特許 6676523 プロトキシン−ＩＩ変異体及びその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6676523

(24)【登録日】2020年3月16日

(45)【発行日】2020年4月8日

(54)【発明の名称】プロトキシン−ＩＩ変異体及びその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20200330BHJP

   C07K 14/435 20060101ALI20200330BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20200330BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20200330BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20200330BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20200330BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20200330BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20200330BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20200330BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20200330BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/12ZNA

   C07K14/435

   C07K19/00

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C12P21/02 C

   A61K38/17

   A61P29/00

【請求項の数】26

【全頁数】68

(21)【出願番号】特願2016-519872(P2016-519872)

(86)(22)【出願日】2014年10月3日

(65)【公表番号】特表2016-533710(P2016-533710A)

(43)【公表日】2016年11月4日

(86)【国際出願番号】US2014058972

(87)【国際公開番号】WO2015051216

(87)【国際公開日】20150409

【審査請求日】2017年9月25日

(31)【優先権主張番号】61/886,100

(32)【優先日】2013年10月3日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】509087759

【氏名又は名称】ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100093676

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 純子

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100153693

【弁理士】

【氏名又は名称】岩田 耕一

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】フリンスパッハ，マック

(72)【発明者】

【氏名】ウィケンデン，アラン

(72)【発明者】

【氏名】フェローズ，ロス

(72)【発明者】

【氏名】ネフ，ロバート

(72)【発明者】

【氏名】リウ，イ

(72)【発明者】

【氏名】ハゲン，レベッカ

(72)【発明者】

【氏名】シュ，キンハオ

【審査官】 金田 康平

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１２／００４６６４（ＷＯ，Ａ２）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ１５／００−１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

単離プロトキシン−ＩＩ変異体であって、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０、４４、５６、５９、６５、７８、１０９、１１０、１１１、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２１、１２２、１２３、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４５、１４６、１４７、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５６、１５８、１５９、１７２、１７３、１７５、１７７、１７８、１８３、１８４、１８５、１８６、１８９、１９０、１９３、１９６、１９７、１９９、２０５、２０７、２１０、２１１、２１６、２１７、２２４、２３０、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９４、２９７、２９８、２９９、３０１、３０２、３０４、３０５、３０７、３０８、３０９、３１０、３１２、３１４、３１５、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５又は３２６のアミノ酸配列で示されるポリペプチドを含み、
ここで、前記変異体は、ヒトＮａｖ１．７活性を、ＩＣ₅₀値が約３０×１０^-9Ｍ以下で阻害し、当該ＩＣ₅₀値の測定は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いるＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイを使用して、ヒトＮａｖ１．７を安定発現するＨＥＫ２９３細胞中に２５×１０^-6Ｍの３−ベラトロイルベラセビンが存在する下で行われる、
前記単離プロトキシン−ＩＩ変異体。

【請求項2】

さらにＮ末端伸長（N-terminal extension）を含み、前記Ｎ末端伸長は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４又は３８５のアミノ酸配列で示されるポリペプチドを含む、請求項１に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体。

【請求項3】

さらにＣ末端伸長（C-terminal extension）を含み、前記Ｃ末端伸長は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６又は３９７のアミノ酸配列で示されるポリペプチドを含む、請求項１又は２に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体。

【請求項4】

前記Ｎ末端伸長及び／又は前記Ｃ末端伸長は、前記プロトキシン−ＩＩ変異体にリンカーを介して結合される、請求項２又は３に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体。

【請求項5】

前記リンカーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８３、３９２、３９８、３９９、４００、４０１又は４０２のアミノ酸配列で示されるポリペプチドを含む、請求項４に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体。

【請求項6】

単離プロトキシン−ＩＩ変異体であって、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３５のアミノ酸配列で示されるポリペプチドを含み、
ここで、前記変異体は、ヒトＮａｖ１．７活性を、ＩＣ₅₀値が約３０×１０^-9Ｍ以下で阻害するものであり、当該ＩＣ₅₀値の測定は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用し、ヒトＮａｖ１．７を安定発現するＨＥＫ２９３細胞中に２５×１０^-6Ｍの３−ベラトロイルベラセビンが存在する下で、ビス−（１，３−ジエチルチオバルビツール酸）トリメチンオキソノールを電子受容体とし、トリナトリウム８−オクタデシルオキシピレン−１，３、６−トリスルホネートをドナーとして用いて、ドナーを３９０〜４２０ｎｍで励起し、ＦＲＥＴを５１５〜５７５ｎｍで測定することによって、行われる、
前記単離プロトキシン−ＩＩ変異体。

【請求項7】

ヒトＮａｖ１．７活性を、ＩＣ₅₀値が約３×１０^-8Ｍ〜約１×１０^-9Ｍで阻害する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離プロトキシン−ＩＩ変異体。

【請求項8】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６、５９、６５、７８、１１１、１１４、１１７、１１８、１１９、１２１、１２２、１２３、１２９、１５０、１９０、２１７、２８１、３２４、３２５又は３２６のアミノ酸配列で示されるポリペプチドを含む、請求項１〜５及び７のいずれか一項に記載の単離プロトキシン−ＩＩ変異体。

【請求項9】

前記変異体はヒトＮａｖ１．７を選択的に阻害する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離プロトキシン−ＩＩ変異体。

【請求項10】

遊離Ｃ末端カルボン酸、アミド、メチルアミド又はブチルアミド基を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離プロトキシン−ＩＩ変異体。

【請求項11】

半減期延長部分に結合された請求項１〜１０のいずれか一項に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体を含む単離融合タンパク質。

【請求項12】

前記半減期延長部分はヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）、Ｆｃ又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１１に記載の融合タンパク質。

【請求項13】

請求項１〜９のいずれか１項に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体をコードする単離ポリヌクレオチド。

【請求項14】

請求項１３に記載の単離ポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項15】

請求項１４に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項16】

単離プロトキシン−ＩＩ変異体を生成する方法であって、請求項１５に記載の宿主細胞を培養すること、及び宿主細胞によって生成されたプロトキシン−ＩＩ変異体を回収することを含む、前記方法。

【請求項17】

請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離プロトキシン−ＩＩ変異体と、薬学的に許容される添加剤とを含む、医薬組成物。

【請求項18】

被験対象におけるＮａｖ１．７を介した痛みを治療するためのものである、請求項１７に記載の医薬組成物。

【請求項19】

前記痛みは、慢性の痛み、急性の痛み、神経障害性疼痛、侵害受容性の痛み、内臓痛、背痛、術後の痛み、熱痛、幻肢痛、又は炎症状態に付随する痛み、肢端紅痛症（ＰＥ）、発作性高度疼痛症（ＰＥＰＤ）、変形性関節症、リウマチ性関節炎、腰部椎間板切除術、膵炎、線維筋痛、有痛性糖尿病性神経障害（ＰＤＮ）、疹後神経痛（ＰＨＮ）、三叉神経痛（ＴＮ）、脊髄損傷又は多発性硬化症である、請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項20】

プロトキシン−ＩＩ変異体を末梢に投与するためのものである、請求項１８又は１９に記載の医薬組成物。

【請求項21】

プロトキシン−ＩＩ変異体を関節、脊髄、手術創、傷害／外傷部位、末梢神経線維、泌尿生殖器臓器、又は炎症組織に局所的に投与するためのものである、請求項１８又は１９に記載の医薬組成物。

【請求項22】

被験対象者はヒトである、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項23】

必要とする被験対象における痛みの治療における使用のための請求項１〜１０のいずれか一項に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体。

【請求項24】

痛みは、慢性の痛み、急性の痛み、神経障害性疼痛、侵害受容性の痛み、内臓痛、背痛、術後の痛み、熱痛、幻肢痛、又は炎症状態に付随する痛み、肢端紅痛症（ＰＥ）、発作性高度疼痛症（ＰＥＰＤ）、変形性関節症、リウマチ性関節炎、腰部椎間板切除術、膵炎、線維筋痛、有痛性糖尿病性神経障害（ＰＤＮ）、疹後神経痛（ＰＨＮ）、三叉神経痛（ＴＮ）、脊髄損傷又は多発性硬化症である、請求項２３に記載の使用のためのプロトキシン−ＩＩ変異体。

【請求項25】

プロトキシン−ＩＩ変異体を末梢に投与する請求項２３又は２４に記載の使用のためのプロトキシン−ＩＩ変異体。

【請求項26】

プロトキシン−ＩＩ変異体を関節、脊髄、手術創、傷害／外傷部位、末梢神経線維、泌尿生殖器臓器、又は炎症組織に局所的に投与する請求項２３、２４又は２５に記載の使用のためのプロトキシン−ＩＩ変異体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、米国仮出願第６１／８８６，１００号（２０１３年１０月３日に出願）の利益を主張する。なおこの文献の全体の内容は本明細書において参照により取り入れられている。

【0002】

本発明は、プロトキシン−ＩＩ変異体、それをコードする合成ポリヌクレオチド、及びそれらを製造及び使用する方法に関する。

【背景技術】

【0003】

電位依存性ナトリウムチャネル（Voltage-Gated Sodium Channel）（ＶＧＳＣ）は、心筋及び骨格筋細胞、並びに中枢及び末梢ニューロンを含むあらゆる興奮性細胞に存在している。神経細胞では、ナトリウムチャネルは、閾値下脱分極を増幅し、活動電位の急速な立ち上がりを引き起こす役割を担っている。このため、ナトリウムチャネルは、神経系における電気信号の開始及び伝播に不可欠である。異常なナトリウムチャンネル機能が種々の医学的障害の根底にあると考えられており（Ｈｕｂｎｅｒ ａｎｄ Ｊｅｎｔｓｃｈ，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １１：２４３５〜４５、２００２）、そうした医学的障害としては、例えば、てんかん（Ｙｏｇｅｅｓｗａｒｉら、Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ５：５８９〜６０２、２００４）、不整脈（Ｔｆｅｌｔ−Ｈａｎｓｅｎら、Ｊ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌ ２１：１０７〜１５、２０１０）、ミオトニー（Ｃａｎｎｏｎ ａｎｄ Ｂｅａｎ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２０：８０〜３、２０１０）、及び痛み（Ｃｒｅｇｇら、Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ５８８：１８９７〜９０４、２０１０）が挙げられる。ナトリウムチャネルは、一般的に各種サブユニットの複合体であり、その主要なものは単独で機能するのに充分なポア形成αサブユニットである。

【0004】

電位依存性ナトリウムチャンネルαサブユニットのファミリーの９つの知られたメンバーがヒトに存在する。Ｎａｖ１．１〜Ｎａｖ１．９である。Ｎａｖ１．ｘサブファミリーは、２つのグループ、テトロドトキシン（ＴＴＸ）感受性及びＴＴＸ耐性に薬理学的に細かく分けることができる。Ｎａｖ１．７（別名ＰＮ１又はｈＮＥ）は、ＳＣＮ９Ａ遺伝子によってコード化され、ＴＴＸ感受性であり、主に末梢交感神経及び感覚ニューロンにおいて発現される。Ｎａｖ１．７は、神経線維末端に蓄積し、小さい閾値下脱分極を増幅し、興奮性を調節する閾値チャネルとして機能する。

【0005】

Ｎａｖ１．７の機能は、急性、炎症性、及び／又は神経因性疼痛を含む、様々な疼痛状態に関係している。男性では、Ｎａｖ１．７の機能獲得型変異が、肢端紅痛症（ＰＥ）（四肢の焼けるような痛み及び炎症を特徴とする疾患）（Ｙａｎｇら、Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ ４１：１７１〜４、２００４）、及び発作性高度疼痛症（ＰＥＰＤ）（Ｆｅｒｔｌｅｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ ５２：７６７〜７４、２００６）に関連している。この観察に一致して、非選択性ナトリウムチャンネル遮断薬リドカイン、メキシレチン及びカルバマゼピンによって、これらの痛みを伴う疾患の症状緩和を得ることができる（Ｌｅｇｒｏｕｘ−Ｃｒｅｓｐｅｌら、Ａｎｎ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｖｅｎｅｒｅｏｌ １３０：４２９〜３３、２００３；Ｆｅｒｔｌｅｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ ５２：７６７〜７４、２００６）。

【0006】

ヒトにおいてＮａｖ１．７の機能喪失型変異があると、先天性疼痛不感症（ＣＩＰ）（痛刺激に対する完全な無関心又は無感覚を特徴とする希な常染色体劣性疾患）が生じる（Ｃｏｘら、Ｎａｔｕｒｅ ４４４：８９４〜８、２００６；Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、Ｃｌｉｎ Ｇｅｎｅｔ ７１：３１１〜９、２００７；Ａｈｍａｄら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １６：２１１４〜２１、２００７）。

【0007】

ＳＣＮ９Ａのコーディング領域内の一塩基多型は、侵害受容器の興奮性及び痛覚感受性の増大との関連が示されている。例えば、ヒトＮａｖ１．７におけるＲ１１５０Ｗ置換に至る多型ｒｓ６７４６０３０が、変形性関節症の痛み、腰部椎間板切除術の痛み、幻想痛、及び膵炎の痛みに関係している（Ｒｅｉｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０７：５１４８〜５３、２０１０）。Ｒ１１５０Ｗ突然変異Ｎａｖ１．７を発現するＤＲＧニューロンによって、脱分極に応じた発生頻度の増加が表示される（Ｅｓｔａｃｉｏｎら、Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ６６：８６２〜６、２００９）。線維筋痛の無効形態がＳＣＮ９Ａナトリウムチャンネル多型ｒｓ６７５４０３１に関係しており、激しい線維筋痛を伴う患者の中には後根神経節ナトリウムチャネロパチーを有するものがあり得ることを示している。（Ｖａｒｇａｓ−Ａｌａｒｃｏｎら、ＢＭＣ Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔ Ｄｉｓｏｒｄ １３：２３、２０１２）。

【0008】

マウスでは、侵害受容ニューロンにおいてＳＣＮ９Ａ遺伝子が欠失すると、機械的痛み及び熱痛の閾値が下がり、並びに炎症性痛覚応答が下がるか又は停止する（Ｎａｓｓａｒら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１：１２７０６〜１１、２００４）。すべての感覚ニューロンにおいてＳＣＮ９Ａを除去したら、機械的な痛み、炎症性痛覚、及び熱に対する反射逃避応答が停止した。感覚ニューロン及び交感神経ニューロンの両方においてＳＣＮ９Ａを欠失させると、機械的痛み、熱痛、及び神経障害性疼痛が停止し、Ｎａｖ１．７機能喪失型変異によってヒトに見られる無痛表現型が繰り返された（Ｍｉｎｅｔｔら、Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ３：７９１、２０１２）。したがって、Ｎａｖ１．７阻害剤又は遮断薬は、様々な疾患に伴う広範な疼痛の治療に有用となりうる。

