特許 6683601 抗菌性ペプチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6683601

(24)【登録日】2020年3月30日

(45)【発行日】2020年4月22日

(54)【発明の名称】抗菌性ペプチド

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/00 20060101AFI20200413BHJP

   C07K 7/08 20060101ALI20200413BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20200413BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20200413BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20200413BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20200413BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20200413BHJP

   A61K 38/10 20060101ALI20200413BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20200413BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20200413BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20200413BHJP

   A61K 31/43 20060101ALI20200413BHJP

   A61K 31/545 20060101ALI20200413BHJP

   A61K 31/351 20060101ALI20200413BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20200413BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20200413BHJP

   A61K 47/46 20060101ALI20200413BHJP

   A61K 47/40 20060101ALI20200413BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20200413BHJP

   A61L 29/16 20060101ALI20200413BHJP

   A61K 49/00 20060101ALI20200413BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20200413BHJP

【ＦＩ】

   C07K14/00ZNA

   C07K7/08

   C12N15/11 Z

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   A61K38/10

   A61K38/16

   A61K31/7088

   A61K48/00

   A61K31/43

   A61K31/545

   A61K31/351

   A61P31/04

   A61K47/42

   A61K47/46

   A61K47/40

   A61K47/36

   A61L29/16

   A61K49/00

   C12P21/02 C

【請求項の数】18

【全頁数】34

(21)【出願番号】特願2016-512870(P2016-512870)

(86)(22)【出願日】2014年5月9日

(65)【公表番号】特表2016-526020(P2016-526020A)

(43)【公表日】2016年9月1日

(86)【国際出願番号】NL2014050295

(87)【国際公開番号】WO2014182172

(87)【国際公開日】20141113

【審査請求日】2017年5月8日

(31)【優先権主張番号】13167240.4

(32)【優先日】2013年5月10日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】511181533

【氏名又は名称】アカデミス ズィーケンハイス レイデン ハー．オー．デー．エン． エルユーエムセー

(74)【代理人】

【識別番号】110000442

【氏名又は名称】特許業務法人 武和国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ニッベリング， ぺトルス ヘンドリクス

(72)【発明者】

【氏名】ヒームストラ， ピーテル

(72)【発明者】

【氏名】デレイハウト， ヤン ウーテル

【審査官】 柴原 直司

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００８−５０８２６５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Nederlands Tijdschrift voor Dermatologie en Venereologie, (2013), 23, [1], p.43(5)

【文献】 Peptides, (2006), 27, [4], p.649-660

【文献】 Antimicrob. Agents Chemother., (2014), 58, [8], p.4411-4419

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ａ６１Ｋ ３８／００−３８／５８

Ａ６１Ｋ ４１／００−４５／０８

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｋ ５０／００

Ａ６１Ｋ ５１／００−５１／１２

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

アミノ酸配列ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲ、または、前記アミノ酸配列のバリアントを含む、単離された、または、組換えられたポリペプチドであって、
前記ポリペプチドは、抗バクテリア、抗真菌、および／または、抗炎症活性を有し、
前記バリアントは、アミノ酸配列ＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬを少なくとも含む少なくとも１６個のアミノ酸を有し、さらに：
− 次のアミノ酸置換
・Ｌ、Ｉ、ＶまたはＡの群から選択される１つまたは複数のアミノ酸の前記群から選択される別のアミノ酸置換、
・Ｒ、ＫまたはＨの群から選択される１つまたは複数のアミノ酸の前記群から選択される別のアミノ酸置換、
・ＥのＱによるアミノ酸置換、
・ＹまたはＷのＦによるアミノ酸置換、
・Ｑ、Ｎ、Ａ、ＳまたはＴの群から選択される１つまたは複数のアミノ酸の前記群から選択される別のアミノ酸置換、
のうち、２つまでのアミノ酸置換を有し、
− 対応するＤ−アミノ酸による１つまたは複数のアミノ酸置換を有し、
− 対応する非天然アミノ酸による１つまたは複数のアミノ酸置換を有し、
および／または、
− 前記アミノ酸配列由来の少なくとも１６個の連続するアミノ酸のレトロインベルソ配列を有する、
ポリペプチド。

【請求項2】

Ｎ末端、および／または、Ｃ末端が修飾されている、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項3】

Ｎ末端に、アセチル−、ヘキサノイル−、デカノイル−、ミリストイル−、ＮＨ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_１１−ＣＯ−またはプロピオニル残基を含み、および／または、Ｃ末端に、アミド−、ＮＨ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_１１−ＣＯ−アミド−または１つまたは２つのアミノ−ヘキサノイル基を含む、請求項２に記載のポリペプチド。

【請求項4】

請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含み、
前記ポリペプチドは、
アミノ酸配列ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲ、または、前記アミノ酸配列のバリアントを含み、
前記バリアントは、少なくとも１６個のアミノ酸を有し、さらに：
− 次のアミノ酸置換
・Ｌ、Ｉ、ＶまたはＡの群から選択される１つまたは複数のアミノ酸の前記群から選択される別のアミノ酸置換、
・Ｒ、ＫまたはＨの群から選択される１つまたは複数のアミノ酸の前記群から選択される別のアミノ酸置換、
・ＥのＱによるアミノ酸置換、
・ＹまたはＷのＦによるアミノ酸置換、
・Ｑ、Ｎ、Ａ、ＳまたはＴの群から選択される１つまたは複数のアミノ酸の前記群から選択される別のアミノ酸置換、
のうち、２つまでのアミノ酸置換を有する、核酸分子。

【請求項5】

請求項４に記載の核酸分子を含むベクター。

【請求項6】

請求項４に記載の核酸分子、および／または、請求項５に記載のベクターを含む組換え宿主細胞。

【請求項7】

請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチド、または、その薬学的に許容される塩、請求項４に記載の核酸分子、および／または、請求項５に記載のベクター、および少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤、および／または、賦形剤を含む医薬組成物。

【請求項8】

局所投与のために製剤され、クリーム、ゲル、軟膏、ローション、フォーム、懸濁剤、スプレー、エアロゾル、粉末エアロゾルなどである、請求項７に記載の医薬組成物。

【請求項9】

抗菌剤を含む、請求項７または８に記載の医薬組成物。

【請求項10】

前記抗菌剤は、
ペニシリン、セファロスポリン、ムピロシン、カルバペネムからなる群から選択される、請求項９に記載の医薬組成物。

【請求項11】

前記ポリペプチドを含む徐放性の、および／または、標的化送達のための担体を含む、請求項７から１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項12】

前記担体は、
ナノ粒子、微小粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、リポソーム、ミクロスフェア、ハイドロゲル、ポリマー、脂質複合体、血清アルブミン、抗体、シクロデキストリンおよびデキストランからなる群から選択される、請求項１１に記載の医薬組成物。

【請求項13】

請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、医療用デバイスのコーティング剤。

【請求項14】

治療剤、予防剤、または、診断剤としての使用のための請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチド、および／または、請求項４に記載の核酸分子。

【請求項15】

細菌、および／または、真菌感染の処置、および／または、細菌、および／または、真菌感染から生じる状態の処置における請求項１１または１２に記載の使用のためのポリペプチド、および／または、核酸分子。

【請求項16】

細菌、および／または、真菌感染に罹患している対象への処置のために、治療有効量を前記対象へ投与することを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項４に記載の核酸分子、または、請求項７から１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項17】

請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチドの調製のための方法であって、
− 請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子を提供するステップと、
− 前記核酸分子で宿主細胞を形質転換するステップと、
− 前記ポリペプチドの発現を可能にする条件下で前記宿主細胞を培養するステップと、
− 前記細胞から前記ポリペプチドを回収するステップと
を含み、
前記ポリペプチドは、
アミノ酸配列ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲ、または、前記アミノ酸配列のバリアントを含み、
前記バリアントは、少なくとも１６個のアミノ酸を有し、さらに：
− 次のアミノ酸置換
・Ｌ、Ｉ、ＶまたはＡの群から選択される１つまたは複数のアミノ酸の前記群から選択される別のアミノ酸置換、
・Ｒ、ＫまたはＨの群から選択される１つまたは複数のアミノ酸の前記群から選択される別のアミノ酸置換、
・ＥのＱによるアミノ酸置換、
・ＹまたはＷのＦによるアミノ酸置換、
・Ｑ、Ｎ、Ａ、ＳまたはＴの群から選択される１つまたは複数のアミノ酸の前記群から選択される別のアミノ酸置換、
のうち、２つまでのアミノ酸置換を有する、
を含む、ポリペプチドの調製のための方法。

【請求項18】

− 前記ポリペプチドをＮ末端またはＣ末端修飾するステップ
を含む、請求項１７に記載のポリペプチドの調製のための方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生化学の分野に関する。さらに具体的には本発明は、抗菌性ペプチドの分野に関し、細菌、ウイルス、真菌および寄生虫感染を妨げることに関する。

【背景技術】

【0002】

抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）は、自然界全体の生物の防御系の不可欠な構成成分であり、侵入する病原体に対する防護をもたらす。ＡＭＰは、単一の規定された分子構造（エピトープ）を標的化しないが、細胞膜に作用して細菌および真菌を急速に死滅させる。したがって従来の抗生物質とは反対に、それらは細菌の代謝活性とは無関係に有効である。それらの直接の殺菌性活性に加えて、抗菌性ペプチドは、自然および適用免疫系の制御、炎症および創傷の治癒、および追加の抗真菌、抗ウイルス、駆虫および抗がん剤活性などの複数の活性を示す特定のペプチドとして特に魅力的である。ＡＭＰは配列および二次構造において非常に多様であるが、いくつかの共通の特性を共有している。それらは、通常短く（約１５〜４０アミノ酸）、カチオン性、両親媒性であり、主に細菌膜の完全性を損なうことによってそれらの殺菌効果を発揮する。ＡＭＰの標的微生物のアニオン性膜表面との相互作用は、膜透過、細胞溶解および死を導く。細胞質膜がほとんどの抗菌性ペプチドの主な標的であり、膜中のペプチドの蓄積が細胞質構成成分の漏出および細胞死を生じる浸透性の増加およびバリア機能の低下を引き起こすことは一般に認められている。ＡＭＰの作用を説明するために、膜透過についての種々の分子機構が提案されているが、そのうち一部は現象論的な分子機構であり、他はより定量的な分子機構である。

【0003】

モデル系における実験観察は、カーペットまたはポアモデル（図１）によって主に合理的に説明された。カーペットモデルでは、ＡＭＰが膜表面で膜と平行に配向されて蓄積し、局所的に膜を薄くして細胞膜を不安定化させて、細胞内内容物の放出を引き起こす。しかし、非特異的方法（例えば脂質クラスター形成または脂質の極性および非極性基の分離）で脂質の充填および組織を破壊することによって、または非二重層脂質凝集を誘導することによって、多数のＡＭＰが界面活性剤のような様式でも機能するという説得力のある証拠がある。さらにいくつかのＡＭＰは、細胞膜を通過し、細胞内標的と相互作用し（図１）、細菌／真菌生存率の低下を導く。

【0004】

明らかにＡＭＰの作用の様式（複数可）は、病原性細菌でより急速に耐性を発達させる、細胞壁上またはタンパク質およびＲＮＡ合成工程中の固有のエピトープなど標的が単純であることが多い従来の抗生物質のものとは異なる。従来の抗生物質を超える抗菌性ペプチドの主な有利点は、主にこれらのペプチドが、従来の抗生物質とは対照的に、単一の規定された分子構造（エピトープ）を標的化するのではなく、細胞膜に作用して細菌および真菌を数分以内に死滅させることにより、これらのＡＭＰに対する微生物の耐性が容易には発達しないことである。したがって、細菌の増殖速度より早い殺菌速度および標的の性質（脂質組成の大幅な改変は細菌細胞生存率に影響を与える）のために、耐性は生じにくい。ＡＭＰに耐性である変異体の出現は、検査した他の臨床用抗生物質（例えばシプロフロキサシンおよびエイスロマイシン）より低い変異率を示すペプチドの抑制濃度以下の存在下で繰り返し継代培養した後の細菌感受性をモニターすることによって決定されている。これらの抗生物質の最少抑制濃度（ＭＩＣ）は、すべての継代培養（６４回まで）を通じて増加したが、ペプチドの圧力はその株のＭＩＣを増加させなかった。したがって、従来の抗生物質とは対照的に、ＡＭＰの存在下での耐性の発達は生じにくい。さらにＡＭＰは、速効型および生分解性であり、環境中での残存抗生物質についての現在の懸念事項を軽減する。

【0005】

多種多様な微生物感染が、微生物が自己産生ポリマー性マトリクス中に構築した群落に凝集し、表面に接着しているバイオフィルム形成と関連している。従来の抗生物質の追加の不利点は、次の理由からバイオフィルム感染の根絶を保障しないことである：

【0006】

１）バイオフィルム中への従来の抗生物質の不完全な浸透：
細菌が包埋されるマトリクスは、抗菌物質などの外部からの影響からそれらを保護する。大部分の抗生物質はバイオフィルムに浸透できるが、バイオフィルム中へのそれらの拡散は遅く、そのためそれらが所望の効果を誘発できるより前にそれらは不活性化される。

