特許 6676589 薬物動態特性の改善されたコンプスタチンアナログ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6676589

(24)【登録日】2020年3月16日

(45)【発行日】2020年4月8日

(54)【発明の名称】薬物動態特性の改善されたコンプスタチンアナログ

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/08 20060101AFI20200330BHJP

   A61K 38/12 20060101ALI20200330BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20200330BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20200330BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20200330BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20200330BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20200330BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20200330BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20200330BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20200330BHJP

   A61P 13/02 20060101ALI20200330BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20200330BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20200330BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20200330BHJP

   A61P 31/06 20060101ALI20200330BHJP

   A61P 11/02 20060101ALI20200330BHJP

【ＦＩ】

   C07K7/08ZNA

   A61K38/12

   A61P43/00 111

   A61P27/02

   A61P29/00 101

   A61P25/00

   A61P25/16

   A61P25/28

   A61P35/00

   A61P31/04

   A61P13/02

   A61P17/06

   A61P11/00

   A61P37/08

   A61P31/06

   A61P11/02

【請求項の数】7

【外国語出願】

【全頁数】39

(21)【出願番号】特願2017-146396(P2017-146396)

(22)【出願日】2017年7月28日

(62)【分割の表示】特願2014-529900(P2014-529900)の分割

【原出願日】2012年9月7日

(65)【公開番号】特開2017-222700(P2017-222700A)

(43)【公開日】2017年12月21日

【審査請求日】2017年7月28日

(31)【優先権主張番号】61/531,919

(32)【優先日】2011年9月7日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/651,204

(32)【優先日】2012年5月24日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】500429103

【氏名又は名称】ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア

(74)【代理人】

【識別番号】100100158

【弁理士】

【氏名又は名称】鮫島 睦

(74)【代理人】

【識別番号】100126778

【弁理士】

【氏名又は名称】品川 永敏

(74)【代理人】

【識別番号】100150500

【弁理士】

【氏名又は名称】森本 靖

(72)【発明者】

【氏名】ジョン・ディ・ランブリス

(72)【発明者】

【氏名】チュイ・ホンチャン

(72)【発明者】

【氏名】ダニエル・リックリン

【審査官】 植原 克典

(56)【参考文献】

【文献】 特許第６２４９９４９（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】 特表２００９−５１７４７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／１３５７１７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１４−５３１４３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１２／０４０２５９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１１／１６３３９４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 M.Katragadda, et al., J Med Chem., 2006, 49, pp4616-4622

【文献】 T.L.Chiu, et al., Chem Biol Drug Des., 2008, 72(2), pp249-256

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号：１８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、Ｃ３およびＣ１３間のジスルフィド結合によって環状が形成されているペプチドを含む、補体活性に関連する疾患状態の治療における使用のための組成物。

【請求項2】

医薬的に許容される担体を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記ペプチドのインビボ保持を持続するさらなる成分を含む、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項4】

さらなる成分が、
（ａ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、
（ｂ）アルブミン結合小分子、および
（ｃ）アルブミン結合ペプチド
から選択されるものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項5】

前記アルブミン結合小分子が、ＡＢＭ２である、請求項４に記載の組成物。

【請求項6】

前記アルブミン結合小分子が、前記ペプチドの末端に直接結合しているか、または前記ペプチドおよびアルブミン結合小分子の間のスペーサーを介して結合しているものである、請求項４に記載の組成物。

【請求項7】

配列番号：１８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、Ｃ３およびＣ１３間のジスルフィド結合によって環状が形成されているペプチドを含む、補体活性に関連する疾患状態の治療剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

政府支援
３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§２０２（ｃ）に従って、米国政府は、一部、認可番号ＧＭ６２１３４、ＡＩ３００４０、ＡＩ０６８７３０、ＧＭ０９７７４７およびＥＹ０２０６３３として国立衛生研究所からの資金でなされた本明細書に記載の発明における一定の権利を有しうることを承認している。

【0002】

技術分野
本発明は、体内の補体カスケードの活性化に関する。特に、本発明は、ナノモル親和性でＣ３タンパク質に結合し、補体活性化を阻害し、強力な水溶解性、血漿安定性およびインビボ保持を示し、複数の投与経路によるバイオベイラビリティを有するペプチドおよびペプチド模倣物を提供する。

【背景技術】

【0003】

特許文献、公開された出願、技術論文および学術論文を含む様々な刊行物は、本明細書を通して引用されている。これらの引用された刊行物の各々は、出典明示によりその全体が本明細書に取り込まれる。

【0004】

ヒト補体系は、病原体に対する防御および免疫応答の媒介において強力な役割を担っている。補体は、３種類の異なる経路：古典的経路、レクチン経路および第二経路を介して活性化されうる。３種類全ての経路に共通する主な活性化事象は、補体系の中心タンパク質であるＣ３を、Ｃ３転換酵素によってその活性化産物Ｃ３ａおよびＣ３ｂにタンパク質切断することである。これらのフラグメントを作り出すことにより、Ｃ３ｂおよびｉＣ３ｂによって、病原性細胞において、食作用またはクリアランスに感受性とするプロセスであるオプソニン化を引き起こし、続いて補体受容体との相互作用により免疫細胞を活性化させる（非特許文献１）。標的細胞におけるＣ３ｂの蓄積はまた、新しい転換酵素複合体を形成させ、それにより自己増幅ループが開始する。

【0005】

血漿および細胞表面結合タンパク質の集合体は、補体カスケードによる自己攻撃から宿主細胞を防御するために、補体活性化を慎重に調節する。しかしながら、補体の過剰な活性化または不適当な調節は、自己免疫疾患から炎症性疾患に至る多くの病理状態を生じうる（非特許文献１〜４）。よって、治療用の補体阻害剤の開発が非常に所望されている。この状況において、Ｃ３およびＣ３ｂは、カスケードにおけるそれらの中心的役割が補体の開始、増幅および下流活性化を同時に抑制することができることから、有望な標的として浮かび上がってきた（非特許文献３）。

【0006】

コンプスタチンは、３種類全ての活性化経路を遮断できることが示された最初の非宿主由来の補体阻害剤であった（非特許文献５および特許文献１）。この環状トリデカペプチドは、Ｃ３およびＣ３ｂの両方に結合し、Ｃ３転換酵素による内因性Ｃ３の切断を防ぐ。その高い阻害効果は、治療剤としてその能力を示す実験モデルを用いた一連の研究によって確認された（非特許文献６〜１１）。コンプスタチンの累積的な最適化により、改善された活性を有するアナログが作り出された（非特許文献９、特許文献２および３）。これらのアナログの１つは、現在、先進国の高齢患者における盲目の一因となっている加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）の治療のための臨床試験中である（非特許文献９および１２）。ＡＭＤおよび他の疾患におけるその治療効果を考慮すると、コンプスタチンをさらに最適化してより大きな有効性を達成することは極めて重要である。

【0007】

初期の構造活性研究では、コンプスタチンペプチドの重要な特徴として、その環状構造およびβターンと疎水性クラスターの両方の存在が同定された（非特許文献９、１３、１４および特許文献４）。４および７位の疎水性残基は特に重要であることが見出され、非天然アミノ酸によるそれらの修飾により、元々のコンプスタチンペプチドより２６４倍の改善された活性を有するアナログが作り出された（非特許文献１５および特許文献５）。

【0008】

これまでの最適化工程は、コンビナトリアルスクリーニング実験、溶液構造およびコンピュータモデルに基づくものであったが（非特許文献９、１６および１７）、補体フラグメントＣ３ｃと複合体を形成したコンプスタチンの共結晶構造の発表（非特許文献１８および特許文献６）は、合理的な最適化を開始するための重要な方向性を示す。その結晶構造により、Ｃ３ｃのマクログロブリン（ＭＧ）ドメイン４および５の連結部における浅い結合部位が明らかにされ、１３個のアミノ酸のうちの９個が、水素結合または疎水性効果のいずれかにより結合に直接関連することが示された。溶液中のコンプスタチンペプチドの構造と比較すると（非特許文献１３）、コンプスタチンの結合形態は、残基５〜８から８〜１１までのβターンの位置でのシフトを伴って構造的に変化した（非特許文献１８および特許文献７）。

【0009】

本発明者は、近年、ペプチド骨格、特に、ペプチド８位のメチル化、および隣接する１３位の置換に基づいて能力の向上した一連のコンプスタチンアナログを開発した（非特許文献１９および特許文献１８）。これらの修飾は、当時報告されていた大部分の活性なアナログより改善された結合親和性を有するコンプスタチンアナログを生じることが報告された。

【0010】

コンプスタチンおよびそのアナログは、臨床応用のための大きな可能性を有する。最近の例として、血液透析中のフィルターで引き起こされる有害作用の減少や敗血症における臓器保存が挙げられる。重要なことに、コンプスタチンアナログの硝子体内使用は、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）実験および第Ｉ相臨床試験の両方での加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）の治療において有望な結果を示した。コンプスタチンおよびそのアナログの低分子量、それらの高い特異性および有効性、ならびに全ての補体活性および増幅経路を同時に阻害するそれらの能力は、有益な薬物プロファイルの一因である。しかしながら、長期間の臨床適用（例えば、様々な経路による全身投与）を行うためには、コンプスタチン誘導体の分子特性にさらなる要件が課される。例えば、血漿からの急速な排出による不利な薬物動態プロファイルは、なおもペプチド薬物の臨床使用を大きく限定するものである。また、経口送達が薬物投与の最も便利で一般的な経路であるが、大半のペプチド薬物は、経口活性をほとんどまたは全く示さない。このことは、主に、酵素および極限条件による胃腸管における分解、ならびに腸管粘膜の透過性の低下によるものと考えられる。よって、大半のタンパク質に基づいた治療薬は、静脈内、筋肉内および皮下注射などによる非経口経路を介して高頻度で注射することにより投与される。これらの投与形態はコストがかかり、医療従事者を必要としうるため、これらの全ては、患者に受け入れられず、コンプライアンスの低下をもたらしうる。前記を考慮すると、より向上した活性、インビボ安定性、血漿滞留時間およびバイオアベイラビリティを有する修飾されたコンプスタチンペプチドまたは模倣物の開発は、当該技術分野における著しい進歩となるであろうことが明らかである。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【特許文献1】米国特許第６，３１９，８９７号

【特許文献2】ＷＯ２００４／０２６３２８

【特許文献3】ＷＯ２００７／０６２２４９

【特許文献4】ＷＯ９９／１３８９９

【特許文献5】ＷＯ２００８／１５３９６３

【特許文献6】ＷＯ２０１０／１２７３３６

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】Markiewski & Lambris, 2007, Am J Pathol 171: 715-727

【非特許文献2】Holers, 2003, Clin Immunol 107: 140-51

【非特許文献3】Ricklin & Lambris, 2007, Nat Biotechnol 25: 1265-75

【非特許文献4】Sahu et al., 2000, J Immunol 165: 2491-9

【非特許文献5】Sahu et al., 1996, J Immunol 157: 884-91

【非特許文献6】Fiane et al., 1999a, Xenotransplantation 6: 52-65

【非特許文献7】Fiane et al., 1999b, Transplant Proc 31:934-935

【非特許文献8】Nilsson et al., 1998 Blood 92: 1661-1667

【非特許文献9】Ricklin & Lambris, 2008, Adv Exp Med Biol 632: 273-292

【非特許文献10】Schmidt et al., 2003, J Biomed Mater Res A 66: 491-499

【非特許文献11】Soulika et al., 2000, Clin Immunol 96: 212-221

【非特許文献12】Coleman et al., 2008, Lancet 372: 1835-1845

【非特許文献13】Morikis et al., 1998, Protein Sci 7: 619-627

【非特許文献14】Morikis et al., 2002, J Biol Chem 277:14942-14953

【非特許文献15】Katragadda et al., 2006, J Med Chem 49: 4616-4622

【非特許文献16】Chiu et al., 2008, Chem Biol Drug Des 72: 249-256

【非特許文献17】Mulakala et al., 2007, Bioorg Med Chem 15: 1638-1644

【非特許文献18】Janssen et al., 2007, J Biol Chem 282: 29241-29247

【非特許文献19】Qu et al., 2011, Molec Immunol 48: 481-489

【発明の概要】

【0013】

本発明は、コンプスタチンと比較して改善した補体阻害活性を維持し、また、複数の投与経路により改善された溶解性および安定性および薬物動態特性（バイオアベイラビリティを含む）を有する補体阻害ペプチドであるコンプスタチンのアナログを提供する。

【0014】

本発明のある態様は、修飾コンプスタチンペプチド（ＩＣＶＶＱＤＷＧＨＨＲＣＴ（環状Ｃ２−Ｃ１２；配列番号：１）またはそのアナログを含む化合物であって、前記修飾は、同等の条件下で未修飾のコンプスタチンペプチドと比較して、（１）ペプチドのＣ３、Ｃ３ｂまたはＣ３ｃ結合親和性、（２）ペプチドの水性液体中の溶解性、および／または（３）ペプチドの血漿安定性および／または血漿滞留時間を改善する、付加され、または置換されたＮ末端成分を含む化合物を特徴とする。

【0015】

前記ペプチドのＮ末端に付加することができる成分には、Ｌ−Ｇｌｙ以外のアミノ酸残基、このようなアミノ酸のペプチドアナログまたは非ペプチドアナログが含まれる。ある実施態様において、付加される成分は、Ｄ−アミノ酸であり、および／または前記成分には、少なくとも１つの芳香族環が含まれうる。ある実施態様において、付加される成分は、Ｄ−Ｔｙｒである。他の実施態様において、付加される成分には、Ｎ−メチル化アミノ酸が含まれる。ある実施態様において、Ｎ−メチル化アミノ酸は、Ｎ−メチル化Ｌ−Ｇｌｙであり、本明細書では、Ｓａｒとも呼ばれる。よって、様々な実施態様において、付加される成分は、Ｄ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ（Ｍｅ）、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｄ−Ｃｈａ、Ｃｈａ、Ｐｈｅ、Ｓａｒ、Ａｒｇ、ｍＰｈｅ、ｍＶａｌ、Ｔｒｐ、ｍＩｌｅ、Ｄ−Ａｌａ、ｍＡｌａ、ＴｈｒまたはＴｙｒである。

【0016】

他の実施態様において、修飾コンプスタチンペプチドには、置換Ｎ末端成分が含まれ、１位におけるＩｌｅが、Ａｃ−ＴｒｐまたはジペプチドＴｙｒ−Ｇｌｙで置換されている。

【0017】

前記化合物にはまた、他の修飾が含まれうる。例えば、９位（コンプスタチンの数に基づく）におけるＨｉｓは、Ａｌａで置換されうる。また、４位におけるＶａｌは、ＴｒｐまたはＴｒｐのアナログで置換されうる。４位におけるＴｒｐの特定のアナログとしては、１−メチルＴｒｐまたは１−ホルミルＴｒｐが挙げられる。７位におけるＴｒｐはまた、Ｔｒｐのアナログ（ハロゲン化Ｔｒｐを含むが、これだけに限定されない）で置換されうる。他の修飾には、その位置における骨格構造を制限するために、８位におけるＧｌｙの修飾が含まれる。特に、前記骨格は、８位におけるＧｌｙ（Ｇｌｙ８）をＮ^ａ−メチルＧｌｙ（Ｓａｒ）で置換することによって制限することができる。他の修飾としては、１３位におけるＴｈｒを、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｎ−メチルＴｈｒまたはＮ−メチルＩｌｅで置換することが挙げられる。さらに他の修飾としては、Ｃ２とＣ１２とのジスルフィド結合をチオエーテル結合で置換して、シスタチオニンまたはランチオニン（lantithionine）を形成することが挙げられる。なお別の修飾としては、１１位におけるＡｒｇをＯｒｎで置換し、および／または６位におけるＡｓｐをＡｓｎで置換することが挙げられる。

【0018】

特定の実施態様において、前記コンプスタチンアナログには、Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｘａａ３−Ｇｌｎ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｇｌｙ−Ｘａａ６−Ｈｉｓ−Ｘａａ７−Ｃｙｓ−Ｘａａ８の配列番号：２９の配列を有するペプチドであって、配列中、Ｘａａ５とＸａａ６との間のＧｌｙ（コンプスタチンの８位）は、必要に応じて、骨格構造を制限するために修飾されるものであり、Ｘａａ１は、非存在であるか、あるいはＴｙｒ、Ｄ−ＴｙｒまたはＳａｒであり；Ｘａａ２は、Ｉｌｅ、ＧｌｙまたはＡｃ−Ｔｒｐであり；Ｘａａ３は、ＴｒｐまたはＴｒｐのアナログであって、前記Ｔｒｐのアナログは、Ｔｒｐと比較して疎水性が増加しているものであり；Ｘａａ４は、ＡｓｐまたはＡｓｎであり；Ｘａａ５は、ＴｒｐまたはＴｒｐのアナログであって、そのインドール環に化学修飾を含み、インドール環の水素結合能が増加しているものであり；Ｘａａ６は、Ｈｉｓ、Ａｌａ、ＰｈｅまたはＴｒｐであり；Ｘａａ７は、ＡｒｇまたはＯｒｎであり；ならびにＸａａ８は、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｎ−メチルＴｈｒまたはＮ−メチルＩｌｅであって、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｎ−メチルＴｈｒまたはＮ−メチルＩｌｅのいずれのカルボキシ末端−ＯＨも、−ＮＨ_２で適宜置換されていてもよく、前記ペプチドは、Ｃｙｓ−Ｃｙｓまたはチオエーテル結合を介して環状であるものであるペプチドが含まれる。

