特許 6676035 リポソームムピロシン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6676035

(24)【登録日】2020年3月13日

(45)【発行日】2020年4月8日

(54)【発明の名称】リポソームムピロシン

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/351 20060101AFI20200330BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20200330BHJP

   A61K 47/40 20060101ALI20200330BHJP

   A61K 47/12 20060101ALI20200330BHJP

   A61K 47/28 20060101ALI20200330BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20200330BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20200330BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20200330BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20200330BHJP

   A61P 33/06 20060101ALI20200330BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/351

   A61K9/127

   A61K47/40

   A61K47/12

   A61K47/28

   A61K47/24

   A61K47/26

   A61P31/00

   A61P31/04

   A61P33/06

【請求項の数】16

【全頁数】38

(21)【出願番号】特願2017-504294(P2017-504294)

(86)(22)【出願日】2015年4月8日

(65)【公表番号】特表2017-513938(P2017-513938A)

(43)【公表日】2017年6月1日

(86)【国際出願番号】IL2015050376

(87)【国際公開番号】WO2015155773

(87)【国際公開日】20151015

【審査請求日】2018年3月15日

(31)【優先権主張番号】61/977,731

(32)【優先日】2014年4月10日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】516300667

【氏名又は名称】イッサム リサーチ ディベロップメント カンパニー オブ ザ ヘブライ ユニバーシティー オブ エルサレム リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＹＩＳＳＵＭ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ ＣＯＭＰＡＮＹ ＯＦ ＴＨＥ ＨＥＢＲＥＷ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＪＥＲＵＳＡＬＥＭ ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】110001302

【氏名又は名称】特許業務法人北青山インターナショナル

(72)【発明者】

【氏名】バーレンホルツ，エヘズケル

(72)【発明者】

【氏名】ゴールドブラム，アミラン

(72)【発明者】

【氏名】セルン，アハバ

【審査官】 六笠 紀子

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００９／０１９６９１８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００７／００１４８４５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第９５／０１５７４６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 J. Control Release，２０１４年 １月１０日，173，p.125-131

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／３３−３３／４４

Ａ６１Ｋ ９／００−９／７２

Ａ６１Ｋ ４７／００−４７／６９

ＷＰＩ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

脂質膜およびリポソーム内水性コンパートメントを含むリポソームであって、前記リポソーム内コンパートメントは、ムピロシン、少なくとも１つのシクロデキストリン（ＣＤ）化合物、およびｐＨ依存性イオン化可能アニオンを封入しており、前記リポソームは、０．１から１．０の範囲内のムピロシン対脂質モル比および０．０５から２．５の範囲内のＣＤ化合物対脂質モル比を有し、前記リポソームは、治療効果を、前記効果を必要とする対象への全身投与後に提供する、リポソーム。

【請求項2】

請求項１に記載のリポソームにおいて、生理学的に許容される媒体中に保持された場合、４℃の保存下で安定であり、前記安定性は、少なくとも１ヶ月間にわたる保存後に、前記媒体中へ放出されるムピロシンが２０％以下であることを特徴とするリポソーム。

【請求項3】

請求項１または２に記載のリポソームにおいて、０．１から０．２の範囲内のＣＤ化合物対脂質モル比を有することを特徴とするリポソーム。

【請求項4】

請求項１から３のいずれか一項に記載のリポソームにおいて、前記少なくとも１つのシクロデキストリン化合物が、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰβＣＤ）であることを特徴とするリポソーム。

【請求項5】

請求項１から４のいずれか一項に記載のリポソームにおいて、２０ｎｍから１２０ｎｍの間のサイズ分布を有することを特徴とするリポソーム。

【請求項6】

請求項１から５のいずれか一項に記載のリポソームにおいて、６０から９０ｎｍの間の平均サイズを有することを特徴とするリポソーム。

【請求項7】

請求項１から６のいずれか一項に記載のリポソームにおいて、小ユニラメラ状ベシクル（ＳＵＶ）であることを特徴とするリポソーム。

【請求項8】

請求項１から７のいずれか一項に記載のリポソームにおいて、前記ｐＨ依存性イオン化可能アニオンを、０．１〜０．５の範囲内のイオン対脂質モル比で含むことを特徴とするリポソーム。

【請求項9】

請求項１から８のいずれか一項に記載のリポソームにおいて、前記ｐＨ依存性イオン化可能アニオンを、０．２〜０．４の範囲内のイオン対脂質モル比で含むことを特徴とするリポソーム。

【請求項10】

請求項１から９のいずれか一項に記載のリポソームにおいて、前記ｐＨ依存性イオン化可能アニオンが、アセテートであることを特徴とするリポソーム。

【請求項11】

請求項１から１０のいずれか一項に記載のリポソームにおいて、前記脂質膜が、リポポリマーおよびコレステロールを含むことを特徴とするリポソーム。

【請求項12】

請求項１１に記載のリポソームにおいて、前記脂質膜が、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、コレステロール、およびｍＰＥＧ−ＤＳＰＥを含むことを特徴とするリポソーム。

【請求項13】

全身投与に適する生理学的に許容されるキャリア、および前記キャリア内のリポソームを含む医薬組成物であって、前記リポソームは、脂質膜およびリポソーム内コンパートメントを含み、前記リポソーム内コンパートメントは、ムピロシン、少なくとも１つのシクロデキストリン（ＣＤ）化合物、およびｐＨ依存性イオン化可能アニオンを含み；前記リポソームは、０．１から１．０の範囲内のムピロシン対脂質モル比および０．０５から２．５の範囲内のＣＤ化合物対脂質モル比を有する医薬組成物。

【請求項14】

請求項１３に記載の医薬組成物において、前記リポソームが、請求項１から１２のいずれか一項に定める通りであることを特徴とする医薬組成物。

【請求項15】

請求項１３または１４に記載の医薬組成物において、前記生理学的に許容されるキャリアが、スクロースを含むことを特徴とする医薬組成物。

【請求項16】

請求項１３から１５のいずれか一項に記載の医薬組成物において、前記生理学的に許容されるキャリアが、緩衝剤を含むことを特徴とする医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、薬物送達に関し、詳細には、リポソーム薬物送達に関する。

【背景技術】

【0002】

本発明で開示される主題に対する背景として関連すると考えられる参考文献を以下に挙げる：
− ＭｃＣｏｒｍａｃｋ Ｂ，Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ Ｇ．１９９８．Ｄｒｕｇｓ−ｉｎ−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｓ−ｉｎ−ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：ａｎ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｈｅ ｆａｔｅ ｏｆ ｗａｔｅｒ ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ ｄｒｕｇｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ １６２：５９−６９
− Ｃｌｅｒｃ Ｓ，Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ Ｙ．１９９５．Ｌｏａｄｉｎｇ ｏｆ ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ ｗｅａｋ ａｃｉｄｓ ｉｎｔｏ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｃａｌｃｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２４０：２５７−２６５．
− Ｚｕｃｋｅｒ Ｄ，Ｍａｒｃｕｓ Ｄ，Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ Ｙ，Ｇｏｌｄｂｌｕｍ Ａ．２００９．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｄｒｕｇｓ’ｌｏａｄｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ：ａ ｗｏｒｋｉｎｇ ｍｏｄｅｌ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｄｒｕｇ’ｓ ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ １３９：７３−８０
− Ｃｅｒｎ Ａ，Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ Ｙ，Ｔｒｏｐｓｈａ Ａ，Ｇｏｌｄｂｌｕｍ Ａ．２０１４．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ａｉｄｅｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｄｒｕｇｓ：Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇ ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ ｆｏｒ ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｒｅｍｏｔｅ ｌｏａｄｉｎｇ．Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ １７３：１２５−３１
− Ｚｈｏｕ Ｘ，Ｙｕｎｇ Ｂ，Ｈｕａｎｇ Ｙ，Ｌｉ Ｈ，Ｈｕ Ｘ，Ｘｉａｎｇ Ｇ ＬＲ．２０１２．Ｎｏｖｅｌ ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ（Ｌ−ＧＥＦ）ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ３２（７）：２９１９−２３
− Ｎｏｂｌｅ ＷＣ．１９９１．Ｔｈｅ ｕｓｅｓ ａｎｄ ａｂｕｓｅｓ ｏｆ ｍｕｐｉｒｏｃｉｎ．Ｊ Ａｍ Ａｃａｄ Ｄｅｒｍａｔｏｌ：３−５．
− Ｃｅｒｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ − ｐｒｏｐｅｒｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｒｅｍｏｔｅ ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｌｏａｄｉｎｇ ｏｆ ｄｒｕｇｓ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ １６０，１４７−１５７（２０１２）

【0003】

本明細書における上記参考文献の認知は、これらが本発明で開示される主題の特許性にいかなる形であっても関連することを意味するものと推測されるべきではない。

【0004】

リポソーム薬物を臨床的に用いるためには、リポソームあたりの高い濃度で薬物がローディングされるべきである。これは、治療用量を提供するために必須の必要条件である。ほとんどの場合、ナノリポソームが極めて小さい体積であることに起因して（約１×１０−^１９リットル）、薬物のリモート（アクティブ）ローディングが、所望される薬物濃度を達成するための唯一の手法である。リモートローディングは、予め形成されたリポソーム内に薬物（典型的には、両親媒性の弱酸または弱塩基）を取り込むための推進力として、イオン勾配を用いる。

【0005】

薬物のリモートローディングでは、充分な薬物の溶解度が必要であり、不溶性の薬物、または低溶解度を有する薬物の場合、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４００、プロピレングリコール（ＰＧ）、またはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰＣＤ）などのシクロデキストリンなどの「可溶化剤」がリモートローディングの過程で添加され得る。これまでのところ、リポソームローディング向上のためのシクロデキストリンの使用は、主として、パッシブローディングによってローディングされる薬物に関して研究されてきた［Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ Ｇ．Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ １６２：５９−６９，１９９８］。

【0006】

リモートローディングに関して収集された膨大な量のデータにより、薬物リモートローディングに対する分子上の特徴および実験条件の両方が及ぼす影響を評価するモデルが開発されてきた［Ｚｕｃｋｅｒ Ｄ，Ｍａｒｃｕｓ Ｄ，Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ Ｙ，Ｇｏｌｄｂｌｕｍ Ａ．２００９．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｄｒｕｇｓ’ｌｏａｄｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ：ａ ｗｏｒｋｉｎｇ ｍｏｄｅｌ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｄｒｕｇ’ｓ ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ １３９：７３−８０］。構築された定量的構造物性相関（ＱＳＰＲ）モデル（Ｃｅｒｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｐｒｏｐｅｒｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｒｅｍｏｔｅ ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｌｏａｄｉｎｇ ｏｆ ｄｒｕｇｓ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ １６０，１４７−１５７（２０１２））により、リモートリポソームローディングのための良好な候補を識別するための薬物データベースのスクリーニングが可能となった［Ｃｅｒｎ Ａ，Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ Ｙ，Ｔｒｏｐｓｈａ Ａ，Ｇｏｌｄｂｌｕｍ Ａ．２０１４．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ａｉｄｅｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｄｒｕｇｓ：Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇ ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ ｆｏｒ ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｒｅｍｏｔｅ ｌｏａｄｉｎｇ．Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ １７３：１２５−３１］。リポソームへのローディングのための良好な候補として識別された薬物のうちの１つは、ムピロシン（９−［（Ｅ）−４−［（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−５−［［（２Ｓ，３Ｓ）−３−［（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシブタン−２−イル］オキシラン−２−イル］メチル］オキサン−２−イル］−３−メチルブタ−２−エノイル］オキシノナン酸）であり、これは、イソロイシルｔＲＮＡシンセターゼの阻害を介して作用する抗生物質である。血流中に吸収されるか、または非経口投与されると、ムピロシンは、急速に分解して、不活性のモン酸を形成する。従って、ムピロシンによる従来の治療法は、局所投与に限定されている［Ｎｏｂｌｅ ＷＣ．１９９１．Ｔｈｅ ｕｓｅｓ ａｎｄ ａｂｕｓｅｓ ｏｆ ｍｕｐｉｒｏｃｉｎ．Ｊ Ａｍ Ａｃａｄ Ｄｅｒｍａｔｏｌ：Ｖｏｌ．１，Ｎｏ．６，Ｐａｇｅｓ ３１７−３１９］。

