特許 6676661 ブタ生殖器呼吸器症候群及びブタサーコウイルス関連疾患に対するワクチン組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6676661

(24)【登録日】2020年3月16日

(45)【発行日】2020年4月8日

(54)【発明の名称】ブタ生殖器呼吸器症候群及びブタサーコウイルス関連疾患に対するワクチン組成物

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20200330BHJP

   C07K 14/00 20060101ALI20200330BHJP

   C07K 14/08 20060101ALI20200330BHJP

   C07K 5/10 20060101ALI20200330BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20200330BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20200330BHJP

   C07K 14/21 20060101ALN20200330BHJP

   C12N 15/40 20060101ALN20200330BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20200330BHJP

   C12N 15/31 20060101ALN20200330BHJP

   C12N 15/63 20060101ALN20200330BHJP

【ＦＩ】

   C07K19/00ZNA

   C07K14/00

   C07K14/08

   C07K5/10

   A61K39/12

   A61P31/14

   !C07K14/21

   !C12N15/40

   !C12N15/62 Z

   !C12N15/31

   !C12N15/63 Z

【請求項の数】14

【全頁数】24

(21)【出願番号】特願2017-562353(P2017-562353)

(86)(22)【出願日】2016年5月27日

(65)【公表番号】特表2018-516926(P2018-516926A)

(43)【公表日】2018年6月28日

(86)【国際出願番号】US2016034858

(87)【国際公開番号】WO2016196383

(87)【国際公開日】20161208

【審査請求日】2017年12月19日

(31)【優先権主張番号】62/169,205

(32)【優先日】2015年6月1日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】517396032

【氏名又は名称】リーバー ジェネティクス シーオー．， エルティーディー．

【氏名又は名称原語表記】ＲＥＢＥＲ ＧＥＮＥＴＩＣＳ ＣＯ．， ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】110001139

【氏名又は名称】ＳＫ特許業務法人

(74)【代理人】

【識別番号】100130328

【弁理士】

【氏名又は名称】奥野 彰彦

(74)【代理人】

【識別番号】100130672

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 寛之

(72)【発明者】

【氏名】チェン， ユ−シン

(72)【発明者】

【氏名】ツァイ， メン−ジュ

(72)【発明者】

【氏名】ライ， パオ−イェン

(72)【発明者】

【氏名】チョウ， ウェイ−イ

(72)【発明者】

【氏名】チャン， シゥ−カン

【審査官】 濱田 光浩

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００８−０１３５３７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許第０７５９５０５４（ＵＳ，Ｂ１）

【文献】 国際公開第２０１４／０８９０３６（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １９／００

Ｃ０７Ｋ １４／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

融合タンパク質であって、
（ａ）前記融合タンパク質のＮ末端に位置する、抗原提示細胞（ＡＰＣ）結合ドメインであって、前記ＡＰＣ結合ドメインが、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）結合ドメインＩａである、ＡＰＣ結合ドメイン；
（ｂ）前記ＡＰＣ結合ドメインのＣ末端に位置する、配列番号：４、２、３、又は６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、３４−１１２アミノ酸残基長のトランスロケーションペプチド；
（ｃ）以下の（ｉ）〜（ｉｖ）を含む融合抗原；
（ｉ）ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）ＯＲＦ７抗原；
（ｉｉ）ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ１ｂ抗原；
（ｉｉｉ）ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ６抗原；及び
（ｉｖ）ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５抗原；
（ｄ）前記融合抗原のＣ末端、又は前記トランスロケーションペプチドと前記融合抗原との間に位置する、配列番号：１３のアミノ酸配列を含む核輸送シグナル、及び
（ｅ）小胞体保持配列であって、前記核輸送シグナルが前記トランスロケーションペプチドと前記融合抗原との間に位置する場合は前記融合抗原のＣ末端に位置し、又は前記核輸送シグナルが前記融合抗原のＣ末端に位置する場合は前記核輸送シグナルのＣ末端に位置する、小胞体保持配列
を含み、
ここで、前記融合抗原が、完全長ＯＲＦ７、ＯＲＦ６、ＯＲＦ５、及びＯＲＦ１ｂタンパク質配列を含まず、
前記融合抗原が、
（ｉ）配列番号：２２、２３又は３３のアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号：２４のアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号：２５のアミノ酸配列；及び
（ｉｖ）配列番号：２６のアミノ酸配列；
を含む、
融合タンパク質。

【請求項2】

前記ＯＲＦ７又はＯＲＦ１ｂ抗原が前記ＯＲＦ６抗原のＮ末端に位置し、前記ＯＲＦ５抗原が前記ＯＲＦ６抗原のＣ末端に位置する、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項3】

前記融合抗原が、前記ＯＲＦ７抗原の２つのタンデム反復を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項4】

前記ＯＲＦ５抗原が前記ＯＲＦ６抗原のＣ末端に位置する、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項5】

前記ＯＲＦ６抗原が、前記ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ６のＮ末端部アミノ酸配列を含み、前記ＯＲＦ５抗原が、前記ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５のＮ末端部アミノ酸配列を含み、前記融合抗原が、前記ＯＲＦ６及びＯＲＦ５のＣ末端部アミノ酸配列を含まない、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項6】

前記ＯＲＦ１ｂ抗原が、ＯＲＦ１ｂ ＮＳＰ １０のＣ末端部アミノ酸配列及びＯＲＦ１ｂ ＮＳＰ １１のＮ末端部アミノ酸配列を含み、前記融合抗原が、前記ＯＲＦ１ｂのＮ末端及びＣ末端部アミノ酸配列を欠いている、請求項５に記載の融合タンパク質。

【請求項7】

前記シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）結合ドメインＩａが、配列番号：１又は３２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項8】

前記トランスロケーションペプチドが３４−６１アミノ酸残基長を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項9】

前記小胞体保持配列がアミノ酸配列KDEL（配列番号：１５）を含み、前記アミノ酸KDELのタンデム反復を含まない、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項10】

前記核輸送シグナル及び前記ＥＲ保持配列が、配列番号：１２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列と融合ペプチドを形成する、請求項９に記載の融合タンパク質。

【請求項11】

前記融合タンパク質が、配列番号２７又は２８のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項12】

抗原特異的細胞媒介性応答及び体液性応答を、それを必要とする被験体において誘導するための組成物であって、
（ｉ）請求項１に記載の融合タンパク質；及び
（ｉｉ）ブタサーコウイルスタイプ２（ＰＣＶ２）融合タンパク質を含み、
（ｉｉ）ブタサーコウイルスタイプ２（ＰＣＶ２）融合タンパク質が、
（ａ）前記融合タンパク質のＮ末端に位置する、抗原提示細胞（ＡＰＣ）結合ドメイン又はＣＤ９１レセプター結合ドメイン；
（ｂ）前記ＡＰＣ結合ドメイン又は前記ＣＤ９１レセプター結合ドメインのＣ末端に位置する、配列番号：４、２、３、又は６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、３４−１１２アミノ酸残基長のトランスロケーションペプチド；
（ｃ）ＰＣＶ２ ＯＲＦ２抗原；
（ｄ）前記ＰＣＶ２ ＯＲＦ２抗原のＣ末端、又は前記トランスロケーションペプチドと前記ＰＣＶ２ ＯＲＦ２抗原との間に位置する、配列番号：１３のアミノ酸配列を含む核輸送シグナル；及び
（ｅ）小胞体保持配列であって、前記核輸送シグナルが前記トランスロケーションペプチドと前記ＰＣＶ２ ＯＲＦ２抗原との間に位置する場合は前記ＰＣＶ２融合タンパク質のＣ末端に位置し、又は前記核輸送シグナルが前記ＰＣＶ２ ＯＲＦ２抗原のＣ末端に位置する場合は前記核輸送シグナルのＣ末端に位置する、小胞体保持配列
を含み、
ここで、前記ＰＣＶ２ ＯＲＦ２抗原が、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質のＣ末端部アミノ酸配列を含み、前記ＰＣＶ２融合タンパク質が、前記ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質のＮ末端部アミノ酸配列を含まない、
組成物。