【0019】

前記アナログの特定の実施態様には、下記の特徴が含まれる：８位におけるＧｌｙは、Ｎ−メチル化され；Ｘａａ１は、Ｄ−ＴｙｒまたはＳａｒであり；Ｘａａ２は、Ｉｌｅであり；Ｘａａ３は、Ｔｒｐ、１−メチル−Ｔｒｐまたは１−ホルミル−Ｔｒｐであり；Ｘａａ５は、Ｔｒｐであり；Ｘａａ６は、Ａｌａであり；ならびにＸａａ８は、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｎ−メチルＴｈｒまたはＮ−メチルＩｌｅであって、前記カルボキシ末端−ＯＨは、−ＮＨ_２で適宜置換されていてもよいものである。より具体的には、Ｘａａ８は、Ｉｌｅ、Ｎ−メチルＴｈｒまたはＮ−メチルＩｌｅであって、前記カルボキシ末端−ＯＨは、−ＮＨ_２で適宜置換されていもよいものである。典型的なアナログには、配列番号：７および配列番号：１８が含まれる。本発明の別の態様は、配列番号：７または配列番号：１８の非ペプチドまたは部分ペプチド模倣物を含む、補体活性を阻害する化合物を特徴とするものであって、前記化合物は、Ｃ３に結合し、同等のアッセイ条件下で配列番号：１を含むペプチド用量より少なくとも５０倍高い活性で補体活性を阻害する。

【0020】

本発明の別の態様は、上記に記載の化合物を特徴とするものであって、化合物のインビボ保持（すなわち、滞留時間）を持続させるさらなる成分が含まれるものである。ある実施態様において、前記さらなる成分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。他の実施態様において、前記さらなる成分は、アルブミン結合小分子またはアルブミン結合ペプチドである。特定の実施態様において、前記アルブミン結合小分子またはアルブミン結合ペプチドは、ＮまたはＣ末端で前記ペプチドに結合される。この結合は、直接、またはリンカーもしくはスペーサーを介して行われうる。

【0021】

本発明の別の態様は、上記に記載の化合物のいずれかおよび医薬的に許容される担体を含む医薬組成物を特徴とする。ある実施態様において、前記医薬組成物は、経口投与のために製剤化されている。別の態様において、前記医薬組成物は、局所投与のために製剤化されている。別の態様において、前記医薬組成物は、肺投与のために製剤化されている。別の態様において、前記医薬組成物は、皮下または筋肉内注射のために製剤化されている。別の態様において、前記医薬組成物は、静脈内注射または注入のために製剤化されている。

【0022】

本発明の別の態様は、インビボ、エクスビボ、インサイチューまたはインビトロで補体活性の阻害のため、ならびに補体活性の阻害のための医薬の製造における使用のための上記に記載の化合物のいずれかの使用を提供する。

【0023】

本発明の様々な特徴および有利な点は、以下に続く詳細な説明、図面および実施例を参照することにより理解される。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】コンプスタチンアナログとＣ３ｂとの相互作用を示す。（Ａ）表面プラズモン共鳴法を用いたサイクル動力学的解析によって調べた、コンプスタチンリード化合物４（１ＭｅＷ）（最も低く狭いピークセット）、Ｃｐ２０（配列番号：３）（中間のピークセット）、およびペプチド１４（Ｃｐ４０（配列番号：１８））（最も高く広いピークセット）の動力学的プロファイルを示す。（Ｂ）ペプチド１〜２０ならびに参照化合物４（１ＭｅＷ）および斜線で示すアイソアフィニティー線を有するＣｐ２０（配列番号：３）の速度プロットを示す。Ｃｐ２０（配列番号：３）の速度定数および親和性についての基準線を示す。

【図2】コンプスタチンアナログおよびＣ３ｃの間の計算上の結合実験から算出された遊離エネルギー値（ΔＧ）（ｙ軸）と、Ｃ３ｂに対して同一のアナログの実験で調べた結合値から算出された遊離エネルギー値（ｘ軸）との間の相関関係を示す。ペプチド番号は、プロット上の各印の隣に示す。全データセットの相関関係を実線として示し、点線はペプチド１、５および７を除いた相関関係を示す。

【図3】コンプスタチンアナログのＣ３ｃ結合部位への結合を示す。（Ａ）ペプチド１４の結合構造（Ｃｐ４０（配列番号：１８）、シアン色の図）およびペプチド４（灰色の図）（無色の図では、ｄＹ側鎖の芳香族環（ＣＰ４０（配列番号：１８））は、Ｙの環の前で重ね合わされ（ペプチド４）、この方法で区別されうる）。他のＤ−アミノ酸は、結合モデルにおいてペプチド１４と同様の構造を有する。ペプチド４の他の残基の側鎖は、明瞭化のために省略した。（Ｂ）ペプチド１９の結合構造を示す。

【図4】３７℃でのヒト血漿におけるペプチド３（Ｃｐ３０（配列番号：７））およびペプチド１４（Ｃｐ４０（配列番号：１８））の安定性を示す。Ｃｐ３０（配列番号：７）、Ｃｐ４０（配列番号：１８）および陽性コントロールペプチド２Ｂをヒト血漿中に混ぜて２０μＭの最終濃度とした。前記血漿を３７℃でインキュベートし、１００μＬの試料を様々な時点で採取した。ペプチドを、固相抽出を用いて血漿から抽出し、ＵＰＬＣ−ＭＳを用いて解析した。３Ａ：各試料の異なる時点の面積を時間と共にプロットした（四角形：Ｃｐ４０（配列番号：１８）、円：Ｃｐ３０（配列番号：７）、三角形：コントロールペプチド２Ｂ）を示す。３Ｂ：０（上部）、２４時間（真ん中）および１２０時間（下部）からの試料のクロマトグラフを示す。

【図5】非ヒト霊長類におけるコンプスタチンアナログの薬物動力学的測定を示す。（Ａ）カニクイザルにおける２ｍｇ／ｋｇの静脈内ボーラス注射後の経時的なペプチドレベルの直線プロットは、急速な最初の排出相、続いて遅延した対数線形終末相である二相モデルを示した。Ｃｐ２０（配列番号：３）−より下部の２つの線；Ｃｐ３０（配列番号：７）（ペプチド３）−中間の２つの線；Ｃｐ４０（配列番号：１８）（ペプチド１４）−より上部の２つの線。（Ｂ）終末相（１〜２４ｈ）からの血漿排出半減期（ｔ_１／２）の算出を示す。Ｃｐ２０（配列番号：３）−より下部の２つの線；Ｃｐ３０（配列番号：７）（ペプチド３）−中間の２つの線；Ｃｐ４０（配列番号：１８）（ペプチド１４）−より上部の２つの線。点線は、パネルＡおよびＢの両方における標的タンパク質Ｃ３の測定した血漿レベルの範囲を示す。（Ｃ）アナログＣｐ２０（配列番号：３）の、ＳＰＲにより測定されるように、ヒト、ヒヒ、カニクイザルおよびアカゲザルに由来する固定されたＣ３に対する動力学的結合プロファイルの重ね合わせを示す。

【図6】カニクイザルにおける２種類の異なる経路による前記アナログの単回投与後のコンプスタチンアナログＣｐ４０（配列番号：１８）の血漿濃度を示す。血漿濃度は、皮下注射（上図）または経口投与（下図）後の時点において質量分析法によって測定した。

【図7】ヒヒにおける筋肉内注射による前記アナログの単剤投与後のコンプスタチンアナログＣｐ４０（配列番号：１８）の血漿濃度および補体阻害活性を示す。血漿濃度は、筋肉内注射（円）後の時点において質量分析法によって測定した。別の経路を介した補体活性の阻害は、赤血球溶血アッセイ（三角形）によって測定した。

【発明を実施するための形態】

【0025】

例示的な実施態様の詳細な説明
定義：
本発明の方法および他の態様に関する様々な用語が明細書および特許請求の範囲を通して用いられる。このような用語は、特に示されていない限り、当該技術分野における通常の意味を付与されるべきである。他に特に定義される用語は、本明細書で提供される定義と一致した意味で解釈されるべきである。

【0026】

下記の略語が本明細書で用いられうる：Ａｃ、アセチル基；ＤＣＭ、ジクロロメタン；ＤＩＣ、１，３−ジイソプロピルカルボジイミド；ＤＩＰＥＡ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン；ＤＰＢＳ、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水；ＥＬＩＳＡ、酵素結合免疫吸着アッセイ；ＥＳＩ、エレクトロスプレーイオン化；Ｆｍｏｃ、９−フルオレニルメトキシカルボニル；ＨＯＡｔ、１−ヒドロキシ−７−アザ−ベンゾトリアゾール；ＩＴＣ、等温滴定熱量測定；ＭＡＬＤＩ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法；ＭＢＨＡ、４−メチルベンゾヒドリルアミン；ＮＭＰ、Ｎ−メチルピロリジノン；Ｓａｒ、Ｎ−メチルグリシン；ＳＰＲ、表面プラズモン共鳴法；ＴＩＰＳ、トリイソプロピルシラン；Ｔｒｔ、トリチル；ＷＦＩ、注射用水。

【0027】

本明細書で用いられる用語「約」は、量、時間などの測定数値に関する場合、変動が開示化合物および組成物を調製し、使用するのに適合するように、特定された値からの±２０％または±１０％、ある実施態様では、±５％、ある実施態様では、±１％、ある実施態様では、±０．１％の変動を包含することを意味する。

【0028】

本明細書で用いられる用語「コンプスタチン」は、配列番号：１であるＩＣＶＶＱＤＷＧＨＨＲＣＴ（ジスルフィド結合を介する環状Ｃ２−Ｃ１２）を含むペプチドを意味する。用語「コンプスタチンアナログ」は、天然および／または非天然アミノ酸またはアミノ酸アナログの置換、ならびに本明細書でより詳細に記載され、当該技術分野で公知である様々なアミノ酸内または間の修飾を含む、修飾されたコンプスタチンを意味する。コンプスタチンまたはコンプスタチンアナログ内の特定のアミノ酸またはアナログの位置に関する場合、これらの位置は、１（コンプスタチンのＩｌｅ）から１３（コンプスタチンのＴｈｒ）まで番号付けられた位置である前記ペプチド内の「位置」として意味することもある。例えば、Ｇｌｙ残基は「８位」を占める。

【0029】

用語「医薬的に活性な」および「生物学的に活性な」は、Ｃ３またはそのフラグメントに結合し、補体活性を阻害する本発明化合物の能力を意味する。この生物学的活性は、本明細書でより詳細に記載されるように、１つまたはそれ以上の数種類の当該分野で理解されるアッセイによって測定されうる。

【0030】

本明細書で用いられる「アルキル」は、約１〜約１０個の炭素原子、好ましくは、約１〜約７個の炭素原子を有する適宜置換されていてもよい飽和の直鎖、分岐鎖または環状炭化水素（およびその中の炭素原子の範囲および具体的な数の全ての組み合わせおよび部分的な組み合わせ）を意味する。アルキル基としては、以下に限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、シクロペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、シクロヘキシル、シクロオクチル、アダマンチル、３−メチルペンチル、２，２−ジメチルブチル、および２，３−ジメチルブチルが挙げられる。用語「低級アルキル」は、約１〜約５個の炭素原子を有する適宜置換されていてもよい飽和の直鎖、分岐鎖または環状炭化水素（およびその中の炭素原子の範囲および具体的な数の全ての組み合わせおよび部分的な組み合わせ）を意味する。低級アルキル基としては、以下に限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、シクロペンチル、イソペンチルおよびネオペンチルが挙げられる。

【0031】

本明細書で用いられる「ハロ」は、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを意味する。

【0032】

本明細書で用いられる「アルカノイル」は、「アシル」と相互に交換可能に用いられてもよく、約１〜約１０個の炭素原子、好ましくは、約１〜約７個の炭素原子を有する適宜置換されていてよい直鎖または分岐鎖の脂肪族アシル基（およびその中の炭素原子の範囲および具体的な数の全ての組み合わせおよび部分的な組み合わせ）を意味する。アルカノイル基としては、以下に限定されないが、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、ペンタノイル、イソペンタノイル、２−メチル−ブチリル、２，２−ジメチルプロピオニル、ヘキサノイル、ヘプタノイル、オクタノイルなどが挙げられる。用語「低級アルカノイル」は、約１〜約５個の炭素原子を有する適宜置換されていてもよい直鎖または分岐鎖の脂肪族アシル基（およびその中の炭素原子の範囲および具体的な数の全ての組み合わせおよび部分的な組み合わせ）を意味する。低級アルカノイルとしては、以下に限定されないが、ホルミル、アセチル、ｎ−プロピオニル、イソプロピオニル、ブチリル、イソブチリル、ペンタノイル、イソペンタノイルなどが挙げられる。

【0033】

本明細書で用いられる「アリール」は、約５〜約１４個の炭素原子、好ましくは、約６〜約１０個の炭素を有する、適宜置換されていてもよい単環または二環式芳香族環（およびその中の炭素原子の範囲および具体的な数の全ての組み合わせおよび部分的な組み合わせ）を意味する。限定されない例として、例えば、フェニルおよびナフチルが挙げられる。

【0034】

本明細書で用いられる「アラルキル」は、アリール基を保有し、約６〜約２０個、好ましくは、約６〜約１２個の炭素原子を有する、上記に定義されるアルキル（およびその中の炭素原子の範囲および具体的な数の全ての組み合わせおよび部分的な組み合わせ）を意味する。アラルキル基は、適宜置換されうる。限定されない例としては、例えば、ベンジル、ナフチルメチル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、フェニルエチルおよびジフェニルエチルが挙げられる。

【0035】

本明細書で用いられる用語「アルコキシ」および「アルコキシル」は、適宜置換されていてもよいアルキル−Ｏ−基（アルキルは上記に定義される）を意味する。典型的なアルコキシおよびアルコキシル基としては、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉ−プロポキシ、ｎ−ブトキシおよびヘプトキシなどが挙げられる。

【0036】

本明細書で用いられる「カルボキシ」は、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ基を意味する。

【0037】

本明細書で用いられる「アルコキシカルボニル」は、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル基（アルキルは、上記に定義される）を意味する。

【0038】

本明細書で用いられる「アロイル」は、−Ｃ（＝Ｏ）−アリール基（アリールは、上記に定義される）を意味する。典型的なアロイル基としては、ベンゾイルおよびナフトイルが挙げられる。

【0039】

典型的に、置換された化学部分には、分子上の選択された位置で水素を置換する１つまたはそれ以上の置換基が含まれる。典型的な置換基としては、例えば、ハロ、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、スルフヒドリル、ヒドロキシル（−ＯＨ）、アルコキシル、シアノ（−ＣＮ）、カルボキシル（−ＣＯＯＨ）、アシル（アルカノイル：−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ）；−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、アミノカルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ_２）、−Ｎ置換アミノカルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ’’）、ＣＦ_３、ＣＦ_２ＣＦ_３などが挙げられる。前記置換基に関して、各部分Ｒ’’は、独立して、例えば、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリールまたはアラルキルのいずれかでありうる。

【0040】

本明細書で用いられる「Ｌ−アミノ酸」は、タンパク質中に通常存在する天然の左旋性アルファ−アミノ酸またはこれらのアルファ−アミノ酸のアルキルエステル化合物のいずれかを意味する。用語「Ｄ−アミノ酸」は、右旋性アルファ−アミノ酸を意味する。特に断りがなければ、本明細書に関する全てのアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸である。

【0041】

「疎水性」または「非極性」は、本明細書で同意語として用いられ、双極子によって特徴付けされない分子間または分子内相互作用のいずれかを意味する。

【0042】

「ＰＥＧ化」は、少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分が、サイズに関わらず、タンパク質またはペプチドに化学的に結合して、ＰＥＧ−ペプチド抱合体を形成する反応を意味する。「ＰＥＧ化される」は、少なくとも１つのＰＥＧ部分が、サイズに関わらず、ペプチドまたはタンパク質に化学的に結合することを意味する。用語ＰＥＧは、一般に、ＰＥＧポリマーのおおよその平均分子量を示す語尾の数値を伴い；例えば、ＰＥＧ−８，０００は、約８，０００ダルトン（またはｇ／ｍｏｌ）の平均分子量を有するポリエチレングリコールを意味する。

