特許 6685900 改変された造血幹／前駆細胞及び非エフェクターＴ細胞、そしてそれらの用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6685900

(24)【登録日】2020年4月3日

(45)【発行日】2020年4月22日

(54)【発明の名称】改変された造血幹／前駆細胞及び非エフェクターＴ細胞、そしてそれらの用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0789 20100101AFI20200413BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20200413BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20200413BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20200413BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20200413BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20200413BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20200413BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20200413BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/0789

   C12N5/10ZNA

   A61K35/28

   A61K35/17 A

   A61K35/17 Z

   A61P35/00

   A61P35/02

   A61P37/04

   !C12N15/62 Z

【請求項の数】30

【全頁数】69

(21)【出願番号】特願2016-527261(P2016-527261)

(86)(22)【出願日】2014年10月31日

(65)【公表番号】特表2017-500009(P2017-500009A)

(43)【公表日】2017年1月5日

(86)【国際出願番号】US2014063576

(87)【国際公開番号】WO2015066551

(87)【国際公開日】20150507

【審査請求日】2017年10月30日

(31)【優先権主張番号】61/898,387

(32)【優先日】2013年10月31日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】506139369

【氏名又は名称】フレッド ハッチンソン キャンサー リサーチ センター

(73)【特許権者】

【識別番号】514204772

【氏名又は名称】シアトル チルドレンズ ホスピタル ドゥーイング ビジネス アズ シアトル チルドレンズ リサーチ インスティテュート

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】特許業務法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】デラニー，コリーン

(72)【発明者】

【氏名】ジェンセン，マイケル

(72)【発明者】

【氏名】ガードナー，レベッカ

【審査官】 中野 あい

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１２−５１８４０４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１３／０２５１６４２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１３／１２３０６１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 DE OLIVEIRA SN et al., Modification of hematopoietic stem/progenitor cells with CD19-specific chimeric antigen receptors as a novel approach for cancer immunotherapy, Human Gene Therapy [online], Vol.24, p.824-839, Epub 2013.08.22, <Retrieved on 2018.09.10>, <URL= https://www.liebertpub.com/doi/abs/10.1089/hum.2012.202>

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００−７／０８

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（１）治療に効果的な量の、遺伝的に改変されていない造血幹前駆細胞（ＨＳＰＣ）、
（２）（ａ）治療に効果的な量の、遺伝子的に改変されたＨＳＰＣ及び／又は
（ｂ）治療に効果的な量の、遺伝子的に改変された骨髄性幹／前駆細胞、及び遺伝子的に改変されたリンパ球幹／前駆細胞を含む、処方物であって、
（２）における遺伝的に改変された細胞は、対象者と免疫学的に適合させず、下記の（ｉ）から（ｉｉｉ）、
（ｉ）望ましくない細胞上に選択的に発現した細胞マーカーを結合するリガンド結合ドメインを含む細胞外成分であって、該リガンド結合ドメインはＣＤ１９、ＲＯＲ１、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、メソテリン、ＣＤ２０、ＷＴ１、Ｈｅｒ２又はＣＤ１２３に結合し、
（ｉｉ）細胞外成分に連結した膜貫通ドメイン、および
（ｉｉｉ）膜貫通ドメインに連結した細胞内成分であって、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８又は４−１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインを含むエフェクタードメインを含む細胞内成分、
を含む分子を発現する、処方物。

【請求項2】

リガンド結合ドメインが、抗体フラグメントである、請求項１に記載の処方物。

【請求項3】

リガンド結合ドメインが、抗体の単鎖可変フラグメントである、請求項１に記載の処方物。

【請求項4】

リガンド結合ドメインが、Ｋａｂａｔ番号付けに従い、ＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０８）の配列であるＣＤＲＬ１、ＳＲＬＨＳＧＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１１）の配列であるＣＤＲＬ２、ＧＮＴＬＰＹＴＦＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０４）の配列であるＣＤＲＬ３、ＤＹＧＶＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０３）の配列であるＣＤＲＨ１、ＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１４）の配列であるＣＤＲＨ２及びＹＡＭＤＹＷＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１５）の配列であるＣＤＲＨ３を含む、単鎖のＦｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項１に記載の処方物。

【請求項5】

リガンド結合ドメインが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０８、１１１、１０４、１０３、１１４及び１１５で表されるＦＭＣ６３抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲを含む、単鎖のＦｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項１に記載の処方物。

【請求項6】

リガンド結合ドメインが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５６、５７又は５８で表されるＲ１２の単鎖のＦｖフラグメント（ｓｃＦｖ）の重鎖及び軽鎖可変領域のＣＤＲを含む、ｓｃＦｖである、請求項１に記載の処方物。

【請求項7】

リガンド結合ドメインが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５３、５４又は５５で表されるＲ１１の単鎖のＦｖフラグメント（ｓｃＦｖ）の重鎖及び軽鎖可変領域のＣＤＲを含む、ｓｃＦｖである、請求項１に記載の処方物。

【請求項8】

エフェクタードメインが、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ２７、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＤＡＰ１０、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、Ｆｙｎ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＬＡＴ、Ｌｃｋ、ＬＲＰ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＯＴＣＨ１、ｐＴα、ＰＴＣＨ２、ＯＸ４０、ＲＯＲ２、Ｒｙｋ、ＳＬＡＭＦ１、Ｓｌｐ７６、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＲＩＭ、Ｗｎｔ及びＺａｐ７０シグナル伝達及び／又は刺激ドメインから選択される１以上の、シグナル伝達及び／又は刺激ドメインをさらに含む、請求項１に記載の処方物。

【請求項9】

エフェクタードメインが、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、リンパ球官能−関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ及びＢ７−Ｈ３から選択される１以上の共刺激ドメインをさらに含む、請求項１に記載の処方物。

【請求項10】

細胞内成分が、
（ｉ）ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインの全てまたは一部、
（ｉｉ）ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインの全てまたは一部、
（ｉｉｉ）４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインの全てまたは一部、または
（ｉｖ）ＣＤ３ζ、ＣＤ２８及び／または４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインの全てまたは一部を含む、細胞内シグナル伝達ドメインを含む、エフェクタードメインを含む、
請求項１に記載の処方物。

【請求項11】

細胞内成分が、ＣＤ３ζの変異体及び／又は４−１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインの一部を含む、エフェクタードメインを含む、請求項１に記載の処方物。

【請求項12】

分子が、さらにスペーサー領域を含む、請求項１に記載の処方物。

【請求項13】

スペーサー領域が、ヒト抗体のヒンジ領域の一部を含む、請求項１２に記載の処方物。

【請求項14】

スペーサー領域が、ヒンジ領域、及びＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３又はその組み合わせから選択されるヒト抗体のＦｃドメインの少なくとも１つのほかの部分を含む、請求項１２に記載の処方物。

【請求項15】

スペーサー領域が、Ｆｃドメイン及びヒトＩｇＧ４重鎖ヒンジを含む、請求項１２に記載の処方物。

【請求項16】

スペーサー領域が、１２以下のアミノ酸、１１９以下のアミノ酸、又は２２９以下のアミノ酸から選ばれた長さの領域である、請求項１２に記載の処方物。

【請求項17】

スペーサー領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１で表される配列を有する、請求項１２に記載の処方物。

【請求項18】

膜貫通ドメインが、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又はＣＤ４膜貫通ドメインである、請求項１に記載の処方物。

【請求項19】

細胞外成分が、さらにタグ配列を含む、請求項１に記載の処方物。

【請求項20】

細胞外成分が、ＣＤ１９を結合するリガンド結合ドメインを含み、細胞内成分が、ＣＤ２８又は４−１ＢＢの細胞質ドメインを含むエフェクタードメインを含み、
分子が、さらにヒトＩｇＧ４のヒンジ領域を含むスペーサー領域、及びヒトＣＤ４またはＣＤ２８膜貫通ドメインを含む、請求項１に記載の処方物。

【請求項21】

遺伝子的に改変された細胞が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、５３、５４、５５、５６、５７、又は５８で表される配列を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する、請求項１に記載の処方物。

【請求項22】

点滴または注射に対応して処方された、請求項１に記載の処方物。

【請求項23】

（１）治療に効果的な量の、遺伝的に改変されていないＨＳＰＣ、
（２）（ａ）治療に効果的な量の、遺伝子的に改変されたＨＳＰＣ及び／又は
（ｂ）治療に効果的な量の、遺伝子的に改変された骨髄性幹／前駆細胞、及び遺伝子的に改変されたリンパ球幹／前駆細胞を含む、医薬であって、
（２）における遺伝的に改変された細胞は、対象者と免疫学的に適合させず、下記の（ｉ）から（ｉｉｉ）、
（ｉ）望ましくない細胞上に選択的に発現した細胞マーカーを結合するリガンド結合ドメインを含む細胞外成分であって、該リガンド結合ドメインはＣＤ１９、ＲＯＲ１、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、メソテリン、ＣＤ２０、ＷＴ１、Ｈｅｒ２又はＣＤ１２３に結合し、
（ｉｉ）細胞外成分に連結した膜貫通ドメイン及び
（ｉｉｉ）膜貫通ドメインに連結した細胞内成分であって、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８又は４−１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインを含むエフェクタードメインを含む細胞内成分、
を含む分子を発現し、それにより対象の免疫系が再増殖し、望ましくない細胞を標的とするものである医薬。

【請求項24】

投与の前に、対象者への免疫適合が必要でない、請求項２３に記載の医薬。

【請求項25】

細胞が対象者に非自家性である、請求項２４に記載の医薬。

【請求項26】

対象者が、再発小児急性リンパ性白血病の患者である、請求項２３に記載の医薬。

【請求項27】

免疫系の再増殖が、化学療法、放射線療法、及び／またはＨＣＴに対応した骨髄機能廃絶療法による、免疫不全、汎血球減少症、好中球減少症、及び／または白血球減少症を治療する、請求項２３に記載の医薬。

【請求項28】

再増殖が、骨髄抑制または造血欠陥を引き起こす薬剤への暴露に基づいて必要とされる、請求項２３に記載の医薬。

【請求項29】

再増殖が、造血細胞移植（ＨＣＴ）に対応して骨髄機能廃絶療法への暴露に基づいて行われる必要があり及び望ましくない細胞が、ＣＤ１９を発現している急性リンパ性白血病細胞である、請求項２３に記載の医薬。

【請求項30】

望ましくない細胞が、望ましくないがん細胞である、請求項２３に記載の医薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第６１／８９８，３８７号、２０１３年１０月３１日登録による優先権を主張し、その全体を参照として援用し、本出願に組み込む。

【0002】

造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）及び／または非エフェクターＴ細胞を、（ｉ）望ましくない細胞に選択的に発現した細胞マーカーを結合する、リガンド結合ドメインを含む細胞外成分、及び（ｉｉ）エフェクタードメインを含む細胞内成分、を発現するように遺伝子的に改変する。さまざまな用途と共に、とりわけ、本改変細胞は、投与前に免疫学的に適合する必要が無く、望ましくないがん細胞を標的にして患者に投与できる。

【背景技術】

【0003】

がん細胞などの望ましくない細胞型を標的にして及び殺傷する、免疫系の遺伝子的に改変されたＴ細胞において、著しい進歩が成し遂げられている。例えば、Ｔ細胞は、特定の標的抗原を結合する細胞外成分及びその細胞外成分が標的抗原に結合した際に、Ｔ細胞の作用を指示する細胞内成分を持つ分子を発現するように、遺伝子的に改変されている。例として、その細胞外成分は、がん細胞上に見出された標的抗原を結合するように設計でき、及び結合した際に、その細胞内成分が、結合されたがん細胞を破壊するようにＴ細胞に指示する。そのような分子の例には、遺伝子的に改変されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。

【0004】

遺伝子的に改変されたＴ細胞は、望ましくない細胞型を標的にして及び破壊する能力を著しく進歩させた一方で、治療行為に使用する前に、個別の特定対象者との免疫学的な適合が必要である。一旦、ドナー適合者が判明すると（または、治療が必要な対象者からＴ細胞が得られると）、その細胞は、その対象者に使用する前に改変され及び増殖されなければならない。この時間浪費かつ費用のかかるプロセスは、例えば、治療において致命的な遅延を引き起こす可能性がある。

【発明の概要】

【0005】

本開示は、特定の対象者に対する免疫適合の必要が無く治療に投与できる、遺伝子的に改変された幹細胞を提供する。したがって、これらの遺伝子的に改変された幹細胞は、ドナーの特定及びそれに続く細胞改変及び増殖に関連した治療における遅延及び費用を排除した、「すぐに使える」治療を提供する。この改変幹細胞は、単独で投与でき、または多数の治療目的を達成するその他の治療法との多様な組み合わせで使用できる。特定の実施形態において、当該改変幹細胞は、投与前に、改変された非エフェクターＴ細胞に分化する。

【0006】

より特定には、造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）は、望ましくない細胞型に選択的に見出される特定細胞マーカーを結合する細胞外成分及びその細胞外成分が、その細胞マーカーを結合した際に、当該遺伝子的に改変された細胞の作用を指示する細胞内成分を有する分子を発現するように、遺伝子的に改変される。例として、当該細胞外成分は、がん細胞上に見出された細胞マーカーを選択的に結合するように設計でき、及び結合した際に、その細胞内成分が、結合されたがん細胞を破壊するように、当該遺伝子的に改変された細胞に指示する。そのような分子の例には、遺伝子的に改変されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びその他の本明細書に開示される分子を含む。特定の実施形態において、当該改変されたＨＳＰＣは、投与前の非エフェクターＴ細胞に、分化できる。

【図面の簡単な説明】

【0007】

【図1】抗ＣＤ１９ショートスペーサーキメラ受容体のヌクレオチド配列、ＧＭＣＳＦＲｓｓ−ＣＤ１９ｓｃＦｖ−ＩｇＧ４ｈｉｎｇｅ−ＣＤ２８ｔｍ−４１ＢＢ−Ｚｅｔａ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ。

【図2-1】ＧＭＣＳＦＲｓｓ−ＣＤ１９ｓｃＦｖ−ＩｇＧ４ｈｉｎｇｅ−ＣＤ２８ｔｍ−４１ＢＢ−Ｚｅｔａ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔのアミノ酸配列。

【図2-2】ＧＭＣＳＦＲｓｓ−ＣＤ１９ｓｃＦｖ−ＩｇＧ４ｈｉｎｇｅ−ＣＤ２８ｔｍ−４１ＢＢ−Ｚｅｔａ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔのアミノ酸配列。

【図2-3】ＧＭＣＳＦＲｓｓ−ＣＤ１９ｓｃＦｖ−ＩｇＧ４ｈｉｎｇｅ−ＣＤ２８ｔｍ−４１ＢＢ−Ｚｅｔａ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔのアミノ酸配列。

【図3A】図３Ａは、ＺＸＲ−０１４ヌクレオチドのセクションマップ及びアミノ酸配列を示す。

【図3B】図３Ｂは、例示的なプライマーの配列を示す。

【図4】ＵｎｉｐｒｏｔのＰ０８６１ ＩｇＧ４−Ｆｃのアミノ酸配列及びセクションマップ。

【図5】ＵｎｉｐｒｏｔのＰ１０７４７ ＣＤ２８のアミノ酸配列及びセクションマップ。

【図6】ＵｎｉｐｒｏｔのＱ０７０１１ ４−１ＢＢのアミノ酸配列及びセクションマップ。

【図7】ＵｎｉｐｒｏｔのＰ２０９６３ ヒトＣＤ３ζアイソフォーム３のアミノ酸配列及びセクションマップ。

【図8】例示的なヒンジ部の配列。

【図9-1】Ｒ１２ロングスペーサーＣＡＲの配列：ＰＪ＿Ｒ１２−ＣＨ２−ＣＨ３−４１ＢＢ−Ｚ−Ｔ２Ａ−ｔＥＧＦＲ。

【図9-2】Ｒ１２ロングスペーサーＣＡＲの配列：ＰＪ＿Ｒ１２−ＣＨ２−ＣＨ３−４１ＢＢ−Ｚ−Ｔ２Ａ−ｔＥＧＦＲ。

【図9-3】Ｒ１２ロングスペーサーＣＡＲの配列：ＰＪ＿Ｒ１２−ＣＨ２−ＣＨ３−４１ＢＢ−Ｚ−Ｔ２Ａ−ｔＥＧＦＲ。

【図9-4】Ｒ１２ロングスペーサーＣＡＲの配列：ＰＪ＿Ｒ１２−ＣＨ２−ＣＨ３−４１ＢＢ−Ｚ−Ｔ２Ａ−ｔＥＧＦＲ。

【図10】リーダー＿Ｒ１２−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＤ２８ｔｍ／４１ＢＢ−Ｚ−Ｔ２Ａ−ｔＥＧＦＲの配列。

【図11-1】Ｒ１２中間スペーサーＣＡＲの配列：ＰＪ＿Ｒ１２−ＣＨ３−４１ＢＢ−Ｚ−Ｔ２Ａ−ｔＥＧＦＲ。

【図11-2】Ｒ１２中間スペーサーＣＡＲの配列：ＰＪ＿Ｒ１２−ＣＨ３−４１ＢＢ−Ｚ−Ｔ２Ａ−ｔＥＧＦＲ。

【図11-3】Ｒ１２中間スペーサーＣＡＲの配列：ＰＪ＿Ｒ１２−ＣＨ３−４１ＢＢ−Ｚ−Ｔ２Ａ−ｔＥＧＦＲ。

【図11-4】Ｒ１２中間スペーサーＣＡＲの配列：ＰＪ＿Ｒ１２−ＣＨ３−４１ＢＢ−Ｚ−Ｔ２Ａ−ｔＥＧＦＲ。

【図12】リーダー＿Ｒ１２−ヒンジ−ＣＨ３−ＣＤ２８ｔｍ／４１ＢＢ−Ｚ−Ｔ２Ａ−ｔＥＧＦＲの配列。

【図13-1】Ｒ１２ショートスペーサーＣＡＲの配列：ＰＪ＿Ｒ１２−ヒンジ−４１ＢＢ−Ｚ−Ｔ２Ａ−ｔＥＧＦＲ。

【図13-2】Ｒ１２ショートスペーサーＣＡＲの配列：ＰＪ＿Ｒ１２−ヒンジ−４１ＢＢ−Ｚ−Ｔ２Ａ−ｔＥＧＦＲ。

【図13-3】Ｒ１２ショートスペーサーＣＡＲの配列：ＰＪ＿Ｒ１２−ヒンジ−４１ＢＢ−Ｚ−Ｔ２Ａ−ｔＥＧＦＲ。

【図13-4】Ｒ１２ショートスペーサーＣＡＲの配列：ＰＪ＿Ｒ１２−ヒンジ−４１ＢＢ−Ｚ−Ｔ２Ａ−ｔＥＧＦＲ。

【図14】リーダー＿Ｒ１２−ＣＤ２８ｔｍ／４１ＢＢ−Ｚ−Ｔ２Ａ−ｔＥＧＦＲの配列。

【図15-1】Ｒ１１ロングスペーサーＣＡＲの配列：ＰＪ＿Ｒ１１−ＣＨ２−ＣＨ３−４１ＢＢ−Ｚ−Ｔ２Ａ−ｔＥＧＦＲ。

【図15-2】Ｒ１１ロングスペーサーＣＡＲの配列：ＰＪ＿Ｒ１１−ＣＨ２−ＣＨ３−４１ＢＢ−Ｚ−Ｔ２Ａ−ｔＥＧＦＲ。

【図15-3】Ｒ１１ロングスペーサーＣＡＲの配列：ＰＪ＿Ｒ１１−ＣＨ２−ＣＨ３−４１ＢＢ−Ｚ−Ｔ２Ａ−ｔＥＧＦＲ。

【図15-4】Ｒ１１ロングスペーサーＣＡＲの配列：ＰＪ＿Ｒ１１−ＣＨ２−ＣＨ３−４１ＢＢ−Ｚ−Ｔ２Ａ−ｔＥＧＦＲ。

【図16】リーダー＿Ｒ１１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＤ２８ｔｍ／４１ＢＢ−Ｚ−Ｔ２Ａ−ｔＥＧＦＲの配列。

【図17-1】Ｒ１１中間スペーサーＣＡＲの配列：ＰＪ＿Ｒ１１−ＣＨ３−４１ＢＢ−Ｚ−Ｔ２Ａ−ｔＥＧＦＲ。

【図17-2】Ｒ１１中間スペーサーＣＡＲの配列：ＰＪ＿Ｒ１１−ＣＨ３−４１ＢＢ−Ｚ−Ｔ２Ａ−ｔＥＧＦＲ。

【図17-3】Ｒ１１中間スペーサーＣＡＲの配列：ＰＪ＿Ｒ１１−ＣＨ３−４１ＢＢ−Ｚ−Ｔ２Ａ−ｔＥＧＦＲ。

【図17-4】Ｒ１１中間スペーサーＣＡＲの配列：ＰＪ＿Ｒ１１−ＣＨ３−４１ＢＢ−Ｚ−Ｔ２Ａ−ｔＥＧＦＲ。

【図18】リーダー＿Ｒ１１−ヒンジ−ＣＨ３−ＣＤ２８ｔｍ／４１ＢＢ−Ｚ−Ｔ２Ａ−ｔＥＧＦＲの配列。

【図19-1】Ｒ１１ショートスペーサーＣＡＲの配列：ＰＪ＿Ｒ１１−４１ＢＢ−Ｚ−Ｔ２Ａ−ｔＥＧＦＲ。

【図19-2】Ｒ１１ショートスペーサーＣＡＲの配列：ＰＪ＿Ｒ１１−４１ＢＢ−Ｚ−Ｔ２Ａ−ｔＥＧＦＲ。

【図19-3】Ｒ１１ショートスペーサーＣＡＲの配列：ＰＪ＿Ｒ１１−４１ＢＢ−Ｚ−Ｔ２Ａ−ｔＥＧＦＲ。

【図19-4】Ｒ１１ショートスペーサーＣＡＲの配列：ＰＪ＿Ｒ１１−４１ＢＢ−Ｚ−Ｔ２Ａ−ｔＥＧＦＲ。

【図20】リーダー＿Ｒ１１−ヒンジ−ＣＤ２８ｔｍ／４１ＢＢ−Ｚ−Ｔ２Ａ−ｔＥＧＦＲの配列。

【図21】例示的なスペーサーの配列。

【図22】Ｈｅｒ２ショートスペーサーコンストラクトの配列、ＧＭＣＳＦｓｓ−Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ−ＩｇＧ４ｈｉｎｇｅ−ＣＤ２８ｔｍ−４１ＢＢ−Ｚｅｔａ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ。

