特許 6681449 Ｖγ１Ｖδ１型Ｔ細胞活性化剤及びウイルス感染症治療剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6681449

(24)【登録日】2020年3月25日

(45)【発行日】2020年4月15日

(54)【発明の名称】Ｖγ１Ｖδ１型Ｔ細胞活性化剤及びウイルス感染症治療剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/7048 20060101AFI20200406BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20200406BHJP

   A61P 31/18 20060101ALI20200406BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/7048ZMD

   A61K45/00

   A61P31/18

【請求項の数】3

【全頁数】28

(21)【出願番号】特願2018-187802(P2018-187802)

(22)【出願日】2018年10月2日

(65)【公開番号】特開2020-55777(P2020-55777A)

(43)【公開日】2020年4月9日

【審査請求日】2018年10月18日

(73)【特許権者】

【識別番号】595103809

【氏名又は名称】高橋 秀実

(74)【代理人】

【識別番号】100104499

【弁理士】

【氏名又は名称】岸本 達人

(72)【発明者】

【氏名】高橋 秀実

【審査官】 古閑 一実

(56)【参考文献】

【文献】 Journal of Andrology，２００５年，Vol.26, No.3，p.414-421

【文献】 International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences，２０１８年 ３月，Vol.10, No.3，p.85-89

【文献】 HIV感染症「治療の手引き」，HIV感染症治療研究会，２０１３年１２月，第17版，p.13

【文献】 Pharmaceutical Biology，２０１１年，Vol.49, No.10，p.1046-1051

【文献】 Biol. Pharm. Bull.，２０００年，Vol.23, No.3，p.356-358

【文献】 Pharmaceutical Biology，２０１７年，Vol.55, No.1，p.1545-1552

【文献】 Food Chemistry，２０１１年，Vol.128，p.312-322

【文献】 Pharmaceutical Biology，２０１７年，Vol.55, No.1，p.198-205

【文献】 Letters in Applied Microbiology，２０１１年，Vol.53，p.602-607

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／００−３３／４４

Ａ６１Ｋ ４１／００−４５／０８

Ａ６１Ｐ １／００−４３／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

有効成分として、下記式（１）又は（２）で表される化合物及びそれらの薬理学的に許容される塩又はエステルよりなる群から選ばれる少なくとも１つのフラボノイド配糖体を含み、Ｖγ１Ｖδ１型Ｔ細胞を活性化させることにより、ＨＩＶ感染患者の無症状期におけるＨＩＶ増殖を抑制するために用いられる、ＨＩＶ感染治療剤。

【化1】

［式（１）及び（２）において、Ｒ^１は炭素数１〜３のアルキル基を表し、Ｒ^２は水素原子又はヒドロキシル基を表す。Ｒ^３はＡ環上に結合していても良い置換基であって炭素数１〜３のアルキル基、水酸基及びハロゲンよりなる群から選ばれる置換基を表し、Ｒ^４はＢ環上に結合していても良い置換基であって炭素数１〜３のアルキル基、水酸基及びハロゲンよりなる群から選ばれる置換基を表し、Ｒ^５はＣ環上に結合していても良い置換基であって炭素数１〜３のアルキル基、水酸基及びハロゲンよりなる群から選ばれる置換基を表す。ｎ１はＲ^３の数であって０から２の整数を表し、ｎ２はＲ^４の数であって式（１）の場合は０から３の整数を表し、式（２）の場合は０又は１の整数を表し、ｎ３はＲ^５の数であって０から３の整数を表す。同一符号で表される置換基が複数存在する場合には各置換基は互いに同じであっても良いし異なっていても良い。］

【請求項2】

前記フラボノイド配糖体は、下記式（３）で表されるヘスペリジン、下記式（４）で表されるリナリン、及びそれらの薬理学的に許容される塩又はエステルよりなる群から選ばれる少なくとも１つである、請求項１に記載のＨＩＶ感染治療剤。

【化2】

【請求項3】

逆転写酵素阻害剤及びウイルス蛋白酵素阻害剤よりなる群から選ばれる抗ウイルス剤と組み合わせて、ＨＩＶ感染治療に用いられる請求項１又は２に記載のＨＩＶ感染治療剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｖγ１Ｖδ１型Ｔ細胞活性化剤、それを用いて生体内のＶγ１Ｖδ１型Ｔ細胞を活性化させる方法に関する。また本発明は、Ｖγ１Ｖδ１型Ｔ細胞活性化作用を有する有効成分を含むウイルス感染症治療剤、及び、ＨＩＶ感染治療のための当該ウイルス感染症治療剤の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）は、ヒトの免疫細胞に感染し、これを破壊するウイルスである。ＡＩＤＳ（エイズ：後天性免疫不全症候群）は、ＨＩＶ感染の病期最終段階である発病期おいて重度な免疫不全状態または重度な免疫力低下症状を呈する疾病である。
ＨＩＶはレトロウイルスの一種で、ＣＤ４陽性の免疫システム関連細胞を標的とし、例えばＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞、ＣＤ４陽性マクロファージ、ＣＤ４陽性樹状細胞などに感染し、これらを破壊することにより免疫系にダメージを与えることが知られている。特に、獲得免疫システムに属するＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞を直接的にも間接的にも破壊し、免疫系へ大きなダメージを与える。
ＨＩＶ感染の病期は、急性感染期、急性感染期後５年〜１０年間の無症状期、及び、無症状期後の発病期に分けられる。急性感染期にはウイルス量が増加し他の感染症と見分けがつかない症状を呈するが、抗体の産生が活発化するとウイルス量が激減し無症状期に移行する。無症状期にはＨＩＶ増殖と免疫システムによるウイルス増殖阻止との平衡状態が保たれるため見かけ上の血中ウイルス濃度が低く抑えられ無症状であるが、免疫システムの疲弊は進行し続け、ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞が徐々に減少する。そして末梢血中のＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞がある程度まで減少すると、ＨＩＶ増殖と免疫システムとの平衡状態が崩れ、発病期に移行する。発病期には免疫力低下症状を呈し、重症化するとＡＩＤＳが発症する。
感染の進行度は、ＨＩＶ−１ ＰＣＲ法によるウイルス量測定と、フローサイトメトリー法によるＣＤ４陽性細胞数の検査により判定される。ＣＤ４陽性細胞数は現在の病態を反映する数値である。正常ならば８００ − １２００個／μｌであるが、ＨＩＶに感染すると徐々に低下し、２００個／μｌ程度よりも低くなると、ＡＩＤＳが発症し、日和見感染や日和見腫瘍などの症状が現れる。

【0003】

ヒトの免疫システムは、主に粘膜・皮膚などの異物の侵入部位である体表面に存在する「自然免疫システム」と、主に血液中、及び脾臓やリンパ節などの免疫臓器内に存在する「獲得免疫システム」から構成されている。
前者の自然免疫を担う細胞群には、表面に発現したToll-like receptors (TLRs) を介して侵入異物の情報を認識、把握し、その情報を免疫システム全体に伝達し、異物制御の包囲網形成を指令する樹状細胞群、そして、異物の保持ならびに処理を担うＮＫＴ細胞 (Natural Killer T-cells)、さらには、異物侵入の制御及び侵入に伴って生じたダメージを修復するγδ型Ｔ細胞群などが含まれる。このγδ型Ｔ細胞群は、主としてＶγ１Ｖδ１型とＶγ２Ｖδ２型に大別され、侵入した病原体の制御や局所に発生した腫瘍の排除などを担うと考えられている。
これまで、免疫システムにおいてＨＩＶに感受性を有する細胞は、ヘルパーＴ細胞のような獲得免疫システムに属するＣＤ４分子陽性のＴ細胞群であると考えられてきたが、最近、自然免疫システムに属するＣＤ４陽性のＮＫＴ細胞群もまたＨＩＶに感受性を有することが判明した (非特許文献１)。

【0004】

現在、ＨＩＶ感染に有効な治療法としてＨＡＡＲＴ（Highly Active Anti-retroviral Therapy）が知られており、実際の治療に広く適用されている。ＨＡＡＲＴは、複数の抗ＨＩＶ−１薬を個々のＨＩＶ感染者の症状、体質に合わせて組み合わせて投薬することによりウイルス増殖を抑え、エイズの発症を防ぐ治療法である。
しかし、ＨＩＶ感染者にＨＡＡＲＴを行うことにより、患者末梢血中にＨＩＶ粒子が全く認められなくなった場合でも、治療が中断されると再び速やかにＨＩＶ粒子が末梢血中に出現してくることが判明した（非特許文献２）。
現在知られている抗ＨＩＶ薬では、患者末梢血中のＨＩＶ粒子を検出限界以下まで減らすことはできるが、ＨＩＶ粒子を患者体内から完全に排除することはほぼ不可能であり、たとえ抗ＨＩＶ薬が奏功した場合でも、患者個体内のどこかにＨＩＶが潜伏し増殖可能な状態で残存するため、ＨＩＶ感染症を完治させることは困難である。

