特許 6684761 新たな特異的結合体を工学的に操作するための足場として使用されるＯＢ−フォールド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6684761

(24)【登録日】2020年4月1日

(45)【発行日】2020年4月22日

(54)【発明の名称】新たな特異的結合体を工学的に操作するための足場として使用されるＯＢ−フォールド

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/195 20060101AFI20200413BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20200413BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20200413BHJP

【ＦＩ】

   C07K14/195ZNA

   C12P21/02 C

   C12N15/09 Z

【請求項の数】35

【全頁数】40

(21)【出願番号】特願2017-145556(P2017-145556)

(22)【出願日】2017年7月27日

(62)【分割の表示】特願2014-90319(P2014-90319)の分割

【原出願日】2007年12月4日

(65)【公開番号】特開2018-35139(P2018-35139A)

(43)【公開日】2018年3月8日

【審査請求日】2017年8月25日

(31)【優先権主張番号】06291869.3

(32)【優先日】2006年12月4日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】501474748

【氏名又は名称】インスティティ・パスツール

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＰＡＳＴＥＵＲ

(73)【特許権者】

【識別番号】506316557

【氏名又は名称】サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィック

(74)【代理人】

【識別番号】100065248

【弁理士】

【氏名又は名称】野河 信太郎

(72)【発明者】

【氏名】ペコラリ，フレデリク

(72)【発明者】

【氏名】アルザリ，ペドロ

【審査官】 植原 克典

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００６−５０３５８０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Biochemistry,2005 Mar 29,44(12),p.4794-804

【文献】 J.Mol.Biol.,2000 Oct 27,303(3),p.395-403

【文献】 GAO Y-G，NATURE STRUCTURAL BIOLOGY，米国，１９９８年 ９月，V5 N9，P782-786

【文献】 Nature，日本，１９９８年，Vol.392, No.6672，p.202-205

【文献】 Nat. Struct. Biol.，日本，１９９８年，Vol.5, No.7，p.579-584

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

スルホロバス・アシドカルダリウス(Sulfolobus acidocaldarius)由来のSac7d及びSac7e、スルホロバス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)由来のSso7d及びp7ss、スルホロバス・トコダイイ(Sulfolobus tokodaii)由来のDBP 7並びにスルホロバス・シバタエ(Sulfolobus shibatae)由来のSsh7a及びSsh7bから選択される出発分子たるOB-フォールドタンパク質のその天然型リガンドとの結合界面に５〜20の変異残基を含んでなる、前記出発分子たるOB-フォールドタンパク質の変異型であって、前記変異を有さない前記出発分子たるOB-フォールドタンパク質の標的とは異なるタンパク質又はペプチドである目的の標的に結合し、その結合親和性が競合表面プラズモン共鳴により測定したときに最大限数百ナノモル範囲であり、、前記変異残基がSac7dのV2、K3、K5、K7、Y8、K9、G10、E14、T17、K21、K22、W24、V26、G27、K28、M29、S31、T33、D36、N37、G38、K39、T40、R42、A44、S46、E47、K48、D49、A50及びP51に相当する残基から選択される、OB-フォールドタンパク質の変異型。

【請求項2】

前記親和性がピコモル範囲である請求項１に記載のOB-フォールドタンパク質の変異型。

【請求項3】

前記出発分子たるOB-フォールドタンパク質のその天然型リガンドとの結合界面に８〜20の変異残基を含んでなる、請求項１又は２に記載のOB-フォールドタンパク質の変異型。

【請求項4】

前記出発分子たるOB-フォールドタンパク質のその天然型リガンドとの結合界面に11〜16の変異残基を含んでなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のOB-フォールドタンパク質の変異型。

【請求項5】

前記出発分子たるOB-フォールドタンパク質の１〜４残基が欠失している、請求項１〜４のいずれか１項に記載のOB-フォールドタンパク質の変異型。

【請求項6】

Sac7dの25位〜30位のアミノ酸に相当する領域に１〜15のランダムアミノ酸残基の挿入を更に含んでなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載のOB-フォールドタンパク質の変異型。

【請求項7】

Sac7dの25位〜30位のアミノ酸に相当する領域における１〜15のランダムアミノ酸残基の挿入がG27とK28との間である、請求項６に記載のOB-フォールドタンパク質の変異型。

【請求項8】

Sac7dの35位〜40位のアミノ酸に相当する領域に１〜15のランダムアミノ酸残基の挿入を更に含んでなる、請求項１〜７のいずれか１項に記載のOB-フォールドタンパク質の変異型。

【請求項9】

Sac7dの35位〜40位のアミノ酸に相当する領域における１〜15のランダムアミノ酸残基の挿入がN37とG38との間である、請求項８に記載の変異型。

【請求項10】

Sac7dの７位〜12位のアミノ酸に相当する領域に１〜20のランダムアミノ酸残基の挿入を更に含んでなる、請求項１〜９のいずれか１項に記載のOB-フォールドタンパク質の変異型。

【請求項11】

Sac7dの７位〜12位のアミノ酸に相当する領域における１〜20のランダムアミノ酸残基の挿入がK9とG10との間である、請求項１０に記載のOB-フォールドタンパク質の変異型。

【請求項12】

Sac7dのK7、Y8、K9、K21、K22、W24、V26、K28、M29、S31、T33、K39、T40、R42、A44、S46、E47及びK48に相当する残基の中から選択される11、12、13、14、15、16、17又は18残基が前記出発分子たるOB-フォールドタンパク質に対して置換されている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のOB-フォールドタンパク質の変異型。

【請求項13】

スルホロバス・アシドカルダリウス(Sulfolobus acidocaldarius)由来のSac7d及びSac7e、スルホロバス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)由来のSso7d及びp7ss、スルホロバス・トコダイイ(Sulfolobus tokodaii)由来のDBP 7並びにスルホロバス・シバタエ(Sulfolobus shibatae)由来のSsh7a及びSsh7bから選択される出発分子たるOB-フォールドタンパク質のその天然型リガンドとの結合界面の５〜20の残基が置換されており、前記出発分子たるOB-フォールドタンパク質が結合しないタンパク質又はペプチドである標的に結合している前記出発分子たるOB-フォールドタンパク質の変異型からなる複合体であって、前記置換された残基が、Sac7dのV2、K3、K5、K7、Y8、K9、G10、E14、T17、K21、K22、W24、V26、G27、K28、M29、S31、T33、D36、N37、G38、K39、T40、R42、A44、S46、E47、K48、D49、A50及びP51に相当する残基から選択される、複合体。

【請求項14】

前記OB-フォールドタンパク質の変異型がSac7dの25位〜30位のアミノ酸に相当する領域に１〜15のランダムアミノ酸残基の挿入を更に含んでなる、請求項１３に記載の複合体。

【請求項15】

Sac7dの25位〜30位のアミノ酸に相当する領域における１〜15のランダムアミノ酸残基の挿入がG27とK28との間である、請求項１４に記載の複合体。

【請求項16】

前記OB-フォールドタンパク質の変異型がSac7dの35位〜40位のアミノ酸に相当する領域に１〜15のランダムアミノ酸残基の挿入を更に含んでなる、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の複合体。

【請求項17】

Sac7dの35位〜40位のアミノ酸に相当する領域における１〜15のランダムアミノ酸残基の挿入がN37とG38との間である、請求項１６に記載の複合体。

【請求項18】

前記OB-フォールドタンパク質の変異型がSac7dの７位〜12位のアミノ酸に相当する領域に１〜20のランダムアミノ酸残基の挿入を更に含んでなる、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の複合体。

【請求項19】

Sac7dの７位〜12位のアミノ酸に相当する領域における１〜20のランダムアミノ酸残基の挿入がK9とG10との間である、請求項１８に記載の複合体。

【請求項20】

前記OB-フォールドタンパク質の変異型において、Sac7dのK7、Y8、K9、K21、K22、W24、V26、K28、M29、S31、T33、K39、T40、R42、A44、S46、E47及びK48に相当する残基の中から選択される11、12、13、14、15、16、17又は18残基が前記出発分子たるOB-フォールドタンパク質に対して置換されている、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の複合体。

【請求項21】

スルホロバス・アシドカルダリウス(Sulfolobus acidocaldarius)由来のSac7d及びSac7e、スルホロバス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)由来のSso7d及びp7ss、スルホロバス・トコダイイ(Sulfolobus tokodaii)由来のDBP 7並びにスルホロバス・シバタエ(Sulfolobus shibatae)由来のSsh7a及びSsh7bから選択される出発分子たるOB-フォールドタンパク質のその天然型リガンドとの結合界面の５〜20の残基が置換されており、前記変異を有さない前記出発分子たるOB-フォールドタンパク質の標的とは異なるタンパク質又はペプチドである標的に結合している前記出発分子たるOB-フォールドタンパク質の変異型からなる複合体であって、前記変異型が、競合表面プラズモン共鳴により測定したときに前記標的とナノモル以下の結合親和性を示し、前記置換された残基が、Sac7dのV2、K3、K5、K7、Y8、K9、G10、E14、T17、K21、K22、W24、V26、G27、K28、M29、S31、T33、D36、N37、G38、K39、T40、R42、A44、S46、E47、K48、D49、A50及びP51に相当する残基から選択される、複合体。

【請求項22】

前記親和性が10nMより低い、請求項２１に記載の複合体。

【請求項23】

前記親和性がピコモル範囲の親和性である、請求項２１又は２２に記載の複合体。

【請求項24】

前記出発分子たるOB-フォールドタンパク質のその天然型リガンドとの結合界面の８〜20残基が置換されている、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の複合体。

【請求項25】

前記出発分子たるOB-フォールドタンパク質のその天然型リガンドとの結合界面の11〜16残基が置換されている、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の複合体。

【請求項26】

前記出発分子たるOB-フォールドタンパク質の１〜４残基が欠失している、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の複合体。

【請求項27】

前記OB-フォールドタンパク質の変異型がSac7dの25位〜30位のアミノ酸に相当する領域及びSac7dの35位〜40位のアミノ酸に相当する領域の少なくとも一方に１〜15アミノ酸の挿入を更に含んでなる、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の複合体。

【請求項28】

前記OB-フォールドタンパク質の変異型がSac7dの７位〜12位のアミノ酸に相当する領域に１〜20アミノ酸の挿入を更に含んでなる、請求項２１〜２７のいずれか１項に記載の複合体。

【請求項29】

請求項１〜１２のいずれか１項に記載の、出発分子たるOB-フォールドタンパク質の標的とは異なるタンパク質又はペプチドである目的の標的に結合する、前記出発分子たるOB-フォールドタンパク質の変異型を取得する方法であって、
ａ)前記出発分子たるOB-フォールドタンパク質のその天然型リガンドとの結合に関与する５〜20残基がランダム化されている前記出発分子たるOB-フォールドタンパク質の変異型のコンビナトリアルライブラリを準備する工程；
ｂ)リボソームディスプレイにより前記ライブラリの前記変異型を発現させる工程；
ｃ)工程ｂ)において取得した発現した変異型を、固定した前記目的の標的に曝す工程；
ｄ)前記固定した目的の標的に結合する変異型を選択する工程；
ｅ)工程ｄ)において選択した変異型からmRNAを抽出し回収する工程；
ｆ)前記出発分子たるOB-フォールドタンパク質の選択された変異型のサブライブラリを取得するために、前記回収したmRNAを逆転写し増幅する工程；
ｇ)工程ｂ)〜ｆ)を０〜更に３回再度実行する工程；
ｈ)工程ｇ)の後に取得したサブライブラリの変異型をリポソームディスプレイにより発現させる工程；
ｉ)工程ｈ)で取得した発現した変異型を、ビオチン化した前記目的の標的に曝す工程；
ｊ)工程ｉ)の、前記発現した変異型と前記目的の標的とを含む組成物をインキュベートする工程；
ｋ)磁性ストレプトアビジン被覆ビーズを用いて、ビオチン化した目的の標的に結合した四元複合体を捕捉する工程；
ｌ)前記ビーズを洗浄し、mRNAを単離する工程；
ｍ)前記出発分子たるOB-フォールドタンパク質の前記選択した変異型のサブライブラリを取得するために、前記回収したmRNAを逆転写し増幅する工程；
ｎ)工程ｍ)のサブライブラリの１つのエレメントを選択する工程であって、前記エレメントが、前記出発分子たるOB-フォールドタンパク質のその天然型リガンドとの結合界面に５〜20の変異残基を含んでなり、前記目的の標的に結合し、その親和性が最大限数百ナノモル範囲である、前記出発分子たるOB-フォールドタンパク質の変異型をコードする、工程
を含んでなり、前記出発分子たるOB-フォールドタンパク質がスルホロバス・アシドカルダリウス(Sulfolobus acidocaldarius)由来のSac7d及びSac7e、スルホロバス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)由来のSso7d及びp7ss、スルホロバス・トコダイイ(Sulfolobus tokodaii)由来のDBP 7並びにスルホロバス・シバタエ(Sulfolobus shibatae)由来のSsh7a及びSsh7bから選択され、前記変異残基が、Sac7dのV2、K3、K5、K7、Y8、K9、G10、E14、T17、K21、K22、W24、V26、G27、K28、M29、S31、T33、D36、N37、G38、K39、T40、R42、A44、S46、E47、K48、D49、A50及びP51に相当する残基から選択される方法。

【請求項30】

前記OB-フォールドタンパク質の変異型がSac7dの25位〜30位のアミノ酸に相当する領域に１〜15のランダムアミノ酸残基の挿入を更に含んでなる、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記OB-フォールドタンパク質の変異型がSac7dの35位〜40位のアミノ酸に相当する領域に１〜15のランダムアミノ酸残基の挿入を更に含んでなる、請求項２９又は３０に記載の方法。

【請求項32】

前記OB-フォールドタンパク質の変異型がSac7dの７位〜12位のアミノ酸に相当する領域に１〜20のランダムアミノ酸残基の挿入を更に含んでなる、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項33】

前記OB-フォールドタンパク質の変異型において、前記出発分子たるOB-フォールドタンパク質の１〜４の残基が欠失している、請求項２９〜３２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項34】

前記工程ｂ)、ｃ)、ｈ)及びｊ)が４℃で行われる、請求項２９〜３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項35】

工程ｊ)のインキュベーションが少なくとも２時間行われる、請求項２９〜３４のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はタンパク質工学の分野に関する。より具体的には、本発明は、多様なリガンドファミリーの中から選択される標的に特異的に結合する安定分子を得るための手段を提供する。