【図23】中間スペーサーＨｅｒ２コンストラクトの配列。

【図24-1】ロングスペーサーＨｅｒ２コンストラクトの配列。

【図24-2】ロングスペーサーＨｅｒ２コンストラクトの配列。

【図25】スペーサー配列のライブラリー。プラスミドライブラリーは、ＩｇＧ４ヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインに連結されるＩｇＧ４ヒンジ部、またはＣＨ３ドメインに連結されるＩｇＧ４ヒンジ部を含む、細胞外成分をコードするコドン最適化のＤＮＡ配列を含むように構築された。任意のｓｃＦＶ配列（ＶＨ及びＶＬ）は、この多様なスペーサードメインのライブラリーにおいてコードされる配列の５′にクローンされ得る。このスペーサードメインは、次に膜貫通ＣＤ２８及び細胞内シグナル伝達ドメイン、そしてＣＤ３ζに連結される。ベクターのＴ２Ａ配列は、切断されたヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）をコードしている選択的マーカーから、キメラ受容体を切り離す。

【図26A】改変されたスペーサー長を有し及び異なる親和性を有する２Ａ２及びＲ１２ｓｃＦＶから誘導されるＲＯＲ１キメラ受容体の設計（図２６Ａ）。２Ａ２ｓｃＦＶ、『ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３』ロングスペーサー、２２９ ＡＡ）、『ヒンジ−ＣＨ３』（中間、１１９ ＡＡ）、または「ヒンジ」のみ（ショート、１２ ＡＡ）のＩｇＧ４−Ｆｃ誘導スペーサー、及びＣＤ３ζ及びＣＤ２８を有するシグナル伝達モジュールを含むＲＯＲ１キメラ受容体のパネルをコードする、レンチウイルス導入遺伝子挿入体の設計。各キメラ受容体のカセットは、Ｔ２Ａエレメントの下流でコードされた、切断されたＥＧＦＲマーカーを含む（図２６Ｂ）。ショートＩｇＧ４−Ｆｃ「ヒンジ」スペーサー（１２ ＡＡ）を有するＲ１２及び２Ａ２ｓｃＦＶから誘導されたＲＯＲ１特異のキメラ受容体、及びＣＤ２８または４−１ＢＢそしてＣＤ３ζの各々を含むシグナル伝達モジュールをコードするレンチウイルス導入遺伝子の挿入体（合計４コンストラクト）。

【図26B】改変されたスペーサー長を有し及び異なる親和性を有する２Ａ２及びＲ１２ｓｃＦＶから誘導されるＲＯＲ１キメラ受容体の設計（図２６Ａ）。２Ａ２ｓｃＦＶ、『ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３』ロングスペーサー、２２９ ＡＡ）、『ヒンジ−ＣＨ３』（中間、１１９ ＡＡ）、または「ヒンジ」のみ（ショート、１２ ＡＡ）のＩｇＧ４−Ｆｃ誘導スペーサー、及びＣＤ３ζ及びＣＤ２８を有するシグナル伝達モジュールを含むＲＯＲ１キメラ受容体のパネルをコードする、レンチウイルス導入遺伝子挿入体の設計。各キメラ受容体のカセットは、Ｔ２Ａエレメントの下流でコードされた、切断されたＥＧＦＲマーカーを含む（図２６Ｂ）。ショートＩｇＧ４−Ｆｃ「ヒンジ」スペーサー（１２ ＡＡ）を有するＲ１２及び２Ａ２ｓｃＦＶから誘導されたＲＯＲ１特異のキメラ受容体、及びＣＤ２８または４−１ＢＢそしてＣＤ３ζの各々を含むシグナル伝達モジュールをコードするレンチウイルス導入遺伝子の挿入体（合計４コンストラクト）。

【図27A】ヒトＨＥＲ２上の腫瘍細胞膜近傍のエピトープ上のハーセプチンのＦａｂ上エピトープ位置の描写。

【図27B】図２７Ｂは、カルボキシルＥＧＦＲｔマーカー膜貫通型タンパク質を有するタンパク質に連結されたＴ２Ａとしての、ハーセプチンｓｃＦｖ ＣＡＲのスペーサー長変異体の構造形式。

【図28】ＣＤ−１９キメラ受容体ベクター。細胞外のスペーサー長及び細胞内の供刺檄を分化する、ＣＤ−１９特異のキメラ受容体のパネルをコードするレンチウイルス導入遺伝子挿入体の設計。ＶＬ−ＶＨ配向において、ＦＭＣ６３ｍＡｂから誘導されるＣＤ−１９特異の単鎖変異フラグメント、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３（ロングスペーサー、２２９ ＡＡ）またはヒンジ単独（ショートスペーサー、１２ ＡＡ）のＩｇＧ４誘導スペーサードメイン、及び直列にＣＤ２８を有するＣＤ３ζまたは４−１ＢＢを単独またはアトランダムに含むシグナル伝達モジュールにコードされる、各キメラ受容体。各キメラ受容体カセットは、開裂可能な２Ａエレメントの下流においてコードされた、切り離されたＥＧＦＲマーカーを含む。

【図29A】例示的なＳＩＮレンチウイルスプラスミド。図２９Ａは、ＳＩＮ ＣＤ１９特異のｓｃＦｖＦｃ-ＣＤ３ζＣＤ２８ ＣＡＲ及び ｈｕＥＧＦＲｔレンチウイルスプラスミドを示す。

【図29B】例示的なＳＩＮレンチウイルスプラスミド。図２９Ｂは、ＳＩＮ ＣＤ１９特異のｓｃＦｖ−４−１ＢＢＣＤ３ζ ＣＡＲ及びｈｕＥＧＦＲｔレンチウイルスプラスミドを示す。

【図30A】形質導入効率／遺伝子発現安定性のマーカーとしてのＥＧＦＲ発現のパーセント表示（図３０Ａ）。ＨＳＰＣは、前述のＤｅｌｔａ上で培養された。＋３日目に、プロタミン硫酸塩の存在下において、ＭＯＩが３の、ｓｃＦｖＦｃ−ＣＤ３ζＣＤ２８ ＣＡＲ及びｈｕＥＧＦＲｔベクターを使用して細胞が導入され、及びスピンフェクションが実施された。導入遺伝子発現は、ＥＧＦＲｔタグを結合しているアービタックスを使用したフローによる培養コースにわたって測定された。７日目に、指定された培養に、１対１の比率で、放射線照射ＬＣＬが添加された。

【図30B】形質導入効率／遺伝子発現安定性のマーカーとしてのＥＧＦＲ発現の絶対数表示（図３０Ｂ）。ＨＳＰＣは、前述のＤｅｌｔａ上で培養された。＋３日目に、プロタミン硫酸塩の存在下において、ＭＯＩが３の、ｓｃＦｖＦｃ−ＣＤ３ζＣＤ２８ ＣＡＲ及びｈｕＥＧＦＲｔベクターを使用して細胞が導入され、及びスピンフェクションが実施された。導入遺伝子発現は、ＥＧＦＲｔタグを結合しているアービタックスを使用したフローによる培養コースにわたって測定された。７日目に、指定された培養に、１対１の比率で、放射線照射ＬＣＬが添加された。

【図31-1】ノッチリガンド上で培養されたＣＤ３４＋ＣＢ細胞は、ｓｃＦｖＦｃ−ＣＤ３ζＣＤ２８ ＣＡＲ及びｈｕＥＧＦＲｔベクターを使用したＭＯＩが３のレンチウイルスを伴って、３日目に形質導入が実施された。７日目に、１対１の比率で、ＬＣＬが指定された培地に添加された。（形質導入された（■）、ＬＣＬで形質導入された（×）、形質導入されず（広範に確認できず、■株の背後）、ＬＣＬで形質導入されず（▲））。ＣＤ３４の倍増殖が、全体的なＴＮＣの倍増殖を通して、ＬＣＬ添加により改善された。

【図31-2】ノッチリガンド上で培養されたＣＤ３４＋ＣＢ細胞は、ｓｃＦｖＦｃ−ＣＤ３ζＣＤ２８ ＣＡＲ及びｈｕＥＧＦＲｔベクターを使用したＭＯＩが３のレンチウイルスを伴って、３日目に形質導入が実施された。７日目に、１対１の比率で、ＬＣＬが指定された培地に添加された。（形質導入された（■）、ＬＣＬで形質導入された（×）、形質導入されず（広範に確認できず、■株の背後）、ＬＣＬで形質導入されず（▲））。ＣＤ３４の倍増殖が、全体的なＴＮＣの倍増殖を通して、ＬＣＬ添加により改善された。

【図32】ＬＣＬの有無による形質導入に対する、ｓｃＦｖ−４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ ＣＡＲ及びｈｕＥＧＦＲｔベクターを使用した、１４日目のＭＩＯ３。７日目のＬＣＬ添加では、ＬＣＬの有無による培養間で同様の増殖分布が記録されたように、ＨＳＰＣまたはそれらの産物を発現しているＣＡＲの増殖を加速する兆候は、現れなかった。

【図33】培養表現型の最後。ＨＳＰＣは、前述したＤｅｌｔａ上で培養された。３日目に、指定された培養は、ｓｃＦｖ−４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ ＣＡＲ及びｈｕＥＧＦＲｔを発現するために、ＭＯＩが３のレンチウイルスで形質導入された。次いで、７日目に、指定された培養に、１対１の比率で放射線照射ＬＣＬを与えた。１４日目に、培養は、フローサイトメトリーにより分析された。形質導入された培養とされなかった培養の間で検出される顕著な差異はなかった。同様に、細胞の総数と、ＣＡＲコンストラクトが、サブグループ間で等しく分布していることを示唆するＥＧＦＲｔ＋細胞との間で、検出される顕著な差異はなかった。

【図34】ｓｃＦｖＦｃ−ＣＤ３ζＣＤ２８ ＣＡＲ及びｈｕＥＧＦＲｔベクターの官能性分析。Ｄｅｌｔａ上の培養の最終１４日目において、細胞はＤｅｌｔａから取り出され、ＮＫ数を増やすためにさらに１週間、ＩＬ−２及びＩＬ−１５が追加されたＲＰＭＩ培地に置かれた。

【図35】ノッチリガンド上で増殖され、及びＣＤ１９特異のｓｃＦｖＦｃ−ＣＤ３ζＣＤ２８ ＣＡＲ及びｈｕＥＧＦＲｔ（●及び◆）を発現するために形質導入されたか、または非形質導入（▲及び×）の、Ｋ５６２（×及び●）またはＣＤ３４＋ＣＢ細胞から誘導されたＮＫエフェクター細胞を用いたＬＣＬ（▲及び◆）の標的細胞を有するクロムリリースアッセイ。ＲＰＭＩ、ＩＬ−２及びＩＬ−１５を伴う培養中で、さらに１週間、成熟ＮＫ細胞が誘導された。

【図36】ｓｃＦｖ−４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ ＣＡＲ及びｈｕＥＧＦＲｔベクターを使用した形質導入細胞を移植されたマウスは、ＣＤ１９の生着を損ね、したがって、抗ＣＤ１９エフェクターが立証され、導入遺伝子の発現に依存していた。

【図37】ｓｃＦｖ−４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ ＣＡＲ及びｈｕＥＧＦＲｔに対してコードする、レンチウイルスで形質導入された培養からの細胞を移植されたＮＯＧマウスは、顕著なＥＧＦＲｔ発現及びＣＤ１９生着の減少を示す。

【発明を実施するための形態】

【0008】

がん細胞などの、望ましくない細胞を標的にし、及び殺傷する免疫系の遺伝的に改変されたＴ細胞において、著しい進歩が成し遂げられている。例えば、Ｔ細胞は、特定の標的抗原を結合する細胞外成分及びその細胞外成分が標的抗原に結合した際に、Ｔ細胞の作用を指示する細胞内成分を持つ分子を発現するように、遺伝子的に改変されている。例として、その細胞外成分は、がん細胞上に見出された標的抗原を選択的に結合するように設計でき、及び結合した際に、その細胞内成分が、結合されたがん細胞を破壊するようにＴ細胞に指示する。そのような分子の例には、遺伝子的に改変されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。

【0009】

遺伝子的に改変されたＴ細胞は、望ましくない細胞型を標的にし、及び破壊する能力を著しく進歩させた一方で、治療行為に使用する前に、個別の特定対象者との免疫学的な適合が必要である。一旦、ドナー適合が判明すると（または、治療が必要な対象者からＴ細胞が得られると）、その細胞は、その対象者に使用する前に改変され及び増殖されなければならない。この時間を浪費しかつ費用のかかるプロセスは、例えば、治療において致命的な遅延を引き起こす可能性がある。

【0010】

本開示は、特定対象者に対する免疫学的な適合の必要が無く治療に投与できる、遺伝子的に改変された幹細胞を提供する。したがって、これらの遺伝子的に改変された幹細胞は、ドナーの特定及びそれに続く細胞改変及び増殖に関連した治療における遅延及び費用を排除した、「すぐに使える」治療を提供する。この改変幹細胞は、単独で投与でき、または多数の治療目的を達成するその他の治療法との多様な組み合わせで使用できる。特定の実施形態において、当該改変幹細胞は、投与前に、改変された非エフェクターＴ細胞に分化できる。

【0011】

より特定には、造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）は、特定細胞マーカーを結合する細胞外成分及びその細胞外成分が、その細胞マーカーを結合した際に、当該遺伝子的に改変された細胞の作用を指示する細胞内成分を有する分子を発現するように、遺伝子的に改変される。例として、当該細胞外成分は、がん細胞上に見出された細胞マーカーを選択的に結合するように設計でき、及び結合した際に、その細胞内成分が、結合されたがん細胞を破壊するように、当該遺伝子的に改変された細胞に指示する。そのような分子の例には、遺伝子的に改変されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、及びその他の本明細書に開示される分子を含む。当該改変されたＨＳＰＣは、投与前の非エフェクターＴ細胞に、分化できる。

【0012】

特定の実施形態の一使用例として、臍帯血移植（ＣＢＴ）は、適切な適合ドナーが特定できない場合の、再発小児急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）に対するケアの標準である。この方法は、適切なドナーが非常に見つかりにくい、少数または混合民族（及び白色人種の３０％）を背景にもつ患者には、特に重要である。

【0013】

ＡＬＬを根絶し、及び長期寛解を与えるＣＢＴの能力は、移植片対白血病（ＧＶＬ）効果の一部によるものである。しかしながら依然として、ＣＢＴ処置後のＡＬＬの再発率は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を含む、再発及び治療関連死の両方に関連した全生存率を含めて、約４０％である（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２００９．１５（９）：ｐ．１０８６―９３、Ｔｏｍｂｌｙｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２００９．２７（２２）：ｐ．３６３４―４１）。本明細書で開示される組成及び処方は、ＧＶＨＤ疾患率を増加させることなしに、ＧＶＬ効果を高めることができる。この戦略は、ノッチリガンドを使用した内因性ノッチシグナル伝達経路の活性化を介した、臍帯血（ＣＢ）ＨＳＰＣの体外増殖を利用して臨床的に実行可能であり、ＣＤ３４＋細胞の１００倍増殖よりさらに大きい結果をもたらす。臨床的に、この増殖ＨＳＰＣは、非操作ユニットと一緒に注入可能であり、その増殖ユニットから誘導される産物と共にこの増殖ＨＳＰＣの一時生着へと導き、一方で、長期生着は、この非操作ユニットから最終的に誘導される。

【0014】

ノッチリガンド増殖のＣＢ ＨＳＰＣは、ＣＤ１９特異のＣＡＲを発現するベクターを使用した遺伝子改変に適している。このノッチリガンドＣＢ増殖システムを利用して、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するための増殖ＨＳＰＣの遺伝子改変により、ＧＶＬをＣＢＴに遺伝子的に組み入れることができ、ここで、この移植骨髄性及びリンパ性エフェクター細胞は、残存している白血病細胞を認識し、そして溶解する。

【0015】

請求項に係る発明を、ここではより一般的に記述する。

【0016】

造血幹／前駆細胞またはＨＳＰＣは、造血幹細胞及び／または造血前駆細胞を指す。ＨＳＰＣは、自己更新することができ、または（ｉ）単球及びマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板または樹状細胞を、最終的に生じさせる骨髄前駆細胞、または（ｉｉ）Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）と呼ばれるリンパ球様細胞を、最終的に生じさせるリンパ球前駆細胞に、分化できる。造血及びＨＳＰＣ分化の一般的な論議に対しては、Ｃｈａｐｔｅｒ １７，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅs，Ａｌｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．,１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ、Ｃｈａｐｔｅｒ ２ ｏｆ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ａｕｇｕｓｔ ５，２００６、及びＣｈａｐｔｅｒ ５ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２００９，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓを参照のこと。

【0017】

ＨＳＰＣは、別のタイプの造血細胞に比べて、ＨＳＰＣ上で亢進したレベルで発現した特定マーカーに対しては、陽性になり得る。例えば、そのようなマーカーには、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１０９、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ１６６、ＨＬＡ ＤＲ、またはそれらの組み合わせを含む。また、当該ＨＳＰＣは、別のタイプの造血細胞と比べて、発現マーカーに対しては相対的に陰性になり得る。例えば、そのようなマーカーには、Ｌｉｎ、ＣＤ３８、またはそれらの組み合わせを含む。望ましくは、当該ＨＳＰＣは、ＣＤ３４＋細胞である。

【0018】

ＨＳＰＣ源には、臍帯血、胎盤血、及び末梢血を含む（米国特許第５，００４，６８１号、第７，３９９，６３３号及び第７，１４７，６２６号、Ｃｒａｄｄｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９７、Ｂｌｏｏｄ ９０（１２）：４７７９−４７８８、Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６：３９，Ｐｅｌｕｓ，２００８、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１５（４）：２８５−２９２、Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９８、Ｂｌｏｏｄ ９１（７）：２２３１−２２３９、Ｔｒｉｃｏｔ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ９３（１１）：１７３９−１７４２、及びＷｅａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２７（２）：Ｓ２３−Ｓ２９、を参照）。血液サンプルの収集、抗血液凝固およびその処理などの方法は、当業者には公知である。例えば、Ａｌｓｅｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９４１，Ｎ．Ｙ．Ｓｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．４１：１２６、Ｄｅ Ｇｏｗｉｎ，ｅｔ ａｌ．，１９４０，Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓ．１１４：８５０、Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，１９５９，Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．３８：５７３、Ｒｏｕｓ及びＴｕｒｎｅｒ，１９１６，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２３：２１９、及びＨｕｍ，１９６８，Ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６−１６０を参照のこと。ＨＳＰＣ源にはまた、適正年齢ドナーからの、骨髄（Ｋｏｄｏ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．７３：１３７７−１３８４を参照）、胚細胞、大動脈・性腺・中腎派生細胞、リンパ、肝臓、胸腺、及び脾臓を含む。ＨＳＰＣの収集された全てのサンプルは、その時点で許容される最新の基準に従って、望ましくない成分を選び出し及び破棄し、処理し、または利用できる。

【0019】

ＨＳＰＣは、任意の適切な技術を使用したサンプルから、収集され及び単離できる。適切な収集及び単離の手順には、磁気分離、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ；Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：１００４、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，１９８６、Ｂｌｏｏｄ ６８（１）：１２６−１３３）、親和性クロマトグラフィー、モノクローナル抗体に結合して、または補体及び細胞毒素などのモノクローナル抗体と併用して使用される細胞毒性薬、固相母体に付着した抗体との「プランニング」（Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７３：９３９−９５３）、大豆などのレクチンを用いた選択的凝集（Ｒｅｉｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７７：１１６４）などを含む。

【0020】

特定の実施形態において、ＨＳＰＣサンプル（例えば、新鮮な臍帯血ユニット）は、磁気細胞分離機、例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）細胞分離システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、 Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に組み込まれた磁気粒子に直接または間接に接合させられた抗―ＣＤ３４抗体を用いて、ＣＤ３４＋細胞に対して選択／濃縮の処置ができる。正常な骨髄細胞数の１−２％から５０−８０％へのＣＤ３４＋ＨＳＰＣの濃縮を記述する、米国特許第７，３９９，６３３号のセクション５．４．１．１を参照のこと。

【0021】

同様に、ＣＤ４３、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１０９、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ１６６、ＨＬＡ ＤＲ、またはそれらの組み合わせを発現しているＨＳＰＣを、それら抗原に対する抗体を使用して濃縮できる。米国特許第５，８７７，２９９号は、サンプルからＨＳＰＣ細胞を単離し、収集し、及び濃縮するために使用可能である適切な造血抗原をさらに記述している。