【請求項13】

抗原特異的細胞媒介性応答及び体液性応答を、それを必要とする被験体において誘導するための医薬品の製造における、治療的に有効量の、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質又は請求項１２に記載の組成物を含む組成物の使用。

【請求項14】

抗原特異的細胞媒介性応答及び体液性応答を、それを必要とする被験体において誘導するために使用される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質又は請求項１２に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明の分野
本発明は、一般にワクチンに関し、より具体的にはサブユニットワクチンに関する。

【背景技術】

【0002】

本発明の背景
免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、単球、又はマクロファージなど）に感染するウイルスとしては、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、ブタサーコウイルスタイプＩＩ（ＰＣＶ２）、及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）が含まれる。免疫細胞は、免疫化応答を誘発することはできないが、ウイルスを運ぶことができる。これらのウイルスに感染した動物には、他の病原体が容易に感染する可能性がある。ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）は、毎年、畜産に大きな損失をもたらす。ブタだけでなく、アヒルも同様に、ＰＲＲＳＶに感染する可能性がある。一般に、ウイルスに感染した動物は、顕著な症状を有しないが、感染した動物の免疫性は低下する。このウイルスは、（肺胞及び脾臓中の）マクロファージ、脳ミクログリア及び単球に感染し、感染した動物の血液及び器官に存在し得る。これは、二次感染に起因する体重増加の減少及び死亡率の増加につながる。

【0003】

米国特許第７，５９５，０５４号は、サブユニットワクチンとして使用される融合抗原を開示しており、ここでは、ＯＲＦ１ｂの領域又はＯＲＦ７の領域から選択される単一の抗原部分が、細胞傷害性ドメインＩＩＩを欠いているシュードモナス外毒素Ａポリペプチド、すなわち、ＰＥ（ΔＩＩＩ）と、及び小胞体保持配列との間で融合される。

【0004】

Ｒｅｂｅｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏ． Ｌｔｄ．によって「ＰＲＲＳＦＲＥＥ（商標）」と命名されているワクチン組成物は、それぞれＤ、Ｍ、Ｒ、及びＰと呼ばれる、４種類の別個のＰＲＲＳ抗原を含む。これらの４種類のＰＲＲＳ抗原は、米国特許第７，５９５，０５４号に開示される設計を使用する、４種類の別個のベクターによって、それぞれ発現され、動物において細胞媒介性免疫応答及び体液性免疫応答を誘導するのに有効であることが見出された。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明の概要
一つの態様において、本発明は、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）融合タンパク質に関する。このブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）融合タンパク質は、
（ａ）融合タンパク質のＮ末端に位置する、抗原提示細胞（ＡＰＣ）結合ドメイン又はＣＤ９１レセプター結合ドメイン；
（ｂ）ＡＰＣ結合ドメイン又はＣＤ９１レセプター結合ドメインのＣ末端に位置する、配列番号：４、２、３、又は６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、３４−１１２アミノ酸残基長のトランスロケーションペプチド；
（ｃ）以下の（ｉ）〜（ｉｖ）を含む融合抗原；
（ｉ）ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）ＯＲＦ７抗原；
（ｉｉ）ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ１ｂ抗原；
（ｉｉｉ）ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ６抗原；及び
（ｉｖ）ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５抗原；
（ｄ）融合タンパク質のＣ末端に位置する、小胞体保持配列；及び
（ｅ）任意選択的に、抗原と小胞体保持配列との間又はトランスロケーションペプチドと抗原との間に位置する、配列番号：１３のアミノ酸配列を含む核輸送シグナル
を含み、
ここで、融合抗原が、完全長ＯＲＦ７、ＯＲＦ６、ＯＲＦ５、及びＯＲＦ１ｂタンパク質配列を含まない。

【0006】

本発明の一つの実施形態において、ＯＲＦ７又はＯＲＦ１ｂ抗原がＯＲＦ６抗原のＮ末端に位置し、ＯＲＦ５抗原がＯＲＦ６抗原のＣ末端に位置する。

【0007】

本発明の別の実施形態において、ＯＲＦ６抗原がＯＲＦ５抗原のＮ末端に位置し、ＯＲＦ６抗原とＯＲＦ５抗原との間に架橋又はリンカーがない。

【0008】

本発明の別の実施形態において、融合抗原が、ＯＲＦ７抗原の２つのタンデム反復を含む。

【0009】

本発明の別の実施形態において、ＯＲＦ５抗原がＯＲＦ６抗原のＣ末端に位置する。

【0010】

本発明の別の実施形態において、ＯＲＦ６抗原が、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ６のＮ末端部アミノ酸配列を含み、ＯＲＦ５抗原が、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５のＮ末端部アミノ酸配列を含み、融合抗原が、ＯＲＦ６及びＯＲＦ５のＣ末端部アミノ酸配列を含まない。

【0011】

本発明の別の実施形態において、ＯＲＦ１ｂ抗原が、ＯＲＦ１ｂ ＮＳＰ １０のＣ末端部アミノ酸配列及びＯＲＦ１ｂ ＮＳＰ １１のＮ末端部アミノ酸配列を含み、融合抗原が、ＯＲＦ１ｂのＮ末端及びＣ末端部アミノ酸配列を欠いている。

【0012】

本発明の別の実施形態において、ＡＰＣ結合ドメイン又はＣＤ９１レセプター結合ドメインが、配列番号：１、８、９、１０、１１、又は３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。

【0013】

本発明の別の実施形態において、小胞体保持配列がアミノ酸配列KDEL（配列番号：１５）を含み、アミノ酸KDELのタンデム反復を含まず、但し、核輸送シグナルが存在する。

【0014】

本発明の別の実施形態において、ＡＰＣ結合ドメイン又はＣＤ９１レセプター結合ドメインが、配列番号：１又は３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。

【0015】

本発明の別の実施形態において、核輸送シグナル及びＥＲ保持配列が、配列番号：１２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列と融合ペプチドを形成する。

【0016】

本発明の別の実施形態において、小胞体保持配列が配列番号：１６、１７、１８、又は１９のアミノ酸配列を有し、但し、核輸送シグナルが存在しない。

【0017】

本発明の別の実施形態において、ＡＰＣ結合ドメイン又はＣＤ９１レセプター結合ドメインが、配列番号：８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。

【0018】

別の態様において、本発明は、組成物に関するものであり、この組成物が、
（ｉ）本発明のＰＲＲＳＶ融合タンパク質；及び
（ｉｉ）ブタサーコウイルスタイプ２（ＰＣＶ２）融合タンパク質
を含み、
（ｉｉ）ブタサーコウイルスタイプ２（ＰＣＶ２）融合タンパク質が、
（ａ）融合タンパク質のＮ末端に位置する、抗原提示細胞（ＡＰＣ）結合ドメイン又はＣＤ９１レセプター結合ドメイン；
（ｂ）ＡＰＣ結合ドメイン又はＣＤ９１レセプター結合ドメインのＣ末端に位置する、配列番号：４、２、３、又は６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、３４−１１２アミノ酸残基長のトランスロケーションペプチド；及び
（ｃ）ＰＣＶ２ ＯＲＦ２抗原；
（ｄ）融合タンパク質のＣ末端に位置する、小胞体保持配列；及び
（ｅ）抗原と小胞体保持配列との間又はトランスロケーションペプチドと抗原との間に位置する、配列番号：１３のアミノ酸配列を含む核輸送シグナル
を含み、
ここで、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２抗原が、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質のＣ末端部アミノ酸配列を含み、ＰＣＶ２融合タンパク質が、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質のＮ末端部アミノ酸配列を含まない。

【0019】

本発明の別の実施形態において、ＡＰＣ結合ドメイン又はＣＤ９１レセプター結合ドメインが、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）結合ドメインＩのアミノ酸配列を含まない。

