特許 6683892 Ｒｖ２２９９ｃとＥＳＡＴ−６を融合した蛋白質を含む樹状細胞の成熟化促進用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6683892

(24)【登録日】2020年3月30日

(45)【発行日】2020年4月22日

(54)【発明の名称】Ｒｖ２２９９ｃとＥＳＡＴ−６を融合した蛋白質を含む樹状細胞の成熟化促進用組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/04 20060101AFI20200413BHJP

   C12N 5/0784 20100101ALI20200413BHJP

   C12N 1/38 20060101ALI20200413BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20200413BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20200413BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20200413BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20200413BHJP

   C07K 14/35 20060101ALN20200413BHJP

   A61P 31/06 20060101ALN20200413BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/04ZNA

   C12N5/0784

   C12N1/38

   A61P37/04

   A61P43/00 107

   A61K39/39

   !C07K19/00

   !C07K14/35

   !A61P31/06

【請求項の数】10

【全頁数】34

(21)【出願番号】特願2019-517746(P2019-517746)

(86)(22)【出願日】2017年6月7日

(65)【公表番号】特表2019-521183(P2019-521183A)

(43)【公表日】2019年7月25日

(86)【国際出願番号】KR2017005892

(87)【国際公開番号】WO2017213407

(87)【国際公開日】20171214

【審査請求日】2018年12月10日

(31)【優先権主張番号】10-2016-0070517

(32)【優先日】2016年6月7日

(33)【優先権主張国】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】518436032

【氏名又は名称】クラティス・インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】ファ−チュン・キム

(72)【発明者】

【氏名】ハン−ギュ・チェ

(72)【発明者】

【氏名】スン−チェ・シン

【審査官】 柴原 直司

(56)【参考文献】

【文献】 韓国公開特許第１０−２０１３−００３９０６１（ＫＲ，Ａ）

【文献】 Oncotarget, (2015), 6, [32], p.33781-33790

【文献】 J. Immunol., (2012), 189, [6], p.3092-3103

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３８／００−３８／５８

Ａ６１Ｋ ３９／００−３９／４４４

Ｃ０７Ｋ １９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１で示されるアミノ酸配列よりなることを特徴とするＲｖ２２９９ｃとＥＳＡＴ−６を融合した蛋白質を有効成分として含む樹状細胞の成熟化誘導用組成物。

【請求項2】

上記Ｒｖ２２９９ｃとＥＳＡＴ−６は、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来の蛋白質であることを特徴とする、請求項１記載の樹状細胞の成熟化誘導用組成物。

【請求項3】

上記Ｒｖ２２９９ｃとＥＳＡＴ−６を融合した蛋白質は、１μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌ濃度で含まれることを特徴とする、請求項１記載の樹状細胞の成熟化誘導用組成物。

【請求項4】

（ａ）血液から分離された単核球を未成熟樹状細胞に分化させる段階と、
（ｂ）上記未成熟樹状細胞に配列番号１で示されるアミノ酸配列よりなることを特徴とするＲｖ２２９９ｃとＥＳＡＴ−６融合蛋白質を処理して成熟樹状細胞に成熟化させる段階と、
を含む、未成熟樹状細胞の成熟化誘導方法。

【請求項5】

上記Ｒｖ２２９９ｃとＥＳＡＴ−６融合蛋白質処理後、細胞を１２時間以上３６時間以下で培養することを特徴とする、請求項４記載の未成熟樹状細胞の成熟化誘導方法。

【請求項6】

上記Ｒｖ２２９９ｃとＥＳＡＴ−６融合蛋白質は、未成熟樹状細胞の成熟過程の間、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−６及びＩＬ−１βからなる群から選択された複数の産生を増加させることを特徴とする、請求項４記載の未成熟樹状細胞の成熟化誘導方法。

【請求項7】

上記Ｒｖ２２９９ｃとＥＳＡＴ−６融合蛋白質は、１μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌ濃度で含まれることを特徴とする、請求項４記載の樹状細胞の成熟化誘導方法。

【請求項8】

上記未成熟樹状細胞の成熟は、Ｒｖ２２９９ｃとＥＳＡＴ−６融合蛋白質は、ＴＬＲ（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）−４を刺激して起こることを特徴とする、請求項４記載の樹状細胞の成熟化誘導方法。

【請求項9】

上記未成熟樹状細胞の成熟は、ミトゲン−活性化蛋白質キナーゼ（ＭＡＰＫ）及びＮＦ−κＢを刺激して起こることを特徴とする、請求項４樹状細胞の成熟化誘導方法。

【請求項10】

請求項１又は２の組成物を含む免疫増強用組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、樹状細胞の成熟化誘導用組成物及び樹状細胞を成熟させる方法に関する。より具体的には、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のＲｖ２２９９ｃとＥＳＡＴ−６を融合した蛋白質を含む樹状細胞の成熟化誘導用組成物及びこれを用いて未成熟樹状細胞を成熟樹状細胞に分化させる方法に関する。

【背景技術】

【0002】

結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｔｂ）は、最も成功したヒトの病原体の一つであって、全世界の人口の３分の１が結核菌に感染している（Ｋａｕｆｍａｎｎ、２００１）。現在使用されている唯一のワクチンであるウシ型結核菌カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）が成人の結核（Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、ＴＢ）に対抗して、重要な防御効果を示さないため（Ｂｒａｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，２００２）、ＢＣＧを代替又はブーストすることができるより効果的なワクチンが必要である。有望な結核（ＴＢ）ワクチン候補の開発を可能にするために、予防免疫誘導と関連のあるマイコバクテリア性抗原を確認し特徴を説明することが重要である。しかし、現在、様々な段階の臨床試験中にあるＴＢワクチンを調製するのに、多くの抗原が使用されてきた（Ａｈｓａｎ、２０１５）。

【0003】

Ｔｈ１免疫反応は、Ｍｔｂ感染規制に不可欠であり、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２経路に関連して、遺伝子破壊または突然変異を有するマウス又はヒトマイコバクテリア性感染に対する感受性の増加がそれを証明する（ｖａｎ Ｃｒｅｖｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００２）。したがって、ＴＢワクチンに関する多くの研究が抗原８５複合体（Ａｇ８５）及びＥＳＡＴ−６などの強いＴ細胞刺激抗原に重点を置いている（Ｙｕｋ ａｎｄ Ｊｏ，２０１４）。感染を調節するのに不可欠なＴ細胞反応が感染したヒトや動物からＭｔｂを除去することがほとんどないので、（Ｆｅｌｄｍａｎ ａｎｄ Ｂａｇｇｅｎｓｔｏｓｓ、１９３８、Ｒｈｏａｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７、Ｇｒａｃｅ ａｎｄ Ｅｒｎｓｔ、２０１６）、これらの抗原がマウスからは、丈夫な予防免疫を誘導することができるが、完全な殺菌免疫を誘導することはできなかった（Ｗｅｉｎｒｉｃｈ Ｏｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１、Ａａｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。

【0004】

樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ、ＤＣ）は、免疫系で最も効率的な抗原提示細胞であって、先天性免疫と適応性免疫の橋渡しをする重要な細胞である。ＭｔｂがＤＣ機能を操作することによって、Ｔ細胞反応の開始を遅延させることで菌が増殖し得る時間を確保することにより（Ｇａｌｌｅｇｏｓ ｅｔ ａｌ．，２００８年、Ｈａｎｅｋｏｍ ｅｔ ａｌ．，２００３年、Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ｃｏｏｐｅｒ、２００９年）、潜伏的な形で生き残っていることを示唆している。

【0005】

したがって、Ｔ細胞刺激と一緒にＤＣの初期活性及びリンパ節へのＤＣ移入は、Ｍｔｂ感染に対する効果的な予防を誘導するための核心要因である。この結果は、ＤＣの活性化による効果的な宿主予防免疫を誘導するマイコバクテリア抗原が、ＴＢワクチンの開発における有望な標的であることを示唆する。実際、ＢＣＧに感染した、又はＭｔｂ抗原に曝露したＤＣは、マウスモデルにおいて、通常の、そして大量の病毒性Ｍｔｂ感染に対してかなりの予防効果を示した（Ｄｅｍａｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９、Ｒｕｂａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。

【0006】

しかし、Ｔｈ１免疫反応が作用するようにＤＣを活性化させるいくつかのマイコバクテリア蛋白質が確認されたが（Ｂｙｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２ｂ）、これらの具体的な抗−結核免疫機構及びワクチンとして蛋白質の予防効果についてはほとんど知られていない。

【0007】

ＤＣ−活性化抗原及びＴ細胞−刺激抗原からなる融合蛋白質がＴＢワクチンとして用いられれば、この蛋白質は、二つの肯定的な反応を誘導することができる。ＤＣ−活性化蛋白質自体によるＴｈ１偏光反応誘導及びＤＣ活性化によるＴ細胞−刺激抗原によって誘導される予防免疫の向上がそれである。したがって、本発明者らは、この融合蛋白質の予防効果がＴ細胞抗原のみを含有するワクチンの場合よりもさらに効果的であると想定した。ＨＳＰ６５をはじめマイコバクテリア熱ショック蛋白質（ＨＳＰ）がＴＢに対して強い予防免疫を誘導する、又は補助剤としての効果があることが報告された（Ｓｉｌｖａ、１９９９）。本研究では、本発明者らは、ＤＣ成熟を効果的に誘導するＨＳＰ９０ファミリーＲｖ２２９９ｃ蛋白質を確認しており、強いＴｈ１型反応を誘導するＤＣ活性化により抗−結核免疫機構を調べた。次に、本発明者らは、Ｍｔｂ ＨＮ８７８臨床分離に対するＲｖ２２９９ｃ蛋白質またはＲＶ２２９９ｃ−ＥＳＡＴ６融合蛋白質の予防ワクチンの効果を試験した。本発明者らの結果は、Ｒｖ２２９９ｃ−成熟ＤＣが、抗−結核免疫活性に対するＴｈ１細胞応答を誘導し、ＤＣ−活性化蛋白質−基盤ワクチンの新しい概念であって、Ｒｖ２２９９ｃ及びＥＳＡＴ６からなる融合蛋白質は、ＢＣＧをブーストするのに有望なワクチン標的であることを示唆した。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｋａｕｆｍａｎｎ、２００１

【非特許文献2】Ｂｒａｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，２００２

【非特許文献3】ｖａｎ Ｃｒｅｖｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００２

【非特許文献4】Ｙｕｋ ａｎｄ Ｊｏ，２０１４

【非特許文献5】Ｆｅｌｄｍａｎ ａｎｄ Ｂａｇｇｅｎｓｔｏｓｓ、１９３８、Ｒｈｏａｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７、Ｇｒａｃｅ ａｎｄ Ｅｒｎｓｔ、２０１６

【非特許文献6】Ｗｅｉｎｒｉｃｈ Ｏｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１、Ａａｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０１１

【非特許文献7】Ｇａｌｌｅｇｏｓ ｅｔ ａｌ．，２００８年

【非特許文献8】Ｈａｎｅｋｏｍ ｅｔ ａｌ．，２００３年

【非特許文献9】Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．，２００７

【非特許文献10】Ｃｏｏｐｅｒ、２００９年

【非特許文献11】Ｄｅｍａｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９

【非特許文献12】Ｒｕｂａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００７

【非特許文献13】Ｂｙｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２ｂ

【非特許文献14】Ｓｉｌｖａ、１９９９

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

上記のように樹状細胞は、体自体の免疫機能を高めるのに重要な役割をしているので、樹状細胞の分化を促進し、成熟させることによって強力な免疫反応を誘発する非毒性の免疫調節剤の開発とその物質の作用機序を明確に理解することは、樹状細胞を用いた細胞免疫治療に重要な課題となっている。

【0010】

したがって、本発明の目的は、樹状細胞の成熟化促進用組成物を提供することにある。

【0011】

本発明のもう一つの目的は、樹状細胞の成熟化方法を提供することにある。

【0012】

本発明のもう一つの目的は、前記の方法で成熟化した樹状細胞を含有する結核菌治療剤を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0013】

上記の課題を解決するために、本発明は、Ｒｖ２２９９ｃ蛋白質基盤のＲｖ２２９９ｃとＥＳＡＴ−６を融合した蛋白質を有効成分として含む樹状細胞の活性化組成物を提供する。

【0014】

また、本発明は、上記Ｒｖ２２９９ｃ−ＥＳＡＴ−６融合蛋白質が結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来の蛋白質であることを特徴とする樹状細胞の成熟化誘導用組成物を提供する。

【0015】

上記Ｒｖ２２９９ｃ−ＥＳＡＴ−６融合蛋白質は、１μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌの量で含まれることが好ましい。

【0016】

また、未成熟樹状細胞にＲｖ２２９９ｃ蛋白質またはＲｖ２２９９ｃとＥＳＡＴ−６を融合した蛋白質を処理し、未成熟樹状細胞の成熟化を誘導する方法を提供する。

【0017】

上記の方法は、Ｒｖ２２９９ｃ−ＥＳＡＴ−６融合蛋白質処理後、細胞を１２時間以上３６時間以下で培養することが好ましく、上記Ｒｖ２２９９ｃ−ＥＳＡＴ−６融合蛋白質は、１μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌの量で添加されることが好ましい。

【0018】

上記Ｒｖ２２９９ｃ−ＥＳＡＴ−６融合蛋白質は、樹状細胞を成熟化させる過程の間、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ７０及びＩＬ−１βからなる群から選択された一つ以上の産生を増加させることを特徴とする、樹状細胞の成熟化誘導方法を提供する。