【0005】

本発明者らは、以前行った研究において、抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ：Anti-retroviral Therapy）を実施し、末梢血中にウイルスが検出できなくなった患者に大腸ファイバースコープを用いて腸管粘膜由来生検組織を検索したところ、回腸粘膜組織内にＨＩＶを放出するｐ２４抗原陽性細胞の存在を確認し、その細胞がＮＫＴ細胞に特有のＶα２４陽性Ｔ細胞レセプターを発現していることを確認した (非特許文献３)。この研究結果は、ＨＩＶ感染者に抗レトロウイルス療法を実施し奏功した後に当該療法を中断した場合に、粘膜部位に存在する自然免疫系のＮＫＴ細胞がＨＩＶ−１の放出源となる可能性が高いことを示唆している。
この研究結果に着目し、さらに本発明者らはＨＩＶ感染ＣＤ４陽性ＮＫＴ細胞内のウイルス複製を制御する細胞の同定を試みたところ、ＣＤ８αα陽性Ｔ細胞群、特にＶγ１Ｖδ１型のγδＴ細胞群が、ＮＫＴ細胞内のＨＩＶ増殖抑制作用を示すことを見出した (非特許文献４)。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】J.Exp. Med., 195:869-879, 2002

【非特許文献2】Nature Med., 6:757-879, 2002

【非特許文献3】Biomed. Res., 35:1-8, 2014

【非特許文献4】Immunology, 141:596, 2014

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、上記知見を踏まえて成し遂げられたものであり、ウイルス感染者の体内においてＶγ１Ｖδ１型Ｔ細胞を活性化することにより、ウイルスに感染した細胞内でのウイルス複製を阻止することができるＶγ１Ｖδ１型Ｔ細胞活性化剤、及び、当該Ｖγ１Ｖδ１型Ｔ細胞活性化剤を用いることにより従来の抗ウイルス薬とは異なる作用原理に基づいてウイルスの潜伏元での残存を阻止することができるウイルス感染治療剤を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明の少なくとも一部として提供されるウイルス感染治療剤は、有効成分として、下記式（１）又は（２）で表される化合物及びそれらの薬理学的に許容される塩又はエステルよりなる群から選ばれる少なくとも１つのフラボノイド配糖体を含み、Ｖγ１Ｖδ１型Ｔ細胞を活性化させることにより、ＨＩＶ感染患者の無症状期におけるＨＩＶ増殖を抑制するために用いられる、ＨＩＶ感染治療剤である。

【0009】

【化1】

【0010】

［式（１）及び（２）において、Ｒ^１は炭素数１〜３のアルキル基を表し、Ｒ^２は水素原子又はヒドロキシル基を表す。Ｒ^３はＡ環上に結合していても良い置換基であって炭素数１〜３のアルキル基、水酸基及びハロゲンよりなる群から選ばれる置換基を表し、Ｒ^４はＢ環上に結合していても良い置換基であって炭素数１〜３のアルキル基、水酸基及びハロゲンよりなる群から選ばれる置換基を表し、Ｒ^５はＣ環上に結合していても良い置換基であって炭素数１〜３のアルキル基、水酸基及びハロゲンよりなる群から選ばれる置換基を表す。ｎ１はＲ^３の数であって０から２の整数を表し、ｎ２はＲ^４の数であって式（１）の場合は０から３の整数を表し、式（２）の場合は０又は１の整数を表し、ｎ３はＲ^５の数であって０から３の整数を表す。同一符号で表される置換基が複数存在する場合には各置換基は互いに同じであっても良いし異なっていても良い。］

【0011】

前記本発明に係るウイルス感染治療剤の有効成分は、例えば、下記式（３）で表されるヘスペリジン、下記式（４）で表されるリナリン、及びそれらの薬理学的に許容される塩又はエステルよりなる群から選ばれる少なくとも１つであってもよい。

【0012】

【化2】

【0013】

本発明に係るウイルス感染症治療剤は、逆転写酵素阻害剤及びウイルス蛋白酵素阻害剤よりなる群から選ばれる抗ウイルス剤と組み合わせて、ＨＩＶ感染治療に用いることができる。

【発明の効果】

【0014】

本発明のＶγ１Ｖδ１型Ｔ細胞活性化剤及びウイルス感染治療剤は、ウイルス感染又は何らかの免疫疾患の患者の体内においてＶγ１Ｖδ１型Ｔ細胞を活性化し、免疫機能を強化又は調節することにより、これらの疾患を治療することができる。
特に、本発明のＶγ１Ｖδ１型Ｔ細胞活性化剤及びウイルス感染症治療剤は、ＨＩＶ感染者のＮＫＴ細胞内に潜伏し続けるＨＩＶの増殖を、活性化したＶγ１Ｖδ１型Ｔ細胞の働きにより阻止するため、ＨＩＶ感染の治療にも有効である。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】図１は、Vγ1及びVδ1を移入したT細胞クローン（1C116）及びVγ2及びVδ2を移入したT細胞クローン（2C21）のTCR‐依存刺激性を検討した結果を示す。図１において、Figure 1AはTCRブロッキング分析の結果である。Figure 1Bは、TCR‐依存刺激分析の結果であり、1C116クローン及び2C21クローンは両方とも抗CD3抗体による刺激時にIL-2を分泌したことを示す。Figure 1C,1D及び1Eは、TCR‐依存刺激に対する反応特異性分析の結果であり、クローン1C116はクローン2C21と異なる反応特異性を有していることを示す。

【図2】図２は、クローン1C116 及びクローン2C21に対する刺激活性に関するフラボノイド配糖体のスクリーニング結果である。Figure 2Aは、ヘスペリジン又はリナリンが、クローン1C116のIL-2分泌に関し強い刺激活性を示したことを示す。Figure 2Bは、クローン1C116に対するヘスペリジン及びリナリンの刺激活性が、抗‐γδ TCR特異的抗体によって完全に失われたことを示す。

【図3】図３は、ヒト由来天然γ1δ1^＋ T細胞に対するフラボノイド配糖体の刺激活性を分析した結果である。Figure 3Aの上段のグラフ、及び、Figure 3Bの向かって左側のグラフは、ヘスペリジン及びリナリンがヒトPBMCから誘導されたγ1δ1^＋T 細胞の数を増加させたことを示す。また、Figure 3Aの下段、及び、Figure 3Bの向かって右側のグラフは、ヘスペリジン及びリナリンがヒトPBMCから誘導されたγ1δ1^＋T 細胞のCD25発現を有意に増強させたことを示す。

【図4】図４は、ヘスペリジン及びリナリンにより刺激したヒト由来天然γ1δ1^＋T 細胞からのサイトカイン及びケモカイン分泌プロファイルを示す。Figure 4Aは、ヒトPBMCsからVγ1Vδ1-TCR 発現T 細胞を選抜した過程及び結果を示したグラフである。Figure 4Bは、ヘスペリジン又はリナリンで刺激したVγ1Vδ1 T 細胞の上清中に観察される主要なサイトカインは、意外にもIL-5 及びIL-13であったことを示す。Figure 4Cは、ヘスペリジン及びリナリンの量を大きくしたときに、ケモカインであるMIP-1α、MIP-1β、及び、RANTESの分泌量が大きくなり、サイトカインであるIL-5及び IL-13の分泌量も大きくなったことを示す。

【図5】図５は、R5 type HIV-1に感染させたCD4^＋ NKT及びCD4^＋T細胞に、ヒト由来天然γ1δ1^＋ T細胞の存在下でヘスペリジン又はリナリンを添加したときに、被感染CD4^＋NKT内のHIV-1ウイルス複製を抑制する否かについて検討した結果である。Figure 5Aの向かって右側のグラフは、ヘスペリジン及びリナリンの量が大きすぎる場合にNKT細胞の成長が停止したことを示す。Figure 5B内の黒色バーは、Vδ1^＋T細胞をヘスペリジン又はリナリンにより刺激すると、R5-HIV-1-NL(AD8) ウイルスの存在を示すp24抗原の検出量が明らかに減少したことを示す。Figure 5B内の白色バーは、フラボノイド配糖体それ自体がある程度のウイルス複製抑制作用を有することを示す。Figure 5Cは、ヘスペリジン又はリナリンにより活性化されたVδ1^＋T 細胞が、CD4^＋T 細胞内におけるR5-HIV-1-NL(AD8) ウイルス複製についても有意に抑制したことを示す。

【発明を実施するための形態】

【0016】

１．本発明のフラボノイド配糖体
ＨＡＡＲＴ療法は、複数の抗ＨＩＶ薬を組み合わせてＨＩＶ感染者に投与することにより優れた治療効果を奏するが、現在知られている抗ＨＩＶ薬をどのように組み合わせたとしても、ＨＩＶ粒子を患者体内から完全に排除することはほぼ不可能であり、ＨＩＶ感染症を完治させることは困難である。
本発明者らは、ＨＩＶ感染者の体内において、自然免疫システムに属するＶγ１Ｖδ１型Ｔ細胞がＮＫＴ細胞内に潜伏するＨＩＶの増殖を抑制するという知見（非特許文献４）を踏まえ、ウイルス感染者の生体内に存在するＶγ１Ｖδ１型Ｔ細胞を活性化させることにより、従来の抗ウイルス薬とは異なる作用原理によりウイルス感染を治療することが可能となり、特に、現在のＨＡＡＲＴ療法をもってしてもＨＩＶ感染者の体内に潜伏し続けるＨＩＶの増殖を阻止し、ＨＡＡＲＴ療法の治療効果を向上させることが可能になると考え、Ｖγ１Ｖδ１型Ｔ細胞を活性化させる物質を探索し、本発明のＶγ１Ｖδ１型Ｔ細胞活性化剤及びウイルス感染症治療剤の有効成分を発見するに至った。