【0009】

クモ毒には、多数のナトリウムチャンネル遮断ペプチドが含まれていることが知られている。例えば、フエントキシン−ＩＶ（ＨｗＴｘ−ＩＶ）（Ｐｅｎｇら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：４７５６４〜７１、２００２）、プロトキシン−Ｉ、プロトキシン−ＩＩ（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：１４７３４〜４７、２００２）及びフリクソトキシン−ＩＩＩ（Ｂｏｓｍａｎｓら、Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ６９：４１９〜２９、２００６）である。広範囲の痛み表示を治療するための更なるＮａｖ１．７遮断薬を特定することが求められている。詳細には、Ｎａｖ１．７に対する選択性が他の電位依存性ナトリウムチャンネルイソ型の場合よりも上回っている新しいＮａｖ１．７遮断薬が求められている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明の一実施形態は、単離プロトキシン−ＩＩ変異体であって、配列：
Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃ＣＸ₄Ｘ₅ＷＸ₆ＱＸ₇ＣＸ₈Ｘ₉Ｘ₁₀Ｘ₁₁Ｘ₁₂ＣＣＸ₁₃Ｘ₁₄ＦＸ₁₅ＣＸ₁₆ＬＷＣＸ₁₇ＫＫＬＷ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０３）で示されるポリペプチドを含み、ここで、
Ｘ₁はＧ、Ｐ、Ａ又は欠失であり、
Ｘ₂はＰ、Ａ又は欠失であり、
Ｘ₃はＳ、Ｑ、Ａ、Ｒ又はＹであり、
Ｘ₄はＱ、Ｒ、Ｋ、Ａ又はＳであり、
Ｘ₅はＫ、Ｓ、Ｑ又はＲであり、
Ｘ₆はＭ又はＦであり、
Ｘ₇はＴ、Ｓ、Ｒ、Ｋ又はＱであり、
Ｘ₈はＤ又はＴであり、
Ｘ₉はＳ、Ａ又はＲであり、
Ｘ₁₀はＥ、Ｒ、Ｎ、Ｋ、Ｔ又はＱであり、
Ｘ₁₁はＲ又はＫであり、
Ｘ₁₂はＫ、Ｑ、Ｓ又はＡであり、
Ｘ₁₃はＥ、Ｑ又はＤであり、
Ｘ₁₄はＧ又はＱであり、
Ｘ₁₅はＶ又はＳであり、
Ｘ₁₆はＲ又はＴであり、及び
Ｘ₁₇はＫ又はＲであり、
場合により、Ｎ末端伸長（N-terminal extension）又はＣ末端伸長（C-terminal extension）を有し、
ここで、当該ポリペプチドは、ヒトＮａｖ１．７活性を、ＩＣ₅₀値が約１×１０^-7Ｍ以下で阻害し、当該ＩＣ₅₀値の測定は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いるＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイを使用して、ヒトＮａｖ１．７を安定発現するＨＥＫ２９３細胞中に２５×１０^-6Ｍの３−ベラトロイルベラセビンが存在する下で行われる、単離プロトキシン−ＩＩ変異体である。

【0011】

本発明の別の実施形態は、単離プロトキシン−ＩＩ変異体であって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８（ＧＰＱＣＱＫＷＭＱＴＣＤＲＥＲＫＣＣＥＧＦＶＣＴＬＷＣＲＫＫＬＷ−ＣＯＯＨ）のアミノ酸配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一性のアミノ酸配列を含み、ここで、
アミノ酸配列は、残基番号付けがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に従うときに、位置１におけるＱ、位置７におけるＱ、及び位置１９におけるＦを有し、
ポリペプチドは、ヒトＮａｖ１．７活性を、ＩＣ₅₀値が約３０×１０^-9Ｍ以下で阻害し、当該ＩＣ₅₀値の測定は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いるＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイを使用して、ヒトＮａｖ１．７を安定発現するＨＥＫ２９３細胞中に２５×１０^-6Ｍの３−ベラトロイルベラセビンが存在する下で行い、及び
ポリペプチドはＮａｖ１．７を選択的に阻害する、単離プロトキシン−ＩＩ変異体である。

【0012】

本発明の別の実施形態は、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体をコードするポリヌクレオチドである。

【0013】

本発明の別の実施形態は、本発明の単離ポリヌクレオチドを含むベクターである。

【0014】

本発明の別の実施形態は本発明のベクターを含む宿主細胞である。

【0015】

本発明の別の実施形態は、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を生成する方法であって、本発明の宿主細胞を培養すること、及び細胞からプロトキシン−ＩＩ変異体を回収することを含む方法である。

【0016】

本発明の別の実施形態は、本発明の単離プロトキシン−ＩＩ変異体と、薬学的に許容される添加剤とを含む医薬組成物である。

【0017】

本発明の別の実施形態は、被験対象におけるＮａｖ１．７を介した痛みを治療する方法であって、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を投与して、Ｎａｖ１．７を介した痛みを治療することを含む方法である。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】ＦＬＩＰＲ ＴｅｔｒａアッセイにおいてＩＣ₅₀値が３０ｎｍ以下でＮａｖ１．７を阻害するプロトキシン−ＩＩ変異体の属アミノ酸配列を示す図である。残基番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の野生型プロトキシン−ＩＩに従う。属ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０３。

【図2-1】ＱＰａｔｃｈアッセイにおけるＮａｖ１．７及びＮａｖ１．６阻害に対するＩＣ₅₀値と、ＱＰａｔｃｈアッセイにおいて得られるＩＣ₅₀（Ｎａｖ１．６）／ＩＣ₅₀（Ｎａｖ１．７）の比によって計算した各変異体の選択性とを示す図である。ＳＥ：標準誤差。

【図2-2】ＱＰａｔｃｈアッセイにおけるＮａｖ１．７及びＮａｖ１．６阻害に対するＩＣ₅₀値と、ＱＰａｔｃｈアッセイにおいて得られるＩＣ₅₀（Ｎａｖ１．６）／ＩＣ₅₀（Ｎａｖ１．７）の比によって計算した各変異体の選択性とを示す図である。ＳＥ：標準誤差。

【図3-1】ＦＬＩＰＲ ＴｅｔｒａアッセイにおいてＩＣ₅₀値が３０ｎｍ以下でＮａｖ１．７を阻害し、Ｎａｖ１．６と比べて選択性が３０倍超のプロトキシン−ＩＩ変異体の配列及び属配列を示す図である。各変異体の選択性の計算は、ＱＰａｔｃｈアッセイにおいて得られるＩＣ₅₀（Ｎａｖ１．６）／ＩＣ₅₀９ａｖ１．７）の比によって行った。残基番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の野生型プロトキシン−ＩＩに従う。

【図3-2】ＦＬＩＰＲ ＴｅｔｒａアッセイにおいてＩＣ₅₀値が３０ｎｍ以下でＮａｖ１．７を阻害し、Ｎａｖ１．６と比べて選択性が３０倍超のプロトキシン−ＩＩ変異体の配列及び属配列を示す図である。各変異体の選択性の計算は、ＱＰａｔｃｈアッセイにおいて得られるＩＣ₅₀（Ｎａｖ１．６）／ＩＣ₅₀９ａｖ１．７）の比によって行った。残基番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の野生型プロトキシン−ＩＩに従う。

【図3-3】ＦＬＩＰＲ ＴｅｔｒａアッセイにおいてＩＣ₅₀値が３０ｎｍ以下でＮａｖ１．７を阻害し、Ｎａｖ１．６と比べて選択性が３０倍超のプロトキシン−ＩＩ変異体の配列及び属配列を示す図である。各変異体の選択性の計算は、ＱＰａｔｃｈアッセイにおいて得られるＩＣ₅₀（Ｎａｖ１．６）／ＩＣ₅₀９ａｖ１．７）の比によって行った。残基番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の野生型プロトキシン−ＩＩに従う。

【図4A】ＣＦＡ誘発熱痛覚過敏に対するＮＶ１Ｄ３０３４（ＮＶ１Ｄ３０３４−ＯＨ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８）の有効性を示す図であり、足逃避潜時の測定を、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験において、ＣＦＡ注入前（ＣＦＡ前）及びＣＦＡ注入後（０）及びペプチド投与後に１日目（１）に行って評価している。^***Ｐ＜０．００１対ＰＢＳ、双方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。

【図4B】ペプチド投与後の１日目の各投与におけるパーセントＭＰＥ（最大可能効果）（ＭＰＥ％）として表現されるＣＦＡ誘発熱痛覚過敏におけるＮＶ１Ｄ３０３４（ＮＶ１Ｄ３０３４−ＯＨ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８）の有効性を示す図である。^*Ｐ＜０．０５対ＰＢＳ、一方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。

【図5A】ＣＦＡ誘発熱痛覚過敏に対するＮＶ１Ｄ３３６８（ＮＶ１Ｄ３３６８−ＯＨ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９８）の有効性を示す図であり、足逃避潜時の測定を、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験において、ＣＦＡ注入前（ＣＦＡ前）及びＣＦＡ注入後（０）及びペプチド投与後の１日目（１）に行って評価している。^**Ｐ＜０．０１及び^****Ｐ＜０．０００１対ＰＢＳ、双方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。

【図5B】ペプチド投与後の１日目の各投与におけるパーセントＭＰＥ（ＭＰＥ％）として表現されるＣＦＡ誘発熱痛覚過敏におけるＮＶ１Ｄ３３６８（ＮＶ１Ｄ３３６８−ＯＨ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９８）の有効性を示す図である。^*Ｐ＜０．０５及び^**Ｐ＜０．０１対ＰＢＳ、一方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。

【図6A】ＣＦＡ誘発熱痛覚過敏に対するＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６）の有効性を示す図であり、足逃避潜時の測定を、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験において、ＣＦＡ注入前（ＣＦＡ前）及びＣＦＡ注入後（０）及びペプチド投与後の１日目（１）に行って評価している。^****Ｐ＜０．０００１対ＰＢＳ、双方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。

【図6B】ペプチド投与後の１日目の各投与におけるパーセントＭＰＥ（ＭＰＥ％）として表現されるＣＦＡ誘発熱痛覚過敏におけるＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６）の有効性を示す図である。^***Ｐ＜０．００１及び^****Ｐ＜０．０００１対ＰＢＳ、一方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。

【図6C】ＣＦＡ誘発触覚異痛症に対するＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６）の有効性を示す図である。後足の触覚閾値、ＣＦＡ前（ＣＦＡ前）、ＣＦＡ後（０）、及びペプチド投与後の１日目（１）。^****Ｐ＜０．０００１対ＰＢＳ、双方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。

【図6D】ペプチド後の１日目のパーセントＭＰＥ（ＭＰＥ％）として表現されるＣＦＡ誘発触覚異痛症に対するＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６）の有効性を示す図である。^***Ｐ＜０．００１対ＰＢＳ、一方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。

【図7A】ＣＦＡ前後及びペプチド投与後の種々の時点におけるＨａｒｇｒｅａｖｅｓ試験での足逃避潜時の測定によって評価されたＣＦＡモデルにおける熱痛覚過敏のＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨを介した逆転の時間経過を示す図である。^**Ｐ＜０．０１対ＰＢＳ、双方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。斜線領域は化合物送達時間（０〜２４ｈｒ）を示す。

【図7B】ＣＦＡ前後及びペプチド投与後の種々の時点における触覚閾値の測定によって評価されたＣＦＡモデルにおける触覚異痛症のＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨを介した逆転の時間経過を示す図である。^**Ｐ＜０．０１対ＰＢＳ、双方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。斜線領域は化合物送達時間（０〜２４ｈｒ）を示す。

【図8】ＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨによってホットプレート試験において著しい無痛覚が形成されたことを示す図。熱逃避潜時の評価を、５０及び５５℃においてポンプ埋め込み前及び後に行った。ポンプ埋め込みは、制御ＰＢＳグループにおける潜時に対して影響はなかった。ポンプ後１日目に、ＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨによって治療されたマウスは、ＰＢＳグループと比べて長時間に渡って潜時を示した。^*Ｐ＜０．０５及び^****Ｐ＜０．０００１対ＰＢＳ、一方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。

【図9】ＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨ前処理が、動物をカラギーナン誘発熱痛覚過敏から保護したことを示す図である。足逃避潜時の測定を、ポンプ前、及びポンプ後１日目で足底内カラギーナン注射前に行った。潜時の再測定を、カラギーナンの２、３、及び４時間後に行った。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本明細書で引用されるすべての刊行物（例えば、限定することなく、特許及び特許出願）は、本明細書において十分に説明されているものとして参照により取り入れられている。

【0020】

本明細書及び特許請求の範囲において使用するところの単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈よりそうでない旨が明確に示されない限り、複数の対象物を含む。

【0021】

別途記載のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様又は同等のあらゆる組成及び方法を本発明を実施又は試験するために使用することが可能であるが、代表的な組成物及び方法が本明細書に記載される。

【0022】

用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって結合されてポリペプチドを形成する少なくとも２個のアミノ酸残基を含む分子を意味する。５０アミノ酸を下回る小ポリペプチドを「ペプチド」と言う場合がある。ポリペプチドは、「タンパク質」と呼ばれる場合もある。

【0023】

用語「ポリヌクレオチド」は、糖−リン酸骨格又は他の同等の共有結合化学により共有結合を介して連結されたヌクレオチド鎖からなる分子を意味する。二本鎖及び一本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡが、ポリヌクレオチドの典型例である。

【0024】

用語「相補配列」は、第１の単離ポリヌクレオチド配列と逆平行であり、第１のポリヌクレオチド配列のヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチド第を含む２の単離ポリヌクレオチド配列を意味する。

【0025】

用語「ベクター」は、生物系内で複製することが可能か又はこのような系の間で移動させることが可能な非天然ポリヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオチドには典型的に、対象とするタンパク質をコードするｃＤＮＡ及び更なる要素、例えば複製の起点、ポリアデニル化シグナル、又は選択マーカー（生物系におけるこれらのポリヌクレオチドの複製又は維持を容易にする働きをする）が含まれている。このような生物系の例としては、細胞、ウィルス、動物、植物、及び還元された生物系であって、ベクターを複製することが可能な生物学的要素を用いるものを挙げても良い。ベクターを構成するポリヌクレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子又はこれらのハイブリッド分子であってもよい。

【0026】

用語「発現ベクター」は、発現ベクター内に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドの翻訳を送るために生物系又は還元された生物系において用いることができるベクターを意味する。

【0027】

用語「変異体」が、本明細書で用いられる場合に指すのは、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の野生型プロトキシン−ＩＩポリペプチドとは異なるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７の配列を有する野生型プロトキシン−ＩＩのコードを、ヌクレオチド又はアミノ酸の１又は複数の修飾（例えば、置換、挿入又は欠失）によって行うポリヌクレオチドとは異なるポリペプチド又はポリヌクレオチドである。

【0028】

明細書の全体に渡って、プロトキシン−ＩＩ変異体内で置換された残基は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の野生型プロトキシン−ＩＩにおけるその位置に対応して番号付けされている。例えば、明細書における「Ｙ１Ａ」が指すのは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の野生型プロトキシン−ＩＩにおける位置１に対応する残基位置におけるチロシンとアラニンとの置換である。

【0029】

「相補的ＤＮＡ」又は「ｃＤＮＡ」は、天然の成熟ｍＲＮＡ種において見出される配列要素の配置を隣接するエクソンと共有する良く知られた合成ポリヌクレオチドを指し、ゲノムＤＮＡ内に存在する介在するイントロンは取り除かれている。開始剤メチオニンをコード化するコドンが、ｃＤＮＡ内に存在していても良いし、存在していなくても良い。ｃＤＮＡの合成を、例えば逆転写又は合成遺伝子組み立てによって行っても良い。