【0019】

また、本発明において、上記樹状細胞の成熟化誘導は、Ｒｖ２２９９ｃがＴＬＲ（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）−４を刺激する、またはミトゲン−活性化蛋白質キナーゼ（ＭＡＰＫ）及びＮＦ−κＢを刺激することによって起こることを特徴とする。

【0020】

上記の方法によって調製された樹状細胞は、ＣＤ（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ（Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ）−クラスＩ、ＩＩに対して陽性の免疫学的特性を示すことを特徴とする。

【0021】

また、本発明は、上記樹状細胞の成熟化誘導用組成物を含む免疫増強用組成物を提供する。

【発明の効果】

【0022】

本発明の樹状細胞を成熟させる方法により、未成熟細胞が成熟樹状細胞によく分化され得るので、体の免疫反応を効果的に活性化させることができるということに、その効果がある。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1(a)】Ｒｖ２２９９ｃ純度を調べるためのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット解析の写真である。

【図1(b)】Ｒｖ２２９９ｃまたはＬＰＳで処理されたＤＣにおける蛋白質による食作用活性の減少と機能の成熟の強化を示す写真である。

【図1(c)】２４時間Ｒｖ２２９９ｃで処理したＤＣにおけるクラスＩ及びＩＩ分子とＣＤ８０及びＣＤ８６のような同時刺激分子の発現を用量依存的に大幅に増加させることを示す写真である。

【図1(d)】Ｒｖ２２９９ｃで処理したＤＣにおけるＩＬ−１２ｐ７０陽性細胞率が大幅に増加することを示すグラフと写真である。

【図1(e)】Ｒｖ２２９９ｃで処理したＤＣにおけるＩＬ−１２ｐ７０陽性細胞率が大幅に増加することを示すグラフと写真である。

【図2】Ｒｖ２２９９ｃが樹状細胞の成熟活性がエンドトキシン汚染によるものであるか否か、確認するグラフである。

【図3(a)】Ｒｖ２２９９ｃがＴＬＲ４による経路でＤＣを活性化させ、表面分子及び前炎症性サイトカインの発現の誘導を示すグラフである。

【図3(b)】Ｒｖ２２９９ｃがＴＬＲ４による経路でＤＣを活性化させ、表面分子及び前炎症性サイトカインの発現の誘導を示すグラフである。

【図3(c)】Ｒｖ２２９９ｃを処理した樹状細胞のサイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１β）の産生がＴＲＩＦとＭｙＤ８８に依存的であることを示すグラフである。

【図3(d)】樹状細胞とＲｖ２２９９ｃが相互作用を示すための共焦点顕微鏡写真（３Ｄ）、ＦＡＣＳ解析グラフ（３Ｅ）、ＴＬＲ２でないＲＬＲ４との結合を示す写真である。

【図3(e)】樹状細胞とＲｖ２２９９ｃが相互作用を示すための共焦点顕微鏡写真（３Ｄ）、ＦＡＣＳ解析グラフ（３Ｅ）、ＴＬＲ２でないＲＬＲ４との結合を示す写真である。

【図3(f)】樹状細胞とＲｖ２２９９ｃが相互作用を示すための共焦点顕微鏡写真（３Ｄ）、ＦＡＣＳ解析グラフ（３Ｅ）、ＴＬＲ２でないＲＬＲ４との結合を示す写真である。

【図4(a)】Ｒｖ２２９９ｃがＰ３８及びＥＲＫ １／２のリン酸化とＤＣにおけるＩκＢ−αのリン酸化と低下を示す写真である。

【図4(b)】ｐ６５の細胞質から核への重要な位置変更を誘導することを示唆する写真である。

【図4(c)】ＪＮＫ阻害剤を除くすべての薬理学的阻害剤によってＤＣ表面上において同時刺激分子のＲｖ２２９９ｃ誘導発現（４Ｃ）及び前炎症性サイトカインの産生が大幅に廃止されることを示すグラフである。

【図4(d)】ＪＮＫ阻害剤を除くすべての薬理学的阻害剤によってＤＣ表面上において同時刺激分子のＲｖ２２９９ｃ誘導発現（４Ｃ）及び前炎症性サイトカインの産生が大幅に廃止されることを示すグラフである。

【図5(a)】ＤＣとＴ細胞との間の相互作用に対するＲｖ２２９９ｃ活性の特徴を正確に説明するために行われたＭＬＲ解析グラフである。５ＡはＲｖ２２９９ｃが処理されたＤＣは、Ｔ細胞の増殖を誘導することを示し、５ＢはナイーブT細胞の増殖をＴｈ１表現型として誘導することを示唆する。

【図5(b)】ＤＣとＴ細胞との間の相互作用に対するＲｖ２２９９ｃ活性の特徴を正確に説明するために行われたＭＬＲ解析グラフである。５ＡはＲｖ２２９９ｃが処理されたＤＣは、Ｔ細胞の増殖を誘導することを示し、５ＢはナイーブT細胞の増殖をＴｈ１表現型として誘導することを示唆する。

【図6(a)】Ｒｖ２２９９ｃ−刺激ＤＣがＣＤ４＋を刺激することができるか否か、調べるためにフローサイトメトリーを用いて得られたグラフである。

【図6(b)】Ｒｖ２２９９ｃ−刺激ＤＣがＣＤ４＋を刺激することができるか否か、調べるためにフローサイトメトリーを用いて得られたグラフである。

【図7】Ｒｖ２２９９ｃがＤＣ成熟によりＭｔｂ成長を抑制し、殺菌活性を有するＴ細胞の活性を誘導することを示唆するグラフである。

【図8(a)】組換えＲｖ２２９９ｃとＥＳＡＴ−６融合蛋白質の細胞毒性を示す写真である。

【図8(b)】組換えＲｖ２２９９ｃとＥＳＡＴ−６融合蛋白質がＭＨＣ分子の発現とＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、及びＩＬ−１２などの前炎症性サイトカイン発現を示すグラフである。

【図8(c)】組換えＲｖ２２９９ｃとＥＳＡＴ−６融合蛋白質がＭＨＣ分子の発現とＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、及びＩＬ−１２などの前炎症性サイトカイン発現を示すグラフである。

【図9(a)】ＥＳＴＡ−６−刺激ＤＣで活性化されたＴ細胞の添加によってＭｔｂ成長が大幅に抑制されることを示すグラフである。

【図9(b)】ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αなどの前炎症性サイトカインの高産生は、Ｍｔｂ−感染ＢＭＤＭが融合蛋白質−刺激ＤＣによって活性化されたＴ細胞と共培養されたとき現れることを示すグラフである。

【図10(a)】Ｒｖ２２９９ｃとＥＳＡＴ−６を融合した蛋白質の高病毒性ＨＮ８７８株のＢＣＧプライムブースト効果を示すための模式図である。

【図10(b)】ＢＣＧ単独、ＥＳＡＴ−６及びＲｖ２２９９ｃ＋ＥＳＡＴ融合蛋白質共々、肺内の細菌負荷を減少させたことを示すグラフである。

【図10(c)】Ｒｖ２２９９ｃ＋ＥＳＡＴ−６融合蛋白質が長期間の間、細菌を減少させるという観点から、ＨＮ８７８株試験に対して予防効果を示すグラフである。

【図10(d)】Ｒｖ２２９９ｃ＋ＥＳＡＴ−６融合蛋白質が長期間の間、細菌を減少させるという観点から、ＨＮ８７８株試験に対して予防効果を示すグラフである。

【図11(a)】Ｒｖ２２９９ｃ＋ＥＳＡＴ−６融合蛋白質−予防接種によって誘導されたＴ細胞表現型への変化をサイトカイン染色によって評価したグラフとＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−２ボールの発現などを示すグラフである。

【図11(b)】Ｒｖ２２９９ｃ＋ＥＳＡＴ−６融合蛋白質−予防接種によって誘導されたＴ細胞表現型への変化をサイトカイン染色によって評価したグラフとＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−２ボールの発現などを示すグラフである。

【図12(a)】Ｒｖ２２９９ｃ＋ＥＳＡＴ−６融合蛋白質−予防接種によって誘導されたＴ細胞表現型への変化をサイトカイン染色によって評価したグラフとＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−２ボールの発現などを示すグラフである。

【図12(b)】Ｒｖ２２９９ｃ＋ＥＳＡＴ−６融合蛋白質−予防接種によって誘導されたＴ細胞表現型への変化をサイトカイン染色によって評価したグラフとＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−２ボールの発現などを示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0024】

今日まで、免疫細胞に関する免疫反応において結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）から由来した蛋白質に関する多くの研究が行われてきたが、Ｒｖ２２９９ｃに関する研究は知られていない。

【0025】

未成熟な樹状細胞を成熟させて成熟樹状細胞を形成する。成熟樹状細胞は、抗原を捕獲し、同時刺激細胞表面分子及び各種サイトカインの上向き−調節された発現を示す能力を喪失する。特に成熟化された樹状細胞は、ＭＨＣＩ型及びＩＩ型の抗原を未熟な樹状細胞よりも高いレベルで発現させ、ＣＤ（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）８０＋、ＣＤ８３＋、ＣＤ８６＋及びＣＤ１４−を調節する。より多くのＭＨＣ発現により樹状細胞の抗原密度の増加を誘導するのに対し、同時−刺激の分子ＣＤ８０及びＣＤ８６の上向き調節で、Ｔ細胞上にＣＤ２８のような同時−刺激分子当量を通じてＴ細胞活性信号を強化する。

【0026】

本発明の成熟樹状細胞は、組み換え方法で調製されたＲｖ２２９９ｃまたはＲｖ２２９９ｃとＥＳＴＡ−６を融合した蛋白質を接触させることによって調製することができる。本発明は、Ｒｖ２２９９ｃまたはＲｖ２２９９ｃとＥＳＴＡ−６を融合した蛋白質を含む組成物を介して樹状細胞の成熟を誘導化させることができる。有効な組み合わせ方法で調製されたＲｖ２２９９ｃまたはＲｖ２２９９ｃとＥＳＴＡ−６を融合した蛋白質は、これらに限定されるものではないが、Ｒｖ２２９９ｃの量１μｇ／ｍｌないし２０μｇ／ｍｌ、好ましくは５μｇ／ｍｌのないし１０μｇ／ｍｌの濃度で組成物に含まれることができる。

【0027】

樹状細胞の成熟は、当該技術分野に公知された方法で監視することができる。細胞表面マーカーをフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）及び免疫組織化学法などのような当該技術分野でよく知られている黒色で検出することができる。上記細胞らもまたサイトカインの産生（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、及び他の免疫試験）を介して監視することができる。

【0028】

以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。ただし、下記の実施例は、本発明をさらに容易に理解できるように例示するものであって、本発明の内容が実施例により限定されるものではない。

【0029】

＜実施例１＞
材料及び方法
１．１ 菌株とマイコバクテリウム属の調製
Ｍｔｂ Ｈ３７Ｒｖ（ＡＴＣＣ ２７２９４）及びＨ３７Ｒａ（ＡＴＣＣ ２５１７７）は、米国の細胞バンク（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入し、Ｍｔｂ ＨＭ８７８は財団法人国際結核研究所（ＩＴＲＣ、Ｃｈａｎｇｗｏｎ、Ｇｙｅｏｎｇｓａｎｇｎａｍ−ｄｏ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）から得た。ウシ型結核菌のＢＣＧ（パスツール菌株１１７３Ｐ２）は、パスツール研究所（Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）のブローチ博士により提供を受けた。この研究に使用されているすべてのマイコバクテリアは、以前に説明したように、調製された（Ｃｈａ ｅｔ ａｌ．，２０１５ｂ）。

【0030】

１．２ 動物、予防接種及びエアロゾルの感染
ＯＴ−Ｉ及びＯＴ−ＩＩ Ｔ−細胞受容体（ＴＣＲ）形質転換マウス（Ｃ５７ＢＬ／６背景）、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２Ｋ^ｂとＩＡ^ｂ）、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ＴＬＲ２ノックアウトマウス（ＴＬＲ２^−／−；Ｂ６．１２９−Ｔｌｒ２^{ｔｍ１Ｋｉｒ}／Ｊ）及びＣ５７ＢＬ／１０ ＴＬＲ４ノックアウトマウス（ＴＬＲ４^−／−；Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＮＪ）のみならず、５週〜６週齢の特定病原体不在の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ジャクソン研究所（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ ）から購入した。マウスは、延世大学医療研究センターのＢＬ−３の生物災害動物施設であるバリア条件下で一定の温度（２４±１°Ｃ）と湿度（５０±５％）に維持される。動物には、標準化された照明制御条件（１２時間ずつの明暗サイクル）の下で、水に任意に接近させ、滅菌した市販のマウスの餌を与えた。マウスは毎日監視し、この実験の間、どのマウスからも、臨床学的症状や病気が示されなかった。

