発明者らは、適用の範囲を拡張し、２つの最も低い対最も高いリスク群を明確に区別する、ＰＣにおけるリスク群層別化のためのその潜在的使用を示唆した。

【0165】

潜在的ＰＣ患者のリスク分類は、血清ＰＳＡアッセイ（ｔＰＳＡおよび％遊離ＰＳＡ）［４９］、２、３のリスク分類モデルの１つ［３、５０、５１］を使用して、臨床にて現在実施可能である。本アプローチが、多くの腫瘍の検出を可能にする一方で、悪性疾患に対する低い特異性が、不必要な生検試験にかけられている一部の患者をもたらす［３］。この数は、臨床家が、リスク分類のためのより適正なツールを利用可能になった場合に、有意に減少可能であった。特に、中程度範囲ｔＰＳＡ（４〜１０ｎｇ／ｍｌ）と低％ｆＰＳＡを有する患者群が、ＰＣと良性前立腺過形成の混合を含む、異種であると知られている［７、４９］。４つの先に決定されたリスク群を分類する本発明者らの取り組みにおいて、結果は、実際に、中程度範囲ｔＰＳＡと低％ｆＰＳＡを有する患者群（群Ｃ）が、他の３つのリスク群のいずれかから区別不可能であったことを示した。したがって、本発明者らのデータはさらに、非常に異種の患者群である、群Ｃの現在の見解を支持した。

【0166】

しかしながら、本発明者らのデータは、Ｃ群が、現在の文献から予測され［２、３、５、４９］、それぞれ２つの最も低いおよび最も高い本来のリスク群とより共通点があるような、２つの異なる亜群Ｃ１およびＣ２に分けることができたことをむしろ暗示した。がん患者の個別化処置を目的とする時に、異種患者群を、より高い、およびより低い、特定のがんを有している（発症している）リスクの、より正確な亜群に層別化する能力が、有益であろう。結局、これは、ＰＣがん患者を管理するための新規の機会を提供し得た。しかしながら、本探索研究は、含まれる患者の完全な臨床文書が入手されておらず、観察された候補バイオマーカーサインは、十分に特徴付けられた患者のより多くの、独立したコホートを対象とした、フォローアップ研究にて適切に検証されるであろう。とりわけ、初期実証のために使用された直交方法（ＭＳＤ）にて検出可能であった２つのサイトカイン、ＩＬ−６とＴＮＦ−ａが、Ｃ１対Ｃ２の本発明者らの区別化を支持した。

【0167】

より詳細に候補バイオマーカーサインを試験する時に、ＰＣの高および低リスクを反映するとすでに公知の新規ならびに多数の生物学的に関連した解析物が観察された。簡単に、ＴＧＦ−ａ１は、ＰＣに関連すると示されてきており、例えばＰＣモデルにおける細胞増殖、より高い腫瘍グレードおよび転移を促進し、結果、暫定的なバイオマーカーとして提案された［３、４、５２］。したがって、本発明者らは、ＴＧＦ−ａ１が、２つの最も低リスク群ＡおよびＢ、対最も高いリスク群Ｄにおいてダウンレギュレートされると発見した。加えて、ＡおよびＢ対Ｃ２（高リスク）、Ｃ１（低リスク）対Ｄ、ならびにＣ１対Ｃ２においてもダウンレギュレートされた。ＩＬ−６の場合、このサイトカインはまた、ＰＣに対する潜在的バイオマーカーとして示唆された［３、４］。本発明者らのデータは、ＩＬ−６が、それぞれ、低リスク群（Ａ、ＢまたはＣ１）対高リスク群（ＤまたはＣ２）の種々の比較においてダウンレギュレートされたことを示した。さらに、ＩＬ−１ｒａおよびＭＣＰ−１のような、低リスク群にてダウンレギュレートされる［５３、５４］と公知の他のサイトカインがまた、低リスク群（Ａ、ＢまたはＣ１）対高リスク群（ＤまたはＣ２）の異なる比較において、ダウンレギュレートされると発見され、これはさらに、本発明者らの報告した観察を支持している。さらに、ルイスＸが、低リスク群においてダウンレギュレートされるという観察が、先の結果と一致し、これは、前立腺がんでの予後パラメータとしてルイスＸを示している［５５］。これらの観察がまた、ＰＣを特定するために観察された、候補悪性バイオマーカーサインを支持したことに留意されたい。今日まで、補体タンパク質が、ＰＣの文脈において明らかに報告されてこなかった。本発明者らのデータは、Ｃ１ｑ、Ｃ３、Ｃ４、プロペルジンおよび／またはＣ１−ＩＮＨのような種々の補体タンパク質の異なる組合せが、それぞれ種々の低リスク群対高リスク群においてアップレギュレートされたことを示した。臨床試験において先には報告されなかったが、Ｃ１ｑが、前立腺がん細胞株において、保護的な役割を提示することが示された［５６］。

【0168】

まとめると、本発明者らは、アフィニティプロテオミクスを使用して、ＰＣリスク群ならびにＰＣに関連した候補血漿バイオマーカーサインを説明した。独立した患者コホートを標的として、結果は、臨床パラメータに基づいて推論的に定義された従来のリスク群が、層別化、またさらに再層別化可能であることを示し、潜在的に、新規の改善されたＰＣリスク群を概説している。

【0169】

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【図1-1】

【図1-2】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]