【0030】

「合成の」又は「非天然の」が、本明細書で用いられる場合に指すのは、自然には存在しないポリヌクレオチド又はポリペプチド分子である。

【0031】

「Ｎａｖ１．７」（ｈＮＥ又はＰＮ１とも言う）又は「ｈＮａｖ１．７」が、本明細書で用いられる場合に指すのは、ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＮＰ＿００２９６８．１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９に示す配列を有する良く知られたヒトナトリウムチャンネルタンパク質タイプ９サブユニットαである。

【0032】

用語「野生型プロトキシン−ＩＩ」又は「野生型ＰｒｏＴｘ−ＩＩ」が、本明細書で用いられる場合に指すのは、タランチュラＴｈｒｉｘｏｐｅｌｍａ ｐｒｕｒｉｅｎｓ（ムクナ）毒素ペプチドであって、アミノ酸配列ＹＣＱＫＷＭＷＴＣＤＳＥＲＫＣＣＥＧＭＶＣＲＬＷＣＫＫＫＬＷ−ＣＯＯＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のアミノ酸配列を有するものであり、これは、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１（５０）：１４７３４〜４７、２００２に記載されている。

【0033】

用語「組み換え型プロトキシン−ＩＩ」又は「組み換え型ＰｒｏＴｘ−ＩＩ」が、本明細書で用いられる場合に指すのは、組み換え型プロトキシン−ＩＩであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すようなＧＰＹＣＱＫＷＭＷＴＣＤＳＥＲＫＣＣＥＧＭＶＣＲＬＷＣＫＫＫＬＷ−ＯＨの配列を有するプロトキシン−ＩＩ融合タンパク質の発現及び以後の切断から得られる組み換え型プロトキシン−ＩＩである。組み換え型プロトキシン−ＩＩは、野生型プロトキシン−ＩＩと比べたときに、２つのアミノ酸Ｎ末端伸長（残基Ｇ及びＰ）を取り入れている。

【0034】

「ヒトＮａｖ１．７活性を遮断する」又は「ヒトＮａｖ１．７活性を阻害する」が、本明細書で用いられる場合に指すのは、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体が、ベラトリジン（３−ベラトロイルベラセビン）によって誘発される膜脱分極を低減することを、ＩＣ₅₀値が約１×１０^-7Ｍ以下で、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いるＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａメンブレン脱分極アッセイにおいて行う能力であり、ここで、ベラトリジン誘発脱分極は、ＦＲＥＴシグナルの減少として測定され、測定は、ＤＩＳＢＡＣ２（３）（［ビス−（１，３−ジエチルチオバルビツール酸）トリメチンオキソノール］）をアクセプタとして、またＰＴＳ１８（トリナトリウム８−オクタデシルオキシピレン−１，３，６−トリスルホネート）をドナーとして用いて、ドナーを３９０〜４２０ｎｍで励起しＦＲＥＴを５１５〜５７５ｎｍで測定することをヒトＮａｖ１．７を安定発現する細胞株において行うことによってなされる。

【0035】

「ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａメンブレン脱分極アッセイ」は、本明細書で用いる場合、実施例３で説明するアッセイである。

【0036】

用語「実質的に同一である」は、本明細書で用いる場合に意味するのは、比較している２つのプロトキシン−ＩＩ変異体アミノ酸配列が同一であるか又は「非実質的な違い」を有するということである。非実質的な違いとは、ペプチド特性に悪影響を与えないプロトキシン−ＩＩ変異体アミノ酸配列における１、２、３、４、５、６、又は７のアミノ酸の置換である。本明細書で開示されるプロトキシン−ＩＩ変異体と実質的に同一であるアミノ酸配列は、本出願の範囲内である。一部の実施形態では、配列同一性は、約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上とすることができる。同一性パーセントの判定は、例えばペアワイズアライメントによって、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ．９．０．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｓｌｂａｄ、ＣＡ）のＡｌｉｇｎＸモジュールのデフォルト設定を用いて行うことができる。本発明のタンパク質配列を問い合わせ配列として用いて、公共又は特許データベースに対する検索を実行して、例えば、関連配列を特定しても良い。このような検索を実行するために用いる典型的なプログラムは、ＸＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴＰプログラム（ｈｔｔｐ＿／／ｗｗｗ＿ｎｃｂｉ＿ｎｌｍ／ｎｉｈ＿ｇｏｖ）、又はＧｅｎｏｍｅＱｕｅｓｔ（商標）（ＧｅｎｏｍｅＱｕｅｓｔ，Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）スイートであって、デフォルト設定を用いるものである。

【0037】

本明細書では表１に示すような従来の１文字及び３文字のアミノ酸コードを用いる。

【0038】

【表1】

【0039】

本発明によって、ヒトＮａｖ１．７活性を阻害する単離プロトキシン−ＩＩ（ＰｒｏＴｘ−ＩＩ）変異体ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、及び本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドを使用する方法が提供される。本発明のポリペプチドは、Ｎａｖ１．７活性化に起因する脱分極を阻害するため、疼痛を伴う様々な状態及び感覚ニューロン又は交感神経ニューロンの機能不全に伴う状態の治療に有用でありうる。

【0040】

本発明の変異体はＮａｖ１．７の強力阻害剤である。本発明は、少なくとも部分的には、プロトキシン−ＩＩ中のある残基置換が選択性、合成収率及び／又は同質性を高めることを、生成されたプロトキシン−ＩＩ変異体の効能に悪影響を与えずに行うことを見出したことに基づいており、具体的にはＷ７及びＭ１９、更に残基Ｙ１及びＳ１１、更に加えて残基Ｅ１２、Ｒ２２及び（残基番号付けはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に従う）である。

【0041】

本発明の一実施形態は単離プロトキシン−ＩＩ変異体であり、プロトキシン−ＩＩ変異体はヒトＮａｖ１．７活性を、ＩＣ₅₀値が約１×１０^-7Ｍ以下、約１×１０^-8Ｍ以下、約１×１０^-9Ｍ以下、約１×１０^-10Ｍ以下、約１×１０^-11Ｍ以下、又は約１×１０^-12Ｍ以下で阻害し、当該ＩＣ₅₀値の測定は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いるＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイを使用して、ヒトＮａｖ１．７を安定発現するＨＥＫ２９３細胞中に２５×１０^-6Ｍの３−ベラトロイルベラセビンが存在する下で行われる。

【0042】

本発明の別の実施形態は、単離プロトキシン−ＩＩ変異体であって、配列：
Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃ＣＸ₄Ｘ₅ＷＸ₆ＱＸ₇ＣＸ₈Ｘ₉Ｘ₁₀Ｘ₁₁Ｘ₁₂ＣＣＸ₁₃Ｘ₁₄ＦＸ₁₅ＣＸ₁₆ＬＷＣＸ₁₇ＫＫＬＷ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０３）で示されるポリペプチドを含み、ここで、
Ｘ₁は、Ｇ、Ｐ、Ａ又は欠失であり、
Ｘ₂は、Ｐ、Ａ又は欠失であり、
Ｘ₃は、Ｓ、Ｑ、Ａ、Ｒ又はＹであり、
Ｘ₄は、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ａ又はＳであり、
Ｘ₅は、Ｋ、Ｓ、Ｑ又はＲであり、
Ｘ₆は、Ｍ又はＦであり、
Ｘ₇は、Ｔ、Ｓ、Ｒ、Ｋ又はＱであり、
Ｘ₈は、Ｄ又はＴであり、
Ｘ₉は、Ｓ、Ａ又はＲであり、
Ｘ₁₀は、Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｋ、Ｔ又はＱであり、
Ｘ₁₁は、Ｒ又はＫであり、
Ｘ₁₂は、Ｋ、Ｑ、Ｓ又はＡであり、
Ｘ₁₃は、Ｅ、Ｑ又はＤであり、
Ｘ₁₄は、Ｇ又はＱであり、
Ｘ₁₅は、Ｖ又はＳであり、
Ｘ₁₆は、Ｒ又はＴであり、及び
Ｘ₁₇は、Ｋ又はＲであり、
場合により、Ｎ末端伸長又はＣ末端伸長を有し、
ここで、ポリペプチドは、ヒトＮａｖ１．７活性を、ＩＣ₅₀値が約１×１０^-7Ｍ以下で阻害し、当該ＩＣ₅₀値の測定は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いるＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイを使用して、ヒトＮａｖ１．７を安定発現するＨＥＫ２９３細胞中に２５×１０^-6Ｍの３−ベラトロイルベラセビンが存在する下で行われる、単離プロトキシン−ＩＩ変異体である。

【0043】

一部の実施形態では、Ｎ末端伸長には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４又は３８５のアミノ酸配列が含まれる。

【0044】

一部の実施形態では、Ｃ末端伸長には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６又は３９７のアミノ酸配列が含まれる。

【0045】

一部の実施形態では、Ｎ末端及び／又はＣ末端伸長はプロトキシン−ＩＩ変異体にリンカーを介して結合される。

【0046】

一部の実施形態では、リンカーには、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８３、３９２、３９８、３９９、４００、４０１又は４０２のアミノ酸配列が含まれる。

【0047】

一部の実施形態では、Ｎ末端伸長は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４又は３８５のアミノ酸配列からなる。

【0048】

一部の実施形態では、Ｃ末端伸長は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６又は３９７のアミノ酸配列からなる。

【0049】

一部の実施形態では、リンカーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８３、３９２、３９８、３９９、４００、４０１又は４０２のアミノ酸配列からなる。

【0050】

本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は強力なＮａｖ１．７阻害剤である。組み換え型プロトキシン−ＩＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）は、ベラトリジン誘発脱分極阻害アッセイにおいて、ヒトＮａｖ１．７に対するＩＣ₅₀値が約４×１０^-9Ｍである。このアッセイでは、Ｎａｖ１．７を安定発現する細胞におけるＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）の減少の測定を、ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ機器（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を使用して、実施例３で説明する実験の詳細を用いて行うものである。プロトキシン−ＩＩ変異体が「強力な」Ｎａｖ１．７阻害剤であるのは、前述したアッセイ及び実験３におけるＩＣ₅₀値が約３０×１０^-9Ｍ以下のとき、すなわち組み換え型プロトキシン−ＩＩの１０倍以内のときである。明確にするために、ＩＣ₅₀が３０×１０^-9Ｍは、ＩＣ₅₀が３．０×１０^-8Ｍと同一である。

【0051】

本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体ポリペプチドの生成は、化学合成（例えば固相ペプチド合成）を、自動化されたペプチドシンセサイザー上で行うことによって実施しても良い。代替的に、本発明のポリペプチドを、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから得ることを、無細胞発現系、例えば網状赤血球ライセートベースの発現系を用いることによって行っても良いし、又は組み換え型の発現系によって行っても良い。当業者であれば、本発明のポリペプチドを得るための他の技術を理解するであろう。典型的な方法では、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体の生成は、それをヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）融合タンパク質として発現することであって、グリシン−リッチリンカー、例えば（ＧＧＧＧＳ）₄（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０）又は（ＧＧＧＧＳ）₆（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１）を、プロテアーゼ切断可能リンカー、例えばＨＲＶ３Ｃプロテアーゼに対する認識配列（ヒトライノウイルスからの組み換え型１４３Ｃプロテアーゼ）ＬＥＶＬＦＱＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２）（ＨＲＶ３Ｃリンカー）に結合したものを用いて発現することと、発現された融合タンパク質をＨＲＶ３Ｃプロテアーゼを用いて切断して組み換え型プロトキシン−ＩＩ変異体ペプチドを放出することと、によって行う。ヘキサヒスチジン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８）又は他のタグを用いて、良く知られた方法を用いる精製を容易にしても良い。

【0052】

本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は、本明細書で説明した方法を用いて精製しても良い。典型的な方法では、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体として、ＨＳＡ融合タンパク質として発現され、ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼによって切断されたものを、本明細書で説明する固相抽出（ＳＰＥ）を用いて精製しても良い。

【0053】

任意的にＮ末端及び／又はＣ末端伸長を有するプロトキシン−ＩＩ変異体、並びにプロトキシン−ＩＩ変異体融合タンパク質の生成は典型的に、核酸レベルにおいて実現される。ポリヌクレオチドの合成は、縮重したオリゴヌクレオチドを用いて所望の変異体を生成する米国特許第６，５２１，４２７号及び第６，６７０，１２７号に記載された方法による化学的遺伝子合成を用いても良いし、又は標準的なＰＣＲクローニング及び突然変異誘発によっても良い。変異体のライブラリを標準的なクローニング技術によって生成して、プロトキシン−ＩＩ変異体をコードするポリヌクレオチドを、発現用ベクターにクローニングしても良い。

【0054】

プロトキシン−ＩＩ変異体には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の野生型プロトキシン−ＩＩと比べたときに、更なるＮ−及び／又はＣ末端アミノ酸を取り入れても良く、例えばクローニング及び／又は発現方式によって得られる。例えば、ＨＳＡ−リンカー−ＨＲＶ３Ｃ切断可能なペプチド−プロトキシン−ＩＩ変異体融合タンパク質として変異体の発現後にＨＳＡから切断すると、更なる２つの残基（例えばＧ及びＰ）が各プロトキシン−ＩＩ変異体のＮ末端に取り入れられる場合がある。

【0055】

本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を試験して、本明細書で説明した方法を用いてヒトＮａｖ１．７を阻害するその能力を調べる。例示のアッセイの１つに、Ｎａｖ１．７を安定的に発現する細胞においてＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）の低下を測定するベラトリジン誘導脱分極阻害アッセイがある。別の典型的なアッセイでは、電気生理学的な記録を用いてＮａｖ１．７を介した電流の変化を測定することを、良く知られたパッチクランプ技術を用いて、また本明細書で説明したように行う。

【0056】

本発明の他の実施形態は、単離プロトキシン−ＩＩ変異体であって、アミノ酸配列として、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８３６７、３７０又は３７１を含む単離プロトキシン−ＩＩ変異体である。

【0057】

本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は、ヒトＮａｖ１．７を、ＩＣ₅₀値が約１×１０^-7Ｍ以下、約１×１０^-8Ｍ、約１×１０^-9以下、約１×１０^-10Ｍ以下、約１×１０^-11Ｍ以下、又は約１×１０^-12Ｍ以下で阻害する場合がある。ＩＣ₅₀値の範囲を示す典型的な変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、４０、４４、５２、５６、５６、５９、６５、７８、１０９、１１０、１１１、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６２、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７７、１７８、１７９、１８０、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８９、１９０、１９３、１９５、１９７、１９９、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２２４、２２６、２２７、２３１、２３２、２４３、２４４、２４５、２４７、２４９、２５２、２５５、２５８、２６１、２６３、２６４、２６５、２６６、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３３２、３３４、３３５、３３６、３３７、３３９、３４０、３４１、３４２、３４６、３５１、３５８、３５９、３６４、３６６、３６７、又は３６８に示されるアミノ酸配列を有する変異体である。