【0020】

本発明の別の実施形態において、トランスロケーションペプチドが３４−４６アミノ酸残基長を有する。

【0021】

本発明の別の実施形態において、トランスロケーションペプチドが３４−６１アミノ酸残基長を有する。

【0022】

さらに別の態様において、本発明は、抗原特異的細胞媒介性応答及び体液性応答を誘導するための方法に関し、この方法が、治療的に有効量の本発明の融合タンパク質を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップ、及びこれにより抗原特異的細胞媒介性応答及び体液性応答を誘導するステップを含む。

【0023】

さらに別の態様において、本発明は、抗原特異的細胞媒介性応答及び体液性応答を、それを必要とする被験体において誘導するための医薬品の製造における、治療的に有効量の、本発明の融合タンパク質又は本発明の組成物を含む組成物の使用に関する。本発明はまた、抗原特異的細胞媒介性応答及び体液性応答を、それを必要とする被験体において誘導する際に使用するための、治療的に有効量の本発明の融合タンパク質又は本発明の組成物を含む組成物に関する。

【0024】

代替的に、本発明は、抗原特異的細胞媒介性応答及び体液性応答を誘導する方法に関し、この方法は、本発明の組成物をそれを必要とする被験体に投与するステップ、及びこれにより抗原特異的細胞媒介性応答及び体液性応答を誘導するステップを含む。

【0025】

本発明の融合抗原は、ＯＲＦ７、ＯＲＦ６、ＯＲＦ５、及びＯＲＦ１ｂ上に中和エピトープ及び保護エピトープを含み、完全長ＯＲＦ７、ＯＲＦ６、ＯＲＦ５、及びＯＲＦ１ｂタンパク質配列を含まない。

【0026】

ＯＲＦ７抗原は、配列番号：３３、２２、又は２３のアミノ酸配列を含む。

【0027】

ＯＲＦ１ｂ抗原は、ＯＲＦ１ｂ ＮＳＰ １０のＣ末端部及びＯＲＦ１ｂ ＮＳＰ １１のＮ末端部のアミノ酸配列を含み、ＯＲＦ１ｂのＮ末端部及びＣ末端部を欠いている。すなわち、この融合抗原は、ＯＲＦ１ｂ ＮＳＰ １０のＣ末端部及びＯＲＦ１ｂ ＮＳＰ １１のＮ末端部のアミノ酸配列を含み、ＯＲＦ１ｂのＮ末端部及びＣ末端部のアミノ酸配列を含まない。

【0028】

ＯＲＦ６抗原が、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ６のＮ末端部アミノ酸配列を含み、ＯＲＦ５抗原が、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５のＮ末端部アミノ酸配列を含み、融合抗原が、ＯＲＦ６及びＯＲＦ５のＣ末端部アミノ酸配列を含まない。言い換えれば、ＯＲＦ６抗原がＰＲＲＳＶ ＯＲＦ６のＮ末端部アミノ酸配列から選択され、ＯＲＦ５抗原がＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５のＮ末端部アミノ酸配列から選択される。

【0029】

本発明の別の実施形態において、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ６のＮ末端部アミノ酸配列が配列番号：３４であり、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５のＮ末端部アミノ酸配列が３５である。

【0030】

さらに本発明の別の実施形態において、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ６のＮ末端部アミノ酸配列が配列番号：３６であり、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５のＮ末端部アミノ酸配列が３７である。ＯＲＦ１ｂ抗原が、ＯＲＦ１ｂ ＮＳＰ １０のＣ末端部アミノ酸配列及びＯＲＦ１ｂ ＮＳＰ １１のＮ末端部アミノ酸配列を含み、融合抗原が、ＯＲＦ１ｂのＮ末端及びＣ末端部アミノ酸配列を欠いている。本発明の一つの実施形態において、ＯＲＦ１ｂ抗原が２００未満のアミノ酸残基長を有し、配列番号：２５のアミノ酸配列を含む。本発明の別の実施形態において、ＯＲＦ１ｂ抗原が、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ１ｂのアミノ酸残基１０４６〜アミノ酸残基１２１０のアミノ酸配列を含む。本発明の一つの実施形態において、配列番号：１３のＣ末端アミノ酸がアラニンである。

【0031】

これらの態様及び他の態様は、以下の図面と併せて、以下の好ましい実施形態の説明から明らかとなるであろう。添付の図面は、本発明の１又は複数の実施形態を、本発明の原理を説明するのに役立つ説明の記載とともに示している。可能な限り、一実施形態の同じ又は類似の要素を指すために、図面全体で同じ参照番号が使用される。

【図面の簡単な説明】

【0032】

【図1A】図１Ａは、完全長緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａ（ＰＥ）、及びＰＥの部分断片を示す略図である。

【0033】

【図1B】図１Ｂはベクターマップを示す。

【図1C】図１Ｃはベクターマップを示す。

【0034】

【図1D】図１Ｄは、ＰＲＲＳＦＲＥＥと命名されているワクチン組成物の調製に使用される４種類の別個のプラスミドを示す略図である。ワクチン組成物ＰＲＲＳＦＥＥは、４種類の別個の、個別のＰＥ融合タンパク質を含む。ＰＲＲＳＦＲＥＥワクチン組成物中のそれぞれの個別のＰＥ融合タンパク質は、ＰＥ（_ΔＩＩＩ）断片（ＰＥ_４０７）、単一の抗原部分（Ｍ、Ｐ、Ｒ、又はＤと呼ばれる）、及び小胞体保持配列（Ｋ３）を含む。用語「Ｄ」又は「ＤＧＤ」は、ＰＲＲＳＶ核タンパク質ＯＲＦ７からの抗原を表す。用語「Ｒ」又は「ＲＳＡＢ」は、架橋／リンカー配列を間に有しない、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ６／膜タンパク質及びＯＲＦ５／主要なエンベロープタンパク質の融合抗原を表す。用語「Ｍ」又は「Ｍ１２」は、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ１ｂからの抗原を表し、ＰＲＲＳＶ非構造タンパク質ＮＳＰ １０及びＮＳＰ １１の人工融合抗原である。用語「Ｐ」又は「ＰＱＡＢ」は、架橋／リンカー配列を間に有しない、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ６／膜タンパク質及びＯＲＦ５／主要なエンベロープタンパク質の融合抗原を表す。用語「ＰＥ（_ΔＩＩＩ）」は、細胞傷害性ドメインＩＩＩを持たないＰＥ断片を表す。用語「ＰＥ_４０７」は、アミノ酸１〜アミノ酸４０７のシュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）ポリペプチドを表す。

【0035】

【図1E】図１Ｅは、ＰＥ−ＤＲＭＰ−ＮＥＳＫ又はＰＲＲＳＦＲＥＥ ４−ｉｎ−ｏｎｅと呼ばれるＰＥ融合タンパク質の調製のために使用されるプラスミドを示す略図である。ＰＥ−ＤＲＭＰ−ＮＥＳＫ融合タンパク質は、ＰＥ（_ΔＩＩＩ）断片（ＰＥ_３１３）、４種類の抗原部分（ＤＲＭＰと呼ばれる）を含む単一の融合ポリペプチド、核輸送シグナル（ＮＥＳ）、及び小胞体保持配列（Ｋ）を含む。

【0036】

【図1F】図１Ｆは、ＰＥ（_ΔＩＩＩ）断片（ＰＥ_３１３）、単一の抗原部分（ＰＣＶ２と呼ばれる）、核輸送シグナル（ＮＥＳ）、及び小胞体保持配列（Ｋ）を含む融合タンパク質をコードするプラスミドを示す略図である。

【0037】

【図2A】図２Ａは、ＰＢＳ、又はワクチン組成物ＰＲＲＳＦＲＥＥ ４−ｉｎ−１又はＰＲＲＳＦＲＥＥで免疫化されたマウスにおける抗原特異的細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）応答を示すグラフである。