【0022】

以下の単離及び／または濃縮によって、ＨＳＰＣの数を増加するために、ＨＳＰＣを増殖できる。単離及び／または増殖法は、例えば、米国特許第７，３９９，６３３号及び第５，００４，６８１号、米国特許公開番号２０１０／０１８３５６４、国際公開特許（ＷＯ）ＷＯ２００６／０４７５６９、ＷＯ２００７／０９５５９４、ＷＯ２０１１／１２７４７０、及びＷＯ２０１１／１２７４７２、Ｖａｍｕｍ−Ｆｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９３、Ｂｌｏｏｄ １０１：１７８４−１７８９、Ｄｅｌａｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｂｌｏｏｄ １０６：２６９３−２６９９、Ｏｈｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００２、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１０：１１６５−１１７４、Ｄｅｌａｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１６（２）：２３２−２３６、及びＣｈａｐｔｅｒ ２ ｏｆ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ａｕｇｕｓｔ ２００６、及び本明細書の参照欄に記述される。収集、単離、及び増殖で参照される各方法は、本開示の特定の実施形態において、利用可能である。

【0023】

ＨＳＰＣを増殖する好ましい方法は、ノッチアゴニストを伴うＨＳＰＣの増殖である。ノッチアゴニストを使用したＨＳＰＣの増殖に関する情報については、米国特許第７，３９９，６３３号のセクション５．１及び５．３、米国特許第５，７８０，３００号、第５，６４８，４６４号、第５，８４９，８６９号、及び第５，８５６，４４１号、ＷＯ１９９２／１１９７３４、Ｓｃｈｌｏｎｄｏｒｆｉａｎｄ Ｂｌｏｂｅｌ，１９９９、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１２：３６０３−３６１７、Ｏｌｋｋｏｎｅｎ ａｎｄ Ｓｔｅｎｍａｒｋ，１９９７，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１７６：１−８５、Ｋｏｐａｎ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｃｅｌｌ １３７：２１６−２３３、Ｒｅｂａｙ ｅｔ ａｌ．，１９９１、Ｃｅｌｌ ６７：６８７−６９９、及びＪａｒｒｉａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：７４２３−７４３１を参照のこと。特定の実施形態において、当該ノッチアゴニストは、増殖中に固定される。

【0024】

ノッチアゴニストは、そのニッチ経路において、ノッチタンパク質またはその他のタンパク質に結合するかもしくは相互作用し、そのためノッチ経路の活性化を促進する任意の化合物を含む。例示的なノッチアゴニストは、リガンドのＤｅｌｔａ及びＳｅｒｒａｔｅ（例えば、Ｊａｇｇｅｄ）を結合する細胞外成分、ＨａｉｒｌｅｓｓのＲＢＰ ＪκＩ 抑制遺伝子、Ｄｅｌｔｅｘ、Ｆｒｉｎｇｅ、またはノッチ経路の活性化を促進するそれらのフラグメントである。Ｄｅｌｔａファミリーメンバー及びＳｅｒｒａｔｅファミリーメンバーの核酸及びアミノ酸配列は、複数の種から単離されており、及び例えば、ＷＯ１９９３／１２１４１、ＷＯ１９９６／２７６１０、ＷＯ１９９７／０１５７１、及びＧｒａｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１５４：７８５−７９４に記述される。

【0025】

特定の実施形態において、当該ノッチアゴニストは、Ｄｅｌｔａ１^{ｅｘｔ−ＩｇＧ}である。特定の実施形態において、Ｄｅｌｔａ１^{ｅｘｔ−ＩｇＧ}は、０．２から２０ μｇ／ｍｌの間の濃度で、１．２５から１０ μｇ／ｍｌの間の濃度で、または２から６ μｇ／ｍｌの間の濃度で、固相に適用される。

【0026】

特定の実施形態において、増殖の間に、ＨＳＰＣは、ノッチアゴニスト及びアリール炭化水素受容体アンタゴニストの存在中で、培養される。当該ノッチアゴニストは、固定され得て、及び当該アリール炭化水素受容体アンタゴニストは、その細胞に接触している液体中に存在し得る。

【0027】

当業者には理解されることだが、さらなる培養条件には、アンジオポエチン様タンパク質（Ａｎｇｐｔｌｓ、例えば、Ａｎｇｐｔｌ２、Ａｎｇｐｔｌ３、Ａｎｇｐｔｌ７、Ａｎｇｐｔ１５、およびＭｆａｐ４)、エリスロポエチン、線維芽細胞成長因子１（ＦＧＦ−１）、Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インスリン成長因子２（ＩＦＧ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、幹細胞因子（ＳＣＦ、またｃ−ｋｉｔリガンドまたは肥満細胞の成長因子として知られる）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、それらの類似体（ここでその類似体には、天然に存在する成長因子の生物学的活性を有する成長因子の任意の構造変異体を含み、例えば、ＷＯ２００７／１１４５２２７、米国特許公開番号２０１０／０１８３５６４を参照）などの、１つ以上の成長因子の存在下での増殖を含めることができる。

【0028】

特定の実施形態において、ＨＳＰＣの増殖に適切な成長因子の量または濃度は、ＨＳＰＣの増殖を促進させるが、しかしそれに続くそのＨＳＰＣの分化を促進させないのに効果的な量または濃度である。細胞数はまた、ヒトの対象者に少なくとも一回の点滴を与えるのに適切な数の細胞、通常は約１０^４ 細胞／ｋｇから１０^９ 細胞／ｋｇが得られるまで、好ましくは増殖される。

【0029】

ＨＳＰＣの増殖に適した成長因子の量または濃度は、成長因子調製液の活性、及びその成長因子及びＨＳＰＣ間の種の対応性に依存している。一般的に、成長因子とＨＳＰＣが同一種である場合、その培地中の成長因子の総量は、１ ｎｇ／ｍｌから５ μｇ／ｍｌの範囲に、５ ｎｇ／ｍｌから１ μｇ／ｍｌの範囲に、または５ ｎｇ／ｍｌから２５０ ｎｇ／ｍｌの範囲にある。さらなる実施形態において、成長因子の量は、５−１０００または５０−１００ ｎｇ／ｍｌの範囲にあり得る。

【0030】

特定の実施形態において、前述の成長因子は、以下の濃度におけるＨＳＰＣ増殖の培養条件中に存在する。２５−３００ ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、２５−３００ ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ−３Ｌ、２５−１００ ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、２５−１００ ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６及び１０ ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３。より特定の実施形態において、５０、１００、または２００ ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、５０、１００、または２００ ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ−３Ｌ、５０または１００ ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、５０または１００ ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６、及び１０ ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３が使用され得る。

【0031】

特定の実施形態において、ＨＳＰＣは、１つの固定されたノッチアゴニスト、及び５０ ｎｇ／ｍｌまたは１００ ｎｇ／ｍｌのＳＣＦに、１つの固定されたノッチアゴニスト、及び５０ ｎｇ／ｍｌまたは１００ ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ−３Ｌ、ＩＬ−６、ＴＰＯ、及びＳＣＦの各々、または１つの固定されたノッチアゴニスト、及び５０ ｎｇ／ｍｌまたは１００ ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ−３Ｌ、ＩＬ−６、ＴＰＯ、及びＳＣＦの各々、そして１0 ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１１またはＩＬ−３に、そのＨＳＰＣを暴露することにより増殖され得る。

【0032】

ＨＳＰＣは、フィブロネクチン（ＦＮ）、またはそのフラグメント(例えば、ＣＨ−２９６（Ｄａｏ ｅｔ．ａｌ．，１９９８，Ｂｌｏｏｄ ９２（１２）：４６１２−２１）)またはＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）(遺伝子組換えヒトフィブロネクチン・フラグメント(Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ)などの、細胞外マトリックスタンパク質が結合されている培養の組織培養皿中で増殖され得る。

【0033】

特定の実施形態において、ＨＳＰＣ増殖法には、固定化Ｄｅｌｔａ１^{ｅｘｔ−ＩｇＧ}及びＣＨ−２９６、そしてＩＬ−６、ＴＰＯ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＣＳＦ、及びＩＬ−３から選ばれる４つ以上の成長因子でコートされた固相上で、体外的に単離されたＨＳＰＣを培養し、その結果、増殖されたＨＳＰＣサンプルを産出する方法を含む。

【0034】

ＨＳＰＣを増殖する特定の実施形態において、当該細胞は、固定化Ｄｅｌｔａリガンド及びフィブロネクチンそして２５ ｎｇ／ｍｌまたは１００ ｎｇ／ｍｌ（またはこれらの値間の任意の範囲）、及び好ましくは５０ ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ及びＴＰＯの各々を含む、プラスチック製の組織培養皿上で培養される。ＨＳＰＣを増殖する特定の実施形態において、当該細胞は、２５ ｎｇ／ｍｌまたは１００ ｎｇ／ｍｌ（またはこれらの値間の任意の範囲）、及び好ましくは５０ ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ及びＦｌｔ−３Ｌの各々の存在下における、固定化Ｄｅｌｔａリガンド及びフィブロネクチンを含むプラスチック製の組織培養皿上で培養される。ＨＳＰＣを増殖する特定の実施形態において、当該細胞は、固定化Ｄｅｌｔａリガンド及びフィブロネクチンそして２５ ｎｇ／ｍｌまたは１００ ｎｇ／ｍｌ（またはこれらの値間の任意の範囲）、及び好ましくは５０ ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、Ｆｌｔ−３Ｌ及びＴＰＯの各々を含む、プラスチック製の組織培養皿上で培養される。ＨＳＰＣを増殖する特定の実施形態において、当該細胞は、固定化Ｄｅｌｔａリガンド及びフィブロネクチンそして２５ ｎｇ／ｍｌまたは１００ ｎｇ／ｍｌ（またはこれらの値間の任意の範囲）、及び好ましくは５０ ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＴＰＯ、及びＩＬ−６の各々を含む、プラスチック製の組織培養皿上で培養される。特定の実施形態において、当該ＨＳＰＣはさらに、５から１５ ｎｇ／ｍｌ、及び好ましくは１０ ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３の存在下で培養される。特定の実施形態において、当該ＨＳＰＣはさらに、５から１５ ｎｇ／ｍｌ、及び好ましくは１０ ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦの存在下で培養される。特定の実施形態において、使用されるひとつ以上の成長因子は、ＧＭ−ＳＣＦまたはＩＬ−７ではない。特定の互換的な実施形態において、フィブロネクチンは、その組織培養皿から除外されまたは別の細胞外マトリクスタンパク質に置き換えられる。ＨＳＰＣの増殖に関するさらなる方法及び詳細は、ＷＯ ２０１３／０８６４３６に見出せる。

【0035】

特定の実施形態において、記述される方法を利用して得られた、増殖ＨＳＰＣサンプル中のＣＤ３４＋細胞のパーセンテージは、増殖前の単離ＨＳＰＣ中のＣＤ３４＋細胞のパーセンテージより高い。適切な培養条件に関するさらなる情報については、米国特許第７，３９９，６３３号、米国特許公開番号２０１０／０１８３５６４、及びＦｒｅｓｈｎｅｙ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９９４））を参照のこと。

【0036】

改変ＨＳＰＣ。特定の実施形態において、ＨＳＰＣは、１つの細胞外成分及び１つの細胞内成分を有する分子を発現するように改変される。その細胞外成分及びの細胞内成分は、直接にまたはスペーサー領域を介して、１つの膜貫通ドメイン、１つのタグ配列、及び／または１つのリンカー配列に連結され得る。

【0037】

細胞外成分。細胞外成分は、ドメインを連結している（これ以降は、結合ドメイン）少なくとも１つのリガンドを含む。その結合ドメインは、当該改変された細胞が、特に望ましくない細胞型を、その望ましくない細胞型上に選択的に見出される細胞マーカーを結合することによって標的にするように設計される。

【0038】

細胞マーカー。特定の実施形態において、細胞マーカーは、望ましくないがん細胞のような望ましくない細胞により選択的に発現される。「選択的に発現された」は、１つの細胞マーカーが、１つの望ましくない細胞型上に、その他の非標的細胞に比べて、より高いレベルで見出されることを意味する。健全な医療判断内で、そのマーカーの存在に基づいてその望ましくない細胞を標的にし、及び殺傷する細胞の投与が、そのマーカーをより少ない程度に発現させるかもしれない別の非標的細胞を巻き添え死させるリスクを上回っている、そうした発現レベルの違いが非常に重要である。ある例において、細胞マーカーは、望ましくない細胞型のみにより発現される。その他に例においては、当該細胞マーカーは、望ましくない細胞型上に、非標的細胞に比べて、少なくとも２５％、３５％、４５％、５５％、６５％、７５％、８５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％以上多く発現される。例示的な望ましくないがん細胞には、副腎がん、膀胱がん、血液がん、骨がん、脳腫瘍、乳がん、上皮性悪性腫瘍、子宮頸がん、結腸がん、大腸がん、コーパス子宮がん、耳、鼻と喉（ＥＮＴ）のがん、子宮内膜がん、食道がん、消化管がん、頭頸部のがん、ホジキン病、腸がん、腎臓がん、喉頭がん、白血病、肝臓がん、リンパ節がん、リンパ腫、肺がん、黒色腫、中皮腫、骨髄腫、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキン病のリンパ腫、口腔がん、卵巣がん、膵がん、陰茎がん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、非上皮性悪性腫瘍、精上皮腫、皮膚がん、胃がん、奇形腫、精巣がん、甲状腺がん、子宮がん、腟がん、血管系腫瘍、及びそれらの転移からのがん細胞を含む。

【0039】

特定の以下のがん細胞は、関連する細胞マーカーを結合するドメインを、その細胞外成分内に含めることにより標的化され得る。

【表1】

【0040】

上述の限定なしに、細胞マーカーにはまた、Ａ３３、ＢＡＧＥ、Ｂｃｌ−２、β−カテニン、Ｂ７Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１９−９、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤ１２３、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＳ−１、サイクリンＢ１、ＤＡＧＥ、ＥＢＮＡ、ＥＧＦＲ、エフリンＢ２、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥｐｈＡ２、エストロゲン受容体、ＦＡＰ、フェリチン、α-フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＦＬＴ１、ＦＬＴ４、葉酸結合タンパク質、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、ＧＡＧＥ、Ｇ２５０、ＧＤ−２、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＲ、ＧＭ２、ｇｐ７５、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ １７）、ｇｐ１３０、ＨＬＡ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＨＶＥＭ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ６Ｒ、ＫＤＲ、Ｋｉ−６７、ＬＩＦＲβ、ＬＲＰ、ＬＲＰ５、ＬＴβＲ、メソテリン、ＯＳＭＲβ、ｐ５３、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＲＡＭＥ、プロゲステロン受容体、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＴＣＨ１、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ、メソテリン、ＭＵＣ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ−１−Ｂ、ｍｙｃ、ＮＹＥＳＯ−１、ＲＡＮＫ、ｒａｓ、Ｒｏｂｏ１、ＲＯＲｌ、サバイビン、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、テネイシン、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＷＥＡＫ−Ｒ、ＴＳＴＡチロシナーゼ、ＶＥＧＦ、及びＷＴ１を含む。

【0041】

特定のがん細胞の細胞マーカーには、以下を含む。

【表2】

【0042】

望ましくない細胞及び細胞マーカーは、がん細胞及びがん細胞マーカーに限定されないが、例えば、Ｂ型肝炎表面抗原を発現するものなどのウイルス感染細胞もまた、含むことができる。

【0043】

結合ドメイン。結合ドメインには、錯体を形成する細胞マーカーを結合する任意の物質を含む。結合ドメインの例には、細胞マーカーリガンド、受容体リガンド、抗体、ペプチド、ペプチドアプタマー、受容体（例えば、Ｔ細胞受容体）、またはそれらの組み合わせを含む。

【0044】

抗体は、結合ドメインの一例であり及び全ての抗体または抗体に結合しているフラグメント、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｃ、及び単鎖（ｓｃ）形成体及び細胞マーカーを特異的に結合するそれらのフラグメントを含む。さらなる例示には、ｓｃＦｖ−ベースのグラバ抗体（ｇｒａｂａｂｏｄｙ）及び溶解性ＶＨドメイン抗体を含む。これらの抗体は、重鎖の可変領域のみを使用した結合領域を形成する。例えば、Ｊｅｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：１１６１，２００４、Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４：２８５３，２００４、Ｂａｒａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１２：５８０，２００６、及びＢａｒｔｈｅｌｅｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：３６３９，２００８）を参照のこと。

【0045】

抗体またはフラグメントを結合している抗原には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ミニ抗体、及び線形抗体の全て又は一部を含むことができる。

【0046】

ヒト起源の抗体またはヒト化抗体は、ヒトにおける免疫原性が低いかもしくは無く及び非ヒト抗体と比べて少ない数の非免疫原性エピトープを有する。抗体及びそれらのフラグメントは一般に、ヒトの対象者において抗原のレベルを低くまたは無いように選択される。

【0047】

特定の細胞マーカーを特異的に結合する抗体は、モノクローナル抗体を得る方法、ファージディスプレイ方法、ヒトまたはヒト化抗体を生成する方法、または当業者には公知である、抗体を作り出すために組み換えられた遺伝子組換え動物または植物を使用する方法（例えば、米国特許第６，２９１，１６１号及び第６，２９１，１５８号を参照)、を利用して調製できる。合成抗体の一部または全体のファージディスプレイ用ライブラリーが利用可能であり及び細胞マーカーを結合できる抗体またはそれらのフラグメントを選別できる。例えば、結合ドメインは、対象となる細胞マーカーに特異的に結合するＦａｂフラグメントに対応したＦａｂファージライブラリーを選別することで、特定されるであろう（Ｈｏｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：３４４、２００５を参照）。ヒト抗体のファージディスプレイ用ライブラリーもまた、利用可能である。さらに、簡便な系統（例えば、マウス、ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）（ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔ’‘ｌ．Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）ＴＣマウス（登録商標）（Ｋｉｒｉｎ Ｐｈａｒｍａ Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，ＪＰ）、ＫＭ−マウス（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）ラマ、チキン、ラット、ハムスター、ウサギなど）における免疫源として、対象の細胞マーカーを使用したハイブリドーマ発現に対応した伝統的な戦略が、結合ドメインの発現に利用できる。特定の実施形態において、抗体は、特定の望ましくない細胞型により選択的に発現された細胞マーカーを結合し及び非特異の成分または関連しない標的とは交差反応しない。一度特定されると、その抗体のアミノ酸配列及びその抗体をコードしている遺伝子配列が、単離でき及び／または決定できる。

【0048】

結合ドメインの代替源には、ｓｃＴＣＲ（例えば、Ｌａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：７４５，１９９９、Ｍａｙｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３０６：５１，２００５、米国特許第８，３６１，７９４号を参照）、フィブリノゲンドメイン（例えば、Ｗｅｉｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３８８，１９８５を参照）、クニッツドメイン（例えば、米国特許第６，４２３，４９８号を参照）、設計されたアンキリン繰り返しタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ；Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２：４８９，２００３、及びＢｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：５７５，２００４）、フィブロネクチン結合ドメイン（アドネクチンまたはモノボディー、Ｒｉｃｈａｒｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２６：１４７５，２００３、Ｐａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌｅｃ．１８：４３５，２００５及びＨａｃｋｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８１：１２３８−１２５２）、システイン−結び目ミニタンパク質（Ｖｉｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９２：６４０４−６４０８；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００２、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：７１，２００２、及びＨｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １３：７５５，２００５）、テトラトリコペプチドの繰り返しドメイン（Ｍａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １１：４９７，２００３及びＣｏｒｔａｊａｒｅｎａ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３：１６１，２００８）、ロイシン−リッチ繰り返しドメイン（Ｓｔｕｍｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２：４７１，２００３）、リポカリンドメイン（例えば、ＷＯ ２００６／０９５１６４、Ｂｅｓｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ‘ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９６：１８９８、１９９９、及びＳｃｈｏｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ‘ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１０６：８１９８，２００９を参照）、Ｖ−様ドメイン（例えば、米国特許公開番号２００７／００６５４３１を参照）、Ｃ型レクチンドメイン（Ｚｅｌｅｎｓｋｙ及びＧｒｅａｄｙ，ＦＥＢＳ Ｊ．２７２：６１７９，２００５、Ｂｅａｖｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ‘ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８９：７５３，１９９２及びＳａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１００：７７７９，２００３）、ｍＡｂ２またはＦｃａｂ商標（例えば、ＷＯ ２００７／０９８９３４及びＷＯ ２００６／０７２６２０を参照）、アルマジロの繰り返しタンパク質（例えば、Ｍａｄｈｕｒａｎｔａｋａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２１：１０１５，２０１２、ＷＯ ２００９／０４０３３８を参照）、アフィリン（Ｅｂｅｒｓｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７２：１７２，２００７）、アフィボディー（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、アビマー（ａｖｉｍｅｒｓ）、ノッチン（ｋｎｏｔｔｉｎｓ）、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒｓ）、アトリマー（ａｔｒｉｍｅｒｓ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質−４（Ｗｅｉｄｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎ．Ｐｒｏｔｅｏ．１０：１５５，２０１３）、またはそれらに類するもの（Ｎｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：６０１，１９９５、Ｎｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：７７２，１９９７、Ｎｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８：４２６９，２００１、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１２５７，２００５、Ｂｏｅｒｓｍａ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：８４９，２０１１）などの、ランダムペプチド・ライブラリーをコードする配列または互換的な非抗体スカフォードのループ領域におけるアミノ酸の組換え多様性をコードする配列を含む。