【0007】

２）細菌の低い代謝活性：
バイオフィルム関連感染（ＢＡＩ）は通常、バンコマイシンで処置され、リファンピシンと組み合せられることも多い。バンコマイシンは、極めて低い輸送速度ではあるもののバイオフィルムにかなりよく浸透することが周知であるが、バイオフィルム内に残存する細菌の数はほとんど低減しない。したがってこの抗生物質での処置は、未だ比較的高い失敗率を有し、これは抗生物質を無効性にするバイオフィルム中の細胞の低い代謝活性によって説明できる。

【0008】

３）抗生物質の不活性化および分解：
ＢＡＩにおいて、抗生物質は主に全身に投与される。したがってそれらは腎クリアランスによって血流から除去され、血液および周囲の組織において酵素的に分解されやすい。酵素（細菌によって産生される）は、化合物を直接破壊または改変できる。これらの機構は、局所環境における薬物濃度を活発に低減する。バイオフィルム中では、低い浸透が追加的問題を提起する。全身投与濃度を増加させることは、抗生物質の高い血液濃度での毒性のために実行可能ではない。

【0009】

４）細菌は耐性を発達させる：
抗生物質への細菌の耐性の全般的な増加に加えて、より深い層での抗生物質の濃度の減少のために、細菌が抗生物質圧力を回避する危険性は高く、これらの抗生物質への耐性が変異体の生存増加を導く場合がある。バンコマイシンを含む抗生物質の最適以下の濃度は、バイオフィルム形成を増強することさえ報告されている。さらに、効果が不十分である従来の抗生物質の頻回投与は、抗生物質耐性の発達を促進する。

【0010】

５）従来の抗生物質は、炎症促進性微生物化合物の放出を生じる：
ＢＡＩにおいてインプラント周囲組織は、細菌によってコロニー形成されることが示されている。これは、局所免疫応答の調節解除に大きく依存する。これが、インプラントの交換後でさえ多くの場合において感染が持続する理由である。生体材料の移植は、好中球、マクロファージ／単球およびリンパ球の逐次的流入に続く、生体材料を覆う多核異物巨細胞へのマクロファージの融合、新規線維芽細胞形成およびフィブリンの沈着によって特徴付けられる「異物反応」として周知の炎症性応答を誘発し、異物の線維症／封入を導く。この一連の事象は、関与する細胞型によって産生されるサイトカインなどの分子シグナルによって高度に制御される。感染の場合宿主免疫系は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）などの宿主細胞上の特異的受容体によって認識される「病原体関連分子パターン」（ＰＡＭＰ）として表される細菌の分子によって追加的に引き起こされる。例えば、細菌性ペプチドグリカンまたはリポ多糖類は、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４によって認識され、炎症性応答の強力な誘導因子である。異物反応および細菌感染の両方による免疫系の活性化は、宿主免疫系の「過度の」反応を導き、組織の炎症および破壊を導き、実際に感染のための理想的な環境を提供している。それにより、生体材料およびＰＡＭＰによる同時活性化は、免疫機能への有害な作用を有し、感染への易罹患性を強く増加させる場合がある。

【0011】

現在、セクロピン、デフェンシン、マガイニンおよびカテリシジンを含む２，０００種を超えるさまざまな抗菌性ペプチド配列が周知である（例えばｗｗｗ．ｂｂｃｍ．ｕｎｉｖ．ｔｒｉｅｓｔｅ．ｉｔ／〜ｔｏｓｓｉ／ｓｅａｒｃｈ．ｈｔｍを参照されたい）。抗菌性ペプチドおよびタンパク質の例は、以下に記載されている：
ＵＳ６，５０３，８８１は、抗菌性ペプチドとして使用されるインドリシジン類似物であるカチオン性ペプチドを開示している。カチオン性ペプチドは動物および植物を含むさまざまな種由来である。
ＵＳ５，９１２，２３０は、抗真菌性および抗バクテリア性のヒスタチンに基づくペプチドおよび真菌性および細菌感染の処置のための方法を開示している。ペプチドは、天然に存在するヒトヒスタチンのアミノ酸配列の規定の部分に基づいている。
ＵＳ５，７１７，０６４は、メチル化リジンに富む溶菌ペプチドを開示している。溶菌ペプチドは、トリプシン消化耐性および非天然である。溶菌ペプチドはｉｎ ｖｉｖｏ投与に好適である。
ＵＳ５，６４６，０１４は、血リンパ由来抗菌性画分から単離された抗菌性ペプチドを開示している。ペプチドは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）およびセレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）などのいくつかの細菌株に対する抗菌活性を示す。
ＷＯ２００４／０１６６５３は、アズロシジンの２０〜４４配列に基づくペプチドを開示している。このペプチドはジスルフィド架橋によって連結されたループ構造を含有する。
ＵＳ６，４９５，５１６は、殺菌性５５ｋＤａタンパク質殺菌性／浸透性増加タンパク質（ＢＰＩ）に基づくペプチドを開示している。ペプチドは、抗菌効果を発揮し、ＬＰＳ中和能力を有する。
ＷＯ０１／８１５７８は、多数の疾患に対して使用できるＧ共役タンパク質受容体関連ポリペプチドをコードする多数の配列を開示している。
ＷＯ２００４／０６７５６３およびＷＯ２００５／０４０１９２は、ペプチドＬＬ−３７、ヒトカテリシジンの３７Ｃ末端アミノ酸に基づく抗菌性ペプチドを開示している。

【0012】

いくつかのＡＭＰ、ダプトマイシンおよびＤＰＫ−０６０が現在臨床で使用されているか、および／または開発中であり、例えばポリミキシンＢ、ナイシン、ペキシガナン、オミガナン、イセガナンが挙げられる。さらにＯＰ−１４５、内在性ヒトカテリシジン抗菌性ペプチドＬＬ−３７由来の２４アミノ酸ペプチドについては、第２相までの臨床試験が実施された。ＯＰ−１４５は、慢性中耳炎の局所処置のための内毒素中和抗菌性ペプチドとして開発された。現在周知のＡＭＰは、まだいくつかの欠点を有する。タンパク質分解は環境のために有益であるが（残存するＡＭＰがないため）、活発な循環を妨害する。これは、効率的なペプチドクリアランスによっても生じる。同様にＡＭＰの正確な作用機序はほとんどわかっていないことから、それらの真の用途と最大の可能性を予測することは困難である。例えば、ＡＭＰがそれらの効果を誘導するために宿主細胞とどのように相互作用するのかについては不明な点が多い。したがってＡＭＰの臨床的適用における使用は、局所適応に限定されている。

【0013】

緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、フェカリス菌（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）および黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）などの種々の細菌はすべて、カテリシジンＬＬ−３７などのいくつかの抗菌性ペプチドを分解するプロテアーゼを分泌する。したがってプロテアーゼ耐性抗菌性ペプチドは、治療の観点から有利である。加えて多くの抗菌性ペプチドは、微生物、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）および緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）などの微生物を攻撃することにおいてあまり効率的ではなく、問題になる病態形成において鍵となる役割をしばしば演じており、効果の増加を示すために最適化される必要がある。さらに、新たなペプチドを設計する課題の１つは、ＡＭＰの潜在的な溶解能に加えて細菌や哺乳動物の膜に対する他の特性のために、感染患者の細胞膜と比較して細菌または真菌の細胞などの微生物に対する高い特異性、すなわち高い治療指数（最小溶血濃度／最小抗菌活性、ＭＨＣ／ＭＥＣ）を有するＡＭＰを開発することにかかっている。

【0014】

したがって今日、比較的多数の利用可能な抗菌性ペプチドがあるが、微生物、具体的には抗生物質および／または他の抗菌剤に対して耐性または抵抗性である微生物に対抗するために使用できる新たな改善された抗菌性ペプチドの必要性が未だ増加しつつある。さらに重要なことに、ヒトなどの哺乳動物に導入された場合に非アレルゲン性であり、病原性微生物に対して高い特異性を有する新たな抗菌性ペプチドに対する必要性がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0015】

本発明の目的は、従来の抗生物質の欠点を克服し、周知の抗菌性ペプチドを超える改善された特性を有する新規の強力な抗菌性ペプチドを提供することである。バイオフィルム感染における病原性微生物に対して高い活性を発揮する新規ペプチドを提供することはさらなる目的である。

【課題を解決するための手段】

【0016】

本発明者らは、配列ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲを有するポリペプチドＰ１０が、（薬物耐性）グラム陽性（例えば黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ））およびグラム陰性（例えば緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））菌に対して、および真菌、例えばカンジダ アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）およびクロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）に対してｉｎ ｖｉｔｒｏで高度に有効であることを見出した。図２Ａおよび２Ｂに示すとおり、Ｐ１０は、検査したいずれの他のペプチドよりも相当に有効である。加えてＰ１０は、プラスチック表面上に加えて生体（創傷３次元ヒト皮膚モデル）表面上でもメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）バイオフィルム形成を妨害できる。さらにＰ１０は、内毒素リポテイコ酸（ＬＴＡ）、ペプチドグリカン（ＰＧ）およびリポ多糖類（ＬＰＳ）を中和し、それにより炎症誘発性応答を低減する。Ｐ１０は、ヘリックスの一方に極性アミノ酸および反対の側に親油性アミノ酸が位置付けられた両親媒性構造を生じるα−ヘリックスの形をとる。プロリン置換がヘリックスを壊すように導入されたペプチドは不活性であり、ポリペプチドの両親媒性の性質がその生物学的活性のために重要であることを示していた。図２〜５から明らかであるとおりＰ１０は、臨床試験が実施されたＯＰ−１４５（Ｐ６０．４Ａｃ）よりもさらに相当強力であることが見出された。図２Ｂに示し、実施例に詳述するとおり、Ｐ１０は、Ｐ６０．４ＡｃのＩＣ９０（０．７５μＭ）よりもさらに低いＩＣ９９．９（０．５９μＭ）を有する。したがって、Ｐ１０は、０．５９μＭの濃度で細菌１０００個の内９９９個を死滅させるが、一方でＰ６０．４Ａｃは、同様のわずかに高い濃度でも、細菌１０００個の内９００個しか死滅させない。したがって同様の濃度ではＰ１０での処置と比較してＰ６０．４Ａｃでの処置後では１００倍多い細菌が生存する。さらに、細菌、真菌、ウイルスおよび寄生虫を含む多種多様な微生物に対して活性であるように、Ｐ１０は広い活性スペクトルを有する。

【0017】

バイオフィルム感染に対する本発明の抗菌性ペプチドの固有の効果は、以下の３つ：１）バイオフィルム形成を妨害し、存在するバイオフィルムを消失させること、２）放出部位およびその周辺で細菌、真菌または他の微生物を死滅させること、および３）リポテイコ酸（ＬＴＡ）、ペプチドグリカン（ＰＧ）およびリポ多糖類（ＬＰＳ）などの炎症促進性微生物内毒素を中和し、それらの食作用および殺菌活性を増強するためにマクロファージを活性化することによって免疫応答を統合すること、からなる。この免疫制御は、インプラント周辺の組織が病原体についての新規ニッチになることを妨害するために必要である。本発明のポリペプチドは、従来の抗生物質に耐性であるものを含む幅広い微生物に対して活性である。

【0018】

さらにｉ）１つまたはすべてのアミノ酸がそのＤ−アミノ酸によって置き換えられているＰ１０バリアント（表２）、ｉｉ）ペプチドがアセチル、アミド、ＮＨ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_１１−ＣＯ、ヘキサノイル、デカノイル、ミリストイル、プロピノイル、１つまたは２つのアミノ−ヘキサノイル基を含むさまざまな基でＣ末端のＮ末端で伸長されているＰ−１０バリアント、ｉｉｉ）１つのアミノ酸が他のＬ−アミノ酸によって置き換えられているＰ−１０バリアント、およびｉｖ）実施例において実証されたとおりＰ１０のものに匹敵する抗菌活性を有する短いＰ−１０バリアント（表２、３、５および６を参照されたい）が見出された。

【0019】

したがって本発明によるポリペプチドは、バイオフィルム中に存在するか否かにかかわらず、内毒素中和活性、高い選択性すなわち高い抗菌活性、許容可能な低い細胞傷害性および免疫増強活性によって証明されるとおり最適な抗炎症（微生物性化合物の中和）活性を伴って微生物に対する高い抗菌活性を有する。

【0020】

したがって本発明は、アミノ酸配列ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲまたは前記アミノ酸配列のバリアントを含む単離されたまたは組換えポリペプチドであって、
前記ポリペプチドが、抗菌、抗バクテリア、抗ウイルス、抗真菌、駆虫および／または抗炎症活性を有し、
前記バリアントが、少なくとも１６アミノ酸を有し、さらに：
− 次のアミノ酸置換：
・Ｌ、Ｉ、ＶまたはＡの群から選択される１つまたは複数のアミノ酸の前記群から選択される別のアミノ酸による置換、
・Ｒ、ＫまたはＨの群から選択される１つまたは複数のアミノ酸の前記群から選択される別のアミノ酸による置換、
・ＥのＱによる置換
・ＹまたはＷのＦによる置換
・Ｑ、Ｎ、Ａ、ＳまたはＴの群から選択される１つまたは複数のアミノ酸の前記群から選択される別のアミノ酸による置換
の５つまでを有し
− 対応するＤ−アミノ酸によるアミノ酸の１つまたは複数の置換を有し、
− 対応する非天然アミノ酸によるアミノ酸の１つまたは複数の置換を有する、および／または
− 前記アミノ酸配列由来の少なくとも１６個の連続するアミノ酸のレトロインベルソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）配列を有する、
単離されたまたは組換えポリペプチドを提供する。