【0038】

【図2B】図２Ｂは、ＰＢＳ、又はワクチン組成物ＰＲＲＳＦＲＥＥ ４−ｉｎ−１又はＰＲＲＳＦＲＥＥで免疫化されたマウスについての抗原特異的抗体（ＩｇＧ）応答を示すグラフである。

【0039】

【図3A】図３Ａは、ＰＢＳ又は異なるＰＲＲＳ／ＰＣＶ２コンボワクチンで免疫化されたマウスについてのＰＲＲＳＦＲＥＥ抗原特異的ＣＭＩ応答を示すグラフである。

【0040】

【図3B】図３Ｂは、ＰＢＳ又は異なるＰＲＲＳ／ＰＣＶ２ ＯＲＦ２コンボワクチンで免疫化されたマウスについてのＰＣＶ２ ＯＲＦ２抗原特異的ＣＭＩ応答を示すグラフである。

【0041】

【図4A】図４Ａは、ＰＢＳ又は異なるＰＲＲＳ／ＰＣＶ２コンボワクチンで免疫化されたマウスについてのＰＲＲＳＦＲＥＥ抗原特異的抗体（ＩｇＧ）応答を示すグラフである。

【0042】

【図4B】図４Ｂは、ＰＢＳ又は異なるＰＲＲＳ／ＰＣＶ２コンボワクチンで免疫化されたマウスについてのＰＣＶ２ ＯＲＦ２抗原特異的抗体（ＩｇＧ）応答を示すグラフである。

【0043】

【図5】図５は、以下の（１）〜（３）のいずれかで免疫化されたマウスにおけるＰＲＲＳＦＲＥＥ抗原特異的ＣＭＩ応答を示すグラフである：（１）２種類の抗原の融合物（ＰＥ_３１３−ＤＲ−ＮＥＳＫ中の抗原Ｄ及び抗原Ｒの融合物）を含む融合タンパク質、又は（２）２種類の別個の融合タンパク質の組み合わせ（それぞれの融合タンパク質が、２種類の抗原の融合物（ＰＥ_３１３−ＤＲ−ＮＥＳＫ中のＤ及びＲの融合物、又はＰＥ_３１３−ＭＰ−ＮＥＳＫ中のＭ及びＰの融合物）を含む）、又は（３）４種類の抗原の融合物（ＰＥ_３１３−ＤＲＭＰ−ＮＥＳＫ中のＤ、Ｒ、Ｍ、及びＰの融合物）を含む融合タンパク質。

【0044】

【図6】図６は、ＰＲＲＳＶ感染に対するブタの免疫化のために使用される、様々な融合タンパク質を示す略図である。

【0045】

【図7】図７は、それぞれのＰＲＲＳＶ抗原での刺激後に、ワクチン接種したブタのＰＢＭＣによって分泌されたＩＦＮ−γを示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0046】

発明の詳細な説明
本発明は、以下の実施例においてより具体的に説明されている。これらの実施例は、単なる例示であることが意図される。なぜなら、実施例における多数の改変及び変更が当業者には明らかであるためである。本発明の様々な実施形態をここで詳細に説明する。図面を参照すると、図面全体において、類似の番号は類似の構成要素を示す。この詳細な説明において、及び以下に続く特許請求の範囲全体において使用されるように、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の意味は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の参照を含む。また、この詳細な説明において、及び以下に続く特許請求の範囲全体において使用されるように、「ｉｎ」の意味は、文脈上他に明確に指示されない限り、「ｉｎ」及び「ｏｎ」を含む。さらに、読者の便宜のために、タイトル又はサブタイトルが明細書中で使用され得る。このことは、本発明の範囲に影響を与えるものではない。加えて、この明細書において使用されるいくつかの用語が、以下により具体的に定義される。

【0047】

＜定義＞

【0048】

この明細書で使用される用語は、一般に、本発明の文脈内で、及び各用語が使用される特定の文脈において、本技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。本発明を説明するために使用されるある特定の用語が、以下で、又は本明細書の他の場所で論じられて、本発明の詳細な説明に関して実務者に追加のガイダンスを提供する。便宜上、ある特定の用語が、例えばイタリック及び／又は引用符を使用してハイライトされ得る。ハイライトの使用は、用語の範囲及び意味に影響を与えない。用語の範囲及び意味は、それがハイライトされているか否かにかかわらず、同じ文脈において同じである。同じものを複数の方法で言うことができることが理解されるだろう。従って、本明細書で論じられる用語のうち任意の１又は複数について、別の言葉及び同義語を使用してよく、また、用語が本明細書において詳細に述べられている又は論じられているかどうかに特別な意味はない。ある特定の用語についての同義語が提供される。１又は複数の同義語の使用は、他の同義語の使用を除外するものではない。本明細書で論じられる任意の用語の例を含む、この明細書のどこかでの例の使用は、例示的なものに過ぎず、本発明の範囲及び意味又は任意の例示される用語の範囲及び意味を決して限定するものではない。同様に、本発明は、この明細書で与えられる様々な実施形態に限定されない。

【0049】

他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する分野の当業者によって共通して理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含む本文書が統制する。

【0050】

用語「抗原提示細胞（ＡＰＣ）又はアクセサリー細胞」は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）と複合体化された外来抗原を、それらの表面上に示す細胞を指す。Ｔ細胞は、それらのＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を使用して、これらの複合体を認識することができる。これらの細胞は、抗原を処理し、それらをＴ細胞に提示する。プロフェッショナル抗原提示細胞の主なタイプは、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ（これらは、ＣＤ４＋でもあり、それ故にＨＩＶに易感染性でもある）、単球、及びある特定のＢ細胞である。

【0051】

用語「抗原提示細胞（ＡＰＣ）結合ドメイン」は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に結合することができるドメイン（これはポリペプチドである）を指す。ＡＰＣ結合ドメインは、配列番号：１及び８−１１からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり得る。ＡＰＣ結合ドメインは、ＡＰＣ上のレセプターを認識して結合するリガンドである。

【0052】

表面抗原分類９１（ＣＤ９１）は、細胞の膜においてレセプターを形成するタンパク質であり、レセプター媒介性エンドサイトーシスに関与する。

【0053】

用語「ＰＥ_ｔ」は、３４−１１２アミノ酸残基長のトランスロケーションペプチド（又はトランスロケーションドメイン）を指す。ＰＥ_ｔは、配列番号：２−４及び６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み得る。例えば、ＰＥ_ｔのアミノ酸配列は、ＰＥのａ．ａ．２８０−ａ．ａ．３１３（配列番号：４）、ａ．ａ．２６８−ａ．ａ．３１３（配列番号：３）、ａ．ａ．２５３−ａ．ａ．３１３（配列番号：２）、又はａ．ａ．２５３−ａ．ａ．３６４（配列番号：６）の断片であり得る。すなわち、ＰＥ_ｔのアミノ酸配列は、それがａ．ａ．２８０−ａ．ａ．３１３（配列番号：４）必須配列（すなわち、必須断片）を含む限り、ＰＥドメインＩＩ（ａ．ａ．２５３−ａ．ａ．３６４；配列番号：６）の任意の領域を含み得る。

【0054】

ＰＥ_４０７（配列番号７）は、先行特許（ＵＳ ７，３３５，３６１ Ｂ２）において、ＰＥ（ΔＩＩＩ）として説明される。

【0055】

用語「トランスロケーションペプチド」は、抗原を標的細胞の細胞質内に移行させることができる。

【0056】

用語「小胞体（ＥＲ）保持配列」は、細胞質からＥＲ内への抗原のトランスロケーションを補助する機能を有するペプチドを指し、ＥＲの内腔に抗原を保持する。ＥＲ保持配列は、Lys Asp Glu Leu（KDEL；配列番号：１５）又はRDELの配列を含む。ＥＲ保持配列は、KDEL、RDEL、KDELKDELKDEL（Ｋ３；配列番号：１６）、KKDLRDELKDEL（Ｋ３；配列番号：１７）、KKDELRDELKDEL（Ｋ３；配列番号：１８）、又はKKDELRVELKDEL（Ｋ３；配列番号：１９）の配列を含み得る。