【0031】

予防接種のために、マウスは、まず皮下注射（２．０×１０^５ ＣＦＵ ／マウス）を用いてＢＣＧパスツール１１７３Ｐ２で予防接種し、後−ＢＣＧ免疫予防接種６週間後に、モノホスホリル脂質−Ａ（ＭＰＬ、５μｇ ／注射）を含むジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）リポソーム（５０μｇ／注射）と一緒にサブユニットワクチンを３週周期で３回投与した。最終免疫予防接種をしてから４週間後、脾臓と肺の細胞を収穫し、これを用いて、免疫原性（ＩＦＮ−γの分泌物のレベルとＩＦＮ−γ−産生Ｔ細胞とＡｇ−特異的Ｔ細胞の周期に）を調べた。サブユニットワクチン単独の予防効果を研究するため、ＢＣＧ免疫法単独及びＢＣＧプライミング−サブユニットワクチンブーストグループは、前述したようにＭｔｂ Ｈ３７Ｒｖ（ＡＴＣＣ２７２９４）またはＭｔｂ ＨＮ８７８株とガスが発生するように試験にかけられた（Ｃｈａ ｅｔ ａｌ．，２０１５ｂ 、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００９）。要約すると、マウスを約２００ ＣＦＵの生存可能なＭｔｂに曝露するために空気感染装置（Ｇｌａｓ−Ｃｏｌ、Ｔｅｒｒｅ Ｈａｕｔｅ、ＩＮ、ＵＳＡ）の吸入チャンバーに６０分間、所定のＨ３７ＲｖまたはＨＮ８７８投与量で曝露させた。後−試験を８週間または１６週間の時点で、各グループで脾臓と肺の細胞を収穫し、フローサイトメトリー解析を用いて、多機能性Ｔ細胞とＴ細胞亜型の周期を評価した。

【0032】

１．３ 抗体及び試薬
組換えマウスマクロファージ増殖刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球−マウスマクロファージ増殖刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、及びインターロイキン−４（ＩＬ−４）は、ＪＷクレアジェン（Ｇｙｅｏｎｇｇｉ、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）から購入した。フルオレセインイソチオシアン酸塩（ＦＩＴＣ）−アネキシンＶ／プロピジウムヨウ化物のキットは、研究開発システム（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）から購入した。デキストラン−ＦＩＴＣ（分子量、４０，０００ Ｄａ）は、シグマ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から得た。大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４からの脂質多糖類は、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎから購入した（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）。エドキシンフィルタ（ＥＮＤ−Ｘ）とエドキシン除去樹脂（ＥＮＤ−Ｘ Ｂ１５）は、米国ＡＣＣ社（（Ｅａｓｔ Ｆａｌｍｏｕｔｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）から得た。ＯＴ−Ｉペプチド（ＯＶＡ ２５７−２６４）とＯＴ−ＩＩペプチド（ＯＶＡ_{３２３−３３９}）は、ＰＥＰＴＲＯＮ社（Ｄａｅｊｅｏｎ、Ｋｏｒｅａ）によって合成された。抗−リン酸化されたＥＲＫ１／２モノクローナル抗体、抗−ＥＲＫ１／２モノクローナル抗体、抗−リン酸化されたｐ３８モノクローナル抗体、抗−ｐ３８モノクローナル抗体、抗−ＮＦ−κＢ（ｐ６５）ポリクローナル抗体、抗−リン酸化されたＩκＢ−αポリクローナル抗体、抗−ＩκＢ−αモノクローナル抗体、抗−ラミンＢポリクローナル抗体及び抗−β−アクチンポリクローナル抗体は、米国のＣＳＴ社（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）から得た。ＨＲＰ−結合抗−マウスＩｇＧ抗体とＨＲＰ−ｒｈｄｄｏｒ抗−ラビット抗体は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）から得て、抗−β−アクチンｍＡｂ（ＡＣ−１５）は、シグマから購入した。ＣＤ１１ｃ、ｐ６５、ＩＦＮ−ｇ及びＣＤ６２Ｌ標的ＦＩＴＣ−共役ｍＡｂ、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１０及びＣＤ３標的ＡＰＣ−共役ｍＡｂ、ＣＤ４及びＣＤ８標的ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５−共役ｍＡｂ、ＣＤ８＋標的ＡＰＣ−Ｃｙ７−共役ｍＡｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ、ＩＦＮ−γ及びＣＤ４４標的フィコエリトリン（ＰＥ）−共役ｍＡｂ、ＣＤ１１ｃ及びＩＬ−２標的ＰＥ−Ｃｙ７−共役ｍＡｂ、そしてＣＤ３ｅ標的ｅＦｌｕｏｒ ４５０−共役ｍＡｂは、ｅ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。フィコエリトリン（ＰＥ）−共役マウス抗−ＩｇＧ１、マウス抗−ＩｇＧ２ａ及びマウス抗−ＩｇＧ２ｂ、ＡＰＣ−共役マウス抗−ＩｇＧ２ａ及びマウス抗−ＩｇＧ１、ＦＩＴＣ−共役マウス抗−ａｎｔｉ−ＩｇＧ２ｂ、そしてＰＥ−Ｃｙ７−共役マウス抗−ＩｇＧ１及びマウス抗−ＩｇＧ２ｂはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから得た。これらの抗体は、イソ型対照群として使用された。ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０及びＩＬ−１２ｐ７０ ＥＬＩＳＡキットは、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから得た。

【0033】

１．４組換え蛋白質の発現及び精製
組換えＲｖ２２９９ｃ蛋白質を産生するために、Ｍ．結核Ｈ３７Ｒｖ ＡＴＣＣ２７２９４ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用し、次のプライマーを用いて、対応する遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅させた：Ｒｖ２２９９ｃ正方向、５’−ＣＡＴＡＴＧＡＡＣＧＣＣＣＡＴＧＴＣＧＡＧＣＡＧＴＴＧ−３’、及び逆方向、５’−ＧＡＡＴＴＣＧＧＣＡＡＧＧＴＡＣＧＣＧＣＧＡＧＡＣＧＴＴＣ−３’ＥＳＡＴ−６正方向、５’−ＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＣＡＧＡＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＡＴ−３’、及び逆方向、５’−ＣＴＣＧＡＧＴＧＣＧＡＡＣＡＴＣＣＣＡＧＴＧＡＣＧＴＴ−３’。Ｒｖ２２９９ｃのＰＣＲ産物は、ＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで切断され、ＥＳＡＴ−６は、ＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩで切断された。この産物は、ｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）に挿入され、その結果物は序列化された。組換えプラスミドは、４２°Ｃで１分間の熱衝撃によってＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１細胞に変形された。過発現された蛋白質は、先に述べたように僅かな改変によって調整された（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，２００６）。簡略に、Ｅ．ｃｏｌｉ含有組換えプラスミドを、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）が０．４〜０．５になるまで３７°Ｃで培養した後、１ｍＭのイソプロピル−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ；ＥＬＰＩＳ−Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｄａｅｊｅｏｎ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）で誘導した。以後、細菌細胞を遠心分離で収穫し、２０ｍＭのトリス−塩化水素（ｐＨ ８．０）、０．５ Ｍの塩化ナトリウム、５ｍＭのイミダゾール及び１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（シグマ）に懸濁させ、音波処理で溶解させた。組換え蛋白質は、調製業者の指示（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ、ＵＳＡ）によりニッケル−ニトリルトリ酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）アガロースクロマトグラフィー解析で精製された。各精製段階を抗−Ｈｉｓ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いてクマシ-ブリリアントブルー菌株と免疫ブロットで１３．５％のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により解析した。精製された蛋白質を集め濃縮させ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ ７．４）に対して透析した。エドキシン汚染を除去するために、透析された組換え蛋白質を、４°Ｃで６時間、ポリミ
キシンＢ−アガロース（ＰｍＢ、Ｓｉｇｍａ）と培養させた。最後に、精製されたエドキシンのない組換え蛋白質を濾過滅菌し、−７０°Ｃで凍結した。蛋白質濃度は、ウシ血清アルブミンを標準として使用し、ＢＣＡ蛋白質解析キット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）で測定した。組換え蛋白質の残余ＬＰＳは、生物学的エドキシン（ＬＡＬ）試験（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、調製業者の指示に従って決定した。組換え蛋白質の純度は、抗−ヒスチジン抗体を用いてクマシ-ブリリアントブルー（ＣＢ）染色及びウェスタンブロッドで評価した。

【0034】

１．５細胞培養
最近、説明したようにミューリン骨髄由来のＤＣを作製し、培養し、精製した（Ｂｙｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２ｂ）。骨髄由来のマクロファージ（ＢＭＤＭｓ）は、先に述べたように組換えＭ−ＣＳＦを用いて調製された。簡略に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから分離された骨髄細胞は、緩衝液（塩化アンモニウム４．１５ｇ／５００ｍｌ、０．０１ Ｍトリス−塩化水素緩衝液（ｐＨ７．５±２）を溶解する赤血球（ＲＢＣ）で溶解され、ＲＰＭＩ １６４０培地で洗浄された。６−ウェル培養プレート（１０^６細胞／ｍｌ、３ｍｌ／ウェル）にプレートされ、５％の二酸化炭素存在下で３７°Ｃから１００ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ）、１０％ウシ胎児血清（Ｌｏｎｚａ）、５０ｍＭメルカプトエタノール（Ｌｏｎｚａ）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（Ｌｏｎｚａ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、２０ｎｇ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳＦ及び１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−４（ＢＭＤＣ）または２０ｎｇ／ｍｌ Ｍ−ＣＳＦ（ＢＭＤＭ）で補充されたＲＰＭＩ １６４０培地を用いて培養された。

【0035】

１．６ 細胞毒性解析
細胞毒性解析は、調製業者の指示に従って（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）アネキシンＶ／プロピジウムヨウ化物（ＰＩ）染色キットを用いて評価した。細胞は、アネキシンＶとＰＩとしてＦＩＴＣ−共役で染色された。染色された細胞の解析は、ＦＡＣＳＤｉｖａと共にＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩを用いて行われ、その結果は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて解析された（ＴｒｅｅＳｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ、ＵＳＡ）。

【0036】

１．７ フローサイトメトリーによる表面分子発現の解析
６日目に、ＢＭＤＣを収穫し、ＰＢＳで洗浄し、蛍光活性化細胞ソーター洗浄緩衝液（２％ＦＢＳ及びＰＢＳ中の０．１％アジ化ナトリウム）で再懸濁した。細胞をＰＢＳで３０分間、０．５％ＢＳＡで事前培養し、ＰＢＳで洗浄した。細胞をＦＩＴＣ−結合抗−ＣＤ１１ｃと共にＰＥ−結合抗−Ｈ−２Ｋｂ（ＭＨＣクラスＩ）、抗−Ｉ−抗体（ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ）、抗−ＣＤ８０及び抗−ＣＤ８６で４°Ｃで４５分間染色した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、５００μｌのＰＢＳで再懸濁した。蛍光発光をフローサイトメトリーで測定し、データはＣｅｌｌＱｕｅｓｔデータ解析ソフトウェアを用いて解析した。

【0037】

１．８ Ｒｖ２２９９ｃによるＢＭＤＣの抗原摂取能力
ＢＭＤＣ（２×１０^５細胞）は、３７°Ｃまたは４°Ｃで４５分間平衡を維持し、フルオレセイン−共役デキストランで１ｍｇ／ｍｌの濃度でパルスされた。冷たい染色緩衝液を添加して反応を停止させた。細胞を３回洗浄し、ＰＥ−結合抗−ＣＤ１１ｃ抗体で染色した後、ＦＡＣＳＣａｎｔｏで解析した。ＤＣに対するデキストランの非特異的な結合は、ＤＣをＦＩＴＣ−共役デキストランと共に４°Ｃで培養することにより決定され、その結果、得られた背景値を特定の結合値から差し引いた。

【0038】

１．９ Ｒｖ２２９９ｃのＬＰＳ−汚染除去の確認
Ｒｖ２２９９ｃによって誘導されるＤＣの成熟が蛋白質調製におけるエドキシン汚染又はＬＰＳに起因するものでないことを確認するために、ポリミキシンＢ（ＰｍＢ）と前処理（Ｓｉｇｍａ）、熱変性、プロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ）の分解の解析を行った。ＤＣは１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ及び１０uｇ／ｍｌ Ｒｖ２２９９ｃで処理する前に、室温で１時間５０μｇ／ｍｌ ＰｍＢで事前−培養された。熱変性のために、ＬＰＳまたはＲｖ２２９９ｃは１００°Ｃで１時間培養された。プロテイナーゼＫの分解のために、ＬＰＳまたはＲｖ２２９９ｃは１０μｇ／ｍｌの濃度で可溶性プロテイナーゼＫで３７°Ｃで１時間分解され、酵素を非活性化させるために、１００°Ｃで１５分間熱処理した後、ＢＭＤＣ培養液に添加された。２４時間後、ＢＭＤＣ上清液におけるＴＮＦ−α及びＩＬ−６レベルを、ＥＬＩＳＡを用いて解析した。

【0039】

１．１０ 共焦点走査レーザー顕微鏡
ＤＣは、ポリ−Ｌ−リジンコーティングされたガラスカバースリップに一晩中、プレーティングされた。Ｒｖ２２９９ｃで処理した後、細胞を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、０．１％トリトンＸ−１００を透過するようにした後、２時間室温でＰＢＳ／Ｔ含有抗−Ｒｖ２２９９ｃ抗体中に２％ＢＳＡで培養する前に、２時間０．１％ツイン−２０（ＰＢＳ／Ｔ）を含有するＰＢＳから２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングされた。ＰＢＳ／Ｔで洗浄した後、細胞を暗室で１時間Ｃｙ−３共役二次抗体に培養し、次いで室温で１０分間１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩで染色した。細胞の形状及び蛍光感度は共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０ Ｍｅｔａ；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｌｔｄ、Ｗｅｌｗｙｎ Ｇａｒｄｅｎ Ｃｉｔｙ、ＵＫ）。画像はＬＳＭ５１０メタソフトウェアを使用して得、ＬＳＭ画像のテスターを用いて処理した。