【0043】

本明細書で用いられる「医薬的に許容される塩」は、親化合物がその酸性または塩基性塩を作り出すことによって改変される開示化合物の誘導体を意味する。医薬的に許容される塩の例としては、以下に限定されないが、塩基性残基の鉱酸または有機酸塩（例えば、アミン）；酸性残基のアルカリまたは有機塩（例えば、カルボン酸）などが挙げられる。よって、用語「酸付加塩」は、酸を付加することによって調製される親化合物の対応する塩誘導体を意味する。医薬的に許容される塩としては、例えば、無機酸または有機酸から形成される親化合物の従来の塩または第四級アンモニウム塩が挙げられる。例えば、このような従来の塩としては、以下に限定されないが、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機酸に由来するもの；ならびに酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸などの有機酸から調製される塩が挙げられる。本発明のある酸性もしくは塩基性化合物は、双性イオンとして存在しうる。本化合物の全ての形態（遊離酸、遊離塩基および双性イオンを含む）は、本発明の範囲内とされる。

【0044】

説明：
本発明は、一部、阻害能および薬物動態的パラメータの両方における改善を示すコンプスタチンアナログの発明者らの開発から作り出される。非タンパク新生アミノ酸および／または他の分子を有するコンプスタチンＮ末端の選択的な修飾は、ｎＭ以下の結合親和性（Ｋ_Ｄ＝０．５ｎＭ）を有する一定のアナログおよび臨床的に関連する溶媒中の溶解性が改善した他の同様の能力を有する誘導体を生じる。非ヒト霊長類における薬物動態的評価により、ペプチド薬物についての予測を超えた血漿半減期の値が明らかになった。２種類の非ヒト霊長類モデルにおけるバイオアベイラビリティ評価により、一定のアナログの皮下、筋肉内および経口バイオアベイラビリティが示された。

【0045】

本発明による１つの修飾は、Ｃ３結合親和性および補体阻害活性を維持し、または改善しつつ、ペプチドの溶解性および血漿安定性を改善するコンプスタチン（Ｉｌｅ−［Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ］−Ｔｈｒ；配列番号：１）のＮ末端に成分を付加することを含む。特定の実施態様において、付加される成分は、アミノ酸残基、特に、タンパク質切断に対抗する残基、例えば、Ｎ−メチル化アミノ酸（例えば、Ｎ−メチルＧｌｙ（Ｓａｒ））またはＤ−アミノ酸（例えば、Ｄ−Ｔｙｒ）である。また、下記でより詳細に説明されるように、Ｎ末端残基のＤ構造は、Ｃ３との極性相互作用のための遊離アミノ基を形成してもよい。また、Ｎ末端に疎水性側鎖（例えば、芳香族環を含む）を含むアミノ酸またはアナログは、コンプスタチン−Ｃ３結合部位における疎水性ポケットにおける相互作用を介して、Ｃ３への結合を促進する。

【0046】

下記に説明される典型的なアナログについて言及すると、これらは、コンプラスチンおよび強力なアナログであるＡｃ−Ｉｌｅ−［Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ（Ｍｅ）−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ］−Ｔｈｒ−ＮＨ_２（配列番号：２）（上記のKatragadda et al., 2006、ＷＯ２００７／０６２２４９；本明細書では「４（１ＭｅＷ）」とも称される）より著しく改善された活性、ならびに下記に詳細に記載される数種類の他の好ましい特性を示す。

【0047】

「コンプスタチン３０」（Ｃｐ３０）：
Ｓａｒ−Ｉｌｅ−［Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ（Ｍｅ）−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｓａｒ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ］−ｍＩｌｅ−ＮＨ_２
（配列番号：７；実施例では「ペプチド３」とも称される）

【0048】

「コンプスタチン４０」（Ｃｐ４０）：
ｄＴｙｒ−Ｉｌｅ−［Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ（Ｍｅ）−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｓａｒ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ］−ｍＩｌｅ−ＮＨ_２
（配列番号：１８；実施例では「ペプチド１４」とも称される）

【0049】

理論に束縛または制限されることなく、本明細書に記載のアナログの改善されたＣ３結合親和性は、少なくとも一部には、Ｎ末端によって介在される高い親和性相互作用によるものと考えられる。例えば、ＳＰＲおよびＥＬＩＳＡデータは、Ｄ−アミノ酸、または疎水性側鎖がＣ３結合を改善したアミノ酸を示す一方、特徴の組み合わせ、すなわち、芳香族側鎖を有するＤ−アミノ酸（例えば、Ｄ−Ｔｙｒ）が最も有利であった。一般に、芳香族側鎖を有するＤ−アミノ酸は、ＤまたはＬ構造のいずれかにより短い側鎖を有するアミノ酸より好ましいことが示された。さらに、結合実験は、改善された親和性が、遊離アミノ基の位置、ならびにＮ末端残基における側鎖の性質および位置に関連するさらなる極性および非極性相互作用から生じることを示す。例えば、Ｃｐ４０（配列番号：１８）の親和性の獲得は、少なくとも一部は、アナログのＮ末端におけるＣ３との相互作用の組み合わせによるものであることが決定された；（１）Ｎ末端ＴｙｒのＤ構造は、Ｄ構造全体の有益な点をも説明する特徴である、Ｃ３との極性相互作用のための遊離アミノ基を提示しし；および（２）大きな疎水性側鎖は、Ｃ３ｃにおける疎水性ポケットに適合でき、Ｃ３ｃとの水素結合のためのヒドロキシル基をも提示した。さらに、結合実験により、高親和性でＣ３に結合するＮ末端においてＡｃ−Ｔｒｐを含むアナログが予測された（実施例２）。実際に、ペプチド１のＳＰＲ解析は、Ｃｐ４０（配列番号：１８）（ペプチド１４）と比較して、高い結合親和性を示した。両方のペプチドは、コンプスタチンのＮ末端近くのＣ３、Ｃ３ｂまたはＣ３ｃにおける疎水性の結合ポケットを利用することがわかった。

【0050】

Ｎ−メチル化は、いくつかの方法でペプチドに影響を与えることができる。第一に、潜在的な水素結合ドナーは、メチル基で置換され、水素結合を形成することができない。第二に、Ｎ−メチル基は、弱い電子供与基であり、隣接するカルボニル基の塩基性をわずかに高めることができる。第三に、Ｎ−メチル基のサイズは、隣接する残基の性質に応じて立体障害を引き起こしうる。最後に、Ｎ−メチル化は、アミド結合のトランス／シス集団を変化させ、これによりプロリンと同様に局所的にペプチド構造を変化させることができる。Ｃｐ３０（配列番号：７）の場合では、ＳＰＲデータは、Ｃｐ２０（配列番号：３）よりわずかに速い会合速度およびより遅い解離速度を示し、これは、Ｃｐ３０（配列番号：７）が、Ｃ３／Ｃ３ｂ／Ｃ３ｃに結合するためのより好ましい遊離溶液構造を有し、結合がより強力であることが示される。Ｎ末端位置におけるＡｃ基の非存在およびメチル基の存在を考慮すると、その修飾がＮ末端をＣ３ｃの残基Ｓ３８８／Ｓ４３７／Ｄ３４９とのより強力な極性相互作用に加わることを可能にしたものと推定することが妥当である。これは、遊離のＮ末端を、Ｃ３／Ｃ３ｃにおける結合部位との極性相互作用を高めるようにＮ−メチル化を介して好ましい位置に局在させることによって可能となった。

【0051】

改善されたＣ３結合親和性に加えて、本発明のアナログは、Ｃｐ２０（配列番号：３）などの以前に利用可能となったアナログと比較して、改善された溶解特性を有する。全身の薬理学的投与に関して、注射用水（ＷＦＩ）およびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の両方における高い溶解性を有するアナログは、必要とされる注射体積を最小にすることが望まれる。比較するに、ＷＦＩにおける高い溶解性およびＰＢＳにおける低い溶解性を有するアナログは、例えば、ＡＭＤの治療のための、局所的な適用または局所注射（例えば、眼内注射）用のより持続的なゲル、沈殿物または懸濁液を生じうる。Ｃｐ３０（配列番号：７）は、ＷＦＩおよびＰＢＳの両方に溶解性を有し、Ｃｐ４０（配列番号：１８）は、ＷＦＩよりＰＢＳにおいてより低い溶解性を有することがわかった。

【0052】

本発明のペプチドアナログは、少なくとも一部には、プロテアーゼの攻撃に抵抗する１つまたはそれ以上のＮ末端成分、例えば、Ｄ−アミノ酸残基またはＮ−メチル基、あるいはアルブミン結合分子の存在によるものと考えられる好ましい血漿安定性特性をさらに示す。さらに、アナログは、血漿中でＣ３、Ｃ３ｂおよびＣ３ｃに特異的かつ強力に結合する。重要なことに、本明細書に記載のＮ末端および／または他の修飾によって生じた安定性は、マウスおよび２種類の非ヒト霊長類モデル系で示されるように、経口、皮下または筋肉内投与からのバイオアベイラビリティの改善、ならびに霊長類モデル系に示されるように、インビボでアナログの（すなわち、遅延した）血漿排出半減期値の改善の一因となる。

【0053】

上記に記載のＮ末端修飾は、活性を改善することが以前に示されたコンプスタチンの他の修飾と組み合わせ、これにより顕著に改善した補体阻害活性を有するペプチドを生成することができる。例えば、Ｎ末端のアセチル化は、典型的に、コンプスタチンおよびそのアナログの補体阻害活性を増加する。よって、前記ペプチドのアミノ末端におけるアシル基の付加（Ｎ−アセチル化を含むが、これに限定されることない）は、本発明の一実施態様であるが、ペプチドのＮ末端がすでに安定である場合、または溶解性が問題となる場合には必要ないかもしれない。

【0054】

別の例として、９位におけるＡｌａのＨｉｓへの置換は、コンプスタチンの活性を改善し、本発明のペプチドの好ましい修飾でもあることが知られている。４位におけるＴｙｒのＶａｌへの置換は、活性のわずかな改善を生じうることもわかっている（Klepeis et al., 2003, J Am Chem Soc 125: 8422-8423）。

【0055】

ＷＯ２００４／０２６３２８およびＷＯ２００７／０６２２２４９では、４位におけるＴｒｐおよび一定のＴｒｐアナログ、ならびに７位における一定のＴｒｐアナログは、特に、９位におけるＡｌａと組み合わされて、コンプスタチンより何倍も高い活性を生じることが開示される。これらの修飾は、本発明のためにも用いられる。

【0056】

特に、４位において、５−フルオロ−トリプトファン、あるいは５−メトキシ−、５−メチル−または１−メチル−トリプトファン、あるいは１−ホルミル−トリプトファンのいずれかを含むペプチドは、コンプスタチンより３１〜２６４倍高い活性を有することが示された。１−メチルおよび１−ホルミルトリプトファンが特に好ましい。インドール「Ｎ」−介在水素結合は、コンプスタチンの結合および活性のために４位において必要ではないと考えられる。この水素結合の非存在、あるいは４位で水素を低級アルキル、アルカノイルまたはインドール窒素に置換することによる極性特性の低下は、コンプスタチンの結合および活性を高める。なんら特定の理論または作用メカニズムに制限されることなく、４位における疎水性相互作用または効果は、コンプスタチンとＣ３との相互作用を亢進すると考えられる。よって、Ｔｒｐアナログの４位におけるＴｒｐの修飾（例えば、当該技術分野で周知の方法に従って側鎖の構造を変化させること）、あるいは４位または７位における置換は、前記疎水性相互作用を維持し、または高め、上記に記載の８位および１３位における修飾と組み合わせて有益な修飾として本発明に包含される。このようなアナログは、当該技術分野で周知であり、以下に限定されないが、本明細書に例示されるアナログ、ならびにその置換されていないか、または別の置換された誘導体が含まれる。適当なアナログの例は、下記の刊行物および多くの文献を参照して見出しうる：Beene, et al., 2002, Biochemistry 41: 10262-10269（とりわけ、単一および複数ハロゲン化Ｔｒｐアナログを記載）；Babitzky & Yanofsky, 1995, J.Biol.Chem.270: 12452-12456（とりわけ、メチル化およびハロゲン化Ｔｒpおよび他のＴｒｐならびにインドールアナログを記載）；ならびに米国特許第６，２１４，７９０号、第６，１６９，０５７号、第５，７７６，９７０号、第４，８７０，０９７号、第４，５７６，７５０号および第４，２９９，８３８号。Ｔｒｐアナログは、インビトロまたはインビボ発現、あるいは当該技術分野で知られるようなペプチド合成によって、コンプスタチンペプチドに導入されうる。

【0057】

ある実施態様において、コンプスタチンの４位におけるＴｒｐは、１−アルキル基、より具体的には、上記に定義される低級アルキル（例えば、Ｃ_１〜Ｃ_５）基を含むアナログで置換される。これらとして、以下に限定されないが、Ｎ（α）メチルトリプトファンおよび５−メチルトリプトファンが挙げられる。他の実施態様において、コンプスタチンの４位におけるＴｒｐは、１−アルカノイル基、より具体的には、上記に定義される低級アルカノイル（例えば、Ｃ_１〜Ｃ_５）基、例えば、Ｎ（α）ホルミルトリプトファン、１−アセチル−Ｌ−トリプトファンおよびＬ−β−ホモトリプトファンを含むアナログで置換される。

【0058】

ＷＯ２００７／０６２２２４９では、コンプスタチンの７位における５−フルオロ−トリプトファンの導入は、コンプスタチンと比較して、得られたコンプスタチンアナログとＣ３との間の相互作用のエンタルピーを増加させる一方で、４位における５−フルオロ−トリプトファンの導入は、この相互作用のエンタルピーを減少させることが開示される。よって、７位におけるＴｒｐの修飾は、ＷＯ２００７／０６２２２４９に開示されるように、上記に記載のＮ末端修飾と組み合わせて有益な修飾として包含される。

【0059】

他の修飾は、ＷＯ２０１０／１２７３３６に記載される。この文献に開示される１つの修飾には、前記ペプチドの８位におけるペプチド骨格の制限が含まれる。特定の実施態様において、骨格は、８位におけるグリシン（Ｇｌｙ^８）をＮ−メチルグリシンに置換することによって制限される。この文献に開示される別の修飾には、１３位のＴｈｒをＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ（ノルロイシン）、Ｎ−メチルＴｈｒまたはＮ−メチルＩｌｅで置換することが含まれる。

【0060】

なお他の修飾は、同時係属出願第６１／３８５，７１１号に記載される。１つのこのような修飾には、Ｃ２またはＣ１２においてホモシステインを形成させるためのＣＨ_２の付加によるＣ２−Ｃ１２ジスルフィド結合の置換、ならびにガンマシスタチオニンまたはデルタシスタチオニンなどのシスタチオニンを形成するためのチオエーテル結合の導入が含まれる。別の修飾には、ランチチオニンを形成するための、ＣＨ_２を付加することなくチオエーテル結合によるＣ２−Ｃ１２ジスルフィド結合の置換が含まれる。チオエーテル結合を含むアナログは、一定のジスルフィド結合アナログと実質的に同一の活性であり、同等のまたは改善された安定性特性をも有する活性を示す。

【0061】

さらに他の内部修飾は、本出願に記載されている。例えば、一定のコンプスタチンアナログ（例えば、Ｃｐ２０，配列番号：３、Ｃｐ４０，配列番号：１８）の１１位におけるオルニチンのアルギニンへの置換、および／または６位におけるアスパラギンのアスパラギン酸への置換は、親化合物と同様の結合および補体阻害活性を有するアナログを生じる。さらに、これらの置換の１つまたは両方は、胃腸管、肝臓または血漿で見出される一定の生理的酵素による代謝に感受性が低いアナログとなることが期待される。

【0062】

本発明の修飾されたコンプスタチンペプチドは、従来のペプチド合成法に従って、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の縮合を介してペプチド合成の様々な合成方法により調製されうる。例えば、ペプチドは、標準的固相法によって合成される。固相法または液相のいずれかによるペプチドもしくはペプチド模倣物の他の合成方法は、当業者に周知である。ペプチド合成過程の間、分岐鎖アミノおよびカルボキシル基は、一般に公知の保護基を用いて、必要に応じて保護／脱保護されうる。適当なペプチド合成法の一例は、実施例１に説明されている。ペプチドおよびペプチド誘導体のための別の保護基を利用する修飾は、当業者に明らかである。

【0063】

あるいは、本発明の一定のペプチドは、適当な原核細胞系または真核細胞系における発現によって生成されうる。例えば、ＤＮＡ構築物は、細菌細胞（大腸菌など）または酵母細胞（出芽酵母など）における発現に用いられるプラスミドベクター、あるいは昆虫細胞における発現用のバキュロウイルスベクターまたは哺乳類細胞における発現用のウイルスベクターに挿入されうる。このようなベクターには、宿主細胞のＤＮＡを発現できるように配置された、宿主細胞のＤＮＡの発現に必要な調節エレメントが含まれる。このような発現に必要な調節エレメントとしては、プロモーター配列、転写開始配列、必要に応じて、エンハンサー配列が挙げられる。