【0057】

核輸送シグナル（ＮＥＳ）は、タンパク質を、核輸送を使用する、核孔複合体を介した細胞核から細胞質への輸送の標的とする、タンパク質中の４つの疎水性残基の短いアミノ酸配列を指す。ＮＥＳは、エクスポーチンによって認識及び結合される。疎水性残基の最も一般的な間隔は、L_xxKL_xxL_xL_x（配列番号１３）であり、式中、「Ｌ」はロイシンであり、「Ｋ」はリシンであり、「ｘ」は任意の天然アミノ酸である。例えば、人工ＮＥＳは、配列Leu Gln Lys Lys Leu Glu Glu Leu Glu Leu Ala（LQKKLEELELA；配列番号：１４）を含み得る。

【0058】

用語「ＮＥＳＫ」は、ＮＥＳ及びＥＲ保持シグナルの融合ペプチド（すなわち、ＥＲ保持シグナルに融合したＮＥＳ）を指す。これは、核輸送シグナル（ＮＥＳ）とＥＲ保持配列の機能を有する人工ペプチドである。したがって、これは、核孔複合体を介して細胞核から細胞質に抗原を輸送し、細胞質からＥＲへの抗原のトランスロケーションを補助し、抗原をＥＲの内腔に保持することができる。例えば、ＮＥＳＫのアミノ酸配列はLQKKLEELELAKDEL（配列番号：１２）であり得る。

【0059】

サブユニットワクチンは、疾患を引き起こすウイルスの一部分のみを使用するワクチンである。この戦略は、ウイルスの一部分が疾患を引き起こす原因となる場合に、最も頻繁に使用される。疾患を引き起こす原因となる部分は、我々が抗原と呼ぶタンパク質である。

【0060】

抗原は、病原体によって引き起こされる疾患の原因となる、又は病原体に感染した宿主において免疫学的応答を誘導することができる、病原性タンパク質、ポリペプチド又はペプチドであり得る。抗原は、１又は複数の病原性タンパク質から選択される２以上の抗原の融合物に由来する融合抗原であり得る。例えば、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ６断片及びＯＲＦ５断片の融合抗原、又はＰＲＲＳＶ病原体及びＰＣＶ２病原体由来の抗原性タンパク質の融合物。

【0061】

エピトープは抗原の一部分である。保護エピトープは、このエピトープが、抗体と結合するときに、抗体の機能に悪影響を及ぼすことなく抗体の機能を助けることを意味する。

【0062】

中和エピトープ（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｏｒ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｅｐｉｔｏｐｅｓ）の存在は、予防ワクチンの構造的基礎である。中和エピトープは、ウイルスの細胞付着／侵入に重要である。

【0063】

本明細書で使用されるように、「ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）ＯＲＦ７抗原」は、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ７の一部から選択されるペプチドであり、保護エピトープを含む。

【0064】

本明細書で使用されるように、「ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ１ｂ抗原」は、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ１ｂの一部から選択されるペプチドであり、保護エピトープを含む。

【0065】

本明細書で使用されるように、「ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ６抗原」は、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ６の一部から選択されるペプチドであり、保護エピトープを含む。

【0066】

本明細書で使用されるように、「ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５抗原」は、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５の一部から選択されるペプチドであり、保護エピトープを含む。

【0067】

用語「ＰＲＲＳＦＲＥＥ」は、４種類の融合タンパク質である、ＰＥ_４０７−Ｍ−Ｋ３、ＰＥ_４０７−Ｐ−Ｋ３、ＰＥ_４０７−Ｒ−Ｋ３、及びＰＥ_４０７−Ｄ−Ｋ３を含むワクチン組成物を指す。

【0068】

用語「Ｍ１２」及び「Ｍ」は交換可能である。本明細書で使用される用語「Ｍ１２」は、ＰＲＲＳＶ ＮＳＰ １０（Ｃ末端ドメイン配列）及びＮＳＰ １１（Ｎ末端ドメイン配列）を融合して得られる融合抗原を指す。

【0069】

用語「ＰＱＡＢ」及び「Ｐ」は交換可能である。本明細書で使用される用語「Ｐ」は、ＯＲＦ６配列とＯＲＦ５配列との間に架橋／リンカー配列を有しない、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ６のＮ末端部及びＯＲＦ５のＮ末端部を融合して得られる融合抗原を指す。

【0070】

用語「ＲＳＡＢ」及び「Ｒ」は交換可能である。本明細書で使用される用語「Ｒ」は、ＯＲＦ６配列とＯＲＦ５配列との間に架橋／リンカー配列を有しない、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ６のＮ末端部及びＯＲＦ５のＮ末端部を融合して得られる融合抗原を指す。

【0071】

用語「ＤＧＤ」及び「Ｄ」は交換可能である。本明細書で使用される用語「Ｄ」は、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ７のＣ末端部の２回の反復を含む抗原を指す。

【0072】

用語「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」又は「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、有効量の融合タンパク質を、それを必要とする被験体（この被験体は、がん又は感染を有するか、又はそのような疾患の症状又は素因を有する）に、疾患、その症状、又はその素因を治癒、軽減、緩和、矯正、改善、又は防止する目的で、投与することを指す。このような被験体は、任意の適切な診断方法の結果に基づいて、医療従事者によって同定されることができる。

【0073】

用語「有効量」は、治療される被験体に治療的効果を与えるために必要とされる活性化合物の量を指す。当業者によって認識されるように、投与の経路、添加剤の使用、及び他の治療との併用の可能性に応じて、有効投与量は変化するだろう。

【実施例】

【0074】

本発明の範囲を限定しようとするものではないが、本発明の実施形態に係る例示的な器具、装置、方法及びそれらに関連する結果を以下に示す。実施例において、タイトル又はサブタイトルが、読者の便宜のために使用される可能性があり、これは、決して本発明の範囲を限定するものではないことに留意されたい。さらに、ある特定の理論が、本明細書において提案及び開示される。しかしながら、それらの理論が正しくても間違っていても、いかなる特定の理論又は行動のスキームにも関係なく、本発明が本発明にしたがって実施される限り、それらの理論は決して、本発明の範囲を限定するものではない。

【0075】

＜方法＞

【0076】

＜融合抗原ＤＲＭＰ及びＭＤＰＲの合成＞

【0077】

融合抗原ＤＲＭＰ（配列番号：５２）、ＭＤＰＲ（配列番号：５３）及びＰＣＶ２ ＯＲＦ２抗原（配列番号：２０）をコードするＤＮＡ配列をそれぞれ合成し、さらにプラスミドｐＴＡＣ−２−ＰＥ_３１３−ＮＥＳＫ又はｐＴＡＣ−２−ＲＡＰ１−ＰＥｔ_{２６８−３１３}−Ｋ３にクローニングした。合成された全ての配列を、Ｅ．ｃｏｌｉ培養に最適化した。それぞれのフォワードプライマー及びリバースプライマーを、ＤＲＭＰ又はＭＤＰＲのＤＮＡ増幅のためのＰＣＲにおいて使用した。増幅したＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩによって消化し、次いで示されるベクターにライゲーションした。融合タンパク質ＰＥ_３１３−ＰＣＶ２−ＮＥＳＫも同様の方法でクローニングした。

【0078】

表１は、プラスミドへのクローニングのために使用されるフォワードプライマー及びリバースプライマーの配列を示す。ボールド体の文字はＥｃｏＲＩ切断部位を示す；イタリック文字はＳａｌＩ切断部位を示す；イタリック且つボールド体の文字はＸｈｏＩ切断部位を示す；下線の付された文字は抗原配列を示す。

