特許 6682008 糖尿病性腎症を予防及び治療するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6682008

(24)【登録日】2020年3月26日

(45)【発行日】2020年4月15日

(54)【発明の名称】糖尿病性腎症を予防及び治療するための方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/48 20060101AFI20200406BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20200406BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20200406BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20200406BHJP

   C12N 9/68 20060101ALN20200406BHJP

   C12N 15/57 20060101ALN20200406BHJP

【ＦＩ】

   A61K38/48 100

   A61P13/12

   A61P43/00 121

   A61K45/00

   !C12N9/68ZNA

   !C12N15/57

【請求項の数】13

【全頁数】39

(21)【出願番号】特願2018-550635(P2018-550635)

(86)(22)【出願日】2016年12月16日

(65)【公表番号】特表2019-500424(P2019-500424A)

(43)【公表日】2019年1月10日

(86)【国際出願番号】CN2016110450

(87)【国際公開番号】WO2017101868

(87)【国際公開日】20170622

【審査請求日】2018年6月18日

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2015/097944

(32)【優先日】2015年12月18日

(33)【優先権主張国】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】518217305

【氏名又は名称】タレンゲン インターナショナル リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＴＡＬＥＮＧＥＮ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＬＩＭＩＴＥＤ

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島 一

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井 京子

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田 光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻 博文

(74)【代理人】

【識別番号】100137729

【弁理士】

【氏名又は名称】赤井 厚子

(74)【代理人】

【識別番号】100151301

【弁理士】

【氏名又は名称】戸崎 富哉

(72)【発明者】

【氏名】李 季男

【審査官】 高橋 樹理

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１９−５００４２２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０２１２１０２３（ＣＮ，Ａ）

【文献】 Endocrinology and Metabolism，１９９７年，Vol.4，p.371-376

【文献】 日本臨床検査自動化学会会誌，２００２年，Vol.27, No.2，p.145-150

【文献】 J. Exp. Med.，１９９７年，Vol.185, No.5，p.963-968

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３８／４８

Ａ６１Ｐ １３／１２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

有効量のプラスミノゲンを含む、被験者の糖尿病性腎症及び／またはその関連疾患を予防、治療及び／または解消するための薬物組成物であって、前記関連疾患は、早期腎臓体積増大、早期糸球体の高濾過率、間欠性タンパク尿、微量アルブミン尿、大量アルブミン尿、持続性タンパク尿、糸球体濾過率低下、腎細胞損傷、腎臓繊維化、腎機能不全、腎不全、尿毒症を含むことを特徴とする、薬物組成物。

【請求項2】

前記糖尿病性腎症は、糸球体硬変、糸球体間質増殖を含む糸球体病変；腎細管間質病変；腎間質繊維化、腎細管萎縮、糸球体輸出細動脈透明変性、腎微小血管硬変を含む腎微小血管病変を含むことを特徴とする、請求項１に記載の薬物組成物。

【請求項3】

前記糖尿病性腎症は糖尿病によって引き起こされる大血管、小血管、微小血管の病変によってもたらされるものであることを特徴とする、請求項１または２に記載の薬物組成物。

【請求項4】

前記プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の薬物組成物。

【請求項5】

前記プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含み、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有するタンパク質であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の薬物組成物。

【請求項6】

前記プラスミノゲンはＧｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ（ｄｅｌｔａ）−プラスミノゲンまたはそれらの任意の組み合わせから選択されるものであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の薬物組成物。

【請求項7】

前記プラスミノゲンは例えば、静脈内、筋肉内、皮下、吸入、ガイドチューブ投与、局所注射、または直腸投与によって全身または局所にて投与される、請求項１〜６のいずれかに記載の薬物組成物。

【請求項8】

前記プラスミノゲンは一種類または複数種類の他の薬物と組み合わせて投与できることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の薬物組成物。

【請求項9】

前記他の薬物は抗糖尿病薬、抗血栓薬、血圧降下薬、高脂血症治療薬、抗心脳血管疾患薬、抗感染薬を含むことを特徴とする、請求項８に記載の薬物組成物。

【請求項10】

有効用量のプラスミノゲンを含有する容器、及び被験者の糖尿病性腎症及び／またはその関連疾患の予防、治療及び／または解消における製品の投与を指導するプロトコルを含むことを特徴とする、前記被験者の糖尿病性腎症及び／またはその関連疾患を予防、治療及び／または解消するための製品であって、前記関連疾患は、早期腎臓体積増大、早期糸球体の高濾過率、間欠性タンパク尿、微量アルブミン尿、大量アルブミン尿、持続性タンパク尿、糸球体濾過率低下、腎細胞損傷、腎臓繊維化、腎機能不全、腎不全、尿毒症を含むことを特徴とする、製品。

【請求項11】

さらに一種類または複数種類の他の薬物を含有する容器を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の製品。

【請求項12】

前記他の薬物は抗糖尿病薬、抗血栓薬、血圧降下薬、高脂血症治療薬、抗心脳血管疾患薬、抗感染薬であることを特徴とする、請求項１１に記載の製品。

【請求項13】

前記プロトコルはさらに前記プラスミノゲンは前記他の薬物を投与する前、投与と同時及び／または後に投与できることを説明するものであることを特徴とする、請求項１１または１２に記載の製品。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はプラスミノゲンの糖尿病によってもたらされる腎臓疾患を予防、治療及び／または解消することにおける作用に係り、さらには異なるタイプの糖尿病性腎症及びその関連疾患に対して全く新しい治療ストラテジーを提供する。

【背景技術】

【0002】

糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ）は体内インスリンの相対的不足または絶対的不足またはターゲット細胞のインスリンに対する感受性の低下、またはインスリン自身に構造上の欠陥が存在することによってもたらされる炭水化物、脂肪及びタンパク質代謝の乱れが生じる慢性疾患である（非特許文献１）。糖尿病性腎症（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ，ＤＮ）は糖尿病の主な合併症の一つであり、約２０−４０％の糖尿病患者がＤＮに進行する（非特許文献２−４）。糖尿病性腎症は臨床において最もよく見られる及び多発的な糖尿病合併症であり、それは高血圧、タンパク尿、むくみ及び腎臓機能不全として現れ、これは主に糖尿病の代謝異常によってもたらされる糸球体の硬変により、腎機能障害及び損傷がもたらされるからである（非特許文献５，６）。糖尿病性腎症は糸球体の肥大、糸球体の基底膜の厚み増加、糸球体間質の厚み増大として現れ、最終的には糸球体の繊維化、硬変を引き起こす（非特許文献７）。

【0003】

通常、糸球体の過剰濾過及び腎肥大は糖尿病の発症後の一年目に発生し、糸球体の濾過率上昇として現れる（例えば、人類の正常な糸球体の濾過率は約１２０ｍｌ／分から約１５０ｍｌ／分である）。糖尿病の当初５年中においては糸球体の肥大、糸球体の基底膜の厚み増大及び糸球体間質の体積拡張などの病理的変化が見られる。糸球体の濾過率は徐々に正常に回復する。糖尿病になってから５−１０年後、個体は尿液中において微量のアルブミン尿を排出するようになる。微量アルブミン尿は顕性の糖尿病性腎症（一部は大量のアルブミン尿を特徴とする）にまで進行した重要な指標である。疾患の早期で見られる基底膜の厚み増大及び糸球体の体積拡張は末期糖尿病性腎症でも蓄積され、これにより毛細血管の血管腔の閉塞をもたらし、最終的に糸球体の硬変をもたらす。一旦顕性糖尿病性腎症が見られれば、糸球体の濾過率は安定的に低下し、約半数の患者は７〜１０年以内に末期腎症にまで進行する。

【0004】

糖尿病性腎症の進行ステージは臨床上において十分観察されている。Ｉ期の糖尿病性腎症と糸球体の濾過増大（即ち過剰濾過、腎臓及び糸球体に流れる血液の増加によって起こる）、糸球体の濾過率上昇、糸球体肥大及び腎腫大に関連する。ＩＩ期の糖尿病性腎症は継続的な過剰濾過及び腎肥大に関連する臨床上のサイレントステージである。糸球体基底膜の厚み増大及び糸球体間質の拡張が起きる。ＩＩＩ期の糖尿病性腎症（初期糖尿病性腎症とも呼ばれる）は微量アルブミン尿と関連する。腎臓は徐々に老廃物を濾過する能力を失い、同時にクレアチニン及び尿素窒素の血液中レベルが上昇する。糸球体基底膜の厚み増大及び糸球体間質の拡張は病状の進行に伴って継続的に発生する。ＩＶ期の糖尿病性腎症（顕性糖尿病性腎症とも呼ばれる）は大量アルブミン尿（即ち臨床的アルブミン尿）及び血液中のクレアチニン及び血中尿素窒素レベルの継続的な上昇と関連するものである。Ｖ期糖尿病性腎症は末期腎臓疾患及び腎不全に伴って発生する。

【0005】

糖尿病性腎症の発症メカニズムは複雑で、現在の糖尿病性腎症に対する治療方法は主に飲食のコントロール、血糖のコントロール、インスリン注射、透析及び腎移植等の方法であり、しかしこれらの治療手段はコストが高すぎて且つ合併症がひどく且つ現在糖尿病性腎症に対する薬物は極めて少なく、そのため治療用の薬物の開発が切実に望まれている。

【0006】

プラスミンはプラスミノゲン活性化系（ＰＡ系）の重要な成分である。プラスミンは広スペクトルのプロテアーゼであり、細胞外基質（ＥＣＭ）の幾つかの成分を加水分解でき、これらの成分はフィブリン、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン及びプロテオグリカンを含む（非特許文献８）。これ以外に、プラスミンは金属プロテアーゼ前駆体（ｐｒｏ−ＭＭＰ）を活性化させて活性を有する金属プロテアーゼ（ＭＭＰ）とするものである。そのためプラスミンは細胞外タンパク加水分解作用の一つの重要な上流調節因子であると考えられている（非常特許文献９，１０）。プラスミンはプラスミノゲンが二種類の生理性のＰＡ：組織型プラスミノゲン活性化剤（ｔＰＡ）またはウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化剤（ｕＰＡ）のタンパク質加水分解によって形成されるものである。プラスミノゲンが血漿及びその他の体液中において比較的レベルが高く、従来ではＰＡ系の調整は主にＰＡの合成及び活性レベルによって実現すると考えられている。ＰＡ系成分の合成は異なる要素の厳格な調節を受け、これらは例えばホルモン、成長因子及びサイトカインである。また、プラスミン及びＰＡの特定の生理的阻害剤が存在する。プラスミンの主な阻害剤はα２−抗プラスミン（α２−ａｎｔｉｐｌａｓｍｉｎ）である。一部の細胞表面には直接加水分解活性を有するｕＰＡ特異性の細胞表面受容体が存在する（非特許文献１１，１２）。

【0007】

プラスミノゲン（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ，ｐｌｇ）は単一鎖の糖タンパクであり、７９１個のアミノ酸からなり、分子量は約９２ｋＤａである（非特許文献１３，１４）。プラスミノゲンは主に肝臓で合成され、大量に細胞外液に存在している。血漿中に含まれるプラスミノゲンの含有量は約２μＭである。そのためプラスミノゲンは組織及び体液中のタンパク質加水分解活性の大きな潜在的なソースである（引用文献１５、１６）。プラスミノゲンには二種類の分子形式が存在する：グルタミン酸−プラスミノゲン（Ｇｌｕ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）及びリジン−プラスミノゲン（Ｌｙｓ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）である。天然的に分泌され及び断裂していない形のプラスミノゲンは一つのアミノ基末端（Ｎ−末端）を有するグルタミン酸であり、そのためグルタミン酸−プラスミノゲンと呼ばれる。しかし、プラスミンが存在する場合、グルタミン酸−プラスミノゲンはＬｙｓ７６−Ｌｙｓ７７において加水分解されてリジン−プラスミノゲンとなる。グルタミン酸−プラスミノゲンと比較した場合、リジン−プラスミノゲンとフィブリンはより高い親和力を有し、さらにより高い速度でＰＡによって活性化されることができる。この二つの形式のプラスミノゲンのＡｒｇ５６０−Ｖａｌ５６１ペプチド結合はｕＰＡまたはｔＰＡによって切断され、これによりジスルフィド結合によって接続された二重鎖プロテアーゼプラスミンが形成される（非特許文献１７）。プラスミノゲンのアミノ基末端には五つの同由来トリサイクルを含み、即ちいわゆるｋｒｉｎｇｌｅであり、カルボキシル末端部分はプロテアーゼドメインを含む。一部のｋｒｉｎｇｌｅはプラスミノゲンとフィブリン及びその阻害剤α２−ＡＰの特異性相互作用を介在するリジン結合部位を有する。最新的に、３８ｋＤａのプラスミノゲンフラグメントで、そのうちにｋｒｉｎｇｌｅ１−４を含み、血管生成の効果的な阻害剤であることが発見されている。このフラグメントはアンギオスタチンと命名され、いくつかのプロテアーゼがプラスミノゲンを加水分解することによって生成されることができる。

【0008】

プラスミンの主な基質はフィブリンであり、フィブリンの溶解は病理性の血栓の形成を予防する重要な点である（非特許文献１８）。プラスミンはさらにＥＣＭのいくつかの成分に対して基質特異性を有し、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン及びゼラチンを含み、これはプラスミンがＥＣＭ再建中において需要な作用を有することを示している（非特許文献１４、１９、２０）。間接的に、プラスミンはさらにいくつかのプロテアーゼ前駆体を活性プロテアーゼに変換することによりＥＣＭのその他の成分を分解し、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９を含む。そのため、以下のように提唱する人がいる。プラスミンは細胞外タンパク加水分解の重要な上流調節因子である（非特許文献２１）。また、プラスミンはいくつかの潜在的な形の成長因子を活性化させる能力を有する（非特許文献２２−２４）。体外において、プラスミンはさらに補体系の成分を加水分解させて走化性の補体フラグメントを放出することができる。

【0009】

糖尿病性腎症は糖尿病のよく見られる合併症であり、糖尿病による全身性微小血管病変の表れの一つであり、臨床的特徴は徐々に進行する腎機能ダメージ、高血圧、むくみ、タンパク尿であり、末期には重度な腎不全が現れ、糖尿病患者の主な死亡原因の一つである。近年の中国の人口平均寿命の延長、生活における飲食習慣、構造の変化により、糖尿病の疾患率も急な上昇傾向を示し、且つ治療方法の改善により、生存時間が長くなり、腎臓及びその他の合併症もそれに伴って増加している。

【0010】

現在の糖尿病性腎臓損傷を治療する方法には主に薬物治療及び透析治療がある。薬物は主に血圧降下薬、スタチン系薬、抗凝固薬及び抗酸化薬等を含む。

【0011】

降圧系薬は主にＡＣＥＩ（アンジオテンシン変換酵素阻害薬）系薬及びＡＲＢ（アンジオテンシンII受容体拮抗薬）系薬、及びＡＣＥＲ系薬があり、例えばエナラプリル、カプトプリル、ベナゼプリル、リシノプリル等である。これらの薬物は味覚の混乱、白血球の減少、皮疹、味覚喪失及び刺激性の空咳などの合併症が起きる。ＡＲＢ系薬物はロサルタン、バルサルタン、カンデサルタン等である。ＡＲＢ系薬は合併症が比較的少ないが、価格が高い。

【0012】

スタチン系薬物はヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素阻害剤であり、主にロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン等を含み、この系の薬物は主に血中脂質に対する降下作用により腎臓を保護するものである。スタチン系薬は使用中において筋肉の痛み及び肝臓の酵素異常などの副作用が現れる。