【0064】

ペプチドはまた、インビトロまたはインビボで核酸分子の発現によって生成することができる。ペプチドの鎖状体をコードするＤＮＡ構築物（鎖状体の上限は、用いられる発現系に依存する）は、インビボ発現系に導入されうる。鎖状体が生成された後、Ｃ末端Ａｓｎおよびそれに続くＮ末端Ｇの間の切断は、ポリペプチドのヒドラジンへの露出によって達成される。

【0065】

組み換え原核細胞または真核細胞系における遺伝子発現によって生成されるペプチドは、当技術分野で周知の方法によって精製されうる。遺伝子発現および合成法の組み合わせはまた、コンプスタチンアナログを生成するために利用されうる。例えば、アナログは、遺伝子発現によって生成され、続いて１つまたはそれ以上の翻訳後合成プロセスにかけらて、例えば、ＮまたはＣ末端を修飾し、または分子を環化することができる。

【0066】

有利なことに、非天然アミノ酸、例えば、メチル化アミノ酸を取り込むペプチドは、適当な原核生物または真核生物系におけるインビボ発現によって生成されうる。例えば、非天然のＴｒｐアナログを大腸菌栄養要求株における発現を介してコンプスタチンに導入するKatragadda & Lambris (2006, Protein Expression and Purification 47: 289-295)によって開示されるような方法は、コンプスタチンの選択された位置にＮ−メチルかまたは他の非天然アミノ酸を導入するために利用されうる。

【0067】

コンプスタチンの構造は、当該技術分野で公知であり、前記アナログの構造は、同様の方法によって決定される。短いペプチドの特定の所望される構造が一旦突き止められると、その構造が適合するペプチドまたはペプチド模倣物を設計する方法は、当該技術分野で周知である。本発明に特に関連するもののうち、ペプチドアナログの設計は、上記に記載されるように（すなわち、官能基の効果または立体について）、アミノ酸残基の様々な側鎖の寄与を考慮してさらに改善されてもよい。

【0068】

ペプチド模倣物は、Ｃ３に結合し、補体活性を阻害するために必要とされる特定の骨格構造および側鎖官能性を提供するためのペプチドと同等に役に立ちうることが当業者によって評価される。よって、結合して適当な骨格構造を形成することができる天然に存在するアミノ酸、アミノ酸誘導体、アナログまたは非アミノ酸分子を用いて、Ｃ３に結合する補体阻害化合物を生成することは、本発明の範囲内として包含される。非ペプチドアナログ、またはペプチドおよび非ペプチド成分を含むアナログは、本明細書では、例示のペプチドと同様に十分に補体活性を阻害できるように、同一の骨格構造特徴および／または他の官能性を有する、本発明のペプチドの置換体または誘導体を示す「ペプチド模倣物」または「イソステリック（isosteric）模倣物」とも称される。

【0069】

高親和性ペプチドアナログの開発のためのペプチド模倣物の使用は、当該技術分野で周知である（例えば、Vagner et al., 2008, Curr.Opin.Chem.Biol.12: 292-296； Robinson et al., 2008, Drug Disc.Today 13: 944-951を参照のこと）。ペプチド内のアミノ酸残基と同様の回転制限を推定して、非アミノ酸部分を含むアナログが解析されてもよく、それらの構造モチーフは、当該技術分野で周知の様々なコンピュータ技術のいずれかによって調べられてもよい。

【0070】

本発明の修飾されたコンプスタチンペプチドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）成分のペプチドへの付加によって修飾することができる。当該技術分野で周知であるように、ＰＥＧ化は、インビボで治療用ペプチドおよびタンパク質の半減期を増加させることができる。ある実施態様において、ＰＥＧは、約１，０００〜約５０，０００の平均分子量を有する。別の態様において、ＰＥＧは、約１，０００〜約２０，０００の平均分子量を有する。別の態様において、ＰＥＧは、約１，０００〜約１０，０００の平均分子量を有する。例示的な実施態様において、ＰＥＧは、約５，０００の平均分子量を有する。前記ポリエチレングリコールは、分岐鎖であってもよく、直鎖であってもよく、好ましくは、直鎖である。

【0071】

本発明のコンプスタチンアナログは、連結基を介してＰＥＧに共有結合しうる。このような方法は、当該技術分野で周知である（Kozlowski A. et al.2001, BioDrugs 15: 419-29で総説される；Harris JM and Zalipsky S, eds. Poly(ethylene glycol), Chemistry and Biological Applications, ACS Symposium Series 680 (1997)も参照のこと）。許容可能な連結基の限定されない例としては、エステル基、アミド基、イミド基、カルバメート基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物基、コハク酸イミド基（以下に限定されないが、スクシンイミジルスクシネート（ＳＳ）、スクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ）、スクシンイミジルカルボキシメチレート（ＳＣＭ）、スクシンイミジルスクシンアミド（ＳＳＡ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）が含まれる）、エポキシド基、オキシカルボニルイミダゾール基（以下に限定されないが、カルボニルジミダゾール（ＣＤＩ）が含まれる）、ニトロフェニル基（以下に限定されないが、ニトロフェニルカルボネート（ＮＰＣ）またはトリクロロフェニルカルボネート（ＴＰＣ）が含まれる）、トリシレート基、アルデヒド基、イソシアネート基、ビニルスルホン基、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基または第一級アミン基が挙げられる。ある実施態様において、連結基は、コハク酸イミド基である。ある実施態様において、連結基は、ＮＨＳである。

【0072】

本発明のコンプスタチンアナログはまた、アミノ基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基を介して、ＰＥＧに直接カップリングすることができる（すなわち、連結基を含まない）。ある実施態様において、ＰＥＧは、コンプスタチンのＣ末端に付加されたリジン残基にカップリングされる。

【0073】

ＰＥＧ化の代わりとして、ペプチドのインビボクリアランスはまた、ペプチドを一定の他の分子またはペプチドに連結することによって減らすことができる。例えば、一定のアルブミン結合ペプチド（ＡＢＰ）は、静脈内ボーラスでウサギに注入されると、２．３時間の非常に長い半減期を示す（Dennis et al., 2002, J Biol Chem.277: 35035-35043）。このタイプのペプチドは、Ｄ３Ｈ４４の抗組織因子Ｆａｂに融合し、組織因子に結合するＦａｂの能力を保ちつつアルブミンに結合させることができる（Nguyen et al., 2006, Protein Eng Des Sel.19: 291-297）。このアルブミンとの相互作用は、マウスおよびウサギにおいて、ＰＥＧ化Ｆａｂ分子、イムノアドヘシンおよびアルブミン融合物について観察されるものに相当する野生型Ｄ３Ｈ４４ Ｆａｂと比較して、著しいインビボクリアランスの減少と半減期の持続を生じた。ＷＯ２０１０／１２７３３６は、ＡＢＰならびにアルブミン結合小分子（ＡＢＭ）を用い、必要に応じて、前記成分間にスペーサーまたはリンカーを用いる適当な合成法を説明する。これらの方法により、補体活性を阻害し、インビボで持続した残存を示すことができるＡＢＰおよびＡＢＭコンプスタチンアナログの抱合体が生成された。本明細書の実施例１は、より高い親和性のアルブミン結合小分子、ＡＢＭ２を用いるこれらの使用および他の方法を記載する。実施例１は、リンカーを含まない直接結合を用いた３つの異なるアルブミン結合小分子、ＡＢＭ、ＡＢＭ０およびＡＢＭ２を有する特定のコンプスタチンアナログのＮ末端抱合体の生成をさらに記載する。Ｃ末端、Ｎ末端に直接またはスペーサーまたはリンカーを介したこのような抱合体は、抱合されていないアナログに相当するか、当該アナログを超えるＣ３結合および補体阻害活性、ならびに好ましいインビボ保持を示す。

【0074】

コンプスタチンアナログ、ペプチド模倣物および抱合体の補体活性を阻害する活性は、 当該技術分野で公知の様々なアッセイによって試験されうる。ある実施態様において、実施例に記載のアッセイが用いられる。他のアッセイの包括的ではないリストは、以下に限定されないが、（１）Ｃ３およびＣ３フラグメントに結合するペプチド；（２）様々な溶血アッセイ；（３）Ｃ３のＣ３転換酵素を介した切断の測定；および（４）因子Ｄによる因子Ｂ切断の測定を含む、米国特許第６，３１９，８９７号、ＷＯ９９／１３８９９、ＷＯ２００４／０２６３２８、ＷＯ２００７／０６２２４９およびＷＯ２０１０／１２７３３６に記載される。

【0075】

本明細書に記載のペプチドおよびペプチド模倣物は、当該技術分野で知られるように、コンプスタチン自体が利用されるため、あらゆる目的についても実用的である。このような使用としては、以下に限定されないが：（１）患者（ヒトまたは動物）の血清、細胞、組織または器官における補体活性を阻害し、一定の疾患または病気（以下に限定されないが、加齢黄斑変性症、関節リウマチ、脊髄傷害、パーキンソン病、アルツハイマー病、癌、敗血症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、乾癬および呼吸器障害（例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー性炎症、肺気腫、気管支炎、気管支拡張症、嚢胞性線維症、結核、肺炎、呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ−新生児および成人）、鼻炎および副鼻腔炎など））の治療を促しうること；（２）細胞または臓器移植中に、あるいは人工臓器またはインプラントの使用時に生じる補体活性を阻害すること（例えば、本発明のペプチドを用いて、その方法の前、間および／または後の制限された全身投与による、あるいは細胞、臓器、人口臓器またはインプラントをコーティングし、さもなければ治療することによる）；（３）生理学的液体（血液、尿）の体外シャント手術の間に生じる補体活性を阻害すること（例えば、本発明のペプチドを用いて、その方法の前、間および／または後の制限された全身投与による、あるいはシャントされる液体を介してチューブをコーティングすることによる）；ならびに（４）コンプスタチン活性の他の阻害剤を同定するための小分子ライブラリーのスクリーニング時（例えば、Ｃ３またはＣ３フラグメントとの結合についてコンプスタチンアナログと競合する試験化合物の能力を測定するように設計された液相または固相ハイスループットアッセイ）が挙げられる。

【0076】

上記に記載の有用性のうちの１つ又はそれ以上を実施するために、本発明の別の態様は、本明細書に記載され、例示されるコンプスタチンアナログまたは抱合体を含む医薬組成物を特徴とする。このような医薬組成物は、対象への投与に適する形で活性成分のみからなっていてもよく、あるいは前記医薬組成物は、活性成分、ならびに１つまたはそれ以上の医薬的に許容される担体、１つまたはそれ以上のさらなる成分あるいはこれらの組み合わせを含んでいてもよい。前記活性成分は、当該技術分野で周知であるように、生理学的に許容されるカチオンまたはアニオンと組み合わせるなどして、生理学的に許容されるエステルまたは塩の形で、医薬組成物中に存在していてもよい。

【0077】

本発明の特定のコンプスタチンアナログは、その溶解特性に基づいて、特定の製剤について選択されていてもよい。上述したように、水または緩衝生理食塩水中に高い溶解性を有するアナログは、注入体積を最小とすることができるため、全身注入に特に適切でありうる。比較して、高い水溶解性および緩衝生理食塩水への低い溶解性を有するアナログは、局所適用または局所注入（例えば、眼内注射）のためのより持続的なゲル、懸濁液または沈殿物を生じる。よって、例示的なものであって、限定することを目的とするものではないが、Ｃｐ３０（配列番号：７）は、全身注入によって投与されるべき医薬製剤について選択されうるが、Ｃｐ４０（配列番号：１８）は、硝子体内注射のための製剤について選択されうる。特に、Ｃｐ４０（配列番号：１８）は、下記に記載されるように、経口で、ならびに皮下または筋肉内注射を介して利用可能であることが示されており、重要なさらなる送達手段を供する。

【0078】

医薬組成物の製剤は、医薬技術の分野で知られ、またはこれから開発される方法のいずれかで調製されうる。一般に、このような調製方法には、活性成分を、担体または１つまたはそれ以上の補助成分と一緒にし、次いで、必要であるか、所望であれば、前記生成物を所望される１回または複数回投薬単位に成形し、またはパッケージすることが含まれる。

【0079】

本明細書で用いられるように、用語「医薬的に許容される担体」は、コンプスタチンアナログが合わされていてもよく、この組み合わせがコンプスタチンアナログを個体に投与するために用いることができる化学組成物を意味する。

【0080】

本明細書で用いられるように、用語「生理学的に許容される」エステルまたは塩は、組成物が投与される対象に毒性ではない、医薬組成物のいずれの他の成分に適合する活性成分のエステルまたは塩の形態を意味する。

【0081】

本発明の実施に有用である医薬組成物は、当業者によって容易に決定されるように、単回ボーラスとして、または繰り返される投薬計画において、あるいはこれらの組み合わせで、１ｎｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の用量を送達するために投与されうる。ある実施態様において、その用量には、１日に、または別の適切な定期的な投薬計画において、少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも０．２ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも０．３ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも０．４ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも０．６ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも０．７ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも０．８ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも０．９ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも１ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも２ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも３ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも４ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも６ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも７ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも８ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも９ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも１５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも２０ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも２５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも３０ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも３５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも４０ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも４５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも５０ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも５５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも６０ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも６５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも７０ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも７５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも８０ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも８５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも９０ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも９５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも１００ｍｇ／ｋｇが含まれる。ある実施態様において、前記用量は、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または約２ｍｇ／ｋｇ〜約６ｍｇ／ｋｇである。

【0082】

ある実施態様において、本発明は、個体において約０．０１μＭ〜約３０μＭのコンプスタチンアナログの血清濃度を生じる用量の投与とされる。ある実施態様において、用量および投薬計画の組み合わせは、少なくとも約０．０１μＭ、または少なくとも約０．０２μＭ、または少なくとも約０．０３μＭ、または少なくとも約０．０４μＭ、または少なくとも約０．０５μＭ、または少なくとも約０．０６μＭ、または少なくとも約０．０７μＭ、または少なくとも約０．０８μＭ、または少なくとも約０．０９μＭ、または少なくとも約０．１μＭ、０．１１μＭ、または少なくとも約０．１２μＭ、または少なくとも約０．１３μＭ、または少なくとも約０．１４μＭ、または少なくとも約０．１５μＭ、または少なくとも約０．１６μＭ、または少なくとも約０．１７μＭ、または少なくとも約０．１８μＭ、または少なくとも約０．１９μＭ、または少なくとも約０．２μＭ、または少なくとも約０．３μＭ、または少なくとも約０．４μＭ、または少なくとも約０．５μＭ、または少なくとも約０．６μＭ、または少なくとも約０．７μＭ、または少なくとも約０．８μＭ、または少なくとも約０．９μＭ、または少なくとも約１μＭまたは少なくとも約１．５μＭ、または少なくとも約２μＭ、または少なくとも約２．５μＭ、または少なくとも約３μＭ、または少なくとも約３．５μＭ、または少なくとも約４μＭ、または少なくとも約４．５μＭ、または少なくとも約５μＭ、または少なくとも約５．５μＭ、または少なくとも約６μＭ、または少なくとも約６．５μＭ、または少なくとも約７μＭ、または少なくとも約７．５μＭ、または少なくとも約８μＭ、または少なくとも約８．５μＭ、または少なくとも約９μＭ、または少なくとも約９．５μＭ、または少なくとも約１０μＭ、または少なくとも約１０．５μＭ、または少なくとも約１１μＭまたは少なくとも約１１．５μＭ、または少なくとも約１２μＭ、または少なくとも約１２．５μＭ、または少なくとも約１３μＭ、または少なくとも約１３．５μＭ、または少なくとも約１４μＭ、または少なくとも約１４．５μＭ、または少なくとも約１５μＭ、または少なくとも約１５．５μＭ、または少なくとも約１６μＭ、または少なくとも約１６．５μＭ、または少なくとも約１７μＭ、または少なくとも約１７．５μＭ、または少なくとも約１８μＭ、または少なくとも約１８．５μＭ、または少なくとも約１９μＭ、または少なくとも約１９．５μＭ、または少なくとも約２０μＭ、または少なくとも約２０．５μＭ、または少なくとも約２１μＭまたは少なくとも約２１．５μＭ、または少なくとも約２２μＭ、または少なくとも約２２．５μＭ、または少なくとも約２３μＭ、または少なくとも約２３．５μＭ、または少なくとも約２４μＭ、または少なくとも約２４．５μＭ、または少なくとも約２５μＭ、または少なくとも約２５．５μＭ、または少なくとも約２６μＭ、または少なくとも約２６．５μＭ、または少なくとも約２７μＭ、または少なくとも約２７．５μＭ、または少なくとも約２８μＭ、または少なくとも約２８．５μＭ、または少なくとも約２９μＭ、または少なくとも約２９．５μＭ、または少なくとも約３０μＭのコンプスタチンアナログの血清濃度または長期間の平均血清濃度を生じる。ある実施態様において、用量および投薬計画の組み合わせは、約０．１μＭまで、または約０．１１μＭまで、または約０．１２μＭまで、または約０．１３μＭまで、または約０．１４μＭまで、または約０．１５μＭまで、または約０．１６μＭまで、または約０．１７μＭまで、または約０．１８μＭまで、または約０．１９μＭまで、または約０．２μＭまで、または約０．３μＭまで、または約０．４μＭまで、または約０．５μＭまで、または約０．６μＭまで、または約０．７μＭまで、または約０．８μＭまで、または約０．９μＭまで、または約１μＭまで、または約１．５μＭまで、または約２μＭまで、または約２．５μＭまで、または約３μＭまで、または約３．５μＭまで、または約４μＭまで、または約４．５μＭまで、または約５μＭまで、または約５．５μＭまで、または約６μＭまで、または約６．５μＭまで、または約７μＭまで、または約７．５μＭまで、または約８μＭまで、または約８．５μＭまで、または約９μＭまで、または約９．５μＭまで、または約１０μＭまで、または約１０．５μＭまでまたは約１１μＭまでまたは約１１．５μＭまで、または約１２μＭまで、または約１２．５μＭまで、または約１３μＭまで、または約１３．５μＭまで、または約１４μＭまで、または約１４．５μＭまで、または約１５μＭまで、または約１５．５μＭまで、または約１６μＭまで、または約１６．５μＭまで、または約１７μＭまで、または約１７．５μＭまで、または約１８μＭまで、または約１８．５μＭまで、または約１９μＭまで、または約１９．５μＭまで、または約２０μＭまで、または約２０．５μＭまでまたは約２１μＭまでまたは約２１．５μＭまで、または約２２μＭまで、または約２２．５μＭまで、または約２３μＭまで、または約２３．５μＭまで、または約２４μＭまで、または約２４．５μＭまで、または約２５μＭまで、または約２５．５μＭまで、または約２６μＭまで、または約２６．５μＭまで、または約２７μＭまで、または約２７．５μＭまで、または約２８μＭまで、または約２８．５μＭまで、または約２９μＭまで、または約２９．５μＭまで、または約２０μＭまでのコンプスタチンアナログの血清濃度または長期間の平均血清濃度を生じる。