【背景技術】

【0002】

ほとんどの天然タンパク質は治療的使用にも、生物工学的使用にさえも適合しない。タンパク質工学の挑戦は、要求される特性を有する新たな又は改善されたタンパク質の設計のための効率的で包括的な方法を規定することである。標的とされる特性の中でも、高い特異性及び親和性でのリガンドの認識が特に重要である。多くの適用に関して、非常に多種のリガンド(例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、糖など)に結合する並外れた適応性のために、抗体が使用されてきた。しかし、抗体又はその誘導フラグメントは、分子的複雑性及び/又は不十分な安定性のために、しばしば製造することが困難であり高価である。このため、近年、抗体の代替物が、コンビナトリアル変異/選択アプローチにより工学的に操作した(engineered)足場タンパク質を用いて、開発されている。その目的は、欠点を取り除く一方で抗体の好適な特性を維持することであった。この戦略の成功した適用が報告されている(Binzら，2005；Mathonet及びFastrez，2004)が、標的の大多数はタンパク質であり、小さな有機化合物は例外的である。

【0003】

本発明は、医学的又は生物工学的使用に十分に適合し、核酸、タンパク質、炭水化物又は他の任意の生物学的分子の中から選択される種々の標的に特異的かつ高親和性で結合することができる分子を工学的に操作するためのツールを提供することを目的とする。この目的のために、本発明者らは、オリゴヌクレオチド/オリゴ多糖結合性フォールド(OB-フォールド；OB-fold)と名付けられた特定のタンパク質構造を、結合面の残基のランダム化により、親タンパク質の好適な生物物理学的特性(すなわち、高い安定性及びフォールディング効率)を少なくとも部分的に維持しつつ改変し得るという仮説を検証してきた。

【0004】

オリゴヌクレオチド/オリゴ多糖結合性フォールド(OB-フォールド)は、Murzin(Murzin，1993)により初めて記載されたが、全ての界(kingdom)で見出され、20ゲノムの調査で28番目に多い代表的な畳み込みであるとしてランク付けられた(Qianら，2001)。このフォールド(両親媒性のα-ヘリックスでキャップされた五本鎖β-バレル)は、広範に多様な配列について適しているように見える。OB-フォールドは、認識され得る化合物のタイプに驚くほどの多様性(ssDNA、dsDNA、RNA、オリゴ多糖、タンパク質、金属イオン及び触媒基質)を付与するβ-シートの結合面を提供する。異なるタンパク質に由来する幾つかのOB-フォールドの研究により、結合性コア(binding core)は常に結合面の同じ位置に局在することが示された(Arcus，2002)。

【0005】

Sac7dはOB-フォールドトポロジーを有する(図1a)(Agbackら，1998；Gaoら，1998；Robinsonら，1998；Suら，2000)。これは、超好熱性古細菌Sulfolobus acidocaldariusに由来する小染色体タンパク質の一クラスに属する。Sac7dは、特別な配列嗜好性なく二本鎖DNAと結合する一方で、当該DNA中でシャープなねじれ(kink)を誘導する(Robinsonら，1998)。これは、Sulfolobus acidocaldariusの高い成長温度(85℃が最適)でのDNAヘリックス安定化において或る役割を演じていると考えられる。Sac7dは非常に安定である。これは熱的に安定であり、91℃のTmでアンフォールディングし、pH０〜10の間で天然型フォールドを維持し、塩酸グアニジン誘導変性は可逆的に起こり、中点濃度は2.8Ｍ変性剤である(McCraryら，1996)。抗体とは対照的に、その分子組織は全く単純である。Sac7dは、１つの構造ドメイン(すなわちOB-フォールド)を有する66アミノ酸の小さな単量体タンパク質であり、ジスルフィド橋架けを有さない(McAfeeら，1995)。Sac7dの幾つかの短縮型形態が観察されている(McAfeeら，1995)。Esherichia coliのフラスコ培養物１リットル当たり可溶性タンパク質10〜15mgまでの過剰産生レベルに達することがある(Edmondson及びShriver，2001)。Sac7d及びSulfolobus solfataricus由来の近縁ホモログSso7dの構造的研究により、２つのタンパク質コアは重ね合わせ可能である(superimposable)こと、及びDNAの小さな溝への結合が、主に、16残基により形成されるよじれ領域(twisted area)を介して起こることが示されている(Agbackら，1998；Gaoら，1998；Robinsonら，1998)。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者らは、リガンド結合に関与する多くの残基中へのランダム変異の導入、続く所与の標的に結合する変形体の選択によるインビトロでのタンパク質進化(in vitro directed protein evolution)によってSac7dの結合特異性を変化させる可能性を探求した。より正確には、本発明者らは、Sac7dの結合界面の11残基のランダム置換に対応する約3.10¹²の変形体の大きなライブラリを構築した。このライブラリを使用して、リボソームディスプレイにより規定のタンパク質標的に結合できる変形体を選択した。３つのタンパク質標的について、数百ナノモル範囲の親和性を有する結合体(binder)のプールを得た。第２のアプローチで、本発明者らは、可能性のある結合領域を13残基及び14残基にまで広げた。これら新たなライブラリを以前の標的の１つ(PulD-N)についての選択に使用し、ピコモル範囲の親和性を有する特異的な結合体を得た。よって、本発明者らは、一般的なDNA結合体(Sac7d)を、驚くべきことに、高い特異性及び親和性を有する特異的なタンパク質結合体へ向けて進化させることができることを実証した。この実証が、Sac7d又は他のOB-フォールドタンパク質から、実質的に任意の種類のリガンドの結合体を、例えば下記により詳細に記載する方法を使用することによって、誘導することができるという原理の証明を提供する。

【発明を実施するための形態】

【0007】

よって、本発明の第１の観点は、標的(特に、出発するOB-フォールドタンパク質が結合しない標的、すなわち、出発分子として使用するOB-フォールドタンパク質の標的とは異なる標的)に特異的に結合する分子をコンビナトリアル変異/選択アプローチにより得るための出発分子としてのOB-フォールドタンパク質の使用である。以下、出発するOB-フォールドタンパク質の標的を「天然型標的」と呼び、選択工程で使用する標的を「目的の標的」と指称する。好ましい実施形態において、目的の標的は、天然型標的の化学的性質とは異なる化学的性質のものである(例えば、タンパク質対/核酸及び金属イオン又は糖対/タンパク質)。よって、本発明の特定の観点は、天然には核酸に結合するOB-フォールドタンパク質の、核酸とは異なる標的(例えば、タンパク質)に特異的に結合する分子をコンビナトリアル変異/選択アプローチにより得るための出発分子としての使用である。天然にはタンパク質に結合するOB-フォールドタンパク質の、非タンパク質標的(例えば、核酸)に特異的に結合する分子をコンビナトリアル変異/選択アプローチにより得るための出発分子としての使用もまた本発明の一部である。

【0008】

本発明によれば、句「OB-フォールドタンパク質」は、Murzin(1993)及びArcus(2002)により記載されるように、OB-フォールドトポロジーを有するドメインを含んでなるか該ドメインからなる任意のポリペプチドをいう。このトポロジーは、１つの端部で両親媒性α-ヘリックスによりキャップされた五本鎖β-バレルを含んでなる構造物(architecture)に相当する。CATHタンパク質構造分類(Pearlら，2003)を参照すれば、OB-フォールドトポロジーは2.40.50フォールドファミリー(CATHデータベースバージョン3.0.0：2006年５月リリース)に相当する。このようなOB-フォールドタンパク質は、天然型タンパク質(すなわち、天然タンパク質と同じ配列を有する単離、精製又は組換えのタンパク質)か、又は工学的に操作されたタンパク質(例えば、天然型タンパク質のフラグメント又は第１のタンパク質に由来するOB-フォールドドメインと別のタンパク質に由来する別の成分とを含んでなる融合タンパク質のような)かのいずれでもあり得る。本発明に従って使用することができるOB-フォールドタンパク質の非制限的な例は、Sac7d、Sso7d、SEBのＮ末端ドメイン(Papageorgiouら，1998)、志賀様毒素IIeの鎖Ａ(PDB 2bosa)、ヒト好中球活性化ペプチド-２(NAP-2、PDB 1tvxA)、Azotobacter vinelandiiのモリブデン結合性タンパク質(modg)(PDB 1h9j)、SPE-CのＮ末端ドメイン(Rousselら，1997)、E. coli志賀様毒素のB₅サブユニット(Kitovら，2000)、Cdc13(Mitton-Fryら，2002)、ヒトY-boxタンパク質YB-1の低温ショックDNA結合性ドメイン(Kloksら，2002)、E. coli無機ピロホスファターゼEPPase(Samyginaら，2001)、又はArcus(2002)による文献の表３に列挙されるタンパク質のいずれか、例えば1krs(Lysyl-tRNAシンセターゼLysS、E.coli)、1c0aA(Asp-tRNAシンセターゼ、E.coli)、1b8aA(Asp-tRNAシンセターゼ、P. kodakaraensis)、1lylA(Lysyl-tRNAシンセターゼLysU、E.coli)、1quqA(複製タンパク質Ａ、32kDaサブユニット、ヒト)、1quqB(複製タンパク質Ａ、14kDaサブユニット、ヒト)、1jmcA(複製タンパク質Ａ、70kDaサブユニット(RPA70)フラグメント、ヒト)、1otc(テロメア末端結合性タンパク質、O. nova)、3ullA(ミトコンドリアssDNA結合性タンパク質、ヒト)、1prtF(百日咳毒素S5サブユニット、B. pertussis)、1bcpD(百日咳毒素S5サブユニット(ATP結合)、B.pertussis)、3chbD(コレラトキシン、V. cholerae)、1tiiD(易熱性トキシン、E. coli)、2bosA(ベロ毒素-１/志賀毒素、Ｂ-ペンタマー、E. coli)、1br9(TIMP-2、ヒト)、1an8(超抗原SPE-C、S. pyogenes)、3seb(超抗原SPE、S. aureus)、1aw7A(トキシックショック症候群トキシン、S. aureus)、1jmc(主要低温ショックタンパク質、E.coli)、1bkb(翻訳開始因子5a、P. aerophylum)、1sro(PNPaseのS1 RNA結合性ドメイン、E.coli)、1d7qA(翻訳開始因子１、elF1a、ヒト)、1ah9(翻訳開始因子１、IF1、E.coli)、1b9mA(Mo依存性転写調節因子ModE、E.coli)、1ckmA(RNAグアニリルトランスフェラーゼ、コレラウイルス、PBCV-1)、1a0i(ATP依存性DNAリガーゼ、バクテリオファージT7)、1snc(ブドウ球菌ヌクレアーゼ、S. aureus)、1hjp(DNAヘリカーゼRuvAサブユニット、Ｎ末端ドメイン、E.coli)、1pfsA(遺伝子Ｖタンパク質、シュードモナスバクテリオファージpf3)、1gvp(遺伝子Ｖタンパク質、糸状バクテリオファージ(f1、M13))、1gpc(遺伝子32タンパク質(gp32)コア、バクテリオファージT4)、1wgjA(無機ピロホスファターゼ、S. cerevisiae)及び2prd(無機ピロホスファターゼ、T. thermophilus)である。結合部位における変異、したがって結合特異性の変化が毒性を完全に消滅させ得るので、トキシンを起源とするOB-フォールドドメインを、毒性を回避すべきである目的にさえ出発分子として使用可能であることに注目することができる。

【0009】

下記の実験の部において更に詳細に例証するように、コンビナトリアル変異/選択アプローチは、出発するOB-フォールドタンパク質の多くの選択された残基のランダム化(特に、タンパク質とその天然型リガンドとの結合に関与する多くの残基のランダム化)に対応するコンビナトリアルライブラリを得ること、続く前記ライブラリにおける所望の特性を有する変形体の選択からなる。

【0010】

よって、本発明の別の目的は、場合により１〜４残基の欠失及び/又は１〜50残基の挿入と組み合わされた、OB-フォールドタンパク質のその天然型リガンドとの結合界面の５〜32残基、好ましくは８〜20、より好ましくは11〜16残基のランダム化に対応するコンビナトリアルライブラリである。当然のことではあるが、「OB-フォールドタンパク質の結合界面」とは、本明細書中で、異なるリガンドに結合する複数のドメインを有するタンパク質の場合でさえ、OB-フォールドドメインとこのドメインに結合するリガンドとの間の界面をいう。当業者は、OB-フォールドタンパク質とその天然型リガンドとの結合に関与する残基を同定するために必要な情報を科学文献中に見出す。このような残基は、しばしば、OB-フォールドのβ-ストランドβ3、β4及びβ5、並びにループ１、３及び４に位置する(図1b及び２)。

【0011】

本発明による特定のコンビナトリアルライブラリは、Sulfolobus acidocaldariusに由来するSac7d、又はそのホモログ(図４)、例えばSso7d(Sulfolobus solfataricusに由来するSso7d)を用いて得ることができる。当然のことながら、Sac7dの短縮形態(McAfeeら(1995)により記載されているもの)を用いて得られるライブラリもまた、本発明の一部である。

【0012】

ウェブサイトWU-Blast2(http://www.ebi.ac.uk/blast2/index.html)(Lopezら，2003)、T-COFFEE(http://www.ch.embnet.org/software/TCoffee.html)(Notredameら，2000)及びDALI lite(http://www.ebi.ac.uk/DaliLite/)(Holm及びPark，2000)を使用してOB-フォールドドメインの幾つかの配列及び3D構造を重ね合わせる(superimpose)ことにより、本発明者らは、本発明によるライブラリを得るために改変し得る位置を同定した。配列番号１のSac7dの配列を参照として、ランダム化し得る残基は以下である：V2、K3、K5、K7、Y8、K9、G10、E14、T17、K21、K22、W24、V26、G27、K28、M29、S31、T33、D36、N37、G38、K39、T40、R42、A44、S46、E47、K48、D49、A50及びP51。
また、Sac7dを参照として用いて、欠失させ得る残基は、A59、R60、A61及びE64である。

【0013】

ウェブサイトDALI(http://www.ebi.ac.uk/dali/Interactive.html)(Holm及びSander，1998)を用いる10のタンパク質又はOB-フォールドドメイン(Sac7dを含む)の3D構造の重ね合わせにより、この種のタンパク質が種々のサイズのループ(これらがリガンドの結合に関与している可能性が最も高い)を有することが明らかになった(図２を参照)。この観察は以前に公開されたデータ(Arcus，2002)と一致する。Sac7dは最も短いループを有するタンパク質の１つであるので、該ループ中へのランダム挿入は、或るリガンドファミリーの結合に特に適合するライブラリを得るために、有利に実行され得る。有利には、１〜15アミノ酸残基の挿入は、(図1b及び２で同定されるような)ループ３中、例えばSac7dの残基25〜30の領域中に、好ましくは残基27と残基28との間に行うことができ、１〜15アミノ酸残基の挿入は、(図1b及び２で同定されるような)ループ４中、例えばSac7dの残基35〜40の領域に、好ましくは残基37と残基38との間に行うことができ、１〜20アミノ酸残基の挿入は、(図1b及び２で同定されるような)ループ１中、例えばSac7dの残基7〜12の領域に、好ましくは残基９と残基10との間に行うことができる。多義性を回避するために、本明細書では、図1a及び２で同定されるようなループ３、４及び１は、Arcus(上記)による概説論文で同定されるループ１、２及び４にそれぞれ相当すると特定される。

