特許 6683691 高効率ゲノム編集のためのアデノ随伴ウイルスベクターバリアント及びその方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6683691

(24)【登録日】2020年3月30日

(45)【発行日】2020年4月22日

(54)【発明の名称】高効率ゲノム編集のためのアデノ随伴ウイルスベクターバリアント及びその方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20200413BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20200413BHJP

   A61K 35/545 20150101ALI20200413BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20200413BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20200413BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20200413BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20200413BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20200413BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20200413BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20200413BHJP

   C12N 7/01 20060101ALN20200413BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/09 100

   A61K35/76

   A61K35/545

   A61K35/28

   A61K48/00

   A61P37/04

   A61P7/00

   A61P31/00

   A61P43/00 105

   A61P3/00

   !C12N7/01ZNA

【請求項の数】19

【全頁数】98

(21)【出願番号】特願2017-516515(P2017-516515)

(86)(22)【出願日】2015年9月23日

(65)【公表番号】特表2017-529854(P2017-529854A)

(43)【公表日】2017年10月12日

(86)【国際出願番号】US2015051785

(87)【国際公開番号】WO2016049230

(87)【国際公開日】20160331

【審査請求日】2018年9月25日

(31)【優先権主張番号】62/054,899

(32)【優先日】2014年9月24日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/063,587

(32)【優先日】2014年10月14日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/209,862

(32)【優先日】2015年8月25日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】598004424

【氏名又は名称】シティ・オブ・ホープ

【氏名又は名称原語表記】Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】サスワティ・チャタジー

(72)【発明者】

【氏名】ローラ・スミス

(72)【発明者】

【氏名】カメハメハ・ウォン

【審査官】 堂畑 厚志

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１３−５４４０７７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１３／００９６１８２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 SMITH, Laura J. et al.，GENE TRANSFER PROPERTIES AND STRUCTURAL MODELING OF HUMAN STEM CELL-DERIVED AAV，MOLECULAR THERAPY，英国，２０１４年 ６月１３日，VOL:22,NR:9，PAGE(S):1625-1634，ＵＲＬ，http://dx.doi.org/10.1038/mt.2014.107

【文献】 KHAN, Iram F. et al.，AAV-MEDIATED GENE TARGETING METHODS FOR HUMAN CELLS，NATURE PROTOCOLS，英国，NATURE PUBLISHING GROUP，２０１１年 ３月，VOL:6, NR:4，PAGE(S):482 - 501，ＵＲＬ，http://dx.doi.org/10.1038/nprot.2011.301

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／

Ｃ１２Ｎ ７／

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

哺乳類染色体の標的座位を編集するエクスビボの方法であって、前記方法が、複製欠損アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）で前記哺乳類染色体を含む哺乳類細胞を形質導入する工程を含み、前記複製欠損ＡＡＶが、
ａ）ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシド、並びに
ｂ）補正ゲノムであって、
（ｉ）標的座位への組み込みのためのヌクレオチド間結合又はヌクレオチド配列から選択される編集エレメント、
（ｉｉ）前記標的座位に対する前記哺乳類染色体の５’領域と相同性を有する、前記編集エレメントの５’側にある５’相同アームヌクレオチド配列、及び
（ｉｉｉ）前記標的座位に対する前記哺乳類染色体の３’領域と相同性を有する、前記編集エレメントの３’側にある３’相同アームヌクレオチド配列
を含む、補正ゲノム
を含み、
前記細胞が、外因性ヌクレアーゼ、又は外因性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を同時形質導入することなく形質導入され、
前記ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドが、
（ｉ）配列番号２〜１７のいずれか１つのアミノ酸２０３〜７３６と１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、
（ｉｉ）配列番号２〜１７のいずれか１つのアミノ酸１３８〜７３６と１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、及び／又は
（ｉｉｉ）配列番号２〜１７のいずれか１つのアミノ酸１〜７３６と１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質
を含む、エクスビボの方法。

【請求項2】

（ａ）前記哺乳類細胞が、筋芽細胞、内皮細胞、肝細胞、線維芽細胞、乳房細胞、リンパ球、若しくは網膜細胞である、及び/又は、
（ｂ）前記哺乳類細胞が、幹細胞であり、場合により、前記幹細胞が、造血幹細胞、臍帯血幹細胞、若しくは末梢血幹細胞であり、さらに場合により、前記幹細胞が、ＣＤ３４＋造血幹細胞である、
請求項１に記載のエクスビボの方法。

【請求項3】

対象の疾患又は障害を治療する方法における使用のための複製欠損アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む医薬組成物であって、前記方法が、外因性ヌクレアーゼ、又は外因性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を同時投与することなく、前記対象に前記複製欠損ＡＡＶを投与する工程を含み、
前記複製欠損ＡＡＶが、
ａ）ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシド、並びに
ｂ）補正ゲノムであって、
（ｉ）哺乳類染色体の標的座位への組み込みのためのヌクレオチド間結合又はヌクレオチド配列から選択される編集エレメント、
（ｉｉ）前記標的座位に対する前記哺乳類染色体の５’領域と相同性を有する、前記編集エレメントの５’側にある５’相同アームヌクレオチド配列、及び
（ｉｉｉ）前記標的座位に対する前記哺乳類染色体の３’領域と相同性を有する、前記編集エレメントの３’側にある３’相同アームヌクレオチド配列
を含む、補正ゲノム
を含み、
前記ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドが、
（ｉ）配列番号２〜１７のいずれか１つのアミノ酸２０３〜７３６と１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、
（ｉｉ）配列番号２〜１７のいずれか１つのアミノ酸１３８〜７３６と１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、及び／又は
（ｉｉｉ）配列番号２〜１７のいずれか１つのアミノ酸１〜７３６と１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質
を含む、医薬組成物。

【請求項4】

前記補正ゲノムが、前記編集エレメントヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを欠いている、請求項１又は２に記載のエクスビボの方法。

【請求項5】

前記補正ゲノムが、前記編集エレメントに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項１又は２に記載のエクスビボの方法。

【請求項6】

前記５’及び３’相同アームヌクレオチド配列の各々が、独立して、約５０〜２０００ヌクレオチドのヌクレオチド長を有する、請求項１、２、４、及び５のいずれか一項に記載のエクスビボの方法。

【請求項7】

前記編集エレメントが、１つ以上のヌクレオチドの挿入、１つ以上のヌクレオチドの欠失、又は１つ以上のヌクレオチドの置換を含み、場合により、前記編集エレメントが、エキソン、イントロン、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、プロモーター、スプライスドナー、スプライスアクセプター、非コードＲＮＡに相当する配列、インスレーター、遺伝子若しくはその断片、遺伝子のコード配列、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１、２、及び４〜６のいずれか一項に記載のエクスビボの方法。

【請求項8】

前記哺乳類染色体の前記標的座位が、対応する野生型哺乳類染色体と比較して、１つ以上の変異ヌクレオチドを含む変異標的座位であり、場合により、
（ａ）前記変異標的座位が、無形質変異、新形質変異、反形質変異、常染色体優性変異、常染色体劣性変異、若しくはそれらの組み合わせを含み、並びに／又は、
（ｂ）前記変異標的座位が、プロモーター、エンハンサー、シグナル配列、イントロン、エキソン、スプライスドナー部位、スプライスアクセプター部位、内部リボソーム進入部位、逆エキソン、インスレーター、遺伝子若しくはその断片、染色体逆位、及び前記哺乳類染色体内における染色体転座から選択される、
請求項１、２、及び４〜７のいずれか一項に記載のエクスビボの方法。

【請求項9】

前記補正ゲノムが、前記５’相同アームヌクレオチド配列の５’側にある５’末端逆位配列（５’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列、及び前記３’相同アームヌクレオチド配列の３’側にある３’末端逆位配列（３’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列を含み、場合により、
（ａ）前記５’ＩＴＲヌクレオチド配列が、配列番号３６と少なくとも９５％の配列同一性を有し、前記３’ＩＴＲヌクレオチド配列が、配列番号３７と少なくとも９５％の配列同一性を有する、又は
（ｂ）前記５’ＩＴＲヌクレオチド配列が、配列番号３８と少なくとも９５％の配列同一性を有し、前記３’ＩＴＲヌクレオチド配列が、配列番号３９と少なくとも９５％の配列同一性を有する、
請求項１、２、及び４〜８のいずれか一項に記載のエクスビボの方法。

【請求項10】

前記ヌクレオチド間結合が、ホスホジエステル結合である、請求項１、２、及び４〜９のいずれか一項に記載のエクスビボの方法。

【請求項11】

前記標的座位が、セーフハーバー部位である、請求項１、２、及び４〜１０のいずれか一項に記載のエクスビボの方法。

【請求項12】

前記補正ゲノムが、前記編集エレメントヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを欠いている、請求項３に記載の医薬組成物。

【請求項13】

前記補正ゲノムが、前記編集エレメントに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項３に記載の医薬組成物。

【請求項14】

前記５’及び３’相同アームヌクレオチド配列の各々が、独立して、約５０〜２０００ヌクレオチドのヌクレオチド長を有する、請求項３、１２、及び１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項15】

前記編集エレメントが、１つ以上のヌクレオチドの挿入、１つ以上のヌクレオチドの欠失、又は１つ以上のヌクレオチドの置換を含み、場合により、前記編集エレメントが、エキソン、イントロン、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、プロモーター、スプライスドナー、スプライスアクセプター、非コードＲＮＡに相当する配列、インスレーター、遺伝子若しくはその断片、遺伝子のコード配列、又はそれらの組み合わせを含む、請求項３、及び１２〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項16】

前記哺乳類染色体の前記標的座位が、対応する野生型哺乳類染色体と比較して、１つ以上の変異ヌクレオチドを含む変異標的座位であり、場合により、
（ａ）前記変異標的座位が、無形質変異、新形質変異、反形質変異、常染色体優性変異、常染色体劣性変異、若しくはそれらの組み合わせを含み、並びに／又は、
（ｂ）前記変異標的座位が、プロモーター、エンハンサー、シグナル配列、イントロン、エキソン、スプライスドナー部位、スプライスアクセプター部位、内部リボソーム進入部位、逆エキソン、インスレーター、遺伝子若しくはその断片、染色体逆位、及び前記哺乳類染色体内における染色体転座から選択される、
請求項３、及び１２〜１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項17】

前記補正ゲノムが、前記５’相同アームヌクレオチド配列の５’側にある５’末端逆位配列（５’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列、及び前記３’相同アームヌクレオチド配列の３’側にある３’末端逆位配列（３’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列を含み、場合により、
（ａ）前記５’ＩＴＲヌクレオチド配列が、配列番号３６と少なくとも９５％の配列同一性を有し、前記３’ＩＴＲヌクレオチド配列が、配列番号３７と少なくとも９５％の配列同一性を有する、又は
（ｂ）前記５’ＩＴＲヌクレオチド配列が、配列番号３８と少なくとも９５％の配列同一性を有し、前記３’ＩＴＲヌクレオチド配列が、配列番号３９と少なくとも９５％の配列同一性を有する、
請求項３、及び１２〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項18】

前記ヌクレオチド間結合が、ホスホジエステル結合である、請求項３、及び１２〜１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項19】

前記標的座位が、セーフハーバー部位である、請求項３、及び１２〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年８月２５日に出願された米国仮出願第６２／２０９，８６２号、２０１４年１０月１４日に出願された米国仮出願第６２／０６３，５８７号、及び２０１４年９月２４日に出願された米国仮出願第６２／０５４，８９９号の優先権の利益を主張する。これらの参照された出願のそれぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

政府の関心の声明
本発明は、国立衛生研究所から付与された助成金番号ＨＬ０８７２８５の下での政府の支援によってなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。

【背景技術】

【0003】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムは、約４．９キロベース長のプラスセンスまたはマイナスセンスのいずれかの一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）で構築される。ゲノムは、ＤＮＡ鎖の両端に逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含み、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：ｒｅｐ及びｃａｐを含む。ｒｅｐは、ＡＡＶライフサイクルに必要なｒｅｐタンパク質をコードする４つの重複する遺伝子から構成され、ｃａｐは、一緒に相互作用して正２０面体対称のキャプシドを形成するキャプシドタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の重複ヌクレオチド配列を含む。

【0004】

複製欠損ヒトパルボウイルスＡＡＶ２由来の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターは、病原性または発癌性のいずれかとして明確に同定されていない、安全かつ有効な遺伝子伝達ビヒクルであることが証明されている［３〜４、６、１８〜１９、２６、３１］。ｒＡＡＶは非分裂初代細胞を形質導入し、免疫原性が低く、インビボで持続的な導入遺伝子発現を誘導する［６、１０、２０］。野生型ＡＡＶによる感染は、発癌性形質転換の阻害に関連し、ＡＡＶ逆位末端反復は、実際に発癌保護を与える可能性がある［２、２８、５２−５５］。ヒト組織のパネルの最近の調査では、骨髄及び肝臓がヒトにおいて天然に生じるＡＡＶ分離株の２つの最も一般的な部位であることが分かり、ＡＡＶによる骨髄細胞の感染がまれではないことが示唆された。

【0005】

遺伝子治療のためのウイルスベクターの使用が、長い間考慮されてきた。長期生存矯正の可能性及びエクスビボ操作の容易さのために、造血系は遺伝子治療の最も初期の標的の１つであった。しかしながら、大きな努力にもかかわらず、実際の治療上の成功は依然として分からない［５］。これは、ほとんどのウイルスベクターが静止した非分裂造血幹細胞（ＨＳＣ）に効率的に形質導入することができないこと［２３］、ならびに挿入腫瘍形成に起因する安全性の懸念があるためである［１５，２２］。しかし、安定した遺伝子導入は、ｒＡＡＶによってネズミ及びヒトＨＳＣの両方に成功裏に実証されている［８，１１〜１２，２４，２７，２９〜３０，３７］。

【0006】

血液脳関門を通過すること、溶質の通過を制限する内皮細胞間の密着結合によって生じる脳細胞外液から循環血液の細胞性及び代謝性の分離の困難さにより、神経学的状態、特に中枢神経系の疾患または障害を治療するための遺伝子治療におけるウイルスベクターの効果的な使用はさらに困難であった。

【0007】

ＣＤ３４は、細胞表面糖タンパク質、及び細胞−細胞接着因子である。ＣＤ３４タンパク質は早期の造血及び血管組織で発現され、ＣＤ３４を発現する細胞はＣＤ３４^＋と命名されている。ヒトＣＤ３４^＋ＨＳＣ ［８，１２，１６，２９］におけるｒＡＡＶの染色体組み込み、ならびに初代及び二次多系統生着を支持することができる原始、多分化能性、自己複製ヒトＨＳＣの効率的な形質導入は、免疫不全ＮＯＤ−ＳＣＩＤ マウスにおいて実証されている［２９］。連続生着を支持することができる原始ＨＳＣの形質導入は、ｒＡＡＶが、Ｇ０に存在する原始、静止ＣＤ３４＋ ＣＤ３８−細胞を効率的に形質転換する傾向に起因することが示された［２４］。インビトロ及びマウスにおけるヒトＨＳＣ、ならびにインビボにおける非ヒト霊長類ＨＳＣへのｒＡＡＶ媒介性遺伝子移入の成功のいくつかの報告にもかかわらず、ＨＳＣ形質導入に対するｒＡＡＶの有用性に関する論争は依然として残っている。これらの矛盾は、発現プロファイリングによる形質導入を評価する短期インビトロ研究から主に生じ、ウイルスアンコート［３５］、細胞内輸送［３３］、核輸送、及び第２鎖合成を含む、ＡＡＶ２からの導入遺伝子発現に対する同定された制限に起因する［３６］。

【0008】

ＡＡＶ２は、ＡＡＶに基づくベクターの最も研究されたプロトタイプウイルスである一方［１、１３、１８、２１］、多数の新しいＡＡＶ血清型の同定は、潜在的遺伝子伝達ベクターのレパートリーを有意に高める［１４］。ＡＡＶ１、３、及び４をアデノウイルスストックの汚染物質として単離し、ＡＡＶ５をヒトのコンジローム性疣贅から単離した。ＡＡＶ６は、ＡＡＶ１とＡＡＶ２との間の実験室組換え体として生じた。最近、ヒト及び非ヒト霊長類組織における天然に存在するＡＡＶの１００以上の異なる分離株が同定された。これにより、ＡＡＶ２のエンベロープタンパク質を新規エンベロープに置き換えて、ＡＡＶ２ ｒｅｐ及び新規キャプシド遺伝子を用いてｒＡＡＶ２ゲノムをパッケージングすることにより、これらの単離物の一部に由来するキャプシドをシュードタイピングに使用した。新規キャプシド、ウイルスの殻の一部としての該タンパク質の使用は、ＡＡＶ２に関連する導入遺伝子発現の多くの制限を回避した［３２、３５〜３６］。

【0009】

これらの制限を回避するために、最近の研究により、新規キャプシド配列は、プロテアソーム媒介性キャプシド分解の減少、核輸送の増加及び保持をもたらすことが示されている。新規受容体を利用する新規キャプシドは、以前は難治性の組織の効率的な形質導入を可能にするｒＡＡＶの向性を広げ、最近の試験で大きな臨床上の制限をもたらした、ＡＡＶ２に対する非常に一般的な既存の血清学的免疫を回避する手段を提供する。注目すべきことに、いくつかの新規キャプシドは、ｒＡＡＶの細胞内プロセシングを変化させるようである。例えば、天然のＡＡＶ２キャプシドと比較して、ＡＡＶ８の文脈では、被覆のない状態及び導入遺伝子の発現が加速される。最近、導入遺伝子発現は、逆方向末端反復（ＩＴＲ）の血清型起源にかかわらず、キャプシドタンパク質に基づくことが示された。

【0010】

天然に存在するＡＡＶは、サイトカインで刺激された末梢血幹細胞において同定可能である。これらのＡＡＶのキャプシド配列は独特である。これらのキャプシドは、組換えＡＡＶ２ゲノムをシュードタイピングすることができる。米国特許公開第２０１３００９６１８２Ａ１号はキャプシドＡＡＶＦ１〜１７を記載し、細胞形質導入及び遺伝子導入のためのその使用を記載する。永久的及び可逆的な遺伝子導入と、治療目的のための発現との両方に関する遺伝子治療の領域における任意の改善は、当技術分野において顕著な改善であろう。さらに、幹細胞への安全で効率的な遺伝子送達は、何十年もの研究にもかかわらず、この分野において依然として重要な課題である。したがって、幹細胞を遺伝子組換えで安全に改変する能力は、大きな進歩をもたらすであろう。

【0011】

さらに、ゲノム中のフットプリントを残さずに、ゲノムの特定の部位での遺伝子標的化または補正によるゲノム編集は、遺伝性疾患及び後天性疾患の正確な補正にとって魅力的である。現在の技術は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬエンドヌクレアーゼ、またはカスパーゼ９／ＣＲＩＳＰＲシステムなどの外因性エンドヌクレアーゼの使用によってこれを達成する。しかしながら、これらの「伝統的な」アプローチは、エンドヌクレアーゼ切断の毒性及び標的効果に関連している。したがって、外因性エンドヌクレアーゼ切断を必要とせずに、幹細胞を高頻度で安全かつ効率的に遺伝的に改変する能力は、有意な進歩を示すであろう。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

さらに、ヒトＨＳＣの遺伝子形質導入の現在の方法は、精製されたドナー幹細胞のエクスビボ形質導入、続いて通常は「コンディショニング」されたレシピエントへの移植を含む。細胞回収手順は、侵襲的であり、骨髄採取またはドナーの顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）プライミングの複数日後に除去療法を伴う。エクスビボ形質導入手順は、幹細胞の造血能力に影響を及ぼす可能性がある。さらに、インビトロで形質導入された細胞は、移植前に無菌性、毒性などについて試験されなければならない。レシピエントに移植する前に、幹細胞は、生着を確実にするために化学療法または放射線によるコンディショニングをしなければならないことが多い。このプロセスは、通常、少なくとも数日間、時にはより長い間、患者の入院を必要とする。全体として、これは幹細胞遺伝子治療の有用性を大きく制限する、厄介で高価で危険性の高い手順である。精製及びエクスビボ形質導入を必要とせずに、現在の幹細胞形質導入法のより良い代替法を提供する手順が必要である。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本明細書では、相同組換えを介した細胞のゲノム編集のための、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、キャプシドに封入された補正ゲノムを含む複製欠損アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などのＣｌａｄｅ Ｆベクター、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドであるキャプシド）及び使用方法ならびにそれらのキットが提供される。

【0014】

いくつかの局面において、本開示は、キャプシドに封入された補正ゲノムを含み、キャプシドがＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドであり、補正ゲノムが（ａ）哺乳類染色体の標的遺伝子座に組み込むためのヌクレオチド間結合またはヌクレオチド配列から選択される編集エレメントと、（ｂ）標的遺伝子座に対する哺乳類染色体の５’領域と相同性を有する編集エレメントの５’側にある５’相同アームヌクレオチド配列と、（ｃ）標的遺伝子座に対する哺乳類染色体の３’領域と相同性を有する編集エレメントの３’側にある３’相同アームヌクレオチド配列とを含む、複製欠損アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を提供する。いくつかの態様では、本開示は、キャプシドに封入された補正ゲノムを含む複製欠損アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であり、該キャプシドがＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドであり、該補正ゲノムが哺乳類染色体の標的遺伝子座に組み込むための編集エレメントヌクレオチド配列を含み、該補正ゲノムが編集エレメントヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターの本質的な非存在を有する、複製欠損アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を提供する。さらなる態様において、本開示は、キャプシドに封入された補正ゲノムを含む複製欠損アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であって、該キャプシドがＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドであり、該補正ゲノムが細胞内の哺乳類染色体の標的遺伝子座に組み込むためのヌクレオチド間結合またはヌクレオチド配列から選択される編集エレメントを含み、該ＡＡＶが編集エレメントを細胞内の哺乳類染色体の標的遺伝子座に組み込むために少なくとも約１％の染色体組み込み効率を有する、複製欠損アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を提供する。本開示の他の態様は、ＡＡＶキャプシドに封入された補正ゲノムを含む複製欠損アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含み、補正ゲノムが、哺乳類細胞染色体の標的遺伝子座に組み込むためのヌクレオチド間結合またはヌクレオチド配列から選択される編集エレメントと、標的遺伝子座に対する染色体の５’領域と相同性を有する編集エレメントの５’側にある５’相同アームヌクレオチド配列と、標的遺伝子座に対する染色体の３’領域と相同性を有する編集エレメントの３’側にある３’相同アームヌクレオチド配列とを含む遺伝子編集ベクターであって、ＡＡＶが外来性ヌクレアーゼの非存在下で哺乳類細胞染色体の標的遺伝子座に編集エレメントを組み込むために少なくとも１０％の染色体組み込み効率を有する、遺伝子編集ベクターに関する。

【0015】

本明細書で提供されるＡＡＶのいずれか１つのいくつかの実施形態では、ＡＡＶは、細胞内の哺乳類の染色体の標的遺伝子座に編集エレメントを組み込むために外因性ヌクレアーゼ非存在下で少なくとも約１％の染色体組み込み効率を有する。

【0016】

本明細書中に提供されるＡＡＶのいずれか１つのいくつかの実施形態では、補正ゲノムは、５’相同アームヌクレオチド配列の５’側にある５’逆方向末端反復（５’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列、及び３’相同アームヌクレオチド配列の３’側にある３’逆方向末端反復（３’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲヌクレオチド配列、及び３’ＩＴＲヌクレオチド配列は、それぞれ、ＡＡＶ２ウイルス５’ＩＴＲ、及びＡＡＶ２ウイルス３’ＩＴＲと実質的に同一である。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲヌクレオチド配列、及び３’ＩＴＲヌクレオチド配列は、互いに実質的に鏡像である。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲヌクレオチド配列は、配列番号３６に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、３’ＩＴＲヌクレオチド配列は、配列番号３７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲヌクレオチド配列、及び３’ＩＴＲヌクレオチド配列は、それぞれＡＡＶ５ウイルス５’ＩＴＲ、及びＡＡＶ５ウイルス３’ＩＴＲと実質的に同一である。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲヌクレオチド配列、及び３’ＩＴＲヌクレオチド配列は、互いに実質的に鏡像である。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲヌクレオチド配列は、配列番号３８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、３’ＩＴＲヌクレオチド配列は、配列番号３９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。

【0017】

本明細書で提供されるＡＡＶのいずれか１つのいくつかの実施形態では、補正ゲノムは、編集エレメントヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターの本質的な欠如を有する。本明細書で提供されるＡＡＶのいずれか１つのいくつかの実施形態では、補正ゲノムは、編集エレメントに作動可能に連結された外因性プロモーターをさらに含む。

【0018】

本明細書で提供されるＡＡＶのいずれか１つのいくつかの実施形態では、複製欠損ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、及びＡＡＶ ｃａｐ遺伝子の本質的な欠如を含む。

【0019】

本明細書で提供されるＡＡＶのいずれか１つのいくつかの実施形態では、５’及び３’相同アームヌクレオチド配列のそれぞれは、独立して約５００〜１０００ヌクレオチドまたは約６００〜１０００ヌクレオチドのヌクレオチド長を有する。いくつかの実施形態では、５’及び３’相同アームヌクレオチド配列は実質的に等しいヌクレオチド長を有する。いくつかの実施形態では、５’及び３’相同アームヌクレオチド配列は、非対称的なヌクレオチド長を有する。いくつかの実施形態では、５’相同アームヌクレオチド配列は、標的遺伝子座に対する哺乳類染色体の５’領域と少なくとも約９５％のヌクレオチド配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、３’相同アームヌクレオチド配列は、標的遺伝子座に対する哺乳類染色体の３’領域と少なくとも約９５％のヌクレオチド配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、５’相同アームヌクレオチド配列は、標的遺伝子座に対する哺乳類染色体の５’領域と１００％の配列同一性を有し、３’相同アームヌクレオチド配列は、標的遺伝子座に対する哺乳類染色体の３’領域と１００％の配列同一性を有する。

【0020】

本明細書で提供されるＡＡＶのいずれか１つのいくつかの実施形態では、編集エレメントは１ヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座は１ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり、標的遺伝子座は哺乳類染色体の点変異を表す。

【0021】

いくつかの実施形態では、標的遺伝子座は、哺乳類染色体のイントロンを含み得る。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座は、哺乳類染色体のエキソンを含み得る。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座は、哺乳類染色体の非コード領域を含み得る。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座は、哺乳類染色体の調節領域を含み得る。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座は、本明細書に記載の疾患状態に関連する遺伝子座であり得る。

【0022】

本明細書で提供されるＡＡＶのいずれか１つのいくつかの実施形態では、編集エレメントは、少なくとも１、２、１０、１００、２００、５００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、または５０００ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、編集エレメントは、１〜５５００、１〜５０００、１〜４５００、１〜４０００、１〜３０００、１〜２０００、１〜１０００、１〜５００、１〜２００、または１〜１００ヌクレオチド、または２〜５５００、２〜５０００、２〜４５００、２〜４０００、２〜３０００、２〜２０００、２〜１０００、２〜５００、２〜２００、または２〜１００ヌクレオチド、または１０〜５５００、１０〜５０００、１０〜４５００、１０〜４０００、１０〜３０００、１０〜２０００、１０〜１０００、１０〜５００、１０〜２００、または１０〜１００ヌクレオチドである。

【0023】

本明細書で提供されるＡＡＶのいずれか１つのいくつかの実施形態では、編集エレメントは、エキソン、イントロン、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、プロモーター、スプライスドナー、スプライスアクセプター、配列をコードするかまたはコードしないＲＮＡ、インスレーター、遺伝子、またはそれらの組み合わせを含む。本明細書で提供されるＡＡＶのいずれか１つのいくつかの実施形態では、編集エレメントは、標的遺伝子座内またはそれにまたがる遺伝子のコード配列の断片である。

【0024】

本明細書で提供されるＡＡＶのいずれか１つのいくつかの実施形態では、標的遺伝子座は、ｎ個のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列であり、ｎは１以上の整数であり、編集エレメントはｍ個のヌクレオチドを含み、ｍはｎに等しい整数であり、編集エレメントは哺乳類染色体の標的遺伝子座の置換を表す。本明細書で提供されるＡＡＶのいずれか１つのいくつかの実施形態では、標的遺伝子座は、ｎ個のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列であり、ｎは１以上の整数であり、編集エレメントはｍ個のヌクレオチドを含み、ｍはｎより大きい整数であり、編集エレメントは、哺乳類染色体の標的遺伝子座のための置換付加を表す。本明細書で提供されるＡＡＶのいずれか１つのいくつかの実施形態では、標的遺伝子座は、ｎ個のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列であり、ｎは２以上の整数であり、編集エレメントはｍ個のヌクレオチドを含み、ｍはｎより小さい整数であり、編集エレメントは、哺乳類染色体の標的遺伝子座のための置換欠失を表す。本明細書で提供されるＡＡＶのいずれか１つのいくつかの実施形態では、標的遺伝子座はヌクレオチド間結合であり、編集エレメントはｍ個のヌクレオチドを含み、ｍは１以上の整数であり、編集エレメントは、哺乳類染色体の標的遺伝子座に対する付加を表す。

【0025】

本明細書で提供されるＡＡＶのいずれか１つのいくつかの実施形態では、編集エレメントはヌクレオチド間結合である。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座は、１つ以上のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列であり、編集エレメントは、哺乳類染色体の標的遺伝子座についての欠失を含む。

【0026】

本明細書で提供されるＡＡＶのいずれか１つのいくつかの実施形態では、哺乳類染色体の標的遺伝子座は、対応する野生型哺乳類染色体と比較して、１つ以上の変異ヌクレオチドを含む変異体標的遺伝子座である。いくつかの実施形態では、変異体標的遺伝子座が、点変異、ミスセンス変異、ナンセンス変異、１つ以上のヌクレオチドの挿入、１つ以上のヌクレオチドの欠失、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、変異体標的遺伝子座が、無形質変異、新形質変異、または反形質変異を含む。いくつかの実施形態では、変異体標的遺伝子座が、常染色体優性変異、常染色体劣性変異、ヘテロ接合変異、ホモ接合変異、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、変異体標的遺伝子座が、哺乳類染色体内における、プロモーター、エンハンサー、シグナル配列、イントロン、エキソン、スプライスドナー部位、スプライスアクセプター部位、内部リボソーム進入部位、逆エクソン、インスレーター、遺伝子、染色体の逆位、及び染色体転座を含む。

【0027】

本明細書で提供されるＡＡＶのいずれか１つのいくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、Ｃｌａｄｅ Ｆ ＶＰ１、Ｃｌａｄｅ Ｆ ＶＰ２、及びＣｌａｄｅ Ｆ ＶＰ３から選択される少なくとも１つのタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、Ｃｌａｄｅ Ｆ ＶＰ１、Ｃｌａｄｅ Ｆ ＶＰ２、及びＣｌａｄｅ Ｆ ＶＰ３から選択される少なくとも２つのタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、Ｃｌａｄｅ Ｆ ＶＰ１、Ｃｌａｄｅ Ｆ ＶＰ２、及びＣｌａｄｅ Ｆ ＶＰ３タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、それぞれＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３のアミノ酸配列に対応する、それぞれ配列番号１のアミノ酸１〜７３６、アミノ酸１３８〜７３６、またはアミノ酸２０３〜７３６に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、それぞれＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１及びＶＰ２のアミノ酸配列に対応する、それぞれ配列番号１のアミノ酸１〜７３６、及びアミノ酸１３８〜７３６に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＶＰ１及びＶＰ２タンパク質か、それぞれＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１及びＶＰ３のアミノ酸配列に対応する、それぞれ配列番号１のアミノ酸１〜７３６、及びアミノ酸２０３〜７３６と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＶＰ１及びＶＰ３タンパク質か、それぞれＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ２及びＶＰ３のアミノ酸配列に対応する、それぞれ配列番号１のアミノ酸１３８〜７３６、及びアミノ酸２０３〜７３６と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＶＰ２及びＶＰ３タンパク質かを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、それぞれＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３のアミノ酸配列に対応する、配列番号１のアミノ酸１〜７３６、アミノ酸１３８〜７３６、及びアミノ酸２０３〜７３６と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、それぞれＡＡＶＦ１〜ＡＡＶＦ９、及びＡＡＶＦ１１〜ＡＡＶＦ１７キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３のアミノ酸配列に対応する、それぞれ配列番号２、３、５、６、１１、７、８、９、１０、４、１２、１４、１５、１６、１７、または１３のいずれか１つのアミノ酸１〜７３６、アミノ酸１３８〜７３６、またはアミノ酸２０３〜７３６と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、それぞれＡＡＶＦ１〜ＡＡＶＦ９及びＡＡＶＦ１１〜ＡＡＶＦ１７キャプシドタンパク質ＶＰ１及びＶＰ２のアミノ酸配列に対応する、それぞれ配列番号２、３、５、６、１１、７、８、９、１０、４、１２、１４、１５、１６、１７、または１３のいずれか１つのアミノ酸１〜７３６及びアミノ酸１３８〜７３６と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＶＰ１及びＶＰ２か、それぞれＡＡＶＦ１〜ＡＡＶＦ９及びＡＡＶＦ１１〜ＡＡＶＦ１７キャプシドタンパク質ＶＰ１及びＶＰ３のアミノ酸配列に対応する、それぞれ配列番号２、３、５、６、１１、７、８、９、１０、４、１２、１４、１５、１６、１７、または１３のいずれか１つのアミノ酸１〜７３６及びアミノ酸２０３〜７３６と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＶＰ１及びＶＰ３か、それぞれＡＡＶＦ１〜ＡＡＶＦ９及びＡＡＶＦ１１〜ＡＡＶＦ１７キャプシドタンパク質ＶＰ２及びＶＰ３のアミノ酸配列に対応する、それぞれ配列番号２、３、５、６、１１、７、８、９、１０、４、１２、１４、１５、１６、１７、または１３のいずれか１つのアミノ酸１３８〜７３６及びアミノ酸２０３〜７３６と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＶＰ２及びＶＰ３か、を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドが、それぞれＡＡＶＦ１〜ＡＡＶＦ９、及びＡＡＶＦ１１〜ＡＡＶＦ１７キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３のアミノ酸配列に対応する、それぞれ配列番号２、３、５、６、１１、７、８、９、１０、４、１２、１４、１５、１６、１７、または１３のいずれか１つのアミノ酸１〜７３６、アミノ酸１３８〜７３６、及びアミノ酸２０３〜７３６と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、それぞれＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードするヌクレオチド配列に対応する、それぞれ配列番号１８と少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を含むヌクレオチド配列によってコードされるＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、配列番号１８に対して少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を含むヌクレオチド配列によってコードされるＶＰ１及びＶＰ２タンパク質か、配列番号１８に対して少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を含むヌクレオチド配列によってコードされるＶＰ１及びＶＰ３タンパク質か、または配列番号１８に対して少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を含むヌクレオチド配列によってコードされるＶＰ２及びＶＰ３タンパク質かを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードするヌクレオチド配列に対応する、配列番号１８に対して少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を含むヌクレオチド配列によってコードされるＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、それぞれＡＡＶＦ１〜ＡＡＶＦ９、及びＡＡＶＦ１１〜ＡＡＶＦ１７キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードするヌクレオチド配列に対応する、それぞれ配列番号２０、２１、２２、２３、２５、２４、２７、２８、２９、２６、３０、３１、３２、３３、３４、または３５のいずれか１つに対して少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を含むヌクレオチド配列によってコードされるＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、配列番号２０〜３５のいずれか１つに対して少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を含むヌクレオチド配列によってコードされるＶＰ１及びＶＰ２タンパク質か、配列番号２０〜３５のいずれか１つと少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を含むヌクレオチド配列によってコードされるＶＰ１及びＶＰ３タンパク質か、配列番号２０〜３５のいずれか１つと少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を含むヌクレオチド配列によってコードされるＶＰ２及びＶＰ３タンパク質かを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、それぞれＡＡＶＦ１〜ＡＡＶＦ９、及びＡＡＶＦ１１〜ＡＡＶＦ１７キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をそれぞれコードするヌクレオチド配列に対応する、配列番号２０、２１、２２、２３、２５、２４、２７、２８、２９、２６、３０、３１、３２、３３、３４、または３５のいずれか１つに対して少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を含むヌクレオチド配列によってコードされるＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、それぞれ配列番号１に記載のアミノ酸１〜７３６、アミノ酸１３８〜７３６、及びアミノ酸２０３〜７３６に対応するＡＡＶ９ ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３キャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、それぞれ配列番号１に記載のアミノ酸１〜７３６、及びアミノ酸１３８〜７３６に対応する、ＡＡＶ９ ＶＰ１及びＶＰ２キャプシドタンパク質か、それぞれ、配列番号１に記載のアミノ酸１〜７３６、及びアミノ酸２０３〜７３６に対応する、ＡＡＶ９ ＶＰ１及びＶＰ３キャプシドタンパク質か、それぞれ配列番号１に記載のアミノ酸１３８〜７３６、及びアミノ酸２０３〜７３６に対応する、ＡＡＶ９ ＶＰ２及びＶＰ３キャプシドタンパク質かを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、それぞれ配列番号１に記載のアミノ酸１〜７３６、アミノ酸１３８〜７３６、及びアミノ酸２０３〜７３６に対応する、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、それぞれ配列番号２、３、５、６、１１、７、８、９、１０、４、１２、１４、１５、１６、１７、または１３に記載のアミノ酸１〜７３６に対応する、ＡＡＶＦ１〜ＡＡＶＦ９、及びＡＡＶＦ１１〜ＡＡＶＦ１７のいずれかのＶＰ１キャプシドタンパク質から選択されるＶＰキャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、それぞれ配列番号２、３、５、６、１１、７、８、９、１０、４、１２、１４、１５、１６、１７、または１３に記載のアミノ酸１〜７３６、及びアミノ酸１３８〜７３６に対応する、ＡＡＶＦ１〜ＡＡＶＦ９、及びＡＡＶＦ１１〜ＡＡＶＦ１７のいずれかのＶＰ１及びＶＰ２キャプシドタンパク質から独立して選択されるＶＰ１及びＶＰ２キャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、それぞれ配列番号２、３、５、６、１１、７、８、９、１０、４、１２、１４、１５、１６、１７、または１３に記載のアミノ酸１３８〜７３６、及びアミノ酸２０３〜７３６に対応する、ＡＡＶＦ１〜ＡＡＶＦ９、及びＡＡＶＦ１１〜ＡＡＶＦ１７のいずれかのＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３キャプシドタンパク質から独立して選択されるＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３キャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、それぞれ配列番号２、３、５、６、１１、７、８、９、１０、４、１２、１４、１５、１６、１７、または１３に記載のアミノ酸１〜７３６、アミノ酸１３８〜７３６、及びアミノ酸２０３に対応する、ＡＡＶＦ１〜ＡＡＶＦ９、及びＡＡＶＦ１１〜ＡＡＶＦ１７のいずれかのＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３キャプシドタンパク質のそれぞれを含む。