【0013】

現在使用する抗凝固系薬は、ヘパリン、ワルファリン、及びウロキナーゼ等を含み、このような薬物は出血、アレルギー等の合併症が現れることがある。

【0014】

抗酸化性薬はビタミンＥ及びタウリン等を含む。

【0015】

透析治療は腸透析、腹膜透析及び血液透析等を含む。結腸透析は腸管粘膜の半透過膜特性及び天然の広大な透析面積を利用して能動的に体内の毒素を排除し、これにより血液浄化の作用が得られるものである。腹膜透析は優れた血糖コントロールを必要とし且つ血管瘻を設ける必要がないが、腹膜炎となりやすく、感染及びタンパク質の損失をもたらしやすい。血液の透析は比較的簡単で、治療時間が短く、しかし血管瘻を設ける必要があり、透析過程において中心血管に対する負担が比較的重い。

【0016】

以上をまとめると、現在の薬物は主に血圧降下、血中脂質の低下、抗凝固、抗酸化等である。しかし、これらの薬物はいずれも糖尿病の腎臓自身に対するダメージを根本から変えにくい。

【0017】

研究により、本発明は意外にもプラスミノゲンは腎臓のダメージを修復する作用を有し、各ステージの糖尿病性腎症の治療に用いることができることを見出した。

【0018】

我々の研究において、糖尿病マウスに対してプラスミノゲンを３１日間注射した後に、マウスの糸球体間質は明らかに減少している；フィブリンの沈着が明らかに減少している；アポトーシス阻害タンパクの発現が明らかに上昇している。これらの指標の変化はマウス腎臓の損傷が顕著に修復されていることを示し、これはプラスミノゲンが糖尿病性腎臓損傷、糖尿病性腎症に対して顕著な治療作用を有することを示している。

【0019】

これとともに、プラスミノゲンの糖尿病によってもたらされるその他の組織器官の損傷及び病変に対しても明らかな修復及び治療作用を有し、例えば糖尿病によってもたらされる神経損傷、心筋損傷、肝臓損傷及び網膜損傷に対する修復及び治療作用である。プラスミノゲンは糖尿病合併症の治療に新しいアプローチを提供している。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0020】

【非特許文献1】Ｍｄ．Ｓｈａｈｉｄｕｌ Ｉｓｌａｍ，２０１３．Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ｓｉｎｃｅ １９６０ｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．

【非特許文献2】Ｓｅａｑｕｉｓｔ ＥＲ，Ｇｏｅｔｚ ＦＣ，Ｒｉｃｈ Ｓ，Ｂａｒｂｏｓａ Ｊ：Ｆａｍｉｌｉａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３２０：１１６１-１１６５，１９８９．

【非特許文献3】Ｋｒｏｌｅｗｓｋｉ ＡＳ：Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｍａｊｏｒ ａｎｄ ｍｉｎｏｒ ｇｅｎｅ ｅｆｆｅｃｔｓ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ５５：１５８２-１５９６，１９９９．

【非特許文献4】Ｉｙｅｎｇａｒ ＳＫ，Ｆｏｘ ＫＡ，Ｓｃｈａｃｈｅｒｅ Ｍ，Ｍａｎｚｏｏｒ Ｆ，Ｓｌａｕｇｈｔｅｒ ＭＥ，Ｃｏｖｉｃ ＡＭ，Ｏｒｌｏｆｆ ＳＭ，Ｈａｙｄｅｎ ＰＳ，Ｏｌｓｏｎ ＪＭ，Ｓｃｈｅｌｌｉｎｇ ＪＲ，Ｓｅｄｒｏｅ ＪＲ：Ｌｉｎｋａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｌｏｃｉ ｆｏｒ ｅｎｄｓｔａｇｅ ｒｅｎａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｄｕｅ ｔｏ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ １４［Ｓｕｐｐｌ ２］：Ｓ１９５-Ｓ２０１，２００３．

【非特許文献5】Ｙｏｕｎｇ ＢＡ，Ｍａｙｎａｒｄ Ｃ，Ｂｏｙｋｏ ＥＪ：Ｒａｃｉａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ，ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ，ａｎｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｉｎ ａ ｎａｔｉｏｎａｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｅｔｅｒａｎｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ ２６：２３９２-２３９９，２００３．

【非特許文献6】Ｔａｒｎｏｗ Ｌ，Ｒｏｓｓｉｎｇ Ｐ，Ｎｉｅｌｓｅｎ ＦＳ，Ｆａｇｅｒｕｄｄ ＪＡ，Ｐｏｉｒｉｅｒ Ｏ，Ｐａｒｖｉｎｇ ＨＨ：Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ ａｎｄ ｅａｒｌｙ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｃｌｕｓｔｅｒ ｉｎ ｐａｒｅｎｔｓ ｏｆ ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ ２３：３０-３３，２０００．

【非特許文献7】Ｍａｕｅｒ ＳＭ，Ｌａｎｅ Ｐ，Ｚｈｕ Ｄ，Ｆｉｏｒｅｔｔｏ Ｐ，Ｓｔｅｆｆｅｓ ＭＷ：Ｒｅｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ ｉｎ ｍａｎ．Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ Ｓｕｐｐｌ １０：Ｓ１７-Ｓ２０，１９９２．

【非特許文献8】Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ＣＭ ａｎｄ Ｗｅｒｂ，Ｚ．（１９９１）．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ，Ｈａｙ ＥＤ，ｅｄ．（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ），ｐｐ．２５５−３０２．

【非特許文献9】Ｗｅｒｂ，Ｚ．，Ｍａｉｎａｒｄｉ，Ｃ．Ｌ．，Ｖａｔｅｒ，Ｃ．Ａ．，ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ，Ｅ．Ｄ．，Ｊｒ．（１９７７）．Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ａｃｔｉｖｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｔｅｎｔ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｂｙ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ｓｙｎｏｖｉａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２９６，１０１７−１０２３．

【非特許文献10】Ｈｅ，Ｃ．Ｓ．，Ｗｉｌｈｅｌｍ，Ｓ．Ｍ．，Ｐｅｎｔｌａｎｄ，Ａ．Ｐ．，Ｍａｒｍｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｇｒａｎｔ，Ｇ．Ａ．，Ｅｉｓｅｎ，Ａ．Ｚ．，ａｎｄ Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｇ．Ｉ．（１９８９）．Ｔｉｓｓｕｅ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｃａｓｃａｄｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ８６，２６３２−２６３６．

【非特許文献11】Ｓｔｏｐｐｅｌｌｉ，Ｍ．Ｐ．，Ｃｏｒｔｉ，Ａ．，Ｓｏｆｆｉｅｎｔｉｎｉ，Ａ．，Ｃａｓｓａｎｉ，Ｇ．，Ｂｌａｓｉ，Ｆ．，ａｎｄ Ａｓｓｏｉａｎ，Ｒ．Ｋ．（１９８５）．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｔｏ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｎ Ｕ９３７ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ８２，４９３９−４９４３．

【非特許文献12】Ｖａｓｓａｌｌｉ，Ｊ．Ｄ．，Ｂａｃｃｉｎｏ，Ｄ．，ａｎｄ Ｂｅｌｉｎ，Ｄ．（１９８５）．Ａ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍｒ ５５，０００ ｆｏｒｍ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ，ｕｒｏｋｉｎａｓｅ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１００，８６−９２．

【非特許文献13】Ｗｉｍａｎ，Ｂ．ａｎｄ Ｗａｌｌｅｎ，Ｐ．（１９７５）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ“ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ”ａｎｄ“ｌｙｓｉｎｅ”ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＮＨ２−ｔｅｒｍｉｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５０，４８９−４９４．

【非特許文献14】Ｓａｋｓｅｌａ，Ｏ．ａｎｄ Ｒｉｆｋｉｎ，Ｄ．Ｂ．（１９８８）．Ｃｅｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ：ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．４，９３−１２６．

【非特許文献15】Ｒａｕｍ，Ｄ．，Ｍａｒｃｕｓ，Ｄ．，Ａｌｐｅｒ，Ｃ．Ａ．，Ｌｅｖｅｙ，Ｒ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｐ．Ｄ．，ａｎｄ Ｓｔａｒｚｌ，Ｔ．Ｅ．（１９８０）．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ｂｙ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０８，１０３６−１０３７．

【非特許文献16】Ｗａｌｌeｎ Ｐ（１９８０）．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ．Ｉｎ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ，Ｋｌｉｎｅ ＤＬ ａｎｄ Ｒｅｄｄｙ ＫＫＮ，ｅｄｓ．（Ｆｌｏｒｉｄａ：ＣＲＣ．

【非特許文献17】Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，Ｌ．，Ｚａｊｄｅｌ，Ｍ．，Ｃｌａｅｙｓ，Ｈ．，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｔ．Ｅ．，ａｎｄ Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｓ．（１９７５）．Ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ ｉｎ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ：ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ“ｐｒｏ”ｐａｒｔ ｏｆ ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ７２，２５７７−２５８１．

【非特許文献18】Ｃｏｌｌｅｎ，Ｄ．ａｎｄ Ｌｉｊｎｅｎ，Ｈ．Ｒ．（１９９１）．Ｂａｓｉｃ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ．Ｂｌｏｏｄ ７８，３１１４−３１２４．

【非特許文献19】Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｃ．Ｍ．ａｎｄ Ｗｅｒｂ，Ｚ．（１９８９）．Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１，９７４−９８２．

【非特許文献20】Ｍｉｇｎａｔｔｉ，Ｐ．ａｎｄ Ｒｉｆｋｉｎ，Ｄ．Ｂ．（１９９３）．Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｉｎｖａｓｉｏｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ．７３，１６１−１９５．

【非特許文献21】Ｃｏｌｌｅｎ，Ｄ．（２００１）．Ｈａｍ−Ｗａｓｓｅｒｍａｎ ｌｅｃｔｕｒｅ：ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｆｉｂｒｉｎ−ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ．（Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｅｄｕｃ．Ｐｒｏｇｒａｍ．）１−９．

【非特許文献22】Ｒｉｆｋｉｎ，Ｄ．Ｂ．，Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｉ，Ｄ．，Ｂｉｚｉｋ，Ｊ．，Ｑｕａｒｔｏ，Ｎ．，Ｂｌｅｉ，Ｆ．，Ｄｅｎｎｉｓ，Ｐ．，Ｆｌａｕｍｅｎｈａｆｔ，Ｒ．，ａｎｄ Ｍｉｇｎａｔｔｉ，Ｐ．（１９９０）．Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ．Ｄｅｖ．３２，３１３−３１８．

【非特許文献23】Ａｎｄｒｅａｓｅｎ，Ｐ．Ａ．，Ｋｊｏｌｌｅｒ，Ｌ．，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｌ．，ａｎｄ Ｄｕｆｆｙ，Ｍ．Ｊ．（１９９７）．Ｔｈｅ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ：ａ ｒｅｖｉｅｗ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７２，１−２２．

【非特許文献24】Ｒｉｆｋｉｎ，Ｄ．Ｂ．，Ｍａｚｚｉｅｒｉ，Ｒ．，Ｍｕｎｇｅｒ，Ｊ．Ｓ．，Ｎｏｇｕｅｒａ，Ｉ．，ａｎｄ Ｓｕｎｇ，Ｊ．（１９９９）．Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ．ＡＰＭＩＳ １０７，８０−８５．

【非特許文献25】Ｍａｒｄｅｒ Ｖ Ｊ，Ｎｏｖｏｋｈａｔｎｙ Ｖ．Ｄｉｒｅｃｔ ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ，ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，２０１０，８（３）：４３３−４４４．

【非特許文献26】Ｈｕｎｔ Ｊ Ａ，Ｐｅｔｔｅｗａｙ Ｊｒ Ｓ Ｒ，Ｓｃｕｄｅｒｉ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｎ：ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕ−ｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｗｉｔｈ ｐｌａｓｍａ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｌａｓｍｉｎ ［Ｊ］．Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ，２００８，１００（３）：４１３−４１９．

【非特許文献27】Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ Ｌ，Ｃｌａｅｙｓ Ｈ，Ｚａｊｄｅｌ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｌｙｓｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｏｎｅ“ｍｉｎｉ”−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ（ＭＷ，３８，０００）ｂｙ ｅｌａｓｔａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｉｍｉｔｅｄ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ，１９７８，３：１９１−２０９．

【非特許文献28】Ｎａｇａｉ Ｎ，Ｄｅｍａｒｓｉｎ Ｅ，Ｖａｎ Ｈｏｅｆ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏｐｌａｓｍｉｎ：ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，２００３，１（２）：３０７−３１３．

【非特許文献29】Ｊａｅ Ｋｙｕ Ｒｙｕ，Ｍａｒｋ Ａ．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｓａｒａ Ｇ．Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ ｖｉａ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ａｎｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ．ＮＡＴＵＲＥ ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ，２０１５，６：８１６４．

【非特許文献30】Ｄｉｍｉｔｒｉｏｓ Ｄａｖａｌｏｓ，Ｋａｔｅｒｉｎａ Ａｋａｓｓｏｇｌｏｕ．Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ ａｓ ａ ｋｅｙ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０１２．３４（１）：４３−６２．

【非特許文献31】Ｖａｌｖｉ Ｄ，Ｍａｎｎｉｎｏ ＤＭ，Ｍｕｌｌｅｒｏｖａ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ，ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ（ＣＯＰＤ）ａｎｄ ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｉｎ ｔｗｏ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｃｏｈｏｒｔｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃｈｒｏｎ Ｏｂｓｔｒｕｃｔ Ｐｕｌｍｏｎ Ｄｉｓ ２０１２；７：１７３-８２．

【非特許文献32】Ｍｏｕｎｇｊａｒｏｅｎ Ｊ，Ｎｉｍｍａｎｎｉｔ Ｕ，Ｃａｌｌｅｒｙ ＰＳ，Ｗａｎｇ Ｌ，Ａｚａｄ Ｎ，Ｌｉｐｉｐｕｎ Ｖ， Ｃｈａｎｖｏｒａｃｈｏｔｅ Ｐ，Ｒｏｊａｎａｓａｋｕｌ Ｙ（２００６）．Ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｍｅｄｉａｔｅ ｃａｓｐａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｌｉｐｏｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｂｃｌ−２ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ３１９，１０６２-１０６９．

【非特許文献33】Ｗａｎｇ Ｌ，Ｃｈａｎｖｏｒａｃｈｏｔｅ Ｐ，Ｔｏｌｅｄｏ Ｄ，Ｓｔｅｈｌｉｋ Ｃ，Ｍｅｒｃｅｒ ＲＲ，Ｃａｓｔｒａｎｏｖａ Ｖ，Ｒｏｊａｎａｓａｋｕｌ Ｙ（２００８）．Ｐｅｒｏｘｉｄｅ ｉｓ ａ ｋｅｙ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｏｆ Ｂｃｌ−２ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｃｉｓｐｌａｔｉｎｉｎ ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ７３，１１９-１２７．

【非特許文献34】Ｚｗａｒｔ Ｂ，Ｃｉｕｒａｎａ Ｃ，Ｒｅｎｓｉｎｋ Ｉ，Ｍａｎｏｅ Ｒ，Ｈａｃｋ ＣＥ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｏｃｃｕｒｓ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ ｖｉａ ＩｇＭ ａｎｄ ｉｓ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ ｌａｔｅ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｎｅｃｒｏｔｉｃ）ｃｅｌｌｓ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ３７：９５-１０２．