【0049】

特定の実施形態において、結合ドメインは、Ｖα／β及びＣα／β鎖（例えば、Ｖα−Ｃα、Ｖβ−Ｃβ、Ｖα−Ｖβ）を含む、または対象の細胞マーカー（例えば、ペプチド−ＭＨＣ錯体）に対して特異的なＶα−Ｃα、Ｖβ−Ｃβ、Ｖα−Ｖβペアを含む、単鎖Ｔ細胞受容体（ｓｃＴＣＲ）である。

【0050】

ペプチドアプタマーには、タンパク質スカフォードの両端に接続している（細胞マーカーに特異的な）ペプチドループを含む。この二重の構造上の制約が、ペプチドアプタマーの結合親和性を、抗体に匹敵するレベルに増加させる。可変のループ長は、通常は８から２０のアミノ酸であり及びそのスカフォードは、任意の、安定した、溶解性の、小さな、及び非毒性のタンパク質であり得る。ペプチドアプタマーの選択は、酵母２−ハイブリッドシステム（例えば、Ｇａｌ４酵母−２−ハイブリッドシステム）、またはＬｅｘＡ相互作用トラップシステムなどの異なるシステムを利用して実施できる。

【0051】

特定の実施形態において、当該結合ドメインは、細胞マーカーＣＤ１９を結合する抗体であり得る。特定の実施形態において、結合ドメインは、ＣＤ１９に特異的なＶＨ及びＶＬ領域を含む単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。特定の実施形態において、そのＶＨ及びＶＬ領域は、ヒトである。例示的なＶＨ及びＶＬ領域には、抗ＣＤ１９特異のモノクローナル抗体ＦＭＣ６３のセグメントを含む。特定の実施形態において、当該ｓｃＦＶは、ヒトまたはヒト化のフラグメントであり及びＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮであるＣＤＲＬ１の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０８）、ＳＲＬＨＳＧＶであるＣＤＲＬ２の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１１）、及びＧＮＴＬＰＹＴＦＧであるＣＤＲＬ３の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０４）を含む、可変部の軽鎖を含む。他の実施形態において、当該ｓｃＦＶは、ＤＹＧＶＳであるＣＤＲＨ１の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０３）、ＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳであるＣＤＲＨ２の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１４）、及びＹＡＭＤＹＷＧであるＣＤＲＨ３の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１５）を含む可変部の重鎖を含む、ヒトまたはヒト化のＳｃＦｖである。

【0052】

結合ドメインをコードする遺伝子配列を、ＦＭＣ６３などの、ＣＤ１９を特異的に結合する抗体からのｓｃＦＶとして、図１に示す。ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）のアミノ酸を含むフレキシブルリンカーをコードする遺伝子配列は、当該ｓｃＦＶのＶＨとＶＬを分離する。そのリンカーを含む当該ｓｃＦｖのアミノ酸配列を、図２に示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）。ＳＪ２５Ｃ１（Ｂｅｊｃｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５、ＰＭＩＤ ７５３８９０１）及びＨＤ３７（Ｐｅｚｕｔｔｏ ｅｔ ａｌ．ＪＩ １９８７、ＰＭＩＤ ２４３７１９９）などのその他のＣＤ１９標的抗体が知られている。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０は、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）のＤＮＡ配列を与え及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９は、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）のアミノ酸配列を与える。

【0053】

特定の実施形態において、当該結合ドメインは、細胞マーカーＲＯＲ１を結合する。特定の実施形態において、当該ｓｃＦＶは、ＡＳＧＦＤＦＳＡＹＹＭであるＣＤＲＬ１の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０１）、ＴＩＹＰＳＳＧであるＣＤＲＬ２の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１２）、及びＡＤＲＡＴＹＦＣＡであるＣＤＲＬ３の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１００）を含む可変部の軽鎖を含む、ヒトまたはヒト化のｓｃＦｖである。特定の実施形態において、当該ｓｃＦＶは、ＤＴＩＤＷＹであるＣＤＲＨ１の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０２）、ＶＱＳＤＧＳＹＴＫＲＰＧＶＰＤＲであるＣＤＲＨ２の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１３）、及びＹＩＧＧＹＶＦＧであるＣＤＲＨ３の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１７）を含む可変部の重鎖を含む、ヒトまたはヒト化のｓｃＦｖである。

【0054】

特定の実施形態において、当該結合ドメインは、細胞マーカーＲＯＲ１を結合する。特定の実施形態において、当該ｓｃＦＶは、ＳＧＳＤＩＮＤＹＰＩＳであるＣＤＲＬ１の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０９）、ＩＮＳＧＧＳＴであるＣＤＲＬ２の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０５）、及びＹＦＣＡＲＧＹＳであるＣＤＲＬ３の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１６）を含む可変部の軽鎖を含む、ヒトまたはヒト化のｓｃＦｖである。特定の実施形態において、当該ｓｃＦＶは、ＳＮＬＡＷであるＣＤＲＨ１の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１０）、ＲＡＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳであるＣＤＲＨ２の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０７）、及びＮＶＳＹＲＴＳＦであるＣＤＲＨ３の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０６）を含む可変部の重鎖を含む、ヒトまたはヒト化のＳｃＦｖである。ＲＯＲ１に特異的なさらなる多数の抗体が、当業者には知られている。

【0055】

特定の実施形態において、当該結合ドメインは、細胞マーカーＨｅｒ２を結合する。Ｈｅｒ２に特異的な多数の抗体が、当業者には知られており及び配列、エピトープ結合、及び親和性に対応して容易に特徴づけることができる。特定の実施形態において、当該結合ドメインは、ハーセプチン抗体からのｓｃＦｖ配列を含む。特定の実施形態において、当該結合ドメインは、ハーセプチン抗体のＣＤＲＬ１配列、ＣＤＲＬ２配列、及びＣＤＲＬ３配列を含む可変部の軽鎖を含む、ヒトまたはヒト化のＳｃＦｖである。特定の実施形態において、当該ｓｃＦＶは、ハーセプチン抗体のＣＤＲＨ１配列、ＣＤＲＨ２配列、及びＣＤＲＨ３配列を含む可変部の重鎖を含む、ヒトまたはヒト化のＳｃＦｖである。当該ＣＤＲ配列は、ハーセプチンのアミノ酸配列から容易に決定できる。Ｈｅｒ２リガンド結合ドメインをコードする例示的な遺伝子配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９及び４０に見出せる。

【0056】

特定の実施形態において、ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔにより以下のように数えられる抗体領域内に見出せる。軽鎖に対しては、ＣＤＲＬ１は、アミノ酸２４−３４、ＣＤＲＬ２は、アミノ酸５０−５６、ＣＤＲＬ３は、アミノ酸８９−９７及び重鎖に対しては、ＣＤＲＨ１は、アミノ酸３１−３５、ＣＤＲＨ２は、アミノ酸５０−６５、ＣＤＲＨ３は、アミノ酸９５−１０２。

【0057】

その他の抗体が公知であり及び商業的に入手可能である。例えば、抗ＰＳＭＡ及び抗ＰＳＣＡ抗体は、Ａｂｃａｍ ｐｌｃ（各々、ａｂ６６９１２及びａｂ１５１６８）から入手可能である。メソテリン及びＷＴ１抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃから入手可能である。リツキシマブ（商品名が、Ｒｉｔｕｘａｎ、ＭａｂＴｈｅｒａ及びＺｙｔｕｘ）などの抗ＣＤ２０抗体が、ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにより開発されている。

【0058】

細胞内成分。分子を発現する細胞内成分には、エフェクタードメインを含めることができる。エフェクタードメインは、細胞に機能的なシグナルを送ることができる。特定の実施形態において、エフェクタードメインは、直接的に細胞応答を高める１つ以上の他のタンパク質を伴って、直接的または間接的に細胞応答を高める。エフェクタードメインは、望ましくない細胞に発現する細胞マーカーを結合している、改変された細胞の少なくとも１つの機能の活性化を与えることができる。その改変された細胞の活性化には、分化、増殖及び／または活性化または別のエフェクター機能の１つ以上を含むことができる。

【0059】

エフェクタードメインは、１つ、２つ、３つまたはそれ以上の受容体シグナル伝達ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、細胞質シグナル伝達の配列）、供刺激ドメイン、またはそれらの組み合わせを含むことができる。例示的なエフェクタードメインには、４−１ＢＢ、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＤＡＰ１０、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、Ｆｙｎ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＬＡＴ、Ｌｃｋ、ＬＲＰ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＯＴＣＨ１、ｐＴα、ＰＴＣＨ２、ＯＸ４０、ＲＯＲ２、Ｒｙｋ、ＳＬＡＭＦ１、Ｓｌｐ７６、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＲＩＭ、Ｗｎｔ、Ｚａｐ７０、またはそれらの任意の組み合わせから選択された、シグナル伝達及び刺激ドメインを含む。

【0060】

刺激により作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、受容体チロシン活性化モチーフまたはｉＴＡＭｓとして知られるシグナル伝達モチーフを含んで良い。一次細胞質シグナル伝達配列を含むｉＴＡＭの例には、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＦｅＲγから誘導されたものを含む。特定の実施形態において、ＣＤ３ζの変異体は、図７に示される、少なくとも１つの、２つの、３つの、または全てのＩＴＡＭ領域を保有する。

【0061】

特定の実施形態において、エフェクタードメインには、細胞質シグナル伝達タンパク質を関連付ける細胞質部分を含み、ここでその細胞質シグナル伝達タンパク質は、リンパ球受容体またはそれらのシグナル伝達ドメイン、ＩＴＡＭ、供刺激ドメインの大多数を含むタンパク質、または任意のそれらの組み合わせである。

【0062】

細胞内シグナル伝達ドメインの例には、ＣＤ３ζ鎖の細胞質配列、及び／または結合ドメインの関与に続くシグナルの形質導入の開始と同時に作用する共受容体を含む。

【0063】

特定の実施形態において、改変された細胞により発現した分子の細胞内シグナル伝達ドメインは、任意のその他の望ましい細胞質ドメインと組み合わされた、細胞内シグナル伝達ドメインを含むように設計できる。例えば、分子の細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内シグナル伝達ドメイン及び共刺激領域などの共刺激ドメインを含むことができる。

【0064】

この共刺激シグナル伝達領域は、共刺激ドメインの細胞内ドメインを含む分子の一部を指す。共刺激ドメインは、細胞マーカーの結合に対してリンパ球が応答できるようにされた、発現された細胞マーカー結合ドメイン以外の、細胞表面分子である。そのような分子の例には、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ １３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、リンパ球官能−関連抗体−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３に特異的に結合するリガンドを含む。

【0065】

特定の実施形態において、ＣＤ３ζの変異体を含む細胞内シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列及び４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインの一部は、図２に与えられる。代表的な遺伝子配列は、図１に与えられる（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）。

【0066】

特定の実施形態において、当該細胞内シグナル伝達ドメインには、（ｉ）ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインの全てまたは一部、（ｉｉ）ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインの全てまたは一部、（ｉｉｉ）４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインの全てまたは一部、または（ｉｖ）ＣＤ３ζ、ＣＤ２８及び／または４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインの全てまたは一部を含む。

【0067】

発現された分子の細胞内シグナル伝達ドメインの配列は、互いにランダムにまたは特定の順序で連結され得る。任意で、好ましくは２から１０のアミノ酸の長さであるショートオリゴ−またはタンパク質リンカーは、連結を形成して良い。

【0068】

スペーサー領域。特定の実施形態において、スペーサー領域は、その結合ドメインと、発現された分子の細胞内成分との間に見出される。特定の実施形態において、当該スペーサー領域は、発現された分子の細胞外成分の一部分である。

【0069】

スペーサー領域の長さは、望ましくない細胞の認識及び破壊を最適化するために、望ましくない細胞上の個別の細胞マーカーに対応してカスタマイズできる。特定の実施形態において、スペーサー領域の長さは、細胞マーカーエピトープの場所、そのエピトープへの結合ドメインの親和性、及び／または細胞マーカーの認識に応答して、体外及び／または体内で増殖する分子を発現している改変細胞の能力に応じて選択できる。

【0070】

通常、スペーサー領域は、発現された分子の結合ドメインと膜貫通ドメインの間に見出せる。スペーサー領域は、その結合ドメインに柔軟性を与え、及び改変された細胞に高い発現レベルを与えることができる。特定の実施形態において、スペーサー領域は、少なくとも１０から２５０のアミノ酸、少なくとも１０から２００のアミノ酸、少なくとも１０から１５０のアミノ酸、少なくとも１０から１００のアミノ酸、少なくとも１０から５０のアミノ酸、または少なくとも１０から２５のアミノ酸を有することができる。さらなる実施形態において、スペーサー領域は、２５０以下のアミノ酸、２００以下のアミノ酸、１５０以下のアミノ酸、１００以下のアミノ酸、５０以下のアミノ酸、４０以下のアミノ酸、３０以下のアミノ酸、２０以下のアミノ酸、または１０以下のアミノ酸を有する。

【0071】

特定の実施形態において、スペーサー領域は、免疫グロブリン様分子のヒンジ領域、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４からのヒンジ領域の全てまたはその一部から誘導され得る。ヒンジ領域は、二量体化などの望ましくない構造的相互作用を避けるために改変できる。特定の実施形態において、ヒンジ領域の全てまたはその一部は、免疫グロブリンの定常領域の１つ以上のドメインと組み合わせることができる。例えば、ヒンジ領域の一部分は、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインの全てまたはその一部と組み合わせることができる。特定の実施形態において、当該スペーサー領域は、ＣＤ８αからの４７−４８アミノ酸のヒンジ領域配列を含まない。

【0072】

特定の実施形態において、当該スペーサー領域は、ＣＨ２領域の全てまたはその一部、ＣＨ３領域の全てまたはその一部、またはＣＨ２領域の全てまたはその一部及びＣＨ３領域の全てまたはその一部との組み合わせにおける、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ｌｇＧ３、またはｌｇＧ４からのヒンジ領域配列を含む群から選ばれる。

【0073】

特定の実施形態において、ショートスペーサー領域は、１２以下のアミノ酸を有し及びＩｇＧ４ヒンジ領域配列の全てまたはその一部（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０にコードされたタンパク質）を含み、中間スペーサー領域は、１１９以下のアミノ酸を有し及びＩｇＧ４ヒンジ領域配列及びＣＨ３領域の全てまたはその一部（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２）を含み、ロングスペーサー領域は、２２９以下のアミノ酸を有し及びＩｇＧ４ヒンジ領域配列、ＣＨ２領域、及びＣＨ３領域の全てまたはその一部（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０）を含む。

【0074】

特定の実施形態において、結合ドメインが、望ましくない細胞の膜の非常に近位にある細胞マーカーの一部を結合する場合、ロングスペーサー領域（例えば、２２９以下のアミノ酸かつ１１９以上のアミノ酸）が選ばれる。望ましくない細胞の膜の非常に近位とは、細胞マーカーの最初の１００細胞外アミノ酸内を意味する。

【0075】

特定の実施形態において、結合ドメインが、望ましくない細胞の膜の遠位にある細胞マーカーの一部を結合する場合、中間またはショートペーサー領域が選ばれる（例えば、１１９以下のアミノ酸または１２以下のアミノ酸）。

【0076】

当業者には理解されることだが、細胞マーカーの結合部分が、膜に対して近位であるか遠位であるかは、３次元構造モデルまたは結晶構造解析を基に決定できる。

【0077】

特定の実施形態において、発現された分子には、Ｉｇ／フリズルド（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）ドメインに対して膜の遠位に位置するＲＯＲ１エピトープに結合するｓｃＦＶを含む結合ドメイン及び１５以下のアミノ酸のスペーサーを含む。特定の実施形態において、発現された分子には、クリングルドメインに対して膜の近位に位置するＲＯＲ１エピトープを結合するｓｃＦＶを含む結合ドメイン及び１５アミノ酸を超えて長いスペーサーを含む。特定の実施形態において、発現された分子には、ＣＤ１９を結合するｓｃＦＶを含む結合ドメイン及び１５以下のアミノ酸であるスペーサーを含む。

【0078】

特定の実施形態において、当該結合ドメインが、（ｉ）ＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮであるＣＤＲＬ１配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８）、ＳＲＬＨＳＧＶであるＣＤＲＬ２配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１）、及びＧＮＴＬＰＹＴＦＧであるＣＤＲＬ３配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４）を含む変異軽鎖、そしてＤＹＧＶＳであるＣＤＲＨ１配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３）、ＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳであるＣＤＲＨ２配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４）、及びＹＡＭＤＹＷＧであるＣＤＲＨ３配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５）を含む変異重鎖、または（ｉｉ）ＡＳＧＦＤＦＳＡＹＹＭであるＣＤＲＬ１配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１）、ＴＩＹＰＳＳＧであるＣＤＲＬ２配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１２）、及びＡＤＲＡＴＹＦＣＡであるＣＤＲＬ３配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００）を含む変異軽鎖、そしてＤＴＩＤＷＹであるＣＤＲＨ１配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２）、ＶＱＳＤＧＳＹＴＫＲＰＧＶＰＤＲであるＣＤＲＨ２配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３）、及びＹＩＧＧＹＶＦＧであるＣＤＲＨ３配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７）を含む変異重鎖を含む場合、そのスペーサーは、１２以下のアミノ酸であり得て、より特定の実施形態においては、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７を含むことができる。

【0079】

特定の実施形態において、当該結合ドメインが、（ｉ）ＳＧＳＤＩＮＤＹＰＩＳであるＣＤＲＬ１配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）、ＩＮＳＧＧＳＴであるＣＤＲＬ２配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５）、及びＹＦＣＡＲＧＹＳであるＣＤＲＬ３配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６）を含む変異軽鎖、そしてＳＮＬＡＷであるＣＤＲＨ１配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０）、ＲＡＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳであるＣＤＲＨ２配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７）、及びＮＶＳＹＲＴＳＦであるＣＤＲＨ３配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６）を含む変異重鎖、または（ｉｉ）ハーセプチン抗体のＣＤＲＬ１配列、ＣＤＲＬ２配列及びＣＤＲＬ３配列を含む変異軽鎖、そしてハーセプチン抗体のＣＤＲＨ１配列、ＣＤＲＨ２配列及びＣＤＲＨ３配列を含む変異重鎖を含む場合、そのスペーサーは、２２９以下のアミノ酸であり得て、より特定の実施形態においては、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１を含むことができる。

【0080】

膜貫通ドメイン。本明細書に開示する発現分子はまた、膜貫通ドメイン、少なくとも当該細胞外成分及び細胞内成分の間に位置する部分を含むことができる。この膜貫通ドメインは、当該改変細胞の膜に当該発現分子を固定できる。当該膜貫通ドメインは、天然の及び／または合成の供給源のいずれかから誘導され得る。その供給源が天然の場合、当該膜貫通ドメインは、任意の膜結合または膜貫通タンパク質から誘導され得る。膜貫通ドメインには、少なくとも、Ｔ細胞受容体のα、βまたはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４の膜貫通領域を含めることができる。膜貫通ドメインには、図２または図６に示されるものを含めることができる。

【0081】

特定の実施形態において、当該膜貫通ドメインには、図２に示されるＣＤ２８膜貫通ドメインのアミノ酸配列またはＣＤ４膜貫通ドメインのアミノ酸配列を含む。ＣＤ２８膜貫通ドメインをコードする代表的な遺伝子配列を、図１に示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８は、ＣＤ４膜貫通ドメインをコードする代表的な遺伝子配列である。

【0082】

タグ配列。特定の実施形態において、当該発現分子はさらに、タグ配列を含む。タグ配列は、形質導入された細胞の特定及び／または選択に対して与えることができる。多数の異なるタグ配列を、採用できる。ポジティブに選択的なタグ配列は、遺伝子によりコードされて、当該改変細胞に導入され、その遺伝子を運ぶ細胞のポジティブな選択を限定している支配的な形質を発現する。このタイプの遺伝子は、当業者には公知であり、及びハイグロマイシンＢへの耐性を付与するハイグロマイシンＢリン酸転移酵素遺伝子（ｈｐｈ）、抗生物質０４１８への耐性をコードするＴｎ５からのアミノ配糖体のリン酸転移酵素遺伝子（ネオまたはａｐｈ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子、アデノシンのデアミナーゼの遺伝子（ＡＤＡ）、及び多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子を含む。特定の実施形態において、当該タグ配列は、図２に示される切断されたＥＧＦＲである。この切断されたＥＧＦＲをコードしている例示的な遺伝子配列を、図１に示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）。

【0083】

特定の実施形態において、機能性遺伝子は、生体内のネガティブ選択を可能にする改変ＨＳＰＣ中に導入され得る。「ネガティブ選択」とは、投与された細胞が、ある対象者の生体内条件において、変化の結果排除され得る、ということを意味する。このネガティブ選択的形質は、投与された薬剤に対する感受性を付与する遺伝子の挿入の結果、もたらすことができる。ネガティブ選択的遺伝子は、当業者には公知であり、及びガンシクロビル感受性を付与する単純ヘルペスウイルスＩ型キミジンキナーゼ（ＨＳＶ−Ｉ ＴＫ）遺伝子、細胞性ヒポキサンチン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子、細胞性アデニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）遺伝子、及び細菌性シトシンデアミナーゼを含む。ネガティブ選択を裏付けるさらなる開示には、Ｌｕｐｔｏｎ Ｓ．Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１１：６（１９９１）、Ｒｉｄｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：３１９−３３８（１９９２）、ＷＯ １９９２／００８７９６及びＷＯ １９９４／０２８１４３及び米国特許第６，０４０，１７７号、段落１４−１７）を参照のこと。