【0014】

本発明の特定の実施形態によれば、コンビナトリアルライブラリは、K7、Y8、K9、K21、K22、W24、V26、K28、M29、S31、T33、K39、T40、R42、A44、S46、E47及びK48の中から選択されるSac7dの11、12、13、14、15、16、17又は18残基、例えばK7、Y8、K9、K21、K22、W24、V26、K28、M29、S31、T33、K39、T40、R42、A44及びS46の中から選択される11、12、13、14、15又は16残基のランダム化に相当する。

【0015】

上記実施形態の好ましいコンビナトリアルライブラリでは、ランダム化された残基は、Sac7dの少なくとも残基K7、Y8、K9、W24、V26、M29、S31、T33、R42、A44及びS46を含んでなる。下記の実験の部において「ライブラリ11」と呼ばれるこの実施形態による具体的ライブラリは、Sac7dの残基K7、Y8、K9、W24、V26、M29、S31、T33、R42、A44及びS46のランダム化に相当する。この実施形態による他のコンビナトリアルライブラリにおいて、K21、K22及びT40の中から選択されるSac7dの１、２又は３の追加の残基もまたランダム化される。実験の部でも記載される本発明による他の２つの好ましいライブラリは、「ライブラリ13」(これは、Sac7dの残基K7、Y8、K9、K21、K22、W24、V26、M29、S31、T33、R42、A44及びS46のランダム化に相当する)、及び「ライブラリ14」(これは、Sac7dの残基K7、Y8、K9、K21、K22、W24、V26、M29、S31、T33、T40、R42、A44及びS46のランダム化に相当する)である。

【0016】

当然のことながら、上記のものと等価な位置に位置する残基の中から選択されるSso7dの11、12、13、14、15又は16残基をランダム化することによって得られるコンビナトリアルライブラリもまた、本発明の一部である。前記等価な位置は、RSCB Protein Data Bank(Bermanら，2000)中のSso7d(鎖Ａ)についてのファイル(1bf4A)を使用し、その3D構造をSac7dのものと比較すること(図3a)によって同定することができる：
Sac7d： 7 8 9 21 22 24 26 28 29 31 33 39 40 42 44 46
1bf4A： 7 8 9 21 22 24 26 28 29 31 33 40 41 43 45 47

【0017】

Sac7dと相同な他のタンパク質もまた、上記のようなコンビナトリアルライブラリを得るために使用することができる。そのようなタンパク質の例は、以下の表に開示される。

【0018】

【表1】

【0019】

表１に列挙するSac7dホモログのOB-フォールドドメインのアラインメントを図４に示す。

【0020】

本発明による他の特定のコンビナトリアルライブラリは、志賀様毒素IIe(PDB 1r4pB)を用いて、例えばSac7dについて上記したものと等価な位置に位置する残基の中から選択される11、12、13、14、15又は16残基をランダム化することによって得ることができる。前記等価な位置(図3b)は以下のとおりである：
Sac7d： 7 8 9 21 22 24 26 28 29 31 33 39 40 42 44 46
1r4pB： 60 59 58 9 10 12 14 17 18 20 22 X X 27 29 31

【0021】

本発明による特定のコンビナトリアルライブラリの他の例は、ヒト好中球活性化ペプチド-２(NAP-2，PDB 1tvxA)の11、12、13、14、15又は16残基をランダム化することによって得ることができる。ここで、前記残基は、Sac7dについて上記したものと等価な位置に位置する残基の中から選択される。これら等価な位置は、該タンパク質の3D構造とSac7dの3D構造との比較(図3c)により得られ、以下のとおりである：
Sac7d： 7 8 9 21 22 24 26 28 29 31 33 39 40 42 44 46
1tvxA： 25 26 27 40 41 43 45 54 55 57 59 61 63 65 67 69

【0022】

本発明による更に他の特定のコンビナトリアルライブラリは、Azotobacter vinelandiiのモリブデン結合性タンパク質(modg)(PDB 1h9j)を用いて、例えばSac7dについて上記したものと等価な位置に位置する残基の中から選択される11、12、13、14、15又は16残基をランダム化することによって得ることができる。ここで、前記等価な位置(図3d)は以下のとおりである：
Sac7d： 7 8 9 21 22 24 26 28 29 31 33 39 40 42 44 46
1h9jA： 60 61 62 86 87 89 91 93 94 96 98 105 106 108 110 112

【0023】

本発明はまた、標的に特異的に結合する分子を工学的に操作するための、上記のようなコンビナトリアルライブラリの使用に関する。本明細書において、分子は、10より上のシグナル対ノイズ比(Ｓ/Ｎ比)で標的に結合するとき、標的の「特異的」結合体とみなされる。本発明によるコンビナトリアルライブラリを使用して工学的に操作された結合体分子は、好ましくはその標的(「目的の標的」とも呼ぶ)に高親和性で、すなわち標的がペプチド又はタンパク質であるときは10nMより良好な親和性で、標的が例えば炭水化物分子であるときは１μMより良好な親和性で結合する。

【0024】

本発明の別の１つの目的は、標的に特異的に結合する分子を工学的に操作するための方法であり、この方法は、上記のコンビナトリアルライブラリにおいて前記標的に特異的に結合するOB-フォールドタンパク質の変形体を選択する工程を含んでなる。本明細書において、「変形体」は、ライブラリに属するタンパク質、すなわち、その結合部位における変異により出発するOB-フォールドタンパク質から誘導されたタンパク質を意味する。

【0025】

既に上で述べたように、本発明の関心の１つは、目的の標的に関して実質的に制限なく、この標的に特異的に結合する分子の工学的操作を可能にすることである。例えば、目的の標的は、ペプチド、タンパク質、オリゴ多糖、脂質、リポペプチド、炭水化物(例えば、糖)、一本鎖DNA、二本鎖DNA、RNAであることができる。興味深いことに、目的の標的は、天然又は合成の、数個の原子に(たった１つの原子にさえ)限定された小分子であることができる。そのような小分子の例としては、任意の種類のハプテン(すなわち、大きなキャリアに付着させたときのみ免疫応答を惹起することができる小分子)、ビタミン又は金属イオンが挙げられる。標的として使用できる分子の広範な多様性は特に興味深い。なぜならば、これら標的に結合するOB-フォールドタンパク質は、抗体について既に知られている同じ適用又は異なる適用のいずれにも使用することができるからである。例えば、本発明に従って得られ、金属イオンに結合するOB-フォールドタンパク質は、バイオレメディエーションプロセスで、例えば土壌又は汚染水のような複雑な材料から重金属を除去するために、使用することができる。

【0026】

当業者は、当該分野の任意の技法を用いて、本発明による方法の選択工程を実施し、及び/又は所望の特性を有するタンパク質を得るためのスクリーニング工程を実施することができる。選択技法は、例えば、ファージディスプレイ(Smith，1985)、mRNAディスプレイ(Wilsonら，2001)、細菌ディスプレイ(Georgiouら，1997)、酵母ディスプレイ(Boder及びWittrup，1997)又はリボソームディスプレイ(Hanes及びPluckthun，1997)であり得る。

【0027】

リボソームディスプレイは、完全にインビトロで実施され、そのためインビボ系の多くの制限(特にライブラリサイズ関するもの)を回避できるので、選択工程の実施に関して特に有利である(He及びTaussig，2002；Schaffitzelら，1999)。当業者は、下記の実験の部、並びにHe及びTaussig(2002)並びにSchaffitzelら(1999)の論文、又は他の論文及びマニュアルに、リボソームディスプレイを実施するためのプロトコルを見出せる。
本発明の方法の好ましい実施形態において、２、３、４又は５回の選択がリボソームディスプレイによって実施される。

【0028】

実験の部に記載のように、本発明による方法はまた、目的の標的に特異的に結合する１又は幾つかの分子を単離し特徴付ける更なる工程を含んでなることができる。例えば、単離及び特徴付け工程は以下のように実施され得る：

【0029】

(ｉ)リボソームディスプレイにより選択されたプール由来のmRNAを逆転写し、PCRにより増幅し、得られるDNAを発現ベクター中にクローニングし；
(ii)細菌(例えば、コンピテントなDH5α)を前記発現ベクター(前記DNAを含んでなる)により形質転換し、個々のクローンを増殖させ；そして
(iii)前記細菌クローンから抽出したタンパク質を標的への結合及び/又は他の生物学的特性(例えば安定性など)について試験する。

【0030】

次いで、最良の特性を有するタンパク質を発現するクローンを増殖させて、より多量のタンパク質を産生させることができる。工学的に操作されたタンパク質のコード配列は、発現ベクターの該当する部分を配列決定することによって決定することができ、このタンパク質をコードする遺伝子はまた、当該タンパク質の更なる工学的操作に使用することができる。確かに、本発明による方法により得られた結合体を使用して、少なくとも１つの標的化成分と、触媒活性、蛍光活性、酵素活性又は他の任意の活性を有する別の成分とを有する多機能タンパク質を構築することは有利であり得る。これは、例えば、第１成分として単離し特徴付けられた分子と少なくとも第２成分とを含んでなる融合タンパク質の構築によりなすことができる。この第２成分は、有利には、酵素、マーカー又はレポータータンパク質(例えば、PhoA、GFPなど)、治療タンパク質などの中から選択することができる。本発明の方法の変形によれば、複数の結合特異性を有する融合体又は複合体を構築するために、幾つかの結合体が一緒に連結される(融合タンパク質中で、又は非共有結合によるのいずれかで)。

【0031】

本発明の他の目的は、上記の方法により得られるタンパク質である。詳細には、PulDに特異的に結合し、配列番号２〜８の中から選択される配列を有するタンパク質、並びに、配列番号47のGarA-結合体は、本発明の一部である。

【0032】

以下の図及び実施例により本発明を更に説明する。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】ａ)二本鎖DNA(PDBコード1azp)と複合体状態の野生型Sac7dの概略図。ｂ)DNA結合に関与する残基。凹面領域は、明灰色に着色された残基で規定され、平面領域は中間及び暗灰色に着色された残基で規定される。結合領域の区域間境界の残基は中間灰色に着色されている。

【図2】種々のOB-フォールドドメインのループ１、３及び４の概略図。この重ね合せを行うために使用したRSCB PBD構造ファイルは以下のとおりである：1azp(すなわち、Sac7d)、1tvxA、1dokA、1bqq、1csp、3seb、1br9，2bosA、1bf4A及び1quqB。図を明瞭にするために、Sac7dの構造のみを表している。

【図3-1】ａ)Sso7d(構造ファイル：1bf4)の概略図及びSac7dとの重ね合せ。OB-フォールドドメインとは異なる追加のドメインを含んでなるタンパク質については、OB-フォールドドメインのみが図に示されていることに留意すべきである。構造の重ね合せはDALI及びDALI Liteサーバーを用いて得られた。タンパク質配列をNCBIファイル中の番号と共に下記の表２に示す。

【図3-2】ｂ)志賀様毒素IIe(構造ファイル：2bosa)；ｃ)ヒト好中球活性化ペプチド-２(NAP-2，構造ファイル：1tvxA)；ｄ)Azotobacter vinelandiiのモリブデン結合性タンパク質(modg)(構造ファイル：1h9j)の概略図及びSac7dとの重ね合せ。OB-フォールドドメインとは異なる追加のドメインを含んでなるタンパク質については、OB-フォールドドメインのみが図に示されていることに留意すべきである。構造の重ね合せはDALI及びDALI Liteサーバーを用いて得られた。タンパク質配列をNCBIファイル中の番号と共に下記の表２に示す。

【表2】

【図4】幾つかのSac7dホモログのOB-フォールドドメインのアラインメント。

【図5】Sac7dをコードする変異配列の遺伝子合成。ライブラリ11のためにランダム化した位置は黒で標識している。ライブラリ14のための追加のランダム化位置は灰色で標識している。使用したオリゴヌクレオチドは、細い矢印で示す(配列については本文を参照)。大きな矢印はSac7dのコード配列に対応する(Ｃ末端TolAリンカーなし)。

【図6a】ａ)ライブラリ11を用いるDnaK、PulD-N及びGarAに対する４回の選択後のRIA(ラジオイムノアッセイ)。選択物のプールをメチオニン³⁵Sの存在下でインビトロで翻訳し、ELISAプレートに固定化したDnaK、PulD-N又はGarAへの結合について試験した。洗浄及び0.1Ｍトリエタノールアミンでの溶出後、結合体の量をβカウンターで推定した。競合は、翻訳プールと１μM及び10μMの濃度の遊離タンパク質とのプレインキュベーションと並行して行った。

【図6b】ｂ)４回目後の抗-PlulD-N結合体のスクリーニング。

【図6c】ｃ)ELISAによる６つの抗PulD-N結合体に対する結合特異性の試験。結合体と固定化したDnaK、PulD-N、GarA及びBSAとの間の相互作用を比較した。

【図7】ライブラリ11、13及び14を用いるPulD-Nに対する５回の選択後のRIA。選択物のプールをメチオニン³⁵Sの存在下でインビトロで翻訳し、ELISAプレートに固定化したDnaK、PulD-N、GarA又はBSAへの結合について試験した。洗浄及び0.1Ｍトリエタノールアミン溶出後、結合体の量をβカウンターで推定した。競合は、翻訳プールと１nM、10nM、100nM、1000nMの濃度の遊離PulD-Nとのプレインキュベーションと並行して行った。BSAを、プールの結合についてのネガティブコントロールとして使用した。(競合は行わなかった)。

【図8】PulD-Nに対して選択した８つの結合体の配列。野生型Sac7dの配列を図の上部に示す。野生型Sac7dと結合体とに共通する残基をドットで表す。置換スキームにおいてプログラムされた位置を灰色で強調している。

【図9】選択した８つの結合体の発現及び精製分析。タンパク質を15％SDS-PAGE上にロードし、クーマシーブリリアントブルーで染色した。ａ)30℃での発現後のE. coli粗抽出物。0.5mM IPTGでの19時間の誘導後に細胞を採集し、ローディング緩衝液中で溶解させた。ｂ)結合体を精製する前の粗抽出物の可溶性画分。ｃ)E. coli粗抽出物可溶性画分の一工程IMAC(固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー)精製後の精製結合体。ロードした全てのサンプルは、13μl液体培養物に等しかった。