【非特許文献35】Ｚｈａｎｇ Ｍ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ，Ａｌｉｃｏｔ ＥＭ，Ｖｏｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ Ｔ，Ｋｅｓｓｌｅｒ Ｂ，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｌｅｃｔｉｎ ｐａｔｈｗａｙ ｂｙ ｎａｔｕｒａｌ ＩｇＭ ｉｎ ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７７：４７２７-４７３４．

【非特許文献36】Ｋｉｍ ＳＪ，Ｇｅｒｓｈｏｖ Ｄ，Ｍａ Ｘ，Ｂｒｏｔ Ｎ，Ｅｌｋｏｎ ＫＢ（２００２）Ｉ−ＰＬＡ２ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｔｈｅ Ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ Ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｙ Ｎａｔｕｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｍ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９６：６５５-６６５．

【非特許文献37】Ｃｕｎｈａ−Ｖａｚ Ｊ，Ｂｅｒｎａｒｄｅｓ Ｒ：Ｎｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｔｙｐｅ ２．Ｉｎｉｔｉａｌ ｓｔａｇｅｓ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ，Ｐｒｏｇ Ｒｅｔｉｎ Ｅｙｅ Ｒｅｓ ２００５，２４：３５５-３７７．

【非特許文献38】Ｒｏｙ Ｓ，Ｓａｔｏ Ｔ，Ｐａｒｙａｎｉ Ｇ，Ｋａｏ Ｒ：Ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒｅｄｕｃｅｓ ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ ｒｅｔｉｎａｓ ｏｆ ｇａｌａｃｔｏｓｅ−ｆｅｄ ｒａｔｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２００３，５２：１２２９-１２３４．

【非特許文献39】Ｓ．Ｒ．Ｃｈａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｔａｃｔｉｌｅ ａｌｌｏｄｙｎｉａ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｐａｗ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ５３（１９９４）５５−６３．

【非特許文献40】Ｒ．Ｌａｎｇｈｏｒｎ ａｎｄ Ｊ．Ｌ．Ｗｉｌｌｅｓｅｎ．Ｃａｒｄｉａｃ Ｔｒｏｐｏｎｉｎｓ ｉｎ Ｄｏｇｓ ａｎｄ Ｃａｔｓ．Ｊ Ｖｅｔ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ ２０１６；３０：３６-５０．

【非特許文献41】Ｋａｒｍｅｎ Ａ，Ｗｒｏｂｌｅｗｓｋｉ Ｆ，Ｌａｄｕｅ ＪＳ（Ｊａｎ １９５５）．Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．３４（１）：１２６-３１．

【非特許文献42】Ｗａｎｇ ＣＳ，Ｃｈａｎｇ ＴＴ，Ｙａｏ ＷＪ，Ｗａｎｇ ＳＴ，Ｃｈｏｕ Ｐ（Ａｐｒ ２０１２）．Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｌｅｖｅｌｓ ｗｉｔｈｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｒａｎｇｅ ｏｎ ｉｎｃｉｄｅｎｔ ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｏｒｍｏｓａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ＝Ｔａｉｗａｎ Ｙｉ Ｚｈｉ．１１１（４）：２０１-８．

【発明の概要】

【0021】

一方において、本発明は糖尿病性腎症及び／またはその関連疾患を予防、治療及び／または解消する方法に係り、被験者にプラスミノゲンまたはプラスミンを投与することを含む。一方において、本発明はプラスミノゲンの、被験者の糖尿病性腎症及び／またはその関連疾患を予防、治療及び／または解消することにおける用途に係り、被験者に対してプラスミノゲンまたはプラスミンを投与することを含む。

【0022】

一つの実施形態において、前記糖尿病性腎症は、糸球体硬変、糸球体間質増殖を含む糸球体病変；腎細管間質病変；腎間質繊維化、腎細管萎縮、糸球体輸出細動脈透明変性、腎微小血管硬変を含む腎微小血管病変を含む。一つの実施形態において、前記糖尿病性腎症関連疾患は腎臓体積の増大、早期糸球体の高濾過率、間欠性タンパク尿、微量アルブミン尿、大量アルブミン尿、持続性タンパク尿、糸球体濾過率低下、腎細胞損傷、腎臓繊維化、腎臓機能不全、腎不全、尿毒症を含む。一つの実施形態において、前記糖尿病性腎症は糖尿病によって引き起こされる大血管、小血管、微小血管の病変によってもたらされるものである。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有する。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンはＧｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはそれらの任意の組み合わせから選ばれるものである。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは例えば、静脈内、筋肉内、皮下、吸入、ガイドチューブ施用、局所注射、または直腸投与によって全身または局所にて投与される。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは一種類または複数種類の他の薬物と共に投与される。一つの実施形態において、前記他の薬物とは以下を含む：抗糖尿病薬、抗血栓薬、血圧降下薬、高脂血症治療薬、抗心脳血管疾患薬、抗感染薬。

【0023】

一つの実施形態において、前記被験者は哺乳動物で、好ましくはヒトである。

【0024】

一つの実施形態において、前記被験者のプラスミンまたはプラスミノゲンが低下している。具体的に、前記低下は先天的、継発的及び／または局所的である。

【0025】

一つの実施形態において、プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有する。一つの実施形態において、プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２に基づいて、１−１００、１−９０、１−８０、１−７０、１−６０、１−５０、１−４５、１−４０、１−３５、１−３０、１−２５、１−２０、１−１５、１−１０、１−５、１−４、１−３、１−２、１個のアミノ酸を追加、削除及び／または置換したもので、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはＧｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはそれらの任意の組み合わせから選ばれるものである。一つの実施形態において、プラスミノゲンは以下から選ばれる保存的（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）な置換バリアントである：Ｇｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはマイクロプラスミノゲン。一つの実施形態において、プラスミノゲンはヒト天然プラスミノゲンであり、例えば配列２が示すプラスミノゲンのオルソログであり、例えば、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するプラスミノゲンのオルソログであり、例えばゴリラ、アカゲザル、マウス、ウシ、ウマ、イヌに由来するプラスミノゲンのオルソログである。もっとも好ましくは、本発明のプラスミノゲンのアミノ酸配列は配列２、６、８、１０または１２に示される通りである。

【0026】

一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは適切なポリペプチド担体または安定剤と組み合わせて使用する。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは毎日０．０００１−２０００ｍｇ／ｋｇ、０．００１−８００ｍｇ／ｋｇ、０．０１−６００ｍｇ／ｋｇ、０．１−４００ｍｇ／ｋｇ、１−２００ｍｇ／ｋｇ、１−１００ｍｇ／ｋｇ、１０−１００ｍｇ／ｋｇ（体重一キロあたりで計算）または０．０００１−２０００ｍｇ／ｃｍ^２、０．００１−８００ｍｇ／ｃｍ^２、０．０１−６００ｍｇ／ｃｍ^２、０．１−４００ｍｇ／ｃｍ^２、１−２００ｍｇ／ｃｍ^２、１−１００ｍｇ／ｃｍ^２、１０−１００ｍｇ／ｃｍ^２（体表面積平方センチメートルあたりで計算）の用量を投与し、好ましくは少なくとも一回繰り返し、好ましくは毎日投与する。局所投与の場合、前記用量はさらに状況に応じて調整することができる。

【0027】

前記プラスミノゲンは単独で使用することもでき、その他の薬物と共に使用することもできる。前記他の薬物は以下を含むがこれに限られない：抗糖尿病薬物、例えばインスリン、アカルボース、メトホルミン、レパグリニド、ロシグリタゾン、アトルバスタチン等である。

【0028】

一方において、本発明はプラスミノゲンまたはプラスミンの被験者の糖尿病性腎症及び／またはその他の関連疾患を予防、治療及び／または解消する薬物における用途に係る。一方において、本発明は製薬方法に係り、プラスミノゲンまたはプラスミンと薬学上許容し得る担体と共に糖尿病性腎症及び／またはその関連疾患を予防、治療及び／または解消する薬物に製造することを含む。

【0029】

一つの実施形態において、前記糖尿病性腎症は、糸球体硬変、糸球体間質増殖を含む糸球体病変；腎細管間質病変；腎間質繊維化、腎細管萎縮、糸球体輸出動脈透明変性、腎微小血管硬変を含む腎微小血管病変を含む。一つの実施形態において、前記糖尿病性腎症関連疾患は腎臓体積の増大、早期糸球体の高濾過率、間欠性タンパク尿、微量アルブミン尿、大量アルブミン尿、持続性タンパク尿、糸球体濾過率低下、腎細胞損傷、腎臓繊維化、腎臓機能不全、尿毒症を含む。一つの実施形態において、前記糖尿病性腎症は糖尿病によって引き起こされる大血管、小血管、微小血管の病変によってもたらされるものである。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有する。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンはＧｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはそれらの任意の組み合わせから選ばれるものである。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは例えば、静脈内、筋肉内、皮下、吸入、ガイドチューブ施用、局所注射、または直腸投与によって全身または局所にて投与される。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは一種類または複数種類の他の薬物と共に投与される。一つの実施形態において、前記他の薬物とは以下を含む：抗糖尿病薬、抗血栓薬、血圧降下薬、高脂血症治療薬、抗心脳血管疾患薬、抗感染薬。

【0030】

一つの実施形態において、前記被験者は哺乳動物で、好ましくはヒトである。

【0031】

一つの実施形態において、前記被験者のプラスミンまたはプラスミノゲンが低下している。具体的に、前記低下は先天的、継発的及び／または局所的である。

【0032】

一つの実施形態において、プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有するものである。一つの実施形態において、プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２に基づいて、１−１００、１−９０、１−８０、１−７０、１−６０、１−５０、１−４５、１−４０、１−３５、１−３０、１−２５、１−２０、１−１５、１−１０、１−５、１−４、１−３、１−２、１個のアミノ酸を追加、削除及び／または置換したもので、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはＧｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはそれらの任意の組み合わせから選ばれるものである。一つの実施形態において、プラスミノゲンは以下から選ばれる保存的な置換バリアントである：Ｇｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはマイクロプラスミノゲン。一つの実施形態において、プラスミノゲンはヒト天然プラスミノゲンであり、例えば配列２が示すプラスミノゲンのオルソログであり、例えば、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するプラスミノゲンのオルソログであり、例えばゴリラ、アカゲザル、マウス、ウシ、ウマ、イヌに由来するプラスミノゲンのオルソログである。もっとも好ましくは、本発明のプラスミノゲンのアミノ酸配列は配列２、６、８、１０または１２に示される通りである。

【0033】

一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは適切なポリペプチド担体または安定剤と組み合わせて投与される。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは毎日０．０００１−２０００ｍｇ／ｋｇ、０．００１−８００ｍｇ／ｋｇ、０．０１−６００ｍｇ／ｋｇ、０．１−４００ｍｇ／ｋｇ、１−２００ｍｇ／ｋｇ、１−１００ｍｇ／ｋｇ、１０−１００ｍｇ／ｋｇ（体重一キロあたりで計算）または０．０００１−２０００ｍｇ／ｃｍ^２、０．００１−８００ｍｇ／ｃｍ^２、０．０１−６００ｍｇ／ｃｍ^２、０．１−４００ｍｇ／ｃｍ^２、１−２００ｍｇ／ｃｍ^２、１−１００ｍｇ／ｃｍ^２、１０−１００ｍｇ／ｃｍ^２（体表面積平方センチメートルあたりで計算）の用量を投与し、好ましくは少なくとも一回繰り返し、好ましくは毎日投与する。局所投与の場合、前記用量はさらに状況に応じて調整することができる。

【0034】

前記プラスミノゲンは単独で投与することもでき、その他の薬物と組み合わせて投与することもできる。前記他の薬物は以下を含むがこれに限られない：抗糖尿病薬物、例えばインスリン、アカルボース、メトホルミン、レパグリニド、ロシグリタゾン、アトルバスタチン等である。

【0035】

一方において、本発明は糖尿病性腎症及び／またはその他の関連疾患を予防、治療及び／または解消するプラスミノゲンまたはプラスミンに係り、及び糖尿病性腎症及び／またはその他の関連疾患を予防、治療及び／または解消する、プラスミノゲンまたはプラスミンを含有する薬物組成物に係る。

【0036】

一つの実施形態において、前記糖尿病性腎症は、糸球体硬変、糸球体間質増殖を含む糸球体病変；腎細管間質病変；腎間質繊維化、腎細管萎縮、糸球体輸出動脈透明変性、腎微小血管硬変を含む腎微小血管病変を含む。一つの実施形態において、前記糖尿病性腎症関連疾患は腎臓体積の増大、早期糸球体の高濾過率、間欠性タンパク尿、微量アルブミン尿、大量アルブミン尿、持続性タンパク尿、糸球体濾過率低下、腎細胞損傷、腎臓繊維化、腎臓機能不全、尿毒症を含む。一つの実施形態において、前記糖尿病性腎症は糖尿病によって引き起こされる大血管、小血管、微小血管の病変によってもたらされるものである。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有するものである。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンはＧｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはそれらの任意の組み合わせから選ばれるものである。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは例えば、静脈内、筋肉内、皮下、吸入、ガイドチューブ施用、局所注射、または直腸投与によって全身または局所にて投与される。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは一種類または複数種類の他の薬物と組み合わせて投与できる。一つの実施形態において、前記他の薬物とは以下を含む：抗糖尿病薬、抗血栓薬、血圧降下薬、高脂血症治療薬、抗心脳血管疾患薬、抗感染薬。

【0037】

一つの実施形態において、前記被験者は哺乳動物で、好ましくはヒトである。

【0038】

一つの実施形態において、前記被験者のプラスミンまたはプラスミノゲンが低下している。具体的に、前記低下は先天的、継発的及び／または局所的である。

【0039】

一つの実施形態において、プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有する。一つの実施形態において、プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２に基づいて、１−１００、１−９０、１−８０、１−７０、１−６０、１−５０、１−４５、１−４０、１−３５、１−３０、１−２５、１−２０、１−１５、１−１０、１−５、１−４、１−３、１−２、１個のアミノ酸を追加、削除及び／または置換したもので、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはＧｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはそれらの任意の組み合わせから選ばれるものである。一つの実施形態において、プラスミノゲンは以下から選ばれる保存的な置換バリアントである：Ｇｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはマイクロプラスミノゲン。一つの実施形態において、プラスミノゲンはヒト天然プラスミノゲンであり、例えば配列２が示すプラスミノゲンのオルソログであり、例えば、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するプラスミノゲンのオルソログであり、例えばゴリラ、アカゲザル、マウス、ウシ、ウマ、イヌに由来するプラスミノゲンのオルソログである。もっとも好ましくは、本発明のプラスミノゲンのアミノ酸配列は配列２、６、８、１０または１２に示される通りである。

【0040】

一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは適切なポリペプチド担体または安定剤と組み合わせて投与できる。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは毎日０．０００１−２０００ｍｇ／ｋｇ、０．００１−８００ｍｇ／ｋｇ、０．０１−６００ｍｇ／ｋｇ、０．１−４００ｍｇ／ｋｇ、１−２００ｍｇ／ｋｇ、１−１００ｍｇ／ｋｇ、１０−１００ｍｇ／ｋｇ（体重一キロあたりで計算）または０．０００１−２０００ｍｇ／ｃｍ^２、０．００１−８００ｍｇ／ｃｍ^２、０．０１−６００ｍｇ／ｃｍ^２、０．１−４００ｍｇ／ｃｍ^２、１−２００ｍｇ／ｃｍ^２、１−１００ｍｇ／ｃｍ^２、１０−１００ｍｇ／ｃｍ^２（体表面積平方センチメートルあたりで計算）の用量を投与し、好ましくは少なくとも一回繰り返し、好ましくは毎日投与する。局所投与の場合、前記用量はさらに状況に応じて調整することができる。

