特許 6682043 変異体ＩＤＨ１阻害剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6682043

(24)【登録日】2020年3月26日

(45)【発行日】2020年4月15日

(54)【発明の名称】変異体ＩＤＨ１阻害剤

(51)【国際特許分類】

   C07D 413/04 20060101AFI20200406BHJP

   A61K 31/506 20060101ALI20200406BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20200406BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20200406BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20200406BHJP

【ＦＩ】

   C07D413/04CSP

   A61K31/506

   A61P43/00 111

   A61P35/00

   A61P35/02

【請求項の数】10

【全頁数】71

(21)【出願番号】特願2019-515768(P2019-515768)

(86)(22)【出願日】2017年5月30日

(65)【公表番号】特表2019-517579(P2019-517579A)

(43)【公表日】2019年6月24日

(86)【国際出願番号】US2017034930

(87)【国際公開番号】WO2017213910

(87)【国際公開日】20171214

【審査請求日】2019年2月4日

(31)【優先権主張番号】16382257.0

(32)【優先日】2016年6月6日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】17382025.9

(32)【優先日】2017年1月20日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】594197872

【氏名又は名称】イーライ リリー アンド カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100131990

【弁理士】

【氏名又は名称】大野 玲恵

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】ルメラス アマダー，ヴェンセスラオ

(72)【発明者】

【氏名】バウアー，レナート エー．

(72)【発明者】

【氏名】ブレ，セルジュ ルイス

(72)【発明者】

【氏名】バークホルダー，ティモシー ポール

(72)【発明者】

【氏名】ギルモア，レイモンド

(72)【発明者】

【氏名】ハーン，パトリック ジェームズ

(72)【発明者】

【氏名】カーバラレス マーティン，サンティアゴ

(72)【発明者】

【氏名】ランコビッチ，ゾラン

【審査官】 三木 寛

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１４−５２８９５１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１６−５１４１２４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１４／１４７５８６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１６／０５２６９７（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｄ ４１３／０４

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式Ｉの化合物であって、

【化1】

式中、
Ｒ^１は水素、ＮＨ_２、またはフルオロであり、
Ｒ^２およびＲ^３はメチルもしくは水素であるか、またはＲ^２がメチル、エチル、１−ヒ
ドロキシエチル、１−メトキシエチル、フルオロメチル、１−フルオロエチル、もしくは
１−メチルエチルであり、Ｒ^３が水素であり、
Ｒ^４はメチルまたはフルオロメチルであり、
Ｒ^５は水素、エチル、または−ＣＨ_２−シクロプロピルである、化合物、
あるいはその薬学的に許容される塩。

【請求項2】

Ｒ^１は水素、ＮＨ_２、またはフルオロであり、
Ｒ^２およびＲ^３はメチルであるか、またはＲ^２が１−メトキシエチルもしくは１−メチ
ルエチルであり、Ｒ^３が水素であり、
Ｒ^４はメチルであり、
Ｒ^５は水素、エチル、または−ＣＨ_２−シクロプロピルである、
請求項１に記載の化合物、あるいはその薬学的に許容される塩。

【請求項3】

下記
（Ｓ）−３−（２−（（（Ｓ）−１−（４−（（４−アクリロイルピペラジン−１−イ
ル）メチル）フェニル）エチル）アミノ）ピリミジン−４−イル）−４−イソプロピルオ
キサゾリジン−２−オン、
（Ｓ）−３−（２−（（１−（４−（（４−アクリロイルピペラジン−１−イル）メチ
ル）フェニル）エチル）アミノ）−６−フルオロピリミジン−４−イル）−４，４−ジメ
チルオキサゾリジン−２−オン、
（Ｒ）−３−（２−（（（Ｓ）−１−（４−（（４−アクリロイルピペラジン−１−イ
ル）メチル）フェニル）エチル）アミノ）ピリミジン−４−イル）−４−（（Ｒ）−１−
メトキシエチル）オキサゾリジン−２−オン、および
（Ｒ）−３−（２−（（（Ｓ）−１−（４−（（４−アクリロイルピペラジン−１−イ
ル）メチル）フェニル）エチル）アミノ）−６−フルオロピリミジン−４−イル）−４−
（（Ｒ）−１−メトキシエチル）オキサゾリジン−２−オン、
から選択される、請求項１または２に記載の化合物または上記化合物のそれぞれの薬学的
に許容される塩。

【請求項4】

（Ｓ）−３−（２−（（１−（４−（（４−アクリロイルピペラジン−１−イル）メチ
ル）フェニル）エチル）アミノ）−６−フルオロピリミジン−４−イル）−４，４−ジメ
チルオキサゾリジン−２−オンである、
請求項１、２または３のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

【請求項5】

請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩、および
薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。

【請求項6】

治療で使用するための、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。

【請求項7】

神経膠腫、神経膠芽細胞腫、多形性神経膠芽細胞腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、傍神経
節腫、線維肉腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、骨髄異形成症候群、Ｂ細胞急性リンパ
芽球性白血病、甲状腺癌、結腸直腸癌、急性骨髄性白血病、黒色腫、前立腺癌、軟骨肉腫
、または胆管癌である、変異体ＩＤＨ１を発現する癌の治療で使用するための、請求項１
〜４のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。

【請求項8】

神経膠腫、神経膠芽細胞腫、多形性神経膠芽細胞腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、傍神経
節腫、線維肉腫、または急性骨髄性白血病である、変異体ＩＤＨ１を発現する癌の治療で
使用するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容
される塩。

【請求項9】

神経膠腫、神経膠芽細胞腫、多形性神経膠芽細胞腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、傍神経
節腫、線維肉腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、Ｂ細胞
急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、甲状腺癌、結腸直腸癌、急性骨髄性白血病（Ａ
ＭＬ）、黒色腫、前立腺癌、軟骨肉腫、または胆管癌である、変異体ＩＤＨ１を発現する
癌の治療用薬剤を製造するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物、または
その薬学的に許容される塩の使用。

【請求項10】

神経膠腫、神経膠芽細胞腫、多形性神経膠芽細胞腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、傍神経
節腫、線維肉腫、または急性骨髄性白血病である、変異体ＩＤＨ１を発現する癌の治療用
薬剤を製造するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的
に許容される塩の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ）タンパク質は、クエン酸（トリカルボン酸またはクレブス）回路において重要な酵素である。クエン酸回路は、多くの生化学的経路にとってとりわけ重要であり、細胞代謝の最も早期に確立した構成要素の１つである。

【0002】

イソクエン酸デヒドロゲナーゼは、イソクエン酸のα−ケトグルタレート（２−オキソグルタレート）への酸化的脱炭酸を触媒する。これらの酵素は、２つの異なるサブクラスに属し、その１つは、電子受容体としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ（＋））を、もう１つはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ（＋））を利用する。５つのイソクエン酸デヒドロゲナーゼが報告されており、３つのＮＡＤ（＋）−依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼは、ミトコンドリアマトリックスに局在化し、２つの（ＮＡＤＰ（＋））−依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼは、その１つがミトコンドリア、もう１つは他の主な細胞質である。各ＮＡＤＰ（＋）−依存性イソチームは二量体である。ＩＤＨ１遺伝子によってコードされたタンパク質は、細胞質及びペルオキシソームに見られるＮＡＤＰ（＋）−依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼである。細胞質の酵素は、細胞質ＮＡＤＰＨの生成において重要な役割を果たしている。ＩＤＨ１は、幅広い種および完全なクエン酸回路を欠いた有機体において発現される。

【0003】

近年、ＩＤＨ１、および関連アイソフォームＩＤＨ２における突然変異が、いくつかの種類の癌において発見された。突然変異は、タンパク質配列に沿って特異的なアミノ酸にて発生し、ヘテロ接合体的に発現し、機能獲得と一致することが見出された。これらの突然変異は、機能保存残基で発生し、ＩＤＨ１の変異体形成の生化学研究でＩＤＨ１の正常機能の喪失、イソクエン酸のα−ケトグルタレートへの可逆的変換を実証した。これらの突然変異の結果は、α−ケトグルタレート（αＫＧ）の２−ヒドロキシグルタレート（２ＨＧ）への新たな（または新形態の）変換を可能にする。その結果、ＩＤＨ１またはＩＤＨ２の変異体形態が隠れている癌細胞は、実質的により高い濃度の２ＨＧを形成する。高レベルの２ＨＧにより、変異体ＩＤＨ１またはＩＤＨ２阻害によって逆転され得る細胞分化においてブロックを生じる。

【0004】

変異体ＩＤＨの特定の阻害剤は、ＷＯ２０１３／０４６１３６に記載されている。出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４３２６４は、変異体ＩＤＨ１の共有結合性阻害剤を開示する。様々な癌治療のために、野生型ＩＤＨ１よりも変異体ＩＤＨ１酵素を選択的に抑制する化合物が必要とされている。様々な癌治療のために、野生型ＩＤＨ１よりも新形態活性を示す変異体ＩＤＨ１酵素を選択的に阻害する化合物がさらに必要とされている。本発明は、変異体ＩＤＨ１の阻害剤である式Ｉの化合物を提供する。式Ｉの化合物は、野生型ＩＤＨ１よりも変異型ＩＤＨ１を、および野生型ＩＤＨ２よりも変異型ＩＤＨ２酵素を、選択的に阻害する共有結合性阻害剤である。

【0005】

本発明の一態様は、式Ｉの変異体ＩＤＨ１酵素阻害剤化合物であって、

【化1】

式中、
Ｒ^１は水素、ＮＨ_２またはフルオロであり、
Ｒ^２およびＲ^３はメチルもしくは水素であるか、またはＲ^２がメチル、エチル、１−ヒドロキシエチル、１−メトキシエチル、フルオロメチル、１−フルオロエチルもしくは１−メチルエチルであり、Ｒ^３が水素であり、
Ｒ^４はメチルまたはフルオロメチルであり、
Ｒ^５は水素、エチルまたは−ＣＨ_２−シクロプロピルである、化合物、あるいはその薬学的に許容される塩を提供することである。

【0006】

本発明のさらなる態様は、式中、
Ｒ^１は水素、６−ＮＨ_２または６−フルオロであり、
Ｒ^２およびＲ^３はメチルであるか、またはＲ^２が１−メトキシエチルもしくは１−メチルエチルであり、Ｒ^３が水素であり、
Ｒ^４はメチルであり、
Ｒ^５は水素、エチルまたは−ＣＨ_２−シクロプロピルである、式Ｉの化合物、あるいはその薬学的に許容される塩を提供する。

【0007】

本発明の別の態様は、下記、
（Ｓ）−３−（２−（（（Ｓ）−１−（４−（（４−アクリロイルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）エチル）アミノ）ピリミジン−４−イル）−４−イソプロピルオキサゾリジン−２−オン、
（Ｓ）−３−（２−（（１−（４−（（４−アクリロイルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）エチル）アミノ）−６−フルオロピリミジン−４−イル）−４，４−ジメチルオキサゾリジン−２−オン、
（Ｒ）−３−（２−（（（Ｓ）−１−（４−（（４−アクリロイルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）エチル）アミノ）ピリミジン−４−イル）−４−（（Ｒ）−１−メトキシエチル）オキサゾリジン−２−オン、および
（Ｒ）−３−（２−（（（Ｓ）−１−（４−（（４−アクリロイルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）エチル）アミノ）−６−フルオロピリミジン−４−イル）−４−（（Ｒ）−１−メトキシエチル）オキサゾリジン−２−オン、
から選択される化合物、または上記化合物のそれぞれの薬学的に許容される塩を提供する。

【0008】

本発明のさらなる態様は、化合物：
（Ｓ）−３−（２−（（１−（４−（（４−アクリロイルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）エチル）アミノ）−６−フルオロピリミジン−４−イル）−４，４−ジメチルオキサゾリジン−２−オン、
またはその薬学的に許容される塩を提供する。

【0009】

本発明のなおさらなる態様は、以下：
（４Ｓ）−３−［［２−［［（１Ｓ）−１−［４−［［２−シクロプロピル−１−（４−プロプ−２−エノイルピペラジン−１−イル）エチル］フェニル］エチル］アミノ］ピリミジン−４−イル］−４−イソプロピル−オキサゾリジン−２−オン、異性体１、
（４Ｓ）−３−［［２−［［（１Ｓ）−１−［４−［［２−シクロプロピル−１−（４−プロプ−２−エノイルピペラジン−１−イル）エチル］フェニル］エチル］アミノ］ピリミジン−４−イル］−４−イソプロピル−オキサゾリジン−２−オン、異性体２、
３−［２−［［（１Ｓ）−１−［４−［２−シクロプロピル−１−（４−プロプ−２−エノイルピペラジン−１−イル）エチル］フェニル］エチル］アミノ］−６−フルオロ−ピリミジン−４−イル］−４，４−ジメチル−オキサゾリジン−２−オン、異性体１、
３−［２−［［（１Ｓ）−１−［４−［２−シクロプロピル−１−（４−プロプ−２−エノイルピペラジン−１−イル）エチル］フェニル］エチル］アミノ］−６−フルオロ−ピリミジン−４−イル］−４，４−ジメチル−オキサゾリジン−２−オン、異性体２、
３−［６−アミノ−２−［［（１Ｓ）−１−［４−［１−（４−プロプ−２−エノイルピペラジン−１−イル）プロピル］フェニル］エチル］アミノ］ピリミジン−４−イル］−４，４−ジメチル−オキサゾリジン−２−オン、異性体１、
３−［６−アミノ−２−［［（１Ｓ）−１−［４−［１−（４−プロプ−２−エノイルピペラジン−１−イル）プロピル］フェニル］エチル］アミノ］ピリミジン−４−イル］−４，４−ジメチル−オキサゾリジン−２−オン、異性体２、
から選択される化合物、または上記化合物のいずれか１つの薬学的に許容される塩を提供する。

【0010】

本発明の別の態様は、式Ｉの変異体ＩＤＨ１阻害剤化合物、またはその薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。

【0011】

本発明のさらなる態様は、患者において、神経膠腫、神経膠芽細胞腫、多形性神経膠芽細胞腫（ＧＢＭ）、星状細胞腫、乏突起膠腫、傍神経節腫、線維肉腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、甲状腺癌、結腸直腸癌、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、黒色腫、前立腺癌、軟骨肉腫、または胆管癌である、変異体ＩＤＨ１を発現する癌を治療する方法であって、治療を必要とする患者に、治療上有効な量の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む方法を提供する。

【0012】

本発明の別の態様は、患者において、神経膠腫、神経膠芽細胞腫、多形性神経膠芽細胞腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、傍神経節腫、線維肉腫、または急性骨髄性白血病である、変異体ＩＤＨ１を発現する癌を治療する方法であって、治療を必要とする患者に、治療上有効な量の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む方法を提供する。

【0013】

本発明のさらなる態様は、治療で使用するための、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。

【0014】

本発明の別の態様は、神経膠腫、神経膠芽細胞腫、多形性神経膠芽細胞腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、傍神経節腫、線維肉腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、甲状腺癌、結腸直腸癌、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、黒色腫、前立腺癌、軟骨肉腫、または胆管癌である、変異体ＩＤＨ１を発現する癌の治療で使用するための、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。

【0015】

本発明のさらなる態様は、神経膠腫、神経膠芽細胞腫、多形性神経膠芽細胞腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、傍神経節腫、線維肉腫、または急性骨髄性白血病である、変異体ＩＤＨ１を発現する癌の治療で使用するための、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。

【0016】

本発明の別の態様は、神経膠腫、神経膠芽細胞腫、多形性神経膠芽細胞腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、傍神経節腫、線維肉腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、甲状腺癌、結腸直腸癌、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、黒色腫、前立腺癌、軟骨肉腫、または胆管癌である、変異体ＩＤＨ１を発現する癌の治療用薬剤を製造するための、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。

【0017】

本発明のさらなる態様は、神経膠腫、神経膠芽細胞腫、多形性神経膠芽細胞腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、傍神経節腫、線維肉腫、または急性骨髄性白血病である、変異体ＩＤＨ１を発現する癌の治療用薬剤を製造するための、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。