【0021】

本明細書に定義のアミノ酸配列またはバリアントでは、アミノ酸は一文字表記によって記される。これらの一文字表記および三文字表記は、当業者に十分周知であり、次の意味を有する：Ａ（Ａｌａ）はアラニンであり、Ｃ（Ｃｙｓ）はシステインであり、Ｄ（Ａｓｐ）はアスパラギン酸であり、Ｅ（Ｇｌｕ）はグルタミン酸であり、Ｆ（Ｐｈｅ）はフェニルアラニンであり、Ｇ（Ｇｌｙ）はグリシンであり、Ｈ（Ｈｉｓ）はヒスチジンであり、Ｉ（Ｉｌｅ）はイソロイシンであり、Ｋ（Ｌｙｓ）はリジンであり、Ｌ（Ｌｅｕ）はロイシンであり、Ｍ（Ｍｅｔ）はメチオニンであり、Ｎ（Ａｓｎ）はアスパラギンであり、Ｐ（Ｐｒｏ）はプロリンであり、Ｑ（Ｇｌｎ）はグルタミンであり、Ｒ（Ａｒｇ）はアルギニンであり、Ｓ（Ｓｅｒ）はセリンであり、Ｔ（Ｔｈｒ）はスレオニンであり、Ｖ（Ｖａｌ）はバリンであり、Ｗ（Ｔｒｐ）はトリプトファンであり、Ｙ（Ｔｙｒ）はチロシンである。

【0022】

本発明のポリペプチドは抗菌活性、好ましくは抗バクテリア、抗ウイルスおよび／または抗真菌活性、より好ましくは抗バクテリアおよび／または抗真菌活性を有する。さらに本発明のポリペプチドは、好ましくは抗菌および抗炎症活性の両方を有する。本明細書において使用される用語ポリペプチドの「抗菌活性」は、少なくとも１つの微生物、例えばバクテリア、ウイルスおよび／または真菌の成長または増殖を妨げることを指し、成長または増殖の抑制、低減または妨害および微生物を死滅させることを含む。微生物は、微細な、すなわち通常ヒト裸眼で見るためには小さすぎる生物である。微生物は非常に多様であり、細菌、ウイルス、真菌、古細菌、原虫および微細藻類を含む。同様に本明細書において使用される用語「抗バクテリア活性」、「抗ウイルス活性」、「抗真菌活性」および「駆虫活性」は、それぞれバクテリア、ウイルス、真菌および寄生虫の成長または増殖を妨げることを指し、一般に成長または増殖の抑制、低減または妨害およびそれらを死滅させることを含む。抗菌、抗バクテリア、抗ウイルス、抗真菌および駆虫活性は、当技術分野において周知の方法によって測定できる。

【0023】

そのような方法の１つは、本出願の実施例において詳述されており、ｉｎ ｖｉｔｒｏ死滅アッセイを含む。この方法では微生物、例えば細菌または真菌は、さまざまな濃度の本発明によるポリペプチドと共に例えば１〜２時間インキュベートされ、その後微生物−ポリペプチド混合物は、ポリペプチドとインキュベートされておらず、同じ方法でさらに処理された微生物の試料と比較した生存しているおよび／または死滅された微生物の数を確立するために好適な培養培地中または上でインキュベートされた。

【0024】

ウイルスプラークアッセイは、本発明のポリペプチドの抗ウイルス活性を評価するために使用できる。簡潔にはウイルス接種物は、許容状態の細胞単層の感染の前にポリペプチドに曝露される。標準的時間間隔後に細胞抽出物中のウイルス力価は、これらの抽出物の複数回希釈を使用し、新鮮細胞単層に感染させ、細胞単層へのそれらの効果を定量することによって決定される。

【0025】

駆虫活性の評価のために、本発明のポリペプチドおよび寄生虫は、標準的時間間隔でインキュベートされる。その後、寄生虫の代謝活性を例えばＭＴＴアッセイによって直接分析してもよいし、または寄生虫を哺乳動物細胞に移して、インキュベーション後にこれらの細胞における寄生虫の繁殖を顕微鏡によって評価する。

【0026】

本明細書において使用されるポリペプチドの「抗炎症活性」という用語は、微生物、例えば細菌、ウイルス、真菌および／または寄生虫に感染した対象における炎症性応答を抑制、低減または妨害することを指す。本発明のポリペプチドの抗炎症活性は、リポテイコ酸（ＬＴＡ）、ペプチドグリカン（ＰＧ）および／またはリポ多糖類（ＬＰＳ）などの炎症促進性微生物化合物の放出を抑制、低減または妨害することによって達成される。抗炎症活性は、当技術分野において周知の方法によって測定できる。そのような方法の一例は、リポ多糖類中和アッセイである。この方法では本発明のポリペプチドは、リポ多糖類１ｍｇと混合され、６０分間インキュベートされる。その後これらの混合物は、４回希釈新鮮ヒト血液に加えられ、その１８時間後にＥＬＩＳＡによって血液試料中のサイトカイン（１Ｌ−８、１Ｌ−１２ｐ４０）のレベルが測定される。

【0027】

本明細書において使用されるアミノ酸配列ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲのバリアントは、少なくとも１６アミノ酸の長さを有し、好ましくは次のアミノ酸置換：
− Ｌ、Ｉ、ＶまたはＡの群から選択される１つまたは複数のアミノ酸の前記群から選択される別のアミノ酸による置換、
− Ｒ、ＫまたはＨの群から選択される１つまたは複数のアミノ酸の前記群から選択される別のアミノ酸による置換、
− ＥのＱによる置換
− ＹまたはＷのＦによる置換
− Ｑ、Ｎ、Ａ、ＳまたはＴの群から選択される１つまたは複数のアミノ酸の前記群から選択される別のアミノ酸による置換、
− １つまたは複数のアミノ酸の対応するＤ−アミノ酸による置換、
− １つまたは複数のアミノ酸の対応する非天然アミノ酸による置換
の５つまでを有する。前記バリアントは、Ｌ−アミノ酸の前記置換の１、２、３、４または５つの別のＬ−アミノ酸による、および／またはＬ−アミノ酸のその対応するＤ−アミノ酸による置換を有する場合がある。代替的に、前記バリアントの少なくとも１６個すべてのＬ−アミノ酸はその対応するＤ−アミノ酸によって置換される。

【0028】

好ましくは、前記バリアントは、次のアミノ酸置換：
− アミノ酸位置１のＬのＩ、ＶまたはＡによる置換
− アミノ酸位置２のＡのＬ、Ｖ、ＱまたはＩによる置換
− アミノ酸位置３のＲのＫまたはＨによる置換
− アミノ酸位置４のＥのＱによる置換
− アミノ酸位置５のＹのＦまたはＷによる置換
− アミノ酸位置６のＫのＲまたはＨによる置換
− アミノ酸位置７のＫのＲまたはＨによる置換
− アミノ酸位置８のＩのＬ、ＶまたはＡによる置換
− アミノ酸位置９のＶのＬ、ＩまたはＡによる置換
− アミノ酸位置１０のＥのＱによる置換
− アミノ酸位置１１のＫのＲまたはＨによる置換
− アミノ酸位置１２のＬのＩ、ＶまたはＡによる置換
− アミノ酸位置１３のＫのＲまたはＨによる置換
− アミノ酸位置１４のＲのＫまたはＨによる置換
− アミノ酸位置１５のＷのＦまたはＹによる置換
− アミノ酸位置１７のＲのＨまたはＫによる置換
− アミノ酸位置１８のＱのＮ、Ａ、ＳまたはＴによる置換
− アミノ酸位置１９のＶのＬ、ＩまたはＡによる置換
− アミノ酸位置２０のＬのＩ、ＶまたはＡによる置換
− アミノ酸位置２１のＲのＫまたはＨによる置換
− アミノ酸位置２２のＴのＱ、ＮまたはＡによる置換
− アミノ酸位置２４のＲのＨまたはＫによる置換
− アミノ酸１から５の対応するＤ−アミノ酸による置換
のうち５つまでを有する。本明細書においてアミノ酸の番号付けは以下のとおりである：Ｌ_１Ａ_２Ｒ_３Ｅ_４Ｙ_５Ｋ_６Ｋ_７Ｉ_８Ｖ_９Ｅ_１０Ｋ_１１Ｌ_１２Ｋ_１３Ｒ_１４Ｗ_１５Ｌ_１６Ｒ_１７Ｑ_１８Ｖ_１９Ｌ_２０Ｒ_２１Ｔ_２２Ｌ_２３Ｒ_２４。

【0029】

好ましくは本明細書に定義のバリアントは、前記置換の１、２、３、４または５つなどの４つまでの前記アミノ酸置換、より好ましくは３つまでの前記アミノ酸置換を有する。さらに本明細書に定義のバリアントは、前記アミノ酸置換の５つまで、より好ましくは４つまで、最も好ましくは３つまでを有するアミノ酸配列ＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬを少なくとも好ましくは含む。

【0030】

前記バリアントにおけるＬアミノ酸の別のＬアミノ酸による５つまでのアミノ酸置換は、好ましくは次のとおりである：
− アミノ酸位置１のＬのＩ、ＶまたはＡによる置換
− アミノ酸位置２のＡのＬ、ＶまたはＱによる置換
− アミノ酸位置３のＲのＫまたはＨによる置換
− アミノ酸位置４のＥのＱによる置換
− アミノ酸位置５のＹのＦによる置換
− アミノ酸位置６のＫのＲまたはＨによる置換
− アミノ酸位置７のＫのＲまたはＨによる置換
− アミノ酸位置１１のＫのＲまたはＨによる置換
− アミノ酸位置１２のＬのＩ、ＶまたはＡによる置換
− アミノ酸位置１３のＫのＨによる置換
− アミノ酸位置１４のＲのＫまたはＨによる置換
− アミノ酸位置１５のＷのＦによる置換
− アミノ酸位置１７のＲのＨによる置換
− アミノ酸位置１８のＱのＮ、Ａ、ＳまたはＴによる置換
− アミノ酸位置１９のＶのＬによる置換
− アミノ酸位置２０のＬのＩ、ＶまたはＡによる置換
− アミノ酸位置２１のＲのＫまたはＨによる置換
− アミノ酸位置２２のＴのＱ、ＮまたはＡによる置換
− アミノ酸位置２４のＲのＨによる置換

【0031】

別の好ましい実施形態では本発明によるポリペプチドは、
ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲ
ＩＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲ
ＶＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲ
ＡＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲ
ＬＬＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲ
ＬＶＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲ
ＬＱＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲ
ＬＡＫＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲ
ＬＡＨＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲ
ＬＡＲＱＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲ
ＬＡＲＥＦＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲ
ＬＡＲＥＹＲＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲ
ＬＡＲＥＹＨＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲ
ＬＡＲＥＹＫＲＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲ
ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＫＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲ
ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＦＬＲＱＶＬＲＴＬＲ
ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＨＱＶＬＲＴＬＲ
ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＮＶＬＲＴＬＲ
ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＡＶＬＲＴＬＲ
ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＳＶＬＲＴＬＲ
ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＴＶＬＲＴＬＲ
ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＬＬＲＴＬＲ
ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＩＲＴＬＲ
ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＶＲＴＬＲ
ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＡＲＴＬＲ
ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＫＴＬＲ
ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＨＴＬＲ
ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＱＬＲ
ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＮＬＲ
ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＡＬＲ
ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＨ
ＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲ
ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴ
ＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴ
ＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲ
ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬ
ＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲ
ＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬ，
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、任意選択でＮ末端および／またはＣ末端修飾を有し、好ましくはＮおよび／またはＣ末端伸長基を含み、前記Ｎ末端修飾は、好ましくはアセチル−、ヘキサノイル−、デカノイル−、ミリストイル−、ＮＨ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_１１−ＣＯ−およびプロピノイル残基からなる群から選択され、前記Ｃ末端修飾は好ましくはアミド−、ＮＨ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_１１−ＣＯ−アミド−および１つまたは２つのアミノ−ヘキサノイル基からなる群から選択される。一実施形態では本発明によるポリペプチドは、前記アミノ酸配列の１つからなる。