【0041】

前記プラスミノゲンは単独で使用することもでき、その他の薬物と共に使用することもできる。前記その他の薬物は以下を含むがこれに限られない：抗糖尿病薬物、例えばインスリン、アカルボース、メトホルミン、レパグリニド、ロシグリタゾン、アトルバスタチン等である。

【0042】

一方において、本発明は被験者の糖尿病性腎症及び／またはその関連疾患を予防、治療及び／または解消することに用いる、プラスミノゲンまたはプラスミンを含有する薬物組成物の製品または薬物キットに係る。一つの実施形態において、前記糖尿病性腎症は、糸球体硬変、糸球体間質増殖を含む糸球体病変；腎細管間質病変；腎間質繊維化、腎細管萎縮、糸球体輸出動脈透明変性、腎微小血管硬変を含む腎微小血管病変を含む。一つの実施形態において、前記糖尿病性腎症関連疾患は腎臓体積の増大、早期糸球体の高濾過率、間欠性タンパク尿、微量アルブミン尿、大量アルブミン尿、持続性タンパク尿、糸球体濾過率低下、腎細胞損傷、腎臓繊維化、腎臓機能不全、尿毒症を含む。一つの実施形態において、前記糖尿病性腎症は糖尿病によって引き起こされる大血管、小血管、微小血管の病変によってもたらされるものである。一つの実施形態において、前記フィブリンプラスノゲンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてフィブリンプラスミノゲン活性を有するものである。一つの実施形態において、前記フィブリンプラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含有し、さらに依然としてフィブリンプラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはＧｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはそれらの任意の組み合わせから選ばれるものである。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは例えば、静脈内、筋肉内、皮下、吸入、ガイドチューブ施用、局所注射、または直腸投与によって全身または局所にて投与される。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは一種類または複数種類の他の薬物と共に投与される。一つの実施形態において、前記他の薬物とは以下を含む：抗糖尿病薬、抗血栓薬、血圧降下薬、高脂血症治療薬、抗心脳血管疾患薬、抗感染薬。

【0043】

一つの実施形態において、前記被験者は哺乳動物であり、好ましくはヒトである。

【0044】

一つの実施形態において、前記被験者フィブリンプラスミンまたはプラスミノゲンは低下している。具体的に、前記低下は先天的、続発的及び／または局所的である。

【0045】

一つの実施形態において、プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有するものである。一つの実施形態において、プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２に基づいて、１−１００、１−９０、１−８０、１−７０、１−６０、１−５０、１−４５、１−４０、１−３５、１−３０、１−２５、１−２０、１−１５、１−１０、１−５、１−４、１−３、１−２、１個のアミノ酸を追加、削除及び／または置換したもので、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはＧｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはそれらの任意の組み合わせから選ばれるものである。一つの実施形態において、プラスミノゲンは以下から選ばれる保存的な置換バリアントである：Ｇｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはマイクロプラスミノゲン。一つの実施形態において、プラスミノゲンはヒト天然プラスミノゲンであり、例えば配列２が示すプラスミノゲンのオルソログであり、例えば、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するプラスミノゲンのオルソログであり、例えばゴリラ、アカゲザル、マウス、ウシ、ウマ、イヌに由来するプラスミノゲンのオルソログである。もっとも好ましくは、本発明のプラスミノゲンのアミノ酸配列は配列２、６、８、１０または１２に示される通りである。

【0046】

一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは適切なポリペプチド担体または安定剤と組み合わせて施用できる。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは毎日０．０００１−２０００ｍｇ／ｋｇ、０．００１−８００ｍｇ／ｋｇ、０．０１−６００ｍｇ／ｋｇ、０．１−４００ｍｇ／ｋｇ、１−２００ｍｇ／ｋｇ、１−１００ｍｇ／ｋｇ、１０−１００ｍｇ／ｋｇ（体重一キロあたりで計算）または０．０００１−２０００ｍｇ／ｃｍ^２、０．００１−８００ｍｇ／ｃｍ^２、０．０１−６００ｍｇ／ｃｍ^２、０．１−４００ｍｇ／ｃｍ^２、１−２００ｍｇ／ｃｍ^２、１−１００ｍｇ／ｃｍ^２、１０−１００ｍｇ／ｃｍ^２（体表面積平方センチメートルあたりで計算）の用量を投与し、好ましくは少なくとも一回繰り返し、好ましくは毎日投与する。局所投与の場合、前記用量はさらに状況に応じて調整することができる。

【0047】

前記プラスミノゲンは単独で使用することもでき、その他の薬物と組み合わせて施用することもできる。前記他の薬物は以下を含むがこれに限られない：抗糖尿病薬物、例えばインスリン、アカルボース、メトホルミン、レパグリニド、ロシグリタゾン、アトルバスタチン等である。

【0048】

一つの実施形態において、前記製品または薬物キットは有効量のプラスミノゲン／プラスミンを含有する容器を含む。好ましくは、該製品または薬物キットはさらに一種類または複数種類の他の薬物を含有する容器を含む。該薬物キットはさらにプロトコル（使用説明書）を含むことができ、これは前記プラスミノゲンを糖尿病によって引き起こされる腎症及びその関連疾患の予防及び／または治療に用いることを説明するものであり、さらには以下のように説明できる。即ち、前記プラスミノゲンまたはプラスミンは前記他の薬物を投与する前、投与と同時、及び／または後に投与できる。

【0049】

一方において、本発明はプラスミノゲンまたはプラスミンの、被験者の糖尿病によってもたらされる生体組織及び内臓臓器の損傷（ダメージ）を予防及び／または治療するための薬物、製品、薬物キットの製造における用途に係るものである。一つの実施形態において、前記組織及び内臓臓器の損傷（ダメージ）は大脳、心臓、肝臓、肺臓、腎臓、神経、網膜、皮膚、胃腸管の損傷（ダメージ）を含む。一方において、本発明はプラスミノゲンの被験者の糖尿病合併症を予防及び／または治療するための薬物、製品、薬物キットにおける用途に係る。一つの実施形態において、前記糖尿病合併症は糖尿病によって引き起こされる糖尿病性大脳病変、糖尿病性心臓病変、糖尿病性肝臓病変、糖尿病性腎臓病変、糖尿病性肺臓病変、糖尿病性神経病変、糖尿病網膜症、糖尿病性皮膚病変である。

【0050】

一方において、本発明は製薬方法に係り、プラスミノゲンまたはプラスミンと薬学的に許容し得る担体を、被験者の糖尿病によってもたらされる生体組織及び内臓臓器の損傷（ダメージ）を予防及び／または治療するための薬物、製品、薬物キットに製造することを含む。一つの実施形態において、前記組織及び内臓臓器の損傷（ダメージ）は大脳、心臓、肝臓、肺臓、腎臓、神経、網膜、皮膚、胃腸管の損傷（ダメージ）を含む。一方において、本発明は製薬方法に係り、プラスミノゲンまたはプラスミンと薬学的に許容し得る担体を、被験者の糖尿病合併症を予防及び／または治療するための薬物、製品、薬物キットに製造することを含む。一つの実施形態において、前記糖尿病合併症は糖尿病によって引き起こされる糖尿病性大脳病変、糖尿病性心臓病変、糖尿病性肝臓病変、糖尿病性腎臓病変、糖尿病性肺臓病変、糖尿病性神経病変、糖尿病網膜症、糖尿病性皮膚病変である。

【0051】

一方において、本発明は被験者の糖尿病によってもたらされる生体組織及び内臓臓器の損傷（ダメージ）を予防及び／または治療するためのプラスミノゲンまたはプラスミン、プラスミノゲンまたはプラスミンを含有する組成物、製品、薬物キットに係るものである。一つの実施形態において、前記組織及び内臓臓器の損傷（ダメージ）は大脳、心臓、肝臓、腎臓、肺臓、神経、網膜、胃腸管、皮膚の損傷（ダメージ）を含む。一方において、本発明は被験者の糖尿病合併症を予防及び／または治療するプラスミノゲン、プラスミノゲンを含有する薬物組成物、製品または薬物キットに係る。一つの実施形態において、前記糖尿病合併症は糖尿病によって引き起こされる糖尿病性大脳病変、糖尿病性心臓病変、糖尿病性肝臓病変、糖尿病性肺臓病変、糖尿病性腎臓病変、糖尿病性神経病変、糖尿病網膜症、糖尿病性皮膚病変である。

【0052】

一方において、本発明は被験者の糖尿病によってもたらさる生体組織及び内臓臓器損傷（ダメージ）を予防及び／または治療する方法に係り、被験者にプラスミノゲンまたはプラスミン、プラスミノゲンまたはプラスミンを含有する薬物組成物、製品、薬物キットを投与することを含む。本発明はさらにプラスミノゲンまたはプラスミン、プラスミノゲンまたはプラスミンを含有する薬物組成物、製品、薬物キットの被験者の糖尿病によってもたらされる生体組織及び内臓臓器損傷（ダメージ）を予防及び／または治療する用途に係るものである。一つの実施形態において、前記組織及び内臓臓器の損傷（ダメージ）は大脳、心臓、肝臓、肺臓、腎臓、神経、網膜、胃腸管、皮膚に対する損傷（ダメージ）を含む。一方において、本発明は被験者の糖尿病合併症を予防及び／または治療する方法に係り、被験者にプラスミノゲンまたはプラスミン、プラスミノゲンまたはプラスミンを含有する薬物組成物、製品または薬物キットを投与することを含む。本発明はさらにプラスミノゲンまたはプラスミン、プラスミノゲンまたはプラスミンを含有する薬物組成物、製品または薬物キットの、被験者の糖尿病合併症を予防及び／治療することにおける用途を含む。一つの実施形態において、前記糖尿病合併症は糖尿病によって引き起こされた糖尿病性大脳病変、糖尿病性心臓病変、糖尿病性肝臓病変、糖尿病性肺臓病変、糖尿病性腎臓病変、糖尿病性神経病変、糖尿病網膜症、糖尿病性皮膚病変である。

【0053】

一つの実施形態において、前記被験者プラスミンまたはプラスミノゲンは低下している。具体的には、前記低下は先天的、継発的、及び／または局所的なものである。

【0054】

一つの実施形態において、プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有する。一つの実施形態において、プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２に基づいて、１−１００、１−９０、１−８０、１−７０、１−６０、１−５０、１−４５、１−４０、１−３５、１−３０、１−２５、１−２０、１−１５、１−１０、１−５、１−４、１−３、１−２、１個のアミノ酸を追加、削除及び／または置換したもので、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはＧｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはそれらの任意の組み合わせから選ばれるものである。一つの実施形態において、プラスミノゲンは以下から選ばれる保存的な置換バリアントである：Ｇｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはマイクロプラスミノゲン。一つの実施形態において、プラスミノゲンはヒト天然プラスミノゲンであり、例えば配列２が示すプラスミノゲンのオルソログであり、例えば、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するプラスミノゲンのオルソログであり、例えばゴリラ、アカゲザル、マウス、ウシ、ウマ、イヌに由来するプラスミノゲンのオルソログである。もっとも好ましくは、本発明のプラスミノゲンのアミノ酸配列は配列２、６、８、１０または１２に示される通りである。

【0055】

本発明は本発明の実施形態どうしの技術的特徴のすべての組み合わせを明確にカバーし、且つこれらの組み合わせ後の技術構成は本出願で明確に開示され、前記技術構成が単独且つ明確に開示されているのと一緒である。また、本発明はさらに各実施形態及び要素のすべてのサブの組み合わせをカバーし、さらに本明細書中において開示され、それぞれのサブの組み合わせが単独且つ明確に本明細書中において開示されているのと一緒である。

【図面の簡単な説明】

【0056】

【図1】図１は１４−１５週齢のｄｂ／ｄｂマウスに対してプラスミノゲンを投与した後の体重の変化を示したものである。

【図2】図２は１４−１５週齢のｄｂ／ｄｂマウスに対してプラスミノゲンを連続的に１１日間投与した後の腎臓ＰＡＳ染色の観察結果を示したものである。

【図3】図３は２４−２５週齢のｄｂ／ｄｂマウスに対して予プラスミノゲンを連続的に３１日間投与した後の体重変化を示したものである。

【図4】図４は２４−２５週齢のｄｂ／ｄｂマウスに対してプラスミノゲンを連続的に３１日間投与した後の腎臓ＰＡＳ染色の観察結果を示したものである。

【図5】図５は２４−２５週齢のｄｂ／ｄｂマウスに対してプラスミノゲンを連続的に３１日間投与した後の腎臓ＨＥ染色の観察結果を示したものである。

【図6】図６は２４−２５週齢のｄｂ／ｄｂマウスに対してプラスミノゲンを連続的に３１日間投与した後の腎臓フィブリン免疫染色の観察結果を示したものである。

【図7】図７は２４−２５週齢のｄｂ／ｄｂマウスに対してプラスミノゲンを連続的に３１日間投与した後の腎臓Ｂｃｌ−２免疫染色の観察結果を示したものである。

【図8】図８は２４−２５週齢のｄｂ／ｄｂマウスに対してプラスミノゲンを連続的に３１日間投与した後の腎臓ＩｇＭ免疫染色の観察結果を示したものである。

【図9】図９は２４−２５週齢のｄｂ／ｄｂマウスに対してプラスミノゲンを連続的に３１日間投与した後の肝臓フィブリン免疫染色の観察結果を示したものである。

【図10】図１０は２４−２５週齢のｄｂ／ｄｂマウスに対してプラスミノゲンを連続的に３１日間投与した後の肝臓Ｆ４／８０免疫染色の観察結果を示したものである。

【図11】図１１は２４−２５週齢のｄｂ／ｄｂマウスに対してプラスミノゲンを連続的に３１日間投与した後の網膜ＰＡＳ染色の観察結果を示したものである。

【図12】図１２は２４−２５週齢のｄｂ／ｄｂマウスに対してプラスミノゲンを連続的に１５日間投与した後の血清中Ｄ−二量体の含有量の測定結果を示したものである。

【図13】図１３は２４−２５週齢のｄｂ／ｄｂマウスに対してプラスミノゲン投与後の０、４、７、１１、１６日目に機械的接触によって誘発される疼痛に対する応答能力の測定結果を示したものである。

【図14】図１４は２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂマウスに対してプラスミノゲンを投与した後の０、４、７、１１、１６日目に行った冷刺激に対する感知能力の測定結果を示したものである。

【図15】図１５は２４−２５週齢のｄｂ／ｄｂマウスに対してプラスミノゲンを３１日間投与後の血清心筋トロポニンＩの濃度の測定結果を示したものである。

【図16】図１６は２４−２５週の糖尿病後期神経損傷マウスに対してプラスミノゲンを１５日間投与した後の坐骨神経フィブリンの免疫組織染色の観察結果を示したものである。

【図17】図１７は２４−２５週の糖尿病マウスに対してプラスミノゲンを３１日間投与した後の血清グルタミン酸ピルビン酸アミノ基転移酵素ＡＬＴの測定結果を示したものである。

