特許 6678046 質量分析によるサイログロブリン定量

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6678046

(24)【登録日】2020年3月18日

(45)【発行日】2020年4月8日

(54)【発明の名称】質量分析によるサイログロブリン定量

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/37 20060101AFI20200330BHJP

   G01N 27/62 20060101ALI20200330BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/37ZNA

   G01N27/62 V

   G01N27/62 X

【請求項の数】13

【全頁数】28

(21)【出願番号】特願2016-47198(P2016-47198)

(22)【出願日】2016年3月10日

(62)【分割の表示】特願2015-533192(P2015-533192)の分割

【原出願日】2013年9月19日

(65)【公開番号】特開2016-165284(P2016-165284A)

(43)【公開日】2016年9月15日

【審査請求日】2016年6月16日

【審判番号】不服2018-9943(P2018-9943/J1)

【審判請求日】2018年7月20日

(31)【優先権主張番号】61/703,721

(32)【優先日】2012年9月20日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】505063050

【氏名又は名称】クエスト ダイアグノスティックス インヴェストメンツ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】230104019

【弁護士】

【氏名又は名称】大野 聖二

(74)【代理人】

【識別番号】100119183

【弁理士】

【氏名又は名称】松任谷 優子

(74)【代理人】

【識別番号】100149076

【弁理士】

【氏名又は名称】梅田 慎介

(74)【代理人】

【識別番号】100173185

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 裕

(72)【発明者】

【氏名】ザン，ヤンニ

(72)【発明者】

【氏名】クラーク，ニゲル ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】ライツ，リチャード イー．

【合議体】

【審判長】 田村 聖子

【審判官】 中島 庸子

【審判官】 小暮 道明

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１２／１１１２４９号

【文献】 Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００８年，Ｖｏ．５４，Ｎｏ．１１，ｐｐ．１７９６−１８０４

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

IPC C12Q

C12N15/

C12N 9/

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＷＰＩＤＳ／ＥＭＢＡＳＥ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

被験試料中のサイログロブリンの量を決定するための方法であって、
（ａ）前記被験試料中のサイログロブリンおよび添加した同位体標識サイログロブリンペプチド標準を消化して、ＴｇペプチドおよびＴｇペプチド標準産物を生成するステップと、ここで、ＴｇペプチドおよびＴｇペプチド標準産物はいずれも配列番号１のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ステップ（ａ）からの前記ＴｇペプチドおよびＴｇペプチド標準産物を精製するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）からの前記ＴｇペプチドおよびＴｇペプチド標準産物をイオン化して、質量分析によって検出可能な１種または複数のＴｇペプチドイオンおよびＴｇペプチド標準産物イオンを産生するステップと、
（ｄ）質量分析によって、ステップ（ｃ）からの６１２．３±０．５、７２６．４±０．５、および７９７．４±０．５の質量／電荷比を有するイオンの群から選択される１種または複数のイオンの量を検出するステップであって、ステップ（ｄ）で検出されるイオンの量を、ステップ（ａ）で消化された前記被験試料中のサイログロブリンの量およびサイログロブリンペプチド標準の量と関係付けるステップと、
を含む方法。

【請求項2】

サイログロブリンペプチド標準の長さが、５０アミノ酸残基未満である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ＴｇペプチドおよびＴｇペプチド標準産物の両方が、Ｔ１２９ペプチド（配列番号１、ＶＩＦＤＡＮＡＰＶＡＶＲ）を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

サイログロブリンペプチド標準が、配列番号２のアミノ酸配列（ＫＶＰＥＳＫＶＩＦＤＡＮＡＰＶＡＶＲＳＫＶＰＤＳ）を含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

サイログロブリンペプチド標準が、配列番号２（ＫＶＰＥＳＫＶＩＦＤＡＮＡＰＶＡＶＲＳＫＶＰＤＳ）に対し少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ステップ（ａ）の消化によりＴ１２９ペプチド（配列番号１、ＶＩＦＤＡＮＡＰＶＡＶＲ）を生成することができる、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

被験試料に添加された同位体標識サイログロブリンペプチド標準の量が既知である、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

ステップ（ｃ）において産生されたＴｇペプチドイオンが、さらに５４１．３±０．５、６３６．４±０．５、９１２．４±０．５または１０５９．５±０．５の質量／電荷比を有するイオンの群から選択される１種または複数のイオンを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記イオン化が、さらに６３６．４±０．５の質量／電荷比を有するＴｇペプチド前駆イオンを生成することと、９１２．４±０．５または１０５９．５±０．５の質量／電荷比を有する１種または複数の断片イオンを生成することとを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記被験試料が、体液または組織である、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

被験試料中のサイログロブリンの量を決定するための方法であって、
（ａ）前記被験試料中のサイログロブリンを消化して、ペプチドＴ１２９を生成し、前記被験試料中の添加された同位体標識サイログロブリンペプチド標準を消化して、同位体標識ペプチドＴ１２９内部標準を生成するステップと、ここで、ペプチドＴ１２９およびペプチドＴ１２９内部標準はいずれも配列番号１のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ステップ（ａ）からの前記ペプチドＴ１２９およびペプチドＴ１２９内部標準を精製するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）からの前記ペプチドＴ１２９およびペプチドＴ１２９内部標準をイオン化して、タンデム質量分析によって検出可能な２種以上の前駆イオンを生成するステップであり、ペプチドＴ１２９の前記前駆イオンが、６３６．４±０．５の質量／電荷比を有するステップと、
（ｄ）質量分析装置において前記前駆イオンを断片化して、質量分析によって検出可能な１種または複数の断片イオンを生成するステップであって、ペプチドＴ１２９の前記断片イオンのうち１種または複数が、７９７．４±０．５の質量／電荷比を有するイオンのリストから選択されるステップと、
（ｅ）質量分析により、ステップ（ｃ）の前記前駆イオン、ステップ（ｄ）の前記断片イオンのうち１種もしくは複数、またはその両方の量を検出するステップとを含み、ステップ（ｅ）で検出されたイオンの量を、前記被験試料中の前記サイログロブリンの量と関係付ける、方法。

【請求項11】

サイログロブリンペプチド標準が、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

サイログロブリンペプチド標準が、配列番号２（ＫＶＰＥＳＫＶＩＦＤＡＮＡＰＶＡＶＲＳＫＶＰＤＳ）に対し少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ステップ（ａ）の消化によりＴ１２９ペプチドを生成することができる、請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

被験試料に添加された同位体標識サイログロブリンペプチド標準の量が既知である、請求項１０に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、ここに本開示の一部を構成するものとしてその内容全体を援用する、２０１２年９月２０日に出願された米国特許仮出願第６１／７０３，７２１号に基づく利益を主張するものである。

【0002】

本開示は、サイログロブリンの定量に関する。特定の態様において、本開示は、質量分析によりサイログロブリンを定量するための方法に関する。

【背景技術】

【0003】

本開示の背景に関する以下の記載は、単に本開示の理解の補助として提供されるものであり、本開示の先行技術を記載または構成するものと認めるものではない。

【0004】

サイログロブリンまたはＴｇは、非共有結合したホモ二量体で構成される、６６０ｋＤａの分子量を有する大型の二量体の分泌性糖タンパク質である。

【0005】

Ｔｇ分子は、数種類の形態で存在する。ＵｎｉＰｒｏｔ知識ベース（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ＋ＴｒＥＭＢＬ）に見出される３種の主要Ｔｇ分子配列は、Ｐ０１２６６（ヒトサイログロブリン前駆体）、Ｐ０１２６６−２（Ｐ０１２６６のアイソフォーム２）およびＱ５９ＧＦ０２（ヒトサイログロブリン変異体）である（それぞれ図１、図２および図３を参照）。

【0006】

Ｐ０１２６６は、２７６８ＡＡの長さを有するＰ０１２６６の主要な変異体であり、Ｐ０１２６６−２は、２７１１ＡＡの長さを有するＰ０１２６６のアイソフォームである。Ｐ０１２６６−２は、Ｔｇのアミノ酸位置１５１０〜１５６７がＰ０１２６６とは異なり、Ｑ５９ＧＦ０は、１５７４ＡＡの長さを有するサイログロブリン断片である。Ｑ５９ＧＦ０は、Ｔｇの１２１２〜２７６８位のアミノ酸を含有する。

