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特許6682221ＴＡＣＣ３阻害剤のスクリーニング方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6682221

(24)【登録日】2020年3月27日

(45)【発行日】2020年4月15日

(54)【発明の名称】ＴＡＣＣ３阻害剤のスクリーニング方法

(51)【国際特許分類】

G01N 33/50 20060101AFI20200406BHJP

C12Q 1/02 20060101ALI20200406BHJP

G01N 33/566 20060101ALI20200406BHJP

G01N 33/15 20060101ALI20200406BHJP

C07K 14/82 20060101ALN20200406BHJP

A61K 45/00 20060101ALN20200406BHJP

A61P 35/00 20060101ALN20200406BHJP

A61P 35/02 20060101ALN20200406BHJP

【ＦＩ】

G01N33/50 ZZNA

C12Q1/02

G01N33/566

G01N33/15 Z

!C07K14/82

!A61K45/00

!A61P35/00

!A61P35/02

【請求項の数】2

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2015-186097(P2015-186097)

(22)【出願日】2015年9月18日

(65)【公開番号】特開2016-65869(P2016-65869A)

(43)【公開日】2016年4月28日

【審査請求日】2018年8月24日

(31)【優先権主張番号】特願2014-194353(P2014-194353)

(32)【優先日】2014年9月24日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000173588

【氏名又は名称】公益財団法人がん研究会

(74)【代理人】

【識別番号】110000800

【氏名又は名称】特許業務法人創成国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】八尾良司

【審査官】海野佳子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１３／１６５００８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Stephen J. Royle ，J Cell Sci. ，２０１２年，125 pt1，PP.1-19

【文献】 Fiona E. Hood et al. ，J. Cell.Biol.，２０１３年，Vol.202,No.3 ，PP.463-478

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ３３／４８−３３／９８

Ｇ０１Ｎ３３／１５

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＴＡＣＣ３活性を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、
ＴＡＣＣ３のアミノ酸配列番号５９３〜８３８の領域と
ＴＯＧｐのアミノ酸配列番号１８９０〜２０３２の領域との結合を阻害することを指標とする化合物のスクリーニング方法。

【請求項2】

前記ＴＡＣＣ３のアミノ酸配列番号５９３〜８３８の領域が
ＴＡＣＣ３のアミノ酸配列番号５９３〜８３８からなる領域を含む組換えタンパク質であり、
前記ＴＯＧｐのアミノ酸配列番号１８９０〜２０３２の領域が、
ＴＯＧｐのアミノ酸配列番号１８９０〜２０３２からなる領域を含む組換えタンパク質であり、少なくともいずれか一方の前記組換えタンパク質が検出に必要な配列を含むことを特徴とする請求項１記載の化合物のスクリーニング方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＴＡＣＣ３に結合し、その活性を阻害する化合物のスクリーニング方法に関する。特に、ＴＡＣＣ３活性を阻害する小化合物をスクリーニングする方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ＴＡＣＣ３（Transforming acidic coiled-coil 3）は、多発性骨髄腫の染色体の切断点から単離された遺伝子であるが、その後、多くの癌で発現異常が示されている癌関連遺伝子である（例えば、非特許文献１〜５、特許文献１）。

【0003】

ＴＡＣＣ３は細胞分裂期にのみ発現し、中心体及び紡錘体に局在することが知られている。また、XenopusやDrosophilaで得られた知見をもとに、ＴＡＣＣ３がＴＯＧｐと結合し、有糸分裂の際に中心体で微小管の重合を安定化し、細胞分裂を制御するというモデルが提示されている（非特許文献６)。

【0004】

腫瘍細胞は細胞分裂が盛んであることから、一般的に、細胞分裂を阻害する薬剤は抗癌剤として有効であると考えられている。実際に従来から分裂装置の主要構造である微小管や、構成タンパク質であるチューブリンを標的とするチューブリン作用薬は抗癌剤として用いられている。

【0005】

しかしながら、ビンクリスチンやパクリタキセルのような従来から用いられているチューブリン作用薬は分裂装置の微小管だけではなく、正常細胞の微小管を同時に標的と
することから、末梢性ニューロパシーのような重篤な副作用を生じることが知られている（例えば、特許文献２）。