【0058】

表２及び表３に示すのは、選択プロトキシン−ＩＩ変異体の配列である。

【0059】

【表2-1】

【0060】

【表2-2】

【0061】

【表3-1】

【0062】

【表3-2】

【0063】

【表3-3】

【0064】

【表3-4】

【0065】

【表3-5】

【0066】

【表3-6】

【0067】

【表3-7】

【0068】

【表3-8】

【0069】

【表3-9】

【0070】

【表3-10】

【0071】

一部の実施形態において、単離プロトキシン−ＩＩ変異体は、ヒトＮａｖ１．７活性を、ＩＣ₅₀値が約３×１０^-8Ｍ以下で阻害する。

【0072】

一部の実施形態において、単離プロトキシン−ＩＩ変異体がヒトＮａｖ１．７活性を阻害するのは、ＩＣ₅₀値が約３×１０^-8Ｍ〜約１×１０^-9Ｍのときである。

【0073】

本発明の他の実施形態は、単離プロトキシン−ＩＩ変異体であって、アミノ酸配列：ＧＰＱＣＸ₁Ｘ₂ＷＸ₃ＱＸ₄₅Ｘ₆Ｘ₇Ｘ₈Ｘ₉ＣＣＸ₁₀Ｘ₁₁ＦＸ₁₂ＣＸ₁₃ＬＷＣＸ₁₄ＫＫＬＷ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０４）を含み、ここで、
Ｘ₁は、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ａ又はＳであり、
Ｘ₂は、Ｋ、Ｓ、Ｑ又はＲであり、
Ｘ₃は、Ｍ又はＦであり、
Ｘ₄は、Ｔ、Ｓ、Ｒ、Ｋ又はＱであり、
Ｘ₅は、Ｄ又はＴであり、
Ｘ₆は、Ｓ、Ａ又はＲであり、
Ｘ₇は、Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｋ、Ｔ又はＱであり、
Ｘ₈は、Ｒ又はＫであり、
Ｘ₉は、Ｋ、Ｑ、Ｓ又はＡであり、
Ｘ₁₀は、Ｅ、Ｑ又はＤであり、
Ｘ₁₁は、Ｇ又はＱであり、
Ｘ₁₂は、Ｖ又はＳであり、
Ｘ₁₃は、Ｒ又はＴであり、及び
Ｘ₁₄は、Ｋ又はＲである。

【0074】

ヒトＮａｖ１．７活性を、ＩＣ₅₀値が約３０×１０^-9Ｍ以下で阻害する典型的なプロトキシン−ＩＩ変異体は、アミノ酸配列として、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６、７８、１１１、１１４、１１７、１１８、１１９、１２２、１２３、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４５、１４６、１４７、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５６、１５８、１５９、１６５、１７２、１７３、１７５、１７７、１７８、１８３、１８４、１８５、１８６、１８９、１９０、１９３、１９７、１９９、２０７、２１０、２１１、２１６、２１７、２２４、２６６、２７３、２８２又は３３５を含む変異体である。

【0075】

一部の実施形態では、単離プロトキシン−ＩＩ変異体はヒトＮａｖ１．７を選択的に阻害する。本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は、組み換え型プロトキシン−ＩＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）と比べたときに、Ｎａｖ１．７に対してより選択性である場合がある。ＱＰａｔｃｈ電気生理学アッセイにおいて、組み換え型プロトキシン−ＩＩは、Ｎａｖ１．７に対するＩＣ₅₀は約２．２×１０^-9Ｍであり、Ｎａｖ１．６に対するＩＣ₅₀は約６２×１０^-9Ｍであり、したがってＮａｖ１．６に対するＩＣ₅₀対Ｎａｖ１．７に対するＩＣ₅₀の比は、約２８倍である。「選択性」又は「選択性の」又は「より選択性の」又は「選択的に遮断する」又は「選択的に阻害する」が、本明細書で用いられる場合に指すのは、プロトキシン−ＩＩ変異体について、Ｎａｖ１．６に対するＩＣ₅₀対Ｎａｖ１．７に対するＩＣ₅₀の比（ＩＣ₅₀（Ｎａｖ１．６）／ＩＣ₅₀（Ｎａｖ１．７））が約３０以上であるということである。Ｎａｖ１．６に対するＩＣ₅₀の分析試験を、ＱＰａｔｃｈ電気生理学アッセイにおいて、Ｎａｖ１．６を安定発現する細胞株を使用して、Ｎａｖ１．７に対して説明したものと同様の方法を用いて行っても良い。

【0076】

選択性を向上させるために突然変異させることができるプロトキシン−ＩＩ内の残基位置には、残基７及び１９、任意的に残基１及び１１、更に任意的に１２、２０、２２及び２６が含まれる（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に従う残基番号付け）。選択性を向上させるための典型的な置換は、Ｙ１Ｑ、Ｗ７Ｑ、Ｓ１１Ｒ、Ｓ１１Ａ、Ｅ１２Ｔ、Ｍ１９Ｆ、Ｖ２０Ｓ、Ｒ２２Ｔ、及びＫ２６Ｒである。選択性が向上した典型的なプロトキシン−ＩＩ変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６、５９、６５、７８、１１１、１１４、１１７、１１８、１１９、１２１、１２２、１２３、１２９、１３０、１３３、１５０、１９０、２１７、２８１、３２４、３２５又は３２６の変異体である。

【0077】

本発明の他の実施形態は、単離プロトキシン−ＩＩ変異体であって、配列：ＧＰＸ₁ＣＱＫＷＭＱＸ₂ＣＤＸ₃Ｘ₄ＲＫＣＣＸ₅ＧＦＸ₆ＣＸ₇ＬＷＣＸ₈ＫＫＬＷ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０５）を含み、ここで、
Ｘ₁は、Ｙ、Ｑ、Ａ、Ｓ又はＲであり、
Ｘ₂は、Ｔ又はＳであり、
Ｘ₃は、Ｓ、Ｒ又はＡであり、
Ｘ₄は、Ｅ、Ｔ又はＮであり、
Ｘ₅は、Ｅ又はＱであり、
Ｘ₆は、Ｖ又はＳであり、
Ｘ₇は、Ｒ又はＴであり、及び
Ｘ₈は、Ｋ又はＲであり、
ここで、プロトキシン−ＩＩ変異体はヒトＮａｖ１．７活性を、ＩＣ₅₀値が約３×１０^-8Ｍ以下で阻害し、ヒトＮａｖ１．７を選択的に阻害する。

【0078】

一部の実施形態において、単離プロトキシン−ＩＩ変異体は、配列：ＧＰＱＣＱＫＷＭＱＸ₁ＣＤＸ₂Ｘ₃ＲＫＣＣＸ₄ＧＦＸ₅ＣＸ₆ＬＷＣＸ₈ＫＫＬＷ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０６）を含み、ここで、
Ｘ₁は、Ｔ又はＳであり、
Ｘ₂は、Ｓ、Ｒ又はＡであり、
Ｘ₃は、Ｅ、Ｔ又はＮであり、
Ｘ₄は、Ｅ又はＱであり、
Ｘ₅は、Ｖ又はＳであり、
Ｘ₆は、Ｒ又はＴであり、及び
Ｘ₇は、Ｋ又はＲである。

【0079】

別の実施形態は、単離プロトキシン−ＩＩ変異体であって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８（ＧＰＱＣＱＫＷＭＱＴＣＤＲＥＲＫＣＣＥＧＦＶＣＴＬＷＣＲＫＫＬＷ−ＣＯＯＨ）のアミノ酸配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一性のアミノ酸配列を含み、ここで、
アミノ酸配列は、残基番号付けがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に従うときに、位置１におけるＱ、位置７におけるＱ、及び位置１９におけるＦを有し、
ポリペプチドは、ヒトＮａｖ１．７活性を、ＩＣ₅₀値が約３０×１０^-9Ｍ以下で阻害し、当該ＩＣ₅₀値の測定は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いるＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイを使用して、ヒトＮａｖ１．７を安定発現するＨＥＫ２９３細胞中に２５×１０^-6Ｍの３−ベラトロイルベラセビンが存在する下で行われ、及び
ポリペプチドはＮａｖ１．７を選択的に阻害する。

【0080】

一部の実施形態において、単離プロトキシン−ＩＩ変異体は遊離Ｃ末端カルボン酸、アミド、メチルアミド又はブチルアミド基を有し、これらは常用の合成方法を介して生成されている。

【0081】

本発明の他の実施形態は、単離融合タンパク質であって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８ ３６７、３７０又は３７１のプロトキシン−ＩＩ変異体を含む単離融合タンパク質である。このような第２のポリペプチドは、良く知られたリーダー若しくは分泌シグナル配列、又は合成配列（例えば、クローニングステップ、又はタグ、例えばヘキサヒスチジンタグ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８）から得られる）であっても良い。このような第２のポリペプチドは、半減期延長部分であっても良い。一実施形態では、単離融合タンパク質には、半減期延長部分に結合された本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体が含まれる。

【0082】

使用できる典型的な半減期延長部分には、良く知られたヒト血清アルブミン、トランスチレチン（ＴＴＲ）、サイロキシン結合グロブリン（ＴＧＢ）、アルブミン結合ドメイン、又はＦｃ若しくはそのフラグメントが含まれる。生物学的に好適なポリマー又はコポリマーを用いても良い、例えばエチレングリコール又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、例えばＰＥＧ５０００又はＰＥＧ２００００、デキストラン、ポリリシン、脂肪酸及び脂肪酸エステル（異なる鎖長の）、例えばラウレート、ミリステート、ステアレート、アラキデート、ベヘネート、オレエート、アラキドネート、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサンニ酸、など、オクタン、又は炭水化物（デキストラン、セルロース、オリゴ−又はポリサッカリド）である。これらの部分は、プロトキシン−ＩＩ変異体ポリペプチドとの直接融合であっても良く、また標準的なクローニング及び発現技術によって生成しても良い。代替的に、良く知られた化学的結合法を用いて、部分を本発明の組み換えにより生成されたプロトキシン−ＩＩ変異体に結合させても良い。

【0083】

別の実施形態では、本発明の融合タンパク質の半減期延長部分はヒト血清アルブミン、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。

【0084】

別の実施形態では、半減期延長部分はプロトキシン−ＩＩ変異体にリンカーを介して結合されている。好適なリンカーは良く知られており、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０又は８１に示される配列を有するリンカーが含まれる。

【0085】

本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を取り入れている典型的な融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１又は１０３のポリペプチド配列を有するものである。

【0086】

更なる部分を取り入れた本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を官能性に対して比べることを、いくつかの良く知られたアッセイによって行っても良い。例えば、ＰＥＧに結合されたプロトキシン−ＩＩ変異体の薬物動態学特性の評価を、良く知られたインビボモデルで行っても良い。

【0087】

更なるプロトキシン−ＩＩ変異体及びプロトキシン−ＩＩ変異体融合タンパク質は、本発明の範囲内である。本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体に対する更なる置換を、結果として得られる変異体又は融合タンパク質が、親ペプチドと比べたときに同様の特徴を保持する限り、行うことができる。典型的な修飾は、例えば同類置換であり、親分子のそれと同様の特徴を有するプロトキシン−ＩＩ変異体になる。同類置換とは、それらの側鎖において関係するアミノ酸のファミリー内で起こるものである。遺伝的にコードされたアミノ酸を次の４つのファミリーに分割することができる。（１）酸性（アスパルテート、グルタメート）；（２）塩基性（リシン、アルギニン、ヒスチジン）；（３）無極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）；及び（４）非帯電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）。フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンはしばしば、芳香族のアミノ酸として一緒に分類される。代替的に、アミノ酸レパートリーは、（１）酸性（アスパルテート、グルタメート）；（２）塩基性（リシン、アルギニンヒスチジン）、（３）脂肪族（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン）、セリン及びトレオニンは任意的に、脂肪族ヒドロキシルとして別個にグループ化される；（４）芳香族（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）；（５）アミド（アスパラギン、グルタミン）；及び（６）含硫（システイン及びメチオニン）（Ｓｔｒｙｅｒ（ｅｄ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２ｎｄ ｅｄ、ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、１９８１）としてグループ化することができる。非同類置換（異なるクラスのアミノ酸間でのアミノ酸残基の置換を伴う）をプロトキシン−ＩＩ変異体に施して、プロトキシン−ＩＩ変異体及びプロトキシン−ＩＩ変異体融合タンパク質の特性を向上させることができる。ポリペプチド又はそのフラグメントのアミノ酸配列の変化が機能的ホモログに至るか否かの判定は、修飾ポリペプチド又はフラグメントが応答を形成する能力の評価を本明細書で説明するアッセイを用いた無修飾ポリペプチド又はフラグメントの場合と同様の方法で行うことによって、容易に実施することができる。ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質（複数の交換が起こる）を同様に容易に試験することができる。

【0088】

本発明の別の実施形態は、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体をコードするポリヌクレオチドを含む単離合成ポリヌクレオチドである。

【0089】

ある典型的な合成ポリヌクレオチドを本明細書で開示したが、他の合成ポリヌクレオチドとして、与えられた発現系において遺伝子コード又はコドン選択の縮重があるならば、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体及びプロトキシン−ＩＩ変異体融合タンパク質をコードするものも、本発明の範囲内である。典型的な合成ポリヌクレオチドは例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２及び１０４に示されるポリヌクレオチド配列（本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体融合タンパク質をコードする）である。当業者であれば、プロトキシン−ＩＩ変異体自体をコードする融合タンパク質におけるポリヌクレオチドセグメントを容易に特定することができる。本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体又は融合タンパク質をコード化する合成ポリヌクレオチド配列は、目的とする宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現を可能にする１又は複数の調節エレメント（例えばプロモーター及びエンハンサ）に動作可能にリンクすることができる。合成ポリヌクレオチドはｃＤＮＡであっても良い。

【0090】

本発明のポリヌクレオチドの生成を、自動化されたポリヌクレオチドシンセサイザー上での化学合成、例えば固相ポリヌクレオチド合成によって行っても良い。あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＣＲに基づく複製、ベクターに基づく複製、又は制限酵素に基づくＤＮＡ操作技術などの他の技術によって生成することもできる。既知の配列のポリヌクレオチドを生成又は取得するための技術が良く知られている。

【0091】

本発明のポリヌクレオチドにはまた、少なくとも１つの非コード配列、例えば転写だが非翻訳配列、終結シグナル、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡ安定化配列、イントロン及びポリアデニル化シグナルが含まれていても良い。ポリヌクレオチド配列は、更なるアミノ酸をコードした更なる配列を含み得る。これらの更なるポリヌクレオチド配列は、例えば、マーカー又は良く知られたタグ配列、例えばヘキサ−ヒスチジン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８）又はＨＡタグ（融合ポリペプチドの精製を容易にする）をコードしても良い。

【0092】

本発明の他の実施形態は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。このようなベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現用ベクター、トランスポゾンベースのベクター、又は任意の他のベクターであって、本発明のポリヌクレオチドを所与の生物又は遺伝的背景に任意手段によって導入することに適したものであっても良い。例えば、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体又はプロトキシン−ＩＩ変異体融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、発現ベクター内に挿入して、発現ベクター内の制御配列に動作可能にリンクして効率的な発現（例えば、シグナル配列、プロモーター（例えば、天然に付随するか又は異種のプロモーター）、エンハンサ要素、及び転写終結配列）を確実にしても良く、また本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体又はプロトキシン−ＩＩ変異体融合タンパク質を発現するように選択された宿主細胞と適合するように選択する。ベクターを適切な宿主内に組み込んだらすぐに、宿主を、組み込んだポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の高レベル発現に適した状態に維持する。