【0017】

本発明のＶγ１Ｖδ１型Ｔ細胞活性化剤及びウイルス感染症治療剤は、有効成分として、下記一般式（Ａ）又は（Ｂ）で表される化合物及びそれらの薬理学的に許容される塩又はエステルよりなる群から選ばれる少なくとも１つのフラボノイド配糖体を含む。なお以下において、当該有効成分であるフラボノイド配糖体を、「本発明のフラボノイド配糖体」と称する場合がある。

【0018】

【化3】

【0019】

フラボノイド配糖体とは、アグリコンとなるフラボン骨格上に糖類がグリコシド結合した構造を有する化合物である。フラボン骨格は下記一般式で表されるが、フラボン骨格に含まれる２重結合の１つ以上が単結合に変化していても良い。なお、下記一般式においてフラボン骨格の周囲に記載した数字は、置換位置を表す番号である。

【0020】

【化4】

【0021】

本発明のフラボノイド配糖体は、フラボン骨格を有するアグリコンと、当該フラボン骨格の７位に結合する特定のニ糖類からなる糖部分とで構成される。
上記一般式（Ａ）はフラボン骨格の２位と３位の間に単結合を有しないのに対し、上記一般式（Ｂ）は同じ位置に二重結合を有する点で異なるだけであり、他の部分の構造は同じである。

【0022】

一般式（Ａ）及び（Ｂ）において、Ｒ^１は炭素数１〜３のアルキル基を表し、Ｒ^２は水素原子又はヒドロキシル基を表す。
Ｒ^３は、Ａ環上に結合していても良い置換基であるが、Ａ環上に存在していなくてもよい。Ｒ^３は、炭素数１〜３のアルキル基、水酸基及びハロゲンよりなる群から選ばれる置換基を表す。
Ｒ^４は、Ｂ環上に結合していても良い置換基であるが、Ｂ環上に存在していなくてもよい。Ｒ^４は、炭素数１〜３のアルキル基、水酸基及びハロゲンよりなる群から選ばれる置換基を表す。
Ｒ^５は、Ｃ環上に結合していても良い置換基であるが、Ｃ環上に存在していなくてもよい。Ｒ^５は、炭素数１〜３のアルキル基、水酸基及びハロゲンよりなる群から選ばれる置換基を表す。
ｎ１は、Ａ環上に置換するＲ^３の数である。Ｒ^３がＡ環上に存在する場合には６位と８位に一つずつ、すなわち最大２つ結合できる。したがってｎ１は、０から２の整数を表す。
ｎ２は、Ｂ環上に置換するＲ^４の数である。一般式（Ａ）においてＲ^４が存在する場合には、Ｂ環上の２位に１つ、３位に２つ、すなわち最大３つ結合できる。一方、一般式（Ｂ）においてＲ^４が存在する場合には、Ｒ^４は、Ｂ環上の３位に１つだけ結合できる。したがってｎ２は、一般式（Ａ）の場合には０から３の整数を表し、一般式（Ｂ）の場合には０又は１の整数を表す。
ｎ３は、Ｃ環上に置換するＲ^５の数である。Ｒ^５がＣ環上に存在する場合には、Ｃ環上の２’位に１つ、３’位に１つ及び６’位に１つ、すなわち最大３つ結合できる。したがってｎ３は、０から３の整数を表す。
Ｒ^３、Ｒ^４又はＲ^５は、メチル基（すなわち炭素数１のアルキル基）、水酸基及びハロゲンよりなる群から選ばれる置換基であってもよい。また、これらの置換基の数を表すｎ１、ｎ２及びｎ３は、０又は１の整数であってもよい。
Ｒ^３、Ｒ^４又はＲ^５はそれぞれ、フラボン骨格上に複数存在する場合がある。同一符号で表される各置換基は、互いに同じであっても良いし異なっていても良い。

【0023】

一般式（Ａ）及び（Ｂ）において、アグリコンであるフラボン骨格の７位に結合する糖部分は、基部側（すなわちアグリコンに結合する側）にアルドヘキソース、及び、末端側にデオキシヘキソースが配置するように連結してなる２糖類構造を有しており、基部側のアルドヘキソースがフラボン骨格に対してβ−（１→７）Ｃグリコシド結合しており、末端側のデオキシヘキソースがアルドヘキソースに対してα（１→６）Ｏグリコシド結合している。すなわち、糖部分の基部側では、アルドヘキソースの１位がフラボン骨格の７位にβ−Ｃグリコシド結合している。一方、糖部分の末端側では、デオキシヘキソースの１位がアルドヘキソースの６位にＯグリコシド結合している。
基部側のアルドヘキソースとしては、例えば、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−アロース、Ｄ−アルトロース、Ｄ−グロース、Ｄ−イドース、Ｄ−タロースなどが挙げられ、その中でもＤ−グルコースが典型例である。
また末端側のデオキシヘキソースとしては、例えば、Ｌ−ラムノース（すなわち６−デオキシ−Ｌ−マンノース）、Ｌ−フコース（すなわち６−デオキシ−Ｌ−ガラクトース）、Ｌ−タロメチロース（すなわち６−デオキシ−Ｌ−タロース）、Ｄ−デオキシリボース（すなわち２−デオキシ−Ｄ−リボース）、Ｄ−アロメチロース（すなわち６−デオキシ−Ｄ−アロース）、Ｄ−キノボース（すなわち６−デオキシ−Ｄ−グルコース）、Ｄ−アンチアロース（すなわち６−デオキシ−Ｄ−グロース）、Ｄ−タロメチロース（すなわち６−デオキシ−Ｄ−タロース）、Ｄ−ジギタロース（すなわち６−デオキシ−３−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトース）、Ｄ−ジギトキソース（すなわち２，６−ジデオキシ−Ｄ−ribo−ヘキソース）、Ｄ−シマロース（すなわち２，６−ジデオキシ−３−Ｏ−メチル−Ｄ−ribo−ヘキソース）、チベロース（すなわち３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノース）、アベコース（すなわち３，６−ジデオキシ−Ｄ−ガラクトース）、パラトース（すなわち３，６−ジデオキシ−Ｄ−グルコース）、コリトース（すなわち３，６−ジデオキシ−Ｌ−ガラクトース）、アスカリロース（すなわち３，６−ジデオキシ−Ｌ−マンノース）などが挙げられ、その中でもＬ−ラムノースが典型例である。

【0024】

一般式（Ａ）又は（Ｂ）で表される化合物の薬理学的に許容される塩又はエステルとしては、フラボン骨格上の水酸基又は糖部分の水酸基が塩又はエステルの構造となったものが挙げられる。塩としては例えば、塩酸塩、硫酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、セシウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩、又はグリシン、アラニン、リジンもしくはグルタミン酸等のアミノ酸塩などを例示することができる。また、エステルとしては例えば、カルボン酸やリン酸などが結合したエステルを例示することができる。

【0025】

Ｖγ１Ｖδ１型Ｔ細胞は、生体の自然免疫システムに属し、病原体の制御や局所に発生した腫瘍の排除などを担い、自然免疫と獲得免疫の橋渡しをしていることがすでに知られている。また、本発明者らの研究により、Ｖγ１Ｖδ１型のγδＴ細胞群が、ＮＫＴ細胞内のＨＩＶ増殖抑制作用を示すことが明らかにされ、すでに報告されている(非特許文献４)。
本発明においては、特定構造のフラボノイド配糖体がＶγ１Ｖδ１型Ｔ細胞を刺激する作用を有していることを発見した。後述する実験結果により、本発明のフラボノイド配糖体は、Ｖγ１Ｖδ１型Ｔ細胞を活性化させケモカインを放出することが発見された。さらに後述する実験結果により、本発明のフラボノイド配糖体は、R5-tropic ＨＩＶ−１に感染したCD4⁺ NKT細胞（ナチュラルキラーT細胞）及び、R5-tropic ＨＩＶ−１に感染したCD4⁺ T 細胞のＨＩＶ−１複製を阻害することを発見した。CD4⁺ NKT細胞は自然免疫システムに属し、CD4⁺ T細胞は獲得免疫システムに属するから、本発明のフラボノイド配糖体は、自然免疫システム及び獲得免疫システムの両方に対し、免疫調節作用及びウイルス増殖抑制作用を有する。
したがって 本発明のフラボノイド配糖体は、ウイルス感染又は何らかの免疫疾患の患者の体内でＶγ１Ｖδ１型Ｔ細胞を活性化させることにより、ウイルス増殖を抑制し又は免疫失調を回復させることができるため、これらの疾患を治療することができる。