【0040】

１．１１ 免疫沈降反応
ＤＣ（１×１０^７）を、１０ｍｇ／ｍｌのＲｖ２２９９ｃで６時間培養し、細胞ペレットを溶解緩衝液（１０ｍＭのトリス−塩化水素（ｐＨ７．４）、１％のＮＰ−４０、０．２５％のジオキシコリン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化水素、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ、それぞれ１μｇ／ｍｌのアプロチニン、ロイペプチン、及びペプスタチン、１ｍＭのＮａ_３ＶＯ_４、１ｍＭのＮａＦ）で溶解した。非特異的な結合を防ぐために、５０μｌの正常血清（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）及び１００μｌの５０％の蛋白質ＡまたはＧセファロースビーズスラリー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を１ｍｇの細胞溶解物に添加して、細胞溶解物の安定性を事前確認した。４°Ｃで２時間培養した後、ビーズと細胞溶解物の混合物を、４°Ｃで５分間、１０，０００×ｇで遠心分離し、上清液は次の実験のために収集した。Ｒｖ２２９９ｃ（Ｈｉｓ）、ＴＬＲ２及びＴＬＲ４−関連蛋白質は、１時間４°Ｃで抗−ＴＬＲ２及びＴＬＲ４に対する対照群の抗体として抗−マウスＩｇＧと培養し、抗−Ｒｖ２２９９ｃ（Ｈｉｓ）に対する対照群の抗体として抗−マウスＩｇＧと培養した後、２４時間４°Ｃで蛋白質ＡまたはＧセファロースとの培養で免疫沈降された。ビーズを収穫し、洗浄し、５分間５Ｘサンプル緩衝液で沸かした。蛋白質は、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥから分離され、塩化ビニリデンジフルオライド膜へ移した（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。膜は明示したとおり、抗−ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、Ｈｉｓ抗体として追加で調査された。

【0041】

１．１２ 免疫ブロッティング解析
１０μｇ／ｍｌのＲｖ２２９９ｃで刺激した後、ＤＣを５０ｍＭのトリス−塩化水素（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ塩化水素、１％トリトンＸ−１００、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＦ、３０ｍＭ Ｎａ_４ＰＯ_７、１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリド、１μｇ／ｍｌアプロチニン及び１ｍＭとバナジン酸塩を含む１００μｌの溶解緩衝液で溶解させた。全細胞溶解物のサンプルは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分解され、ニトロセルロース膜に移された。膜は５％スキムミルクでブロックされ、２時間抗体と一緒に培養され、以後、室温で１時間ＨＲＰ−共役二次抗体で培養された。抗体に特異的に認識されるＭＡＰＫ及びＮＦ−κＢを含む標的蛋白質上のエピトープは、ＥＣＬアドバンスキットを用いて視覚化された（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）。

【0042】

１．１３ 核抽出液の調製
細胞から得られた核抽出液は、次のように調製された。ＤＣを氷の上で１０分間１００ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、１ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ）、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ）で処理した。５分間４，０００ｒｐｍで遠心分離した後、ペレットを１００μｌの抽出緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、４０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦ）に再懸濁し、氷の上で３０分間培養した。１０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離した後、核抽出液を含む上清液を収集し、必要になるまで−８０°Ｃで保存した。

【0043】

１．１４ 信号伝達経路解析のための薬理学的阻害剤におけるＤＣ処理
すべての薬理学的阻害剤は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍのを購入した。ジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ）は、０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）で溶媒対照群として培養に追加された。ＤＣをＰＢＳで洗浄し、２４時間Ｒｖ２２９９ｃで処理する前に１時間、グルタミン含有ＲＰＭＩ １６４０培地で阻害剤で事前処理した。阻害剤は次の濃度で使用された：Ｕ０１２６（１０μＭ）、ＳＢ２０３５８０（２０μＭ）、ＳＰ６００１２５（１０μＭ）及びＢａｙ１１−７０８２（２０μＭ）。阻害剤を用いたすべての実験において、試験濃度はＭＴＴ解析を用いてＤＣの生存力を評価する、細心の適正実験後に使用された。

【0044】

１．１５ 生体外Υ細胞増殖反応の測定法
ナイーブT細胞反応に関与する反応性Ｔ細胞は、ＢＡＬＢ／ｃマウスから調製した全単核細胞からＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて単離した。ＯＶＡ−特異的ＣＤ８^＋及びＣＤ４^＋反応性Ｔ細胞いずれもＯＴ−１とＯＴ−２マウスそれぞれの脾臓細胞から得た。これらのＴ細胞は、先に説明したように、１μＭのＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した（Ｊｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９）。１０μｇ／ｍｌのＲｖ２２９９ｃ存在下、２４時間、ＯＶＡペプチドで処理されたＤＣ（ウェル当たり２×１０^５細胞）は、ＣＦＳＥ−染色されたＣＤ８^＋及びＣＤ４^＋Ｔ細胞（２×１０^６）で、ＤＣとＴ細胞率１：１０で共培養された。共培養３日または４日目に、それぞれのＴ細胞をＰｅｒＣＰ−ｃｙ５．５−結合抗−ＣＤ４^＋ｍＡｂ、ＰＥ−ｃｙ５−結合抗−ＣＤ４^＋ｍＡｂ、ＰＥ−ｃｙ５−結合抗−ＣＤ８^＋ｍＡｂ、Ａｌｅｘａ６４７−結合抗−ＣＣＲ３ｍＡｂまたはＰＥ−結合抗−ＣＸＣＲ３ｍＡｂで染色し、フローサイトメトリーで解析した。上清液を収穫し、ＥＬＩＳＡを用いて、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２及びＩＬ−４の産生を測定した。

【0045】

１．１６ 効果／記憶Υ細胞活性化の解析
前述したように、同種Ｔ細胞反応に関与する反応性Ｔ細胞は、結核菌−感染ＢＡＬＢ／ｃマウスから調製された全単核細胞からＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて隔離された。ＡＰＣ−結合抗−ＣＤ３ｍＡｂ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）への染色は、産生が主にＣＤ３^＋細胞（＞９５％）からなることを明らかにした。大規模の洗浄後、野生型（ＷＴ）、ＴＬＲ２^-/-及びＬＲ４^-/-Ｃ５７ＢＬ／６マウスから調製したＤＣ（ウェル当たり２×１０^５細胞）は、２４時間Ｒｖ２２９９ｃで処理され、ＤＣのＴ細胞率が１：１０になるように２×１０^６の同種反応性Ｔ細胞（結核菌−感染Ｔ細胞）で共培養された。共培養４日目に、細胞をＰｅｒＣＰ−ｃｙ５．５−結合抗−ＣＤ４^＋ｍＡｂ、ＰｅｒＣＰ−ｃｙ５．５−結合抗−ＣＤ８^＋ｍＡｂ、ＦＩＴＣ−結合抗−ＣＤ６２ＬｍＡｂ及びＰＥ−結合抗−ＣＤ４４ｍＡｂで染色し、フローサイトメトリーで解析した。

【0046】

１．１７ サイトカイン測定
サンドイッチ酵素結合免疫吸着検査（ＥＬＩＳＡ）は、先に説明したように培養上清液のＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｐ７０及びＩＬ−１０を検出するために使用された（Ｂｙｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２ｂ）。予防接種した、または感染したマウスの肺から調製された単細胞はＰＰＤ（２μｇ／ｍｌ）を、または抗原−特異的ＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞ペプチド（２μｇ／ｍｌ）を３７°Ｃで２４時間刺激した。培養上清液におけるＩＦＮ−γサイトカインレベルは、調製業者のプロトコルに従って、市販のＥＬＩＳＡキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて測定した。

【0047】

１．１８ 細胞内のサイトカイン解析
細胞は、４°Ｃで１５分間、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）正常ヤギ血清でまずブロックし、４°Ｃで３０分間ＦＩＴＣ−共役ＣＤ１１ｃ^＋抗体で染色した。適切なイソタイプ−マッチされた免疫グロブリン（Ｉｇ）で染色した細胞を陰性対照群として使用した。細胞を、調製業者の指示に従って使用されたサイトフィックス／サイトパームキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で固定して透過されるようにした。細胞内ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＦＮ−γは、フルオレセイン−結合抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で透過緩衝液で検出された。純粋な蛋白質誘導体（ＰＰＤ）は、ＡｅｒａｓのＢｒｅｎｎａｎ博士によって提供された（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）。細胞内サイトカイン染色のために、予防接種された動物（２×１０^６細胞）から得られた単一細胞懸濁液は、ＰＰＤ（２μｇ／ｍｌ）を、抗原−特異的ＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞ペプチド（２μｇ／ｍｌ）でＧｏｌｇｉＳｔｏｐ存在下で３７°Ｃで１２時間刺激された（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。ＨＮ８７８チャレンジ後、細胞内サイトカイン染色のための刺激剤としてＰＰＤを単独で使用した。細胞は、４°Ｃで１５分間Ｆｃブロック（抗−ＣＤ１６／３２）に優先ブロッキングされ、４°Ｃで３０分間ＢＶ４２１−結合抗−ＣＤ３、ＰｅｒＣｐ−Ｃｙ５．５−結合抗−ＣＤ４、ＡＰＣ−Ｃｙ７−結合抗−ＣＤ８及びＦＩＴＣ−結合抗−ＣＤ６２Ｌ抗体で染色された。細胞を、調製業者の指示に従って使用されたサイトフィックス／サイトパームキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で固定して透過されるようにした。細胞内ＴＮＦ−α、ＩＬ−２及びＩＦＮ−γは、透過緩衝液においてＡＰＣ−結合抗−ＴＮＦ−α、ＰＥ−Ｃｙ７−結合抗−ＩＬ−２及びＰＥ−結合抗−ＩＦＮ−γ抗体を用いて検出された。すべての抗体は、特に指定されない限りｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で購入した。細胞はＦＡＣＳｖｅｒｓｅフローサイトメトリーで、市販で購入可能なソフトウェアプログラムＦｌｏｗＪｏを用いて解析された（Ｔｒｅｅｓｔａｒ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ）。

【0048】

１．１９ 細菌数及び組織病理学的解析
最終の予防接種後、そしてＨＮ８７８チャレンジ１６週間後、１グループ当たり６〜７匹のマウスを二酸化炭素で安楽死させ、その肺と脾臓を均質化した。生菌数は、臓器（左肺及び脾臓の半分）ホモジネートの連続希釈によりミドルブルック７Ｈ１１寒天（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）にプレーティングすることにより決定され、これは１０％ＯＡＤＣ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、アムホテリシンＢ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、及び２μｇ／ｍｌの２−チオフェンカルボン酸ヒドラジド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で補充された。群体は３７°Ｃで４週間培養した後、計数した。組織病理学的解析のために、右肺の上葉はヘマトキシリン及びエオシンで染色され、炎症の重症度について評価した。前述のように（Ｃｈａ ｅｔ ａｌ．，２０１５ａ）、肺における炎症レベルは、ＩｍａｇｅＪ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＬ）ソフトウェアプログラムを用いて評価した。さらに、炎症反応は、病変の大きさ及び免疫細胞の構成に基づいて評価した。ＣＦＵに対するデータ及び肺の炎症は、メディアンｌｏｇ_１０ＣＦＵ±四分位範囲（ＩＱＲ）で報告された。

【0049】

１．２０ 統計分析
すべての実験は少なくとも３回繰り返して行い、一貫した結果を得た。サンプル間の比較に対する重要度レベルは、統計的ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０３； ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて、トルコの多重比較試験分散で決定された。グラフ内のデータは、平均±ＳＥＭで示した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１または^＊＊＊ｐ＜０．００１のそれぞれの値は、統計的に有意なものとみなされた。

【0050】

＜実施例２＞
組換えＲｖ２２９９ｃ蛋白質は、樹状細胞（ＤＣ）の成熟及び活性化を誘導する。
２．１ 実験方法
（Ａ）（ａ）Ｒｖ２２９９ｃは、６時間１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の補充によりＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１で正常に誘導された。蛋白質は、封入体で主に局在化された。Ｎ−末端Ｈｉｓ−タグＲｖ２２９９ｃの分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる７２ｋＤａに近かった（Ｍ：分子量マーカー；レーン１：非誘導：レーン２、誘導）。組換えＲｖ２２９９ｃは、ＢＬ２１細胞で産生され、ＮＴＡ樹脂で精製された。精製された蛋白質は、１：１０００のマウス抗−Ｈｉｓ抗体を用いて、（ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥと（ｃ）ウェスタンブロット解析に用いられた。（Ｂ）ＢＭＤＣは１、５または１０μｇ／ｍｌのＲｖ２２９９ｃで３０分間処理され、以後２４時間ＬＰＳの存在と不在下で培養された。細胞は、３７℃で３０分間、そして４℃で３０分間デキストラン（ＦＩＴＣ）で培養され、デキストラン（ＦＩＴＣ）摂取のＦＡＣ解析で評価された。デキストラン（ＦＩＴＣ）−陽性ＣＤ１１ｃ（ＰＥ）−陽性細胞率が示されている。結果は、４つの実験結果を代表する。バーグラフは、３つの独立した実験のデキストラン−ＦＩＴＣ−陽性ＣＤ１１ｃ^＋細胞率の平均±ＳＥＭを示し、統計的有意性（^＊＊＊ｐ＜０．００１）は、対照群と比較して処理に関して示す。（Ｃ）ＢＭＤＣは１、５または１０μｇ／ｍｌ Ｒｖ２２９９ｃの存在下で２４時間培養しており、２色フローサイトメトリーによって解析した。細胞は、ＣＤ１１ｃ細胞を排除するために、ゲートされた。培地：未処理対照群；ＬＰＳ：陽性対照群（１００ｎｇ／ｍｌＬＰＳ）のＤＣは、抗−ＣＤ８０、抗−ＣＤ８６、抗−ＭＨＣクラスＩまたは抗−ＭＨＣクラスＩＩで染色された。結果は、３つの実験結果を代表する。平均蛍光強度は、上記のグラフから算出した。それぞれのバーは、サンプルの平均蛍光レベルを示す。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝５）で表示される。未処理対照群と比較して^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１と^＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｄ）ＢＭＤＣは１、５または１０μｇ／ｍｌ Ｒｖ２２９９ｃと１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳで２４時間刺激した。ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２ｐ７０及びＩＬ−１０の産生についての解析は、ＥＬＩＳＡで測定した。結果は行われた３つの実験を代表する一つの実験から得られたものである。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝５）で表示される。
未処理対照群と比較して^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１及び^＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｅ）細胞内サイトカイン染色によってＣＤ１１ｃ＋ＤＣ内のＩＬ−１２ｐ７０及びＩＬ−１０の発現解析。