【発明を実施するための形態】

【0057】

１．定義
「糖尿病」は遺伝的要素、免疫機能の乱れ、微生物感染及びその毒素、フリーラジカル毒素、精神要因などの各種病気誘発因子が生体に作用することによってもたらされる、インスリン機能減退、インスリン抵抗などによって引き起こされる糖、タンパク質、脂肪、水及び電解質等の一連の代謝に乱れが生じる症候群であり、臨床的には高血糖を主な特徴とする。

【0058】

「糖尿病合併症」は糖尿病プロセスにおける血糖のコントロール不良によってもたらされる身体のその他の臓器または組織のダメージまたは機能障害であり、そのうちの臓器とは肝臓、腎臓、心臓、網膜、神経系のダメージまたは機能障害等を含む。世界保健機関（ＷＨＯ）の統計によれば、糖尿病合併症は１００種類以上あり、現在における合併症が最も多い疾患である。

【0059】

「糖尿病性微小血管障害」とは糖尿病患者の生体の各臓器または組織の微小循環において異なる程度の異常がもたらす微小血管障害である。微小血管障害が形成するプロセスは概ね以下である：微小循環の機能性改変、内皮損傷、基膜の厚み増大、血液粘度の上昇、赤血球の凝集、血小板の粘着及び凝集、最終的には微小血栓形成及び／または微小血管閉塞をもたらす。

【0060】

前記の二種類の「糖尿病性血管病変」は組織または器官の局所の血管損傷、血流不順、細胞の酸素欠、血液凝塊の形成、血栓及び炎症をもたらし、さらに周辺の組織及び器官の機能を影響し、これにより「糖尿病合併症」をもたらす。そのため、本発明の「糖尿病性血管病変」及び「糖尿病合併症」という用語は糖尿病によって引き起こされる血栓及び微小血栓、及びそれが引き起こす器官、組織病変をカバーしている。

【0061】

糖尿病は全世界における発病率及び死亡率の主な原因であり、約４０％の糖尿病患者が糖尿病性腎症にまで進行し、腎臓透析または腎臓移植を必要とする。糖尿病は末期腎臓障害の主な原因であり、そのため、どの糖尿病患者も糖尿病性腎症にまで進行するリスクを有する。

【0062】

「糖尿病性腎症」は「糖尿病腎症」とも呼ばれ、糖尿病微小血管合併症であり、主に糖尿病性糸球体硬化症といい、これは血管損傷を主とする糸球体の病変であり、タンパク尿、高血圧、むくみ、糸球体硬化症、血管構造変化及び細管間質性疾患（ｔｕｂｕｌｏｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）を含むことを特徴とする。

【0063】

「プラスミン」は血液中に存在する非常に重要な酵素であり、フィブリン凝塊をフィブリン分解生成物及びＤ−二量体に加水分解する。

【0064】

「プラスミノゲン」はプラスミンの酵素前駆体の形であり、ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔ中の配列に基づいて、シグナルペプチドの天然ヒト由来プラスミノゲンのアミノ酸配列（配列４）は計算によれば８１０個のアミノ酸からなり、分子量は約９２ｋＤであり、主に肝臓において合成され且つ血液中で循環できる糖タンパク質であり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列３に示される通りである。フルサイズのプラスミノゲンは七つのドメインを含む：Ｃ末端に位置するセリンプロテアーゼドメイン、Ｎ末端に位置するＰａｎ Ａｐｐｌｅ（ＰＡｐ）ドメイン及び５つのＫｒｉｎｇｌｅドメイン（Ｋｒｉｎｇｌｅ１−５）を含む。ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔ中の配列を参照すれば、そのシグナルペプチドは残基Ｍｅｔ１−Ｇｌｙ１９を含み、Ｐａｐは残基Ｇｌｕ２０−Ｖａｌ９８を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ１は残基Ｃｙｓ１０３−Ｃｙｓ１８１を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ２は残基Ｇｌｕ１８４−Ｃｙｓ２６２を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ３は残基Ｃｙｓ２７５−Ｃｙｓ３５２を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ４は残基Ｃｙｓ３７７−Ｃｙｓ４５４を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ５は残基Ｃｙｓ４８１−Ｃｙｓ５６０を含む。ＮＣＢＩデータによれば、セリンプロテアーゼドメインは残基Ｖａｌ５８１−Ａｒｇ８０４を含む。

【0065】

Ｇｌｕ−プラスミノゲンは天然のフルサイズのプラスミノゲンであり、７９１個のアミノ酸からなる（１９個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含まない）。該配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列１に示される通りであり、そのアミノ酸配列は配列２に示される通りである。体内において、さらにＧｌｕ−プラスミノゲンの第７６−７７位のアミノ酸の位置で加水分解することにより形成されたＬｙｓ−プラスミノゲンが存在し、例えば配列６に示されるものであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列５が示す通りである。δ−プラスミノゲン（δ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はフルサイズのプラスミノゲンにＫｒｉｎｇｌｅ２−Ｋｒｉｎｇｌｅ５構造の欠損が生じているフラグメントであり、Ｋｒｉｎｇｌｅ１及びセリンプロテアーゼドメインしか含有せず（非特許文献２５，２６）、δ−プラスミノゲンのアミノ酸配列（配列８）を報告している文献があり（非特許文献２６）、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は例えば配列７である。ミニプラスミノゲン（Ｍｉｎｉ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はＫｒｉｎｇｌｅ５及びセリンプロテアーゼドメインからなり、残基Ｖａｌ４４３−Ａｓｎ７９１（シグナルペプチドＧｌｕ−プラスミノゲン配列を含まないＧｌｕ残基を開始アミノ酸とする）について文献が報告しており（非特許文献２７）、そのアミノ酸配列は配列１０に示される通りであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列９が示す通りである。しかしマイクロプラスミノゲン（Ｍｉｃｒｏ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はセリンプロテアーゼドメインのみ含有し、そのアミノ酸配列は残基Ａｌａ５４３−Ａｓｎ７９１（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ−プラスミノゲン配列のＧｌｕ残基は開始アミノ酸である）と文献が報告し（非特許文献２８）、特許文献ＣＮ１０２１５４２５３Ａはそれが残基Ｌｙｓ５３１−Ａｓｎ７９１を含むと開示し（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ−プラスミノゲン配列のＧｌｕ残基を開始アミノ酸とする）、本特許の配列は特許文献ＣＮ１０２１５４２５３Ａを参照でき、そのアミノ酸配列は配列１２に示される通りであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列１１に示される通りである。

【0066】

本発明の「プラスミン」と「フィブリンプラスミン」、「繊維タンパクプラスミン」は互いに置き換えて使用でき、その意味は同じである。「プラスミノゲン」と「フィブリンプラスミノゲン」、「繊維タンパクプラスミノゲン」は互いに置き換えて使用でき、その意味は同じである。

【0067】

当業者は以下のように理解できる。本発明のプラスミノゲンのすべての技術構成はプラスミンに適用でき、そのため、本発明に記載の技術構成はプラスミノゲン及びプラスミンをカバーするものである。

【0068】

循環プロセスにおいて、プラスミノゲンは閉鎖した非活性コンフォメーションであるが、血栓または細胞表面に結合した際、プラスミノゲン活性化剤（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ，ＰＡ）の介在下において、開放性のコンフォメーションを有する活性プラスミンとなる。活性を有するプラスミンはさらにフィブリン凝塊をフィブリン分解生成物及びＤ−二量体に加水分解させ、これにより血栓を溶解させる。そのうちプラスミノゲンのＰａｐドメインはプラスミノゲンを非活性閉鎖コンフォメーションにする重要な決定クラスターであり、しかしＫＲドメインは受容体及び基質上のリジン残基と結合できるものである。プラスミノゲン活性化剤としての酵素は、既に複数種類知られ、以下を含む：組織プラスミノゲン活性化剤（ｔＰＡ）、ウロキナーゼプラスミノゲン活性化剤（ｕＰＡ）、カリクレイン及び凝結因子ＸＩＩ（ハーゲマン因子）などである。

【0069】

「プラスミノゲン活性フラグメント」とはプラスミノゲンタンパク質において、基質中のターゲット配列と結合してタンパク質加水分解機能を発揮できる活性フラグメントである。本発明はプラスミノゲンの技術構成に係り、プラスミノゲン活性フラグメントでプラスミノゲンの代替とする技術構成を含む。本発明に記載のプラスミノゲン活性フラグメントはプラスミノゲンのセリンプロテアーゼドメインを含むタンパク質であり、好ましくは、本発明に記載のプラスミノゲン活性フラグメントは配列１４、配列１４と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性のアミノ酸配列を含有するタンパク質を含むものである。そのため、本発明に記載のプラスミノゲンは該プラスミノゲン活性フラグメントを含み、且つ依然として該プラスミノゲン活性を有するタンパク質を含む。

【0070】

現在、血液中のプラスミノゲン及びその活性測定方法は以下を含む：組織フィブリンプラスミノゲン活性化剤の活性に対する測定（ｔ−ＰＡＡ）、血漿組織プラスミノゲン活性化剤抗原に対する測定（ｔ−ＰＡＡｇ）、血漿組織プラスミノゲン活性に対する測定（ｐｌｇＡ）、血漿組織プラスミノゲン抗原に対する測定（ｐｌｇＡｇ）、血漿組織プラスミノゲン活性化剤の阻害物活性に対する測定、血漿組織プラスミノゲン活性化剤の阻害物抗原に対する測定、血漿プラスミン−抗プラスミン複合物に対する測定（ＰＡＰ）。最もよく見られる測定方法は発色基質法である：測定対象の血漿中にストレプトキナーゼ（ＳＫ）と発光基質を添加し、測定対象の血漿中のＰＬＧはＳＫの作用下においてプラスミンとなり、後者は発光基質に作用し、それから分光光度計で測定し、吸光度の増加はプラスミノゲンの活性と正比例関係となる。この他にも免疫化学法、ゲル電気泳動法、免疫比濁法、放射免疫拡散法などを用いて血液中のフィブリンプラスミノゲン活性に対して測定を行うことができる。

【0071】

「オルソロジー（ｏｒｔｈｏｌｏｇｙ）」とは異なる種どうしのオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）であり、タンパク質の相同物もＤＮＡの相同物も含む。それは具体的に異なる種どうしの同じ祖先の遺伝子から進化して得られるタンパク質または遺伝子を言う。本発明のプラスミノゲンはヒト天然プラスミノゲンを含み、さらには異なる種に由来する、プラスミノゲン活性を有するプラスミノゲン直系同源物または直系同系物を含む。

【0072】

「保存的置換バリアント」とはそのうちの一つの指定されたアミノ酸残基が改変されたがタンパク質または酵素の全体のコンフォメーション及び機能を変えないものであり、これは類似の特性（例えば酸性、アルカリ性、疎水性など）のアミノ酸でペアレントタンパク質中のアミノ酸配列中のアミノ酸を置換するものを含むがこれらに限られない。類似の性質を有するアミノ酸は知られている通りである。例えば、アルギニン、ヒスチジン及びリジンは親水性のアルカリ性アミノ酸であり且つ互いに置き換えることができる。同じように、イソロイシンは疎水アミノ酸であり、ロイシン、メチオニンまたはバリンによって置換されることができる。そのため、機能の類似する二つのタンパク質またはアミノ酸配列の類似性は異なる可能性もある。例えば、ＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づいて７０％〜９９％の類似性（同一性）を有する。「保存的置換バリアント」はさらにＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムに基づいて６０％以上のアミノ酸同一性を有するポリペプチドまたは酵素であり、７５％以上に達すればさらによく、最も好ましくは８５％以上に達し、さらには９０％以上に達するのが最も好ましく、さらに天然またはペアレントタンパク質または酵素と比較して同じまたは基本的に類似する性質または機能を有する。

【0073】

「分離された」プラスミノゲンとは天然環境から分離及び／または回収されたプラスミノゲンタンパク質である。いくつかの実施形態において、前記プラスミノゲンは（１）９０％を超える、９５％を超える、または９８％を超える純度（重量で計算した場合）になるまで精製し、例えばＬｏｗｒｙ法によって決まるもので、例えば９９％（重量で計算した場合）を超えるまで精製する、（２）少なくともスピニングカップ配列分析装置によりＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基が得られる程度になる精製する、または（３）同質性になるまで精製する。該同質性はクマシーブリリアントブルーまたは銀染色により還元性または非還元性条件下のドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミノゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって決まるものである。分離されたプラスミノゲンはバイオエンジニアリング技術により組み換え細胞から製造することができ、さらに少なくとも一つの精製ステップで分離されたプラスミノゲンを含む。

【0074】

用語の「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は本明細書において互いに置き換えて使用でき、いかなる長さのアミノ酸の重合体をも指し、遺伝的にコードされた及び非遺伝的にコードされたアミノ酸、化学的または生化学的に修飾されまたは派生したアミノ酸、及び修飾されたペプチド主鎖を有するポリペプチドを含む。該用語は融合タンパク質を含み、異種性アミノ酸配列を有する融合タンパク質を含むがこれに限られず、異種性と同種性由来のリーダー配列（Ｎ端メチオニン残基を有するか有しない）を含む融合物；等々である。

【0075】

参照ペプチド配列の「アミノ酸配列同一性パーセンテージ（％）」の定義は、必要な時にギャップを導入することで最大のパーセンテージ配列の同一性を実現した後、如何なる保存的な置換も配列同一性の一部として見なさない場合、候補配列中における参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同じアミノ酸残基のパーセンテージである。パーセンテージのアミノ酸配列の同一性を測定することを目的とした比較は本分野の技術範囲における複数種類の方式によって実現でき、例えば公衆が入手できるコンピュータソフトウエア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアによって実現できる。当業者は引用配列の適切なパラメータを決めることができ、比較対象の配列のフルサイズを比較することで最大比較の要求を実現するための如何なるアルゴリズムも含む。しかし、本発明の目的のために、アミノ酸配列の同一性パーセンテージは配列比較コンピュータソフトウエアＡＬＩＧＮ−２により得られるものである。

【0076】

ＡＬＩＧＮ−２を用いることによりアミノ酸配列を比較する場合、アミノ酸配列Ａと所定のアミノ酸配列Ｂのアミノ酸配列同一性％（または所定のアミノ酸配列Ｂのあるアミノ酸配列と同一性を有する所定のアミノ酸配列Ａの占める％）は以下のように計算される：
分数Ｘ／Ｙ×１００

【0077】

そのうちＸは配列比較プログラムＡＬＩＧＮ−２において該プログラムのＡ及びＢの比較において同一でマッチングすると評価したアミノ酸残基の数であり、且つそのうちＹはＢにおけるアミノ酸残基の総数である。以下のように理解するべきである：アミノ酸配列Ａの長さとアミノ酸配列Ｂの長さが等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列の同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％とは異なる。明確に説明した場合を除き、本文中において使用するすべてのアミノ酸配列同一性値％は前記の段落に記載の通りであり、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムによって得られるものである。

【0078】

本文において使用されているように、用語の「治療」及び「処理」は期待される薬理及び／または生理的効果が得られることを言う。前記効果は疾患またはその症状を完全または一部予防すること、及び／または疾患及び／またはその症状を一部または完全に治癒するものとすることができる。さらに以下を含む：（ａ）疾病が被験者の体内で発生することを予防し、前記被験者は疾患の要因を持っているが、該疾患を有すると診断されていない状況である；（ｂ）疾患を抑制し、その形成を阻害する；及び（ｃ）疾患及び／またはその症状を減軽し、即ち疾患及び／またはその症状を減退させる。

【0079】

用語の「個体」、「被験者」及び「患者」は本明細書中において互いに置き換えて使用でき、哺乳動物を指し、ネズミ（ラット、マウス）、ヒト以外の霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄動物（例えばウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）などを含むがこれらに限られない。