【0018】

用語「患者」は哺乳動物を意味し、「哺乳動物」としてはヒトが挙げられるが、これに限定されない。

【0019】

「治療上有効な量」は、癌患者において変異体ＩＤＨ１を阻害して、分化におけるブロックの解除につながることで腫瘍細胞増殖の阻害をもたらし、患者の癌を排除するか、または進行を遅らせるもしくは阻止するのに必要な式Ｉの化合物、もしくはその薬学的に許容される塩、またはこの化合物、もしくはその薬学的に許容される塩を含有する薬学的組成物の用量を意味する。式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩の予想用量は、２０ｍｇ／患者／１日〜２０００ｍｇ／患者／１日の範囲内である。好ましい用量は、３０ｍｇ／患者／１日〜１８００ｍｇ／患者／１日の範囲内と予想される。最も好ましい用量は、４０ｍｇ／患者／１日〜１６００ｍｇ／患者／１日の範囲内と予想される。患者を治療するのに正確な用量及び治療期間の長さは、疾患のステージ及び重症度と共に、個々の患者の具体的なニーズ及び反応を考慮して、医師によって決定されるだろう。１日当たりが基準の用量で表されるが、投薬投与は調整されてよく、患者により最適な治療的利益を提供し、あらゆる薬物関連毒性を管理または緩和する。毎日の投薬に加えて、１日２回（Ｂ．Ｉ．Ｄ．）の投薬、１日３回（Ｔ．Ｉ．Ｄ．）の投薬、１日おき（Ｑ２Ｄ）の投薬、５日間にわたる１日おきの投薬に続いて２日間の投薬なし（Ｔ．Ｉ．Ｗ．）、または３日に１回（Ｑ３Ｄ）の投薬が適切でよい。

【0020】

用語「治療」、「治療する」、および「治療している」は、患者が罹患している癌について、例えば、癌が実際に除去されないとしても、症状のうちの１つ以上を軽減させる、緩徐にする、もしくは回復させるため、および癌の進行を遅らせるための活性化合物の投与などの、全ての範囲の介入を含むことを意味する。

【0021】

式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩は、好ましくは、薬学的に許容される担体を使用して薬学的組成物として製剤化され、様々な経路によって投与される。好ましくは、そのような組成物は、経口投与用である。そのような薬学的組成物およびそれらを調製するプロセスは、当該技術分野において周知である。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＹ，Ｌ．Ｖ．Ａｌｌｅｎ，Ｅｄｉｔｏｒ，２２^ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＰｒｅｓｓ，２０１２を参照されたい。特定の実施形態では、薬学的組成物は、薬学的に許容される担体および任意に、特に癌全般または特定の癌の種類の治療のための他の治療成分と共に、（Ｓ）−３−（２−（（１−（４−（（４−アクリロイルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）エチル）アミノ）−６−フルオロピリミジン−４−イル）−４，４−ジメチルオキサゾリジン−２−オンまたはその薬学的に許容される塩を含む。

【0022】

式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩は、１つ以上の他の治療剤と同時に、または前に、または後に投与されてよい。１つ以上の他の治療用薬剤と共に投与された場合、式Ｉの化合物、または薬学的に許容される塩は、同じもしくは異なる投与経路で、または同じ薬学的組成物中に他の治療剤として、個別に投与されてよい。１つ以上の追加の治療剤が投与される場合、各治療剤の投与は、同時、個別または連続でよい。

【0023】

式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩は、当技術分野において既知の様々な手順、ならびに以下に記載の手順によって調製されてよい。特定の合成ステップは、異なる順序で組み合わせて、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を調製することができる。

【0024】

式Ｉの化合物は、ＩＵＰＡＣに従って命名され、ＣＡＳに従って命名されてもよく、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を明確に同定するために他の命名規則が使用されてよい。

【0025】

式Ｉの化合物は、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^２置換基を有する炭素原子を含む、最大４つのキラル中心を有することができ、ならびに複数の立体異性体を生じる定義されたＲ^２基内のさらなる可能性を有することが理解される。１つ以上の化合物が１つ、２つ、３つ、または４つの立体異性体構造を有し得、各異性体が確認され得ることが理解されるべきである。式Ｉ中の特定の化合物は、示された立体配置を有する実質的に鏡像異性的に純粋な立体異性体として描写することができる。示されたすべての立体中心を有する立体配置を有する式Ｉの化合物について、「実質的に鏡像異性的に純粋な」とは、異性体純度が９０％を超える鏡像体過剰率を意味する。別の実施形態において、式Ｉの化合物の異性体純度は、Ｒ^４および／またはＲ^５を有する炭素原子において９５％を超える鏡像体過剰率である。さらに別の実施形態において、式Ｉの化合物の異性体純度は、Ｒ^４および／またはＲ^５を有する炭素原子において９８％を超える鏡像体過剰率である。さらに別の実施形態において、式Ｉの化合物の異性体純度は、Ｒ^４および／またはＲ^５を有する炭素原子において９９％を超える鏡像体過剰率である。式Ｉの化合物の、個々のおよびジアステレオマー混合物を含むすべての立体異性体は、本発明の範囲内であると考えられる。

【0026】

本明細書で使用する場合、単一の立体異性体に対する言及は、式Ｉの命名されたまたは描写された化合物を含む立体異性体混合物を含むことも意味する。本明細書で、カーン・インゴルド・プレローグ表記の（Ｒ）−及び（Ｓ）−は、特異的な立体異性体を指すために使用されてよい。特異的な立体異性体は、鏡像異性的に純粋または濃縮出発物質を使用して立体特異的合成によって調製することができる。式Ｉの化合物を含む出発物質、中間体、またはラセミ混合物のいずれかの特定の立体異性体は、キラル固定相でのクロマトグラフィー、酵素的分割、または分別結晶、またはその目的のために、例えばジアステレオマー塩のために形成されたジアステレオマーのクロマトグラフィーを含む、ＳＴＥＲＥＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＯＭＰＯＵＮＤＳ，Ｅ．Ｉ．Ｅｌｉｅｌ ａｎｄ Ｓ．Ｈ．Ｗｉｌｅｎ（Ｗｉｌｅｙ １９９４）およびＥＮＡＮＴＩＯＭＥＲＳ，ＲＡＣＥＭＡＴＥＳ ＡＮＤ ＲＥＳＯＬＵＴＩＯＮＳ，Ｊ．，Ｊａｃｑｕｅｓ，Ａ．Ｃｏｌｌｅｔ，ａｎｄ Ｓ．Ｈ．Ｗｉｌｅｎ（Ｗｉｌｅｙ １９９１）に見られるような当該技術分野で周知の技術によって分割することができる。「異性体１」および「異性体２」という名称は、キラルクロマトグラフィーからそれぞれ第１および第２に溶出する化合物を指し、キラルクロマトグラフィーが合成の初期に開始される場合、同じ名称が、その後の中間体および実施例に適用される。

【化2】

で示される結合は、異性体混合物を指す。

【0027】

式Ｉの化合物の合成において初期の出発物質として用いられる化合物は、周知であり、市販する程度までではないが、当業者によって一般的に用いられる標準的な手順によって提供される特定の参考文献を用いて容易に合成されるか、または一般的な参考文献に見出される。

【0028】

既知の手順および方法の例には、一般的な参照テキストに記載されたものが含まれ、例えばＣＯＭＰＲＥＨＥＮＳＩＶＥ ＯＲＧＡＮＩＣ ＴＲＡＮＳＦＯＲＭＡＴＩＯＮＳ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ，１９８９、ＣＯＭＰＥＮＤＩＵＭ ＯＦ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＴＩＣ ＭＥＴＨＯＤＳ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １−１０，１９７４−２００２，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＭＡＲＣＨ’Ｓ ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，ＲＥＡＣＴＩＯＮＳ ＭＥＣＨＡＮＩＳＭＳ，ＡＮＤ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ，５^ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｂ．Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｅｒｒｙ Ｍａｒｃｈ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，２００１、ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，４^ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ｐａｒｔ Ｂ，Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｆｒａｎｃｉｓ Ａ．Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｊ．Ｓｕｎｄｂｅｒｇ，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２０００などであり、そこに引用された参考文献を参照されたい。

【0029】

ある特定の立体化学中心は、明瞭化のために以下のスキームにおいて特定されないままにされてもよく、あらゆる意味においてスキームの教示を制限することを意図するものではない。個々の異性体、鏡像異性体、およびジアステレオマーは、当業者によって、本発明の化合物の合成における都合のよい時点で、選択的結晶化技法またはキラルクロマトグラフィーなどの方法によって分離または分割されてよい。

【0030】

ある特定の略称を、以下の通りに定義する。「ＡＣＮ」はアセトニトリルを指し、「αＫＧ」はアルファ−ケトグルタル酸または２−ケトグルタレートを指し、「ＢＣＡ」はビシンコニン酸を指し、「ＢＯＣ」はｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルを指し、「ＢＳＡ」はウシ血清アルブミンを指し、「ＣＢＺ」はカルボベンジルオキシを指し、「ＣＤＩ」は１−１´−カルボニルジイミダゾールまたはジ（イミダゾール−１−イル）メタノンを指し、「ＤＣＣ」は１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドを指し、「１，２−ＤＣＥ」は１，２−ジクロロエタンを指し、「ＤＩＣ」はジイソプロピルカルボジイミドを指し、「ＤＩＰＥＡ」はジイソプロピルエチルアミンまたはＮ−エチル−Ｎ−イソプロピル−プロパン−２−アミンを指し、「ＤＭＡＰ」はジメチルアミノピリジンを指し、「ＤＭＥ」はジメトキシエタンを指し、「ＤＭＥＡ」はジメチルエチルアミンを指し、「ＤＭＦ」はジメチルホルムアミドを指し、「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドを指し、「ＤＴＴ」はジチオスレイトールを指し、「ＤＰＰＦ」は１，１´−フェロセンジイル−ビス（ジフェニルホスフィノ）を指し、「ＥＤＣ」は、ＥＤＡＣ、ＥＤＣＩ、または塩酸１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドを指し、「ＥＤＴＡ」はエチレンジアミン四酢酸を指し、「ｅｅ」は鏡像体過剰率を指し、「ＥＧＴＡ」はエチレングリコール四酢酸を指し、「ＥｔＯＡｃ」は酢酸エチルを指し、「ＥｔＯＨ」はエタノールまたはエチルアルコールを指し、「Ｅｔ_２Ｏ」はジエチルエーテルを指し、「Ｅｘ」は実施例を指し、「ＨＡＴＵ」は（ジメチルアミノ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル（３Ｈ−［１，２，３］トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルオキシ）メタンイミニウムヘキサフルオロリン酸塩を指し、「ＨＢＴＵ」は２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩を指し、「２ＨＧ」は２−ヒドロキシグルタレートを指し、「ｄ_５−３ＨＧ」は３−ヒドロキシ−１，５−ペンタンジオイック−２，２，３，４，４−ｄ_５酸を指し、「ＨＩＬＩＣ」は親水性相互作用液体クロマトグラフィーを指し、「ＨＯＡｔ」は１−ヒドロキシ−７−アゾベンゾトリアゾールを指し、「ＨＯＢｔ」は１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物を指し、「ＨＰＬＣ」は高性能液体クロマトグラフィーを指し、「ＩＣ_５０」は、その薬剤にとって可能な最大阻害反応の５０％が生じる薬剤濃度を指し、「ＩＰＡｍ」はイソプロピルアミンを指し、「ｍＣＰＢＡ」はメタ−クロロ過安息香酸を指し、「ＭｅＯＨ」はメタノールまたはメチルアルコールを指し、「ＮＡＤＰ^＋およびＮＡＨＰＨ」はそれぞれニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の酸化および還元形態を指し、「ＯＡｃ」は酢酸を指し、「ＰＧ」は保護基を指し、「Ｐｈ」はフェニルを指し、「Ｐｒｅｐ」は調製を指し、「ＰｙＢＯＰ」はベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩を指し、「ＰｙＢｒｏｐ」はブロモ−トリス−ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩を指し、「ｒｐｍ」は毎分の回転数を指し、「Ｒ_ｔ」は保持時間を指し、「ＳＣＸ」は強カチオン交換を指し、「ＳＦＣ」は、超臨界流体クロマトグラフィーを指し、「Ｓ_ＮＡｒ」は求核芳香族置換を指し、「ＴＥＡ」はトリエチルアミンを指し、「ＴＦＡ」はトリフルオロ酢酸を指し、「ＴＨＦ」はテトラヒドロフランを指し、および「Ｔｒｉｓ」はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを指す。

【0031】

本発明の化合物、またはその塩は、当該技術分野において既知の様々な方法によって調製されてよく、そのいくつかが以下のスキーム、調製および実施例に図示されている。記載される各経路の特異的な合成ステップは、様々な方法で、または異なるスキームからのステップと共に組み合わされてよく、本発明の化合物、またはその塩を調製する。以下のスキームにおける各ステップの生成物は、抽出、蒸発、析出、クロマトグラフィー、濾過、粉砕及び結晶化を含む、当該技術分野において周知の従来方法によって回収されることができる。以下のスキームにおいて、全ての置換基は、別途指示のない限り、以前に定義された通りである。試薬および出発物質は、当業者にとって容易に入手可能である。他に定義しない限り、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５は式Ｉについて定義した通りである。

【化3】

【0032】

スキーム１のステップＡにおいて、ＴＨＦなどの溶媒中で、トリエチルアミンおよびジ（イミダゾール−１−イル）アミンなどの有機塩基を使用して、２−置換−４−アミノエタノールピリミジン（１）を環化して置換ピリミジン２−オキサゾリジン−２−オン（３）にする。ピリミジン上のＸは、ハロゲンまたはメチルスルホニルのような他の脱離基であり得る。あるいは、化合物（２）については、Ｓ_ＮＡｒ反応でハロを置換オキサゾリジン−２−オンのアミンで置き換えて、ステップＢの生成物、化合物（３）を得ることができる。

【化4】

【0033】

スキーム２において、化合物（４）は、当業者に既知の様々な手順によって調製することができる。例えば、置換４−（１−アミノエチル）ベンズアルデヒドおよびピペラジンの還元的アミノ化により化合物（４）を得ることができる。あるいは、４−［１−（ハロメチル）フェニル］エタンアミンからハロゲン化物をアルキル化条件下、ピペラジンで置換することによっても、化合物（４）が得られる。ステップＣのサブステップ１において、化合物（４）の保護アミンを脱保護することができる。例えば、１−フェニルエチルアミンは、ＥｔＯＨなどの溶媒中、水酸化ナトリウム水溶液に暴露するなどのアルカリ性条件を使用して、標準的な脱保護条件下で脱保護して、ステップＣ、サブステップ１の遊離アミン生成物を得ることができる。あるいは、保護基がカルボキシベンジル基である場合、水素雰囲気下、ＥｔＯＨなどの溶媒中、１０％％Ｐｄ／Ｃを使用するなどの水素化分解条件により、ステップＣ、サブステップ１の脱保護生成物を提供することができる。次いで、化合物（４）の脱保護されたアミンは、ステップＣ、サブステップ２において、約−５０℃〜−２０℃の温度で、Ｅｔ_２Ｏのような溶媒を用いるＳ_ＮＡｒ反応において、２，４，６−トリフルオロ置換ピリミジンでアルキル化して、ステップＣ、サブステップ２の生成物、化合物（５）を得ることができる。第２のＳ_ＮＡｒアリール化は、４−ハロゲンまたは４−、［５または６］−ジハロゲン置換ピリミジン上で、ＤＭＦなどの溶媒中、水素化ナトリウムなどの塩基を用いて、約０℃の温度で、４−ハロゲンを置換オキサゾリジン−２−オンの窒素で置換して完了し、ステップＤの生成物、化合物（６）を得ることができる。

【0034】

別のルートでは、ステップＥ、サブステップ１において、化合物（４）をステップＣ、サブステップ１に記載のように脱保護し、次にステップＥ、サブステップ２、のＳ_ＮＡｒ反応でアルキル化することができる。例えば、脱保護後、ステップＥ、サブステップ１の生成物を、ＤＭＥなどの溶媒中、約マイクロ波条件下で約１２０℃の温度で、２位がメチルスルファニルなどの脱離基である、２−置換ピリミジン−６−オンでアリール化して、ステップＥ、サブステップ２の生成物、化合物（７）を得ることができる。ピリミドン（７）は、四塩化炭素を含む１，２−ＤＣＥなどの溶媒中でトリフェニルホスフィン樹脂を用いてハロゲン化し、約７０℃で加熱して、ステップＦの生成物、化合物（５）を得ることができる。次いで、化合物（５）を、ステップＤについて先に記載したのと同じ方法を実施して化合物６を得ることができる。