【0083】

適する範囲には、約０．１〜約３０μＭ、または約１〜約２９μＭ、または約２〜約２８μＭ、または約３〜約２７μＭ、または約４〜約２６μＭ、または約５〜約２５μＭ、または約６〜約２４μＭ、または約７〜約２３μＭ、または約８〜約２２μＭ、または約９〜約２１μＭ、または約１０〜約２０μＭ、または約１１〜約１９μＭ、または約１２〜約１８μＭ、または約１３〜約１７μＭ、または約１〜約５μＭ、または約５〜約１０μＭ、または約１０〜約１５μＭ、または約１５〜約２０μＭ、または約２０〜約２５μＭ、または約２５〜約３０μＭが含まれる。投与される正確な用量は、以下に限定されないが、患者のタイプおよび治療される疾患状態、患者の年齢および投与経路などを含む多くの因子に応じて変動しうるが、このような用量は当業者によって容易に決定される。

【0084】

医薬組成物は、１日数回の頻度で患者に投与することができ、あるいは、１日１回、１週間に１回、２週間に１回、１ヶ月に１回、またはそれより少ない頻度、例えば、数ヶ月に１回もしくは１年に１回またはそれより少ない頻度で投与されてもよい。投薬頻度は、当業者にとって明らかであり、以下に限定されないが、上記に記載されるように、治療される疾患のタイプおよび重症度、患者のタイプおよび年齢などの多くの因子のいずれかによる。

【0085】

本発明の方法に有用である医薬組成物は、経口、非経口、眼（硝子体内を含む）、坐剤、エアロゾル、局所、経皮または他の同様の製剤で全身投与されうる。このような医薬組成物には、薬物投与を促進し、容易にすることが知られる医薬的に許容される担体および他の成分が含有されうる。他の製剤（例えば、ナノ粒子、リポソーム、再封入された赤血球および免疫学を基にしたシステム）はまた、本発明の方法によるコンプスタチンアナログを投与するために用いられてもよい。

【0086】

本明細書で用いられるように、医薬組成物の「経口投与」または「経腸投与」には、胃腸管に取り込まれることを特徴とする投与経路が含まれる。このような投与には、口ならびに経口胃または胃内経管栄養による供給が含まれる。このような投与にはまた、舌下、バッカル、鼻腔内、肺または直腸投与、当該技術分野で公知の他の経路などが含まれる。

【0087】

経口投与に適する医薬組成物の製剤には、様々な剤形中で医薬的に許容される担体と組み合わされた活性成分が含まれ、以下に限定されないが、いくつかの例を挙げると、丸剤、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、分散液、懸濁液、溶液、乳濁液、マイクロエマルション、ゲル剤およびフィルム剤（film）などが含まれる。このような製剤には、典型的に、活性成分の製剤化および送達を容易にするための担体および賦形剤が含まれる。

【0088】

医薬的に許容される担体は、タンパク質、炭水化物、脂質、有機および無機分子およびこれらの組み合わせから選択される。活性成分は、適当な希釈剤中で担体と合わせて、溶液または懸濁液を形成させることができる。このような液体製剤は、用いられる量および担体に依存して、粘稠性または非粘稠性でありうる。液体製剤は、直接用いることができ、あるいは当業者に公知の方法によって適当なカプセル、ゲル状カプセルまたは固形物にさらに製剤化することができる。あるいは、固体製剤は、固形成分を合わせることによって調製することができる。このような固体製剤は、粉末として用いられうるか、あるいは顆粒剤、カプセル剤、錠剤またはフィルム剤中に製剤化されて、それらのうちのいずれか１つは徐放性製剤として調製されうる。

【0089】

経口製剤中で担体として用いるために適するタンパク質としては、カゼインなどの牛乳タンパク質、カゼイン酸ナトリウム、乳清、低乳糖乳清、乳清タンパク質濃縮物、ゼラチン、大豆タンパク質（単離済み）、褐藻タンパク質、紅藻タンパク質、パン酵母エキスおよびアルブミンが挙げられる。適する炭水化物としては、セルロース（例えば、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸セルロースおよびエチルセルロースなど）、デンプン（例えば、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、タピオカデンプン、小麦デンプン、酸加工デンプン、アルファ化デンプンおよび未加工デンプンなど）、アルギン酸（例えば、アルギン酸アンモニウム、アルギン酸ナトリウム、およびアルギン酸カルシウム）、グルテン（例えば、トウモロコシグルテンおよび小麦グルテンなど）、ガム（例えば、アカシア（アラビアガム）、ガディガム、グアーガム、カラヤガム（アラヤガム）およびガム（トラガント）など）、不溶性グルコースイソメラーゼ酵素調製物、糖（例えば、トウモロコシ糖、転化糖、トウモロコシシロップ、ブドウ糖果糖液糖およびグルコン酸ナトリウムなど）が挙げられる。適する脂質としては、トコフェロール（例えば、酢酸α−トコフェロール）、短鎖、中鎖および長鎖脂肪酸およびそれらのエステル、脂肪族アルコールおよびそれらのエーテル、油（例えば、ココナッツ油（精製）、ダイズ油（水素化）およびナタネ油など）、パルミチン酸アルミニウム、チオジプロピオン酸ジラウリル、酵素処理したレシチン、ステアリン酸カルシウム、酵素処理した脂肪、パルミトステアリン酸グリセリン（glyceryl palmitostereate）、レシチン、モノおよびジグリセリド、グリセリンおよび蝋（例えば、蜜蝋（黄色および白色）、カンデリラ蝋およびカルナウバ蝋など）ならびに植物油が挙げられる。適する有機および無機物質としては、メチルおよびビニルピロリドン（例えば、ポリビニルピロリドン）、メチルスルホニルメタン、ジメチルスルホキシドおよびその関連化合物、ヒドロキシおよびポリヒドロキシ酸（例えば、ポリ乳酸）などが挙げられる。

【0090】

ある実施態様において、徐放性製剤は、吸収を改善し、代謝の一定の形態を阻害するために、胃腸におけるコンプスタチンアナログの持続的または局所特異的な放出を達成するために調製されうる。例えば、錠剤の耐酸性コーティング剤または耐酸性カプセル物質は、胃におけるコンプスタチンアナログの放出を防ぎ、この化合物を胃の酵素による代謝から保護するために用いられうる。胃を通過後の制御放出を達成するための適切な物質およびコーティング剤は、主に、脂肪酸、蝋、シェラック、プラスチックおよび植物繊維からなり、以下に限定されないが、アクリル酸メチル−メタクリル酸コポリマー、セルロースアセテートスクシネート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート（ヒプロメロースアセテートスクシネート）、ポリビニルアセテートフタレート、アルギン酸ナトリウムまたはステアリン酸などが含まれる。胃腸管における持続放出は、例えば、コンプスタチンアナログを、様々なアクリル系、キチン類などの不溶性物質のマトリックスに埋め込むことによって達成することができる。このような製剤の製造方法は、当業者に公知である。

【0091】

コンプスタチンは、直腸、膣または尿道投与のための座剤または浣腸に製剤化されうる。このために、コンプスタチンアナログは、室温で固形または半固形であるが、体温で融解するココアバターなどの脂肪性基剤担体中に、またはポリエチレングリコールまたはグリセリン（グリセロールおよびゼラチンから調製される）などの水溶解性固形基剤中に溶解し、または懸濁することができる。他の賦形剤は、製剤を改善するために加えられてもよく、座剤は、投与を容易にする形で成形される。他の実施態様において、小さいシリンジで投与される直腸送達に適する液体中に溶解され、または懸濁されるコンプスタチンアナログからなる液体座剤が用いられてもよい。

【0092】

補体活性が関連する慢性または急性肺疾患の治療において、医薬組成物の好ましい投与経路は、肺投与である。よって、本発明の医薬組成物は、口腔を介した肺投与に適する製剤中で製造され、包装され、または販売されてもよい。このような製剤は、活性成分を含み、約０．５〜約７ナノメータ、好ましくは、約１〜約６ナノメータの範囲の直径を有する乾燥粒子が含まれていてもよい。このような組成物は、便宜上、推進剤の気流が粉末を噴霧するようにされていてもよい乾燥粉末容器を含む装置を用いて、あるいは密封容器に低沸点推進剤中に溶解させ、懸濁させた活性成分を含む装置などの自己推進溶媒／粉末投薬容器を用いた投与用の乾燥散剤の形態である。好ましくは、このような散剤には、粒子重量の少なくとも９８％が、０．５ナノメータ以上の直径を有し、粒子数の少なくとも９５％が、７ナノメータ以下の直径である粒子が含まれる。より好ましくは、粒子重量の少なくとも９５％は、１ナノメータ以上の直径を有し、粒子数の少なくとも９０％は、６ナノメータ以下の直径を有するものである。乾燥粉末組成物には、好ましくは、糖などの固体微細粉末希釈剤が含まれ、単位製剤で利便的に供される。

【0093】

低沸点推進剤には、一般に、大気圧で６５°Ｆ以下の沸点を有する液体推進剤が含まれる。一般に、推進剤は、組成物の５０〜９９．９％（ｗ／ｗ）を占めていてもよく、活性成分は、組成物の０．１〜２０％（ｗ／ｗ）を占めうる。推進剤は、液体非イオン性または固形アニオン性界面活性剤または固形希釈剤（好ましくは、活性成分を含む粒子と同一オーダーの粒子サイズを有する）などのさらなる成分をさらに含んでいてもよい。

【0094】

肺送達のために製剤化された本発明の医薬組成物はまた、溶液または懸濁液の液滴の形態で活性成分を提供しうる。このような製剤は、活性成分を含む、必要に応じて滅菌されていてもよい水性または希アルコール溶液または懸濁液として製造され、包装され、または販売されていてもよく、噴霧または微粒子装置を用いて利便的に投与されてもよい。このような製剤には、以下に限定されないが、香料（例えば、サッカリンナトリウムなど）、揮発性油、緩衝剤、界面活性剤（置換肺サーファクタントを含む）または保存剤（例えば、メチルヒドロキシベンゾエート）を含む１つまたはそれ以上のさらなる成分がさらに含まれていてもよい。この投与経路によって供される液滴は、好ましくは、約０．１〜約２００ナノメータの範囲の平均直径を有する。

【0095】

肺送達に有用である本明細書に記載の製剤はまた、本発明の医薬組成物の鼻腔内送達にも有用である。

【0096】

鼻腔内投与に適する別の製剤は、活性成分を含み、約０．２〜５００マイクロメータの平均粒子を有する粗い粉末である。このような製剤は、嗅ぎ薬の様式で、すなわち、鼻の近くに固定した粉末の容器から経鼻を介した急速な吸入で投与される。

【0097】

経鼻投与に適する製剤は、例えば、活性成分の約０．１％（ｗ／ｗ）〜１００％（ｗ／ｗ）が含まれていてもよく、本明細書に記載の１つまたはそれ以上のさらなる成分がさらに含まれていてもよい。

【0098】

本明細書で用いられるように、医薬組成物の「非経口投与」には、対象の組織の身体的な切り目によって特徴付けられる投与経路および組織の切り目を介した医薬組成物の投与が含まれる。よって、非経口投与には、以下に限定されないが、組成物の注射、外科的な切開による組成物の適用、組織を浸透する非外科的な創傷による組成物の適用によるなどの医薬組成物の投与が含まれる。特に、非経口投与には、以下に限定されないが、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、関節内、硝子体内、胸骨内注射、および腎臓透析注入技術が含まれるものとされる。

【0099】

非経口投与に適する医薬組成物の製剤には、滅菌水または滅菌等張生理食塩水などの医薬的に許容される担体と合わせた活性成分が含まれる。このような製剤は、ボーラス投与または持続投与に適する形態で製造され、包装されまたは販売されうる。注射可能な製剤は、単位製剤で、例えば、アンプルまたは保存剤を含有する複数回投薬容器で製造され、包装されまたは販売されうる。非経口投与のための製剤としては、以下に限定されないが、懸濁液、溶液、油性もしくは水性ベヒクル中の乳濁液、ペーストおよび移植可能な徐放性もしくは生物分解性製剤が挙げられる。このような製剤には、以下に限定されないが、懸濁剤、安定化剤または噴霧剤を含む１つまたはそれ以上のさらなる成分がさらに含まれうる。非経口投与のための製剤のある態様において、活性成分は、再構成される組成物を非経口投与前に適切なベヒクル（例えば、滅菌した発熱物質を含まない水）で再構成するために乾燥（すなわち、粉末または造粒）形態で供される。

【0100】

医薬組成物は、滅菌した注射可能な水性もしくは油性懸濁液または溶液の形態で製造され、包装されまたは販売されうる。この懸濁液または溶液は、公知の技術によって製剤化することができ、活性成分に加えて、本明細書に記載の分散剤、湿潤剤または懸濁剤などのさらなる成分が含まれていてもよい。このような滅菌した注射可能な製剤は、非毒性の非経口で許容可能な希釈剤または溶媒（例えば、水または１，３−ブタンジオールなど）を用いて調製されうる。他の許容可能な希釈剤および溶媒としては、以下に限定されないが、リンガー溶液、等張塩化ナトリウム溶液および固定油（例えば、合成モノもしくはジグリセリド）が挙げられる。有用である他の非経口で投与可能な製剤には、微結晶形態、リポソーム製剤、超音波放出送達のための微小気泡で、または生物分解性ポリマー系の構成成分として活性成分を含むものが挙げられる。徐放または注入のための組成物には、医薬的に許容されるポリマー性または疎水性物質、例えば、乳濁液、イオン交換樹脂、難溶性ポリマーまたは難溶性塩が含まれうる。

【0101】

本明細書で用いられるように、「さらなる成分」としては、以下に限定されないが、下記：賦形剤；置換肺サーファクタントを含む界面活性剤；分散剤；不活希釈剤；造粒剤および崩壊剤；結合剤；滑沢剤；甘味剤；香料；着色剤；保存剤；生理学的に分解される組成物（例えば、ゼラチン）；水性ベヒクルおよび溶媒；油性ベヒクルおよび溶媒；懸濁剤；分散剤または湿潤剤；乳化剤、粘滑剤；緩衝剤；塩；増粘剤；充填剤；乳化剤；抗酸化剤；抗生物質；抗真菌薬；安定化剤；および医薬的に許容されるポリマー性もしくは疎水性物質のうちの１つまたはそれ以上が含まれる。本発明の医薬組成物に含まれうる他の「さらなる成分」は、当該技術分野で公知であり、例えば、Genaro, ed., 1985, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PAに記載される。