【0007】

Ｔｇは、甲状腺でのみ産生され、正常かつ十分に分化した良性の甲状腺細胞、または甲状腺がん細胞、のいずれによっても産生され得る。これは、甲状腺ホルモン合成のための前駆体タンパク質であり、甲状腺ヨウ素貯蔵のためのマトリックスとして機能する。Ｔｇは、甲状腺によって、甲状腺ホルモン、サイロキシン（Ｔ４）およびトリヨードサイロニン（Ｔ３）を産生するために用いられる。血中のＴｇレベルは、分化型甲状腺癌（ＤＴＣ）の腫瘍マーカーとして用いることができる。血中の高レベルＴｇは、それのみでは甲状腺がんの指標ではないが、甲状腺の外科的除去後の血中にＴｇが残留することは、甲状腺組織が残留していることの指標となる。甲状腺の外科的除去後に血中Ｔｇが検出された後の処置過程は、残存する全ての正常甲状腺を除去するための放射性ヨウ素の投与を含み得る。全ての正常甲状腺を除去した後でも持続的に血中Ｔｇが残留することは、ある程度の量の腫瘍がなお存在していることを示す可能性がある。

【0008】

Ｔｇを定量するためにいくつかの方法が開発されている。例えば、Ｓｐｅｎｃｅｒら、Ｔｈｙｒｏｉｄ、１９９９、９（５）：４３５〜４１およびＰｅｒｓｏｏｎら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ ２００６、５２（４）：６８６〜６９１は、Ｔｇを定量するための免疫測定法、放射免疫測定法、および化学発光免疫測定法を開示する。これらの方法は全て、規格化の差、アッセイ間感度および精度のばらつき、フック効果、ならびにＴｇ抗体に起因し得る干渉等、方法論上の問題の影響を受ける。甲状腺がん患者の最大２０％がＴｇ自己抗体を有するため、Ｔｇ抗体に起因し得る干渉の問題は、腫瘍マーカーとしてＴｇ
レベルをモニターする臨床適用において特に厄介である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本開示は、タンデム質量分析などの質量分析により試料中のＴｇを定量するための方法を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0010】

一態様において、被験試料中のＴｇの量を決定するための方法であって、（ａ）Ｔｇ含有被験試料を消化処理し、Ｔｇペプチドを作製するステップと、（ｂ）１種または複数のＴｇペプチドを精製するステップと、（ｃ）１種または複数のＴｇペプチドをイオン化するステップと、（ｄ）質量分析によりＴｇペプチドイオンの量を検出するステップと、（ｅ）検出されたＴｇペプチドイオンの量を、被験試料中のＴｇの量と関係付けるステップとを含む方法が提供される。Ｔｇペプチドを調製するための好ましい酵素は、トリプシンである。本方法に適したＴｇペプチドは、質量分析により評価することができ、Ｔｇ以外のタンパク質から生成され得る関連ペプチドから十分に精製することができるＴｇペプチドである。斯かるペプチドの一例は、Ｔｇの１５７９〜１５９０位由来のアミノ酸を含有し、約１，２７０Ｄａの分子量を有し、Ｔｇの全３種のアイソフォームに存在するペプチドＴ１２９（配列ＶＩＦＤＡＮＡＰＶＡＶＲ；配列番号１）である。図４を参照されたい。

【0011】

ペプチドＴ１２９の形成は、サイログロブリンの特有のトリプシン生成ペプチドをもたらす。また、Ｔｇのトリプシン消化からのペプチドＴ１２９の作製は、Ｔｇ抗体の有無の影響を受けないと予想される。よって、被験試料中のペプチドＴ１２９の増加の測定は、Ｔｇ抗体の干渉を受けずに被験試料に元から存在するＴｇの量を定量する方法を提供する。

【0012】

あらゆる適切な方法を用いて、試料中のＴｇの消化に起因するＴｇペプチドの量を決定することができる。被験試料が内在性Ｔｇペプチドを含有し得る場合には、内在性ペプチドが、試料中のＴｇの消化により生成されるペプチドと混同されないようにするステップを採用してもよい。アプローチの１つは、Ｔｇを消化する前に試料から内在性Ｔｇペプチドを除去することである。これは、例えば、サイズ分離技術を用いて行うことができる。別のアプローチは、被験試料中の内在性ペプチドのベースラインレベルを確立するために、特許請求される方法に従って、但し消化ステップを除外して、被験試料の一部を解析することである。このアプローチにおいて、ベースラインが決定されたら、ペプチドの消化後レベル（内在性ペプチドおよび消化により生成されたペプチドの両方を表す）からこれを減算することができる。

【0013】

本方法は、複合被験試料（特に、体液または組織由来被験試料）に適用することができるため、消化の前に被験試料中のＴｇを精製するステップを採用してもよい。これは、例えば、サイズ分離技術を用いて行うことができる。

【0014】

いくつかの実施形態において、本方法は、１種または複数のＴｇペプチドイオンを生成するステップを含み、前記イオンのうち少なくとも１種は、（一価または多価の）ペプチドＴ１２９イオンに相当する質量／電荷比（ｍ／ｚ）を有する。好ましい関連実施形態において、本方法は、１種または複数のＴｇペプチドイオンを生成するステップを含み、その少なくとも１種は、１２７２．８±０．５、６３６．４±０．５または４２４．３±０．５（単一、二重または三重荷電ペプチドＴ１２９イオンに相当）のｍ／ｚを有する。関連する好ましい実施形態において、本方法は、Ｔｇペプチドイオンの１種または複数の断片イオンを生成するステップを含むことができ、その少なくとも１種は、５４１．３±０
．５、６１２．３±０．５、７２６．４±０．５、７９７．４±０．５、９１２．４±０．５または１０５９．５±０．５のｍ／ｚを有し、好ましくは、断片イオンのうち１種または複数は、７９７．４±０．５、９１２．４±０．５および１０５９．５±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択される。

【0015】

いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）における精製は、少なくとも１回のサイズ分離技術を用いて達成される。好ましくは、サイズ分離技術は、濾過、ＬＣまたはこれらのいずれかの組み合わせとなり得る。特定の好ましい実施形態において、被験試料は、体液または組織である。いくつかの実施形態において、１種または複数の内在性Ｔｇペプチドのベースラインレベルを確立するために、第２の量の被験試料をステップ（ｂ）から（ｅ）で処理する追加のステップが含まれる。これらの実施形態において、このベースラインレベルを被験試料で検出されたＴｇペプチドイオンの量から減算して、元の被験試料中のＴｇに起因するＴｇペプチドイオンの量を決定することができる。他の実施形態において、本方法は、消化の前に被験試料中のＴｇを精製する追加の初期ステップを含む。これらの実施形態において、消化前精製および／またはステップ（ｂ）における精製はそれぞれ、少なくとも１回のサイズ分離技術により達成することができる。好ましくは、消化前精製およびステップ（ｂ）の両方において用いられる少なくとも１回のサイズ分離技術は、濾過である。より好ましくは、この濾過は、フィルター上にＴｇを保持し、濾液と共にＴｇペプチドを通過させる分子量カットオフを有する分子量カットオフフィルターにより行われる。関連する実施形態において、分子量カットオフは、約２ｋＤ〜３００ｋＤ、より好ましくは、約１００ｋＤ〜３００ｋＤである。これらの実施形態において、同じフィルターで２回の濾過（消化前およびステップ（ｂ））を行ってもよい。

【0016】

第２の態様において、被験試料中のＴｇの量を決定するための方法であって、（ａ）Ｔｇ含有被験試料を消化処理し、ペプチドＴ１２９を作製するステップと、（ｂ）ペプチドＴ１２９を精製するステップと、（ｃ）ペプチドＴ１２９をイオン化して、６３６．４±０．５のｍ／ｚを有する前駆イオンを生成するステップと、（ｄ）ペプチドＴ１２９前駆イオンを断片化して、１種または複数の断片イオンを生成し（ここで断片イオンのうち少なくとも１種が、約７９７．４±０．５、９１２．４±０．５または１０５９．５±０．５のｍ／ｚを有する）、質量分析により、ペプチドＴ１２９前駆イオン、断片イオンのうち１種もしくは複数、またはその両方の量を検出するステップと、（ｅ）検出されたイオンの量を、被験試料中のＴｇの量と関係付けるステップとを含む方法が提供される。特定の好ましい実施形態において、被験試料は、体液または組織または組織である。いくつかの実施形態において、１種または複数の内在性ペプチドＴ１２９のベースラインレベルを確立するために、第２の量の被験試料をステップ（ｂ）から（ｅ）で処理する追加ステップが含まれる。これらの実施形態において、このベースラインレベルを、被験試料で検出されたペプチドＴ１２９イオンの量から減算して、元の被験試料中のＴｇに起因するペプチドＴ１２９イオンの量を決定することができる。他の実施形態において、本方法は、消化の前に被験試料中のＴｇを精製する追加の初期ステップを含む。これらの実施形態において、消化前精製および／またはステップ（ｂ）における精製はそれぞれ、少なくとも１回のサイズ分離技術により達成することができる。好ましくは、消化前精製およびステップ（ｂ）の両方において用いられる少なくとも１回のサイズ分離技術は、濾過である。より好ましくは、この濾過は、フィルター上にＴｇを保持し、濾液と共にＴｇペプチドを通過させる分子量カットオフを有する分子量カットオフフィルターにより行われる。関連する実施形態において、分子量カットオフは、約２ｋＤ〜３００ｋＤ、より好ましくは、約１００ｋＤ〜３００ｋＤである。これらの実施形態において、同じフィルターで２回の濾過（消化前およびステップ（ｂ））を行ってもよい。