【0028】

提供されるＡＡＶのいずれか１つのいくつかの実施形態では、Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドが、ＡＡＶＦ５（配列番号１１）、ＡＡＶＦ７（配列番号８）、ＡＡＶＦ１２（配列番号１２）、ＡＡＶＦ１５（配列番号１６）、ＡＡＶＦ１７（配列番号１３）、ＡＡＶＦ９（配列番号１０）、ＡＡＶＦ１６（配列番号１７）、バリアント、断片、変異体、及びそれらの任意の組み合わせの群から選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも９５％のパーセント配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。本明細書中で使用するＡＡＶＦ１、ＡＡＶＦ２、ＡＡＶＦ３、ＡＡＶＦ４、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶＦ６、ＡＡＶＦ７、ＡＡＶＦ８、ＡＡＶＦ９、ＡＡＶＦ１０、ＡＡＶＦ１１、ＡＡＶＦ１２、ＡＡＶＦ１３、ＡＡＶＦ１４、ＡＡＶＦ１５、ＡＡＶＦ１６、及びＡＡＶＦ１７は、それぞれＡＡＶＨＳＣ１、ＡＡＶＨＳＣ２、ＡＡＶＨＳＣ３、ＡＡＶＨＳＣ４、ＡＡＶＨＳＣ５、ＡＡＶＨＳＣ６、ＡＡＶＨＳＣ７、ＡＡＶＨＳＣ８、ＡＡＶＨＳＣ９、ＡＡＶＨＳＣ１０、ＡＡＶＨＳＣ１１、ＡＡＶＨＳＣ１２、ＡＡＶＨＳＣ１３、ＡＡＶＨＳＣ１４、ＡＡＶＨＳＣ１５、ＡＡＶＨＳＣ１６、及びＡＡＶＨＳＣ１７とも呼ばれる。言い換えれば、ＡＡＶＦ１、ＡＡＶＦ２、ＡＡＶＦ３、ＡＡＶＦ４、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶＦ６、ＡＡＶＦ７、ＡＡＶＦ８、ＡＡＶＦ９、ＡＡＶＦ１０、ＡＡＶＦ１１、ＡＡＶＦ１２、ＡＡＶＦ１３、ＡＡＶＦ１４、ＡＡＶＦ１５、ＡＡＶＦ１６、またはＡＡＶＦ１７のいずれかの列挙は、それぞれＡＡＶＨＳＣ１、ＡＡＶＨＳＣ２、ＡＡＶＨＳＣ３、ＡＡＶＨＳＣ４、ＡＡＶＨＳＣ５、ＡＡＶＨＳＣ６、ＡＡＶＨＳＣ７、ＡＡＶＨＳＣ８、ＡＡＶＨＳＣ９、ＡＡＶＨＳＣ１０、ＡＡＶＨＳＣ１１、ＡＡＶＨＳＣ１２、ＡＡＶＨＳＣ１３、ＡＡＶＨＳＣ１４、ＡＡＶＨＳＣ１５、ＡＡＶＨＳＣ１６またはＡＡＶＨＳＣ１７と同等であり、置換することができる。

【0029】

本明細書で提供されるＡＡＶのいずれか１つのいくつかの実施形態では、哺乳類染色体は、ヒト染色体１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、Ｘ、及びＹから選択される。本明細書で提供されるＡＡＶのいずれか１つのいくつかの実施形態では、哺乳類染色体は、マウス染色体１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、Ｘ、及びＹから選択される。いくつかの実施形態では、哺乳類の染色体はヒト１９番染色体ではない。

【0030】

本明細書で提供されるＡＡＶのいずれか１つのいくつかの実施形態では、哺乳類の染色体は体細胞染色体である。いくつかの実施形態では、体細胞は、結合組織（血液を含む）、筋肉組織、神経組織、及び上皮組織からなる群から選択される組織由来である。いくつかの実施形態では、体細胞は、肺、心臓、肝臓、腎臓、筋肉、脳、眼、乳房、骨、及び軟骨からなる群から選択される器官由来である。いくつかの実施形態では、体細胞はＣＤ３４＋細胞である。

【0031】

本明細書で提供されるＡＡＶのいずれか１つのいくつかの実施形態では、細胞は幹細胞である。いくつかの実施形態では、幹細胞は、造血幹細胞、臍帯血幹細胞、骨髄幹細胞、胎児肝幹細胞、または末梢血幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ３４＋造血幹細胞株（ＨＳＣ）、Ｋ５６２ ＣＤ３４＋白血病細胞株、ＨｅｐＧ２ヒト肝細胞株、末梢血幹細胞、臍帯血幹細胞、ＣＤ３４＋末梢血幹細胞、ＷＩ−３８ヒト二倍体線維芽細胞株、ＭＣＦ７ヒト乳癌細胞株、Ｙ７９ヒト網膜芽腫細胞株、ＳＣＩＤ−Ｘ１ ＬＢＬヒトＥＢＶ不死化Ｂ細胞株、初代ヒト肝細胞、初代肝類洞内皮細胞、初代骨格筋筋芽細胞からなる群から選択される。

【0032】

本明細書で提供されるＡＡＶのいずれか１つのいくつかの実施形態では、ＡＡＶは、編集エレメントを細胞内の哺乳類染色体の標的遺伝子座に組み込むために少なくとも約５％の染色体組み込み効率を有する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、編集エレメントを細胞内の哺乳類染色体の標的遺伝子座に組み込むために、少なくとも約１０％の染色体組み込み効率を有する。

【0033】

本開示の他の態様は、本明細書に記載のＡＡＶを含む組成物であって、組成物が薬学的に許容される製剤である、組成物に関する。いくつかの実施形態では、製剤は、哺乳類への投与のために構成される。いくつかの実施形態では、製剤は、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、自己細胞移動、または同種異系細胞移動を介して哺乳類に投与するために構成される。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される製剤は、賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、賦形剤は、担体、アジュバント、及びビヒクル、またはそれらの組み合わせから選択される。

【0034】

本開示のさらに他の態様は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の組換え調製のためのパッケージングシステムであって、パッケージングシステムが１つ以上のＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードするＲｅｐヌクレオチド配列と、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドの１つ以上のＡＡＶ Ｃａｐタンパク質をコードするＣａｐヌクレオチド配列と、本明細書に記載の補正ゲノムとを含むパッケージングシステムであって、パッケージングシステムがキャプシド中に補正ゲノムを封入してアデノ随伴ウイルスを形成するために細胞内で作用する、パッケージングシステムに関する。いくつかの実施形態では、パッケージングシステムは、Ｒｅｐヌクレオチド配列、及びＣａｐヌクレオチド配列を含む第１のベクター、及び補正ゲノムを含む第２のベクターを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、Ｃｌａｄｅ Ｆ ＶＰ１、Ｃｌａｄｅ Ｆ ＶＰ２、及びＣｌａｄｅ Ｆ ＶＰ３から選択される少なくとも１つのタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、Ｃｌａｄｅ Ｆ ＶＰ１、Ｃｌａｄｅ Ｆ ＶＰ２、及びＣｌａｄｅ Ｆ ＶＰ３から選択される少なくとも２つのタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、Ｃｌａｄｅ Ｆ ＶＰ１、Ｃｌａｄｅ Ｆ ＶＰ２、及びＣｌａｄｅ Ｆ ＶＰ３タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、本明細書に記載の任意のＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドである。いくつかの実施形態では、Ｒｅｐヌクレオチド配列は、ＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、コードされるＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質は、Ｒｅｐ７８／６８またはＲｅｐ６８／５２の少なくとも１つである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４０のＡＡＶ２ Ｒｅｐヌクレオチド配列と最小パーセント配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、最小パーセント配列同一性が、ＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列の長さにわたって少なくとも７０％である。提供されるパッケージングシステムのいずれか１つのいくつかの実施形態では、パッケージングシステムは、第３のベクターをさらに含み、第３のベクターは、ヘルパーウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ヘルパーウイルスベクターは、独立した第３のベクターである。いくつかの実施形態では、ヘルパーウイルスベクターは、第１のベクターと一体である。いくつかの実施形態では、ヘルパーウイルスベクターは第２のベクターと一体である。いくつかの実施形態では、第３のベクターは、ヘルパーウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ヘルパーウイルスは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を含む）、ワクシニアウイルス、及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、ヘルパーウイルスはアデノウイルスである。いくつかの実施形態では、アデノウイルスゲノムは、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、及びＶＡからなる群から選択される１つ以上のアデノウイルスＲＮＡ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ヘルパーウイルスはＨＳＶである。いくつかの実施形態では、ＨＳＶゲノムは、ＵＬ５／８／５２、ＩＣＰＯ、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、及びＵＬ３０／ＵＬ４２からなる群から選択される１つ以上のＨＳＶ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、第１のベクター及び第３のベクターは、第１のトランスフェクションプラスミド内に含まれる。いくつかの実施形態では、第２のベクター及び第３のベクターのヌクレオチドは、第２のトランスフェクションプラスミド内に含まれる。いくつかの実施形態では、第１のベクター及び第３のベクターのヌクレオチドは、組換えヘルパーウイルスにクローニングされる。いくつかの実施形態では、第２のベクター及び第３のベクターのヌクレオチドは、組換えヘルパーウイルスにクローニングされる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ９、ＡＡＶＦ１、ＡＡＶＦ２、ＡＡＶＦ３、ＡＡＶＦ４、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶＦ６、ＡＡＶＦ７、ＡＡＶＦ８、ＡＡＶＦ９、ＡＡＶＦ１１、ＡＡＶＦ１２、ＡＡＶＦ１３、ＡＡＶＦ１４、ＡＡＶＦ１５、ＡＡＶＦ１６、ＡＡＶＦ１７、ＡＡＶＨＵ３１、及びＡＡＶＨＵ３２からなる群より選択されるＣｌａｄｅ Ｆ ＡＡＶのキャプシドである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のパッケージングシステムのいずれかがキット内に含まれる。

【0035】

本開示の他の態様は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の組換え調製のための方法であって、該方法が、ＡＡＶを形成するキャプシド中に該補正ゲノムを封入するように作用する条件下で、本明細書中に記載されるようなパッケージングシステムで細胞をトランスフェクトするかまたは形質導入することを含む。

【0036】

他の態様では、本開示は、哺乳類ゲノムを含む細胞を本明細書に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）で形質導入することを含む、哺乳類ゲノムの標的遺伝子座を編集する方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳類幹細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、結合組織（血液を含む）、筋肉組織、神経組織、及び上皮組織からなる群から選択される組織由来である。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、肺、心臓、肝臓、腎臓、筋肉、脳、眼、乳房、骨、及び軟骨からなる群から選択される器官由来である。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は幹細胞である。いくつかの実施形態では、幹細胞は、造血幹細胞、臍帯血幹細胞、または末梢血幹細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、筋芽細胞、内皮細胞、肝細胞、線維芽細胞、乳房細胞、リンパ球、または網膜細胞である。本開示の他の態様は、本明細書に記載の任意の方法によって得ることができる細胞に関する。

【0037】

本開示の別の態様は、哺乳類ゲノムの標的遺伝子座を編集するための方法であって、該方法が、（ａ）哺乳類細胞から哺乳類細胞を得ることと、（ｂ）エクスビボで哺乳類細胞を培養してエクスビボ培養物を形成することと、（ｃ）形質導入された哺乳類細胞を形成するためにエクスビボ培養において本明細書に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）で哺乳類細胞を形質導入することと、（ｄ）形質導入された哺乳類細胞を哺乳類に投与することとを含む、方法に関する。

【0038】

他の態様では、本開示は、哺乳類ゲノムの標的遺伝子座を編集する方法であって、該方法が、（ａ）第１の哺乳類から哺乳類細胞を得ることと、（ｂ）エクスビボで哺乳類細胞を培養してエクスビボ培養物を形成することと、（ｃ）形質導入された哺乳類細胞を形成するために、エクスビボ培養物中に本明細書に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）で哺乳類細胞を形質導入することと、（ｄ）形質導入された哺乳類細胞を第２の哺乳類に投与することとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、第１哺乳類、及び第２哺乳類は同じ種である。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、結合組織（血液を含む）、筋肉組織、神経組織、及び上皮組織からなる群から選択される組織に由来する。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、肺、心臓、肝臓、腎臓、筋肉、脳、眼、乳房、骨、及び軟骨からなる群から選択される器官由来である。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は幹細胞である。いくつかの実施形態では、幹細胞は、造血幹細胞、臍帯血幹細胞、または末梢血幹細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞はＣＤ３４＋細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、筋芽細胞、内皮細胞、肝細胞、線維芽細胞、乳房細胞、リンパ球、または網膜細胞である。

【0039】

本開示の別の態様は、哺乳類ゲノムの標的遺伝子座を編集するための方法であって、該方法が、本明細書に記載のＡＡＶまたは本明細書に記載の組成物を、インビボで、ＡＡＶで哺乳類の細胞に形質導入するのに有効な量で哺乳類に投与することを含む、方法を提供する。

【0040】

提供される方法のいずれか１つのいくつかの実施形態では、ＡＡＶは、外因性ヌクレアーゼ、または外因性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の同時形質導入または同時投与なしに、形質導入または投与される。

【0041】

提供される方法のいずれか１つのいくつかの実施形態では、ＡＡＶは、編集エレメントを哺乳類染色体の標的遺伝子座に組み込むための少なくとも約１％の染色体組み込み効率を有する。いくつかの実施形態では、編集エレメントを哺乳類染色体の標的遺伝子座に組み込むために、ＡＡＶの染色体組み込み効率は少なくとも約２％、３％、４％または５％である。いくつかの実施形態では、補正ゲノムの編集エレメントは、哺乳類細胞の少なくとも１０％、２０％、４０％、または５０％の染色体組み込み効率で哺乳類染色体の標的遺伝子座に組み込まれる。いくつかの実施形態では、補正ゲノムの編集エレメントは、哺乳類細胞の１０％〜７０％、２０％〜７０％、４０％〜７０％、または５０％〜７０％の範囲の染色体組み込み効率で哺乳類染色体の標的遺伝子座に組み込まれる。

【0042】

提供される方法のいずれか１つのいくつかの実施形態では、ＡＡＶは、哺乳類の染色体の標的遺伝子座に組み込まれた編集エレメントを含む対立遺伝子について少なくとも約１０％の細胞集団における対立遺伝子頻度によってさらに特徴づけられる染色体組み込み効率を有する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、哺乳類染色体の標的遺伝子座に組み込まれた編集エレメントを含む対立遺伝子について少なくとも約５０％の細胞集団における対立遺伝子頻度によってさらに特徴づけられる染色体組み込み効率を有する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、哺乳類染色体の標的遺伝子座に組み込まれた編集エレメントを含む対立遺伝子について少なくとも約７５％の細胞集団における対立遺伝子頻度によってさらに特徴づけられる染色体組み込み効率を有する。いくつかの実施形態では、細胞集団における対立遺伝子頻度は、インビトロでの細胞集団における対立遺伝子頻度である。

【0043】

本開示の他の態様は、トランスジェニック非ヒト動物を作製する方法であって、該方法が、非ヒト動物に本明細書に記載のＡＡＶまたは本明細書に記載の組成物を投与することを含むか、非ヒト動物細胞を本明細書に記載のＡＡＶまたは本明細書に記載の組成物で形質導入し、宿主非ヒト動物からトランスジェニック非ヒト動物を生成するのに十分な条件下で細胞を非ヒト動物に移植すること（例えば、移植された細胞が胚の一部を形成するかまたは胚の一部となることを可能にすることにより、宿主においてトランスジェニック非ヒト動物へと発達する）を含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物を別の非ヒト動物と交配させて、さらなるトランスジェニック非ヒト動物を作製する。いくつかの実施形態では、非ヒト動物細胞は、非ヒト動物の接合体または胚に由来する。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、または霊長類である。

【0044】

本開示の他の態様は、本明細書に記載の方法によって得ることができるトランスジェニック非ヒト動物、例えば上述の方法に関する。いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、または霊長類である。

【0045】

本開示のさらに他の態様は、本明細書に記載のトランスジェニック非ヒト動物に由来する組織に関する。いくつかの実施形態では、組織は、結合組織（血液を含む）、筋肉組織、神経組織、内皮組織、及び上皮組織からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、組織は、肺、心臓、肝臓、腎臓、筋肉、脳、眼、乳房、骨、及び軟骨からなる群から選択される器官由来である。

【0046】

本開示の他の態様は、本明細書に記載のトランスジェニック非ヒト動物に由来する細胞に関する。いくつかの実施形態では、細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ３４＋細胞、筋芽細胞、内皮細胞、肝細胞、線維芽細胞、乳房細胞、リンパ球、または網膜細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は誘導性多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、結合組織（血液を含む）、筋肉組織、神経組織、内皮組織、及び上皮組織からなる群から選択される組織由来である。いくつかの実施形態では、細胞は、肺、心臓、肝臓、腎臓、筋肉、脳、眼、乳房、骨、及び軟骨からなる群から選択される器官由来である。いくつかの実施形態では、細胞は幹細胞である。いくつかの実施形態では、幹細胞は、造血幹細胞、臍帯血幹細胞、または末梢血幹細胞である。

【0047】

特定の実施形態によれば、細胞のゲノムを編集するための、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）Ｃｌａｄｅ Ｆベクター（例えば、Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドに封入された補正ゲノムを含む複製欠損ＡＡＶ）またはＡＡＶベクターバリアント（例えば、ＡＡＶ９キャプシドに対するキャプシドバリアントを含む複製欠損ＡＡＶ）が提供される。特定の実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは、１つ以上のＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたは１つ以上のキャプシドバリアントと（ＡＡＶ９キャプシドと比較して）、ゲノムの標的遺伝子座（本明細書中では標的部位とも呼ばれる）に組み込まれる１つ以上の治療用ヌクレオチド配列を含む編集エレメント（本明細書では標的カセットとも呼ばれる）と、編集エレメント（標的カセット）に隣接して、標的遺伝子座（標的部位）の上流にある領域と相同性を有する５’相同アームポリヌクレオチド配列と、編集エレメント（標的カセット）に隣接して、標的遺伝子座（標的部位）の下流にある領域と相同性を有する、３’相同アームポリヌクレオチド配列とを含み得る。編集エレメント（標的カセット）は、本明細書に記載の逆位末端反復（ＩＴＲ）を含み、本明細書に記載されているように、補正ゲノム内に含まれていてもよい。特定の実施形態では、１つ以上のＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアントは、本明細書に記載のＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアントのいずれかであり得る。特定の実施形態では、１つ以上のＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアントが、ＡＡＶＦ７（配列番号８）、ＡＡＶＦ１２（配列番号１２）、ＡＡＶＦ１５（配列番号１６）、ＡＡＶＦ１７（配列番号１３）、バリアント、断片、変異体、及びそれらの任意の組み合わせの群から選択されるポリペプチド配列を含み得る。特定の実施形態では、１つ以上のＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたは１つ以上のキャプシドバリアントが、ＡＡＶＦ５（配列番号１１）、ＡＡＶＦ７（配列番号８）、ＡＡＶＦ１２（配列番号１２）、ＡＡＶＦ１５（配列番号１６）、ＡＡＶＦ１７（配列番号１３）、ＡＡＶＦ９（配列番号１０）、ＡＡＶＦ１６（配列番号１７）、バリアント、断片、変異体、及びそれらの任意の組み合わせの群から選択されるポリペプチド配列を含み得る。特定の実施形態では、１つ以上のＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアントが、ＡＡＶＦ７（配列番号８）、ＡＡＶＦ１２（配列番号１２）、ＡＡＶＦ１５（配列番号１６）、ＡＡＶＦ１７（配列番号１３）、バリアント、断片、変異体、及びそれらの任意の組み合わせの群から選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも９５％のパーセント配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。特定の実施形態では、１つ以上のＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアントが、ＡＡＶＦ５（配列番号１１）、ＡＡＶＦ７（配列番号８）、ＡＡＶＦ１２（配列番号１２）、ＡＡＶＦ１５（配列番号１６）、ＡＡＶＦ１７（配列番号１３）、ＡＡＶＦ９（配列番号１０）、ＡＡＶＦ１６（配列番号１７）、バリアント、断片、変異体、及びそれらの任意の組み合わせの群から選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも９５％のパーセント配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。特定の実施形態では、標的遺伝子座（標的部位）はセーフハーバー部位であり得る。特定の実施形態では、セーフハーバー部位は、第１９染色体上のＡＡＶＳ１遺伝子座であり得る。特定の実施形態では、標的遺伝子座（標的部位）は、本明細書に記載の疾患状態に関連する遺伝子座であり得る。特定の実施形態では、細胞は幹細胞であってもよい。特定の実施形態において、幹細胞は、造血幹細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、または間充織幹細胞であり得る。

【0048】

特定の実施形態によれば、細胞のゲノムを編集する方法が提供される。特定の実施形態では、細胞のゲノムを編集する方法は、細胞を１つ以上のＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆベクター（例えば、Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドに封入された補正ゲノムを含む複製欠損ＡＡＶ）またはＡＡＶベクターバリアント（例えば、ＡＡＶ９キャプシドに対するキャプシドバリアントを含む複製欠損ＡＡＶ）を含み得る。特定の実施形態では、形質導入は、さらなる外因性ヌクレアーゼなしに実施され得る。特定の実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは、１つ以上のＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアントと（ＡＡＶ９キャプシドと比較して）、ゲノムの標的遺伝子座（標的部位）に組み込まれる１つ以上の治療用ヌクレオチド配列を含む編集エレメント（標的カセット）と、編集エレメント（標的カセット）に隣接して、標的遺伝子座（標的部位）の上流にある領域と相同性を有する５’相同アームポリヌクレオチド配列と、編集エレメント（標的カセット）に隣接して、標的遺伝子座（標的部位）の下流にある領域と相同性を有する、３’相同アームポリヌクレオチド配列とを含み得る。編集エレメント（標的カセット）は、本明細書に記載のＩＴＲを含む、本明細書に記載の補正ゲノム内に含み得る。特定の実施形態では、１つ以上のＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアントが、ＡＡＶＦ７（配列番号８）、ＡＡＶＦ１２（配列番号１２）、ＡＡＶＦ１５（配列番号１６）、ＡＡＶＦ１７（配列番号１３）、バリアント、断片、変異体、及びそれらの任意の組み合わせの群から選択されるポリペプチド配列を含み得る。特定の実施形態では、１つ以上のＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアントが、ＡＡＶＦ５（配列番号１１）、ＡＡＶＦ７（配列番号８）、ＡＡＶＦ１２（配列番号１２）、ＡＡＶＦ１５（配列番号１６）、ＡＡＶＦ１７（配列番号１３）、ＡＡＶＦ９（配列番号１０）、ＡＡＶＦ１６（配列番号１７）、バリアント、断片、変異体、及びそれらの組み合わせの群から選択されるポリペプチド配列を含み得る。特定の実施形態では、１つ以上のＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアントが、ＡＡＶＦ７（配列番号８）、ＡＡＶＦ１２（配列番号１２）、ＡＡＶＦ１５（配列番号１６）、ＡＡＶＦ１７（配列番号１３）、バリアント、断片、変異体、及びそれらの任意の組み合わせの群から選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも９５％のパーセント配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。特定の実施形態では、１つ以上のＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアントが、ＡＡＶＦ５（配列番号１１）、ＡＡＶＦ７（配列番号８）、ＡＡＶＦ１２（配列番号１２）、ＡＡＶＦ１５（配列番号１６）、ＡＡＶＦ１７（配列番号１３）、ＡＡＶＦ９（配列番号１０）、ＡＡＶＦ１６（配列番号１７）、バリアント、断片、変異体、及びそれらの任意の組み合わせの群から選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも９５％のパーセント配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。特定の実施形態において、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは、１つ以上の治療用ヌクレオチド配列のためのプロモーターを含まない。特定の実施形態では、標的遺伝子座（標的部位）はセーフハーバー部位であり得る。特定の実施形態では、セーフハーバー部位は、第１９染色体上のＡＡＶＳ１遺伝子座であり得る。特定の実施形態では、標的遺伝子座（標的部位）は、本明細書に記載の疾患状態に関連する遺伝子座であり得る。特定の実施形態では、細胞は幹細胞であってもよい。特定の実施形態において、幹細胞は、造血幹細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、または間充織幹細胞であり得る。

【0049】

特定の実施形態によれば、対象の細胞のゲノムを編集することによって対象の疾患または障害を治療する方法が提供される。特定の実施形態では、対象の細胞のゲノムを編集することによって対象の疾患または障害を治療する方法は、本明細書に記載のＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントで対象の細胞を形質導入し、形質導入された細胞は、疾患または障害を治療する。特定の実施形態では、細胞の形質導入は、さらなる外因性ヌクレアーゼなしに実施され得る。特定の実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは、１つ以上のＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアントと（ＡＡＶ９キャプシドと比較して）、ゲノムの標的遺伝子座（標的部位）に組み込まれる１つ以上の治療用ヌクレオチド配列を含む編集エレメント（標的カセット）と、編集エレメント（標的カセット）に隣接して、標的遺伝子座（標的部位）の上流にある領域と相同性を有する５’相同アームポリヌクレオチド配列と、編集エレメント（標的カセット）に隣接して、標的遺伝子座（標的部位）の下流にある領域と相同性を有する、３’相同アームポリヌクレオチド配列とを含み得る。編集エレメント（標的カセット）は、本明細書に記載のＩＴＲを含む、本明細書に記載の補正ゲノム内に含み得る。特定の実施形態では、Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアントが、ＡＡＶＦ７（配列番号８）、ＡＡＶＦ１２（配列番号１２）、ＡＡＶＦ１５（配列番号１６）、ＡＡＶＦ１７（配列番号１３）、バリアント、断片、変異体、及びそれらの任意の組み合わせを含み得る。特定の実施形態では、１つ以上のＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアントが、ＡＡＶＦ５（配列番号１１）、ＡＡＶＦ７（配列番号８）、ＡＡＶＦ１２（配列番号１２）、ＡＡＶＦ１５（配列番号１６）、ＡＡＶＦ１７（配列番号１３）、ＡＡＶＦ９（配列番号１０）、ＡＡＶＦ１６（配列番号１７）、バリアント、断片、変異体、及びそれらの組み合わせの群から選択されるポリペプチド配列を含み得る。特定の実施形態では、１つ以上のＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアントが、ＡＡＶＦ７（配列番号８）、ＡＡＶＦ１２（配列番号１２）、ＡＡＶＦ１５（配列番号１６）、ＡＡＶＦ１７（配列番号１３）、バリアント、断片、変異体、及びそれらの任意の組み合わせの群から選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも９５％のパーセント配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。特定の実施形態では、１つ以上のＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアントが、ＡＡＶＦ５（配列番号１１）、ＡＡＶＦ７（配列番号８）、ＡＡＶＦ１２（配列番号１２）、ＡＡＶＦ１５（配列番号１６）、ＡＡＶＦ１７（配列番号１３）、ＡＡＶＦ９（配列番号１０）、ＡＡＶＦ１６（配列番号１７）、バリアント、断片、変異体、及びそれらの任意の組み合わせの群から選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも９５％のパーセント配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。特定の実施形態において、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは、１つ以上の治療用ヌクレオチド配列のためのプロモーターを含まない。特定の実施形態では、標的遺伝子座（標的部位）はセーフハーバー部位であり得る。特定の実施形態では、セーフハーバー部位は、第１９染色体上のＡＡＶＳ１遺伝子座であり得る。特定の実施形態では、標的遺伝子座（標的部位）は、本明細書に記載の疾患状態に関連する遺伝子座であり得る。特定の実施形態では、細胞は幹細胞であってもよい。特定の実施形態において、幹細胞は、造血幹細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、または間充織幹細胞であり得る。特定の実施形態では、疾患または障害は、細胞ゲノムにおける１つ以上の変異によって引き起こされ得る。特定の実施形態では、疾患または障害は、遺伝性代謝疾患、リソソーム蓄積症、ムコ多糖症、免疫不全疾患、及びヘモグロビン異常症、及び感染症から選択され得る。

【0050】

本明細書に記載のＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントを対象に直接投与することによって、インビボゲノム編集によって対象の疾患または障害を治療する方法も本明細書に開示される。特定の実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントを対象に直接投与することによって、対象の細胞のインビボゲノム編集によって対象の疾患または障害を治療する方法が開示される。特定の実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは、１つ以上のＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアントと（ＡＡＶ９キャプシドと比較して）、ゲノムの標的遺伝子座（標的部位）に組み込まれる１つ以上の治療用ヌクレオチド配列を含む編集エレメント（標的カセット）と、編集エレメント（標的カセット）に隣接して、標的遺伝子座（標的部位）の上流にある領域と相同性を有する５’相同アームポリヌクレオチド配列と、編集エレメント（標的カセット）に隣接して、標的遺伝子座（標的部位）の下流にある領域と相同性を有する、３’相同アームポリヌクレオチド配列とを含んでも良く、該ベクターは前記対象の細胞に形質導入し、該１つ以上の治療用ヌクレオチド配列を前記細胞のゲノムに組み込む。編集エレメント（標的カセット）は、本明細書に記載のＩＴＲを含む、本明細書に記載の補正ゲノム内に含み得る。特定の実施形態では、１つ以上のＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアントは、ＡＡＶＦ１（配列番号２）、ＡＡＶＦ２（配列番号３）、ＡＡＶＦ１１（配列番号４）、ＡＡＶＦ３（配列番号５）、ＡＡＶＦ４（配列番号６）、ＡＡＶＦ６（配列番号７）、ＡＡＶＦ７（配列番号８）、ＡＡＶＦ８（配列番号９）、ＡＡＶＦ９（配列番号１０）、ＡＡＶＦ５（配列番号１１）、ＡＡＶＦ１２（配列番号１２）、ＡＡＶＦ１７（配列番号１３）、ＡＡＶＦ１３（配列番号１４）、ＡＡＶＦ１４（配列番号１５）、ＡＡＶＦ１５（配列番号１６）、ＡＡＶＦ１６（配列番号１７）、バリアント、断片、変異体、及びそれらの任意の組み合わせを含む。特定の実施形態において、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは、１つ以上の治療用ヌクレオチド配列のためのプロモーターを含まない。特定の実施形態では、標的遺伝子座（標的部位）はセーフハーバー部位であり得る。特定の実施形態では、セーフハーバー部位は、第１９染色体上のＡＡＶＳ１遺伝子座であり得る。特定の実施形態では、標的遺伝子座（標的部位）は、本明細書に記載の疾患状態に関連する遺伝子座であり得る。特定の実施形態では、細胞は幹細胞であってもよい。特定の実施形態において、幹細胞は、造血幹細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、または間充織幹細胞であり得る。特定の実施形態では、疾患または障害は、細胞ゲノムにおける１つ以上の変異によって引き起こされ得る。特定の実施形態では、疾患または障害は、遺伝性代謝疾患、リソソーム蓄積症、ムコ多糖症、免疫不全疾患、及びヘモグロビン異常症、及び感染症から選択され得る。また、本明細書には、細胞のゲノムを編集するための１つ以上のＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントを含むキットが開示される。

【0051】

このアプリケーションには、カラーで実行される図面が少なくとも１つ含まれている。この申請書のカラー図面の写しは、要請に応じて、必要な手数料を支払って、オフィスによって提供される。

【図面の簡単な説明】

【0052】

【図1】ＡＡＶ９と比較してＣｌａｄｅ Ｆ ＡＡＶキャプシドバリアントポリペプチド配列のアライメントを示す。Ｃｌａｄｅ Ｆ ＡＡＶキャプシドバリアントポリヌクレオチド配列の対応するアライメントは、米国特許公開第２０１３００９６１８２Ａ１号の図１に提供されている。

【図2】塩基変化、アミノ酸変化、及びＶＰ１またはＶＰ３にあるかどうかを含む、各配列のキャプシドにおけるヌクレオチド変異のいくつかを列挙したチャートである。

【図3】ゲノム編集に使用された１組のドナーＩＴＲ−ＡＡＶＳ１−ＦＰベクター構築物の一部の模式図を示す。ＡＡＶベクターは、５’相同性及び３’相同性アーム、ならびに２Ａ配列、スプライスアクセプター配列、及びポリアデニル化配列を含む調節エレメントを含んでいた。導入遺伝子として黄色蛍光タンパク質（「ＹＦＰ」または「ＦＰ」）を用いた。ＡＡＶ２ ＩＴＲは相同アームに隣接し、ベクターゲノムはＡＡＶＦキャプシドにパッケージングされてＡＡＶＦ−ＡＡＶＳ１−ＦＰドナーベクターを形成した。重要なことに、ＦＰ遺伝子を含むベクターは、発現を駆動するプロモーターを含まない。ＦＰ遺伝子は、内因性染色体プロモーターの下流のＡＡＶＳ１に正確に組み込まれる場合にのみ発現される。

【図4】ＡＡＶＦベクターによって媒介される導入遺伝子組み込みの標的部位であった、標的化染色体ＡＡＶＳ１遺伝子座、及び編集されたＡＡＶＳ１遺伝子座の概略図を示す。上の図（図４Ａ）「野生型ＡＡＶＳ１遺伝子座」は、５’相同性アーム、及び３’相同性アームを含むが、導入遺伝子を含まない野生型ＡＡＶＳ１遺伝子座を示す。「ＯＵＴフォワードプライマー領域」プライマー、及び「ＯＵＴリバースプライマー領域」プライマーを用いた相同性領域の外側に位置するプライマーによる増幅は、約１．９ｋｂの長さの断片（「断片１」と表示されたラインを参照）を生じ、組み込まれた導入遺伝子を含まない。下図（図４Ｂ）、「編集ＡＡＶＳ１遺伝子座」は、５’相同性アーム、調節エレメント、組み込み導入遺伝子、及び３’相同性アームを含む編集されたＡＡＶＳ１遺伝子座を示す。「ＯＵＴフォワードプライマー領域」プライマー、及び「ＯＵＴリバースプライマー領域」プライマーを用いた相同性領域の外側に位置するプライマーによる増幅は、約３．０ｋｂの長さの断片を生じる（「断片２」と表示されたラインを参照）導入遺伝子を含む。「ＯＵＴフォワードプライマーＲｅｇｉｏｎ」プライマー、及び「Ｉｎリバースプライマー」を用いた５’接合領域（５’相同性アームと導入遺伝子との間の接合部）の増幅は、約１．７ｋｂの長さの断片を生じる（「断片３」）。「ＯＵＴリバースプライマーＲｅｇｉｏｎ」プライマー、及び「Ｉｎフォワードプライマー」を用いた３’接合領域（導入遺伝子と３’相同性アームとの間の接合部）を増幅すると、約１．２ｋｂの断片が生じる（「断片４」）。導入遺伝子が組み込まれていない場合、５’接合領域または３’接合領域の増幅時に結果物が存在しない。