【0102】

方法：
本発明の別の態様は、補体活性を調節する方法を特徴とする。一般に、前記方法は、本発明のコンプスタチンアナログによる補体活性の調節が好ましい媒体を接触させることを特徴とし、接触は、媒体における補体活性の調節を生じるものである。前記媒体は、補体活性の調節が所望される媒体のいずれかでありうる。ある実施態様において、前記媒体には、（１）培養された細胞または組織、（２）対象または患者の体内の細胞または組織、および（３）ある対象の体から取り出され、その同じ患者の体に戻され（例えば、血液の体外循環または自己移植）、または別の患者に移される細胞または組織を含む、生物の細胞または組織が含まれる。後者の実施態様に関して、前記培地には、体外循環中に細胞または組織と接触させるチューブ、フィルターまたは膜などの生体材料がさらに含まれうる。あるいは、前記媒体には、対象に移植される生体材料が含まれうる。

【0103】

ある実施態様において、補体活性の調節方法は、生きている患者または対象に適用し、補体活性、特に、ＡＰ介在補体活性に関連する疾患状態の患者の治療方法の一部または全てを特徴とする。多くのこのような疾患状態は、当該技術分野で公知であり（例えば、上記のHolers, 2008を参照のこと）、以下に限定されないが、非定型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、デンスデポジット病、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、寒冷凝集素症（ＣＡＤ）、関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、数種の自己免疫および自己炎症性腎疾患、自己免疫心筋炎、多発性硬化症、外傷性脳および脊髄傷害、腸および腎臓の虚血再灌流（ＩＲ）傷害、自発性および再発性妊娠損失、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、アルツハイマー病、喘息、抗核細胞質抗原関連微量免疫血管炎（ウェジナー肉芽腫症）、非ループス自己免疫皮膚疾患（例えば、天疱瘡、水疱類天疱瘡および表皮水疱症）、外傷後ストレス、癌の一定の形態およびアテローム性動脈硬化症が含まれる。特定の実施態様において、疾患状態は、ＦＨおよび／またはＣＤ４６をコードする遺伝子における突然変異および多型に関連するものであり、以下に限定されないが：ＡＭＤ、ａＨＵＳおよび膜性増殖性糸球体腎炎ＩＩ型（ＭＰＧＮ−ＩＩ、デンスデポジット病（ＤＤＤ）とも呼ばれる）が含まれる。他の実施態様において、本発明のコンスタチンアナログは、現在処方されているか、または前臨床試験および臨床試験で開発されているエクリズマまたはＴＴ３０の代わりとしての使用に適する。これらの疾患としては、以下に限定されないが、ａＨＵＳ、ＰＮＨ、ＣＡＤおよびＡＭＤが挙げられる。

【0104】

治療方法は、典型的に、（１）上記に記載の補体活性の調節によって治療可能な疾患または病気にかかっている対象を同定し、次いで（２）前記対象に、治療される状態に適当な治療投薬計画および期間を用いて、有効量の本発明のコンプスタチンアナログを投与することを含むことを特徴とする。適当な投与量および治療投薬計画の作成は、下記に限定されないが、治療される患者のタイプおよび疾患状態のタイプ、患者の年齢および投与経路などを含む多くの因子に依存して変動する。当業者は、このような変動を考慮して、投薬計画を設計することに精通している。例えば、本発明のコンプスタチンアナログの経口投与が、例えば、静脈内注射と比較される経路よりバイオアベイラビリティが低いため、より高い初期投薬量が必要とされることは、当業者にとって明らかである。

【0105】

下記の実施例は、本発明をより詳細に説明するために提供される。それらは、本発明を例示するためであって、限定することを意図するものではない。

【実施例】

【0106】

実施例１
本実施例は、Ｎ末端が修飾されたコンプスタチンアナログおよびアルブミン結合小分子に対する一定のアナログ抱合体の合成を説明する。

【0107】

化学物質
ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡレジン、Ｏｘｙｍａおよび下記のＦｍｏｃ−アミノ酸は、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（カリフォルニア州、サンディエゴ）から入手した：Ｉｌｅ、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｖａｌ、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ｇｌｙ、Ｓａｒ、Ａｌａ、ＭｅＡｌａ、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、ＭｅＩｌｅ、Ｐｈｅ、ＭｅＰｈｅおよびＤ−Ｃｈａ。ＤＩＣおよびＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｍｅ）−ＯＨは、ＡｎａＳｐｅｃ（カリフォルニア州、サンノゼ）から購入した。ＨＯＡｔは、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ（ケンタッキー州、ルイビス）から購入した。ＮＭＰおよびＤＣＭは、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ペンシルベニア州、ピッツバーグ）から入手した。合成のための他の全ての化学試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州、セントルイス）から購入し、さらに精製することなく使用した。

【0108】

ペプチド合成および精製
全てのペプチドは、ＤＩＣおよびＯｘｙｍａをカップリング試薬として用いて、Ｆｍｏｃ固相法によって手動で合成した。下記の手順は直鎖ペプチドの合成に用いた：ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡレジン（０．５９ｍｍｏｌ／ｇ）を、底にフリットを備えたペプチド合成ガラス管に入れ、ＤＣＭ中で３０分間膨張させた。Ｆｍｏｃ保護基を除去し（ＮＭＰ中で２５％ ピペリジン、５および１０分）、レジンを、ＮＭＰで７回、ＤＣＭで２回洗浄し、各アミノ酸をレジンにカップリングさせた。各カップリングについて、３当量のアミノ酸、ＨＯＡｔおよびＤＩＣを、ＮＭＰで１０分間前もって活性化して用いた。全てのカップリングは、１時間行い、カイザー試験またはクロラニル試験のいずれかでモニターした。陽性の試験結果の場合、カップリングは、陰性の試験結果が観察されるまで繰り返した。合成は、１位のＣｙｓのカップリング後に停止した。続いて、前記レジンを、底にフリットを備えるＨＳＷポリプロピレンシリンジ（ミシガン州、トルビック、ナイルズ）中で割り、さらなる量のアミノ酸を以前に報告された方法を用いてカップリングした。

【0109】

固相合成の終了後、前記レジンを、ＮＭＰ、ＤＣＭおよびＤＣＭ／ジエチルエーテル（１：１）で４回洗浄し、高真空下で４時間乾燥させた。前記ペプチドを、９４％ ＴＦＡ、２．５％ 水、２．５％ ＥＤＴおよび１％ ＴＩＰＳの混合物でレジンから２時間で分離した。ＴＦＡを減圧下で蒸発し、ペプチドを沈殿させ、冷ジエチルエーテルで３回洗浄した。液体を遠心分離で固体から分離し、移した。粗ペプチドを減圧下で乾燥させ、３０％ アセトニトリル中に溶解させた。溶液のｐＨを、濃水酸化アンモニウムを用いて８〜９に調整した。該溶液に、希釈した過酸化水素（１：１００，２当量）を激しく攪拌しながら加えた。環化は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを用いてモニターした。反応が終了したら、該溶液を、ＴＦＡでｐＨを２まで低くした。続いて、該溶液を凍結乾燥させた。粗ペプチドを、上記に記載されるように（上記のQu et al., 2011）ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製した。精製したペプチドは、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ００Ｇ−４０４１−Ｅ０ Ｌｕｎａ ５ｍ Ｃ１８ １００Ａカラム，２５０ｘ４．６０ｍｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，カリフォルニア州、トランス）によって調べると＞９５％であった。各ペプチドの質量は、Ｗａｔｅｒｓ ＭＡＬＤＩ ｍｉｃｒｏ ＭＸ装置またはＳｙｎａｐｔ ＨＤＭＳを用いて確認した。

【0110】

一定のコンプスタチンアナログをアルブミン結合小分子に抱合させ、その例を下記に示す。

【化1】

【化2】

【化3】

【0111】

ある構築物において、ＡＢＭ２は、ＷＯ２０１０／１２７３３６に記載の方法に従って、ｍｉｎｉ−ＰＥＧ−３スペーサーを介して、ペプチドＣｐ３０（配列番号：７；下記の表１）のＣ末端にカップリングさせた。

【化4】

【0112】

他の構築物において、ＡＢＭ、ＡＢＭ０またはＡＢＭ２は、スペーサーなしでＣＰ２０（配列番号：３）またはＣＰ４０（配列番号：１８）のＮ末端にカップリングさせた。

【0113】

実施例２
実施例１に記載の方法で合成したコンプスタチンアナログを、Ｃ３結合および補体阻害活性について測定した。

【0114】

材料および方法：
補体活性の阻害
補体の古典的経路の活性を阻害するコンプスタチンアナログの能力は、以前に記載されるようなＥＬＩＳＡによって評価した（上記のKatragadda et al., 2006；上記のMallik et al., 2005）。パーセント阻害をペプチド濃度に対してプロットし、得られたデータセットは、Ｏｒｉｇｉｎ ８．０ソフトウェアを用いて、ロジスティックス用量反応関数に適合させた。ＩＣ_５０値は、適合させたパラメータから得て、最低χ^２値を生じた。各アナログは、少なくとも３回アッセイした。

【0115】

ＳＰＲ解析
コンプスタチンアナログとＣ３ｂとの相互作用は、Ｂｉｏｃｏｒｅ３０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃｏｒｐ．，ニュージャージー州、ピスカタウェイ）を用いて特徴付けた。流動緩衝液は、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４（１０ｍＭ リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）であった。ビオチン化Ｃ３ｂは、約３０００および５０００ＲＵの密度でストレプトアビジンチップ上にて部位特異的に捕捉した；２つの未処理のフローセルを対照表面として使用した。動力学的解析については、５つの高濃度の一定の化合物のセットを１回のサイクルで順番にチップ表面に注入した。３倍希釈シリーズ（０．４９〜４０ｎＭ）を３０ｕｌ／分で注入した；各注入を２分間行い、毎回ペプチドを次の注入を開始する前５分間で解離させた。最後の注入が終わった後４０分間解離させた。ペプチド４（１ＭｅＷ）は、内部対照および標準として各実験に含ませた。データ解析は、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ（ＢｉｏＬｏｇｉｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，オーストラリア、キャンベル）およびＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃｏｒｐ．，ニュージャージー州，ピスカタウェイ）を用いて行った。未処理のフローセルおよび緩衝液ブランクの集団からのシグナルを差し引いて、緩衝液の効果および注入の人為的な影響について補正した。処理したバイオセンサーデータは、１：１のラングミュア結合モデル（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから好意で提供）に広く適合させ、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）は、式 Ｋ_Ｄ＝ｋ_ｄ／ｋ_ａから算出した。各アッセイを少なくとも２回行った。

【0116】

ペプチドのＣ３ｃへの結合
ＡｕｔｏＤｏｃｋ Ｖｉｎａ（Trott and Olson, 2010）を結合実験に用いた。固定される場合にのみ操作できる環状コア領域の骨格を除いて、ペプチドの全ての他の部分（末端残基、側鎖）は、結合流動中で可撓性であるとして特定した。アナログＣｐ２０（配列番号：３）のＮ末端付近のＣ３ｃの残基（すなわち、Ａｓｐ３４９、Ｌｙｓ３８６、Ｓｅｒ３８８、Ａｓｎ３９０、Ｓｅｒ４３７、Ａｓｎ４５２、Ｌｅｕ４５４、Ａｓｐ４９１およびＬｅｕ４９２）は、これらのペプチドの伸びたＮ末端とＣ３ｃとの間のより十分な相互作用を可能にするため、結合実験において可撓性であるとして特定した。ペプチド１９のみが例外であり、このＮ末端は、他のペプチドのように伸長しなかった；よって、Ｃ３ｃ上の結合部位は、ペプチド１９の結合時に固定されたままであった。全てのペプチドの最初の構造は、４Ｗ９ＡのＣ３ｃの結合構造に基づいてＰｙＭｏｌで手動にて構築した。ＡｕｔｏＤｏｃｋＴｏｏｌを用いて、結合ポケットを特定し、Ｖｉｎａ（ｐｄｂｑｔ）．５５のｐｄｂフォーマットからインプットフォーマットで、Ｃ３ｃおよび全ペプチドの最初の構造を作成した。コンピュータおよび実験の結合遊離エネルギー（ＤＧ）の比較プロットにおいて、実験ＤＧは、Ｒ＝１．８６ｃａｌＫ^−１ｍｏｌ^−１およびＴ＝２９３．１５Ｋを用いてＤＧ＝ＲＴｌｎ（ＫＤ）としてＳＰＲによって決定される結合値から算出した。

【0117】

結果：
Ｎ末端伸長の構造／活性
分子モデリング法を用いて、初期のコンプスタチンアナログ４Ｗ９Ａを、標的フラグメントＣ３ｃとの共結晶構造においてＣｐ２０（配列番号：３）に置換した。この複合体のコンピュータ解析により、Ｓａｒ８のメチル基がＣ３ｃにおけるＧ４８９の酸素原子と接触することが確認された（距離〜４．０Å）。結合部位のさらなる解析により、ペプチドリガンドのＮ末端伸長に利用されうるＣ３ｃ上の疎水性領域の存在も明らかになった。Ｃ３ｃの結合ポケットに埋もれることなく、コンプスタチンのＮ末端は、主に、アセチル部分によって保護されてペプチドの安定性を向上させていたが；このようなキャッピングはまた、阻害能に関しても有益な効果を有していた。このリード化合物Ｃｐ２０（配列番号：３）に基づいて、標的結合に対してＮ末端アセチル部分を置換する効果を評価した（表１）。このために、アナログを、Ｃ３ｂに対するこれらの結合についての定量的動態プロファイリングにかけ、臨床的に用いられるアナログ４（１ＭｅＷ）およびＣｐ２０（配列番号：３）と比較した（表１，図１）。実際に、末端アセチルを短いメチル基に置換すると（ペプチド１）、４（１ＭｅＷ）の親和性よりほぼ１桁低い親和性まで低下し、それによりＮ末端キャッピングの有効性が確認された。対照的に、グリシン残基によるキャッピング（ペプチド２）により、会合速度（ｋ_ａ）はわずかに低下するが、解離速度（ｋ_ｄ）が改善され、（Ｃｐ２０（配列番号：３）と比較して）親和性において非常に小さな正味変化のみを生じた。ＧｌｙのＳａｒへのＮ−メチル化（ペプチド３）は、有益な解離値を維持しつつ会合特性を回復し、著しく改善した親和性を有する化合物を生じた（Ｋ_Ｄ＝１．６ｎＭ；表１）。

【0118】

Ｎ末端最適化の利益をさらに探索するために、ＸａａＯ位において、天然（ペプチド４〜８）、メチル化（ペプチド９〜１３）およびＤ−アミノ酸（ペプチド１４〜１８）を有するさらなるＣｐ２０（配列番号：３）を基にしたアナログ（図１Ｂ；表１）をスクリーニングした。このセットには、代表的な疎水性、親水性および荷電した側鎖が含まれた。全ての試験化合物は、Ｋ_ａ値（１〜４×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１）が全パネルを通してＫ_ｄ値（１〜２５×１０^−３ｓ^−１）より低い変動を示しつつ、強力な結合（Ｋ_Ｄ＜２０ｎＭ）を示した（表１，図１Ｂ）。全てのアナログは、Ｃ３ｂへの結合についてスクリーングする際に１：１ラングミュア動態モデルを行い、これにより単一の高い親和性結合部位の存在が強く示された。一般に、疎水性側鎖を有するＤ−アミノ酸は、Ｃｐ２０（配列番号：３）のアセチル（Ａｃ）部分より好ましいようである。これらのうち、この位置にＤＴｙｒを有するペプチド１４が最も能力が高く、ｎｍ以下の親和性（Ｋ_Ｄ＝０．５ｎＭ；表１）および図中のうちの最も遅延した解離速度を示した。Ａｃが他のアミノ酸によって置換されたペプチドの親和性は、ペプチド１および１４の間にあり、大半のアナログはＣｐ２０（配列番号：３）のプロファイル付近に密集した（図１Ｂ）。チロシンは、一般に、Ｎ末端Ｔｙｒを有する全てのペプチド、そのＯ−メチルアナログおよびそのＤ−アイソフォームが、１ｎＭ付近またはそれ以下の親和性を有する最も優れた結合剤に順位付けされることから、好ましいようである。対照的に、Ｇｌｙ、ＴｈｒまたはＡｌａ誘導体のような短い側鎖を有する残基は、あまり好ましくないようであり、Ｃｐ２０（配列番号：３）と比較して親和性が向上しなかった。よって、キャッピングＸａａ０残基の置換は、疎水性から荷電性までの様々な特性を有する広範囲のアミノ酸残基について十分に耐容性を有しうる。
表１．Ｎ末端が修飾された一連のコンプスタチンアナログ（Ｘａａ０−Ｘａａ１−［Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ（Ｍｅ）−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｓａｒ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ］−ｍＩｌｅ−ＮＨ_２）（配列番号：４）の動力学的パラメータおよび阻害能力の評価。Ｋ_ａ：会合速度；ｋ_ｄ：解離速度；Ｋ_Ｄ：ＳＰＲからの結合定数；ＩＣ_５０、古典的経路の補体活性の５０％阻害を達成するためのペプチド濃度。ＮＤ：調べていない。