【0007】

加えて、硫酸アンモニウムを含有し、ゲフィチニブがパッシブローディングされたペグ化ナノリポソームのリポソーム内水相中に含ませることによる、ローディングに関するＨＰＣＤの効果も報告された。Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ３２（７）：２９１９−２３ ２０１２）は、以下のようにしてリポソームを作製した（論文の方法セクションから転記）：「ＥＰＣまたはＨＳＰＣ、コレステロール、およびｍＰＥＧ−ＤＳＰＥの混合物（５５／４０／５ モル／モル）、ならびに脂質対薬物重量比 ２０：１でのゲフィチニブを、クロロホルム中に溶解し、続いて３５℃で蒸発させて、薄膜を形成した。得られた脂質膜を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．３Ｍ（ＮＨ４）_２ＳＯ_４溶液、または０．３Ｍ（ＮＨ４）_２ＳＯ_４プラス０．１Ｍ ＨＰβＣＤで再水和し、室温で３０分間インキュベートした」。

【発明の概要】

【0008】

本開示は、その態様の第一によると、脂質膜およびリポソーム内コンパートメントを含むリポソームを提供し、リポソーム内コンパートメントは、ムピロシン、少なくとも１つのシクロデキストリン化合物、およびｐＨ依存性イオン化可能アニオンを封入しており、前記リポソームは、その全身投与後に、治療効果を、前記効果を必要とする対象に対して提供する。

【0009】

ある実施形態では、リポソーム内コンパートメントは、対カチオン（前記ｐＨ依存性イオン化可能アニオンに対する対イオンであり、本明細書において以下でさらに定められる水との混和性が高い塩の一部である）も含む。

【0010】

ある例では、リポソームは、リポソームの全身投与後に対象に対して治療効果を提供するのに充分である量のムピロシン（例えば、脂質とのそのモル比によって定められる）および少なくとも１つのシクロデキストリン化合物（やはり、例えば、脂質とのそのモル比によって定められる）を有する。

【0011】

本明細書で開示されるリポソームは、安定なリポソームである。ある例では、安定性は、生理学的に許容される媒体中に４℃の保存下で保持された場合、少なくとも１ヶ月間にわたる保存後に媒体へ放出されるムピロシンが２０％以下であることとして決定することができる。

【0012】

本開示はまた、脂質膜およびリポソーム内コンパートメントを含み、リポソーム内コンパートメントは、ムピロシン、少なくとも１つのシクロデキストリン化合物、およびｐＨ依存性イオン化可能アニオンを封入しており、前記ムピロシンを用いた対象の全身治療のための方法に用いるためのリポソームも提供する。

【0013】

本開示はまた、全身投与に適する生理学的に許容されるキャリア、およびキャリア内のリポソームを含む医薬組成物も提供し、リポソームは、脂質膜およびリポソーム内コンパートメントを含み、前記リポソーム内コンパートメントは、ムピロシン、少なくとも１つのシクロデキストリン化合物、およびｐＨ依存性イオン化可能アニオンを含む。

【0014】

なおさらに、本開示によって、ムピロシンを用いて対象（例：感染症を有する対象）を治療する方法も提供され、この方法は、脂質膜およびリポソーム内コンパートメントを含むリポソームの全身投与を含み、前記リポソーム内コンパートメントは、ムピロシン、少なくとも１つのシクロデキストリン化合物、およびｐＨ依存性イオン化可能アニオンを封入している。

【図面の簡単な説明】

【0015】

本明細書で開示される主題をより良く理解するために、およびそれを実際に実施することができる方法を例示するために、添付の図面を参照し、単なる限定されない例として、ここで例を記載する。

【0016】

【図1】図１は、酢酸カルシウムリポソーム中へのムピロシンのローディング（最終薬物対脂質（Ｄ／Ｌ）モル比）を、初期Ｄ／Ｌモル比およびインキュベーション溶液内容の関数として示す図である（平均±ＳＥ、ｎ＝２）。

【図2】図２は、ＨＰＣＤを含有する酢酸カルシウムリポソーム（ＣＡ−ＨＰＣＤ−ｌｉｐ）中へのムピロシンのローディングを、初期Ｄ／Ｌモル比およびインキュベーション溶液組成の関数として示す図である（平均±ＳＥ、ｎ＝２）。

【図3】図３Ａ〜３Ｂは、ＨＰＣＤ−リポソーム、酢酸カルシウム−リポソーム「ＣＡ−ｌｉｐ」、もしくはＨＰＣＤ＋酢酸カルシウムリポソーム「ＨＰＣＤ−ＣＡ−ｌｉｐ」（図３Ａ）、または酢酸カルシウム−リポソーム「ＣＡ−ｌｉｐ」、ＨＰＣＤ＋酢酸カルシウムリポソーム「ＨＰＣＤ−ＣＡ−ｌｉｐ」、酢酸ナトリウム−リポソーム「ＳＡ−ｌｉｐ」、もしくはＨＰＣＤ＋酢酸ナトリウムリポソーム「ＨＰＣＤ−ＳＡ−ｌｉｐ」（図３Ｂ）の異なるリポソーム内水相を有するリポソームへのリン酸緩衝液からのムピロシンローディングを、用いた初期Ｄ／Ｌモル比の関数として示す図である（平均±ＳＥ、ｎ＝２）。

【図4】図４は、異なるリポソーム（ＨＰＣＤ−リポソーム、酢酸カルシウム−リポソーム「ＣＡ−ｌｉｐ」、もしくはＨＰＣＤ＋酢酸カルシウムリポソーム「ＣＡ−ＨＰＣＤ−ｌｉｐ」）の３７℃での１時間のインキュベーション後にリポソーム中に保持されたムピロシン％を示す図である。

【図5】図５は、酢酸カルシウム−ＨＰＣＤリポソーム（「ＣＡ−ＨＰＣＤ−ｌｉｐ」）からの、生理食塩水および血清中における経時でのリポソームムピロシンの保持％を示す図であり、各時間点は、方法セクションで述べるように、セファロースカラムで回収した２３の画分によって得られたリポソーム面積比を表す（Ｐ＝０．０４、ＡＮＯＶＡ：繰り返しのなし二元配置によって算出）。

【図6】図６Ａ〜６Ｄは、ムピロシンを含有する酢酸カルシウムリポソームおよび酢酸カルシウム−ＨＰＣＤリポソーム（それぞれ、図６Ａおよび６Ｂ）を、薬物を含有しないこれらのリポソーム（それぞれ、図６Ｃおよび６Ｄ）に対して示すクライオＴＥＭ画像である。

【図7】図７Ａ〜７Ｂは、リン酸緩衝液中の薬物溶液の酢酸カルシウムとの１：１混合物（図７Ａ）、および薬物溶液の１５％ＨＰＣＤ含有酢酸カルシウムとの１：１混合物（図７Ｂ）のサーモグラムである。

【図8】図８Ａ〜８Ｂは、酢酸カルシウム−リポソーム（図８Ａ）、および酢酸カルシウム−ＨＰＣＤ−リポソーム（図８Ｂ）のサーモグラムである。

【図9】図９Ａ〜９Ｂは、ムピロシンがローディングされた酢酸カルシウム−リポソーム（図９Ａ）、およびムピロシンがローディングされた酢酸カルシウム−ＨＰＣＤ−リポソーム（図９Ｂ）のサーモグラムである。

【図10】図１０は、細菌暴露後の処理グループ全体にわたる経時でのマウス体重を示す図である。

【図11】図１１Ａ〜１１Ｄは、細菌暴露の４８時間後の未処理マウス（図１１Ａ〜１１Ｂ）、およびリポソームムピロシン処理マウス（図１１Ｃおよび１１Ｄ）の外観を示す画像である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本発明によって解決されることになる問題は、ムピロシン、（９−［（Ｅ）−４−［（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−５−［［（２Ｓ，３Ｓ）−３−［（２Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシブタン−２−イル］オキシラン−２−イル］メチル］オキサン−２−イル］−３−メチルブタ−２−エノイル］オキシノナン酸）の全身送達に関し、これは、以下の化学式を有し：

【0018】

【0019】

血流中で急速に分解し、血漿中タンパク質に対して高い結合を示すことが知られており、従って、その使用は、局所投与のみに制限され、限定される。

【0020】

ムピロシンは、生体外において、いずれも疾病管理予防センター（ＣＤＣ）によって重大な脅威であると見なされているメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）および肺炎レンサ球菌を含むグラム陽性細菌に対して活性である。感受性を持つグラム陰性細菌の中でも、ムピロシンは、ＣＤＣによって切迫した脅威であると見なされている淋菌（０．０５μｇ／ｍｌのＭＩＣ）に対して活性である。ムピロシンの作用モードは、他の入手可能である抗生物質の作用モード（イソロイシンｔＲＮＡシンターゼの阻害）とは異なり、従って、他の抗生物質との交差耐性は考えられず、このことが、この薬物を全身送達用として特に興味深いものとしている。

【0021】

従って、この薬物の全身投与が臨床的に許容される製剤が求められている。この目的のために、本明細書で開示されるように、ムピロシンのリポソーム製剤が開発された。

【0022】

全身送達のためのリポソームをベースとする臨床的に使用可能である製剤を得るためには、多くの必須条件が存在する。第一は、充分なレベルの薬物ローディングを達成することであり；第二は、血中を循環する間、リポソーム中に薬物を維持することであり；第三は、所望される治療効果をもたらすのに充分である速度およびレベルで、標的部位において薬物を放出することであり；第四は、そのようにして、保存安定性という意味で薬理学的に許容される製品を得ることである。

【0023】

ムピロシンのリポソーム製剤（ナノムピロシン）は、リポソーム内水相中への封入によって血液循環中での分解からそれが保護されることになり、細菌感染組織における高い透過性および保持（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）（ＥＰＲ）効果を利用して感染組織への受動的標的化を可能とすることから、その全身投与による適用を可能とし得るものである［Ａｚｚｏｐａｒｄｉ，Ｅ．ａ，Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｅ．Ｌ．＆Ｔｈｏｍａｓ，Ｄ．Ｗ．Ｔｈｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ：ａ ｎｅｗ ｐａｒａｄｉｇｍ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．６８，２５７−７４（２０１３）］。しかし、そのような製剤を有効とするためには、感染部位での蓄積に加えて、リポソームは、疾患部位でのムピロシンの制御されたゆっくりした放出を示すべきである。

【0024】

ムピロシンは、水性媒体中にほんの僅かに可溶性でしかなく、その溶解度は、ｐＨに依存することから、ムピロシンに関するさらなる課題は、その溶解度に関する。以下の例で示されるように、ｐＨ６．３のリン酸緩衝液中では、ムピロシンは、約２８ｍＭの溶解度を有しており、この濃度は、激しい撹拌および超音波処理の後にようやく達成された。従って、様々な可溶化剤を用いた薬物溶解度を上昇させる試みが行われてきた。その結果から、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４００、プロピレングリコール（ＰＧ）、およびシクロデキストリンヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰＣＤ）を可溶化剤として用いた場合に、溶解度が上昇したことが示された。

【0025】

しかし、予想外なことに、これらの可溶化剤を、リポソームへのムピロシンローディング（リモートローディングによる）に用いられるインキュベーション溶液中に組み込むことを試みた場合、得られたリポソーム製剤は、血清中において非常に速い薬物放出を示し、このことにより、臨床使用に適するものではなかった。

【0026】

加えて、薬物のリポソームへのローディングは、薬物がｐＨ６．３のリン酸緩衝液からローディングされたか、または可溶化剤としてＰＥＧ４００を含有した場合、逆Ｕ字形の挙動を有していた。ＰＧ溶液およびＨＰＣＤ溶液からのローディングパターンは、逆Ｕ字形ではなかった。しかし、ＨＰＣＤ溶液からのローディングは、ＨＰＣＤ濃度に依存していた。ＨＰＣＤ（１％）は、僅かに高いローディング率だが、類似の逆Ｕ字形ローディング曲線を示した。より高いＨＰＣＤ濃度（２．５％〜１０％）では、初期比の上昇と共に、ローディング率の一定の上昇が示され、逆Ｕ字形パターンの結果とはならなかった。しかし、ローディング率は、２．５％ＨＰＣＤの方が高く、ＨＰＣＤの濃度の上昇（５％および１０％）と共に低下しており；高いＨＰＣＤ濃度は、ローディングを妨害したものと思われる。得られたリポソーム製剤を、その放出プロファイルについて試験したところ、これらの製剤が、血清の存在下において非常に速い放出を示したことが見出され、これは、臨床的使用には適さないであろう。