【0032】

上述した別のアミノ酸によるアミノ酸の５つまでの置換の代わりに、またはそれに加えて、本明細書で定義されたアミノ酸配列ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲのバリアントは、１つまたは複数のＬ−アミノ酸のその対応するＤ−アミノ酸による置換を含有していてもよい。アラニンに対するＡなどの大文字一文字表記によって本明細書で示されるアミノ酸は、天然に存在するタンパク質中に一般に見出されるこれらのＬ−アミノ酸である。実施例（表２）において実証するとおり、Ｌ−アミノ酸がその対応するＤ−アミノ酸で置換されたポリペプチドは、それらの抗菌活性を保持している。したがって本明細書で定義されたアミノ酸配列ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲのバリアントは、１つまたは複数のアミノ酸の対応するＤ−アミノ酸による置換を含有していてもよい。本明細書において使用される「対応するＤ−アミノ酸」は、Ｌ−アミノ酸のＤ−アミノ酸対応物として定義される。例えばアラニン（Ａ）の対応するＤ−アミノ酸はＤ−アラニン（ａ）であり、アルギニン（Ｒ）の対応するＤ−アミノ酸はＤ−アルギニン（ｒ）であり、アスパラギン（Ｎ）の対応するＤ−アミノ酸はＤ−アスパラギン（ｎ）などである。本明細書で定義されたバリアントのすべてのＬ−アミノ酸が、それらの対応するＤ−アミノ酸によって置換されていてもよい。本明細書で定義されたアミノ酸配列ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲのバリアントは、Ｌ−アミノ酸のその対応するＤ−アミノ酸による２４個までの置換を含有していてもよい。そのようなアミノ酸バリアントを含むポリペプチドにおいて抗菌活性が保持されることから、バリアントは、完全にＤ−アミノ酸からなるものでもよい。例えばバリアントは、Ｌ−アミノ酸２４個、２３個、２２個、２１個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個のその対応するＤ−アミノ酸による置換を含有していてもよい。一実施形態では本明細書で定義されたアミノ酸配列ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲのバリアントは、その対応するＤ−アミノ酸によるアミノ酸の１つの置換を含有する。アミノ酸配列中のＤ−アミノ酸の位置は重要ではない。表２に示すとおり、１つのアミノ酸がＤ−アミノ酸によって置換されている配列ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲを有するすべてのポリペプチドにおいて抗菌活性は保持されている。別の実施形態ではバリアントは、すべてのＬ−アミノ酸のそれらの対応するＤ−アミノ酸による置換を含有する。同様に実施例（表２）において示すとおり、Ｄ−アミノ酸だけを含有しているバリアントである配列ｌａｒｅｙｋｋｉｖｅｋｌｋｒｗｌｒｑｖｌｒｔｌｒ（ペプチド番号１３１３−０７）を含むポリペプチドは、抗菌活性を持っている。本明細書で定義されたバリアントは、アミノ酸配列ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲの少なくとも１６個の連続するアミノ酸のレトロインベルソペプチドをさらに含有する場合がある。好ましくは、前記バリアントは、前記アミノ酸配列の全長のレトロインベルソペプチドである。レトロインベルソペプチドは、参照アミノ酸配列の逆向き配列にあるＤ−アミノ酸からなるペプチドである。それにより本発明の好ましいバリアントは、Ｄ−アミノ酸配列ｒｌｔｒｌｖｑｒｌｗｒｋｌｋｅｖｉｋｋｙｅｒａｌの少なくとも１６アミノ酸を有する場合がある。表２に示すとおり、アミノ酸配列ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲのレトロインベルソ配列を含有するバリアントである配列ｌａｒｅｙｋｋｉｖｅｋｌｋｒｗｌｒｑｖｌｒｔｌｒ（ペプチド番号１２４１−０３）を含むポリペプチドは、抗菌活性を持っている。

【0033】

本明細書で定義されたアミノ酸配列ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲのバリアントは、アミノ酸の非天然アミノ酸による５つまでの置換を含有する場合がある。本明細書において使用される「非天然アミノ酸」は、それらが天然にあるかどうかに関わらず遺伝的にコードされていないアミノ酸を指す。本明細書で定義されたアミノ酸配列のバリアントにおいて存在できる非天然アミノ酸は：β−アミノ酸、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、ベーターアラニン、４−ｔｅｒｔ−ブチル水素２−アジドサクシネート、ベータ−アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、２，４，−ジアミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、ｐ−アミノフェニルアラニン、２，３−ジアミノ酪酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、２，２’−ジアミノピメリン酸、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、Ｄ−アリルグリシン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｔ−ブチルアラニン、ｔ−ブチルグリシン、４−クロロフェニルアラニン、シクロヘキシルアラニン、システイン酸、Ｄ−シトルリン、チオ−Ｌ−シトルリン、デスモシン、イプシロン−アミノヘキサン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアルパラギン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、ホモアルギニン、ホモシステイン、ホモセリン、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、３−（３−メチル−４−ニトロベンジル）−Ｌ−ヒスチジンメチルエステル、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、６−Ｎ−メチルリジン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｎ−メチルバリン、メチオニンスルホキシド、２−ナフチルアラニン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、イソセリン、３−フェニルセリン、ノルバリン、ノルロイシン、５，５，５−トリフルオロ−ＤＬ−ロイシン、オルニチン、３−クロロ−チロシン、Ｎ５−カルバモイルオルニチン、ペニシラミン、フェニルグリシン、ピペリジン酸、ピリジルアラニン、１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−３−カルボキシル酸、ベータ−２−チエニルアラニン、γ−カルボキシ−ＤＬ−グルタミン酸、４−フルオロ−ＤＬ−グルタミン酸、Ｄ−チロキシン、アロ−スレオニン、５−ヒドロキシ−トリプトファン、５−メトキシ−トリプトファン、５−フルオロ−トリプトファン、３−フルオロ−バリンを含む。

【0034】

一実施形態では前記配列の天然アミノ酸は、対応する非天然アミノ酸によって置換される。本明細書において使用される「対応する非天然アミノ酸」は、参照天然アミノ酸の誘導体である非天然アミノ酸を指す。例えば天然アミノ酸は、対応するβ−アミノ酸によって置換される。β−アミノ酸は、天然アミノ酸におけるα炭素ではなくβ炭素に結合したアミノ基を有する。例えばα−アラニンは、β−アラニンによって置換されるなど。天然アミノ酸の前記天然アミノ酸の誘導体である非天然アミノ酸による置換の他の例は、次のとおり。アラニンは、例えばベータ−アラニン、ｔ−ブチルアラニン、２−ナフチルアラニン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、２−アミノイソ酪酸によって置換される。アルギニンは、例えばホモアルギニン、オルニチン、Ｎ５−カルバモイルオルニチン、３−アミノプロピオン酸によって置換される。アスパラギンは、例えばＮ−エチルアスパラギンによって置換される。アスパラギン酸は、例えば４−ｔｅｒｔ−ブチル水素２−アジドサクシネートによって置換される。システインは、例えばシステイン酸、ホモシステインによって置換される。グルタミン酸は、例えばγ−カルボキシ−ＤＬ−グルタミン酸、４−フルオロ−ＤＬ−グルタミン酸によって置換される。グルタミンは、例えばＤ−シトルリン、チオ−Ｌ−シトルリンによって置換される。グリシンは、例えばＮ−メチルグリシン、ｔ−ブチルグリシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｄ−アリルグリシンによって置換される。ヒスチジンは、例えば３−（３−メチル−４−ニトロベンジル）−Ｌ−ヒスチジンメチルエステルによって置換される。イソロイシンは、例えばイソデスモシン、Ｎ−メチルイソロイシン、アロ−イソロイシンによって置換される。ロイシンは、例えばノルロイシン、デスモシン、５，５，５−トリフルオロ−ロイシンによって置換される。リジンは、例えば６−Ｎ−メチルリジン、２−アミノヘプタン酸、Ｎ−アセチルリジン、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジンによって置換される。メチオニンは、例えばメチオニンスルホキシドによって置換される。フェニルアラニンは、例えばｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニンによって置換される。プロリンは、例えば３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、１−アセチル−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンによって置換される。セリンは、例えばホモセリン、イソセリン、３−フェニルセリンによって置換される。スレオニンは、例えばＤ−チロキシン、アロ−スレオニンによって置換される。トリプトファンは、例えば５−ヒドロキシ−トリプトファン、５−メトキシ−トリプトファン、５−フルオロ−トリプトファンによって置換される。チロシンは、例えばＯ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、３−クロロ−チロシンによって置換される。バリンは、例えばノルバリン、Ｎ−メチルバリン、３−フルオロ−バリンによって置換される。

【0035】

本発明による特に好ましいポリペプチドは、アミノ酸配列ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲまたは表２、３、５または６から選択される、最大でＰＢＳ中３．２μＭの致死性濃度（ＬＣ）９９．９を有するそのバリアントを含む。一実施形態では表２、３、５または６から選択される、最大で２．４μＭのＰＢＳ中ＬＣ９９．９を有するポリペプチドが提供される。

【0036】

本発明によるポリペプチドは、アミノ酸配列ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲまたは本明細書で定義されたこの配列のバリアントからなる場合がある。本明細書において使用される「ポリペプチド」は、複数のアミノ酸を含むペプチド、ポリペプチドおよびペプチド模倣物を指す。用語「ポリペプチド」および「ペプチド」は、互換的に用いられる。抗菌活性を有することが実証された本発明による最も小さなポリペプチドは、１６アミノ酸の長さを有する。しかしアミノ酸配列またはそのバリアントは、大きなポリペプチド、すなわち１つまたは複数の追加のアミノ酸によってＮ末端および／またはＣ末端で伸長されたポリペプチドの一部であってよい。本発明のポリペプチドのアミノ酸配列またはそのバリアントは、好ましくはＮおよび／またはＣ末端伸長基を含むことによってＮ末端および／またはＣ末端で修飾されてよい。代替的に前記アミノ酸配列またはそのバリアントは、Ｎおよび／またはＣ末端で伸長されている。本発明によるポリペプチドは、したがって少なくとも１６アミノ酸を含み、１０００アミノ酸までを含む場合がある。しかし小さなポリペプチドは、産生費用をできるだけ低く保つために好ましい。好ましくは本発明によるポリペプチドは、長さ１６〜２００アミノ酸、より好ましくは１６〜１００アミノ酸、より好ましくは１６〜５０アミノ酸である。一実施形態では本発明によるポリペプチドは、１６から２４アミノ酸、すなわち１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４アミノ酸を含む。前記ポリペプチドは、好ましくは１６〜２４アミノ酸を有する。そのような１６〜２４アミノ酸を有するポリペプチドは、アセチル−、ヘキサノイル−、デカノイル−、ミリストイル−、ＮＨ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_１１−ＣＯ−およびプロピオニル残基からなる群から選択されるＮ末端修飾などおよび／またはアミド−、ＮＨ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_１１−ＣＯ−アミド−および１つまたは２つのアミノ−ヘキサノイル基からなる群から選択されるＣ末端修飾などのＮ末端および／またはＣ末端修飾をさらに有する場合があり、さまざまな長さのポリペプチドの例およびそれらの抗菌活性は、実施例において提供されている。一実施形態では本発明のポリペプチドは、アミノ酸配列ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲまたは本明細書で定義されたそのバリアントからなり、任意選択でＮ末端および／またはＣ末端修飾を有し、好ましくはＮおよび／またはＣ末端伸長基を含む。

【0037】

本明細書において使用される「ペプチド模倣物」は、本発明のポリペプチドの抗菌、抗バクテリア、抗ウイルス、抗真菌、駆虫および／または抗炎症特性を模倣する非ペプチド構造要素を含有する化合物を指す。それにより本発明のポリペプチドは、非ペプチド構造要素を含む場合がある。そのような非ペプチド構造要素は、前記配列またはバリアントの１つまたは複数のアミノ酸の修飾の置換の結果として、アミノ酸配列ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲまたは本明細書で定義されたそのバリアントに存在する場合がある。代替的に本発明のポリペプチドは、アミノ酸配列ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲまたは本明細書で定義されたそのバリアントの外に非ペプチド構造要素、すなわち任意選択のＮおよび／またはＣ末端伸長基を含む場合がある。ペプチド模倣物中の非ペプチド構造要素は、典型的には１つまたは複数の既存のアミノ酸の修飾である。好ましいペプチド模倣物は、例えば本明細書上に定義されるような非天然アミノ酸、コンホメーションの制限、ポリペプチドの環化、等比体積（ｉｓｏｓｔｅｒｉｃ）置換または他の修飾を使用して、本発明のポリペプチドの構造的修飾によって得られる。本発明によるポリペプチドのアミノ酸配列は、したがって任意選択で１つまたは複数の修飾を含む。そのようなポリペプチドは、翻訳後プロセシングなどの天然のプロセスによってまたは化学的修飾技術によって修飾されてよい。修飾は、ポリペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびＮまたはＣ末端を含む前記ポリペプチド中の任意の位置に挿入されてよい。単一のポリペプチドが複数の種類の修飾または単一の種類の複数の修飾を含有する場合がある。修飾は、アセチル化、アミド化、アシル化、リン酸化、メチル化、脱メチル化、ＡＤＰ−リボシル化、ジスルフィド結合形成、ユビキチン化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、酸化、ペグ化および硫酸化を含む。加えて本発明によるポリペプチドは、ビオチン、フルオレセインまたはフラビン、脂質または脂質誘導体、糖類などの標識を有して提供されてよい。本発明によるポリペプチドは、標的化成分を有してさらに提供されてよい。

【0038】

好ましい実施形態では前記アミノ酸配列ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲまたは本明細書で定義された前記そのバリアント、本発明によるポリペプチドは、Ｎ末端および／またはＣ末端で修飾されている。したがって本発明のポリペプチドは、好ましくはＮおよび／またはＣ末端伸長基を含む。本発明のポリペプチドにおいて使用できるＮおよびＣ末端伸長基は、当技術分野において十分周知である。Ｎ末端修飾の好ましい例は、アセチル、ヘキサノイル、デカノイル、ミリストイル、ＮＨ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_１１−ＣＯ−およびプロピオニル残基である。Ｃ末端修飾の好ましい例は、アミド、ＮＨ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_１１−ＣＯ−アミドおよび１つまたは２つのアミノヘキサノイル基である。しかし他のＮまたはＣ末端伸長基も当業者に周知の活性化合物を生じる。一実施形態では前記アミノ酸配列ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲまたは本明細書で定義されたそのバリアントは、Ｎ末端アセチル−、ヘキサノイル−、デカノイル−、ミリストイル−、ＮＨ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_１１−ＣＯ−またはプロピオニル残基およびＣ末端アミド−、ＮＨ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_１１−ＣＯ−アミド−および１つまたは２つのアミノ−ヘキサノイル基を含む。実施例（表３）において実証するとおりそのようなＮ末端またはＣ末端修飾を有するポリペプチドは、高い抗菌活性を保持している。一実施形態では本発明によるポリペプチドは、Ｎ末端がアセチル化され、Ｃ末端がアミド化されて提供される。