【図5】形質導入の２４時間後のＫ５６２細胞におけるＹＦＰ発現のフローサイトメトリー分析からの代表的な散布図を示す。（Ａ）任意のベクターで形質導入しなかった細胞（非形質導入）、（Ｂ）５０，０００ＭＯＩ、（Ｃ）１００，０００ＭＯＩ、（Ｄ）２００，０００ＭＯＩ、及び（Ｅ）４００，０００ＭＯＩで細胞をＡＡＶＦ７ ＦＰベクターで様々な感染多重度で形質導入した。示されたデータは、代表サンプルからのものである。各散布図内の境界線上の事象は、これらの細胞において、内因性染色体プロモーターの下流のヒト１９番染色体のＡＡＶＳ１に正確に組み込まれたドナーＩＴＲ−ＡＡＶＳ１−ＦＰベクターからのプロモーターのないＦＰ遺伝子を示すＦＰ発現細胞を表す 。

【図6】形質導入７２時間後のＫ５６２細胞におけるＹＦＰ発現のフローサイトメトリー分析からの代表的な散布図を示す。（Ａ）任意のベクターで形質導入しなかった細胞（非形質導入）、（Ｂ）５０，０００ＭＯＩ、（Ｃ）１００，０００ＭＯＩ、（Ｄ）２００，０００ＭＯＩ、及び（Ｅ）４００，０００ＭＯＩで細胞をＡＡＶＦ７ ＦＰベクターで形質導入した。境界線の上の事象は、ドナーＩＴＲ−ＡＡＶＳ１−ＦＰベクター中のプロモーターのないＦＰ遺伝子の正確に標的化された組み込みを有する細胞を表す。

【図7】ＣＤ３４＋ Ｋ５６２白血病細胞におけるＡＡＶＳ１遺伝子座におけるプロモーターのないＹＦＰ導入遺伝子の標的化された組み込み後のＹＦＰ発現の平均パーセンテージを示す。（Ａ）５０，０００、１００，０００、１５０，０００、２００，０００、３００，０００、及び４００，０００のＭＯＩを有する細胞におけるＡＡＶＦ７ベクターによる形質導入の２４時間後のＹＦＰ発現を示す棒グラフ。（Ｂ）５０，０００、１００，０００、１５０，０００、２００，０００、及び４００，０００のＭＯＩを有する細胞におけるＡＡＶＦ７ベクターによる形質導入７２時間後のＹＦＰ発現を示す棒グラフ。各バーは、最大７つのサンプルからまとめられたデータを表す。

【図8】Ｋ５６２細胞におけるＡＡＶＳ１遺伝子座へのＹＦＰ導入遺伝子の標的組み込みのＰＣＲ確認を示す。Ａ）テンプレートなし、形質導入されていない、または１００，０００のＭＯＩでＡＡＶＦ７ ＦＰベクターで形質導入されたＫ５６２細胞由来の代表的サンプルから増幅されたＤＮＡを示すゲル。レーン１：ＤＮＡラダー、レーン２：テンプレート対照なし、レーン３：非形質導入対照、及びレーン４：ＡＡＶＦ７ ＦＰ形質導入Ｋ５６２。矢印は、ＦＰ組み込みＡＡＶＳ１〜３．１ｋｂ断片または非組み込みＡＡＶＳ１〜１．９ｋｂ断片のいずれかを指す。Ｂ）テンプレートなし、形質導入されていない、または１００，０００のＭＯＩを有するＡＡＶＦ７ ＦＰベクターで形質導入されたＫ５６２細胞由来の代表的サンプルから増幅されたＤＮＡを示すゲル。レーン１：ＤＮＡラダー、レーン２：テンプレート対照なし、レーン３：形質導入していない対照、レーン４：ＡＡＶＦ７ ＦＰベクターで形質導入したＫ５６２。矢印は、増幅されたＦＰ組み込みＡＡＶＳ１〜３．１ｋｂ断片または増幅された非組み込みＡＡＶＳ１〜１．９ｋｂ断片のいずれかを指す。

【図9】ＡＡＶＦ ＦＰベクターによる形質導入の１日後の標的化された組み込み後の初代ＣＤ３４＋細胞におけるＹＦＰ発現の代表的な散布図を示す。（Ａ）任意のベクターで形質導入されていない細胞（非形質導入）、（Ｂ）ＡＡＶＦ７ ＦＰベクターで形質導入された細胞、及び（Ｃ）ＡＡＶＦ１７ ＦＰベクターで形質導入された細胞。ＡＡＶＦ７またはＡＡＶＦ１７ベクターのいずれかで形質導入した細胞は、非形質導入細胞と比較して有意な量のＹＦＰ発現を示した（ＡとそれぞれＢ、及びＣを比較する）。（Ｂ）、及び（Ｃ）のＹＦＰ発現は、ＡＡＶＦベクターによって送達されたプロモーターのないＦＰ遺伝子が、染色体ＡＡＶＳ１座に正確に組み込まれたことを示す。

【図10】ＡＡＶＦ ＦＰベクターでの形質導入の４日後に標的化された組み込み後の初代ＣＤ３４＋細胞におけるＹＦＰ発現の代表的な散布図を示す。（Ａ）任意のベクターで形質導入されていない細胞（非形質導入）、（Ｂ）ＡＡＶＦ７ ＦＰベクターで形質導入された細胞、及び（Ｃ）ＡＡＶＦ１７ ＦＰベクターで形質導入された細胞。ＡＡＶＦ７またはＡＡＶＦ１７ ＦＰベクターで形質導入された細胞は、非形質導入細胞と比較して有意な量のＹＦＰ発現を示した（それぞれＢ及びＣを、Ａと比較する）、ＡＡＶＦベクターによって送達された遺伝子の正確な標的組み込みを示す。

【図11】代表的なサンプルからのＡＡＶＦ ＦＰベクターによる形質導入の１８日後の標的化された組み込み後の、初代ＣＤ３４＋細胞におけるＹＦＰ発現の代表的な散布図を示す。（Ａ）任意のベクターで形質導入されていない細胞（非形質導入）、（Ｂ）ＡＡＶＦ７ ＦＰベクターで形質導入された細胞、及び（Ｃ）ＡＡＶＦ１７ ＦＰベクターで形質導入された細胞。ＡＡＶＦ７またはＡＡＶＦ１７ ＦＰベクターで形質導入された細胞は、非形質導入細胞と比較して有意な量のＹＦＰ発現を示した（ＡとそれぞれＢ、及びＣを比較する）。

【図12】標的化された組み込み後の初代ＣＤ３４＋細胞におけるＹＦＰ発現を示す。（Ａ）非形質導入細胞、及び形質導入後４、１８、２０、及び３９日に、ＡＡＶＦ７ ＦＰベクターまたはＡＡＶＦ１７ ＦＰベクターのいずれかで形質導入された細胞に関するＹＦＰ陽性細胞のパーセンテージを示す表。（Ｂ）１００，０００のＭＯＩでＡＡＶＦ ＦＰ形質導入後４、１８、２０、及び３９日のＹＦＰを発現する初代ＣＤ３４＋細胞の頻度を示す折れ線グラフ。菱形の線は非形質導入細胞を表し、四角の線はＡＡＶＦ７ ＦＰベクターで形質導入された細胞を表し、三角形の線はＡＡＶＦ１７ ＦＰベクターで形質導入された細胞を表す。

【図13】初代ＣＤ３４＋細胞におけるＡＡＶＳ１遺伝子座への標的化された組み込みのＰＣＲ確認を示す。テンプレートなし、形質導入されていない、または１５０，０００のＭＯＩを有するＡＡＶＦ７ ＦＰベクターで形質導入された初代ＣＤ３４＋細胞の代表的サンプルから増幅されたＤＮＡを示すゲル。レーン１：ＤＮＡラダー、レーン２：テンプレート対照なし、レーン３：未形質転換対照、レーン４：ＤＮＡマーカー、及びレーン５：形質導入されたＡＡＶＦ７ ＦＰベクター。矢印は、５’接合領域の増幅産物を示すＦＰ組み込みＡＡＶＳ１（〜１．７ｋｂ断片）を指す。左のインセットは、レーン１にロードされたＤＮＡラダーを示す。

【図14】ＯＵＴフォワードプライマー領域から始まるＡＡＶＳ１遺伝子座におけるＹＦＰ遺伝子配列の標的組み込みの配列確認を示している。配列決定の結果は、ＹＦＰ遺伝子が存在し、ＡＡＶＳ１遺伝子座に正しく組み込まれていることを示している。

【図15】５’相同性アームの近くから始まるＡＡＶＳ１遺伝子座におけるＹＦＰ配列の標的化された組み込みの配列確認を示す。配列決定の結果は、ＹＦＰ遺伝子が存在し、ＡＡＶＳ１遺伝子座に組み込まれていることを示している。

【図16】調節エレメントの５’領域の近くから始まるＡＡＶＳ１遺伝子座におけるＹＦＰ配列の標的化された組み込みの配列確認を示す。配列決定の結果は、ＹＦＰ遺伝子が存在し、ＡＡＶＳ１遺伝子座に組み込まれていることを示している。

【図17】調節エレメントの３’領域付近で開始するＡＡＶＳ１遺伝子座におけるＹＦＰ配列の標的組み込みの配列確認を示す。配列決定の結果は、ＹＦＰ遺伝子が存在し、ＡＡＶＳ１遺伝子座に組み込まれていることを示している。

【図18】導入遺伝子の５’領域付近で開始するＡＡＶＳ１遺伝子座におけるＹＦＰ配列の標的化された組み込みの配列確認を示す。配列決定の結果は、ＹＦＰ遺伝子が存在し、ＡＡＶＳ１遺伝子座に組み込まれていることを示している。

【図19】「ＩＮリバースプライマー」領域の近くで開始するＡＡＶＳ１遺伝子座におけるＹＦＰ配列の標的化された組み込みの配列確認を示す。配列決定の結果は、ＹＦＰ遺伝子が存在し、ＡＡＶＳ１遺伝子座に組み込まれていることを示している。

【図20】実施例４の実験で実施されたステップの概略を示す。１００万個のヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞が得られ（ステップ１参照）、亜致死的に照射された免疫不全のＮＯＤ／ＳＣＩＤ成体マウスに注入された（ステップ２参照）。ＣＤ３４＋細胞を注射して２時間後、マウスにＡＡＶＦ−ルシフェラーゼベクター（すなわち、ＡＡＶＦ７−ルシフェラーゼベクターまたはＡＡＶＦ１７−ルシフェラーゼベクター）を注射した。２〜７日後、マウスにＡＡＶＦ−Ｖｅｎｕｓベクター（すなわち、ＡＡＶＦ７−ＶｅｎｕｓベクターまたはＡＡＶＦ１７−Ｖｅｎｕｓベクター）を注射した（ステップ３参照）。最後に、インビボでのルシフェラーゼ発現を注射の４週間後に測定し、Ｖｅｎｕｓの発現を注射の６週間後に定量した（ステップ４参照）。

【図21】代表的なレシピエントにおけるインビボ特異的ルシフェラーゼ発現を示す。図２１Ａは、ＡＡＶＦ−ルシフェラーゼベクターの静脈注射を受けたヒト臍帯血ＣＤ３４＋ＨＳＣで以前に異種移植された成体免疫不全マウスが、移植後の造血のすべての部位である脊椎、脾臓、臀部、及び長骨において特異的なルシフェラーゼ発現を示したことを示す。矢印は、脊椎、脾臓、肝臓、臀部、及び長骨におけるルシフェラーゼ発現を示す。肝臓及び脾臓のフラックスは４．０８ｅ９であり、尾部のフラックスは１．７４ｅ９であった。図２１Ｂは、ＡＡＶＦ−ルシフェラーゼベクターの静脈内注射を受けたヒト臍帯血ＣＤ３４＋ＨＳＣで以前に異種移植されていない成体免疫不全マウスは、高レベルの特異的ルシフェラーゼ発現を示さないことを示す。肝臓及び脾臓のフラックスは１．４７ｅ８であり、尾部のフラックスは２．２２ｅ８であった。

【図22-1】ＡＡＶＦ７−ＶｅｎｕｓまたはＡＡＶＦ１７−Ｖｅｎｕｓベクターの静脈内注射を受けたヒト臍帯血ＣＤ３４＋ＨＳＣで異種移植された成人免疫不全マウスにおけるＶｅｎｕｓ発現ヒトＣＤ３４＋またはＣＤ４５＋細胞のフローサイトメトリーデータを示すヒストグラムを示す。図２２Ａは、ＡＡＶＦ７−Ｖｅｎｕｓベクターを注射した異種移植マウスの大腿ＣＤ３４＋細胞からのフローサイトメトリーデータを示す。移植されたヒト造血細胞の９．２３％がＶｅｎｕｓを発現した。図２２Ｂは、ＡＡＶＦ７−Ｖｅｎｕｓベクターを注射した異種移植マウスの大腿ＣＤ４５＋細胞からのフローサイトメトリーデータを示す。移植されたヒト造血細胞の８．３５％がＶｅｎｕｓを発現した。図２２Ｃは、ＡＡＶＦ１７−Ｖｅｎｕｓベクターを注射した異種移植マウスの大腿ＣＤ３４＋細胞からのフローサイトメトリーデータを示す。移植されたヒト造血細胞の８．９２％がＶｅｎｕｓを発現した。図２２Ｄは、ＡＡＶＦ１７−Ｖｅｎｕｓベクターを注射した異種移植マウスの大腿ＣＤ４５＋細胞からのフローサイトメトリーデータを示す。移植されたヒト造血細胞の８．５９％がＶｅｎｕｓを発現した。

【図22-2】図２２Ｅは、ＡＡＶＦ７−Ｖｅｎｕｓベクターを注射した異種移植マウスの脊椎ＣＤ４５＋細胞からのフローサイトメトリーデータを示す。移植されたヒト造血細胞の１５．３％がＶｅｎｕｓを発現した。図２２Ｆは、ＡＡＶＦ１７−Ｖｅｎｕｓベクターを注射した異種移植マウスの脊椎ＣＤ４５＋細胞からのフローサイトメトリーデータを示す。移植されたヒト造血細胞の７０．２％がＶｅｎｕｓを発現した。図２２Ｇは、ＡＡＶＦ７−Ｖｅｎｕｓベクターを注入した異種移植マウスの脾臓ＣＤ４５＋細胞からのフローサイトメトリーデータを示す。移植されたヒト造血細胞の１０．３％がＶｅｎｕｓを発現した。図２２Ｈは、ＡＡＶＦ１７−Ｖｅｎｕｓベクターを注射した異種移植マウスの脾臓ＣＤ４５＋細胞からのフローサイトメトリーデータを示す。移植されたヒト造血細胞の９．９０％がＶｅｎｕｓを発現した。図２２の結果も表５に示す。

【図23】ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆウイルスと他のＡＡＶ株との関係の鳥瞰図を示す。この鳥瞰図は、ＡＡＶＦウイルスのキャプシド遺伝子のヌクレオチド配列相同性に基づく（Ｓｍｉｔｈら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１４ Ｓｅｐ；２２（９）：１６２５−３４）。

【図24】大きなＤＮＡインサートの挿入のための一本鎖ＡＡＶベクターゲノムのマップを示す。一本鎖ＡＡＶ２ゲノムは、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、相同性アーム、調節配列、及びプロモーターを持たないＶｅｎｕｓオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでいた。Ｖｅｎｕｓは蛍光レポータータンパク質である。Ｖｅｎｕｓ ＯＲＦを含むプロモーターを持たないＶｅｎｕｓは、スプライスアクセプター、及び２Ａ配列の下流にある。Ｖｅｎｕｓ ＯＦの後にポリアデニル化シグナルが続く。各ホモロジーアームは８００ｂｐ長であり、第１９染色体上のＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子のイントロン１を標的とする

【図25】ＡＡＶＳ１における編集部分の挿入部位の模式図を示す。Ｖｅｎｕｓのオープンリーディングフレームとスプライスアクセプター部位とに続く２Ａ配列からなる導入遺伝子カセットは、相同性アームによって両側に隣接している。相同性アームは、染色体１９上のＡＡＶＳ１座内のヒトＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子のイントロン１に相補的であり、２つの相同性アーム間の部位へのＶｅｎｕｓの挿入を媒介する。

【図26-1】ＡＡＶＦ媒介ゲノム編集が頑強であり、ヒトＣＤ３４＋細胞、及び細胞株において効率的な編集があることを示す、ヒト細胞株、及び初代細胞における組換えＡＡＶＦベクターによる大きなタンパク質コード配列の標的ゲノム挿入を示す。図２６Ａ：ＣＤ３４＋は、初代ヒトＣＤ３４＋サイトカインで刺激された末梢血幹細胞を表す。図２６Ｂ：Ｋ５６２は、ヒトＣＤ３４＋赤白血病細胞株である。図２６Ｃ：ＨｅｐＧ２はヒト肝細胞株である。Ｖｅｎｕｓ発現を示す細胞の割合（正確な挿入を示す）が、図２６Ａ〜Ｃに示されている。

【図26-2】図２６Ｄは、形質導入されていない細胞と比較した組換えＡＡＶＦウイルスによる形質導入後のＣＤ３４＋細胞の異なるＶｅｎｕｓ発現集団を示す代表的なフロープロファイルを示す。

【図26-3】図２６Ｅは、ＡＡＶＦ７、ＡＡＶＦ１２、ＡＡＶＦ１５、ＡＡＶＦ１７、及びＡＡＶ９の編集活性をＫ５６２赤白血病のＡＡＶ６、及びＡＡＶ８と比較して示す図である。図２６Ｆは、肝細胞株であるＨｅｐＧ２における同じウイルスの編集活性を示す。データは、編集とＶｅｎｕｓの表現を表示する細胞の割合を示す。

【図27】ヒト１９番染色体上のＡＡＶＳ１遺伝子座への大小のインサートの検出のための標的化された組み込みアッセイを示す。主題マップはプライマーの位置を示す。５’プライマーは染色体配列に相補的である。３’プライマーはインサートに特異的である。特異的なアンプリコンは、大きなインサートについて１．７ｋｂであり、小さなインサートについて１ｋｂであると予測される。スプリットプライマー対（染色体、及びインサート特異的）は、標的化された組み込みアッセイに特異性を与える。

【図28】ＡＡＶＦベクターが特定のゲノム部位でのヌクレオチド置換を媒介することを示している。図２８Ａは、ヒトＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子のイントロン１に１０ｂｐインサートを挿入するための一本鎖ＡＡＶベクターゲノムのマップを示す。このベクターは、Ｎｈｅ１制限酵素認識部位（ＧＣＴＡＧＣ）を含む野生型左相同性アーム（ＨＡ−Ｌ）をコードする。ＮＳ ｍｕｔベクターは、第１９染色体上の左相同性アームのＴＡ配列をＡＴに変更するように設計された。この変化は、Ｎｈｅ１部位のＳｐｈ１部位への変換をもたらし、配列をＧＣＴＡＧＣからＧＣＡＴＧＣに変更する。図２８Ｂは、染色体１９上のＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子のイントロン１の１０ｂｐインサートに位置する上流プライマー、及び上流プライマーを使用して左側ホモロジーアームを増幅したことを示す。上の図は、Ｋ５６２細胞由来のゲノムＤＮＡが野生型またはＮＳ Ｍｕｔ ＡＡＶＦベクターのいずれかを用いて編集されたときに生成される予想断片の相対的な大きさを示す。図２８Ｃは、野生型ＡＡＶＦベクターで編集したＫ５６２細胞のゲノムＤＮＡに由来する実際のアンプリコンを示すゲルである。レーンは、切断されていないアンプリコン（Ｕｎ）、Ｎｈｅ１（Ｎｈｅ１）、及びＳｐｈ１（Ｓｐｈ１）で切断されたアンプリコンを示す。図２８Ｄは、野生型またはＮＳ ＭｕｔゲノムのいずれかをコードするＡＡＶＦ７またはＡＡＶＦ１７ベクターで編集した後のＫ５６２ ＤＮＡのゲル電気泳動を示す。図２８Ｅは、野生型またはＮＳ ＭｕｔゲノムのいずれかをコードするＡＡＶＦ７またはＡＡＶＦ１７ベクターで編集した後の肝細胞癌細胞株、ＨｅｐＧ２のゲル電気泳動を示す。

【図29】ＡＡＶＦ７、及びＡＡＶＦ１７野生型またはＮＳ Ｍｕｔベクターで編集した細胞からのＤＮＡの配列分析を示す。

【図30】分裂細胞、及び非分裂細胞の両方においてＡＡＶＦベクターが編集を媒介すること、及びＡＡＶＦ媒介遺伝子編集がＤＮＡ合成を必要としないことを示す表である。この図は、初代ヒトＣＤ３４＋細胞の分裂、及び非分裂サブセットにおけるＶｅｎｕｓを発現する編集細胞の頻度を示す。Ｖｅｎｕｓ陽性であり、ＢｒｄＵ陽性または陰性であったすべてのＣＤ３４＋細胞の割合を、フローサイトメトリーによって決定した。ＢｒｄＵ陽性細胞は分裂細胞を表し、ＢｒｄＵ陰性細胞は非分裂細胞を表す。

【図31-1】全身送達されたＡＡＶＦベクターによるインビボでの生着されたヒト造血幹細胞の効率的な編集を示す。図３１Ａは、実験設計図を示す。免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにヒト臍帯血ＣＤ３４＋造血幹細胞を移植した。細胞をＡＡＶＦ１７−Ｖｅｎｕｓの静脈内注射の前に７週間生着させた。造血細胞をＡＡＶＦ注射の１２．５週間後に異種移植マウスの脊髄、及び大腿骨髄、及び脾臓から採取した。Ｖｅｎｕｓ発現のための多色フローサイトメトリーならびにヒト特異的表面マーカーの存在によって細胞を分析した。具体的には、Ｖｅｎｕｓ発現は、原始ＣＤ３４＋ヒト造血幹／前駆細胞、ＣＤ４５＋ヒト分化単核造血細胞、及び赤血球系統のグリコホリンＡ＋細胞で分析した。

【図31-2】図３１Ｂは、ＣＤ３４＋前駆細胞からグリコホリンＡ＋赤血球へのヒト赤血球系統の分化経路の概略図を示す。図３１Ｃは、移植の２０週間後の異種移植マウスの骨髄細胞、及び脾臓細胞における長期生着ヒト細胞のフローサイトメトリープロファイルを示す。細胞は、編集のマーカーであるＶｅｎｕｓの発現、及び特異的ヒト細胞表面マーカーの両方について分析した。

【図32】ヒト臍帯血ＣＤ３４＋造血幹／前駆細胞を異種移植した免疫不全マウスへのＡＡＶＦベクターの静脈注射後のインビボデータの要約である。Ｖｅｎｕｓ発現は、インビボで移植されたヒト造血幹細胞、及びその子孫におけるヒトＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子のイントロン１へのプロモーターを持たないＶｅｎｕｓカセットの標的挿入を反映する。図３２Ｂは、図３２Ａのデータの要約である。図３２Ａ、及びＢは、編集が長期的であり、その編集が安定して継承され（インサートが分化した子孫細胞において効率的に発現される）、インビボ編集がエクスビボ形質導入よりもずっと効率的であり得、そして編集の子孫ＣＤ３４＋細胞はＶｅｎｕｓ発現を長期間保持する。

【図33】は、初代ヒトサイトカインで刺激された末梢血ＣＤ３４＋細胞（ＰＢＳＣ）、及びＨｅｐＧ２ヒト肝細胞株であるＫ５６２赤白血病細胞株におけるプロモーターのないＳＡ／２Ａ ｖｅｎｕｓ ＯＲＦの標的化染色体挿入の配列分析を示す。部位特異的に組み込まれた配列は、染色体特異的プライマー、及びインサート特異的プライマーを用いて増幅された。増幅産物をＴＯＰＯ−ＴＡベクターにクローニングし、Ｓａｎｇｅｒ配列決定を用いて配列決定した。

【図34】初代ヒトサイトカインで刺激された末梢血ＣＤ３４＋細胞、及びＨｅｐＧ２ヒト肝細胞株における１０ｂｐインサート断片の標的化染色体挿入の配列分析を示す。部位特異的に組み込まれた配列は、染色体特異的プライマー、及びインサート特異的プライマーを用いて増幅された。増幅産物をＴＯＰＯ−ＴＡベクターにクローニングし、Ｓａｎｇｅｒ配列決定を用いて配列決定した。

【図35】ＡＡＶＦは、ＡＡＶＳ１−ＣＤ３４＋細胞への小さなインサートの組み込みを標的とすることを示している。

【図36】ＨｅｐＧ２（Ｈｅｐａｔｏｍａ）細胞株におけるプロモーターのないＶｅｎｕｓ、及びＲＦＬＰのＡＡＶ標的化を示す。

【図37】ソートされた総集団、Ｖｅｎｕｓ陽性及びＶｅｎｕｓ陰性集団のＣＤ３４及びｇｌｙｃｏＡ陽性細胞、Ｖｅｎｕｓ陰性集団のＣＤ３４／ＧｌｙｃｏＡ陽性細胞のバックゲーティング、ならびにｇｌｙｃｏＡ陽性及びＣＤ３４陽性集団を示す、代表的な大腿骨骨髄フローサイトメトリーグラフを示す。

【図38】ソートされた総集団、Ｖｅｎｕｓ陽性及びＶｅｎｕｓ陰性集団のＣＤ３４及びｇｌｙｃｏＡ陽性細胞、Ｖｅｎｕｓ陰性集団のＣＤ３４／ＧｌｙｃｏＡ陽性細胞のバックゲーティング、ならびにｇｌｙｃｏＡ陽性及びＣＤ３４陽性集団を示す、代表的な脾臓フローサイトメトリーグラフを示す。

【図39】ＡＡＶベクターの相対的形質導入対編集効率を決定するために使用されるＣＢＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ、及びＡＡＳ１−Ｖｅｎｕｓベクターゲノムのマップを示す。

【図40-1】ヒトＣＤ３４＋臍帯血細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙ（図４０Ａ）発現のフローサイトメトリープロファイルを示す。

【図40-2】ヒトＣＤ３４＋臍帯血細胞におけるＶｅｎｕｓ（図４０Ｂ）発現のフローサイトメトリープロファイルを示す。

【図40-3】図４０Ｃは、形質導入４８時間後のＣＤ３４＋細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙ、及びＶｅｎｕｓ発現の定量を示す。

【図40-4】図４０ＤはＶｅｎｕｓとｍＣｈｅｒｒｙの相対的発現（編集比）の比較を示す。バーは、ｍＣｈｅｒｒｙを発現する細胞と対応するキャプシドとの比として、Ｖｅｎｕｓを発現する細胞の割合の比を示す。黒の水平バーは１の比を示し、これはＶｅｎｕｓ：ｍＣｈｅｒｒｙの発現の同等の効率を示す。

【発明を実施するための形態】

【0053】

本発明の特定の実施形態を、具体的な実施例、順序、及び図面を用いて詳細に説明する。列挙された実施形態は、本発明が特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲内に含まれ得る全ての代替物、改変物、及び同等物を包含することが意図されているので、本発明をそれらの実施形態に限定することを意図するものではない。当業者であれば、本発明の実施に用いることができる本明細書に記載されたものと類似または同等の多くの方法、及び材料を認識するであろう。他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語、及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。すべての刊行物及び／または特許は、本明細書に完全に記載されるように参照により組み込まれる。

【0054】

本明細書では、外因性ヌクレアーゼの添加を必要とせずに相同組換えを用いて細胞のゲノムを精密に編集するために開発された、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）Ｃｌａｄｅ Ｆベクター（例えば、Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドに封入された補正ゲノムを含む複製欠損ＡＡＶ）、またはＡＡＶベクターバリアント（例えば、ＡＡＶ９キャプシドに対するキャプシドバリアントを含む複製欠損ＡＡＶ）、及びそれらに関連する方法が提供される。特定の実施形態では、ゲノム編集は、細胞のゲノム配列（例えば、哺乳類染色体の標的遺伝子座位）に挿入、欠失、改変、点変異またはそれらの任意の組み合わせを導入することを含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本明細書で提供されるＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアント、及びその関連方法は、１つ以上のヌクレオチド配列の組み込みの前に、外因性ヌクレアーゼの添加を必要とせずに、細胞ゲノムの特定の位置に１つ以上のヌクレオチド配列を挿入するために使用される。特定の実施形態では、本明細書で提供されるＣｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアント、及びそれらの関連方法を使用して、ヌクレオチド間結合を組み込む前に外因性ヌクレアーゼを添加する必要なく、細胞ゲノムの特定の位置にヌクレオチド間結合を挿入することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載のＣｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントで細胞を形質導入することにより対象の細胞のゲノムをエクスビボで編集し、さらに形質導入された細胞をさらに移植することによって、対象の疾患または障害を処置するために対象に投与することを含む。本明細書に記載のＣｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントを対象に直接投与することによるインビボゲノム編集によって、対象の疾患または障害を治療する方法もまた提供される。本明細書中に記載される１つ以上のＣｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントを含む細胞のゲノム編集のためのキットも本明細書に提供される。

【0055】

種々のＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、及びＡＡＶ８）を用いる相同組換えは以前に報告されている。しかし報告された効率は非常に低く、１００万個の細胞で約１個であった。以下の実施例１、及び２に示すように、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆベクター（またはＡＡＶベクターバリアント）を使用して、以前に見られたよりもはるかに高い頻度で特定の染色体位置に遺伝子挿入を再現可能に標的化した。例えば、標的ゲノム編集は、初代細胞をＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆベクター（またはＡＡＶベクターバリアント）で形質導入して、初代細胞のゲノムに驚くほど高い頻度で導入遺伝子を挿入し、約１０％の初代細胞を導入することによって達成された形質導入の６週間後に導入遺伝子の挿入を示した。この頻度は、以前に報告されたものよりも１，０００〜１００，０００倍高効率である（例えば、Ｋｈａｎ、２０１１参照）。以下の実施例１、及び２に示すように、初代ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞（Ｋ５６２）、及びＣＤ３４＋初代末梢血由来ヒト造血幹細胞（ＰＢＳＣ）を用いて高レベルのゲノム編集を達成した。標的遺伝子挿入は、短期（１日）、及び長期（約６週まで）のＣＤ３４＋培養物の両方で観察され、導入遺伝子発現、及び配列分析によって確認された。さらに、本明細書に記載のＣｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアント標的組換えは、関連する毒性のない特定のゲノム工学を可能にする。以下の実施例３に示すように、ＡＡＶＦ７またはＡＡＶＦ１７でシュードタイピングしたＡＡＶベクターの静脈内注射は、インビボでのヒトＣＤ３４＋造血幹細胞、及び前駆細胞の形質導入をもたらした。以下の実施例４に示すように、ゲノム編集は、小さい（〜１０ｂｐｓ）、及び大きなインサート（〜８００ｂｐｓ）の両方について、細胞培養、及びインビボの両方で達成され、配列決定によって標的遺伝子座に正確に組み込まれることが示された。以下の実施例５に示すように、種々のヒト細胞株（例えば、線維芽細胞、肝細胞癌細胞、乳癌細胞、網膜芽腫細胞、白血病細胞、及びＢ細胞）のゲノム編集が達成され、Ｃｌａｄｅ Ｆベクターが、線維芽細胞、肝細胞、乳房細胞、網膜細胞、及びＢ細胞のようないくつかの異なる細胞タイプにおいてゲノムの編集に使用され得ることが実証される。したがって、この技術は、特定の器官におけるエクスビボならびにインビボでの細胞の標的ゲノム編集に関し非常に大きな可能性を秘めている。

【0056】

本明細書では、細胞のゲノムを編集するための、Ｃｌａｄｅ Ｆベクター（例えば、Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドに包括された補正ゲノムを含む複製欠損ＡＡＶ）、またはＡＡＶベクターバリアント（例えば、ＡＡＶ９キャプシドに対するキャプシドバリアントを含む複製欠損ＡＡＶ）、及びそれらの方法が提供される（組換えにより、好ましくは外因性ヌクレアーゼを使用せずに）。特定の実施形態では、ゲノム編集は、ゲノムにおける１つ以上の変異の修正または挿入、ゲノムにおける１つ以上のヌクレオチドの欠失、調節配列を含むゲノム配列の改変、セーフハーバー部位またはゲノム中の他の特定の場所での導入遺伝子を含む１つ以上のヌクレオチドの挿入、またはそれらの任意の組み合わせを含むが、これに限定されない。特定の実施形態では、本明細書に記載のＣｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアント、及びその方法を用いるゲノム編集は、外因性ウイルス配列または他のフットプリントを挿入することなく、１つ以上のゲノム配列の正確な変化の誘導をもたらし得る。

【0057】

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載のキャプシドに封入された補正ゲノム、例えばＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドを含む複製欠損アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を提供する。いくつかの実施形態では、「補正ゲノム」は、追加の要素（例えば、５’逆方向末端反復（５’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列、またはその断片、及び３’逆方向反復配列（３’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列、またはその断片）とともに、本明細書に記載の編集エレメントを含む核酸分子である用語「補正ゲノム」は、必ずしも、標的遺伝子座に組み込まれた後に、補正ゲノムに含まれる編集エレメントがゲノム中の標的遺伝子座を「補正」することを必ずしも必要としないことが理解されるべきである（例えば、野生型配列による置換による変異）。したがって、いくつかの実施形態では、補正ゲノムは、標的遺伝子座に付加的なヌクレオチド配列を含み得る編集エレメント（例えば、標的遺伝子座は第１のオープンリーディングフレームの３’末端であり、編集エレメントは、標的遺伝子座に組み込まれた場合、融合タンパク質をコードする遺伝子を生成する、第２のオープンリーディングフレームである）を含み得る。

【0058】

いくつかの実施形態では、複製欠損アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、（ａ）哺乳類染色体の標的遺伝子座に組み込むためのヌクレオチド間結合またはヌクレオチド配列から選択される編集エレメントを含む補正ゲノムを含み、（ｂ）標的遺伝子座に対する哺乳類染色体の５’領域に対して相同性を有する編集エレメントの５’側にある５’相同アームヌクレオチド配列、及び（ｃ）編集の３’側にある３’相同アームヌクレオチド配列標的遺伝子座に対する哺乳類染色体の３’領域に対して相同性を有する。いくつかの実施形態では、複製欠損ＡＡＶは、哺乳類染色体の標的遺伝子座への組み込みのための編集エレメントヌクレオチド配列を含む補正ゲノムを含み、この補正ゲノムは、編集エレメントヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターの本質的な欠如を有する。いくつかの実施形態では、複製欠損ＡＡＶが補正ゲノムを含み、補正ゲノムが細胞内の哺乳類染色体の標的遺伝子座に組み込むためのヌクレオチド間結合またはヌクレオチド配列から選択される編集エレメントを含み、編集エレメントを細胞内の哺乳類染色体の標的遺伝子座に組み込むために、ＡＡＶが、少なくとも約１％（例えば、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％）の染色体組み込み効率を有する。いくつかの実施形態では、複製欠損ＡＡＶが補正ゲノムを含み、補正ゲノムが細胞内の哺乳類染色体の標的遺伝子座に組み込むためのヌクレオチド間結合またはヌクレオチド配列から選択される編集エレメントを含み、編集エレメントを細胞内の哺乳類染色体の標的遺伝子座に組み込むために、外因性ヌクレアーゼの非存在下で、ＡＡＶが、少なくとも約１％（例えば、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％）の染色体組み込み効率を有する。補正ゲノムのいずれか１つのいくつかの実施形態では、補正ゲノムは、編集エレメントヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターの本質的な欠如を有する。補正ゲノムのいずれか１つのいくつかの実施形態では、補正ゲノムは、編集エレメントに作動可能に連結された外因性プロモーターをさらに含む。複製欠損ＡＡＶのいずれか１つのいくつかの実施形態では、ＡＡＶは、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％の染色体組み込み効率を有し、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または編集エレメントを細胞内の哺乳類染色体の標的遺伝子座に組み込むために少なくとも約９０％の配列同一性を有する。

【0059】

本開示の他の態様は、ＡＡＶキャプシドに封入された補正ゲノムで、（例えば、哺乳類細胞染色体の標的遺伝子座に組み込むためのヌクレオチド間結合またはヌクレオチド配列から選択される編集エレメントと、標的遺伝子座に対する染色体の５’領域と相同性を有する編集エレメントの５’側にある５’相同アームヌクレオチド配列と、標的遺伝子座に対する染色体の３’領域と相同性を有する編集エレメントの３’側にある３’相同アームヌクレオチド配列とを含む）本明細書に記載の該補正ゲノムを含む、複製欠損アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む遺伝子編集ベクターであって、本明細書に記載の標的遺伝子座に本明細書に記載の編集エレメントを組み込むために、ＡＡＶが少なくとも１０％（例えば、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％）の染色体組み込み効率を有する、遺伝子編集ベクターに関する。いくつかの実施形態では、染色体組み込み効率は、少なくとも１０％（例えば、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％）、本明細書に記載の編集エレメントを外因性ヌクレアーゼの非存在下で本明細書に記載されるような標的遺伝子座に組み込むことができる。