【0027】

しかしながら、本発明者らは、すべての必須条件、すなわち、高い薬物／脂質比を有するリポソーム、長い血中循環時間、ローディングリポソームからの薬物のゆっくりした放出、長い保存期間、ならびにもっとも重要であることには、より優れた治療効果を示し、全身的臨床使用に適する製剤という条件を満足するリポソーム製剤の開発に成功した。

【0028】

具体的には、本発明者らの開発に基づいて、本開示は、ムピロシン、少なくとも１つのシクロデキストリン化合物、およびｐＨ依存性イオン化可能アニオンを封入しているリポソーム内コンパートメントを含むリポソームを提供する。本明細書で示されるように、リポソーム中のムピロシンおよび少なくとも１つのシクロデキストリン化合物の量は、対象へのリポソームの全身投与後に治療効果を提供するのに充分である。

【0029】

ムピロシンを封入するリポソームは、いかなる形状またはサイズであってもよい。

【0030】

ある例では、リポソームは、マルチラメラ状またはオリゴラメラ状のベシクルである。

【0031】

ある例では、リポソームは、マルチベシクル状のベシクル（ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ）である。

【0032】

ある他の例では、リポソームは、ユニラメラ状のベシクルである。

【0033】

リポソームは、小、中、大、または巨大であってもよい。小リポソームと称する場合、それは、約２０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲の平均サイズを有するとして理解されるべきであり；中サイズリポソームと称する場合、それは、約１００ｎｍ〜２００ｎｍの範囲の平均サイズを有するとして理解されるべきであり；大リポソームと称する場合、それは、約２００ｎｍ超の平均サイズを有するとして理解されるべきであり；巨大リポソームと称する場合（典型的には、巨大ユニラメラ状またはマルチベシクル状ベシクル）、それは、１μｍよりも大きいリポソームを意味するとして理解されるべきである。

【0034】

ある例では、リポソームは、小ユニラメラ状ベシクル（ＳＵＶ）である。ある例では、ＳＵＶは、２０ｎｍから１００ｎｍ：場合によっては、２０ｎｍから１００ｎｍ、さらに場合によっては、４０ｎｍから１００ｎｍまたは５０から１００ｎｍのサイズ分布を有する。

【0035】

ある例では、リポソームは、６０から９０ｎｍ；場合によっては、７０ｎｍから８０ｎｍ；および場合によっては、約７７±５．０ｎｍの平均サイズを有する。

【0036】

これらのリポソームは、安定であることが見出された。実際、生理学的に許容される媒体中の場合、ムピロシンを封入しているリポソームは、４℃の保存条件下にて、非常に安定であることが見出されている。

【0037】

本明細書で開示される状況において安定性と称する場合、少なくとも１ヶ月間にわたる保存（４℃）の後、初期ローディング薬物と比較して、保存媒体中へのムピロシンの放出が、２０％以下、場合によっては、１０％以下であることとして理解されるべきである。ある例では、リポソームの安定性は、少なくとも３か月間のにわたる４℃での保存後に、保存中における周囲媒体へのムピロシンの放出が、１０％以下であることを特徴とする。ある例では、リポソームの安定性は、少なくとも４か月間、５か月間、６か月間、７か月間、８ヶ月間、９か月間、１２ヶ月間、およびさらには２４か月間にわたる４℃での保存後に、周囲媒体へのムピロシンの放出が、１０％以下であることを特徴とする。

【0038】

安定性は、保存条件下（４℃、緩衝液中）における化学的および物理的安定性の一方または両方によって特定される。

【0039】

この状況において、化学的安定性は、とりわけ、以下のパラメータの１つ以上によって評価されてよい：
ａ）分散体ｐＨの測定（ｐＨメーター）
ｂ）リン脂質（ＰＬ）アシルエステル加水分解、ＰＬ加水分解時に放出される非エステル化（遊離）脂肪酸（ＮＥＦＡ）の変化の特定による［Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ ｅｔ．ａｌ．Ｆｒｏｍ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，２^ｎｄ Ｅｄｎ．，ＲＲＣ Ｎｅｗ ｅｄ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｏｘｆｏｒｄ，１９９７］または薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）による［Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ，Ｙ．ａｎｄ Ａｍｓａｌｅｍ，Ｓ．Ｉｎ：Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２^ｎｄ Ｅｄｎ．，Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ（Ｅｄ．）ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｖｏｌ．１，ｐｐ：５２７−６１６］

【0040】

脂質集合体の物理的安定性は、とりわけ、以下のパラメータの１つ以上によって評価されてよい：
ａ）動的光散乱法（ＤＬＳ）による集合体のサイズ分布
ｂ）遊離（非会合／凝集）成分のレベル
ｃ）ゼータ電位

【0041】

リポソームは、理論的には、少なくとも１つのリポソーム形成脂質を用いて作製される。本発明の状況において、「リポソーム形成脂質」の用語は、主として、グリセロリン脂質またはスフィンゴミエリンを意味し、これらは、以下でさらに考察されるように、リポソームなどであるがこれに限定されないベシクルを水中で形成する。

【0042】

リポソームは、この場合、とりわけ、リポソーム形成脂質に対する各成分の比率によって特徴付けられる。そのような成分には、薬物、すなわち、ムピロシン、少なくとも１つのＣＤ、ならびにｐＨ依存性イオン化可能アニオンおよびそれに対する対イオン（例：酢酸カルシウムまたはナトリウム）が含まれる。

【0043】

ＣＤ化合物は、（α−１，４）−結合したα−Ｄ−グルコピラノース単位から成る環状オリゴサッカリドとして認識され、親油性の中央キャビティおよび親水性の外側面を含有する。本開示の状況において、ＣＤは、天然のＣＤ、さらには天然ＣＤの誘導体であってよい。天然ＣＤとしては、それぞれ６、７、および８個のグルコピラノース単位から成るα−、β−、またはγ−シクロデキストリン（αＣＤ、βＣＤ、またはγＣＤ）が挙げられる。天然ＣＤの誘導体と称される場合、それは、親油性の中央キャビティおよび親水性の外側面を有する（α−１，４）−結合したα−Ｄ−グルコピラノース単位から成るいずれかの環状オリゴサッカリドとして理解されるべきである。

【0044】

ある例では、ＣＤは、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰβＣＤ）である。

【0045】

ある例では、ＣＤは、２−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン（ＨＰγＣＤ）である。

【0046】

ある例では、ＣＤは、ソルホブチルエーテル（Ｓｏｌｆｏｂｕｔｙｌ ｅｔｈｅｒ）（ＳＢＥ）シクロデキストリンである。

【0047】

１つの好ましい例では、ＣＤは、ＨＰβＣＤである。ある例では、ＨＰβＣＤは、追加のＣＤまたはプロピレングリコールなどの共溶媒を例とする少なくとも１つの可溶化剤と組み合わされる

【0048】

本明細書で開示されるリポソームは、血清の存在下の場合であってもリポソーム内でムピロシンを安定とするのに充分な量のＣＤを含む。理論に束縛されるものではないが、ＨＰＣＤは、恐らくは複合体化により、リポソームからの薬物の漏出に影響を与える方法でムピロシンと相互作用を起こすものと考えられる。このことは、本明細書で提示されるＤＳＣイメージから結論付けることができ（図９Ａおよび９Ｂ）、そこでは、ＨＰＣＤを含有するリポソームが、非脂質成分に対する融点において、ＨＰＣＤの非存在下での対応する融点の７８．４４７と比較して、８１．３０７というシフトを示している（脂質は約５０℃の融点を有する）。加えて、本明細書で提示されるクライオＴＥＭ画像は、ＨＰＣＤおよび対イオンとしてのカルシウムと共にムピロシンを封入するリポソームが、その内部に観察可能な薬物結晶を有していなかったことを示している。これは、ムピロシンの限界溶解度を超える非常に高いムピロシンのリポソーム内濃度にも関わらずである。２００ｍＭ、ｐＨ５．５の酢酸カルシウム中におけるムピロシンの溶解度は、２ｍｇ／ｍｌ未満であることが見出された。その媒体中において、ＨＰＣＤ（１５％）は、その溶解度を１０倍以下まで増加させる。しかし、ムピロシンのリポソーム内濃度は、８８〜１０８ｍｇ／ｍｌの範囲内であることが見出された。

【0049】

ムピロシンのリポソーム内濃度は、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）によって測定されたリポソーム内Ｃａイオンレベルから特定されるリポソーム内水性体積を特定することによって算出した（Ａ．Ｍｏｎｔａｓｅｒ ａｎｄ Ｄ．Ｗ．Ｇｏｌｉｇｈｔｌｙ，ｅｄｓ．（１９９２）．Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｐｌａｓｍａｓ ｉｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ａｔｏｍｉｃ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，）。脂質濃度４０ｍＭの場合のリポソーム内カルシウム濃度は、２９６ｍｇ／Ｌであることが見出され、リポソーム作製に用いた溶液中のカルシウム濃度は、５８１２ｍｇ／Ｌであった。これら２つの値の割り算を行うと、製剤中のリポソーム内体積分率（５．０９％）となり、脂質１μｍｏｌあたり１．２７μｌに相当する（封入された体積を特定するための方法は、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ．ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｒ．Ｒ．Ｃ．Ｎｅｗ．Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ（Ｂｏｏｋ ５８），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９０を参照されたい）。

【0050】

以下で詳細に述べるように、ムピロシンに対する対イオンをリポソーム内に含めることによって、リポソームの安定性が高まり、リポソームの血液中循環時間が長くなることが見出された。具体的には、ムピロシン、およびＣＤに加えて酢酸カルシウム（ＣＡ−ＨＰＣＤ−ｌｉｐを得るために）も封入したリポソームが、ＣＤを含まないリポソーム、またはカルシウム対イオンを含まないリポソームと比較して、薬物漏出および放出速度に関して、生理食塩水および血清中で安定であったことが見出された。具体的には、酢酸カルシウム−ＨＰＣＤリポソームの血清中でのムピロシンの放出（１時間後に１７〜２２％）は、ＨＰＣＤ−リポソーム（酢酸カルシウム非含有）からの放出（１時間後に７３％）およびＨＰＣＤを含まない酢酸カルシウムリポソームからの放出（１時間以内に８２％放出）と比較して、非常に遅いことが見出された。これらの知見は、ＨＰＣＤ、および酢酸カルシウム勾配または酢酸ナトリウム勾配を例とする対イオン勾配の組み合わせを含有する媒体から作製したリポソームが、全身送達のために臨床的に適するリポソームの確立に不可欠であるという理解を支持するものである。

【0051】

「ｐＨ依存性イオン化可能アニオン」と称される場合、それは、適切なｐＨ条件下にて帯電するいずれかの塩に由来するアニオンとして理解されるべきである。従って、このアニオンは、実際、リポソーム中では非イオン化形態であってよいことは理解されるべきであり、それによって、イオン化形態である場合は、リポソーム中に保持され、非イオン形態である場合は、脂質膜を透過してリポソームのリポソーム内コアから漏出する。これは、内部ｐＨ、すなわち、リポソーム内コンパートメント内のｐＨに依存することになる。塩は、高い溶解度を有する塩であり（少なくとも２５０ｍＭ）、そのアニオンは、３．５よりも高いｐＫａ、および約−２．５から約１．５の範囲内、好ましくは、約−１．５から約１．０の範囲内であるｐＨ７でのｌｏｇＤを有するアニオンである。ある例では、ｐＨ依存性イオン化可能アニオンは、アセテート、ベンゾエート、ホルメートから成る群より選択される。ある例では、アニオンは、コリンなどの有機アニオンである。１つの特定の例では、アニオンは、アセテートである。

【0052】

塩のカチオンは、ムピロシンに対する対イオンとしてリポソーム内で作用する。両親媒性の弱酸であることから、適切な対カチオンは、有機ならびに無機カチオンであってよい。ある例では、対カチオンは、カルシウム、マグネシウム、およびナトリウムから成る群より選択される。ある例では、カチオンは、非常に低い透過係数、好ましくは、＜１０−^１１を有するｐＨ依存性イオン化可能アニオン、好ましくは、アセテートに対する対イオンである（通常、これが、リポソームへのムピロシンのリモートローディングのための推進力である）。