【0017】

本明細書において、用語「精製」または「精製する」とは、試料から目的とする分析物以外のあらゆる材料を除去することを指すものではない。その代わりに、精製は、試料の
１種または複数の他の構成成分と比べて、目的とする１種または複数の分析物の量を濃縮する手順を指す。本明細書における精製は、他のあらゆるものからの分析物の単離を必要としない。好ましい実施形態において、精製ステップまたは手順を用いて、１種または複数の干渉物質、例えば、本方法において用いられる装置の動作に干渉し得る１種もしくは複数の物質または質量分析による分析物イオンの検出に干渉し得る物質を除去することができる。

【0018】

本明細書において、イオンの質量測定値以外の、定量的測定値に関する用語「約」は、表示の値プラスマイナス１０％を指す。

【0019】

本明細書において、用語「実質的に全ての」は、５０％を超える、より好ましくは６０％を超える、より好ましくは７０％を超える、より好ましくは８０％を超える、より好ましくは９０％を超える、いずれかの比率を指す。

【0020】

本明細書において、用語「被験試料」は、Ｔｇを含有し得るいずれかの試料を指す。本明細書において、用語「体液または組織」は、個体の身体から単離することができるいずれかの流体または組織を意味する。例えば、「体液または組織」は、血液、血漿、血清、胆汁、唾液、尿、涙、汗その他を含むことができる。固形組織を解析する必要がある場合、これを加工することで、組織中に存在する何らかのＴｇを含有する可能性がある液体部分を放出させてもよい。次に、液体部分を本明細書に記載されている方法で処理してもよい。

【0021】

本明細書において、用語「消化」は、タンパク質をペプチドにするタンパク質切断を意味する。消化剤は、トリプシン、Ｌｙｃ−Ｃ、Ａｒｇ−Ｒ、Ａｓｐ−Ｎその他を含むことができる。消化は、試料に消化剤（即ち、酵素）を添加し、所定期間インキュベートすることにより行われる。

【0022】

本明細書において、「Ｔｇ」または「Ｔｇ分子」は、インタクトなＴｇタンパク質分子を意味する。

【0023】

本明細書において、用語「Ｔｇペプチド」は、天然のＴｇの断片である、１００アミノ酸以下のいずれかのペプチドを意味する。Ｔｇペプチドは、被験試料に内在していてもよいし、あるいはＴｇの消化の結果として形成されてもよい。ペプチドＴ１２９は、Ｔｇのトリプシン消化の結果として形成されるＴｇペプチドの一例である。

【0024】

本明細書において、用語「サイズ分離技術」は、分子量および形状のうちいずれか１種または複数に基づき、被験試料からの少なくとも１種の化学種の分離を可能にするいずれかの技術（物理的または化学的）を意味する。斯かる技術の例として、濾過、クロマトグラフィーおよび質量分析の特定の態様が挙げられるがこれらに限定されない。

【0025】

本明細書において、用語「クロマトグラフィー」は、液体または気体によって運ばれる化学的混合物が、固定された液相または固相の周り、その上および／またはその中を流動するときに、化学物質の差次的分布の結果として構成成分に分離されるプロセスを指す。

【0026】

本明細書において、用語「液体クロマトグラフィー」または「ＬＣ」は、流体が、微粉物質のカラムを通ってまたは毛細管通路を通って均一に浸出する際の、流体溶液の１種または複数の構成成分の選択的遅延のプロセスを意味する。遅延は、この流体が固定相と相対的に移動する際の、１種または複数の固定相およびバルク流体（即ち、移動相）の間の混合物の構成成分の分布に起因する。「液体クロマトグラフィー」は、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および高乱流（high
turbulence）液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）を含む。

【0027】

本明細書において、用語「高速液体クロマトグラフィー」または「ＨＰＬＣ」は、典型的には密に充填されたカラムである固定相を通して移動相を加圧下で推し進めることにより、分離の程度が増加した液体クロマトグラフィーを指す。

【0028】

本明細書において、用語「質量分析」または「ＭＳ」は、その質量により化合物を同定するための分析的技術を指す。ＭＳは、そのｍ／ｚに基づきイオンを濾過、検出および測定する方法を指す。ＭＳ技術は、一般に、（１）化合物をイオン化して、荷電化学種（例えば、イオン）を生成するステップと、（２）イオンの分子量を検出し、そのｍ／ｚを計算するステップとを含む。化合物は、いずれかの適した手段によりイオン化および検出することができる。「質量分析計」は、一般に、イオン化装置およびイオン検出器を含む。一般に、目的とする１種または複数の分子がイオン化され、その後、イオンは質量分析装置に導入され、磁場および電場の組み合わせにより、質量（「ｍ」）および電荷（「ｚ」）に依存する空間中のパスをたどる。例えば、「Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｆｒｏｍ Ｓｕｒｆａｃｅｓ」と題する米国特許第６，２０４，５００号；「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｔａｎｄｅｍ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」と題する第６，１０７，６２３号；「ＤＮＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｂａｓｅｄ Ｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」と題する第６，２６８，１４４号；「Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ａｎｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｆｏｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｎａｌｙｔｅｓ」と題する第６，１２４，１３７号；Ｗｒｉｇｈｔら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２：２６４〜７６（１９９９）；ならびにＭｅｒｃｈａｎｔおよびＷｅｉｎｂｅｒｇｅｒ、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２１：１１６４〜６７（２０００）を参照されたい。

【0029】

本明細書において、用語「正イオンモードで操作する」は、正イオンが検出される質量分析方法を指す。同様に、用語「負イオンモードで操作する」は、負イオンが検出される質量分析方法を指す。

【0030】

本明細書において、用語「イオン化」または「イオン化する」は、１または複数の電子単位に等しい正味電荷を有する分析物イオンを生成するプロセスを指す。正イオンは、１または複数の電子単位の正味正電荷を有するイオンである。負イオンは、１または複数の電子単位の正味負電荷を有するイオンである。

【0031】

本明細書において、用語「電子イオン化」または「ＥＩ」は、気相または蒸気相における目的とする分析物が、電子の流動と相互作用する方法を指す。分析物と電子の衝突は、分析物イオンを産生し、次にこれを質量分析技術で処理してもよい。

【0032】

本明細書において、用語「化学イオン化」または「ＣＩ」は、試薬ガス（例えば、アンモニア）が電子衝突に付され、試薬ガスイオンおよび分析物分子の相互作用により分析物イオンが形成される方法を指す。

【0033】

本明細書において、用語「高速原子衝撃」または「ＦＡＢ」は、高エネルギー原子（多くの場合、ＸｅまたはＡｒ）のビームが不揮発性試料に衝突し、試料に含有される分子を脱離およびイオン化させる方法を指す。被験試料は、グリセロール、チオグリセロール、ｍ−ニトロベンジルアルコール、１８−クラウン−６クラウンエーテル、２−ニトロフェニルオクチルエーテル、スルホラン、ジエタノールアミンおよびトリエタノールアミン等、粘稠性の液体マトリックスに溶解される。化合物または試料に適切なマトリックスの選択は、経験的なプロセスである。

【0034】

本明細書において、用語「マトリックス支援レーザー脱離イオン化」または「ＭＡＬＤＩ」は、不揮発性試料をレーザー照射に曝露して、光イオン化、プロトン化、脱プロトン化およびクラスター崩壊を含む様々なイオン化経路により、試料中の分析物を脱離およびイオン化させる方法を指す。ＭＡＬＤＩのため、試料は、分析物分子の脱離を容易にするエネルギー吸収マトリックスと混合される。

【0035】

本明細書において、用語「表面増強レーザー脱離イオン化」または「ＳＥＬＤＩ」は、不揮発性試料をレーザー照射に曝露して、光イオン化、プロトン化、脱プロトン化およびクラスター崩壊を含む様々なイオン化経路により、試料中の分析物を脱離およびイオン化させる別の方法を指す。ＳＥＬＤＩのため、試料は典型的に、目的とする１種または複数の分析物を優先的に保持する表面に結合している。ＭＡＬＤＩと同様に、このプロセスは、イオン化を容易にするためにエネルギー吸収材料を用いることもできる。