【図10】SPR(表面プラズモン共鳴)分析を用いたクローン６の親和性決定。ａ)結合の動力学は、BIAcoreを用いて以下のとおりに行った。ストレプトアビジンチップにビオチン化PulD-Nを固定した(250RU)。50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.13nM及び1.56nMのクローン６を注入した。PulD-Nを固定していないフローセルを特異的結合が生じないコントロールとして使用し、このセルからのシグナルを測定セルから得られたシグナルから減じた。BIAevaluationソフトウェアを使用して、グローバルフィッティング手順によりデータを分析した。ｂ)競合BIAcoreを使用して平衡時の親和性もまた測定した。両アプローチから決定したパラメータを表３に示す。

【図11】示差走査熱量測定により決定した野生型及び変形体Sac7d組換えタンパク質の熱的安定性。wt Sac7d、クローン40、クローン33及びクローン６の過剰熱吸収を、300mM NaClを含有する50mM MES緩衝液(pH5.6)中200μg/mlのタンパク質濃度にて１℃/分で報告する。各タンパク質サンプルについて、非線形回帰により、実験的過剰熱容量曲線(太線)を非二状態モデル(non two-state model)(細線)にフィットさせた。得られる熱力学的パラメータを表４に示す。

【図12a】ａ)クローン６-アルカリホスファターゼ融合体を使用した、E. coli粗抽出物と混合したPulD-Nの検出のためのウェスタンブロット。

【図12b】ｂ)カラムに固定化したクローン６を用いたPulD-Nの単一工程精製。E. coli抽出物のPulD-N含有可溶性画分を、HBS緩衝液(pH7.0)で平衡化したカラムに注射した。洗浄後、グリシン-HCl緩衝液でpHを2.5に低下させた。画分を15％SDS-PAGE上で分析し、ブリリアントブルーで染色した。CE：細胞抽出物；PulD-N：マーカーとして使用した純粋タンパク質；画分：酸性pHジャンプ後にカラムから溶出した画分；FT：貫流。

【図13】単離細胞エンベロープ及びPulD十二量体(PulDD)及びPulD単量体(PulDM)へのSac7^*40、Sac7*33、及びSac7^*6の結合。(Ａ)PulD及びPulS又はPulD-CS及びPulS産生株PAP105からの漸増量の細胞エンベロープをSac7^*40-GFPとインキュベートし、次いで膜画分をSDS及びGFP抗体でのイムノブロッティングにより分析した。(Ｂ)３つのSac7^*-PhoAキメラ及びPhoAに対する抗体を使用した、同じ株からの指定量の細胞エンベロープタンパク質のファーウェスタンブロッティング(Far-Western blotting)。

【図14】IPTG誘導したか又はしていないSac7-PhoAキメラの産生、及びpCHAP231を有する細胞エンベローププロテアーゼ欠損株PAP5198における分泌及びPulD多量体化に対するそれらの効果。(Ａ)同量の細胞抽出物のイムノブロッティング(PhoA抗体を使用)により検出されるSac7-PhoAレベル。(Ｂ)フェノール処理及び非処理細胞抽出物のPulD抗体でのイムノブロッティングにより検出されるPulD十二量体(PulDD)及び単量体(PulDM)の分泌レベル(％)及び存在。矢印は、フェノール処理なしで検出されるPulDMを示す。ＳはSac7d-PhoAを示す。(Ｃ)IPTG誘導がない以外はＢと同様。

【図15】サイクル番号４(図19、RT-PCRステージを参照)の間に溶出したARNmsから得られるADNcに対して行ったPCR。

【図16】５回の抗-PKnG及び抗-リゾチーム選択サイクル後に行った競合放射免疫試験。

【図17】５回の選択サイクル後に得られた抗-リゾチーム(Ａ)、抗-PknG(Ｂ)及び抗-GarA(Ｃ)クローンのELISAスクリーニング。

【図18】５回の選択サイクル後に得られた抗-リゾチームクローンの配列。

【図19】GarA-結合体とSac7dとのアラインメント。

【図20】Fcフラグメントに対する４番目の選択ラウンド後の競合ELISA。

【図21】リボソームディスプレイ選択ラウンドの概略図。

【実施例】

【0034】

実施例
以下の実験データは、下記の材料及び方法を用いて得た。
材料及び方法
一般分子生物学
酵素及び緩衝液はNew England Biolabs社(米国)又はFermentas社(リトアニア)のものであった。オリゴヌクレオチドは、MWG Biotech社(ドイツ)のものであった。全てのPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)は、本文中に示されていなければ、Ventポリメラーゼを用いて行った。野生型Sac7d及び選択した変異体のためのクローニング及び発現ベクターは、Qiagen社(ドイツ)のpQE30であった。

【0035】

野生型Sac7dをコードするDNAの合成
野生型Sac7dのDNA配列は、以下の６つのオリゴヌクレオチドを用いるアセンブリPCRにより生成した：SC1(配列番号９：GAAACTCCTAGGTATTGTGCTGACGACCCCGATCGCGATCTCTAGCTTTGCGGTGAAAGTGAAATT)、SC2(配列番号10：GATCTTGCTGGTGTCCACTTCTTTTTCTTCGCCTTTATATTTAAATTTCACTTTCACCGCAAAGCTAG)、SC3(配列番号11：GAAGTGGACACCAGCAAGATCAAGAAAGTTTGGCGTGTGGGCAAAATGGTGAGCTTTACCTACGACGACAACGGCAAG)、SC4(配列番号12：CTCTTTCGGGGCATCTTTCTCGCTCACGGCGCCACGGCCGGTCTTGCCGTTGTCGTCGTA)、SC5(配列番号13：GAGAAAGATGCCCCGAAAGAGTTATTAGATATGTTAGCGCGTGCGGAAAGCTTCAACCA)、SC6(配列番号14：TGGTGGTTGAAGCTTTCCGCACG)。精製したPCR産物を、以下の２つのプライマーを用いる第２のPCR増幅用のテンプレートとして供した：SC07(配列番号15：ATTAATGGTACCGGATCCGTGAAAGTGAAATTTAAATATAAAG)及びSC08(配列番号16：ATAATTGAGCTCTAAGCTTTTTTTCACGTTCCGCACGCGCTAACATATC)。PCR産物を、BamHI及びHindIII制限部位を使用してpQe30発現ベクター中にクローニングした。予測された配列を有するクローンをその後の発現に使用した。

【0036】

コンビナトリアルライブラリの生成
プロトコルは、３つのライブラリ11、13、14の生成について、リボソームディスプレイと適合性のフォーマットにおいて同じであった。ライブラリは、主に、遺伝子合成及びPCRアセンブリ工程により構築した。４つの標準とNNSトリプレット(式中、N=A、C、T又はGであり、S=C又はG)をコードする３つの縮重オリゴヌクレオチドとの組合せを使用する単一工程PCRで、リボソームディスプレイに必要な５'-側方領域及びSac7dのランダム化遺伝子を含むDNA産物を得た。ライブラリ14については、以下のオリゴヌクレオチドを使用した：T7C(配列番号17：ATACGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTC)、SDA_MRGS(配列番号18：AGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATATCCATGAGAGGATCG)、SClib1(配列番号19：GGAGATATATCCATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCGTCAAGGTGAAATTC)、SClib2(配列番号20：GGATCCGTCAAGGTGAAATTCNNSNNSNNSGGCGAAGAAAAAGAAGTGGACACTAGTAAGATC)、SClib3(配列番号21：CTTGCCGTTGTCGTCGTASNNAAASNNCACSNNTTTGCCSNNACGSNNAACSNNSNNGATCTTACTAGTGTCCACTTC)、SClib4(配列番号22：TAATAACTCTTTCGGGGCATCTTTCTCSNNCACSNNGCCSNNGCCSNNCTTGCCGTTGTCGTCGTA)、SClib5(配列番号23：CCATATAAAGCTTTTTCTCGCGTTCCGCACGCGCTAACATATCTAATAACTCTTTCGGGGCATC)。Sac7d中の残基21、22及び40に、又は残基40に対応する位置でNNSトリプレットの代わりに野生型トリプレットをコードするプライマーを、それぞれライブラリ11及び13の構築に使用した。

【0037】

リボソーム上にディスプレイされたタンパク質を潜在的なリガンドによりアクセス可能とするために、該タンパク質をリンカーに融合する必要がある。このリンカーの配列(E. coliタンパク質TolAの一部に相当し、プラスミドpRDVベクター(Binzら，2004a)中にコードされている)を、プライマーSClink(配列番号24：GCGGAACGCGAGAAAAAGCTTTATATGGCCTCGGGGGCC)及びtolAk(配列番号25：CCGCACACCAGTAAGGTGTGCGGTTTCAGTTGCCGCTTTCTTTCT)(後者は、リボソームディスプレイに必要な３'-側方領域をコードする)を使用してPCR増幅した。最後に、tolAk及びT7B(配列番号25：ATACGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGG)プライマーを使用するPCRアセンブリによってtolAリンカーを有するライブラリを組み立てた。最終的なアセンブリ産物は、以前(Hanesら，1998；Schaffitzelら，1999)に記載されたリボソームディスプレイ選択に使用するために必要な５'-及び３'-領域を全て有するSac7dのライブラリに対応していた。

【0038】

リボソームディスプレイ選択ラウンド
選択実験には、ビオチン化標的タンパク質を使用した。氷上にて１時間の、PBS中DnaK、GarA又はPulD-Nの10μM溶液と20倍モル過剰のスルホスクシンイミジル-６-(ビオチンアミド)ヘキサノエート(スルホ-NHS-LC-LC-ビオチン，Pierce)とのインキュベーションにより、ビオチン化を行った。TBS中で平衡化したPierce社のタンパク質脱塩スピンカラムを用いて、ビオチン化タンパク質の緩衝液交換を行った。ビオチン化の程度は、HABAアッセイ(Sigma)を用いて、タンパク質１分子あたり２〜３分子のビオチンと決定した。ビオチン化標的タンパク質を、Maxisorpプレート(Nunc)中の固定化ニュートラビジンに結合させ、本質的にはBinzら(2004b)に記載のとおりであるが幾らか改変して、リボソームディスプレイによる選択を４℃にて行った。簡潔には、各選択ラウンド後、溶出mRNAをcDNAに逆転写し、SDA_MRGS及びSClib5プライマーを用いて増幅させた。PCR産物を、Nuclespin extraction IIカラム(Macherey-Nagel)で脱塩し、TolAリンカーDNAフラグメント(上記参照)を用いるPCRアセンブリに使用した。これにより、５'-及び３'-側方領域が新たに付加された全長リボソームディスプレイ構築物を生成して、操作の間のmRNA末端の分解に起因するクローン喪失を最小にした。RT-PCRサイクル数は、35サイクル(ラウンド１)、30サイクル(ラウンド２)、30サイクル(ラウンド３)、25サイクル(ラウンド４)であった。ラウンド５では、Jermutusら(2001)に記載のような解離速度(off-rate)選択を使用して、選択圧を増大させた。この選択のために、10nMのビオチン化PulD-Nを、ラウンド４からのプールの停止翻訳物(stopped translation)に添加した。この混合物を１時間４℃にて平衡化し、非ビオチン化PulD-Nを10μMの最終濃度(ビオチン化PulD-Nに対して1000倍過剰)まで加えた。４℃にて撹拌しながら２時間のインキュベーション後、ビオチン化PulD-Nに結合した三つ組複合体(mRNA-リボソーム-結合体)を、４℃にて15分間、30μlの磁性ストレプトアビジン被覆ビーズ(Roche)を用いて捕捉した。ビーズを洗浄し、最初の４ラウンドと同様にmRNAを単離した。RT-PCRサイクル数は、この５番目の選択ラウンドについては35であった。選択の進行は、ラウンドごとのRT-PCR産物の量をモニターすることによって検証した。

【0039】

選択したプール及び単離クローンの分析
４又は５ラウンド後、選択したプールを、Maxisorpプレート中の直接被覆標的タンパク質を使用し、１nM〜10μMの遊離標的タンパク質を競合物として使用して、Hanesら(1998)に記載のようにRIA(ラジオイムノアッセイ)により試験した。
選択したプールからのRT-PCR産物を、BamHI及びHindIII制限部位を用いてpQE30ベクター中にクローニングし、得られた結紮物(ligation)を使用してE. coli DH5α株を形質転換させた。クローンをペトリ皿から採取し、１ウェルあたり1.5mlのLB培地(100μg/mlアンピシリン，１％グルコース)を含むディープウェルプレートに接種した。250rpmで振盪させながらの37℃にて一晩の培養後、このマスタープレートからの0.2mlの各ウェルを使用して、１ウェルあたり1.3mlの2YT培地(100μg/mlアンピシリン)を含む他のディープウェルプレートに接種した。次いで、プレートを37℃にて１時間、振盪(250rpm)させながらインキュベートした。0.5mMのIPTGの添加及び振盪(250rpm)させながらの30℃にて４時間のインキュベーションで発現を誘導した。遠心分離工程(2250ｇ)で細胞をペレット化し、上清を廃棄した。250rpmにて30分間振盪させながら１ウェルあたり50μlのBugBuster(Novagen)でタンパク質を抽出し、次いで250μlのTBS(pH7.4)(20mM Tris-HCl，150mM NaCl)を加えた。遠心分離工程(2500ｇ)で細胞砕片をペレット化した。ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)スクリーニングについては、100μlの各上清を使用してMaxisorpプレート中に被覆した標的タンパク質への結合を試験した。結合体に由来するRGS-(His)₆-タグのみを検出し、標的タンパク質に由来する(His)₆-タグを検出しないRGS His抗体HRP接合体(Qiagen)及びRoche社のBM-Blue基質を用いて、検出を行った。0.1％Tween 20を有するTBS(pH7.4)中で全てのインキュベーション工程を行った。標準的な配列決定技法によりポジティブクローンを配列決定した。