【0080】

「治療上有効量」または「有効量」とは、哺乳動物またはその他の被験者に投与して疾患の治療に用いられる際に疾患の前記予防及び／または治療を実現できるプラスミノゲンの量である。「治療上有効量」は使用するプラスミノゲン、治療しようとする被験者の疾患及び／または症状の重症度及び年齢、体重などに従って変化するものである。

【0081】

２．本発明のプラスミノゲンの製造
プラスミノゲンは自然界から分離及び精製され、治療の用途に用いられるものであり、さらには標準的な化学ペプチド合成技術によって合成することができる。化学的手法によりポリペプチドを合成する際、液相または固相で合成を行うことができる。固相ポリペプチド合成（ＳＰＰＳ）（配列のＣ末端アミノ酸を不溶性支持体に附着させ、順番に配列中の残りのアミノ酸を添加する）はプラスミノゲンの化学的合成に適したものである。各種形式のＳＰＰＳ、例えばＦｍｏｃ及びＢｏｃは、プラスミノゲンの合成に用いることができる。固相合成に用いられる技術は以下に記載されている：Ｂａｒａｎｙ及びＳｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；３−２８４ページ、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ．第二巻：Ｓｐｅｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ Ａ．，Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，ｔら Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５６（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．（１９８４）；及びＧａｎｅｓａｎ Ａ．２００６Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ．Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．６：３−１０及びＣａｍａｒｅｒｏ ＪＡら ２００５Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｌｅｔｔ．１２：７２３−８。簡単に言えば、その上にペプチド鎖が構築されている機能性ユニットにより不溶性の多孔ビーズを処理する。カップリング／脱保護の繰り返し循環後に、附着した固相の遊離Ｎ末端アミンと単一のＮ保護を受けているアミノ酸ユニットをカップリングさせる。それから、該ユニットを脱保護し、他のアミノ酸と接続する新しいＮ末端アミンを露出させる。ペプチドを固相上に固定したままにし、それからそれを切除する。

【0082】

標準的な組み換え方法により本発明のプラスミノゲンを生産する。例えば、プラスミノゲンをコードする核酸を発現ベクター中に挿入し、それと発現ベクター中の制御配列を操作可能に接続させる。発現制御配列はプロモーター（例えば天然に関連されているプロモーター、または異種由来のプロモーター）、シグナル配列、エンハンサー素子及び転写終了配列を含むが、これらに限られない。発現の制御はベクター中の真核プロモーター系とすることができ、前記ベクターは真核宿主細胞（例えばＣＯＳまたはＣＨＯ細胞）を形質転換またはトランスフェクションさせる。一旦ベクターを適切な宿主に導入すれば、ヌクレオチド配列の高レベル発現及びプラスミノゲンの収集及び精製の条件下において宿主を維持できる。

【0083】

適切な発現ベクターは通常宿主体内において附加体または宿主染色体ＤＮＡの整合部分として複製される。通常、発現ベクターは選択マーカー（例えばアンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性またはネオマイシン耐性）を含み、外部由来に期待されるＤＮＡ配列によって形質転換されたそれらの細胞に対して測定を行うことに有用である。

【0084】

大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）はターゲット抗体をコードするポリヌクレオチドをクローンする原核宿主細胞の例である。その他の使用に適した微生物宿主は桿菌を含み、例えばバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びその他の腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えばサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、及び各種シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種である。これらの原核宿主において、発現ベクターを生成でき、通常は宿主細胞と許容する発現制御配列（例えば複製開始点）を含むものである。また、多くの公知のプロモーターが存在し、例えば乳糖プロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系、またはファージλ由来のプロモーター系である。プロモーターは通常発現を制御し、遺伝子配列を操縦する場合、さらにリボソームの結合位置配列を有し、転写及び翻訳を起動させてもよい。

【0085】

その他の微生物、例えば酵母も発現に用いることができる。酵母（例えば出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））及びピキア（Ｐｉｃｈｉａ）が適した酵母宿主細胞の例であり、そのうちの適切な担体は必要に応じて発現制御配列（例えばプロモーター）、複製開始点、終止配列など含む。典型的なプロモーターは３−ホスホグリセリン酸キナーゼ及びその他の糖分解酵素を含む。誘導型酵母はエタノール脱水素酵素、イソ細胞色素Ｃ、及び麦芽糖とガラクトースの利用のための酵素のプロモーターによって起動される。

【0086】

微生物以外に、哺乳動物細胞（例えば体外細胞培養物中において培養された哺乳動物細胞）も本発明のプラスミノゲンの発現に用いることができる（例えばターゲット−Ｔａｕ抗体をコードするポリヌクレオチド）。例えばＷｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）参照。適した哺乳動物宿主細胞はＣＨＯ細胞系、各種Ｃｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系、及び形質転換されたＢ細胞またはハイブリドーマを含む。これらの細胞に用いられる発現ベクターは発現制御配列、例えば複製開始点、プロモーター、及びエンハンサー（Ｑｕｅｅｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））、及び必要とされる加工情報位置、例えばリボソームの結合位置、ＲＮＡの切断位置、ポリアデノシン酸化位置、及び転写終止子配列を含むことができる。適切な発現制御配列の例はウサギ免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウィルス、サイトメガロウイルスなどの派生のプロモーターである。Ｃｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照すること。

【0087】

一旦合成（化学または組み換え式）されれば、本分野の標準的な手順、例えば硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィー、高速液相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ゲル電気泳動などにより本発明に記載のプラスミノゲンを精製することができる。該プラスミノゲンは基本的に純粋なものであり、例えば少なくとも約８０％から８５％の純度で、少なくとも約８５％〜９０％の純度で、少なくとも約９０％〜９５％の純度で、または９８％〜９９％の純度またはさらに純度が高いものであり、例えば汚染物を含まず、前記汚染物は例えば細胞砕片、ターゲット抗体以外の大分子などである。

【0088】

３．薬物配合剤
必要とする純度のプラスミノゲンと選択可能な薬用担体、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．ｅｄ．（１９８０））を混合して凍結乾燥製剤または水溶液を形成して治療用の配合剤を得る。許容可能な担体、賦形剤、安定剤は所要の用量及び濃度下において被験者に対して毒性がなく、さらに例えばリン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸などの緩衝剤を含む。抗酸化剤はアスコルビン酸和メチオニンを含む；防腐剤（例えばベンジルジメチルステアリルアンモニウムクロリド水和物；塩化ヘキサメチレンジアミン；塩化ベンザルコニウム（ｂｅｎｚａｌｋｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブタノールまたはベンジルエタノール；アルキルパラヒドロキシ安息香酸エステル、例えばメチルまたはプロピルのパラヒドロキシ安息香酸エステル；ピロカテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンチルエタノール；ｍ−クレゾール）；低分子量ポリペプチド（少なくとも１０個の残基を有するもの）；タンパク質例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポリゼニールピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンである；単糖、二糖及びその他の炭水化物はブドウ糖、マンノース、またはデキストリンを含む；キレート剤は例えばＥＤＴＡである；糖類は例えばショ糖、マンニトール、フコースまたはソルビトールである；塩形成イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えば亜鉛−タンパク複合体）；及び／または非イオン界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。好ましくは凍結乾燥された抗−ＶＥＧＦ抗体配合剤であり、ＷＯ ９７／０４８０１に記載されているとおりであり、本明細書において参考とされるものである。

【0089】

本発明の配合剤は治療を必要とする具体的な症状の必要とする一種類以上の活性化合物を含有してもよく、好ましくは活性が相補的で互いに副作用を有しないものである。例えば、血圧降下薬、抗不整脈薬、糖尿病治療薬等である。

【0090】

本発明のプラスミノゲンは例えば凝集技術または界面重合によって作られるマイクロカプセル中に内包することができ、例えば、膠質薬物輸送系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン剤、ナノ粒子及びナノカプセル）中に入れまたはエマルジョン状液中のヒドロキシメチルセルロースまたはゲルーマイクロカプセル及びポリ―（メタアクリル酸メチル）マイクロカプセル中に入れることができる。これらの技術は以下に開示されている。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）。

【0091】

体内に投与することに用いられる本発明のプラスミノゲンは必ず無菌である必要がある。これは凍結乾燥及び再度配合する前または後に除菌濾過膜で濾過することで容易に実現できる。

【0092】

本発明のプラスミノゲンは緩衝製剤を調製できる。緩衝製剤の適切な実例は一定の形状を有し且つ糖タンパクを含む固体の疎水性重合体の半透過基質を含み、例えば膜またはマイクロカプセルである。緩衝基質の実例はポリエステル、水性ゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタアクリル酸エステル）（Ｌａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２））またはポリ（ビニールエタノール）、ポリラクチド（米国特許３７７３９１９，ＥＰ ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγメチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体（Ｓｉｄｍａｎ，ら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７（１９８３）），分解できないエチレン−ビニルアセテート（ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｖｉｎｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）（Ｌａｎｇｅｒ，ら，出所は前記と同じ）、または分解可能な乳酸−ヒドロキシ酢酸共重合体、例えばＬｕｐｒｏｎ ＤｅｐｏｔＴＭ（乳酸−ヒドロキシ酢酸共重合体及びリュープロレリン（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）酢酸エステルからなる注射可能なミクロスフェア体）、及びポリＤ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。重合体、例えばエチレン−酢酸エチル及び乳酸−ヒドロキシ酢酸は、持続的に１００日間以上分子を放出することができ、しかしいくつかの水性ゲルがタンパク質を放出する時間は比較的短い。関連のメカニズムに応じてタンパク質を安定化させる合理的なストラテジーにより設計できる。例えば、凝集のメカニズムが硫化ジスルフィド結合の交換によって分子間Ｓ−Ｓ結合を形成するであれば、メルカプト基残基を修飾することにより、酸性溶液中から凍結乾燥させ、湿度を制御し、適切な添加剤を用いて、及び特定の重合体基質組成物を開発することで安定化を実現できる。

【0093】

４．投与及び使用量
異なる方式、例えば静脈内、腹膜内、皮下、頭蓋骨内、髄腔内、動脈内（例えば頸動脈）、筋肉内、鼻内、体表または皮内投与または脊髄または脳内輸送により本発明の薬物組成物の投与を実現できる。エアロゾル製剤例えば鼻噴霧製剤は活性剤を含有する精製した水性またはその他の溶液及び防腐剤と等張剤を含有する。このような製剤を鼻粘膜と許容し得るｐＨ及び等張状態に調整する。

【0094】

一部の場合において、以下の方式により本発明のプラスミノゲン薬物組成物を修飾または配合することができ、これにより血液脳関門を通過できる能力を提供する。各種の腸内及び胃腸外の投与経路、内服、静脈内等を用いて患者に対して血栓及び／または血栓関連疾患を患っている個体に対してこのようなプラスミノゲンの組成物を投与することを含む。

【0095】

胃腸外での投与に用いられる製造物は無菌水性または非水性溶液、懸濁液及び乳剤を含む。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、例えばオリーブオイルのような植物油、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は水、エタノール性／水性溶液、乳剤または懸濁液を含み、食塩水及び緩衝媒介を含む。胃腸外媒介物は塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、または固定油である。静脈内媒介物は液体及び栄養補充物、電気分解補充物などを含む。されには防腐剤及びその他の添加剤、例えば抗微生物製剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなども存在してもよい。

【0096】

いくつかの実施形態において、本発明のプラスミノゲンは血液脳関門の通過を促進する薬剤と配合されている。いくつかの場合において、本発明のプラスミノゲンは直接またはアダプターにより血液脳関門の通過を促進する担体分子、ペプチドまたはタンパク質と融合する。一部の実施形態において、本発明のプラスミノゲンは内在性血液脳関門（ＢＢＢ）受容体に結合するポリペプチドと融合する。プラスミノゲンと内在性血液脳関門受容体に結合するポリペプチドは、ＢＢＢの通過を促進する。内在性血液脳関門（ＢＢＢ）受容体に結合するポリペプチドは抗体、例えばモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントを含み、それは特異的に内在性ＢＢＢ受容体に結合する。適切な内在性ＢＢＢ受容体はインスリン受容体を含むがこれに限られず、抗体はリポソームに内包されたものである。例えば米国特許公開書類Ｎｏ．２００９／０１５６４９８を参照すること。

【0097】

医療関係者は各種臨床的要素により用量案を決めることができる。例えば医学分野で公知のように、任意の患者の用量は複数の要素によって決められ、これらの要素は患者の体型、体表面積、年齢、投与される具体的な化合物、性別、投与回数及び経路、全体の健康度、及び同時に投与するその他の薬物を含む。本発明が含有するプラスミノゲンの薬物組成物の用量の範囲は例えば被験者体重に対して毎日約０．０００１〜２０００ｍｇ／ｋｇであり、または約０．００１〜５００ｍｇ／ｋｇ（例えば０．０２ｍｇ／ｋｇ，０．２５ｍｇ／ｋｇ，０．５ｍｇ／ｋｇ，０．７５ｍｇ／ｋｇ，１０ｍｇ／ｋｇ，５０ｍｇ／ｋｇなど）とすることができる。例えば、用量は１ｍｇ／ｋｇ体重または５０ｍｇ／ｋｇ体重または１−５０ｍｇ／ｋｇの範囲とすることができ、または少なくとも１ｍｇ／ｋｇである。この例示性の範囲より高いまたは低い用量もカバーされ、特に前記の要素を考慮した場合である。前記範囲中の中間用量も本発明の範囲内に含まれるものである。被験者は毎日、隔日、毎週または経験分析によって決められた任意のスケジュール表に従ってこのような用量を投与できる。例示的な用量のスケジュール表は連続数日１−１０ｍｇ／ｋｇ投与することである。本発明の薬物の投与過程において血栓及びその関連疾患の治療効果及び安全性はリアルタイムに評価、定期的に評価すべきである。

【0098】

５．治療の効力
本発明の一つの実施形態はプラスミノゲンを用いて被験者を治療した後、治療効力及び治療安全性に対して判断を行うことに係る。その臨床上における治療効力を判断する方法は以下の指標を測定することにより腎臓機能を評価することを含むが、これらに限られない：血清クレアチニンレベル、クレアチニン除去率、２４−時間尿タンパク排出率（ＵＡＥＲ）、糸球体濾過率、尿アルブミン／クレアチニン比、アルブミン分泌率及び腎臓生検等である。例えば、糸球体濾過率は糸球体の過剰濾過及び過剰灌流の状況を示すことができ、これは糖尿病性腎症の早期症状の緩和の程度を示すものである。糸球体濾過率は腎臓から１分間に生じる濾液の体積であり、各種方法によって決めることができ、例えばプロテオグリカン、イオタラム酸塩またはイオヘキソールのような濾過マーカーの尿除去率を測定することで測定できる。最もよく見られる方法は、クレアチニン（筋肉によって生じさらに血液中に放出されるタンパク質）の除去率を知ることによって糸球体濾過率を予測することである。クレアチニン除去率（通常はｍｌ／分と示される）は所定時間（例えば１２時間または２４時間）内の尿液中で収集されたクレアチニンレベル及び血液中のクレアチニンレベルを比較することによって知ることができる。成人男性の典型的なクレアチニン除去率は約９７−１３７ｍｌ／分であり、成人女性は約８８−１２８ｍｌ／分である。クレアチニン除去率と尿クレアチニン排泄は正比例関係であり、血清クレアチニン濃度と逆比例関係である。