【0026】

本発明のフラボノイド配糖体が、Ｖγ１Ｖδ１型Ｔ細胞を活性化させる作用を発揮するためには、以下の２つの条件が特に重要である。
（１）フラボン骨格の７位に、基部側（すなわちフラボン骨格側）から末端側に向かってアルドヘキソース及びデオキシヘキソースがこの順序で連結してなり、基部側のアルドヘキソースがフラボン骨格に対してβ−（１→７）Ｃグリコシド結合しており、末端側のデオキシヘキソースがアルドヘキソースに対してα（１→６）Ｏグリコシド結合している２糖類構造の糖部分を有していること。
（２）フラボン骨格の２位に結合したフェニル系置換基の４’位に炭素数１〜３の低級アルコキシル基が置換していること。

【0027】

上記一般式（Ａ）又は（Ｂ）で表される化合物及びそのエステル又は塩のなかでも、下記式（１）又は（２）で表される化合物及びそれらの薬理学的に許容される塩又はエステルよりなる群から選ばれる少なくとも１つのフラボノイド配糖体が好ましい。
式（１）は一般式（Ａ）に対応しており、フラボン骨格の２位と３位の間に単結合を有しないのに対し、式（２）は一般式（Ｂ）に対応しており、同じ位置に二重結合を有する。

【0028】

【化5】

【0029】

［式（１）及び（２）において、Ｒ^１は炭素数１〜３のアルキル基を表し、Ｒ^２は水素原子又はヒドロキシル基を表す。Ｒ^３はＡ環上に結合していても良い置換基であって炭素数１〜３のアルキル基、水酸基及びハロゲンよりなる群から選ばれる置換基を表し、Ｒ^４はＢ環上に結合していても良い置換基であって炭素数１〜３のアルキル基、水酸基及びハロゲンよりなる群から選ばれる置換基を表し、Ｒ^５はＣ環上に結合していても良い置換基であって炭素数１〜３のアルキル基、水酸基及びハロゲンよりなる群から選ばれる置換基を表す。ｎ１はＲ^３の数であって０から２の整数を表し、ｎ２はＲ^４の数であって式（１）の場合は０から３の整数を表し、式（２）の場合は０又は１の整数を表し、ｎ３はＲ^５の数であって０から３の整数を表す。同一符号で表される置換基が複数存在する場合には各置換基は互いに同じであっても良いし異なっていても良い。］

【0030】

上記式（１）及び（２）の化合物は、一般式（Ａ）及び（Ｂ）におけるフラボン骨格の７位に糖部分としてβ−ルチノースが結合した構造を有する。β−ルチノースとは、６−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシル−Ｄ−β−グルコースである。すなわち、式（１）及び（２）の化合物は、フラボン骨格の７位にグルコースの１位がβ結合し、グルコースの６位にラムノースの１位がα結合（ラムノース側から見てα−１，６結合）している。

【0031】

上記式（１）又は（２）で表される化合物としては、例えば、式（１）に包含される下記式（３）で表されるヘスペリジン、及び、式（２）に包含される下記式（４）で表されるリナリンが挙げられる。ヘスペリジン（CAS登録番号５２０−２６−３）及びリナリン（CAS登録番号４８０−３６−４）は公知の化合物である。

【0032】

【化6】

【0033】

一般式（１）及び（２）で表される化合物は、公知の方法によりフラボン骨格を合成し、フラボン骨格に糖部分などの置換基を修飾することにより合成することができる。フラボン骨格を合成する方法としては、例えば、下記反応スキームに従うアラン・ロビンソン フラボン合成（Allan-Robinson Flavone Synthesis）が知られており、この方法ではｏ−ヒドロキシアリールケトンおよび酸無水物からフラボン誘導体を得ることができる。

【0034】

【化7】

【0035】

フラボン骨格の７位への糖部分の修飾は、フラボン骨格の７位に水酸基を導入し、修飾すべき糖を脱水縮合することにより達成できる。フラボン骨格の５位への水酸基の導入、及び、フラボン骨格の２位への置換基の導入又は当該置換基の修飾も、適宜公知の方法により行うことができる。
一般式（１）で表される化合物のうち、上記式（１）で表されるヘスペリジン及び上記式（２）で表されるリナリンはメーカーから購入することも可能である。例えば、ヘスペリジンは東京化成工業（株）、リナリンはエキストラシンシース社（Extrasynthese、フランス）から購入できる。

【0036】

２．本発明のフラボノイド配糖体のＶγ１Ｖδ１型Ｔ細胞活性化剤、ウイルス感染症治療剤としての使用及び治療方法
Ｖγ１Ｖδ１型Ｔ細胞は、生体の自然免疫システムに属し、病原体の制御や局所に発生した腫瘍の排除などを担い、自然免疫と獲得免疫の橋渡しをしている。本発明のフラボノイド配糖体は、Ｖγ１Ｖδ１型Ｔ細胞を活性化するので、当該フラボノイド配糖体をウイルス感染又は何らかの免疫疾患の患者に投与することにより、または、インビトロで当該フラボノイド配糖体と接触させたＶγ１Ｖδ１型Ｔ細胞をウイルス感染又は何らかの免疫疾患の患者に投与することにより、これらの疾患を治療することができる。
本発明のＶγ１Ｖδ１型Ｔ細胞活性化剤及びウイルス感染症治療剤は、有効成分である上記フラボノイド配糖体のみ含む単体であってもよいが、その投与経路、投与方法、又は使用方法に合わせて公知の添加剤、賦形剤、酸化防止剤、溶媒等を用いて適切な治療組成物に調製されるのが一般的である。注射剤とする場合の一例としては、有効成分であるフラボノイド配糖体を、水系溶媒に溶解し、必要に応じ緩衝剤、ｐＨ調整剤、安定剤などの添加剤を加えて注射剤を調製することができる。

【0037】

本発明のウイルス感染症治療剤は、ウイルス感染者に投与されると、ウイルス感染者の生体内に存在するＶγ１Ｖδ１型Ｔ細胞を活性化し、活性化されたＶγ１Ｖδ１型Ｔ細胞が、ウイルスに感染した細胞内におけるウイルス増殖を阻止するので、ウイルス感染の治療効果が発揮される。本発明のウイルス感染症治療剤の投与経路は、経口、注射など特に限定されない。
本発明のウイルス感染症治療剤は、現在のＨＡＡＲＴ療法をもってしてもＨＩＶ感染者のＮＫＴ細胞内に潜伏し続けるＨＩＶの増殖を阻止するため、ＨＩＶ感染の治療にも有効である。
ＨＩＶ−１が標的であるＣＤ４陽性細胞に侵入するためには、ＣＸＣＲ４（Ｘ４）又はＣＣＲ５（Ｒ５）のうちどちらかのケモカイン受容体（kemokine recepter）がＣＤ４陽性細胞表面に発現している必要がある。Ｘ４-tropic ＨＩＶ−１（T cell-tropic HIV-1株）はＣＸＣＲ４を用いて細胞に侵入し、Ｒ５-tropic ＨＩＶ−１（macrophage-tropic HIV-1株）はＣＣＲ５を用いて細胞に侵入する。
Ｒ５-tropic ＨＩＶ−１は通常、感染後早い時期に検出され、Ｘ４-tropic ＨＩＶ−１は多くの場合、ＡＩＤＳが進行した時期に検出される。ＨＩＶ感染の進行を阻止し、患者の予後を良好にするためには、Ｒ５-tropic ＨＩＶ−１の増殖を防ぐことが重要になる。
ＮＫＴ細胞は自然免疫システムに属するＣＤ４陽性細胞である。ＮＫＴ細胞はＣＣＲ５受容体を発現しており、ＮＫＴ細胞に侵入し残存しているＨＩＶは、Ｒ５-tropic ＨＩＶ−１である。したがって、ＨＩＶ感染者に対し、本発明のウイルス感染症治療剤をＨＡＡＲＴ療法と組み合わせて投与することにより、ＮＫＴ細胞内に残存するＲ５-tropic ＨＩＶ−１の複製を抑制することができるため、ＨＡＡＲＴ療法によるＨＩＶ感染の治療効果を向上させることが可能となる。さらに、従来のＨＡＡＲＴ療法では不可能であった患者体内からのＨＩＶ粒子の完全排除も期待できる。
また本発明のウイルス感染症治療剤は、獲得免疫システムに属するCD4⁺ T 細胞がＲ５-tropic ＨＩＶ−１に感染した場合にも、Ｒ５-tropic ＨＩＶ−１の複製を抑制することができる。したがって本発明のウイルス感染症治療剤は、ＮＫＴ細胞内に潜伏し複製し続けるウイルスを排除するだけでなく、自然免疫システム及び獲得免疫システムのいずれに属するＣＤ４陽性細胞に対しても、Ｒ５-tropic ＨＩＶ−１感染時のウイルス抑制作用を有しているため、ＨＩＶ感染の治療全般に適用できる。