【0040】

SPR(表面プラズモン共鳴)によるスクリーニングのためのタンパク質産生
PulD-Nからの解離時間に基づいて結合体のスクリーニングを行うために、クローンを５mlスケール培養物(E. coli DH5α株)中で発現させた。ディープウェル中での500μlの一晩予備培養物(LB培地，100μg/mlアンピシリン，１％グルコース，37℃)を使用して、4.5ml培養物(2YT，100μg/mlアンピシリン，37℃)に接種した。OD₆₀₀=1.0で発現を0.5mMのIPTGの添加により誘導し、培養物を30℃にて19時間インキュベートした(250rpm)。細胞を遠心分離(2500g)により採集し、25mMイミダゾール、BugBuster及びBenzonase(Novagen)を含む0.5mlのTBS(pH7.4)中に細胞を再懸濁することによりタンパク質をディープウェルにおいて抽出した。４℃にて１時間の振盪後、ディープウェルを遠心分離して細胞砕片をペレット化した。20mMイミダゾールを含むTBS(pH7.4)で平衡化した100μlのNi-Fast Flow Chelating Sepharose(General Electric)を含むマイクロスピンカラムで上清を精製した。樹脂をローディング緩衝液で４回洗浄し、精製したタンパク質を400μlのTBS(pH7.4)及び250mMイミダゾールで溶出させた。

【0041】

結合体及び野生型Sac7dのタンパク質産生及び精製
Biacore及びマイクロ熱量測定実験のために、下記のように、結合体を１リットルスケールでDH5α E. coli株において発現させ精製した。50mlの一晩予備培養物(LB培地，100μg/mlアンピシリン，１％グルコース，37℃)を使用して、１リットルの培養物(2YT，100μg/mlアンピシリン，37℃)に接種した。OD₆₀₀=1.0で0.5mMのIPTGの添加により発現を誘導し、培養物を30℃にて19時間インキュベートした(250rpm)。細胞を遠心分離により採集し、25mMイミダゾールを含む30℃の30ml TBS(pH7.4)中に再懸濁した。細胞をAvestin Emulsiflexホモジナイザーで溶解させ、遠心分離工程で細胞砕片を破棄した。25mMイミダゾールを含むTBS(pH7.4)で平衡化した５mlのHiTrapキレート化カラムでタンパク質を精製した。TBS(pH7.4)及び250mMイミダゾールで溶出を行った。HBS(pH7.0)(20mM HEPES，150mM NaCl)で平衡化したSuperdex 75 26/60ゲル濾過カラム(GE Healthcare)でのサイズ排除クロマトグラフィーによりタンパク質を更に精製した。HBS(pH7.0)(60μl/分，50μlの注入サンプル)で平衡化したSuperdex 75 3.2/20カラムを用いるSMARTシステム(GE Healthcare)で分析ゲル濾過を行った。BPTI(6.5kDa)、リボヌクレアーゼＡ(14.6kDa)、キモトリプシノゲンＡ(20.3kDa)、オボアルブミン(46.7kDa)及びアルブミン(62.9kDa)を分子量ゲル濾過較正標準として使用した。

【0042】

表面プラズモン共鳴
BIAcore 2000装置を用いて25℃にてSPRを測定した。リボソームディスプレイによる選択用と同様にビオチン化PulDを調製し、SA-チップのフローセルに固定化した。動力学的測定用及び阻害測定用の固定ビオチン化PulD-Nの密度はそれぞれ200RU及び800RU(飽和チップ)であった。ランニング緩衝液はHBST(pH7.0)(20mM HEPES，150mM NaCl，0.05％Tween 20)であった。
60μl/分の流速での動力学測定用注入の前にランニング緩衝液に1/20希釈したマイクロIMAC精製タンパク質(上記参照)を用いて解離速度による結合体のスクリーニング及びランキングを行った。

【0043】

親和性決定のための動力学測定は、１nM〜50nMの範囲の濃度で注入したサイズ排除精製タンパク質で行った。阻害測定は、５nMの結合体濃度及び競合物としてのPulD-Nの0.2nM〜20nMの範囲の種々の濃度で、25μl/分の流速にてOstermeierら(1995)に記載のように行った。結合相に関してセンサーグラムの傾斜を決定し、PulD-Nの濃度に対してプロットした。データ評価はBIAevalソフトウェア(BIAcore)を用いて行った。

【0044】

マイクロ熱量測定
以前(Hibleら，2005)に記載されたようにMicroCal VP-DSC熱量計で示差走査熱量測定を行った。組換え野生型及び変形体Sac7dのストック溶液を50mM MES緩衝液(pH5.6，300mM NaCl)に対して一晩４℃にて透析した。次いで、タンパク質サンプルを同じ緩衝液調製物中に200μg/mlに希釈し、真空下に10分間穏やかに撹拌しながら脱気した後、熱量計セル(0.5ml)中にロードした。参照セルには同じ緩衝液を満たした。130℃まで気泡形成及び蒸発を回避するためにサンプルをインサイチュで25psiの一定の外圧下に保持し、25℃にて25分間平衡化し、１度/分の一定加熱速度で加熱し、16秒のフィルターでデータを収集した。データ分析は、製造業者が提供するOrigin7^TMソフトウェア(Plotnikovら，1997)で行った。熱容量関数から２つのベースライン(緩衝液参照サーモグラム及び算出化学ベースライン(アンフォールディング転位(unfolding transition)の進行から濃度に対して規格化した後に計算される))を引くことにより過剰熱容量関数(C_p,excess)が得られた。各タンパク質サンプルのアンフォールディング転位の熱力学的パラメータは、非二状態モデルを仮定した過剰熱容量曲線の非線形３パラメータ(Tm，ΔH_cal，ΔH_vH)回帰の結果である。

【0045】

アルカリホスファターゼ融合体の構築
プライマーSCPhoAF(配列番号26：ATTAATGGTACCGGATCCGTGAAGGTGAAATTC)及びSCPhoAR(配列番号27：ATAATTGAGCTCTAAGCTTTTTTTCACGCTCCGCAC)、並びにPhusionポリメラーゼを用いて、結合体をコードする遺伝子をPCR増幅して、５'-及び３'-末端にそれぞれKpnI及びSacIを導入した。PCR産物をKpnI及びSacIで消化し、pQUANTagenベクター(Qbiogene)中にクローニングした。こうして、アルカリホスファターゼを結合体のＣ末端に融合させた。DH5α E. coli株及び製造業者マニュアルの指示を使用して、アルカリホスファターゼ活性クローンのスクリーニング及びペリプラズマ抽出(periplasmic extraction)を行った。簡潔には、ポジティブクローンをLBプレート(100μg/mlアンピシリン，４μg/mlの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-ホスフェート)上でアルカリホスフェート活性についてスクリーニングした。８mlの一晩予備培養物(LB培地，100μg/mlアンピシリン，37℃)を用いて400ml(2YT培地，100μg/mlアンピシリン，１ｇのリン酸二カリウム(pH7.5)，37℃)の培養物に接種した。OD₆₀₀が約0.7になったときに0.5mM IPTGの添加によりtacプロモーターの誘導を行い、増殖を30℃にて４時間継続させた。細胞を遠心分離によりペレット化し、40mlのTSE緩衝液(30mM Tris-HCl(pH8.0)，スクロース20％，0.5mM EDTA，0.1mg/mlリゾチーム)に再懸濁した。穏やかに撹拌しながら４℃にて20分間の懸濁物のインキュベーションによりリゾチームショック(lysozymic shock)を行った。４℃にて20000ｇで30分間の遠心分離により細胞砕片を廃棄し、上清を0.45μm膜で濾過した後、−20℃で保存した。

【0046】

アルカリホスファターゼ融合体を用いるウェスタンブロット
発現ベクターを含まないDH5α E. coli株の10ml一晩培養物(LB培地，37℃)を遠心分離して細胞をペレット化した。細胞ペレットを１ml TBS(１×BugBuster及び１μl Benzonase)中に再懸濁した。細胞溶解を室温にて30分間生じさせ、懸濁物を20000ｇにて５分間遠心分離して細胞砕片を除去した。次いで、上清を精製PulD-Nの系列希釈に使用した。サンプルは、定量の上清と、５μlのサンプルをSDSゲル上にロードしたとき0.4ng〜400ng PulD-Nに対応する可変量の精製PulD-Nとで調製した。移動後、タンパク質をSDSゲルからニトロセルロース膜(Hybond-C extra，0.45μm，General Electric)に移した。膜をTBST(20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.5，0.1％Tween 20)中５％の粉乳でブロックした。次いで、膜を、TBST乳中に１〜15倍希釈した融合体の可溶性ペリプラズマ抽出物と共に、１時間穏やかに撹拌しながらインキュベートした。膜を洗浄後、反応緩衝液(100mM Tris-HCl pH9.5，100mM NaCl，５mM MgCl₂)中に希釈した沈降基質NBT/BCIP(AP接合基質キット，Biorad)で検出を行った。

【0047】

GFP(緑色蛍光タンパク質)融合体の構築及び発現
結合体をコードする遺伝子を、eGFPの遺伝子及び可撓性ペプチドリンカーKLGSAGSAAGSGEF(配列番号32)をコードする領域を含有するpQE30由来プラスミド(pFP3000)中に、BamHI及びHindIII部位を介してクローニングした。これは、Ｎ末端にMRGS(His)₆タグを有するN-ter-結合体-リンカー-eGFP-C-ter融合体を生じた。個々のクローンの配列は、DNA配列決定により検証した。
結合体-GFP融合体の発現及び精製は、結合体単独についてと同じ条件下で(すなわち、IMAC及びサイズ排除クロマトグラフィー工程を用いて)行った。

【0048】

膜画分の単離及び40-eGFPキメラを用いる相互作用研究
プラスミドpCHAP3671(pulD)及びpCHAP580(pulS)(Guilvoutら，1999)又はプラスミドpCHAP3711(pulD-CS)(Guilvoutら，2006)及びpCHAP580を有するE. coli K-12株PAP105(Guilvoutら，1999)を、膜ベシクルの単離に使用した。培養物を、適切な抗生物質(100μg/mlアンピシリン，25μg/mlクロラムフェニコール)を含むLB培地(Miller，1992)中、30℃にて激しく撹拌しながら、対数増殖相(OD₆₀₀：0.9〜1.1)まで増殖させた。細胞のフレンチプレス破壊(French press desintegration)後に膜画分を遠心分離(180,000×ｇ、30分間)により単離し、Tris 50mM pH7.5、NaCl 150mM中に450μg/mlの最終濃度で再溶解した。

【0049】

異なる量の膜ベシクルを70pmolの精製40-eGFP融合タンパク質と共に室温にて１時間インキュベートした。遠心分離(80,000×ｇ、20分間)後、ペレットを同じ緩衝液で洗浄し、再び遠心分離し、同じ量に再懸濁した。各サンプル中のタンパク質をSDS-PAGEにより分離し、ニトロセルロース上に移した。40-eGFP融合タンパク質の検出は、GFP一次抗体を用いるイムノブロッティングにより行った。

【0050】

固定化クローン６結合体を用いるアフィニティークロマトグラフィー
17mgのIMAC精製クローン６を0.2M炭酸緩衝液(pH8.3)(0.5M NaCl)に対して透析し、事前に６mlの１mM HClをフラッシュした１ml HiTrapNHS活性化HPカラム(General Electric)に注入した。固定化は室温にて30分間生じさせた。カラムを洗浄し、0.5Mエタノールアミン(0.5M NaCl，pH8.3)及び0.1Mアセテート(0.5M NaCl，pH8.3)で室温にて30分間残存する活性基を不活化させた後、カラムをTBS(pH8.0)(20mM Tris，500mM NaCl)で平衡化させ、精製に使用する準備を整えた。

【0051】

PulD-Nタンパク質は、プラスミドpCHAP3702(Chamiら，2005)で形質転換させたBL21(DE3)E. coli株を用いて発現させた。50mlの一晩予備培養物(LB培地，100μg/mlアンピシリン，1％グルコース，37℃)を使用して１l培養物(2YT，100μg/mlアンピシリン，37℃)に接種した。発現はOD₆₀₀=1.0の時に1.0mM IPTGの添加により誘導し、培養物を30℃にて４時間インキュベートした(250rpm)。細胞を遠心分離により採集し、30ml TBS pH8.0中に再懸濁した。細胞をAvestin Emulsiflexホモジナイザーで溶解させ、細胞砕片を遠心分離工程で廃棄した。1.5mlのこの可溶性画分をNHS-クローン６固定化カラムに流量0.5ml/分で注入した。非特異的タンパク質を40mlのランニング緩衝液で洗い流し、100mMグリシン緩衝液(pH2.5，250mM NaCl)を用いる酸性pHジャンプでPulD-Nを溶出させた。溶出タンパク質の純度は、画分をSDSゲル上にロードすることにより検証した。

【0052】

ファーウェスタンブロッティング
PulS(pCHAP580；Daeflerら，1997)とPulD(pCHAP3671；Guilvoutら，1999)又はPulD-CS(pCHAP3711；Guilvoutら，2006)とを含む/含まないE. coli PAP105の外膜を、前述のように調製した。膜を、10％スクロース及び0.1mg/mlのプロテアーゼインヒビターPefabloc(Interchim，Montlucon，France)を含む50 mM Tris-HCl(pH7.5)中に再懸濁して貯蔵し、SDS/PAGEに供し、ニトロセルロースシートに移した。このシートを次いでブロックし、Sac7-PhoAキメラ産生株のペリプラズマ(浸透圧ショック)抽出物と共にインキュベートした。洗浄後、結合PhoAをPhoAに対する抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼカップリング二次抗体及び化学発光により検出した。

【0053】

分泌
PAP7232株(Hardieら，1996)を空のベクター又はSac7-PhoAキメラをコードするプラスミドで形質転換した。この形質転換体を、0.4％マルトース(プルラナーゼの産生及びその分泌系(PulDを含む)を誘導するため)及び１mM IPTGを含有する培地中で増殖させてSac7-PhoA産生を誘導した。分泌レベルは、d'Enfertら(1989)に記載のように測定し、溶解細胞中で検出された酵素活性量(100％)と比較した全細胞中で検出された酵素活性量として表す。細胞抽出物もまた、PulD及びPhoAに対する抗体を用いるイムノブロッティングにより調べた。

【0054】

PulD産生のより高い(プラスミドがコードする)レベルでのSac7-PhoAキメラの効果を分析するために、ゼオシン耐性遺伝子を側方のPstI部位と共に増幅し、対応するプラスミドのblaM遺伝子の独特なPstI部位中に挿入した。次いで、この組換えプラスミドをpCHAP231(d'Enfertら，1987)と一緒にエンベローププロテアーゼ欠損株PAP5198(degP，ompT，ptr)中に形質転換した。プルラナーゼ分泌及びPulDレベル(フェノールでの前処理あり又はなし)を、IPTGによる誘導あり又はなしで、上記のように分析した。

【0055】

結果
実施例１：第１世代ライブラリ(ライブラリ11)の設計
種々のリガンドに対する結合体を得るための足場としてのSac7dの使用可能性を調べるための第１の重要な工程は、親のSac7dタンパク質の安定性及び溶解性を維持しながら、潜在的結合性領域のランダム化によりライブラリを設計することであった。