【0079】

【表1】

【0080】

＜例１ 発現ベクターの構築＞

【0081】

図１Ａは、ＰＥが３つのドメイン（Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩ）を含むことを示す。ＰＥ_４０７は、ＰＥのａ．ａ．１〜ａ．ａ４０７の領域である。ＰＥ_４０７は、細胞傷害性ドメインＩＩＩを含まず、したがって、ドメインＩ及びＩＩを含む。ＰＥ_３１３は、ＰＥのａ．ａ．１〜ａ．ａ．３１３の領域である。したがって、ＰＥ_３１３は、ＰＥのドメインＩａ及びドメインＩＩの部分Ｎ末端領域のみを含む。

【0082】

図１Ｂ−Ｃは発現ベクターの構築を示し、これらのそれぞれは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）結合ドメイン、トランスロケーションペプチド、抗原、核輸送シグナル（ＮＥＳ）（これは、下のパネルでは存在し、上のパネルでは存在しない）、及び小胞体（ＥＲ）保持配列（上のパネルではＫ３、下のパネルではＫ）を含み、ＥＲ保持配列が融合タンパク質のＣ末端に位置している。プラスミドであるｐＴａｃ−２−ＰＥ_３１３−ＮＥＳＫ、ｐＴａｃ−２−ＰＥ_４０７−Ｋ３、ｐＴａｃ−２−ＲＡＰ１−ＰＥ_{２６８−３１３}−ＮＥＳＫ及びｐＴａｃ−２−ＲＡＰ１−ＰＥ_{２６８−３１３}−Ｋ３は、以下のように生成した：^ＮｄｅＩＰＥ_３１３−^{（ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ）}−ＮＥＳＫ^ＸｈｏＩ、^ＮｄｅＩＰＥ_４０７−^{（ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ）}−Ｋ３^ＸｈｏＩ、^ＮｄｅＩＲＡＰ１−^{（ＥｃｏＲＩ）}−ＰＥ_{２６８−３１３}−^{（ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ）}−ＮＥＳＫ^ＸｈｏＩ及び^ＮｄｅＩＲＡＰ１−^{（ＥｃｏＲＩ）}−ＰＥ_{２６８−３１３}−^{（ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ）}−Ｋ３^ＸｈｏＩ断片を、ＰＣＲ法によって合成し、次いでカナマイシン抵抗性遺伝子を有するｐＵＣ１８主鎖にライゲーションして、それぞれのプラスミドを得た。

【0083】

次いで、関心の対象となる病原体の抗原又は融合抗原をコードする標的ＤＮＡを上述のプラスミドに挿入すると、融合タンパク質の発現のための発現ベクターを生成することができる。例えば、ブタサーコウイルスタイプ２（ＰＣＶ２）ＯＲＦ２（配列番号：２０）の抗原をコードするＤＮＡ断片を合成し、プラスミドｐＴａｃ−２−ＰＥ_３１３−ＮＥＳＫに挿入して、発現ベクターＰＥ_３１３−ＰＣＶ２−ＮＥＳＫ（図１Ｆ）を生成した。

【0084】

以下の標的ＤＮＡ断片を合成した。
（ｉ）ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ７のＣ末端部の２回の反復を含む抗原をコードする標的ＤＮＡ。この抗原は、「ＤＧＤ」又は「Ｄ」と呼ばれる。
（ｉｉ）ＰＲＲＳＶ ＮＳＰ １０（Ｃ末端ドメイン配列）及びＮＳＰ １１（Ｎ末端ドメイン配列）を融合して得られる融合抗原をコードする標的ＤＮＡ。この抗原は、「Ｍ１２」又は「Ｍ」と呼ばれる。
（ｉｉｉ）ＯＲＦ６配列とＯＲＦ５配列との間に架橋／リンカー配列を有しない、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ６のＮ末端部及びＯＲＦ５のＮ末端部を融合して得られる融合抗原をコードする標的ＤＮＡ。この抗原は、「ＲＳＡＢ」又は「Ｒ」と呼ばれる。
（ｉｖ）ＯＲＦ６配列とＯＲＦ５配列との間に架橋／リンカー配列を有しない、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ６のＮ末端部及びＯＲＦ５のＮ末端部を融合して得られる融合抗原をコードする標的ＤＮＡ。この抗原は、「ＰＱＡＢ」又は「Ｐ」と呼ばれる。

【0085】

上記の標的ＤＮＡ断片を、図１Ｂの上のパネルに示されるプラスミドに挿入して、融合タンパク質ＰＥ_４０７−Ｍ−Ｋ３、ＰＥ_４０７−Ｐ−Ｋ３、ＰＥ_４０７−Ｒ−Ｋ３、及びＰＥ_４０７−Ｄ−Ｋ３をそれぞれ生成した（図１Ｄ）。

【0086】

４種類の上述の抗原Ｄ、Ｒ、Ｍ、及びＰのすべてを含む融合抗原（ＤＲＭＰ、ＭＤＰＲ、など）をコードする標的ＤＮＡ断片を合成し、プラスミドｐＴａｃ−２−ＰＥ_３１３−ＮＥＳＫに挿入して、融合タンパク質ＰＥ−ＤＲＭＰ−ＮＥＳＫ（図１Ｅ）（これは「ＰＲＲＳＦＲＥＥ ４−ｉｎ−１」とも呼ばれる）を発現する発現ベクターを生成した。

【0087】

＜例２ タンパク質発現＞

【0088】

融合タンパク質の発現のためのプラスミドを内部に持つＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１細胞を、２５ｐｐｍのカナマイシンを含有するルリアベルターニ培地中で、３７℃でそれぞれ培養した。培養が初期対数期（Ａ６００＝０．１〜０．４）に達すると、誘導のために、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．５〜２ｍＭの最終濃度で添加した。細胞を誘導４時間後に採取し、−７０℃で直ちに保存した。融合タンパク質を、既述の（Liao et al., 1995. Appl. Microbiol. Biotechnol. 43: 498-507）尿素抽出によって精製し、次いで、４℃で一晩の、５０Ｘ体積のＴＮＥバッファー（５０ｍＭ トリス、５０ｍＭ ＮａＣｌ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ）に対する透析法によって、リフォールディングした。リフォールディングされたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供し、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して定量分析を実施した。この結果は、リフォールディングされたタンパク質のほとんどが、非還元条件下ではモノマーであることを示した。これは、融合タンパク質が容易にリフォールディングされ、凝集されなかったことを示す。

【0089】

＜例３ ＰＲＲＳＶサブユニットワクチン免疫原性アッセイ＞

【0090】

マウスに、３０μｇ／ショットのＰＲＲＳＦＲＥＥ ４−ｉｎ−１又はＰＲＲＳＦＲＥＥ及びＩＳＡ２０６アジュバントを含む、２００μｌのＰＲＲＳＶサブユニットワクチンを、皮下注射により、１週間に１回を２週間、ワクチン接種した。コントロール群（プラセボ）にはＰＢＳを注射した。

【0091】

最後の免疫化の１４日後に全てのマウスを屠殺し、脾臓を採取した。脾細胞を単離し、刺激剤組換え抗原タンパク質の有り無しで、３７℃で７２時間、９６穴プレート（１０^５細胞／１００μｌ／ウェル）で培養した。免疫化で使用したワクチンに応じて、抗原特異的細胞媒介性免疫応答を検出するために使用した刺激剤組換え抗原タンパク質は、ＰＲＲＳＦＲＥＥ抗原、ＰＲＲＳＦＲＥＥ−４−ｉｎ−ｏｎｅキメラ融合抗原、又はＰＣＶ２ ＯＲＦ２抗原であった。細胞培養上清を回収し、上清中のインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）を、ＩＦＮ−γマウス抗体ペア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって測定した。