【表1】

^ａＡｃ−Ｉｌｅ−［Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ（Ｍｅ）−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ］−Ｔｈｒ−ＮＨ_２（上記のKatragadda et al., 2006、ＷＯ２００７／０６２２４９；本明細書では「４（１ＭｅＷ）」とも称されることがある）は、全ての解析において標準として含ませたが、Ｃｐ２０（配列番号：３）鋳型については調べていない。
^ｂＮ末端修飾の基本化合物；以前の公開（ＷＯ２０１０／１２７３３６）からの結合／能力の値。
^ｃさらに試験するために選択した：ペプチド３−Ｃｐ３０（配列番号：７）；ペプチド１４−Ｃｐ４０（配列番号：１８）。

【0119】

コンピュータ解析
持続結合解析は、結合親和性において観察された効果の構造上の証拠を提供し、予測される新規なアナログのコンピュータモデルを作成するために行った。まず、結合の方策は、Ｃｐ２０（配列番号：３）のＮ末端を修飾したアナログのスクリーニング（ペプチド１−１８；表１）からのデータセットを用いて検証した。このために、前記化合物をコンピュータ上で作成し、ヒトＣ３ｃのコンプスタチン結合ポケットに結合させ（上記のJanssen et al., 2007）、結合遊離エネルギー（ＤＧ）を算出し、ピアソン係数を調べることによってＳＰＲ親和性から生じた値を比較した（Ｒ、図２）。実験上および理論上のＤＧ値間の全体の相関は、全データセットに対する５つの独立した結合実験に基づいて０．４６であった（図２）。データセットの１９個のアナログ以外に、非常に短い部分（メチル；ペプチド１）または芳香族性天然アミノ酸（ペプチド５および７）のいずれかを保有する３つのペプチドは、極めて高い偏差を示し；これらのアナログを除いた場合、相関は、０．６９まで増加した（図２）。

【0120】

結合したペプチドのより詳細な解析により、Ｎ末端が修飾されたコンプスタチンアナログのほとんどがＣ３ｃにおける極性領域および浅いポケットとさらなる接触を形成することが示された。例えば、Ｃ３ｃのＡｓｐ３４９、Ｓｅｒ３８８およびＳｅｒ４３７に関連する極性領域は、ペプチド１４におけるＤＴｙｒのＮ−末端アミノ基と相互作用する（図３Ａ）。対照的に、このような極性相互作用は、ペプチド４に例示されるように、アミノ基の異なる方向性のため、この位置の天然アミノ酸残基を保有するペプチドには好ましくない（図２Ａ）。さらに、ペプチド１４における伸長したアミノ酸（ＤＴｙｒ）の側鎖は、Ｃ３ｃにおける浅い伸長ポケットのＬｅｕ４５４およびＬｅｕ４９２とさらなる疎水性の接触を形成する。最終的に、ＤＴｙｒのヒドロキシル基は、Ｃ３ｃのＡｓｎ４５２と弱い水素結合を形成した。これらの効果の組み合わせが、ペプチド１４の観察されたｎＭ以下の結合親和性の要因となっているようである。

【0121】

Ｎ末端ポケットに対応するための別の方策をさらに探索するために、芳香族残基がＸａａ０またはＸａａ１に位置する２つのアナログを設計した（ペプチド１９および２０；表１）。上記で開発したコンピュータモデルに基づいて、ペプチド１９の新たなＴｒｐの側鎖を疎水性結合ポケットに十分に適合するように予測し（図３Ｂ）、短い可撓性Ｇｌｙリンカーをペプチド２０中で選択することにより、ホモログペプチド４と比較してＴｙｒ側鎖のより良好な方向性を可能にした。ペプチド２０がペプチド４より３倍弱い結合親和性を示したが、ペプチド１９は、ｎＭ以下の結合親和性（Ｋ_Ｄ＝０．５ｎＭ；表１）に達し、ペプチド１４と同様に強力であった。同時に、これらの結果は、２位でＣｙｓに隣接する適切に方向付けられた疎水性残基の有益性を示す。

【0122】

さらなるアナログは、Ｃｐ４０（ペプチド１４，配列番号：１８，表１）に基づいて構築した。これらを下記の表２に示す。
表２．ペプチド内が修飾されたＣｐ４０（配列番号：１８）を基にしたアナログの動力学的パラメータおよび阻害能の評価。ペプチド表記内の番号は、コンプスタチンに対する相対的な位置を示す。
ｋ_ａ：会合速度；ｋ_ｄ：解離速度；Ｋ_Ｄ：ＳＰＲからの結合定数；ＩＣ_５０，古典的経路の補体活性の５０％阻害を達成するためのペプチド濃度。

【表2】

^ａ１１位のアルギニンについて置換したオルニチン。
^ｂ６位のアスパラギン酸について置換したアスパラギン。

【0123】

上述したように、ＡＢＭ、ＡＢＭ０またはＡＢＭ２は、ＣＰ２０（配列番号：３）またはＣＰ４０（配列番号：１８）およびその一定の変異型のＮ末端にスペーサーなしでカップリングした。これらのアナログは、表２で説明されるＣｐ４０アナログおよびその誘導体と同一の範囲において結合および補体阻害活性を示した。

【0124】

実施例３
実施例１に記載されるように合成した一定のコンプスタチンアナログは、注射用水（ＷＦＩ）およびダルベッコＰＢＳ（ＤＰＢＳ）中の溶解性について測定した。

【0125】

材料および方法：
各ペプチド（酢酸型）の約５ｍｇを別個のＬｏＢｉｎｄ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに量り分け、５０μＬの注射用水（ＷＦＩ）を各チューブに加えた。各試料を１３０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光高度計（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，デラウェア州、ウィルミントン）を用いて２８０ｎｍで光学濃度（ＯＤ）を測定するために希釈した。各濃縮した試料を、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ、カリウムおよびカルシウムを含まない；インビトロジェン，カリフォルニア州、カールスバッド）中で１：２０に希釈した。前記試料を沈殿についてモニターし、各試料を５分間ボルテックスにかけ、１３０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。各ＤＰＢＳ上澄み液のＯＤを測定して、ペプチド飽和濃度を調べた。

【0126】

結果：
ほとんどのコンプスタチンアナログ中の３つの酸性または塩基性残基（Ａｓｐ６、Ｈｉｓ１０、Ａｒｇ１１）の存在が水溶液中の一般に好ましい溶解性の一因となるが、これらの双性特性は、緩衝溶液中では悪影響を及ぼすこともありうる。よって、２つの臨床的に関連する溶媒、すなわち、注射用水（ＷＦＩ）およびダルベッコＰＢＳ（ＤＰＢＳ）における選択した化合物の溶解性を評価した。さらに、Ｃ１８カラムにおけるこれらのペプチドの超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）保持時間は、それらの見掛けの相対疎水性を評価するために測定した（表３）。
表３．ＷＦＩ（注射用水）およびＤＰＢＳ中のペプチドの溶解性、ならびに疎水性の指標としてのＵＰＬＣ（超高速液体クロマトグラフィー）保持時間。

【表3】

^ａ飽和状態でのＯＤ（２８０ｎｍ）として測定した；ＷＦＩ＝注射用水、ＤＰＢＳ＝ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水
^ｂＣ１８カラムに対するＵＰＬＣ解析間の保持時間として測定した。
^ｃペプチド１９は、ＥＬＩＳＡ実験中、ＰＢＳ中に１００μＭまたはそれ以上で溶解できなかった。

【0127】

ＷＦＩ中での溶解性は、Ｃｐ２０（配列番号：３）を除いて全ての化合物について５０ｍｇ／ｍＬ以上の値で優れていた。一般に、ＤＰＢＳ中での溶解性は、全てのアナログについて著しく低い。両方の溶媒中での４（１ＭｅＷ）と比較したＣｐ２０（配列番号：３）の減少した溶解性は、２つのＮ−メチル化（８および１３位）およびＣ末端ＴｈｒからＩｌｅへの置換から生じるその疎水性の結果と考えられる。キャップされていないアミノ酸による４（１ＭｅＷ）およびＣｐ２０（配列番号：３）におけるＮ末端アセチル部分の置換は、Ｃｐ３０（配列番号：７）およびＣｐ４０（配列番号：１８）においての親水性の顕著な獲得を生じ、ＷＦＩ中でのそれらの高い水溶性を回復した（＞５０ｍｇ／ｍＬ）。しかしながら、そのＮ末端における疎水性ＤＴｙｒの取り込みは、Ｃｐ４０（配列番号：１８）のＤＰＢＳ中での溶解性に悪影響を与えた（０．８ｍｇ／ｍＬ）。対照的に、Ｃｐ３０（配列番号：７）中の小さいＮ末端Ｓａｒの存在は、ＤＰＢＳ中のその溶解性を大幅に改善し（６．９ｍｇ／ｍＬ）、このペプチドは、臨床的に用いられる４（１ＭｅＷ）アナログのほぼ２倍の溶解性となった。

【0128】

実施例４
実施例１に記載されるように合成した一定のコンプスタチンアナログは、ヒト血漿における血漿安定性および血漿タンパク質結合について測定した。

【0129】

材料および方法：
血漿安定性
レピルジン（３．７５ユニット／ｍｌ）を含有する新鮮なヒト血漿は、それぞれ２０μＭの最終濃度でＣｐ３０（配列番号：７）、Ｃｐ４０（配列番号：１８）またはコントロールペプチド２Ｂと３７℃でインキュベートさせた。１００μＬの試料は固相抽出で取得した。９６ウェルプレートＨＬＢ Ｏａｓｉｓ ３０μｍ １０ｍｇ（Ｗａｔｅｒｓ，マサチューセッツ州、ミルフォード）を抽出のために用いた。ＳＰＥ物質は、メタノールおよびＡＣＮを各々５００μＬ加え、続いて５００μＬのｍｉｌｌｉ−Ｑ水を加えることによって調整した。試料を４％ Ｈ_３ＰＯ_４を用いて１：１に希釈した。試料を載せ、０．１％ ギ酸中の１０％ ＡＣＮの５００μＬで２回洗浄した。試料を０．１％ ギ酸中の６５％ ＡＣＮの２００μＬで溶出し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＬｏＢｉｎｄ採取プレート中に収集した。ＵＰＬＣ−ＭＳのための試料は、０．１％ ギ酸を含有するｍｉｌｌｉ−Ｑ水中で１：１０に希釈した。Ｃｐ２０（配列番号：３）は、ＳＰＥを内部標準とする前に各試料に混ぜた。

【0130】

血漿タンパク質結合
Ｃｐ３０（配列番号：７）は、最終ペプチド濃度が２０μＭとなるように（Ｃ３：１．２ｍｇ／ｍＬ，６．４μＭ）、レピルジン（３．７５ユニット／ｍｌ）を含有する新鮮なヒト血漿の５００μＬ中に混ぜた。コントロール試料をＣｐ３０（配列番号：７）およびｍｉｌｌｉ−Ｑ水を用いて同様に調製して、１μＭにてＵＰＬＣ−ＭＳでペプチド面積を調べた。血漿試料を室温で１０分間平衡にした。続いて、ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中の３０％ ＰＥＧ（ＭＷ３３５０）の５００μＬを混合しながら血漿試料にゆっくり加えた。該混合物を、１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、上澄み液を分離した。該沈殿物を１０００μＬのＦＰＬＣ緩衝液Ａに溶解し、Ｍｏｎｏ Ｑ ５／５カラムを用いてＦＰＬＣにより分離し、フラクションを１チューブあたり１ｍＬで収集した。０．５ｍＬの各フラクションは、ＳＰＥおよびＵＰＬＣ−ＭＳ分析のために同一体積の４％ Ｈ_３ＰＯ_４と混合した。

【0131】

ＵＰＬＣ−ＭＳ解析
ＵＰＬＣ−ＭＳ解析は、ＭａｓｓＬｙｎｘ ４.１ソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ）によって制御されるＥＳＩ源を搭載したＳＹＮＡＰＴ ＨＤＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ，マサチューセッツ州、ミルフォード）で実施した。各試料を４連にて注入した。オンラインＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）システムは、逆相液体クロマトグラフィーによるペプチド分離について使用した。キャピラリー電圧は、３．２ｋＶであり、コーン電圧は、３０Ｖであり、温源は、１２０℃であった。［Ｇｌｕ１］−フィブリノーゲンペプチドは、３０秒のサンプリング速度による固定質量補正のために使用した。質量スペクトルは、走査速度１秒でｍ／ｚ範囲２００〜２０００Ｄａにわたり陽性モードで取得した。分析物の存在は、保持時間および質量によって確認した。選択性は、ブランク血漿試料および純粋なペプチドの解析によって実験して、分析物と共溶出する干渉の存在を調べた。注入後、１．７μｍ ＵＰＬＣ ＢＥＨ１３ Ｃ１８カラム（水、２．１μｍｘ１５０ｍｍ，製品番号１８６００３５５６）を用いて分析物について分離した。分析カラム温度を４０℃で保持した。ペプチドを流速０．３ｍＬ／分で分離した。グラジエントは８分間で直線１０〜６０％ Ｂ（アセトニトリル中で０．１％ ギ酸）であった。

【0132】

結果：
血漿安定性
遊離Ｎ末端を有する新規なアナログの安定性を調べるために、Ｃｐ３０（配列番号：７）およびＣｐ４０（配列番号：１８）を、３７℃でヒト血漿中にてインキュベートするために選択した（図４Ａ）。コントロール直鎖ペプチド２Ｂ（ＬＲＦＬＮＰＦＳＬＤＧＳＧＦＷ，配列番号：２８）を血漿と接触して素早く切断した。０時点のサンプルは、Ａｒｇ位置における切断を示した。該ペプチドは３０分以内に完全に消滅した。同一条件下で、Ｃｐ３０（配列番号：７）およびＣｐ４０（配列番号：１８）の両方は、血漿中で著しい安定性を示した。５５％以上のペプチドが５日後にも残存する。０、２４および１２０時間でのＵＰＬＣ−ＭＳクロマトグラムはほとんど同じであった（図４Ｂ）。特に切断された産物は見られなかった。

【0133】

血漿タンパク質結合
Ｃｐ３０（配列番号：７）の結合特異性を調べるために、過剰量のペプチドを新鮮なヒト血漿中でインキュベートした。血漿タンパク質をＰＥＧ３３５０で沈殿させ、小さいＭｏｎｏ Ｑカラムを用いて分離した。各１ｍＬのフラクションをＣｐ３０（配列番号：７）の存在について測定した。Ｃｐ３０（配列番号：７）を含有したフラクションを、ＵＰＬＣ−ＭＳを用いてさらに定量的に分析し、共溶出タンパク質の同定のために試験した。Ｃｐ３０（配列番号：７）の７．５％が通過画分に存在し、Ｃ３およびＣ３ｃでそれぞれ８８．０％および４．５％共溶出されたことが見出された。タンパク質の同定は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてクーマシー染色およびウェスタンブロットによって行った。さらに、検出されたＣｐ３０（配列番号：７）の総量は、血漿Ｃ３量と同等であった。

【0134】

実施例５
コンプスタチンアナログＣｐ２０（配列番号：３）、Ｃｐ３０（配列番号：７）およびＣｐ４０（配列番号：１８）は、実施例１に記載されるように合成し、カニクイザルモデルでインビボ保持について測定した。該ペプチドの結合プロファイルは、上記に記載のＳＰＲ法を用いて、４種類の霊長類：ヒト、カニクイザル、アカゲザルおよびヒヒの血漿と比較した。

【0135】

材料および方法：
霊長類研究および試料採取
血漿半減期の評価および主要な代謝物の作成は、カニクイザル（Macaca fascicularis）において、Ｓｉｍｉａｎ Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＳＩＣＯＮＢＲＥＣ，フィリピン、マカティ市）で実施した。各アナログ（Ｃｐ２０（配列番号：３）、Ｃｐ３０（配列番号：７）およびＣｐ４０（配列番号：１８））について、２匹の健常な動物を落ち着かせ、（注射用生理食塩水中に溶解させた）化合物を２ｍｇ／ｋｇで静脈内に注射した。血液試料（１〜２ｍＬ）は、化合物の注射直前および注射後様々な時点（２、５および３０分；１、２、４、６および２４時間）で、血液凝固および補体活性を防ぐためにＥＤＴＡでコーティングしたバキュテナー管中に採取し、〜８００ｘｇで１０分間遠心分離して血漿を得た。血漿試料をすぐに凍結し、さらなる解析のために保存した。全てのＮＨＰ実験は、動物保護法および規則に従って行った。