【0038】

本発明のＶγ１Ｖδ１型Ｔ細胞活性化剤は、ウイルス感染者に対してウイルス感染症治療剤として投与するほか、ウイルス感染以外の免疫疾患患者に対し、Ｖγ１Ｖδ１型Ｔ細胞活性化作用を有する免疫機能調節剤として投与してもよい。
さらに本発明のＶγ１Ｖδ１型Ｔ細胞活性化剤は、患者に直接投与しない方法で用いることもできる。例えば、本発明のＶγ１Ｖδ１型Ｔ細胞活性化剤をインビトロでＶγ１Ｖδ１型Ｔ細胞に添加することにより刺激した後、Ｖγ１Ｖδ１型Ｔ細胞が刺激によって活性化したことを確認した後又は確認することなく、当該Ｖγ１Ｖδ１型Ｔ細胞をウイルス感染又は何らかの免疫疾患の患者に注射等の方法で投与するという治療方法や、本発明のＶγ１Ｖδ１型Ｔ細胞活性化剤をインビトロでＶγ１Ｖδ１型Ｔ細胞に添加し、得られた混合物をウイルス感染又は何らかの免疫疾患の患者に注射等の方法で投与するという治療方法に用いることができる。

【0039】

３．本発明に包含される実施形態
本発明は、特に以下の実施形態を包含する。
（１）有効成分として、下記式（１）又は（２）で表される化合物及びそれらの薬理学的に許容される塩又はエステルよりなる群から選ばれる少なくとも１つのフラボノイド配糖体を含む、Ｖγ１Ｖδ１型Ｔ細胞活性化剤。

【0040】

【化8】

【0041】

［式（１）及び（２）に含まれる各符号の意味は上記したものと同じである。］

【0042】

（２）前記フラボノイド配糖体は、下記式（３）で表されるヘスペリジン、下記式（４）で表されるリナリン、及びそれらの薬理学的に許容される塩又はエステルよりなる群から選ばれる少なくとも１つである、上記（１）に記載のＶγ１Ｖδ１型Ｔ細胞活性化剤。

【0043】

【化9】

【0044】

（３）有効成分として、前記式（１）又は（２）で表される化合物及びそれらの薬理学的に許容される塩又はエステルよりなる群から選ばれる少なくとも１つのフラボノイド配糖体を含む、ウイルス感染症治療剤。
（４）前記フラボノイド配糖体は、前記式（５）で表されるヘスペリジン、前記式（６）で表されるリナリン、及び、それらの薬理学的に許容される塩又はエステルよりなる群から選ばれる少なくとも１つである、上記（３）に記載のウイルス感染症治療剤。
（５）ＨＩＶ感染治療に用いられる、上記（３）又は（４）に記載のウイルス感染症治療剤。
（６）逆転写酵素阻害剤及びウイルス蛋白酵素阻害剤よりなる群から選ばれる他の抗ウイルス剤と組み合わせて、ＨＩＶ感染治療に用いられる、上記（３）又は（４）に記載のウイルス感染症治療剤。
（７）免疫疾患を治療するための、前記式（１）又は（２）で表される化合物及びそれらの薬理学的に許容される塩又はエステルよりなる群から選ばれる少なくとも１つのフラボノイド配糖体の使用。
（８）ウイルス感染症を治療するための、前記式（１）又は（２）で表される化合物及びそれらの薬理学的に許容される塩又はエステルよりなる群から選ばれる少なくとも１つのフラボノイド配糖体の使用。
（９）免疫疾患の治療方法であって、前記式（１）又は（２）で表される化合物及びそれらの薬理学的に許容される塩又はエステルよりなる群から選ばれる少なくとも１つのフラボノイド配糖体を、インビトロでＶγ１Ｖδ１型Ｔ細胞と接触させた後、当該Ｖγ１Ｖδ１型Ｔ細胞を免疫疾患の患者に投与する治療方法。
（１０）ウイルス感染症の治療方法であって、前記式（１）又は（２）で表される化合物及びそれらの薬理学的に許容される塩又はエステルよりなる群から選ばれる少なくとも１つのフラボノイド配糖体を、インビトロでＶγ１Ｖδ１型Ｔ細胞と接触させた後、当該Ｖγ１Ｖδ１型Ｔ細胞をウイルス感染の患者に投与する治療方法。

【実施例】

【0045】

１．TCR欠陥T細胞に、Vγ1及びVδ1 TCR遺伝子を移入したT細胞クローン（1C116）及びVγ2及びVδ2 TCR遺伝子を移入したT細胞クローン（2C21）の樹立
（不死化T細胞クローンの誘導）
健康な被験者から採取した末梢血を遠心分離し、PBMCs（末梢血単核球）を得た。PBMCsを抗panγδTCR抗体（製品名 B6.1；メーカー名 BD Bioscience；所在地 アメリカ合衆国カリフォルニア州サンディエゴ）で標識した後、FACS（フローサイトメトリー）を用いてγδＴ細胞群を選別した。
得られたγδＴ細胞群を、下記ベース培地中に下記成分を添加した組成の完全培地中で、１μg／mLフィトヘマグルニチン（PHP-P）（メーカー名 Sigma-Aldrich；所在地 St. Louis, MO）を用いて３日間刺激した。
ベース培地：RPMI-1640（製品名；メーカー名 Thermo Fisher Scientific；所在地 アメリカ合衆国マサチューセッツ州ウオルサム）
添加成分：
10% heat-inactivated fetal calf serum （FCS）（メーカー名 Hyclone, Logan, UT)
5 mM HEPES buffer (メーカー名 Thermo Fisher Scientific)
100 U/ml penicillin (メーカー名 Thermo Fisher Scientific)
100 μg/ml streptomycin (メーカー名 Thermo Fisher Scientific)
2 mM L-glutamine (メーカー名 Thermo Fisher Scientific)
2 mM sodium pyruvate (メーカー名 Thermo Fisher Scientific)
2 mM non-essential amino acids (メーカー名 Thermo Fisher Scientific)
2 mM modified vitamins (メーカー名 Thermo Fisher Scientific)
0.5 μM 2-mercaptoethanol (2-ME) (メーカー名 Thermo Fisher Scientific)
刺激した後のγδＴ細胞群を、ヘルペス サイミリ（Herpes saimiri）の488株（メーカー名 ATCC（American Type Culture Collection）から製品名VR-1396として入手可能）に感染させた後、10U/ml の組換えインターロイキン２（rIL-2）（メーカー名 塩野義；所在地 大阪、日本）存在下で培養し、安定した増殖能力を有する不死化γδＴ細胞群を誘導した。
得られた不死化γδＴ細胞群をVδ1抗体で標識し、FACS（フローサイトメトリー）を用いて選別し、不死化Vγ1Vδ1^＋（Vδ１^＋）T細胞クローンを分離した。この不死化T細胞クローンは、マイトゲン刺激無しで数か月間に亘り安定した増殖能力を示した。

【0046】

（プラスミドを用いたTCR-γ1 cDNA及びTCR-δ1 cDNAの増幅）
TCR-γ1とTCR-δ1の両方をエンコードする全配列ｃＤＮＡを、不死化Vγ1Vδ1^＋Ｔ細胞クローンから分離した。
TCR-γ1 cDNAは、下記センスプライマー及び下記アンチセンスプライマーを用いて増幅し、下記プラスミドに組み込んでクローン化した。
センスプライマー（配列番号１）：
5’-GGCGGCGGCCGCGAAGGCATGCGGTGGGCCCT-3’
アンチセンスプライマー（配列番号２）：
5’-GGGCTCGAGCTGTTATGATTTCTCTCCATT-3
プラスミド：pEF1/Myc-His A （メーカー名 Thermo Fisher Scientific；所在地 Waltham, MA）
TCR-δ1 cDNAは、下記センスプライマー及び下記アンチセンスプライマーを用いて増幅し、下記プラスミドに組み込んでクローン化した。
センスプライマー（配列番号３）：
5’-GGCGGCGGCCGCCTTCAGGCAGCACAACTC-3’
アンチセンスプライマー（配列番号４）：
5’-GGGCTCGAGGGAGTGTAGCTTCCTCAT-3’
プラスミド：pREP4 (メーカー名 Thermo Fisher Scientific).

【0047】

（TCR欠陥T細胞へのVγ1及びVδ1 TCR遺伝子の移入）
TCR-γ1 cDNAを組み込んだプライマー及びTCR-δ1cDNAを組み込んだプライマーの両方を、TCR欠陥Jurkat T細胞株であるJRT3-T3.5内に240〜270Vのエレクトロポレーション（electroporation）により移入した。移入処理した細胞を２日から３日間、1mg/mL のG418 sulfate（Thermo Fisher Scientific）及び0.5 mg/mL のhygromycin B（Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan）を含む選択培地で培養することにより選別した。選別した細胞を、96ウエル マイクロプレート上に、限界希釈法により０．５から１細胞／ウエルとなるように撒き、分離した後、フローサイトメトリーによりγδTCR発現について分析し、Vγ1及びVδ1を移入したT細胞クローン（1C116）を樹立した。

【0048】

（PBMCsからVγ2Vδ2^＋T細胞の分離）
Vγ2Vδ2^＋T細胞は、骨粗鬆症治療に用いる薬剤リセドロネート（risedronate）により刺激されることが知られている。そこで、リセドロネートを用いて、PBMCs中のVγ2Vδ2^＋T細胞を刺激、増殖させた。具体的には、次の手順を実施した。
健康な被験者から採取した末梢血を遠心分離し、PBMCs（末梢血単核球）を得た。このPBMCsを２．５ μg/mL のリセドロネート（メーカー名 Ajinomoto Pharmaceutical. Co.；所在地 Tokyo, Japan）で１０U/mLのrIL-2の存在下で頻回刺激した後、Vδ2抗体で標識しFACS（フローサイトメトリー）を用いて選別し、Vγ2Vδ2^＋（Vδ２^＋）T細胞株を分離した。分離したVγ2Vδ2^＋（Vδ２^＋）T細胞株から目的とするfull-length cDNAsを得た。