【0036】

本明細書において、用語「エレクトロスプレーイオン化」または「ＥＳＩ」は、長さの短い毛細管に沿って溶液を通過させて、その末端に高い正または負の電位を印加する方法を指す。チューブの末端に達した溶液は、溶媒蒸気中で溶液の微小液滴のスプレーまたはジェットに気化（噴霧化）される。この液滴ミストは、溶媒の濃縮を防いで蒸発させるために僅かに加熱された蒸発チャンバー中を流動する。液滴が小さくなればなるほど、同じ電荷間の自然反発がイオンおよび中性分子を放出させるような時間まで、電気的表面電荷密度は増加する。

【0037】

本明細書において、用語「大気圧化学イオン化」または「ＡＰＣＩ」は、ＥＳＩと同様の質量分析方法を指す。しかし、ＡＰＣＩは、大気圧におけるプラズマ内で起こるイオン−分子反応によりイオンを産生する。プラズマは、スプレーキャピラリーおよび対電極の間の放電により維持される。続いて、イオンは典型的に、差次的にポンプ注送されるスキマーステージのセットの使用により質量分析器へと抽出される。乾燥および予熱されたＮ₂ガスの向流を用いて、溶媒の除去を改善することができる。ＡＰＣＩにおける気相イオ
ン化は、極性の小さい化学種を解析するためにＥＳＩよりも有効となり得る。

【0038】

用語「大気圧光イオン化」または「ＡＰＰＩ」は、本明細書において、分子Ｍの光イオン化の機序が、分子Ｍ＋を生成するための光子吸収および電子放出である質量分析の形態を指す。光子エネルギーは典型的に、イオン化ポテンシャルのわずかに上であるため、分子イオンは、解離に対する感受性が低い。多くの場合、クロマトグラフィーの必要なく、よって、有意な時間および費用を節約しつつ試料を解析することが可能となり得る。水蒸気またはプロトン性溶媒の存在下で、分子イオンは、Ｈを抽出して、ＭＨ＋を生成することができる。これは、Ｍが高いプロトン親和性を有する場合に起こる傾向がある。Ｍ＋およびＭＨ＋の合計が一定であるため、これは定量の正確性に影響を与えない。プロトン性溶媒における薬物化合物は通常、ＭＨ＋として観察され、一方、ナフタレンまたはテストステロン等、非極性化合物は通常、Ｍ＋を生成する。Ｒｏｂｂ、Ｄ．Ｂ．、Ｃｏｖｅｙ、Ｔ．Ｒ．およびＢｒｕｉｎｓ、Ａ．Ｐ．（２０００）：例えば、Ｒｏｂｂら、Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｐｈｏｔｏｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：Ａｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２（１５）：３６５３〜３６５９を参照されたい。

【0039】

本明細書において、用語「誘導結合型プラズマ」または「ＩＣＰ」は、試料が、大部分の要素の微粒化およびイオン化に十分な高温で、部分的にイオン化されたガスと相互作用される方法を指す。

【0040】

本明細書において、用語「電界脱離」は、不揮発性被験試料がイオン化表面に置かれ、強電界を用いて分析物イオンが生成される方法を指す。

【0041】

本明細書において、用語「脱離」は、表面からの分析物の除去および／または気相への分析物の侵入を指す。

【0042】

本明細書において、用語「定量限界」または「ＬＯＱ」は、測定が定量的に臨界的となるポイントを指す。このＬＯＱにおける分析物の応答は、２０％の精度および８０％〜１２０％の正確性で個別に識別可能であり、再現性がある。

【0043】

本明細書に開示されている方法の特定の好ましい実施形態において、質量分析は、正イオンモードで行われる。本明細書に開示されている方法の特定の特に好ましい実施形態において、質量分析は、Ｔｇペプチドからイオンを作製する方法としてＥＳＩを用いて行われる。

【0044】

好ましい実施形態において、質量分析計で検出可能なＴｇペプチドイオン化由来のイオンは、６３６．４±０．５、１０５９．５±０．５、９２１．４±０．５、７９７．４±０．５、７２６．４±０．５、６１２．３±０．５および５４１．３±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択され；上記のうち１番目のイオン（６３６．４±０．５のｍ／ｚ）は、正の２電子単位の正味電荷を有する前駆イオンであり、上記のうち後者の６イオンは、前駆イオンの断片イオンである。特に好ましい実施形態において、前駆イオンは、正の２電子単位の正味電荷および約６３６．４±０．５のｍ／ｚを有し、断片イオンは、１０５９．５±０．５、９２１．４±０．５または７９７．４±０．５のｍ／ｚを有する。

【0045】

一部の好ましい実施形態において、別々に検出可能な内部標準ペプチド（例えば、Ｔ１２９）は、トリプシン消化後に被験試料に導入される。これらの実施形態において、内在性Ｔｇの消化および内部標準の添加の両方に由来する被験試料に存在するペプチドの全体または一部は、イオン化されて、質量分析計で検出可能な複数のイオンを産生し、ペプチドイオン化から産生された１種または複数のイオンは、質量分析計で検出される。

【0046】

他の好ましい実施形態において、別々に検出可能な内部Ｔｇ標準は、トリプシン消化の前に被験試料に供給される。これらの実施形態において、被験試料に存在する内在性Ｔｇおよび内部標準の両方の全体または一部は、トリプシンにより消化されて、Ｔｇペプチドの生成をもたらす。Ｔｇペプチドは、イオン化されて、質量分析計で検出可能な複数のイオンを産生し、Ｔｇペプチドイオン化から産生された１種または複数のイオンは、質量分析により検出される。

【0047】

好ましい実施形態において、Ｔｇ消化に起因するＴｇペプチドのイオン化から産生される質量分析計で検出可能なイオンは、６３６．４±０．５、１０５９．５±０．５、９２１．４±０．５、７９７．４±０．５、７２６．４±０．５、６１２．３±０．５および５４１．３±０．５のｍ／ｚを有するイオンからなる群から選択され；上記のうち１番目のイオン（６３６．４±０．５のｍ／ｚ）は、正の２電子単位の正味電荷を有する前駆イオンであり、上記のうち後者の６イオンは、前駆イオンの断片イオンである。特に好ましい実施形態において、前駆イオンは、正の２電子単位の正味電荷および６３６．４±０．５のｍ／ｚを有し、断片イオンは、１０５９．５±０．５、９２１．４±０．５、７９７．４±０．５のｍ／ｚを有する。

【0048】

好ましい実施形態において、Ｔｇペプチドイオンの存在または量を、参照Ｔｇ試料と比較することにより、元の被験試料中のＴｇの存在または量と関係付ける。

【0049】

一実施形態において、本方法は、質量分析とＬＣとの組み合わせを含む。別の好ましい実施形態において、質量分析は、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）である。

【0050】

上述の本開示の概要は、非限定的であり、本開示の他の特色および利点は、次の本開示の詳細な説明と特許請求の範囲から明らかとなるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0051】

【図1】ＭＳ／ＭＳによるペプチドＴ１２９に相当するｍ／ｚを有するＴｇペプチドイオンの定量限界の検証を示す図である。詳細は、実施例１に記載されている。

【図2】ＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイを用いた、連続希釈したストック試料中のペプチドＴ１２９の定量の直線性を示す図である。詳細は、実施例１に記載されている。

【図3】ＭＳ／ＭＳによるストリップ血清におけるペプチドＴ１２９の定量限界の検証を示す図である。詳細は、実施例２に記載されている。

【図4】ＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイを用いた、ペプチドＴ１２９添加ストリップ血清におけるペプチドＴ１２９の定量の直線性を示す図である。詳細は、実施例２に記載されている。

【図5】本明細書に記載されている方法に従った加工および濃縮の前にＴｇを添加したストリップ血清におけるＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイを用いた、ペプチドＴ１２９に相当するｍ／ｚを有するＴｇペプチドイオンの定量の直線性を示す図である。詳細は、実施例３に記載されている。

【図6】実施例４に記載の内部標準として用いるための、同位体標識したサイログロブリンペプチド標準の例示的な実施形態を示す図である。

【図7-10】実施例５に記載されている抗体陰性患者廃棄（図７、図９）および抗体陽性患者廃棄（図８、図１０）由来の、本技術の方法による被験試料中のサイログロブリン定量（Ｙ軸）対、イムノアッセイまたはラジオイムノアッセイによる定量（Ｘ軸）のグラフを示す図である。

【図11】Ｐ０１２６６（ヒトサイログロブリン前駆体；配列番号３）のアミノ酸配列を示す図である。

【図12】Ｐ０１２６６−２（Ｐ０１２６６のアイソフォーム２；配列番号４）のアミノ酸配列を示す図である。

【図13】Ｑ５９ＧＦ０（サイログロブリン変異体断片；配列番号５）のアミノ酸配列を示す図である。

【図14】図１〜図３に含有されている３種の配列の比較を示す図であり、これら全てＴｇの１５７９〜１５９０位に相当するアミノ酸を含有することが実証される。上段が配列Ｐ０１２６６であり、中段が配列Ｐ０１２６６−２であり、下段が配列Ｑ５９ＧＦ０である。