【0051】

２．２ 実験結果の解析
マイコバクテリアＨＳＰファミリーのうち、Ｒｖ２２９９ｃ蛋白質の免疫学的役割についての情報はほとんどない。本発明者らは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１内組換えＲｖ２２９９ｃ蛋白質を精製して、それの免疫反応を調べた。Ｒｖ２２９９ｃの純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット解析（図１ａ）で評価した。調製されたＲｖ２２９９ｃエンドトキシン含有量は、ＬＡＬ解析で１５ｐｇ／ｍｌの（＜０．１ＵＥ／ｍｌ）を未満であった。ＤＣとマクロファージは、マイコバクテリアの予防免疫反応の開始及び活性化に重要な役割を果たす。したがって、本発明者らは、マクロファージ活性化またはＤＣ成熟に対するＲｖ２２９９ｃの効果を調べた。Ｒｖ２２９９ｃはさらなるマクロファージ活性化を誘導しなかった。ＤＣ成熟のマーカーとしての食作用活性は、デキストラン−ＦＩＴＣを曝露させることによって決定した。二重陽性細胞（ＣＤ１１ｃ^＋及びデキストラン−ＦＩＴＣ−陽性）は、陽性対照群として使用されるＲｖ２２９９ｃまたはＬＰＳで処理されたＤＣで減少し、これは蛋白質による食作用活性の減少と機能成熟の強化を示す（図１ｂ）。さらに、２４時間Ｒｖ２２９９ｃ処理したＤＣは、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ分子とＣＤ８０及びＣＤ８６のような同時刺激分子の発現を用量依存的に大幅に向上させた（図１ｃ）。このような結果は、Ｒｖ２２９９ｃがＤＣ成熟を効果的に誘導することを示唆する。

【0052】

次に、本発明者らはＲｖ２２９９ｃ−媒介性ＤＣ成熟が前炎症性または抗炎症サイトカインの分泌と結合されたかを解析した。図１ｄに示すように、Ｒｖ２２９９ｃは、高レベルのＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１βを分泌するために、ＤＣを大きく刺激したのに対し、未処理のＤＣは無視できる程度のサイトカインを分泌した。以後、本発明者らは、Ｔ細胞−媒介性免疫反応の発達に重要な効果を有するＩＬ−１２ｐ７０及びＩＬ−１０の産生を決定した。ＬＰＳとは異なり、Ｒｖ２２９９ｃはＩＬ−１０ではないＩＬ−１２ｐ７０の分泌を大きく誘導した（図１ｄ）。ＦＡＣＳ解析において、ＩＬ−１０陽性細胞において、どのような変化も見られなかったのに対し、未処理ＤＣに対して得られた結果と比較してＲｖ２２９９ｃ処理されたＤＣからＩＬ−１２ｐ７０−陽性細胞率が増加したことを示している（図１ｅ）。内毒素含有量が組換え蛋白質を調製するすべての時間を決定したが、本発明者らは、ＤＣ成熟を誘発するＲｖ２２９９ｃ能力がＬＰＳ汚染によらないことをプロテイナーゼＫまたは熱変性処理を介して確認した（図２）。また、ポリミキシンＢの処理がＲｖ２２９９ｃ活性に影響を与えていないのに対し、ＬＰＳ活性は、ポリミキシンＢに大きく抑制された。このような点から見たとき、これらの結果は、Ｒｖ２２９９ｃがＤＣから前炎症性サイトカイン分泌を誘導し、このようなＲｖ２２９９ｃ−成熟ＤＣがＴｈ１型免疫反応を促進することができることを示唆している。

【0053】

＜実施例３＞
Ｒｖ２２９９ｃはＴＬＲ４経路を介して樹状細胞（ＤＣ）の成熟を誘導する。
３．１実験方法
（Ａ）バーグラフは、ＷＴ、ＴＬＲ２／及びＴＬＲ４／マウスに由来するＲｖ２２９９ｃ−処理ＣＤ１１ｃ＋−ゲートされたＤＣにおけるＣＤ８６またはＭＨＣＩＩ発現を示す。ＷＴ、ＴＬＲ２／及びＴＬＲ４／マウスに由来するＤＣは、２４時間Ｒｖ２２９９ｃ（１０μｇ／ｍｌ）で処理された。陽性細胞率は、各パネルに表示される。バーグラフは、３つの独立した実験からＣＤ１１ｃ＋細胞の各表面分子に対する比率の平均±ＳＥＭを示す。

【0054】

統計的有意性（^＊＊＊ｐ＜０．００１）は、Ｒｖ２２９９ｃ−処理されたＴＬＲ２／対Ｒｖ２２９９ｃ−処理されたＷＴ ＤＣで表示される。すべてのデータは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）として表示され、統計的有意性（^＊＊＊ｐ＜０．００１）は、Ｒｖ２２９９ｃ−処理されたＷＴ ＤＣと比較して処理のために表示される。（Ｂ）ＷＴ、ＴＬＲ２／及びＴＬＲ４／マウスから由来したＤＣは、２４時間Ｒｖ２２９９ｃまたはＬＰＳで処理される。ＷＴ、ＴＬＲ２／及びＴＬＲ４／マウスから由来したＲｖ２２９９ｃ−またはＬＰＳ−処理されたＤＣにおけるＴＮＦ−α、ＩＬ−６、またはＩＬ−１βの産生は、ＥＬＩＳＡで測定した。すべてのデータは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）で表示され、統計的有意性（^＊＊＊ｐ＜０．００１）は、Ｒｖ２２９９ｃ−処理されたＷＴ ＤＣと比較して処理のために表示される。（Ｃ）ＷＴ、ＭｙＤ８８／及びＴＲＩＦ／マウスから由来するＤＣは、２４時間Ｒｖ２２９９ｃ（１０μｇ／ｍｌ）、及びＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で処理された。ＷＴ、ＭｙＤ８８／及びＴＲＩＦ／マウス由来のＲｖ２２９９ｃ−またはＬＰＳ−処理されたＤＣにおけるＴＮＦ−α、ＩＬ−６、またはＩＬ−１βの産生は、ＥＬＩＳＡによって測定した。すべてのデータは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）で表示され、統計的有意性（^＊＊＊ｐ＜０．００１）は、Ｒｖ２２９９ｃ−処理されたＷＴ ＤＣと比較して処理のために表示される。（Ｄ）Ｒｖ２２９９ｃ−処理されたＤＣと結合された抗−Ｒｖ２２９９ｃの蛍光強度。ＷＴ、ＴＬＲ２／及びＴＬＲ４／マウス由来のＤＣは、１時間Ｒｖ２２９９ｃ（１０μｇ／ｍｌ）で処理され、固定され、ＤＡＰＩ及びＣｙ３−結合抗−Ｈｉｓ抗体（スケールバー：１０μｍ）で染色された。（Ｅ）ＷＴ、ＴＬＲ２／及びＴＬＲ４／マウス由来のＢＭＤＣは、１時間Ｒｖ２２９９ｃ（１０μｇ／ｍｌ）で処理され、Ａｌｅｘａ４８８−結合抗−Ｈｉｓ ｍＡｂで染色された。陽性細胞率は、各パネルに表示される。バーグラフは、３つの独立した実験から得られたＣＤ１１ｃ＋細胞内のＲｖ２２９９ｃ−Ａｌｅｘａ４８８の比率の平均±ＳＥＭを示す。統計的有意性（^＊＊＊ｐ＜０．００１）は、Ｒｖ２２９９ｃ−処理されたＷＴ ＤＣと比較してＲｖ２２９９ｃ−処理されたＴＬＲ４／のために表示される。（Ｆ）抗−Ｈｉｓ、抗−ＴＬＲ２または抗−ＴＬＲ４抗体で
免疫沈降反応（ＩＰ）及び抗−Ｈｉｓ、抗−ＴＬＲ２または抗−ＴＬＲ４抗体で免疫ブロッティング法。ＤＣは６時間Ｒｖ２２９９ｃ（１０μｇ／ｍｌ）で処理された。細胞は収穫し、細胞溶解物は、抗−マウスＩｇＧ、抗−マウスＩｇＧ、抗−Ｈｉｓ、抗−ＴＬＲ２または抗−ＴＬＲ４で免疫沈降された：その後、蛋白質は抗−Ｈｉｓ、抗−ＴＬＲ２または抗−ＴＬＲ４抗体で免疫ブロッティングして視覚化された。総計は、平均総細胞溶解物を指す。

【0055】

３．２実験結果に対する分析
トル様受容体（ＴＬＲｓ）経路を介してＤＣを活性化させるいくつかのＭｔｂ構成要素が確認された（Ｈａｒｄｉｎｇ ａｎｄ Ｂｏｏｍ、２０１０）。したがって、本発明者らは、ＤＣ中のＴＬＲによってＲｖ２２９９ｃが認められ得るのか、そしてこれにより、活動ができるのか、調ベた。表面分子（図３ａ）及び前炎症性サイトカイン（図３ｂ）の発現は、野生型（ＷＴ）またはＴＬＲ２^−／−マウスから得られたＤＣと比較して、ＴＬＲ４^−／−マウスから得られたＤＣにおいて大きく抑制された。これはＲｖ２２９９ｃがＴＬＲ４に対する作用剤となり得ることを意味する。ＭｙＤ８８は、すべてのＴＬＲの共通したアダプタ分子であるのに対し、ＴＲＩＦはＭｙＤ８８−独立とした信号伝達経路のＴＬＲ４−媒介活性化に不可欠である（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ＷＴ、ＭｙＤ８８^−／−及びＴＲＩＦ−欠乏マウスから得られたＤＣにおける前炎症性サイトカイン産生の決定は、ＭｙＤ８８−及びＴＲＩＦ−依存性経路がＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１βのＲｖ２２９９ｃ−誘導産生に関与していることを示唆する（図３ｃ）。次に、本発明者らはＲｖ２２９９ｃがＤＣにおいてＴＬＲ４分子と相互作用するか否かを調べた。Ｃｙ３−結合抗−Ｒｖ２２９９ｃ多クローン性抗体を有する共焦点顕微鏡は、Ｒｖ２２９９ｃがＴＬＲ４^−／−ＤＣでないＷＴ及びＴＬＲ２^−／−から得られたＤＣの表面に優先的に結合することを示す（図３ｄ）。また、Ｒｖ２２９９ｃとＴＬＲ４分子間の結合は、ＦＡＣＳ解析によって確認された（図３ｅ）。Ｒｖ２２９９ｃとＴＬＲ４との間の相互作用を確認するために、本発明者らは、抗−ＴＬＲ２または抗−ＴＬＲ４抗体及びＡｎｔｉ−Ｈｉｓ抗体について免疫沈降解析を行った。

【0056】

本発明者らは、Ｒｖ２２９９ｃがＴＬＲ２でないＴＬＲ４と結合することを発見した（図３ｆ）。これらの結果は、Ｒｖ２２９９ｃがＴＬＲ４−依存的な方法でＤＣ成熟を誘導することにより、細胞表面分子と前炎症性サイトカインの発現の増加を起こしていることを説明する。

【0057】

＜実施例４＞
ＭＡＰＫ及びＮＦ−κＢ経路はＲｖ２２９９ｃ−媒介樹状細胞（ＤＣ）成熟と関連している。
４．１ 実験方法。
（Ａ）ＤＣは１０μｇ／ｍｌ Ｒｖ２２９９ｃ蛋白質で処理され、蛋白質の発現は、経時的に示される。細胞溶解物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに置かれ、免疫ブロット解析は、ホスホｐ３８（ｐ−ｐ３８）、ｐ３８、ホスホＥＲＫ１／２（ｐ−ＥＲＫ１／２）、ホスホＩκＢ−ａ、ＩκＢ−ａ及びｐ６５ ＮＦ−κＢに特異的なそれぞれの抗体を用いて行われた。（Ｂ）ＤＣにおいてＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットの細胞局在化のＲｖ２２９９ｃの効果。ＤＣは覆われたガラスチャンバースライドにプレーティングされ、１時間Ｒｖ２２９９ｃで処理された。刺激後、細胞内ＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットの免疫反応性は、「材料及び方法」にて説明したように、免疫蛍光法によって決定された。（ＣＤ）ＤＣは１０μｇ／ｍｌ Ｒｖ２２９９ｃ蛋白質で２４時間処理される前、１時間ｐ３８（ＳＢ２０３５８０、２０μＭ）、ＥＲＫ１／２（Ｕ０１２６、１０μＭ）、ＪＮＫ（ＳＰ６００１２５、２０μＭ）、Ｂａｙ１１−７０８２（２０μＭ）またはＤＭＳＯ（車両制御）の薬理学的阻害剤で処理された。ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現は、フローサイトメトリーによって解析された。バーグラフはＣＤ１１ｃ＋細胞のそれぞれの表面分子に対する比率（３つの別々の実験に対する平均±ＳＥＭ）を示す。培養培地でＴＮＦ−ａ、ＩＬ−６及びＩＬ−１βの量はＥＬＩＳＡで測定した。平均±ＳＥＭは、３つの独立した実験を示し、統計的有意性（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１または^＊＊＊ｐ＜０．００１）は、Ｒｖ２２９９ｃ−処理された対照群と比較して処理のために表示される。