【化5】

【0035】

あるいは、スキーム３のステップＧのサブステップ１において、１−フェニルエチルアミン化合物（４）をスキーム２のステップＣのサブステップ１に記載のように脱保護して、ステップＧのサブステップ１の脱保護生成物を得ることができる。次いで、この１−フェニルエチルアミンを、Ｓ_ＮＡｒ反応におけるスキーム１のステップＡまたはＢの生成物である化合物（３）と、反応を促進するために、ＤＩＰＥＡ、フッ化セシウムなどの有機塩基を用いて、溶媒例えばＤＭＳＯ中、約７０〜１００℃の温度で反応させて、ステップＧのサブステップ２の生成物である化合物（６）、ステップＤ、スキーム２の類似生成物を得ることができる。Ｒ^１が−ＮＨ_２置換基である式Ｉの化合物については、スキーム２のステップＤまたはスキーム３のステップＧの保護されたピペラジン（６）は、一晩加熱しながら圧力容器中のＤＭＳＯ溶液中５または６フルオロピリミジンと水酸化アンモニウムとを反応させることにより、アミンアルキル化（アミノ−脱ハロハロゲン化（ａｍｉｎｏ−ｄｅｈａｌｏｈａｌｏｇｅｎａｔｉｏｎ））する。保護されたピペラジン（６）は、ジオキサン中のＨＣｌおよびＣＨ_２Ｃｌ_２中のＭｅＯＨまたはＴＦＡのような酸性脱保護法で脱保護して、ステップＨ、サブステップ１の脱保護されたピペラジンを得ることができる。オキサゾリジノンのＲ^２またはＲ^３基がＯ−ｔ−ブチルなどの酸不安定基で保護されている場合、この基の脱保護は、同じ操作でピペラジンの脱保護と共に達成することができる。ステップＨのサブステップ２において、ピペラジンアミンは、ＣＨ_２Ｃｌ_２などの溶媒中、トリエチルアミンのような有機塩基を用いてまたは用いずに、−７８〜０℃の温度で塩化アクリロイルでアシル化して、式Ｉの化合物を得ることができる。当業者であれば、アミドカップリングが、アクリル酸およびＤＭＦなどの溶媒中の適切なアミンと、ＥＤＣなどのカップリング試薬およびＨＯＢｔなどの添加剤とを用いて達成され得ることがわかるであろう。当業者であれば、カルボン酸とアミンとの反応によって生じるアミド形成のための多数の方法および試薬が存在することを理解するであろう。例えば、ＤＩＰＥＡまたはＴＥＡなどの有機塩基と共にまたはそれなしで、カップリング試薬の存在下において適切なアミンとアクリル酸との反応により、式Ｉの化合物を与え得る。他のカップリング試薬としては、ＤＣＣ、ＤＩＣなどのカルボジイミド、またはＣＤＩなどのカルボニルジイミダゾールが挙げられる。ＨＯＡｔなどの他のアミドカップリング添加剤は、反応を促進するためにも使用され得る。加えて、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＰｙＢＯＰ、およびＰｙＢｒＯＰなどの非求核性アニオンのウロニウムまたはホスホニウム塩が、より従来のカップリング試薬の代わりに使用される可能性がある。ＤＭＡＰなどの添加剤は、所望のアミド化反応を加速するために使用され、式Ｉの化合物を得ることができる。

【0036】

式Ｉの化合物は、多数の無機および有機酸と反応させることができ、薬学的に許容される酸付加塩を形成する。任意のステップにおいて、式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩は、標準条件下で、式Ｉの適切な遊離塩基と適切な溶媒中の適切な薬学的に許容される酸との反応によって形成され得る。加えて、そのような塩の形成は、窒素保護基の脱保護と同時に起こり得る。そのような塩の形成は、当該技術分野で周知であり、また理解されている。例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ，（ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００２）、Ｐ．Ｌ．Ｇｏｕｌｄ， “Ｓａｌｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｂａｓｉｃ ｄｒｕｇｓ，”Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，３３：２０１−２１７（１９８６）、Ｒ．Ｊ． Ｂａｓｔｉｎ， ｅｔ ａｌ． “Ｓａｌｔ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｎｅｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｔｉｔｉｅｓ”，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，４：４２７−４３５（２０００）およびＳ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅ，ｅｔ ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ６６：１−１９，（１９７７）を参照されたい。式Ｉの化合物は、薬学的に許容される塩として容易に変換され、分離され得ることを当業者は理解するであろう。

【化6】

【0037】

反応温度を２５℃未満に維持しながら、ＣＨ_２Ｃｌ_２（２．５Ｌ）中の（Ｓ）−（４−（１−アミノエチル）フェニル）メタノール（８１．８ｇ、５４１ｍｍｏｌ）溶液に、ＳＯＣｌ_２（８０ｍＬ、１．１ｍｍｏｌ）を、３０分にわたって滴下して添加する。４時間撹拌した後、混合物を濃縮して黄色固体を得る。ＡＣＮ（１Ｌ）を添加し、混合物を５００ｍＬに濃縮し、得られた固体を濾過し、オフホワイト固体を得て、これを真空下で乾燥させて、最初のロットの標記化合物を得る。母液も濃縮して、黄色固体として純度がより低い生成物（約２０ｇ）を供し得る。２つの生成物のロットを組み合わせ、標記化合物（１１１ｇ、７８％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１７０（Ｍ＋Ｈ）。

【化7】

【0038】

ＣＨ_２Ｃｌ_２（１６０ｍＬ）中の（１Ｓ）−１−［４−（クロロメチル）フェニル］エタンアミン塩酸塩（１０ｇ、４８．５ｍｍｏｌ）溶液に、０℃で、無水トリフルオロ酢酸（８．２ｍＬ、５８ｍｍｏｌ）を添加する。添加温度を５℃未満に維持しながら、ＴＥＡ（１５ｍＬ、１０８ｍｍｏｌ）を添加する。０℃で１時間撹拌した後、反応混合物を濃縮し、乾燥させ、ＡＣＮ（１２０ｍＬ）を添加し、続いてｔｅｒｔ−ブチルピペラジン−１−イルカルボネート（１３．５ｇ、７２．５ｍｍｏｌ）を添加する。Ｋ_２ＣＯ_３（２０ｇ、１４４．７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を６０℃に加熱し、１７時間撹拌する。溶媒を真空で除去し、ＥｔＯＡｃ（１Ｌ）を添加して固体を得る。固体を濾過により除去し、ＥｔＯＡｃ溶液を水およびブラインで洗浄する。有機相をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮乾固して残渣を得、これをシリカゲルクロマトグラフィー（１０〜５０％アセトン／ＣＨ_２Ｃｌ_２）で精製して、標記化合物を白色泡状物として得る（１５．８ｇ、７８％）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４１６（Ｍ＋Ｈ）。

【化8】

【0039】

ＣＨ_２Ｃｌ_２（１５０ｍＬ）中の［４−［（１Ｓ）−１−アミノエチル］フェニル］メタノール（１０．８ｇ、７１．４ｍｍｏｌ）の０℃の溶液に無水トリフルオロ酢酸（１２ｍＬ、８５．４ｍｍｏｌ）を添加する。１０分後、ＣＨ_２Ｃｌ_２（８ｍＬ）中のＴＥＡ（２４ｍＬ、１７２ｍｍｏｌ）を３０分かけて滴下し、冷却浴を除去し、反応物を一晩撹拌する。反応混合物を減圧下で濃縮し、追加のＣＨ_２Ｃｌ_２で希釈し、１Ｎ ＨＣｌ水溶液および水で洗浄する。有機相を乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、濃縮する。粗物質を０〜５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンの勾配で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、標記化合物を白色固体として得る（１１．１ｇ、４４．９ｍｍｏｌ、６３％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：２４６（Ｍ−Ｈ）。

【化9】

【0040】

ＣＨ_２Ｃｌ_２（４５０ｍＬ）中の２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−［（１Ｓ）−１−［４−（ヒドロキシメチル）フェニル］エチル］アセトアミド（１１．１ｇ、４４．９ｍｍｏｌ）の０℃の溶液にデス−マーチンペルヨージナン（２０．９ｇ、４９．３ｍｍｏｌ）を添加する。反応混合物を一晩撹拌し、室温まで温める。反応混合物を追加のＣＨ_２Ｃｌ_２で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液、飽和Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_３水溶液およびブラインで洗浄する。合わせた有機物を乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、濃縮して残渣を得、これを０〜５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンの勾配で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、標記化合物を白色固体として得る（９．５ｇ、３９ｍｍｏｌ、８６％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：２４４（Ｍ−Ｈ）。

【化10】

【0041】

ＴＨＦ（１００ｍＬ）中の（Ｓ）−２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−（１−（４−ホルミルフェニル）エチル）アセトアミドの溶液（４．５ｇ、１８．３５ｍｍｏｌ）に０℃でエチルマグネシウムブロマイド（１２．２３ｍＬ、３６．７ｍｍｏｌ、Ｅｔ_２Ｏ中３Ｍ）を１５分かけて添加する。４５分後、ＮＨ_４Ｃｌ飽和水溶液を加えて反応混合物をクエンチし、ＥｔＯＡｃと水との間に分配する。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、濃縮して、標題化合物をワックス状白色固体として得る（５．７４ｇ、１９ｍｍｏｌ、純度９１％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：２７４（Ｍ−Ｈ）。

【化11】

【0042】

ＣＨ_２Ｃｌ_２（１５０ｍＬ）中の２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−（（１Ｓ）−１−（４−（１−ヒドロキシプロピル）フェニル）エチル）アセトアミド（５ｇ、１８．２ｍｍｏｌ）の溶液に０℃で塩化チオニル（４．６３ｍＬ、６３．６ｍｍｏｌ）を滴下で添加する。反応混合物を室温で２時間撹拌する。混合物を濃縮して、標題化合物をベージュ色の固体（５．３３ｇ、１８．２ｍｍｏｌ、１００％）として得て、これをさらに精製することなく使用する。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：２９２（Ｍ−Ｈ）。

【化12】

【0043】

内部温度を−７０℃より下に保つようにして、ＴＨＦ（６００ｍＬ）中のＮ−［（１Ｓ）−１−（４−ブロモフェニル）エチル］−２，２，２−トリフルオロ−アセトアミド（１８．００ｇ、６０．７９ｍｍｏｌ）溶液に−７８℃で、ｎ−ブチルリチウム（ヘキサン中２．５Ｍ、５３ｍＬ、１３０ｍｍｏｌ）を滴下で添加する。添加が完了した後、混合物を−７８℃で４５分間撹拌し、ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の溶液として２−シクロプロピル−Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチル−アセトアミド（１１．４ｇ、７９．６ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を−７８℃で４５分間撹拌し、飽和塩化アンモニウム水溶液を添加し、混合物を室温に温める。層を分離し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。固体に少量のＣＨ_２Ｃｌ_２を加え、混合物を短時間加熱してこの固体を溶解する。混合物を沈殿直前まで濃縮し、次いで激しく撹拌しながらヘキサン（１５０ｍＬ）を滴下で添加して無色の固体を得る。濾過により固体を集め、少量のヘキサンで洗浄し、減圧下で乾燥させて、標記化合物（１３．８２ｇ、７６％）を無色の固体として得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２９８．３（Ｍ−Ｈ）。

【化13】

【0044】

１−（４−ブロモフェニル）−２−フルオロ−エタンアミン（１０ｇ、４５．９ｍｍｏｌ）を含む水（１１５ｍＬ）とＣＨ_２Ｃｌ_２（６０ｍＬ）の二相溶媒混合物に室温で炭酸ナトリウム（１７ｇ、１６０．３ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を０℃に冷却し、クロロギ酸ベンジル（８．４５ｍＬ、５７．３ｍｍｏｌ）を滴下で添加する。０℃で２時間撹拌した後、反応混合物を室温で一晩撹拌し、次いでＣＨ_２Ｃｌ_２で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液、水およびブラインで洗浄する。有機相を乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、濃縮し、最少量のＥｔＯＡｃに溶解する。沈殿が観察されるまでヘキサンを添加し、固体を濾過し、追加のヘキサンで洗浄する。標記化合物をベージュ色の固体として得る（１２ｇ、３４．１ｍｍｏｌ、７４％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：３５２（Ｍ＋Ｈ）。

【化14】

【0045】

ＰａｒｒオートクレーブにＰｄ（ＯＡｃ）_２（７７４ｍｇ、３．２８ｍｍｏｌ）、ＤＰＰＦ（２．３ｇ４ｍｍｏｌ）、ベンジル（１−（４−ブロモフェニル）−２−フルオロエチル）カルバメート（１２ｇ、３４．１ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＨ（１２０ｍＬ）、ＣＨ_３ＣＮ（１８０ｍＬ）およびＴＥＡ（１２ｍＬ）を加える。容器を密閉し、パージし、ＣＯガス（１００ｐｓｉ）で加圧する。反応物を８５℃で２４時間撹拌し、次いで室温に冷却する。Ｐａｒｒ反応器を排気し、反応混合物を濃縮する。５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出するシリカゲルクロマトグラフィー続いて最少量のＥｔＯＡｃからの沈殿およびヘキサンのゆっくりとした添加により所望の生成物を精製する。標記化合物をオレンジ色の固体として得る（９．５ｇ、２９ｍｍｏｌ、８４％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：３３２（Ｍ＋Ｈ）。

【化15】

【0046】

ＴＨＦ（１６０ｍＬ）中のメチル４−（１−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）−２−フルオロエチル）ベンゾエート（９．５ｇ、２９ｍｍｏｌ）の溶液に、室温でＭｅＯＨ（８０ｍＬ）および２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（８０ｍＬ、１６０ｍｍｏｌ）を添加する。一晩撹拌した後、反応混合物を６Ｎ ＨＣｌ水溶液でｐＨ４に酸性化する。混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、濃縮して、標記生成物をベージュ色の固体（９．２ｇ、２９ｍｍｏｌ、１００％）として得、これをさらに精製することなく使用する。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：３１６（Ｍ−Ｈ）。

【化16】

【0047】

ＴＨＦ（１５０ｍＬ）中の４−（１−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）−２−フルオロエチル）安息香酸（９．２ｇ、２９ｍｍｏｌ）溶液に、０℃でボランジメチルスルフィド（５１ｍＬ、１０２ｍｍｏｌ、ＴＨＦ中２Ｎ）を滴下で添加する。反応物を２．５時間７０℃に加温する。室温に冷却した後、さらなるガス発生が観察されなくなるまでＭｅＯＨを滴下して反応混合物をクエンチする。次いで、反応混合物を濃縮し、ＭｅＯＨに再溶解し、再び濃縮する。このＭｅＯＨの添加／濃縮を２回繰り返して、黄色−褐色の油状物（６．６５ｇ、２１．９ｍｍｏｌ、７６％）として標記化合物を得、さらに精製することなく使用する。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：３０４（Ｍ＋Ｈ）。

【化17】

【0048】

ＥｔＯＨ（２００ｍＬ）中のベンジル（２−フルオロ−１−（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）エチル）カルバメート（６．６５ｇ、２１．９ｍｍｏｌ）の溶液を、ＥｔＯＨ（２００ｍＬ）に懸濁させた１０重量％パラジウム炭素（２．３３ｇ、２．１９ｍｍｏｌ）に添加する。溶液をＮ_２でパージし、Ｈ_２で充填した後、Ｈ_２（バルーン）の注入口を加え、反応物を室温で一晩撹拌する。この溶液をケイソウ土で濾過する。追加の１０重量％パラジウム炭素（２．３３ｇ、２．１９ｍｍｏｌ）を濾液に加え、反応混合物をＨ_２バルーン下でさらに６時間撹拌する。溶液をケイソウ土で濾過し、濾液を濃縮乾燥して標記化合物を灰色固体（３．９ｇ、１６ｍｍｏｌ、純度７０％）として得て、さらに精製することなく使用する。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：１７０（Ｍ＋Ｈ）。

【化18】

【0049】

ＣＨ_２Ｃｌ_２（８０ｍＬ）中の（４−（１−アミノ−２−フルオロエチル）フェニル）メタノール（３．９ｇ、１６ｍｍｏｌ、７０％純度）の溶液に０℃で塩化チオニル（４．７ｍＬ、６５ｍｍｏｌ）を添加する。反応物を室温で４時間撹拌する。固体を濾別し、Ｅｔ_２Ｏで洗浄し、次いで水に溶解し、ＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出し、ＭｅＯＨでさらに希釈し、濃縮して残渣を得、これを１０〜１００％ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏで溶出する逆相クロマトグラフィーで精製し、標記化合物を白色固体として得る（２．４ｇ、１１ｍｍｏｌ、６６％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：１８８（Ｍ＋Ｈ）。

【化19】

【0050】

ＡＣＮ（５０ｍＬ）中の１−（４−（クロロメチル）フェニル）−２−フルオロエタン−１−アミン塩酸塩（２．４ｇ、１１ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ−ブチルピペラジン−１−カルボキシレート（４ｇ、２１．５ｍｍｏｌ）の溶液に室温で炭酸カリウム（５．９ｇ、４３ｍｍｏｌ）を添加する。反応混合物を６０℃で２４時間撹拌し、室温に冷却し、濃縮する。粗反応物をＣＨ_２Ｃｌ_２に懸濁させ、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液およびブラインで洗浄する。有機相を乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、濃縮して残渣を得、これを１０〜１００％ＣＨ_３ＣＮ／重炭酸アンモニウム水溶液で溶出する逆相クロマトグラフィーにより精製して、標記化合物を黄色の油状物として得る（２．４７ｇ、７．３２ｍｍｏｌ、６８％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：３３８（Ｍ＋Ｈ）。