【発明を実施するための形態】

【0052】

被験試料中のＴｇを定量的に測定するための方法が記載されている。この定量的測定は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ技術の使用により達成される。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの使用の前に、次の技術またはそのいずれかの一部により試料を調製してもよい。被験試料中のＴｇの第１の精製は、被験試料中の実質的に全てのＴｇが保持されるようなサイズ分離技術の使用によって行うことができる。第１の精製ステップ後にＴｇの酵素消化を行って、目的とするＴｇペプチドを作製することができる。消化後に、サイズ分離技術を別途利用して、Ｔｇの酵素消化で生成した選択Ｔｇペプチドを精製することもできる。この第２のサイズ分離技術を用いて、実質的に全ての未消化のより高分子量の化学種を除去することができる。かかる試料調製技術を適正に実行することにより、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで定量される選択Ｔｇペプチドが、被験試料に元から存在するＴｇを酵素により消化することで直接生じたものであることが確保される。よって、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの開始時の被験試料中の選択Ｔｇペ
プチドのレベルは、被験試料に元から存在するＴｇの量に正比例する。

【0053】

いずれかの適したサイズ分離技術を利用することができるが、次の実施例において、第１および第２のサイズ分離技術の両方が、分子量カットオフフィルターを通した濾過である。次の実施例に記述されるように、第１のサイズ分離と第２のサイズ分離との両方に同じフィルターを使用できるように、適切な分子量カットオフを有する分子量カットオフフィルターを選択することも可能である。

【0054】

選択Ｔｇペプチドを精製するために、ＬＣ、最も好ましくはＨＰＬＣを、単独でまたは他の精製方法と組み合わせて利用する、または利用することができる。この精製をＭＳ／ＭＳと組み合わせることにより、被験試料中の選択Ｔｇペプチドを定量するためのアッセイ系が得られる。次に、被験試料中の選択Ｔｇペプチドの含量を用いて、元の被験試料中のＴｇの含量を決定する。本明細書に提示されているＴｇ定量方法は、増強された特異性を有し、方法論上の問題（Ｔｇ抗体干渉等）の影響が少ない。

【0055】

適した被験試料としては、目的とする分析物を含有し得るあらゆる被験試料が挙げられる。一部の好ましい実施形態において、試料は、生物学的試料である。即ち、動物、細胞培養物、器官培養物その他等、何らかの生物学的供給源から得られる試料である。特定の好ましい実施形態において、試料は、イヌ、ネコ、ウマ等、哺乳動物から得られる。特に好ましい哺乳動物は、霊長類、最も好ましくは、ヒトである。特に好ましい試料は、血液、血漿、血清、尿、唾液、涙、脳脊髄液または他の体液もしくは組織試料を含む。斯かる試料は、例えば、患者から得ることができる。即ち、疾患または状態の診断、予後予測または処置のための臨床背景を呈する生者から得ることができる。被験試料は、好ましくは、患者から得られ、例えば、血清または血漿である。

【0056】

質量分析のための試料調製
試料を加工または精製して、質量分析による解析に適した調製物を得ることができる。斯かる精製は通常、液体クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーを含み、多くの場合、クロマトグラフィーの前に行われる追加の精製手順を含んでいてもよい。試料の種類またはクロマトグラフィーの種類に応じて、様々な手順をこの目的のために用いることができる。例として、濾過、遠心分離、これらの組み合わせその他が挙げられる。特定の好ましい実施形態において、Ｔｇは、酵素消化の前に被験試料に存在する。

【0057】

濾過は、クロマトグラフィーのための被験試料、特に、血清または血漿等の生物学的被験試料を調製する好ましい方法の一つである。斯かる濾過は、分子量カットオフフィルターを通して被験試料を濾過して、フィルターのカットオフよりも低い分子量を有する化学種から、フィルターのカットオフよりも高い分子量を有する化学種（Ｔｇを含む）を分離することにより行われる。完全な（またはほぼ完全な）濾過後にフィルター上に残る被験試料は、フィルターのカットオフよりも低い分子量を有する潜在的干渉化学種を実質的に含まない。

【0058】

次に、被験試料のｐＨは、消化剤に要求される何らかのポイントに調整されうる。特定の好ましい実施形態において、消化剤は、トリプシンであり、ｐＨは、この酵素に適したｐＨとなるよう酢酸アンモニウム溶液で調整することができる。これらの好ましい実施形態において、次に、試料をトリプシンで消化して、Ｔｇペプチド（ペプチドＴ１２９を含む）を生成する。

【0059】

トリプシン消化後に、第２の濾過により試料を精製することができる。試料中に存在し得るフィルターのカットオフよりも高い分子量を有する潜在的干渉化学種からＴｇ断片を分離するために、この消化後濾過は、上述の消化前濾過と同様に行うことができる（濾液
が保持されることを除いて）。次に、この消化後濾過から得た濾液を液体クロマトグラフィーにより精製し、その後、質量分析法により分析してもよい。

【0060】

質量分析法による分析前に試料を浄化するためにＨＰＬＣの使用を含む様々な方法が記載されてきた。例えば、Ｔａｙｌｏｒら、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ２２：６０８〜１２（２０００）（血液試料の手動沈殿と、続く手動Ｃ１８固相抽出、Ｃ１８分析カラムにおけるクロマトグラフィーのためのＨＰＬＣへの注入およびＭＳ／ＭＳ解析）；およびＳａｌｍら、Ｃｌｉｎ． Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２２ 付録Ｂ：Ｂ７１〜Ｂ８５（２０００）（血液試料の手動沈殿と、続く手動Ｃ１８固相抽出、Ｃ１８分析カラムにおけるクロマトグラフィーのためのＨＰＬＣへの注入およびＭＳ／ＭＳ解析）を参照されたい。当業者であれば、本方法における使用に適したＨＰＬＣ装置およびカラムを選択することができる。クロマトグラフィー用カラムは典型的に、化学的部分の分離（即ち、分画）を容易にするための媒体（即ち、充填材料）を含む。培地は、微小な粒子を含むことができる。粒子は、化学的部分の分離を容易にするための、様々な化学的部分と相互作用する結合した表面を含む。適した結合表面の１つは、アルキル結合表面等、疎水性結合表面である。アルキル結合表面は、Ｃ−４、Ｃ−８またはＣ−１８結合アルキル基、好ましくは、Ｃ−８結合化学基を含むことができる。クロマトグラフィー用カラムは、試料を受け入れるための入口と、分画された試料を含む流出液を排出するための出口とを含む。

【0061】

特定の実施形態において、１種または複数の他の材料は保持されないが目的とする分析物がカラム充填材料により可逆的に保持される条件下でカラムに試料を適用することにより、分析物を精製することができる。これらの実施形態において、目的とする分析物がカラムにより保持される第１の移動相条件を用いることができ、その後に第２の移動相条件を用いて、非保持材料を洗い流した後に、保持された材料をカラムから除去することができる。あるいは、１種または複数の他の材料と比較して目的とする分析物が異なる速度で溶出する移動相条件下でカラムに試料を適用することにより、分析物を精製することができる。斯かる手順は、試料の１種または複数の他の構成成分と比べて、１種または複数の目的とする分析物の量を濃縮することができる。

【0062】

一実施形態において、解析しようとする試料が、カラムの入口に加えられ、溶媒または溶媒混合物と共に溶出され、出口から排出される。異なる溶媒モードは、目的とする分析物の溶出に対して選択することができる。例えば、液体クロマトグラフィーは、勾配モード、均一濃度モードまたはポリタイプ（即ち、混合型）モードを用いて行うことができる。好ましい実施形態において、ＨＰＬＣは、移動相としてＨＰＬＣグレードの超純水に溶解した０．２％ギ酸および１００％メタノールに溶解した０．２％ギ酸を用いて、Ｃ８固相を備える分析ＨＰＬＣシステムにおいて行われる。

【0063】

多数のカラム充填材を試料のクロマトグラフィー分離に利用でき、適切な分離プロトコールの選択は、試料の特徴、目的とする分析物、干渉物質の存在およびその特徴等に依存した経験的プロセスである。市販のＨＰＬＣカラムとして、極性、イオン交換（カチオンおよびアニオンの両方）、疎水性相互作用、フェニル、Ｃ−２、Ｃ−８、Ｃ−１８および多孔性ポリマーカラムにおける極性コーティングが挙げられるがこれらに限定されない。