【0060】

本明細書に記載の補正ゲノムは、５’相同アームヌクレオチド配列の５’逆方向末端反復（５’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列、及び３’相同アームヌクレオチド配列の３’逆方向末端反復（３’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲヌクレオチド配列、及び３’ＩＴＲヌクレオチド配列は、（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一または１００％同一）ＡＡＶ２ウイルス５’ＩＴＲ、及びＡＡＶ２ウイルス３’ＩＴＲをそれぞれ含む。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲヌクレオチド配列は、配列番号３６に対して少なくとも９５％（例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）の配列同一性を有する３’ＩＴＲヌクレオチド配列は、配列番号３７に対して少なくとも９５％（例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲヌクレオチド配列、及び３’ＩＴＲヌクレオチド配列は、（１つ以上の）ヌクレオチド配列と実質的に同一である（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一または１００％ＡＡＶ５ウイルス５’ＩＴＲ、及びＡＡＶ５ウイルス３’ＩＴＲをそれぞれ含む。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲヌクレオチド配列は、配列番号３８に対して少なくとも９５％（例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）の配列同一性を有する３’ＩＴＲヌクレオチド配列は、配列番号３９に対して少なくとも９５％（例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲヌクレオチド配列、及び３’ＩＴＲヌクレオチド配列は、互いに実質的に鏡像である（例えば、５’または３’ＩＴＲの１、２、３、４または５個のヌクレオチド位置以外の互いの鏡像である）。

【0061】

例示的なＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ（配列番号３６）−ｔｔｇｇｃｃａｃｔｃｃｃｔｃｔｃｔｇｃｇｃｇｃｔｃｇｃｔｃｇｃｔｃａｃｔｇａｇｇｃｃｇｇｇｃｇａｃｃａａａｇｇｔｃｇｃｃｃｇａｃｇｃｃｃｇｇｇｃｔｔｔｇｃｃｃｇｇｇｃｇｇｃｃｔｃａｇｔｇａｇｃｇａｇｃｇａｇｃｇｃｇｃａｇａｇａｇｇｇａｇｔｇｇｃｃａａｃｔｃｃａｔｃａｃｔａｇｇｇｇｔｔｃｃｔ

【0062】

例示的なＡＡＶ２ ３’ＩＴＲ（配列番号３７）−ａｇｇａａｃｃｃｃｔａｇｔｇａｔｇｇａｇｔｔｇｇｃｃａｃｔｃｃｃｔｃｔｃｔｇｃｇｃｇｃｔｃｇｃｔｃｇｃｔｃａｃｔｇａｇｇｃｃｇｇｇｃｇａｃｃａａａｇｇｔｃｇｃｃｃｇａｃｇｃｃｃｇｇｇｃｔｔｔｇｃｃｃｇｇｇｃｇｇｃｃｔｃａｇｔｇａｇｃｇａｇｃｇａｇｃｇｃｇｃａｇａｇａｇａｇａｇｔａｇｃｃａａ

【0063】

例示的なＡＡＶ５ ５’ＩＴＲ（配列番号３８）−
ｃｔｃｔｃｃｃｃｃｃｔｇｔｃｇｃｇｔｔｃｇｃｔｃｇｃｔｃｇｃｔｇｇｃｔｃｇｔｔｔｇｇｇｇｇｇｇｔｇｇｃａｇｃｔｃａａａｇａｇｃｔｇｃｃａｇａｃｇａｃｇｇｃｃｃｔｃｔｇｇｃｃｇｔｃｇｃｃｃｃｃｃｃａａａｃｇａｇｃｃａｇｃｇａｇｃｇａｇｃｇａａｃｇｃｇａｃａｇｇｇｇｇｇａｇａｇｔｇｃｃａｃａｃｔｃｔｃａａｇｃａａｇｇｇｇｇｔｔｔｔｇｔａ

【0064】

例示的なＡＡＶ５ ３’ＩＴＲ（配列番号３９）−
ｔａｃａａａａｃｃｔｃｃｔｔｇｃｔｔｇａｇａｇｔｇｔｇｇｃａｃｔｃｔｃｃｃｃｃｃｔｇｔｃｇｃｇｔｔｃｇｃｔｃｇｃｔｃｇｃｔｇｇｃｔｃｇｔｔｔｇｇｇｇｇｇｇｔｇｇｃａｇｃｔｃａａａｇａｇｃｔｇｃｃａｇａｃｇａｃｇｇｃｃｃｔｃｔｇｇｃｃｇｔｃｇｃｃｃｃｃｃｃａａａｃｇａｇｃｃａｇｃｇａｇｃｇａｇｃｇａａｃｇｃｇａｃａｇｇｇｇｇｇａｇａｇ

【0065】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の補正ゲノムは、７ｋｂ（キロベース）を超えない、６ｋｂを超えない、５ｋｂを超えない、または４ｋｂを超えないサイズである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の補正ゲノムは、４ｋｂ〜７ｋｂ、４ｋｂ、及び６ｋｂ、４ｋｂ、及び５ｋｂ、または４．１ｋｂ、及び４．９ｋｂである。

【0066】

特定の実施形態では、細胞のゲノムを編集するためのＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは、１つ以上のＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアント（ＡＡＶ９キャプシドと比較してバリアント）を含む。特定の実施形態では、細胞のゲノムを編集するためのＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは、１つ以上のＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドを含む。特定の実施形態において、ドナーベクターは、標準的なＡＡＶパッケージング方法に従って本明細書に記載のＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアントにパッケージングして、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアント（例えば、Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ、１９９２参照）を形成させることができる。特定の実施形態では、１つ以上のＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアントは、特定の細胞に対するＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントの指向性に影響を及ぼす。

【0067】

特定の実施形態によれば、１つ以上のＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアントは、ヒト幹細胞由来ＡＡＶに由来し得る。健康なドナーからのサイトカインで刺激された末梢血ＣＤ３４^＋幹細胞は、それらのゲノム中の内因性天然ＡＡＶ配列を有することが以前に示されている（例えば、米国特許公開第２０１３００９６１８２Ａ１号、及び第２０１１０２９４２１８Ａ１号参照）。細胞形質導入における使用のための個々のキャプシドヌクレオチド、及びタンパク質の有効性を含むＡＡＶ単離変異体（ＡＡＶ９に対する変異体）の効力は、以前に実証されている（例えば、米国特許公開第第２０１３００９６１８２Ａ１号、及び第２０１１０２９４２１８Ａ１号参照）。

【0068】

それらのゲノム中の内在性天然ＡＡＶ配列を有するドナーからの全長ＡＡＶキャプシドバリアント遺伝子（ＡＡＶ９に対する変異体）を単離し、配列決定した。キャプシドバリアントのポリヌクレオチド、及びポリペプチド配列は、図１、及び米国特許公開第２０１３００９６１８２Ａ１号として公開された２０１２年１１月２日に出願された米国特許出願第１３／６６８，１２０号、及び米国特許出願第１３／０９７，０４６号、２０１４年１月１４日に米国特許第８，６２８，９６６号として発行された米国特許公開第２０１３００９６１８２Ａ１号として公開された２０１１年４月２８日の米国特許出願第２０１１０２９４２１８Ａ１号に記載されている。特定の実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは、ＡＡＶＦ１（配列番号２０）、ＡＡＶＦ２（配列番号２０）、またはＡＡＶＦ２（配列番号２０）の群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、２１）、ＡＡＶＦ３（配列番号２２）、ＡＡＶＦ４（配列番号２３）、ＡＡＶＦ５（配列番号２５）、ＡＡＶＦ１１（配列番号２６）、ＡＡＶＦ７（配列番号２７）、ＡＡＶＦ８配列番号２８）、ＡＡＶＦ９（配列番号２９）、ＡＡＶＦ１２（配列番号３０）、ＡＡＶＦ１３（配列番号３１）、ＡＡＶＦ１４（配列番号３２）、ＡＡＶＦ１５（配列番号３３）、ＡＡＶＦ１６（配列番号３４）、ＡＡＶＦ１７（配列番号３５）、バリアント、断片、変異体、及びそれらの任意の組み合わせを含む。特定の実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは、ＡＡＶＦ１（配列番号２）、ＡＡＶＦ２（配列番号３）、ＡＡＶＦ１１（配列番号４）、ＡＡＶＦ３（配列番号５）、ＡＡＶＦ４（配列番号６）、ＡＡＶＦ６（配列番号７）、ＡＡＶＦ７（配列番号８）、ＡＡＶＦ８（配列番号９）、ＡＡＶＦ９（配列番号１０）、ＡＡＶＦ５（配列番号１１）、ＡＡＶＦ１２（配列番号１２）、ＡＡＶＦ１７（配列番号１３）、ＡＡＶＦ１３（配列番号１４）、ＡＡＶＦ１４（配列番号１５）、ＡＡＶＦ１５（配列番号１６）、ＡＡＶＦ１６（配列番号１７）、バリアント、断片、変異体、及びそれらの任意の組み合わせから選択されるポリペプチド配列を含む、１つ以上のＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアントを含む（例えば、図１参照）。

【0069】

特定の実施形態によれば、Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアントのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、本明細書において教示された配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、より好ましくは約９８％、及び最も好ましくは約９９％の配列同一性を有し得る。パーセンテージ同一性は、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４ １９８８）のような多くの配列比較プログラムまたは方法、ならびにＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、またはＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．から）、または国立バイオテクノロジー情報センターのウェブサイトから入手できるＢＬＡＳＴなどの、比較アルゴリズムを実施するプログラムのいずれかを用いて計算することができる。

【0070】

Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアント配列は、Ｖ１及び／またはＶ３キャップ遺伝子の１つ以上の位置で修飾されてもよく、遺伝子のこれらの遺伝子または機能的部分は、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアント、及び方法を提供する。Ｃａｐ遺伝子Ｖ１、Ｖ２、及びＶ３は、複数の変異した配列から置換されてよく、典型的には共線様式Ｖ１−Ｖ２−Ｖ３で使用される。しかし、配列は、部分的なＶ１−Ｖ２−Ｖ３またはＶ１−Ｖ３またはＶ１−Ｖ１−Ｖ２−Ｖ３のように、切断されてもよい。例えば、１つの配列は、ＡＡＶＦ１４の（ＡＡＶＦ４）−Ｖ３の（ＡＡＶＦ８）−Ｖ２のＶ１であり得る。好ましくは、Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアントは、ＡＡＶ２またはそれ以上のレベルで標的細胞に形質導入する。

【0071】

特定の実施形態では、１つ以上のキャプシドバリアントは、キャプシドバリアントの１つ以上のＶ１、Ｖ２、及びＶ３ポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号２０〜３５、ＡＡＶ９キャプシドに対する変異体）、ＡＡＶ９キャプシド（配列番号１８）、ＡＡＶ２キャプシド（配列番号１９）、その変異体、断片、または変異体を含む。特定の実施形態では、１つ以上のまたはキャプシドバリアントは、キャプシドバリアント（配列番号２０〜３５、ＡＡＶ９キャプシドに対する変異体）の１つ以上のＶ１、Ｖ２、及びＶ３ポリヌクレオチド配列、任意の他の既知のＡＡＶキャプシド、変異体、断片、または変異体である。

【0072】

特定の実施形態では、１つ以上のＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアントは、キャプシドバリアントのＶ１、Ｖ２、及びＶ３ポリペプチド配列（配列番号２〜１７、ＡＡＶ９キャプシドに対する変異体）、ＡＡＶ９キャプシド（配列番号１）、その変異体、断片または変異体である。特定の実施形態では、１つ以上のキャプシドバリアントは、Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドバリアント（配列番号２〜１７、ＡＡＶ９と比較してバリアント）のＶ１、Ｖ２、及びＶ３ポリペプチド配列の組み合わせ、任意の他の既知のＡＡＶキャプシド、変異体、断片、または変異体である。

【0073】

いくつかの実施形態では、細胞のゲノムを編集するためのＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドを含む。いくつかの実施形態では、「ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシド」とは、それぞれ、ＡＡＶ９のＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列との少なくとも８６％（例えば、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の配列同一性を有するＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列を有するキャプシドをいう。例示的なＣｌａｄｅ Ｆキャプシドには、ＡＡＶＦ１〜１７（本明細書中ではＡＡＶＨＳＣ１〜１７と称する）、ＡＡＶ９、ＡＡＶＨＵ３１、ＡＡＶＨＵ３２、及びＡＡＶＡｎｃ１１０が含まれる（例えば、Ｚｉｎｎら、Ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｖｉｒａｌ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｌｉｎｅａｇｅ Ｙｉｅｌｄｓ ａ Ｐｏｔｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｖｅｃｔｏｒ（２０１５）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌ １２，ｐｐ．１０５６−１０６８）．

【0074】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、Ｃｌａｄｅ Ｆ ＶＰ１、Ｃｌａｄｅ Ｆ ＶＰ２、及びＣｌａｄｅ Ｆ ＶＰ３から選択される少なくとも１つまたは少なくとも２つのタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、Ｃｌａｄｅ Ｆ ＶＰ１、Ｃｌａｄｅ Ｆ ＶＰ２、及びＣｌａｄｅ Ｆ ＶＰ３タンパク質を含む。

【0075】

ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドの例示的なＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３タンパク質配列を以下の表に示す。

【0076】

【表1-1】

【表1-2】

【0077】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、それぞれ、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３のアミノ酸配列に対応する、それぞれ、配列番号１のアミノ酸１〜７３６、アミノ酸１３８〜７３６、またはアミノ酸２０３〜７３６に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドが、それぞれＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１及びＶＰ２のアミノ酸配列に対応する、それぞれ配列番号１のアミノ酸１〜７３６、及びアミノ酸１３８〜７３６に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するＶＰ１及びＶＰ２タンパク質か、それぞれＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１及びＶＰ３のアミノ酸配列に対応する、それぞれ配列番号１のアミノ酸１〜７３６、及びアミノ酸２０３〜７３６と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するＶＰ１及びＶＰ３タンパク質か、それぞれＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ２及びＶＰ３のアミノ酸配列に対応する、それぞれ配列番号１のアミノ酸１３８〜７３６、及びアミノ酸２０３〜７３６と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するＶＰ２及びＶＰ３タンパク質かを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、それぞれ、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３のアミノ酸配列に対応する、それぞれ配列番号１のアミノ酸１〜７３６、及びアミノ酸１３８〜７３６及びアミノ酸２０３〜７３６に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３タンパク質を含む。

【0078】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、それぞれＡＡＶＦ１〜ＡＡＶＦ９、及びＡＡＶＦ１１〜ＡＡＶＦ１７キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３のアミノ酸配列に対応する、それぞれ配列番号２、３、５、６、１１、７、８、９、１０、４、１２、１４、１５、１６、１７、または１３のいずれか１つのアミノ酸１〜７３６、アミノ酸１３８〜７３６、またはアミノ酸２０３〜７３６と、少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドが、それぞれＡＡＶＦ１〜ＡＡＶＦ９及びＡＡＶＦ１１〜ＡＡＶＦ１７キャプシドタンパク質ＶＰ１及びＶＰ２のアミノ酸配列に対応する、それぞれ配列番号２、３、５、６、１１、７、８、９、１０、４、１２、１４、１５、１６、１７、または１３のいずれか１つのアミノ酸１〜７３６及びアミノ酸１３８〜７３６と、少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するＶＰ１及びＶＰ２タンパク質か、それぞれＡＡＶＦ１〜ＡＡＶＦ９及びＡＡＶＦ１１〜ＡＡＶＦ１７キャプシドタンパク質ＶＰ１及びＶＰ３のアミノ酸配列に対応する、それぞれ配列番号２、３、５、６、１１、７、８、９、１０、４、１２、１４、１５、１６、１７、または１３のいずれか１つのアミノ酸１〜７３６及びアミノ酸２０３〜７３６と、少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するＶＰ１及びＶＰ３タンパク質か、それぞれＡＡＶＦ１〜ＡＡＶＦ９及びＡＡＶＦ１１〜ＡＡＶＦ１７キャプシドタンパク質ＶＰ２及びＶＰ３のアミノ酸配列に対応する、それぞれ配列番号２、３、５、６、１１、７、８、９、１０、４、１２、１４、１５、１６、１７、または１３のいずれか１つのアミノ酸１３８〜７３６及びアミノ酸２０３〜７３６と、少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するＶＰ２及びＶＰ３タンパク質かを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、それぞれＡＡＶＦ１〜ＡＡＶＦ９及びＡＡＶＦ１１〜ＡＡＶＦ１７キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３のアミノ配列に対応する、それぞれ配列番号２、３、５、６、１１、７、８、９、１０、４、１２、１４、１５、１６、１７、または１３のいずれか１つのアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸１〜７３６、アミノ酸１３８〜７３６、及びアミノ酸２０３〜７３６の少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３タンパク質かを含む。

【0079】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、それぞれＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードするヌクレオチド配列に対応する、配列番号１８に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも約９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）のヌクレオチド配列同一性を含むヌクレオチド配列によってコードされるＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドが、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードするヌクレオチド配列に対応する、配列番号１８と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも約９４％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）のヌクレオチド配列同一性を含むヌクレオチド配列によってコードされるＶＰ１及びＶＰ２か、配列番号１８と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）のヌクレオチド配列同一性を含むヌクレオチド配列によってコードされるＶＰ１及びＶＰ３か、配列番号１８と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）のヌクレオチド配列同一性を含むヌクレオチド配列によってコードされるＶＰ２及びＶＰ３を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードするヌクレオチド配列に対応する、配列番号１８と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３を含む。

【0080】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドが、それぞれＡＡＶＦ１〜ＡＡＶＦ１７キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードするヌクレオチド配列に対応する、配列番号２０、２１、２２、２３、２５、２４、２７、２８、２９、２６、３０、３１、３２、３３、３４、または３５のいずれか１つに対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）のヌクレオチド配列同一性を含むヌクレオチド配列によってコードされるＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドが、配列番号２０〜３５のいずれか１つに対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）のヌクレオチド配列同一性を含むヌクレオチド配列によってコードされるＶＰ１及びＶＰ２タンパク質か、配列番号２０〜３５のいずれか１つに対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）のヌクレオチド配列同一性を含むヌクレオチド配列によってコードされるＶＰ１及びＶＰ３タンパク質か、配列番号２０〜３５のいずれか１つに対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）のヌクレオチド配列同一性を含むヌクレオチド配列によってコードされるＶＰ２及びＶＰ３タンパク質かを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドが、それぞれＡＡＶＦ１〜ＡＡＶＦ１７キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードするヌクレオチド配列に対応する、配列番号２０、２１、２２、２３、２５、２４、２７、２８、２９、２６、３０、３１、３２、３３、３４、または３５のいずれか１つに対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）のヌクレオチド配列同一性を含むヌクレオチド配列によってコードされるＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３タンパク質を含む。

【0081】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、それぞれ配列番号１に記載のアミノ酸１〜７３６、アミノ酸１３８〜７３６、及びアミノ酸２０３〜７３６に対応するＡＡＶ９ ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３キャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、それぞれ配列番号１に記載のアミノ酸１〜７３６、及びアミノ酸１３８〜７３６に対応するＡＡＶ９ ＶＰ１及びＶＰ２キャプシドタンパク質か、それぞれ配列番号１に記載のアミノ酸１〜７３６、及びアミノ酸２０３〜７３６に対応するＡＡＶ９ ＶＰ１及びＶＰ３キャプシドタンパク質か、それぞれ配列番号１に記載のアミノ酸１３８〜７３６、及びアミノ酸２０３〜７３６に対応するＡＡＶ９ ＶＰ２及びＶＰ３キャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、それぞれ配列番号１に記載のアミノ酸１〜７３６、アミノ酸１３８〜７３６、及びアミノ酸２０３〜７３６に対応するＡＡＶ９ ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３キャプシドタンパク質を含む。

【0082】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、それぞれ配列番号２、３、５、６、１１、７、８、９、１０、４、１２、１４、１５、１６、１７、または１３に記載のアミノ酸１〜７３６のアミノ酸に対応するＡＡＶＦ１〜ＡＡＶＦ９、及びＡＡＶＦ１１〜ＡＡＶＦ１７のいずれかのＶＰ１キャプシドタンパク質から選択されるＶＰ１キャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、それぞれ配列番号２、３、５、６、１１、７、８、９、１０、４、１２、１４、１５、１６、１７、または１３に記載のアミノ酸１〜７３６、及びアミノ酸１３８〜７３６に対応する、ＡＡＶＦ１〜ＡＡＶＦ９、及びＡＡＶＦ１１〜ＡＡＶＦ１７のいずれかのＶＰ１、及びＶＰ２キャプシドタンパク質から独立して選択されるＶＰ１、及びＶＰ２キャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、それぞれ配列番号２、３、５、６、１１、７、８、９、１０、４、１２、１４、１５、１６、１７、または１３に記載のアミノ酸１３８〜７３６、及びアミノ酸２０３〜７３６に対応するＡＡＶＦ１〜ＡＡＶＦ９、及びＡＡＶＦ１１〜ＡＡＶＦ１７のいずれかのＶＰ２、及びＶＰ３キャプシドタンパク質から独立して選択されるＶＰ２、及びＶＰ３キャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドは、それぞれ配列番号２、３、５、６、１１、７、８、９、１０、４、１２、１４、１５、１６、１７、または１３に記載のアミノ酸１〜７３６、アミノ酸１３８〜７３６、及びアミノ酸２０３〜７３６に対応するＡＡＶＦ１〜ＡＡＶＦ９、及びＡＡＶＦ１１〜ＡＡＶＦ１７のいずれかのＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３キャプシドタンパク質を含む。

【0083】

本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチド配列の断片は、全長ポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドと実質的に同じ機能を提供するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの部分であり得る。本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチド配列の変異体は、特定のポリヌクレオチド配列への１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換、付加、及び／または挿入によって得ることができる。このようなポリヌクレオチド配列の断片及び／または変異体は、全長ポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドと実質的に同じ機能を有するポリペプチドをコードすることが理解されるべきである。

【0084】

本明細書中で使用される場合、ポリペプチド配列は、完全長ポリペプチド配列と実質的に同じ機能を提供しながら、ポリペプチド配列の断片及び／または変異体を含み得る。ポリペプチド配列の断片は、全長ポリペプチド配列と実質的に同じ機能を提供するポリペプチド配列の一部を意味する。ポリペプチド配列の変異体の例には、ポリペプチド配列に対する１つ以上のアミノ酸の欠失、置換、付加、及び／または挿入が含まれる。

【0085】

特定の実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、組換えまたは非天然のポリヌクレオチドであり得る。特定の実施形態では、ポリヌクレオチド配列はｃＤＮＡであり得る。

【0086】

特定の実施形態では、本明細書で提供されるＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは、ＡＡＶＦ（またはＡＡＶＨＳＣ）または本明細書に記載の他のＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆベクターのいずれかを含み得る。特定の実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは、ＡＡＶＦ１、ＡＡＶＦ２、ＡＡＶＦ３、ＡＡＶＦ４、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶＦ６、ＡＡＶＦ７、ＡＡＶＦ８、ＡＡＶＦ９、ＡＡＶＦ１０、ＡＡＶＦ１１、ＡＡＶＦ１２、ＡＡＶＦ１３、ＡＡＶＦ１４、ＡＡＶＦ１５、ＡＡＶＦ１６、ＡＡＶＦ１７、バリアント、断片、変異体、またはそれらの任意の組み合わせなどの、本明細書に記載のＡＡＶＦ（またはＡＡＶＨＳＣ）ベクターのいずれかを含み得る。特定の実施形態において、Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは、ＡＡＶ９、ＡＡＶＦ１、ＡＡＶＦ２、ＡＡＶＦ３、ＡＡＶＦ４、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶＦ６、ＡＡＶＦ７、ＡＡＶＦ８、ＡＡＶＦ９、ＡＡＶＦ１０、ＡＡＶＦ１１、ＡＡＶＦ１２、ＡＡＶＦ１３、ＡＡＶＦ１４、ＡＡＶＦ１５、ＡＡＶＦ１６、ＡＡＶＦ１７、ＡＡＶＨＵ３１、ＡＡＶＨＵ３２、バリアント、断片、変異体、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0087】

特定の実施形態では、本明細書で提供されるＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは、編集エレメント（本明細書では、標的カセットとも呼ばれ、「編集エレメント」、及び「標的カセット」という用語が、ゲノムの５’相同アームヌクレオチド配列５’、５’相同アームヌクレオチド配列５’、５’相同アームヌクレオチド配列５’、５’相同アームヌクレオチド配列５’標的遺伝子座（例えば、編集エレメントに隣接する５’相同アームポリヌクレオチド配列（標的カセット））と標的遺伝子座の上流にある領域（標的部位）との相同性を有する哺乳類染色体の５’））、及び編集エレメントの３’相同アームヌクレオチド配列３’を含み、標的遺伝子座に対する哺乳類染色体の３’領域に対して相同性を有する（標的カセット）に隣接し、標的遺伝子座（標的部位）の下流にある領域と相同性を有する３’相同アームポリヌクレオチド配列）を含む。

【0088】

特定の実施形態では、ゲノムの標的部位に組み込まれる１つ以上のヌクレオチド配列は、１つ以上の治療用ヌクレオチド配列であり得る。本明細書で使用する「治療用」という用語は、疾患または障害の治療をもたらす物質またはプロセスを指す。「治療用ヌクレオチド配列」は、治療効果を提供するヌクレオチド配列である。治療効果は、直接的（例えば、タンパク質として発現される遺伝子の核酸の置換、または発現のためのイントロンへのｃＤＮＡの挿入）または間接的（例えば、プロモーターなどの調節要素の補正）であり得る。特定の実施形態では、治療用ヌクレオチド配列は、１つ以上のヌクレオチドを含み得る。特定の実施形態では、治療用ヌクレオチド配列は、その遺伝子、変異体、断片、または変異体であり得る。特定の実施形態では、遺伝子治療が所望される場合、治療用ヌクレオチド配列は、治療用抗体を含む治療上有効なタンパク質をコードする任意のヌクレオチド配列であり得る。治療用ヌクレオチド配列を含むＣｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは、好ましくは、注射、吸入、吸収、摂取または他の方法のような適切な投与経路を介して治療有効量で投与される。

【0089】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の編集エレメントは、１つのヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の編集エレメントは、１つのヌクレオチドからなり、本明細書に記載の標的遺伝子座は、１つのヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり、標的遺伝子座は点変異を表す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の編集エレメントは、少なくとも１、２、１０、１００、２００、５００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、または５０００ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている編集エレメントは、１〜５５００、１〜５０００、１〜４５００、１〜４０００、１〜３０００、１〜２０００、１〜１０００、１〜５００、１〜２００、または１〜１００ヌクレオチド、または２〜５５００、２〜５０００、２〜４５００、２〜４０００、２〜３０００、２〜２０００、２〜１０００、２〜５００、２〜２００、または２〜１００ヌクレオチド、または１０〜５５００、１０〜５０００、１０〜４５００、１０〜４０００、１０〜３０００、１０〜２０００、１０〜１０００、１０〜５００、１０〜２００、または１０〜１００ヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の編集エレメントは、エクソン、イントロン、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、プロモーター、スプライスドナー、スプライスアクセプター、配列をコードするＲＮＡもしくは非コードＲＮＡ、インスレーター、遺伝子、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の編集エレメントは、断片（例えば、２ｋｂ以下、１ｋｂ以下、５００ｂｐ以下、２５０ｂｐ以下、１００ｂｐ以下、５０ｂｐ以下、または本明細書に記載されるような標的遺伝子座内またはそれにまたがる遺伝子のコード配列の少なくとも２５ｂｐ）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の編集エレメントは、ヌクレオチド間結合（例えば、２つの隣接するヌクレオチドを連結するホスホジエステル結合）である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の編集エレメントはヌクレオチド間結合であり、本明細書に記載の染色体の標的遺伝子座は１つ以上のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列であり、編集エレメントは染色体の標的遺伝子座の欠失を含む。

【0090】

特定の実施形態において、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントの編集エレメント（または標的カセット）は、１つ以上の調節エレメントポリヌクレオチド配列を含み得る。例えば、特定の実施形態では、１つ以上の調節エレメントポリヌクレオチド配列は、２Ａ配列、スプライスアクセプター配列、ポリアデニル化配列、及びそれらの任意の組み合わせから選択され得る。特定の実施形態では、標的カセットは、５’、及び３’相同アームポリヌクレオチド配列に隣接する１つ以上のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）ポリヌクレオチド配列を含み得る。特定の実施形態では、編集エレメント（または標的カセット）は、１つ以上のヌクレオチド配列の発現を駆動するプロモーターを含まない。特定の実施形態では、編集エレメント（または標的カセット）がプロモーターを含まない場合、細胞ゲノムへの組み込み後の１つ以上のヌクレオチド配列の発現は、細胞の１つ以上の調節要素によって制御され得る。特定の実施形態では、プロモーターを含まない１つ以上のヌクレオチド配列の発現は、１つ以上のヌクレオチド配列が細胞に正しく組み込まれたことを示す。

【0091】

特定の実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは、１つ以上の相同アームポリヌクレオチド配列を含み得る。特定の実施形態では、１つ以上の相同アームポリヌクレオチド配列は、ゲノムの標的遺伝子座（標的部位）の領域に相同であり得る。特定の実施形態において、１つ以上の相同アームポリヌクレオチド配列は、５’相同アームポリヌクレオチド配列であり得る。特定の実施形態では、５’相同アームポリヌクレオチド配列は、編集エレメント（または標的カセット）の５’末端に隣接し得る。特定の実施形態では、編集エレメント（または標的カセット）に隣接する５’相同アームポリヌクレオチド配列は、ゲノムの標的遺伝子座（標的部位）の上流にある領域と相同であり得る。特定の実施形態では、１つ以上の同種アームポリヌクレオチド配列は、３’相同アームポリヌクレオチド配列であり得る。特定の実施形態では、３’相同アームポリヌクレオチド配列は、編集エレメント（または標的カセット）の３’末端に隣接し得る。特定の実施形態では、編集エレメント（または標的カセット）に隣接する３’相同アームポリヌクレオチド配列は、ゲノムの標的遺伝子座（標的部位）の下流にある領域と相同であり得る。特定の実施形態では、相同アームポリヌクレオチド配列は、約５００〜１，０００ヌクレオチド長であり得る。例えば、特定の実施形態では、相同アームポリヌクレオチド配列は、約８００ヌクレオチド長であり得る。特定の実施形態では、相同アームポリヌクレオチド配列は、約３，０００ヌクレオチド長までであり得る。いくつかの実施形態では、５’、及び３’相同アームヌクレオチド配列のそれぞれは、独立して、約５０〜２０００ヌクレオチド、例えば約５００〜１０００、約６００〜１０００または約７００〜９００ヌクレオチドのヌクレオチド長を有する。いくつかの実施形態では、５’、及び３’相同アームヌクレオチド配列のそれぞれは、独立して、約６００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、または約１０００ヌクレオチドのヌクレオチド長を有する。

【0092】

いくつかの実施形態では、５’、及び３’相同アームヌクレオチド配列は、実質的に等しいヌクレオチド長を有する。いくつかの実施形態では、５’、及び３’相同アームヌクレオチド配列は、非対称的なヌクレオチド長を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド長の非対称性は、長さ５０％まで、例えば長さ４０％、３０％、２０％または１０％までの、５’及び３’相同アームヌクレオチド配列長の差によって定義される。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド長の非対称性は、約６００ヌクレオチドの長さを有する５’、及び３’相同アームのアームと、約８００または約９００ヌクレオチドを有する５’、及び３’相同アームのその他のアームとによって規定される。

【0093】

いくつかの実施形態では、５’相同アームヌクレオチド配列は、標的遺伝子座に対する哺乳類染色体の５’領域と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．５％）のヌクレオチド配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、３’相同アームヌクレオチド配列は、標的遺伝子座に対する哺乳類染色体の３’領域と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．５％）のヌクレオチド配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、５’相同アームまたは３’相同アームヌクレオチド配列と、それぞれ、対応する哺乳類染色体の５’領域または３’領域との相違を含み得、ヌクレオチド配列において、非コーディングの相違からなるか、本質的になる。いくつかの実施形態では、５’相同アームまたは３’相同アームヌクレオチド配列と、それぞれ、対応する哺乳類染色体の５’領域または３’領域との相違を含み得、保存的アミノ酸変化（例えば、塩基性アミノ酸が異なる塩基性アミノ酸に変化）を生じるヌクレオチド配列において、非コーディングの相違からなるか、本質的になる。いくつかの実施形態では、５’相同アームヌクレオチド配列は、標的遺伝子座に対する哺乳類染色体の５’領域と１００％の配列同一性を有し、３’相同アームヌクレオチド配列は、標的遺伝子座に対する哺乳類染色体の３’領域と１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座が、５’または３’相同アームと比較して、１つ以上の天然のＳＮＰのような、１つ以上の変異を含む場合であっても、５’相同アームヌクレオチド配列、及び３’相同アームヌクレオチド配列は、それぞれ標的遺伝子座に対して哺乳動物染色体の５’領域、及び３’領域と相同であると考えられる。

【0094】

特定の実施形態において、細胞ゲノムの標的遺伝子座（標的部位）は、細胞ゲノムの編集が起こることが望ましいゲノムの任意の領域であり得る。例えば、細胞ゲノムの標的遺伝子座（標的部位）は、細胞内の染色体の座位（例えば、哺乳類の染色体の領域）を含むことができる。特定の実施形態では、染色体の遺伝子座はセーフハーバー部位であり得る。セーフハーバー部位は、ヌクレオチド配列が内因性遺伝子活性を混乱させることなく予測可能な様式で組み込み、機能し得るゲノム内の場所である。特定の実施形態では、セーフハーバー部位は、ヒト第１９染色体（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子座としても知られる）のＡＡＶＳ１遺伝子座であり得る。特定の実施形態では、セーフハーバー部位は、ヒト１９番染色体のＡＡＶＳ１遺伝子座におけるＰＰＰ１Ｒ１２Ｃの第１のイントロンであり得る。第１９染色体ｑｔｅｒ１３．３〜１３．４上のＡＡＶＳ１遺伝子座は、ここに挿入された遺伝子が病原性のない状態で発現され、これを組み込む野生型ＡＡＶに類似しているので、導入遺伝子の挿入のための「セーフハーバー」部位であることが以前に示された病原性のない遺伝子座（Ｇｉｒａｕｄ １９９４；Ｌｉｎｄｅｎ、１９９６Ａ；Ｌｉｎｄｅｎ １９９６Ｂ）。特定の実施形態では、標的遺伝子座（標的部位）は、本明細書に記載の疾患状態に関連する遺伝子座であり得る。

【0095】

特定の実施形態では、標的遺伝子座は、対応する野生型哺乳類染色体と比較して、１つ以上の変異体ヌクレオチドを含む哺乳類染色体中の変異体標的遺伝子座である。いくつかの実施形態では、変異体標的遺伝子座が、点変異、ミスセンス変異、ナンセンス変異、１つ以上のヌクレオチドの挿入、１つ以上のヌクレオチドの欠失、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、変異体標的遺伝子座が、無形質変異、新形質変異、または反形質変異を含む。いくつかの実施形態では、変異標的遺伝子座は、常染色体優性変異、常染色体劣性変異、ヘテロ接合変異、ホモ接合変異、またはそれらの組み合わせを含む。本明細書に記載の変異標的遺伝子座のいずれか１つのいくつかの実施形態では、変異標的遺伝子座が、哺乳類染色体内における、プロモーター、エンハンサー、シグナル配列、イントロン、エキソン、スプライスドナー部位、スプライスアクセプター部位、内部リボソーム、逆エキソン、インスレーター、遺伝子、染色体の逆位、及び染色体転座を含むが、これらに限定されない。

【0096】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の染色体における標的遺伝子座は、ｎ個のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列であり、ｎは１以上の整数である（例えば、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００またはその間の任意の整数）である場合、本明細書に記載の編集エレメントはｍ個のヌクレオチドを含み、ｍはｎに等しい整数であり、編集エレメントは染色体の標的遺伝子座の置換を表す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の染色体における標的遺伝子座は、ｎ個のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列であり、ｎは１以上の整数である（例えば、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、ここで記述されるような編集エレメントはｍ個のヌクレオチドを含み、ｍはｎより大きい整数であり、編集エレメントは染色体の標的遺伝子座に対する置換付加を表す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の染色体における標的遺伝子座は、ｎ個のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列であり、ｎは１以上の整数である（例えば、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、またはそれらの間の任意の整数）であり、本明細書に記載の編集エレメントはｍ個のヌクレオチドを含み、ｍはｎより小さい整数であり、編集エレメントは、染色体の標的遺伝子座のための置換欠失を表す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の染色体中の標的遺伝子座はヌクレオチド間結合であり、本明細書に記載の編集エレメントはｍ個のヌクレオチドを含み、ｍは１以上の整数である（例えば、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、またはそれらの間の任意の整数）。編集エレメントは、染色体の標的遺伝子座に対する付加を表す。