【化20】

【0051】

ＥｔＯＨ（２．４Ｌ）中のｔｅｒｔ−ブチル４−［［４−［（１Ｓ）−１−［（２，２，２−トリフルオロアセチル）アミノ］エチル］フェニル］−メチル］−ピペラジン−１−カルボキシレート（２０３ｇ、０．４８９モル）溶液に、室温で、５Ｍの水性ＮａＯＨ（４８０ｍＬ、２．４０モル）を添加する。室温で３．５時間撹拌した後、反応混合物を濃縮し、ＥｔＯＨの大部分を除去する。ＥｔＯＡｃ（２Ｌ）を添加して残渣を溶解し、有機溶液を水およびブラインで洗浄する。合わせた水相を、ＥｔＯＡｃ（２×）で抽出する。合わせた有機抽出物をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、濃縮して乾燥させ、黄色粘性油（１５６ｇ、９３％）として粗標記化合物を得、これをさらに精製を行うことなく使用する。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３２０（Ｍ＋Ｈ）。

【化21】

【0052】

ＣＨ_３ＣＮ（９０ｍＬ）中のＮ−（（１Ｓ）−１−（４−（１−クロロプロピル）フェニル）エチル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミド（４．９ｇ、１７ｍｍｏｌ）および１−Ｂｏｃ−ピペラジン（３．７ｇ、２０ｍｍｏｌ）の溶液にＫ_２ＣＯ_３（９．２ｇ、６７ｍｍｏｌ）およびＮａＩ（１．５ｇ、１０ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を９０℃で３時間撹拌し、次いで室温に冷却する。固体を濾別し、濾液を濃縮し、１０〜４０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出するシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、標記化合物を油状物として得る（５．５６ｇ、１２．５ｍｍｏｌ、７５％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４４４（Ｍ＋Ｈ）。

【化22】

【0053】

ＴＨＦ（８０ｍＬ）中のＮ−［（１Ｓ）−１−［４−（２−シクロプロピルアセチル）フェニル］エチル］−２，２，２−トリフルオロ−アセトアミド（１２．０ｇ、４０．１ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ−ブチルピペラジン−１−カルボキシレート（１７．９ｇ、９６．１ｍｍｏｌ）の溶液にチタン（ＩＶ）イソプロポキシド（６０ｍＬ、２００ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を６０℃で一晩撹拌する。混合物を室温に冷却し、ＭｅＯＨ（８０ｍＬ）を添加し、続いてシアノ水素化ホウ素ナトリウム（５．３ｇ、８０ｍｍｏｌ）を少量ずつ加える。混合物を室温で８時間撹拌し、次いで水およびＭｅＯＨを添加し、混合物を室温で一晩撹拌する。混合物を濾過して固体を除去し、この固体をＭｅＯＨおよび水で濯ぐ。濾液を部分的に濃縮して大部分のＭｅＯＨを除去し、残渣をＥｔＯＡｃ（２×）で抽出する。合わせた有機抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。粗物質を、溶媒Ｂが１：１のヘキサン：ＣＨ_２Ｃｌ_２である溶媒Ｂ中の０％〜３０％ＥｔＯＡｃの勾配で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、標記化合物（１０．５ｇ、５６％）を無色固体として得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４７０．３（Ｍ＋Ｈ）。

【化23】

【0054】

ＥｔＯＨ（５０．１ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル４−（１−（４−（（Ｓ）−１−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）エチル）フェニル）プロピル）ピペラジン−１−カルボキシレート（５．５６ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＫＯＨ（３．５２ｇ、６２．７ｍｍｏｌ）を水（１１ｍＬ）形態で添加する。混合物を室温で３時間撹拌し、濃縮し、ＣＨ_２Ｃｌ_２と飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液との間で分配する。有機相を分離し、ブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ_２ＣＯ_３）、濾過し、濃縮して、標記化合物を油状物として得（４．３１ｇ、１２ｍｍｏｌ、９６％）、これをさらに精製することなく使用する。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：３４８（Ｍ＋Ｈ）。

【化24】

【0055】

ＥｔＯＨ（３５０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル４−［２−シクロプロピル−１−［４−［（１Ｓ）−１−［（２，２，２−トリフルオロアセチル）アミノ］エチル］フェニル］エチル］ピペラジン−１−カルボキシレート（３２．２４ｇ、６８．６７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＫＯＨ水溶液（５Ｍ、６９ｍＬ、３５０ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を室温で４時間撹拌する。ＥｔＯＨを減圧下で除去し、残渣に飽和重炭酸ナトリウム水溶液を添加し、混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出する。合わせた有機抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、無色の粘性油状物として標記化合物（２４．３３ｇ、純度９６．５％、残留ＣＨ_２Ｃｌ_２３．５％、収率９２％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３７４．３（Ｍ＋Ｈ）。

【化25】

【化26】

【0056】

ｔｅｒｔ−ブチル４−［１−［４−［（１Ｓ）−１−アミノエチル］フェニル］−２−シクロプロピル−エチル］ピペラジン−１−カルボキシレート（３．２３ｇ）をＭｅＯＨ（４０ｍＬ）に溶解し、以下の条件を使用して分取キラルＨＰＬＣクロマトグラフィーによって個々のジアステレオマーを分離する：カラムＣｈｉｒａｌｐａｋ ＡＤ、２０μｍ（８×３３ｃｍ）、注入量１０ｍＬ、溶離液０．２％ＤＭＥＡを含む１００％メタノール、検出波長２２０ｎｍ、流速４００ｍＬ／分。実施例１９ａ、ｔｅｒｔ−ブチル４−［１−［４−［（１Ｓ）−１−アミノエチル］フェニル］−２−シクロプロピル−エチル］ピペラジン−１−カルボキシレート、異性体１を最初の溶出ピークから透明粘稠な油状物（１．５０ｇ、４６％、＞９９％ｄｅ、Ｒ_ｔ＝４．２分）として得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３７４．３（Ｍ＋Ｈ）。実施例１９ｂ、ｔｅｒｔ−ブチル４−［１−［４−［（１Ｓ）−１−アミノエチル］フェニル］−２−シクロプロピル−エチル］ピペラジン−１−カルボキシレート、異性体２を２番目の溶出ピークからが透明粘稠な油状物（１．４６ｇ、４５％、＞９８．２％ｄｅ、Ｒ_ｔ＝５．７分）として得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３７４．３（Ｍ＋Ｈ）。

【化27】

【0057】

ＣＨ_３ＣＮ（６０ｍＬ）中の４−クロロ−２−メチルスルファニル−ピリミジン（４．２ｇ、２６ｍｍｏｌ）および２−アミノエタノール（３．２ｇ、５２ｍｍｏｌ）の溶液にＤＩＰＥＡ（５ｍＬ、２９ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を８０℃で２時間撹拌した後、５０℃で濃縮する。粗生成物をＥｔＯＡｃに溶解し、水で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ_２ＣＯ_３）、濾過し、濃縮する。０〜１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンの勾配で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーにより物質を精製して、標記化合物を白色固体として得る（３．３３ｇ、１８．０ｍｍｏｌ、６９％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：１８６（Ｍ＋Ｈ）。

【化28】

【0058】

ＴＥＡ（０．８６４ｍＬ、６．２ミリモル）を、ＴＨＦ（１２．４ｍＬ）中の（２Ｓ）−２−［（２−クロロピリミジン−４−イル）アミノ］ブタン−１−オール（１．２５ｇ、６．２ｍｍｏｌ）（独国公開公報第１０２００９００１４３８号、２０１０年９月１６日）およびジ（イミダゾール−１−イル）メタノン（１．２１ｇ、７．４４ｍｍｏｌ）の溶液に室温で添加する。５時間撹拌した後、追加のジ（イミダゾール−１−イル）メタノン（１．２１ｇ、７．４４ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（０．８６４ｍＬ、６．２ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を５０℃に加温し、３時間撹拌する。加熱を除去し、得られた混合物を１６時間放置した後、水で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×）で抽出する。次いで、合わせた有機抽出物を１Ｍ ＨＣｌ水溶液およびブラインで洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、濃縮して、白色固体（１．２０ｇ、５．２７ｍｍｏｌ、８５％）として標記化合物を得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：２２８（Ｍ＋Ｈ）。

【0059】

適切な試薬を使用して、調製２１の方法と本質的に同じ方法で、以下の化合物を調製する。

【表1】

【化29】

【0060】

ＣＨ_２Ｃｌ_２（７１ｍＬ）中の３−（２−メチルスルファニルピリミジン−４−イル）オキサゾリジン−２−オン（３．０ｇ、１４ｍｍｏｌ）の溶液に、ｍＣＰＢＡ（７．４ｇ、３０ｍｍｏｌ、７０重量％）を室温で添加する。１時間撹拌した後、固体を濾別し、濾液を濃縮して固体を得る。固体をＥｔ_２Ｏでトリチュレートし、真空下で乾燥させて、標記化合物を白色固体として得る（２．６３ｇ、９．３０ｍｍｏｌ、純度８６％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：２４４（Ｍ＋Ｈ）。

【化30】

【0061】

ＤＭＦ（１６．５ｍＬ）中の２，４−ジクロロピリミジン（１．４７ｇ、９．８９ｍｍｏｌ）および（Ｓ）−４−メチルオキサゾリジン−２−オン（８７７ｍｇ、８．２ｍｍｏｌ、９５％純度）の溶液に、固体として水素化ナトリウム（３７９ｍｇ、９．４８ｍｍｏｌ、鉱油中６０％）を室温で添加する。室温で１６時間撹拌後、混合物を飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（３×）で抽出する。有機抽出物を合わせて、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、濃縮する。粗物質を９：１ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨに溶解し、望ましくない白色固体を濾別する。濾液中で得られた粗生成物を５％〜１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンの勾配で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、標記化合物を白色固体として得る（５１８ｍｇ、２．４２ｍｍｏｌ、２９％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：２１４（Ｍ＋Ｈ）。

【化31】

【0062】

ＴＨＦ（３０ｍＬ）中のイソブチルクロロホルメート（０．６４０ｍＬ、４．９０ｍｍｏｌ）およびＮ−シクロヘキシルシクロヘキサンアンモニウム（２Ｓ、３Ｓ）−２−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）−３−ｔｅｒｔ−ブトキシ−ブタノエート（２．００ｇ、４．０８ｍｍｏｌ）に２５℃で４−メチルモルホリン（０．５４０ｍＬ、４．９ｍｍｏｌ）を添加する。１０分後、固体を濾過により除去し、最小限の無水ＴＨＦですすいだ。濾液を−２０℃に冷却し、水素化ホウ素ナトリウム（２３１ｍｇ、６．１ｍｍｏｌ）を添加し、続いて水（４ｍＬ）を添加する。混合物を−２０℃で１０分間撹拌し、次いで室温で２時間撹拌する。水を添加し、混合物をＥｔＯＡｃ（２×）で抽出する。合わせた有機抽出物をブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、濃縮して、標記化合物を黄色油状物として得る（１．３６７ｇ、３．９３ｍｍｏｌ、純度８５％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：２４０（Ｍ＋Ｈ−ｔ−ブチル）。

【0063】

適切な試薬を使用して、調製２５の方法と本質的に同じ方法で、以下の化合物を調製する。

【表2】

【化32】

【0064】

ＤＭＦ（４０ｍＬ）中のベンジル（（２Ｒ、３Ｓ）−３−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−１−ヒドロキシブタン−２−イル）カルバメート（２．６１ｇ、７．５１ｍｍｏｌ）の溶液に、水素化ナトリウム（６１６ｍｇ、１５．４ｍｍｏｌ、鉱油中６０％）を０℃で添加し、混合物を３０分間撹拌する。この混合物に、４−メトキシベンジルクロライド（１．４９ｍＬ、１１．３ｍｍｏｌ）およびヨウ化テトラブチルアンモニウム（２７７ｍｇ、０．７４９ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を室温まで温め、一晩撹拌する。反応混合物を氷水（２００ｍＬ）に注ぎ、撹拌しながらＥｔＯＡｃを添加する。ＥｔＯＡｃ層を分離し、水相を追加のＥｔＯＡｃ（２×）で抽出する。合わせたＥｔＯＡｃ抽出液を５％ＬｉＣｌ水溶液（２×）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、濃縮して残渣を得、これを０〜２０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出するシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、標記化合物（１．９１ｇ、６．２１ｍｍｏｌ、８３％）を得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：３０８（Ｍ＋Ｈ）。

【0065】

適切な試薬を使用して、調製２７の方法と本質的に同じ方法で、以下の化合物を調製する。

【表3】

【化33】

【0066】

ＣＨ_２Ｃｌ_２（１５ｍＬ）中の（Ｒ）−４−（（Ｓ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）エチル）−３−（４−メトキシベンジル）オキサゾリジン−２−オン（２．３１ｇ、７．５ｍｍｏｌ）の溶液に、室温でＴＦＡ（１５ｍＬ、１９８ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を２０分間撹拌し、濃縮乾燥する。粗生成物を追加のＣＨ_２Ｃｌ_２に再溶解し、濃縮する。ＣＨ_２Ｃｌ_２の添加および濃縮をもう一度繰り返して、黄色油状物（１．９７ｇ、７．５１ｍｍｏｌ、１００％）として標記化合物を得、これをさらに精製することなく使用する。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：２５２（Ｍ＋Ｈ）。

【0067】

適切な試薬を使用して、調製２９の方法と本質的に同じ方法で、以下の化合物を調製する。

【表4】

【化34】

【0068】

ＣＨ_３ＣＮ（１３ｍＬ）中の（Ｒ）−４−（（Ｓ）−１−ヒドロキシエチル）−３−（４−メトキシベンジル）オキサゾリジン−２−オン（９８５ｍｇ、３．９２ｍｍｏｌ）の溶液を、０℃で、ＴＥＡ（５ｍＬ、３５．９ｍｍｏｌ）にて処理する。ノナフルオロブタンスルホニルフルオライド（２．１１ｍＬ、１１．７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン三フッ化水素（１．９４ｍＬ、１１．７ｍｍｏｌ）を順次添加し、混合物を０℃で１時間撹拌する。追加のノナフルオロブタンスルホニルフルオライド（０．９ｍＬ、５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン三フッ化水素（１ｍＬ、６ｍｍｏｌ）、およびＴＥＡ（２．５ｍＬ、１７．９５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を０℃で４５分間撹拌する。さらなるノナフルオロブタンスルホニルフルオライド（１．０５ｍＬ、５．８ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン三フッ化水素（１ｍＬ、６ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（２．５ｍＬ、１７．９５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を３０分間撹拌する。混合物を水でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（３×）で抽出する。合わせた有機抽出物を、ブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、濃縮しする。粗混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解し、固体を濾別する。得られた濾液を濃縮し、残渣を２０〜６０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンの勾配で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、標記化合物を黄色油状物として得る（３００ｍｇ、１．１８ｍｍｏｌ、３０％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：２５４（Ｍ＋Ｈ）。

【0069】

適切な試薬を使用して、調製３１の方法と本質的に同じ方法で、以下の化合物を調製する。

【表5】

【化35】

【0070】

ＴＦＡ（６ｍＬ）中の（Ｒ）−４−（（Ｒ）−１−フルオロエチル）−３−（４−メトキシベンジル）オキサゾリジン−２−オン（２９０ｍｇ、１．１５ｍｍｏｌ）の溶液を６５℃で４０時間加熱する。混合物を室温に冷却し、真空下で濃縮する。粗生成物を追加のＣＨ_２Ｃｌ_２に再溶解し、濃縮する。これをもう一度繰り返して残留ＴＦＡを除去する。粗残渣を３０〜８０％ＥｔＯＡｃ／ＣＨ_２Ｃｌ_２の勾配で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、標記化合物を琥珀色の油状物として得る（１４１ｍｇ、１．０６ｍｍｏｌ、９３％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：１３４（Ｍ＋Ｈ）。

【0071】

適切な中間体を使用して、調製３３の方法と本質的に同じ方法で、以下の化合物を調製する。

【表6】

【化36】

【0072】

ＴＨＦ（７０ｍＬ）中のベンジルＮ−［（１Ｒ、２Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシ−１−（ヒドロキシメチル）プロピル］カルバメート（４．３５ｇ、１３．７ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃で水素化ナトリウム（８２２ｍｇ、２０．６ｍｍｏｌ、鉱油中６０％）を添加する。０℃で１時間撹拌した後、反応混合物を室温まで一晩温める。混合物を飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（２×）で抽出し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、濃縮する。この物質を３０〜７０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンの勾配で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、標記化合物を放置すると白色固体になる無色の油状物として得る（１．９５ｇ、９．３５ｍｍｏｌ、純度９０％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：１８８（Ｍ＋Ｈ）。