【0093】

好適な発現ベクターは典型的に、エピソームとして又は宿主染色体ＤＮＡの一体部分として宿主生物において複製可能である。一般的に、発現ベクターには、選択マーカー、例えばアンピシリン耐性、ヒグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性又はネオマイシン耐性が含まれ、所望のＤＮＡ配列によって変換された細胞の検出を可能にする。

【0094】

好適なプロモーター及びエンハンサ要素が当該技術分野で知られている。バクテリア細胞における発現の場合、好適なプロモーターには以下が含まれる（但し、これらに限定されない）。ｌａｃｌ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰ、及びｔｒｃ。真核細胞における発現の場合、好適なプロモーターには以下が含まれる（但し、これらに限定されない）。軽及び／又は重鎖免疫グロブリン遺伝子プロモーター及びエンハンサ要素；サイトメガロウイルス前初期プロモーター；単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼプロモーター；初期及び後期ＳＶ４０プロモーター；レトロウイルスからの長末端反復内に存在するプロモーター；マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター；及び種々の当業者に知られた組織特異性プロモーター。イースト菌における発現の場合、好適なプロモーターは、構成的プロモーター、例えばＡＤＨ１ ＰＧＫ１、ＥＮＯ又はＰＹＫ１プロモーターなど、又は調節可能なプロモーター、例えばＧＡＬ１又はＧＡＬ１０プロモーターである。適切なベクター及びプロモーターを選択することは、十分に当業者のレベル内である。

【0095】

多数の好適なベクター及びプロモーターが当業者には知られており、多くが、組み換え構築物を生成するために市販されている。以下のベクターを一例として示す。バクテリア：ｐＢｓ、ファージスクリプト、ＰｓｉＸ１７４、ｐブルースクリプトＳＫ、ｐＢｓ ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）。真核性：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ＰＸＲ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。

【0096】

プロトキシン−ＩＩ変異体又はプロトキシン−ＩＩ変異体融合タンパク質の発現用の典型的なベクターは、以下のものを有するベクターである。アンピシリン耐性選択マーカー、ＣＭＶプロモーター、ＣＭＶイントロン、シグナルペプチド、ネオマイシン耐性、複製のｆ１起点、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、及び本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体又はプロトキシン−ＩＩ変異体融合タンパク質をコードするｃＤＮＡ。

【0097】

本発明の別の実施形態は本発明のベクターを含む宿主細胞である。用語「宿主細胞」は、ベクターが導入されている細胞を指す。当然のことながら、用語宿主細胞は、特定の対象細胞だけでなくそのような細胞の子孫も指すことが意図されている。ある変更が、突然変異又は環境の影響により後世において発生する場合があるため、このような子孫は親細胞と同一でない場合があるが、やはり本明細書で用いる用語「宿主細胞」の範囲に含まれる。このような宿主細胞は、真核細胞、原核細胞、植物細胞又は古細胞であっても良い。

【0098】

大腸菌、バチルス、例えばバチルスズブチルス、及び他の腸内細菌科、例えばサルモネラ菌、セラチア属、及び種々のシュードモナス種は、原核宿主細胞の例である。他の病原菌、例えば酵母菌も発現に対して有用である。サッカロミセス属（例えば、Ｓ．セレビシエ）及びピチアは、好適な酵母菌宿主細胞の例である。典型的な真核細胞は、哺乳類、昆虫、鳥類又は他の動物起源であっても良い。哺乳類真核細胞には、不死化細胞株、例えばハイブリドーマ、又は骨髄腫細胞株、例えばＳＰ２／０（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＣＲＬ−１５８１）、ＮＳ０（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ、ＥＣＡＣＣ Ｎｏ．８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣＣＲＬ−１６４６）及びＡｇ６５３（ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８０）マウス細胞株が含まれる。ヒト骨髄腫細胞株の一例は、Ｕ２６６（ＡＴＴＣ ＣＲＬ−ＴＩＢ−１９６）である。他の有用な細胞株には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、例えばＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｗａｌｒｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣＣＲＬ−６１）、又はＤＧ４４から得られるものが含まれる。

【0099】

ポリヌクレオチド（例えばベクター）を宿主細胞に導入することは、当業者に良く知られた方法によって行うことができる。典型的な方法は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランを介したトランスフェクション、顕微注入法、カチオン性脂質を介したトランスフェクション、及び電気穿孔法である。

【0100】

本発明の別の実施形態は、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を生成するための方法であって、本発明の宿主細胞を提供するステップと、宿主細胞を、本発明の少なくとも１つのプロトキシン−ＩＩ変異体の発現にとって十分な条件下で培養するステップとを含む方法である。

【0101】

宿主細胞の培養は、所与のタイプの宿主細胞を維持又は伝搬するのに適しており、かつポリペプチドを発現するのに十分な、任意の条件下で行うことができる。ポリペプチドの発現にとって充分な培養条件、培地、及び関連する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、多くの哺乳動物の細胞型を、適切に緩衝化したＤＭＥＭ培地を使用して３７℃で好気的に培養することができる一方、細菌、酵母及び他の細胞型は、ＬＢ培地中、適切な雰囲気条件下で３７℃で培養することができる。

【0102】

本発明の方法において、プロトキシン−ＩＩ変異体の発現は、種々の良く知られた方法を用いて確認することができる。例えば、ポリペプチドの発現の確認は、検出試薬を用いて（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ又はＨＰＬＣを用いて）行うことができる。

【0103】

本発明の別の態様は、生体組織におけるＮａｖ１．７の活性を調整する方法である。本方法には、Ｎａｖ１．７を発現する生体組織を、Ｎａｖ１．７調節量の本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体と接触させることが含まれる。

【0104】

治療方法
本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は、痛みの症状又は感覚ニューロン若しくは交感神経ニューロン機能障害の他の疾患を治療するか、低減するか、又は緩和するのが望ましい任意の治療において用いても良い。

【0105】

本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を用いて治療される痛みは、任意のタイプの痛み、例えば慢性の痛み、急性の痛み、神経障害性疼痛、侵害受容性の痛み、内臓痛、背痛、炎症状態に付随する痛み、術後の痛み、熱痛、又は疾患及び変性に付随する痛みであっても良い。

【0106】

本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を用いて治療される痛みは、Ｎａｖ１．７を介した痛みであっても良い。

【0107】

本明細書で使用するところのＮａｖ１．７を介した痛みとは、増大したＮａｖ１．７チャネル活性に少なくとも一部起因する痛みを指す。

【0108】

本発明の方法を用いて任意の分類に属する動物患者を治療することができる。このような動物の例としては、ヒト、齧歯類、イヌ、ネコ、及び家畜などの哺乳動物が挙げられる。

【0109】

痛み及び／又はＮａｖ１．７を介した痛みは、例えば末梢神経障害、中枢神経障害、神経圧迫又は絞扼性神経障害、例えば手根管症候群、足根管症候群、尺骨神経圧迫、圧迫性神経根症、腰部脊柱管狭窄症、坐骨神経圧迫、脊髄根圧迫、肋間神経痛、圧迫性神経根症及び神経根下背部痛、脊髄根損傷、神経炎、自己免疫疾患、一般的炎症、慢性炎症性疾患、関節炎、リウマチ性疾患、狼瘡、変形性関節症、汎胃腸障害、大腸炎、胃潰瘍形成、十二指腸潰瘍、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、下痢に付随する痛み、炎症性眼疾患、炎症性又は不安定膀胱疾患、乾癬、炎症性要素を伴う皮膚疾患、日焼け、心臓炎、皮膚炎、筋炎、神経炎、膠原血管病、炎症性痛覚及び付随する痛覚過敏及び異痛症、神経障害性疼痛及び付随する痛覚過敏及び異痛症、多発性硬化症、脱髄疾患、糖尿病、糖尿病神経障害性疼痛、灼熱痛、切断又は膿瘍に由来する痛み、幻肢痛、骨折痛、骨損傷、直接的外傷、ＨＩＶ感染、後天性免疫不全症候群（「ＡＩＤＳ」）、天然痘感染、ヘルペス感染、毒素又は他の異質粒子又は分子に対する暴露、浸潤癌、癌、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、火傷、先天性欠損症、歯痛、痛風の痛み、線維筋痛、脳炎、慢性アルコール中毒、甲状腺機能低下症、尿毒症及びビタミン欠乏、三叉神経痛、脳卒中、視床症候群、一般的頭痛、片頭痛、群発頭痛、緊張性頭痛、混合血管症候群及び非血管症候群、交感神経依存性疼痛、求心路遮断症候群、ぜんそく、上皮組織損傷又は機能障害、呼吸時の内臓運動能の障害、泌尿生殖器、胃腸又は血管領域、創傷、火傷、アレルギー性皮膚反応、掻痒症、血管運動神経性又はアレルギー性鼻炎、又は気管支疾患、月経困難症、労働及び送達中の痛み、消化不良、胃食道逆流、膵炎、及び臓器痛などの１又は複数の原因に由来し得る。

【0110】

本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体によって緩和される場合がある感覚ニューロン又は交感神経ニューロン機能障害の他の疾患には、痒み、咳、及びぜんそくが含まれる。マウスでは、ＳＣＮ９Ａ遺伝子の全体欠失が生じると、ヒスタミン誘発性そう痒に対する完全無感覚に至る（Ｇｉｎｇｒａｓら、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐａｉｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ａｂｓｔｒａｃｔ ２０１３及び米国特許出願公開第２０１２／０１８５９５６号）。この発見が示唆するのは、ペプチドＮａｖ１．７遮断薬が、痒みの治療において有用な場合があるということである。痛みは種々の原因によって生じる場合がある。例えば皮膚若しくは炎症性疾患；又は炎症性疾患例えば腎臓若しくは肝胆汁性疾患、免疫学的疾患、薬物反応及び未知／特発の状態、例えば、皮膚炎、乾癬、湿疹、昆虫刺症若しくは刺傷である。またＮａｖ１．７は、気道に神経を分布させる感覚神経において発現され（Ｍｕｒｏｉら、Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１１年１２月１日；５８９（Ｐｔ ２３）：５６６３〜７６；Ｍｕｒｏｉら、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ Ｉｎｔｅｇｒ Ｃｏｍｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１３年４月１０日）、このことは、ペプチドＮａｖ１．７遮断薬が、以下の治療において有用であり得ることを示唆している。咳、例えば、急性又は慢性咳、あるいは胃食道逆流疾患からの炎症によって生じる咳、及び気道の炎症性疾患、例えばぜんそく及びアレルギー関連の免疫応答、気管支けいれん、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、気腫、及びしゃっくり（しゃっくり（hiccoughs）、しゃっくり（singultus））。ｓｈＲＮＡを用いてモルモットの節状神経節内のＮａｖ１．７をインビボでサイレンシングすることによって、機械的プロービングによって誘発される咳反射がほぼ停止した（Ｍｕｒｏｉら、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ Ｉｎｔｅｇｒ Ｃｏｍｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１３年４月１０日）。

【0111】

本発明の一態様は、被験対象における痒み、咳、又はぜんそくを緩和又は治療する方法であって、治療効果的な量の本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を、それを必要とする被験対象に、痒み、咳、又はぜんそくを緩和するのに十分な時間、投与することによって行う方法である。

【0112】

本発明の別の態様は、被験対象におけるＮａｖ１．７を介した痒み、Ｎａｖ１．７を介した咳、又はＮａｖ１．７を介したぜんそくを緩和又は治療する方法であって、治療効果的な量の本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を、それを必要とする被験対象に、痒み、咳、又はぜんそくを緩和するのに十分な時間、投与することによって行う方法である。

【0113】

Ｎａｖ１．７を介した痒みが、本明細書で用いられる場合に指すのは、少なくとも部分的にＮａｖ１．７チャネル活性の増加に由来する痒みである。

【0114】

Ｎａｖ１．７を介した咳が、本明細書で用いられる場合に指すのは、少なくとも部分的にＮａｖ１．７チャネル活性の増加に由来する咳である。

【0115】

Ｎａｖ１．７を介したぜんそくが、本明細書で用いられる場合に指すのは、少なくとも部分的にＮａｖ１．７チャネル活性の増加に由来するぜんそくである。

【0116】

本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を試験して、痛み及び／又はＮａｖ１．７を介した痛みの低減又は緩和の効果を調べることを、以下のモデルを用いて行っても良い。本明細書で説明した動物モデル、及び神経障害性疼痛のラット脊髄神経結紮（ＳＮＬ）モデル、カラギーナン誘発異痛症モデル、Ｆｒｅｕｎｄの完全アジュバント（ＣＦＡ）誘発異痛症モデル、熱傷モデル、ホルマリンモデル及びＢｅｎｎｅｔｔモデルなどのモデル、並びに米国特許第２０１１／０１２４７１１号及び米国特許第７，９９８，９８０号に記載された他のモデル。カラギーナン誘発異痛症及びＣＦＡ誘発Ｎａｖ１．７異痛症は炎症性疼痛のモデルである。ベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）モデルは、術後痛、複合性局所疼痛症候群、及び反射性交感神経性ジストロフィーを含む慢性疼痛の動物モデルを提供する。

【0117】

前述の動物モデルのいずれかを用いて、痛み及び／又はＮＡ１．７を介した痛みの治療における本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体阻害剤の有効性を評価しても良い。本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体の有効性を、無治療又はプラシーボ対照に対して比べても良い。付加的に又は代替的に、有効性の評価を１又は複数の既知の鎮痛薬剤に対して行っても良い。

【0118】

本発明によって、Ｎａｖ１．７を介した痛みを本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を用いて治療する方法が提供される。本発明者らによる係属中の出願（米国特許出願第６１／７８１，２７６号）において、Ｎａｖ１．７遮断ペプチドを投与することは、痛みの種々の動物モデルにおける痛みを治療及び／又は緩和するのに効果的であり、文献に開示及び示唆されたこととは反対であることが見出されている。Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤は、過剰発現のＮａｖ１．７を用いるか又は単離ニューロン（血液神経関門が、デシーシング又は高張食塩水注射を通して破壊される）上でのインビトロ細胞培養モデルでは、強力及び／又はＮａｖ１．７に対して選択的であることが示されているが、痛みのインビボ動物モデルでは非効果的であることがこれまで証明されており、有効性が無いことは、ペプチドが血液神経関門を通ることができないことに由来することが報告されている。複数の文献に、疼痛の動物モデルにおける、又は単離神経におけるＮａｖ１．７遮断性ペプチドの有効性の欠如について記載されている。例えば、Ｈａｃｋｅｌら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １０９：Ｅ２０１８−２７、２０１２には、ＰｒｏＴｘ−ＩＩが単離神経における活動電位発火を阻害することは、神経周囲関門（このモデルにおける拡散障壁となる）が危うくならない限り、できないことが記載されている。ＰｒｏＴｘ−ＩＩは、急性及び炎症性痛覚のげっ歯類モデルにおいて非効果的であることが分かっていた。有望な説明によれば、ＰｒｏＴｘ−ＩＩは血液神経関門を横断することはできないと言われていた（Ｓｃｈｍａｌｈｏｆｅｒら、Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ７４：１４７６〜１４８４、２００８）。Ｎａｖ１．７ペプチド毒素遮断薬は経口バイオアベイラビリティが不十分であり、神経終末まで送達するのは難しいことが提言されている。すなわち、それらを治療薬として用いることは限定されている（Ｄｉｂ−Ｈａｊｊら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １４、４９〜６２、２０１３）。