【0006】

そこで、腫瘍細胞の分裂装置に特異的に作用する治療薬の開発が望まれている。ＴＡＣＣ３は、上述のように多くの癌で発現に異常が見られることから、発癌との関連が指摘されてきた。実際に、本発明者はＴＡＣＣ３のコンディショナルノックアウトマウスを用い、ＴＡＣＣ３発現の枯渇が胸腺リンパ腫をアポトーシスにより退縮させるものの、正常細胞においてはＴＡＣＣ３が高発現であっても、何ら異常を示さないことを明らかにした（非特許文献７）。

【0007】

以上のようなＴＡＣＣ３の発癌との関連性や、細胞分裂を制御するという知見から、ＴＡＣＣ３を標的とする化合物は、腫瘍細胞に選択的に作用する優れた抗癌剤となることが期待できる。

【0008】

すでに、本発明者は、ＴＡＣＣ３を標的とするＴＡＣＣ３活性阻害剤のスクリーニング方法を開発し、該スクリーニング方法により、ＴＡＣＣ３を標的とし、その活性を抑制する化合物について開示している（非特許文献８、特許文献３、特許文献４）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】国際公開２００５／０７１４１９号

【特許文献2】特開２００９−１６７１６３号公報

【特許文献3】特開２０１２−５４７９号公報

【特許文献4】国際公開２０１３／１６５００８号

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Kiemency, L.A. et al., Nat.Genet. (2010), 42(5), 415-419

【非特許文献2】Peters, D.G. et al., Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev. (2005), 14(7), 1717-1723

【非特許文献3】Ma, X.J. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA (2003), 100(10), 5974-5979

【非特許文献4】Ulisse, S. et al., Endocr.Relat.Cancer (2007), 14(3), 827-837

【非特許文献5】Still, I.H. et al., Genomics (1999), 58(2), 165-170

【非特許文献6】Peset, I., and Vernons, I. Trends Cell Biol. (2008), 18(8), 379-388

【非特許文献7】Yao, R. et al., Oncogene (2012), 31, 135-148

【非特許文献8】Yao, R. et al., Oncogene (2014), 33, 4242-4252

【非特許文献9】Charrasse, S.et al., Eur.J.Biochem. (1995), 234(2), 406-413

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

本発明の課題は、ＴＡＣＣ３やＴＡＣＣ３-ＴＯＧｐ複合体と相互作用し、ＴＡＣＣ３活性を阻害する物質の新たなスクリーニング方法を提供することにある。従来のスクリーニング方法とは異なるスクリーニング方法を用いることによって、今までに得られている化合物とは作用機序の異なる化合物をスクリーニングできる可能性がある。

【0012】

ＴＡＣＣ３と相互作用することが知られているＴＯＧｐ（Tumor over-expressed gene）も、種々の癌で過剰発現しており、いわゆる癌遺伝子であると考えられている（非特許文献９）。また、タンパク質の構造解析からα／βチューブリン二量体に結合することが示されている。また、ＴＡＣＣ３はＴＯＧｐの微小管ポリメラーゼ活性を制御することにより癌細胞の紡錘体形成に関わると考えられている。

【0013】

本発明は、ＴＡＣＣ３とＴＯＧｐとの複合体形成を阻害する化合物を得ることのできるスクリーニング方法を提供することを課題とする。本発明のスクリーニング方法により、腫瘍細胞に対して、より選択性が高く、優れた効果を備えた化合物を得ることができる。

【課題を解決するための手段】

【0014】

本発明のスクリーニング方法は、ＴＡＣＣ３のアミノ酸配列番号５９３〜８３８を含むアミノ酸断片とＴＯＧｐのアミノ酸配列番号１８９０〜２０３２を含むアミノ酸断片との結合を指標とすることを特徴とする。

【0015】

本発明者は、ＴＡＣＣ３のアミノ酸配列番号５９３〜８３８の領域とＴＯＧｐのアミノ酸配列番号１８９０〜２０３２の領域が相互作用することを見出した。したがって、上記アミノ酸領域を用いて化合物をスクリーニングすることによって、ＴＡＣＣ３とＴＯＧｐとの結合を阻害する化合物を得ることができる。