【0092】

免疫化に使用したワクチンに応じて、体液性免疫応答を検出するために、ＰＲＲＳＦＲＥＥ抗原、又はＰＲＲＳＦＲＥＥ ４−ｉｎ−ｏｎｅ融合抗原、又はＰＣＶ２ ＯＲＦ２抗原をＥＬＩＳＡプレートにコーティングした。コーティングの後、プレートを洗浄し、ブロッキングした後で、希釈されたマウス血清を添加した。次いでプレートを洗浄し、ＨＲＰコンジュゲート二次抗体でハイブリダイズし、その後ＴＭＢ基質を添加した。反応を止めた後、結果をＥＬＩＳＡリーダーによって検出した。

【0093】

＜例４ 細胞媒介性免疫応答（ＣＭＩ）及び体液性免疫応答＞

【0094】

図２Ａは、ワクチン接種群のＩＦＮ−γ濃度が、コントロール群のものより高かったことを示している。このことは、ワクチン接種下でＣＭＩ応答が誘導されたことを示す。さらに、ＰＲＲＳＦＲＥＥ ４−ｉｎ−１ワクチンを投与された群のＩＦＮ−γ濃度は、ＰＲＲＳＦＲＥＥ治療群より劇的に高かった。この結果は、１種類の単一の融合抗原で構成されたＰＲＲＳＦＲＥＥ ４−ｉｎ−１ワクチンが、驚くべきことに、４種類の別個の抗原で構成されたＰＲＲＳＦＲＥＥワクチンよりも強いＣＭＩ応答を誘導することができることを示す。

【0095】

図２Ｂは、ワクチン免疫化群がコントロール群よりも高い抗原特異的抗体価を有したことを示す。ＰＲＲＳＦＲＥＥ ４−ｉｎ−１ワクチンを接種したマウスは、ＰＲＲＳＦＲＥＥワクチンで免疫化した群よりも高い抗体価を有した。この結果は、ＰＲＲＳＦＲＥＥ ４−ｉｎ−１が、ＰＲＲＳＦＲＥＥワクチンよりも強い体液性免疫応答を誘導することができることを示す。

【0096】

図２Ａ−Ｂのデータは、ＰＲＲＳＦＲＥＥ ４−ｉｎ−１（これは、Ｄ、Ｍ、Ｐ、及びＲ抗原の融合物を備える１種類の単一の融合抗原を含む融合タンパク質を含む）が、ＰＲＲＳＦＲＥＥワクチン（これは、４種類の個別の、別個の抗原を含み（すなわち、４種類の抗原Ｍ、Ｍ、Ｐ、Ｒが融合されていない）、各抗原はそれぞれの融合タンパク質にある）よりも強い細胞性及び体液性免疫応答を誘発することができることを示す。

【0097】

＜例５ ブタサーコウイルスタイプ２（ＰＣＶ２）ＯＲＦ２サブユニットワクチンとの組み合わせワクチン＞

【0098】

上述の免疫化スケジュールにしたがって、マウスに、ＰＢＳ、ＰＲＲＳＦＲＥＥ ４−ｉｎ−ｏｎｅプラスＰＥ−ＰＣＶ２−ＮＥＳＫ、又はＰＲＲＳＦＲＥＥプラスＰＥ−ＰＣＶ２−ＮＥＳＫコンボワクチンをワクチン接種した。ＰＲＲＳＦＲＥＥ ４−ｉｎ−ｏｎｅプラスＰＥ−ＰＣＶ２−ＮＥＳＫコンボワクチンは、ＰＥ−ＤＲＭＰ−ＮＥＳＫ（図１Ｄ）及びＰＥ−ＰＣＶ２−ＮＥＳＫ（図１Ｆ）融合タンパク質を含む。ＰＲＲＳＦＲＥＥプラスＰＥ−ＰＣＶ２−ＮＥＳＫコンボワクチンは、５種類の別個の融合タンパク質：（１）ＰＥ−ＤＧＤ−Ｋ３、ＰＥ−Ｍ１２−Ｋ３、ＰＥ−ＰＱＡＢ−Ｋ３、ＰＥ−ＲＳＡＢ−Ｋ３（図１Ｄ）、及びＰＥ−ＰＣＶ２−ＮＥＳＫ（図１Ｆ）を含む。

【0099】

＜例６ ＰＣＶ２ ＯＲＦ２サブユニットワクチンとの組み合わせワクチン＞

【0100】

図３Ａは、ＰＲＲＳＶ抗原特異的（ＰＲＲＳＦＲＥＥ ４−ｉｎ−１融合抗原、及びＰＲＲＳＦＲＥＥ抗原）ＣＭＩ応答を示し、図３Ｂは、ＰＣＶ２−ＯＲＦ２特異的ＣＭＩ応答を示す。このデータは、ＰＲＲＳＦＲＥＥ ４−ｉｎ−１融合抗原及びＰＣＶ２ ＯＲＦ２サブユニットワクチンの組み合わせで免疫化したマウス群が、ＰＲＲＳＦＲＥＥ（４種類の別個の抗原）及びＰＣＶ２ ＯＲＦ２サブユニットワクチンの組み合わせで免疫化したマウス群よりも強いＣＭＩ応答を示したことを示す。

【0101】

図４Ａは、ＰＲＲＳＶ抗原特異的抗体応答を示す。ＥＬＩＳＡ法を使用して抗原特異的抗体価を測定した。ＰＥ−ＤＲＭＰ−ＮＥＳＫ及びＰＥ−ＰＣＶ２−ＮＥＳＫの組み合わせ（すなわち、２種類の融合タンパク質）で治療した群については、融合抗原ＤＲＭＰを使用して抗原特異的抗体価を測定した。ＰＲＲＳＦＲＥＥ及びＰＥ−ＰＣＶ２−ＮＥＳＫの組み合わせ（すなわち、５種類の融合タンパク質）で治療した群については、４種類の抗原Ｄ、Ｒ、Ｍ、及びＰを使用して抗原特異的抗体価を測定した。このデータは、ＰＲＲＳＦＲＥＥ ４−ｉｎ−１融合抗原及びＰＣＶ２ ＯＲＦ２サブユニットワクチンの組み合わせで免疫化したマウス群が、ＰＲＲＳＦＲＥＥ（４種類の別個の抗原）及びＰＣＶ２ ＯＲＦ２サブユニットワクチンの組み合わせで免疫化したマウス群よりも強いＰＲＲＳＦＲＥＥ ４−ｉｎ−１融合抗原特異的体液性応答を示したことを示す（図４Ａ）。

【0102】

図４Ｂは、ＰＣＶ２−ＯＲＦ２抗原特異的抗体応答を示す。驚くべきことに、ＰＲＲＳＦＲＥＥ（４種類の別個の抗原）及びＰＣＶ２ ＯＲＦ２サブユニットワクチン（ＰＥ−ＰＣＶ２−ＮＥＳＫ）の組み合わせで免疫化されたマウスは、ＰＲＲＳＦＲＥＥ ４−ｉｎ−１融合抗原（ＰＥ−ＤＲＭＰ−ＮＥＳＫ）及びＰＣＶ２ ＯＲＦ２サブユニットワクチン（ＰＥ−ＰＣＶ２−ＮＥＳＫ）の組み合わせで免疫化された群よりも高いＰＣＶ２特異的抗体価を有した。この結果は、これら２種類のＰＲＲＳＶ／ＰＣＶ２コンボワクチンの間で、ＰＲＲＳＶ抗原特異的体液性免疫応答及びＰＣＶ２特異的体液性免疫応答に差異があったことを示す。

【0103】

ＣＭＩ応答及び体液性免疫応答の誘導において、両方のアプローチが有効であることは明らかである。２種類の融合タンパク質（ＰＥ−ＤＲＭＰ−ＮＥＳＫ及びＰＥ−ＰＣＶ２−ＮＥＳＫ）を含むＰＲＲＳＶ／ＰＣＶ２コンボワクチンは、試験した４つの免疫応答のうち３つにおいて、より良好な効能を示す。この研究は、ＰＲＲＳＶキメラ融合抗原及びＰＣＶ２ ＯＲＦ２抗原で構成されたＰＲＲＳＶ／ＰＣＶ２コンボワクチンが、５種類の個別の抗原で構成されたものよりも良い選択であることを示す。それでもなお、両方のアプローチが、動物において免疫応答を誘導するのに有用である。