【0097】

いくつかの実施形態では、染色体中の標的遺伝子座は、哺乳類染色体（例えば、ヒト、マウス、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ラットまたはウサギ染色体）の標的遺伝子座である。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座は、哺乳類染色体のイントロンを含み得る。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座は、哺乳類染色体のエキソンを含み得る。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座は、哺乳類染色体の非コード領域を含み得る。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座は、哺乳類染色体の調節領域を含み得る。いくつかの実施形態では、哺乳類染色体は、ヒト染色体１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、Ｘ、及びＹいくつかの実施形態では、哺乳類染色体は、マウス染色体１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、Ｘ、及びＹから選択される。いくつかの実施形態では、哺乳類の染色体はヒト１９番染色体ではない。いくつかの実施形態では、哺乳類染色体は体細胞染色体である。例示的な体細胞が本明細書にさらに記載される。

【0098】

特定の実施形態では、１つ以上のヌクレオチド配列または編集エレメントは、組み込みの前にＤＮＡ切断の必要性なしに、相同組換えを介してゲノムに組み込まれ得る。特定の実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ（登録商標））などの外因性ヌクレアーゼの添加を必要とせずに、相同組換えを介して１つ以上のヌクレオチド配列または編集エレメントをゲノムに組み込むことができる。）、またはＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）である。

【0099】

特定の実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントによって編集される細胞は、任意のタイプの細胞であり得る。特定の実施形態では、細胞は、肝臓、肺、軟骨、及び他の結合組織の細胞、眼、中枢及び末梢神経系、リンパ系、骨、筋肉、血液、脳、皮膚、心臓、及び消化管などの多種多様な哺乳類細胞であってもよい。ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントによって編集される細胞が、例えば肝細胞である場合、挿入されたヌクレオチド配列は、（疾患を改善または治癒させる、または疾患または障害のさらなる進行を止めること）、または状態を防ぐ。ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントによって編集される細胞が肝細胞である場合、治療または予防される肝臓状態は、血友病、酵素送達、肝硬変、癌またはアテローム性動脈硬化症を含む。特定の実施形態では、細胞は体細胞（例えば、哺乳類体細胞）であってもよい。特定の実施形態では、細胞（例えば、哺乳類体細胞などの体細胞）は、結合組織（血液を含む）、筋肉組織、神経組織、及び上皮組織からなる群から選択される組織由来であり得る。特定の実施形態では、細胞（例えば、哺乳類体細胞などの体細胞）は、肺、心臓、肝臓、腎臓、筋肉、脳、眼、乳房、骨、及び軟骨からなる群から選択される器官由来であり得る。いくつかの実施形態では、細胞はＣＤ３４＋細胞（例えば、ＣＤ３４＋体細胞）である。いくつかの実施形態では、細胞（例えば、哺乳類体細胞などの体細胞）は、肝細胞、線維芽細胞、乳房細胞、リンパ球または網膜細胞である。

【0100】

本明細書に示すように、本明細書に記載のＣｌａｄｅ ＦキャプシドまたはキャプシドバリアントとともにパッケージングされたＡＡＶは、血液幹細胞、肝臓、心臓、眼、乳房、及び関節組織などの特定の標的組織に対する特異指向性を示し、幹細胞目的の遺伝子を対象組織に導入する。ある種のベクターは、ゲノム編集による遺伝子治療の方法を提供する、追加の新規用途、及びベクターの標的器官を開く、血液脳関門のようなしっかりと制御された生物学的接合部を交差することができる。したがって、Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは、それらのＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアントに基づいて、特定の細胞について指向性を示すことができる。例えば、ａ）筋肉組織または細胞の場合、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶＦ７、ＡＡＶＦ１３、ＡＡＶＦ１５、及びＡＡＶＦ１７の群から選択することができ；ｂ）心臓または肺の組織または細胞について、ベクターは、ＡＡＶＦ１３、ＡＡＶＦ１５、及びＡＡＶＦ１７の群から選択され得る；ｃ）肝臓またはＣＮＳ組織または細胞について、ベクターは、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶＦ１３、ＡＡＶＦ１７、ＡＡＶＦ７またはＡＡＶＦ１５から選択され得る；ｄ）幹細胞については、ベクターはＡＡＶＦ１７であり得る；ｅ）Ｂ細胞前駆体については、ベクターはＡＡＶＦ５であり得る；ｆ）骨髄性、及び赤血球系の前駆細胞では、ベクターはＡＡＶＦ１２であり得る；ｇ）リンパ節、腎臓、脾臓、軟骨、及び骨の組織または細胞では、ベクターは、ＡＡＶＦ７、ＡＡＶＦ１３、ＡＡＶＦ１５、及びＡＡＶＦ１７の群から選択されるベクターの群から選択され得る。

【0101】

さらに、Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは、６−Ｈｉｓタグまたは親和性タグなどの様々なタグを含む細胞、または誘発された天然に存在する抗体または応答して投与されるモノクローナル抗体などのインターフェロン応答の向性を有し得る 病原体または腫瘍細胞に送達される。

【0102】

特定の実施形態において、細胞は、幹細胞（例えば、哺乳類幹細胞）であり得る。特定の実施形態では、幹細胞は、造血幹細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞または間充織幹細胞を含む任意のタイプの幹細胞であり得る。特定の実施形態において、幹細胞（例えば、哺乳類幹細胞）は、造血幹細胞、臍帯血幹細胞、骨髄幹細胞、胎児肝幹細胞、または末梢血幹細胞であり得る。いくつかの実施形態では、幹細胞は、ＣＤ３４＋幹細胞であり得る。特定の実施形態において、幹細胞（例えば、哺乳類幹細胞）は、造血幹細胞または末梢血幹細胞であり得る。幹細胞の形質導入は、一時的または永続的（永続的とも呼ばれる）のいずれかであり得る。一過性である場合、一実施形態は、治療用ヌクレオチドが、ベクター、ベクターに付着した物質、または外部因子または力のいずれかによって制御されるように使用されるかまたは発現される時間を可能にする。

【0103】

特定の実施形態では、細胞は、ＣＤ３４＋造血幹細胞株（ＨＳＣ）、Ｋ５６２ ＣＤ３４＋白血病細胞株、ＨｅｐＧ２ヒト肝細胞株、末梢血幹細胞、臍帯血幹細胞、ＣＤ３４＋末梢血幹細胞、ＷＩ−３８ヒト二倍体線維芽細胞株、ＭＣＦ７ヒト乳癌細胞株、Ｙ７９ヒト網膜芽細胞腫細胞株、ＳＣＩＤ−Ｘ１ ＬＢＬヒトＥＢＶ不死化Ｂ細胞株、初代肝類洞内皮細胞、初代骨格筋筋芽細胞腫を含むが、これらに限定されない。

【0104】

本明細書中に記載されるようなクラッドＦまたはＡＡＶベクターバリアントで細胞を形質導入することを含む、対象の細胞のゲノムのエクスビボ編集方法も本明細書において提供される。特定の実施形態では、細胞をＣｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントで形質導入することは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）等の、さらなる外因性ヌクレアーゼなしで起こり得る。特定の実施形態において、細胞は、任意のタイプの細胞であり得る。特定の実施形態では、細胞は、本明細書に記載の幹細胞であり得る。例えば、特定の実施形態では、幹細胞のゲノムを編集する方法は、幹細胞を１つ以上のＣｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントで形質導入することを含み得る。特定の実施形態において、幹細胞の形質導入は、さらなる外因性ヌクレアーゼを必要とせずに実施され得る。特定の実施形態では、細胞は、本明細書に記載の体細胞であり得る。例えば、特定の実施形態では、体細胞のゲノムを編集する方法は、体細胞を１つ以上のＣｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントで形質導入することを含み得る。特定の実施形態において、体細胞の形質導入は、さらなる外因性ヌクレアーゼを必要とせずに実施され得る。特定の実施形態では、Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは、１つ以上のＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアント（ＡＡＶ９と比較してバリアント）、標的に組み込むためのヌクレオチド間結合またはヌクレオチド配列から選択される編集エレメント（標的カセット）に隣接し、ゲノムの標的遺伝子座（標的部位）に組み込まれる１つ以上の治療用ヌクレオチド配列を含む５’相同アームポリヌクレオチド配列（標的カセット）に隣接し、標的遺伝子座の下流にある領域（標的部位）と相同性を有する３’相同アームポリヌクレオチド配列とを含む。特定の実施形態において、インターヌクレオチド結合またはヌクレオチド配列または１つ以上の治療用ヌクレオチド配列は、組み込みの前にＤＮＡ切断のためのさらなる外因性ヌクレアーゼを必要とせずにゲノムに組み込まれ得る。

【0105】

本明細書では、Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントで細胞を形質導入し、形質導入細胞を対象にさらに移植して疾患または障害を治療することを含む、対象の細胞のゲノムをエクスビボで編集することによって、対象における疾患または障害を治療する方法も提供される。特定の実施形態では、本方法は、本明細書に記載のＣｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントベクターで対象の細胞を形質導入することを含み得る。特定の実施形態において、細胞は、さらなる外因性ヌクレアーゼなしに形質導入され得る。特定の実施形態において、Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントによる細胞の形質導入は、本明細書で提供されるように、または当業者に公知の形質導入の任意の方法によって実施され得る。特定の実施形態では、細胞を５０，０００、１００，０００、１５０，０００、２００，０００、２５０，０００、３００，０００、３５０，０００、４００，０００、４５０，０００、または５００，０００の感染多重度（ＭＯＩ）で、または細胞の最適な形質導入を提供する任意のＭＯＩで、Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントで形質導入し得る。特定の実施形態では、形質導入細胞は、対象にさらに移植され、ここで、形質導入細胞は、疾患または障害を治療する。特定の実施形態では、細胞は、本明細書に記載される任意のタイプの細胞であり得る。

【0106】

本明細書に記載の哺乳類ゲノムの標的遺伝子座を編集する方法も本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に記載のＡＡＶ（例えば、キャプシドに封入された補正ゲノムを含む複製欠損ＡＡＶ）での哺乳類ゲノムを含む細胞（ヒト、マウス、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ラット、またはウサギ細胞など）を、形質導入することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、（ａ）哺乳類（ヒト、マウス、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ラットまたはウサギなど）から哺乳類細胞を得ること、（ｂ）エクスビボで哺乳類細胞を培養してエクスビボ培養物を形成すること、（ｃ）形質導入された哺乳類細胞を形成するために、本明細書に記載のＡＡＶ（例えば、キャプシドに封入された補正ゲノムを含む複製欠損ＡＡＶ）で哺乳類細胞を形質導入すること、（ｄ）形質導入された哺乳類細胞を哺乳類に投与すること、を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、（ａ）第１の哺乳類から哺乳類細胞を得ること、（ｂ）エクスビボで哺乳類細胞を培養してエクスビボ培養物を形成すること、（ｃ）哺乳類細胞を、本明細書に記載のＡＡＶ（例えば、形質導入された哺乳類細胞を形成するためにエクスビボ培養物中のキャプシドに封入された補正ゲノムを含む複製欠損ＡＡＶ）に形質導入し；そして（ｄ）形質導入された哺乳類細胞第２の哺乳類に投与することを含む。いくつかの実施形態では、第１哺乳類、及び第２哺乳類は異なる種である（例えば、第１哺乳類はヒト、マウス、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ラットまたはウサギであり、第２哺乳類は異なる種である）。いくつかの実施形態では、第１哺乳類、及び第２哺乳類は同じ種である（例えば、ヒト、マウス、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ラットまたはウサギの両方）。いくつかの実施形態では、本方法は、インビボで哺乳類の細胞にＡＡＶで形質導入するのに有効な量で、哺乳類（ヒト、マウス、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ラット、またはウサギなど）に、本明細書に記載のＡＡＶ（例えば、キャプシドに封入された補正ゲノムを含む複製欠損ＡＡＶ）を、投与することを含む。

【0107】

本方法のいずれか１つのいくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、結合組織（血液を含む）、筋肉組織、神経組織、及び上皮組織からなる群から選択される組織からのものである。本方法のいずれか１つのいくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、肺、心臓、肝臓、腎臓、筋肉、脳、眼、乳房、骨、及び軟骨からなる群から選択される器官由来である。本方法のいずれか１つのいくつかの実施形態では、哺乳類細胞は幹細胞である。いくつかの実施形態では、幹細胞は、造血幹細胞または末梢血幹細胞である。方法のいずれか１つのいくつかの実施形態では、哺乳類細胞はＣＤ３４＋細胞である。

【0108】

本方法のいずれか１つのいくつかの実施形態では、外因性ヌクレアーゼ、または外因性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を同時形質導入または同時投与することなく、ＡＡＶ（例えば、クラッドＦ ＡＡＶ）を形質導入または投与する。例示的な外因性ヌクレアーゼには、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）が含まれる。本方法のいずれか１つのいくつかの実施形態では、ＡＡＶは、外因性ジンクフィンガーヌクレアーゼまたは外因性ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を同時形質導入または同時投与することなく、形質導入または投与される。いくつかの実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ＡＡＶＳ１遺伝子座を標的とするＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＡＡＶＳ１遺伝子座におけるＰＰＰ１Ｒ１２Ｃの第１のイントロンを標的とするＤＮＡ結合ドメイン）を含むジンクフィンガーヌクレアーゼである。

【0109】

本方法のいずれか１つのいくつかの実施形態では、ＡＡＶ（例えば、Ｃｌａｄｅ Ｆ ＡＡＶ）は、哺乳類染色体の標的遺伝子座に編集エレメントを組み込むために、少なくとも約１％（例えば、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または約１００％）の染色体組み込み効率を有する。本方法のいずれか１つのいくつかの実施形態では、ＡＡＶ（例えば、Ｃｌａｄｅ Ｆ ＡＡＶ）は、外因性ヌクレアーゼの非存在下で哺乳類染色体の標的遺伝子座に編集エレメントを組み込むために、少なくとも約１％（例えば、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または約１００％）の染色体組み込み効率を有する。本方法のいずれか１つのいくつかの実施形態では、補正ゲノムの編集エレメントは、哺乳類細胞の１０％〜７０％、２０％〜７０％、４０％〜７０％、５０％〜７０％、１０％〜８０％、２０％〜８０％、４０％〜８０％、５０％〜８０％、１０％〜９０％、２０％〜９０％、４０％〜９０％、５０％〜９０％、１０％〜１００％、２０％〜１００％、４０％〜１００％、または５０％〜１００％の範囲の染色体組み込み効率で哺乳類染色体の標的遺伝子座に組み込まれる。本方法のいずれか１つのいくつかの実施形態では、補正ゲノムの編集エレメントは、外因性ヌクレアーゼの非存在下で、哺乳類細胞の１０％〜７０％、２０％〜７０％、４０％〜７０％、５０％〜７０％、１０％〜８０％、２０％〜８０％、４０％〜８０％、５０％〜８０％、１０％〜９０％、２０％〜９０％、４０％〜９０％、５０％〜９０％、１０％〜１００％、２０％〜１００％、４０％〜１００％、または５０％〜１００％の範囲の染色体組み込み効率で哺乳類染色体の標的遺伝子座に組み込まれる。

【0110】

本方法のいずれか１つのいくつかの実施形態では、ＡＡＶ（例えば、Ｃｌａｄｅ Ｆ ＡＡＶ）は、哺乳類染色体の標的遺伝子座に組み込まれた編集エレメントを含む対立遺伝子について、少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％）の細胞集団における対立遺伝子頻度をさらに特徴とする染色体組み込み効率を有する。いくつかの実施形態では、細胞集団における対立遺伝子頻度は、インビトロで本明細書で提供される細胞タイプの集団（例えば、ＣＤ３４＋造血幹細胞株（ＨＳＣ）、Ｋ５６２ ＨｅｐＧ２ヒト肝細胞株、末梢血幹細胞、臍帯血幹細胞、ＣＤ３４＋末梢血幹細胞、ＷＩ−３８ヒト二倍体線維芽細胞株、ＭＣＦ７ヒト乳癌細胞株、ＳＣＩＤ−Ｘ１ ＬＢＬヒトＥＢＶ不死化Ｂ細胞株、初代ヒト肝細胞、初代肝類洞内皮細胞、または初代骨格筋筋芽細胞）を含むが、これらに限定されない。

【0111】

特定の実施形態によれば、対象の幹細胞のゲノムをエクスビボで編集し、編集された細胞を対象に移植して疾患または障害を治療することによって、対象の疾患または障害を治療する方法が提供される。特定の実施形態では、対象の幹細胞のゲノムを編集することによって対象の疾患または障害を治療する方法は、対象の幹細胞を、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントで形質導入するステップ形質導入された幹細胞を対象に移植する段階を含み、形質導入された幹細胞は、疾患または障害を治療する。特定の実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは、１つ以上のＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアント、標的遺伝子座に組み込まれる１つ以上の治療用ヌクレオチド配列を含む編集エレメント（標的カセット）に隣接し、標的遺伝子座（標的部位）の上流にある領域と相同性を有する５’相同アームポリヌクレオチド配列、及び３’相同アームポリヌクレオチド配列（標的カセット）に隣接し、標的遺伝子座（標的部位）の下流にある領域と相同性を有する。特定の実施形態において、幹細胞への形質導入は、さらなる外因性ヌクレアーゼなしに実施され得る。特定の実施形態では、１つ以上の治療用ヌクレオチド配列は、組み込みの前にＤＮＡ切断のためのさらなる外因性ヌクレアーゼを必要とせずに、ゲノムに組み込まれ得る。

【0112】

特定の実施形態では、細胞が幹細胞である場合、治療される疾患または障害は、ゲノムの１つ以上の変異によって引き起こされる任意の疾患または障害であり得る。特定の実施形態では、治療される疾患または障害は、遺伝性代謝疾患、リソソーム蓄積症、ムコ多糖症、免疫不全疾患、ならびにヘモグロビノパシー疾患及び感染症から選択される。特定の実施形態では、編集される細胞が幹細胞である場合、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは、ＡＡＶＦ７、ＡＡＶＦ１２、ＡＡＶＦ１５、ＡＡＶＦ１７、改変体、変異体、及びそれらの組み合わせの群から選択され得る。ある実施形態では、編集される細胞が幹細胞である場合、Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶＦ７、ＡＡＶＦ１２、ＡＡＶＦ１５、ＡＡＶＦ１７、変異体、変異体、及びそれらの組み合わせの群から選択され得る。特定の実施形態では、Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは、ＡＡＶＦ７（配列番号２７）、ＡＡＶＦ１２（配列番号３０）、ＡＡＶＦ１５（配列番号３３）、ＡＡＶＦ１７（配列番号３５）、バリアント、断片、変異体、及びそれらの組み合わせの群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む１つ以上のＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアントを含み得る。特定の実施形態では、Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは、ＡＡＶＦ５（配列番号２５）、ＡＡＶＦ７（配列番号２７）、ＡＡＶＦ１２（配列番号３０）、ＡＡＶＦ１５（配列番号３３）、ＡＡＶＦ１７（配列番号３５）、バリアント、断片、変異体、及びそれらの組み合わせ及びＡＡＶＦ５の群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む１つ以上のＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアントを含み得る。特定の実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントが、ＡＡＶＦ７（配列番号８）、ＡＡＶＦ１２（配列番号１２）、ＡＡＶＦ１５（配列番号１６）、ＡＡＶＦ１７（配列番号１３）、バリアント、断片、変異体、及びそれらの組み合わせの群から選択されるポリペプチド配列を含む１つ以上のＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアントを含み得る。特定の実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントが、ＡＡＶＦ５（配列番号１１）、ＡＡＶＦ７（配列番号８）、ＡＡＶＦ１２（配列番号１２）、ＡＡＶＦ１５（配列番号１６）、ＡＡＶＦ１７（配列番号１３）、バリアント、断片、変異体、及びそれらの組み合わせの群から選択されるポリペプチド配列を含む１つ以上のＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアントを含み得る。

【0113】

別の実施形態では、ＣＤ３４^＋ＨＳＣまたは別の供給源からのゲノム編集が可能なＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは、ＨＳＣ及びｉＰＳＣを含む幹細胞、及び、心臓、関節、脳、筋肉、肝臓を含む中枢神経系などの他の細胞の高効率な形質導入のために用いられても良い。ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントがインビトロで使用される場合、それらは研究及び調査の目的のために、または対象に後で移植される細胞または組織を調製するために使用され得る。好ましくは、対象は、ヒトなどの哺乳類であるが、本ベクターによって形質導入され得る組織を有する任意の他の動物、及びそれらのベクターを使用する方法であり得る。本発明のＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは、ヒト及び獣医学的使用の両方に適している。ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントはまた、ＨＳＣなどの幹細胞の一過性形質導入のためにインビトロで使用され得る。形質導入の長さは、培養条件によって制御することができる。ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントがインビボで使用される場合、これらは、肝細胞または軟骨細胞などの標的細胞における取り込みまたは使用のための治療を受ける対象に直接投与され得る。ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントが中枢神経系の細胞を形質導入するために使用される場合、それらは好ましくは血液脳関門を通過してその有効性を維持することができる。

【0114】

ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントを対象に直接投与することにより、対象の細胞のインビボゲノム編集により対象の疾患または障害を治療する方法も本明細書で提供される。特定の実施形態において、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは、本明細書に記載の任意のＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントであり得る。特定の実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは、１つ以上のＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアント、標的遺伝子座に組み込まれる１つ以上の治療用ヌクレオチド配列を含む編集エレメント（標的カセット）に隣接し、標的遺伝子座（標的部位）の上流にある領域と相同性を有する５’相同アームポリヌクレオチド配列、及び３’相同アームポリヌクレオチド配列（標的カセット）に隣接し、標的遺伝子座（標的部位）の下流にある領域と相同性を有する。特定の実施形態において、投与されるＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは、対象の細胞のゲノム編集によって疾患または障害を治療する。特定の実施形態では、インビボゲノム編集は、さらなる外因性ヌクレアーゼなしで行われ得る。特定の実施形態では、１つ以上のＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアントは、本明細書で提供されるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を含む。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、米国特許公開第２０１３００９６１８２Ａ１号の図１または本明細書の図１に提供される配列、バリアント、断片、変異体、及びそれらの組み合わせから選択され得る。特定の実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは、好ましくは、注射、吸入、吸収、摂取または他の方法のような適切な投与経路を介して治療有効量で投与される。

【0115】

Ｘｕら、Ｗａｎｇら、及びＣａｒｂｏｎａｒｏらを含む以前の研究は、ウイルスベクターのインビボ送達後のＨＳＣの形質導入を示した（Ｘｕ ２００４；Ｗａｎｇ ２０１４；及びＣａｒｂｏｎａｒｏ ２００６参照）。しかし、これらの３つの研究のすべてに、レトロウイルス（Ｘｕ ２００４）またはレンチウイルス（Ｗａｎｇ ２０１４、及びＣａｒｂｏｎａｒｏ ２００６）のいずれかが関与していた。さらに、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．及びＣａｒｂｏｎａｒｏ ｅｔ ａｌ．では注射が新生児マウスで実施され、ラパマイシン、及び大腿内注射が、Ｗａｎｇらの効率的な形質導入に必要であった。しかしながら、これらの論文のいずれも、成体マウスへのＣｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントのインビボ形質導入によるＨＳＣの形質導入を報告していない。実施例３で提供される新規な結果は、静脈注射によるＨＳＣ上でのＡＡＶベクター形質導入を最初に示すものである。

【0116】

以下の実施例３に示すように、ＡＡＶＦ７またはＡＡＶＦ１７でシュードタイプ化されたＣｌａｄｅ Ｆベクター（またはＡＡＶベクターバリアント）の静脈内注射は、インビボでのヒトＣＤ３４＋造血幹細胞、及び前駆細胞の形質導入をもたらした。静脈注射されたＣｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターは、ヒト造血部位に輸送され、ヒト細胞に形質導入された。Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントの静脈注射は、ヒトＣＤ３４＋幹前駆細胞ならびにそれらのＣＤ４５＋子孫におけるＶｅｎｕｓ発現をもたらした。これらのデータは、幹細胞採取、エクスビボ形質導入、レシピエントのコンディショニング、及びその後の形質導入細胞の移植を必要とせずに、インビボゲノム工学にＣｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントの静脈内注射を用いることができることを示している。このアプローチにより、幹細胞遺伝子治療は、世界中の患者にとってより安全で、よりアクセスしやすく、安価であり、入院の必要性がなくなる。

【0117】

特定の実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントを対象に直接投与することによって、対象の細胞のインビボゲノム編集によって対象の疾患または障害を治療する方法が開示される。特定の実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは、１つ以上のＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアントと、ゲノムの標的遺伝子座（標的部位）に組み込まれる１つ以上の治療用ヌクレオチド配列を含む編集エレメント（標的カセット）と、編集エレメント（標的カセット）に隣接して、標的遺伝子座（標的部位）の上流にある領域と相同性を有する５’相同アームポリヌクレオチド配列と、編集エレメント（標的カセット）に隣接して、標的遺伝子座（標的部位）の下流にある領域と相同性を有する、３’相同アームポリヌクレオチド配列とを含んでも良く、該ベクターは前記対象の細胞に形質導入し、該１つ以上の治療用ヌクレオチド配列を前記細胞のゲノムに組み込む。特定の実施形態では、１つ以上のＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアントは、ＡＡＶＦ１（配列番号２）、ＡＡＶＦ２（配列番号３）、ＡＡＶＦ１１（配列番号４）、ＡＡＶＦ３（配列番号５）、ＡＡＶＦ４（配列番号６）、ＡＡＶＦ６（配列番号７）、ＡＡＶＦ７（配列番号８）、ＡＡＶＦ８（配列番号９）、ＡＡＶＦ９（配列番号１０）、ＡＡＶＦ５（配列番号１１）、ＡＡＶＦ１２（配列番号１２）、ＡＡＶＦ１７（配列番号１３）、ＡＡＶＦ１３（配列番号１４）、ＡＡＶＦ１４（配列番号１５）、ＡＡＶＦ１５（配列番号１６）、ＡＡＶＦ１６（配列番号１７）、バリアント、断片、変異体、及びそれらの任意の組み合わせを含む。特定の実施形態では、１つ以上のＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアントは、ＡＡＶＦ７（配列番号８）またはＡＡＶＦ１７（配列番号１３）のポリペプチド配列を含み得る。特定の実施形態では、１つ以上のＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアントは、ＡＡＶＦ５（配列番号１１）、ＡＡＶＦ（配列番号８）またはＡＡＶＦ１７（配列番号１３）のポリペプチド配列を含み得る。特定の実施形態において、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは、１つ以上の治療用ヌクレオチド配列のためのプロモーターを含まない。特定の実施形態では、標的遺伝子座（標的部位）はセーフハーバー部位であり得る。特定の実施形態では、セーフハーバー部位は、第１９染色体上のＡＡＶＳ１遺伝子座であり得る。特定の実施形態では、細胞は幹細胞であってもよい。特定の実施形態において、幹細胞は、造血幹細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、または間充織幹細胞であり得る。特定の実施形態では、疾患または障害は、細胞ゲノムにおける１つ以上の変異によって引き起こされ得る。特定の実施形態では、疾患または障害は、遺伝性代謝疾患、リソソーム蓄積症、ムコ多糖症、免疫不全疾患、及びヘモグロビン異常症、及び感染症から選択され得る。

【0118】

インビボ適用の有効性をさらに実証することにより、単離された変異体（ＡＡＶ９と比較して）を有する免疫不全マウスへの形質導入細胞の移植は、延長された持続的な導入遺伝子発現をもたらし、遺伝子治療に使用され得る。特定の実施形態では、全身的に送達される場合、これらのベクターは、遺伝性、後天性、感染性、及び腫瘍性疾患の治療に関与する肝臓、及び軟骨の指向性を示す。肝形質導入に関して、本ＡＡＶ単離体は、肝臓への全身性遺伝子送達の現在の金標準であるＡＡＶ８よりも約１０倍高い肝形質導入レベルを有する。この性質は、血友病、酵素欠乏症、及びアテローム性動脈硬化症のような疾患のための肝臓からの遺伝子ベースの酵素補充療法に利用することができる。関節における軟骨組織のための本ＡＡＶ単離物の付加指向性は、関節炎、骨粗鬆症または他の軟骨／骨ベースの疾患のような骨障害の治療のために利用され得る。したがって、変異体配列、及び方法は、長期間の組み込みが望ましくない一過性形質導入のために使用され得る。

【0119】

ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦキャプシドファミリーまたはＡＡＶキャプシドバリアントファミリーのメンバーはＨＳＣを形質導入し、例えばＡＡＶＦ１５及びＡＡＶＦ１７は、持続的な遺伝子発現による長期生着をもたらすので、したがって、幹細胞遺伝子治療ベクターの強力な候補である。ＡＡＶＦ１７、及びＡＡＶＦ１５（「ＨＳＣ１７」、及び「ＨＳＣ１５」と略称する）は、移植後２２週間までの最高レベルのインビボでの長期間の形質導入を支持した。ＡＡＶ変異体の静脈内注射後の連続生物発光イメージングは、ＡＡＶＦ１５が一般にインビボでの長期導入遺伝子発現の最高レベルを支持することを明らかにした。ＡＡＶＦ１３、及び１７を含む他のＡＡＶ変異体も強力なインビボ形質導入を支持した。

【0120】

ＡＡＶＦ１５は、高度に肝臓向性であり、ＡＡＶ９より約５〜１０倍高いことが判明した。ＡＡＶＦ１３、及びＡＡＶＦ１５はまた、心臓、及び骨格筋にＡＡＶ９よりも少なくとも１０倍良好に形質導入した。インビトロ中和力価は、プールされたヒトＩＶＩＧにおけるＡＡＶＦ１〜９キャプシドに対する抗体の有病率はＡＡＶ９と類似していたが、ＡＡＶＦ１３、ＡＡＶＦ１５、ＡＡＶＦ１６、及びＡＡＶＦ１７に対する抗体は幾分優勢ではないことを明らかにした。インビボ中和アッセイは、ＡＡＶＦ１５をＩＶＩＧ投与した後の肝臓、及び筋肉において、ＡＡＶ９と比較して１００倍以上高いベクターゲノムコピー数／細胞が見出され、既存の抗体がＡＡＶＦ１５を完全に中和しないことを示唆した。筋肉疾患または障害は、冠状動脈性心疾患または心筋症などの心臓を含む疾患または障害を有する筋肉細胞を含む任意の細胞、組織、器官または系を含むことができる。

【0121】

さらに、部位特異的変異誘発実験は、ＡＡＶＦ１５におけるＲ５０５Ｇ変異が肝臓向性の増強の原因であることを示している。ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは、血友病、アテローム性動脈硬化症、及び種々の先天性代謝異常などの遺伝病の全宿主を治療するために使用され得る。ある例では、ＡＡＶＦ１５は血友病Ｂを効果的に治療する。このファミリーの一部のメンバーは、関節炎などの関節、及び軟骨疾患を治療するために使用され得る、全身注射後の関節を標的にする。家族の他のメンバーは、静脈注射の際に心臓を標的とする。しかし、家族の他のメンバーは脳を標的にしている。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＦ５キャプシドタンパク質を含むベクターは、ＡＡＶＦ５が複数の細胞タイプを形質導入することが示されたので、本明細書で提供される方法、キットまたは組成物の一部として提供される（図４参照）。

【0122】

特定の実施形態では、ゲノム編集によって対象における神経学的疾患または障害を治療する方法は、血液脳関門、血液眼関門または血液神経関門を通過することができるＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントを投与することを含み得る。本明細書中に開示される特定のＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントの特定のものは、改変されたウイルスベクターを用いて、遺伝子治療または他の診断または治療目的のために任意のベクターに接近可能であることが以前は不明であった生物学的接合部を横断する独特の能力を有する。これらの接合部は共通の特性を有する。血液脳関門は、体内を循環する血液と中枢神経系の脳細胞外液との間の分離であり、毛細血管の周りの密着結合によって形成される。血液脳関門は、一般に、小さな疎水性分子の拡散による通過のみを可能にする。血液−眼球関門は、局所血管と眼の大部分との間でなされる分離であり、網膜、及び虹彩の毛細管の内皮によって作られる。血液−神経関門は、軸索、シュワン細胞、及び末梢神経機能の他の関連する細胞が、神経鞘、及び投資する髄膜内の内胚葉の微小血管からなる生理学的空間である。これらの３つの障壁と同様に、内部環境、ここでは血管や他の細胞外空間における劇的な濃度変化から神経を保護するための透過性が制限されている。これらの障壁のいずれかを横断するベクターは、神経疾患または障害を治療するため、または標識された及び／または診断薬として作用するために、１つ以上の治療用ヌクレオチド配列を送達する独特な能力を有する。ＡＡＶＦ１５、ＡＡＶＦ１５Ａ３４６Ｔ、及びＡＡＶＦ１５Ｒ５０５Ｇが、これらの生物学的障壁を横切るのに特に適していると実験的に立証されたＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントの特定のものが含まれる。

【0123】

脳、脊髄、神経節、運動神経、感覚神経の疾患または障害などの細胞または臓器型によって一般的に分類され得る、当業者に周知の多くの神経学的疾患または障害が存在する、自律神経、視神経、網膜神経、及び聴覚神経が挙げられる。例として、脳疾患または障害は、癌または他の脳腫瘍、炎症、細菌感染、狂犬病、アメーバまたは寄生虫感染を含むウイルス感染、脳卒中、麻痺、アルツハイマー病、パーキンソン病または他の認知症、脳卒中、筋ジストロフィー、筋ジストロフィー、震え、脳性麻痺、自閉症、ダウン症候群、注意欠陥多動性障害、及び注意欠陥多動性障害、睡眠時無呼吸症候群、睡眠時無呼吸症候群、睡眠時無呼吸症候群、慢性炎症、てんかん、昏睡、髄膜炎、多発性硬化症、重症筋無力症、種々の神経障害、不穏下肢症候群、及びテイ−サックス病が挙げられる。

【0124】

筋肉疾患または障害には、筋萎縮症、慢性疲労症候群、線維筋痛、筋ジストロフィー、多発性硬化症、萎縮、痙攣、痙攣、硬直、皮膚筋炎、横紋筋融解症、ミオトニック障害、麻痺、腱炎、リウマチ性多発筋痛症、癌、及び腱炎、及び腱鞘炎などの腱障害を含むが、これらに限定されない。

【0125】

心疾患または障害には、冠動脈疾患、冠状動脈性心疾患、うっ血性心不全、心筋症、心筋炎、心膜疾患、先天性心疾患、癌、心内膜炎、及び弁疾患が含まれる。

【0126】

肺疾患または障害としては、ほんの一例として、喘息、アレルギー、慢性閉塞性肺疾患、気管支炎、肺気腫、嚢胞性線維症、肺炎、結核、肺水腫、癌、急性呼吸窮迫症候群、塵肺症、及び間質性肺疾患。

【0127】

肝臓疾患または障害には、例としてのみであるが、癌、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、及びＣ型肝硬変、黄疸、及び肝臓病が含まれる。腎疾患、先天性疾患、多発性嚢胞腎疾患、腎炎、初代高酸素尿症、及びシスチン尿症が挙げられるが、これらに限定されない。脾臓の疾患または障害には、単なる例として、癌、脾臓梗塞、サルコイドーシス、及びゴーシェ病が含まれる。骨疾患または障害は、ほんの一例として、骨粗鬆症、癌、低骨密度、パジェット病、及び感染を含む。

【0128】

治療用ヌクレオチド配列またはＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆベクター、またはＡＡＶベクターの変異体によって、またはで搬送小さな分子を用いて治療これらの疾患または障害のいずれかを用いて、治療用ヌクレオチド配列は、一例として、核酸は、治療用タンパク質をコードすることができる、アポトーシスタンパク質、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、他のＲＮＡサブタイプまたはそれらの組み合わせのような、癌のような癌の治療に使用することができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、本明細書に記載のように単離、及び精製される。有効性を高め、汚染を低減するために、単離、及び精製がインビボ投与に好ましい。ベクターは、１つの生物から単離され、別の生物に導入された遺伝子または他の遺伝物質である導入遺伝子に永続的または一時的に形質導入することができる。ここで、他の生物はベクターを受ける被験者であってもよい。