【0016】

ＴＯＧｐはＴＡＣＣ３とともにいわゆる癌関連遺伝子であると考えられており、両者の結合を阻害する化合物は腫瘍細胞に特異的に作用することが期待される。

【0017】

本発明のスクリーニング方法を用いることによって、ＴＡＣＣ３-ＴＯＧｐ複合体の形成を阻害する新たな化合物を同定することができた。また、これら化合物のＴＡＣＣ３活性阻害や細胞分裂阻害を確認することができた。

【0018】

本発明のスクリーニング方法は、前記ＴＡＣＣ３のアミノ酸配列番号５９３〜８３８を含むアミノ酸断片が、ＴＡＣＣ３のアミノ酸配列番号５９３〜８３８からなるアミノ酸断片を含む組換えタンパク質であり、ＴＯＧｐのアミノ酸配列番号１８９０〜２０３２を含むアミノ酸断片が、ＴＯＧｐのアミノ酸配列番号１８９０〜２０３２からなるアミノ酸断片を含む組換えタンパク質であり、少なくともいずれか一方の前記組換えタンパク質が検出に必要な配列を含むことを特徴とする。

【0019】

ＴＡＣＣ３、ＴＯＧｐの結合に必要な領域を含む組換えタンパク質を用いることにより、精製したアミノ酸断片を容易に準備することが可能である。また、これら組換えタンパク質のどちらか一方に検出に必要なエピトープが含まれるようにデザインした組換えタンパク質を用いることによって、ＥＬＩＳＡ法等、免疫アッセイによって、簡便に精度良くスクリーニングを行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】ＴＡＣＣ３とＴＯＧｐとの結合を指標とするスクリーニング方法の概要を示す図。

【図2】ＴＯＧｐに対するＴＡＣＣ３の結合領域の解析結果を示す図。図２Ａに、用いた組換えタンパク質の構造を模式的に示す。図２ＢにＴＯＧｐに結合するＴＡＣＣ３フラグメントの解析結果を示す。

【図3】ＴＡＣＣ３に対するＴＯＧｐの結合領域の解析結果を示す図。図３Ａに、用いた組換えタンパク質の構造を模式的に示す。図３Ｂ、３Ｃに、ＴＡＣＣ３に結合するＴＯＧｐフラグメントの解析結果を示す。

【図4】ＴＡＣＣ３、ＴＯＧｐ各フラグメントのin vivoでの相互作用を示す図。

【図5】ＴＡＣＣ３、ＴＯＧｐ各フラグメントのin vitroでの相互作用を示す図。図５Ａに、用いたＴＯＧｐの組換えタンパク質の構造を模式的に示す。図５Ｂに、ＴＡＣＣ３に結合するＴＯＧｐフラグメントの解析結果を示す。

【図6】本発明のスクリーニング方法による結果を示す図。

【発明を実施するための形態】

【0021】

本発明は、ＴＡＣＣ３を標的とする化合物をスクリーニングする方法を提供することを課題とする。ＴＡＣＣ３を標的とする化合物とは、化合物がＴＡＣＣ３タンパク質、又はＴＡＣＣ３-ＴＯＧｐ複合体と結合することによって、その作用を阻害する化合物を意味する。

【0022】

ＴＡＣＣ３は、ＴＡＣＣファミリーに属するタンパク質の１種である。ＴＡＣＣ３をコードする遺伝子のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、例えば、GenBankアクセッション番号NM_006342.1、UniProtアクセッション番号Q9Y6A5等、データベース上に開示されている。

【0023】

ＴＯＧｐは、微小管結合タンパク質として知られている。ＴＯＧｐをコードする遺伝子のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、例えば、GenBankアクセッション番号NM_001008938.3、 NM_014756.3、UniProtアクセッション番号Q14008等、データベース上に開示されている。

【0024】

本発明のスクリーニング方法では、化合物として、化学合成により得られる化合物だけではなく、抗体、抗体断片、ペプチド等、生物由来の物質天然物等、どのような物質を用いてスクリーニングしてもよい。

【0025】

本発明のスクリーニング方法で得られた化合物は、医薬組成物の薬学的に許容されうるその塩、溶媒和物、又はエステル誘導体を有効成分とし、薬学的に許容し得る賦形剤を含有する医薬組成物とすることができる。