【0058】

４．２ 実験結果に対する分析。
ＭＡＰＫ及びＮＦ−κＢは、ＤＣ成熟と前炎症性サイトカインの分泌を調節するための重要な信号伝達分子である（Ｂａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１０ｂ、Ｐａｔｈａｋ ｅｔ ａｌ．，２００７）。したがって、本発明者らはＲｖ２２９９ｃに対する応答としてＭＡＰＫとＮＦ−κＢの活性化を調べた。予想通り、Ｒｖ２２９９ｃはｐ３８及びＥＲＫ １／２のリン酸化とＤＣにおいてＩκＢ−αのリン酸化と低下を誘発し（図４ａ）、ｐ６５のシートゾルから核への重要な位置変更を誘導した（図４ｂ）。Ｒｖ２２９９ｃ−誘導前炎症性サイトカインの産生及び同時刺激分子の発現におけるＭＡＰＫ及びＮＦ−κＢの役割を確認するために、Ｒｖ２２９９ｃに曝露する前に、１時間ＤＣをｐ３８阻害剤（ＳＢ２０３５８０）、ＥＲＫ１／２阻害剤（Ｕ０１２６）、ＪＮＫ阻害剤（ＳＰ６００１２５）、またはＮＦ−κＢ阻害剤（Ｂａｙ １１−０７８２）で前処理する。ＪＮＫ阻害剤を除くすべての薬理学的阻害剤は、ＤＣ表面上において同時刺激分子のＲｖ２２９９ｃ−誘導発現（図４ｃ）及び前炎症性サイトカインの産生（図４ｄ）を大きく廃止した。これらの研究結果から、本発明者らはＭＡＰＫ及びＮＦ−κＢ信号伝達経路が前炎症性サイトカインの産生及びＲｖ２２９９ｃによって誘導されたＤＣ成熟マーカー発現に不可欠であることを知ることができる。

【0059】

＜実施例５＞
Ｒｖ２２９９ｃ−成熟樹状細胞（ＤＣ）がナイーブT細胞の増殖を誘導する。
５．１ 実験方法
（Ａ）形質転換ＯＶＡ−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞及び形質転換ＯＶＡ−特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を分離し、ＣＦＳＥで染色し、Ｒｖ２２９９ｃ（１０μｇ／ｍｌ）またはＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で処理されたＤＣで９６時間、共培養し、ＯＶＡ−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞についてはＯＶＡ２５７２６４（１μｇ／ｍｌ）に、またはＯＶＡ−特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞にはＯＶＡ３２３３３９（１μｇ／ｍｌ）に、それぞれパルスされた。Ｔ細胞単独及び未処理ＤＣにおける共培養されたＴ細胞が対照群としての役割をした。ＯＴ−Ｉ＋及びＯＴ−ＩＩ＋Ｔ細胞の増殖は、フローサイトメトリーによって評価された。（Ｂ）２４時間後、収穫された培養上清液とＩＦＮ−γ、ＩＬ−２とＩＬ−４は、ＥＬＩＳＡによって測定された。平均±ＳＥＭは、３つの独立した実験について示しており、統計的有意性（^＊ｐ＜０．０５）は、適切な対照群（Ｔ細胞／ＯＶＡ２５７２６４パルスされたＤＣまたはＴ細胞／ＯＶＡ３２３３３９パルスされたＤＣｓ）と比較して、処理のために表示される。顕著な効果がない処理はｎｓと表示される。

【0060】

５．２ 実験結果に対する解析
ＤＣとＴ細胞間の相互作用についてのＲｖ２２９９ｃ活性の特徴を正確に説明するために、本発明者らはＯＴ−ＩＴ細胞受容体（ＴＣＲ）形質転換ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＯＴ−ＩＩＴＣＲ形質転換ＣＤ４＋Ｔ細胞を用いて同系のＭＬＲ解析を行った。ＯＶＡ_{２５７−２６４}またはＯＶＡ_{３２３−３３９}とパルスされたＤＣは、７２時間形質転換ＣＦＳＥ−標識ＯＶＡ−特異ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養した。Ｒｖ２２９９ｃ−またはＬＰＳ−処理されたＤＣは、未処理ＤＣに比べて著しく大きいほどの Ｔ細胞の増殖を誘導した（図５ａ）。また、Ｒｖ２２９９ｃ−処理されたＤＣとパルスされた処女ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、未処理ＤＣよりもはるかに高いＩＦＮ−γ及びＩＬ−２レベルで産生されたのに対し（ｐ＜０．０５−０．０１）、ＩＬ−４分泌は、Ｒｖ２２９９ｃ刺激とは無関係に増加しなかった（図５ｂ）。これらの結果は、Ｒｖ２２９９ｃ−処理されたＤＣがナイーブT細胞の増殖をＴｈ１表現型に誘導することを示唆する。

【0061】

＜実施例６＞
Ｒｖ２２９９ｃ−成熟樹状細胞（ＤＣ）が効果／記憶Ｔ細胞集団の拡大を誘導した。
６．１実験方法
（Ａ）結核菌−感染ＢＡＬＢ／ｃマウスから用意されたＴ細胞。ＤＣを２４時間１０μｇ／ｍｌ Ｒｖ２２９９ｃ蛋白質で培養した。Ｒｖ２２９９ｃ−成熟したＤＣを洗浄し、同種Ｔ細胞とＤＣ対Ｔ細胞率１：１０で３日間共培養した。脾臓細胞が抗−ＣＤ４、抗−ＣＤ８ｍＡｂ、抗−ＣＤ６２Ｌ及び抗−ＣＤ４４ｍＡｂで染色された。 棒グラフは 、脾臓からのＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗＣＤ４４^ｈｉｇｈＴ細胞を示す。バーグラフは、３つの独立した実験においてＣＤ４＋／ＣＤ８＋ＣＤ４４^ｈｉｇｈ及びＣＤ４＋／ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗＴ細胞率（平均±ＳＥＭ）を示す。（Ｂ）ＣＤ３＋／ＣＤ４＋及びＣＤ３＋／ＣＤ８＋細胞におけるＩＦＮ−γ、ＩＬ−２またはＩＬ−４発現は、細胞内ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２またはＩＬ−４染色によってＲｖ２２９９ｃ−パルスされたＤＣまたはＬＰＳ−パルスされたＤＣで共培養された腸内のリンパ節のＴ細胞で解析された。Ｔ細胞の二重−陽性細胞率は、右上隅に示し、結果は３つの独立した実験を表す。統計的有意性（^＊＊ｐ＜０．０１または^＊＊＊ｐ＜０．００１）は、未処理ＤＣと比較して比較のために示し、顕著な効果がないのはｎｓと示す。

【0062】

６．２ 実験結果に対する解析
Ｒｖ２２９９ｃ−刺激ＤＣが特にＭｔｂに感染したマウスから得られたＣＤ４＋を刺激することができる能力に反映されているかどうかを評価するために、本発明者らは、フローサイトメトリーを用いてＲｖ２２９９ｃ−処理されたＤ Ｃにより誘導されたＣＤ４＋脾臓Ｔ細胞におけるＣＤ６２ＬとＣＤ４４の発現の変化を解析した。ＤＣはＷＴ、ＴＬＲ２^−／−またはＴＬＲ４^−／−マウスの骨髄から調製され、Ｒｖ２２９９ｃまたはＬＰＳで成熟された。感染したマウスから得られたＲｖ２２９９ｃ−成熟ＤＣ及び同系ＣＤ４＋Ｔ細胞の両方を７２時間共培養した後、ＴＬＲ４^−／−マウスではないＷＴまたはＴＬＲ２^−／−マウスから得られたＲｖ２２９９ｃ−成熟ＤＣが対照ＤＣまたはＬＰＳ−処理されたＤＣに比べてＣＤ４＋Ｔ細胞中で大きく下向き調節されたＣＤ６２Ｌ及び上向き調節されたＣＤ４４発現を示す（図６ａ）。ＣＤ４−ＩＦＮ−γまたはＣＤ４−ＩＬ−２陽性細胞率は、対照ＤＣまたはＬＰＳ−処理されたＤＣに比べて、ＴＬＲ４^−／−マウスではないＷＴまたはＴＬＲ２^−／−マウスから得られたＲｖ２２９９ｃ−成熟ＤＣと共培養したときにはるかに高かった（図６ｂ）。加えて、ＣＤ４−ＩＬ−４陽性細胞は、抗原刺激されたＤＣと共培養によって増加されなかった。これらのデータは、Ｒｖ２２９９ｃ−成熟ＤＣが効果／記憶Ｔ細胞の拡大を誘導し、ＴＬＲ４−依存的方法でＴｈ１免疫反応を駆動することを示唆する。

【0063】

＜実施例７＞
Ｒｖ２２９９ｃ−成熟樹状細胞（ＤＣ）によって活性化されたΥ細胞は、細胞内のＭｔｂ成長を抑制する。
７．１ 実験方法
ＢＭＤＭは４時間Ｈ３７Ｒｖ（ＭＯＩ＝１）で感染した。その後、感染したＢＭＤＭは、２時間アミカシン（２００μｇ／ｍｌ）で処理され、ＰＢＳを用いて２回洗浄した。その後、前に調製された混合物を、それぞれのシェルに追加させてプレートを３日間培養した。混合物は、ＤＣ対Ｔ細胞率１：１０で３日間ＣＤ４＋Ｔ細胞で共培養された抗原活性化されたＤＣであった。抗原を活性化したＤＣは、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びＲｖ２２９９ｃ（１０μｇ／ｍｌ）をした。（Ａ）感染されたマクロファージでＭｔｂの数。（Ｂ）上清液は、ＥＬＩＳＡを用いて解析された。表示されるデータは、平均値±ＳＤ（ｎ＝３）であり；^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１または^＊＊＊ｐ＜０．００１＝処理済み細胞対未処理細胞に対する有意性。顕著な効果がない処理はｎｓと示す。

【0064】

７．２ 実験結果に対する解析
Ｒｖ２２９９ｃ−成熟ＤＣが実際にＭｔｂを制御する役割をしていることを確認するために、本発明者らはＲｖ２２９９ｃ−成熟ＤＣによって活性化されたＴ細胞がマクロファージにおける殺菌作用を向上させることができるかを調べた。感染していないマウスから得られた処女脾臓Ｔ細胞は、７２時間Ｒｖ２２９９ｃ−成熟ＤＣと共培養することにより活性化され、以後、Ｍｔｂ−感染されたＢＭＤＭに添加された。図７に示すように、非活性化Ｔ細胞の単純付加が細胞内のＭｔｂ成長を相当部分抑制した。興味深いことに、Ｒｖ２２２９ｃ−刺激ＤＣによって活性化されたＴ細胞は、非活性化Ｔ細胞またはＬＰＳ−刺激ＤＣによって活性化されたＴ細胞に比べてＭｔｂ成長が大きく抑制された。抗−結核活性と関連する前炎症性サイトカイン、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１７は、非活性化Ｔ細胞またはＬＰＳ−刺激ＤＣによって活性化されたＴ細胞に比べてＲｖ２２９９ｃ−刺激ＤＣによって活性化されたＴ細胞を添加したとき顕著に調製された。これはＭｔｂ成長抑制が、これらのサイトカインの産生と関連していることを示している（図７）。この結果は、Ｒｖ２２９９ｃ、ＤＣ成熟を介して殺菌活性を有するＴ細胞の活性化を誘導することを示唆する。

【0065】

＜実施例８＞
Ｒｖ２２９９ｃとＥＳＡＴ−６融合蛋白質は、ＥＳＡＴ−６免疫反応を強化する。
８．１ 融合蛋白質は、樹状細胞（ＤＣ）成熟を誘導することを確認するための実験方法
（Ａ）ＢＭＤＣは１、２、５、１０または２０μｇ／ｍｌＥＳＡＴ−６または融合蛋白質の存在下で２４時間培養され、フローサイトメトリーで解析した。スタウロスポリンは陽性対照群であった。ＤＣは抗−ＣＤ１１ｃ、アネキシンＶ及びＰＩで染色された。各四分画領域における陽性細胞（アネキシンＶ−及びＰＩ−染色された細胞）の比率が示されている。結果は、３つの実験を代表する。（Ｂ）ＢＭＤＣは１、５または１０μｇ／ｍｌの融合蛋白質、２μｇ／ｍｌ ＥＳＡＴ−６または１０μｇ／ｍｌ Ｒｖ２２９９ｃの存在下で２４時間培養しており、２色のフローサイトメトリーで解析した。細胞は、ＣＤ１１ｃ細胞を排除するために、ゲートされた。ＤＣは抗−ＣＤ４０、抗−ＣＤ８０、抗−ＣＤ８６または抗−ＭＨＣクラスＩＩで染色された。結果は、３つの実験の結果を代表する。平均蛍光強度は、上記のグラフから算出した。それぞれのバーは、サンプルの平均蛍光レベルを示す。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝５）で示される。未処理対照群、ＥＳＡＴ−６またはＲｖ２２９９ｃと比較して^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１と^＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｃ）上清液は、ＥＬＩＳＡで測定した。結果は行われた３つの実験のうちの一つの代表実験による。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝５）で示される。未処理対照群、ＥＳＡＴ−６またはＲｖ２２９９ｃと比較して^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１と^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【0066】