【化37】

【0073】

ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の（４Ｒ）−４−［（１Ｓ）−１−ヒドロキシエチル］−３−［（４−メトキシフェニル）メチル］−オキサゾリジン−２−オン（９８５ｍｇ、３．９２ｍｍｏｌ）の溶液に０℃で水素化ナトリウム（３００ｍｇ、７．５ｍｍｏｌ、鉱油中６０％）を添加する。３０分後、ＣＨ_３Ｉ（０．７３２ｍＬ、１１．７５ｍｍｏｌ）を添加する。さらに３０分後、追加の水素化ナトリウムを添加し（１００ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ、鉱油中６０％）、反応物を４５分間撹拌し、次いで飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液でクエンチさせ、水を加え、反応混合物ＥｔＯＡｃ（３×）で抽出する。合わせた有機抽出物を乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、濃縮して残渣を得、これを２５〜６０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンの勾配で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、標記化合物を無色油状物として得る（４２３ｍｇ、１．５９ｍｍｏｌ、４１％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：２６６（Ｍ＋Ｈ）。

【0074】

適切な中間体を使用して、調製３８の方法と本質的に同じ方法で、以下の化合物を調製する。

【表7】

【化38】

【0075】

フッ化セシウム（９．３５ｇ、６１．６ｍｍｏｌ）を、ＤＭＳＯ（５０ｍＬ）中の（Ｓ）−３−（２−クロロピリミジン−４−イル）−４−イソプロピルオキサゾリジン−２−オン（７．４４ｇ、３０．８ｍｍｏｌ）［ＰＣＴ国際出願（２０１３）、ＷＯ２０１３／０４６１３６］の溶液に室温で添加する。次いで、ＤＩＰＥＡ（８．０５ｍＬ、４６．２ｍｍｏｌ）を添加する。得られた混合物を、ＤＭＳＯ（５０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル４−［［４−［（１Ｓ）−１−アミノエチル］フェニル］メチル］ピペラジン−１−カルボキシレート（１０．０ｇ、３１．４ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。この反応混合物を６０℃で６時間、７０℃で１７．５時間、９０℃で１．５時間加熱する。反応混合物を冷却し、ＮａＣｌ（５０％飽和）水溶液で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３ｘ）で抽出する。有機抽出物を合わせ、ブラインで洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、濃縮して残渣を得、これをシリカゲルクロマトグラフィー（３５〜９５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製して、標記化合物を得る（１０．７２ｇ、２０．４ｍｍｏｌ、６６％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：５２５（Ｍ＋Ｈ）。

【0076】

適切な中間体を使用して調製４０の方法と本質的に同じ方法で以下の化合物を調製する。

【表8-1】

【表8-2】

【化39】

【0077】

ＤＭＳＯ（３．０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル４−［１−［４−［（１Ｓ）−１−アミノエチル］フェニル］−２−シクロプロピル−エチル］ピペラジン−１−カルボキシレート（３５０ｍｇ、０．９１ｍｍｏｌ）、（４Ｒ）−４−［（１Ｒ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシエチル］−３−（２−クロロピリミジン−４−イル）オキサゾリジン−２−オン（２７３ｍｇ、０．９１ｍｍｏｌ）、フッ化セシウム（１５２ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）およびＤｉＰＥＡ（０．１７ｍＬ、１．００ｍｍｏｌ）の混合物を密閉バイアル中で約８５℃に加熱する。約６時間後、混合物を室温に冷却し、Ｅｔ_２Ｏと水との間で分配する。有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、濃縮する。粗物質をヘキサン中の２０％〜５０％ＥｔＯＡｃの勾配で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、標記化合物を油状物として得る（２８８ｍｇ、０．４４８ｍｍｏｌ、４９％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：６３７．４（Ｍ＋Ｈ）。

【化40】

【0078】

ＤＭＳＯ（１７ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル４−［１−［４−［（１Ｓ）−１−アミノエチル］フェニル］−２−シクロプロピル−エチル］ピペラジン−１−カルボキシレート、異性体１（１．３ｇ、３．４８ｍｍｏｌ）、（４Ｓ）−３−（２−クロロピリミジン−４−イル）−４−イソプロピル−オキサゾリジン−２−オン（１．０９ｇ、４．５１ｍｍｏｌ）、フッ化セシウム（１．５９ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）およびＤｉＰＥＡ（０．９１１ｍＬ、５．２２ｍｍｏｌ）の混合物を７０℃の予熱ブロックに入れ、２時間撹拌する。反応混合物を室温に冷却し、ＥｔＯＡｃで希釈し、３×水で洗浄する。合わせた水層を２×ＥｔＯＡｃで再抽出する。有機抽出物を合わせ、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧除去して粗生成物を得る。生成物をヘキサン中の３０〜６０％ＥｔＯＡｃの勾配を用いるシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、標記化合物（１．９７ｇ、９３％）を白色非晶質固体として得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ５７９（Ｍ＋Ｈ）。

【0079】

以下の化合物を、調製例５１の方法と本質的に同じ方法で調製する

【表9】

【化41】

【0080】

ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−（１−（（４−（（Ｓ）−４−エチル−２−オキソオキサゾリジン−３−イル）ピリミジン−２−イル）アミノ）−２−フルオロエチル）ベンジル）ピペラジン−１−カルボキシレート（５４０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（４ｍＬ）に溶解し、以下の条件を用いてキラルＳＦＣクロマトグラフィーにより分割する：カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＡＳ−Ｈ、２１．２×１５０ｍｍ）、注入容量：０．９ｍＬ×５、溶離液：１５％ＩＰＡ（０．２％ＩＰＡｍ）／ＣＯ_２、検出波長：２２５ｎｍ、溶出時間：１０分、流速：７０ｇ／分、カラム温度：４０℃、ＢＰＲ設定値：１００バール、ＢＰＲ温度：３５℃。標記化合物を第２の溶出ピーク（異性体２）として、白色固体として単離する（２６０ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ、４８％、Ｒ_Ｔ＝３．０４、＞９９％ｅｅ）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：５２９（Ｍ＋Ｈ）。

【0081】

調製５３の方法と本質的に同じ方法で以下の化合物を調製する。

【表10】

【化42】

【0082】

Ｅｔ_２Ｏ（１０ｍＬ）中の２，４，６−トリフルオロピリミジン（２７８ｍｇ、２．０７ｍｍｏｌ）の溶液を−２０℃に冷却し、Ｅｔ_２Ｏ（１０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル４−［［４−［（１Ｓ）−１−アミノエチル］フェニル］メチル］ピペラジン−１−カルボキシレート（６００ｍｇ、１．８８ｍｍｏｌ）の溶液で、滴下で処理する。得られた混合物を−２０℃で１時間撹拌し、次いで室温まで温め、一晩撹拌する。固体を濾過により除去し、追加のＥｔ_２Ｏで洗浄する。濾液を少量のＮａＣｌ添加剤を用いて水で洗浄して乳化を減少させ、水層をＥｔ_２Ｏ（１×）およびＣＨ_２Ｃｌ_２（１×）で逆抽出する。合わせた有機抽出物を次いで乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、濃縮して粗生成物を得、これを２０〜６０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出するシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、標記化合物を淡黄色の油状物として得る（６０６ｍｇ、１．４０ｍｍｏｌ、７４％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４３４（Ｍ＋Ｈ）。

【化43】

【0083】

Ｅｔ_２Ｏ（５６ｍＬ）中の２，４，６−トリフルオロピリミジン（１．７ｇ、１３ｍｍｏｌ）の溶液を−３０〜−４０℃に冷却し、Ｅｔ_２Ｏ（５６ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル４−［１−［４−［（１Ｓ）−１−アミノエチル］フェニル］−２−シクロプロピル−エチル］ピペラジン−１−カルボキシレート、異性体１（５．５ｇ、１５ｍｍｏｌ）の溶液で、滴下で処理する。混合物を撹拌し、温度を−３０〜−４０℃で４５分間維持する。４５分後、冷却浴を除去し、反応物を室温で一晩撹拌する。反応物を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で希釈し、３×ＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出する。有機層を合わせ、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、２０％〜５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンの勾配を用いるシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、標記化合物（５．３１８ｇ、７４％）を白色非晶質固体として得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ４８８（Ｍ＋Ｈ）。

【0084】

適切な中間体を使用して、調製例５８の方法と本質的に同じ方法で、以下の化合物を調製する。

【表11】

【化44】

【0085】

ＤＭＦ（６ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル（Ｓ）−４−（４−（１−（（４，６−ジフルオロピリミジン−２−イル）アミノ）エチル）ベンジル）ピペラジン−１−カルボキシレート（５５０ｍｇ、１．２７ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃で水素化ナトリウム（６１ｍｇ、１．５３ｍｍｏｌ、鉱油中６０％）を添加する。１分後、（Ｓ）−４−イソプロピルオキサゾリジン−２−オン（１８０ｍｇ、１．３９ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を０℃で１時間撹拌し、続いて室温に温め、一晩撹拌する。次いで、反応混合物を水でクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出する。ＥｔＯＡｃ抽出物を５％ＬｉＣｌ水溶液（２×）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、濃縮して残渣を得、これを３０〜５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンの勾配で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、標記化合物の固体を得る（５００ｍｇ、０．９２ｍｍｏｌ、７３％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：５４３（Ｍ＋Ｈ）。

【0086】

適切な中間体を使用して、調製６０の方法と本質的に同じ方法で以下の化合物を調製する。

【表12】

【化45】

【0087】

ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の４，４−ジメチルオキサゾリジン−２−オン（４９３ｍｇ、４．２８２ｍｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却し、水素化ナトリウム（１８７ｍｇ、４．６７５４１ｍｍｏｌ）で処理し、約４０分間撹拌する。ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル４−［２−シクロプロピル−１−［４−［（１Ｓ）−１−［（４，６−ジフルオロピリミジン−２−イル）アミノ］エチル］フェニル］エチル］ピペラジン−１−カルボキシレート、異性体１（１．９０ｇ、３．９０ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、混合物を、冷却浴が終了するままに一晩で室温に温める。反応が完了したら、反応を飽和塩化アンモニウム水溶液でクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出する。有機抽出物を５％水性ＬｉＣｌで洗浄し、集め、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、２０％〜４０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンの勾配を用いるシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、標記生成物（１．１２ｇ、４８％）を白色非晶質固体として得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ５８３（Ｍ＋Ｈ）。

【0088】

適切な中間体を使用して、調製例６４の方法と本質的に同じ方法で、以下の化合物を調製する。

【表13】

【化46】

【0089】

２−メチルスルファニル−１Ｈ−ピリミジン−６−オン（４．８１ｇ、３３．８ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチル４−［［４−［（１Ｓ）−１−アミノエチル］フェニル］メチル］ピペラジン−１−カルボキシレート（９．００ｇ、２８．２ｍｍｏｌ）およびＤＭＥ（５６ｍＬ）を３つのマイクロ波容器に均等に分割し、密閉し、１２０℃で４日間加熱する。反応混合物を室温に冷却し、合わせ、濃縮し、ＣＨ_２Ｃｌ_２に再懸濁する。固体を濾別し、濾液をシリカゲルに吸着させ、１〜７％ＭｅＯＨ／ＣＨ_２Ｃｌ_２の勾配で溶出するシリカゲルでのクロマトグラフィーに付して、標記化合物をオフホワイトの固体として得る（１０．５５ｇ、２２．４５ｍｍｏｌ、純度８８％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４１４（Ｍ＋Ｈ）。

【化47】

【0090】

ｔｅｒｔ−ブチル（Ｓ）−４−（４−（１−（（６−オキソ−１，６−ジヒドロピリミジン−２−イル）アミノ）エチル）ベンジル）ピペラジン−１−カルボキシレート（１０．５５ｇ、２２．４５ｍｍｏｌ、８８％純度）、四塩化炭素（６．５ｍＬ）、トリフェニルホスフィン樹脂（２２．５ｇ、６７ｍｍｏｌ、３ｍｍｏｌのホスフィン／ｇ）、および１，２−ＤＣＥ（３００ｍＬ）の混合物を７０℃で６時間撹拌し、室温まで冷却する。ＭｅＯＨ（３００ｍＬ）を添加し、得られた混合物を３０分間激しく撹拌する。樹脂を濾過により混合物から取り出し、追加のＭｅＯＨですすぎ、これを濾液に添加する。合わせた濾液を濃縮し、残渣をＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液で洗浄する。水相をＣＨ_２Ｃｌ_２（２×）で逆抽出する。合わせた有機抽出物を乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、濃縮して残渣を得、３５〜６０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンの勾配で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、標記化合物を白色非晶質固体として得る（６．８５ｇ、１５．９ｍｍｏｌ、７１％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４３２（Ｍ＋Ｈ）。

【化48】

【0091】

１，４−ジオキサン（４．５ｍＬ）中の、ｔｅｒｔ−ブチル（Ｓ）−４−（４−（１−（（４−クロロピリミジン−２−イル）アミノ）エチル）ベンジル）ピペラジン−１−カルボキシレート（４００ｍｇ、０．９２５ｍｍｏｌ）、（Ｒ）４−（（Ｒ）−１−フルオロエチル）オキサゾリジン−２−オン（１３６ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）およびＣｓ_２ＣＯ_３（５１３ｍｇ、１．５７ｍｍｏｌ）の溶液をＮ_２ガスを５〜１０分間バブリングすることにより脱気する。次いで、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（５１ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）および４，５−ビス（ジフェニルホスフィノ）−９，９−ジメチルキサンテン（１１３ｍｇ、０．１９５ｍｍｏｌ）を添加し、脱気を繰り返す。容器を密閉し、１００℃で４．５時間加熱する。混合物を室温まで冷却し、ＥｔＯＡｃで希釈し、珪藻土で濾過する。濾液を水で洗浄し、水を追加のＥｔＯＡｃで抽出する。合わせた有機抽出物を乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、濃縮する。残渣を７０〜１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンの勾配で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、標記化合物を淡黄色非晶質固体（４２１ｍｇ、０．７９６ｍｍｏｌ、８６％）として得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：５２９（Ｍ＋Ｈ）。

【0092】

適切な中間体を使用して調製６８の方法と本質的に同じ方法で、以下の化合物を調製する。

【表14】

【化49】

【0093】

ｔｅｒｔ−ブチル４−［１−［４−［（１Ｓ）−１−［［４−（４，４−ジメチル−２−オキソ−オキサゾリジン−３−イル）−６−フルオロ−ピリミジン−２−イル］アミノ］エチル］フェニル］プロピル］ピペラジン−１−カルボキシレート、異性体１（１．６２ｇ、２．７４ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ溶液（１４ｍＬ）を、圧力容器内で、水酸化アンモニウム（７２％、１ｍＬ、１０当量）で処理し、１１０℃で一晩加熱する。反応物を室温まで冷却し、ＥｔＯＡｃで希釈し、水（３回）で洗浄する。有機層を集め、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去して、標記化合物を白色非晶質固体として得る（１．５１ｇ、９３％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ５５４（Ｍ＋Ｈ）。

【0094】

適切な中間体を使用して、調製例７２の方法と本質的に同じ方法で、以下の化合物を調製する。

【表15】

【化50】

【0095】

ＣＨ_２Ｃｌ_２（２０４ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル４−（４−（（Ｓ）−１−（（４−（（Ｓ）−４−イソプロピル−２−オキソオキサゾリジン−３−イル）ピリミジン−２−イル）アミノ）エチル）ベンジル）ピペラジン−１−カルボキシレート（１０．７ｇ、２０．４ｍｍｏｌ）の溶液に室温で、ＴＦＡ（６９ｍＬ、９１２．６ｍｍｏｌ）を添加する。４時間撹拌した後、飽和Ｎａ_２ＣＯ_３水溶液を用いて反応のｐＨを９に調整し、得られた混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２（３×）で抽出する。有機抽出物を合わせ、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、濃縮して残渣を得、これを０〜１５％のＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ中の７Ｎ−ＮＨ_３の勾配で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、標記化合物を得る（７．７６ｇ、１８．３ｍｍｏｌ、９０％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４２５（Ｍ＋Ｈ）。

【0096】

適切な中間体を使用して、調製例７４の方法と本質的に同じ方法で、以下の化合物を調製する。

【表16-1】

【表16-2】

【表16-3】

【化51】

【0097】

ＣＨ_２Ｃｌ_２（１５ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル４−［２−シクロプロピル−１−［４−［（１Ｓ）−１−［［４−［（４Ｓ）−４−イソプロピル−２−オキソ−オキサゾリジン−３−イル］ピリミジン−２−イル］アミノ］エチル］フェニル］エチル］ピペラジン−１−カルボキシレート、異性体１（１．９７ｇ、３．４０ｍｍｏｌ）の溶液をＴＦＡ（５ｍＬ、６６．１３ｍｍｏｌ）で処理し、室温で一晩撹拌する。溶媒を除去し、残渣をＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解する。溶液のｐＨを１０％炭酸ナトリウム水溶液で塩基性にする。層を分離し、水層を２×ＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出する。有機層を合わせ、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して標題化合物を得る（１．６９１ｇ、９７％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ４７９（Ｍ＋Ｈ）。