【0064】

一実施形態において、ＨＰＬＣカラムは、メジアン粒子サイズ５μｍ（名目上）およびメジアン粒子孔径１００Åを有するＣ８固相を有する。好ましい実施形態において、カラム寸法は、内径１．０ｍｍ×長さ５０ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｃｏｒｐ．Ｌｕｎａ
５μＣ８（２）１００Å Ｎｅｗ Ｃｏｌｕｍｎ ５０×１．０ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ カタログ番号００Ｂ−４２４９−Ａ０または均等物）である。

【0065】

クロマトグラフィーにおいて、物質の分離は、溶出剤（「移動相」としても知られる）の選択、勾配溶出の選択および勾配条件、温度等の変数により影響される。

【0066】

質量分析による検出および定量
様々な実施形態において、Ｔｇペプチドは、当業者に公知のいずれかの方法によりイオン化することができる。質量分析は、分画された試料をイオン化し、さらなる解析のための荷電分子を作製するためのイオン源を含む質量分析計を用いて行われる。様々なＭＳ技術において用いられるイオン化源として、電子イオン化、化学イオン化、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、光子イオン化、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、光イオン化、大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）、高速原子衝撃（ＦＡＢ）／液体二次イオン化（ＬＳＩＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、電界イオン化、電界脱離、熱スプレー／プラズマスプレーイオン化、表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）、誘導結合型プラズマ（ＩＣＰ）および粒子ビームイオン化が挙げられるがこれらに限定されない。当業者であれば、イオン化方法の選択が、測定しようとする分析物、試料の種類、検出器の種類、正又は負のモードの選択等に基づき決定され得ることを理解できよう。

【0067】

好ましい実施形態において、Ｔｇペプチドは、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）によりイオン化されて、Ｔｇペプチド前駆イオンを作製する。関連する好ましい実施形態において、Ｔｇペプチド前駆イオンは、気体状態であり、不活性衝突ガスは、アルゴンである。

【0068】

試料がイオン化された後に、これにより作製された正に荷電したイオンを解析して、ｍ／ｚを決定することができる。ｍ／ｚの決定に適した分析器は、四重極型分析装置、イオントラップ型分析装置および飛行時間型分析装置を含む。数種類の検出モードのうちの１種を用いてイオンを検出することができる。例えば、選択的イオンモニタリングモード（ＳＩＭ）を用いて選択されたイオンのみを検出することができる、あるいは、走査モード、例えば、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）または選択された反応モニタリング（ＳＲＭ）を用いて複数のイオンを検出することができる。好ましい実施形態において、イオンは、ＳＲＭを用いて検出される。

【0069】

好ましくは、ｍ／ｚは、四重極型の装置を用いて決定される。「四重極型」または「四重極型イオントラップ」装置において、発振無線周波数電場におけるイオンは、電極間に印加されたＤＣ電位、ＲＦシグナルの振幅およびｍ／ｚに比例する力を受ける。特定のｍ／ｚを有するイオンのみが四重極の長さを移行できるが、他の全イオンは偏向するように、電圧および振幅を選択することができる。よって、四重極型の装置は、装置に注入されたイオンの「質量フィルター」および「質量検出器」の両方として作用することができる。

【0070】

「タンデム質量分析」または「ＭＳ／ＭＳ」を用いることにより、ＭＳ技術の分解能を増強することができる。この技術において、目的とする分子から生成された前駆イオン（親イオンとも呼ばれる）をＭＳ装置においてフィルターし、その後前駆イオンを断片化して、１種または複数の断片イオン（娘イオンまたは産物イオンとも呼ばれる）を得て、次にこれを第２のＭＳ処理により分析することができる。前駆イオンの慎重な選択により、特定の分析物により産生されたイオンのみが断片化チャンバーへと通され、そこで、不活性ガスの原子との衝突により断片イオンが生じる。所定の組のイオン化／断片化条件下において、再現性がある様式で前駆イオンと断片イオンとの両方が生じるため、ＭＳ／ＭＳ技術は、非常に強力な分析ツールとなり得る。例えば、濾過／断片化の組み合わせを用いて、干渉物質を排除することができ、これは生物学的試料等の複合試料において特に有用となり得る。

【0071】

その上、飛行時間型分析器に連結したマトリックス支援レーザー脱離イオン化（「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ」）等、技術の近年の進歩は、非常に短いイオンパルスにおけるフェムトモルレベルでの分析物の解析を可能にする。タンデムＭＳと飛行時間型分析器を組み合わせた質量分析計も当業者に周知である。その上、「ＭＳ／ＭＳ」として公知の方法において、複数の質量分析ステップを組み合わせることができる。ＭＳ／ＭＳ／ＴＯＦ質量分析、ＭＡＬＤＩ／ＭＳ／ＭＳ／ＴＯＦ質量分析またはＳＥＬＤＩ／ＭＳ／ＭＳ／ＴＯＦ質量分析等、様々な他の組み合わせを用いることができる。

【0072】

質量分析計は典型的に、イオン走査；即ち、所定の範囲（例えば、４００〜１６００ａｍｕ）にわたり特定のｍ／ｚを有する各イオンの相対的存在量を使用者に提供する。分析物アッセイ、即ち質量スペクトルの結果は、本技術分野において公知の多数の方法により、元の試料中の分析物の量と関係付けることができる。例えば、サンプリングと解析パラメータとを慎重に制御すれば、所定のイオンの相対的存在量を変換表と比較して、その相対的存在量を元の分子の絶対量に変換することができる。あるいは、試料と共に分子標準を試験し、この標準から生成されたイオンに基づき検量線を作成することができる。斯かる検量線を用いて、所定のイオンの相対的存在量を元の分子の絶対量に変換することができる。特定の好ましい実施形態において、内部標準は、Ｔｇの含量を計算するための検量線の生成に用いられる。斯かる検量線を作成および使用する方法は、本技術分野において周知のものであり、当業者であれば、適切な内部標準を選択することができる。イオンの量を元の分子の量と関係付けるための多数の他の方法が、当業者に周知であろう。

【0073】

方法の１つまたは複数のステップは、自動機械を用いて行うことができる。特定の実施形態において、１つまたは複数の精製ステップは、オンラインで行われ、より好ましくは、ＬＣ精製および質量分析ステップの全ては、オンライン様式で行うことができる。

【0074】

特定の実施形態において、ＭＳ／ＭＳ等の技術は、断片化に向けた前駆イオンの単離に用いられる。これらの実施形態において、衝突活性化解離（ＣＡＤ）を用いて、検出のための断片イオンを生成することができる。ＣＡＤにおいて、前駆イオンは、不活性ガスとの衝突によりエネルギーを得、その後、「単分子分解」と称されるプロセスにより断片化される。振動エネルギーの増加によりイオン内の特定の結合を壊すことができるように、前駆イオンに十分なエネルギーが付与される必要がある。代替的な実施形態において、電子移動解離（ＥＴＤ）を用いて、断片イオンを生成することができる。ＥＴＤにおいて、ラジカルアニオンを用いて、多重荷電ペプチドまたはタンパク質カチオンに電子を移動させ、ペプチド主鎖に沿ってランダム切断をもたらす。

【0075】

特に好ましい実施形態において、Ｔｇは、次の通りＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて検出および／または定量される。上述の通り調製されたＴｇペプチド濃縮被験試料は、ＬＣで処理される。クロマトグラフィー用カラムから流出した液体溶媒は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析器の加熱されたネブライザー界面に進入し、溶媒／分析物混合物は、界面の加熱された管において蒸気に変換される。噴霧溶媒に含有される分析物（例えば、Ｔｇペプチド）は、噴霧溶媒／分析物混合物に高い電圧を印加する界面のコロナ放電針によりイオン化される。イオン（即ち、Ｔｇペプチド前駆イオン）は、装置のオリフィスを通過し、第１の四重極に進入する。四重極１および３（Ｑ１およびＱ３）は、そのｍ／ｚに基づくイオン（即ち、「前駆」および「断片」イオン）の選択を可能にする質量フィルターである。四重極２（Ｑ２）は、イオンが断片される衝突セルである。Ｑ１は、ペプチドＴ１２９前駆イオンのｍ／ｚ（６３６．４±０．５のｍ／ｚ）を有するイオンを選択する。選択された前駆イオンを衝突チャンバー（Ｑ２）に通し、一方、その他のｍ／ｚを有するイオンは、Ｑ１の側面と衝突して排除される。Ｑ２に進入する前駆イオンは、中性アルゴンガス分子との衝突による衝突活性化解離（ＣＡＤ）により断片化することができる。あるいは、Ｑ２に進
入する前駆イオンは、多重荷電カチオンである場合、電子移動解離（ＥＴＤ）により断片化することができる。生成された断片イオンは、Ｑ３に移行し、そこで、選択された断片イオンが収集され、一方、他のイオンは排除される。