【0056】

Sac7d-DNA複合体の幾つかの三次元構造は公知である(Agbackら，1998；Edmondson及びShriver，2001；Gaoら，1998；McAfeeら，1995；McCraryら，1996；Robinsonら，1998；Suら，2000)(図1a)。これら構造によれば、DNAの小さな溝へのSac7dの結合には、DNAと顕著に(形状及び電荷が)一致する結合表面領域が関与している。この結合領域は、16残基(K7、Y8、K9、K21、K22、W24、V26、K28、M29、S31、T33、K39、T40、R42、A44、S46)から構成される(図1b)。この結合領域の視覚的検査により、それがねじれていること及び２種類の幾何学形状(geometry)を含んでなることが示される：一方は少し凹面であり(K7、Y8、K9、W24、V26、K28、M29、S31、T33、R42、A44、S46)、他方は本質的に平面である(K21、K22、W24、T33、K39、T40、R42)。残基W24、T33及びR42はこれら２つの面により共有されている。Sac7dの配列の約1/4がDNAの結合に貢献する。これら残基の全てが面上に露出しているが、Sac7dの配列の25％の大規模ランダム変異誘発は、得られる変異体のフォールディング及び安定性に関して劇的であり得る。第１の工程で、本発明者らは、変異誘発スキームからK28及びK39を排除することを決めた。なぜならば、これら２つの残基は結合表面へ向いて十分に配向していないからである。それらを排除した第２の理由は、下記のような一工程PCRによるライブラリの生成がプライマーアニーリング(下記参照)に利用可能なオーバーラップの減少に起因して不可能であったことであった。また、結合領域の凹面側の幾何学形状は球状タンパク質の球形と良好に一致しているか、又は少なくとも露出ループの結合に適合しているであろうと推論された。よって、置換ストラテジーは、Sac7dのこの領域中の11残基(K7、Y8、K9、W24、V26、M29、S31、T33、R42、A44、S46)に絞った。

【0057】

Sac7dをコードする遺伝子はかなり短い(約200塩基対)。よって、11残基のランダム置換に対応するライブラリは、一工程PCRによって得ることができた。これは、３つの縮重オリゴヌクレオチド(NNSスキーム)と３つの標準オリゴヌクレオチドとの混合物を用いて行った。ランダム化した位置のコドンを、全てのアミノ酸表現を可能にするNNSトリプレットによりコードした。この変異誘発ストラテジーにより、理論的な多様性は約3.2 10¹⁶(32¹¹)であり、これは本発明者らのライブラリの実験的に達成した多様性より程度が約４オーダー勝っている。確かに、リボソームディスプレイ構築物を生成するために使用したPCRアセンブリ産物の量によれば、ライブラリの上限予測値は約3.0 10¹²変形体であった。40のランダムクローンの配列決定により、観察された残基頻度は予想されたものと類似していることが確証された(データは示さず)。正確なクローン(フレームシフトも欠失もない)のパーセンテージは、ほぼ50％であることが分かった。よって、「機能的」多様性は申し分ないと考え、このライブラリを選択に使用した。

【0058】

実施例２：ライブラリ11を使用したリボソームディスプレイ選択
３つのタンパク質を標的として選んだ：DnaK、GarA(共に、Mycobacterium tuberculosis由来)及びPulD(Klebsiella oxytoca由来)のＮ末端ドメイン。PulDは、イオン性界面活性剤なしでは溶液状態に維持することができない外膜タンパク質である。したがって、可溶性単量体フラグメントを使用した。このフラグメント(PulD-Nと名付ける)は、PulDのＮ末端領域に相当する。特異的で貪欲(avid)な結合体はDnaK、GarA及びPulDを研究するための有用なツールとなり得るのでこれら標的を選択した。更に、これらタンパク質は、構造研究のために結晶化するのが困難である。これらタンパク質を認識する結合体は、抗体フラグメントと同じ方法で共結晶化(co-crystallization)試行に使用し得る(Ostermeierら，1995)。

【0059】

ニュートラビジンを被覆したELISAプレートを使用して、ビオチン化タンパク質を固定化し、選択を実行した。４回の選択ラウンド後、３つ全ての標的について特異的結合体の富化が観察された(図6a)。全ての場合で、RIAによれば、プールの結合の50％より多くが10Ｍの遊離標的で阻害された。

【0060】

PulD-Nでの選択について結合体のプールをELISAにより更に評価するために、選択したプールからのRT-PCR産物を、BamHI及びHindIII制限部位を用いてpQE30ベクター(Qiagen)中にクローニングした。得られる結紮物(ligation)を使用してE. coli DH5α株を形質転換させた。96のランダムなクローンをペトリ皿から取り、１ウェルあたり1.5mlのLB培地(100μg/mlアンピシリン，１％グルコース)を含むディープウェルプレートに接種した。250rpmで振盪させながら37℃にて一晩培養後、このマスターウェルプレートの0.2mlの各ウェルを使用して、１ウェルあたり1.3mlの2YT培地(100μg/mlアンピシリン)を含む他のディープウェルプレートに接種した。次いで、このプレートを振盪(250rpm)させながら37℃にて１時間インキュベートした。発現は、0.5mM IPTGの添加及び振盪(250rpm)させながら30℃にて４時間のインキュベーションで誘導した。細胞を遠心分離工程(2250ｇ)でペレット化し、上清を廃棄した。タンパク質を、250rpmで30分間振盪させながら、１ウェルあたり50μlのBugBuster(Novagen)で抽出し、次いで250μlのTBS(pH7.4)(20mM Tris-HCl，150mM NaCl)を加えた。細胞砕片を遠心分離工程(2500ｇ)でペレット化した。ELISAスクリーニングのために、100μlの各上清を使用して、PulD-N又はBSAを被覆したMaxisorpプレートに対する結合を試験した。検出は、結合体由来のRGS-(His)₆-タグのみを検出し、標的タンパク質由来の(His)₆-タグを検出しないRGS His抗体HRP接合体(Qiagen)及びRoche社のBM-Blue基質を用いて行った。全てのインキュベーション工程を、0.1％Tween 20を含むTBS(pH7.4)中で行った。

【0061】

全てのクローンについて、340nmでのODをPulD-N結合及びBSA結合について測定した。PulD-Nについて得られる値に対するBSA結合について得られる値の比を各クローンについて算出した。10を超えるＳ/Ｎ比がラウンド４からの約92％のクローンについて観察された(図6b)。PulD-N選択(ラウンド４)からの６つの精製クローンの結合をDnaK、GarA、PulD-N及びBSAについてELISAにより試験した。図6cに示されるように、結合はPulD-Nについて特異的であった。ラウンド４からの28クローンの配列決定により配列の高度な多様性が明らかとなった；確かに、１回より多く見出された配列はなかった。このことは、より高い選択圧を使用できたことを示している。更に、野生型残基は、全11のランダム化位置のいずれにも見出されなかった(データは示さず)。９つのクローンのIMAC(固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー)精製後に見積もられた発現の平均収率は、約70mg/リットルフラスコ培養物(30℃にて４時間の誘導)であった。結合体は少なくとも45mg/mlまで濃縮できた。これら観察により、全般的に、Sac7dの結合領域が置換に対して高度に寛容であること、及び選択した変形体が満足できる生物物理学的特性を保持していることが示唆された。しかし、RIAによるより詳細な分析によって、ラウンド４からのプール中の結合体に対する平均親和性はほぼ100nMであり、マイルドな(２時間)又はよりストリンジェントな(17時間)解離速度選択で行った５番目のラウンドは、抗PulD-Nプールの平均親和性を増大させることに失敗した(図7)。このような低い親和性は、低いナノモル解離定数を必要とする適用に関して制限的である。よって、本発明者らは、より高い親和性を得るために他のアプローチを探索することを決定した

【0062】

実施例３：第２世代ライブラリ(ライブラリ13及び14)の設計
親和性を改善する直感的方法は、結合領域を拡張すること、よって結合体とそのリガンドとの間の相互作用の可能な数を増大させることである。11残基のランダム化に対応する可能な結合領域は、890Ųの溶媒接近可能面を有していた。Sac7dは11置換に対して非常に寛容であるので、２又は３の更なる位置(K21及びK22(ライブラリ13)又はK21、K22及びT40(ライブラリ14)、それぞれ1130Ų及び1200Ųに対応)をランダム化することを決定した。別の説明は、凹面結合性領域はタンパク質との結合に良好に適合しておらず、よってより平坦な面の使用が最終的な親和性を改善することができるというものであり得る。これら２つの新たなライブラリ(各々3.0 10¹²変形体)をライブラリ11と同様に構築した。ライブラリ14からの70のランダムクローンの配列決定により、観察された残基頻度は予想された頻度に類似するが、S、L及びRアミノ酸残基の提示は僅かに低い一方、P、N、Q及びHアミノ酸残基の提示は少し多いことが確証された(データは示さず)。正確なクローン(フレームシフトも欠失もない)のパーセンテージは、ほぼ65％であることが分かった。よって、「機能的」多様性は申し分ないと考え、このライブラリを選択に使用した。

【0063】

実施例４：ライブラリ13及び14を使用し、標的タンパク質としてPulD-Nを用いたリボソームディスプレイ選択
４回の選択ラウンドを、これらライブラリ及び標的タンパク質としてのPulD-Nを用いて行った。より遅い解離速度を有する結合体についてプールを富化するために、５番目のラウンドを、２時間のマイルドな解離速度選択でライブラリ11、13、14を用いて並行して行った。５番目のラウンド後のプールについてのラジオイムノアッセイ(図７)は、２つの新たなライブラリを用いた特異的PulD-N結合体についての富化を示した。結合は、固定化BSA又はニュートラビジン上では検出することができなかった。更に、このRIAにより、10nMの遊離PulD-Nは、ライブラリ13との結合シグナルの約50％を阻害するに十分であるのに対し、ライブラリ11については100nMのPulD-Nが同レベルで阻害したことが示された。１nMの競合物が結合シグナルの約20％の顕著な阻害を達成するに十分であったので、ライブラリ14は尚更良好に挙動した。よって、ライブラリ14に使用した設計により、平均親和性について程度が少なくとも１オーダー増した。

【0064】

実施例５：ライブラリ14からの抗-PulD-N結合体の特徴付け
5.1．選択した結合体の配列分析、発現及び精製
最も見込みのある親和性はライブラリ14(ラウンド５)から得たプール中で見出すことができたので、このライブラリからの結合体のプールを分析した。富化したプールを発現プラスミドpQE30中にクローニングし、タンパク質産生にE. coli株DH5αを使用した。48の個々のクローンを、固定化PulD-N又はBSA及びE. coli粗抽出物を用いるELISA手順によりアッセイした。全てのクローンについて、バックグランドに対して顕著で特異的な結合が検出された。よって、更なる分析のために全ての結合体を配列決定した。

【0065】

ライブラリ11について観察されたように、結合体の大きな多様性が５番目の選択ラウンド後でさえも維持されていた(図８)。しかし、クローンのほとんどは、相同性により６つのファミリーに分類することができた(データは示さず)。加えて、２つの全く同一のクローンが２つの場合で見出され、他の全てのクローンは独特であった。このことは選択収斂(selection convergence)を示唆する。ランダム化した位置に見出される残基は、脂肪族側鎖を有するものや芳香族側鎖を有するもの、荷電側鎖又は親水性側鎖を有するものなど、性質が非常に異なっていた。特定残基に対する明白な嗜好性を幾つかの位置で観察することができた。例えば、R42位はクローンの約半分でチロシンが占めていた。これは、おそらく、PulD-Nの結合についてのその重要性を反映している。全てのプログラムされた変異の中で、天然型残基の厳格な保存は見出せなかった(ライブラリ11と比較して新たに標的とされた３つの位置(K21、K22及びT40)も含む)。最後に、配列決定された40クローンにおいて、560残基(40×14)のうち僅かに７つの天然型残基が維持されていた。よって、これら観察は、標的とされた14位置が全てランダム置換に寛容であることを示唆している。

【0066】

結合体は、30℃にて一晩の増殖後にE. coli細胞質に大量に蓄積され、単一工程IMACで均質まで精製することができ、収量は１リットルの振盪フラスコ培養物から上限200mgであった(図９)。タンパク質は、15％アクリルアミドSDS-PAGEゲル上で、計算された分子量について予測される位置に泳動した。精製結合体は、沈澱の徴候なく標準TBS緩衝液中60mg/mlまで濃縮することができ、４℃にて数ヶ月にわたって可溶性を維持することができた。

【0067】

サイズ排除クロマトグラフィーにより、調べたクローン６、39、40及び41結合体は単量体であることが示された。Sac7dと同様に、全ての結合体が、おそらく９残基のＮ末端タグの存在により生じる真球形状からの逸脱に起因して、このアッセイでは、予測値より大きいようであった(測定値11.5kDaに対して、計算値9.1kDa)。

【0068】

5.2．PulD-N結合体の親和性
最も高い親和性を有するクローンを同定するために、微量発現及びIMAC精製に48のクローンを使用した。次いで、これら精製したタンパク質を、ストレプトアビジン被覆チップ上で固定化ビオチン化PulD-Nを用いるSPRによりスクリーニングした。全てのアッセイした結合体について、ストレプトアビジンのみを被覆したブランク面上では有意な結合は観察されなかった。このことは、結合がPulD-Nについて特異的であるという考えを支持している。解離相の分析に従って、SPRによる一価タンパク質の詳細な親和性決定のために、最も遅い解離速度を有する５つのクローンを選択した。

【0069】

これら５つのクローン６、33、39、40及び41をゲル濾過により更に精製した。動力学的分析を異なる濃度で行い、動力学的グローバルフィッティングを用いて分析した。全てのPulD-N結合体の解離定数は、ピコモル又は低ナノモル範囲であることが分かった(図10a及び表３)。クローン６及び33は最も高い親和性を有していた(それぞれ、K_D=130pM及び190pM)。高イオン強度条件(300mM NaCl)下で、会合動力学はわずかに減少していた(ファクター1.3)。このことは、これら会合が静電気学的な助力を受けていないことを示す(データは示さず)。これら５つの結合体のK_D値を、競合SPR分析(Niebaら，1996)により確証した(図10b及び表３)。コントロール実験により、野生型Sac7dを固定化PulD-Nへの結合について試験したときには結合が生じないことが示された。このことは、選択したクローンについて観察された結合特性が新たに導入した機能の結果であり、PulD-NについてのSac7dの既存の親和性の結果でないことを示している。