【0026】

医薬組成物の薬学的に許容されうる塩とは、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸、クエン酸、ギ酸、マレイン酸、酢酸、コハク酸、酒石酸、メタンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸等の無機酸及び有機酸との塩が挙げられる。また、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、重炭酸ナトリウム、アンモニア、アミン塩、トリアルキルアミン塩等の塩基塩も挙げられる。

【0027】

また、薬学的に許容されうるエステル誘導体には、炭素数１〜１０個のアルコールまたはカルボン酸など、好ましくは、メチルアルコール、エチルアルコール、酢酸、又はプロピオン酸などとのエステル化合物が挙げられる。

【0028】

薬学的に許容されうる溶媒和物には、好ましくは、水との溶媒和物が挙げられる。このような塩、エステル誘導体、溶媒和物は、標準的な技術を使用して当業者により形成することができる。

【0029】

本発明のスクリーニング方法により得られた化合物を有効成分とする医薬組成物は、ＴＡＣＣ３及びＴＯＧｐを発現し、細胞分裂を盛んに行っている細胞、腫瘍を処置するための組成物として用いることができる。処置とは、ＴＡＣＣ３及びＴＯＧｐ発現細胞において異常な細胞増殖を抑制する、または、ＴＡＣＣ３高発現細胞、又はＴＯＧｐ高発現細胞、特に腫瘍細胞にアポトーシスを誘導することにより、対象における疾患もしくは障害、特に腫瘍を退縮させる、または、腫瘍の増殖を遅延もしくは抑制することを意味する。

【0030】

本発明のスクリーニング方法によって得られた化合物を有効成分とする医薬組成物は、例えば錠剤、コーティング錠、糖衣錠、硬若しくは軟ゼラチンカプセル剤、液剤、乳剤又は懸濁剤の剤形で経口投与してよい。また、例えば坐剤を使用して直腸内に投与してよい。また、例えば軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤又は液剤を使用して局所的又は経皮的に投与してよい。また、例えば、注射剤を使用して非経口的、例えば静脈内、筋肉内、皮下、脊髄内又は皮内的に投与してよい。好ましくは、静脈内、筋肉内又は経口投与であり、最も好ましくは経口投与である。限定されないが、１日に１回または数回投与できる。

【0031】

本発明のスクリーニング方法によって得られた化合物を有効成分とする医薬組成物は、薬学的に不活性な無機又は有機の賦形剤と混合してもよい。錠剤、糖衣錠又は硬ゼラチンカプセル剤の適切な賦形剤の例としては、乳糖、トウモロコシデンプン若しくはその誘導体、タルク又はステアリン酸若しくはその塩などが挙げられる。軟ゼラチンカプセル剤に使用される適切な賦形剤の例には、植物油、ロウ、脂肪、半固体又は液体ポリオール等が挙げられる。液剤及びシロップ剤の調製のための賦形剤の例には、水、ポリオール、サッカロース、転化糖及びグルコースなどが挙げられる。注射剤のための賦形剤の例には、水、アルコール、ポリオール、グリセリン及び植物油などが挙げられる。坐剤及び局所又は経皮適用のための賦形剤の例には、天然又は硬化油、ロウ、脂肪及び半固体又は液体ポリオールなどが挙げられる。また、防腐剤、可溶化剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色剤、着香剤、浸透圧を変える塩、緩衝剤、被膜剤又は酸化防止剤などを含んでよい。さらに、他の治療上有用な薬剤を含んでよい。

【0032】

本発明のスクリーニング方法によって得られた化合物の有効量または投与量は、特に制限されないが、投与形態、年齢、体重、症状に応じて適宜選択すればよい。

【0033】

ＴＡＣＣ３やＴＯＧｐの遺伝子またはタンパク質の働きを阻害することによって利益が得られる疾患は、限定されないが、好ましくは腫瘍である。本発明において、癌と腫瘍は交換可能に用いられる。