【0039】

したがって本発明はアミノ酸配列ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲ、または前記アミノ酸配列のバリアントを含む単離されたまたは組換えポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、抗菌、抗バクテリア、抗ウイルス、抗真菌、駆虫および／または抗炎症活性を有し、前記バリアントが、少なくとも１６アミノ酸を有し、さらに次のアミノ酸置換：
− アミノ酸位置１のＬのＩ、ＶまたはＡによる置換
− アミノ酸位置２のＡのＬ、Ｖ、ＱまたはＩによる置換
− アミノ酸位置３のＲのＫまたはＨによる置換
− アミノ酸位置４のＥのＱによる置換
− アミノ酸位置５のＹのＦまたはＷによる置換
− アミノ酸位置６のＫのＲまたはＨによる置換
− アミノ酸位置７のＫのＲまたはＨによる置換
− アミノ酸位置８のＩのＬ、ＶまたはＡによる置換
− アミノ酸位置９のＶのＬ、ＩまたはＡによる置換
− アミノ酸位置１０のＥのＱによる置換
− アミノ酸位置１１のＫのＲまたはＨによる置換
− アミノ酸位置１２のＬのＩ、ＶまたはＡによる置換
− アミノ酸位置１３のＫのＲまたはＨによる置換
− アミノ酸位置１４のＲのＫまたはＨによる置換
− アミノ酸位置１５のＷのＦまたはＹによる置換
− アミノ酸位置１７のＲのＨまたはＫによる置換
− アミノ酸位置１８のＱのＮ、Ａ、ＳまたはＴによる置換
− アミノ酸位置１９のＶのＬ、ＩまたはＡによる置換
− アミノ酸位置２０のＬのＩ、ＶまたはＡによる置換
− アミノ酸位置２１のＲのＫまたはＨによる置換
− アミノ酸位置２２のＴのＱ、ＮまたはＡによる置換
− アミノ酸位置２４のＲのＨまたはＫによる置換
− アミノ酸１から４の対応するＤ−アミノ酸による置換、
の５つまで、好ましくは３つまで、より好ましくは１つまでを有し、
前記アミノ酸配列または前記そのバリアントは、Ｎおよび／またはＣ末端伸長基を含み、好ましくはＮ末端アセチル−、ヘキサノイル−、デカノイル−、ミリストイル−、ＮＨ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_１１−ＣＯ−またはプロピオニル残基およびＣ末端アミド−、ＮＨ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_１１−ＣＯ−アミド−および１つまたは２つのアミノ−ヘキサノイル基を含む、単離されたまたは組換えポリペプチドを提供する。他のＮまたはＣ末端伸長基も活性化合物を生じることは当業者に明らかである。本明細書においてアミノ酸の番号付けは次のとおりである：Ｌ_１Ａ_２Ｒ_３Ｅ_４Ｙ_５Ｋ_６Ｋ_７Ｉ_８Ｖ_９Ｅ_１０Ｋ_１１Ｌ_１２Ｋ_１３Ｒ_１４Ｗ_１５Ｌ_１６Ｒ_１７Ｑ_１８Ｖ_１９Ｌ_２０Ｒ_２１Ｔ_２２Ｌ_２３Ｒ_２４。前記ポリペプチドは、好ましくは１６〜２４アミノ酸を有する。

【0040】

好ましい実施形態では本発明によるポリペプチドは、疎水性成分を含む。カチオン性（ポリ）ペプチドへの疎水性基の付加は、微生物内毒素を中和するおよび微生物膜と相互作用するそれらの能力を改善し、それにより微生物、例えば病原体を排除するそれらの能力を改善する。

【0041】

本明細書で上述したとおり、本発明によるポリペプチドは、当技術分野において周知の化学的修飾技術によって修飾されてよい。本発明によるポリペプチドの修飾は、ポリペプチドの合成の際または終了時に導入できる。例えばポリペプチドが固相合成技術を使用して合成される場合、Ｎ末端アセチル化は、樹脂に結合したままのアミノ酸配列を酢酸と反応させることによって終了時に実施できる。別の例として、Ｃ末端アミド化は、例えば固相ペプチド合成での特別な種類の樹脂、商業的に入手できるＴｅｎｔａｇｅｌ Ｓ ＡＭ（例えばＲａｐｐ、Ｔｕｂｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）などを使用して実施される。これらの樹脂は、アミド化（ポリ）ペプチドが切断の際に放出される化学的手段を含む。ポリペプチドを修飾するこれらおよび他の方法は、当業者に周知である。

【0042】

一実施形態では本発明は、アミノ酸配列ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲまたは前記アミノ酸配列のバリアントを含む単離されたまたは組換えポリペプチドであって、
前記ポリペプチドが、抗菌、抗バクテリア、抗ウイルス、抗真菌、駆虫および／または抗炎症活性を有し、
前記バリアントが、少なくとも１６アミノ酸を有し、さらに：
− 次のアミノ酸置換：
・Ｌ、Ｉ、ＶまたはＡの群から選択される１つまたは複数のアミノ酸の前記群から選択される別のアミノ酸による置換、
・Ｒ、ＫまたはＨの群から選択される１つまたは複数のアミノ酸の前記群から選択される別のアミノ酸による置換、
・ＥのＱによる置換
・ＹまたはＷのＦによる置換
・Ｑ、Ｎ、Ａ、ＳまたはＴの群から選択される１つまたは複数のアミノ酸の前記群から選択される別のアミノ酸による置換、
の５つまでを有し、および／または
− 対応するＤ−アミノ酸によるアミノ酸の１つまたは複数の置換を有する、
単離されたまたは組換えポリペプチドを提供する。

【0043】

本発明は、アミノ酸配列ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲまたは本明細書で定義されたそのバリアントを含む６つまでのポリペプチドを含む多量体をさらに提供する。前記多量体は、同じアミノ酸配列を有する６つまでのポリペプチドモノマー、またはそのため２つ以上ポリペプチドモノマーが異なるアミノ酸配列を有する６つまでのポリペプチドモノマーを含む場合がある。好ましい実施形態では本発明による多量体は、同じアミノ酸配列を有する６つまでの本発明によるポリペプチドを含む。

【0044】

本発明によるポリペプチドの塩も提供される。そのような塩は、これだけに限らないが、酸付加塩および塩基付加塩を含む。本明細書において使用されるポリペプチドの「薬学的に許容される塩」は、ポリペプチドの所望の抗菌、抗バクテリア、抗真菌、抗ウイルス、駆虫および／または抗炎症活性を保持しており、ヒトまたは動物への投与のために好適である塩を指す。ポリペプチドの塩の調製のための方法は、当技術分野において周知であり、一般に塩が不溶性である溶媒または培地中において、または真空でまたは凍結乾燥によって次に除去される水などの溶媒において例えば産生物の遊離酸または遊離塩基形態を適切な酸または塩基の１つまたは複数の等価物と反応させることによって、または好適なイオン交換樹脂で存在する塩のカチオンを別のカチオンに交換することによって、ポリペプチドを薬学的に許容される酸または塩基と混合することを含む。薬学的に許容される酸および塩基の例は、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、グリコール酸、シュウ酸、ピルビン酸、コハク酸、マレイン酸、マロン酸、トリフルオロ酢酸、ケイ皮酸、硫酸、塩酸、臭化水素酸、硝酸、過塩素酸、リン酸およびポリペプチドの遊離アミノ基とアンモニウム塩を形成するチオシアン酸などの有機および無機酸、およびエチルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン、トリエチルアミン、イソプロピルアミン、ジイソプロピルアミン、および他のモノ−、ジ−およびトリアルキルアミンおよびアリールアミンなどのポリペプチドの遊離カルボキシル基とカルボキシレートを形成する塩基を含む。

【0045】

本発明によるポリペプチドは、種々の方法によって調製できる。例えばポリペプチドは、一般に使用される固相合成方法、例えば当技術分野において十分周知であるアルファアミノ基のｔ−ＢＯＣまたはＦＭＯＣ保護を含む方法によって合成されてよい。ここでアミノ酸は、アミノ酸の伸長している鎖に逐次的に付加される。そのような方法は、例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９〜２１５６およびＡｔｈｅｒｔｏｎら、「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ（１９８９）に記載されている。固相合成方法は、ポリペプチドの合成または比較的短い長さ、約７０アミノ酸までの長さを有するポリペプチドなどの大規模産生のために特に好適である。

【0046】

代替的に本発明のポリペプチドは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が宿主細胞において発現される当技術分野において十分周知の組換え技術を使用して調製できる。したがって本発明は：
− 本発明によるポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子を提供するステップ、
− 前記核酸分子で宿主細胞を形質転換するステップ、
− 前記ポリペプチドの発現を可能にする条件下で前記宿主細胞を培養するステップ、
− 前記細胞から前記ポリペプチドを回収するステップ、
− 任意選択で前記ポリペプチドを、例えばＮおよび／またはＣ末端伸長基を付加することによって、Ｎ末端またはＣ末端で修飾するステップ
を含む本発明によるポリペプチドの調製のための方法を提供する。

【0047】

本発明は、本明細書において本発明による核酸分子とも称される、本発明によるポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子をさらに提供する。本明細書において使用される本発明の核酸分子または核酸配列は、ヌクレオチド、好ましくはＤＮＡおよび／またはＲＮＡの鎖を含む。

【0048】

さらに、本発明による核酸配列分子を含むベクターが提供される。本明細書において使用される用語「ベクター」は、異種性核酸配列を宿主細胞に導入できるプラスミド、バクテリオファージまたは動物ウイルスなどの核酸分子を指す。本発明によるベクターは、宿主細胞において異種性核酸配列によってコードされた本発明のポリペプチドの発現または産生を可能にする。本発明により使用されるベクターは、例えば動物ウイルス由来であり、その例はこれだけに限らないが、ワクチニアウイルス（改変ワクチニアウイルスＡｎｋａｒａ、ＭＶＡなどの弱毒化誘導体を含む）、ニューカッスル疾患ウイルス（ＮＤＶ）、アデノウイルスまたはレトロウイルスを含む。本発明によるベクターは、選択された宿主細胞において本発明によるポリペプチドの転写の開始のために好適であるプロモーターを含む発現カセットを好ましくは含む。真核宿主細胞における本発明によるポリペプチドの発現のための好適なプロモーターの例は、これだけに限らないが、哺乳動物宿主のためのベータアクチンプロモーター、イムノグロビンプロモーター、５Ｓ ＲＮＡプロモーターまたは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）およびサルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターなどのウイルス由来プロモーターを含む。

【0049】

さらに本発明は、本発明による核酸分子および／またはベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。宿主細胞は、本発明によるベクターなどの核酸分子によって形質転換されているまたは形質転換できる細胞である。「形質転換」は、外来核酸のレシピエント細胞への導入を指す。宿主細胞の形質転換は、前記細胞による組換えタンパク質の一過性発現を生じることができ、組換えタンパク質が規定の期間についてだけ発現されることを意味する。代替的にレシピエント細胞の形質転換は、安定な発現を生じることができ、核酸が細胞のゲノムに導入され、それにより細胞の次世代に伝えられることを意味する。追加に、組換えタンパク質の誘導性発現は、達成できる。誘導性発現系は、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列の発現を可能にする分子の存在または不在を必要とする。誘導性発現系の例は、これだけに限らないが、Ｔｅｔ−ＯｎおよびＴｅｔ−Ｏｆｆ発現系、例えばエクジソン誘導性遺伝子発現系、アラビノース誘導性遺伝子発現系などのホルモン誘導性遺伝子発現系、および誘導性メタロチオネインプロモーターを含むｐＭＴ／ＢｉＰベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用するショウジョウバエ誘導性発現系を含む。本発明によるポリペプチドの調製のための方法において使用される宿主細胞は、例えばグラム陽性原核生物、グラム陰性原核生物または真核生物である。好ましくは、前記宿主細胞は、植物細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞または昆虫細胞などの真核細胞であり、最も好ましくは昆虫細胞または哺乳動物細胞である。好適な宿主細胞の例は、コーン細胞、イネ細胞、ウキクサ（ｄｕｃｋｗｅｅｄ）細胞、タバコ細胞（ＢＹ−２またはＮＴ−１細胞など）およびジャガイモ細胞などの植物細胞を含む。酵母細胞の例は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびピキア（Ｐｉｃｈｉａ）である。昆虫細胞の例は、Ｔｎ５、ＳＦ−９およびＳＦ−２１細胞などのヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ２（Ｓ２）細胞などのショウジョウバエ細胞である。本発明によるポリペプチドを発現するために好適である哺乳動物細胞の例は、これだけに限らないが、アフリカミドリザル腎臓（Ｖｅｒｏ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ−２１など）細胞、ヒト網膜細胞（例えばＰｅｒＣ６細胞）、ヒト胚性腎臓細胞（ＨＥＫ２９３細胞など）、メイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）、ニワトリ胚腎臓細胞（ＣＥＫ細胞）、胚盤葉由来胚性幹細胞（例えばＥＢ１４）、マウス胚性線維芽細胞（３Ｔ３細胞など）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびこれらの細胞型の誘導体を含む。