【化52】

【0098】

（２ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル４−［１−［４−［（１Ｓ）−１−［［４−［（４Ｒ）−４−［（１Ｒ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシエチル−２−オキソ−オキサゾリジン−３−イル］ピリミジン−２−イル］アミノ］エチル］フェニル］−２−シクロプロピル−エチル］ピペラジン−１−カルボキシレート（２８８ｍｇ、０．４４８ｍｍｏｌ）溶液にＴＦＡ（２ｍＬ）を添加し、混合物を室温で撹拌する。約２時間後、混合物を濃縮し、ＭｅＯＨに溶解する。溶液をＳＣＸカラムで精製する。カラムをＭｅＯＨでフラッシュし、標記化合物をＭｅＯＨ中の１Ｎアンモニアで溶出する。アンモニア／ＭｅＯＨ溶液を濃縮して、標記化合物を油状物（１７６ｍｇ、０．３５９ｍｍｏｌ、８０％）として得て、これをさらに精製することなく使用する。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４８１．２（Ｍ＋Ｈ）。

【化53】

【0099】

ｔｅｒｔ−ブチル４−［１−［４−［（１Ｓ）−１−［［４−アミノ−６−（４，４−ジメチル−２−オキソ−オキサゾリジン３−イル）ピリミジン−２−イル］アミノ］エチル］フェニル］プロピル］ピペラジン−１−カルボキシレート（１．５０ｇ、２．５５ｍｍｏｌ）のＣＨ_２Ｃｌ_２（１３ｍＬ）溶液をＴＦＡ（４ｍＬ）で処理し、室温で一晩撹拌する。反応物を１０％炭酸カリウム水溶液で希釈し、３×ＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出する。有機抽出物を合わせ、固体Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、溶媒を減圧下で除去して、淡黄色非晶質固体として標記化合物を得る（１．２８５ｇ、１００％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ４５４（Ｍ＋Ｈ）。

【0100】

適切な中間体を使用して、調製例９３の方法と本質的に同じ方法で、以下の化合物を調製する。

【表17】

【化54】

【0101】

ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−（（Ｓ）−１−（（４−（（Ｓ）−４−エチル−２−オキソオキサゾリジン−３−イル）ピリミジン−２−イル）アミノ）エチル）ベンジル）ピペラジン−１−カルボキシレート（７４９ｍｇ、１．４７ｍｍｏｌ）をＨＣｌ（ジオキサン中４Ｍ、１．８ｍＬ、７．３ｍｍｏｌ）およびＣＨ_２Ｃｌ_２（２．９ｍＬ）の混合物に溶解する。反応混合物を室温で２時間撹拌し、次いで濃縮して標記化合物のＨＣｌ塩を得、これをＭｅＯＨで予め洗浄した２５−ｇカチオン交換ＳＣＸカラムを用いて脱塩し、ＭｅＯＨ中の２Ｎ ＮＨ_３ですすいで、標記化合物を無色油状物として得る（４９１ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ、８２％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４１１（Ｍ＋Ｈ）。

【0102】

適切な中間体を使用して調製９４の方法と本質的に同じ方法で、以下の化合物を調製する。

【表18】

【化55】

【0103】

ＣＨ_２Ｃｌ_２（９ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル４−［２−シクロプロピル−１−［４−［（１Ｓ）−１−［［４−（４，４−ジメチル−２−オキソ−オキサゾリジン−３−イル）−６−フルオロ−ピリミジン−２−イル］アミノ］エチル］フェニル］エチル］ピペラジン−１−カルボキシレート（１．１１ｇ、１．８５ｍｍｏｌ）溶液をＨＣｌ（１，４−ジオキサン（９．５ｍＬ、３８ｍｍｏｌ）中４．０モル／Ｌ）で処理し、室温で３時間撹拌する。反応物を減圧下で濃縮して、標記化合物（１．１４２ｇ、９０質量％、１００％）を白色固体として得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ４８３（遊離塩基のＭ＋Ｈ）。

【0104】

適切な中間体を使用して、調製例９６の方法と本質的に同じ方法で、以下の化合物を調製する。

【表19】

【化56】

【0105】

ＣＨ_２Ｃｌ_２（１００ｍＬ）中の（Ｓ）−４−イソプロピル−３−（２−（（（Ｓ）−１−（４−（ピペラジン−１−イルメチル）フェニル）エチル）アミノ）ピリミジン−４−イル）オキサゾリジン−２−オン（４．６ｇ、１１ｍｍｏｌ）の溶液に０℃で塩化アクリロイル（０．９７ｍＬ、１２ｍｍｏｌ）を添加する。１５分後、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液を添加し、冷却浴を取り除く。得られた混合物をブラインでさらに希釈し、ＣＨ_２Ｃｌ_２（３×）で抽出し、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、濃縮して白色固体を得、これを５０〜１００％ヘキサン／［アセトン中１０％ＭｅＯＨ］で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、標記化合物を白色固体として得る（４．３５ｇ、９．１ｍｍｏｌ、８４％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４７９（Ｍ＋Ｈ）。

【0106】

適切な中間体を使用して、実施例１の方法と本質的に同じ方法で、以下の化合物を調製する。

【表20-1】

【表20-2】

【表20-3】

【化57】

【0107】

ＣＨ_２Ｃｌ_２（３０ｍＬ）中の（４Ｓ）−３−［２−［［（１Ｓ）−１−［４−［２−シクロプロピル−１−ピペラジン−１−イル−エチル］フェニル］エチル］アミノ］ピリミジン−４−イル］−４−イソプロピル−オキサゾリジン−２−オン、異性体１（１．６６５ｇ、３．２７０ｍｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却し、ＣＨ_２Ｃｌ_２（３ｍＬ）中の塩化アクリロイル（３０６μＬ、３．７６０ｍｍｏｌ）溶液で滴下処理し、室温で撹拌する。混合物をＭｅＯＨ（約３ｍＬ）、次いで水性重炭酸ナトリウムでクエンチし、室温に温める。層を分離し、水層を３×ＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出する。有機抽出物を合わせ、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去して、粗生成物を得る。粗物質をヘキサン中２０〜４０％の勾配（アセトン中１０％ＭｅＯＨ）で溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーで精製して、標記化合物を非晶質固体として得る（１．３０４ｇ、７４％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ５３３（Ｍ＋Ｈ）。

【0108】

適切な中間体を使用して、実施例２０の方法と本質的に同じ方法で、以下の化合物を調製する。

【表21】

【化58】

【0109】

ＣＨ_２Ｃｌ_２（約５０ｍＬ）中の３−［２−［［（１Ｓ）−１−［４−［２−シクロプロピル−１−ピペラジン−１−イル−エチル］フェニル］エチル］アミノ］−６−フルオロ−ピリミジン−４−イル］−４，４−ジメチル−オキサゾリジン−２−オン、異性体１二塩酸塩（１．１１８ｇ、１．８１１ｍｍｏｌ、９０質量％）の溶液を飽和ＮａＨＣＯ_３で処理し、層を分離する。水層を追加の２×ＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出し、合わせた有機物をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させる。このＣＨ_２Ｃｌ_２溶液（約１００ｍＬ）を０℃に冷却し、ＣＨ_２Ｃｌ_２（１ｍＬ）中の塩化アクリロイル（１７０μＬ、２．０８９ｍｍｏｌ）の溶液で滴下処理し、０℃で２分間撹拌する。混合物をＭｅＯＨ（約１ｍＬ）でクエンチし、飽和ＮａＨＣＯ_３で希釈し_、室温まで温める。反応物を２×ＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出する。有機抽出物を合わせ、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、減圧下で濃縮し、ヘキサン中の１０％〜３０％（アセトン中１０％ＭｅＯＨ）のシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、標記化合物を（８７０ｍｇ、８９％）を白色非晶質固体として得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ５３７（Ｍ＋Ｈ）。

【0110】

適切な中間体を使用して、実施例２２の方法と本質的に同じ方法で、以下の化合物を調製する。

【表22】

【化59】

【0111】

３−［６−アミノ−２−［［（１Ｓ）−１−［４−［１−ピペラジン−１−イルプロピル］フェニル］エチル］アミノ］ピリミジン−４−イル］−４，４−ジメチル−オキサゾリジン−２−オン、異性体１（１．２６ｇ、２．７８ｍｍｏｌ）のＣＨ_２Ｃｌ_２溶液（２４ｍＬ）を氷浴で冷却する。冷時、溶液を塩化アクリロイル（２２４μＬ、２．７５ｍｍｏｌ）のＣＨ_２Ｃｌ_２溶液（１ｍＬ）でシリンジを介して滴下処理し、粘稠な油状沈殿物を得る。懸濁液を−７８℃に冷却し、ＴＥＡ（３８７μＬ、２．７８ｍｍｏｌ）で処理し、−７８℃で１５分間撹拌する。反応をＭｅＯＨ（１ｍＬ）でクエンチし、飽和重炭酸ナトリウム水溶液で希釈し、室温まで温める。層を分離し、水層を２×ＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出する。有機抽出物を合わせ、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去する。粗物質をＣＨ_２Ｃｌ_２中の２％〜５％ＭｅＯＨの勾配で溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、白色非晶質固体として標記化合物（８５５ｍｇ、５９％）を得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ５０８（Ｍ＋Ｈ）。

【0112】

適切な中間体を用いて、実施例２４の方法と本質的に同じ方法で、以下の化合物を調製する。

【表23】

【化60】

【0113】

ＣＨ_２Ｃｌ_２（５ｍＬ）中の（４Ｒ）−３−［２−［［（１Ｓ）−１−［４−（２−シクロプロピル−１−ピペラジン−１−イル−エチル）フェニル］エチル］アミノ］ピリミジン−４−イル］−４−［（１Ｒ）−１−ヒドロキシエチル］オキサゾリジン−２−オン（１７６ｍｇ、０．３５８９ｍｍｏｌ）の溶液に塩化アクリロイル（ＣＨ_２Ｃｌ_２中１．２３Ｍ、０．２９２ｍＬ、０．３５８９ｍｍｏｌ）を添加し、ドライアイスアセトン浴中で冷却する。約２０分後、混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２と飽和重炭酸ナトリウム溶液との間で分配する。有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮する。粗残渣をＣＨ_２Ｃｌ_２中の１０％〜７０％［ＥｔＯＡｃ中１０％ＭｅＯＨ］で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、標題化合物を白色固体として得た（１９９ｍｇ、１００％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：５３５．４（Ｍ＋Ｈ）。

【0114】

癌は、その開始および進行が、細胞および組織の微環境におけるＤＮＡ修復、ゲノム安定性、細胞増殖、細胞死、癒着、脈管形成、浸潤、および転移を調整する１つ以上の遺伝子の異常機能によって誘発される疾患の異種集合として次第に認識されている。「癌」遺伝子の変異体または異常機能は、ゲノムの複写数の変化（増幅、抹消、染色体消失、または重複による）自然発生したＤＮＡ多型、（無秩序な遺伝子発現を引き起こす染色体転座、転移、または他の再構成による）遺伝子及び染色体構造の変化及び点突然変異に起因する可能性がある。癌腫瘍は、１つの異常遺伝子機能によって誘発され、同じ異常遺伝子機能によって保持される、またはさらなる異常遺伝子機能によって保持および進行する可能性がある。

【0115】

上記の遺伝的染色体異常以外に、それぞれの癌は、アセチル化、メチル化、またはリン酸化によるＤＮＡメチル化、ゲノム刷り込み、およびヒストン修飾を含むゲノムの後成的修飾も含む可能性がある。後成的修飾は、悪性腫瘍の誘発および／または保持に関与する可能性がある。

【0116】

ヒト癌における細胞遺伝学的異常の広範なカタログは、蓄積され、保持され、定期的にオンラインにアップデートされている（ＵＳ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｔｏｍｙ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＣＧＡＰ）のウェブサイトで、Ｔｈｅ Ｍｉｔｅｌｍａｎ Ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓを参照されたい。）。Ｔｈｅ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔと同様にＣＯＳＭＩＣ（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ）のヒト癌における体細胞突然変異のデータベースも、腫瘍形成の原因となる全ヒト遺伝子の「癌遺伝子調査」の詳細を保持している。様々な癌の原因となる細胞遺伝学的変化に関する豊富な情報を含むさらなる情報源は、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙである。

【0117】

生検による癌性悪性腫瘍の診断は、免疫表現型検査および他の試験が知られており、定期的に使用される。高解像度染色体分染法および高度染色体画像技術に加えて、癌が疑われる場合の染色体染異常は、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、核型分析、スペクトル型分析（ＳＫＹ）、多重ＦＩＳＨ（Ｍ−ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、一塩基多型アレイ（ＳＮＰチップ）などの細胞遺伝学的分析、ならびに当業者によって使用される他の診断法および既知の分析試験から測定することができる。

【0118】

複数の癌腫瘍型において確認されているＩＤＨ１における突然変異としては、神経膠腫、多形性神経膠芽細胞腫（ＧＢＭ）、星状細胞腫、乏突起膠腫、傍神経節腫、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、甲状腺、結腸直腸、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｄａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，２０１０，１６：３８７−３９７；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２０１２，３１（１９）：２４９１−２４９８；ｍｅｌａｎｏｍａ，Ｓｈｉｂａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．，２０１０，１７８（３）：１３９５−１４０２；ｐｒｏｓｔａｔｅ，Ｆｌａｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２０１４，３２（ｓｕｐｐｌ．４；Ａｂｓｔｒａｃｔ ２１３）；Ｃａｉｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２０１３，３：７３０−７４１；ｃｈｏｎｄｒｏｓａｒｃｏｍａ ａｎｄ ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ，Ｂａｌｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．，２０１２，１２４：８８３−８９１；Ｃａｉｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２０１３，３：７３０−７４１；ａｎｇｉｏｉｍｍｕｎｏｂｌａｓｔｉｃ Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ（ＡＩＴＬ），Ｃａｉｒｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ，２０１２．１１９（８）：１９０１−１９０３、が挙げられるが、これらに限定されない。突然変異は、活性部位の特定の残基または付近に見られる：ＩＤＨ１のＧ９７Ｄ、Ｒ１００、Ｒ１３２Ｈ、Ｒ１３２Ｃ、Ｒ１３２Ｓ、Ｒ１３２Ｖ、Ｒ１３２Ｇ、Ｖ７１Ｉ、Ｒ１３２Ｌ、およびＧ１２３Ｒ、Ｄａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，２０１０，１６：３８７−３９７；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０１２および補足表２。

【0119】

ＩＤＨ１の変異形態は、α−ケトグルタレートを２−ヒドロキシグルタレートに還元する新形態活性（機能獲得）を有することを示している。２−ヒドロキシグルタレートの内因性生成は、エナンチオ特異的であり、Ｄ−エナンチオマー（（Ｒ）エナンチオマーとも称される）の生成をもたらす。通常、細胞の２−ヒドロキシグルタレートは低レベルを有するが、ＩＤＨ１の突然変異が隠れている細胞の２−ヒドロキシグルタレートは著しく上昇したレベルを明示する。２−ヒドロキシグルタレートの著しく上昇したレベルは、突然変異が隠れている腫瘍、及び変異体ＩＤＨ１を有する患者の血漿中で検出される。高レベル２−ヒドロキシグルタレートは、強化された腫瘍形成につながる分化においてブロックをもたらす高メチル化表現型と関連する。

【0120】

特異的な不可逆共有結合性阻害剤の活性は、Ｋ_Ｉで定義される標的（ＩＤＨ１）へのその結合によって定義され、Ｋ_{ｉｎａｃｔ}で定義される共有結合形成の最大潜在速度によって定義される。これらの２つの要素は、分離したものではなく、むしろ共有結合形成の所望の効果を生むために共に作用する。このことは、以下の３点で説明する。

【0121】

第１に、求電子剤、例えばアクリルアミドが、求核試薬、例えばシステインに対して適切に配置されなければならないという事実は、有機化学において共有結合形成の基本要素である。共有結合を形成するために、求核試薬が求電子剤に近づかなければならない正確な角度および距離がある。求核試薬近くの求電子剤の単純配置は、共有結合形成には十分ではない。