【0053】

その他のある例では、対カチオンは、カチオン性ポリマーを含む。カチオン性ポリマーの限定されない例としては、デキストランスペルミン、デキストランスペルミジン、アミノエチルデキストラン、トリメチルアンモニウムデキストラン、ジエチルアミノエチルデキストラン、ポリエチレンイミンデキストランなどが挙げられる。

【0054】

ある特定の例では、対カチオンは、カルシウムである。ある例では、カルシウムイオンは、ギ酸カルシウム、酢酸カルシウム、および安息香酸カルシウムのうちのいずれか１つから誘導される。

【0055】

その他のある例では、対カチオンは、ナトリウムであり、例えば、酢酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、および安息香酸ナトリウムから誘導される。

【0056】

ある例では、リポソームは、酢酸カルシウムまたは酢酸ナトリウムを含む。

【0057】

リポソームは、リポソーム製剤中の各成分の量によって特性決定することができる。リポソーム組成を表現するためのより許容される方法は、個々の成分とリポソーム形成脂質（リポソーム膜を形成する脂質）との間のモル比による方法である。モル比を特定するために、リポソーム製剤中の各成分の絶対量がまず特定され、これは、当業者に公知である従来の技術によって達成される。次に、この量がモルに換算され、（１もしくは複数の）リポソーム形成脂質のモルとのモル比が算出される。

【0058】

ある例では、少なくとも１つのＣＤの対脂質モル比は、０．０５〜２．５の間であり、場合によっては、０．１から２の間である。ある例では、少なくとも１つのＣＤと脂質との間のモル比は、０．１５±０．０３である。

【0059】

リポソームコンパートメント内の少なくとも１つのＣＤの濃度が定められて（以下の限定されない例で示されるように）、リポソームの特性決定に用いられてもよい。ある例では、リポソーム内水相中の少なくとも１つのＣＤの濃度は、少なくとも約１００ｍｇ／ｍｌ（７３ｍＭに相当する）であり；場合によっては、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ（９０ｍＭ）である。ある例では、少なくとも１つのＣＤの濃度は、最大で２００ｍｇ／ｍｌ（１４５ｍＭ）であり、場合によっては、最大で１７５ｍｇ／ｍｌ（２４１ｍＭ）である。さらなるある例では、少なくとも１つのＣＤの濃度は、１２０ｍｇ／ｍｌから１８０ｍｇ／ｍｌ（８７ｍＭ）の範囲である。

【0060】

ある例では、少なくとも１つのＣＤの濃度は、約１５０ｍｇ／ｍｌ±１０ｍｇ／ｍｌ（約１０９ｍＭ）である。

【0061】

ある例では、イオン（カチオンまたはアニオン）と脂質との間のモル比は、約０．１から約０．５の間であり、場合によっては、約０．２から０．４の間であり、さらに場合によっては、モル比は、約０．３±０．０５である。

【0062】

イオン、例えばカチオン（例えば、カルシウムおよびナトリウム）またはアニオン（例：アセテート）の濃度も、そのリポソーム内コンパートメント含有量の特性決定に用いられてよい。ある例では、イオン源（例：酢酸カルシウムからのカルシウムおよび酢酸ナトリウムからのナトリウム）の濃度は、少なくとも１００ｍＭであり、場合によっては、１５０ｍＭである。ある例では、イオン源（酢酸カルシウムおよび酢酸ナトリウムなど）の濃度は、最大で３００ｍＭであり、場合によっては、最大で２５０ｍＭ、または最大で２２５ｍＭである。

【0063】

ある例では、イオンの濃度は、約２００ｍＭである。

【0064】

この特定のケースではムピロシンである薬物自体に関しては、リポソームに封入されるその量は、それが臨床的に許容されるリポソーム製剤のための必須条件の１つであることから、特に重要である。薬物の封入を評価するために、薬物の対脂質比が特定され、初期比（封入前）と比較される。この目的のために、薬物がローディングされたリポソームは、一般的に、薬物のローディング後、封入されなかった薬物を除去するために精製される。続いて、リポソーム中の薬物の量および脂質の量が、従来の方法によって特定される。薬物および脂質の特定された量に基づいて、様々なパラメータ：脂質のグラムまたはモルあたりの薬物のグラムまたはモルである「薬物ローディング量」；および初期ローディング前の比の関数としての封入薬物のパーセントとして表される「封入効率」；および封入されなかった薬物の除去後における脂質のモルあたりの薬物のモルである「薬物対脂質モル比」が特定可能であり、リポソームの特性決定のために重要である。

【0065】

リポソーム中のムピロシンの量は、市販のクロマトグラフィ技術を用いて特定されてよい。ある例では、ムピロシンの濃度は、米国薬局方（ＵＳＰ）３５．ムピロシン公式モノグラフ；：３９６２−３］に基づく高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）／ＵＶ法を用いて特定される。ムピロシンのリポソーム内濃度を算出するためには、水性リポソーム内封入体積も必要であり、これは、リポソーム内カルシウム濃度から算出されてよい（既述のように）。製剤におけるムピロシンリポソーム濃度は、ＨＰＬＣ法によって特定される。この濃度をリポソーム内封入体積で除することによって、リポソーム内ムピロシン濃度が得られる（詳細は例を参照）。

【0066】

ある例では、薬物ローディング量は、２〜１０ｍｇ／ｍｌのリポソーム分散体の範囲である。ある例では、薬物ローディング量は、少なくとも２ｍｇ／ｍｌであり；場合によっては、少なくとも３ｍｇ／ｍｌ、場合によっては、少なくとも４ｍｇ／ｍｌ、場合によっては、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、場合によっては、少なくとも６ｍｇ／ｍｌ、場合によっては、少なくとも７ｍｇ／ｍｌ、場合によっては、少なくとも８ｍｇ／ｍｌである。ある例では、薬物ローディング量は、最大で１０ｍｇ／ｍｌ、場合によっては、最大で９ｍｇ／ｍｌ、場合によっては、最大で８ｍｇ／ｍｌ、場合によっては、最大で７ｍｇ／ｍｌ、場合によっては、最大で６ｍｇ／ｍｌである。

【0067】

ある例では、薬物対脂質モル比が特定される。

【0068】

ある例では、ムピロシン／脂質モル比は、０．１から１．０の間であり；場合によっては、少なくとも０．１、または少なくとも０．２、または少なくとも０．３、または少なくとも０．４、または少なくとも０．５、または少なくとも０．６、または少なくとも０．７、または少なくとも０．８、または少なくとも０．９、または少なくとも１．０である。ある例では、モル比は、最大で１．０、または最大で０．９、または最大で０．８、または最大で０．７、または最大で０．６、または最大で０．５、または最大で０．４、または最大で０．３である。

【0069】

ある例では、モル比は、０．２から０．４の間である。

【0070】

リポソーム形成脂質に関して、グリセロリン脂質と称される場合、それは、グリセロールバックボーンを有する脂質として理解されるべきであり、ここで、ヘッド基にあるヒドロキシル基のうちの少なくとも１つ、好ましくは２つが、アシル、アルキル、もしくはアルケニル鎖、ホスフェート基、または上記のいずれかの組み合わせ、および／またはその誘導体によって置換されており、ならびにヘッド基に化学反応性基（アミン、酸、エステル、アルデヒド、またはアルコールなど）が含有されていてよく、それによって、脂質に極性ヘッド基が備えられる。スフィンゴミエリンは、１位にホスホリルコリン部分が結合したセラミド単位から成り、従って、実際にはＮ−アシルスフィンゴシンである。スフィンゴミエリンのホスホコリン部分は、スフィンゴミエリンの極性ヘッド基を与える。

【0071】

リポソーム形成脂質において、アシル、アルキル、またはアルケニル鎖は、典型的には、１４から約２４炭素原子の長さであり、様々な飽和度を有して、完全、部分、もしくは非水素化の天然脂質、半合成、または完全合成脂質であり、飽和のレベルは、そうして形成されるリポソームの剛性に影響を与え得る（典型的には、飽和鎖の脂質は、不飽和鎖が存在し、特にシス二重結合を有する同じ鎖長の脂質よりも剛性である）。

【0072】

ある例では、リポソームは、単一種類、または組み合わされたリポソーム形成脂質を含む。

【0073】

ある例では、リポソーム形成脂質は、リン脂質である。リポソーム形成脂質がリン脂質である場合、リポソームにおけるその量は、改変バートレット法（ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｍｅｔｈｏｄ）［Ｓｈｍｅｅｄａ Ｈ，Ｅｖｅｎ−Ｃｈｅｎ Ｓ，Ｈｏｎｅｎ Ｒ，Ｃｏｈｅｎ Ｒ，Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ Ｃ，Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ Ｙ．２００３．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｎｏｎｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ３６７：２７２−９２］により、有機リンとして特定されてよい。

【0074】

ある例では、リポソーム形成脂質は、ジアシルグリセロ−ホスホコリンなどのコリン型リン脂質である（アシル、アルキル、またはアルケニル鎖は、上記で定める通りである）。

【0075】

その他のある例では、リポソーム形成脂質は、ジ−ラウロイル−ｓｎ−グリセロ−２ホスホコリン（ＤＬＰＣ）である。ある例では、リポソーム形成脂質は、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）である。ある例では、リポソーム形成脂質は、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）である。ある例では、リポソーム形成脂質は、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）である。ある例では、リポソーム形成脂質は、１，２−ジヘプタデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンである。ある例では、リポソーム形成脂質は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である。ある例では、リポソーム形成脂質は、１，２−ジノナデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンである。ある例では、リポソーム形成脂質は、１，２−ジアラキドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＢＰＣ）である。ある例では、リポソーム形成脂質は、１，２−ジヘンアラキドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１，２−ｄｉｈｅｎａｒａｃｈｉｄｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）である。ある例では、リポソーム形成脂質は、１，２−ジベヘノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン １，２−ジトリコサノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンである。ある例では、リポソーム形成脂質は、１，２−ジリグノセロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンである。ある例では、リポソーム形成脂質は、１−ミリストイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンである。ある例では、リポソーム形成脂質は、１−パルミトイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＳＰＣ）である。ある例では、リポソーム形成脂質は、１−ステアロイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＰＰＣ）である。ある例では、リポソーム形成脂質は、１，２−ジ−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）またはジ−ラウロイル−ｓｎ−グリセロ−２ホスホコリン（ＤＬＰＣ）である。

【0076】

ある例では、リポソーム形成脂質は、少なくとも水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）を含む。

【0077】

１つの好ましい実施形態では、リポソーム形成脂質は、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）を含むか、またはそれから成る。

【0078】

ある例では、リポソームは、コレステロールなどのステロールを含む。

【0079】

ある例では、リポソームは、リポポリマーを含む。リポポリマーは、７５０Ｄａまたはそれを超える分子量を有するポリマー部分（ＰＥＧ）でそのヘッド基が修飾された脂質を含む。ヘッド基は、極性または非極性であってよく、それに、長く（＞７５０Ｄａ）フレキシブルな親水性ポリマーが結合されている。親水性ポリマーヘッド基の脂質領域への結合は、共有結合または非共有結合であってよいが、好ましくは、共有結合の形成を介するものである（所望に応じてリンカーを介してよい）。

【0080】

リポポリマーに修飾される脂質は、中性、負に帯電、さらには正に帯電であっていが、すなわち、特定の（または無）帯電状態に対する制限はない。例えば、いずれも、Ｍｗ７５０、２０００、５０００、または１２０００のメトキシポリ（エチレングリコール）（ｍＰＥＧまたはＰＥＧ）と共有結合した中性のジステアロイルグリセロールおよび負に帯電したジステアロイルホスファチジルエタノールアミンである［Ｐｒｉｅｖ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ １８，６１２−６１７（２００２）；Ｇａｒｂｕｚｅｎｋｏ Ｏ．，Ｃｈｅｍ Ｐｈｙｓ Ｌｉｐｉｄｓ １３５，１１７−１２９（２００５）；Ｍ．Ｃ．Ｗｏｏｄｌｅ ａｎｄ ＤＤ Ｌａｓｉｃ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｈｙｓ．Ａｃｔａ，１１３，１７１−１９９．１９９２］。