【0084】

当該改変細胞により発現される特定分子の設計は、標的細胞マーカーのタイプ、その細胞マーカーに対する結合ドメインの親和力、その細胞マーカー結合ドメインに必要な柔軟性、及び／または細胞内シグナル伝達ドメインに応じてカスタマイズされ得る。特定の実施形態において、培養で増殖し及び／または望ましくない細胞を殺傷する改変細胞の能力を決定するために、多数のコンストラクトが、生体内及び生体外モデルで試験されている。特定の実施形態において、１つの分子が、生体内で少なくとも２世代にわたり及び／または生体内への導入後７２時間以内に増殖するために、改変エフェクター（例えば、分化した改変ＨＳＰＣ）の少なくとも３０％の能力を提供するように選択される。特定の実施形態において、１つの分子が、免疫不全マウスの生体内に７２時間以内に細胞死（ＡＩＣＤ）を誘発する活性化を受ける細胞が、５０％以上になるようには選択されず、及び腫瘍細胞の存在を減らすのに失敗するようには選択されない。

【0085】

以下の開示は、発現された分子及び関連ベクターのさらに特定の例示を提供する。

【0086】

「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」は、エフェクタードメインに連結された望ましくない細胞に特異的に関連付けられた細胞マーカーを結合する結合ドマメインを含む、合成的に設計された受容体を指す。この結合ドメイン及びエフェクタードメインは、スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、タグ配列、及び／またはリンカー配列を介して連結され得る。

【0087】

特定の実施形態において、ＲＯＲ１特異の及びＣＤ１９特異のＣＡＲは、２Ａ２、Ｒ１２、及びＲ１１ ｍＡｈｓ（ＲＯＲ１）及びＦＭＣ６３ ｍＡｂ（ＣＤ１９）のＶＬ及びＶＨ鎖セグメントを使用して構築され得る。Ｒ１１及びＲ１２に対応した変異領域の配列は、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ ６（６）：ｅ２１０１８、Ｊｕｎｅ １５，２０１１において提供されている。各ｓｃＦＶは、（Ｇ４Ｓ）３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）タンパク質により、『ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３』（２２９ ＡＡ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１）、『ヒンジ−ＣＨ３』（１１９ ＡＡ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２）または『ヒンジ単独』（１２ ＡＡ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）のいずれかの配列（図１）を含む、ＩｇＧ４−Ｆｃ（Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース：Ｐ０１８６ｌ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２）から誘導されたスペーサードメインに連結される。全てのスペーサーは、天然のＩｇＧ４−Ｆｃタンパク質の１０８位に位置する「ヒンジ」ドメイン内でのＳ→Ｐ置換を含むことができ、及びヒトＣＤ２８（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ１０７４７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３）の２７ＡＡ膜貫通ドメインに及び（ｉ）天然のＣＤ２８タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３）の１８６−１８７位に位置するＬＬ→ＧＧ置換を伴うヒトＣＤ２８の４１ＡＡ細胞質ドメインまたは、（ｉｉ）ヒト４−１ＢＢ（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ０７０１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５）の４２ＡＡ細胞質ドメインのいずれかを含む、エフェクタードメインのシグナル伝達モジュールに連結され得て、その各々が、ヒトＣＤ３ζ（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ２０９６３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４）のアイソフォーム３の１１２ＡＡ細胞質ドメインに連結される。このコンストラクトは、Ｔ２Ａリボソームのスキップエレメント（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８）及びキメラ受容体下流のｔＥＧＦＲ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）をコードする。各導入遺伝子をコードするコドン最適化遺伝子配列は、合成され得て（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び、Ｎｈｅｌ及びＮｏｔ１制約サイトを使用したｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクターにクローンされ得る。このｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクターは、サイトメガロウイルスプロモーターｐＨＩＶ７をＥＦ−１プロモーターで置き換えることにより、ｐＨＩＶ７ベクターから誘導され得る。ＲＯＲ１キメラ受容体、ＣＤ１９キメラ受容体またはレンチウイルスをコードするｔＥＧＦＲは、パッケージングベクターｐＣＨＧＰ−２、ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ２及びｐＣＭＶ−Ｇ、そしてＣａｌｐｈｏｓ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用した２９３Ｔ細胞中で、産生できる。

【0088】

ＨＥＲ２特異キメラ受容体は、ＨＥＲ２上の膜近位エピトープ（図１２Ａ）を認識するＨＥＲ２特異のｍＡｂのＶＬ及びＶＨ鎖セグメントを使用して構築でき、及びそのｓｃＦＶｓは、ＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、ＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ３、及びＩｇＧ４ヒンジ単独の細胞外スペーサードメインに、及びＣＤ２８膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン（図１２Ｂ）に連結され得る。

【0089】

示されるように、各ＣＤ１９キメラ受容体は、互いに単独または並行した、ＣＤ１９特異ｍＡｂ ＦＭＣ６３（ｓｃＦｖ：ＶＬ−ＶＨ）の配列、『ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３』ドメイン（２２９ ＡＡ、ロングスペーサー）または『ヒンジ』ドメイン単独（１２ ＡＡ、ショートスペーサー）のいずれかを含むＩｇＧ４−Ｆｃから誘導されたスペーサー、及び膜近位ＣＤ２８または４−１ＢＢ共刺激ドメインを伴うＣＤ３ζのシグナル伝達モジュール（図１３Ａ）に相応した、単鎖変異フラグメントを含むことができる。導入遺伝子カセットには、キメラ受容体改変細胞に対する形質導入、選択及び生体内トラッキングのためのタグ配列として作用するように、開裂可能なＴ２Ａエレメントにより分離され、キメラ受容体遺伝子から切断されたＥＧＦＲ（ｔＥＧＦＲ）下流を含むことができる。

【0090】

当業者には理解されることだが、改変ＨＳＰＣは、ＨＳＰＣへの組換え遺伝子配列の導入により、組換えができる。遺伝子的に改変されたＨＳＰＣの記述は、米国特許第７，３９９，６３３号の５．１項に見出すことができる。当該改変細胞に望ましく発現させる遺伝子が、その細胞及び／またはそれらの産物により発現可能である当該ＨＳＰＣに導入される。

【0091】

望ましい遺伝子が、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、リン酸カルシウムを介した遺伝子導入、遺伝子配列を含むウイルスやバクテリオファージのベクターによる感染、細胞融合、染色体を介した遺伝子導入、マイクロセルを介した遺伝子導入、スフェロプラスト融合などの、当技術分野で公知の任意の方法により、ＨＳＰＣに導入され得る。外来遺伝子を細胞に導入するための多数の技術が、当技術分野で公知であり（例えば、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ及びＢｅｈｒ，１９９３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８、Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４、Ｃｌｉｎｅ、１９８５、Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２を参照）及び受け入れ細胞に必要な発現機能及び生理機能が破壊されずに利用され、提供される。その遺伝子が細胞によって発現し及びその細胞の産物により好ましく遺伝し及び発現するには、細胞に遺伝子を適切に導入するための技術が必須である。示されるように、特定の実施形態において、当該導入法には、当該細胞への選択可能なタグ配列の導入を含む。次いで、当該細胞は、導入を受け入れてその導入遺伝子を発現している細胞を単離するために、選別される。

【0092】

用語「遺伝子」は、本明細書に記述される細胞外成分及び細胞内成分を有する分子をコードする核酸配列（ポリヌクレオチドまたはヌクレオチド配列と互換的に使用される）を指す。本定義には、多様な配列の多型、変異、及び／またはそのような変更が、そのコードされた分子の機能に実質的に悪影響しない配列変異体を含む。用語「遺伝子」には、コード配列のみならず、プロモーター、エンハンサー、及び末端領域などの定常領域をも含んでよい。当該用語はさらに、互換的スプライスサイトからもたらされる変異体を伴う、ｍＲＮＡ転写からスプライスされた全てのイントロン及びその他のＤＮＡ配列を含むことができる。当該分子をコードする遺伝子配列は、当該分子の発現を指示するＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。これらの核酸配列は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ標準配列またはタンパク質に翻訳されるＲＮＡ配列であって良い。当該核酸配列には、完全長の核酸配列と同様に、その完全長タンパク質から誘導される非完全長配列の両方を含む。当該配列にはまた、天然配列または特定の細胞型にコドン選好を与えるように導入される配列の、縮退コドンを含むことができる。完全遺伝子配列の一部分が、本開示を通して参照されることは、当業者には理解されるであろう。

【0093】

結合ドメイン、エフェクタードメイン、スペーサー領域、膜貫通ドメイン、タグ配列、リンカー配列、または本明細書に記述される任意のその他のタンパク質またはペプチド配列をコードする遺伝子配列は、関連アミノ酸配列からの合成または組換え法により容易に調製できる。複数の実施形態において、これら配列のいずれをもコードする遺伝子配列はまた、異なる配列をコードする他の遺伝子配列を伴う配列をコードする遺伝子配列の切除及び交換を容易にするために、そのコード配列の５′及び／または３′末端に、１つ以上の制限酵素サイトを有することができる。複数の実施形態において、当該配列をコードする遺伝子配列は、哺乳類細胞での発現に最適化されたコドンであり得る。

【0094】

「コードする」は、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡなどの、遺伝子内のヌクレオチドの特定配列の特徴を指し、アミノ酸として定義される配列などの、その他のマクロ分子の合成に対応したテンプレートとしての役割を果たす。したがって、仮に細胞またはその他の生物学的システムにおいて、遺伝子に対応したｍＲＮＡの転写及び翻訳が、そのタンパク質を産生するならば、遺伝子はタンパク質に対してコードする。「タンパク質をコードする遺伝子配列」は、互いに縮退バージョンであり、及び同じアミノ酸配列に対してまたは本質的に同じ形態及び機能のアミノ酸配列に対してコードする全てのヌクレオチド配列を含む。

【0095】

発現された分子の一部分以上をコードするポリヌクレオチド遺伝子配列は、互いに及び関連する調節配列に、連結操作が可能である。例えば、調節配列と異種核酸配列間での機能的連結が、後者の発現をもたらすことができる。他の例として、第一核酸配列が、第二核酸配列と機能的な関係にある場合には、その第一核酸配列は、その第二核酸配列と連結操作が可能である。例えば、仮にプロモーターが、コード配列の転写または発現に影響する場合には、そのプロモーターをそのコード配列に連結操作される。一般的に、連結操作されたＤＮＡ配列は、連続しており及び、必要で有用な場所で、同じリーディングフレームにコード領域を結合する。

【0096】

レトロウイルスベクターが利用できる（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９を参照）。そのような実施形態において、発現された遺伝子は、ＨＳＰＣへの送達のために、レトロウイルスベクターにクローンされる。特定の実施形態において、レトロウイルスベクターは、そのウイルスゲノムのパッケージング及び統合、すなわち（ａ）そのベクターの各末端における、ロングの末端リピート（ＬＴＲ）、またはそれらの一部、（ｂ）ネガティブ及びポジティブ鎖ＤＮＡ合成に対応するサイトを結合するプライマー、及び（ｃ）ゲノムＲＮＡのウイルス粒子への組む込みに必要な、パッケージングシグナルに必要な、全てのシス作用配列を含む。レトロウイルスベクターについてのより詳細は、Ｂｏｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１−３０２、Ｃｌｏｗｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１、Ｋｉｅｍ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７−１４７３、Ｓａｌｍｏｎｓ ａｎｄ Ｇｕｎｚｂｅｒｇ，１９９３，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２９−１４１、及びＧｒｏｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，１９９３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．３：１１０−１１４に見出せる。アデノウイルス、アデナ関連ウイルス（ＡＡＶ）及びアルファウイルスもまた、使用できる。Ｋｏｚａｒｓｋｙ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：４９９−５０３、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５、Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２３４、Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｉ．Ｍｅｄ．２０４：２８９−３００、及びＬｕｎｄｓｔｒｏｍ，１９９９，Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔ．Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ．Ｒｅｓ．１９：６７３−６８６を参照のこと。その他の遺伝子送達法には、哺乳類人工染色体（Ｖｏｓ，１９９８，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．８：３５１−３５９）、リポソーム（Ｔａｒａｈｏｖｓｋｙ ａｎｄ Ｉｖａｎｉｔｓｋｙ，１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃ）６３：６０７−６１８）、リボサイム（Ｂｒａｎｃｈ ａｎｄ Ｋｌｏｔｍａｎ，１９９８，Ｅｘｐ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．６：７８−８３）、及び三重鎖ＤＮＡ（Ｃｈａｎ ａｎｄ Ｇｌａｚｅｒ，１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７５：２６７−２８２）の使用を含む。

【0097】

さらなる実施形態には、本明細書に開示される任意の遺伝子、タンパク質またはペプチド配列の７０％配列同一性、８０％配列同一性、８１％配列同一性、８２％配列同一性、８３％配列同一性、８４％配列同一性、８５％配列同一性、８６％配列同一性、８７％配列同一性、８８％配列同一性、８９％配列同一性、９０％配列同一性、９１％配列同一性、９２％配列同一性、９３％配列同一性、９４％配列同一性、９５％配列同一性、９６％配列同一性、９７％配列同一性、９８％配列同一性、または９９％配列同一性を有する配列を含む。

【0098】

「％配列同一性」は、その配列を比較して決定される、２つ以上の配列間の関係性を指す。タンパク質配列間の配列の類似度合いを意味する。「同一性」（しばしば「類似性」として示される）は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８８）、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９４）、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ（１９９４）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８７）、及びＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９２）に記述されるものを含む、公知の方法により容易に計算できる。配列同一性を決定する好ましい方法は、試験される配列間の最良の一致を与えるように設計される。配列同一性及び類似性を決定する方法は、公開されているコンピュータープログラムにより体系化されている。配列アラインメント及びパーセント同一性の計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ生物情報学コンピュータープログラムのパッケージソフト（ｔｈｅ ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ｓｕｉｔｅ）のＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用して実施されて良い。配列の多重アラインメントはまた、既定のパラメーターを伴うアラインメントのＣｌｕｓｔａｌ法（ｔｈｅ Ｃｌｕｓｔａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）（Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ ＣＡＢＩＯＳ，５，１５１−１５３（１９８９）（ギャップペナルティー＝１０、ギャップレングス・ペナルティー＝１０）を使用して実施できる。関連プログラムにはまた、ＧＣＧプログラムパッケージソフト（ｔｈｅ ＧＣＧ ｓｕｉｔｅ ｏｆ ｐｒｏｇｒａｍｓ）（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）、ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）、ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）、及びＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み込むＦＡＳＴＡプログラム（ｔｈｅ ＦＡＳＴＡ ｐｒｏｇｒａｍ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４），Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｄａｔｅ １９９２，１１１−２０．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．を含む。本開示の文脈内において、配列分析ソフトウェアが分析に使用される場合、その分析の結果は、そのプログラムが参照する「デフォルト値」に基づいていることは理解されよう。「デフォルト値」とは、初期化に際してそのソフトウェアが最初にロードする値またはパラメーターの任意のセットを意味する。

【0099】

前述に限定されずに、本明細書に開示される配列と配列同一性を有するタンパク質またはペプチドには、それらの変異体及びＤ置換の類似体を含む。

【0100】

本明細書に開示される配列の「変異体」には、本明細書に開示される配列との比較で、１つ以上の付加、欠失、停止位置、または置換を有する配列を含む。

【0101】

アミノ酸置換は、保存的または非保存的置換であり得る。本明細書に開示されるタンパク質またはペプチド配列の変異体には、１つ以上の保存的なアミノ酸置換を有するものを含むことができる。「保存的置換」には、以下の保存置換基の１つに見出せる置換を含む。グループ１：アラニン(ＡｌａまたはＡ)、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、グループ２：アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、Ｇｌｕ、グループ３：アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、グルタミン(ＧｌｎまたはＱ)、グループ４：Ａｒｇ、リシン（ＬｙｓまたはＫ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、グループ５：Ｉｌｅ、ロイシン(ＬｅｕまたはL)、メチオニン(ＭｅｔまたはＭ)、バリン(ＶａｌまたはＶ)、及びグループ６：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ。

【0102】

さらに、アミノ酸は、類似の機能、化学構造、または組成（例えば、酸性、塩基性、脂肪族、芳香族、硫黄含有）により保存置換基にグループ化される。例えば、脂肪族グループには、置換の目的に応じて、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、及びＩｌｅを含めて良い。互いに保存的置換であると考えられるアミノ酸を含むその他のグループには、硫黄含有：Ｍｅｔ及びＣｙｓ、酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、及びＧｌｎ、小分子の脂肪族、無極性またはわずかな極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、及びＧｌｙ、極性、負荷電残基及びそれらのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、及びＧｌｎ、極性、正電荷残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、及びＬｙｓ、大分子の脂肪族、無極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、及びＣｙｓ、及び大分子の芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、及びＴｒｐを含む。追加情報は、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙに見出せる。

【0103】

「Ｄ置換類似体」には、１つ以上のＤアミノ酸で置換された１つ以上のＬアミノ酸を有する本明細書に開示のタンパク質またはペプチドを含む。当該Ｄアミノ酸は、参照配列に見出されるような同じアミノ酸タイプであり得て、または異なるアミノ酸であり得る。したがって、Ｄ類似体はまた、変異体でもあり得る。

【0104】

前述に限定されず、及び例示目的のみ。

【0105】

特定の実施形態において、結合ドメインは、本明細書で開示される軽鎖の可変領域（ＶＬ）または重鎖の可変領域（ＶＨ）の、またはその両方のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％配列同一性を有する、配列をみ、ここで、各ＣＤＲは、対象の細胞マーカーを特異的に結合するモノクローナル抗体またはそれらのフラグメントからの、ゼロの、または多くても１つの、２つの、または３つ変化を含む。

【0106】

特定の実施形態において、結合ドメインは、Ｖα、Ｖβ、Ｃα、またはＣβ領域のＴＣＲのアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％配列同一性を有する、配列を含み、ここで各ＣＤＲは、ＴＣＲまたはフラグメントまたは対象の細胞マーカーに特異的に結合するそれらからの変更が無いかまたは多くとも１つ、２つ、または３つの変更を含む。

【0107】

特定の実施形態において、Ｖα、Ｖβ、Ｃα、またはＣβ領域の結合ドメインは、既知のＴＣＲ（例えば、高親和性ＴＣＲ）のＶα、Ｖβ、Ｃα、またはＣβから誘導され得るかまたは基づき、及び既知ＴＣＲのＶα、Ｖβ、Ｃα、またはＣβと比較して、１つ以上の（例えば、 ２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の挿入、１つ以上の（例えば、 ２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の欠失、１つ以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換）または上記変更の組み合わせを含む。挿入、欠失または置換は、Ｖα、Ｖβ、Ｃα、またはＣβ領域のどこでもよく、アミノ末端またはカルボキシ末端またはこれら領域の両端においてを含み、各ＣＤＲに、変更がないかまたは多くとも１つの、２つの、または３つの変更を含むことを与えて良く、及び変更されたＶα、Ｖβ、Ｃα、またはＣβ領域を含む結合ドメインが、野生タイプに類似した親和性で、その標的を特異的に結合できることを与えて良い。

【0108】

特定の実施形態において、結合ドメインＶＨまたはＶＬ領域は、既知のモノクローナル抗体のＶＨまたはＶＬから誘導され得るかまたは基づき、及び既知のモノクローナル抗体のＶＨ、またはＶＬと比較して、個別にまたは集団的に１つ以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の挿入、１つ以上の（例えば、 ２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の欠失、１つ以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換）、または上記変更の組み合わせを含むことができる。挿入、欠失または置換は、ＶＨまたはＶＬ領域のどこでもよく、アミノ末端またはカルボキシ末端またはこれら領域の両端においてを含み、各ＣＤＲに、変更がないかまたは多くとも１つの、２つの、または３つの変更を含むことを与えて良く、及び変更されたＶＨまたはＶＬ領域を含む結合ドメインが、野生タイプの結合ドメインに類似した親和性で、その標的をさらに特異的に結合できることを与えて良い。

【0109】

特定の実施形態において、結合ドメインは、（ｉ）ＦＭＣ６３に対応するｓｃＦｖ、（ｉｉ）Ｒ１２に対応するｓｃＦｖ、（ｉｉｉ）Ｒ１１に対応するｓｃＦｖ、または（ｉｖ）ハーセプチンに対応するｓｃＦｖの配列に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列を含む。

【0110】

特定の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、図２で与えられる配列を有するＣＤ３ζに対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有することができる。

【0111】

特定の実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、図５に示されるＣＤ２８の細胞内ドメインまたは図２で与えられる配列を有する４−１ＢＢに対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有することができる。特定の実施形態において、ＣＤ２８細胞内ドメインの変異体には、１８６−１８７位でのアミノ酸置換を含み、ここでＬＬは、ＧＧで置換される。

【0112】

特定の実施形態において、膜貫通ドメインは、受容体複合体のその他のメンバーとの相互作用を最小化するために、類似のまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへの、そのようなドメインの結合を避けるように選択でき、またはアミノ酸置換により改変できる。さらなる特定の実施形態において、合成または変異膜貫通ドメインには、ロイシン、バリンなどの主要な疎水性残基を含む。変異膜貫通ドメインは、好ましくはＫｙｔｅ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅにより計算される疎水性指標で少なくとも５０を有する。特定の実施形態において、膜貫通ドメインは、図２または６の配列と、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有することができる。