【0136】

血漿試料の解析
ＵＰＬＣ−ＭＳによる解析前に、血漿試料中のコンプスタチンアナログは、９６ウェルプレートフォーマット（ＨＬＢ Ｏａｓｉｓ ３０μｍ，１０ｍｇ；Ｗａｔｅｒｓ，マサチューセッツ州、ミルフォード）内で固相抽出（ＳＰＥ）によって抽出した。ＳＰＥ物質は、アセトニトリルおよび水を用いて十分に調整した。血漿試料は、４％ リン酸で１：１に希釈し、Ｃｐ２０（配列番号：３）の定常濃度（５ｐＭ）を、内部標準としてＣｐ３０（配列番号：７）またはＣｐ４０（配列番号：１８）を含有する全ての試料に混ぜ；Ｃｐ２０（配列番号：３）を含有する試料の場合には、Ｃｐ４０（配列番号：１８）を内部標準として使用した。該試料は、ＳＰＥプレート上に載せ、０．１％ ギ酸中の１０％ アセトニトリルで洗浄した。抽出したペプチドを、０．１％ ギ酸中の６５％ アセトニトリルの２００μＬで溶出し、ペプチドの吸着を回避するために、ＬｏＢｉｎｄ管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に収集した。最終的に、５μＬの各溶出液を４５μＬの０．１％ ギ酸で希釈し、ＥＳＩ源を搭載したＳＹＮＡＰＴ Ｇ２−Ｓ ＨＤＭＳ装置に繋がれ、ＭａｓｓＬｙｎｘ ４.１ソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ）によって制御されるオンラインＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣからなるＵＰＬＣ−ＭＳシステムに注入した。各試料は、４連にて注入した。逆相液体クロマトグラフィーは、４０℃のカラム温度で１．７μｍ ＵＰＬＣ ＢＥＨ１３０ Ｃ１８カラム（２．１μｍｘ１５０ｍｍ；Ｗａｔｅｒｓ）を用いて、ペプチド分離に用いた。ペプチドは、８分間で０．１％ ギ酸を含有する水中で１０〜６０％ アセトニトリルの直線グラジエントを用いて０．１５ｍＬ／分の流速で分離した。溶出したペプチドをＨＤＭＳで直接分析し；ＥＳＩ源キャピラリー電圧は、３．２ｋＶに設定し、コーン電圧は、３０Ｖとし、ＥＳＩ源の温度は１２０℃とした。［Ｇｌｕ１］−フィブリノペプチドＢ（Ｓｉｇｍａ）は、３０秒のサンプリング速度を用いて固定質量補正に用いた。質量スペクトルは、１秒の走査速度で５０〜１９５０Ｄａのｍ／ｚ範囲にわたり陽性モードで取得した。

【0137】

血漿半減期の測定
検量線は、コンプスタチンアナログ（Ｃｐ２０（配列番号：３）、Ｃｐ３０（配列番号：７）およびＣｐ４０（配列番号：１８））は、０．５、１、２、４、および８μＭの最終濃度で、未処理のカニクイザルに由来する新たに解凍した血漿に混ぜることにより解析する日に作成した。全ての較正試料をＳＰＥにかけ、上記に記載されるようにＵＰＬＣ−ＨＤＭＳを用いて測定した。ＭＳピーク面積は、積分によって決定し、濃度に対してプロットして、０．９９３以上の回帰係数（Ｒ２）の優れた直線性を示す検量線となった。薬物動態解析については、各時点での血漿濃度（Ｃｐ）は、対応する標準曲線を用いて、各ペプチドの抽出したピーク面積から算出した。排出定数（ｋ_ｅ）および血漿半減期（t_１／２）は、下記の式を用いて、最終排出相（０．５〜２４時間）の勾配から決定した：ｌｎ（Ｃｐ）＝ｌｎ（Ｃｐ０）−ｋ_ｅｘｔ、およびｔ_１／２＝０．６９３／ｋ_ｅ。Ｃ３レベルの決定。この研究に用いられる各カニクイザルにおけるＣ３の血漿濃度は、ＥＬＩＳＡによって決定した。簡単に説明すると、９６ウェルプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ；Ｎｕｎｃ）は、ＰＢＳ中のモノクローナル抗Ｃ３抗体（クローン８Ｅ１１；Tosic et al., 1989, J.Immunol.Methods 120: 241-249）の１μｇ／ｍｌで４．２５℃にて終夜コーティングした。ウェルをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ ０．０５％で洗浄し、ＰＢＳ／ＢＳＡ１％にて室温で１時間ブロックした。続いて、血漿（ＰＢＳ／ＢＳＡ中で１：１０，０００および１：２０，０００に希釈）または精製したカニクイザルＣ３の一連の希釈物を、室温で１時間インキュベートし、次いで洗浄し、ＰＢＳ／ＢＳＡ中で１：１，０００に希釈したペルオキシダーゼが抱合された抗Ｃ３（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，オハイオ州、ソロン）と室温にて１時間インキュベートさせた。該反応物を、製造業者の説明書に従って、テトラメチルベンジジン基質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ミネソタ州、ミネアポリス）を用いて発色させ、光学濃度を、４５０ｎｍでの波長設定にてマイクロプレートリーダーを用いて測定した。

【0138】

溶血アッセイ
ウサギ赤血球は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、続いてベロナール緩衝生理食塩水（ＶＢＳ）^Mg+／ＥＧＴＡで洗浄した。１：２０希釈液をＶＢＳ緩衝液で調製した。血漿試料（ＶＢＳ中で１：１０−１００μｌ）は、ウサギ赤血球溶液（５０μｌ）と共に９６ウェルプレート中で３７℃にて１時間インキュベートした。ＥＤＴＡ（０．２ｍＭ−１５μｌ）を加えて、反応を停止し、プレートを遠心分離した（２５００ｘｇ，３分）。上澄み液（１００μｌ）を新しいウェルに移し、光学濃度を４０５ｎｍで測定した。水または緩衝液を用いた赤血球のインキュベートには、陽性（１００％ 溶解）および陰性（０％ 溶解）コントロールとしてそれぞれ用いた。

【0139】

結合プロファイル
ＮＨＰ特異性実験について、ヒト、カニクイザル、アカゲザルおよびヒヒの血漿に由来するＣ３は、標準アミンカップリングを用いてＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の各フローセル上に固定して、６，０００〜７，０００ＲＵの目的の密度を達成した。ペプチドＣｐ２０（配列番号：３）およびＣｐ４０（配列番号：１８）は、実施例２に記載のシングルサイクルカイネティクス法を用いて定量的に評価した。目的の密度または活性の相違とは独立して、動力学的プロファイルを視覚的に比較するために、各結合曲線は、最大応答に対して標準化し、元のものと重ね合わせた。

【0140】

結果：
ペプチド薬物は、血漿からの比較的速い排出によって妨げられることが多く、通常の全身薬物レベルによる臨床適用において非常に限定されうる（例えば、補体阻害剤の場合には、ＰＮＨ）。Ｃｐ２０（配列番号：３）ならびに新たに開発したＣｐ３０（配列番号：７）およびＣｐ４０（配列番号：１８）を含む比較実験を行い、その実験の中で、カニクイザルに各アナログの２ｍｇ／ｋｇを静脈内注射し、血漿レベルを２４時間にわたりＬＣ−ＭＳによって評価した。全ての試験したアナログは、類似した二相排出プロファイルであり、すなわち、その血漿レベルは注射後最初の１時間以内に急速に低下し、それ以後より遅延した低下となった（図５Ａ）。動力学的変化が生じたペプチド濃度は、標的タンパク質Ｃ３の予想された生理学的な血漿レベルに非常に類似していた。実際に、ＥＬＩＳＡによる関連したサルにおけるＣ３レベルの測定（４．９−１２．８μＭ）により、コンプスタチンレベルの最初の低下がＣ３の測定した範囲内であったことが確認された（図５Ａ）。これらの観察は、十分な標的Ｃ３への緊密な結合がペプチド排出に大きく影響する標的促進排出モデルを示唆するものである。実際に、血漿半減期が終末対数線形部分に基づいて算出される場合（１〜２４時間）に、Ｃ３への結合親和性に対する直接的な相関関係は、Ｃｐ２０（配列番号：３）、Ｃｐ３０（配列番号：７）およびＣｐ４０（配列番号：１８）について、それぞれ９．３、１０．１および１１．８時間の半減期の値を観察することができた（図５Ｂ）。Ｃｐ３０−ＡＢＭ２抱合体の半減期は、２２時間であることが観察された（示さず）。

【0141】

コンプスタチンアナログの濃度は、赤血球溶血アッセイを用いて、血漿試料における代わりの経路を介した補体活性の阻害に対して測定した。補体阻害活性は、測定した各時点におけるアナログ濃度を詳しく追跡して観察した。

【0142】

結合親和性による主な排出相の強い明確な依存性を前提とすると、ヒト系に対するこれらのＮＨＰに基づく実験の変換は、ヒトおよびＮＨＰ Ｃ３に対するこれらのコンプスタチンアナログの異なる親和性に影響されるようである。よって、ヒトおよび３種類の関連するＮＨＰ（カニクイザル、アカゲザル、ヒヒ）に由来するＣ３に対するペプチドの結合プロファイルを、上記に記載のＳＰＲ法を用いて測定した。全てのアナログについての親和性および動力学的プロファイルの両方は、ほぼ同等であった（図５Ｃ）。

【0143】

実施例６
コンプスタチンアナログＣｐ４０（配列番号：１８）は、実施例１に記載されるように合成し、カニクイザルモデルにおいて皮下および経口投与経路からバイオアベイラビリティについて測定した。

【0144】

材料および方法：
霊長類研究および試料採取
バイオアベイラビリティの評価は、カニクイザル（Macaca fascicularis）についてＳｉｍｉａｎ Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＳＩＣＯＮＢＲＥＣ，フィリピン、マカティ市）で実施した。２匹の健常な動物を各投与経路に用いた。該動物を落ち着かせ、２ｍｇ／ｋｇの化合物を皮下注射し、または４ｍｇ／ｋｇの化合物で胃内経管により経口投与した。血液試料（１〜２ｍＬ）は、血液凝固および補体活性を防ぐためにＥＤＴＡでコーティングしたバキュテナー管中に、化合物注射の直前および様々な時点（２、５および３０分；１、２、４、６、および２４時間）で採取し、〜８００ｘｇで１０分間遠心分離して血漿を得た。血漿試料をすぐに凍結し、さらなる解析のために保存した。全てのＮＨＰ実験は、動物保護法および規則に従って行った。

【0145】

解析
血漿試料の解析、血漿半減期の測定および血漿中の補体阻害活性は、実施例５に記載されるとおりに行った。

【0146】

結果：
ペプチド薬物は、典型的に、費用がかかり、患者に十分な耐容性を示さず、通常、訓練された専門家によって行われることを要する静脈内投与を除いたいずれの経路によっても非常に乏しいバイオアベイラビリティを示す。コンプスタチンアナログＣｐ４０（配列番号：１８）は、皮下または経口送達後のバイオアベイラビリティについて試験した。カニクイザルを、アナログの２ｍｇ／ｋｇで皮下注射し、または４ｍｇ／ｋｇで経口注入し、血漿レベルを２４時間にわたりＬＣ−ＭＳにより測定した。結果を図６に示す。

【0147】

Ｃｐ４０（配列番号：１８）の血漿濃度は、皮下注射による投与後４〜５時間以内に約１２．５ｍＭのそのピークに達した（図６の上図）。アナログの経口注入は、注入の１時間以内に約０．０２３ｍＭの血漿濃度を生じた（図６の下図；経口注入は、２匹のサルのうち１匹のみについて成功したことに留意）。比較すると（図５Ｂ）、アナログの静脈内注射は、注射直後に約２８ｍＭのピーク血漿濃度を生じた。

【0148】

Ｃｐ４０（配列番号：１８）の濃度は、赤血球溶血アッセイを用いて、皮下注射からの血漿試料における別の経路による補体活性の阻害に対して測定した。補体阻害活性は、測定した各時点におけるアナログ濃度を詳しく追跡して観察した。

【0149】

実施例７
実施例１に記載されるコンプスタチンアナログＣｐ３０（配列番号：７）およびＣｐ−３０−ＡＢＭ２抱合体は、ヒヒモデルでインビボ保持について測定した。

【0150】

材料および方法：
５〜８ｋｇの重さの若年ヒヒ（P. Anubis，オクラホマ大学のＢａｂｏｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）を使用した。２匹のヒヒを研究に用い、各化合物について１匹ずつ用いた。各動物は、末梢血管を介する注射によるペプチド（１０ｍｇ）のボーラス投薬を受けた。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイ用の血液試料は、５０μｇのレピルジンを含有する１ｍｌ プラスチック管中に採取し、血漿分離のために２０００ｇで４℃にて２０分間遠心分離した。血漿試料を−７０℃で保存した。血液試料は、Ｃｐ３０（配列番号：７）またはＣｐ３０（配列番号：７）−ＡＢＭ２抱合体の注射後所定の時間間隔で採取した。試料をＳＰＥで処理し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて分析した。検量線はを、血漿中の様々な濃度での標準ペプチドを用いて作成して、各試料中のペプチド濃度を決定した。

【0151】

ＳＰＥによる血漿試料からのコンプスタチンアナログの抽出
９６ウェルプレートＨＬＢ Ｏａｓｉｓ ３０μｍ １０ｍｇ（Ｗａｔｅｒｓ，マサチューセッツ州、ミルフォード）を抽出のために用いた。ＳＰＥ物質は、５００μｌのメタノール、ＡＣＮを加え、続いて５００μＬのｍｉｌｌｉ−Ｑ水を加えて調整した。試料を４％ Ｈ_３ＰＯ_４で希釈した。試料を載せ、５００μＬの水および０．１％ ギ酸を含有する１０％ ＡＣＮで洗浄した。試料を、０．１％ ギ酸中の６５％ ＡＣＮの２００μＬで溶出し、採取プレート中に採取した。ＬＣ−ＭＳ用の試料は、１０％ ＡＣＮおよび０．１％ ギ酸を含有するｍｉｌｌｉ−Ｑ水中で１：２〜１：１１に希釈した。ＣＰ２０（配列番号：３）は、内部標準としてＳＰＥ前の各試料に混ぜた。

【0152】

ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析は、ＭａｓｓＬｙｎｘ４．１ソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ）によって制御されるＥＳＩ源を搭載したＳＹＮＡＰＴ ＨＤＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ，マサチューセッツ州、ミルフォード）において実施した。各試料は３連にて注入した。オンラインＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）システムは、逆相液体クロマトグラフィーによるペプチド分離のために使用した。キャピラリー電圧は、３．２ｋＶであり、コーン電圧は、３０Ｖであり、ＥＳＩ源の温度は、１２０℃であった。［Ｇｌｕ１］−フィブリノーゲンペプチドは、３０秒のサンプリング速度を用いて固定質量補正のために用いた。質量スペクトルは、１秒の走査速度でｍ／ｚ範囲５００〜１８００Ｄａにわたり陽性モードで取得した。分析物の存在は、保持時間および質量によって確認された。注入後、分析物は、１．７μｍ ＵＰＬＣ ＢＥＨ１３０ Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ，１．０μｍｘ１００ｍｍ）で分離した。分析カラム温度は、４０℃で保持した。ペプチドは流速０．１５ｍＬ／分で分離した。グラジエントは、７分間で直線１５〜５５％ Ｂ（アセトニトリル中で０．１％ ギ酸）であった。

【0153】

結果：
ペプチドＣｐ３０（配列番号：７）およびＡＢＭ２抱合体の血漿濃度は、ヒヒへの静脈内ボーラス注射後にＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて決定した。ペプチドＣｐ３０（配列番号：７）は、５時間の半減期を示し、Ｃｐ３０（配列番号：７）−ＡＢＭ２は、７．５時間の半減期を示した。比較すると、同一のヒヒモデルにおいて、コンプスタチンアナログ４（１ＭｅＷ）およびＷＯ２０１０／１２７３３６に開示の強力なアナログ（ペプチド３）は、約６０〜９０分の半減期を有することが示された。

【0154】

実施例８
コンプスタチンアナログＣｐ４０（配列番号：１８）は、実施例１に記載されるように合成され、ヒヒモデルで筋肉内投与経路からのバイオアベイラビリティについて測定した。

【0155】

方法：
若年ヒヒを、２ｍｇ／ｋｇのＣｐ４０（配列番号：１８）で筋肉内注射した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイのための血液試料を、５０μｇのルピルジンを含有する１ｍｌのプラスチック管内に採取し、血漿分離のために４℃で２０００ｇにて２０分間遠心分離した。血漿試料を−７０℃で保存した。血液試料を、アナログの注射後所定の時間間隔で採取した。試料をＳＰＥで処理し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて分析した。検量線は、血漿中の様々な濃度での標準ペプチドを用いて作成して、各試料中のペプチド濃度を調べた。

【0156】

血漿試料からのコンプスタチンアナログの抽出およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析は、実施例７に記載されるように行った。溶血アッセイは、実施例５に記載されるとおりに実施した。

【0157】

結果：
結果を図７に示す。Ｃｐ４０（配列番号：１８）の血漿濃度は、筋肉内注射による投与後約５〜６時間以内に約１０ｍＭのピークに達した。補体阻害活性は、測定した各時点におけるアナログ濃度を詳しく追跡して観察した。

【0158】

本発明は、上記に記載され、例示される実施態様に限定されるものではないが、特許請求の範囲の範囲内で変形および改変が可能である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]