【0099】

通常はクレアチニン除去率／糸球体濾過率または尿アルブミン排出率を主な効力評価指標とする。これとともにその他の二次的な指標を加えて本発明の薬物の対応の合併症に対する効力を評価し、例えばトリグリセリド、総コレステロール、低密度ポリタンパク等を用いて血中脂質変化を評価し、治療前後の収縮圧、拡張圧のレベルを測定することを増やすことによって高血圧状況の緩和の程度などについて評価する。

【0100】

６．製品または薬物キット
本発明の一つの実施形態は製品または薬物キットに係るものであり、糖尿病腎症を治療するための本発明のプラスミノゲンを含有する。前記製品は好ましくは一つの容器、ラベルまたはパンフレットを含む。適切な容器はボトル、小瓶、注射器などである。容器は各種材料例えばガラスまたはプラスチックから作られることができる。前記容器は組成物を含有し、前記組成物は本発明の疾患または症状を有効に治療し且つ無菌の入口を有する（例えば前記容器は静脈輸液用パックまたは小瓶であり、皮下注射針によって貫通される栓を含む）。前記組成物中の少なくとも一種類の活性化剤がプラスミノゲンである。前記容器上にあるまたは添付されているラベルは前記組成物を本発明の前記糖尿病によって引き起こされる糖尿病性腎症及びその関連疾患の治療に用いられると説明するものである。前記製品はさらに薬用緩衝液を含有する第二容器を含み、前記薬用緩衝液は例えばリン酸塩緩衝の食塩水、リンガー溶液及びブドウ糖溶液を含む。さらには商業及び使用者の角度から見ると必要とされるその他の物質、即ちその他の緩衝液、希釈剤、濾過物、針及び注射器を含むことができる。また、前記製品は使用説明を有するパンフレットを含み、これは例えば前記組成物の使用者にプラスミノゲン組成物及び疾患の治療に伴うその他の薬物を患者に投与することを指示するものである。

【0101】

＜実施例＞

【実施例1】

【0102】

実施例１はプラスミノゲンの糖尿病早期のマウス体重に対する影響に関するものである。

【0103】

１４−１５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを１０匹準備し、ランダムで二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミン投与グループであり、各グループ５匹ずつである。実験開始当日を０日目として体重測定してからグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与して１日目と記録する。プラスミノゲン投与グループに対して１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日に応じてプラスミノゲンを尾部から静脈注射を行い、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。０、３、６、１２日目にそれぞれ体重を測定する。

【0104】

結果はプラスミノゲン投与グループ及び溶媒ＰＢＳ投与対照グループは０、３、６、１２日目に体重に顕著な差異がないことを示し（図１）、これはプラスミノゲンが動物の体重に対して影響が大きくないことを示している。

【実施例2】

【0105】

実施例２はプラスミノゲンの糖尿病早期マウス糸球体メサンギウム基質及び基底膜の増殖に対する影響に関するものである。

【0106】

１４−１５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを１０匹準備し、ランダムで二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミン投与グループで、各グループ５匹ずつである。実験開始当日を０日目として体重測定してからグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与してさらに１日目と記録する。プラスミノゲン投与グループに対して１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日に応じてプラスミノゲンを尾部から静脈注射を行い、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。１２日目に、マウスを殺処分してから左腎臓を取り、Ｃａｒｎｏｙ固定液にて２４時間固定させる。固定後の腎臓組織をエタノールで段階的に脱水させてさらにキシレンで透明にした後にパラフィンで包埋させる。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせさらに再水和してからヘマトキシリン及びＳｃｈｉｆｆ氏液で染色させ（ＰＡＳ染色）、１％塩酸エタノールで分化させ、アンモニア水で安定化させ、さらにエタノールで段階的に脱水させて封入し、切片を顕微鏡下において４００倍下にて観察を行う。

【0107】

結果は以下を示している。プラスミノゲン投与グループ（図２Ｂ）に比較して、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ（図２Ａ）は糸球体基底膜が明らかに厚くなり、メサンギウム基質が明らかに増殖し、毛細血管腔が狭くなっている。定量分析は以下を示している。溶媒ＰＢＳ投与対照グループの糸球体メサンギウム基質が顕著に増大し、且つ統計的差異が顕著である（図２Ｃ）。これはプラスミノゲンを注射することで糸球体メサンギウム基質成分の沈着が顕著に減少し、プラスミノゲンは糖尿病マウスの腎臓ダメージの修復を顕著に促進できることを示している。

【実施例3】

【0108】

実施例３はプラスミノゲンの糖尿病末期マウス体重に対する影響に関するものである。

【0109】

２４−２５週齢ｄｂ／ｄｂのオスマウス２０匹を準備し、ランダムで二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミン投与グループで、各グループ１０匹である。実験開始当日を０日目として体重測定してからグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与して１日目と記録する。連続的に３１日間投与する。プラスミノゲン投与グループに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日に応じてプラスミノゲンを尾部から静脈注射を行い、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。０、４、７、１１、１６、２１、２６、３１日目にそれぞれ体重を計測する。

【0110】

結果は以下を示している。プラスミノゲン投与グループ及び溶媒ＰＢＳ投与対照グループの０、４、７、１１、１６、２１、２６、３１日目の体重に顕著な差異がなく（図３）、これはプラスミノゲンの動物体重に対する影響が大きくないことを示している。

【実施例4】

【0111】

実施例４はプラスミノゲンの糖尿病末期のマウス糸球体メサンギウム基質及び基底膜の増殖に対する影響に関するものである。

【0112】

２４−２５の週齢ｄｂ／ｄｂオスマウスを２０匹準備し、ランダムで二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミン投与グループで、各グループ１０匹である。実験開始当日を０日目として体重測定してからグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与して１日目と記録する。連続的に３１日間投与する。プラスミノゲン投与グループに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日に応じてプラスミノゲンを尾部から静脈注射を行い、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。３２日目にマウスを殺処分してから左腎臓を取り、Ｃａｒｎｏｙ固定液にて２４時間固定させる。固定後の腎臓組織をエタノールで段階的に脱水させてさらにキシレンで透明にした後にパラフィンで包埋させる。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせさらに再水和してからヘマトキシリン及びＳｃｈｉｆｆ氏液で染色させ（ＰＡＳ染色）、１％塩酸エタノールで分化させ、アンモニア水で安定化させ、さらにエタノールで段階的に脱水させて封入し、切片を顕微鏡下において４００倍下にて観察する。

【0113】

結果は以下を示している。プラスミノゲン投与グループ（図４Ｂ）と比較して、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ（図４Ａ）の糸球体基底膜が明らかに厚くなり、メサンギウム基質が明らかに増殖され、毛細血管腔が狭くなり、これはプラスミノゲンを注射することで糸球体メサンギウム基質成分の沈着が顕著に減少し、プラスミノゲンが糖尿病マウス腎臓損傷に対して顕著な修復機能を有することを示している。

【実施例5】

【0114】

実施例５はプラスミノゲンの糖尿病末期のマウス腎臓に対する保護作用に関するものである。

【0115】

２４−２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを２０匹準備し、ランダムで二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミン投与グループで、各グループ１０匹ずつである。実験開始当日を０日目として体重測定してからグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与して１日目と記録する。連続的に３１日間投与する。プラスミノゲン投与グループに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日に応じてプラスミノゲンを尾部から静脈注射を行い、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。３２日目に、マウスを殺処分してから腎臓を取り、１０％中性ホルマリン固定液にて２４時間固定する。固定後の腎臓組織をエタノールで段階的に脱水させてさらにキシレンで透明にした後にパラフィンで包埋させる。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせさらに再水和してからヘマトキシリン及びエオジンで染色させ（ＨＥ染色）、１％塩酸エタノールで分化させ、アンモニア水で安定化させ、さらにエタノールで段階的に脱水させて封入する。切片を顕微鏡下において２００倍下にて観察する。

【0116】

ＨＥ染色結果は以下を示している。溶媒ＰＢＳ投与対照グループ（図５Ａ）及びプラスミノゲン投与グループ（図５Ｂ）においていずれも少量の糸球体萎縮、発育不良、腎細管上皮細胞の空胞化現象及び少量の炎症性細胞浸潤が見られる（↑）。しかし溶媒ＰＢＳ投与対照グループのマウスにはさらに比較的大きい面積の腎間質充血が観察され（＊）、糸球体壁層基底膜増殖（▲）が観察され、且つプラスミノゲン投与グループの壁層の基底膜増殖は溶媒ＰＢＳ投与対照グループより軽い。また、解剖時に１匹の溶媒ＰＢＳ投与対照グループのマウスに右腎臓のむくみが見られる。これはプラスミノゲンを投与した後に腎臓の損傷の程度が改善されていることを示している。

【実施例6】

【0117】

実施例６はプラスミノゲンの糖尿病末期マウス腎臓フィブリン加水分解の促進に関するものである。

【0118】

２４−２５週齢ｄｂ／ｄｂオスマウスを２０匹準備し、ランダムで二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミン投与グループであり、各グループ１０匹である。実験開始当日を０日目として体重測定してからグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与して１日目と記録する。連続的に３１日間投与する。プラスミノゲン投与グループに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日に応じてプラスミノゲンを尾部から静脈注射を行い、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。３２日目にマウスを殺処分してから腎臓を取り、１０％中性ホルマリン固定液にて２４時間固定する。固定後の腎臓組織をエタノールで段階的に脱水させ及びキシレンで透明化処理した後にパラフィンで包埋処理を行う。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせさらに再水和して１回水洗いする。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、２回水洗いし、毎回５分間である。１０％の正常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間封止する；時間になった後に、ヒツジ血清液を廃棄し、ＰＡＰマーカーで組織を囲む。ウサギ抗マウスフィブリン（フィブリノーゲン）抗体（Ａｂｃａｍ）４℃で終夜インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間である。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間である。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で顕色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒再染色して、流水で５分間流す。透明になるよう段階的に脱水してから封止させ、顕微鏡下で２００倍にて切片を観察する。

【0119】

フィブリノーゲンはフィブリンの前駆体であり、組織に損傷が存在する状況下において、有機体の損傷に対する刺激応答反応として、フィブリノーゲンは加水分解してフィブリンとなる（非特許文献２９〜３１）。そのためフィブリノーゲンレベルを損傷の程度の一つの指標とすることができる。

【0120】

結果は以下を示している。プラスミノゲン投与グループ（図６Ｂ）は溶媒ＰＢＳ投与対照グループ（図６Ａ）と比較した場合、フィブリノゲンの陽性着色が浅い。これはプラスミノゲンを注射することで顕著に糖尿病マウスの腎臓フィブリン沈着を低下させることができ、プラスミノゲンは糖尿病マウスの腎臓ダメージに対して顕著な修復作用を有することを示している。

【実施例7】

【0121】

実施例７はプラスミノゲンの糖尿病末期マウスの腎臓アポトーシス阻害タンパクＢｃｌ−２の発現促進に関するものである。

【0122】

２４−２５週齢ｄｂ／ｄｂオスマウスを２０匹準備し、ランダムで二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミン投与グループで、各グループ１０匹ずつである。実験開始当日を０日目として体重測定してからグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与して１日目と記録する。連続的に３１日間投与する。プラスミノゲン投与グループに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日に応じてプラスミノゲンを尾部静脈から注射を行い、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。３２日目にマウスを殺処分し、腎臓を取り１０％中性ホルマリン固定液中において２４時間固定させる。固定後の腎臓組織をエタノールで段階的に脱水させ及びキシレンで透明化処理した後にパラフィンで包埋処理を行う。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせさらに再水和して１回水洗いする。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、２回水洗いし、毎回５分間である。１０％の正常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間封止する；時間になった後に、ヒツジ血清液を廃棄し、ＰＡＰマーカーで組織を囲む。ウサギ抗マウスＢｃｌ−２抗体（Ａｂｃａｍ）４℃で終夜インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間である。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間である。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で顕色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒再染色して、流水で５分間流す。透明になるよう段階的に脱水させてから封止を行い、顕微鏡下で２００倍下にて切片を観察する。

【0123】

Ｂｃｌ−２は細胞アポトーシス阻害タンパクであり、アポトーシス刺激因子の作用下において発現が減少するように制御される（非特許文献３２，３３）。結果は以下を示している。プラスミノゲン投与グループ（図７Ｂ）の腎細管上皮細胞の陽性発現着色は明らかに溶媒ＰＢＳ投与対照グループ（図７Ａ）より深く、且つ前者の着色範囲がより広い。定量分析結果は観察結果と一致し、且つ顕著な差異を有する（図７Ｃに示す通り）。これは、プラスミノゲンは糖尿病マウス腎臓アポトーシス阻害分子Ｂｃｌ−２的の発現を促進させ、これにより糖尿病マウス腎臓組織細胞のアポトーシスを阻害することを示している。

【実施例8】

【0124】

実施例８はプラスミノゲンの糖尿病末期マウスの腎臓損傷の低下に関するものである。

【0125】

２４−２５週齢ｄｂ／ｄｂオスマウスを８匹準備し、ランダムで二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミン投与グループで、各グループ４匹である。実験開始当日を０日目として体重測定してからグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与して１日目と記録する。連続的に３１日間投与する。プラスミノゲン投与グループに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日に応じてプラスミノゲンを尾部から静脈注射を行い、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。３２日目に、生理的指標の測定を完了してから、マウスを殺処分してから腎臓を取り、１０％中性ホルマリン固定液にて２４時間固定する。固定後の腎臓組織をエタノールで段階的に脱水させてさらにキシレンで透明にした後にパラフィンで包埋させる。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせてから再水和して１回水洗いする。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、２回水洗いし、毎回５分間である。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間である。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で顕色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒再染色して、流水で５分間流す。透明になるよう段階的に脱水してから封止させ、顕微鏡下で４００倍下にて切片を観察する。

【0126】

ＩｇＭ抗体はアポトーシス及び壊死細胞を除去する過程において重要な役割を発揮し、組織器官の損傷局所のＩｇＭ抗体のレベルは損傷の程度と正比例関係を有する（非特許文献３４〜３６）。組織器官の局所ＩｇＭ抗体のレベルを測定することで該組織器官の損傷状況を反映できる。

【0127】

結果は以下を示している。プラスミノゲン投与グループ（図８Ｂ）のマウス糸球体ＩｇＭの陽性着色は溶媒ＰＢＳ投与対照グループより薄く、且つ対照グループより範囲が狭い（図８Ａ）。定量分析は観察結果と一致し、且つ統計的差異が顕著で、これはプラスミノゲンを注射した後糸球体の損傷が明らかに改善され、プラスミノゲンが糖尿病マウスの腎臓損傷に対して顕著な修復作用を有することを示している。

【実施例9】

【0128】

実施例９はプラスミノゲンの糖尿病末期肝臓組織フィブリンレベルを低減させることに関するものである。

【0129】

２４−２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウス１０匹を準備し、ランダムで二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミン投与グループで、各グループ５匹ずつである。実験開始当日を０日目として体重測定してからグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与して１日目と記録する。連続的に３１日間投与する。プラスミノゲン投与グループに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日に応じてプラスミノゲンを尾部から静脈注射を行い、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。３２日目にマウスを殺処分してから肝臓を取り、１０％中性ホルマリン固定液にて２４時間固定する。固定後の腎臓組織をエタノールで段階的に脱水させてさらにキシレンで透明にした後にパラフィンで包埋させる。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせさらに再水和して１回水洗いする。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、２回水洗いし、毎回５分間である。１０％の正常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間封止する；時間になった後に、ヒツジ血清液を廃棄し、ＰＡＰマーカーで組織を囲む。ウサギ抗マウスフィブリン（フィブリノーゲン）抗体（Ａｂｃａｍ）４℃で終夜インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間である。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間である。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で顕色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒再染色して、流水で５分間洗い流す。透明になるよう段階的に脱水してから封止を行い、顕微鏡下で２００倍下にて切片を観察する。