【0113】

本明細書に開示されるものと同じ官能性を有するタンパク質及びペプチドもまた、含まれる。

【0114】

本明細書に表現されていない場合であっても、公開されたデータベースにより提供される配列情報及び当業者が有するそれらの知識が、関連するタンパク質及びペプチドの配列及びそのようなタンパク質及びペプチドをコードする遺伝子配列を特定するために、利用できる。

【0115】

分化。特定の実施形態において、改変ＨＳＰＣは、対象者への投与前に、改変された非エフェクターＴ細胞に分化される。改変ＨＳＰＣの分化が必要な場合、ＨＳＰＣは、非エフェクターＴ細胞への分化を促進する１つ以上の成長因子に暴露することができる。この成長因子及び分化を促進する細胞培養条件は、当技術分野では公知である（例えば、米国特許第７，３９９，６３３号、セクション５．２及び５．５を参照）。例えば、ＳＣＦは、ＨＳＰＣを各々骨髄性幹／前駆細胞またはリンパ球幹／前駆細胞に分化するために、ＧＭ−ＳＣＦまたはＩＬ−７との組み合わせで使用できる。特定の実施形態において、ＨＳＰＣは、ＳＣＦ及びＧＭ−ＳＣＦまたはＩＬ−７の各々の１００ ｎｇ／ｍｌにＨＳＰＣを暴露することにより、リンパ球幹／前駆細胞に分化できる。特定の実施形態において、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アゴニスト、または好ましくは全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）は、ＨＳＰＣの分化を促進するために使用される。例えば、ナチュラルキラー細胞への分化は、培養されたＨＳＰＣを、ＩＬ−２の５０ Ｕ／ｍｌ及びＩＬ−１５の５００ ｎｇ／ｍｌのヒト血清で補足されたＲＰＭＩ培地に暴露することにより、達成できる。さらなる実施形態において、ＲＰＭＩ培地はまた、Ｌ−グルタミン酸で補足され得る。

【0116】

特定の実施形態において、改変ＨＳＰＣは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または好中球を含む非エフェクターＴ細胞に分化され得る。ＮＫ細胞は、２つの主要な機能を発揮する。すなわち、（ｉ）腫瘍細胞及びその他のウイルス感染細胞を認識し及び殺傷する、及び（ｉｉ）ＣＣＬ３、ＣＣＬ４，ＣＣＬ５、及び／またはＸＣＬ１ケモカインまたは顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子−α、またはインターフェロン−γなどのサイトカインの分泌によって、自然免疫と適応免疫応答を調節する。好中球は一般に、彼らが標的とし及び破壊する異常細胞型がある炎症対象者へ到達するまで、血流中を循環する。

【0117】

組成物及び処方物。細胞及び改変細胞は、対象者への投与に対応した組成物及び／または処方物として調製され得る。組成物は、対象者への投与に対応した薬学的に許容されるキャリアーを伴って調製される、細胞または改変細胞を指す。処方物は、対象者への投与に対応した薬学的に許容されるキャリアー（以降はキャリアー）内の少なくとも２つの細胞型を指す。

【0118】

組成物または処方物の調製の間の様々な場面において、細胞を冷凍保存することが必要または有益であり得る。用語「凍結した（ｆｒｏｚｅｎ）／凍結している（ｆｒｅｅｚｉｎｇ）」及び「凍結した（ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ）／凍結している（ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ）」は、互換的に使用できる。凍結には、凍結乾燥を含む。

【0119】

当業者には理解されることだが、細胞の凍結は、凍結破壊を起こすが（Ｍａｚｕｒ， Ｐ．，１９７７，Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ １４：２５１−２７２を参照）、しかしそのような損傷を防ぐことが可能な多数の手段がある。例えば、（ａ）凍害防止剤の使用、（ｂ）凍結速度の制御、及び／または（ｃ）分解反応を最小化するのに十分低い温度での貯蔵により避けることができる。例示的な凍結防止剤には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｌｏｖｅｌｏｃｋ及びＢｉｓｈｏｐ，１９５９，Ｎａｔｕｒｅ １８３：１３９４−１３９５、Ａｓｈｗｏｏｄ−Ｓｍｉｔｈ，１９６１，Ｎａｔｕｒｅ １９０：１２０４−１２０５）、グリセロール、ポリビニルピロリジン（Ｒｉｎｆｒｅｔ，１９６０，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５７６）、ポリエチレングリコール（Ｓｌｏｖｉｔｅｒ及びＲａｖｄｉｎ，１９６２，Ｎａｔｕｒｅ １９６：５４８）、アルブミン、デキストラン、ショ糖、エチレングリコール、ｉ−エリスリトール、Ｄ−リビトール、Ｄ−マンニトール（Ｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，１９６２，Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．２１：１５７）、Ｄ−ソルビトール、ｉ−イノシトール、Ｄ−乳糖、塩化コリン（Ｂｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９６０，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５：５２０）、アミノ酸（Ｐｈａｎ Ｔｈｅ Ｔｒａｎ及びＢｅｎｄｅｒ，１９６０，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０：６５１）、メタノール、アセトアミド、グリセロールモノアセテート（Ｌｏｖｅｌｏｃｋ，１９５４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．５６：２６５）、及び無機塩（Ｐｈａｎ Ｔｈｅ Ｔｒａｎ 及び Ｂｅｎｄｅｒ，１９６０，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１０４：３８８、Ｐｈａｎ Ｔｈｅ Ｔｒａｎ及びＢｅｎｄｅｒ，１９６１，放射線生物学、放射線生物学の第３回のオーストラリア会議論文集（ｉｎ Ｒａｄｉｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｉｒｄ Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｒａｄｉｏｂｉｏｌｏｇｙ，）Ｉｌｂｅｒｙ ｅｄ．，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐ．５９）を含む。特定の実施形態において、ＤＭＳＯが使用できる。プラズマの添加（例えば、２０−２５％濃度まで）は、ＤＭＳＯの保護効果を強化できる。１％ＤＭＳＯ濃度は、４℃以上の温度では毒性があるので、ＤＭＳＯの添加後、細胞は、凍結まで０℃に保つことができる。

【0120】

細胞の冷凍保存においては、ゆっくりした冷却速度の制御が重要であり及び異なる凍結防止剤（Ｒａｐａｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９６８，Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ５（１）：１８−２５）及び異なる細胞型は、異なる最適冷却速度を持つ（例えば、Ｒｏｗｅ 及び Ｒｉｎｆｒｅｔ，１９６２，Ｂｌｏｏｄ ２０：６３６、Ｒｏｗｅ，１９６６，Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ３（１）：１２−１８、Ｌｅｗｉｓ，ｅｔ ａｌ．，１９６７，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ７（１）：１７−３２、及び幹細胞の生存及びそれらの移植潜在性における冷却速度の効果に対しては、Ｍａｚｕｒ，１９７０，Ｓｃｉｅｎｃｅ １６８：９３９−９４９を参照）。水が氷になる熱融解相を、最小にする必要がある。当該冷却手段は、例えば、プログラム可能な凍結装置またはメタノール浴処置の利用によって実行できる。プログラム可能な凍結装置は、置最適冷却速度の決定及び標準的な再生冷却の促進を可能にする。

【0121】

特定の実施形態において、ＤＭＳＯ処理細胞は、氷上での予冷が可能で及び−８０℃の機械式冷蔵庫（例えば、ＨａｒｒｉｓまたはＲｅｖｃｏ）の中で並べて配置された、冷やしたメタノールを含むトレイに移すことができる。メタノール浴及びサンプルの熱電対測定は、１℃から３℃／分の冷却速度を示す熱電対が推奨できる。少なくとも２時間後、試験体は−８０℃に到達し及び直接液体窒素中に配置することができる（−１９６℃）。

【0122】

完全凍結の後、その細胞は、長期極低温貯蔵容器に迅速に移送できる。好ましい実施形態において、サンプルは、液体窒素（−１９６℃）または窒素蒸気中（−１℃）に、極低温で貯蔵できる。そのような貯蔵は、高効率液体窒素冷凍庫の入手により促進される。

【0123】

細胞の操作、冷凍保存及び長期貯蔵に対するさらなる検討事項及び手順は、以下の例示的な参照に見出すことができる。米国特許第４，１９９，０２２号、第３，７５３，３５７号、及び第４，５５９，２９８号、Ｇｏｒｉｎ，１９８６，Ｃｌｉｎｉｃｓ Ｉｎ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ １５（１）：１９−４８、Ｂｏｎｅ−Ｍａｒｒｏｗ Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ａ Ｐａｎｅｌ、Ｍｏｓｃｏｗ，Ｊｕｌｙ ２２−２６，１９６８，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｔｏｍｉｃ Ｅｎｅｒｇｙ Ａｇｅｎｃｙ、Ｖｉｅｎｎａ，ｐｐ．１０７−１８６、Ｌｉｖｅｓｅｙ 及び Ｌｉｎｎｅｒ，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２７：２５５、Ｌｉｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３４（９）：１１２３−１１３５、Ｓｉｍｉｏｎｅ，１９９２，Ｊ．Ｐａｒｅｎｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．４６（６）：２２６−３２）。

【0124】

以下の冷凍保存、凍結細胞は、当業者には公知の方法に従って、その使用に対応して解凍できる。好ましくは、凍結細胞はすぐに解凍され及び解凍時に即座に冷蔵される。特定の実施形態において、その凍結細胞を入れた小瓶は、温水浴にその首まで浸す。穏やかな回転は、細胞を解凍し及びその温水から内氷部分への熱伝達を高め、その細胞懸濁液の混合を確実にするであろう。氷が完全に溶けると同時に、その小瓶をただちに氷上に配置できる。

【0125】

特定の実施形態において、解凍時に細胞の凝集を防ぐための手立てをとることができる。例示的な方法には、低分子デキストラン及びクエン酸、ヒドロキシエチル澱粉（Ｓｔｉｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９８３，低温生物学（Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ）２０：１７−２４）などの、ＤＮａｓｅの冷凍前及び／または後での添加（Ｓｐｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｃａｎｃｅｒ ４５：３０７５−３０８５）を含む。

【0126】

当業者には理解されることだが、仮に、ヒトに毒性のある凍結防止剤が使用される場合、その凍結防止剤は、治療使用の前に取り除かれるべきである。ＤＭＳＯは、深刻な毒性は有しない。

【0127】

例示的な細胞投与のキャリアー及び方法は、米国特許公開番号２０１０／０１８３５６４の１４−１５ページに記述されている。さらなる薬学的キャリアーは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎに記述されている。Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｖｉｄ Ｂ．Ｔｒｏｙ，ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００５）。

【0128】

特定の実施形態において、細胞は、培地から収穫でき、及び洗浄できそして治療に効果的な量でキャリアーに濃縮できる。例示的なキャリアーには、食塩水、緩衝生理食塩水、生理食塩水、水、Ｈａｎｋｓ液、リンゲル液、Ｎｏｎｎｏｓｏｌ−Ｒ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ）、Ｐｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ Ａ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｒｔｏｎ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）、グリセロール、エタノール、及びそれらの組み合わせを含む。

【0129】

特定の実施形態において、キャリアーは、ヒト血清アルバミン（ＨＳＡ）またはその他のヒト血清成分またはウシ胎児血清で補完できる。特定の実施形態において、点滴用のキャリアーには、５％ＨＡＳまたはブドウ糖で緩衝された生理食塩水を含む。さらに等張剤には、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、またはマンニトールなど、三価またはより多価の糖アルコール含む多価の糖アルコールを包含する。

【0130】

キャリアーには、クエン酸バッファー、コハク酸バッファー、酒石酸バッファー、フマル酸バッファー、グルコン酸バッファー、シュウ酸バッファー、バッファー乳酸、酢酸バッファー、リン酸バッファー、ヒスチジンバッファー及び／またはトリメチルアミン塩などの、緩衝剤を含むことができる。

【0131】

安定剤は、増量剤から容器の壁への細胞付着を防ぐのに役立つ添加剤までの機能に及ぶことが可能な、賦形剤の広範なカテゴリーを指す。典型的な安定剤には、多価の糖アルコール、アルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、及びスレオニンなどのアミノ酸、乳糖、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール、ガラクチトール、グリセロール、およびイノシトールなどのシクリトール、などの有機砂糖または糖アルコール、ＰＥＧ、アミノ酸ポリマー、尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロール、及びチオ硫酸ナトリウムなどの硫黄含有還元剤、低分子量ポリペプチド（すなわち、＜１０残基）、ＨＳＡ、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、キシロース、マンノース、フルクトース及びグルコースなどの単糖類、乳糖、麦芽糖、ショ糖などの二糖類、ラフィノースなどの三糖類、及びデキストランなどの多糖類を含めることができる。

【0132】

必要または有益である場合、組成物または処方物には、注入場所で、痛みを緩和するリドカインなどの局所麻酔薬を含めることができる。

【0133】

例示的な防腐剤には、フェノール、ベンジルアルコール、メタ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジル・塩化アンモニウム、ベンザルコニウムハロゲン化物、塩化ヘキサメトニウム、メチル、またはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、及び３−ペンタノールを含む。

【0134】

組成物または処方物中の治療に効果的な細胞の量は、１０^２細胞を超えて多く、１０^３細胞を超えて多く、１０^４細胞を超えて多く、１０^５細胞を超えて多く、１０^６細胞を超えて多く、１０^７細胞を超えて多く、１０^８細胞を超えて多く、１０^９細胞を超えて多く、１０^１０細胞を超えて多く、または１０^１１を超えて多くあり得る。

【0135】

本明細書に開示される組成物及び処方物において、細胞は一般に、１リットル以下の、５００ ｍｌｓ以下の、２５０ ｍｌｓ以下の、または１００ ｍｌｓ以下の容積である。したがって、投与される細胞の密度は通常、１０^４ 細胞／ｍｌを超えて、１０^７ 細胞／ｍｌまたは１０^８ 細胞／ｍｌを超えて高い。

【0136】

示されるように、組成物には、１つの細胞型（例えば、改変ＨＳＰＣまたは改変エフェクター）を含む。処方物には、ＨＳＰＣ、改変ＨＳＰＣ及び／または改変エフェクター（改変ＮＫ細胞など）を組み合わせで含む。特定の実施形態において、同じ結合ドメインの改変ＨＳＰＣと改変エフェクターとの組み合わせで、組まれる。その他の実施形態において、異なる結合ドメインの改変ＨＳＰＣと改変エフェクターとが、組み合わされる。同様に、一処方物中の改変ＨＳＰＣと改変エフェクター間の多様な組み合わせにおいて、発現分子（例えば、エフェクタードメイン成分、スペーサー領域など）の全てのその他の側面が、同じことも異なることも可能である。さらに、異なる分子を発現する改変ＨＳＰＣまたはそれらの成分は、処方物中に共に含めることができ、及び異なる分子を発現する改変エフェクターまたはそれらの成分は、処方物中に共に含めることができる。特定の実施形態において、一処方物は、異なる分子を発現する少なくとも２つの改変ＨＳＰＣ及び異なる分子を発現する少なくとも２つの改変エフェクター細胞を含むことができる。

【0137】

ＨＳＰＣ、改変ＨＳＰＣ及び改変エフェクターは、例えば、１対１対１の比率、２対１対１の比率、１対２対１の比率、１対１対２の比率、５対１対１の比率、１対５対１の比率、１対１対５の比率、１０対１対１の比率、１対１０対１の比率、１対１対１０の比率、２対２対１の比率、１対２対２の比率、２対１対２の比率、５対５対１の比率、１対５対５の比率、５対１対５の比率、１０対１０対１の比率、１対１０対１０の比率、１０対１対１０の比率、などの異なる比率で組み合わせることができる。これら比率はまた、同じかまたは異なる分子の成分を発現する細胞の数に適応できる。仮に２つの細胞型だけで組み合わすかまたは発現分子成分の２種類の組み合わせだけが、処方物に含まれるならば、その比率は、前述の３数字の組み合わせから作り得る任意の２数字の組み合わせを含むことができる。複数の実施形態において、組み合わされた細胞集団は、生体内及び／または生体外における有効性及び／または細胞増殖が試験され、及び有効性及び／または細胞増殖に対して与えられる細胞の比率が選択される。

【0138】

本明細書に開示される当該組成物及び処方物は、例えば、注射、点滴、灌流、または洗浄による投与に対して調製され得る。当該組成物及び処方物はさらに、骨髄、静脈内、皮内、動脈内、節内、リンパ内及び結節、腹腔内、病巣内、前立腺内、膣内、直腸内、局所、髄腔内、腫瘍内、筋肉内、膀胱内、及び／または皮下注射に対して、処方できる。

【0139】

キット。キットには、１つ以上の当該細胞、本明細書に記述される組成物または処方物が入った１つ以上の容器を含むことができる。特定の実施形態において、当該キットは、１つ以上の細胞、組成物または処方物及び／または別の細胞、組成物または処方物との組み合わせで使用される組成物が入った１つ以上の容器を含むことができる。そのような容器関連事項は、医薬品または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制する政府機関により定められる所定の形式で通達され、その通達は、ヒトへの投与に対応した製造、使用または販売を所管する機関による承認を反映している。その通達は、当該提供細胞、組成物または処方物は、免疫適合無しで、対象者に投与できることを言明するであろう。当該キットは、例えば、投与に対する細胞、組成物及び／または処方物の調製、関連廃棄物の適切な処分、及びそれらに類する事項に関する説明書、などのキットの使用説明書を含むことができる。その説明書は、キット内に与えられた印刷物の形式においても可能であり、またはその説明書が、キット自身の一部分に印刷されることも可能である。説明書は、手順書、パンフレット、冊子、ＣＤ−Ｒｏｍ、またはコンピューター読み取り可能なデバイスの形式で良く、またはウエブサイトなどのように、遠隔地から説明書の使い方を提供することができる。特定の実施形態において、キットはまた、シリンジ、アンプル、チューブ、フェイスマスク、無針の流体輸送装置、インジェクションキャップ、スポンジ、滅菌接着剤ストリップ、Ｃｈｌｏｒａｐｒｅｐ、手袋などの、そのキットを効果的に使用するために必要な医療用品のいくつかまたは全てを含むことができる。本明細書に記述されるキットのいずれの中身においても変更が可能である。

【0140】

使用法。本明細書に開示される方法には、本明細書で開示される細胞で治療される対象者（人間、獣医動物（犬、猫、爬虫類、鳥など）、家畜（馬、牛、ヤギ、豚、鶏など）、及び研究動物（サル、ラット、マウス、魚など））を含む。治療対象者には、治療に効果的な量の送達を含む。治療に効果的な量には、効果的な量、予防処置、及び／または治療処置を与える量を含む。

【0141】

「有効量」は、対象者に望ましい生理的変化をもたらすのに必要な細胞数である。有効量はしばしば、研究目的で投与される。本明細書に開示される有効量は、（ｉ）免疫不全、汎血球減少症、好中球減少症及び／または白血球減少症（例えば、免疫システムの再増殖細胞）を減らすことによる血液サポートを与える、及び（ｉｉ）抗ガン効果を有する、の１つ以上に作用する。

【0142】

「予防処置」には、治療する状態のサインまたは症状を現わさないまたは治療する状態の初期サインまたは初期症状を現わす対象者に投与される治療で、状態の発現リスクを徐々に下げ、防ぎ、または減らす目的に対して治療が行われる場合を含む。したがって、予防処置は、ある状態に対しての予防的な治療として機能する。

【0143】

「治療処置」には、ある状態に対して症状またはサインを現わしている対象者に投与される処置を含み、及びその状態の重篤度合いまたは進行度合いを減らす目的に対してその対象者へ投与される。

【0144】

特定の対象者への実際の投与量は、例えば、標的を含む物理的及び生理学的要因、体重、状態のタイプ、状態の重症度、もし判るならば、予想される関連事象、以前または同時並行の治療介入、その対象者の特発性疾患、及び投与の経路などのパラメーターを考慮する医師、獣医師、または研究者により決定できる。さらに、最適投与範囲の特定を補助するために、生体内及び生体外アッセイを、任意で取り入れることができる。

【0145】

投与する治療有効量は、１０^２細胞を超えて、１０^３細胞を超えて、１０^４細胞を超えて、１０^５細胞を超えて、１０^６細胞を超えて、１０^７細胞を超えて、１０^８細胞を超えて、１０^９細胞を超えて、１０^１０細胞を超えて、または１０^１１を超えて、多く含むことができる。

【0146】

示されるように、本明細書で開示される組成物及び処方物は、例えば、注射、点滴、灌流、または洗浄により投与でき、及びより特定には、骨髄、静脈内、皮内、動脈内、節内、リンパ内及び結節、腹腔内、病巣内、前立腺内、膣内、直腸内、局所、髄腔内、腫瘍内、筋肉内、膀胱内、及び／または皮下注射、及び／またはボーラス注入の１つ以上を介した投与を含むことができる。

【0147】

非改変ＨＳＰＣの使用については、米国特許第７，３９９，６３３号のセクション５．６．１及びＷＯ ２０１３／０８６４３６に記述される。ＨＳＰＣ及び改変ＨＳＰＣは、同様の目的または異なる目的に対して投与できる。共通目的には、必要に応じて対象者へ造血機能を与えること、及び／または免疫不全、汎血球減少症、好中球減少症及び／または白血球減少症（周期性好中球減少及び特発性好中球減少症を含んで)の１つ以上を治療することを含む（総称して「目的」）。ＨＳＰＣ及び改変ＨＳＰＣは、低下した血液細胞レベルを有するか、または対照となる血液細胞レベルと比較して低下した血液細胞レベルを発症するリスクがある対象者に投与できる。特定の実施形態において、当該対象者は、貧血であるかまたは貧血を発症するリスクがある。