【0119】

Ｎａｖ１．７の発現は、末梢神経系において、例えば、侵害受容後根神経節（ＤＲＧ）において、とりわけ侵害受容小直径ＤＲＧニューロンにおいて、詳細には、皮膚内の末梢端において、脳内表現がほとんどない状態で行われる。Ｎａｖ１．７の分布（例えば感覚神経終末）及び生理機能は、Ｎａｖ１．７が痛覚刺激の伝達に主要な役割を担う素因となっている。

【0120】

本発明の一実施形態は、Ｎａｖ１．７を介した痛みを治療する方法であって、治療効果的な量の本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を、それを必要とする被験対象に、Ｎａｖ１．７を介した痛みを治療するのに十分な時間、投与することによって行う方法である。

【0121】

本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体Ｎａｖ１．７を、Ｎａｖ１．７を介した痛み又は感覚ニューロン若しくは交感神経ニューロン機能障害の他の疾患を治療することが望まれる任意の治療において用いても良い。痛みを「治療する」又は「治療」は、痛みの知覚を防止するか、停止するか、阻害するか、低減するか、又は遅延することを部分的又は完全に含むことが意図されている。

【0122】

一部の実施形態では、Ｎａｖ１．７を介した痛みは、慢性の痛み、急性の痛み、神経障害性疼痛、侵害受容性の痛み、内臓痛、背痛、術後の痛み、熱痛、幻肢痛、又は炎症状態に付随する痛み、肢端紅痛症（ＰＥ）、発作性高度疼痛症（ＰＥＰＤ）、変形性関節症、リウマチ性関節炎、腰部椎間板切除術、膵炎、線維筋痛、有痛性糖尿病性神経障害（ＰＤＮ）、疹後神経痛（ＰＨＮ）、三叉神経痛（ＴＮ）、脊髄損傷若しくは多発性硬化症、又は疾患及び変性に付随する痛みである。

【0123】

神経因性疼痛としては、例えば、有痛性糖尿病性ニューロパチー（ＰＤＮ）、帯状疱疹後ニューロパチー（ＰＨＮ）、又は三叉神経痛（ＴＮ）が挙げられる。神経因性疼痛の他の原因としては、脊髄損傷、多発性硬化症、幻肢痛、脳卒中後痛、及びＨＩＶ関連痛が挙げられる。また慢性的な背痛、変形性関節症、及び癌などの状態は、神経障害性関連の痛みの生成に至る場合があり、したがって潜在的に、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を用いた治療に適している。

【0124】

別の実施形態では、Ｎａｖ１．７を介した痛みは、原発性皮膚紅痛症（ＰＥ）、発作性激痛症（ＰＥＰＤ）、変形性関節症、関節リウマチ、腰椎椎間板切除、膵炎又は線維筋痛症に伴うものである。

【0125】

本発明の方法において、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を第２のポリペプチドに結合して、融合タンパク質を形成しても良い。このような融合タンパク質は、例えば、ペプチド阻害剤の半減期を延長するヒト血清アルブミンに対する良く知られたＦｃ融合又は融合である。結合は、リンカー（例えば、グリシン−セリンリッチリンカー）を介した直接結合であっても良い。このようなリンカーは当該技術分野では周知である。更なる部分を取り入れている本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を、そのＮａｖ１．７遮蔽能力、並びに良く知られた方法及び本明細書で説明した方法を用いて痛みを治療又は低減することにおける有効性に対して比べても良い。

【0126】

本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を用いて治療することができる感覚ニューロン又は交感神経ニューロン機能障害の他の疾患としては、ぜんそく、咳、胸焼け、痒み、皮膚炎、膀胱不安定性、及びＲｅｙｎａｕｄの疾患が挙げられる。

【0127】

医薬組成物
本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は、薬学的に許容される溶媒又は担体中で製剤化されても良い。本発明の一実施形態は、本発明の単離プロトキシン−ＩＩ変異体及び薬学的に許容される添加剤を含む医薬組成物である。

【0128】

適当な溶媒又は担体は、場合により、非経口投与用の組成物において一般的な他の物質を補った注射用蒸留水、生理食塩水又は人工脳脊髄液であってよい。中性緩衝生理食塩水、又は血清アルブミンと混合された生理食塩水は更なる代表的な溶媒である。これらの溶液は無菌であり、粒子状物質を通常含まず、従来の周知の滅菌法（例えば、濾過）によって滅菌することができる。組成物は、ｐＨ調整及び緩衝剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤、及び着色剤などの生理学的条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容される添加剤を含有することができる。適当な溶媒及びそれらの配合及びパッケージングについては、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｓｔ ｅｄ．，Ｔｒｏｙ，Ｄ．ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（２００５）Ｃｈａｐｔｅｒｓ ４０ ａｎｄ ４１）に述べられている。

【0129】

本発明の方法において、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を末梢投与によって投与しても良い。「末梢投与」又は「末梢投与される」とは、中枢神経系の外側において被験対象に薬剤を導入することを意味する。末梢投与には、脊椎又は脳への直接投与以外のあらゆる投与経路が含まれる。

【0130】

末梢投与は局所的又は全身的であってよい。関節、脊髄、手術創、傷害／外傷部位、末梢神経線維、各種臓器（消化器、泌尿生殖器等）又は炎症組織への局所投与などの局所投与を用いることで、治療薬を作用部位に集中させることができる。全身投与では、医薬組成物は被験対象の末梢神経系のほぼ全体に送達されることになり、更に組成物の性質によっては中枢神経系にも送達される可能性がある。

【0131】

末梢投与経路には、これらに限定されるものではないが、局所投与、静脈内又は他の注射、及び埋め込み式ミニポンプ、又は他の持続放出装置若しくは製剤が含まれる。

【0132】

本発明の医薬組成物には、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を持続性又は制御された送達製剤中に含ませる製剤が含まれる。これらの製剤は、以下のものを用いることによって実現しても良い。例えば注射可能な微小球、生物浸食性粒子、マイクロエマルション、ナノ粒子、ナノカプセル、マクロエマルション、高分子化合物（例えばポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）、ポリグリコール酸又はエチレンビニルアセテートコポリマー）、ビーズ又はリポソーム、ヒアルロン酸又は埋め込み可能な薬物送達デバイス。

【0133】

本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は、非経口（皮下、筋肉内、又は静脈内）、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、又は病巣内経路で用いるために；持続放出システムによって若しくは埋め込み装置によって、又は任意の他の投与によって、特に液体溶液又は懸濁液の形態で用いるために；口腔又は舌下投与で用いるために（例えば錠剤又はカプセルの形態で）；又は鼻腔内で用いるために（例えば粉末、点鼻剤、若しくはエアロゾル、又はある特定の薬剤の形態で）；ゲル、軟膏、ローション、クリーム若しくは粉剤、懸濁液若しくはパッチ送達システムの形態で、皮膚構造を変更するか若しくは経皮パッチ中の薬物濃度を増加させる化学的促進剤を用いて、又はタンパク質及びペプチドを含む製剤を皮膚上に塗布することを可能にする（国際特許出願公開第ＷＯ９８／５３８４７号）、若しくは過渡的な輸送経路を形成するために（例えば電気穿孔法）、若しくは皮膚を通る帯電薬剤の可動性を増加させるために（例えばイオン導入法）、電界を印加することを可能にする、又は超音波を印加すること（例えばソノフォレーシス）（米国特許第４，３０９，９８９号及び第４，７６７，４０２号）を可能にする薬剤を用いて、経皮的に用いるために、調製されても良い。組成物は、所望の分子が吸収又は封入された膜、スポンジ、又は別の適当な材料の埋め込みによって局所的に投与することもできる。

【0134】

特定の実施形態では、埋め込み式装置が使用される場合には、該装置は任意の適当な組織又は臓器に埋め込むことができ、所望の分子の送達は、拡散、時限放出ボーラス（timed-release bolus）、又は継続的投与を介してもよい。

【0135】

このような製剤処方における本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体又はＮａｖ１．７の他のペプチド阻害剤の濃度は、大幅に、例えば約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２％から、又は２％〜５％、最大で１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、又は７０％程度（重量で）まで変えることができる。また濃度の選択は、主に流体体積、粘性率、及び選択した特定の投与方法による他の要因に基づいて行う。本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は、貯蔵用に凍結乾燥して、使用前に好適な溶媒中で還元することができる。この技術は、従来のタンパク質調製に対して効果的であることが分かっている。凍結乾燥及び還元技術は当該技術分野において良く知られている。

【0136】

本発明の例示の医薬組成物は、約ｐＨ ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝液、又は約ｐＨ ４．０〜５．５の酢酸塩緩衝液を含んでよく、ソルビトール、スクロース、Ｔｗｅｅｎ−２０、及び／又はこれらの適当な代用物を更に含んでよい。

【0137】

適切な治療効果的な用量は、当業者であれば容易に決定することができる。有効な用量は、望ましい結果をもたらすのに十分な量又は用量、すなわち任意の疼痛医学的状態に付随する痛みの知覚を部分的若しくは完全に防止し、停止し、阻害し、低減し、又は遅延するのに十分な量又は用量を指す。有効な量は、特定の溶媒及び選択された本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体に応じて変わっても良く、また治療すべき被験対象及び痛みの重大性に関係する種々の要因及び状態に依存している。例えば、本発明の医薬組成物を投与すべき被験対象の年齢、体重、及び健康状態などの要因、並びに前臨床動物研究において得られる用量反応曲線及び毒性データが、考えられるものの中に入る。決定された用量は、必要ならば、治療期間中に医師又は他の当業者（例えば、看護士、獣医、又は獣医技師）によって適切に選択された適切な時間間隔で繰り返すことができる。所与の薬剤の有効量又は治療上の有効量の決定は、当業者の能力の範囲内である。

【0138】

したがって、筋肉注射用の本発明の医薬組成物を、１ｍＬの殺菌した緩衝水、及び約１ｎｇ〜約１００ｍｇ、約５０ｎｇ〜約３０ｍｇ、又は約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を含むように調製することができる。同様に、静脈内注射用の本発明の医薬組成物を、約２５０ｍＬの殺菌したＲｉｎｇｅｒの溶液及び約１ｍｇ〜約３０ｍｇ又は約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を含むように調製することができる。非経口投与が可能な組成物を調製するための実際の方法は良く知られており、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ」、１５ｔｈ ｅｄ．、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡにより詳細に説明されている。

【0139】

次に、本発明を以下の特定の非限定的な実施例を参照して説明する。

【実施例】

【0140】

実施例１：プロトキシン−ＩＩ変異体の設計及び生成
プロトキシン−ＩＩ単一位置限定アミノ酸スキャニングライブラリ置換は、選択性、ペプチド収率、及び同質性をどの程度まで向上させることができるかを評価するために設計された。

【0141】

プロトキシン−ＩＩ変異体を、ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ切断可能なＨＳＡ融合タンパク質として以下のＮ末端からＣ末端までのフォーマットで設計した。すなわち、６ｘＨｉｓ−ＨＳＡ−リンカー−ＨＲＶ３Ｃ切断可能なペプチド−プロトキシン−ＩＩ変異体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８として開示された「６ｘＨｉｓ」）。リンカーは（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０であり、ＨＳＡは配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６を有し、ＨＲＶ３Ｃ切断可能なペプチドは配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２を有する）。各プロトキシン−ＩＩ変異体は、ＨＳＡから切断した後に、切断部位からの残りのＮ末端ＧＰを有していた。

【0142】

変異体の特徴付けを、ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａを用いる膜脱分極アッセイにおいて、実施例３のＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａメンブレン脱分極アッセイで説明したように、またＱＰａｔｃｈアッセイを用いた全細胞パッチクランプ実験において、実施例３で説明したように行った。

【0143】

天然ペプチドと比較して更に向上した有効性及び選択性プロファイルを有するＮａｖ１．７アンタゴニストを生成する目的で、選択された単一位置ヒット化合物の相加的効果について試験するためのコンビナトリアルライブラリーを設計した。

【0144】

発現ベクターの構造
設計されたプロトキシン−ＩＩ変異体遺伝子の生成を、米国特許第６，５２１，４２７号に記載された合成遺伝子組み立て技術を用いて行った。設計されたペプチド変異体のアミノ酸配列をＤＮＡ配列に逆翻訳することを、ヒトの高頻度コドンを用いて行った。各変異体遺伝子のＤＮＡ配列を、ＤＮＡクローニング部位を含むベクターＤＮＡと共に、一部が縮重コドンを含む複数のオリゴヌクレオチドとして合成し、これらを完全長のＤＮＡフラグメントに組み立てた。組み立てられたＤＮＡフラグメントをＰＣＲにより増幅した後、ＰＣＲ産物をプールとしてクローニングした。プールしたＰＣＲ産物を、適切な制限酵素を用いて消化し、クローニングして設計した発現ベクターにすることを、各毒素変異体遺伝子をベクター内に含まれるシグナルペプチド及び融合パートナ（６ｘＨｉｓ−ＨＳＡ−リンカー−ＨＲＶ３Ｃ切断可能なペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８として開示された「６ｘＨｉｓ」）に融合するようにして行った。標準的な分子生物学の手法を用いて、それぞれの設計した変異体について陽性クローンを特定した。これらの陽性クローンからのプラスミドＤＮＡを精製して、配列確認することを、プロトキシン−ＩＩペプチド変異体融合タンパク質を標準的な方法を用いて発現する前に行った。

【0145】

タンパク質発現
ＨＥＫ ２９３−Ｆ細胞を２９３ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ＃１２３３８）内に保持して、分割することを細胞濃度が１．５〜２．０×１０⁶細胞／ｍＬのときに行った。細胞の培養を、懸濁液中で、１２５ＲＰＭで振りながら、加湿培養器（３７℃及び８％ ＣＯ₂に設定）内で行った。ＨＥＫ ２９３Ｆ細胞を、ＤＮＡ／脂質複合体を用いて一過性にトランスフェクトすることを、それを１．０×１０⁶細胞／ｍＬに希釈した後に行った。複合体を生成するために、トランスフェクションのｍＬ当たり１．２５μｇのＤＮＡを、１．０ｍＬのＯｐｔｉＰｒｏ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ ＃ １２３０９）に希釈し、１．２５ｍＬのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）Ｍａｘトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ ＃ １６４４７）を、１．０ｍＬのＯｐｔｉＰｒｏ培地に希釈した。ＤＮＡ及び最大トランスフェクション試薬を一緒に混合して、１０分間室温で保温することを、細胞に添加する前に行った。トランスフェクトされた細胞を、加湿培養器（３７℃及び８％ ＣＯ₂に設定）内に４日間置くことを、１２５ＲＰＭで振盪しながら行った。上澄みを細胞から分離することを、遠心分離によって５、０００×ｇにおいて１０分間行い、０．２μｍフィルタ（Ｃｏｒｎｉｎｇ；Ｃａｔ ＃４３１１５３）を通して濾過した後に、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ １０Ｋ（Ｃａｔ ＃ＵＦＣ９０１０９６）を使用して、３、７５０×ｇで約１０分間遠心することによって行った。