【0122】

第２に、酵素への阻害剤の結合を安定化するために水素結合部分を含むコア、例えば配向コアに反応性基を組み込む場合、当業者は、どのように配向コアを標的に結合し、上記の最適角度および距離を考慮して求核試薬に対して求電子剤を配置するかを検討しなくてはならない。繰り返すが、求核試薬近くの求電子剤の単純配置は、共有結合形成には十分ではない。配向コアの変更は、共有結合を形成するための阻害剤化合物の能力に影響する可能性がある。

【0123】

第３に、上記の２つの点を共に考えると、配向コアに求電子剤部分がわずかに存在することでは、共有結合が形成されることを示唆するのに十分ではない。

【0124】

以下の生体外および生体内研究は、変異体ＩＤＨ１タンパク質阻害活性および様々な特異的な癌細胞株に対する式Ｉの試験化合物の有効性を実証している。これらのアッセイは、一般に、これらの突然変異型ＩＤＨ１酵素を有する癌細胞を含む増殖性新生物に対するヒト臨床的治療活性を予測するものとして当業者に認識されている。変異体ＩＤＨ１阻害活性および有効性を明示するアッセイは、実質的に以下の通りに、または同様のデータをもたらす同様のアッセイによって実施されてよい。

【0125】

以下のアッセイの結果は、例示され、試験された化合物がＩＤＨ１変異体阻害剤として有用であり、共有結合性阻害剤であり、変異体ＩＤＨ１を発現する癌治療において有用である可能性があることを実証する。特定の技術化合物を試験する以下の各アッセイでは、追加の技術化合物を作製し、試験し、同様のデータを得る。

【0126】

ＩＤＨ１およびＩＤＨ２変異体酵素の生化学的アッセイ
ＩＤＨ１−Ｒ１３２Ｈ、ＩＤＨ１−Ｒ１３２Ｃ、ＩＤＨ２−Ｒ１７２ＫおよびＩＤＨ２−Ｒ１４０Ｑ変異体酵素は、αＫＧから２ＨＧへの変換を触媒する。２ＨＧを、インライン固相抽出および質量分析を使用して分析する。この分析は、６４６０三連四重極質量分析計（Ｇ６４６０Ａ Ａｇｉｌｅｎｔ）と結合したＲａｐｉｄＦｉｒｅ（登録商標）機器において実施される。

【0127】

Ｎ−末端Ｈｉｓ−タグを含有するＩＤＨ１変異体（Ｒ１３２ＨおよびＲ１３２Ｃ）ならびにＩＤＨ２変異体（Ｒ１４０ＱおよびＲ１７２Ｋ）タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、一般的に使用され、当業者に周知の方法によって、ニッケル親和性クロマトグラフィーを使用して精製する。酵素アッセイを、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝剤、１ｍＭのＤＴＴ、０．００５％ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００、１２０ｍＭのＮａＣｌを含有するＶ底９６ウェルポリプロピレンプレートで実施する。ＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｈに関しては、α−ケトグルタレート、ＮＡＤＰＨおよびＭｎＣｌ_２を、それぞれ３００μＭ、２．５μＭおよび３００μＭの最終濃度で含ませる。ＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｃに関しては、α−ケトグルタレート、ＮＡＤＰＨおよびＭｎＣｌ_２を、それぞれ１００μＭ、１０μＭおよび１００μＭの最終濃度で含ませる。ＩＤＨ２ Ｒ１７２Ｋに関しては、α−ケトグルタレート、ＮＡＤＰＨおよびＭｎＣｌ_２を、それぞれ１５０μＭ、１０μＭおよび１５０μＭの最終濃度で含ませる。ＩＤＨ２ Ｒ１４０Ｑに関しては、α−ケトグルタレート、ＮＡＤＰＨおよびＭｎＣｌ_２を、それぞれ３００μＭ、１０μＭおよび１００μＭの最終濃度で含ませる。最終ｐＨ＝７．０。ＤＭＳＯ原料中に溶解させた試験化合物を、４％の最終ＤＭＳＯ濃度で、反応混合物中に希釈する。化合物を、用量応答形式で試験する。酵素を添加することによりアッセイを開始する。酵素を以下の最終濃度で使用する：ＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｈ、２ｎＭ、ＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｃ、０．５ｎＭ、ＩＤＨ２ Ｒ１７２Ｋ、１．２ｎＭ、ＩＤＨ２ Ｒ１４０Ｑ、１．２ｎＭ、ならびにアッセイを以下の時間継続させる：ＩＤＨ−１ Ｒ１３２Ｃについては４０分、ＩＤＨ−１ＨＲ１３２Ｈについては６０分、ＩＤＨ−２１７２ＫおよびＩＤＨ−２ Ｒ１４０Ｑ酵素については５０分。反応物を、質量分析法分析および反応生成物の定量化のための内部標準として、ｄ_５−３ＨＧを含有するＡＣＮ（５０：５０）を添加することによってクエンチする。クエンチした試料中の２ＨＧを、強力アニオン交換カラムクロマトグラフィー（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｓｔｒａｔａ−Ｘ−Ａ ＳｅｃｕｒｉｔｙＧｕａｒｄ、４×３ｍｍ）を使用して分離し、６４６０三連四重極質量分析計（Ｇ６４６０Ａ Ａｇｉｌｅｎｔ）における質量分析によって分析する。検出された２ＨＧ信号を、既知の２ＨＧ濃度を使用して生成した検量曲線を使用して、分析対象濃度に変換する。試験した各化合物の％阻害を、ＤＭＳＯ対照試料を０％阻害として、酵素なしの対照を１００％阻害として使用し、計算する。ＩＣ_５０値を、４−パラメータ計算式を使用して異なる化合物濃度での個々の阻害値％から得る。これらの計算を、Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｂａｓｅ（ＩＤＢＳ）またはＳｃｒｅｅｎｅｒ（Ｇｅｎｅｄａｔａ）データ分析プログラムを使用して実施する。

【0128】

このアッセイの結果は、例示され、試験された化合物が、ＩＨＤ１／Ｒ１３２ＨおよびＩＤＨ１／Ｒ１３２Ｃに対する変異体ＩＤＨ１活性を阻害することを実証する。

【0129】

以下の実施例は、実際に上記の通りに試験され、以下の表２２に示されるように、変異体ＩＤＨ１に対する活性を示し、変異体ＩＤＨ２よりも変異体ＩＤＨ１に対して選択的である（変異体ＩＤＨ２対するデータは示されていない）。

【表24】

【0130】

平均は＋ＳＥＭである（ＳＥＭは平均の標準誤差を指す）
＊技術化合物、ＷＯ１３／０４６１３６の実施例番号５５６と同様に調製した（４Ｓ）−３−（２−｛［（１Ｓ）−１−｛４−［（４−アセチルピペラジン−１−イル）メチル］フェニル｝エチル］アミノ｝ピリミジン−４−イル）−４−（プロパン−２−イル）−１，３−オキサゾリジン−２−オン。

【0131】

このアッセイの結果は、表２２に列挙した実施例の化合物が、ＩＤＨ１ Ｒ１３２ＨまたはＲ１３２Ｃ変異体酵素と比較して、ＩＤＨ１野生型酵素の阻害で活性がより少ないことを実証する。

【0132】

ＩＤＨ１（Ｒ１３２Ｈ）生化学的ジャンプ希釈アッセイ
凍結乾燥した実施例の化合物を、１００％ＤＭＳＯで１０ｍＭまたは１００ｍＭに還元し、室温で試験まで保管した。ＩＤＨ１（Ｒ１３２Ｈ）−Ｈｉｓタンパク質が発現し、当業者に周知で、一般に使用される方法によって精製した。アッセイ試薬は以下を含む：α−ケトグルタル酸（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ番号Ｋ１８７５）、ＭｎＣｌ_２−Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃａｔ番号Ｍ８７−１００、ＮＡＤＰＨ−Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃａｔ番号Ｎ７５０５、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ番号１５５６７−０２７）、ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ、Ｓ３０１４）、ジチオスレイトール（Ｓｉｇｍａ、Ｄ５５４５）、及びＴｒｉｔｏｎＸ１００（Ｐｅｉｒｃｅ、２８３１４）。Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｇ９０６１）からのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−Ｇｌｏ（商標）キット。

【0133】

全体を通して使用したアッセイ緩衝剤は、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．０、１２０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、０．００５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および（試験化合物の添加による）２％のＤＭＳＯを含む。各化合物のＩＣ_５０を、アッセイ緩衝剤中の１．５ｎＭのＩＤＨ１（Ｒ１３２Ｈ）、１ｍＭのα−ケトグルタレート、１ｍＭのＭｎＣｌ_２、および１５μＭのＮＡＤＰＨと共に、Ｅｃｈｏ５５５で調製した化合物の反応の用量をインキュベーションすることによって決定する。反応物を、室温で２時間インキュベーションし、次に６−シクロプロピル−５−（イソキノリン−５−イル）−２−［（３Ｒ）−４−（３−メトキシプロパノイル）−３−メチルピペラジン−１−イル］ピリジン−３−カルボニトリル（１０μＭ）を使用して停止する。ＮＡＤＰＨ濃度を、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−Ｇｌｏ（商標）キットを使用して、製造業者によって明記された通りに測定する。発光信号を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ；０．１秒／Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｅ Ｍｉｒｒｏｒ／Ｌｕｍ７００ ＷＬ４００−７００フィルター）上で読み取った。それに続くジャンプ希釈実験において、１０×ＩＣ_５０に相当する化合物濃度を、１００ｎＭのＩＤＨ１（Ｒ１３２Ｈ）で予めインクベーションした。化合物の濃度は、常に酵素濃度以上である。室温で２時間後、この混合物を、α−ケトグルタレート（１０ｍＭ）、ＭｎＣｌ_２（１０ｍＭ）、およびＮＡＤＰＨ（１５μＭ）を含有する溶液に希釈する（１：１００）。この最終酵素反応は、１ｎＭのＩＤＨ１（Ｒ１３２Ｈ）および０．１×［ＩＣ_５０］を含有する。室温で２時間インキュベーションした後、ＮＡＤＰＨ濃度を、６−シクロプロピル−５−（イソキノリン−５−イル）−２−［（３Ｒ）−４−（３−メトキシプロパノイル）−３−メチルピペラジン−１−イル］ピリジン−３−カルボニトリルおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−Ｇｌｏ（商標）キットを使用して、上記で特定したように測定する。３つの対照を含む：１）１ｍＭのα−ケトグルタレート、１ｍＭのＭｎＣｌ_２、および１５μＭのＮＡＤＰＨが、酵素活性を測定する最終アッセイにおいて使用されることを除き、プレインキュベーションおよび酵素アッセイにおいて１０×ＩＣ_５０の化合物を含有する「１０×対照」、２）プレインキュベーションおよび酵素アッセイの両方の化合物の代わりにＤＭＳＯを含有する「最大活性対照」、３）プレインキュベーションにおける化合物の代わりにＤＭＳＯおよび酵素アッセイにおける０．１×ＩＣ_５０の化合物を含有する「０．１×対照」。「最少活性対照」は酵素を欠くが、それ以外は「最大活性対照」に相当するものが含まれる。最大および最少活性対照の第２セットを、１ｍＭのα−ケトグルタレート、１ｍＭのＭｎＣｌ_２、および１５μＭのＮＡＤＰＨを使用して実施する。各アッセイ条件を３連で試験し、最大活性対照（１０ｍＭ）および最少活性対照（１０ｍＭ）については３２回繰り返す一方、最大活性対照（１ｍＭ）および最少活性対照（１ｍＭ）については１６回繰り返す。

【0134】

各実験／対照において生成されたＮＡＤＰ（生成物）の濃度を、１５μＭのＮＡＤＰＨを含有する、最少活性対照に対して観察された信号における減少のパーセントを使用して測定する。最少活性対照（１ｍＭおよび１０ｍＭ）ならびに、最大活性対照（１ｍＭおよび１０ｍＭ）を平均化し、それぞれの標準偏差を計算する。各ジャンプ希釈および０．１×対照の信号に１５を掛け、次に最少活性対照（１０ｍＭ）ウェルの平均数で割る。１５からこの数を引き、ＮＡＤＰ（μＭ生成物）を計算する。１０×対照に同じ計算を使用したが、最少活性対照（１ｍＭ）を使用する。最大活性対照（１ｍＭおよび１０ｍＭ）の生成物のμモルを、平均数に１５を掛け、次にそれぞれの最少活性対照（１ｍＭおよび１０ｍＭ）で割り、計算する。化合物のジャンプ希釈、１０×対照、および０．１×対照のＩＤＨ活性％を、各ウェルのμＭ ＮＡＤＰを平均最大活性対照（１ｍＭまたは１０ｍＭ）で割り、次に１００を掛けて算出する。合格する化合物は、プレインキュベーション濃度が化合物で酵素を飽和するのに十分であることを示す、１０×対照の＜３０％活性を示さなければならない。加えて、化合物は、０．１×／希釈化合物濃度で阻害のないことを立証する、０．１×対照の７０〜８０％＞活性を示さなければならない。

【0135】

以下の実施例は、実際に上記の通りに試験され、以下の表２３に示されるようにこのアッセイにおいて、変異体ＩＤＨ１／Ｒ１３２Ｈに対して回復データ％を示す。

【0136】

以下に示す希釈２時間後に回復％を有し、酵素を阻害しなかった技術化合物とは対照的に、以下に示す実施例は、希釈２時間後に酵素を阻害する。

【表25】

【0137】

＊技術化合物、ＷＯ１３／０４６１３６の実施例番号５５６と同様に調製した（４Ｓ）−３−（２−｛［（１Ｓ）−１−｛４−［（４−アセチルピペラジン−１−イル）メチル］フェニル｝エチル］アミノ｝ピリミジン−４−イル）−４−（プロパン−２−イル）−１，３−オキサゾリジン−２−オン。

【0138】

このデータは、化合物が、阻害剤の希釈が酵素活性の回復を生じさせないことから、変異体ＩＤＨ１の共有結合阻害と一致する方法で作用することを実証する。

【0139】

野生型ＩＤＨ１およびＩＤＨ２酵素の生化学的アッセイ
ＩＤＨ１およびＩＤＨ２酵素は、イソクエン酸のαＫＧへの変換を触媒する。
Ｎ−末端Ｈｉｓ−タグを含有する野生型ＩＤＨ１（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿００１２６９３１６．１）およびＩＤＨ２（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＥＡＸ０２０８２．１）タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、一般的に使用され、当業者に周知の方法によって、ニッケル親和性クロマトグラフィーを使用して精製する。酵素アッセイを、ｐＨ７．５の１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝剤、１ｍＭのＤＴＴ、０．００５％ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００、１２０ｍＭのＮａＣｌを含有するＶ底９６ウェルポリプロピレンプレートで実施する。ＩＤＨ１野生型アッセイに対しイソクエン酸、ＮＡＤＰ^＋およびＭｎＣｌ_２を、それぞれ８５ μＭ、５０ μＭおよび２０ μＭの濃度で含ませる。ＩＤＨ２野生型アッセイに対しイソクエン酸、ＮＡＤＰ^＋およびＭｎＣｌ_２を、それぞれ３０μ Ｍ、５０μＭおよび１０μＭの濃度で含ませる。ＤＭＳＯ原液中に溶解された阻害剤を、４％の最終ＤＭＳＯ濃度で、反応混合物中に希釈する。酵素アッセイを、質量分析法分析のために内部標準としてｄ（ｄ_６−αＫＧ）を含有するＡＣＮ（５０：５０）を添加することによって終了（クエンチ）する。反応混合物の１０マイクロリットルと、水１００μＬ、ピリジン緩衝剤（８．６％ピリジン、ｐＨ５）中１ＭのＯ−ベンジルヒドロキシアミン５０μＬ、およびピリジン緩衝剤中１ＭのＥＤＣ５０μＬとを合わせる。室温で１時間、誘導体化した後、試料をＥｔＯＡｃ（６００ μＬ）で抽出する。上層の４００μＬを除去し、加熱窒素下にて乾燥させ、ＭｅＯＨ／水（１：１） （１００ μＬ）で再構成する。誘導体化試料１０μＬを、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ２０Ａ ＨＰＬＣシステムおよびＴｈｅｒｍｏ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｕｌｔｒａ（商標）三連四重極質量分析計からなるＬＣ−ＭＳシステムに注入する。分析対象を、０．６ｍＬ／分の流速を用いてＷａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ（商標）Ｃ１８カラムで（２．１×５０ｍｍ、３．５μｍ）分離する。移動相Ａは０．１％ギ酸水であり、移動相ＢはＭｅＯＨである。検出されたαＫＧ信号を、既知のαＫＧ濃度を使用して発生させた検量曲線を使用して、分析対象濃度に変換する。試験した各化合物の％阻害を、ＤＭＳＯ対照試料を０％阻害として、触媒なしの対照を１００％阻害として使用し、計算する。ＩＣ_５０値を、４−パラメータ計算式を使用した異なる化合物濃度で、個々の阻害値％から得る。これらの計算を、Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｂａｓｅ（ＩＤＢＳ）またはＳｃｒｅｅｎｅｒ（Ｇｅｎｅｄａｔａ）データ分析プログラムを使用して実施する。