【0049】

（プラスミドを用いたTCR-γ2 cDNA及びTCR-δ2 cDNAの増幅）
TCR-γ2とTCR-δ2の両方をエンコードする全配列ｃＤＮＡを、Vγ2Vδ2^＋T細胞から分離した。
TCR-γ2 cDNAは、下記センスプライマー及び下記アンチセンスプライマーを用いて増幅し、下記プラスミドに組み込んでクローン化した。
センスプライマー（配列番号５）：
5’-GGGCTCGAGGACACCGCTTTACAACGA-3’
アンチセンスプライマー（配列番号６）：
5’-GGGTCTAGAGTGAGGTTCTCTGTGT-3’
プラスミド： pEF1/Myc-His A.
TCR-δ2 cDNAは、下記センスプライマー及び下記アンチセンスプライマーを用いて増幅し、下記プラスミドに組み込んでクローン化した。
センスプライマー（配列番号７）：
5’-GGGCTCGAGAACACTTGTGTGTTGGTTCA-3’
アンチセンスプライマー（配列番号８）：
5’-GGGGGATCCAGTGTATCACTTGTAGGAG-3’
プラスミド： pREP4

【0050】

（TCR欠陥T細胞へのVγ2及びVδ2 TCR遺伝子の移入）
上記Vγ1及びVδ1 TCR遺伝子を移入する手順と同じ手順で、TCR-γ2 cDNAを組み込んだプライマー及びTCR-δ2cDNAを組み込んだプライマーの両方を、TCR欠陥Jurkat T細胞株であるJRT3-T3.5内に移入し、選別培養し、分析し、Vγ2及びVδ2を移入したT細胞クローン（2C21）を樹立した。

【0051】

２． 1C116クローン及び2C21クローンのTCRブロッキング分析、TCR‐依存刺激分析、及び、TCR‐依存刺激の反応特異性
（TCRブロッキング分析）
Vγ1及びVδ1を移入したT細胞クローン（1C116）及びVγ2及びVδ2を移入したT細胞クローン（2C21）を、抗pan-γδ-PE抗体（メーカー名 BioLegend；San Diego, CA）、及び、Vδ1-APC 抗体（メーカー名 Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach；所在地 Germany）、抗Vδ2-PE 抗体（メーカー名 Biolegend）、又は、抗CD3抗体と共に４℃、30分間インキュベートした後、処理した細胞を洗浄し、3% FCS 及び 0.01 M NaN₃ （FACS buffer）を含有するフォスファイトバッフアーサリン（PBS）中に再懸濁した。そして、フローサイトメトリーにより細胞を分析した。
Figure 1Aに結果を示す。オープンヒストグラム（白抜きの度数分布グラフ）は各抗体で染色したことを意味しており、シェードヒストグラム（網掛けの度数分布グラフ）はアイソタイプコントロールで染色したことを意味している。
クローン1C116は、pan-γδ及びVδ1によって染色されたが、Vδ2では染色されなかった。一方、クローン2C21は、pan-γδとVδ2によって染色されたが、Vδ1では染色されなかった。したがってクローン1C116及びクローン2C21は、どちらもγδT細胞クローンであることが確認された。

【0052】

（TCR‐依存刺激分析）
1C116クローン及び2C21クローンを、抗CD3抗体500ng/mLによりPMA 100ng/mL存在下、３７℃、２４時間の条件で刺激し、インターロイキン２（IL-2）の分泌を試験した。
どちらのクローンもCD3を発現しており（Figure 1A）、抗CD3抗体によりPMA存在下で刺激したときにIL-2を分泌した（Figure 1B）。したがって、これらのγδT細胞クローンから分泌されるIL-2の量は、TCR‐依存刺激の優れた指標になると考えられた。

【0053】

（TCR‐依存刺激の反応特異性）
イソペンテニル ピロフォスフェート（IPP）、エチルアミン、プロピルアミン又はブチルアミンのような様々なタイプのアルキルアミン、及び、骨粗しょう症の治療に用いるリセドロネート（Risedronate）のようなアミノ−ビスフォスフォネートが、Vγ2Vδ2^＋T細胞を刺激することが、すでに知られている。そこで、1C116クローン及び2C21クローンを、IPP、エチルアミン及びリセドロネートを用いて刺激し、反応性の相違を試験した。
96ウエルU-bottom 組織培養プレートの各ウエルに200 μL の 完全培地（CCM）を入れた。CCMを満たした各ウエルに、1×10⁵個の1C116クローン又は2C21クローンを撒き、下記被験化合物又は基材コントロール（vehicle control）であるジメチルスルホキシド（DMSO）のいずれかと共に、PMA100ng/mL存在下、３７℃、２４時間の条件でインキュベートした。インキュベート後、培地の上清を採取し、ELISAキット（メーカー名 BD Biosciense；所在地 San Diego, CA）を用いてIL-2の濃度を分析した。
＜被験化合物＞
0から1000 μM のイソペンテニル ピロフォスフェート（isopentenyl pyrophosphate （IPP）） (メーカー名 Sigma-Aldrich)
0から2000 μM のリセドロネート（risedronate）（メーカー名 Ajinomoto Co. Ltd；所在地 Tokyo, Japan）
0から33.5 μM のエチルアミン（ethylamine）(メーカー名 Sigma-Aldrich)
Figure 1Cに示したように、クローン2C21が、IPPによる刺激されIL-2を分泌するが、クローン1C116はIL-2を分泌しなかった。同様に、クローン2C21は、エチルアミンによって刺激されIL-2を分泌するが、クローン1C116はIL-2を分泌しなかった（Figure 1D）。また、クローン2C21は、リセドロネートにより刺激されIL-2を分泌するが、クローン1C116はIL-2を分泌しなかった（Figure 1E）。
これらの結果は、クローン2C21は、γ2δ2刺激性の抗原分子によってVγ2Vδ2 TCRを介して特異的に刺激されるが、クローン1C116は、Vγ1Vδ1 TCRを有し、Vγ2Vδ2 TCRを有しないため、クローン2C21とは異なる反応特異性を有していることを示している。

【0054】

３．クローン1C116 及びクローン2C21に対する刺激活性に関するフラボノイド配糖体のスクリーニング
幾つかの植物代謝産物が生理活性を有していることが知られている。近年、そのような天然化合物は、「フィトケミカルズ（phytochemicals）」と呼ばれている。そこで本発明者らは、C6-C3-C6構造を有する植物由来の芳香性化合物であるフラボノイドの、クローン1C116 及び2C21に対する刺激活性についてスクリーニングを実施した。
上記の試験「TCR‐依存刺激の反応特異性」と同様の方法で、本試験を実施した。すなわち、96ウエルU-bottom 組織培養プレートの各ウエルに200 μL の 完全培地（CCM）を入れた。CCMを満たした各ウエルに、1×10⁵個の1C116クローン又は2C21クローンを撒き、下記被験化合物又は基材コントロール（vehicle control）であるジメチルスルホキシド（DMSO）のいずれかと共に、PMA100ng/mL存在下、３７℃、２４時間の条件でインキュベートした。インキュベート後、培地の上清を採取し、ELISAキット（メーカー名 BD Biosciense, San Diego, CA）を用いてIL-2の濃度を分析した。
＜被験化合物＞
0から100 μg/mL の各フラボノイド
被験フラボノイドは次のとおりである：ケルセチンquercetin、イソケルセチン isoquercitrin、 ハイペロサイドhyperoside、ガランギン galangin、カンフェノール、モリン morin、ミリセチン myricetin、ヘスペレチン hesperetin、ヘスペリジン hesperidin、アカセチン acacetin、リナリン linarin、及び、イソルフォリン isorhoifolin（これら全ての供給会社 Extrasynthese, Lyon, France）
各被験化合物の化学構造を以下に示す。

【0055】

【化10】

【0056】

（試験結果）
スクリーニング試験の結果を下記Table 1に示す。

【0057】

【表1】

【0058】

Table 1に示したように、幾つかのフラボノイドは、クローン1C116を刺激し、多量のIL-2を分泌させた。これに対し、いずれのフラボノイドも、クローン2C21は刺激しなかった。
特に、ルチノースと呼ばれる6-O-α-L-rhamnosyl-D-glucose 構造の二糖体がＡ環上に置換し、かつ、メトキシ基（−OCH₃）がB環上に置換しているもの、例えば、ヘスペリジンやリナリンは、クローン1C116のIL-2分泌に関し強い刺激活性を示した（Figure 2A）。このような刺激活性が、抗‐γδ TCR特異的抗体を用いた処理によって完全に失われた事実は、フラボノイド配糖体の認識がVγ1Vδ1 TCRを介して開始されたことを強く示している（Figure 2B）。
また、ヘスペリジンからルチノースを取り除いた構造を持っているヘスペレチン、又は、リナリンからルチノースを取り除いた構造を持っているアカセチンは、クローン1C116からIL-2を分泌させないか又は弱い分泌のみ示した（Figure 2A）。
また、フラボノイドのＡ環上に二糖体であるルチノースが置換していても、イソロイフォリン（isorhoifolin）のようにＢ環上にメトキシ基（−OCH3）がB環上に置換していない場合には、クローン1C116からのIL-2分泌が観察されなかった（Figure 2A）。
これらの知見を総合すると、Vγ1及びVδ1 TCR遺伝子を移入したクローン1C116は、Ａ環上のルチノースとB環上のメトキシ基（−OCH₃）の両方を有しているフラボノイド配糖体によって、Vγ1Vδ1 TCRを介して特異的かつ強力に刺激されることを明らかに示している。さらに、ヘスペリジン及びリナリンは、クローン1C116に対し、極めて顕著な刺激活性を示した。
よって本発明者らは、ヘスペリジン及びリナリンに着目し、これらのフラボノイド配糖体が、Vγ1δ1-TCR-発現γ1δ1 T細胞の活性化作用を介して、CD4⁺ NKT細胞内におけるR5-type HIV-1の複製を抑制するか否かについて検討を進めた。