【0146】

実施例２：プロトキシン−ＩＩ変異体の精製
プロトキシン−ＩＩ変異体を、実施例１に示したＨＳＡ融合タンパク質として発現して、プロトキシン−ＩＩ変異体ペプチドをＨＲＶ３Ｃプロテアーゼによって切断することを、精製前に行った。２つの方法を、プロトキシン−ＩＩ変異体の効率的な精製に対して試験した。

【0147】

タンパク質の精製
ＲＰ−ＨＰＬＣによるプロトキシン−ＩＩ変異体の精製
分泌タンパク質を発現上澄みから精製することを、１ｍＬのＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃａｔ＃ １７−５２４７−０１）を用いるＩＭＡＣを介して行った。このクロマトグラフィー法は、ＡＫＴＡ Ｘｐｒｅｓｓを使用して行い、イミダゾールの段階的勾配を利用してタンパク質を溶出した。ピーク分画をプールして、一晩中消化することをＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（１μｇプロテアーゼ／１５０μｇ融合）を用いて行った。

【0148】

切断されたペプチド融合プールを更に精製することを、逆相Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５μｍ Ｃ１８（２）カラム（Ｃａｔ＃ ００Ｂ−４２５２−Ｐ０−ＡＸ）を有するＤｉｏｎｅｘＨＰＬＣシステムを用いて行った。サンプルをカラムから溶出することを、０〜６８％アセトニトリル（０．０５％ ＴＦＡ）直線勾配を用いて行った。溶出画分をプールして、一晩中凍結乾燥し、ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水、ｐＨ ７．４（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭグルコース、２ｍＭ ＣａＣｌ₂、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂）中で還元した。

【0149】

表４に示すのは、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製されたプロトキシン−ＩＩ変異体の収率である。平均ｍｇ収率／Ｌは０．０１６１５であった。

【0150】

【表4】

【0151】

固相抽出（ＳＰＥ）によるプロトキシン−ＩＩ変異体の精製
分泌タンパク質を発現上澄みから精製することを、１ｍＬのＨｉｓＴｒａｐＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃａｔ＃ １７−５２４７−０１）を用いるＩＭＡＣを介して行った。このクロマトグラフィー法は、ＡＫＴＡ Ｘｐｒｅｓｓを使用して行い、イミダゾールの段階的勾配を利用してタンパク質をカラムから溶出した。ピーク分画をプールして、一晩中消化することをＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（１μｇプロテアーゼ／１５０μｇ融合）を用いて行った。切断されたサンプルを、５０ｋＤａ分子量カットオフ遠心フィルタユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＵＦＣ８０５０９６）内に充填して、切断されたペプチドを濾液分画内に収集した。

【0152】

ペプチドプールを９６−ウェルの固相抽出ブロック（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｏｎｄ Ｅｌｕｔ Ｐｌｅｘａ Ａ３９６９０３０）に充填して、更なる精製、脱塩、及び濃縮を行った。ブロックを真空マニフォールド（Ｗｈａｔｍａｎ）とともに用いた。ペプチドサンプルを水中の０．０５％ ＴＦＡに充填及び洗浄して、水中の０．０５％ ＴＦＡを用いたアセトニトリルの段階的勾配を用いて溶出した。溶出画分を次に、一晩中凍結乾燥して、ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水、ｐＨ ７．４（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣ、５ｍＭグルコース、２ｍＭ ＣａＣｌ₂、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂）中で還元した。

【0153】

ペプチドを還元することを、補ったＨＥＰＥＳ緩衝食塩水、ｐＨ ７．４（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣ、５ｍＭグルコース、２ｍＭ ＣａＣｌ₂、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂）中で行って、吸光度の測定を２８０ｎｍで行った。濃度値を次に計算することを、各サンプルの吸光度係数を用いて行った。２μｇの各ペプチドをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ １５ウェルゲル上に充填して、ＭＥＳ緩衝液（無希釈）中で実行した。

【0154】

サンプルの分析を、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣ上で、０．０５％ ＴＦＡ直線勾配中の４〜８０％アセトニトリルを用いて、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８（２）分析カラム（Ｃａｔ＃００Ａ−４０４１−Ｂ０）を用いて行った。すべてのペプチドの濃度を規格化して、それぞれの１０μＬを全部で１．３μｇ／サンプルに対して注入した。吸光度を２２０ｎｍにおいてモニタして、クロマトグラム分析をＣｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウェアを用いて行った。

【0155】

表５に示すのは、ＳＰＥによって精製されたプロトキシン−ＩＩ変異体の収率（ｍｇ）である。平均ｍｇ収率／Ｌは０．０５３５３であった。

【0156】

ＳＰＥ精製プロセスの効果は、精製の容易性及びスループット（なぜならば、サンプルの処理は９６−ウェルブロック内で並行して行われ、ＲＰ−ＨＰＬＣ上で順次に行われるわけではないので）並びに収率の向上である。ＲＰ−ＨＰＬＣの場合と比べて、ＳＰＥによって精製された変異体の収率（ｍｇ／Ｌ）は、平均して３倍超高かった。

【0157】

【表5-1】

【0158】

【表5-2】

【0159】

実施例３：プロトキシン−ＩＩ変異体の特徴付け
選択プロトキシン−ＩＩ変異体を膜脱分極及び全細胞パッチクランプアッセイにおいて特徴付けて、その効能及びＮａｖ１．７に対する選択性を評価した。

【0160】

ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａメンブレン脱分極アッセイ
生成されたペプチドが、Ｎａｖ１．７作動薬ベラトリジン（３−ベラトロイルベラセビン；Ｂｉｏｍｏｌ、Ｃａｔａｌｏｇ＃ ＮＡ１２５）によって誘発される膜脱分極を阻害する能力を測定することを、ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ上のＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）アッセイを使用して、ＤＩＳＢＡＣ２（３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋ１０１８）を電子受容体として、ＰＴＳ１８（トリナトリウム８−オクタデシルオキシピレン−１，３，６−トリスルホネート）（Ｓｉｇｍａ）をドナーとして用いて、ドナーを３９０〜４２０ｎｍで励起して、ＦＲＥＴを５１５〜５７５ｎｍで測定することによって、行った。

【0161】

ヒトＮａｖ１．７を安定発現するＨＥＫ２９３細胞を培養することを、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（１：１）において行った。培地には、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、４００μｇ／ｍＬジェネティシン、及び１００μＭ ＮＥＡＡ（試薬はすべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）を補った。５０μＬの採取細胞の平板培養を、２５，０００細胞／ウェルで、ポリ−リシンコーティングされた３８４−ウェルの黒色透明な下部プレート内で行った。プレートを室温（ＲＴ）に保温することを１５分行った後に、３７℃に一晩中保温した。保温はすべて、特に明記しない限りは暗所で行った。翌日、ウェルを４時間洗浄することをアッセイ緩衝液（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＫＣ、２ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２ｍＭ ＣａＣｌ₂、５ｍＭグルコース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．４）を用いて行い、２５μＬのアッセイ緩衝液に再懸濁した。ＰＴＳ１８色素の２ｘストック（６μＭ）の調製を、ＤＭＳＯ中の１０％プルロニックＦ１２７に色素を１：１（ｖ／ｖ比）で懸濁することによって行った。２５μＬの２ｘＰＴＳ１８ストックをウェル内に添加して、細胞を染色することを３０分間室温で行った後に、色素をアッセイ緩衝液を用いて洗い流した。ペプチドを、最終濃度の３倍の濃度で、アッセイ緩衝液（１０μＭ ＤＩＳＢＡＣ２（３）及び４００μＭ ＶＡＢＳＣ−１を含む）中に懸濁し、背景蛍光を抑制した（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ＃ ２０１９８７）。２５μＬ／ウェルの懸濁されたペプチドを各ウェルに添加して、６０分間室温で保温した。脱分極を誘発することを２５μＭの最終濃度のベラトリジンによって（２５μＬ／ウェルの７５μＭ（３ｘ）ストック溶液を添加することによって）行い、ＦＲＥＴ色素蛍光の平均強度の減少の測定を、作動薬を添加した後に３０〜１００秒行った。各測定済みペプチドの１．３Ｘ希釈を、慣例によりベラトリジンを添加した後に行った。ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａアッセイの開始時の濃度を報告する。

【0162】

合成プロトキシン−ＩＩ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）の濃度反応曲線を各実験シリーズにおいて構成して、対照として用いた。各ウェルに対する蛍光カウントを％応答に変換することを、シグナルを、陰性対照（作動薬ベラトリジン単独に対応する）値と陽性対照（１０μＭテトラカインの存在下でのベラトリジンに対応する）値との差に対して規格化することによって行った。測定を行うため、ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａの「空間均一性補正」（すべての蛍光トレースを平均初期開始強度に対して規格化する）及び「バイアス値を減ずる」（初期開始強度を各トレースから減ずる）を、オンした。各データポイントは個々のウェルにおける応答を表わしていた。すべての個々のデータポイントを非線形最小二乗法フィッティングにおいて用いて、Ｈｉｌｌ関数に対するベストフィットを求めることを、Ｏｒｉｇｉｎ（Ｍｉｃｒｏｃａｌ）を用いて行った。ＩＣ₅₀値を、結果としての近似曲線から抽出した。陽性（Ｐ）及び陰性（Ｎ）対照の平均応答を用いて、ウェルにおける％応答の計算を以下のように行った：％応答＝１００＊（Ｎ−Ｒ）／（Ｎ−Ｐ）。

【0163】

アッセイプレートは、その日に対する対照アンタゴニストの効能がその履歴平均の±０．５対数単位内である場合に容認した。

【0164】

ＱＰａｔｃｈアッセイ
ヒトＮａｖ１．５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５）、Ｎａｖ１．７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９）、又はＮａｖ１．６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０７）を安定発現するＨＥＫ２９３細胞を培養することを、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（１：１）において行った。培地には、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、４００μｇ／ｍＬジェネティシン、及び１００μＭ ＮＥＡＡ（試薬はすべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手）を補った。細胞を３７℃及び５％ ＣＯ２に保持して、５０〜９０％密集度に達した時点で分析試験を行った。テトラサイクリン誘導可能な方法（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０７）でヒトＮａｖ１．６を安定発現するＣＨＯ細胞の培養を、ＨＡＭｓ Ｆ１２において行った。ＨＡＭｓ Ｆ１２には、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１０μｇ／ｍＬ Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ、及び４００μｇ／ｍＬ Ｚｅｏｃｉｎを補った。細胞を３７℃及び５％ ＣＯ２に保持して、約５０〜９０％密集度に達した時点で分析試験を行った。Ｎａｖ１．６発現を１μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを用いて誘発することを、実験の２４〜４８時間前に行った。

【0165】

ＱＰａｔｃｈ ＨＴ（Ｓｏｐｈｉｏｎ）において試験する前に、細胞を最初に解離することを０．０５％トリプシンを用いて行い（５分間、３７℃で）、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に再懸濁し、ゆるやかに粉砕して細胞集塊をバラバラにした。細胞密度を１〜２×１０⁶／ｍＬに調整することを同じ培地を用いて行い、細胞をＱＰａｔｃｈ ＨＴの細胞「ホテル」に移して、数時間にわたって実験に用いた。ギガオームシール形成及び全細胞パッチクランプ記録用に、細胞外溶液は、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣ、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２ｍＭ ＣａＣｌ₂、５ｍＭグルコース、及び１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．４及び浸透圧モル濃度＝３１５ｍＯｓｍ）を含むものとした。細胞内液は、１３５ｍＭ ＣｓＦ、１０ｍＭ ＣｓＣｌ、５ｍＭ ＥＧＴＡ、５ｍＭ ＮａＣｌ及び１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．３、浸透圧モル濃度＝２９０ｍＯｓｍ）を含むものとした。アッセイで用いた電圧プロトコルは以下のとおりである。保持電位が−７５ｍＶ（Ｎａｖ１．７）、−６０ｍＶ（Ｎａｖ１．６）、又は−１０５ｍＶ（Ｎａｖ１．５）から、細胞を最初に−１２０ｍＶに２秒間過分極化してから、０ｍＶに５ｍｓ脱分極させた後、保持電位に戻した。このプロトコルを、液体供給時に６０秒毎に１回繰り返した（下記参照）。細胞は、その他の場合には、前述の電圧プロトコルが実行されなかったときに保持電位に保持した。全細胞記録構成を設定する際、細胞外溶液を全部で５回供給すること（すべて、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含み、試験化合物がある場合もない場合もあり、但し最後の供給では１μＭ ＴＴＸ又は１０ｍＭリドカインを陽性対照として含んでいた）を、記録中の細胞上で行った。最初の液体供給には対照緩衝液（５μＬ）のみが含まれていた。供給の５秒後、電圧プロトコルを１０回（全体で１０分間の長さ）行った。次の３回の液体供給（各５μＬ）には、試験化合物（３回の供給すべてに対して同じ化合物を同じ濃度で）又は対照緩衝液（対照細胞に対してのみ）が含まれていた。これらの供給のそれぞれの５秒後、電圧プロトコルを再び１０回行った（やはり毎分１回）。最後の供給には陽性が含まれており（３回の１０μＬ副供給からなり、それぞれ２秒間離した）、５秒後に同じ電圧プロトコルを２回実行してベースライン電流を得た。電流を２５ｋＨｚでサンプリングし、８極Ｂｅｓｓｌｅフィルタにより５ｋＨｚでフィルタリングした。直列抵抗の補償レベルを８０％に設定した。各細胞に対して、最初の４回の液体供給における各電流トレースの０ｍＶにおけるピーク電流振幅を、陽性対照の存在下での最後のトレースのピーク電流振幅から最初に差し引いた後に、最初の（対照緩衝液）供給における最後のトレースのピーク電流振幅に対して、阻害率（％）として規格化した。電流のランダウン（rundown）について調整するため、試験化合物の存在下における各細胞のこの（阻害率（％）の）値を、同じ実験中の対照（通常５〜６個の）細胞の平均の阻害率（％）の値に対して更に規格化した。最後の化合物供給における最後の２つのこのような値の平均（すなわち、試験化合物の各濃度に対する補正された阻害率（％）値）を、試験した特定の化合物濃度における各細胞に対する％阻害値として取った。各化合物濃度において試験したすべての細胞に対する阻害率（％）値を平均化して、濃度応答計算において用いた。実験はすべて、室温（約２２℃）で行った。データは平均±標準誤差として表されている。野生型プロトキシン−ＩＩは各実験において陽性対照として含めた。データは、プロトキシン−ＩＩの効能がその履歴平均の±０．５対数単位内である場合にのみ容認した。

【0166】

ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａを用いて得られた選択プロトキシン−ＩＩ変異体に対するＮａｖ１．７のＩＣ₅₀値を表６に示す。