【0148】

当該目的に対する処置は、アルキル化剤、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、アザチオプリン、カルボプラチン、シスプラチン、クロランブシル、クロファラビン、シクロホスファミド、イホスファミド、メクロレタミン、メルカプトプリン、オキサリプラチン、タキサン系薬剤、及びビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、及びビンデシン）の１つ以上への露出を含む、集中化学療法への暴露に基づいて行う必要があり得る。

【0149】

当該目的に対する処置はまた、造血細胞移植（ＨＣＴ）に対応して骨髄機能廃絶療法への暴露に基づいて行う必要があり得る。特定の実施形態において、ＨＳＰＣ及び／または改変ＨＳＰＣは、劣化骨髄リスクのある、または劣化した、または限定された血液細胞レベルの発症リスクのある骨髄ドナーに投与される。投与は、骨髄取得の前後に生じることができる。ＨＳＰＣ及び／または改変ＨＳＰＣはまた、骨髄移植の受給者に投与できる。

【0150】

当該目的に対する処置はまた、急性電離放射線への暴露及び／または抗生物質、ペニシリン、ガンシクロビ、ダウノマイシン、サルファ剤、フェノチアジン、精神安定剤、メプロバメート、鎮痛薬、アミノピリン、ジピロン、抗けいれん薬、フェニトイン、カルバマゼピン、抗甲状腺薬、プロピルチオウラシル、メチマゾール、及び利尿薬を含む骨髄抑制または造血欠陥を起こす可能性があるその他の薬剤への暴露に基づいて行う必要があり得る。

【0151】

当該目的に対する処置はまた、ウイルス（例えば、ＨＩＶＩ、ＨＩＶＩＩ、ＨＴＬＶＩ、ＨＴＬＶＩＩ、ＨＴＬＶＩＩＩ）、微生物または寄生虫感染及び／または、例えば透析などの腎疾患または腎不全に対する処置の結果に基づいて行う必要があり得る。例えば、Ｔ及び／またはＢリンパ球、または、例えば関節リウマチなどの免疫異常における多様な免疫不全はまた、ＨＳＰＣ及び／または改変ＨＳＰＣによる処置で有益な影響を受けるであろう。免疫不全はまた、別の医療処置の結果でもあっても良い。

【0152】

ＨＳＰＣ及び／または改変ＨＳＰＣはまた、再生不良性貧血、チェディアック・東症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、白血病、骨髄異形成症候群、骨髄線維症または血小板減少症の治療に使用できる。重篤な血小板減少症はまた、ファンコーニ貧血（Ｆａｎｃｏｎｉ’ｓ Ａｎｅｍｉａ）、Ｗｉｓｃｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ、またはＭａｙ−Ｈｅｇｇｌｉｎ症候群などの遺伝的欠陥からもたらされる。後天性血小板減少症はまた、免疫性血小板減少性紫斑病、全身性エリテマトーデス（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｌｕｐｕｓ Ｅｒｙｔｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ）、溶血性貧血、または胎児母体非互換性などにおける、自己または同種抗体からもたらされる。さらに、脾腫、播種性血管内凝固症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、感染症、及び/または人工心臓弁は、血小板減少症をもたらす。血小板減少症はまた、がん、リンパ腫、白血病または線維症による骨髄浸潤からもたらされる。

【0153】

特定の実施形態において、当該対象者は、例えば外傷のため出血を被り、または出血のリスクがある。特定の実施形態において、当該対象者は、例えば、骨髄損失や劣化骨髄によって特徴付けられる先天的、遺伝的または後天的症候群に関連した劣化骨髄を被る。特定の実施形態において、当該対象者は、造血の必要がある。

【0154】

骨髄ドナーに関連して示されるように、対象者へのＨＳＰＣまたは改変ＨＳＰＣの投与は、治療専門者により有用と判断される治療計画中の任意の時間に生じ得る。非限定的な例示として、ＨＳＰＣ及び／または改変ＨＳＰＣは、例えば、化学療法、放射線治療または骨髄移植の前に、同時に、または後で対象者へ投与できる。ＨＳＰＣ及び／または改変ＨＳＰＣは、そのＨＳＰＣ及び／または改変ＨＳＰＣの対象者への投与後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０日目（または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０日を超えて、または未満で）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０週目（または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０週を超えて、または未満で）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２か月目（または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２か月を超えて、または未満で）、１、２、３、４、５年目（または１、２、３、４、５年を超えて、または未満で）にアッセイされた場合、効果的に生着を与えうる。特定の実施形態において、当該ＨＳＰＣ及び／または改変ＨＳＰＣは、当該ＨＳＰＣ及び／またはＣＡＲ−ＨＳＰＣの対象者への投与後、１０日以内、２週間以内、３週間以内、４週間以内、６週間以内、または１３週間以内にアッセイされた場合、生着を与えるのに効果的である。

【0155】

ＨＳＰＣ、改変ＨＳＰＣ及び改変エフェクター。ＨＳＰＣ、改変ＨＳＰＣ及び改変エフェクターは、一治療計画内の異なる目的に対して投与できる。血液支援を与えるためのＨＳＰＣ及び改変ＨＳＰＣの使用、及び全ての処置における白血病に対する移植片効果を与える改変ＨＳＰＣ及び改変エフェクターが、上述される。同様のアプローチが、血液支援を与えるために及び／または望ましくないがん細胞を標的にするために、及び化学療法または放射線療法の補助治療として使用できる。

【0156】

改変ＨＳＰＣ及び改変エフェクターで治療ができる例示的ながんには、副腎がん、膀胱がん、血液がん、骨のがん、脳腫瘍、乳がん、がん、子宮頸がん、結腸がん、大腸がん、コーパス子宮がん、耳、鼻と喉（ＥＮＴ）のがん、子宮内膜がん、食道がん、消化器がん、頭頸部がん、ホジキン病、腸がん、腎臓がん、喉頭がん、白血病、肝臓がん、リンパ節がん、悪性リンパ腫、肺がん、黒色腫、中皮腫、骨髄腫、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔がん、卵巣がん、膵がん、陰茎がん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、肉腫、セミノーマ、皮膚がん、胃がん、奇形、精巣がん、甲状腺がん、子宮がん、腟がん、血管腫瘍、及びそれらの転移を含む。

【0157】

がんの文脈において、治療有効量は、抗がん効果を有する。抗がん効果には、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、腫瘍量の減少、寿命の増加、がん細胞のアポトーシスの誘導、がん細胞死の誘導、がん細胞の増殖抑制、腫瘍の増殖抑制、転移の予防、対象者の生命の延長、及び／または再発の減少または治療以降のがんの再発を観察することにより、定量化され得る。

【0158】

血液支援の文脈において、治療有効量は、対象者の循環で望ましい細胞数を増やすことにより、免疫不全、汎血球減少症、好中球減少症及び／または白血球減少症を治療する。免疫系細胞及び／または免疫系細胞前駆体の数を増やすことにより、対象者の循環で望ましい細胞数を増やすことで、その対象者の免疫系を再生着できる。

【0159】

改変ＨＳＰＣ及び改変エフェクターを利用する特定の実施形態において、ある対象者のがん細胞は、細胞マーカーの存在で特徴づけができる。改変ＨＳＰＣまたは改変エフェクターで発現している結合ドメインは、その細胞マーカーの特徴を基に選択できる。特定の実施形態において、事前に産生された改変ＨＳＰＣ及び改変エフェクターは、特定対象者のがん細胞上で選択的に発現した細胞マーカーを結合する能力に基づいて選択される。

【0160】

がんを治療するために処方される場合、当開示の組成物及び処方物にはまた、ｐ５３、ＲＢ、ＢＲＣＡ１、Ｅ１Ａ、ｂｃｌ−２、ＭＤＲ−１、ｐ２１、ｐ１６、バックス、ｂｃｌ―ｘｓ、Ｅ２Ｆ、ＩＧＦ−Ｉ ＶＥＧＦ、アンギオスタチン、オンコスタチン、エンドスタチン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及び／またはＨＳＶ−ｔｋから選ばれた、１つ以上の抗がん遺伝子を運ぶプラスミドＤＮＡを含むことができる。組成物及び処方物はまた、アドリアマイシン、アンギオスタチン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、クロルメテャミン、クロロキノキサリン、スルホンアミド、シスプラチン、シクロホスファミド、シクロプラタム、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ｄｉｄｏｘ、ドキソルビシン、エンドスタチン、エンロプラチン、エストラムスチン、エトポシド、リン酸エクストラムスチ（ｅｘｔｒａｍｕｓｔｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔ）、フルシトシン、フルオロデオキシウリジン、フルオロウラシル、硝酸ガリウム、ヒドロキシウレア、イドクスウリジン、インターフェロン、インターロイキン、リュープロリド、ロバプラチン、ロムスチン、マンノムスチン、メクロレタミン、メクロレタミン酸化物、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミスラマイシン、ミトブロニトール、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノコダゾール、オンコスタチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペンタムスチン、プラチナ−トリアミン錯体、プリカマイシン、プレドニゾロン、プレドニゾン、プロカルバジン、プロテインキナーゼＣ阻害剤、ピューロマイシン、セムスチン、シグナル伝達阻害剤、スピロプラチン、ストレプトゾトシン、ストロメリシン阻害剤、タキソール、テガフール、テロメラーゼ阻害剤、テニポシド、サリドマイド、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアミプリン、トレタミン、トリアジコン、トロホスファミド（ｔｒｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、チロシンキナーゼ阻害剤、ウラムスチン、ビダラビン、ビンブラスチン、ビンカアルカロイド、ビンクリスチン、ビンデシン、ボロゾール、ゼニプラチン、ゼニプラチンまたはジノスタチンを含む、１つ以上の抗がん剤の組み合わせを含み得てまたは投与され得る。

【0161】

改変ＨＳＰＣ及び改変エフェクター。改変ＨＳＰＣ及び／または改変エフェクターは、造血機能を付与するために、または免疫不全、汎血球減少症、好中球減少症及及び／または白血球減少症の治療に、処置が望ましくないまたは必要でない場合には、ＨＳＰＣ無しで使用できる。

【0162】

当業者には理解されることだが、異なる血液疾患及びがんの動物モデルが公知であり及び必要または有益であれば、特定治療の枠組みの有効性を評価するために使用できる。

【0163】

以下の実施例及び例示的な実施形態は、本開示の特定の実施形態を代表する目的に含まれる。当業者は、本明細書に開示される特定の実施形態に対して多数の変更がなされ得て及び本開示の主旨及び範囲からの逸脱無しで類似のまたは同様の結果が得られる、ということを、本開示に照らして認識すべきである。