【0070】

【表3】

【0071】

これら結合体の配列分析により、異なる状況(図８)が明らかにされた。それぞれのK_D値は同じ範囲(130〜140pM)にあるという事実にもかかわらず、クローン６及び33におけるランダム化位置は異なっていた。これに対し、クローン40は11/14のランダム化残基をクローン41と共通して有しており、類似のK_D値(およそ１nM)を有していた。クローン39は10/14のランダム化残基をクローン６と共有しているが、1/7の親和性を有していた。興味深いことに、クローン39はＣ末端部で４残基ほど切り取られているが、PulD-Nと結合可能のままであることが分かった。このことは、幾つかの短縮形態のSac7dも存在する(McAfeeら，1995)ことから、驚くべきことではない。

【0072】

5.3．PulD-N結合体の安定性
Sac7dは、pH7.0にて91℃のT_mでアンフォールディングする超熱安定性タンパク質であり、このタンパク質の熱的安定性はより低いpHで減少する(McCraryら，1996)。示差走査熱量測定によりクローン６、33及び40の熱的安定性を野生型Sac7dの熱的安定性と比較した。DSCの上限温度(125℃)より低い温度でのこのタンパク質の完全なアンフォールディングを保証するために、全てのスキャンにpH5.6を使用した。68℃〜83℃に変性温度を有する熱的に安定であるクローンを見出した(図11及び表４)。クローン40は著しく安定であり、野生型(89.7℃)のものよりわずか5.8℃低いT_m値を有していた。次にクローン33(ΔT_m = -10.5℃)が続き、最も安定性が低いクローンはクローン６(ΔT_m = -22.0℃)であった。しかし、クローン６のT_mは、依然として、Protein Data Bankのタンパク質の平均T_m値(Freire，2001)より８℃上回っている。DSCスキャンは、高い変異負荷(14残基までの変異、すなわちSac7dの21％までの変異)を有するにもかかわらず、Sac7d変形体が野生型と同様なフォールディングした構造を採用することができたことを示す協調的アンフォールディング(cooperative unfolding)の特徴を示していた。熱量エンタルピー(１モルあたりの熱変化、ΔH_cal)は、クローン40及びクローン33について、野生型(42.5kcal.mol^-1)に対してそれぞれ僅か5.8及び4.8kcal.mol-1低かった(表４)。更に、両クローン40及びクローン33について、ファント・ホフエンタルピー(協調的アンフォールディング単位あたりの熱変化)対熱量エンタルピーの比値βは１に近く、野生型Sac7dのβ値に近かった。この観察は、クローン40及びクローン33のアンフォールディングがフォールディングしたタンパク質単量体のアンフォールディングに相当することを強く示した(表４)。クローン６は、野生型より(18.10kcal.mol^-1)低い熱量エンタルピー及び高いβ比を示した(表４)。これら観察は、当該タンパク質がさほど安定でない(クローン６のT_mはpH７で８℃高い；データは示さず)酸性pHでのクローン６タンパク質の部分的なアンフォールディングに関連しているかもしれない。まとめると、これら観察により、クローン６、33及び40は野生型タンパク質の好適な熱的安定性を大体保持していたことが示される。

【0073】

【表4】

【0074】

5.4．PulD-N結合体の特異性
これらPulD-N結合体はどのように特異的か、そして特異性が重要である生物工学的適用に使用できるか？
これら質問に答えるため、結合体６、33及び40を、E. coliアルカリホスファターゼ(PhoA)のＮ末端に融合させた。このキメラ(Sac7^*-PhoA)を、PhoAシグナルペプチドをコードするpQUANTagenベクターを使用してDH5α株中にペリプラズマタンパク質として産生した。次いで、浸透圧ショックにより、このキメラをペリプラズマから抽出し、それらの官能性をPulD-N-又はBSA-被覆ウェルを用いるELISAによってアッセイした。結合した融合体を色素形成性ｐ-ニトロフェニルホスフェート基質及び分光測光法により定量した(データは示さず)。３つ全てのキメラについてバックグランドに対して高いシグナルを観察した(比シグナル/バックグラウンド＞10)。このことは、キメラが１)ペリプラズマに輸送され、２)依然としてPulD-Nを特異的に認識でき、３)触媒活性であることを示した。よって、これら融合体は、単一工程のELISA検出試薬として使用し得る。

【0075】

これら融合体が複雑なタンパク質混合物(例えばE. coli粗抽出物)中でPulD-Nタンパク質を識別することができるかを評価するために、本発明者らはそれらをイムノブロットの検出試薬として使用した。この実験では、プラスミド-フリーDH5αの一晩培養物を採集し、溶解させた。粗抽出物をアリコートにし、漸減量の精製PulD-Nを各試験管に加えた。SDS-PAGE及びニトロセルロース膜への転移後、1.5〜３ng程度の低量の沈降性色素形成性基質(NBT/BCIP)の存在下で結合体-PhoAキメラを用いて、PulD-Nを交差反応性なしで検出した(図12a)。このことは、ELISAを用いて観察された融合体の二重官能性を支持した(図12a)。より遥かに高い量の内因性タンパク質が存在していたにもかかわらず、低量のPulD-Nの検出ができた。このことは、結合体６、33及び40は多くのタンパク質の中からPulD-Nを識別することができ、したがって高度に特異的であることを証明している。

【0076】

更に特異性を評価するために、結合体６を１ミリリットルNHS-アガロース活性化カラム上にアミンカップリング反応により共有結合的に固定化した。次いで、40mlのPulD-N産生培養物に対応するE. coli粗抽出物の可溶性画分をカラムに注入した。ローディング、洗浄及び溶出(酸pHジャンプ)工程の間に画分を収集した。これら画分のSDS-PAGE分析は、このカラムは粗抽出物中に存在するPulD-Nを捕捉することができること及び染色されたSDS-PAGEゲル上の唯一の可視バンドがPulD-Nに対応するので、これは高い特異性で起こったことを示した(図12b)。よって、多くのタンパク質の中からPulD-Nを識別する結合体の能力が再度確証された。

【0077】

実施例６：十二量体PulDへのPulD-N結合体の結合
次に、本発明者らは、PulD-Nに対して最高の親和性を有する３つの選択したSac7d誘導体(結合体６、33及び40)がE. coli外膜に組み込まれた完全長PulDタンパク質を認識することができるかを調べた。完全長PulDは外膜中で十二量体を形成し(一方、PulD-Nは単量体である)(Chamiら，2005)、結合体の各々により認識されるエピトープがPulDの多量体化により影響され、よって天然型PulDへの結合が妨げられることを排除できない。漸増量のE. coli PAP105(pCHAP3671 pCHAP580)由来のPulD含有膜を飽和量のGFP-タグ化結合体40又は33と混合すると、遠心分離後のペレット中に残存する結合体の量は対応して増加した(図13A)。GFP-タグ化結合体は、Ｎ-ドメインを欠いているPulD変形体を含有するPAP105(pCHAP3711 pCHAP580)(Guilvoutら，2006)由来の膜で沈澱しなかった(図13A)。よって、これらGFP-結合体キメラの膜への結合は、PulD-N-特異的であり、それらは、GFPタグの存在にもかかわらず、天然型の十二量体セクレチン複合体に結合する。結合体６はPulD含有膜に非常に弱く結合しただけであった(データは示さず)。

【0078】

ファーウェスタンイムノブロットを使用して、PulD十二量体へのSac7d誘導体の結合を検証した。３つ全てのSac7^*-PhoAキメラは単量体及び十二量体のPulDの両方に特異的に結合したが、PulD-CSには結合しなかった(図13B)。これら３つのキメラは、フェノール解離(単量体；Hardieら，1996を参照)PulDに等しく良好に結合したが(データは示さず)、一貫して、十二量体PulDに対して異なる見かけの親和性(高い(結合体40)から低い(結合体６)までの範囲)を示した。

【0079】

実施例７：PulD-N結合体はプルラナーゼ分泌を阻害し、PulD多量体化を妨げる
Sac7^*-PhoAキメラ(Sac7d又はその誘導体がPhoAシグナルペプチドとPhoAの触媒部分との間に挟まれている)は、高いPhoA活性及びペリプラズマショックに際しての遊離によりモニターされるように、ペリプラズマに効率的に輸出された。Sac7^*-PhoAキメラをコードするプラスミドをE. coli株PAP7232(pul遺伝子が染色体に組み込まれている)中に形質転換した。３つ全てのキメラはIPTG誘導後に類似する量で産生され、プルラナーゼ分泌を完全に阻害した一方、輸出されたSac7d-PhoAは効果がなかった。更に、PulD十二量体も単量体も、いずれかのSac7^*-PhoAキメラを産生する株において検出されなかった(データは示さず)。これら現象についてのより正確な情報を得るため及びキメラを産生する株におけるPulDの運命を調べるために、pCHAP231(T2SS産生を増大させるため；Guilvoutら，2006を参照)を有するエンベローププロテアーゼ欠損株PAP5198で３つのキメラを産生させた。Sac7^*-PhoA産生のIPTG誘導レベルは、プルラナーゼ分泌を＞90％阻害した(図14A)。キメラを有さない又はSac7d-PhoAを有するコントロール中より、十二量体のPulDは豊富ではなく、PulD単量体は対応して豊富であった(図14B中矢印)。このことは、キメラがPulDの多量体化を妨げ、エンベローププロテアーゼによるPulD単量体分解を引き起こすことを証明する。類似の結果が非誘導レベルのSac7^*33-PhoA及びSac7^*40-PhoAを用いて得られたが、Sac7^*6-PhoAが非誘導レベルで存在するときには実質的なプルラナーゼ分泌(＞50％)及びPulDの多量体化が生じた(図14C)。

【0080】

実施例８：他の標的に結合するSac7d変形体の選択
最良のライブラリ(ライブラリ14)を使用して、上記と同じ技術を用いて他の標的に特異的な結合体を得た。
選択は、第５サイクルまでの以下のタンパク質に照準を定めた抗-タンパク質リボソームディスプレイにより行った：PulDN1(26.8kDa)、NGF(13kDa)、PknG(81,6kDa)、GarA(12kDa)及びリゾチーム(14.3kDa)。第４サイクルの間、選択プロセスは標的あり及びなしを並行して行った。図15は、４つの選択サイクル後、標的が存在するとき(「+」と印されたレーン)だけPCR産物が得られることを示す。このことは、選択プールが試験した標的の各々に特異的なクローンで富化されたことを示唆する。

【0081】

選択プロセスの成功を更に評価するため、競合ラジオイムノアッセイ(RIA)を、種々の阻害濃度の標的タンパク質を用いて行った。これらRIAは、抗-PknG、抗-リゾチーム及び抗-PulDN1選択についての顕著な富化が存在すること明白に示している。一方、NGF及びGarAの場合、結果は、選択が十分に集束していないことを示唆している。図16は、抗-PknG及び抗-リゾチーム変形体についての平均予想親和性が１〜10nMのオーダーであることを示している。

【0082】

第５サイクルで使用した抗-リゾチーム、抗-PknG及び抗-GarA選択プールは、96ウェルマイクロ培養物を調製し、30℃にて４時間IPTGでクローンの発現を誘導した後の細菌溶解上清を使用して、ELISA法に従ってスクリーニングした。図17に示す結果は、標的の各々に特異的なクローンが存在することを明白に示している。GarAについてのRIAは有望でないが、なおも有意な割合のポジティブクローンがELISA法で検出された。GarAに結合する特定クローンを単離し、配列決定した。図19は、この結合体の配列(GSVKVKFLYLGEEKEVDTSKIWFVMRAGKHVYFQYDDNGKYGIGWVREKDAPKELLDMLARAEREKKL、配列番号47)とSac7dとのアラインメントを示している。

【0083】

PknGに関しては、有意な割合のクローンがBSAに結合するようである。このことは、これらを排除するために追加の選択サイクルが必要であることを示唆している。抗-PulDN1及び抗-NGFスクリーニングを実施する。
96ウェルマイクロ培養物を調製することによりBiacoreで最良の予想親和性(長い複合体解離時間(k_off))について、ポジティブ抗-リゾチームクローンをスクリーニングして分類した。次いで、選択した24の最良クローンを配列決定した(図18)。何度も現れるので(或る位置について同じアミノ酸を異なるコドンによりコードするが)、優先的な配列(例えばLys_B11クローンの優先的配列)は明白である。第４サイクルのスクリーニングは、より大きな多様性を明らかにした(示さず)。

【0084】

異なる配列の３つのクローン(Lys_B3、Lys_H4及びLys_H8)をE. coliで産生し、IMACにより大規模に精製し、次いで分子篩に通した。得られた産生レベルはそれぞれ約120、40及び25mg/Ｌ培養物であった。Biacoreにより決定される親和性は、取得中及び処理中である。現在の(基礎)データは、15nM、３nM及び25nM(それぞれ、Lys_B3、Lys_H4及びLys_H8)のオーダーの親和性を示している。
３つの抗-リゾチームクローン(Lys_B3、Lys_H4及びLys_H8)は、溶液状態での熱安定性及び親和性を決定するために、微量熱量測定による特徴付けの最中である。
他の選択から得られたクローンもまた、Biacoreによりスクリーニングし、配列決定して、或るクローンの親和性をBiacoreによってより正確に決定する予定である。

【0085】

実施例９：ヒトIgG Fcフラグメントに結合するSac7d変形体の選択
9.1．Fc結合体の選択
スルホスクシンイミジル-６-(ビオチンアミド)ヘキサノエートを用いて、Bio-Radにより提供されたヒトIgG Fcフラグメント(MW = 50kDa)を化学的にビオチン化した。HABAアッセイにより決定したビオチン化の程度は、１タンパク質分子あたり約２〜３分子のビオチンであった。ビオチン化FcをMaxisorpプレート(Nunc)において固定化ニュートラビジン又はストレプトアビジンに結合し、リボソームディスプレイによる選択を、Sac7dに由来するライブラリ(上記のような)を用いて４℃にて行った。４回の選択ラウンドを行って結合体を単離した。ニュートラビジン及びストレプトアビジンを回毎に交互に使用して非特異結合体を回避した。

【0086】

9.2．選択配列のプールの評価
選択ラウンド後、RGS-His6-タグを有する配列(おそらく結合体)のプールを得た。このプールを、インビトロでE. coli S30抽出物を用いて翻訳し、その結合活性を、抗-RGS-His6-タグ-HRP接合体を用いるELISAにより試験した。この選択プールにおいて、受動的に固定化したFcフラグメントに対する結合活性が検出され、BSA、ニュートラビジン及びストレプトアビジンに対しては結合シグナルは観察されなかった(示さず)。この結果は、この結合体プールがおそらくFcフラグメントに特異的であること、及び結合活性に対するニュートラビジン又はストレプトアビジンの有意な寄与はないことを示唆している。