【0081】

リポポリマーへと誘導体化される最も一般的に用いられ、市販されている脂質は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）をベースとする脂質であり、通常、ジステアリルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）である。本発明によって用いられるリポポリマーの具体的なファミリーとしては、メトキシＰＥＧ−ＤＳＰＥ（異なるＰＥＧ鎖長を有する）が挙げられ、この場合、ＰＥＧポリマーは、カルバメート結合を介してＤＳＰＥ一級アミノ基と結合している。ＰＥＧ部分は、好ましくは、約７５０Ｄａから約２０，０００Ｄａのヘッド基の分子量を有する。より好ましくは、分子量は、約７５０Ｄａから約１２，０００Ｄａであり、最も好ましくは、約１，０００Ｄａから約５，０００Ｄａの間である。本明細書で用いられる１つの具体的なＰＥＧ−ＤＳＰＥは、ＰＥＧが２０００Ｄａの分子量を有するものであり、本明細書において、^２０００ＰＥＧ−ＤＳＰＥまたは^２ｋＰＥＧ−ＤＳＰＥと称される（Ｍ．Ｃ．Ｗｏｏｄｌｅ ａｎｄ ＤＤ Ｌａｓｉｃ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｈｙｓ．Ａｃｔａ，１１３，１７１−１９９．１９９２）。

【0082】

本開示の状況における１つの特定の実施形態は、少なくとも水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（^２ｋＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、およびコレステロールを含むリポソームに関する。

【0083】

ある例では、リポソームの膜は、少なくともリポソーム形成脂質（１つであっても、そのような脂質の組み合わせであってもよい）、ステロール、およびリポポリマーを含む。これらの成分間のモル比は、様々であってよい。

【0084】

ある例では、リポソームの膜は、１モル％から１０モル％の間のリポポリマーを含む。場合によっては、リポソームの膜は、少なくとも１モル％のリポポリマー、場合によっては、少なくとも２モル％のリポポリマー、場合によっては、少なくとも３モル％のリポポリマー、場合によっては、少なくとも４モル％のリポポリマー、場合によっては、少なくとも５モル％のリポポリマー、場合によっては、少なくとも６モル％のリポポリマー、場合によっては、少なくとも７モル％のリポポリマー、場合によっては、少なくとも８モル％のリポポリマーを含む。場合によっては、リポソームの膜は、最大で８モル％のリポポリマー、場合によっては、最大で７モル％のリポポリマー；最大で６モル％のリポポリマー；最大で５モル％のリポポリマー；最大で４モル％のリポポリマー；最大で３モル％のリポポリマー；最大で２モル％のリポポリマーを含む。

【0085】

ある例では、リポソームの膜は、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、コレステロール、およびｍＰＥＧ−ＤＳＰＥを含む。成分のこの組み合わせを用いる場合の１つの特定のモル比は、約５５：４０：５のＨＳＰＣ：コレステロール：ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥである水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、コレステロール、およびｍＰＥＧ−ＤＳＰＥのモル比を含む。

【0086】

そのリポソーム内コンパートメントにムピロシン、少なくとも１つのシクロデキストリン化合物、およびｐＨ依存性イオン化可能アニオンを含むリポソームは、少なくとも１つのＣＤおよびアニオンを封入するリポソームのリポソーム内水相中にムピロシンをリモートローディングすることによって作製される。このようなリポソームは、本明細書にて、リポソームの「第一集団」と称される。

【0087】

具体的には、リポソームの第一集団が作製され、これらは、少なくとも１つのＣＤおよびｐＨ依存性イオン化可能アニオンを含んでいた。一般的に、ｐＨ依存性イオン化可能アニオンは、その対を成す対カチオンと共に提供されることから、対を成すカチオンも存在する。例えば、アニオンがアセテートである場合、当業者であれば、酢酸カルシウムまたはナトリウムの対の一部であるカルシウムまたはナトリウムも存在し得ることは理解される。ある例では、リポソームの第一集団は、少なくともｐＨ依存性イオン化可能アニオンおよび少なくとも１つのＣＤを含む緩衝溶液を用いたリモートローディングによって作製された（膜貫通アセテート勾配）。

【0088】

本発明者らは、驚くべきことに、リポソーム内水相中にＨＰＣＤを添加することで、血清中でのムピロシンの漏出が遅延されることを見出した。ＨＰＣＤが存在しない場合、血清の存在下でインキュベートされると、薬物漏出は非常に速く、実際、薬物のほとんどが血清中に漏出した。理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、ＣＤがムピロシンと相互作用を起こして、リポソーム中の後者を安定化するものと考えている。

【0089】

あるより具体的な例では、リポソームの第一集団を作製する方法は、リポソーム形成脂質、コレステロール、リポポリマー、および所望される量の少なくとも１つのＣＤを例とする（脂質およびＣＤをまとめて混合物と称する）脂質膜中に含まれるべき脂質を、所望される高い混和性の塩（ｐＨ依存性イオン化可能アニオンおよびそれに対する対イオンを含む）を含有する緩衝溶液と共に撹拌（好ましくは、周囲温度より高いが１００℃よりも低い温度にて）することによる再水和を含み、それによって、リポソームが形成される。次に、必要または所望される場合、リポソームはサイズダウンされる。サイズダウンは、押出しおよび／または当業者に公知のその他のいずれの手段によって行われてもよい。

【0090】

ある例では、再水和に用いられる緩衝液中のＣＤの重量比は、少なくとも１％、場合によっては、少なくとも５％、場合によっては、少なくとも１０％、場合によっては、少なくとも１５％、場合によっては、少なくとも２０％、場合によっては、少なくとも２５％、場合によっては、少なくとも３０％、場合によっては、少なくとも３５％、場合によっては、少なくとも４０％、および場合によっては、その溶解度の限界まで、すなわち、少なくとも４５％である（最大ＣＤ溶解度）。

【0091】

ある例では、緩衝溶液による再水和の前の混合物中におけるＣＤの重量比は、最大で４５％、場合によっては、最大で４０％、最大で３５％、最大で３０％、最大で２５％、最大で２０％、最大で１５％、最大で１０％、最大で５％である。

【0092】

ある例では、リポソームの第一集団は、次に、リポソーム二重層は透過せず、血液との等浸透圧に近い一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）非電解質緩衝溶液に対して透析される。非電解質溶液の例としては、糖の溶液が挙げられ、限定されないが、デキストロース、グルコース、スクロースなどである。ある特定の例では、透析は、スクロース溶液に対して行われる。ある例では、透析は、１０％±１のスクロースを含む溶液に対して行われる。

【0093】

こうして形成されたリポソームの第一集団は、次に、ムピロシンでローディングされる。

【0094】

ある例では、リポソームの第一集団へのムピロシンのローディングは、リモートローディングを含む。ある例では、リモートローディングは、第一集団を、ムピロシンを含む緩衝溶液とインキュベートすることによって行われる。ある例では、ローディングのためのムピロシンを保持する緩衝溶液は、リン酸緩衝液である。

【0095】

ムピロシンのローディングは、いずれのリポソーム（リポソームの第一集団を形成するリポソーム分散体中）対ムピロシン比でムピロシンを含む溶液を用いて行われてもよい。ある例では、ローディングに用いられるリポソーム対ムピロシン比は、約１：０．５から１：２．０の間の体積比で定められる。ある例では、リポソームとムピロシン溶液との間の体積比は、約１：１である。

【0096】

ある例では、ムピロシン含有緩衝溶液は、少なくとも１つのＣＤも含む。ある例によると、緩衝溶液は、１％から１５％の間の少なくとも１つのＣＤを含む。

【0097】

ある例では、緩衝溶液は、２％から５％の間の少なくとも１つのＣＤを含む。

【0098】

ある例では、ムピロシンをローディングするための緩衝溶液は、その他の賦形剤を含んでよい。例えば、緩衝溶液は、少なくとも１つのＣＤに加えて、ＰＧおよび／またはＰＥＧなどの１つ以上の可溶化剤を含んでよい。

【0099】

こうして形成されたリポソームの第二集団は、ある例によると、リポソーム内水性コア中に封入されてムピロシン、少なくともＣＤ、ならびに上記および下記で考察されるｐＨ依存性イオン化可能アニオンを含むＳＵＶである。

【0100】

限定されない例で示されるように、ＣＡ−ＨＰＣＤリポソームへのローディングは、酢酸カルシウムリポソームなどのその他の種類のリポソームへのローディングよりも高かった。さらに、ＣＡ−ＨＰＣＤリポソームを用いた場合、ＰＥＧ４００などのその他の可溶化剤と共にリン酸緩衝液からローディングした場合に得られる逆Ｕ字型パターンは消滅した。ローディングがＨＰＣＤのみによって推進されたものではないことを調べるために、酢酸カルシウム勾配を含まないコントロールＨＰＣＤリポソームが作製された。このようなリポソームへのローディングは、非常により低く、到達した最大ローディング後Ｄ／Ｌ値は０．１であった。

【0101】

さらに、本明細書で提示される限定されない例から、本明細書で開示されるリポソーム（例でのＣＡ−ＨＰＣＤリポソーム）が、血清中において、その他のリポソーム製剤よりも非常にゆっくりとムピロシンを放出したことが示される（１時間後に１７〜２２％）。理論に束縛されるものではないが、リポソーム内部にあるＨＰＣＤによって達成された包接複合体中でのムピロシンの保護によって、放出が阻害されたものと考えられる。限定されない例によってさらに示されるように、コントロール−ＨＰＣＤリポソームからの放出は、酢酸カルシウム−ＨＰＣＤリポソームからよりも速かった（血清中１時間後に７３％）。ＨＰＣＤを含まない酢酸カルシウムリポソームからの放出は、僅かにより高く（１時間以内に８２％放出）、このことは、ＨＰＣＤおよび酢酸カルシウム勾配の組み合わせが、この目的のために重要であることを示している。

【0102】

本開示はまた、全身投与に適する生理学的に許容されるキャリア、および上記で定める通りであるリポソームを含む医薬組成物も提供する。

【0103】

本発明の状況において、生理学的に許容されるキャリアとは、一般的に安全で無毒性であり、生物学的にも、またはそれ以外でも望ましくないものではない医薬組成物を作製するのに有用であるいかなるキャリアをも意味する。ある例では、生理学的に許容されるキャリアは、全身投与に適する水溶液である。ある例では、全身（または非経口）投与に適する生理学的に許容されるキャリアとしては、水性および非水性等張滅菌注射／注入溶液が挙げられ、これは、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および意図するレシピエントの血液に対して製剤を等張性とする溶質を含有してよい。ある例では、キャリアは、生理食塩水、緩衝溶液、糖水溶液（デキストロース、スクロースなど）などのいずれか１つまたは組み合わせである。ある例では、キャリアはまた、増粘剤、安定剤、および保存剤も含んでよい。

【0104】

ある例では、生理学的に許容されるキャリアは、緩衝剤を含む。さらなるある例では、緩衝剤は、リン酸緩衝剤を含むか、またはリン酸緩衝剤である。

【0105】

ある例では、生理学的に許容されるキャリアは、糖を含む。ある例では、糖は、デキストロース、グルコース、およびスクロースから成る群より選択される。

【0106】

糖の量は、例えば組成物の希釈に応じて、様々であってよい。しかし、ある例では、糖の量は、リポソーム形成脂質とのそのモル比に基づいて決定／画定される。ある例では、糖の対脂質比は、約３から６の間であり、場合によっては、約３．５から５の間である。ある例では、モル比は、約４±０．５である。

【0107】

ある例では、糖は、スクロースであり、スクロースの対脂質比は、４±０．５である。

【0108】

リポソーム中のムピロシンおよび少なくとも１つのシクロデキストリン化合物の量は、ムピロシンの全身投与後に対象に対して治療効果を提供するのに充分であるように設計される。

【0109】

全身投与後に治療効果を達成するのに充分または有効である量は、ムピロシンによって達成されること、またはムピロシンに関連していることが既知である少なくとも１つの治療効果を含むものとして理解されるべきである。理論に束縛されるものではないが、治療効果は、感染の低減または除去における効果であってよい。ある例では、治療効果は、治療される対象における微生物（細菌、真菌）負荷の低減に関連していてよい。ある例では、治療効果は、グラム陽性細菌によって引き起こされる感染に関連する感染もしくは症状の低減または除去における効果であってよい。ある例では、治療効果は、ブドウ球菌属および／またはレンサ球菌属、例えば黄色ブドウ球菌に対する効果である。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、肺炎レンサ球菌、髄膜炎菌、淋菌、インフルエンザ桿菌を含む。