【0034】

腫瘍は、限定されないが、肉腫、白血病、胆道癌、乳癌、子宮癌、結腸直腸癌、喉頭癌、食道癌、胃癌、大腸癌、扁桃癌、舌癌、首の癌、リンパ腫、肺癌、甲状腺癌、卵巣癌、腎臓癌、すい臓癌、脳腫瘍、骨髄腫、神経膠腫、メラノーマ、肝癌、前立腺癌及び膀胱癌、好ましくは、大腸癌、卵巣癌、子宮癌、乳癌、食道癌、リンパ腫、神経膠腫、前立腺癌、腎臓癌、メラノーマからなる群から選択される。

【0035】

以下、本発明のスクリーニング方法について、詳細に説明する。本発明のスクリーニング方法は、検出方法としてＥＬＩＳＡを用いているが、ＴＡＣＣ３とＴＯＧｐの複合体形成が検出できれば、以下に示す方法に限らずどのような方法を用いてもよい。

【0036】

［ＴＡＣＣ３とＴＯＧｐとの結合を指標とするスクリーニング方法］
１．スクリーニング方法の概略
図１にＴＡＣＣ３とＴＯＧｐとの結合を指標とするスクリーニング方法の概略を示す。

【0037】

ＴＯＧｐをＥＬＩＳＡプレート（Nunc Maxisorp）に吸着させ、洗浄した後、５％ skim milkを含むＰＢＳでブロッキングする。ＴＡＣＣ３と化合物は混合し、室温で一定時間放置した後、ＴＯＧｐが固定化されたプレートに添加する。その後所定の時間静置し、洗浄後、結合したＴＡＣＣ３をＨＲＰ標識抗ＧＳＴ抗体を用いて検出する。

【0038】

ここでは、タンパク質の精製、検出のために、夫々ＨＩＳタグ、ＧＳＴを融合させたＴＯＧｐ、ＴＡＣＣ３を用いているが、精製、検出が可能であれば、どのように構築した融合タンパク質を用いてもよい。

【0039】

また、ここでは、ＧＳＴ-ＴＡＣＣ３融合タンパク質を用いていることから、ＴＯＧｐとＴＡＣＣ３の結合を検出するために、ＨＲＰ標識をした抗ＧＳＴ抗体を用いているが、標識、抗体等、ＴＡＣＣ３-ＴＯＧｐ複合体を検出することができればどのようなものを用いてもよい。

【0040】

さらに、ＴＯＧｐを固相に吸着させるのではなく、ＴＡＣＣ３を固相に吸着させ、その後ＴＯＧｐと化合物を添加して、結合したＴＯＧｐを検出する構成としてもよい。

【0041】

また、本発明のスクリーニング方法は、ＴＡＣＣ３-ＴＯＧｐ複合体の形成を指標としていることから、ＴＡＣＣ３-ＴＯＧｐ複合体形成を検出することができれば、ＥＬＩＳＡを応用した系に限らず、公知のどのような系を用いてもよい。

【0042】

２．ＴＡＣＣ３、ＴＯＧｐの結合領域の特定
ＴＡＣＣ３、ＴＯＧｐともに、全長が含まれるタンパク質を用いてもよいが、タンパク質精製、検出感度の点から、結合領域が含まれるなるべく狭い領域をスクリーニングに用いた方がよい。そこで、両者の結合領域の特定を行った。

【0043】

以下、培養細胞での組換えタンパク質の発現、免疫沈降等は、特に断りのない限り周知の分子遺伝学的手法により行った。

【0044】

２．１．ＴＯＧｐに対するＴＡＣＣ３の結合領域の検討
ＴＡＣＣ３を３分割したフラグメントｄ１（アミノ酸配列番号１〜３３２）、ｄ３（アミノ酸配列番号３２７〜６００）、ｄ４（アミノ酸配列番号５９３〜８３８）をｐｃＤＮＡ３にクローニングし、ＨＡ-タグを付与し（図２Ａ）、２９３細胞で発現させ、内因性のＴＯＧｐとの相互作用を解析した。

【0045】

抗ＨＡ抗体（シグマ社製 E6779）で免疫沈降し、上記各ＴＡＣＣ３フラグメントとＴＯＧｐが共沈するかをウェスタンブロットにより解析した（図２Ｂ右）。その結果、ＴＡＣＣ３ドメインを含むｄ４フラグメントとＴＯＧｐが相互作用することが明らかとなった。