【0130】

フィブリノーゲンはフィブリンの前駆体であり、組織に損傷が存在する状況下において、有機体の損傷に対する刺激応答反応として、フィブリノーゲンは加水分解してフィブリンとなる（非特許文献２９〜３１）。そのためフィブリノーゲンレベルを損傷の程度の一つの指標とすることができる。

【0131】

研究により以下が示されている。溶媒ＰＢＳ投与対照グループ（図９Ａ）と比較して、プラスミノゲン投与グループ（図９Ｂ）のマウス肝臓組織のフィブリンの陽性着色が浅く、これはプラスミノゲンを注射することで顕著に糖尿病マウス肝臓フィブリンの沈着を低減し、プラスミノゲンが糖尿病マウスの肝臓損傷に対して顕著な修復効果を有する。

【実施例10】

【0132】

実施例１０はプラスミノゲンの糖尿病末期マウス肝臓組織の炎症修復に関するものである。

【0133】

２４−２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウス１０匹準備し、ランダムで二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミン投与グループで、各グループ５匹である。実験開始当日を０日目として体重測定してからグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与して１日目と記録する。連続的に３１日間投与する。プラスミノゲン投与グループのマウスに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日に応じてプラスミノゲンを尾部から静脈注射を行い、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。プラスミノゲンを３１日間投与した後にマウスを殺処分してから肝臓組織を取り、１０％中性ホルマリン固定液中にて２４時間固定する。固定後の肝臓組織をエタノールで段階的に脱水させてさらにキシレンで透明にした後にパラフィンで包埋させる。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせさらに再水和して１回水洗いする。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、２回水洗いし、毎回５分間である。１０％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間封止する；時間になった後に、ヒツジ血清を遠心により廃棄し、ＰＡＰマーカーで組織を囲む。Ｆ４／８０のウサギポリグローナル抗体（Ａｂｃａｍ）４℃で終夜インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間である。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗う。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で顕色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒再染色して、流水で５分間洗い流す。透明になるよう段階的に脱水してから封止させ、切片を顕微鏡下で４００倍にて観察する。

【0134】

Ｆ４／８０はマクロファージマーカーである。マクロファージは炎症段階の主なマクロファージ細胞であり、生体の損傷箇所及び細胞の壊死砕片及び病原体などの清掃を行う。そのため、局所マクロファージの量は炎症反応の程度及びステージを表している。

【0135】

実験は以下を示している。プラスミノゲン投与グループ（図１０Ｂ）と溶媒ＰＢＳ投与対照グループ（図１０Ａ）を比較した場合、プラスミノゲン投与グループのＦ４／８０陽性レベルは明らかに低下し、これはプラスミノゲンを投与した後の肝臓組織の炎症の程度が減軽されていることを示している。図１０ＣはＦ４／８０免疫組織陽性発現数の定量分析の結果であり、プラスミノゲン投与グループのＦ４／８０の発現量が顕著に減少され、且つ統計学的差異を有し、プラスミノゲンは糖尿病マウスの肝臓炎症の修復を顕著に促進できることを示している。

【実施例11】

【0136】

実施例１１はプラスミノゲンの糖尿病末期マウス網膜損傷に対する改善に関するものである。

【0137】

２４−２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを２０匹準備し、ランダムで二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミン投与グループであり、各グループ１０匹ずつである。実験開始当日を０日目として体重測定してからグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与して１日目と記録する。連続的に３１日間投与する。プラスミノゲン投与グループに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日に応じてプラスミノゲンを尾部から静脈注射を行い、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。３２日目にマウスを殺処分してから左側眼球を取り、パラホルムアルデヒド固定液中で２４時間固定する。固定後の眼球から網膜を分離した後に、１ｍｌ ３％パンクレアチン（Ｓｏｌａｒｂｉｏ）のＥＰチューブ中に入れ、振動テーブルにおいて３７℃で２〜３ｈ振動消化させる。網膜に軟化、脱落の現象が現れてからていねいに網膜を蒸留水の入ったＥＰチューブ中に移し、振動テーブルにおいて３７℃で２〜３ｈ振動させ、網膜上の余分な組織を脱落させる。優しく網膜を処理し、血管層のみが残るようにしてからスライド上にサンプルを広げて載せ、自然乾燥させる。網膜をＳｃｈｉｆｆ氏液で染色させ（ＰＡＳ染色）、１％塩酸エタノールで分化させ、アンモニア水で安定化させ、さらにエタノールで段階的に脱水させてキシレンで透明にしてから封入を行い、顕微鏡下で４００倍下にて観察を行う。

【0138】

関連の研究が示すように、糖尿病は網膜の病変を引き起こし、網膜血管内皮細胞の増殖、周細胞の損失及び無細胞血管の形成をもたらす（非特許文献３７，３８）。

【0139】

実験結果から分かるように、プラスミノゲン投与グループ（図１１Ｂ）と比較して、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ（図１１Ａ）のｄｂ／ｄｂマウス網膜毛細血管の管径の太さが不均一で、血管の管壁が厚くなり深く染色させ、血管内皮細胞（▲）が増殖し、周細胞（↓）が明らかに減少し、これに対してプラスミノゲン投与グループ（図１１Ｂ）は病理的に改変が明らかに減軽されている；定量分析により、プラスミノゲン投与グループと溶媒ＰＢＳ投与対照グループを比較した場合、無細胞血管の長さ（図１１Ｃ）が顕著に低下し、且つ統計学的分析結果から顕著な差異があると示されている。これはプラスミノゲンが糖尿病後期のマウス網膜損傷の修復を顕著に促進できることを示している。

【実施例12】

【0140】

実施例１２はプラスミノゲンの糖尿病による微小血栓の溶解促進に関するものである。

【0141】

２４−２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウス１０匹を取り、ランダムに二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループとプラスミノゲン投与グループで、各グループ５匹ずつである。実験開始当日を０日目として体重計測してグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与して且つ１日目と記録し、１５日間連続的に投与する。プラスミノゲン投与グループのマウスに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日に応じて尾部静脈からプラスミノゲンを注射し、溶媒ＰＢＳ投与グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。１６日目に眼球を摘出して採血し、全血を静置した後に血清を用いて血液中のＤ−二量体の含有量を測定する。

【0142】

結果は以下を示している。投薬１５日後に、血清中のＤ−二量体の含有量が顕著に上昇した（図１２）。これはプラスミノゲンを投与した後に、糖尿病によってもたらされる網膜微小血栓が顕著に溶解していることを示している。

【実施例13】

【0143】

実施例１３はプラスミノゲンの糖尿病後期神経損傷マウスの機械性接触によって誘発される疼痛に対する応答能力修復の促進に関するものである。

【0144】

２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを１０匹取り、ランダムに二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミノゲン投与グループで、各グループ５匹ずつである。実験開始当日を０日目として体重測定してグループ分けを行い、生理実験を開始し、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与して且つ１日目と記録し、連続的に１５日間投与する。プラスミノゲン投与グループのマウスに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日に応じて尾部からプラスミノゲンを静脈注射し、溶媒ＰＢＳ投与グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。プラスミノゲン投与後の０、４、７、１１、１６日目にＶｏｎ−Ｆｒｅｙファイバー（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ，ＵＳＡ）を用いて動物の機械性損傷に関する感受度を測定する。２．０ｇの力を開始力として、まずその左足を測定する。５回の刺激中に２回の足を引っ込める反応があれば陽性で、陽性であれば、１ランク小さい力でその右足に対して刺激を行う；陰性であれば、１ランク大きい力でその右足を刺激し、このように左右足を交互に刺激し、刺激の間隔は５分間であり、全部で６回刺激し、それからＳ．Ｒ．Ｃｈａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）（非特許文献３９）で紹介した方法によりその５０％足の引っ込めが生じる閾値を計算する。

【0145】

研究により、溶媒ＰＢＳ投与対照グループと比較して、プラスミノゲン投与グループの糖尿病マウスの機械的接触により誘発される疼痛に対する反応の均一性に増加し、且つ１６日目測定した際に溶媒ＰＢＳ投与対照グループに比較して極めて顕著な差異が見られている（図１３）。これはプラスミノゲンが神経損傷末期の糖尿病マウスの機械的接触に誘発される疼痛（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ａｌｌｏｄｙｎｉａ）に対する応答能力を修復していることを示している。

【実施例14】

【0146】

実施例１４はプラスミノゲンの糖尿病後期の神経損傷マウスの冷刺激感知に対する修復に関するものである。

【0147】

２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを１０匹取り、ランダムに二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミノゲン投与グループで、各５匹である。実験開始当日を０日目として体重測定してグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与して且つ１日目と記録し、連続的に１５日間投与する。プラスミノゲン投与グループのマウスに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日に応じて尾部からプラスミノゲンを静脈注射し、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。投薬後の０、４、７、１１、１６日目に針注射器で一滴のアセトン液滴を押し出してさらにｄｂ／ｄｂマウスの足裏に接触させ、それが足裏全体を覆うようにする。左足から始め、３分間間隔で交互にその左右足を刺激し、全部で１０回刺激し、その足を引っ込める反応の回数を統計する。反応パーセンテージ＝足を引っ込めた回数／刺激回数×１００のパーセンテージである。

【0148】

実験結果は以下を示している。０及び４日目に、プラスミノゲン投与グループ及び溶媒ＰＢＳ投与対照グループはアセトン刺激に対して顕著な差異がなく、７日目から顕著な差異が観察され、１６日目に極めて顕著な差異が観察され、Ｐ値＜０．０００１である（図１４）。これは投薬１５日後に、糖尿病マウスがほぼ完全に冷刺激に対する反応を回復したことを示し、これはプラスミノゲンが糖尿病後期の神経の冷刺激に対する応答能力を極めて顕著に修復したことを示している。

【実施例15】

【0149】

実施例１５はプラスミノゲンの糖尿病末期の心筋損傷に対する修復の促進に関するものである。

【0150】

２４−２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウス２８匹を取り、ランダムに二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ１２匹、プラスミノゲン投与グループ１６匹である。実験開始当日を０日目として体重測定してグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与して且つ１日目と記録し、連続的に３１日間投与する。プラスミノゲン投与グループのマウスに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日に応じて尾部静脈からプラスミノゲンを注射し、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。３２日目に眼球を摘出して採血を行い、３５００ｒ／ｍｉｎにて１５−２０分間遠心させ、さらに上澄みを取って心肌トロポニンＩの濃度測定を行う。

【0151】

心肌トロポニンＩ（ｃａｒｄｉａｃ ｔｒｏｐｏｎｉｎ，ＣＴＮＩ）は心筋損傷の重要なマーカーであり、その血清濃度は心筋損傷の程度を反映できる（非特許文献４０）。結果は以下を示している。プラスミノゲン投与グループの心筋トロポニンＩの濃度は明らかに溶媒ＰＢＳ対照グループより低く、且つ極めて顕著な統計学差異を有する（図１５）。これはプラスミノゲンが顕著に糖尿病後期のマウスの心筋損傷の修復を促進できることを示している。

【実施例16】

【0152】

実施例１６はプラスミノゲンが糖尿病後期の神経損傷マウスの神経組織のフィブリンレベルを減少させることに関するものである。

【0153】

２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを１０匹取り、ランダムに二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミノゲン投与グループで、各５匹である。実験開始当日を０日目として体重測定してグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与して且つ１日目と記録し、連続的に１５日間投与する。プラスミノゲン投与グループのマウスに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日に応じて尾部静脈からプラスミノゲンを注射し、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。１６日目にマウスを殺処分して坐骨神経を取り１０％中性ホルマリン固定液中において２４時間固定する。固定後の坐骨神経をエタノールで段階的に脱水させ及びキシレンで透明にした後にパラフィンで包埋させる。組織切片の厚みは５μｍで、切片を脱パラフィンさせて再水和した後にさらに１回水洗いし、それからＰＡＰマーカーで組織を囲む。３％ＴＢＳで希釈した過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、３回水洗いする。１０％の正常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間封止し、余分な血清を除去する。ウサギ抗マウスフィブリン（フィブリノーゲン）抗体（Ａｂｃａｍ）４℃で終夜インキュベーションし、ＴＢＳで３回洗う。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＴＢＳで３回洗う。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で顕色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒再染色して、流水で５分間洗い流す。透明になるよう段階的に脱水してから封止を行い、顕微鏡下で４００倍下にて切片を観察する。

【0154】

フィブリノーゲンはフィブリンの前駆体であり、組織に損傷が存在する状況において、生体の損傷に対する刺激応答反応として、フィブリノーゲンは加水分解されてフィブリンとなり、そのためフィブリンレベルを損傷の程度の一つの指標とすることができる。フィブリンは組織損傷後に血栓を形成する主な成分であり、そのため、フィブリンレベルを血栓の一つの指標とすることができる。

【0155】

研究により、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ（図１６Ａ）と比較した場合、プラスミノゲン投与グループ（図１６Ｂ）のマウスの坐骨神経フィブリンのレベルが低下している。これは、プラスミノゲンはフィブリンレベルを低下させる機能を有し、損傷がある程度修復されていることを示している。また、プラスミノゲンは神経組織周囲の血栓の溶解を促進できることを示している。

【実施例17】

【0156】

実施例１７はプラスミノゲンの糖尿病マウスの肝臓損傷の修復促進に関するものである。

【0157】

２５−２８週齢のｄｂ／ｄｂオスマウス９匹を取り、ランダムに二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ３匹、プラスミノゲン投与グループ６匹である。実験開始当日を０日目として体重測定してグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与して且つ１日目と記録し、連続的に３１日間投与する。プラスミノゲン投与グループのマウスに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日に応じて尾部からプラスミノゲンを静脈注射し、溶媒ＰＢＳ投与グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。プラスミノゲンを３１日間投与した後に眼球を摘出して全血を採取し、血清が析出してから４℃、３５００ｒ／ｍｉｎにて１０分間遠心させ、上澄み液を取って測定を行う。本実験はグルタミン酸ピルビン酸アミノ基転移酵素測定薬物キット（南京建成生物工程研究所、品番Ｃ００９−２）を使用して、ライトマン−フランケル法（Ｒｅｉｔｍａｎ−Ｆｒａｎｋｅｌ）を用いて血清中のグルタミン酸ピルビン酸アミノ基転移酵素（ＡＬＴ）の含有量を測定する。

【0158】

グルタミン酸ピルビン酸アミノ基転移酵素は肝臓の健康状態を示す重要な指標であり（非特許文献４１、４２）、グルタミン酸ピルビン酸アミノ基転移酵素の正常参考値の範囲は９〜５０Ｕ／Ｌである。測定結果は以下を示している。溶媒ＰＢＳ投与対照グループの血清中のＡＬＴの含有量は明らかに正常な生理的数値より高く、プラスミノゲン投与グループは既に体内の正常レベルに戻り、且つプラスミノゲン投与グループは溶媒ＰＢＳ投与対照グループより顕著に低く、且つ統計学的差異を有する（図１７）。これは糖尿病末期モデルマウスにおいて、プラスミノゲンを注射することでより効果的に肝損傷を修復できることを示している。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]