【0087】

この翻訳プールを用いても競合ELISAを行い、選択した結合体の平均親和性を大まかに評価した。この実験では、翻訳物を幾つかの濃度のFcフラグメントと共に予備インキュベートした後、Fcフラグメントを固定化したELISAプレート中でインキュベートした。図20に示すように、シグナルの20％及び70％がそれぞれ10nM及び100nM Fcで阻害できた。この結果は、予測された平均親和性がおよそ数十nMであることを示唆している。この範囲の親和性は、PulD-N選択について観察されたものと類似している。

【0088】

実施例10：技術の自動化
上記の技術の可能性を増大させるために、リボソームディスプレイ選択プロトコル(図21)を、後の、同時の及び迅速な、多数標的の検査用の自動化プラットフォームに移す(ライブラリ14を依然として用いるか、又は例えばSac7dとは異なるOB-フォールドタンパク質から出発する任意の他のライブラリを用いる)。

【0089】

この目的のために、Tecan Gemini 150ロボットを完全装備させる。このステーションは、幾つかの加熱/冷却/撹拌ブロック、電動の蓋を備えた自動化ステーション用MJ researchサーモサイクラー、反応セットアップ、RNA及びDNA清浄化を実施するため並びに核酸の濃度を測定するために必要な全ての付属装置(内蔵型マイクロプレートリーダーを有する)を含んでなる。ゴールは、手作業介入なしで１回の選択ラウンドを達成することである。サイクルの終時に多くのプラスチック製品を交換しなければならないので、手作業介入は選択ラウンド間でのみ必要となる。リボソームディスプレイによる手作業選択(図21)は、繰り返しが多く(結合体についての富化に５回必要)、細心の注意を要し(転写、翻訳、PCR、RT-PCRの多くの工程)、したがって２、３の標的について多大の時間を要するか、１人の実験者が４より多い標的を取り扱うことさえできない。よって、ロボットを用いて選択を実行する多大な実用上の利点が存在する。ロボットステーションでの選択プロトコル(PulD標的を用いる)の検証後、１又は２週間の時間スケールで、48までの標的に対して結合体を選択することが可能になる。

【0090】

考察
本発明者らは、進化が数百万年の間にOB-フォールドを用いて達成した事の潜在的利益を探索して、このフォールドを広範な種々のリガンド：金属イオン、糖、核酸(RNA、一本鎖及び二本鎖DNA)及びタンパク質に結合するように適合させた。本発明者らは、OB-フォールドファミリーのメンバーをインビトロ進化によりDNA認識からタンパク質認識へ変換させ得ることを示すことができた。このことにより、所与の標的に対する高親和性、高特異性結合体の生成に成功した。

【0091】

Sac7dライブラリの設計
OB-フォールド構造様式が二極化しているという観察は、全てのOB-フォールドタンパク質で結合面が常に同じである(Arcus，2002)ことを意味し、野生型タンパク質の好適な生物物理学的特性を保持するSac7d変形体のライブラリの設計を可能にした。異なるOB-フォールドタンパク質は、ループ１、３及び４の長さ(これはしばしばリガンド結合に関与する)に実質的なバリエーションを示すことがある(図1b及び２)。現在までに使用されるほとんどの足場は抗体中(Binzら，2005)と同様に可撓性ループのランダム化に基づくが、本発明者らは、天然型Sac7dタンパク質の元のループ長を維持することを決定した。本発明者らは、先ず、結合領域の僅かに窪んだ部分が標的として使用するタンパク質の球形状に最も適合すると推論した。しかし、上記のように、この領域の残基のランダム化によって、高ナノモルより良好な結合体を取得することはできなかった。この潜在的結合表面は約890Ųの溶媒接近可能面積に相当し、抗体-タンパク質会合についての代表的範囲内である(777±135Ų)(Jones及びThornton，1996)。よって、この面は、高親和性を有する単量体結合体を得るに足りる相互作用エネルギーを提供するに十分であるはずである。次いで、３つの更なる置換による潜在的結合領域の拡張を試験した。

【0092】

Sac7dライブラリを用いる選択
リボソームディスプレイを用いて、幾つかの異なる標的に対する結合体の選択を成功裡に行った。富化には５〜６回の選択ラウンドが必要となる(Hanesら，2000)完全に合成のナイーブscFvライブラリを用いる選択とは対照的に、Sac7dライブラリを用いると第３ラウンド後に既に有意な富化が観察された。このことは、抗体と比較して、より効率的なSac7dのフォールディングにより説明がつく。なぜならば、天然型状態に到達するためのジスルフィド結合形成も、機能的であるための２つの連結された構造ドメインの(scFvフラグメントについてと同様な)正確な会合も必要としないからである。高率での富化は、足場におけるDARPについて記載されたもの(Binzら，2004a)と同様である。最後に、PulD-Nに対する選択の結果(output)は、ライブラリが同じ標的タンパク質を認識することができる異なる結合体を提供するに十分な機能的多様性を含んでいることを証明している。このことは、本発明によるSac7dライブラリの設計の妥当性を示した。

【0093】

選択した結合体の特性
PulD-Nに対する選択した単量体結合体の特徴付けは、Sac7dライブラリを用いてピコモル親和性が得られることを示した。これら親和性は、親和性成熟工程(概説として、Hosseら，2006及びその中の参考文献を参照)を必要とせずに足場タンパク質を用いて得られた最も高いものの１つである。結合の動力学もまた約２ 10⁷M^-1.s^-1の結合速度を有し驚くべきものであった。この結合速度により、PulD-N結合体はタンパク質-タンパク質相互作用についての拡散律速結合速度(Gabdoulline及びWade，1997)の上位にランク付けられる。結合速度は、静電気学的な助力を受けていないようにはみえない。よって、高い結合速度は、コンホメーション変化を必要とすることのない、標的に幾何学的に一致する結合体の「予め形成された(preformed)」形状により説明し得る。

【0094】

得られる高親和性は、非常に高い特異性に関連している。本発明者らは、状況(E. coli粗抽出物又は膜)及びアプローチ(イムノブロット又はアフィニティークロマトグラフィー)に関わらず、試験した全ての結合体が数千もの他のタンパク質の中から標的を識別することができたことを示した。この厳格な特異性は、異なる標的への僅かな適合を阻止する足場の剛直性に関連付け得る。更に、スクリーニングした数十の結合体の全てがELISAアッセイにおいて標的特異的であることが示された。このことは、適用した選択圧が粘着性分子を取り除くに十分であったことを示している。

【0095】

変形体の組換えタンパク質収量(上限200mg/l E. coli培養物)は、Sac7dについて報告された収量(約10〜15mg/l)より遥かに高かった。この差は、野生型sac7d遺伝子の発現誘導の数時間後に起こる溶解により説明することができる。Sac7dは一般的なDNA結合性タンパク質であるので、この毒性は、おそらくE. coliゲノムへのSac7d結合により誘導される調節経路の乱れに起因する。この制限は変形体については見られない。このことは、変形体が確かにDNA結合特性を喪失していることを示唆する。

【0096】

３つの変形体について観察される熱力学的安定性は、thermophilesに由来する幾つかの他のタンパク質(Kahsaiら，2005)に良く匹敵しており、結合体の熱的安定性は野生型Sac7dのものに近いままであった。クローン６(分析した最も安定性が小さいクローン)が、依然として、pH5.6で約68℃のTm(pH7.0でのものと比較して８℃低いTm)を有する熱的に安定なタンパク質のままであった。よって、クローンごとに観察される種々のTm値に関わらず、全体として、上記のライブラリ設計が、extremophile起源のタンパク質の使用と組み合せて、所望の認識特性を有する非常に安定なタンパク質の生成を導いたようである。

【0097】

インビボにおける結合及びプルラナーゼ分泌の細胞内阻害
試験した３つ全てのSac7^*-PhoAキメラが単量体の完全長PulDに結合した。Sac7^*40-PhoA及びSac7^*33-PhoAは十二量体PulDに良好に結合し、このことはエピトープが接近可能なままであることを示している。対照的に、Sac7^*6-PhoAはPulD十二量体に弱々しくのみ結合したが、インビトロでPulD-Nに対して最も高い親和性を有していた。このことは、エピトープが多量体化に際して部分的にマスクされており、Sac7^*40及びSac7^*33により認識されるエピトープとは異なることを示している。ITC競合実験は、Sac7^*6及びSac7^*40により認識されるエピトープが同一であるか又はオーバーラップしていることを示唆した(データは示さず)。PhoAに融合したときのこれら２つの結合体のインビボ効果の差は、エピトープがオーバーラップしていることを示唆する。

【0098】

３つ全てのSac7^*-PhoA変形体はPulD多量体化を防ぎ、エンベローププロテアーゼによる分解についてPulD単量体を標的とし、このことによってプルラナーゼ分泌をブロックした。先の証拠は、ＮドメインがPulD多量体化に影響しないことを示した(Guilvoutら，2006)。Sac7^*-PhoAにおけるPhoA多量体化は、立体障害及びその結果としてPulD単量体の誤配置(mispositioning)を引き起こすかもしれない。Sac7^*-PhoA産生株における分泌レベルは、産生されたPulDのレベルが増大しエンベローププロテアーゼが不活化された場合には、非常に低いままであった(図14B)。低分泌は、ほんの少数のPulD十二量体の存在、結合したキメラによるチャンネル閉塞又は基質(Shevchikら，1997)若しくは別の分泌成分(Possotら，2000)との本質的な相互作用部位のマスキングに起因し得る。

【0099】

Sac7^*33又はSac7^*40レベルの減少(IPTGによる誘導の解消による)は、分泌又はPulD多量体化に対する効果を縮小させなかったが、Sac7^*6-PhoAは、他のキメラと少なくとも同程度に豊富であっても(図14A)、これら条件下で効果をほとんど有さなかった(図14C)。２つの異なるシナリオがこの観察を説明し得る。第１は、高度に豊富なSac7^*6-PhoAがほとんど全てのPulD単量体に結合し、それらの多量体化を防ぐというもの。しかし、Sac7^*6-PhoAは、レベルがより低いときには、PulD単量体-単量体相互作用と効率的に競合することができず、効率的な分泌を可能にするに十分な多量体が組み立てられる。十二量体PulDに対するSac7^*6-PhoAの明らかにより低い親和性は、分泌を妨げるに不十分である。第２は、シャペロンPulSのPulD単量体への結合(外膜への正確な標的付けの必須条件(Guilvoutら，2006；Hardieら，1996))がSac7^*6-PhoA結合を妨げ、正確な多量体化を可能にするというものである。このシナリオでは、結果(outcome)は、どのタンパク質が最初にPulD、PulS又はSac7^*6-PhoAに結合するかに依存する。両方のシナリオとも、Sac7^*6により認識されるエピトープはPulD多量体化に際して強力にマスクされるという事実と一致している。このことは、エピトープが２つの単量体の界面にあることを示唆している。

【0100】

可能性のある生物工学的適用
これら結合体は、抗体に代替する足場において要求される非常に好適な生物物理学的特性のほとんどを保持していた。それらの特性は、以前に提案された抗体代替物(例えば、アフィボディ(affibodies)(Nordら，1997)、フィブロネクチン(Xuら，2002)、又はアンキリン(Binzら，2004a))に良好に匹敵する。確かに、これら結合体はE. coliにおいて(細胞質又はペリプラズマで)非常に良好に発現し、安定で、可溶性であり、高親和性及び高い特異性でタンパク質標的を認識することができ、また異なるレポータータンパク質(PhoA及びGFP)に機能的に融合させることが可能である。換言すれば、これら結合体は、製造が安価で、精製及び取り扱いが容易である。このことは多くの生物工学的適用のための扉を開く。

【0101】

更に、非常に小さなサイズ(scFv又はIgGよりそれぞれ３倍又は19倍小さい)により、これら結合体は、合理的サイズを維持しつつ結合性分子を必要とするキメラタンパク質の設計のための理想的な候補とされる。異なる特異性を有する幾つかの結合体を連結すること、したがって多重特異性を有する融合体を構築することもまた企図できる。小さい結合体(例えば、Sac7d)の別の利点は、天然抗体又はそれらフラグメントには立体的に接近不可能である埋れたエピトープに結合する潜在能力である。

【0102】

結合体が標的タンパク質に結合する能力は高分子量を有する標的に限定されないことに注目することができる。確かに、既に得られた結果は、PulDに関するものに加えて、Sac7dから開発したバンクが広範囲の分子量をカバーする３つの新たな標的(リゾチーム = 14.3kDa、GarA = 17.3kDa、PknG = 81.6kDa)に特異的に結合するクローンの単離を可能にしたことを示している。E. coliにおけるこれら結合体の発現は、組換え抗体フラグメントについて観察されたレベルを遥かに優っている。得られた親和性は、時間の不足に起因して、長いk_off値に基づく選択(解離速度選択)なしでnMのオーダーである。この選択工程は、ナノモル未満の親和性を得るために必要であり、現在実施されている。

【0103】

PulD結合体はどの程度特異的であり得るかに取り組むために、本発明者らはそれらが検出試薬の開発に使用できることを既に証明した。例えば、一工程ELISA又はウェスタンブロットは、アルカリホスファターゼへの結合体の融合により達成可能である。別の例は、インビボ細胞内局在化への道を開くインビトロ検出のためのGFP融合体の使用である。アフィニティークロマトグラフィーをこれら結合体で実施可能であること及びタンパク質を単一工程精製により均質まで精製可能であることもまた証明した。例えばタンパク質チップアレイ、バイオセンサー又はインビボノックアウトの切替可能物のような他の適用もこれら結合体を使用し得る。

【0104】

結論
高親和性及び非常に繊細な特異性で標的タンパク質を認識することができる結合体を得るためにOB-フォールドタンパク質を使用するストラテジーは、上記の結果によって成功したと確証された。出発点は一般的なDNA結合性タンパク質たるSac7dであった。Sac7d及びその誘導体は、今や、２つの構造的に無関係のファミリーのリガンド：DNA及びタンパク質を認識することができる。よって、本発明者らは、所与の標的についてOB-フォールドの結合性適合をインビトロで再現した。したがって、Sac7dはまた、OB-フォールドタンパク質の他の公知のリガンド(例えば、一本鎖DNA、RNA又は糖)に適合させ得ると考えられる。機能的ノックアウト実験における見込みのある使用に加えて、これら結合体は、アフィニティークロマトグラフィー、検出、インビボ局在化実験などに使用することができる。確かに、これら結合体の好適な生物物理学的特性は、異なるレポータータンパク質への容易な融合及び小さなサイズ(scFv及びIgGよりそれぞれ３倍及び19倍小さい)と共に、これら適用を容易にし得る。

【0105】

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【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4】

【図5】

【図6a】

【図6b】

【図6c】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12a】

【図12b】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]