【0076】

当業者は、本技術分野において周知の標準的な方法を用いて、Ｑ３における選択に用いることのできる、特定のＴｇペプチド前駆イオンの１種または複数の断片イオンを同定することができる。特異的断片イオンは、同様の分子構造を有する他の分子によって有意な量で生成されることのない断片イオンである。対照的に、非特異的断片イオンは、所望の分析物以外の分子によって生成される断片イオンである。様々な分子標準を検査して、選択されたＴｇペプチドによって生成された断片イオンが、同様の構造または特色を有する他の分子によっても生成されるか決定することにより、適した特異的断片イオンを同定することができる。好ましくは、ペプチドＴ１２９イオンに相当するｍ／ｚを有するＴｇペプチドイオンに特異的な少なくとも１種の断片イオンが同定される。より好ましくは、これらの断片イオンのうち１種または複数は、７９７．４±０．５、９１２．４±０．５または１０５９．５±０．５のｍ／ｚを有する。

【0077】

イオンは、検出器と衝突すると、電子のパルスを産生し、これはデジタルシグナルに変換される。取得されたデータは、コンピュータに中継され、単位時間当たりのイオン計数がプロットされる。特定のイオンに相当するピーク下面積または斯かるピークの振幅が測定され、面積または振幅は、目的とする分析物の量に相関される。特定の実施形態において、断片イオンおよび／または前駆イオンのピークの曲線下面積または振幅が測定されて、ペプチドＴ１２９に相当するｍ／ｚを有するＴｇペプチドの量を決定する。上述の通り、所定のイオンの相対的存在量は、内部分子標準の１種または複数のイオンのピークに基づく較正検量線を用いて元の分析物の絶対量に変換することができる。次に、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより検出された分析物の絶対量は、元の被験試料に存在していたＴｇの絶対量に変換することができる。

【0078】

標識されたサイログロブリンペプチド標準によるシステム較正
サイログロブリンの不完全な消化は、サイログロブリン定量の不正確性の原因となり得る。いくつかの実施形態において、サイログロブリンペプチド標準を、消化の前に被験試料に添加することができる。サイログロブリンペプチド標準は、いくつかの実施形態において、消化されると、サイログロブリンにより産生されるペプチドと同じ１種または複数のＴｇペプチドを産生する。一部の態様において、試料に添加されるサイログロブリンペプチド標準の量は公知である。

【0079】

質量分析によりＴｇペプチドの量が定量されたら、消化率を計算することができる。一部の態様において、サイログロブリンペプチド標準の消化率が、サイログロブリンと同一または同様となることができるように、サイログロブリンペプチド標準は、Ｔｇペプチド前後と同じ消化部位を含むよう構成されている。従って、被験試料中のサイログロブリンの定量化の較正または調整に用いることのできる、サイログロブリンの消化率が決定される。

【0080】

いくつかの実施形態において、サイログロブリンペプチド標準は、サイログロブリンよりも短い。一態様において、サイログロブリンペプチド標準は、約１００アミノ酸残基以下であり、約７５アミノ酸残基以下であり、あるいは約７０、６０、５０、４０、３０、２５または２０アミノ酸残基以下である。

【0081】

いくつかの実施形態において、サイログロブリンペプチド標準は、消化されて、Ｔ１２９ペプチドを生成する、あるいはＴ１２９に対し少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０５または９５％の配列同一性を有するペプチドを生成する。

【0082】

いくつかの実施形態において、サイログロブリンペプチド標準は、配列番号２のアミノ酸配列（ＫＶＰＥＳＫＶＩＦＤＡＮＡＰＶＡＶＲＳＫＶＰＤＳ）を含む。いくつかの実施形態において、サイログロブリンペプチド標準は、配列番号２（ＫＶＰＥＳＫＶＩＦＤＡＮＡＰＶＡＶＲＳＫＶＰＤＳ）に対し少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０５または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むが、消化によりＴ１２９ペプチドを生成することができる。いくつかの実施形態において、消化は、トリプシン消化である。

【0083】

いくつかの実施形態において、サイログロブリンペプチド標準の１種または複数の残基は、例えば、¹³Ｃ、¹⁵Ｎまたはその両方で同位体標識されている。いくつかの実施形態において、標識されたアミノ酸残基は、バリン残基である。いくつかの実施形態において、サイログロブリンペプチド標準は、ＫＶＰＥＳＫＶＩＦＤＡＮＡＰＶ^*ＡＶ^*ＲＳＫＶＰＤＳを含み、これは、トリプシン消化後に、Ｋ、ＶＰＥＳＫ、ＶＩＦＤＡＮＡＰＶ^*ＡＶ^*Ｒ（Ｔ−１２９−ＩＳ１）、ＳＫおよびＶＰＤＳを産生する。

【0084】

次の実施例は、本開示の例示に資する。これらの実施例は、決して本方法の範囲の限定を企図するものではない。

【実施例1】

【0085】

ペプチドＴ１２９のＭＳ定量の実行
公知のペプチドＴ１２９濃度の試料を初発とする連続希釈により、様々な公知の濃度のペプチドＴ１２９を含む数種類の試料を調製した。これらの試料のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析から、ペプチドＴ１２９ ＬＯＱおよび較正曲線を作成した。

【0086】

Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ分析カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｃｏｒｐ．Ｌｕｎａ ５μ
Ｃ８（２）１００Å Ｎｅｗ Ｃｏｌｕｍｎ ５０×１．０ｍｍ）によりＬＣを行った。超純水（ＨＰＬＣグレード）に溶解した０．２％ギ酸（移動相Ａ）および１００％メタノールに溶解した０．２％ギ酸（移動相Ｂ）で構成された二成分ＨＰＬＣ溶出剤を分析カラムに適用して、試料に含有されている他の化学種から、選択されたＴｇペプチドを分離した。以下の勾配プロファイルに従って二成分溶出剤を適用した：第１のステップとして、移動相Ａ／移動相Ｂの８０／２０混合物を１２０秒間適用し；第２のステップとして、移動相Ａ／移動相Ｂの３０／７０混合物を６０秒間適用した；第３のステップとして、混合物における移動相Ｂの相対量を１２０秒間の期間かけて一定の比率で増加させて、移動相Ａ／移動相Ｂの５／９５混合物とし；第４のステップとして、移動相Ａ／移動相Ｂの５／９５混合物を６０秒間適用し；第５の最終ステップとして、移動相Ａ／移動相Ｂの８０／２０混合物を２４０秒間適用した。

【0087】

次に、ペプチドＴ１２９に相当するｍ／ｚを有する１種または複数のＴｇペプチドの定量のために、分離された試料をＭＳ／ＭＳで処理した。

【0088】

Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｕｌｔｒａ ＭＳ／ＭＳシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いてＭＳ／ＭＳを行った。本明細書に記載されている実施例において、全てＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ製の次のソフトウェアプログラムを用いた：Ｔｕｎｅ Ｍａｓｔｅｒ Ｖ１．２またはより新しい版、Ｘｃａｌｉｂｕｒ Ｖ２．０ ＳＲ１またはより新しい版、ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ
１．４またはより新しい版、ＬＣＱｕａｎ Ｖ２．０またはより新しい版およびＸＲｅｐｏｒｔ １．０またはより新しい版。分析ＨＰＬＣカラムから出た液体溶媒／分析物は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＭＳ／ＭＳ分析器の加熱されたネブライザー界面へと流された。界面の加熱された管において、溶媒／分析物混合物は蒸気に変換された。噴
霧溶媒／分析物混合物に電圧を印加する界面のコロナ放電針により、噴霧溶媒における分析物をイオン化した。

【0089】

イオンは、６３６．４±０．５のｍ／ｚを有するイオンを選択する第１の四重極（Ｑ１）へと通過した。四重極２（Ｑ２）に進入するイオンは、アルゴンガスと衝突して、イオン断片を生成し、これは、さらなる選択のために四重極３（Ｑ３）へと通過した。正の極性における検証において、ペプチドＴ１２９に相当するｍ／ｚを有する前駆イオンの定量に用いられる質量遷移を表１に示す。

【0090】

【表1】

【0091】

２０％の精度および８０％〜１２０％の正確性による定量限界（ＬＯＱ）を決定するために、変動濃度の７種の異なる試料をアッセイし、それぞれの再現性（ＣＶ）を決定した。ペプチドＴ１２９に相当するｍ／ｚを有する１種または複数のＴｇペプチドのＬＯＱは、約６７ａｍｏｌ／μｌに定義した。