８．２ 融合蛋白質によるマクロファージ内のＭｔｂ成長を抑制することを確認する実験方法。
ＢＭＤＭは、４時間Ｈ３７Ｒｖ（ＭＯＩ＝１）で感染した。その後、感染したＢＭＤＭは、２時間アミカシン（２００μｇ／ｍｌ）で処理され、ＰＢＳを用いて２回洗浄した。その後、以前に調製された混合物を、それぞれのウェルに追加させてプレートを３日間培養した。混合物は、ＤＣ対Ｔ細胞率１：１０で３日間ＣＤ４＋Ｔ細胞で共培養された抗原活性化されたＤＣであった。抗原を活性化するＤＣは、ＥＳＡＴ−６（２μｇ／ｍｌ）、Ｒｖ２２９９ｃ、及び融合蛋白質（１０μｇ／ｍｌの）であった。（Ａ）感染されたマクロファージにおけるＭｔｂの数。（Ｂ）上清液は、ＥＬＩＳＡを用いて解析された。表示されるデータは、平均値±ＳＤ（ｎ＝３）であり；^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１または^＊＊＊ｐ＜０．００１＝処理済み細胞対未処理細胞に対する有意性。顕著な効果がない処理はｎｓと示す。

【0067】

８．３ 実験結果に対する分析
本発明者らは、ＤＣ−活性化蛋白質がＴ細胞−刺激抗原の予防免疫を向上させることができると仮定した。これを検証するため、主要なＴ細胞ワクチン候補であるＥＳＡＴ−６がＥ．ｃｏｌｉ中のＲｖ２２９９ｃに融合された蛋白質で発現させて精製させ、これの免疫原性を調べた。まず、本発明者らはアネキシンＶとプロピオンロジウムヨウ化（ＰＩ）染色によってＢＭＤＭにおける組換えＲｖ２２９９ｃ−融合ＥＳＡＴ−６の細胞毒性を決定した。ＥＳＡＴ−６は５μｇ／ｍｌより高い値で、細胞毒性を示したが、融合蛋白質は、１０μｇ／ｍｌで毒性を示さなかった（図８ａ）。したがって、その後の実験でＥＳＡＴ−６を２μｇ／ｍｌ濃度で使用した。同時刺激及びＭＨＣ分子の発現とＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、及びＩＬ−１２などの前炎症性サイトカインの産生は、単一蛋白質に比べて融合蛋白質で刺激されたＤＣで大幅に増加した（図８Ｂ）。次に、本発明者らは融合蛋白質熟成ＤＣによって刺激されるＴ細胞の殺菌活性を決定した。図９Ａに示すように、Ｔ細胞もＤＣもないＢＭＤＭに比べＥＳＡＴ−６刺激ＤＣに活性化されたＴ細胞の添加により細胞内のＭｔｂ成長が大きく抑制されたが、Ｒｖ２２９９ｃ−刺激ＤＣまたは融合蛋白質−刺激ＤＣによって活性化されたＴ細胞は、他の条件に比べて細胞内のＭｔｂ成長を大きく抑制させた。ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αなどの前炎症性サイトカインの高産生は、Ｍｔｂ−感染ＢＭＤＭが融合蛋白質−刺激ＤＣによって活性化されたＴ細胞と共培養されたときに現れた（図９ｂ）。

【0068】

＜実施例９＞
Ｒｖ２２９９ｃ、ＥＳＡＴ−６融合蛋白質は、高病毒性 Ｍｔｂ ＨＮ８７８株の有意なＢＣＧプライムブースト効果を誘導する。
９．１ 実験方法
（Ａ）免疫接種スケジュールと実験のデザイン、（Ｂ）Ｍｔｂ ＨＮ８７８へチャレンジ後１６週間の時点で、ＢＣＧ単独、蛋白質単独、ＢＣＧ／Ｒｖ２２９９ｃ＋ＥＳＡＴ−６融合蛋白質及びサプリメント対照群（ＭＰＬ−ＤＤＡのみ）で予防接種したマウスの肺腸から細菌増殖程度の差が示される。（Ｃ）Ｍｔｂ ＨＮ８７８（ｎ＝６動物／グループ）とのチャレンジ後１６週の時点で予防接種したそれぞれのマウスから得た肺の部分は、Ｈ＆Ｅで染色した。（Ｄ）肺組織切片における炎症組織部位の百分率。Ｇ１：感染対照、Ｇ２：ＭＰＬ／ＤＤＡ接種対照、Ｇ３：ＢＣＧ単独、Ｇ４：ＢＣＧ／Ｒｖ２２９９ｃ＋ＥＳＡＴ−６／ＭＰＬ−ＤＤＡ融合蛋白接種、Ｇ５：ＥＳＡＴ−６／ＭＰＬ−ＤＤＡ接種群。ＭＰＬ−ＤＤＡ−単独グループと比較して^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１及び^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【0069】

９．２ 実験結果に対する解析
最後に、本発明者らはＲｖ２２９９ｃ＋ＥＳＡＴ−６融合蛋白がＴＢに対するワクチンの可能性があるか、評価した。本発明者らは、まず、Ｒｖ２２９９ｃ蛋白質単独のワクチン効果をＭｔｂエドマン（Ｅｒｄｍａｎ）菌株を活用して、マウスモデルで評価した。しかし、肺と脾臓における細菌の負担の減少という観点からＲｖ２２９９ｃ／ＭＰＬ−ＤＤＡ接種は、エドマン菌株に対して意味のある防御効果を示さなかった。

【0070】

次に、本発明者らは高病原性結核菌株であるＭｔｂ ＨＮ８７８チャレンジモデルにおいて、Ｒｖ２２９９ｃ＋ＥＳＡＴ−６融合蛋白がＢＣＧ−プライムブースターとして可能性があるか、評価した。以前の研究では、マウスのＢＣＧ単独予防接種後−感染１０週間後にＭｔｂ Ｈ３７ＲｖよりＷ−Ｂｅｉｊｉｎｇ分離菌株についてあまり予防することがないことが分かった（Ｌｏｐｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００３）。したがって、前述したように、Ｗ−Ｂｅｉｊｉｎｇファミリーの一つである臨床高病毒性ＨＮ８７８菌株を用いて、マウスモデルで蛋白質のワクチン効能を検証した（Ｃｈａ ｅｔ ａｌ．，２０１５ｂ）。最終のワクチン接種後４週間後、本発明者らは、マウスをＭｔｂ ＨＮ８７８株でチャレンジし、１６週間の時点で肺内の細菌負荷を決定した（図１０ａ）。図１０ｂに示すように、サプリメント対照群と比較してＢＣＧ単独で使用され、ＥＳＡＴ−６及びＲｖ２２９９ｃ＋ＥＳＡＴ−６融合蛋白質共々、肺内の細菌負荷を大幅に減少させた。ＢＣＧ単独と融合蛋白質は、同様の予防効果を示し、ＥＳＡＴ−６予防接種が肺からより高い細菌負荷を示した。しかし、この３つのワクチンは、大きな違いを示さなかった。本発明者らはまた、ＢＣＧワクチンをブーストするために融合蛋白質の能力を調べた。感染後１６週間後、融合蛋白質−ブーストマウスがＢＣＧ−ワクチンマウスに比べてかなり低い細菌数を示した。本発明者らはまた、予防接種後の肺の炎症を評価した。チャレンジ後１６週間の時点で、Ｒｖ２２９９ｃ＋ＥＳＡＴ−６融合蛋白質−予防接種グループは、ＢＣＧ対照群に比べて顕著に減少された肺の炎症を示した（ｐ＜０．０１）。全体として、Ｒｖ２２９９ｃ＋ＥＳＡＴ−６融合蛋白質が長期間の細菌が減少するという観点から、ＨＮ８７８菌株チャレンジに対して予防効果を示した。加えて、チャレンジ１６週間の時点で、Ｒｖ２２９９ｃ＋ＥＳＡＴ−６融合蛋白質−予防接種グループは、感染対照群に比べて顕著に減少された肺の炎症を示した（ｐ＜０．０１）（図１０ｃ及び１０ｄ）。

【0071】

＜実施例１０＞
Ｍｔｂ ＨＮ８７８に感染したマウスから抗原特異的Ｔｈ１免疫反応の免疫原性
１０．１ 免疫性を有するマウスの肺における抗原−特異的多機能性Ｔ細胞の誘導を確認するための実験方法。
マウスの各グループは、材料及び方法で説明したように、予防接種されて犠牲にさせた。最終の予防接種４週間後、マウス（ｎ＝６）の各グループは、安楽死させ、その肺の細胞は、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ存在下３７°Ｃで１２時間、表示された抗原で刺激された。予防接種されたマウスの肺から分離された細胞内のＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及び／またはＩＬ−２を産生する抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞率は、多色のフローサイトメトリーでＣＤ４＋リンパ球についてゲーティングし解析された。パイチャートは、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及び／またはＩＬ−２を共発現する細胞の平均回数を示す。データは、各グループで５匹のマウスから得た平均±ＳＤで示し、独立標本ｔ試験は、有意性を決定するために使用された。ＭＰＬ−ＤＤＡ−単独グループと比較して^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１及び^＊＊＊ｐ＜０．００１（独立標本ｔ試験）。

【0072】

１０．２ 結核菌ＨＮ８７８株でチャレンジした後、脾臓における多機能性Ｔ細胞の維持を確認するための実験方法。
感染１６週間後、各グループ（ｎ＝６）のマウスは安楽死させ、その脾臓細胞（２．０×１０^６細胞）は、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ存在下で３７°Ｃで１２時間、それぞれの抗原（５μｇ／ｍｌ）で刺激された。マウスの各グループの肺から分離された細胞内のＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及び／またはＩＬ−２を産生する抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞率は、多色のフローサイトメトリーでＣＤ４＋リンパ球に対してゲーティングしながら解析された。パイチャートは、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及び／またはＩＬ−２を共発現する細胞の平均回数を示す。データは、各グループで５匹のマウスから得た平均±ＳＤで示し、独立標本ｔ試験は、有意性を決定するために使用された。ＭＰＬ−ＤＤＡ−単独グループと比較して^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１と^＊＊＊ｐ＜０．００１（独立標本ｔ試験）。

【0073】

１０．３ 上記の実験結果に対する解析
Ｔｈ１媒介免疫反応及び多機能性Ｔ細胞は、Ｍｔｂの予防免疫に重要な役割を果たす。したがって、次に本発明者らは、Ｒｖ２２９９ｃ＋ＥＳＡＴ−６融合蛋白質−予防接種によって誘導されたＴ細胞表現型の変化を評価した。チャレンジ後１６週に肺（図１１ａ、ｂ）と脾臓細胞（図１２、ａ、ｂ）を分離して、各免疫抗原で刺激して反応するＣＤ４＋Ｔ細胞の表現型を多色の細胞内サイトカイン染色によって評価された。他のグループに比べてＲｖ２２９９ｃ＋ＥＳＡＴ−６融合蛋白質−予防接種グループのみ肺におけるトリプル陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−２のボール発現）が増加され、維持された（図１１、ａ、ｂ及び１２ ａ、ｂ）。加えて、Ｒｖ２２９９ｃ＋ＥＳＡＴ−６融合蛋白質−予防接種グループが肺におけるチャレンジ後に増加された頻度の二重陽性多機能性ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＴＮＦ−α＋ＩＬ−２＋ＣＤ４＋Ｔ細胞）を示す（図１１ａ、ｂ、及び１２ａ、ｂ）。

【0074】

＜実施例１１＞
考察
サブユニット蛋白質ワクチンは、ＢＣＧの代替またはＢＣＧ−誘導免疫反応をブーストすることに潜在的に有用であることが判明した（Ｄａｌｍｉａ ａｎｄ Ｒａｍｓａｙ、２０１２）。本発明者らは、ＴＢワクチン候補の予防効果を改善するため、新しいワクチン開発戦略を提案した。最適な抗原が多蛋白質ワクチンを含むように選択されることは、ワクチン開発において最も重要なステップである。ＤＣはナイーブT細胞の偏光及びリンパ節排水において、Ｔｈ１またはＴｈ２類型の次の開発を調節する。したがって、ＤＣ−活性化蛋白質−基盤のワクチンは、作製された、他の抗原の予防免疫を向上させることができる。本研究では、本発明者らは、ＤＣを活性化することができるＲｖ２２９９ｃ蛋白質がＴＢワクチン開発のための価値ある目標であることを発見した。これはＲｖ２２９９ｃ＋ＥＳＡＴ−６融合蛋白質が非常に高病毒性Ｍｔｂ ＨＮ８７８臨床菌株とチャレンジ後の肺の細菌の負荷を大幅に減少させることを示す。