【0129】

特定の実施形態では、ゲノム編集のためのＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは、本明細書に示される所与の疾患または障害についての所与の標的細胞または組織における最も高い有効性の実験結果に基づいて選択され得る。筋肉を介して対象に投与される筋肉疾患または障害ならびに抗体遺伝子または他のワクチン処置のために、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶＦ７、ＡＡＶＦ１３、ＡＡＶＦ１５、及びＡＡＶＦ１７の群から選択されるＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアント；ｂ）心臓、及び肺の疾患または障害について、ＡＡＶＦ１３、ＡＡＶＦ１５、及びＡＡＶＦ１７の群から選択されるベクター；ｃ）肝臓または神経系の疾患または障害について、ＡＡＶＦ５、及びＡＡＶＦ１５から選択されるベクター；ｄ）造血幹細胞を処置した状態については、ベクターＡＡＶＦ１７；ｅ）Ｂ細胞前駆体を形質導入することによって治療される状態については、ベクターＡＡＶＦ５；ｆ）骨髄性及び赤血球系の前駆細胞を形質導入することによって治療される状態については、ベクターＡＡＶＦ１２；ｇ）リンパ節、腎臓、脾臓、軟骨、及び骨の疾患または障害のために、ＡＡＶＦ７、ＡＡＶＦ１３、ＡＡＶＦ１５、及びＡＡＶＦ１７の群から選択されるベクターの群から選択される、ベクターであって、該ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは細胞または組織に形質導入し、１つ以上の治療用ヌクレオチド配列は細胞のゲノムに組み込まれ、疾患または障害を治療する。特定の実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントは、本明細書に記載の細胞の指向性を示す１つ以上のＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアント（ＡＡＶ９と比較して）を含み得る。

【0130】

対象は、この方法が作用する任意の動物であるが、好ましくはヒトであり得る哺乳類である。ベクターが抗体遺伝子または他のワクチン処置を含む場合、それは筋肉内注射により投与され、ＨＩＶ、インフルエンザ、マラリア、破傷風、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、ＨＰＶ、百日咳または他のものを含む疾患に対して免疫学的防御を提供し得るワクチン。ベクターは、パッケージングされ、単離され、精製され得、少なくとも１つの治療用ヌクレオチド配列を有する任意のタイプの幹細胞に形質導入され得る。ベクターはまた、導入遺伝子を形質導入するか、または対象及び／または同じ種の他の対象に内因性の矯正遺伝子を担持し得る。

【0131】

「ＡＡＶ」はアデノ随伴ウイルスである。この用語は、他に指示がない限り、ウイルスまたはその誘導体、ウイルスサブタイプ、ならびに天然、及び組換え形態を指すために使用され得る。ＡＡＶは、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２などと呼ばれる１００以上の異なるサブタイプを有し、ヒト、及び非ヒト由来ＡＡＶの両方を含む。約１２のＡＡＶ血清型がある。ＡＡＶの様々なサブタイプは、多くの異なる細胞タイプを形質導入するための組換え遺伝子導入ウイルスとして使用することができる。

【0132】

ポリヌクレオチドに適用される「組換え」は、ポリヌクレオチドが、クローニング、制限またはライゲーションステップ、及び天然に存在するポリヌクレオチドとは異なる構築物を生じる他の手順の様々な組み合わせの産物であることを意味する。組換えウイルスは、元のポリヌクレオチド構築物の複製物、及び元のウイルス構築物の子孫を含む、組換えポリヌクレオチドを含むウイルス粒子である。「ｒＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ起源ではないポリヌクレオチド配列（すなわち、ＡＡＶに対して異種のポリヌクレオチド）を含む組換えＡＡＶベクターを指し、これは、通常、細胞の遺伝子形質転換のための目的の配列である。

【0133】

本明細書で使用するＡＡＶの「ヘルパーウイルス」は、ＡＡＶを複製して哺乳類細胞によってパッケージングすることを可能にするウイルスである。ＡＡＶのヘルパーウイルスは、例えば、アデノウイルス（サブグループＣのアデノウイルス５型など）、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス、エプスタインバーウイルス、及びサイトメガロウイルスなど）、及びポックスウイルスを含む。

【0134】

「関節組織」は、軟骨、滑液、及び成熟した前駆細胞、及び（ｉ）軟骨産生細胞、（ｉｉ）Ｉ型滑膜細胞、（ｉｉｉ）ＩＩ型滑膜細胞、（ｉｖ）常在または循環白血球、（ｖ）線維芽細胞、（ｖｉ）血管内皮細胞、及び（ｖｉｉ）周皮細胞を生じさせる、またはそれを生じる幹細胞を含む多数の組織からなる。

【0135】

「複製適格」ウイルスとは、感染性で、感染細胞内で複製可能なウイルスをいう。ＡＡＶの場合、複製能力は、一般に、機能的ＡＡＶパッケージング遺伝子、ならびにアデノウイルス、及び単純ヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルス遺伝子の存在を必要とする。一般に、１つ以上のＡＡＶパッケージング遺伝子がないため、ｒＡＡＶベクターは複製不能（本明細書では複製欠損とも呼ばれる）である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶがＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、及び／またはＡＡＶ ｃａｐ遺伝子の本質的な欠損を有する場合、ＡＡＶは複製欠損（または複製不能）とみなされ得る。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、及び／またはＡＡＶ ｃａｐ遺伝子が欠損している場合、複製欠損（または複製不能）とみなされ得る。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶバリアント単離物を含む組成物は無細胞組成物である。組成物は、一般に、細胞タンパク質、及び／または他の汚染物質を含まず、緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液）、塩（例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２）、イオン（例えば、マグネシウムイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン）、防腐剤、可溶化剤、または界面活性剤（例えば、非イオン性界面活性剤；ジメチルスルホキシド）を含む。

【0136】

別の実施形態では、発現カセットは、Ｃｌａｄｅ ＦキャプシドまたはＡＡＶ変異体単離物の１つ以上を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、少なくとも約９５％、９６％、９７％、より好ましくは約９８％、最も好ましくは約９９％の配列同一性を有する。パーセンテージ同一性は、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４（１９８８）のような多くの配列比較プログラムまたは方法、ならびにＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、またはＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．から）、または国立バイオテクノロジー情報センターのウェブサイトから入手できるＢＬＡＳＴなどの、比較アルゴリズムを実施するプログラムのいずれかを用いて計算することができる。

【0137】

別の態様では、発現カセットは、キャプシドタンパク質Ｖ１〜Ｖ３（ＶＰ１〜ＶＰ３としても参照される）を含む３つの遺伝子の部分からなる、Ｃｌａｄｅ ＦキャプシドまたはＡＡＶバリアント単離物の１つ以上を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。例えば、カセットは、キャプシドＡＡＶＦ１由来のＶ１、ＡＡＶ９ｈｕ．１４と比較した標準Ｖ２、及びＡＡＶＦ１７キャプシド由来のＶ３を含むことができる。さらに別の実施形態において、キャプシドは、キャプシド遺伝子成分のそれぞれの１つより多くを含み得る。例えば、Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアントは、本明細書に記載のキャプシド配列についてＶＰ１〜ＶＰ３（Ｖ１〜Ｖ３）のいずれかから選択することができ、所望の性質が増加する限り任意の順序、及び任意の組み合わせで組み合わせることができる形質導入が達成される。例えば、キャプシド配列は、ＶＰ１Ａ−ＶＰ１Ｂ−ＶＰ２−ＶＰ３（Ｖ１Ａ−Ｖ１Ｂ−Ｖ２−Ｖ３）、ＶＰ３−ＶＰ１−ＶＰ２（Ｖ３−Ｖ１−Ｖ２）、またはＶＰ１−ＶＰ２−ＶＰ３Ａ−ＶＰ３Ｂ（Ｖ１−Ｖ２ −Ｖ３Ａ−Ｖ３Ｂ）であり得る。

【0138】

別の実施形態は、対象の免疫化方法を含む。Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアントを含む組成物は、免疫学的反応を引き起こして対象に免疫をもたらすように対象に導入され得る。Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアントは、組成物中に単独でまたは発現カセットの一部として存在し得る。一実施形態では、発現カセット（またはポリヌクレオチド）は、遺伝子送達ベクターを使用して導入することができる。遺伝子送達ベクターは、例えば、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターであり得る。例示的なウイルスベクターとしては、シンドビスウイルス由来ベクター、レトロウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。免疫学的応答を生じさせるために有用な組成物はまた、微粒子担体を用いて送達され得る。さらに、このような組成物は、例えば、金またはタングステン粒子上に被覆することができ、被覆された粒子は、例えば遺伝子銃を使用して対象に送達される。組成物はまた、リポソームとして処方され得る。この方法の一実施形態において、対象は哺乳類であり、例えばヒトであり得る。

【0139】

用語「親和性タグ」は、本明細書では、第２ポリペプチドの精製または検出を提供するためまたは第２ポリペプチドの基材への結合部位を提供するために第２ポリペプチドに結合され得るポリペプチドセグメントを示すために使用される。原則として、抗体または他の特異的結合剤が利用可能な任意のペプチドまたはタンパク質を親和性タグとして使用することができる。親和性タグは、ポリヒスチジン管、プロテインＡ（Ｎｉｌｓｓｏｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．４：１０７５，１９８５；Ｎｉｌｓｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８：３，１９９１）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（Ｓｍｉｔｈ及びＪｏｈｎｓｏｎ、Ｇｅｎｅ ６７：３１，１９８８）、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ親和性タグ（Ｇｒｕｓｓｅｎｍｅｙｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：７９５２−４，１９８５）、サブスタンスＰ、Ｆｌａｇ（商標）ペプチド（Ｈｏｐｐら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４−１０、１９８８）、ストレプトアビジン結合ペプチド、または他の抗原性エピトープまたは結合ドメインを含む。一般に、Ｆｏｒｄら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２：９５−１０７，１９９１を参照されたい。親和性タグをコードするＤＮＡは、商業的供給者（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）から入手可能である。

【0140】

利用可能な親和性タグ精製システムの数のうち、最も頻繁に使用されるものは、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ）またはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグを利用する。彼は、典型的にはイミノ二酢酸またはニトリロ三酢酸キレート基で固定化されたＮｉ＋２イオンを含むマトリックスに対する良好な選択性で結合する。この技術は、固定化金属親和性クロマトグラフィーとして知られている。弱塩基性ヒスチジンイミダゾール基のプロトン化、及び結合能力の喪失を防ぐために、Ｈｉｓタグ付きタンパク質の吸収を中性〜わずかにアルカリ性のｐＨで行う。結合したタンパク質の溶出は、イミダゾールまたは低ｐＨ条件下での置換によって引き起こされる。

【0141】

外来ＤＮＡを永久的に導入することなく体細胞から誘導された多能性幹細胞を作製する方法も記載されている。該方法は、ポリペプチド配列、またはそのＶＰ１（Ｖ１）もしくはＶＰ３（Ｖ３）部分をコードする本明細書に記載されるようなＣｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシドバリアントヌクレオチド配列を含むベクターで幹細胞を一過性に形質導入することを含む。

【0142】

これら、及び他の実験のために、当業者はＡＡＶをどのように改変、及び増殖させるかを知っている。例えば、ＡＡＶ−２は溶菌性ウイルス、及びプロウイルスの両方として増殖することができる。溶解増殖のために、ＡＡＶはヘルパーウイルスとの同時感染を必要とする。アデノウイルスまたは単純ヘルペスのいずれかが、ヘルパー機能を供給することができる。ヘルパーが利用できない場合、ＡＡＶは、ＡＡＶ末端と宿主配列との間の組換えを含む統合されたプロウイルスとして存続することができ、大部分のＡＡＶ配列は、プロウイルスにおいて無傷のままである。宿主ＤＮＡに組み込まれるＡＡＶの能力は、ヘルパーウイルスが存在しない場合の増殖を可能にする。ＡＡＶプロウイルスを保有する細胞が続いてヘルパーに感染すると、統合されたＡＡＶゲノムが救済され、生産的な溶解サイクルが生じる。特定の改変を有するｒＡＡＶベクターの構築、及び例えば改変されたキャプシドを有するｒＡＡＶ粒子の産生は、例えば、Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １２：１６９７−１７１１；Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９９）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６５：２７４−２８５；Ｎｉｃｋｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１７４−１８１；Ｗｕら（２０００）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４：８６３５−８６４７、及びＧｒｉｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：９６４−９７４。

【0143】

さらに別の態様は、本明細書に記載のＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントまたはＡＡＶ粒子を含む医薬組成物に関する。ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントまたは粒子を含む医薬組成物は、好ましくは、薬学的に許容される賦形剤、アジュバント、希釈剤、ビヒクルまたは担体、またはそれらの組み合わせを含む。「薬学的に許容される担体」は、組成物の有効成分と組み合わされたときに、成分が生物学的活性を保持し、意図しない免疫反応などの破壊的な生理学的反応を引き起こさない任意の物質を含む。薬学的に許容される担体としては、水、リン酸緩衝化生理食塩水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、及び湿潤剤が挙げられる。そのような担体を含む組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｄ．、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ Ｐａ．１８０４２、ＵＳＡ；Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”、２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｗｉｌｋｉｎｓ；Ｈ．Ｃ．Ａｎｓｅｌら、７ｔｈ ｅｄ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、及びＷｉｌｋｉｎｓ；（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ）（２０００）Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅら、３ｒｄ ｅｄ．Ａｍｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．に記載されているような周知の従来の方法によって製剤化される。そのような担体は、従来の方法によって処方することができ、適切な用量で対象に投与することができる。適切な組成物の投与は、様々な方法、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所または皮内投与によって投与することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、哺乳類への投与のために処方される。いくつかの実施形態では、組成物は、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、自己細胞移動、または同種異系細胞移動を介して哺乳類に投与するために処方される。投与経路は、もちろん、とりわけ、薬学的組成物中に含まれるベクターの種類に依存する。投与レジメンは主治医、及び他の臨床的要因によって決定される。医学分野において周知であるように、任意の１人の患者のための投薬量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、性別、投与される特定の化合物、投与の時間、及び経路、感染症または疾病、一般的な健康状態、及び他の薬物が同時に投与される。

【0144】

ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆベクターまたはキャプシドバリアントのいくつかは、形質導入された造血幹細胞の移植後、またはｒＡＡＶの直接的な全身送達の後、インビボで長期間安定した導入遺伝子発現を支持することができる。

【0145】

特定の実施形態では、Ｃｌａｄｅ ＦキャプシドまたはＡＡＶキャプシド単離体変異体を含む核酸を、新しいウイルスのゲノムに挿入することができ、ここで、Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドまたはキャプシド単離体変異体遺伝子の添加で、同じまたは類似の組織または器官 Ｃｌａｄｅ ＦキャプシドまたはＡＡＶキャプシドの指向性は、新しいウイルスに分離する。このような遺伝子治療は、インビボ、及びエクスビボの遺伝子治療手順を用いて行うことができる。例えば、米国特許第５，４７４，９３５号；Ｏｋａｄａ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：９５７−９６４，１９９６を参照のこと。ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦキャプシドまたはＡＡＶキャプシドバリアント遺伝子を用いる遺伝子治療は、典型的には、単独でまたは治療目的のために意図された別の遺伝子とともにインビトロで標的遺伝子を新規ウイルスに導入することを含む。トロピック遺伝子が１つ以上のさらなる遺伝子とともに導入される場合、好ましくは、得られたポリペプチドは、治療目的のために、Ｃｌａｄｅ ＦキャプシドまたはＡＡＶ単離物が向性を有する組織において投与される。次いで、このような治療を必要とする患者にウイルスを投与してもよく、または移植を待つ器官のように、エクスビボで投与してもよい。ウイルスは、レトロウイルス、ＲＮＡウイルス、アデノウイルスベクターなどのＤＮＡウイルス、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターなどであってもよい。新規ウイルスベクターを封入した投与用リポソームを用いたウイルスベクターを用いたトランスフェクション法も考えられる。

【0146】

本明細書で提供される特定の実施形態によれば、本明細書に記載の１つ以上のＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントまたはその組成物または製剤を含むキットが提供される。特定の実施形態では、キット中の１つ以上のＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントを細胞のゲノム編集に使用することができる。特定の実施形態では、キットは、１つ以上のＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶベクターバリアントによるゲノム編集の効果を調べるための研究ツールとして使用することができる。

【0147】

本開示の他の態様は、本明細書に記載のＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶ変異ベクター）の組換え調製のためのパッケージングシステム、及びその使用方法に関する。いくつかの実施形態では、パッケージングシステムは、１つ以上のＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードするＲｅｐヌクレオチド配列；本明細書に記載のＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドの１つ以上のＡＡＶ Ｃａｐタンパク質をコードするＣａｐヌクレオチド配列；本明細書に記載の補正ゲノムを含み、パッケージングシステムは、キャプシド中に補正ゲノムを封入してアデノ随伴ウイルスを形成するために細胞内で作動する。

【0148】

いくつかの実施形態では、パッケージングシステムは、Ｒｅｐヌクレオチド配列、及びＣａｐヌクレオチド配列を含む第１のベクター、及び補正ゲノムを含む第２のベクターを含む。本明細書に記載のパッケージングシステムの文脈で使用される場合、「ベクター」とは、核酸を細胞（例えば、プラスミド、ウイルス、コスミド、人工染色体など）に導入するための媒体である核酸分子を指す。

【0149】

パッケージングシステムのいくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドが、Ｃｌａｄｅ Ｆ ＶＰ１、Ｃｌａｄｅ Ｆ ＶＰ２、及びＣｌａｄｅ Ｆ ＶＰ３から選択される少なくとも１つまたは少なくとも２つのタンパク質を含む。パッケージングシステムのいくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドが、Ｃｌａｄｅ Ｆ ＶＰ１、Ｃｌａｄｅ Ｆ ＶＰ２、及びＣｌａｄｅ Ｆ ＶＰ３タンパク質を含む。パッケージングシステムのいくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドが、ＡＡＶ９、ＡＡＶＨＳＣ１、ＡＡＶＨＳＣ２、ＡＡＶＨＳＣ３、ＡＡＶＨＳＣ４、ＡＡＶＨＳＣ５、ＡＡＶＨＳＣ６、ＡＡＶＨＳＣ７、ＡＡＶＨＳＣ８、ＡＡＶＨＳＣ９、ＡＡＶＨＳＣ１０、ＡＡＶＨＳＣ１１、ＡＡＶＨＳＣ１２、ＡＡＶＨＳＣ１３、ＡＡＶＨＳＣ１４、ＡＡＶＨＳＣ１５、ＡＡＶＨＳＣ１６、ＡＡＶＨＳＣ１７、ＡＡＶＨＵ３１、及びＡＡＶＨＵ３２からなる群より選択される。

【0150】

パッケージングシステムのいくつかの実施形態では、Ｒｅｐヌクレオチド配列がＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質をコードする。パッケージングシステムのいくつかの実施形態では、コードされるＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質が、Ｒｅｐ７８／６８またはＲｅｐ６８／５２の少なくとも１つである。パッケージングシステムのいくつかの実施形態では、ＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、配列番号４０のＡＡＶ２ Ｒｅｐアミノ酸配列に対して最小パーセント配列同一性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、最小パーセント配列同一性 全長にわたって少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）である。 のＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質のアミノ酸配列の一部である。

【0151】

例示的なＡＡＶ２ Ｒｅｐアミノ酸配列（配列番号４０）−
ｍｐｇｆｙｅｉｖｉｋｖｐｓｄｌｄｅｈｌｐｇｉｓｄｓｆｖｎｗｖａｅｋｅｗｅｌｐｐｄｓｄｍｄｌｎｌｉｅｑａｐｌｔｖａｅｋｌｑｒｄｆｌｔｅｗｒｒｖｓｋａｐｅａｌｆｆｖ ｑｆｅｋｇｅｓｙｆｈｍｈｖｌｖｅｔｔｇｖｋｓｍｖｌｇｒｆｌｓｑｉｒｅｋｌｉｑｒｉｙｒｇｉｅｐｔｌｐｎｗｆａｖｔｋｔｒｎｇａｇｇｇｎｋｖｖｄｅｃｙｉｐｎｙｌｌｐｋｔｑｐｅｌｑｗａｗｔｎｍｅｑｙｌｓａｃｌｎｌｔｅｒｋｒｌｖａｑｈｌｔｈｖｓｑｔｑｅｑｎｋｅｎｑｎｐｎｓｄａｐｖｉｒｓｋｔｓａｒｙｍｅｌｖｇｗｌｖｄｋｇｉｔｓｅｋｑｗｉｑｅｄｑａｓｙｉｓｆｎａａｓｎｓｒｓｑｉｋａａｌｄｎａｇｋｉｍｓｌｔｋｔａｐｄｙｌｖｇｑｑｐｖｅｄｉｓｓｎｒｉｙｋｉｌｅｌｎｇｙｄｐｑｙａａｓｖｆｌｇｗａｔｋｋｆｇｋｒｎｔｉｗｌｆｇｐａｔｔｇｋｔｎｉａｅａｉａｈｔｖｐｆｙｇｃｖｎｗｔｎｅｎｆｐｆｎｄｃｖｄｋｍｖｉｗｗｅｅｇｋｍｔａｋｖｖｅｓａｋａｉｌｇｇｓｋｖｒｖｄｑｋｃｋｓｓａｑｉｄｐｔｐｖｉｖｔｓｎｔｎｍｃａｖｉｄｇｎｓｔｔｆｅｈｑｑｐｌｑｄｒｍｆｋｆｅｌｔｒｒｌｄｈｄｆｇｋｖｔｋｑｅｖｋｄｆｆｒｗａｋｄｈｖｖｅｖｅｈｅｆｙｖｋｋｇｇａｋｋｒｐａｐｓｄａｄｉｓｅｐｋｒｖｒｅｓｖａｑｐｓｔｓｄａｅａｓｉｎｙａｄｒｙｑｎｋｃｓｒｈｖｇｍｎｌｍｌｆｐｃｒｑｃｅｒｍｎｑｎｓｎｉｃｆｔｈｇｑｋｄｃｌｅｃｆｐｖｓｅｓｑｐｖｓｖｖｋｋａｙｑｋｌｃｙｉｈｈｉｍｇｋｖｐｄａｃｔａｃｄｌｖｎｖｄｌｄｄｃｉｆｅｑ

【0152】

パッケージングシステムのいくつかの実施形態では、パッケージングシステムが、第３のベクター、例えば、ヘルパーウイルスベクターをさらに含む。第３のベクターは、独立した第３のベクターであってもよく、第１のベクターと組み込みされていてもよいし、第２のベクターと組み込みされていてもよい。いくつかの実施形態では、第３のベクターは、ヘルパーウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む。

【0153】

パッケージングシステムのいくつかの実施形態では、ヘルパーウイルスが、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を含む）、ポックスウイルス（ワクシニアウイルスなど）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、及びバキュロウイルスからなる群より選択される。ヘルパーウイルスがアデノウイルスであるパッケージングシステムのいくつかの実施形態では、アデノウイルスゲノムが、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、及びＶＡからなる群から選択される１つ以上のアデノウイルスＲＮＡ遺伝子を含む。ヘルパーウイルスがＨＳＶであるパッケージングシステムのいくつかの実施形態では、ＨＳＶゲノムが、ＵＬ５／８／５２、ＩＣＰＯ、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、及びＵＬ３０／ＵＬ４２からなる群から選択されるＨＳＶ遺伝子の１つ以上を含む。

【0154】

パッケージングシステムのいくつかの実施形態では、第１、第２、及び／または第３のベクターが、１つ以上のトランスフェクトプラスミド内に含まれる。いくつかの実施形態では、第１のベクター、及び第３のベクターは、第１のトランスフェクションプラスミド内に含まれる。いくつかの実施形態では、第２のベクター、及び第３のベクターは、第２のトランスフェクションプラスミド内に含まれる。

【0155】

パッケージングシステムのいくつかの実施形態では、第１、第２、及び／または第３のベクターが、１つ以上の組換えヘルパーウイルス内に含まれる。いくつかの実施形態では、第１のベクター、及び第３のベクターは、組換えヘルパーウイルス内に含まれる。いくつかの実施形態では、第２のベクター、及び第３のベクターは、組換えヘルパーウイルス内に含まれる。

【0156】

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載のＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶバリアントベクター）の組換え調製のための方法を提供し、この方法は、本明細書に記載のＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ ＦベクターまたはＡＡＶバリアントベクター）を形成するために、キャプシド中に補正ゲノムを封入するために使用される。ＡＡＶの組換え調製のための例示的な方法は、一過性トランスフェクション（例えば、本明細書に記載の第１、及び第２の、及び場合により第３のベクターを含む１つ以上のトランスフェクションプラスミドによる）、ウイルス感染（例えば、１つ以上の組換えヘルパーウイルス、（例えば、本明細書に記載の第１、及び第２の、及び場合により第３のベクターを含む）アデノウイルス、ポックスウイルス（ワクシニアウイルス）、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス、またはバキュロウイルスなど）、安定な生産細胞株トランスフェクションまたは感染（例えば、本明細書に記載されているようなＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆキャプシドの、１つ以上のＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードするＲｅｐヌクレオチド配列、及び／または１つ以上のＡＡＶ Ｃａｐタンパク質をコードするＣａｐヌクレオチド配列、及びトランスフェクションプラスミドまたは組換えヘルパーウイルスの形態で送達される本明細書中に記載されるような補正ゲノムを含む、哺乳類または昆虫細胞などの、安定な生産細胞株）を含む。

【0157】

本開示の他の例示的で非限定的な実施形態が以下に提供される。

【0158】

実施形態１。１つ以上のキャプシドバリアントと、ゲノムの標的部位に組み込まれる１つ以上の治療用ヌクレオチド配列を含む標的カセットと、標的カセットに隣接し、標的部位の上流にある領域と相同性を有する５’相同アームポリヌクレオチド配列と、標的化カセットに隣接し、標的部位の下流にある領域と相同性を有する３’相同アームポリヌクレオチド配列とを含む、幹細胞のゲノムを編集するためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターバリアント。

【0159】

実施形態２。１つ以上のキャプシドバリアントが、ＨＳＣ７（配列番号８）、ＨＳＣ１２（配列番号１２）、ＨＳＣ１５（配列番号１６）、ＨＳＣ１７（配列番号１３）、バリアント、断片、変異体、及びそれらの任意の組み合わせの群から選択されるポリペプチド配列を含む、実施形態１に記載のＡＡＶベクターバリアント。

【0160】

実施形態３。１つ以上のキャプシドバリアントが、ＨＳＣ７（配列番号８）、ＨＳＣ１２（配列番号１２）、ＨＳＣ１５（配列番号１６）、ＨＳＣ１７（配列番号１３）、バリアント、断片、変異体、及びそれらの任意の組み合わせの群から選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、を含む、実施形態２に記載のＡＡＶベクターバリアント。

【0161】

実施形態４。標的部位がセーフハーバー部位である、実施形態１に記載のＡＡＶベクターバリアント。

【0162】

実施形態５。セーフハーバー部位が第１９染色体上のＡＡＶＳ１遺伝子座である、実施形態４に記載のＡＡＶベクターバリアント。

【0163】

実施形態６。幹細胞が、造血幹細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、または間充織幹細胞である、実施形態１に記載のＡＡＶベクターバリアント。

【0164】

実施形態７。１つ以上のキャプシドバリアントと、ゲノムの標的部位に組み込まれる１つ以上の治療用ヌクレオチド配列を含む標的カセットと、標的カセットに隣接し、標的部位の上流にある領域と相同性を有する５’相同アームポリヌクレオチド配列と、標的化カセットに隣接し、標的部位の下流にある領域と相同性を有する３’相同アームポリヌクレオチド配列とを含む、１つ以上のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターバリアントで、幹細胞を、追加の外因性ヌクレアーゼなしで形質導入することを含む、幹細胞のゲノムを編集する方法。

【0165】

実施形態８。１つ以上のキャプシドバリアントが、ＨＳＣ７（配列番号８）、ＨＳＣ１２（配列番号１２）、ＨＳＣ１５（配列番号１６）、ＨＳＣ１７（配列番号１３）、バリアント、断片、変異体、及びそれらの任意の組み合わせのグループから選択されるポリペプチド配列を含む、実施形態７に記載の方法。

【0166】

実施形態９。ＡＡＶベクターバリアントが、１つ以上の治療用ヌクレオチド配列のプロモーターを含まない、実施形態７に記載の方法。

【0167】

実施形態１０。標的部位がセーフハーバー部位である、実施形態７に記載の方法。

【0168】

実施形態１１。セーフハーバー部位が第１９染色体上のＡＡＶＳ１遺伝子座である、実施形態１０に記載の方法。

【0169】

実施形態１２。幹細胞が、造血幹細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、または間葉系幹細胞である、実施形態７に記載の方法。

【0170】

実施形態１３。対象の幹細胞をさらなる外因性ヌクレアーゼなしで、１つ以上のキャプシドバリアントと、幹細胞のゲノム中の標的部位に組み込まれる１つ以上の治療用ヌクレオチド配列を含む標的カセットと、標的カセットに隣接し、標的部位の上流にある領域と相同性を有する５’相同アームポリヌクレオチド配列と、標的カセットに隣接し、標的部位の下流にある領域と相同性を有する３’相同アームポリヌクレオチド配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）とを含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターバリアントで、形質導入すること、ならびに形質導入された幹細胞を対象に移植することを含む、対象の幹細胞のゲノムを編集することにより対象の疾患または障害を処置する方法であって、形質導入された幹細胞は、疾患または障害を治療する。

【0171】

実施形態１４。１つ以上のキャプシドバリアントが、ＨＳＣ７（配列番号８）、ＨＳＣ１２（配列番号１２）、ＨＳＣ１５（配列番号１６）、ＨＳＣ１７（配列番号１３）、バリアント、断片、変異体、及びそれらの任意の組み合わせの群からのポリペプチド配列を含む、実施形態１３に記載の方法。

【0172】

実施形態１５。ＡＡＶベクターバリアントが前記１つ以上の治療用ヌクレオチド配列のプロモーターを含まない、実施形態１３に記載の方法。

【0173】

実施形態１６。標的部位がセーフハーバー部位である、実施形態１３に記載の方法。

【0174】

実施形態１７。セーフハーバー部位が第１９染色体上のＡＡＶＳ１遺伝子座である、実施形態１６に記載の方法。

【0175】

実施形態１８。幹細胞が、造血幹細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、または間葉系幹細胞である、実施形態１３に記載の方法。

【0176】

実施形態１９。疾患または障害が、細胞ゲノム中の１つ以上の変異によって引き起こされる、実施形態１３に記載の方法。

【0177】

実施形態２０。疾患または障害が、遺伝性代謝疾患、リソソーム蓄積症、ムコ多糖症、免疫不全疾患、及びヘモグロビン異常症、及び感染から選択される、実施形態１９に記載の方法。

【0178】

実施形態２１。１つ以上のキャプシドバリアントと、ゲノムの標的部位に組み込まれる１つ以上の治療用ヌクレオチド配列を含む標的カセットと、標的カセットに隣接し、標的部位の上流にある領域と相同性を有する５’相同アームポリヌクレオチド配列と、標的化カセットに隣接し、標的部位の下流にある領域と相同性を有する３’相同アームポリヌクレオチド配列とを含む、ＡＡＶベクターバリアントを、対象に直接投与することによって、対象の細胞のインビボゲノム編集によって対象の疾患または障害を治療する方法であって、ベクターを対象の細胞に形質導入し、１つ以上の治療用ヌクレオチド配列を細胞のゲノムに組み込む。

【0179】

実施形態２２。１つ以上のキャプシドバリアントが、ＨＳＣ１（配列番号２）、ＨＳＣ２（配列番号３）、ＨＳＣ１１（配列番号４）、ＨＳＣ３（配列番号５）、ＨＳＣ４（配列番号６）、ＨＳＣ６（配列番号７）、ＨＳＣ７（配列番号８）、ＨＳＣ８（配列番号９）、ＨＳＣ９（配列番号１０）、ＨＳＣ５（配列番号１１）、ＨＳＣ１２（配列番号１２）、ＨＳＣ１７（配列番号１３）、ＨＳＣ１３（配列番号１４）、ＨＳＣ１４（配列番号１５）、ＨＳＣ１５（配列番号１６）、ＨＳＣ１６（配列番号１７）、バリアント、断片、変異体、及びそれらの任意の組み合わせを含む、実施形態２１に記載の方法。

【0180】

実施形態２３。細胞が幹細胞である、実施形態２１に記載の方法。

【0181】

実施形態２４。幹細胞が、造血幹細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、または間充織幹細胞である、実施形態２３に記載の方法。

【0182】

実施形態２５。疾患または障害が、細胞ゲノム中の１つ以上の変異によって引き起こされる、実施形態２４に記載の方法。

【0183】

実施形態２６。疾患または障害が、遺伝性代謝疾患、リソソーム蓄積症、ムコ多糖症、免疫不全疾患、ならびにヘモグロビノパシー疾患及び感染から選択される、実施形態２５に記載の方法。

【0184】

実施形態２７。ＡＡＶベクターバリアントが、前記１つ以上の治療用ヌクレオチド配列のプロモーターを含まない、実施形態２１に記載の方法。

【0185】

実施形態２８。標的部位がセーフハーバー部位である、実施形態２２に記載の方法。

【0186】

実施形態２９。セーフハーバー部位が第１９染色体上のＡＡＶＳ１遺伝子座である、実施形態２３に記載の方法。

【0187】

以下の実施例は、本開示の様々な実施形態を説明することを意図している。このように、議論された特定の実施形態は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。当業者には、本開示の範囲から逸脱することなく様々な同等物、変更、及び修正を行うことができ、そのような同等な実施形態が本明細書に含まれることは明らかであろう。さらに、本開示に引用される全ての参考文献は、本明細書に完全に記載されているかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【実施例】

【0188】

実施例１：ＣＤ３４＋ヒト造血幹細胞株またはＫ５６２細胞株におけるＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆベクターバリアント媒介ゲノム編集
外因性ヌクレアーゼを使用せずにＡＡＶＦ（ＡＡＶＨＳＣ）ベクターを用いた特定のＤＮＡ配列の部位特異的挿入または標的化された組み込みによるゲノム編集を、健康なドナーからのヒトＣＤ３４＋造血細胞株またはＣＤ３４＋赤白血病細胞であるＫ５６２細胞株で行った。１組のドナー組換えＡＡＶベクター、ＩＴＲ−ＡＡＶＳ１−ＦＰベクターを構築し、これを用いて天然の野生型ＡＡＶ組み込み部位である染色体１９のＡＡＶＳ１座に導入遺伝子を組み込んだ（Ｋｏｔｉｎ、１９９２；Ｇｉｒａｕｄ、１９９４）。第１９染色体ｑｔｅｒ１３．３−１３．４上のＡＡＶＳ１遺伝子座は、ここに挿入された遺伝子が病原性のない状態で発現され、これを組み込む野生型ＡＡＶに類似しているので、導入遺伝子の挿入のための「セーフハーバー」部位であることが以前に示された（Ｇｉｒａｕｄ、１９９４；Ｌｉｎｄｅｎ、１９９６Ａ；Ｌｉｎｄｅｎ １９９６Ｂ）。統合される導入遺伝子は、ヒト染色体１９上のＡＡＶＳ１遺伝子座と相同性を有する約８００ヌクレオチドの両側に隣接するＶｅｎｕｓ黄色蛍光タンパク質（「ＹＦＰ」または「ＦＰ」）遺伝子であった（図３の模式図参照）。ドナーＡＡＶベクターは、導入遺伝子がプロモーターを持たず、染色体上コードされた調節配列の下流にある正しい遺伝子座に組み込まれている場合にのみ発現されるように設計された（図４参照）。したがって、発生したＶｅｎｕｓＹＦＰ導入遺伝子の発現は、ＡＡＶＳ１またはその近くに位置する染色体プロモーターの制御下にあった。

【0189】

ドナーベクター、ＩＴＲ−ＡＡＶＳ１−ＦＰは、Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、１９９２に記載されている標準的なＡＡＶパッケージング法に従ってＡＡＶＨＳＣキャプシドにパッケージングした。具体的には、ＩＴＲ−ＡＡＶＳ１−ＦＰを、偽型ＡＡＶＨＳＣ−ＡＡＶＳ１−ＦＰベクターを形成するＡＡＶＨＳＣ７、ＡＡＶＨＳＣ１５またはＡＡＶＨＳＣ１７キャプシド（すなわち、ＡＡＶベクターバリアント）にパッケージングした。ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞株またはＫ５６２細胞を、異なる感染多重度（ＭＯＩ）（すなわち、５０，０００ＭＯＩ；１００，０００ＭＯＩ；２００，０００ＭＯＩ；３００，０００ＭＯＩ、及び４００，０００ＭＯＩ）で、偽型ＡＡＶＨＳＣ−ＡＡＶＳ１−ＦＰで形質導入した。

【0190】

相同組換えによるＡＡＶＳ１遺伝子座へのＹＦＰ導入遺伝子の組み込みを、形質導入されたＫ５６２細胞におけるＹＦＰ発現の細胞蛍光分析によって最初にアッセイした。ＡＡＶＨＳＣ７ ＦＰベクターを用いた標的化された組み込みは、形質導入後２４時間（図５、及び７Ａ）、及び形質導入後７２時間（図６、及び７Ｂ）のＹＦＰ導入遺伝子の発現をもたらした。さらに、ＡＡＶＨＳＣ７ ＦＰベクターのＭＯＩが増加するにつれて、ＹＦＰ発現の平均パーセンテージもまた増加した（図７Ａ、及びＢ）。