【0092】

収集し、ＬＯＱならびに図５および図６における較正曲線の作成に用いたデータを表２に示す。

【0093】

【表2】

【実施例2】

【0094】

ペプチドＴ１２９をスパイクした、加工、濃縮および消化したストリップ血清におけるペプチドＴ１２９の定量の実行
ストリップ血清（例えば、本実施例における被験試料）の５００μｌ試料を、市販の３００ｋＤａ分子量カットオフフィルターカートリッジ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．Ｎａｎｏｓｅｐ ３００ｋＤａ、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．カタログ番号ＯＤ３００Ｃ３３）のフィルター要素の上に加えた。

【0095】

１３ｋｇで６分間カートリッジを遠心分離することにより、被験試料を完全に濾過した。濾液を除去し廃棄した。次に、５００μｌのＨＰＬＣグレード水をフィルターの上に加え、１３ｋｇで６分間カートリッジを再度遠心分離した。濾液を再度除去し廃棄した。次に、２００μｌの２０ｍＭ酢酸アンモニウムをフィルターの上に加えた。１３ｋｇで３分
間カートリッジを再度遠心分離した。濾液を再度除去し廃棄し、１００μｌの２０ｍＭ酢酸アンモニウムをフィルターの上に加えた。

【0096】

続いて、１５μｇのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｇｏｌｄ、質量分析グレード、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｖ５２８０または均等物）を、フィルターの上に残る被験試料に加えた。その結果得られた混合物を、フィルターカートリッジから除去せずに３７Ｃで最大１７時間インキュベートした。

【0097】

インキュベーション後に、１３ｋｇで６分間フィルターカートリッジを遠心分離し、濾液を保持した。次に、５０μｌの２０ｍＭ酢酸アンモニウムをフィルターの上に加えることによりフィルターカートリッジを洗浄し、１３ｋｇで６分間遠心分離した。２つの保持された消化後濾液をプールすることにより、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる解析のための被験試料を作製した。

【0098】

上述の加工および濃縮処理したストリップ血清試料の出発容量は、約５００μｌであった。各プールされた消化後濾液の最終容量は、約１３０μｌであった。よって、上述のプロセスは、試料を３．８３倍に濃縮する。

【0099】

次に、プールした消化後濾液にペプチドＴ１２９を濃度を変えながら加えた。次に、表３に示す質量遷移を用いたことを除き実施例１に記載されている手順に従ったＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるペプチドＴ１２９の定量のために、３０μｌ試料を解析した。加工、濃縮されたストリップ血清によって生成されるバックグラウンドの増加のため、７９７．４±０．５のｍ／ｚを有する断片イオンは用いなかった。

【0100】

【表3】

【0101】

収集され、ＬＯＱならびに図７および図８に示される較正曲線の作成に用いたデータを表４に示す。

【0102】

【表4】

【実施例3】

【0103】

様々な濃度の添加Ｔｇを含有するストリップ血清におけるペプチドＴ１２９の定量の実行
実施例２に詳述されている手順に従って、様々な濃度の添加Ｔｇを含有するストリップ
血清の５００μｌ試料を数種類調製した。実施例１に詳述されているステップに従って、その結果得られた被験試料のＬＣ−ＭＳ／ＭＳを行った。

【0104】

収集し、図９に示される較正曲線の作成に用いたデータを表５に示す。

【0105】

【表5】

【実施例4】

【0106】

Ｔｇ消化の程度を確認するための手順
Ｔｇが十分に消化されていることを確認するために、消化されると同位体標識Ｔ−１２９内部標準を遊離する、合成「翼状（winged）」ペプチドを被験試料に加えた。理想的には、調製プロセス（変性／還元、アルキル化および消化）の前に血清試料に加えることのできる、完全に標識されたＴｇが用いられる。しかし、現在、斯かる標識Ｔｇタンパク質を得ることは不可能である。従って、その中に同位体標識されたＴ−１２９を含有する短いＴｇペプチドを合成した（Ｔ１２９−ＩＳ１）。Ｔ１２９−ＩＳ１は、血清試料に存在するＴｇ由来のＴ１２９と同じ様式で、加工手順において生成される。従って、これは、標識Ｔｇタンパク質の代用として作用し、試料の完全な加工を確認する。

【0107】

この手順の例示的な実施形態を、図６に例示する。簡潔に説明すると、同位体標識したバリンを印のついた位置に有する、配列ＫＶＰＥＳＫＶＩＦＤＡＮＡＰＶ^*ＡＶ^*ＲＳＫＶＰＤＳのペプチドを調製した。バリン残基は、標識¹³Ｃ５および¹⁵Ｎであった。トリプシン消化の前に、ペプチドを被験試料に加えた。次の断片が、消化の際に産生される：Ｋ、ＶＰＥＳＫ、ＶＩＦＤＡＮＡＰＶ^*ＡＶ^*Ｒ（Ｔ−１２９−ＩＳ１）、ＳＫおよびＶＰＤＳ。Ｔ−１２９−ＩＳ１の量は、Ｔ−１２９と同じ方法で定量され、Ｔ−１２９消化の程度の決定を可能にする。

【実施例5】

【0108】

抗体陰性および抗体陽性患者試料中のＴｇの定量の比較
イムノアッセイおよび本質量分析方法の両方を用いて、患者試料中のＴｇを定量した。次表に示す通り、検査から得られた結果は、抗体陰性試料に対して十分に相関したが、患者被験試料が抗体陽性である場合、非常に異なる結果を産生した。下表は、有意なＴｇＡｂ濃度の存在下において、イムノアッセイにより検出されるＴｇの量は低いが、一方、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより決定されるＴｇの量はより高いことを示す。

【0109】

【表6】

【0110】

次表は、スパイクした標準により測定される定量アッセイの回収率を示す。

【0111】

【表7】

【0112】

次表は、前混合および後混合実験間の回収率を比較する。

【0113】

【表8】

【実施例6】

【0114】

Ｔｇ抗体陽性患者由来の被験試料のＴｇ定量
本実施例において、ＤＴＣを呈する３７歳女性は、根治的甲状腺摘除術および放射性ヨウ素によるアブレーションを受けた。この患者は、Ｔｇ抗体（Ａｂ）陽性であることが判明した。自動ＩＣＭＡプラットフォームにおいて患者を検査したところ、結果は０．２ｎｇ／ｍＬ Ｔｇであった。ＲＩＡ検査のために試料を送ったところ、１５ｎｇ／ｍＬのＴｇであり、ＩＣＭＡ検査とは矛盾した結果であった。本技術のＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイを行った。後者のアッセイは、干渉抗体を破壊し、５．６ｎｇ／ｍＬ Ｔｇの結果を返し、患者が経過観察を要し、さらなる外科手術を必要とする可能性があることを示唆する。

【0115】

本明細書に言及または引用されている論文、特許、特許出願ならびに他のあらゆる文書および電子的に利用できる情報の内容は、あたかも個々の刊行物それぞれが特にかつ個々に、ここに本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用すると示されているのと同じ程度まで、これにより、ここに本明細書の一部を構成するものとしてその内容全体を援用する。本出願人らは、本出願に、斯かる論文、特許、特許出願または他の物理的および電子文書のいずれかに由来するありとあらゆる材料および情報を物理的に取り込む権利を留保する。

【0116】

本明細書に例示的に記載されている方法は、特に本明細書に開示されていないいずれかの要素（単数または複数）、限定（単数または複数）の非存在下で、適切に実施することができる。よって、例えば、用語「含む（comprising）」、「含む（including）」、「
含有する」等は、包括的に、限定することなく読解されたい。その上、本明細書に用いられている用語および表現は、限定ではなく説明の用語として用いられ、斯かる用語および表現の使用において、示され記載されている特色またはその一部のいかなる均等物を除外する意図もないが、請求されている本開示の範囲内において様々な修正が可能であることが認識される。よって、本開示は、好ましい実施形態と最適な特徴とによって特に開示されているが、本明細書に開示された、具体的に例示された本開示の修正および変種を当業者であれば用いることができることと共に、斯かる修正および変種が、本開示の範囲内に収まると考慮されることを理解されたい。

【0117】

本明細書において、広く一般的に本開示を記載してきた。かかる一般的な開示に含まれるより狭い概念や下位群のそれぞれも、本方法の一部を構成する。これは、削除される要素が本明細書に特に列挙されているか否かにかかわらず、何らかの条件ないしある概念から何らかの主題を除外する否定的限定が付された、本方法の一般的な説明にも適用される。

【0118】

他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内にある。加えて、本方法の特色または態様が、マーカッシュ群の観点で記載される場合、当業者であれば、それにより本開示がマーカ
ッシュ群のいずれか個々の要素または要素の部分群の観点でも記載されていることを認識するであろう。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14-1】

【図14-2】

【図14-3】

【図14-4】

【図14-5】

【図14-6】

【図14-7】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]