【0110】

ある例では、感染は、原虫によって引き起こされる。ある実施形態では、原虫は、熱帯熱マラリア原虫である。

【0111】

医薬組成物によって送達されるべきムピロシンの量は、当業者に公知ように、様々なパラメータに依存し、適切に設計された臨床試験（用量範囲試験）に基づいて決定することができ、当業者にとって、有効量を決定するためにそのような試験を適切に行う方法は公知である。量は、とりわけ、治療されるべき疾患の種類および重篤度、ならびに治療レジメン（全身投与のモード）、治療される対象の性別および／または年齢および／または体重などに依存する。

【0112】

ある例では、医薬組成物は、注射または注入による投与に適するキャリアを含むように調合される。ある例では、投与は、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、および皮下（ｓ．ｃ．）注射のうちのいずれか１つによる。

【0113】

本開示はまた、対象のムピロシンによる治療を実行するための方法も提供し、この方法は、本明細書で開示されるリポソームの全身投与を含む。本態様によると、微生物感染を有する対象を治療する方法も本開示によって提供され、本明細書で開示されるリポソームの対象への全身投与を含む。

【0114】

投与は、全身薬物送達において許容されるいずれのレジメンによって行われてもよい。ある例では、投与は、注射による。

【0115】

本明細書で開示されるリポソームの注射は、本明細書で最初に開示されるように、生体内での細菌負荷の低減に有効であることが見出された。具体的には、壊死性筋膜炎モデルのマウスに、Ａ群レンサ球菌（ＧＡＳ）を皮下注射した。細菌暴露の２４時間後、処理を受けなかったマウスは、被毛粗剛、体重減少、および創傷発生を含む疾患の徴候を示し、２匹のケースでは、移動困難および閉眼も示した。細菌暴露の４８時間後、未処理グループのマウスのうち２匹が死亡した。遊離ムピロシンを受けたグループのマウスは（コントロール）、死亡はしなかったが、疾患症状は発症した。しかし、リポソームムピロシングループのマウスは、疾患を発症しなかった。リポソームムピロシンは、細菌暴露の３時間前にリポソームムピロシンの単一用量を受けた予防グループにおいても有効であった。本明細書において詳述する研究は、非経口／全身経路によって投与された場合のリポソームムピロシンの有効性を示しており、それは、より低いまたは等しい用量において、遊離ムピロシンによる治療よりも優れていた。予防用量の活性に基づいて評価することができるムピロシンの排出は、文献データから知られている遊離ムピロシンの排出半減期（２０〜４０分間）と比較して遅かった。

【0116】

上記を考慮すると、本開示の状況において、本明細書で開示されるリポソームによる治療と称される場合、それは、疾患に伴う望ましくない症状の寛解、そのような症状の発現のそれが生ずる前の予防、疾患の進行の遅延、症状の悪化の遅延、疾患の鎮静期間開始の促進、疾患の進行性の慢性ステージにおいて引き起こされる不可逆的損傷の遅延、進行ステージ開始の遅延、疾患の重篤度の軽減または治癒、生存率の改善もしくは疾患からのより迅速な回復、疾患発症の予防、または上記の２つ以上の組み合わせを包含するとして理解されるべきである。

【0117】

本発明を、ここで、限定されない例によって記載する。

【実施例】

【0118】

限定されない実施形態および例の詳細な記述
例１−リポソームの作製および特性決定
物質
ムピロシン（テバ（Ｔｅｖａ））は、フォーミックス社（Ｆｏａｍｉｘ Ｌｔｄ）（イスラエル）から寄贈されたものである。
ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰＣＤ）およびＤｏｗｅｘ １×８−２００は、シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）から入手した。
水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ｍＰＥＧ ＤＳＰＥ）、およびコレステロールは、リポイド社（Ｌｉｐｏｉｄ ＧｍｂＨ）（ルートヴィヒスハーフェン、ドイツ）から入手した。
セファロース ＣＬ−４Ｂは、ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）から入手した。
成体ウシ血清は、バイオロジカルインダストリーズ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）（イスラエル）から入手した。
分析に用いた溶媒は、ＨＰＬＣグレードであった。
その他の化学薬品はすべて、試薬グレードの市販品であった。

【0119】

方法
リポソームムピロシンの作製
リポソームは、酢酸カルシウム（ＣＡ）勾配法を用いて作製した［Ｃｌｅｒｃ Ｓ，Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ Ｙ．１９９５．Ｌｏａｄｉｎｇ ｏｆ ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ ｗｅａｋ ａｃｉｄｓ ｉｎｔｏ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｃａｌｃｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２４０：２５７−２６５］。具体的には、５５：４０：５ ＨＳＰＣ：コレステロール：ｍＰＥＧ ＤＳＰＥのモル比の脂質を、２００ｍＭ、ｐＨ５．５の酢酸カルシウムと、６５℃、重量比１：９で撹拌することにより、機械的に水和した。リポソーム分散体を、ノーザンリピッズ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ）（バーナビー、ブリティッシュコロンビア州、カナダ）製押出機により、ポリカーボネートフィルターを用いて４００ｎｍポアサイズ膜を通しての３回の押出しから開始し、次に１００ｎｍポアサイズ膜を通しての３回の押出し、最後に５０ｎｍポアサイズ膜を通しての１０回の押出しによる段階的押出しによってサイズダウンした。次に、Ｃｅｌｌｕ Ｓｅｐ再生セルロース膜（メンブレンフィルトレーションプロダクツ（Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、米国）を用い、１０％スクロース溶液に対してリポソームを透析した。ＨＰＣＤ含有リポソームの場合、脂質を、１５％（重量／重量）ＨＰＣＤを含有する２００ｍＭ、ｐＨ５．５の酢酸カルシウムによって水和した。コントロールＨＰＣＤリポソームは、脂質を、２００ｍＭ、ｐＨ６．３のリン酸緩衝液中において、１５％（重量／重量）ＨＰＣＤと共に水和することによって作製した。その他の作製工程はすべて（サイズダウンおよび透析）、上述と同じであった。リモートローディングは、薬物溶液をリポソーム分散体と、１：１の体積比、６５℃で１０分間インキュベートすることによって行った。ローディングに用いたリポソームは、新たに作製したものであり、１週間以内に使用した。薬物ローディング溶液は、２００ｍＭ、ｐＨ６．３のリン酸緩衝液で作製した。ｐＨ６．３のリン酸緩衝液中の高ムピロシン濃度は（２８ｍＭ）、超音波洗浄器中での激しい撹拌および１０分間の超音波処理によって達成した。ローディングはまた、ｐＨ６．３のリン酸緩衝液中の１から１０％（重量／重量）ＨＰＣＤ溶液でも試験した。１％ ＨＰＣＤ溶液中での高ムピロシン濃度は（２８ｍＭ）、リン酸緩衝液において述べたように、激しい撹拌および超音波処理によって達成した。より高いＨＰＣＤ濃度（２．５〜１０％）のムピロシン溶液は、撹拌のみで作製した。ローディングはまた、プロピレングリコール（ＰＧ）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４００溶液からも行った。これらの場合、１００ｍＭ ムピロシンのストック溶液を作製し、２００ｍＭ、ｐＨ６．３のリン酸緩衝液で所望される濃度に希釈した。

【0120】

ローディング実験に用いたリポソーム分散体中のリン脂質の濃度は、２４〜６０ｍＭの範囲であった。

【0121】

リポソームの内部ｐＨは、リポソーム内体積と外部体積との間の安息香酸の分布によって測定され、酢酸カルシウムリポソームの内部ｐＨは、７．７であると算出される。これまでの経験に基づいて、薬物がローディングされた酢酸カルシウムリポソームの内部ｐＨは、７．０未満であるべきである。

【0122】

リポソームはまた、１５％（重量／重量）ＨＰＣＤと共に、およびＨＰＣＤなしでの酢酸ナトリウム勾配を用いることによっても作製した。具体的には、５５：４０：５ ＨＳＰＣ：コレステロール：ｍＰＥＧ ＤＳＰＥのモル比の脂質を、２００ｍＭ、ｐＨ５．５の酢酸ナトリウムと、６５℃、重量比１：９で撹拌することにより、機械的に水和した。リポソーム分散体を、上述のように段階的押出しによってサイズダウンし、次に透析した。ＨＰＣＤ含有リポソームの場合、脂質を、１５％（重量／重量）ＨＰＣＤを含有する２００ｍＭ、ｐＨ５．５の酢酸ナトリウムによって水和した。酢酸ナトリウムリポソームへのローディングは、既に述べたように、２００ｍＭ、ｐＨ６．３のリン酸緩衝液中のムピロシン溶液から行った。酢酸ナトリウムの場合、各カルシウムに対して２つのアセテートが存在する酢酸カルシウムと比較して、各ナトリウムに対して１つのアセテート部分しか存在しないことには留意されたい。アセテートは、ローディングの推進力であり、２００ｍＭ 酢酸カルシウムと比較して、２００ｍＭ 酢酸ナトリウム中のアセテート含有量が低いことにより、ローディング効率という点でこれら２つの方法を比較することは困難である。

【0123】

リン脂質の特定
ブランクリポソーム中のリン脂質濃度を、改変バートレット法［Ｓｈｍｅｅｄａ Ｈ，Ｅｖｅｎ−Ｃｈｅｎ Ｓ，Ｈｏｎｅｎ Ｒ，Ｃｏｈｅｎ Ｒ，Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ Ｃ，Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ Ｙ．２００３．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｎｏｎｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ３６７：２７２−９２］により、有機リンとして特定した。コントロールＨＰＣＤリポソーム（リン酸緩衝液含有）を、リポイド社から入手した脂質ブレンドのアッセイのための手順に基づいたＨＰＬＣ法により、そのリン脂質含有量について試験した。それは、ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ １００ Ｄｉｏｌ ５μｍ、２５０ｍｍ×４．０ｍｍカラム、ヘキサン：２−プロパノール：水による勾配溶出、およびＡｌｌｔｅｃｈ ３３００ ＥＬＳＤ検出器による蒸発光散乱検出を用いる。

【0124】

ムピロシンの定量
ＨＰＬＣ／ＵＶ法（ＨＰＬＣシステム−ヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ）シリーズＩＩ １０９０）を用いて薬物濃度を定量した。カラムは、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）、ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム、５μｍ、４．６ｍｍ×１５０ｍｍを用いた。クロマトグラフィ条件は、公開されている方法［ＵＳＰ ３５．ムピロシン公式モノグラフ；：３９６２−３］に基づいた。酸加水分解生成物のための分割溶液を、説明［ＵＳＰ ３５．ムピロシン公式モノグラフ；：３９６２−３］に従って作製した。ムピロシン加水分解生成物とムピロシンとの間の分割は、２．０以上であった。合計（遊離プラスリポソーム）薬物濃度を、メタノールで希釈したリポソーム分散体のＨＰＬＣアッセイによって特定した。リポソーム薬物濃度は、遊離薬物を結合させるＤｏｗｅｘ １×８−２００アニオン交換体と分散体とを混合することによって遊離薬物を除去した後に特定した。リポソーム内ムピロシン濃度は、リポソーム薬物濃度およびリポソーム内封入体積（既述のように、リポソーム内カルシウム含有量によって特定される）により、以下の式に従って算出した。

【0125】

【0126】

薬物対脂質（Ｄ／Ｌ）モル比
初期Ｄ／Ｌ比とは、リモートローディングに用いられる初期モル比を意味する。インキュベーションにおける初期Ｄ／Ｌ比は、リモートローディングに用いられる薬物の総量の、リモートローディングに用いられる総リポソームリン脂質に対するモル比として特定した。ローディング後Ｄ／Ｌ比とは、リポソームの薬物およびリン脂質濃度の間のモル比を意味する。

【0127】

粒子サイズ分布分析
粒子サイズは、充分に確立された動的光散乱法を用いて特定し、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｓｅｒｉｅｓ ＺＥＮ３６００Ｆ（マルバーンインスツルメンツ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）モールバン、英国）を用いて行った。平均径は、体積平均に基づいた（さらなる詳細については、Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ Ｙ，Ａｍｓｅｌｅｍ Ｓ．１９９３．Ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｓｓａｙｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｓｅ ｏｆ ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｂａｓｅｄ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｉｎ：Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ（Ｅｄ．），Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．；１９９３：５２７−６１６を参照）。