【0050】

本発明による方法は、本発明によるポリペプチドを回収、精製および／または単離するステップを好ましくはさらに含む。得られた本発明によるポリペプチドは、任意選択での追加の精製、単離またはプロセシングステップ、例えばゲル電気泳動またはクロマトグラフィー法を使用する精製後に、ヒト治療において好ましくは使用される。

【0051】

本発明によるポリペプチドは、治療用および非治療用適用の両方において有利に使用できる多数の活性を表す。具体的には本発明によるポリペプチドは、細菌感染、真菌感染、ウイルス感染などの種々の微生物感染を妨げること、および寄生虫感染を妨げることにおいて有用である。それにより、本発明によるポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩、および少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤を含む医薬組成物が提供される。同様に、本発明による核酸分子またはベクター、および少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤を含む医薬組成物が提供される。

【0052】

本発明は、医薬としての使用のための本発明によるポリペプチドをさらに提供する。さらに、医薬としての使用のための本発明によるポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子が提供される。前記医薬は、治療剤または予防剤であってよい。

【0053】

一実施形態では本発明は、細菌、真菌、ウイルスおよび／または寄生虫感染に罹患している対象の処置のための方法であって、本発明によるポリペプチド、本発明による医薬組成物または本発明による核酸分子の治療有効量を前記対象に投与するステップを含む、方法を提供する。同様に、微生物に感染した対象の処置のためまたは微生物感染の予防のための医薬の調製物のための方法が提供される。好ましい実施形態では、前記微生物は、バクテリア、真菌、ウイルスまたは寄生虫である。さらに、微生物、細菌、真菌、ウイルスおよび／または寄生虫感染から生じる微生物、細菌、真菌、ウイルスおよび／または寄生虫感染または状態の処置における本発明による使用のためのポリペプチドおよび／または核酸分子が提供される。

【0054】

本明細書において使用される「対象」は、ヒトまたは動物である。対象は、これだけに限らないが、ヒト、ブタ、フェレット、アザラシ、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシおよびウマなどの哺乳動物、およびニワトリ、アヒル、ガチョウおよびシチメンチョウなどの鳥類を含む。本発明の好ましい実施形態では対象は、哺乳動物である。特に好ましい実施形態では対象は、ヒトである。

【0055】

本発明は、前記微生物または寄生虫を本発明によるポリペプチドまたは医薬組成物と接触させることを含む、微生物、例えばバクテリア、ウイルス、真菌または寄生虫の成長を抑制するための方法も提供する。前記接触させることは、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで実施できる。

【0056】

本発明によるポリペプチドおよび医薬組成物は、種々のウイルス、細菌および真菌感染などのさまざまな微生物感染の処置において有効である。例えばポリペプチドおよび医薬組成物は、グラム陰性およびグラム陽性細菌の処置において有効である。本発明のポリペプチドおよび組成物で処置できる感染をヒトまたは動物において生じる可能性がある病原性細菌の例は、これだけに限らないが、リステリア、大腸菌類、クラミジア、リケッチア菌、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌、クレブシレア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、シュードモナス、レギオネラ、ジフテリア、サルモネラ、桿菌、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、破傷風、クロストリジウム、バシラス、エルシニアおよびレプトスピラ細菌を含む。

【0057】

本発明のポリペプチドおよび組成物で処置できる感染をヒトまたは動物において生じる可能性がある病原性ウイルスの例は、これだけに限らないが、Ａ、ＢまたはＣ肝炎、ヘルペスウイルス（例えばＶＺＶ、ＨＳＶ−Ｉ、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ−ＩＩ、ＣＭＶ、ＥｐｓｔｅｉｎＢａｒｒ−ｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器多核体ウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ＲＳＶ）、ロタウイルス、モルビリウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクチニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、パピローマウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルスおよびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶウイルス、例えばＩおよびＩＩ型）を含む。

【0058】

本発明のポリペプチドおよび組成物で処置できる感染をヒトまたは動物において生じる可能性がある病原性真菌の例は、これだけに限らないが、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）（例えば、アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）、クルセイ（ｋｒｕｓｅｉ）、グラブラタ（ｇｌａｂｒａｔａ）、トロピカリス（ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ））、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（例えば、フミガーツス（ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、ニガー（ｎｉｇｅｒ））、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、ケカビ属（Ｇｅｎｕｓ Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）、ブラストミセス・デルマティティディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、南アメリカ分芽菌（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）およびコクシジオイデス・イミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）を含む。

【0059】

本発明のポリペプチドおよび組成物で処置できる感染をヒトまたは動物において引き起こす可能性がある病原性寄生虫の例は、これだけに限らないが、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、マラリア原虫（例えばファルシパルム、ビバックス）、エントアメーバ、ジアルジア、大腸バランチジウム（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ）、アカントアメーバ、クリプトスポリジウム菌種、ニューモシスチル カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、ネズミバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ）、トリパノソーマ（例えばブルセイ、クルーズ）、リーシュマニア（例えばドノバニ）およびトキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）を含む。

【0060】

好ましい実施形態では本発明のポリペプチドおよび医薬組成物は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＭＲＳＡ）および（非耐性）黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、グラム陰性バクテリア緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）および真菌性菌種カンジダ アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）およびクロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）によって生じた感染を処置することにおいて有効である。

【0061】

ポリペプチドを含有する組成物は、予防および／または治療処置のために投与されてよい。治療用適用ではポリペプチドまたは組成物は、既に疾患に罹患している対象、好ましくはヒトに、感染の症状または感染から生じる状態およびその合併症を妨げるための十分な量で投与される。予防用適用ではポリペプチドまたは組成物は、微生物または寄生虫感染に罹患する危険がある対象、例えばヒトまたは動物に、感染を予防するまたは感染の発症を少なくとも抑制するために十分な量で投与される。ポリペプチドは、本発明による医薬組成物中に、状態または疾患、特に微生物または寄生虫感染に関連する症状を治療するために十分な量である治療量で典型的には存在する。本発明によるポリペプチドまたはその少なくとも２つの組合せの投与の典型的な用量は、ポリペプチドのサイズに応じて体重１ｋｇあたりポリペプチド０．０１から１０ｍｇの間である。

【0062】

本発明のポリペプチドおよび医薬組成物は、例えば皮膚感染、創傷感染および尿路感染における局所適用のために特に好適である。本明細書に前述のとおり本発明のポリペプチドは、バイオフィルム形成を妨害でき、既存のバイオフィルムを消失させ、バイオフィルム形成部位およびその周辺で細菌、真菌または他の微生物を死滅させ、炎症促進性微生物内毒素を中和することによって免疫応答を調節する。細菌性バイオフィルムは、皮膚創傷の治癒を遅らせ、感染した皮膚創傷、皮膚感染または尿路感染の治癒または処置における従来の抗生物質の局所的な抗バクテリア有効性を低減する場合がある。本出願の実施例において実証するとおり本発明によるポリペプチドは、例えば創傷治癒において特に有用である。実施例は、本発明のポリペプチドがヒト線維芽細胞の熱創傷感染モデルにおけるバイオフィルムに存在する細菌を死滅させることにおいて有効であることを示している。一実施形態では、それにより本発明は皮膚感染、創傷感染および／または尿路感染の処置または予防における使用のための本発明によるポリペプチド、医薬組成物および／または核酸分子を提供する。同様に、創傷治癒における使用のための本発明によるポリペプチド、医薬組成物および／または核酸分子の使用が提供される。さらに、皮膚感染、創傷感染、尿路感染の処置または予防および／または創傷治癒のための医薬組成物の製造における本発明によるポリペプチド、医薬組成物および／または核酸分子の使用が提供される。本発明は、皮膚感染、創傷感染および／または尿路感染に罹患している対象の処置のための、前記対象に本発明によるポリペプチド、本発明による医薬組成物または本発明による核酸分子の治療有効量を投与することを含む方法をさらに提供する。

【0063】

ポリペプチドおよび医薬組成物は、それらがリポテイコ酸、ペプチドグリカンおよびリポ多糖類などの炎症促進性微生物内毒素を中和し、それにより好中球、マクロファージ／単球およびリンパ球の流入および感染した対象による炎症促進性微生物化合物の放出を抑制、低減または妨害することから抗炎症剤としても有用である。したがって同様に、炎症促進性化合物を放出できる細胞を本発明によるポリペプチドと接触させることを含む炎症促進性化合物の放出を抑制するための方法が提供される。前記接触させることは、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで実施できる。さらに、抗炎症剤としての使用のための本発明によるポリペプチドが提供される。

【0064】

本発明のポリペプチドは、徐放性および／または標的化送達担体に有利に組み込まれる。本明細書において使用される用語「徐放性」は、経時的方法での本発明のポリペプチドの放出を指す。一実施形態では徐放性は、緩効性を指す。本明細書において使用される用語「標的化送達」は、部位特異的方法での本発明のポリペプチドの放出を指す。徐放性ビヒクルの使用は、注射によるなどの本発明のポリペプチドの頻回投与が回避できる有利点を有する。標的化送達ビヒクルの使用は、本発明のポリペプチドが炎症の部位または感染の部位などの対象の身体における目的の部位に効果的に送達および／または保持される有利点を有する。好ましくは本発明のポリペプチドは、細菌、真菌、ウイルスおよび寄生虫を含む微生物に感染した部位に標的化される。徐放性および／または標的化送達担体は、当技術分野において十分周知である。徐放性および／または標的化送達ビヒクルの非限定的例は、ナノ粒子、微小粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、リポソーム、ミクロスフェア、ハイドロゲル、ポリマー、脂質複合体、血清アルブミン、抗体、シクロデキストリンおよびデキストランである。徐放性は、例えばそのような担体中にまたは表面上に本発明のポリペプチドを組み込むことによって提供される。担体は本発明のポリペプチドを捕捉し、水性、酸性または塩基性環境または体液などの好適な環境においてゆっくり分解または溶解し、それによりポリペプチドを放出する粒子を形成する材料である。標的化送達は、その表面上に標的化基を有する担体を提供することによって例えば達成される。標的化基を含むそのような担体の例は、抗体機能化担体、部位特異的リガンドを有する担体および正または負の表面電荷を有する担体である。徐放性および／または標的化送達のための好ましい粒子は、ナノ粒子、すなわち直径約１から５００ｎｍ、好ましくは直径約２００ｎｍまでの範囲の粒子およびリポソームであり、任意選択で標的化基を有して提供される。

【0065】

したがって本発明は、本発明のポリペプチドを含む徐放性担体およびそのような徐放性担体を含む医薬組成物をさらに提供する。同様に、本発明のポリペプチドを含む標的化送達担体およびそのような標的化送達担体を含む医薬組成物が提供される。一実施形態では前記担体は、ナノ粒子、微小粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、リポソーム、ミクロスフェア、ハイドロゲル、ポリマー、脂質複合体、血清アルブミン、抗体、シクロデキストリンおよびデキストランからなる群から選択される。

【0066】

好ましい標的化送達および／または徐放性担体は、生分解性材料のものである。本明細書において使用される「生分解性」は、生理的条件下で分解する分子を指す。これは、加水分解的に分解可能である分子および酵素的分解を必要とする分子を含む。好適な生分解性材料は、これだけに限らないが、ＰＬＡ（ポリ乳酸酸）、ＰＧＡ（ポリグリコール酸）、ポリカプロラクトン（ＰＣＡ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリジオキサノン（ＰＤＳ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリプロピレンフマレート、（ラクチド、グリコリドおよびカプロラクトンなどの）ラクトン由来のポリマー、トリメチレンカーボネートおよびテトラメチレンカーボネートなどのカーボネート、ジオキサノン、エチレングリコール、ポリエステルアミド（ＰＥＡ）エチレンオキシド、エステルアミド、γ−ヒドロキシバレレート、β−ヒドロキシプロピオネート、α−ヒドロキシ酸、ヒドロキシブチレート、ヒドロキシアルカノエート、ポリイミドカーボネート、ポリウレタン、ポリ酸無水物およびその組合せ、ヒアルロン酸、キトサンおよびセルロースなどの多糖およびゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質などの生分解性ポリマーおよび天然生分解性材料を含む。

【0067】

本発明のポリペプチドは、微生物、例えば細菌、ウイルス、真菌、寄生虫感染に影響されやすい材料のための保存剤としてさらに有利に使用できる。そのような材料は、本発明のポリペプチドによって浸透またはコートまたは覆われてよい。一実施形態では本発明のポリペプチドは、医療用デバイスのための保存剤として使用される。本明細書において使用される用語「医療用デバイス」は、ヒトまたは動物の身体において使用できるデバイスを指し、これだけに限らないが、医療機器、医療用具、臀部および膝を含む人工接合部などの人工関節および歯科用人工装具、乳房インプラント、ペースメーカー、心臓バルブ、ステント、カテーテル、耳管チューブ、スプリント、医療用デバイスのためのネジおよび創傷または組織ドレッシング材などのインプラント可能なデバイスを含む。そのような医療用デバイスは、例えば細菌による付着のため、個々の細菌の付着およびバイオフィルム中の細菌の両方のために特に好適である。