【0059】

４．ヒト由来天然γ1δ1^＋T細胞に対するフラボノイド配糖体の刺激活性分析
フラボノイド配糖体に属する化合物群の一部が、Vγ1及びVδ1 TCR遺伝子を移入したT細胞クローン1C116に対し刺激活性を有することが上記スクリーニング試験によって示された。そこで、スクリーニングニング試験においてVγ1Vδ1 TCRに特異的な刺激活性を示したフラボノイド配糖体が、Vγ1Vδ1 TCR遺伝子移入体クローンと同様に、ヒト由来天然γ1δ1 T細胞に対しても刺激活性を有するか否か検討した。

【0060】

健康な被験者から採取した末梢血を遠心分離し、PBMCs（末梢血単核球）を得た。PBMCsを、Cell Trace CFSE Cell Proliferation Kit （carboxy-fluorescein diacetate succinimidyl ester (CFDA-SE, also known as CFSE)） （メーカー名 Thermo Fisher Scientific）を用いて標識した。
次に、48ウエルプレートの各ウエルに、0.5 mL の完全培地（CCM）を入れた。CCMは、RPMI-1640 （製品名；メーカー名 Thermo Fisher Scientific）に、5% AB ヒト血清（メーカー名 Biowest Nuaille； 所在地France）及び100 U/mL 組換えIL-2 （メーカー名 Shionogi）を添加した組成を有する。CCMを満たした各ウエルに、標識したPBMCsを撒き、100 μg/mL のヘスペレチン（hesperetin）、ヘスペリジン（hesperidin）、アカセチン（acacetin）又はリナリン（linarin）と共に、又は0.01%の ジメチルスルホキシド（DMSO：vehicle control）と共に、14日間培養した。
培養後、PBMCsを抗Vδ1-APC抗体（メーカー名 Miltenyi Biotec GmbH；所在地 Bergisch Gladbach, Germany）、又は、抗CD25-PE/Cy7抗体（メーカー名 Biolegend）と共に、4℃、30分間インキュベートした。 そして、インキュベートしたPBMCsを洗浄し、3% FCS 及び 0.01 M NaN₃ （FACS buffer）を含有する PBS 中に懸濁し、フローサイトメトリーにより分析した。

【0061】

Figure 3Aの上段のグラフは、培養後のPBMCsに抗Vδ1-APC抗体を反応させてフローサイトメトリーにより分析した結果であり、PBMCs中に存在するγ1δ1^＋T細胞に対する各被験化合物の増殖活性を示している。Figure 3Bの向かって左側のグラフはFigure 3A上段の化合物ごとの結果を一つのグラフにしたものである。非刺激コントロ−ル又はDMSO（vehicle control）と比較すると、ヘスペレチン及びアカセチンはPBMC s中に存在するγ1δ1 ^＋T 細胞を有意に増加させなかったが、ヘスペリジン及びリナリンはPBMC s中に存在するγ1δ1^＋ T 細胞の数を増加させることができた。
また、Figure 3Aの下段は、培養後のPBMCsに抗Vδ1-APC抗体及び抗CD25-PE/Cy7抗体を反応させてフローサイトメトリーにより分析した結果であり、PBMCs中に存在するγ1δ1^＋T細胞に対する各被験化合物のCD25発現量を示している。Figure 3Bの向かって右側のグラフはFigure 3A下段の化合物ごとの結果を一つのグラフにしたものである。非刺激コントロ−ル又はDMSO（vehicle control）と比較すると、ヘスペレチン及びアカセチンはPBMC s中に存在するγ1δ1 ^＋T 細胞のCD25発現を優意に増強させなかったが、ヘスペリジン及びリナリンはPBMC s中に存在するγ1δ1^＋ T 細胞のCD25発現を有意に増強させた。

【0062】

５．ヘスペリジン及びリナリンにより刺激したヒト由来天然γ1δ1 ⁺T 細胞からのサイトカイン及びケモカイン分泌プロファイル
上記実験により、ヘスペリジン及びリナリンが、ヒト由来天然γ1δ1^＋T細胞に対して刺激活性を有することが示された。
一般に免疫系細胞は、サイトカイン分泌による宿主細胞間の免疫調節及びケモカイン分泌による外来微生物に対する免疫調節を行っている。 本発明者らは、Vγ1Vδ1 T⁺ 細胞により分泌されるCCL3 （MIP-1α）、 CCL4 （MIP-1β） 、及び、CCL5（RANTES）のようなケモカインは、CD4⁺ NKT 細胞内におけるR5-HIV-1-NL(AD8) ウイルス複製を抑制すると考えられることを以前に報告している。さらに本発明者らは、NL(AD8)-感染 CD4⁺ NKT 細胞上に高度に発現したMICA/MICB を介してVγ1Vδ1 T 細胞が活性化することについて以前に報告している。
そこで本発明者らは、ヘスペリジン又はリナリンにより刺激されたVγ1Vδ1 T 細胞が、サイトカイン及びケモカインを分泌するか否かを検討した。

【0063】

健康な被験者から採取した末梢血を遠心分離し、PBMCs（末梢血単核球）を得た。PBMCsに、Vδ1-APC 抗体（メーカー名 Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach；所在地 Germany）を反応させ、フローサイトメトリー法により、γ1δ1^＋T 細胞を選別した。
選別されたVδ1^＋T 細胞（Vγ1Vδ1 T 細胞に代表される細胞群）を、1 x 10⁶個/mL のirradiated PBMCsを含有する2 μg/mL PHA（メーカー名 Sigma-Aldrich） と共にインキュベートした。それから、24ウエル培養プレートの各ウエルに、5% AB ヒト血清（メーカー名 Biowest Nuaille；所在地 France）、及び、100 U/mL 組換えIL-2（メーカー名 Shionogi；所在地 Osaka, Japan）を添加した完全培地（CCM）を入れ、各ウエルに、あらかじめインキュベートしたVδ1^＋T 細胞を撒き、３日から４日ごとに培地を半分ずつ交換しながら、１４ 日間培養した。
１４日間に亘り上記の初期培養を行った後、Vδ1^＋T 細胞を、1 x 10⁶個/mL のirradiated PBMCsを含有する2 μg/mL PHA (メーカー名 Sigma-Aldrich) を用いて再刺激し、さらに引き続き、上記と同じ方法により培養した。Vδ1^＋T 細胞の再刺激は、実験に使用する少なくとも７日前に開始した。
再刺激を完了させたVδ1^＋T 細胞を、以下の手順によりヘスペリジン又はリナリンで刺激し、サイトカイン及びケモカインのプロファイルを検討した。

【0064】

ラウンドボトム（round-bottom）型96ウエルプレートの各ウエルに、200μl の完全培地（CCM）を入れた。CCMは、5% AB ヒト血清（メーカー名 Biowest Nuaille； 所在地France）及び100 U/mL 組換えIL-2 （メーカー名 Shionogi）を添加した組成を有する。CCMを満たした各ウエルに、5 x 10^４個/mL のVγ1^＋T 細胞を撒き、２５ng/mLのＰＭＡと共に、１μg/mLのイオノマイシン（ionomycin）、又は、１０、３０、１００μg/mLいずれかの量のヘスペリジン、前記と同量のリナリン、又は、０．０１、０．０３、０．１％のジメチルスルホキシド（DMSO：vehicle control）のいずれかを添加し、培養した。４８時間後、１５０μl の培地上清を各ウエルから採集し、
サイトカイン及びケモカインの測定まで−８０℃で保存した。
多種類のサイトカイン（IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IL-17A）を定量するために、ＢＤ ＣＢＡ キット（BD CBA kit；「ＢＤ」は登録商標；メーカー名 BD Bioscience）、及び、FACSCanto II（製品名；メーカー名 べクトンディッキンソン）さらに、サイトカインのうち、IL-5の量は、ＢＤ ＣＢＡ キットとIL-5 ELISA kit（メーカー名 R&D Systems；所在地 Minneapolis, MN）を用いて測定し、IL-13の量は、ＢＤ ＣＢＡ キットとIL-13 ELISA kit（メーカー名 ThermoFisher）を用いて測定した。また、MIP-1α、MIP-1β、RANTESなどのケモカインは、それぞれのELISA kit（メーカー名 R&D Systems）を用いて定量した。