【0128】

クライオＴＥＭ画像
溶液および分散体の直接撮像のために、極低温での透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）（クライオＴＥＭ）を用いた。ガラス化した試料を、３００メッシュの穿孔レース状カーボン（ｐｅｒｆｏｒａｔｅｄ ｌａｃｙ ｃａｒｂｏｎ）で被覆した銅グリッド（テッドペラ社（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ，Ｉｎｃ．））上に作製した。４μＬの溶液を滴下してグリッドに適用し、フィルター紙で拭いて溶液の薄い液体膜を形成した。この拭いたサンプルを、直ちに凝固点（−１８３℃）の液体エタン中に投入した。この手順は、プランジャ（ライカ（Ｌｉｅｃａ））により自動的に行った。ガラス化試料を液体窒素へ移して保存した。サンプルの研究は、ＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ １２ Ｇ２ ＴＥＭを１２０ｋＶで用い、ガタン（Ｇａｔａｎ）製クライオホルダーを−１８０℃に維持して行い、画像は、ガタン製スロースキャン冷却電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラで記録した。画像は、Ｄｉｇｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈソフトウェアパッケージを用い、電子ビーム放射線による損傷を最小限に抑えるために低電子線量条件で記録した。

【0129】

示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を用いた特性決定
方法
本明細書で開示されるリポソームムピロシンを、酢酸カルシウム勾配を用いたリン酸緩衝液の薬物溶液からのリモートローディングによって作製した。リポソームは、モル比５５：４０：５のＨＳＰＣ：コレステロール：ｍＰＥＧ ＤＳＰＥから成っていた。通常の酢酸カルシウムリポソーム（ＣＡ−リポソーム）および内部体積に酢酸カルシウム中の１５％ ヒドロキシプロピルベータシクロデキストリン（ＨＰＣＤ）を含有するリポソーム（ＣＡ−ＨＰＣＤ−リポソーム）の２種類のリポソームを試験した。

【0130】

ＤＳＣ測定は、ＤＳＣ−ＶＰ（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））で行った。サンプルおよびレファレンスを充填し、１℃／分の速度で１５〜２０℃から９０℃まで、典型的には３つのサイクル（加熱、冷却、および再加熱）でスキャンした。すべてのリポソームサンプルに対するレファレンスはスクロース：リン酸緩衝液（１：１）であった。ＨＰＣＤを含むおよび含まない酢酸カルシウム緩衝溶液を、それぞれ、バルク相でのＨＰＣＤを含むおよび含まない薬物−カルシウム析出物に対するレファレンスとして用いた。サーモグラムは、ベースラインを差し引くことで補正した。

【0131】

リポソームムピロシンからのムピロシンの放出動態
リポソームムピロシンを、１：２０の希釈後に、５０％成体ウシ血清中または生理食塩水中にて３７℃でインキュベートした。所望される時間点でこれらのサンプルからアリコートを取り出し、リポソームムピロシンを遊離ムピロシンから分離するセファロースＣＬ−４Ｂカラムを用いてゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）によって薬物放出レベルを分析した。カラムを生理食塩水溶液で平衡化し、カラムへのサンプル充填の後、０．５ｍｌの画分を回収し、ムピロシン含有量について分析した。各画分でＨＰＬＣによって得られたムピロシン濃度を、溶出体積に対してプロットし、各サンプルに対する溶出プロファイルを得た。溶出プロファイルは２つのピークを含有しており；第一は、リポソーム中のムピロシンに対応し、第二は、遊離ムピロシンに対応していた。リポソームムピロシンおよび遊離ムピロシンに対する曲線下面積（ＡＵＣ）を、台形法で算出した。各時間点において、リポソーム中に保持された薬物のパーセント（保持％）を、以下の式によって算出した。

【0132】

【0133】

結果
ムピロシンのペグ化ナノリポソームへのリモートローディングに対する可溶化剤の効果
酢酸カルシウムの膜貫通勾配を示すペグ化ナノリポソームへのムピロシンローディングを（ＣＡ−ｌｉｐ）、異なるローディング溶液組成を用いて評価した。ムピロシンは、水性媒体中での溶解性は高くない。弱酸であることから、その溶解度は、ｐＨと共に上昇する。ムピロシンは、２００ｍＭ、ｐＨ６．３のリン酸緩衝液中において、１５ｍＭの濃度まで可溶であった。より高い濃度は、激しい撹拌および超音波処理によって達成した。溶解度の向上（約１００ｍＭ）が、ＰＥＧ４００およびＰＧによって達成された。ｐＨ６．３のリン酸緩衝液中の１〜１０％ ＨＰＣＤ溶液においても、溶解度が上昇する結果となった（＞３４ｍＭ）。しかし、１％ ＨＰＣＤ中での高濃度（≧２８ｍＭ）は、透明溶液を得るために１０分間の超音波処理が必要であった。試験した異なる溶液中のムピロシンのクロマトグラフィプロファイルは、標準溶液のプロファイルに類似していたことには留意されたい。ムピロシンローディングに対する溶解度向上剤の効果を試験する試みとして、ムピロシンを、ＰＥＧ４００、ＰＧ、および１〜１０％ ＨＰＣＤを含むおよび含まないｐＨ６．３のリン酸緩衝液を含有するインキュベーション溶液からリポソーム（膜貫通酢酸カルシウム勾配を示す）にローディングした。

【0134】

図１は、試験した異なるインキュベーション溶液における、初期Ｄ／Ｌ比の関数としてのローディング後Ｄ／Ｌ比を示す。リン酸緩衝液およびＰＥＧ４００からのインキュベーションは、類似の逆Ｕ字型曲線のパターンを示し：ローディング後Ｄ／Ｌは、０．２３〜０．２５Ｄ／Ｌの最大ローディング後比に達し、初期Ｄ／Ｌ比の上昇と共に低下した。ＰＧからのローディングは、試験したすべての初期比（０．１４〜０．５９）において高く、ローディング後Ｄ／Ｌの一定した上昇を示し、試験した最も高い初期比（０．５９）において、０．４８の値に達した。リン酸緩衝液およびＰＥＧ４００溶液と比較したＰＧでのこの高いローディングは、ＰＧの浸透性を向上させる特徴の結果であり得る。ＨＰＣＤ溶液からのローディングプロファイルは、ＨＰＣＤ濃度に依存していた。１％ ＨＰＣＤは、リン酸緩衝液の場合よりも僅かに高いローディング後比を示したが、類似の逆Ｕ字型ローディング曲線であった。より高いＨＰＣＤ濃度（２．５〜１０％）は、初期比の上昇と共にローディング後比の一定の上昇を示し、ＰＧの場合と同様に、これらの溶液からのローディングは、逆Ｕ字型パターンの結果とはならなかった。しかし、ローディング後比は、２．５％ ＨＰＣＤの場合の方が高く、ＨＰＣＤの濃度の上昇（５％および１０％）と共に低下しており；高いＨＰＣＤ濃度は、ローディングを阻害するもの思われた。

【0135】

ローディングに対するＨＰＣＤの効果を、その内部体積中にＨＰＣＤを含有する酢酸カルシウムリポソーム（ＣＡ−ＨＰＣＤ−ｌｉｐ）についても特定した。ペグ化リポソームを、１５％（重量／重量）ＨＰＣＤを含有する酢酸カルシウム緩衝液で作製した。リポソーム内部体積中のＨＰＣＤ濃度は、ローディングを阻害した濃度（１０％、図１参照）よりも高かった。リポソーム内部のこの濃度は、従って、リポソーム内部において包摂複合体中にムピロシンを取り込み、外部媒体へのその透過を阻害することによってローディングを補助するものと想定された。図２は、用いた初期Ｄ／Ｌ比およびインキュベーション溶液組成の関数としてのＣＡ−ＨＰＣＤリポソーム中のローディング後Ｄ／Ｌ比を示している。加えて、酢酸カルシウム勾配を用いない１５％ ＨＰＣＤを含有するコントロールＨＰＣＤリポソーム（ＣＴＲＬ−ＨＰＣＤ−ｌｉｐ）も、リン酸緩衝溶液からのそのムピロシンローディングについて試験した。図２に示されるように、ＣＡ−ＨＰＣＤ ｌｉｐに対するいずれのローディング溶液も、逆Ｕ字型曲線を示さなかった。ＣＡ−ＨＰＣＤ−ｌｉｐに対するローディングは、ＣＡ−ｌｉｐにおいて逆Ｕ字型曲線を示さなかったインキュベーション溶液（ＰＧおよび２．５〜１０％ ＨＰＣＤ）からのＣＡ−ｌｉｐへのローディング（図１）に類似していた。しかし、リン酸緩衝液、１％ ＨＰＣＤ、およびＰＥＧ４００からのローディングにおいて、著しい相違が見出された。これらのＣＡ−ＨＰＣＤ−ｌｉｐに対してローディングすることにより、ＣＡ−ｌｉｐにおいて得られた逆Ｕ字型ローディングは消滅した。ＣＡ−ｌｉｐの場合に示されるように（図２）、ＨＰＣＤ溶液からのＣＡ−ＨＰＣＤ−ｌｉｐへのローディングは、ＨＰＣＤ濃度に依存しており；インキュベーション溶液中のＨＰＣＤ濃度の増加と共に、ローディングは減少した。図２はさらに、ＣＡ−ＨＰＣＤ−ｌｉｐへのローディングの場合、インキュベーション溶液に可溶化剤は必要ではなく；リン酸緩衝液は、ＰＧ、ＰＥＧ４００、および１％ ＨＰＣＤと同様に良好であったことを示している。しかし、インキュベーション溶液中のより高いＨＰＣＤ濃度（５〜１０％）では、ローディングは低下した。図３Ａは、ＣＡ−ｌｉｐ、ＣＡ−ＨＰＣＤ−ｌｉｐ、およびＣＴＲＬ−ＨＰＣＤ−ｌｉｐへのリン酸緩衝溶液からのムピロシンローディングの比較を示し、一方図３Ｂは、「酢酸カルシウム」の対応するリポソームとの比較として、酢酸ナトリウム（ＮＡ−アセテート）リポソーム、ＮＡ−アセテート−ＨＰＣＤリポソームへのリン酸緩衝溶液からのムピロシンローディングの比較を示す。これらの比較から、リポソーム内媒体のローディングパターンに対する影響が示される。ＣＡ−ｌｉｐは、逆Ｕ字型ローディング曲線を示したが、一方ＨＰＣＤ含有リポソームでは、このパターンは見られなかった。しかし、カルシウム勾配なしの場合、ローディングは非常に遅かった。加えて、この結果から、ローディング効率という意味で、酢酸ナトリウムよりも酢酸カルシウムの使用がある程度好ましいことも示される。

【0136】

ムピロシン放出
ＣＡ−ｌｉｐ、ＣＡ−ＨＰＣＤリポソーム、およびコントロール−ＨＰＣＤリポソームからのムピロシンの放出について試験した。放出は、生理食塩水中または５０％血清中において評価した。図４は、生理食塩水または血清中において３７℃で１時間インキュベートした後、異なるリポソーム内媒体を有するリポソーム中に保持されたムピロシン％を示す。ムピロシンを含有するＣＡ−ｌｉｐは、生理食塩水中では安定であったが、５０％血清の存在下では、非常に速く薬物を放出した（１時間以内に８２％放出）。放出速度に対するローディング溶液組成の影響はなく、ＰＧ溶液からローディングされた酢酸カルシウムリポソームは、リン酸緩衝液からローディングされたリポソームと比較して、類似の放出の値を血清中で示した（データ示さず）。しかし、血清中での放出は、ＣＡ−ＨＰＣＤ−ｌｉｐの場合に大きく低下した。１時間のインキュベーション後、放出されたのは僅かに２２％であり、ここでも、ローディング溶液組成の影響は見られなかった（データ示さず）。ムピロシンを含有するコントロールＨＰＣＤリポソームは、１時間のインキュベーション後、速い放出を示した（７３％）。生理食塩水および血清におけるＣＡ−ｌｉｐからのムピロシン放出の著しい相違は、ムピロシンの高いタンパク質結合親和性（９６．５％）に帰するものであるとの仮説を立てた。この仮説を試験するために、ムピロシンを含有するＣＡ−ｌｉｐを、１２．５μＭの濃度までの遊離ムピロシンで予備インキュベートしておいた血清中でインキュベートした。この場合、ＣＡ−ｌｉｐからの放出は、３５％まで大きく低下し、放出薬物シンクとしての血清タンパク質の関与に関する発明者らの作業仮説が支持された。