【0191】

相同領域の外側に位置するプライマーを用いて編集されたゲノムのＰＣＲ増幅によって、ＹＦＰ導入遺伝子の標的化された組み込みがさらに確認された。簡潔には、ＡＡＶＨＳＣ７ ＦＰベクターを用いて１００，０００個のベクターゲノム／細胞のＭＯＩで形質導入したＫ５６２細胞からＤＮＡを抽出した。ＰＣＲ増幅は、「ＯＵＴフォワードプライマーＲｅｇｉｏｎ」、及び「ＯＵＴ リバースプライマー Ｒｅｇｉｏｎ」プライマーを用いて行った（図４参照）。ＹＦＰ導入遺伝子の組み込みは、約１．９ｋｂの野生型サイズから〜３．１ｋｂ断片を含むＹＦＰ導入遺伝子までのＡＡＶＳ１遺伝子座のサイズの増加をもたらした（図４参照、「断片１」で表示されたラインと「断片２」で表示されたラインとを比較）。染色体１９ ＡＡＶＳ１遺伝子座内のＹＦＰ導入遺伝子を含む約３．１ｋｂ断片の増幅は、ＹＦＰ導入遺伝子がＡＡＶＨＳＣ７ ＦＰベクターで形質導入された細胞においてＡＡＶＳ１座に効果的に組み込まれていることを示した（図８Ａ、及び８Ｂ、レーン４参照）。

【0192】

実施例２：初代ヒトＣＤ３４＋末梢血幹細胞におけるＡＡＶベクターバリアント媒介ゲノム編集。
ヒトＣＤ３４＋初代末梢血由来ヒト造血幹細胞（ＰＢＳＣ）においても、外因性ヌクレアーゼを使用せずにＡＡＶＨＳＣベクターを用いた特異的ＤＮＡ配列の部位特異的挿入または標的化組み込みによるゲノム編集を行った。簡単に述べると、ＩＴＲ−ＡＡＶＳ１−ＦＰベクターは、ＡＡＶＨＳＣ７、ＡＡＶＨＳＣ１２、ＡＡＶＨＳＣ１５、及びＡＡＶＨＳＣ１７を含むＡＡＶＨＳＣキャプシドにパッケージングされた（標準的なＡＡＶパッケージング方法については、Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ、１９９２参照）。初代ＣＤ３４＋細胞を、偽型ＡＡＶＨＳＣ−ＡＡＶＳ１−ＦＰベクター（すなわち、ＡＡＶベクターバリアント）で、１００，０００、及び１５０，０００のＭＯＩで形質導入した。

【0193】

相同組換えによるＹＦＰ導入遺伝子のＡＡＶＳ１遺伝子座への組み込みを、ＹＦＰ発現の細胞蛍光分析によりアッセイした。初代ＣＤ３４＋細胞におけるＡＡＶＨＳＣ７ ＦＰ、及びＡＡＶＨＳＣ１７ＦＰベクターを用いた標的化された組み込みでは、１５０，０００のＭＯＩで形質導入後１日（図９）、１００，０００のＭＯＩで形質導入後４日（図１０）、１００，０００のＭＯＩで形質導入後１８日（図１１）にＹＦＰ導入遺伝子の発現をもたらした。ＭＯＩ１００，０００（３９日）で、形質導入後５．５週でＹＦＰを発現する陽性細胞のパーセンテージは低下しなかった（図１２Ａ及びＢ、２０日の結果と３９日の結果とを比較）。分裂細胞集団におけるプロモーターのないＹＦＰ導入遺伝子のこの長期発現は、導入遺伝子の正確な組み込みを示す。

【0194】

ＹＦＰ導入遺伝子の標的化された組み込みは、ＰＣＲ分析によってさらに確認された。編集されたゲノムは、挿入された導入遺伝子配列と天然の染色体５’相同性アーム配列との間の５’接合領域を増幅するプライマーを用いて増幅された（図４参照、「断片３」と表示されたライン参照）。簡潔には、ＡＡＶＨＳＣ７ ＦＰベクターを用いて１５０，０００個のベクターゲノム／細胞のＭＯＩで形質導入した初代ＣＤ３４＋細胞からＤＮＡを抽出した。ＰＣＲ増幅は、「ＯＵＴフォワードプライマーＲｅｇｉｏｎ」、及び「Ｉｎリバースプライマー」プライマーを用いて行った（図４参照）。形質導入された初代ＣＤ３４＋細胞の５’接合領域の約１．７ｋｂ断片の増幅は、ＹＦＰ導入遺伝子がＡＡＶＳ１座にうまく組み込まれたことを示した（図１３、レーン５参照）。一方、ＡＡＶＨＳＣ７ ＦＰベクターで形質導入されなかった細胞については増幅産物は存在しなかった（図１３、レーン３参照）。

【0195】

ＹＦＰ導入遺伝子の標的化された組み込みは、編集されたＡＡＶＳ１遺伝子座の異なる部分の配列分析によってさらに確認された。調節エレメント（図１６参照）の５’領域付近、３’領域の近く、５’相同性アーム（図１５参照）の近くの「ＯＵＴフォワードプライマーＲｅｇｉｏｎ」（図１４参照）（図１７参照）、導入遺伝子の５’領域付近（図１８参照）、及び「ＩＮリバースプライマー」領域（図１９参照）の近くに存在する。配列決定の結果は、ＹＦＰ遺伝子が存在し、ＡＡＶＳ１座に首尾よく組み込まれていることを示した。

【0196】

実施例１及び２に示されるように、ＡＡＶＨＳＣベクターは、外因性エンドヌクレアーゼの添加を必要とせずに、ヒトＣＤ３４＋造血細胞株、及びＣＤ３４＋ＰＢＳＣにおける効率的な標的ゲノム編集を首尾よく媒介した。ＡＡＶＨＳＣベクターは、ＡＡＶＳ１遺伝子座に対応する隣接相同性アームに基づいて、ＹＦＰ導入遺伝子の第１９染色体上のＡＡＶＳ１座への組み込みを指向することができた。ＡＡＶ媒介性トランスジェネシスは以前に報告されている。しかし報告された頻度は低く、通常、１ｅ６細胞の１対１ｅ４細胞の１のオーダである。本明細書に示すように、ＡＡＶＨＳＣベクターを用いた標的ゲノム編集は、以前に報告されたものよりも１，０００〜１００，０００倍効率が高い、初代細胞の長期間の約１０％の頻度で生じた（例えば、Ｋｈａｎ、２０１１参照）。ヒトＣＤ３４＋造血細胞株におけるＹＦＰ導入遺伝子の発現は、形質導入後１日目に早く観察され、３日目に確認された。ＰＢＳＣ中のＹＦＰ導入遺伝子の発現は、１日目から開始し、分析された最新の時点である長期間（約６週間まで）観察された。ＡＡＶＨＳＣベクター形質導入の結果として明白な毒性は観察されなかった。高頻度の挿入、使用の容易さ、及び毒性の欠如が観察されることに基づいて、ＡＡＶＨＳＣベクターを用いた標的ゲノム編集に基づく治療は実用的かつ実現可能である。

【0197】

実施例３：ＡＡＶベクターバリアントを用いたインビボゲノム工学。
Ｖｅｎｕｓをコードするルシフェラーゼ、及びＡＡＶＨＳＣベクターをコードするＡＡＶＨＳＣベクターを、以前にヒト臍帯血ＣＤ３４＋ＨＳＣで異種移植した成体免疫不全マウスに注射した。以下に示すように、ＡＡＶＨＳＣベクターの静脈内注射は、ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞、及び前駆細胞のインビボでの形質導入をもたらし、静脈内注射ＡＡＶＨＳＣベクターは、ヒト造血部位に輸送され、ヒト細胞に形質導入した。

【0198】

方法。簡単に説明すると、免疫不全のＮＯＤ／ＳＣＩＤ成体マウスに、最初に^１３７Ｃｓ供給源から３５０ｃＧｙの亜致死量を照射した。第二に、百万人のヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞を、亜致死的に照射された免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに注射した。次に、ＣＤ３４＋ＨＳＣ移植の２時間後、マウスに約１Ｅ１１−５ｅ１１粒子のＡＡＶＨＳＣ−ルシフェラーゼベクター（ＡＡＶＨＳＣ７−ルシフェラーゼベクターまたはＡＡＶＨＳＣ１７−ルシフェラーゼベクターのいずれか）を静脈注射した。これらのベクターは、外因性ヌクレアーゼの非存在下で使用した。ＡＡＶＨＳＣ−ルシフェラーゼベクターは、ユビキタスＣＢＡプロモーターの制御下で一本鎖ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｓｓＬｕｃ）をコードして、導入遺伝子発現のインビボ生物発光モノリスを連続的に可能にする。これらのベクターは、米国特許出願第１３／６６８，１２０号（米国特許公開第２０１３００９６１８２Ａ１号として公開）、及びＳｍｉｔｈら（本明細書中に完全に記載されているかのように参照により本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている（Ｓｍｉｔｈ、２０１４）。ＡＡＶＨＳＣ−ルシフェラーゼベクターは、ＨＳＣ７キャプシドバリアント（ＨＳＣ７キャプシドのポリヌクレオチド配列は配列番号２７として提供され、ＨＳＣ７キャプシドのポリペプチド配列は配列番号８（図１参照）として提供される）、またはシュードタイピングされたＨＳＣ１７キャプシドバリアント（ＨＳＣ１７キャプシドのポリヌクレオチド配列は配列番号３５として提供され、ＨＳＣ１７キャプシドのポリペプチド配列は配列番号１３（図１参照）として提供される）、ＡＡＶＨＳＣ７−ルシフェラーゼベクター、及びＡＡＶＨＳＣ１７−ルシフェラーゼベクター（Ｓｍｉｔｈ、２０１４参照）を形成する（標準的なＡＡＶパッケージング方法については、Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ、１９９２を参照）。ＡＡＶＨＳＣ−ルシフェラーゼベクターは、マウス、及びヒト細胞の両方に形質導入することができることに留意されたい。しかしながら、下記のＡＡＶＨＳＣ−ＶｅｎｕｓベクターにコードされているＶｅｎｕｓとは対照的に、ルシフェラーゼはＡＡＶＳ１に組み込まれないであろう。代わりに、ルシフェラーゼは無作為に組み込むことができ、またはエピソームにとどまることができる。

【0199】

ＡＡＶＨＳＣ−ルシフェラーゼベクターを注射して２〜７日後、マウスに約１Ｅ１１〜５ｅ１１粒子のＡＡＶＨＳＣ−Ｖｅｎｕｓベクターを注射した。具体的には、最初にＡＡＶＨＳＣ７−ルシフェラーゼベクターを注射したマウスにＡＡＶＨＳＣ７−Ｖｅｎｕｓベクターを注射し、ＡＡＶＨＳＣ１７−ルシフェラーゼベクターを最初に注射したマウスにＡＡＶＨＳＣ１７−Ｖｅｎｕｓベクターを注射した。Ｖｅｎｕｓドナーベクターは、上記の実施例１、及び２に具体的に記載されている。ドナーＡＡＶベクターは、Ｖｅｎｕｓ導入遺伝子がプロモーターを持たず、染色体コードされた調節配列の下流にある正しいＡＡＶＳ１遺伝子座に組み込まれている場合にのみ発現されるように設計した（図３、及び４参照）。したがって、発生したＶｅｎｕｓ導入遺伝子の発現は、ＡＡＶＳ１またはその近くに位置する染色体プロモーターの制御下にあった。重要なことに、Ｖｅｎｕｓ遺伝子を含むベクターは、発現を駆動するプロモーターを含まない。Ｖｅｎｕｓ遺伝子は、内因性染色体プロモーターの下流のヒト細胞においてＡＡＶＳ１に正しく組み込まれる場合にのみ発現される。ドナーベクター、ＩＴＲ−ＡＡＶＳ１−Ｖｅｎｕｓ（図３参照）を、Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、１９９２に記載されている標準的なＡＡＶパッケージング法に従ってＡＡＶＨＳＣキャプシドにパッケージングした。このベクターは、ＨＳＣ７キャプシドバリアント（ＨＳＣ７キャプシドのポリヌクレオチド配列は配列番号２７として提供され、ＨＳＣ７キャプシドのポリペプチド配列は配列番号８（図１参照）として提供される）またはＨＳＣ１７キャプシドバリアント（ＨＳＣ１７キャプシドのポリヌクレオチド配列は配列番号３５として提供され、ＨＳＣ１７キャプシドのポリペプチド配列は配列番号１３（図１参照）として提供される）を用いてＡＡＶＨＳＣ７−Ｖｅｎｕｓベクター、及びＡＡＶＨＳＣ１７−Ｖｅｎｕｓベクターを形成する。

【0200】

最後に、インビボでのルシフェラーゼ発現を注射の４週間後に測定した。注入６週間後、ヒトＣＤ３４＋、及びＣＤ４５＋細胞の生着を測定し、Ｖｅｎｕｓ発現を定量した。この実施例で実施された実験の全体概略図については、図２０を参照。

【0201】

結果。注入後４週間、ＡＡＶＨＳＣ−ルシフェラーゼベクターの静脈内注射を受けた異種移植、及び非異種移植マウスで、インビボイメージングを行った。結果は、移植後の造血部位である脊椎、脾臓、臀部、及び長骨において特異的なルシフェラーゼ発現を示した（図２１Ａ参照）。しかしながら、以前にヒト臍帯血ＣＤ３４＋ＨＳＣで異種移植されていないマウスでは、造血器官における特異的なルシフェラーゼ発現は観察されなかった（図２１Ｂ参照）。これらの結果は、静脈内注射されたＡＡＶＨＳＣベクターが、ヒト造血のインビボ部位へのトラフィックを伝達し、幹細胞、及び前駆細胞を優先的に形質導入することを示す。

【0202】

ＡＶＨＳＣ−Ｖｅｎｕｓベクターを注射して６週間後、ヒトＣＤ３４＋、及びＣＤ４５＋細胞を、フローサイトメトリーを用いて分析した。結果は、注入されたヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞がマウスに移植され、より成熟した血液細胞を生じることを示した。具体的には、原始ヒト血液前駆細胞（すなわち、ＣＤ３４＋細胞）が骨髄で観察された（表１、ＣＤ３４＋細胞、及び大腿骨髄を参照）。さらに、表１に示すように、大腿骨髄、脊髄骨髄、及び脾臓において、ヒト単核球細胞（すなわち、ＣＤ４５＋細胞）が明らかであった。

【0203】

【表2】

【0204】

注射から６週間後、フローサイトメトリーを用いて、ＡＡＶＨＳＣ７−ＶｅｎｕｓまたはＡＡＶＨＳＣ１７−Ｖｅｎｕｓベクターのいずれかの静脈内注射を受けた異種移植マウスのヒトＨＳＣからのＶｅｎｕｓ発現を分析した。結果は、ＡＡＶＨＳＣ形質導入が大腿骨、及び脊髄骨髄由来のＣＤ４５＋ヒトＨＳＣ、及びＣＤ３４＋ヒトＨＳＣにおいて容易に観察されたことを明らかにした（表２、及び図２２Ａ〜Ｆ参照）。

【0205】

【表3】

【0206】

さらに、脾臓のヒトＣＤ４５＋細胞は、Ｖｅｎｕｓがこれらの細胞で発現されると容易に形質導入の証拠を示した（表２、ならびに図２２Ｇ及びＨ参照）。これは、移植されたヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞から生じるＣＤ４５＋細胞がＶｅｎｕｓを発現することを実証する。これらの結果は、インビボでのＡＡＶＨＳＣベクターの静脈内注射が、ヒト造血細胞の形質導入をもたらすことを示す。

【0207】

実施例４：ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆベクターを用いた大小の編集エレメントのゲノムへの挿入
方法。ｒＡＡＶの生産、精製、滴定。ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ｖ．１．６．２（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を用いて設計したプライマーを用いて、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用して、すべての標的化ゲノムをＡＡＶ２骨格にクローニングした。全ての標的ゲノムを配列決定し、ＡＡＶ２ ＩＴＲの完全性を制限ダイジェスト、及び配列決定を用いて確認した。一本鎖標的ゲノムを、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染２９３細胞のＡＡＶＦキャプシドにパッケージングした。得られた組換えＡＡＶベクターを２ラウンドのＣｓＣｌ２密度遠心分離勾配で精製し、導入遺伝子特異的プライマー、及びプローブを用いてｑＰＣＲを用いて力価を測定した。

【0208】

Ｋ５６２、ＨｅｐＧ２、及びＰＢＳＣ形質導入が含まれる。慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞株、Ｋ５６２、及び肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手し、ＡＴＣＣガイドラインに従って培養した。末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）を、ＣＤ３４＋間接分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて健康なドナーのサイトカイン下塗したＰＢから単核細胞から精製し、単離直後に形質導入を行った。ＰＢＳＣを、２０％ＦＣＳ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ−グルタミン、ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、及び幹細胞因子（１ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含むイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で培養した。ＨｅｐＧ２細胞を分割し、形質導入の約２４時間前にプレーティングした。形質導入の直前にＫ５６２細胞をプレーティングした。Ｋ５６２ｓ、ＨｅｐＧ２ｓまたはＰＢＳＣを、５Ｅ４〜４Ｅ５のＭＯＩで、ＡＡＶＦ標的ベクターで形質導入した。細胞に形質導入し、外因性ヌクレアーゼの非存在下で相同組換えを達成した。形質導入の１〜３９日後の時点で細胞をフロー、及び分子分析のために採取した。インビトロでの形質導入のＢｒｄＵ標識は、ＡＰＣ ＢｒｄＵフローキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を指示通りに用いて採取する前に行った。

【0209】

ＴＩ ＰＣＲ、及びシークエンシング。高分子量ＤＮＡを、ＡＡＶＦ標的ベクターで形質導入したＫ５６２、ＨｅｐＧ２またはＰＢＳＣから単離した。ＴＩ特異的ＰＣＲは、相同性アームの外側の染色体領域であるＳｉｇｍａ ＡＡＶＳ１フォワードプライマー（５’ − ＧＧＣ ＣＣＴ ＧＧＣ ＣＡＴ ＴＧＴ ＣＡＣ ＴＴ − ３’）と挿入されたカセットにアニールするプライマーＶｅｎｕｓ リバースプライマー（５’−ＡＡＣ ＧＡＧ ＡＡＧ ＣＧＣ ＧＡＴ ＣＡＣ Ａ−３’）またはＲＦＬＰ ＨｉｎｄＩＩＩリバースプライマー（５’−ＣＣＡＡＴＣＣＴＧＴＣＣＣＴＡＧＴＡＡＡＧＣＴＴ−３’）。Ｒｏｃｈｅ Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲシステム（インディアナポリス、インディアナ州）を使用し、以下のサイクル条件を用いた：１サイクル、５分間〜９５℃；１５サイクル、３０秒〜９５℃、３０秒〜６２℃で開始し、０．５℃／サイクル、２分〜６８℃；２０サイクル、３０秒〜９５℃、３０秒〜５３℃、２分〜６８℃；１サイクル、５分〜６８℃。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いる直接配列決定のためにＰＣＲ精製し、または配列決定のためのＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット、及びＳａｎｇｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって配列決定したクローンを用いてクローニングした。

【0210】

ＣＤ３４＋細胞の移植。すべての動物のケア、及び実験は、施設の動物用ケア、及び使用委員会によって承認されたプロトコルの下で行われた。６−８週齢の雄のＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／ＮＣｒＣｒｌ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスを特定の病原体のない施設で維持した。マウスを、移植前少なくとも４８時間、スルファメトキサゾール、及びトリメトプリム経口小児抗生物質（Ｈｉ−Ｔｅｃｈ Ｐｈａｒｍａｃａｌ（Ａｍｉｔｙｖｉｌｌｅ、ＮＹ）、１０ｍｌ／５００ｍｌ Ｈ２Ｏ）上に置いた。マウスに、１３７Ｃｓ源から３５０ｃＧｙの亜致死量の放射線を照射し、移植の前に最低４時間回復させた。ＣＤ３４＋間接分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて臍帯血（ＣＢ）ＣＤ３４＋細胞を単離した。１ Ｘ １０^６ＣＣＢＣＤ３４＋細胞を約２００μｌに再懸濁し、尾静脈注射により移植した。ＡＡＶＦ標的ベクターの２．４Ｅ１１〜６．０Ｅ１１粒子を、ＣＢ ＣＤ３４＋移植の１週間または７週間後に尾静脈に静脈内注射した。大腿骨髄（ＢＭ）、椎骨ＢＭ、及び脾臓を、移植後６，７または１９週に採取した。

【0211】

フローサイトメトリー分析。インビトロ形質導入は、ＡＡＶフローサイトメーター（Ｄａｋｏ）を用いて、ＡＡＶＦ標的ベクター媒介組み込み、及びＢｒｄＵ、及び７−ＡＡＤについて分析した。特異的蛍光を、自己蛍光の減算に続いて定量した。ヒト特異的抗体、ＡＰＣ結合抗ＣＤ３４、及びＰＥ結合抗Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ Ａ、及びＰＥで染色することにより、採取した脊椎ＢＭ、大腿骨ＢＭ、及び異種移植マウスの脾臓において、ＣＤ３４＋、及び赤血球細胞における統合された蛍光カセットのインビボ発現を分析した、及びＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＳＯＲＰ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上のＡＰＣ結合ＩｇＧ対照（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）を用いてフローサイトメトリーデータを分析した。

【0212】

結果。幹細胞由来ＡＡＶは、キャプシド遺伝子のヌクレオチド配列相同性に基づいてＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆにマッピングされることが示された（図２３、Ｓｍｉｔｈら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１４ Ｓｅｐ；２２（９）：１６２５−３４）。これらの幹細胞由来のＡＡＶをＡＡＶＨＳＣ１〜１７と命名した。これらのＡＡＶは、本明細書ではそれぞれＡＡＶＦ１〜１７とも呼ばれる。

【0213】

一本鎖ＡＡＶベクターゲノムを用いて、相同性アーム、及び大きなインサートを含む補正ゲノムを設計した（図２４）。インサートは、スプライスアクセプター（ＳＡ）、及び２Ａ配列（２Ａ）の下流にプロモーターのないＶｅｎｕｓオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、独立したタンパク質発現を可能にした。Ｖｅｎｕｓは、黄色蛍光タンパク質の変異体である（例えば、Ｎａｇａｉら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００２，２０（１）：８７−９０参照）。左右の相同性アーム（ＨＡ）はそれぞれ８００ｂｐ長であり、染色体１９（図２５）のＡＡＶＳ１遺伝子座に位置するヒトＰＰＰ１Ｒ１２Ｃのイントロン１の配列に相補的であった。同様の一本鎖ＡＡＶベクターゲノムを、２つの相同性アームの間に１０ｂｐインサートを用いて設計した（図３５）。ＡＡＶＳ１遺伝子座は、異種導入遺伝子の挿入のためのセーフハーバー部位と考えられている。

【0214】

相同性アーム、オープンリーディングフレーム、及び調節配列をＡＡＶ２逆位末端反復（ＩＴＲ）の間でクローニングした。この補正ゲノムは、ＡＡＶＨＳＣ、ＡＡＶ８，９，６、及び２を含む異なるＡＡＶキャプシドにパッケージング（シュードタイピング）された。次に、組換えウイルスを使用して、編集ゲノムを標的細胞の核に送達した。試験した標的細胞には、ＣＤ３４＋赤白血病細胞株、肝細胞株、及び初代ヒトＣＤ３４＋造血幹／前駆細胞ならびにそれらの造血子孫が含まれた。

【0215】

ＶｅｎｕｓＯＲＦを含み、ヒトＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子のイントロン１に相補的な相同性アームが隣接しているＡＡＶＦベクターを使用して、編集ヒトゲノムを初代ヒトＣＤ３４＋サイトカイン刺激末梢血幹細胞（図２６Ａ）、ヒトＫ５６２ ＣＤ３４＋赤白血病細胞株（図２６Ｂ）、及びヒト肝細胞株ＨｅｐＧ２（図２６Ｃ）。主要なＣＤ３４＋細胞は最高６０％の編集レベルを支持した（図２６Ａ〜Ｆ）。Ｋ５６２及びＨｅｐＧ２を含む不死化細胞株も、有意なレベルの編集を示した。すべての場合において、達成された編集のレベルは、ＡＡＶ６、及びＡＡＶ８を含む非Ｃｌａｄｅ Ｆウイルスで達成されたレベルよりも一貫して有意に高かった（図２６Ａ〜Ｆ、及び図３６）。

【0216】

別の実験では、ＡＡＶＦ７、ＡＡＶＦ１５またはＡＡＶＦ１７ベクターで形質導入されたサイトカインで刺激されたＣＤ３４＋末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）から抽出されたＤＮＡを、染色体特異的プライマー、及びインサート特異的プライマーで増幅した。ベクターには大きなインサート（Ｖｅｎｕｓ）または短いインサート（１０ｂｐ、ＲＦＬＰ）が含まれていた。ゲルは、正確なサイズのアンプリコンが、編集されたＣＤ３４細胞から増幅されたことを示した（図２７、図３５、及び図３６）。１．７ｋｂ、及び１ｋｂバンドの存在は、それぞれ大きなインサート、及び小さなインサートの正確に標的化された組み込みを反映した。標的化された組み込みは、ＡＡＶＦベクターで編集した後の短期、及び長期の両方の時点で示された（図２７）。

【0217】

別の実験では、ヒトＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子のイントロン１に１０ｂｐインサートを挿入するために、一本鎖ＡＡＶベクターゲノムを設計した（図２８Ａ）。これらのベクターは、Ｎｈｅ１制限酵素認識部位（ＧＣＴＡＧＣ）を含む野生型左相同性アーム（ＨＡ−Ｌ）を含んでいた。ＮＳ ｍｕｔベクターは、第１９染色体上の左相同性アームのＴＡ配列をＡＴに変更するように設計された。この変化は、Ｎｈｅ１部位のＳｐｈ１部位への変換をもたらし、配列をＧＣＴＡＧＣからＧＣＡＴＧＣに変更する。図２８Ｂは、Ｋ５６２細胞由来のゲノムＤＮＡを野生型またはＮＳ Ｍｕｔ ＡＡＶＦベクターのいずれかを用いて編集した場合に、Ｎｈｅ１またはＳｐｈ１で切断することによって作製された予想断片の相対的サイズを示す。野生型ＡＡＶＦベクターで編集したＫ５６２細胞のゲノムＤＮＡ由来の実際のアンプリコンをＮｈｅ１で消化したが、Ｓｐｈ１で消化しなかった（図２８Ｃ）。野生型またはＮＳ ＭｕｔゲノムのいずれかをコードするＡＡＶＦ７またはＡＡＶＦ１７ベクターで編集した後に増幅したＫ５６２ ＤＮＡを用いた結果は、Ｎｈｅ１による消化が、未編集細胞からのアンプリコンに匹敵するアンプリコンの切断をもはやもたらさないことを示した。Ｓｐｈ１での消化は切断をもたらし、染色体の左側の相同性アームのＮｈｅ１部位がＳｐｈ１部位によって置換されたことを示した（図２８Ｄ）。野生型またはＮＳ ＭｕｔゲノムのいずれかをコードするＡＡＶＦ７またはＡＡＶＦ１７ベクターで編集した後の肝細胞癌腫細胞株ＨｅｐＧ２からの増幅ＤＮＡの電気泳動は、Ｎｈｅ１による消化が、未編集細胞からのアンプリコンに匹敵するアンプリコンの切断をもはやもたらさないことを示した（図２８Ｅ）。Ｓｐｈ１による消化は切断をもたらし、染色体の左側の相同性アームのＮｈｅ１部位がＳｐｈ１部位によって置換されたことを実証した。配列分析により、ＡＡＶＦ７、及びＡＡＶＦ１７野生型またはＮＳ Ｍｕｔベクターによる編集が確認された（図２９）。これらの結果は、ＡＡＶＦ７、及びＡＡＶＦ１７の両方が、２つの異なる細胞系における染色体配列における２ヌクレオチド置換を首尾よく媒介したことを示している。これらの結果はまた、ヒト細胞のゲノムＤＮＡにおける２塩基対置換を媒介するＡＡＶＦベクターの能力を示し、疾患誘発変異の矯正またはゲノムにおける新しい変異の誘導のためのそれらの使用を示唆する。

【0218】

別の実験では、ＡＡＶＦベクターの編集能力に対する細胞分裂の潜在的な必要性を健康なヒトＣＤ３４＋ ＰＢＳＣで試験した。１０μＭのＢｒｄＵで２時間パルスすることにより、形質導入したヒトＣＤ３４＋ＰＢＳＣにＢｒｄＵを組み込んだ。ＡＡＶＦで形質導入したＣＤ３４＋細胞を採取し、透過処理し、ＤＮａｓｅ処理の前に固定した。ＤＮａｓｅ処理後、処理した細胞を抗ＢｒｄＵ ＡＰＣ抗体で２０分間染色した。インビトロで編集した細胞のＢｒｄＵ標識を、指示に従ってＡＰＣ ＢｒｄＵフローキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて採取する前に行った。その後、細胞を、Ｖｅｎｕｓ発現ならびにＢｒｄＵ標識のためのフローサイトメトリーによって分析した。結果は、ＢｒｄＵ陽性、及び陰性集団の両方におけるＶｅｎｕｓ発現の同様の頻度を示し、細胞分裂がＡＡＶＦ媒介性編集に必要でないことを示唆した（図３０）。

【0219】

別の実験では、インビボでの生着されたヒト造血幹細胞の編集を、ヒト臍帯血ＣＤ３４＋造血幹細胞で移植された全身送達ＡＡＶＦベクター免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスによって試験した（図３１Ａ、及びＢ）。骨髄、及び脾臓の両方において、ヒト細胞の大部分はＶｅｎｕｓを発現することが見出されたが、Ｖｅｎｕｓ発現はマウス細胞では観察されなかった（図３１Ｃ、図３７、及び図３８）。マウスゲノムは、相同性アームに相補的なＡＡＶＳ１座を含まないので、これらの知見は、遺伝子標的の特異性を実証する。分析されたヒト細胞のうち、Ｖｅｎｕｓ発現は、原始ＣＤ３４＋前駆細胞ならびに成熟グリコホリンＡ＋赤血球細胞（骨髄、及び脾臓の両方）において観察された。

【0220】

別の実験では、マウスをヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞で移植し、ＡＡＶＦ−Ｖｅｎｕｓを１または７週間後に静脈内経路で注射した。Ｖｅｎｕｓの静脈注射の５，６または１３週間後に、脊椎または大腿骨髄または脾臓を採取した。これらは移植後６、７または２０週間の累積時間を表している。結果は、ＡＡＶＦ−Ｖｅｎｕｓの静脈注射は、より成熟した、分化した（ＣＤ４５＋）インビボで生着されたヒト造血細胞と同様に、原始（ＣＤ３４＋）ウェルとしての編集をもたらすことを明らかにする。ヒト赤血球系統の細胞は、移植、及び注射後に長期間にわたり非常に効率的な編集を示した（図３２）。ＡＡＶＦ媒介性編集は長期間安定であることが判明し、インビボで移植されたヒトＣＤ３４＋細胞の分化した子孫によって安定して遺伝した（図３２）。編集されたＣＤ３４＋細胞の分化した子孫は、Ｖｅｎｕｓ長期間を示した（図３２）。

【0221】

別の実験では、Ｋ５６２赤白血病細胞株、初代ヒトサイトカインで刺激された末梢血ＣＤ３４＋細胞、及びＨｅｐＧ２ヒト肝細胞株（図３３）におけるプロモーターレスＳＡ／２Ａ ｖｅｎｕｓ ＯＲＦの標的染色体挿入について配列分析を行った。部位特異的に組み込まれた配列は、染色体特異的プライマー、及びインサート特異的プライマーを用いて増幅された。結果は、すべての場合において、左、及び右の相同性アーム間の接合部にＳＡ／２ＡＶｅｎｕｓの正確な挿入を示した（図３３）。

【0222】

別の実験では、初代ヒトサイトカインで刺激された末梢血ＣＤ３４＋細胞、及びＨｅｐＧ２ヒト肝細胞株（図３４）における１０ｂｐインサートの標的化染色体挿入のための配列分析を行った。部位特異的に組み込まれた配列は、染色体特異的プライマー、及びインサート特異的プライマーを用いて増幅された。結果は、いずれの場合においても、左、及び右の相同性アーム間の接合部に１０ｂｐインサートの正確な挿入を示した（図３４）。

【0223】

これらのデータは、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆベクターを使用して、大きなインサート断片、及び短いインサート断片の両方をゲノムにうまく編集することができ、ゲノムへの組み込みが正確であることを示す。これらのデータはまた、ＡＡＶ Ｃｌａｄｅ Ｆベクターが、外因性ヌクレアーゼの非存在下で高効率ゲノム編集に使用され得ることを示す。

【0224】

実施例５：ヒト細胞株におけるＰＰＰ１Ｒ１２ｃ遺伝子座の編集
方法

【0225】

ＡＡＶＦベクターによるヒト細胞タイプの編集を評価するために、以下のヒト細胞株を使用した：

【0226】

【表4】

【0227】

使用したＡＡＶＦベクターはそれぞれ、プロモーターを持たないＶｅｎｕｓレポーターをコードする編集エレメントを含むベクターゲノムを含んでいた。プロモーターを持たないＶｅｎｕｓは、Ｖｅｎｕｓのスプライスアクセプター（ＳＡ）、及び２Ａ配列（２Ａ）の下流のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、独立したタンパク質発現を可能にした。左右の相同性アーム（ＨＡ）はそれぞれ８００ｂｐ長であり、１９番染色体上のＡＡＶＳ１座に位置するヒトＰＰＰ１Ｒ１２Ｃのイントロン１の配列に相補的であった。ＡＡＶＳ１遺伝子座は、異種導入遺伝子の挿入のためのセーフハーバー部位と考えられている。相同性アーム、Ｖｅｎｕｓ ＯＲＦ、及び調節配列を含む編集エレメントを、ＡＡＶ２逆位末端反復（ＩＴＲ）間にクローン化した。

【0228】

細胞培養。全細胞株を、３７℃で５％ＣＯ２の加湿雰囲気下で成長させ、以下の条件で培養した。ＳＣＩＤ−Ｘ１リンパ芽球（Ｃｏｒｉｅｌｌ）を、１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２６１４０）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２１８７５）で培養した。Ｋ５６２細胞（ＡＴＣＣ）を１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２６１４０）、及び１％Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２５０３０）を補充したＤＭＥＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号１５−０１７−ＣＶＲ）で培養した。ＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２６１４０）を補充したＥＭＥＭ（ＡＴＣＣ、カタログ番号３０−２００３）中で培養した。ＭＣＦ−７細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２６１４０）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１１４０）、１％のＳｏｄｉｕｍピルビン酸（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１３６０）、及び１０μｇ／ｍＬヒト組換えインスリン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１２５８５−０１４）を補充したＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１０９５）中で培養した。ＷＩ−３８線維芽細胞（ＡＴＣＣ）、及びＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ）１１１４０）を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ＃２６１４０）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１１１４０）、及び１％ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１３６０）を補充したＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１０９５）中で培養した。そしてＹ７９細胞（ＡＴＣＣ）を、２０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２６１４０）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ａ１０４９１）で培養した。

【0229】

ヒト細胞株のＡＡＶＦ媒介性編集。接着細胞を、９６ウェルフォーマットについては２０，０００細胞／０．１ｍＬで、または２４ウェルフォーマットについては２００００細胞／０．５ｍＬで０日目に播種した。ＡＡＶＦベクターの添加の２４時間後（１日目）の細胞数を測定した。サスペンド細胞を、９６ウェルフォーマットで２０，０００細胞／０．１ｍＬまたは２４ウェルプレートフォーマットで２０，０００細胞／０．５ｍＬで１日目に播種した。１日目に、１５０，０００個のベクターゲノム（ＶＧ）／細胞の多重感染（ＭＯＩ）を用いてＡＡＶＦを細胞に添加した。ＡＡＶＦ添加の前に、移送に使用したピペットチップを硫酸プロタミン（１０ｍｇ／ｍｌ）でコーティングした。ＡＡＶＦを、形質導入の直前に最大速度のボルテックスミキサーで３０秒間完全に懸濁させた。細胞に添加されたＡＡＶＦの量は、ウェル中の総体積の５％を超えなかった。３日目に、細胞を採取し（接着細胞を穏やかにトリプシン処理して組織培養プレートから除去した）、洗浄し、Ｈｙｐｅｒｃｙｔオートサンプラーを備えたＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔフローサイトメーターを用いてフローサイトメトリーによりＶｅｎｕｓ発現を分析した。編集は、非形質導入細胞（典型的には１％未満のＶｅｎｕｓ陽性細胞）において観察された、Ｖｅｎｕｓ陽性であった全細胞集団からバックグラウンド蛍光を差し引いた割合として表された。ＡＡＶＦ編集実験は、外因性ヌクレアーゼを使用せずに行った。