【0046】

なお、ウェスタンブロットは各パネルの下に記載した抗体を用いて検出を行っている（以下に示す免疫沈降の解析結果も同様に表示している。）。図２Ｂ左は２９３細胞内で発現している内因性のＴＯＧｐ、図２中央は２９３細胞内で発現させたＴＡＣＣ３フラグメントの検出結果を示す。

【0047】

２．２. ＴＡＣＣ３に対するＴＯＧｐの結合領域の検討
ＴＯＧｐを４分割したフラグメントＦ１（アミノ酸配列番号１〜６１９）、Ｆ２（アミノ酸配列番号６２０〜１０９４）、Ｆ３（アミノ酸配列番号１０９５〜１５０９）、Ｆ４（アミノ酸配列番号１５０２〜２０３２）をｐｃＤＮＡにクローニングし、ＦＬＡＧ-タグを付与し（図３Ａ）、２９３細胞で発現させ、内因性のＴＡＣＣ３との相互作用を解析した。

【0048】

抗ＦＬＡＧ抗体（シグマ社製 F2426）で免疫沈降し、上記ＴＯＧｐフラグメントとＴＡＣＣ３が共沈するかをウェスタンブロットにより解析した（図３Ｂ右）。その結果、Ｆ４フラグメントとＴＡＣＣ３が結合することが明らかとなった。

【0049】

さらに、Ｆ４フラグメントを、Ｆ４−６（アミノ酸配列番号１５０２〜１８８９）、Ｆ４−３（アミノ酸配列番号１８９０〜２０３２）に分割し、上記と同様に、２９３細胞で発現させ、免疫沈降実験を行った。その結果、Ｃ末のフラグメントＦ４−３とＴＡＣＣ３との結合が認められた（図３Ｃ右）。

【0050】

２．３．ＴＡＣＣ３、ＴＯＧｐ各フラグメントのin vivoでの相互作用
内因性のＴＯＧｐ、又はＴＡＣＣ３と、各フラグメントの結合が観察されたことから、in vivoでこれらフラグメント同士が結合するか解析した。

【0051】

まず、ＴＡＣＣ３-ｄ４フラグメントに、ＴＯＧｐのＦ１からＦ４までのフラグメントが結合するか解析した。

【0052】

ＨＡタグを付与されているＴＡＣＣ３-ｄ４フラグメントと、ＦＬＡＧタグが付与されているＴＯＧｐのＦ１〜Ｆ４までの各フラグメントを２９３細胞で発現させる。その後、抗ＨＡ抗体でＴＡＣＣ３-ｄ４フラグメントを免疫沈降し、ＴＡＣＣ３-ｄ４と共沈するＴＯＧｐのフラグメントの解析を行った（図４Ａ）。その結果、ＴＡＣＣ３-ｄ４（アミノ酸配列番号５９３〜８３８）フラグメントは、ＴＯＧｐのＦ４（アミノ酸配列番号１５０２〜２０３２）フラグメントと結合することが示された（図４Ａ右）。

【0053】

次に、ＴＯＧｐ-Ｆ４−３（アミノ酸配列番号１８９０〜２０３２）フラグメントに結合するＴＡＣＣ３フラグメントを解析した。ＦＬＡＧタグが付与されているＴＯＧｐ-Ｆ４−３と、ＨＡタグが付与されているＴＡＣＣ３のｄ１、ｄ３、ｄ４の各フラグメントを２９３細胞で発現させ、抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降し、ＴＯＧｐ-Ｆ４−３フラグメントと共沈するＴＡＣＣ３のフラグメントの解析を行った。その結果、ＴＯＧｐ-Ｆ４−３フラグメントは、ＴＡＣＣ３のｄ４（アミノ酸配列番号５９３〜８３８）と結合することが示された（図４Ｂ右）。