【0137】

４８時間のインキュベーション後の放出プロファイルを、生理食塩水および血清の存在下、ムピロシンを含有するＣＡ−ＨＰＣＤ−ｌｉｐについて試験した（図５）。生理食塩水中での放出は比較的遅く、４８時間のインキュベーション後の放出は３７％であった。血清中での放出はこれよりも速く、３時間および２４時間のインキュベーション後の放出は、それぞれ４７％および７２％であった。血清中でのＣＡ−ＨＰＣＤ−ｌｉｐからの放出は、ＣＡ−ｌｉｐからの放出よりも著しく遅かった（１時間のインキュベーション後に８２％放出、図４）。

【0138】

リポソームムピロシンのクライオＴＥＭによる特性決定
ムピロシンを含むおよびムピロシンを含まないＣＡ−ｌｉｐならびにＣＡ−ＨＰＣＤ−ｌｉｐのクライオＴＥＭ画像を、図６に示す。これらの画像は、その内部またはリポソーム媒体中に観察可能な薬物結晶を含まない球状ＳＵＶリポソームを示している。

【0139】

リポソームサイズ分布
リポソームは、そのサイズおよびサイズ分布についても、マルバーン（Ｍａｌｖｅｒｎ）粒子サイズアナライザーを用いて評価した。得られたサイズは小さく、Ｚ平均は７７±５ｎｍであった。多分散指数（ＰＤＩ）は、作製したすべてのロットにおいて０．０５よりも低く、このことは、リポソームのサイズ分布の変動が低いことを意味しており、酢酸カルシウムおよび酢酸カルシウム−ＨＰＣＤ−リポソーム、酢酸ナトリウムおよび酢酸−ＨＰＣＤの間でサイズ分布に差は見られなかった。

【0140】

示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によるリポソームムピロシンの特性決定
ＤＳＣ分析は、Ｂｉｌｔｏｎｅｎ ａｎｄ Ｌｉｃｈｔｅｎｂｅｒｇ １９９３（Ｂｉｌｔｏｎｅｎ Ｒ．Ｌ．ａｎｄ Ｌｉｃｈｔｅｎｂｅｒｇ Ｄ．，１９９３，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ ９４，１２８−１４２）による記載に基づいて行った。ＨＰＣＤを含むおよびＨＰＣＤを含まないブランクリポソームは、可逆的でブロードな相転移プロセスに相当する１つの吸熱を示し、相転移のＴ_ｍと考えられる５３℃において熱容量の最大変化を有していた（図８Ａ〜８Ｂ）。これは、ＨＳＰＣベースのリポソームの相転移挙動と一致していた（Ｇａｒｂｕｚｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ ２００５ Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ Ｌｉｐｉｄｓ、上記参考文献参照）。

【0141】

脂質組成およびサイズ分布がブランクリポソームと同一である薬物をローディングしたリポソームは、２つの吸熱を示している（図９Ａ〜９Ｂ）。１つ目は、ブランクリポソームに類似のＴ_ｍを有する可逆的プロセスを表しており、従って、それは膜脂質に帰するものであり、それは、ＨＰＣＤを含むまたは含まない薬物ローディングリポソームにおいて観察された。より高い温度にある（＞７８℃）２つ目の吸熱は、薬物−カルシウム複合体の溶融に関連する。この吸熱は、不可逆的であり、それは、薬物が関与する集合体の溶融が一旦発生すると、それは冷却しても同じ集合体を再度形成しないことを意味する。ＨＰＣＤを含まない酢酸カルシウムリポソーム中の薬物複合体は、７８．４℃の融点を有し、一方酢酸カルシウム−ＨＰＣＤリポソーム中の薬物複合体は、それよりも高い温度の８１．３℃および８７．０℃に２つのピークを示し、このことは、ＨＰＣＤを含まない場合に観察されたものとは異なる複合体であることを示している。

【0142】

リポソームムピロシンの長期的安定性
リポソームムピロシンの長期的安定性を、視覚的外観、封入濃度、および粒子サイズ分布に基づき、２年間の期間にわたり、サンプルの一部について試験した。

【0143】

方法
酢酸カルシウム勾配を用いたリモートローディングによって作製され、その内部水相中にＨＰＣＤを含有する５つのリポソームムピロシン製剤を追跡した。

【0144】

粒子サイズおよびサイズ分布
粒子サイズ測定は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（マルバーンインスツルメンツ）を用いて行った。平均径は、体積平均に基づいた。ゼロ時間に得られたサイズは、７７±１．５ｎｍであった。多分散指数（ＰＤＩ）は、０．０５よりも低かった。

【0145】

リポソームムピロシンのレベルおよび濃度の特定
リポソーム分散体中のムピロシン濃度は、ＨＰＬＣ／ＵＶ法を用いて定量した。用いたカラムは、ウォーターズ、ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム、５μｍ、４．６ｍｍ×１５０ｍｍであった。クロマトグラフィ条件は、ＵＳＰの方法に基づいた。リポソーム薬物濃度は、分散体を、遊離薬物を結合させるＤｏｗｅｘ １×８−２００アニオン交換体と混合することによって遊離薬物を除去した後に特定した。

【0146】

結果
製剤の視覚的外観は、すべての時間点において半透明であり、析出は観察されなかった。

【0147】

加えて、９〜２４ヶ月間にわたってサイズ分布に変化は示されておらず、このことは、リポソームの安定性を示すものである。

【0148】

最後に、以下の表１は、示された期間（０日、９か月間、１４か月間、および２４ヶ月間）にわたるムピロシンリポソームの濃度（濃度）をまとめたものである。ゼロ時間点における薬物対脂質モル比は、製剤中の封入薬物および脂質濃度の間のモル比であった。

【0149】

【0150】

上記の結果から、これらのリポソーム製剤では、サイズもＰＤＩも変化せず、また、リポソーム分散体中のムピロシン濃度も変化せず、リポソームの凝集も発生しなかったことを示しており、これらは長期的安定性を示すものである。

【0151】

例２−マウスの壊死性筋膜炎モデルにおけるリポソームムピロシン
物質および方法
本研究で用いた薬物製剤
リポソームは、上述のようにして作製した

【0152】

リポソームムピロシン組成を、表１Ａに示す。

【0153】

^ａ製剤中の封入リポソーム体積５．０９％に基づいて推計（本明細書で示されないカルシウム測定に基づいて算出）
^ｂリポソーム内コンパートメントのＨＰＣＤ濃度は１５０ｍｇ／ｍｌ、それに５．０９％の封入リポソーム体積を乗じて、全製剤中での７．６ｍｇ／ｍｌ ＨＰＣＤを得た。
^ｃリポソーム内相における酢酸カルシウム含有量は３５．２ｍｇ／ｍｌ、それに５．０９％の封入リポソーム体積を乗じて、全製剤中での１．８ｍｇ／ｍｌ 酢酸カルシウムが得られる。
^ｄローディング溶液による０．５３の希釈を仮定（ダイアフィルトレーション後に得られるリン脂質濃度に基づく）
^ｅ最終製剤の重量オスモル濃度は、４００ｍＯｓｍ／ｋｇ未満であった。

【0154】

Ｄｏｗｅｘ １×８−２００（アニオン交換体）を用いて遊離ムピロシンを分離した後にＨＰＬＣ／ＵＶ法によって特定したリポソームムピロシン濃度は、５．５〜６．５ｍｇ／ｍｌであった。

【0155】

ＨＰＣＤ、酢酸カルシウム、およびムピロシンのリポソーム内濃度は、表１Ｂに示されるように特定された。ＨＰＣＤ：ムピロシンのリポソーム内モル比は、０．６〜０．８の範囲であることが見出された。

【0156】

^ａローディング前のリポソーム内体積中の２０．４μｍｏｌ アセテートに相当
^ｂローディング前の初期アセテート濃度は、４００ｍＭであり、ローディング後は、約２００ｍＭに減少した。
^ｃ４．５〜５．５ｍｇ／ｍｌの製剤中、５．０９％のリポソーム内体積中に濃縮されたリポソームムピロシン濃度に基づいて算出

【0157】

遊離ムピロシン溶液
遊離ムピロシン溶液（６ｍｇ／ｍｌ）を、２００ｍＭ、ｐＨ６．３のリン酸緩衝液で作製した。

【0158】

生体内研究手順
壊死性筋膜炎モデルを、公開されている方法に基づいて行った［Ｈｉｄａｌｇｏ−ｇｒａｓｓ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｈｅｒｏｍｏｎｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｏｎ ｈｏｓｔ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｎ ｇｒｏｕｐ Ａ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｎｅｃｒｏｔｉｓｉｎｇ ｓｏｆｔ−ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．３６３，（２００４）］。具体的には、作業プロトコルは以下を含んでいた：

【0159】

体重１０ｇおよび３〜４週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを選択した。

【0160】

第１日：血液カンテンプレートに細菌を播種し、３７℃でインキュベートした。ＴＨＹ培地を作製し、オートクレーブを施し、室温で保持した。

【0161】

第２日：プレートをインキュベータから取り出し、室温下に置いた。

【0162】

第４日：細菌をプレートから５ｍｌ ＴＨＹチューブ（インキュベータ中で加温済み）へ移した。

【0163】

第５日：２ｍｌの細菌を、５ｍｌ ＴＨＹチューブから５０ｍｌ ＴＨＹチューブへ移した。細菌を対数期初期まで増殖させ（Ｏ．Ｄ_６００＝０．３〜０．４）、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに懸濁させて、注射体積１００μｌ中１０^８の細菌数と相関するＯ．Ｄ_６００＝０．８とした。得られた細菌量を、研究のマウス数に応じたバイアルに分割した。各希釈分を、血液カンテンプレートに播種し、翌日にコロニーを計数した。

【0164】

分析：
第５日に、マウスの背中中央部から被毛を取り除き、細菌を皮下注射した。

【0165】

第６〜７日：疾患状態およびマウス死亡数を追跡した。これらの日まで生存したマウスを屠殺した。疾患状態は、以下の表２Ａに従って追跡した。

【0166】

表２Ｂは、研究グループを示す。具体的には、Ａ群レンサ球菌（ＧＡＳ）注射（０．７５×１０^８ＣＦＵ）を、すべての研究グループに施した。薬物は、１００μｌの製剤のＩＶ注射によって投与した。各リポソームムピロシン用量は、４５ｍｇ／ｋｇであった。各遊離ムピロシン用量は、５０ｍｇ／ｋｇであった。

【0167】

【0168】

【0169】

結果
上述の研究手順に記載のパラメータに基づいてマウスを評価した。観察結果を、表３〜９にまとめる。グループ１（未処理、薬物投与なし）およびグループ２（遊離薬物）のマウスは、細菌暴露の２４時間後に疾患を発症した。

【0170】

未処理グループでは、２体のマウスが、閉じたまたは部分的に閉じた眼、および動きの困難さによって示されるように、重症となった（このグループの他のマウスよりも）。この２体のマウスは、次の観察時点（４８時間）で死亡した。このグループおよびグループ２のその他のマウスはすべて、重篤度のより低い疾患を発症し：これらのマウスは、最初の２４時間で体重を減少させ、創傷を生じ、被毛は粗剛化し、滑らかではなかった。

【0171】

リポソームムピロシンを受けたグループ３〜５のマウスは、１回の予防用量（細菌注射の３時間前）のみを受けたグループ３であっても、疾患の症状を示さなかった。図１０は、研究全体にわたるマウスの平均体重を示す。図から分かるように、グループ３〜５のマウスは、研究を通して体重を増加させており、最初の２４時間に体重減少を示したグループ１および２とは対照的である。図１１Ａおよび１１Ｂは、細菌注射の４８時間後における未処理グループおよびリポソームムピロシングループのマウスの写真を示す。

【0172】

【0173】

^ａ−２４時間ではグループ１に６体のマウス。４８、７２、および９６時間では４体のマウス
^ｂ−グループあたり６体のマウス

【0174】

【0175】

^ａ−２４時間ではグループ１に６体のマウス。４８、７２、および９６時間では４体のマウス
^ｂ−グループあたり６体のマウス

【0176】

^ａ−２４時間ではグループ１に６体のマウス。４８、７２、および９６時間では４体のマウス
^ｂ−グループあたり６体のマウス

【0177】

^ａ−２４時間ではグループ１に６体のマウス。４８、７２、および９６時間では４体のマウス
^ｂ−グループあたり６体のマウス

【0178】

^ａ−２４時間ではグループ１に６体のマウス。４８、７２、および９６時間では４体のマウス
^ｂ−グループあたり６体のマウス

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A-6D】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】