【0104】

＜例７ ２種類の抗原の融合物対４種類の抗原の融合物＞

【0105】

３群の６週齢メスＣ５７ＢＬ／６マウス（１群あたり３匹のマウス）に、毎週の間隔で３回、（１）１５μｇのＰＥ−ＤＲ−ＮＥＳＫタンパク質、（２）１５μｇのＰＥ−ＤＲ−ＮＥＳＫタンパク質及び１５μｇのＰＥ−ＭＰ−ＮＥＳＫタンパク質の組み合わせ、又は（３）３０μｇのＰＥ−ＤＲＭＰ−ＮＥＳＫ（２００μｌの５０％ＩＳＡ２０６中）を、皮下注射した。最後の免疫化の１週間後にマウスを殺し、脾細胞を採取した。脾細胞を４種類のＰＲＲＳＶ抗原（Ｍ１２、ＤｇＤ、ＰＱＡＢ及びＲＳＡＢ、それぞれ２．５μｇ／ｍｌ）で７２時間刺激し、ＥＬＩＳＡキットを使用して各群の無細胞上清中のＩＦＮ−γを検出した。図５は、ＰＥ−ＤＲＭＰ−ＮＥＳＫで免疫化されたマウスが、３群の中で最も大きいＣＭＩ応答を示したことを示す。

【0106】

＜例８ ブタにおける細胞媒介性免疫性＞

【0107】

５週齢のＳＰＦブタ（１群あたり２−４匹のブタ）に、毎週の間隔で２回、以下のワクチンのうちの１つを筋肉内注射した：（１）ＰＲＲＳＦＲＥＥ、（２）ＰＥ−ＤＲＭＰ−ＮＥＳＫ、（３）ＰＥ−ＭＤＰＲ−ＮＥＳＫ、（４）ＲＡＰ１−ＰＥ_{２６８−３１３}−ＤＲＭＰ−Ｋ３、（５）ＲＡＰ１−ＰＥ_{２６８−３１３}−ＭＤＰＲ−Ｋ３（２ｍｌの５０％ＩＳＡ２０６中）、又は（６）プラセボとしてＰＢＳ。図６は、これらのワクチンの設計を示す。各注射中の抗原は、２ｍｌの５０％ＩＳＡ２０６中に３００μｇであった。ワクチン接種したブタの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、最後の免疫化の３週間後に採取した。免疫化において使用したワクチンに応じて、ＰＢＭＣを、ＰＲＲＳＦＲＥＥ抗原（Ｍ１２、ＤｇＤ、ＰＱＡＢ及びＲＳＡＢ、それぞれ２．５ｕｇ／ｍｌ）、ＰＥ−ＤＲＭＰ−ＮＥＳＫ、ＰＥ−ＭＤＰＲ−ＮＥＳＫ、ＲＡＰ１−ＰＥ_{２６８−３１３}−ＤＲＭＰ−Ｋ３、又はＲＡＰ１−ＰＥ_{２６８−３１３}−ＭＤＰＲ−Ｋ３で７２時間刺激し、次いでＥＬＩＳＡキットを使用して、各群の無細胞上清中のＩＦＮ−γを検出した。図７は、刺激の後に、ワクチン接種したブタのＰＢＭＣによって分泌されたＩＦＮ−γを示す。融合抗原を含むワクチンが、プラセボ群よりも高いＩＦＮ−γ分泌を誘導することができたことが観察された。

【0108】

＜例９ ブタにおけるウイルス血症研究＞

【0109】

５週齢のＳＰＦブタ（１群あたり２−４匹のブタ）に、毎週の間隔で２回、以下のワクチンのうちの１つを筋肉内注射した：（１）ＰＲＲＳＦＲＥＥ、（２）ＰＥ−ＤＲＭＰ−ＮＥＳＫ、（３）ＰＥ−ＭＤＰＲ−ＮＥＳＫ、（４）ＲＡＰ１−ＰＥ_{２６８−３１３}−ＤＲＭＰ−Ｋ３、（５）ＲＡＰ１−ＰＥ_{２６８−３１３}−ＭＤＰＲ−Ｋ３（２ｍｌの５０％ＩＳＡ２０６中）、又は（６）プラセボとしてＰＢＳ。各注射中の抗原は、２ｍｌの５０％ＩＳＡ２０６中に３００μｇであった。ワクチン接種したブタに、最後の免疫化の３週間後に、２ ｘ １０^５ ＴＣＩＤ５０のＰＲＲＳＶを鼻腔内投与した。血液サンプルを毎週回収した。ウイルスＲＮＡを血清から抽出し、ワンステップＳｙＢＲ ＧｒｅｅｎリアルタイムＰＣＲを使用して定量化して、ウイルス血症のレベルを測定した。この実験結果は、融合抗原を含むワクチンがウイルス量を低減することができたことを示した。

【0110】

表２は、様々な融合タンパク質を作製するために使用されるペプチドの配列番号を示す。

【0111】

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【0112】

＊：ＰＥ_{２６８−３１３}は、完全長ＰＥのａ．ａ．２６８−ａ．ａ．３１３である；ＰＥ_３１３は、完全長ＰＥのａ．ａ．１−ａ．ａ．３１３である；ＰＥ_４０７は、完全長ＰＥのａ．ａ．１−ａ．ａ．４０７である。
＊＊：ボールド体の文字は、人工核輸送シグナルのアミノ酸配列を表す；下線の付された文字は、小胞体保持シグナルのアミノ酸配列を表す。
＊＊＊：Ｍ（Ｍ１２）は、ＰＲＲＳＶ ＮＳＰ １０（Ｃ末端ドメイン配列）及びＮＳＰ １１（Ｎ末端ドメイン配列）の融合によって調製された融合ポリペプチドである。すなわち、このポリペプチドは、非構造タンパク質であるＯＲＦ１ｂ ＮＳＰ １０ Ｃ末端部及びＮＳＰ １１ Ｎ末端部に由来する。
＊＊＊＊：Ｐ（ＰＱＡＢ）は、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ６ ａ．ａ．２−ａ．ａ．２６及びＯＲＦ５ ａａ３１−ａａ６３の融合によって調製されたポリペプチドである。米国特許第７４６５４５５号を参照。普通の文字で示される配列はＰＲＲＳＶ ＯＲＦ６／マトリクスタンパク質配列に由来し、ボールド体の文字で示される配列はＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５配列に由来する。ＰＲＲＳＶのＯＲＦ５によってコードされる主要なエンベロープタンパク質（ＧＰ５）は、ウイルス中和（ＶＮ）抗体及びＰＲＲＳＶの異なる株間の交差防御の誘導において、決定的役割を有する。異なる株間には配列変異があるため、本明細書中の配列は、例示の目的で開示される。

【0113】

本発明は、図示された特定の形態に限定されず、本発明の精神及び範囲から逸脱しない全ての改変が、添付の特許請求の範囲に規定される範囲内にある。企図される特定の用途に適するように様々な改変をして、本発明及び様々な実施形態を当業者が利用することができるように、本発明の原理及びその実際の適用を説明する目的で、実施形態及び実施例は選択及び記載された。本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、別の実施形態が、本発明に関する分野の当業者には明らかになるであろう。特許、特許出願及び様々な刊行物を含み得る、いくつかの参考文献が、本発明の説明において引用され、論じられている。そのような参考文献の引用及び／又は議論は、単に本発明の説明を明確にするために提供されるものであり、そのような参照が本明細書に記載された発明の「先行技術」であることを認めるものではない。本明細書で引用され論じられたすべての参考文献は、各参考文献が参照により個別に組み込まれた場合と同じ程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]