【0054】

以上の結果は、前述の内因性のＴＡＣＣ３、ＴＯＧｐと、各フラグメントとの結合実験の結果と一致している。

【0055】

２．４．ＴＡＣＣ３、ＴＯＧｐ各フラグメントのin vitroでの相互作用
上述のin vivoアッセイで相互作用が確認されたＴＯＧｐ-Ｆ４−３（アミノ酸配列番号１８９０〜２０３２）をさらに分割したＦ４−４（アミノ酸配列番号１８９０〜１９６３）、Ｆ４−５（アミノ酸配列番号１９５６〜２０３２）（図５Ａ）とＴＡＣＣ３-ｄ４フラグメントを用いて、in vitro pull-downアッセイにより結合解析を行った（図５Ｂ）。

【0056】

ＧＳＴ融合ＴＡＣＣ３-ｄ４フラグメント、ＨＩＳ-Ｖ５タグ融合ＴＯＧｐの各フラグメントを夫々大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３中で発現させ、ＧＳＴ融合タンパク質はGlutathione Sepharose 4B(GE healthcare社製)、Ｈｉｓタグ融合タンパク質はＴＡＬＯＮレジン（clontech社製）を用いて精製した。

【0057】

Glutathione Sepharos 4BにＧＳＴ融合ＴＡＣＣ３-ｄ４フラグメントを結合させ、Glutathione Sepharose-ＧＳＴ-ＴＡＣＣ３-ｄ４カラムを作製し、精製した各ＴＯＧｐフラグメントをアプライした。洗浄後、ＳＤＳbufferで溶出し、結合したＴＯＧｐフラグメントを抗Ｖ５抗体（invitrogen社製）を用い、ウエスタンブロットにより解析した（図５Ｂ上）。

【0058】

その結果、ＴＡＣＣ３-ｄ４と結合するのはＴＯＧｐ−Ｆ４−３フラグメントであり、さらに短くしたＦ４−４、Ｆ４−５とは結合が確認できなかった。

【0059】

２．５．ＴＡＣＣ３-ＴＯＧｐの結合を用いた化合物のスクリーニング
上記アッセイより、in vivo、in vitroで結合が確認できたＴＡＣＣ３-ｄ４、ＴＯＧｐ-Ｆ４-３を用いて理研ＮＰＤｅｐｏ化合物ライブラリーを用いて化合物のスクリーニングを行った。ここでは、化合物のスクリーニングを例に挙げて説明するが、抗体、ペプチドなど医薬候補となるものであればどのようなものを用いてもよい。

【0060】

候補化合物は、１００μＭの濃度で、図１に示したようにＴＯＧｐフラグメントを吸着させた固相に、ＴＡＣＣ３-ｄ４フラグメントとともに添加して、結合をＥＬＩＳＡにより測定した。図６にＥＬＩＳＡの結果を示す。図中矢印で示したＴＯＧｐとＴＡＣＣ３との結合を阻害し、５０％以下の結合しか示さない化合物をＴＡＣＣ３-ＴＯＧｐスクリーニングにおいて、陽性を示す化合物とした。

【0061】

さらに、ＴＡＣＣ３とＴＯＧｐとの結合を阻害する化合物について、培養細胞を用いて細胞アッセイを行った。細胞アッセイは、上記スクリーニングにより得られた化合物を培養細胞（卵巣癌細胞、ＳＫＯＶ−３）の培地に４０μｇ/ｍｌの濃度で添加して、細胞数低下、mitotic index、紡錘体サイズなど、有糸分裂の停止を示す表現型を誘導するか解析を行った。

【0062】

ＴＡＣＣ３-ＴＯＧｐスクリーニングでは、６９の候補化合物のうち、１７の化合物がＴＡＣＣ３とＴＯＧｐの結合を阻害し、さらに、細胞分裂を停止する表現型を備えた８つの化合物得ることができた。

【0063】

本発明のスクリーニングによって得られた化合物の例を示す。下記構造式で示した化合物（ＮＰＤ１３４８６、２Ｈ-１-Ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ-２-ｏｎｅ，７，８-ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ-４-［［４-（４-ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）-１-ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｍｅｔｈｙｌ］-）は、コントロール（候補化合物無添加）の２２．５％しか結合せず、ＥＬＩＳＡのスクリーニング系で最も強い結合阻害を示した化合物である（図６において、黒い矢印で示している。）。本化合物は、従来のスクリーニング方法では検出することのできなかった化合物であり、類似の化合物も抗癌剤として報告された例はない。

【0064】

【化1】