【0075】

Ｔ−細胞基盤の免疫を誘導するために設計されたＴＢワクチン開発の基本原理は、結核菌抗原に特異的に対抗する強いＴｈ１反応が抗−結核免疫の基本的なメカニズムであることを前提とする。Ｔｈ１反応を引き出せなかった抗原は、Ｍｔｂに対するワクチン効能がなかったが、丈夫なＴｈ１反応を誘導する蛋白の全部がかなりの予防効果を示すわけではない（Ｏｒｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。Ａｇ８５Ａに対抗して丈夫なＴｈ１反応を誘導するＭＶＡ８５Ａワクチンはヒトから明確なＢＣＧブースト効果が示されることができなかった（Ｔａｍｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。これはワクチンが記憶Ｔ細胞反応を誘導して、長期的な免疫反応を誘導させることが重要である。ＤＣは、Ｔ細胞の効果的な活性化及び記憶Ｔ細胞反応の誘導に重要な役割を果たす。Ｍｔｂ−感染ＤＣ（Ｔａｓｃｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）、または抗原抽出液で処理されたＤＣ（Ｒｕｂａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００７）に接種されたマウスがＭｔｂ感染から保護されることが分かった。これらの結果は、生体内のＤＣを標的とすることができる抗−結核ワクチン戦略開発を支持する（Ｓｉｎｈａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。本研究では、ＤＣ−活性化蛋白質が可能なワクチン候補といわれる仮説を検証するために、信頼できるＤＣ−活性化蛋白質を選択することが重要な研究課題であった。まず、本発明者らはマイコバクテリアＨＳＰは、マクロファージまたはＤＣなどの免疫細胞ＤＣｓ（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００１、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２、Ｆｒａｎｃｏ ｅｔ ａｌ．，２００８）及びサプリメントの活動（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，１９９８）を活性化させる能力と関連しているので、マイコバクテリアＨＳＰを選択した。本研究では、本発明者らはマイコバクテリアＨＳＰのうち、Ｒｖ２２９９ｃ（ＨＳＰ９０）がＴＬＲ４シグナル伝達とＭＡＰＫ及びＮＦ−κＢの活性化を介してＤＣ成熟を誘導することが分かった。この活性化は、Ｔｈ１型の免疫反応を促進させる同時刺激分子の発現及び前炎症性サイトカインの分泌の増加を導いた。最近Ｒｖ２２９９ｃを投与したマウスの脾臓細胞から分離されたＤＣがＭＨＣ分子及び同時刺激分子の発現の増加をもたらし、Ｒｖ２２９９ｃ治療とともにＤＣ負荷腫瘍抗原が相乗的な抗−腫瘍免疫効果を誘導することが報告された（Ｖ
ｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。これらの結果と本発明者らの研究結果は、Ｒｖ２２９９ｃが、生体内及び生体外でＤＣ活性化を介して補助活性を有することを示唆している。

【0076】

いくつかのマイコバクテリア蛋白質がＤＣを活性化させ、ＴＬＲ２（Ｂａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１０ａ、Ｂｙｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２ａ）、またはＴＬＲ４経路（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１３）を介してＴｈ１感染反応を誘導したり、ＴＬＲ２経路（Ｂａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１０ｂ）を介してＴｈ２感染反応を誘導することが報告された（Ｂａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１０ｂ）。これは、それぞれの抗原が樹状細胞で他の活動を見せることを示す。組換えマイコバクテリアＨＳＰ７０は、ＴＬＲ４及びＴＬＲ２の両方を介しシグナル伝達されるのに対し、マイコバクテリアＨＳＰ６５はＴＬＲ４のみ介してシグナル伝達されて、免疫細胞を活性化させる（Ｂｕｌｕｔ ｅｔ ａｌ．，２００５）。ヒトＨＳＰ９０はＴＬＲ４経路を通じて生物学的活性を誘導する（Ｔｈｕｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）。本研究では、ＨＳＰ９０ファミリーのＲｖ２２９９ｃがＴＬＲ４−、ＭｙＤ８８−及びＴＲＩＦ−依存的方法でＤＣを活性化することを示し、これはＴＲＬ４またはＴＲＬ２ノックアウトマウスを使用するプルダウン解析と実験を通じて立証される。

【0077】

本発明者らは、信頼性の高いＤＣ−基盤のワクチンのために抗−マイコバクテリア活性を有するＴ細胞を活性化させることが重要であると仮定した。しかし、Ｔｈ１免疫反応を誘導するＤＣ−活性蛋白質がもたらす実際の抗−マイコバクテリア効果については知られたところがない。本研究では、Ｒｖ２２９９ｃ−成熟ＤＣによって活性化されたＴ細胞が非活性化Ｔ細胞に比べて、マクロファージ内でのＭｔｂ成長を大幅に抑制しており、大量のサイトカイン産生を誘導したことを示している。ＬＰＳ成熟ＤＣによって非特異的に活性化されたＴ細胞は、いかなる抗−殺菌活性を示さなかった。これらの結果は、Ｒｖ２２９９ｃは、予防活性を有する処女ＣＤ４＋Ｔ細胞に特定の活性化を誘導することを示す。

【0078】

２〜４の融合蛋白質の抗原からなるサブユニットワクチンがＢＣＧのみに誘導された予防と対等な程度の強い予防反応と効果を誘発されたことが報告されている。ほとんどの人は、幼児期にＢＣＧ接種をするが、その効能は、時間が経過すると弱くなり（Ｂｅｒｔｈｏｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、このためにＢＣＧによって誘導される予防免疫をブーストすることが最も実用的な戦略になり得る。したがって、本発明者らは、Ｒｖ２２９９ｃ及びＥＳＡＴ−６からなる融合蛋白質の予防免疫反応と効果を調べた。本発明者らは、ＥＳＡＴ−６は、現在臨床試験でワクチンに含まれる主要な抗原の一つであるため、これを融合パートナーとして選択した。本研究では、ＢＣＧ単独で接種されたマウスと融合蛋白質で接種されたマウスにおいて同様の予防効果が示された。記憶Ｔ細胞のリコール応答がＤＣに依存的ではなく、他の非専門的な抗原提示細胞が、二次反応の開始に十分であることが示唆されたが（Ｂｅｒｔｒａｍ ｅｔ ａｌ．，２００４年、Ｄａｗｉｃｋｉ ａｎｄ Ｗａｔｔｓ、２００４）、他の研究者は、全身または局在感染に応答して記憶Ｔ細胞の活性化がＤＣに主に依存することを実証されている（Ｚａｍｍｉｔ ｅｔ ａｌ．，２００５、Ｗａｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００８）。本研究では、本発明者らは、Ｒｖ２２９９ｃ−成熟ＤＣがＭｔｂ−感染マウスから得られた効果／記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞の拡大を誘導していることを発見した。これはＲｖ２２９９ｃがＢＣＧ接種された対象から記憶Ｔ細胞のリコール反応を誘導することができることを示唆する。Ｒｖ２２９９ｃ−融合ＥＳＡＴ−６蛋白質でＢＣＧをブーストすることはＢＣＧ単独接種に比べて病理を減少させ、Ｍｔｂに対して長期的な保護を提供する。特に、本発明者らは、マウスのＢＣＧ予防接種がＭｔｂ Ｈ３７Ｒｖに比べてＷ−Ｂｅｉｊｉｎｇ分離についてあまり保護しないので、Ｗ−Ｂｅｉｊｉｎｇファミリーから得られた病毒性の臨床菌株であるＭｔｂ ＨＮ８７８に対する融合蛋白質の効果を決定した（Ｌｏｐｅｚ ｅｔ ａｌ。、２００３）。この分離は、感染Ｃ５７ＢＬ／６マウスから死及び幅広い肺の病理を誘発させる。

【0079】

本発明者らは、マウスモデルで高病毒性Ｗ−Ｂｅｉｊｉｎｇ系統の菌株であるＭｔｂ ＨＮ８７８株に対するＲｖ２２９９ｃ＋ＥＳＡＴ−６融合蛋白質ワクチンの予防効果を調べた。Ｒｖ２２９９ｃ＋ＥＳＡＴ−６融合蛋白質−免疫マウスは、肺の病理と細菌の増殖の評価に基づいてＭｔｂ ＨＮ８７８株にチャレンジされた後、実質的に予防された（図１０）。Ｒｖ２２９９ｃ＋ＥＳＡＴ−６融合予防接種は、著しく減少した肺の病理とともに肺から大幅に減少した細菌の負担を示すことで、Ｍｔｂ ＨＮ８７８の驚くべき予防を示した。

【0080】

一般に、Ｍｔｂ感染へのワクチン−誘導予防は、特に、肺内のＡｇ−特定の多機能ＩＦＮ−γ＋ＴＮＦ−α＋ＩＬ−２＋及びＴＮＦ−α＋ＩＬ−２＋ＣＤ４＋Ｔ ｃｅｌｌｓ細胞と関連付けられる。重要なのは、Ａｇ−免疫化されたマウスに対する検査は、Ｒｖ２２９９ｃ＋ＥＳＡＴ−６融合蛋白質に対する免疫が前−チャレンジ及び後−チャレンジで肺の中で多機能性ＣＤ４＋Ｔ細胞の産生を大幅に誘導したことを示している（図１１及び１２）。これらの傾向に基づいて、Ｒｖ２２９９ｃはＭｔｂ感染に対する成功したワクチンの主な構成要素として作用することができるはずである。ＢＣＧ単独または蛋白質単独免疫ではないＲｖ２２９９ｃ＋ＥＳＡＴ−６融合免疫は、肺内におけるＲｖ２２９９ｃ−ＥＳＡＴ−６蛋白質特異多機能性ＣＤ４＋Ｔ細胞反応を誘導した。筋肉注射後、肺におけるＲｖ２２９９ｃ＋ＥＳＡＴ−６融合−特定多機能性Ｔ細胞反応を誘導するワクチン候補の能力は、観察される予防効果と一致する。加えて、Ｒｖ２２９９ｃ＋ＥＳＡＴ−６融合蛋白質免疫化によって誘導されたこの反応は、後−感染１６週まで維持された。これはプライム多機能メモリＣＤ４＋Ｔ細胞とＭｔｂ感染を認識した後、これらの急増を示唆する。これらの結果は、肺の免疫反応予防を誘導するため、ワクチン候補を適切に補助することの重要性を示すことができる。

【0081】

結論として、本発明者らの結果は、Ｒｖ２２９９ｃが、複数の抗原の効果的なＴＢワクチンの合理的な設計に優れた候補であることを示唆する。したがって、ミューリンまたはモルモットモデルにおけるＲｖ２２９９ｃ＋ＥＳＡＴ６融合蛋白質の具体的なワクチンの効能及び効果的な予防機構を調査するために、より詳細な研究が必要である。

【0082】

Ｒｖ２２９９ｃアミノ酸配列
ＭＮＡＨＶＥＱＬＥＦＱＡＥＡＲＱＬＬＤＬＭＶＨＳＶＹＳＮＫＤＡＦＬＲＥＬＩＳＮＡＳＤＡＬＤＫＬＲＩＥＡＬＲＮＫＤＬＥＶＤ
ＴＳＤＬＨＩＥＩＤＡＤＫＡＡＲＴＬＴＶＲＤＮＧＩＧＭＡＲＥＥＶＶＤＬＩＧＴＬＡＫＳＧＴＡＥＬＲＡＱＬＲＥＡＫＮＡＡＡＳＥ
ＥＬＩＧＱＦＧＩＧＦＹＳＳＦＭＶＡＤＫＶＱＬＬＴＲＫＡＧＥＳＡＡＴＲＷＥＳＳＧＥＧＴＹＴＩＥＳＶＥＤＡＰＱＧＴＳＶＴＬＨ
ＬＫＰＥＤＡＥＤＤＬＨＤＹＴＳＥＷＫＩＲＮＬＶＫＫＹＳＤＦＩＡＷＰＩＲＭＤＶＥＲＲＴＰＡＳＱＥＥＧＧＥＧＧＥＥＴＶＴＩＥ
ＴＥＴＬＮＳＭＫＡＬＷＡＲＰＫＥＥＶＳＥＱＥＹＫＥＦＹＫＨＶＡＨＡＷＤＤＰＬＥＩＩＡＭＫＡＥＧＴＦＥＹＱＡＬＬＦＩＰＳＨ
ＡＰＦＤＬＦＤＲＤＡＨＶＧＩＱＬＹＶＫＲＶＦＩＭＧＤＣＤＱＬＭＰＥＹＬＲＦＶＫＧＶＶＤＡＱＤＭＳＬＮＶＳＲＥＩＬＱＱＤＲ
ＱＩＫＡＩＲＲＲＬＴＫＫＶＬＳＴＩＫＤＶＱＳＳＲＰＥＤＹＲＴＦＷＴＱＦＧＲＶＬＫＥＧＬＬＳＤＩＤＮＲＥＴＬＬＧＩＳＳＦＶ
ＳＴＹＳＥＥＥＰＴＴＬＡＥＹＶＥＲＭＫＤＧＱＱＱＩＦＹＡＴＧＥＴＲＱＱＬＬＫＳＰＨＬＥＡＦＫＡＫＧＹＥＶＬＬＬＴＤＰＶＤ
ＥＶＷＶＧＭＶＰＥＦＤＧＫＰＬＱＳＶＡＫＧＥＶＤＬＳＳＥＥＤＴＳＥＡＥＲＥＥＲＱＫＥＦＡＤＬＬＴＷＬＱＥＴＬＳＤＨＶＫＥ
ＶＲＬＳＴＲＬＴＥＳＰＡＣＬＩＴＤＡＦＧＭＴＰＡＬＡＲＩＹＲＡＳＧＱＥＶＰＶＧＫＲＩＬＥＬＮＰＳＨＰＬＶＴＧＬＲＱＡＨＱ
ＤＲＡＤＤＡＥＫＳＬＡＥＴＡＥＬＬＹＧＴＡＬＬＡＥＧＧＡＬＥＤＰＡＲＦＡＥＬＬＡＥＲＬＡＲＴＬ

【図1(a)】

【図1(b)】

【図1(c)】

【図1(d)】

【図1(e)】

【図2】

【図3(a)】

【図3(b)】

【図3(c)】

【図3(d)】

【図3(e)】

【図3(f)】

【図4(a)】

【図4(b)】

【図4(c)】

【図4(d)】

【図5(a)】

【図5(b)】

【図6(a)】

【図6(b)】

【図7】

【図8(a)】

【図8(b)】

【図8(c)】

【図9(a)】

【図9(b)】

【図10(a)】

【図10(b)】

【図10(c)】

【図10(d)】

【図11(a)】

【図11(b)】

【図12(a)】

【図12(b)】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]