【0230】

結果

【0231】

試験した全てのＡＡＶＦについてヒトＰＰＰ１Ｒ１２ｃ遺伝子座の編集が観察され、細胞タイプの選択性が示された（表３）。一般に、ＡＡＶＦ５は、４８時間の感染後、全細胞集団の１２〜４５％から各細胞株において最高レベルの編集を生じた。ＡＡＶＦ９は、Ｂリンパ芽球細胞株（ＳＣＩＤ−Ｘ１ ＬＢＬ、及びＫ５６２）においても高レベルの遺伝子編集をもたらした。ＡＡＶＦ１７は、これらの条件下で正常ヒト二倍体線維芽細胞（ＷＩ−３８細胞）において遺伝子編集の最高レベルを生じた。ＡＡＶＦ１、ＡＡＶＦ４、ＡＡＶＦ７ベクターは、形質導入されていない細胞で見られるものより一貫して大きいが、一般にＡＡＶＦ５、ＡＡＶＦ９、及びＡＡＶＦ１７で観察された最大レベルよりも低いレベルの編集をもたらした。これらのデータは、ＡＡＶＦがヒト組織に広い指向性を有し、肝臓、ＣＮＳ（網膜）、組織線維芽細胞、乳房、及びリンパ球における遺伝子編集に有用であり得ることを示す。

【0232】

【表5】

【0233】

実施例６：初代ヒト細胞におけるＡＡＶＦ編集
ＡＡＶＦベクターによる初代ヒト細胞の編集を評価するために、ヒト肝細胞、肝類洞内皮細胞、及び骨格筋筋芽細胞の初代培養を使用した。

【0234】

それぞれ使用されたＡＡＶＦ、及びＡＡＶベクターは、プロモーターを含まないＶｅｎｕｓレポーターをコードするベクターゲノムをパッケージした。インサートは、スプライスアクセプター（ＳＡ）、及び２Ａ配列（２Ａ）の下流のＶｅｎｕｓオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、独立したタンパク質発現を可能にした。左右の相同性アーム（ＨＡ）はそれぞれ８００ｂｐ長であり、１９番染色体上のＡＡＶＳ１座に位置するヒトＰＰＰ１Ｒ１２Ｃのイントロン１の配列に相補的であった。ＡＡＶＳ１遺伝子座は、異種導入遺伝子の挿入のためのセーフハーバー部位と考えられている。相同性アーム、オープンリーディングフレーム、及び調節配列からなる補正ゲノムをＡＡＶ２逆位末端反復（ＩＴＲ）の間にクローニングした。

【0235】

方法

【0236】

細胞培養。全ての初代ヒト細胞を、組織培養インキュベーター中、３７℃、５％加湿ＣＯ２下で培養した。すべての材料、及び媒体成分は、別段の指定がない限りＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した。

【0237】

ヒト肝細胞の初代培養物をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手し、Ｉ型コラーゲンコートプレート上で製造業者によって示唆されるように培養した。細胞を、解凍／プレート培地［最終体積３５．０ｍＬあたり、ウィリアムズＥ培地（＃Ａ１２１７６）３２．５ｍＬ、ウシ胎仔血清１．６ｍＬ、１０ｍＭデキサメタゾン３．２ｕＬ、及び０．９ｍＬのメッキカクテルＡ］の、液体窒素での保存から回収した。０．５ｍＬペニシリン（１０，０００Ｕ／ｍＬ）／ストレプトマイシン（１０，０００μｇ／ｍＬ）溶液（Ｃａｔ＃１５１４０）、０．０５ｍＬの４．０ｍｇヒト組換えインスリン／ｍＬ（カタログ番号１２５８５−０１４）、０．５ｍＬの最終容量１．８ｍＬあたり２００ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ溶液（カタログ番号３５０５０）、及び０．７５ｍＬの１．０Ｍ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４（カタログ番号１５６３０）で溶出した。ヒト肝細胞は、最終体積１０３．６ｍＬあたり、Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｅ培地１００ｍＬ、デキサメタゾン０．００１ｍＬ、及びメンテナンスカクテルＢ（カタログ番号Ａ１３４４８）３．６ｍＬを含むメンテナンス培地で維持した。

【0238】

ヒト骨格筋筋芽細胞の初代培養物をロンザ（Ｌｏｎｚａ）から入手し、製造者の記載に従ってＳｋＧＭ（商標）培地で培養した。

【0239】

ＳｋｇＭ （商標） −２ Ｂｕｌｌｉｔ （商標）キット（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＣＣ−３２４５）は、５００ｍＬのＳｋＧＭ−２培地（＃００００４８２６５３）中、０．５ｍＬのヒト上皮成長因子［ｈＥＧＦ］（＃００００４８２６５３）、０．５ｍＬのデキサメタゾン（＃００００４７４７３８）、１０ｍＬのＬ−グルタミン（＃００００４７４７４０）、５０ｍＬのウシ胎児血清（＃００００４７４７４１）、０．５ｍＬのゲンタマイシン／アンホテリシン−Ｂ［ＧＡ］（＃００００４７４７３６）を含む。

【0240】

ヒト肝臓洞様内皮細胞の初代培養物をＣｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏａｒｒａｙから購入し、ＳｕｐｅｒＣｕｌｔ（登録商標）内皮細胞培地で培養し、製造者の記載に従ってゼラチンベースのコーティング上で増殖させた。ＳｕｐｅｒＣｕｌｔ（登録商標）Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｋｉｔ（カタログ＃ＥＣＭ−５００ Ｋｉｔ）は、０．５ｍＬのＶＥＧＦ（＃１５２０６）、０．５ｍＬのヘパリン（＃１５２５０）、０．５ｍＬのＥＧＦ、０．５ｍＬのＨｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ（＃１５３１８）、５．０ｍＬのＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（＃１５１７９）、５．０ｍＬのＬ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（＃１５４０９）、１０．０ｍＬのＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（＃１５６０４）、５０．０ｍＬのＦＢＳ（＃１５３１０）、及び５００．０ｍＬのＳｕｐｅｒＣｕｌｔ（登録商標）Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（＃１５５１７）を含む

【0241】

初代ヒト細胞のＡＡＶＦ媒介性編集。ヒト初代肝細胞を、９６ウェルフォーマットについては２×１０^４細胞／０．１ｍＬ、または２４ウェルフォーマットについては２×１０^４細胞／０．５ｍＬで、０日目に播種した。ウィルスベクターは、後述のように、２日目の４８時間後に添加した。ヒト骨格筋筋芽細胞、及びヒト肝臓洞様内皮細胞を、１日目に９６ウェルフォーマットで２×１０^４細胞／０．１ｍＬまたは２４ウェルフォーマットで２×１０^４細胞／０．５ｍＬで播種した。２日目に、ウイルスベクターを１５０，０００ＶＧ（ベクターゲノム）／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）／細胞（ＡＡＶＦ５についてＭＯＩ５×１０^４ＶＧ／細胞ＡＡＶＦ１７については、２．５×１０^４ＶＧ／細胞のＭＯＩを使用した）。ベクターを細胞に添加する前に、ベクター送達に使用した全てのピペットチップを硫酸プロタミン（１０ｍｇ／ｍＬ）でコーティングし、ベクターを形質導入の直前に３０秒間ボルテックスして完全に混合した。細胞に添加されたベクターの体積は、ウェル中の総体積の５％を超えなかった。

【0242】

ヒト初代肝細胞の培養培地を３日目にリフレッシュした。４日目に、細胞を採取し（接着細胞をトリプシン処理した）、Ｈｙｐｅｒｃｙｔ Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒを備えたＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔフローサイトメーターを用いてフローサイトメトリーによりＶｅｎｕｓ発現を分析した。編集は、非形質導入細胞（典型的には１％未満のＶｅｎｕｓ陽性細胞）において観察された、Ｖｅｎｕｓ陽性であった全細胞集団からバックグラウンド蛍光を差し引いた全細胞集団のパーセントとして表した。

【0243】

結果

【0244】

試験した全てのＡＡＶＦについてヒトＰＰＰ１Ｒ１２ｃ遺伝子座の編集が観察され、細胞タイプの選択性が示された（表４）。一般に、ＡＡＶＦ５は、初代細胞集団のそれぞれにおいて、ヒト肝細胞の２％の低さから、初代骨格筋芽細胞、及び肝臓の類洞状内皮細胞における２４％〜３５％まで、４８時間の感染後、最高レベルの編集を与えた。ＡＡＶＦ７、及びＡＡＶＦ１７はまた、初代肝類洞内皮細胞、及び骨格筋芽細胞において高レベルの遺伝子編集をもたらした。これらの細胞におけるＡＡＶＦベクターによる編集のレベルは、ＡＡＶ２またはＡＡＶ６で観察されたレベルより１０〜５０倍高かった。ＡＡＶＦベクターは、プロモーターを持たないＶｅｎｕｓベクターゲノムをパッケージングしたＡＡＶ２またはＡＡＶ６で形質導入された形質導入されていない細胞または細胞で見られたものより一貫して高いレベルの編集をもたらした。これらの細胞におけるＡＡＶ２またはＡＡＶ６のいずれかについては、編集がほとんどまたは全く観察されなかった。初代ヒト細胞におけるこれらのデータは、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶＦ７、及びＡＡＶＦ１７がヒト組織に広い指向性を有し、肝臓、骨格筋、及び内皮細胞集団に向けられた遺伝子治療用途に有用であり得ることを示している。

【0245】

比較のために、初代ヒト細胞集団のそれぞれに、チキンベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターの制御下でｍＣｈｅｒｒｙをパッケージングするＡＡＶＦ遺伝子導入ベクターを形質導入した。Ｖｅｎｕｓ／ｍＣｈｅｒｒｙのタンパク質発現比は、実験（Ｖｅｎｕｓ）の遺伝子編集ベクターを用いて多様な細胞タイプにおいて検出可能なタンパク質発現を有する細胞の数と、ＡＡＶ６、ＡＡＶＦ５、及びＡＡＶＦ７に対して上記の遺伝子導入ベクター（ｍＣｈｅｒｒｙ）を用いて検出可能なタンパク質発現を有する細胞の数とを反映した、編集比を推定するために用いられた。表５に示すように、ＡＡＶ６媒介遺伝子編集は、一般に、研究された初代ヒト細胞における対応するＡＡＶＦ媒介遺伝子導入アプローチよりもタンパク質発現に対してより有効であるが、ＡＡＶ６媒介遺伝子編集は、実質的に同じか、そのような細胞におけるＡＡＶ６媒介遺伝子導入よりあまり有効ではない。注目すべきことに、表５に示すように、ＡＡＶＦ媒介遺伝子編集は、研究した初代ヒト細胞のＡＡＶ６媒介遺伝子編集で観察されたものよりも高かった。これらのデータは、ＡＡＶＦ媒介遺伝子編集が様々な初代ヒト細胞においてＡＡＶ６よりも効率的であり、ＡＡＶＦ媒介遺伝子編集が、そのような細胞における対応する遺伝子伝達アプローチよりも好ましいことを示す。

【0246】

ｍＣｈｅｒｒｙレポーターをパッケージングするＡＡＶＦベクターも、初代ヒト細胞に効果的に形質導入し、細胞タイプ特異性を示した（表６）。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、及び肝類洞内皮細胞（ＨＳＥＣ）では、ＡＡＶＦ９による形質導入は４８時間の感染後に３８〜５０％ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞を産生した。ＡＡＶＦ９はまた、ヒト骨格筋筋芽細胞を効率的に形質導入し、より少ない程度で、試験したＡＡＶＦの全てが、これらの条件下でＨＳＥＣに効果的に形質導入した（表６）。理論に拘束されるものではないが、これらの研究におけるｍＣｈｅｒｒｙ発現の大部分は、相同性アームがｍＣｈｅｒｒｙベクターゲノムに存在しないため、発現がＣＢＡプロモーターによって駆動されるため、レポーターのエピソーム発現を表す可能性が高い。

【0247】

【表6】

【0248】

実施例７：ＡＡＶＦ相対遺伝子編集（ＨＤＲ）対、遺伝子導入（形質導入）効率の研究
相対的遺伝子編集効率対、ＡＡＶＦベクターの遺伝子導入形質導入効率を評価するために、２種類のＡＡＶベースのベクター（ＣＢＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子伝達ベクター、及びＡＡＶＳ１−Ｖｅｎｕｓ遺伝子編集ベクター、図３９）を使用した。ＡＡＶ２、及びＡＡＶ６の相対的な発現を示す。遺伝子導入ベクターについては、ＣＢＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ構築物はニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーターの制御下にｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を含み、ポリアデニル化シグナルを利用したが、相同性アームを含まなかった。遺伝子編集ベクターのために、ＡＡＶＳ１−Ｖｅｎｕｓ構築物は、Ｖｅｎｕｓ ＯＲＦを、染色体１９のＡＡＶＳ１領域内のＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子のイントロン１に標的化する（ＨＡ−Ｌ）及び（ＨＡ−Ｒ）相同性アームを有するプロモーターのないＶｅｎｕｓオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含ませた。Ｖｅｎｕｓ ＯＲＦの上流にスプライスアクセプター（ｓｐｌｉｃｅ ａｃｃｅｐｔｏｒ）（ＳＡ）、及び２Ａ配列があり、Ｖｅｎｕｓ転写産物をスプライシングしてＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子とは独立して発現させた。

【0249】

初代ヒト臍帯血ＣＤ３４＋造血幹／前駆細胞において、ＡＡＶＦ、ＡＡＶ２、及びＡＡＶ６ベクターが遺伝子編集対遺伝子伝達を仲介する能力を比較した。使用した細胞を複数のドナーからプールした。精製されたＣＤ３４＋細胞を、１細胞当たり１５０，０００個のベクターゲノム（ＶＧ）の多重度で遺伝子導入ベクター（ＡＡＶ＊−ＣＢＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ）または遺伝子編集ベクター（ＡＡＶ＊−Ｖｅｎｕｓ）のいずれかで形質導入した。４８時間後、細胞を採取し、フローサイトメトリーによって分析した（図４０Ａ、及び４０Ｂ）。示されるデータは、バックグラウンド非形質導入細胞の減算を含む。

【0250】

Ｖｅｎｕｓの発現は遺伝子編集の効率を表すのに対して、ｍＣｈｅｒｒｙ発現は形質導入効率を表すと仮定された。理論に拘束されるものではないが、以下はＡＡＶ形質導入と編集の潜在的メカニズムの要約である。感染すると、ＡＡＶは細胞表面受容体に結合し、核移行、及び進入の前に内在化される。核では、ＡＡＶはコーティングされず、ベクターゲノムが放出される。これらのプロセスは、ベクターゲノムにかかわらず、同じ細胞集団中の各所定のキャプシドについて同じ速度で起こる可能性が高い。コーティングしないと、一本鎖ＣＢＡ−ｍＣｈｅｒｒｙゲノムはｍＣｈｅｒｒｙ発現の前に第二鎖合成を受ける。他方、プロモーターを持たないＶｅｎｕｓ編集ベクターは、染色体１９上の相補性のゲノム領域に向けられている。次いで、相同性アームによって境界を定められたＳＡ／２Ａ−Ｖｅｎｕｓカセットは、相同性依存修復（ＨＤＲ）機構を介して相同性アームの内部接合部で染色体に組換えられ得る。この再結合事象に続いて、Ｖｅｎｕｓは正常に編集された細胞内で発現される。

【0251】

Ｖｅｎｕｓは、ＡＡＶＦ９を除く全てのベクターについて、ｍＣｈｅｒｒｙよりもはるかに高い割合の細胞で発現された（図４０Ａ、及び４０Ｃ）。Ｖｅｎｕｓ発現は、ＡＡＶＦ１、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶＦ７、ＡＡＶＦ１６、及びＡＡＶＦ１７による形質導入後に特に高かった。同じキャプシドが、ｍＣｈｅｒｒｙ発現のレベルをはるかに低くした（図４０Ａ、及び４０Ｃ）。ＡＡＶ２、及びＡＡＶ６による形質導入後に、ｍＣｈｅｒｒｙ、及びＶｅｎｕｓ発現の両方の発現量が最小限であることが観察された。ＶｅｎｕｓとｍＣｈｅｒｒｙの相対的発現の比較も行った。具体的には、上述の遺伝子導入ベクター（ｍＣｈｅｒｒｙ）を用いて検出可能なタンパク質発現を有する細胞の数に対する、実験（Ｖｅｎｕｓ）の遺伝子編集ベクターを用いた様々な細胞タイプにおける検出可能なタンパク質発現を有する細胞数の比を反映する編集比が決定された。編集比は、核内でのコーティングを通じたウイルス侵入のプロセスのための正規化後の各ＡＡＶキャプシドによって媒介される編集の相対効率の推定値を提供する。試験したすべてのＡＡＶベクターは、ＡＡＶＦ９を除いて、遺伝子導入／導入遺伝子発現（ｍＣｈｅｒｒｙ）と比較して、より効率的な遺伝子編集（Ｖｅｎｕｓ）を示した（図４０Ｄ、及び表７）。ＡＡＶＦ５、及びＡＡＶＦ７が最も高い編集比を示した（図４０Ｄ、及び表７）。ＡＡＶ２、及びＡＡＶ６媒介遺伝子編集（Ｖｅｎｕｓ）と比較して、ＡＡＶＦ媒介遺伝子編集（Ｖｅｎｕｓ）もまた比較した（ＡＡＶ２またはＡＡＶ６のいずれかに対して同じ比で割ったＡＡＶＦのＶｅｎｕｓ：ｍＣｈｅｒｒｙ比を示す表７）。ＡＡＶＦ遺伝子編集構築物の遺伝子編集効果は、ＡＡＶ２、及びＡＡＶ６遺伝子編集構築物と比較して有利に比較された。ＡＡＶＦ５、及びＡＡＶＦ７の編集比は、比較したベクターの中で最高であり、これらのベクターが特に効率的な編集を媒介することを示している。

【0252】

【表7】

【0253】

本発明は、本発明のいくつかの態様の例示として意図される実施例に開示される特定の実施形態によって範囲が限定されず、機能的に同等の任意の実施形態は本発明の範囲内である。実際、本明細書に示され説明されたものに加えて、本発明の様々な改変は、当業者には明らかとなり、添付の特許請求の範囲に含まれるものとする。
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１８． ＫＡＰＬＩＴＴ，Ｍ．Ｇ．，ＦＥＩＧＩＮ，Ａ．，ＴＡＮＧ，Ｃ．，ＦＩＴＺＳＩＭＯＮＳ，Ｈ．Ｌ．，ＭＡＴＴＩＳ，Ｐ．，ＬＡＷＬＯＲ，Ｐ．Ａ．，ＢＬＡＮＤ，Ｒ．Ｊ．，ＹＯＵＮＧ，Ｄ．，ＳＴＲＹＢＩＮＧ，Ｋ．，ＥＩＤＥＬＢＥＲＧ，Ｄ．，ａｎｄ ＤＵＲＩＮＧ，Ｍ．Ｊ．（２００７）．Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ａｎ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ） ｂｏｒｎｅ ＧＡＤ ｇｅｎｅ ｆｏｒ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ：ａｎ ｏｐｅｎ ｌａｂｅｌ，ｐｈａｓｅ Ｉ ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ ３６９，２０９７−２１０５．
１９． ＫＥＬＬＳ，Ａ．Ｐ．，ＨＡＤＡＣＺＥＫ，Ｐ．，ＹＩＮ，Ｄ．，ＢＲＩＮＧＡＳ，Ｊ．，ＶＡＲＥＮＩＫＡ，Ｖ．，ＦＯＲＳＡＹＥＴＨ，Ｊ．，ａｎｄ ＢＡＮＫＩＥＷＩＣＺ，Ｋ．Ｓ．（２００９）．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ−ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｔｏ ｐｒｉｍａｔｅ ｃｏｒｔｅｘ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０６，２４０７−２４１１．
２０． ＫＥＳＳＬＥＲ，Ｐ．Ｄ．，ＰＯＤＳＡＫＯＦＦ，Ｇ．Ｍ．，ＣＨＥＮ，Ｘ．，ＭＣＱＵＩＳＴＯＮ，Ｓ．Ａ．，ＣＯＬＯＳＩ，Ｐ．Ｃ．，ＭＡＴＥＬＩＳ，Ｌ．Ａ．，ＫＵＲＴＺＭＡＮ，Ｇ．Ｊ．，ａｎｄ ＢＹＲＮＥ，Ｂ．Ｊ．（１９９６）．Ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９３，１４０８２−１４０８７．
２１． ＭＡＮＮＯ，Ｃ．Ｓ．，ＣＨＥＷ，Ａ．Ｊ．，ＨＵＴＣＨＩＳＯＮ，Ｓ．，ＬＡＲＳＯＮ，Ｐ．Ｊ．，ＨＥＲＺＯＧ，Ｒ．Ｗ．，ＡＲＲＵＤＡ，Ｖ．Ｒ．，ＴＡＩ，Ｓ．Ｊ．，ＲＡＧＮＩ，Ｍ．Ｖ．，ＴＨＯＭＰＳＯＮ，Ａ．，ＯＺＥＬＯ，Ｍ．，ＣＯＵＴＯ，Ｌ．Ｂ．，ＬＥＯＮＡＲＤ，Ｄ．Ｇ．，ＪＯＨＮＳＯＮ，Ｆ．Ａ．，ＭＣＣＬＥＬＬＡＮＤ，Ａ．，ＳＣＡＬＬＡＮ，Ｃ．，ＳＫＡＲＳＧＡＲＤ，Ｅ．，ＦＬＡＫＥ，Ａ．Ｗ．，ＫＡＹ，Ｍ．Ａ．，ＨＩＧＨ，Ｋ．Ａ．，ａｎｄ ＧＬＡＤＥＲ，Ｂ．（２００３）．ＡＡＶ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ＩＸ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｅｖｅｒｅ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｂ．Ｂｌｏｏｄ １０１，２９６３−２９７２．
２２． ＭＣＣＯＲＭＡＣＫ，Ｍ．Ｐ．，ａｎｄ ＲＡＢＢＩＴＴＳ，Ｔ．Ｈ．（２００４）．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｔ−ｃｅｌｌ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ＬＭＯ２ ａｆｔｅｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ ｓｅｖｅｒｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５０，９１３−９２２．
２３． ＭＩＬＬＥＲ，Ｄ．Ｇ．，ＡＤＡＭ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ ＭＩＬＬＥＲ，Ａ．Ｄ．（１９９０）．Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｙ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｏｃｃｕｒｓ ｏｎｌｙ ｉｎ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ａｒｅ ａｃｔｉｖｅｌｙ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ａｔ ｔｈｅ ｔｉｍｅ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０，４２３９−４２４２．
２４． ＰＡＺ，Ｈ．，ＷＯＮＧ，Ｃ．Ａ．，ＬＩ，Ｗ．，ＳＡＮＴＡＴ，Ｌ．，ＷＯＮＧ，Ｋ．Ｋ．，ａｎｄ ＣＨＡＴＴＥＲＪＥＥ，Ｓ．（２００７）．Ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＣＤ３４−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ ｓｔａｂｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １８，６１４−６２６．
２５． ＰＥＴＲＳ−ＳＩＬＶＡ，Ｈ．，ＤＩＮＣＵＬＥＳＣＵ，Ａ．，ＬＩ，Ｑ．，ＭＩＮ，Ｓ．Ｈ．，ＣＨＩＯＤＯ，Ｖ．，ＰＡＮＧ，Ｊ．Ｊ．，ＺＨＯＮＧ，Ｌ．，ＺＯＬＯＴＵＫＨＩＮ，Ｓ．，ＳＲＩＶＡＳＴＡＶＡ，Ａ．，ＬＥＷＩＮ，Ａ．Ｓ．，ａｎｄ ＨＡＵＳＷＩＲＴＨ，Ｗ．Ｗ．（２００９）．Ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｒｅｔｉｎａ ｂｙ ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｍｕｔａｎｔ ＡＡＶ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １７，４６３−４７１．
２６． ＰＯＤＳＡＫＯＦＦ，Ｇ．，ＷＯＮＧ，Ｋ．Ｋ．，ＪＲ．，ａｎｄ ＣＨＡＴＴＥＲＪＥＥ，Ｓ．（１９９４）．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｎｏｎｄｉｖｉｄｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８，５６５６−５６６６．
２７． ＰＯＮＮＡＺＨＡＧＡＮ，Ｓ．，ＹＯＤＥＲ，Ｍ．Ｃ．，ａｎｄ ＳＲＩＶＡＳＴＡＶＡ，Ａ．（１９９７）．Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｇｌｏｂｉｎ ｇｅｎｅ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７１，３０９８−３１０４．
２８． ＲＡＪ，Ｋ．，ＯＧＳＴＯＮ，Ｐ．，ａｎｄ ＢＥＡＲＤ，Ｐ．（２００１）．Ｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｋｉｌｌｉｎｇ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｌａｃｋ ｐ５３ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ ４１２，９１４−９１７．
２９． ＳＡＮＴＡＴ，Ｌ．，ＰＡＺ，Ｈ．，ＷＯＮＧ，Ｃ．，ＬＩ，Ｌ．，ＭＡＣＥＲ，Ｊ．，ＦＯＲＭＡＮ，Ｓ．，ＷＯＮＧ，Ｋ．Ｋ．，ａｎｄ ＣＨＡＴＴＥＲＪＥＥ，Ｓ．（２００５）．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＡＶ２ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｈｕｍａｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｓｅｒｉａｌ ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ｉｎ ｉｍｍｕｎｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０２，１１０５３−１１０５８．
３０． ＳＲＩＶＡＳＴＡＶＡ，Ａ．（２００４）．Ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｍｕｒｉｎｅ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ａｎｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＡＡＶ２ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４６，２４５−２５４．
３１． ＴＯＷＮＥ，Ｃ．，ＳＣＨＮＥＩＤＥＲ，Ｂ．Ｌ．，ＫＩＥＲＡＮ，Ｄ．，ＲＥＤＭＯＮＤ，Ｄ．Ｅ．，ＪＲ．，ａｎｄ ＡＥＢＩＳＣＨＥＲ，Ｐ．（２００９）．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＡＶ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ６．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．
３２． ＺＨＯＮＧ，Ｌ．，ＣＨＥＮ，Ｌ．，ＬＩ，Ｙ．，ＱＩＮＧ，Ｋ．，ＷＥＩＧＥＬ−ＫＥＬＬＥＹ，Ｋ．Ａ．，ＣＨＡＮ，Ｒ．Ｊ．，ＹＯＤＥＲ，Ｍ．Ｃ．，ａｎｄ ＳＲＩＶＡＳＴＡＶＡ，Ａ．（２００４ａ）．Ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ２（ＡＡＶ）−Ｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｓ ｈｅｌｐｅｒ ｖｉｒｕｓｅｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １０，９５０−９５７．
３３． ＺＨＯＮＧ，Ｌ．，ＬＩ，Ｂ．，ＪＡＹＡＮＤＨＡＲＡＮ，Ｇ．，ＭＡＨ，Ｃ．Ｓ．，ＧＯＶＩＮＤＡＳＡＭＹ，Ｌ．，ＡＧＢＡＮＤＪＥＭＣＫＥＮＮＡ，Ｍ．，ＨＥＲＺＯＧ，Ｒ．Ｗ．，ＷＥＩＧＥＬ−ＶＡＮ ＡＫＥＮ，Ｋ．Ａ．，ＨＯＢＢＳ，Ｊ．Ａ．，ＺＯＬＯＴＵＫＨＩＮ，Ｓ．，ＭＵＺＹＣＺＫＡ，Ｎ．，ａｎｄ ＳＲＩＶＡＳＴＡＶＡ，Ａ．（２００８ａ）．Ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ２ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｎ ｖｉｒａｌ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ａｎｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３８１，１９４−２０２．
３４． ＺＨＯＮＧ，Ｌ．，ＬＩ，Ｂ．，ＭＡＨ，Ｃ．Ｓ．，ＧＯＶＩＮＤＡＳＡＭＹ，Ｌ．，ＡＧＢＡＮＤＪＥ−ＭＣＫＥＮＮＡ，Ｍ．，ＣＯＯＰＥＲ，Ｍ．，ＨＥＲＺＯＧ，Ｒ．Ｗ．，ＺＯＬＯＴＵＫＨＩＮ，Ｉ．，ＷＡＲＲＩＮＧＴＯＮ，Ｋ．Ｈ．，ＪＲ．，ＷＥＩＧＥＬ−ＶＡＮ ＡＫＥＮ，Ｋ．Ａ．，ＨＯＢＢＳ，Ｊ．Ａ．，ＺＯＬＯＴＵＫＨＩＮ，Ｓ．，ＭＵＺＹＣＺＫＡ，Ｎ．，ａｎｄ ＳＲＩＶＡＳＴＡＶＡ，Ａ．（２００８ｂ）．Ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ２ ｖｅｃｔｏｒｓ：ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅｓ ｌｅａｄ ｔｏ ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ａｔ ｌｏｗｅｒ ｄｏｓｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０５，７８２７−７８３２．
３５． ＺＨＯＮＧ，Ｌ．，ＬＩ，Ｗ．，ＹＡＮＧ，Ｚ．，ＱＩＮＧ，Ｋ．，ＴＡＮ，Ｍ．，ＨＡＮＳＥＮ，Ｊ．，ＬＩ，Ｙ．，ＣＨＥＮ，Ｌ．，ＣＨＡＮ，Ｒ．Ｊ．，ＢＩＳＣＨＯＦ，Ｄ．，ＭＡＩＮＡ，Ｎ．，ＷＥＩＧＥＬ−ＫＥＬＬＥＹ，Ｋ．Ａ．，ＺＨＡＯ，Ｗ．，ＬＡＲＳＥＮ，Ｓ．Ｈ．，ＹＯＤＥＲ，Ｍ．Ｃ．，ＳＨＯＵ，Ｗ．，ａｎｄ ＳＲＩＶＡＳＴＡＶＡ，Ａ．（２００４ｂ）．Ｉｍｐａｉｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ａｎｄ ｕｎｃｏａｔｉｎｇ ｌｉｍｉｔ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ２ ｖｅｃｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｍｕｒｉｎｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌｓ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １５，１２０７−１２１８．
３６． ＺＨＯＮＧ，Ｌ．，ＺＨＡＯ，Ｗ．，ＷＵ，Ｊ．，ＬＩ，Ｂ．，ＺＯＬＯＴＵＫＨＩＮ，Ｓ．，ＧＯＶＩＮＤＡＳＡＭＹ，Ｌ．，ＡＧＢＡＮＤＪＥＭＣＫＥＮＮＡ，Ｍ．，ａｎｄ ＳＲＩＶＡＳＴＡＶＡ，Ａ．（２００７）．Ａ ｄｕａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ＥＧＦＲ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ２ ｃａｐｓｉｄｓ ａｎｄ ｖｉｒａｌ ｓｅｃｏｎｄ−ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １５，１３２３−１３３０．
３７． ＺＨＯＵ，Ｓ．Ｚ．，ＢＲＯＸＭＥＹＥＲ，Ｈ．Ｅ．，ＣＯＯＰＥＲ，Ｓ．，ＨＡＲＲＩＮＧＴＯＮ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ ＳＲＩＶＡＳＴＡＶＡ，Ａ．（１９９３）．Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ２−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ ２１，９２８−９３３．
３８．ＫＨＡＮ，Ｉ．Ｇ．，ＨＩＲＡＴＡ，Ｒ．Ｋ．，ＲＵＳＳＥＬＬ，Ｄ．Ｗ．（２０１１） ＡＡＶ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．４，４８２−５０１．
３９．ＫＨＯＴＩＮ，Ｒ．Ｍ．，ＬＩＮＤＥＮ，Ｒ．Ｍ．，ａｎｄ ＢＥＲＮＳ，Ｋ．Ｉ．（１９９２）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ ｓｉｔｅ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １９ｑ ｆｏｒ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ｂｙ ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．ＥＭＢＯ １３，５０７１−８．
４０．ＧＩＲＡＵＤ，Ｃ．，ＷＩＮＯＣＯＵＲ，Ｅ．，ａｎｄ ＢＥＲＮＳ，Ｋ．Ｉ．（１９９４）．Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｂｙ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｉｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｂｙ ａ ｃｅｌｌｕｌａｒ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２１，１００３９−４３．
４１．ＬＩＮＤＥＮ，Ｒ．Ｍ．，ＷＡＲＤ，Ｐ．，ＧＩＲＡＵＤ，Ｃ．，ＷＩＮＯＣＯＵＲ，Ｅ．，ａｎｄ ＢＥＲＮＳ，Ｋ．Ｉ．（１９９６Ａ）．Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｂｙ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２１，１１２８８−９４．
４２．ＬＩＮＤＥＮ，Ｒ．Ｍ．，ＷＩＮＯＣＯＵＲ，Ｅ．，ａｎｄ ＢＥＲＮＳ，Ｋ．Ｉ．（１９９６Ｂ）．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌｓ ｆｏｒ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １５，７９６６−７２．
４３．ＸＵ，Ｌ．，Ｏ’ＭＡＬＬＥＹ，Ｔ．，ＳＡＮＤＳ，Ｍ．Ｓ．，ＷＡＮＧ，Ｂ．，ＭＥＹＥＲＲＯＳＥ，Ｔ．，ＨＡＳＫＩＮＳ，Ｍ．Ｅ．，ａｎｄ ＰＯＮＤＥＲ，Ｋ．Ｐ（２００４）．Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ａｆｔｅｒ Ｎｅｏｎａｔａｌ Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ａｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ ｉｎ Ｍｉｃｅ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｊｕｌ；１０（１）：３７−４４．
４４．ＷＡＮＧ，Ｃ．Ｘ．，ＳＡＴＨＥＲ，Ｂ．Ｄ．，ＷＡＮＧ，Ｘ．，ＡＤＡＩＲ，Ｊ．，ＫＨＡＮ，Ｉ．，ＳＩＮＧＨ，Ｓ．，ＬＡＮＧ，Ｓ．，ＡＤＡＭＳ，Ａ．，ＣＵＲＩＮＧＡ，Ｇ．，ＫＩＥＭ，Ｈ−Ｐ．，ＭＩＡＯ，Ｃ．Ｈ．，ＲＡＷＬＩＮＧＳ，Ｄ．Ｊ．，ａｎｄ ＴＯＲＢＥＴＴ，Ｂ．Ｅ．（２０１４）．Ｒａｐａｍｙｃｉｎ ｒｅｌｉｅｖｅｓ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ．Ａｕｇ；１２４（６）：９１３−２３．
４５．ＣＡＲＢＯＮＡＲＯ，Ｄ．Ａ．，ＪＩＮ，Ｘ．，ＰＥＴＥＲＳＥＮ，Ｄ．，ＷＡＮＧ，Ｘ．，ＤＯＲＥＹ，Ｆ．，ＫＩＬ，Ｋ．Ｓ．，ＡＬＤＲＩＣＨ，Ｍ．，ＢＬＡＣＫＢＵＲＮ，Ｍ．Ｒ．，ＫＥＬＬＥＭＳ，Ｒ．Ｅ．，ａｎｄ ＫＯＨＮ，Ｄ．Ｂ．（２００６） Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｈｕｍａｎ ＡＤＡ ｉｎｔｏ Ｎｅｏｎａｔａｌ ＡＤＡ Ｇｅｎｅ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｍｉｃｅ：Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｆｏｒｍ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ＡＤＡ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｊｕｎ；１３（６）：１１１０−２０．
４６．ＳＭＩＴＨ，Ｌ．Ｊ．，ＵＬ−ＨＡＳＡＮ，Ｔ．，ＣＡＲＶＡＩＮＥＳ，Ｓ．Ｋ．，ＶＡＮ ＶＬＩＥＴ，Ｋ．，ＹＡＮＧ，Ｅ．，ＷＯＮＧ，ＪＲ，Ｋ．Ｋ．，ＡＧＢＡＮＤＪＥ−ＭＣＫＥＮＮＡ，Ｍ．，ａｎｄ ＣＨＡＴＴＥＲＪＥＥ，Ｓ．（２０１４） Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ＡＡＶ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｓｅｐｔ；２２（９）：１６２５−１６３４．

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図1-4】

【図1-5】

【図1-6】

【図1-7】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図2-4】

【図3】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図6-1】

【図6-2】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22-1】

【図22-2】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26-1】

【図26-2】

【図26-3】

【図26-4】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31-1】

【図31-2】

【図32】

【図33-1】

【図33-2】

【図33-3】

【図33-4】

【図33-5】

【図33-6】

【図33-7】

【図33-8】

【図33-9】

【図34-1】

【図34-2】

【図34-3】

【図34-4】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40-1】

【図40-2】

【図40-3】

【図40-4】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]