【0167】

【表6-1】

【0168】

【表6-2】

【0169】

選択プロトキシン−ＩＩ変異体を、ヒトＮａｖ１．５に対する選択性に対して試験することを、ＱＰａｔｃｈを用いて行った。選択ペプチドに対するＮａｖ１．７及びＮａｖ１．５の両方のＩＣ₅₀値を、表７に示すＱＰａｔｃｈを用いて得た。

【0170】

【表7】

【0171】

実施例４：組み合わせプロトキシン−ＩＩ変異体の生成及び特性評価
いくつかのアプローチを用いて天然ペプチドと比較して更に改善された有効性及び選択性プロファイルを有するＮａｖ１．７アンタゴニストを生成する目的で、選択された一位置ヒット化合物の相加的効果について試験するために、コンビナトリアルライブラリーを設計した。

【0172】

限定アミノ酸スキャンを全ての非システインプロトキシン−ＩＩ位置において行うことを、多様化のためにＡ、Ｄ、Ｑ、Ｒ、Ｋ及びＳを用いて行った。これらの実験において、プロトキシン−ＩＩを発現して、一価のＦｃ融合タンパク質として試験することを、実施例１で説明したように行った。このスキャンから、結果として得られる変異体の効能及び／又は選択性を向上させた置換Ｙ１Ｑ、Ｗ７Ｑ、Ｓ１１Ａが特定された。

【0173】

位置Ｍ６及びＭ１９における全アミノ酸スキャン（ｃｙｓ及びｔｒｐを除く）も行った。このスキャンから、結果として得られる変異体の効能及び／又は選択性を向上させたＭ１９Ｆ置換が特定された。

【0174】

プロトキシン−ＩＩ／フエントキシン−ＩＶ単一位置キメラを双方向的に設計した。このライブラリの目的は、野生型プロトキシン−ＩＩの効能及び選択性プロファイルを保持したプロトキシン−ＩＩ変異体を得ることであり、フエントキシン−ＩＶに付随する有用なリフォールディング特性を実現するであろう。置換Ｒ２２Ｔ及びＥ１２Ｎがこのスキャンから特定された。

【0175】

ペプチドＮＶ１Ｇ１１５３を更に設計することを、Ｒ、Ｋ、Ｔ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｑ及びＳを用いた限定アミノ酸スキャンによって位置Ｙ１を多様化することによって、また電荷クラスタエンジニアリングによって行い、ペプチドの三次元構造内のすべての荷電残基組（Ｄ１０／Ｅ１２、Ｋ４／Ｅ１７、Ｄ１０／Ｅ１２／Ｒ１３）を突然変異させた。

【0176】

作用部位に対するペプチド分布を改善し、かつ結果として得られるペプチドの分子量を著しく増加させることなくペプチドの半減期を改善することを目的として、Ｎ−及びＣ末端伸長を選択ペプチド（例えば、ＮＶ１Ｇ１１５３）に導入した。使用したＮ−及びＣ末端伸長は表８及び９にそれぞれ示されており、また、Ｏｉら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４３４、２６６〜２７２、２００８；Ｗｈｉｔｎｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１１ ２９：４、３５２〜３５６；Ｓｏｃｋｏｌｏｓｋｙら、（２０１２）１０９：４０、１６０９５〜１６１００に記載されている。細胞透過性ペプチドＨＩＶ Ｔａｔ及びポリアルギニンも用いた。種々のリンカーを用いて、プロトキシン−ＩＩ変異体をＮ−及び／又はＣ末端伸長に結合させた。使用したリンカーを表１０に示す。

【0177】

各キャンペーンからのプロトキシン−ＩＩ変異体を試験してＮａｖ１．７に対するそれらの効能及び選択性を調べることを、実施例３に説明した方法を用いて行った。Ｎａｖ１．７をＩＣ₅₀値が２００ｎｍ以下で阻害した変異体のアミノ酸配列を表３に示す。表１１に示すのは、野生型プロトキシン−ＩＩと比べたときの選択変異体におけるアミノ酸置換、及びＦＬＩＰＲ ＴｅｔｒａアッセイにおけるＮａｖ１．７阻害のＩＣ₅₀値である。

【0178】

【表8】

【0179】

【表9】

【0180】

【表10】

【0181】

【表11-1】

【0182】

【表11-2】

【0183】

【表11-3】

【0184】

【表11-4】

【0185】

【表11-5】

【0186】

【表11-6】

【0187】

【表11-7】

【0188】

【表11-8】

【0189】

【表11-9】

【0190】

野生型プロトキシン−ＩＩがＮａｖ１．７を、ＦＬＩＰＲアッセイにおいてＩＣ₅₀値が約４ｎＭで阻害することは、実施例３で説明した通りである。著しいＮａｖ１．７効能を保持する変異体を更に特徴付けた。図１に示すのは、Ｎａｖ１．７を、ＩＣ₅₀値が３０ｎＭ以下で阻害する、生成されたプロトキシン−ＩＩ変異体の配列属である。

【0191】

選択プロトキシン−ＩＩ変異体を試験して、そのＮａｖ１．７の阻害及びそのヒトＮａｖ１．６に対する選択性を調べることを、ＱＰａｔｃｈを用いて行った。ＱＰａｔｃｈを用いて得られた選択ペプチドに対するＮａｖ１．７及びＮａｖ１．６の両方に対するＩＣ₅₀値を、図２に示す。これらのペプチドはＮａｖ１．７をＩＣ₅₀が３０ｎＭ以下で阻害し、Ｎａｖ１．６と比べたときにＮａｖ１．７に対して少なくとも３０倍の選択性があった。

【0192】

図２に示すペプチドのアミノ酸配列を図３に示す。これらのペプチドはすべて、野生型プロトキシン−ＩＩと比べたときに、Ｗ７Ｑ及びＭ１９Ｆ置換を有していた。

【0193】

プロトキシン−ＩＩ変異体を発現して精製することを実施例１で説明したように行うか、又は標準的な固相合成方法によって合成した。組み換え型又は合成ペプチドの収率を野生型プロトキシンの収率と比べた。表１２には、選択プロトキシン−ＩＩ変異体の収率がプロトキシン−ＩＩの収率よりも著しく高いことが示されており、変異体の折り畳み特性の向上が示されている。固相合成のスケールは０．５ｍｍｏｌであった。

【0194】

【表12】

【0195】

実施例５：プロトキシン−ＩＩ変異体は痛みのインビボモデルにおいて効率的である。
材料及び方法
動物 雄性Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（２４〜２６ｇ）（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから発注、別個に収容）を、この研究で用いた。

【0196】

行動試験
Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ Ｔｅｓｔ：機械的（触覚）閾値の評価を、Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ Ｈａｉｒｓによって、上下法（Ｄｉｘｏｎ、１９８０、Ｃｈａｐｌａｎら、１９９４）に従って行った。７つの段階的な刺激（ｖｏｎ Ｆｒｅｙ繊維：０．０３、０．０７、０．１６、０．４、０．６、１、２ｇ；Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ，Ｗｏｏｄ Ｄａｌｅ，ＩＬ）を用いた。Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ毛を後足上の中央の足底領域（骨隆起の間）に対して垂直に与えた。十分な力を印加して、フィラメントをわずかに曲げて、３秒間保持した。Ｃｈａｐｌａｎの論文に従って、肯定応答は、繊維を取り除いたときに、１）急に逃避するか又は２）即座に後ろへ下がることとすることができる。より詳細は、Ｃｈａｐｌａｎらを参照のこと。マウスを試験室内のワイヤメッシュに順応させることを、試験前に３０〜６０分間行った。

【0197】

Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験：変更されたＨａｒｇｒｅａｖｅｓ ｂｏｘを用いて、熱足逃避潜時（ＰＷＬ）を測定した（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓら、１９８８、Ｐａｉｎ、３２：７７〜８８；Ｄｉｒｉｇら、１９９７、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７６：１８３〜１９１）。このボックスは、ガラスの高床が一定温度（２７℃）に維持されたチャンバーからなる熱侵害刺激はガラス表面下方の投影電球光線から発生する。光線を骨隆起（中央の足底）間の領域に向ける。「開始」ボタンによって光をオンしてタイマを開始する。刺激を受けた足に動き（例えば突然の逃避）があると、スイッチがトリガされて光がオフしタイマが停止する。潜時（秒）が表示される。動きが起きない場合、電球は２０秒（カットオフ）後にオフして、組織傷害を防止する。動物は、ＰＷＬ測定前の３０〜６０分間、ガラス表面上で慣れさせた。一定アンペア数を研究の全体に渡って用いた結果、予備試験の足逃避潜時において８〜１２秒となった（少なくとも５分間離して行った３〜６回の読み取りに対して平均化）。

【0198】

ＭＰＥ％計算：パーセント最大可能効果（ＭＰＥ％）＝（Ｔ₁−Ｔ₀）／（Ｔｃ−Ｔ₀）×１００％。Ｔ₀：０日目の閾値（ＣＦＡ後、ポンプ前）；Ｔ₁：ポンプ埋め込み後、１日目の閾値；Ｔｃ：試験のカットオフ（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験では２０秒、Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験では２ｇ）。

【0199】

ホットプレート試験：動物を、２５ｃｍ×２５ｃｍ（１０”×１０”）金属プレートを４つのプレキシグラス壁（３８センチメートル（１５インチ）高さ）で囲んだものの上に置いた。プレートを５０又は５５℃の温度に維持した。反応潜時（動物が最初にその後ろ足を後ろへ下げるか若しくは舐める、飛び上がる、又は声を出すときの時間）を測定して、動物をプレートから取り除いた。応答を示さない動物を、４０秒後（５０℃）又は２０秒（５５℃）後にプレートから取り除いて、起こり得るわずかな組織損傷も防止した。このトライアルを、１日に１５〜６０分毎に２〜５回繰り返した。

【0200】

炎症性痛覚モデル
ＣＦＡモデル：動物への麻酔をイソフルラン（４％導入及び２％維持）を用いて行い、２０μＬの１００％Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ（ＣＦＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を一方の後足上の中央の足底領域に注射することを、２７ゲージ針が取り付けられた５０μＬ Ｈａｍｉｌｔｏｎ注射器を用いて行った。

【0201】

Ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎモデル：動物への麻酔をイソフルラン（４％導入及び２％維持）を用いて行い、２５μＬの２％λ−カラギーナン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を生理食塩水中に溶解したものを、後足上の中央の足底領域に注射することを、インスリン注射器（ＢＤ；Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）を用いて行った。

【0202】

ミニポンプの埋め込み
Ａｌｚｅｔマイクロオスモティックミニポンプ（Ｄｕｒｅｃｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｍｏｄｅｌ１００３Ｄ及び２００１Ｄ）を、製造業者のガイドに従って充填して呼び水を入れた。マウスにイソフルランを用いて麻酔した（５％誘導；２％維持）。マウスの背中を剃毛し、イソプロピルアルコール及びポビドンヨードで拭き、肩甲骨の間に小さい切開を行った。一対のピンセット又は止血鉗子を用いて、小さいポケットを形成することを、皮下結合組織を広げて離すことによって行った。流量調節要素が切開から離れる方向を向くようにしてポンプをポケットに挿入した。この後、７ｍｍのステープルを使用して皮膚の切開を閉じ、動物を飼育ケージ内で回復させた。

【0203】

データ解析
データは、平均±標準誤差として表されている。Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、グラフ化及び統計分析を図った。時間に対する閾値を比較するため、双方向ＡＮＯＶＡ及びそれに続くＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較検定を、ｐ＜０．０５の有意水準で用いた。ホットプレート及びＭＰＥ％データを一方向ＡＮＯＶＡによって分析した後に、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較検定を行った。

【0204】

結果
変異体ＮＶ１Ｄ３０３４−ＯＨ（ＮＶ１Ｄ３０３４−ＣＯＯＨ）、ＮＶ１Ｄ３３６８−ＯＨ（ＮＶ１Ｄ３３６８−ＣＯＯＨ）及びＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨ（ＮＶ１Ｄ２７７５−ＣＯＯＨ）の有効性を、ＣＦＡモデル（炎症性痛覚の広く用いられているモデル）において研究した。ＣＦＡを後足に注射することによって、足浮腫（図示せず）及び熱刺激（熱痛覚過敏）に対する過敏症が誘発された。これは、０日目における注射された足において熱潜時が下がったことで示される（図６Ａ）。熱痛覚過敏が完全に逆転することが、ＮＶ１Ｄ３０３４−ＯＨを６８４及び１８２４μｇ／日で、皮下浸透圧ミニポンプによって投与したときに生じた（図４Ａ及び４Ｂ）。

【0205】

ＮＶ１Ｄ３３６８−ＯＨによって、ＣＦＡ誘発熱痛覚過敏が６８４及び１８２４μｇ／日において十分に逆転された（図５Ａ及び５Ｂ）。

【0206】

ＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨはＣＦＡモデルにおける強い有効性を示した。熱潜時は、ＮＶ１Ｄ２７７５投与後のカットオフに近い値に到達しており（図６Ａ及び６Ｂ、１８２４μｇ／日）、これは、抗痛覚過敏効果に加えて強い無痛覚効果を示唆している。加えて、ＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨによってＣＦＡ誘発触覚異痛症が逆転された（図６Ｃ及び６Ｄ、１８２４μｇ／日）。ＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨの抗痛覚過敏効果は、ポンプを埋め込んでから早くも４時間後に見られた（図７Ａ）。効果が８時間において最大に達することが、熱及び触覚試験の両方において起こり（図７Ａ及び７Ｂ）、これは２４時間維持された。熱潜時及び触覚閾値は、ポンプ埋め込み後４８時間（ポンプが空であると予測されてから約２４時間後）で制御レベルに戻った（図７Ａ及び７Ｂ）。

【0207】

ＣＦＡ誘発熱痛覚過敏は容易に逆転することが、２つの更なるペプチド、ＮＶ１Ｄ３３６８−アミド（ＮＶ１Ｄ３３６８−ＮＨ₂）及びＮＶ１Ｄ３０３４−Ｎ−メチルアミド（ＮＶ１Ｄ３０３４−ＮＨＭｅ）によって生じた。実験からの熱ＭＰＥ％を表１３にまとめる。

【0208】

【表13】

【0209】

またＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨは、ホットプレート試験において強い用量依存性有効性を示した（図８）。５０℃及び５５℃における潜時は、１８２４μｇ／日の投与の後にカットオフに近い値に達した。２２８μｇ／日において、ＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨは、熱潜時がＰＢＳ対照と比べて少なめだが著しく増加した。

【0210】

ＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨの有効性を、炎症性痛覚の別のモデル（カラギーナンモデル）において評価した。動物に、ＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨ又はＰＢＳポンプを埋め込んだ。熱逃避潜時の測定を、ポンプ前及びポンプ後１日目で行った。λ−カラギーナンを後足に注射して、熱潜時の再測定をカラギーナンの２、３、及び４時間後に行った。ＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨは、１８２４μｇ／日において、著しい無痛覚を実現した（図９）。λ−カラギーナンを後足に注射すると、炎症が誘発されて（図示せず）、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験における熱足逃避潜時が短くなることが、４時間の試験時間に渡って生じた。（図９、ＰＢＳグループ）。動物をＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨを用いて１８２４μｇ／日で前処理したところ、カラギーナン誘発痛覚過敏から十分に保護された。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]