【0140】

表２４における以下の実施例は、ＩＤＨ１およびＩＤＨ２突然変異体酵素についての生化学的アッセイについて上述したように本質的に試験し、ＩＤＨ１ Ｒ１３２ＨまたはＲ１３２Ｃ突然変異体酵素と比較してＩＤＨ１野生型酵素を阻害する活性はより低い。

【表26】

【0141】

平均＝＋ＳＥＭ（ＳＥＭ＝平均の標準誤差）
ＩＤＨ１変異体阻害剤の細胞系アッセイ
ＩＤＨ１変異体Ｒ１３２Ｃの細胞阻害を試験するために、線維肉腫細胞株ＨＴ１０８０（ＡＴＣＣから購入）を、使用する。Ｒ１３２Ｈ突然変異の細胞系阻害を試験するために、Ｕ８７ＭＧ神経膠腫細胞株（ＡＴＣＣ）を、当業者によってよく知られ、日常的に使用される方法によって調製されたＲ１３２Ｈ変異体酵素を発現するＤＮＡ構築物で安定的に導入する。

【0142】

ＨＴ１０８０細胞アッセイ
化合物で処理する１８〜２４時間前に、１５，０００個の細胞を、ポリ−Ｄ−ｌｙｓコーティング９６ウェルプレート（１５，０００細胞／ウェル）に蒔く。化合物処理の４時間前に、細胞を、通常培地から取り出し、グルタミンなしの培地に置き換えることによってグルタミン欠乏にする。欠乏に続き、次に細胞を、０．２％の最終濃度で、ＤＭＳＯを含有するグルタミンなしの培地に溶解した、異なる濃度の試験化合物（２０μＭ〜１ｎＭ）で処理する。初期の化合物インキュベーションは、３７℃／５％ＣＯ_２で１時間である。１時間後、最終の２ｍＭ濃度にグルタミンを添加し、次に処理細胞をさらに３７℃／５％ＣＯ_２で１８時間インキュベーションする。１８時間インキュベーションした後、細胞溶解物で細胞内２ＨＧおよびαＫＧを分析する。培地から取り出した後、ｐＨ７．５、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ／１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含有する緩衝剤を細胞に加えて溶解物を調製する。溶解物のアリコートを、ｄ_６−αＫＧとｄ_５−３ＨＧとの混合物に内部標準として添加し、混合物を、ＥＤＣおよびピリジンの存在下においてＯ−ベンジルヒドロキシルアミンで処理する。次に、分析対象誘導体を、ＥｔＯＡｃで抽出し、乾燥させ、次いで５０％ＭｅＯＨ水で再構成する。記載された通りに調製した試料を、ＨＰＬＣに注入し、Ｃ１８カラムにおける逆相クロマトグラフィーを使用して、２ＨＧとαＫＧ誘導体（および対応する内部標準）とを分離する。試料の分析を、６４６０三連四重極質量分析計（Ｇ６４６０Ａ Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して実施する。検出された２ＨＧおよびαＫＧの信号を、検量曲線内で外挿したαＫＧ／ｄ_６−αＫＧの比率、および２ＨＧ／ｄ_５−３ＨＧの比率を使用して分析対象の濃度へと変換する。各々個々の試料のパーセント阻害を、化合物で細胞処理中にグルタミンの存在下および欠如下で得た最大基準および最小基準に、計算した２ＨＧまたはａＫＧ濃度を正規化した後に得る。ＩＣ_５０値を、Ｓ字型用量応答４−パラメータ計算式を使用して個々の％阻害から得る。これらの計算を、Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｂａｓｅ（ＩＤＢＳ）またはＳｃｒｅｅｎｅｒ（Ｇｅｎｅｄａｔａ）データ分析プログラムを使用して、自動的に実施する。

【0143】

このアッセイの結果は、このアッセイの細胞において、表２５の試験実施例が、２−ヒドロキシグルタレートの生成を阻害し、変異体ＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｃの阻害を示していることを実証する。このアッセイの細胞において、野生型ＩＤＨ１によって生成された代謝物質αＫＧが、阻害剤によって影響されず、化合物が、野生型ＩＤＨ１よりも変異体ＩＤＨ１に対して選択的であることを示している。以下の実施例で得られたＩＣ_５０値を、表２５に示す。

【表27】

【0144】

平均＝＋ＳＥＭ（ＳＥＭ＝平均の標準誤差）
＊技術化合物、ＷＯ１３／０４６１３６の実施例番号５５６と同様に調製した（４Ｓ）−３−（２−｛［（１Ｓ）−１−｛４−［（４−アセチルピペラジン−１−イル）メチル］フェニル｝エチル］アミノ｝ピリミジン−４−イル）−４−（プロパン−２−イル）−１，３−オキサゾリジン−２−オン。

【0145】

Ｕ８７ＭＧ／ＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈの細胞アッセイ
化合物で処理する１８〜２４時間前に、細胞をポリ−Ｄ−ｌｙｓコーティング９６ウェルプレート（１２，０００細胞／ウェル）に蒔く。化合物処理の４時間前に、細胞を、通常培地から除去し、グルタミンなしの培地に置き換えることによってグルタミン欠乏にする。欠乏に続き、次に細胞を、０．２％の最終濃度で、ＤＭＳＯを含有するグルタミンなしの培地に溶解した、異なる濃度の試験化合物（２０μＭ〜１ｎＭ）で処理する。初期の化合物インキュベーションは、３７℃／５％ＣＯ_２で１時間である。１時間後、最終の２ｍＭ濃度にグルタミンを添加し、次に処理細胞をさらに３７℃／５％ＣＯ_２で１８時間インキュベーションする。細胞内の２ＨＧを、培地から取り出し、溶解緩衝剤（ｐＨ７．５、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ／１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）で処理後に得られた細胞溶解物で分析する。細胞溶解物を、処理するまで−８０℃で保存する。分析対象抽出用に、解凍溶解物のアリコートを、深い９６ウェルプレートに移し、内部標準としてｄ_５−３ＨＧを含有する冷ＭｅＯＨ、続いてクロロホルムおよびＨ_２Ｏ（１：４：３：２）で処理する。分離後に上部相を収集し、ＨＰＬＣに注入し、６４６０三連四重極質量分析計においてＭＳ／ＭＳ検出と結合した親水性相互作用（ＨＩＬＩＣ）クロマトグラフィーを使用して、２ＨＧ（及び内部標準）を分離した。各々個々の試料のパーセント阻害は、計算した２ＨＧ濃度を、化合物で細胞処理中にグルタミンの存在下および欠如下で得た最大基準および最小基準に正規化した後に得る。ＩＣ_５０値を、Ｓ字型用量応答４−パラメータ計算式を使用して個々の％阻害から得る。これらの計算を、Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｂａｓｅ（ＩＤＢＳ）またはＳｃｒｅｅｎｅｒ（Ｇｅｎｅｄａｔａ）データ分析プログラムを使用して、自動的に実施する。

【0146】

以下の実施例は、基本的に上記の通りに試験され、以下の表２６に示されるようにこのアッセイにおいて、Ｕ８７ＭＧ細胞中の変異体ＩＤＨ１／Ｒ１３２Ｈに対して阻害活性を示す。

【表28】

【0147】

平均＝＋ＳＥＭ（ＳＥＭ＝平均の標準誤差）
＊技術化合物、ＷＯ１３／０４６１３６の実施例番号５５６と同様に調製した（４Ｓ）−３−（２−｛［（１Ｓ）−１−｛４−［（４−アセチルピペラジン−１−イル）メチル］フェニル｝エチル］アミノ｝ピリミジン−４−イル）−４−（プロパン−２−イル）−１，３−オキサゾリジン−２−オン。

【0148】

生体内２−ヒドロキシグルタレートのアッセイ
ＩＤＨ１阻害剤の生体内試験用に、ＴＢ０８−０５３７（ＴＢ０８）細胞（Ｒ１３２Ｈ変異体ＩＤＨ１を有する二次神経膠芽細胞腫、ヘテロ接合性ヒト、ＷＯ２０１３／０８６５０６）の移植後に、胸腺欠損ヌードマウス（２０〜２２ｇ、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において皮下異種移植片腫瘍を増殖させる。細胞移植の前に、マウスに自由に餌と水を与え１週間順応させる。ＴＢ０８を、右後ろわき腹に直接腫瘍断片として移植する。腫瘍の大きさを、カリパスで週に２回測定し、腫瘍の大きさを、０．５３６×Ｌ×Ｗ^２を使用して計算する（式中、Ｌ＝長さ、Ｗ＝幅）。腫瘍の大きさが、１５０〜４００ｍｍ^３に達した時点で、動物を無作為化し、グループに分類し（１グループ当たりｎ＝３〜６）、ＩＤＨ１阻害剤または賦形剤対照を投与する。ＩＤＨ１阻害剤に対しては、化合物は、１モル当量の１Ｎ ＨＣｌでｐＨ２にした、２５ｍＭのリン酸緩衝液中の２０％のＣａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）を含む賦形剤中に処方される。化合物を浴超音波処理し、懸濁液を得る。化合物を、１キロクラム当たり１ミリグラム（ｍｐｋ）を基準に、０．２ｍｌの最終容量で経口強制飼養により投与する。２ＨＧの阻害を測定するために、化合物を、１日に１回（ＱＤ）で６日間（合計投与回数＝６）投与する。最後の投与の１２時間後、マウスをイソフルラン麻酔および頸椎脱臼で安楽死させる。賦形剤対照マウスには、ＩＤＨ１阻害剤化合物を添加しないで同じ投与スケジュールが与えられる。腫瘍を切除し、ラベルを貼ったチューブに入れ、直ちに液体窒素で冷凍する。腫瘍を、処理するまで−８０℃で保存する。

【0149】

腫瘍溶解物の調製
ＸＹ Ｌｉｔｅ緩衝液を、分子グレード水において調製し、以下の構成成分を含ませる：ｐＨ７．５、２５ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ。ＸＹ Ｌｉｔｅ（４０ｍｌ）に、Ｈａｌｔ ＰｒｏｔｅａｓｅとＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓとの組み合わせ（Ｈａｌｔ（商標）ＰｒｏｔｅａｓｅおよびＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ、ＥＤＴＡ−Ｆｒｅｅ Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ番号７８４４１）８００μｌを添加する。試料をボルテックスし、次に氷上で冷却する。橙色キャップの溶解−Ａチューブにラベルを貼り、氷上の棚に置いた。セラミックモルタル及び乳棒をドライアイスに置き、冷却させた。２×２インチ正方形のアルミフォイルを、モルタルの底に置いた。腫瘍試料を、予め冷却したモルタルの正方形のフォイル上に移した。液体窒素（約５ｍｌ）を添加し、蒸発させ、腫瘍を超冷凍した。フォイルの別片を、腫瘍の上に置き、腫瘍を粉砕し、セラミック乳棒を用いて小片にした。粉砕した腫瘍を、素早く溶解チューブに移す。氷冷ＸＹ Ｌｉｔｅ（５００μＬ）を、各チューブに添加し、キャップを閉める。次に腫瘍を、ＭＰ ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓのＦａｓｔＰｒｅｐ−２４を使用して、速度を５に設定し、それぞれ３５秒で２回、回転させることによって処理する。次に試料を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ Ｒにおいて、４℃で、１４，０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離する。上澄みを、予め冷却された９６の深いウェルプレートに移す。ペレットを廃棄する。

【0150】

タンパク質のアッセイ
タンパク質のアッセイ希釈プレートをまず、ＸＹ緩衝剤（１４５μｌ）を非滅菌９６ウェル丸底Ｃｏｒｎｉｎｇプレートに添加することによって作製する。ここに、腫瘍溶解物（５μＬ）を添加し、緩やかに混合する。プレートを氷上で保持する。ＢＳＡ開始（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｃａｔ．２３２０９ ２ｍｇ／ｍＬ）の連続希釈を、以下のように設定する：５つの０．５ｍＬチューブを棚に置き、各自にＸＹ緩衝剤（６０μＬ）を添加する。原料のＢＳＡ（６０μＬ）を第１のチューブに添加し、ボルテックスする。第１のチューブから６０μＬを次のチューブに移し、ボルテックスするなど、希釈系列が終了するまでは、以下の通りである：チューブ１＝原料ＢＳＡ、チューブ２〜５は１：２連続希釈、チューブ６＝ＸＹ緩衝剤のみ。Ｔｈｅｒｍｏ ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬を、製造業者の指示に従って混合する。混合ＢＣＡ試薬（２００μＬ）を、各試料に添加し、１５分間インキュベーションする。タンパク質アッセイの結果を、ＳＯＦＴｍａｘ Ｐｒｏ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ上で読み取る。タンパク質アッセイの結果に基づき、適切な量のＸＹ緩衝剤を、各腫瘍溶解物に添加し、５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度が生じた。全試料にラベルを貼り、−８０℃で保存する。

【0151】

腫瘍溶解物中の代謝物質分析
２ＨＧ及びαＫＧの合計濃度でのＩＤＨ１阻害の生体内効果を、腫瘍異種移植の液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）分析によって測定した。本方法を、ＬＣ−ＭＳによる分析より前に、Ｏ−ベンジルヒドロキシルアミンを用いる誘導体化に利用する。各腫瘍溶解物１０マイクロリットルを、深いウェルの９６ウェルプレートに置き、１０μＭのｄ_５−３ＨＧおよび１０μＭのｄ_６−αＫＧを含有する内部標準溶液１００μＬと合わせる。ピリジン緩衝剤（８．６％ピリジン、ｐＨ５）中１ＭのＯ−ベンジルヒドロキシルアミン５０μＬと、ピリジン緩衝剤中１ＭのＥＤＣの５０μＬとを、各試料に添加する。誘導体化反応を、室温で１時間進める。Ｂｅｃｋｍａｎ Ｂｉｏｍｅｋ ＦＸの液体処理器を使用して、６００μＬのＥｔＯＡｃを各試料に添加する。プレートを密封し、５分間ボルテックし、次にそれらをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ５８１０Ｒ遠心器において、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。上層の４００μＬを、新たな９６ウェルプレートに移す。試料を、５０℃で、加熱窒素下にて乾燥させ、１００μＬのＭｅＯＨ／水（１：１）でもどす。誘導体化試料１マイクロリットルを、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ２０Ａ ＨＰＬＣシステムおよびＴｈｅｒｍｏ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｕｌｔｒａ（商標）三連四重極質量分析計からなるＬＣＭＳシステムに注入する。分析対象を、Ｗａｔｅｒ ＸＢｒｉｄｇｅ（商標）Ｃ１８カラム（２．１×５０ｍｍ、３．５μｍ）を使用して、０．６ｍＬ／分の流速で分離する。移動相Ａは０．１％ギ酸水であり、移動相ＢはＭｅＯＨである。勾配プロファイルは、０分、５％Ｂ；３分、１００％Ｂ；４．００分、１００％Ｂ；４．１分、５％Ｂ；５．５０分、停止である。質量分析計は、ＨＥＳＩ−ＩＩプローブを利用し、陽イオン選択反応モニタリングモードで操作する。検量曲線を、分析対象濃度の、分析対象／内部標準に対するピーク面積比をプロットすること、Ｘｃａｌｉｂｕｒ（商標）ソフトウェアで計量した１／濃度を使用してデータの二次適合を実施することによって描いた。未知の分析対象濃度を、検量曲線から逆算した。ＬＣＭＳアッセイからの代謝物質データを、ｎモル／ｍｇタンパク質で表した。賦形剤処理グループにおける平均２ＨＧレベルを使用して、０％阻害対照を測定した。次に賦形剤対照に対する、各阻害剤処理動物における％阻害を測定した。データをＪＭＰソフトウェアにおいて分析し、各投与グループにおける平均％阻害、標準偏差、および標準誤差を測定する。

【0152】

表２７に同定された実施例の化合物によるＩＤＨ１変異体異種移植マウスにおける２ＨＧの生体内阻害を実証するデータを示す。

【表29-1】

【表29-2】

【0153】

ＳｔｄＤｅｖは標準偏差を指す。Ｓｔｄ Ｅｒｒ Ｍｅａｎは平均の標準誤差を指す。

【0154】

＊技術化合物、ＷＯ１３／０４６１３６の実施例番号５５６と同様に調製した（４Ｓ）−３−（２−｛［（１Ｓ）−１−｛４−［（４−アセチルピペラジン−１−イル）メチル］フェニル｝エチル］アミノ｝ピリミジン−４−イル）−４−（プロパン−２−イル）−１，３−オキサゾリジン−２−オン。