【0068】

したがって同様に、医療用デバイスのための保存剤としての本発明のポリペプチドの使用が提供される。さらに、好ましくは医療用デバイスのための、本発明のポリペプチドを含むコーティングが提供される。一実施形態ではそのようなコーティングは、本発明のポリペプチドの徐放性を提供する。医療用デバイスのためのそのような徐放性コーティングは、好ましくは生分解性材料を含み、それにより本発明のポリペプチドの放出は、コーティング材料の分解によって達成される。したがって同様に、本発明のポリペプチドを含む徐放性コーティングが提供される。さらに、本発明のポリペプチドおよび生分解性材料を含むそのようなコーティングを含む医療用デバイスが提供される。本発明による生分解性コーティングは、上記で定義された生分解性材料を含む。具体的には、そのような生分解性コーティングは、ＰＬＡ（ポリ乳酸酸）、ＰＧＡ（ポリグリコール酸）、ポリカプロラクトン（ＰＣＡ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリジオキサノン（ＰＤＳ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリプロピレンフマレート、（ラクチド、グリコリドおよびカプロラクトンなどの）ラクトン由来のポリマー、トリメチレンカーボネートおよびテトラメチレンカーボネートなどのカーボネート、ジオキサノン、エチレングリコール、ポリエステルアミド（ＰＥＡ）エチレンオキシド、エステルアミド、γ−ヒドロキシバレレート、β−ヒドロキシプロピオネート、α−ヒドロキシ酸、ヒドロキシブチレート、ヒドロキシアルカノエート、ポリイミドカーボネート、ポリウレタン、ポリ酸無水物およびその組合せ、ヒアルロン酸、キトサンおよびセルロースなどの多糖、およびゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質からなる群から選択される材料を含む。

【0069】

本発明によるポリペプチドは、強力な抗菌剤であるが、それらを抗生物質、抗ウイルス剤および抗真菌剤などの従来の抗感染薬などの周知の抗菌剤または他の抗菌性ペプチド、および抗体および化学物質、例えば増感剤、ナノ粒子と組み合わせることができる。そのような組合せは、抗菌活性の増加または活性スペクトルの広幅化を生じる可能性がある。本発明のポリペプチドは、細菌感染を処置するために例えばペニシリン、セファロスポリン、マクロライド、フルオロキノロン、スルホンアミド、テトラサイクリンおよび／またはアミノグリコシドと組み合わされてよい。ウイルス感染の処置のためにポリペプチドは、アシクロビル、ガンシクロビル、ジドブジン（ＡＺＴ）またはジダノシンなどの抗ウイルスヌクレオシド類似物または、オセルタミビル、ペラミビルまたはザナミビルなどのノイラミダーゼ阻害剤と組み合わされてよい。真菌感染の処置のために本発明のポリペプチドおよび組成物は、ポリエン抗真菌剤、イミダゾール、トリアゾ−ル、アリルアミン、エキノキャンディン、シクロピロクス、フルシトシンおよび／またはグリセオフルビンと組み合わされてよい。したがって本発明は、本発明によるポリペプチドおよび、ペニシリン、セファロスポリン、カルバペネム、ムピロシンからなる群から好ましくは選択される抗生物質または抗菌性ペプチドなどの追加の抗菌剤を含む医薬組成物を提供する。

【0070】

本発明による医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む。好適な担体の例は、例えばキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン（例えばＢＳＡまたはＲＳＡ）およびオボアルブミンを含む。好ましい実施形態では前記好適な担体は、溶液、例えば生理食塩水である。錠剤、カプセルなどに組み込まれ得る賦形剤の例は次のとおりである：トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンデンプンまたはゼラチンなどの結合剤；結晶セルロースなどの賦形剤；コーンデンプン、アルファ化デンプン、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；ショ糖、乳糖またはサッカリンなどの甘味剤；ペパーミント、冬緑油またはサクランボなどの風味剤。単位投与形態がカプセルである場合、上の種類の材料に加えて、脂肪油などの液体担体を含有してよい。種々の他の材料は、コーティングとして、または他に投与単位の物理的形態を改変するために存在してもよい。例えば錠剤は、セラック、糖または両方でコートされてよい。シロップまたはエリキシル剤は、活性化合物、甘味剤としてショ糖、保存剤としてメチルおよびプロピルパラベン、色素およびサクランボまたはオレンジ風味などの風味剤を含有してよい。本発明による医薬組成物は、好ましくはヒト使用のために好適である。

【0071】

本明細書に記載の医薬組成物は、種々の異なる方法で投与できる。例は、本発明によるポリペプチドを含み、薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物を経口、鼻腔内、直腸内、局所、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、真皮下、経皮的、くも膜下腔内および頭蓋内方法を介して投与することを含む。経口投与のために活性成分は、カプセル、錠剤および粉剤などの固体投与形態またはエリキシル剤、シロップおよび懸濁剤などの液体投与形態で投与できる。

【0072】

注射用の滅菌組成物は、本発明のポリペプチドを水または、ゴマ油、ココナッツ油、ピーナッツ油、綿実油などの天然に存在する植物油またはオレイン酸エチルなどの合成脂肪性ビヒクル、などの注射のためのビヒクルに溶解または懸濁することによって従来の医薬用常法により製剤できる。緩衝液、保存剤、抗酸化物質なども組み込まれてよい。

【0073】

好ましい実施形態では本発明による医薬組成物は、局所投与のために製剤化される。本明細書において使用される「局所投与」は、微生物または寄生虫感染から生じる状態を局所的に処置するための皮膚または粘膜などの身体表面への適用を指す。局所投与のために好適な製剤の例は、これだけに限らないがクリーム、ゲル、軟膏、ローション、フォーム、懸濁剤、スプレー、エアロゾル、粉末エアロゾルを含む。局所用の医薬は、皮膚上にあってよく、それらが皮膚に直接適用されることを意味する。局所用の医薬は、例えば気道の粘膜上皮への適用のために吸入用であってもよく、または結膜に適用される点眼薬または耳に入れられる点耳薬などの皮膚以外の組織の表面に適用されてよい。局所投与のために製剤された前記医薬組成物は、利尿剤、希釈剤、保水剤、保存剤、ｐＨ調整剤および／または水などの局所適用のために好適な少なくとも１つの薬学的賦形剤を好ましくは含む。

【0074】

本発明によるポリペプチドは、診断用使用のためにも特に好適である。ポリペプチドは、血液、血漿、粘液、創傷滲出液および尿などの生理学的試料中に存在する微生物感染の、例えば微生物毒素、例えばＬＰＳ、ＬＴＡおよびＰＧを含む細菌性毒素の検出による、検出のために使用できる。さらにポリペプチドは、そのような試料中の微生物毒素の量を決定するために使用できる。したがって、診断剤としての使用のための本発明によるポリペプチド核酸分子が提供される。さらに、血液、血漿、粘液、創傷滲出液および尿試料などの生理学的試料中の微生物毒素、好ましくは細菌性または真菌性毒素を検出するための本発明によるポリペプチドの使用が提供される。上述したとおり本発明によるポリペプチドは、ビオチン、フルオレセイン標識、近赤外色素または放射性同位元素などの好適な成分にカップリングされてよい。そのような標識ポリペプチドは、それらが微生物感染の部位に移動することから、細菌感染などの微生物感染を検出するための方法において使用できる。ポリペプチドに付着した使用される標識についての好適な検出器を使用して、感染部位を検出することが可能である。したがって、細菌感染などの微生物感染を検出するための方法も本発明によって提供される。方法は、微生物に感染したまたは感染したと疑われる対象に標識ポリペプチドを投与することを典型的には含む。標識ポリペプチドが感染性生物と相互作用できることから、それは感染部位に蓄積する。生理学的試料中の微生物毒素を検出するための方法は、微生物に感染したまたは感染したと疑われる対象の生理学的試料に標識化ポリペプチドを投与することを含む。ポリペプチドに付着している標識に感受性である種々の検出器を使用して、感染部位または試料中でのポリペプチドの蓄積を検出できる。

【0075】

本発明によるポリペプチドの別の有用な適用は、食品の保存においてである。したがって、食品保存剤としての本発明によるポリペプチドの使用が同様に提供される。一般に病原性または腐敗性微生物は、６０から１００℃で変動する温度にそれらを供することにより食品を熱的に処理することによって破壊される。そのような処置は、望ましくない官能効果など食品に望ましくない効果を有する場合がある。食品における保存剤としての本発明によるポリペプチドの使用は、食品の保存期間の延長および／または安全性の増強をもたらすことができる。

【0076】

食品中の病原性微生物は、対象の感染または中毒を生じる場合があり、カンピロバクター ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、パラチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ）および非チフスサルモネラ菌種（ｎｏｎ−ｔｙｐｈｉ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）およびボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）などの細菌、ロタウイルスおよびノーウォークウイルスなどのウイルス、有鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ ｓｏｌｉｕｍ）、無鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ ｓａｇｉｎａｔａ）および旋毛虫（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｓｐｉｒａｌｉｓ）などの寄生虫およびカビを含む。食品の腐敗は、食品の見た目、硬さ、風味および／または匂いの変化を指し、ラクトバチルス、ロイコノストック、シュードモナス、ミクロコッカス、フラボバクテリウム、セラチア、エンテロバクターおよび連鎖球菌などの細菌、アスペルギルス、フサリウムおよびクラドスポリウムなどの細菌および酵母によって生じる場合がある。
本発明は、次の非限定的例においてより詳細に説明される。

【図面の簡単な説明】

【0077】

【図1】膜破壊（カーペットおよびポア形成）および細胞内環境へのＡＭＰ移行についての２つの最も顕著なモデルを示す、ＡＭＰの作用の様式に含まれるステップの簡略化図である。アニオン性ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）および中性ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）から主に構成される細胞質の細菌膜に結合するためにＡＭＰは、細胞外バイオフィルムポリマーマトリクスおよび外膜および／またはペプチドグリカン／リポテイコ酸層（簡略化のため示さない）を通じて移行する必要があり、ほとんどが静電気的に駆動される。

【図2A1】ペプチドのさまざまな濃度による培養培地１ｍｌあたりのＭＲＳＡのＣＦＵ（コロニー形成単位）の量によって表される、ペプチドＰ６０．４Ａｃ（Ｎｅｌｌ ＭＪら．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（２００６）６４９〜６６０）およびペプチドＰ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ９、Ｐ１０によるＭＲＳＡ ＬＵＨ１４６１６の死滅を示す図である。

【図2A2】ペプチドのさまざまな濃度による培養培地１ｍｌあたりのＭＲＳＡのＣＦＵ（コロニー形成単位）の量によって表される、ペプチドＰ１１、Ｐ１２、Ｐ１３、Ｐ１４、Ｐ１５、Ｐ１６、Ｐ１７およびＰ１９によるＭＲＳＡ ＬＵＨ１４６１６の死滅を示す図である。

【図2B】ペプチドについてのＩＣ９０、ＩＣ９９およびＩＣ９９．９（９０％、９９％および９９．９％抑制濃度（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ））値を示す図表である。

【図3】培養培地１ｍｌあたりＭＲＳＡのＣＦＵの量によって示す、さまざまな濃度のＰ６０．４ＡｃおよびＰ１０によるＭＲＳＡの死滅を示すグラフである。

【図4】（Ａ）皮膚モデル１つあたりのＭＲＳＡ ＬＵＨ１４６１６のＣＦＵの計数として表す、熱創傷皮膚モデルでのＭＲＳＡ ＬＵＨ１４６１６へのＬＬ−３７、Ｐ６０．４Ａｃ、Ｐ１０およびムピロシンの効果および皮膚モデル１つあたりのＭＲＳＡ ＬＵＨ１４６１６の生存率（％において）を示すグラフである。

【図5】（Ａ）皮膚モデル１つあたりのＭＲＳＡ ＬＵＨ１５０５１のＣＦＵの計数として表す、熱創傷皮膚モデルでのムピロシン耐性ＭＲＳＡ ＬＵＨ１５０５１へのＬＬ−３７、Ｐ６０．４Ａｃ、Ｐ１０およびムピロシンの効果および皮膚モデル１つあたりのＭＲＳＡ ＬＵＨ１５０５１の生存率（％において）を示すグラフである。

【実施例】

【0078】

材料と方法
抗菌性ペプチドの合成
合成ペプチドを、前処理したＴｅｎｔａｇｅｌ樹脂、ｉｎ ｓｉｔｕ活性化のためのＰｙＢｏｐ／ＮＭＭおよびＦｍｏｃ除去のためのＮＭＰ中の２０％ピペリジンを使用して通常のＦｍｏｃ化学によって調製した［Ｈｉｅｍｓｔｒａ ＨＳら．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９４、１０３１３〜１０３１８（１９９７）］。カップリングを６倍のアシル化種で６０分間実施した。最後のＦｍｏｃ除去後、ペプチドをペプチド配列中にＣ（トリエチルシラン）またはＷ（エタンチオール）が存在する場合、追加のスカベンジャーを含有するＴＦＡ／Ｈ_２Ｏ １９／１（ｖ／ｖ）で切断した。ペプチドをエーテル／ペンタン １／１（ｖ／ｖ）沈殿および遠心分離による産生物の単離によって単離した。約４０℃での空気乾燥後、ペプチドを酢酸／水 １／１０（ｖ／ｖ）に溶解し、凍結乾燥した。ペプチドをＵＰＬＣ−ＭＳ（Ａｃｑｕｉｔｙ、Ｗａｔｅｒｓ）を使用して純度についておよびＭａｌｄｉ−Ｔｏｆ質量分析機（Ｍｉｃｒｏｆｌｅｘ、Ｂｒｕｋｅｒ）を使用して完全性について検査し、予測された分子量を示した。
略号：
Ｆｍｏｃ：９Ｈ−フルオレニルメチルオキシカルボニル
ＮＭＭ：Ｎ−メチルモルホリン
ＰｙＢＯＰ：ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロフォスフェート
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸

【0079】

細菌株
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＭＲＳＡ）、ＬＵＨ１４６１６の臨床分離株は、ｄｒ．Ｓ．Ｃｒｏｅｓ、Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（Ｃｒｏｅｓ Ｓ ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００９；９：２２９．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１−２１８０−９−２２９を参照されたい）によって親切にも提供され、そのムピロシン耐性ＭＲＳＡ ＬＵＨ １５０５１はｄｒ ＭＥＯＣ Ｈｅｃｋ（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，ＲＩＶＭ、Ｂｉｌｔｈｏｖｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）からの寄贈であった。
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＪＡＲは、Ｃａｍｐｏｃｃｉａら（Ｉｎｔ Ｊ Ａｒｔｉｆ Ｏｒｇａｎｓ．２００８年９月；３１（９）：８４１〜７）に記載されている。
細菌を使用まで−８０℃で保存した。中期対数期の細菌の接種材料を血液アガープレートから単離したＭＲＳＡコロニーをＴｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）培地（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｌｅ Ｐｏｎｔ ｄｅ Ｃｌａｘ、Ｆｒａｎｃｅ）で２．５時間インキュベートし、次いで必要な濃度に希釈することによって調製した。

【0080】

【表1】

【0081】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ死滅アッセイ
中期対数期細菌でのｉｎ ｖｉｔｒｏ死滅アッセイのために、ＭＲＳＡ ＬＵＨ１４６１６およびＭＲＳＡ ＬＵＨ １５０５１をＰＢＳ中、細菌１×１０^６個／ｍｌの濃度に再懸濁した。続いて２００μｌを予め凍結乾燥した濃度範囲のペプチドＬＬ−３７、Ｐ６０．４Ａｃ（ＯＰ−１４５）およびＰ１０に加えた。続いて細菌ペプチド混合物を１時間、３７℃でインキュベートした。これらのペプチドの死滅能力を確立するために、懸濁物を系列希釈し、生存ＣＦＵ数を測定するためにＤＳＴアガープレートに蒔いた。ＩＣ９０、ＩＣ９９およびＩＣ９９．９値を直線回帰分析によって算出した。
Ｐ１０バリアントでのｉｎ ｖｉｔｒｏ死滅アッセイのために、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＪＡＲ（１ｍｌｎ ＣＦＵ／ｍｌ）をＰＢＳ中またはＰＢＳ／ヒト血漿（１／１、ｖ／ｖ）中で種々の濃度のペプチドと共に２時間、３７℃でインキュベートした。表２〜６に示すのは、細菌の９９．９％死滅（１０００ＣＦＵ／ｍｌ残存）を生じるペプチドの濃度である。ＬＣ９９．９は、２回の独立した実験の平均値である。

【0082】

ヒト皮膚等価物
ヒト皮膚等価物を、Ｅｌ Ｇｈａｌｂｚｏｕｒｉら（Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．２００４年１月；８４（１）：１０２〜１２）に記載のとおり調製した。簡潔には、正常ヒトケラチノサイト５×１０^５個を線維芽細胞定植ラット尾部コラーゲンマトリックスに播種した。コラーゲンマトリックスを基礎（０．１％酢酸、４ｍｇ／ｍｌコラーゲン、ハンクス平衡塩類塩溶液（ＨＢＳＳ、１０×）、１Ｍ ＮａＯＨおよびＦＣＳ）および正常ヒト線維芽細胞が播種された上層コラーゲン層（４ｍｇ／ｍｌコラーゲン、１０×ＨＢＳＳ、１Ｍ ＮａＯＨ、ＦＣＳおよび線維芽細胞）を作ることによって予め調製した。ポアサイズ３μｍを有するトランスウエルフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ３４１４、Ｃｏｓｔａｒ）をヒト皮膚等価物を培養するために使用した。コラーゲンマトリックスを線維芽細胞培地中で１週間培養した。全層ヒト皮膚等価物をケラチノサイト培地中液内で最初に２または３日間、３７℃、７．３％ＣＯ_２で培養し、次いで上述したとおりだが、１％ＦＣＳを含み、２Ｍ Ｌ−セリン、１０ｍＭ Ｌ−カルニチン、１μＭ ＤＬ−α−トコフェロール−アセテート、５０μＭアスコルビン酸、パルミチン酸、リノール酸およびアラキドン酸を１：１：１の比で含有した脂質補充物および２．４×１０^−５Ｍウシ血清アルブミンを補充したケラチノサイト培地中で培養した。２または３日後、次いでＨＳＥを上述したとおりだが、血清を含まず、２Ｍ Ｌ−セリン、１０ｍＭ Ｌ−カルニチン、１μＭ ＤＬ−α−トコフェロール−アセテート、５０μＭアスコルビン酸、２５μＭパルミチン酸、３０μＭリノール酸および７μＭアラキドン酸（２：１：１）を含有した脂質補充物および２．４×１０^−５Ｍウシ血清アルブミンを補充したケラチノサイト培地中、気相液相界面で１４日間培養した。培養培地を１週間に２回更新した。

【0083】

熱創傷感染モデルおよび実験的処置
全層皮膚モデルを上述したとおりポアサイズ０．４μｍを有するトランスウエルフィルターＣｏｒｎｉｎｇ ３４６０、Ｃｏｓｔａｒ）を使用して再構築した。１０日間の気相液相間培養後、液体窒素を皮膚等価物に１５秒間適用することによって２０ｍｍ^２の熱創傷を作った。熱損傷皮膚等価物を感染前に１時間、３７℃、７．３％ＣＯ_２でインキュベートした。感染は、皮膚等価物にＭＲＳＡ １×１０^５個の接種材料を適用することによって行った。１時間インキュベーション後、非付着細菌を除去した。感染１または８時間後に処置を開始し、ＬＬ−３７、Ｐ６０．４ＡｃまたはＰ１０の１用量（ＰＢＳ １００ｍｌ中１００μｇ）を加えた。処置を処理前に４または２４時間延長した。皮膚等価物をすべての非付着細菌を除去するためにＰＢＳ １ｍｌで洗浄した。次いで４ｍｍの生検を２個取り、ＰＢＳ １ｍｌ中で破砕した。破砕物および洗浄物を診断感受性検査（ＤＳＴ）アガープレート上で生存ＣＦＵ数を測定するために系列希釈した。

【0084】

結果
Ｐ１０の同定
１５種のペプチドのセットを合成した。ペプチドは、コンピューターによる構造予測に基づいて、予測される両親媒性構造をＰ６０．４Ａｃと比較して強めるまたは弱めるのいずれかで設計した（Ｎｅｌｌ ＭＪら．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（２００６）６４９〜６６０）。抗バイオフィルム活性は、ペプチドにおいて高度に可変性である（高いおよび低いの両方の活性の抗菌性ペプチドをこの方法で生成した）。両親媒性らせん構造の改変と抗菌性ペプチド内の抗バイオフィルム活性との間に弱い関連が存在することが見込まれた。したがって、一連の短い合成ペプチドをこれらの観察に基づいて開発し、それらの抗菌活性を評価した。これらのペプチドの活性は、抗菌活性なしから、モルベースでＬＬ−３７のものを超える活性を有するペプチドまで変動した。検査したＰ６０．４Ａｃおよび１５個のペプチドの配列は：

Ｐ６０．４Ａｃ ＩＧＫＥＦＫＲＩＶＥＲＩＫＲＦＬＲＥＬＶＲＰＬＲ
Ｐ２ ＩＡＫＥＦＫＲＩＶＥＲＩＫＲＦＬＲＥＬＶＲＰＬＲ
Ｐ３ ＬＡＲＤＹＫＲＬＶＥＲＬＫＲＷＬＲＥＬＶＲＰＬＫ
Ｐ４ ＩＡＫＥＦＫＲＩＬＥＲＩＫＲＦＩＲＥＩＴＲＰＩＲ
Ｐ５ ＴＡＫＥＹＫＲＩＬＤＲＩＫＲＹＬＲＥＬＶＲＡＩＫ
Ｐ６ ＶＡＫＤＹＲＫＶＶＤＲＩＫＲＦＬＲＹＬＬＲＰＶＲ
Ｐ９ ＬＡＫＤＹＫＫＩＶＥＲＬＲＫＷＬＲＥＶＬＲＰＶＫ
Ｐ１０ ＬＡＲＥＹＫＫＩＶＥＫＬＫＲＷＬＲＱＶＬＲＴＬＲ
Ｐ１１ ＬＡＫＥＹＲＫＩＦＤＲＬＫＫＷＬＲＱＩＶＲＰＳＫ
Ｐ１２ ＬＡＲＥＹＫＲＩＦＥＲＬＲＫＷＬＲＱＩＶＫＰＶＲ
Ｐ１３ ＬＡＫＥＷＲＫＩＶＤＲＬＫＲＷＬＲＤＩＬＫＡＴＫ
Ｐ１４ ＶＡＲＥＷＫＲＩＬＥＫＩＫＲＷＬＲＤＩＬＫＡＬＲ
Ｐ１５ ＶＡＫＥＷＲＫＩＶＤＲＩＫＲＹＬＲＤＩＳＫＡＴＫ
Ｐ１６ ＴＡＲＥＷＫＲＩＬＥＫＩＲＫＹＬＲＤＶＳＲＶＴＲ
Ｐ１７ ＶＡＫＤＷＫＲＩＶＤＫＶＲＲＹＬＲＥＶＴＫＩＬＫ
Ｐ１９ ＴＡＫＤＹＲＫＩＦＥＫＩＫＫＹＬＫＤＬＴＲＩＬＫ
である。

【0085】

ペプチドＰ１０は、ＭＲＳＡ ＬＹＨ１４６１６を非常に効果的に死滅させる。検査したすべてのペプチドの内でＭＲＳＡ ＬＵＨ１４６１６に対して最も高い活性を有し、Ｐ６０．４Ａｃ（ＯＰ−１４５）よりも相当に有効でさえある、図２ＡおよびＢを参照されたい。例えばＰ１０は、０．５９μＭのＩＣ９９．９を有し、この濃度でＰ１０が細菌１０００個の内９９９個を死滅させることを意味している。Ｐ６０．４Ａｃは、０．７５μＭと同様の、わずかに高い濃度でさえ細菌１０００個の内９００個だけを死滅させる（０．７５μＭのＩＣ９０）。したがって、同様の濃度のＰ１０での処置と比較して１００倍を超える細菌がＰ６０．４Ａｃでの処置後に生き残る。それによりＰ１０は、Ｐ６０．４Ａｃよりもおよそ１００倍よい活性を有する。

【0086】

Ｐ１０およびバリアントの活性
ペプチド１０は、ＭＲＳＡおよびムピロシン耐性ＭＲＳＡを死滅させることにおいておよび熱的に創傷されたヒト皮膚等価物からこれらの細菌を除去することにおいてＬＬ−３７およびＰ６０．４Ａｃよりもさらに有効であった（図３〜５）。
Ｐ１０は、対数期、定常期細菌におけるＭＲＳＡ細菌に対しておよびバイオフィルムに存在する細菌に対して高度に有効である。

【0087】

加えてＰ１０は：
１）グラム陽性細菌、例えばメチシリン耐性および感受性株の種々の株（図４および５を参照されたい）、表在性ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、２）種々の（薬物耐性）緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株、（薬物耐性）アシネトバクター バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）株を含むグラム陰性細菌、
３）マイコバクテリア、および
４）真菌性病原体（フルコナゾール耐性）、カンジダ アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）およびクロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）に対して高度に有効である。

【0088】

１つまたはすべてのアミノ酸がそれらの対応するＤ−アミノ酸によって置き換えられている、または１つのアミノ酸が他のＬ−アミノ酸によって置き換えられているＰ１０バリアントは、Ｐ１０のものに匹敵する抗菌活性を有する。同様に、アセチル、アミド、ＮＨ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_１１−ＣＯ、ヘキサノイル、デカノイル、ミリストイル、プロピオニル、１つまたは２つのアミノ−ヘキサノイル基を含むさまざまな基で伸長されたＣ末端のＮ末端を有するバリアント、および短いＰ−１０バリアントは、Ｐ１０のものに匹敵する抗菌活性を有する。これらのＰ１０バリアントの配列および活性を表２、３、５および６に示す。プロリン置換がヘリックスを壊すように導入されたペプチドは、大部分が不活性であった（表４を参照されたい）。

【0089】

表2. 1つのアミノ酸がそのD-アミノ酸(小文字)によって置き換えられたP-10バリアントおよび対応物およびレトロインベルソペプチドの活性。J=アセチル、B=アミド

【表2】

【0090】

表3. さまざまな基でC末端のN末端でペプチドが伸長されたP-10バリアントの活性。J=アセチル、B=アミド、o=NH-(CH₂-CH₂-O)₁₁-CO、b=ヘキサノイル、j=デカノイル、u=ミリストイル、U=プロピオニル、Z=アミノ-ヘキサノイル

【表3】

【0091】

表4. 特定のアミノ酸のP(プロリン、ヘリックス破壊残基であると報告されている)による2つの置換によってペプチドが修飾された、P-10バリアントの活性。J=アセチル、B=アミド

【表4】

【0092】

表5. 表5.1つのアミノ酸が他のL-アミノ酸によって置き換えられたP-10バリアントの活性。J=アセチル、B=アミド

【表5】

【0093】

表6. 短いP-10バリアントの活性。J=アセチル、B=アミド

【表6】

【図1】

【図2A1】

【図2A2】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】