【0065】

Figure 4AはPBMCsからVγ1Vδ1-TCR 発現T 細胞を選抜した過程及び結果を示したグラフである。Figure 4Aの左側に示すように、PBMCs中に、Vδ1 ^＋T 細胞は０．４７％含まれており、そこからFigure 4Aの右側に示すようにVδ1 ^＋T 細胞を選別した。
ヘスペリジン又はリナリンで刺激したVγ1Vδ1 T 細胞の上清中に観察される主要なサイトカインは、意外にもIL-5 及びIL-13であり、刺激されていない通常状態 のlymphocytes 2 （ILC-2）に良く似た挙動であった。IL-5 及びIL-13は、アレルギー反応時や感染時に分泌されることが知られている。しかし、大多数のγδ T 細胞が分泌する主要なサイトカインであることが知られているIL-17 及び IFN-γは観察されないことを発見した（Figure 4B）。
さらに、ヘスペリジン及びリナリンの量を３段階（10 μg/mL, 30 μg/mL, 100 μg/mL）に変えて効果の差を検討し、サイトカインとケモカインの分泌量を測定した。DMSO（vehicle control）と比較すると、ケモカインであるMIP-1α、MIP-1β、及び、RANTESの分泌量が大きくなり、サイトカインであるIL-5及び IL-13の分泌量も大きくなった（Figure 4C）。
これらの結果により、PBMCs中に存在するヒト由来天然γ1δ1^＋T細胞は、ヘスペリジンやリナリンのようなフラボノイド配糖体により刺激されると、サイトカイン及び／又はケモカインを分泌して免疫調節を行うことが確認された。
また、ヘスペリジン及びリナリンにより刺激されたγ1δ1^＋T細胞から分泌されたケモカインは、CD4⁺ NKT 細胞内におけるR5-HIV-1-NL(AD8) ウイルス複製を抑制すると考えられることから、ヘスペリジンやリナリンのようなフラボノイド配糖体により刺激されたヒト由来天然γ1δ1^＋T細胞は、CD4^＋NKT 細胞内におけるR5-HIV-1-NL(AD8) ウイルス複製を抑制することが示唆された。

【0066】

６．ヘスペリジン及びリナリンにより活性化されたヒト由来天然γ1δ1^＋T 細胞を介するCD4^＋ナチュラルキラーT（CD4^＋NKT）細胞内でのR5-type of HIV-1複製の抑制
上記実験によって、ヘスペリジンやリナリンのようなフラボノイド配糖体により刺激されたヒト由来天然γ1δ1^＋T細胞は、CD4^＋NKT 細胞内におけるR5-HIV-1-NL(AD8) ウイルス複製を抑制することが示唆された。
上記示唆を踏まえ、本発明者らは、R5 type HIV-1に感染させたCD4^＋NKTに、ヒト由来天然γ1δ1^＋T細胞の存在下でヘスペリジン又はリナリンを添加したときに、被感染CD4^＋NKT内のHIV-1ウイルス複製を抑制する否か検討した。
NKT 細胞を誘導するために、2 x 10^６のPBMCsを含有する1 mL の完全培地（CCM）中に、20 ng/ml のα‐ガラクトシルセラミド（α-GalCer）（製品名 KRN7000：メーカー名 Funakoshi Co., Ltd.,；所在地 Tokyo, Japan）を添加した。７日後、培地の半分を、20 U/ mL のIL-2（メーカー名 Shionogi）を含有し、かつ、α-GalCerを含有しない新しいCCMに置換した。この培養スキームにより、ヒトPBMCsからCD4^＋Vα24^＋NKT 細胞が誘導された（Figure 5A、向かって左のグラフ）。
誘導されたCD4⁺ Vα24^＋NKT 細胞を、20 U/mL のIL-2を含有する完全培地（CCM）中で、2 μg/mL の PHAを用い、３日間刺激した。引き続き、上記のPHA刺激CD4^＋Vα24^＋type-I NKT 細胞を洗浄して遊離PHAを除去した。洗浄後、1 - 2 X 10^５個の細胞を、30 μg/mL のDEAE-Dextran（メーカー名 Sigma-Aldrich）の存在下、感染多重度０．１（0.1 MOI）、且つ、３７℃で２時間の条件で、NL(AD8) HIV-1 (R5-type)に感染させた。ここで感染多重度（MOI：Multiplicity of infection）とは、感染を受ける細胞に対する感染性ウィルスの比率であり、0.1 MOIは、１０細胞に対しウィルス粒子１つを培養することを意味する。

【0067】

ベース培地であるRPMI-1640 （製品名；メーカー名 Thermo Fisher Scientific；所在地 アメリカ合衆国マサチューセッツ州ウオルサム）に2% FCS を含有させた培地を調製した。このベース培地を用いてNL(AD8)-感染NKT 細胞を３回繰り返し洗浄した。洗浄後の細胞を、ラウンドボトム（round-bottom）型 96-ウエルプレートを使用し、20 U/ml のIL-2を含有する培地中でインキュベートした。
そして、2 x 10^４個のNL(AD8)-感染NKT 細胞を、ラウンドボトム（round-bottom）型96-ウエルプレートを使用し、20 U/mL のIL-2を含有する200 μl の CCM 中で、1 x 10^４個のVδ14^＋細胞の存在下で、又は、非存在下培養した。培養を行う際に、3, 10 又は 30 μg/mL のヘスペリジン、又は、3, 10 又は 30 μg/mL のリナリン、又は、0.003, 0.01 又は 0.03% DMSO （vehicle control）をプレートの各ウエルに添加した。
培養開始後４日目に100 μlの培地上清を各ウエルから採集し、p24 抗原の測定まで−８０℃で保存し、ELISA kit（メーカー名 Sino Biological；所在地 Beijing, China）を用いて測定した。

【0068】

培地中のヘスペリジン又はリナリンの添加量が100 μg/mLを超えるとNKT細胞の成長が停止したことから、ヘスペリジン及びリナリンの量が100 μg/mLを超えると毒性をもつことが示され、これは予想外の結果であった（Figure 5Aの向かって右側のグラフ）。
細胞生存率の評価については、上記の培養スキームにより、ヒトPBMCsから誘導されたCD4^＋Vα24^＋NKT 細胞（１X１０^４個）を、3, 10, 30又は100 μg/mL のヘスペリジン、又は、3, 10, 30又は100μg/mL のリナリン、又は、0.003, 0.01 又は 0.03% DMSO （vehicle control）と共に３日間培養した。培養後、トリパンブルーエクスクルージョン試験（trypan blue exclusion test）により、細胞生存率を計算した。
Vδ1^＋T細胞をヘスペリジン又はリナリンにより刺激すると、R5-HIV-1-NL(AD8) ウイルスの存在を示すp24抗原の検出量が明らかに減少したことが観察され、これらのフラボノイド配糖体が、CD4^＋NKT 細胞内におけるR5-HIV-1-NL(AD8) ウイルス複製を用量依存的に有意に抑制した（Figure 5B内の黒色バー）。
Vδ1⁺ T細胞を含まない培地を用いた場合に、フラボノイド配糖体添加群において測定可能レベルのウイルス複製抑制が観察されたことから、フラボノイド配糖体それ自体がある程度のウイルス複製抑制作用をもつことも示された（Figure 5B内の白色バー）。

【0069】

７．ヘスペリジン及びリナリンにより活性化されたヒト由来天然γ1δ1⁺ T 細胞を介するCD4⁺T細胞内でのR5-type of HIV-1複製の抑制
上記実験によって、ヘスペリジンやリナリンのようなフラボノイド配糖体により刺激されたヒト由来天然γ1δ1^＋T細胞は、CD4^＋NKT（ナチュラルキラーT）細胞内におけるR5-HIV-1-NL(AD8) ウイルス複製を抑制することが示唆された。
そこで本発明者らは、ヒト由来天然γ1δ1^＋T細胞をヘスペリジン又はリナリンで刺激したときに、CD4^＋NKTと同様に、CD4^＋T 細胞内におけるR5-HIV-1-NL(AD8) の複製についても阻害するか否かを検討した。
PBMCsから誘導されたCD4^＋T 細胞を、CD4^＋NKTに対して実施した上記手順と同じ手順で、NL(AD8) HIV-1 (R5-type)に感染させた。得られたNL(AD8)-感染CD4^＋T 細胞を、上記と同じ手順でヘスペリジン又はリナリンと共に培養した。そして、培養開始後４日目に、培地上清中に存在するp24 抗原を測定した。
我々は、ヘスペリジン又はリナリンにより活性化されたVδ1^＋T 細胞は、CD4^＋T 細胞内におけるR5-HIV-1-NL(AD8) ウイルス複製についても有意に抑制したことを観察した（Figure 5C）。
これらの知見を総合的に検討すると、Vδ1⁺ T細胞は、ヘスペリジン及びリナリンのようなフラボノイド配糖体により活性化したときに、CD4^＋NKT 細胞内におけるR5 tropic HIV-1 複製を抑制するだけでなく、CD4^＋T 細胞内におけるR5 tropic HIV-1 複製も抑制することが示唆される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]