【0164】

例示的な実施形態。
１．（ｉ）ＣＤ１９を結合するリガンド結合ドメインを含む細胞外成分、（ｉｉ）ＣＤ２８または４−１ＢＢの細胞質ドメインを含むエフェクタードメインを含む細胞内成分、（ｉｉｉ）ヒトＩｇＧ４のヒンジ領域を含むスペーサー領域、及び（ｉｖ）ヒトＣＤ４またはＣＤ２８膜貫通ドメインを発現するように、遺伝子的に改変されたＣＤ３４＋造血幹前駆細胞（ＨＳＰＣ）。
２．当該リガンド結合ドメインが、ＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０８）のＣＤＲＬ１配列、ＳＲＬＨＳＧＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１１）のＣＤＲＬ２配列、ＧＮＴＬＰＹＴＦＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０４）のＣＤＲＬ３配列、ＤＹＧＶＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０３）のＣＤＲＨ１配列、ＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１４）のＣＤＲＨ２配列、及びＹＡＭＤＹＷＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１５）のＣＤＲＨ３配列を含む単鎖のＦｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である、実施形態１に記載のＨＳＰＣ。
３．当該スペーサー領域が、１２以下のアミノ酸である、実施形態１または２に記載のＨＳＰＣ。
４．当該スペーサー領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７を含む、実施形態１−３の任意の１つに記載のＨＳＰＣ。
５．（ｉ）ＣＤ１９を結合するリガンド結合ドメインを含む細胞外成分、（ｉｉ）ＣＤ２８または４−１ＢＢの細胞質ドメインを含むエフェクタードメインを含む細胞内成分、（ｉｉｉ）ヒトＩｇＧ４のヒンジ領域を含むスペーサー領域、及び（ｉｖ）ヒトＣＤ４またはＣＤ２８膜貫通ドメインを発現するように、遺伝子的に改変された非エフェクターＴ細胞。
６．当該リガンド結合ドメインが、ＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０８）のＣＤＲＬ１配列、ＳＲＬＨＳＧＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１１）のＣＤＲＬ２配列、ＧＮＴＬＰＹＴＦＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０４）のＣＤＲＬ３配列、ＤＹＧＶＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０３）のＣＤＲＨ１配列、ＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１４）のＣＤＲＨ２配列、及びＹＡＭＤＹＷＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１５）のＣＤＲＨ３配列を含む単鎖のＦｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である、実施形態５に記載の非エフェクターＴ細胞。
７．当該スペーサー領域が、１２以下のアミノ酸である、実施形態５または６に記載の非エフェクターＴ細胞。
８．当該スペーサー領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７を含む、実施形態５−７の任意の１つに記載の非エフェクターＴ細胞。
９．当該非エフェクターＴ細胞が、ナチュラルキラー細胞である、実施形態５−８の任意の１つに記載の非エフェクターＴ細胞。
１０．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、５３、５４、５５、５６、５７、または５８のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように、遺伝子的に改変された造血幹前駆体細胞（ＨＳＰＣ）。
１１．当該ＨＳＰＣがＣＤ３４＋である、実施形態１０に記載のＨＳＰＣ。
１２．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、５３、５４、５５、５６、５７、または５８のＣＡＲを発現するように、遺伝子的に改変された非エフェクターＴ細胞。
１３．当該非エフェクターＴ細胞が、ナチュラルキラー細胞である、実施形態１２に記載の非エフェクターＴ細胞。
１４．（ｉ）望ましくない細胞上に選択的に発現した細胞マーカーを結合するリガンド結合ドメインを含む細胞外成分、及び（ｉｉ）エフェクタードメインを含む細胞内成分を発現するように、遺伝子的に改変されたＨＳＰＣ。
１５．当該リガンド結合ドメインが、抗体フラグメントである、実施形態１４に記載のＨＳＰＣ。
１６．当該リガンド結合ドメインが、抗体の単鎖変異体フラグメントである、実施形態１４または１５に記載のＨＳＰＣ。
１７．当該リガンド結合ドメインが、ＣＤ１９を結合する、実施形態１４―１６の任意の１つに記載のＨＳＰＣ。
１８．当該リガンド結合ドメインが、ＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０８）のＣＤＲＬ１配列、ＳＲＬＨＳＧＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１１）のＣＤＲＬ２配列、ＧＮＴＬＰＹＴＦＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０４）のＣＤＲＬ３配列、ＤＹＧＶＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０３）のＣＤＲＨ１配列、ＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１４）のＣＤＲＨ２配列、及びＹＡＭＤＹＷＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１５）のＣＤＲＨ３配列を含むｓｃＦｖである、実施形態１４−１７の任意の１つに記載のＨＳＰＣ。
１９．当該ＨＳＰＣがまた、アミノ酸が１２以下のスペーサー領域を発現するように遺伝子的に改変された、実施形態１８に記載のＨＳＰＣ。
２０．当該スペーサー領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７を含む、実施形態１９に記載のＨＳＰＣ。
２１．当該リガンド結合ドメインが、ＲＯＲ１を結合する、実施形態１４―１６の任意の１つに記載のＨＳＰＣ。
２２．当該リガンド結合ドメインが、ＡＳＧＦＤＦＳＡＹＹＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０１）のＣＤＲＬ１配列、ＴＩＹＰＳＳＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１２）のＣＤＲＬ２配列、ＡＤＲＡＴＹＦＣＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１００）のＣＤＲＬ３配列、ＤＴＩＤＷＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０２）のＣＤＲＨ１配列、ＶＱＳＤＧＳＹＴＫＲＰＧＶＰＤＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１３）のＣＤＲＨ２配列、及びＹＩＧＧＹＶＦＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１７）のＣＤＲＨ３配列を含むｓｃＦｖである、実施形態１４−１６または２１の任意の１つに記載のＨＳＰＣ。
２３．当該リガンド結合ドメインが、ＳＧＳＤＩＮＤＹＰＩＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０９）のＣＤＲＬ１配列、ＩＮＳＧＧＳＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０５）のＣＤＲＬ２配列、ＹＦＣＡＲＧＹＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１６）のＣＤＲＬ３配列、ＳＮＬＡＷ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１０）のＣＤＲＨ１配列、ＲＡＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０７）のＣＤＲＨ２配列、及びＮＶＳＹＲＴＳＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０６）のＣＤＲＨ３配列を含むｓｃＦｖである、実施形態１４−１６または２１の任意の１つに記載のＨＳＰＣ。
２４．当該ＨＳＰＣがまた、アミノ酸が２２９以下のスペーサー領域を発現するように遺伝子的に改変された、実施形態２３に記載のＨＳＰＣ。
２５．当該スペーサー領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１を含む、実施形態２４に記載のＨＳＰＣ。
２６．当該リガンド結合ドメインが、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、メソテリン、ＣＤ２０、ＷＴ１、またはＨｅｒ２を結合する、実施形態１４―１６の任意の１つに記載のＨＳＰＣ。
２７．当該細胞内成分が、４−１ＢＢ、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＤＡＰ１０、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、Ｆｙｎ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＬＡＴ、Ｌｃｋ、ＬＲＰ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＯＴＣＨ１、ｐＴα、ＰＴＣＨ２、ＯＸ４０、ＲＯＲ２、Ｒｙｋ、ＳＬＡＭＦ１、Ｓｌｐ７６、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＲＩＭ、Ｗｎｔ、及びＺａｐ７０のシグナル伝達及び／または刺激ドメインから選ばれる１つ以上のシグナル伝達及び／または刺激ドメインを含有するエフェクタードメインを含む、実施形態１４―２６の任意の１つに記載のＨＳＰＣ。
２８．当該細胞内成分が、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８ζ、または４−１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインを含有するエフェクタードメインを含む、実施形態１４―２７の任意の１つに記載のＨＳＰＣ。
２９．当該細胞内成分が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、またはＢ７−Ｈ３の共刺激ドメインから選ばれる１つ以上の共刺激ドメインを含有するエフェクタードメインを含む、実施形態１４―２８の任意の１つに記載のＨＳＰＣ。
３０．当該細胞内成分が、（ｉ）ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインの全部またはその一部、（ｉｉ）ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインの全部またはその一部、（ｉｉｉ）４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインの全部またはその一部、または（ｉｖ）ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、及び／または４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインの全部またはその一部を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含有するエフェクタードメインを含む、実施形態１４―２９の任意の１つに記載のＨＳＰＣ。
３１．当該細胞内成分が、ＣＤ３ζの変異体及び／または４−１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインの一部分を含有するエフェクタードメインを含む、実施形態１４―３０の任意の１つに記載のＨＳＰＣ。
３２．当該ＨＳＰＣがまた、スペーサー領域を発現すように遺伝子的に改変された、実施形態１４―１８、２１−２３、または２６−３１の任意の１つに記載のＨＳＰＣ。
３３．当該スペーサー領域が、ヒト抗体のヒンジ領域の一部分を含む、実施形態３２に記載のＨＳＰＣ。
３４．当該スペーサー領域が、ヒンジ領域、及びＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３またはそれらの組み合わせから選ばれるヒト抗体のＦｃドメインの少なくとも１つのその他の部分を含む、実施形態３２または３３に記載のＨＳＰＣ。
３５．当該スペーサー領域が、Ｆｃドメイン及びヒトＩｇＧ４重鎖ヒンジを含む、実施形態３２または３３に記載のＨＳＰＣ。
３６．当該スペーサー領域が、１２以下のアミノ酸、１１９以下のアミノ酸、または２２９以下のアミノ酸から選ばれた長さの領域である、実施形態３２に記載のＨＳＰＣ。
３７．当該スペーサー領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１である、実施形態３２に記載のＨＳＰＣ。
３８．当該ＨＳＰＣがまた、膜貫通ドメインを発現するように遺伝子的に改変された、実施形態１４―３７の任意の１つに記載のＨＳＰＣ。
３９．当該膜貫通ドメインが、ＣＤ２８膜貫通ドメインまたはＣＤ４膜貫通ドメインである、実施形態３８に記載のＨＳＰＣ。
４０．当該細胞外成分がさらに、タグ配列を含む、実施形態１４―３９の任意の１つに記載のＨＳＰＣ。
４１．当該タグ配列が、細胞内シグナル伝達ドメインを欠いたＥＧＦＲである、実施形態４０に記載のＨＳＰＣ。
４２．当該ＨＳＰＣが、ＣＤ３４＋である、実施形態１４―４１の任意の１つに記載のＨＳＰＣ。
４３．（ｉ）望ましくない細胞上の細胞マーカーを結合するリガンド結合ドメインを含む細胞外成分、及び（ｉｉ）エフェクタードメインを含む細胞内成分を発現するように、遺伝子的に改変された非エフェクターＴ細胞。
４４．当該リガンド結合ドメインが、抗体フラグメントである、実施形態４３に記載の非エフェクターＴ細胞。
４５．当該リガンド結合ドメインが、抗体の単鎖可変フラグメントである、実施形態４３または４４に記載の非エフェクターＴ細胞。
４６．当該リガンド結合ドメインが、ＣＤ１９を結合する、実施形態４３−４５の任意の１つに記載の非エフェクターＴ細胞。
４７．当該リガンド結合ドメインが、ＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０８）のＣＤＲＬ１配列、ＳＲＬＨＳＧＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１１）のＣＤＲＬ２配列、ＧＮＴＬＰＹＴＦＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０４）のＣＤＲＬ３配列、ＤＹＧＶＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０３）のＣＤＲＨ１配列、ＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１４）のＣＤＲＨ２配列、及びＹＡＭＤＹＷＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１５）のＣＤＲＨ３配列を含むｓｃＦｖである、実施形態４３−４６の任意の１つに記載の非エフェクターＴ細胞。
４８．当該非エフェクターＴ細胞がまた、アミノ酸が１２以下のスペーサー領域を発現するように遺伝子的に改変された、実施形態４７に記載の非エフェクターＴ細胞。
４９．当該スペーサー領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７を含む、実施形態４８に記載の非エフェクターＴ細胞。
５０．当該リガンド結合ドメインが、ＲＯＲ１を結合する、実施形態４３−４５の任意の１つに記載の非エフェクターＴ細胞。
５１．当該リガンド結合ドメインが、ＡＳＧＦＤＦＳＡＹＹＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０１）のＣＤＲＬ１配列、ＴＩＹＰＳＳＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１２）のＣＤＲＬ２配列、ＡＤＲＡＴＹＦＣＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１００）のＣＤＲＬ３配列、ＤＴＩＤＷＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０２）のＣＤＲＨ１配列、ＶＱＳＤＧＳＹＴＫＲＰＧＶＰＤＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１３）のＣＤＲＨ２配列、及びＹＩＧＧＹＶＦＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１７）のＣＤＲＨ３配列を含むｓｃＦｖである、実施形態４３−４５または５０の任意の１つに記載の非エフェクターＴ細胞。
５２．当該リガンド結合ドメインが、ＳＧＳＤＩＮＤＹＰＩＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０９）のＣＤＲＬ１配列、ＩＮＳＧＧＳＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０５）のＣＤＲＬ２配列、ＹＦＣＡＲＧＹＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１６）のＣＤＲＬ３配列、ＳＮＬＡＷ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１０）のＣＤＲＨ１配列、ＲＡＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０７）のＣＤＲＨ２配列、及びＮＶＳＹＲＴＳＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０６）のＣＤＲＨ３配列を含む単鎖のＦｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である、実施形態４３−４５または５０の任意の１つに記載の非エフェクターＴ細胞。
５３．当該非エフェクターＴ細胞がまた、アミノ酸が２２９以下であるスペーサー領域を発現するように遺伝子的に改変された、実施形態５２に記載の非エフェクターＴ細胞。
５４．当該スペーサー領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１を含む、実施形態５３に記載の非エフェクターＴ細胞。
５５．当該リガンド結合ドメインが、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、メソテリン、ＣＤ２０、ＷＴ１、またはＨｅｒ２を結合する、実施形態４３―４５の任意の１つに記載の非エフェクターＴ細胞。
５６．当該細胞内成分が、４−１ＢＢ、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＤＡＰ１０、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、Ｆｙｎ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＬＡＴ、Ｌｃｋ、ＬＲＰ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＯＴＣＨ１、ｐＴα、ＰＴＣＨ２、ＯＸ４０、ＲＯＲ２、Ｒｙｋ、ＳＬＡＭＦ１、Ｓｌｐ７６、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＲＩＭ、Ｗｎｔ、及びＺａｐ７０のシグナル伝達及び／または刺激ドメインから選ばれる１つ以上のシグナル伝達及び／または刺激ドメインを含有するエフェクタードメインを含む、実施形態４３―５５の任意の１つに記載の非エフェクターＴ細胞。
５７．当該細胞内成分が、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８ζ、または４−１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインを含有するエフェクタードメインを含む、実施形態４３―５６の任意の１つに記載の非エフェクターＴ細胞。
５８．当該細胞内成分が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、またはＢ７−Ｈ３の共刺激ドメインから選ばれる１つ以上の共刺激ドメインを含有するエフェクタードメインを含む、実施形態４３―５７の任意の１つに記載の非エフェクターＴ細胞。
５９．当該細胞内成分が、（ｉ）ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインの全部またはその一部、（ｉｉ）ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインの全部またはその一部、（ｉｉｉ）４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインの全部またはその一部、または（ｉｖ）ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、及び／または４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインの全部またはその一部を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含有するエフェクタードメインを含む、実施形態４３―５８の任意の１つに記載の非エフェクターＴ細胞。
６０．当該細胞内成分が、ＣＤ３ζの変異体及び／または４−１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインの一部を含有するエフェクタードメインを含む、実施形態４３―５９の任意の１つに記載の非エフェクターＴ細胞。
６１．スペーサー領域を発現すように遺伝子的に改変された、実施形態４３―４７、５０−５２、または５５−６０の任意の１つに記載の非エフェクターＴ細胞。
６２．当該スペーサー領域が、ヒト抗体のヒンジ領域の一部分を含む、実施形態６１に記載の非エフェクターＴ細胞。
６３．当該スペーサー領域が、ヒンジ領域、及びＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３またはそれらの組み合わせから選ばれるヒト抗体のＦｃドメインの少なくとも１つのその他の部分を含む、実施形態６１または６２に記載の非エフェクターＴ細胞。
６４．当該スペーサー領域が、Ｆｃドメイン及びヒトＩｇＧ４重鎖ヒンジを含む、実施形態６１または６２に記載の非エフェクターＴ細胞。
６５．当該スペーサー領域が、１２以下のアミノ酸、１１９以下のアミノ酸、または２２９以下のアミノ酸から選ばれた長さの領域である、実施形態６１に記載の非エフェクターＴ細胞。
６６．当該スペーサー領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１である、実施形態６１に記載の非エフェクターＴ細胞。
６７．当該非エフェクターＴ細胞がまた、膜貫通ドメインを発現するように遺伝子的に改変された、実施形態４３―６６の任意の１つに記載の非エフェクターＴ細胞。
６８．当該膜貫通ドメインが、ＣＤ２８膜貫通ドメインまたはＣＤ４膜貫通ドメインである、実施形態６７に記載の非エフェクターＴ細胞。
６９．当該細胞外成分がさらに、タグ配列を含む、実施形態４３―６８の任意の１つに記載の非エフェクターＴ細胞。
７０．当該タグ配列が、細胞内シグナル伝達ドメインを欠いたＥＧＦＲである、実施形態６９に記載の非エフェクターＴ細胞。
７１．当該非エフェクターＴ細胞が、ナチュラルキラー細胞である、実施形態４３―７０の任意の１つに記載の非エフェクターＴ細胞。
７２．実施形態１−４、１０、１１、または１４−４２の任意の１つに記載の、遺伝子的に改変されたＨＳＰＣを含む組成物。
７３．実施形態５−９、１２、１３、または４３−７１の任意の１つに記載の、非エフェクターＴ細胞を含む組成物。
７４．点滴または注射に対応して処方された、実施形態７２または７３に記載の組成物。
７５．ＨＳＰＣ及び実施形態１−４、１０、１１、または１４−４２の任意の１つに記載の、遺伝子的に改変されたＨＳＰＣを含む処方物。
７６．ＨＳＰＣ及び実施形態５−９、１２、１３、または４３−７１の任意の１つに記載の、遺伝子的に改変された非エフェクターＴ細胞を含む処方物。
７７．実施形態１−４、１０、１１、または１４−４２の任意の１つに記載の、遺伝子的に改変されたＨＳＰＣ及び実施形態５−９、１２、１３、または４３−７１の任意の１つに記載の、非エフェクターＴ細胞を含む処方物。
７８．ＨＳＰＣをさらに含む、実施形態７７に記載の処方物。
７９．点滴または注射に対応して処方された、実施形態７５−７８の任意の１つに記載の処方物。
８０．当該組成物または処方物を、免疫的な適合無しで、対象者に投与できることを助言する説明書を含む、実施形態７２−７４の任意の１つに記載の組成物を含むキット。
８１．当該組成物または処方物を、免疫的な適合無しで、対象者に投与できることを助言する説明書を含む、実施形態７５−７９の任意の１つに記載の処方物を含むキット。
８２．当該組成物または処方物を、免疫的な適合無しで、対象者に投与できることを助言する説明書を含む、実施形態７２−７４の任意の１つに記載の組成物及び実施形態７５−７９の任意の１つに記載の処方物を含むキット。
８３．遺伝子的に改変されたＨＳＰＣの治療に効果的な量を対象者に投与することを含み、その遺伝子的に改変されたＨＳＰＣが、（ｉ）望ましくないがん細胞上に選択的に発現する細胞マーカーを結合する、リガンド結合ドメインを含む細胞外成分、及び（ｉｉ）エフェクタードメインを含む細胞内成分を発現し、それにより対象者の免疫系を再増殖し及び望ましくないがん細胞を標的化する、それを必要とする対象者の免疫系の再増殖を行い及び対象者において望ましくないがん細胞を標的化する方法。
８４．遺伝子的に改変された非エフェクターＴ細胞を対象者に投与することをさらに含む、実施形態８３に記載の方法であって、その遺伝子的に改変された非エフェクターＴ細胞が、（ｉ）望ましくないがん細胞上に選択的に発現する細胞マーカーを結合する、リガンド結合ドメインを含む細胞外成分、及び（ｉｉ）エフェクタードメインを含む細胞内成分を発現する、前記方法。
８５．ＨＳＰＣを投与することをさらに含む、実施形態８３または８４に記載の方法。
８６．投与前に、対象者に対する免疫的な適合が必要でない、実施形態８３−８５の任意の１つに記載の方法。
８７．当該細胞マーカーが、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、メソテリン、ＣＤ２０、ＷＴ１、またはＨｅｒ２である、実施形態８３−８６の任意の１つに記載の方法。
８８．増殖が、造血細胞移植（ＨＣＴ）に対応して骨髄機能廃絶療法への暴露に基づいて行われる必要があり及びその望ましくないがん細胞が、ＣＤ１９を発現している急性リンパ性白血病細胞である、実施形態８３−８７の任意の１つに記載の方法。
８９．当該対象者が、再発小児急性リンパ性白血病の患者である、実施形態８３−８８の任意の１つに記載の方法。
９０．遺伝子的に改変された非エフェクターＴ細胞の治療に有効な量を対象者に投与し、その遺伝子的に改変された非エフェクターＴ細胞が、（ｉ）選択的に発現した細胞マーカーを結合するリガンド結合ドメインを含む細胞外成分、及び（ｉｉ）エフェクタードメインを含む細胞内成分を発現し、当該対象者からのがん細胞上に選択的に発現した少なくとも１つの細胞マーカーを特定することを含む、対象者の望ましくないがん細胞を標的化する方法。
９１．遺伝子的に改変されたＨＳＰＣを対象者に投与することを含み、その遺伝子的に改変されたＨＳＰＣが、（ｉ）選択的に発現した細胞マーカーを結合するリガンド結合ドメインを含む細胞外成分、及び（ｉｉ）エフェクタードメインを含む細胞内成分を発現する、実施形態９０に記載の方法。
９２．対象者からのがん細胞上に選択的に発現した少なくとも１つの細胞マーカーを特定することを含む、対象者の望ましくないがん細胞を標的化する方法であって、遺伝子的に改変されたＨＳＰＣを対象者に投与し、前記遺伝子的に改変されたＨＳＰＣが、（ｉ）選択的に発現した細胞マーカーを結合するリガンド結合ドメインを含む細胞外成分、及び（ｉｉ）エフェクタードメインを含む細胞内成分を発現し、当該対象者からのがん細胞上に選択的に発現した少なくとも１つの細胞マーカーを特定することを含む、対象者の望ましくないがん細胞を標的化する方法。
９３．ＨＳＰＣの治療に効果的な量を対象者に投与することにより、その対象者の免疫不全、汎血球減少症、好中球減少症、及び／または白血球減少症を治療することをさらに含む、実施形態９０−９２の任意の１つに記載の方法。
９４．免疫不全、汎血球減少症、好中球減少症、及び／または白血球減少症が、化学療法、放射線療法、及び／またはＨＣＴに対応した骨髄機能廃絶療法によるものである、実施形態９３に記載の方法。
９５．当該細胞マーカーが、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、メソテリン、ＣＤ２０、ＷＴ１、またはＨｅｒ２である、実施形態９０−９４の任意の１つに記載の方法。
９６．投与前に、当該対象者への免疫的な適合が必要でない、実施形態９０−９５の任意の１つに記載の方法。
９７．当該望ましくないがん細胞が、ＣＤ１９を発現している急性リンパ性白血病細胞である、実施形態９０−９６の任意の１つに記載の方法。
９８．当該対象者が、再発小児急性リンパ性白血病の患者である、実施形態９０−９７の任意の１つに記載の方法。
９９．ＨＳＰＣ及び／または遺伝子的に改変されたＨＳＰＣの治療に効果的な量を当該対象者に投与し、それにより当該対象者の免疫系が増殖することを含む、それを必要とする対象者の免疫系を増殖する方法。
１００．当該増殖が、免疫不全、汎血球減少症、好中球減少症、または白血球減少症の１つ以上に基づいて必要とされる、実施形態９９に記載の方法。
１０１．当該増殖が、ウイルス感染、微生物感染症、寄生虫感染症、腎疾患、及び／または腎不全の１つ以上に基づいて必要とされる、実施形態９９または１００に記載の方法。
１０２．当該増殖が、化学療法、ＨＣＴに対応した骨髄機能廃絶療法、及び／または急性電離放射線への暴露に基づいて必要とされる、実施形態９９―１０１の任意の１つに記載の方法。
１０３．当該増殖が、骨髄抑制または造血欠陥を引き起こす薬剤への暴露に基づいて必要とされる、実施形態９９−１０２の任意の１つに記載の方法。
１０４．当該増殖が、ペニシリン、ガンシクロビ、ダウノマイシン、メプロバメート、アミノピリン、ジピロン、フェニトイン、カルバマゼピン、プロピルチオウラシル、及び／またはメチマゾールへの暴露に基づいて必要とされる、実施形態９９−１０３の任意の１つに記載の方法。
１０５．当該増殖が、透析への暴露に基づいて必要とされる、実施形態９９−１０４の任意の１つに記載の方法。
１０６．遺伝子的に改変されたＨＳＰＣ及び／または遺伝子的に改変された非エフェクターＴ細胞を投与することにより、対象者における望ましくないがん細胞を標的化することをさらに含む、実施形態９９−１０５の任意の１つに記載の方法であって、その遺伝子的に改変されたＨＳＰＣ及び／または遺伝子的に改変された非エフェクターＴ細胞が、（ｉ）対象者のがん細胞上に選択的に発現していると判っている細胞マーカーに結合するリガンド結合ドメインを含む細胞外成分、及び（ｉｉ）エフェクタードメインを含む細胞内成分を発現する、前記方法。
１０７．当該がん細胞が、副腎がん、膀胱がん、血液がん、骨のがん、脳のがん、乳がん、カルシノーマ、子宮頸がん、結腸がん、大腸がん、子宮体がん、耳、鼻と喉（ＥＮＴ）のがん、子宮内膜がん、食道がん、消化器がん、頭頸部がん、ホジキン病、腸がん、腎臓がん、喉頭がん、白血病、肝臓がん、リンパ節がん、悪性リンパ腫、肺がん、黒色腫、中皮腫、骨髄腫、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔がん、卵巣がん、膵がん、陰茎がん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、肉腫、セミノーマ、皮膚がん、胃がん、テラトーマ、精巣がん、甲状腺がん、子宮がん、腟がん、血管腫瘍、及び／またはそれらの転移からの細胞である、実施形態１０６に記載の方法。
１０８．当該細胞マーカーが、Ａ３３、ＢＡＧＥ、Ｂｃｌ−２、β−カテニン、Ｂ７Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１９−９、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤ１２３、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ−ＭＥＴ、ＣＳ−１、サイクリンＢ１、ＤＡＧＥ、ＥＢＮＡ、ＥＧＦＲ、エフリンＢ２、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥｐｈＡ２、エストロゲン受容体、ＦＡＰ、フェリチン、α-フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＦＬＴ１、ＦＬＴ４、葉酸結合タンパク質、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、ＧＡＧＥ、Ｇ２５０、ＧＤ−２、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＲ、ＧＭ２、ｇｐ７５、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ １７）、ｇｐ１３０、ＨＬＡ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＨＶＥＭ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ６Ｒ、ＫＤＲ、Ｋｉ−６７、ＬＩＦＲβ、ＬＲＰ、ＬＲＰ５、ＬＴβＲ、メソテリン、ＯＳＭＲβ、ｐ５３、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＲＡＭＥ、プロゲステロン受容体、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＴＣＨ１、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ、メソテリン、ＭＵＣ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ−１−Ｂ、ｍｙｃ、ＮＹＥＳＯ−１、ＲＡＮＫ、ｒａｓ、Ｒｏｂｏ１、ＲＯＲｌ、サバイビン、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、テネイシン、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＷＥＡＫ−Ｒ、ＴＳＴＡチロシナーゼ、ＶＥＧＦ、及びＷＴ１から選ばれる細胞マーカーである、実施形態１０６または１０７に記載の方法。
１０９．当該がんが、白血病／リンパ腫であり及び当該細胞のマーカーが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、ＣＤ３３、及びＷＴ−１の１つ以上である、当該がんが、多発性骨髄腫であり及び当該細胞のマーカーが、ＢＣＭＡである、当該がんが、前立腺がんであり及び当該細胞マーカーが、ＰＳＭＡ、ＷＴ１、ＰＳＣＡ、及びＳＶ４０ Ｔの１つ以上である、当該がんが、乳がんであり及び当該細胞マーカーが、ＨＥＲ２、ＥＲＢＢ２、及びＲＯＲ１の１つ以上である、当該がんが、幹細胞がんであり及び当該細胞マーカーがＣＤ１３３である、当該がんが、卵巣がんであり及び当該細胞マーカーが、Ｌ１−ＣＡＭ、ＭＵＣ−ＣＤ、葉酸受容体、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、ＲＯＲ１、メソテリン、及びＷＴ−１の１つ以上である、当該がんが、中皮腫あり及び当該細胞マーカーが、メソテリンである、当該がんが、腎細胞がんであり及び当該細胞マーカーが、ＣＡＩＸである、当該がんが、黒色腫であり及び当該細胞マーカーが、ＧＤ２である、当該がんが、膵臓がんであり及び当該細胞マーカーが、メソテリン、ＣＥＡ、ＣＤ２４、及びＲＯＲ１の１つ以上である、または当該がんが、肺がんであり及び当該細胞マーカーが、ＲＯＲ１である、実施形態１０６−１０８の任意の１つに記載の方法。
１１０．当該がんが、急性リンパ性白血病であり及び当該対象者が、小児患者である、実施形態１０６−１０９の任意の１つに記載の方法。
１１１．投与前に、当該対象者への免疫的な適合が必要でない、実施形態１０６−１１０の任意の１つに記載の方法。
１１２．遺伝子的に改変されたＨＳＰＣ及び／または遺伝子的に改変された非エフェクターＴ細胞の治療に効果的な量を、必要に応じて対象者に投与し、その遺伝子的に改変された細胞が、（ｉ）リガンド結合ドメインＣＤ１９を含む細胞外成分、及び（ｉｉ）エフェクタードメインを含む細胞内成分を発現し、それによりＣＤ１９を選択的に発現している細胞を標的化し及び破壊することを含む、破壊に対応してＣＤ１９を選択的に発現している細胞を標的化する方法。
１１３．ＨＳＰＣの治療に効果的な量を当該対象者に投与することによる、当該対象者の免疫不全、汎血球減少症、好中球減少症、及び／または白血球減少症の治療をさらに含む、実施形態１１２に記載の方法。
１１４．当該免疫不全や汎血球減少症、好中球減少症、及び／または白血球減少症が、化学療法、放射線療法、及び／またはＨＣＴに対応した骨髄機能廃絶療法によるものである、実施形態１１３に記載の方法。
１１５．投与前に、当該対象者への免疫的な適合が必要でない、実施形態１１２−１１４の任意の１つに記載の方法。
１１６．ＣＤ１９を選択的に発現している当該細胞が、急性リンパ性白血病細胞である、実施形態１１２−１１５の任意の１つに記載の方法。
１１７．当該対象者が、再発小児急性リンパ性白血病患者である、実施形態１１２−１１６の任意の１つに記載の方法。

【0165】

実施例１。ＣＤ１９−ＣＡＲ及びｈｕＥＧＦＲｔ選択／自滅コンストラクトの同調発現に対応した、２／３世代レンチウイルスベクターの設計及びｃＧＭＰ産生を創出した。ＣＤ１９特異のＣＡＲをコードするｃＧＭＰ条件下でのＳＩＮ水疱性口内炎ウイルス Ｇ（ＶＳＶ−Ｇ）偽型のレンチウイルスベクター及び細胞内シグナル伝達ドメインを含まない切断されたヒトＥＧＦＲであるｈｕＥＧＦＲｔの両方を、発現させた。ＣＤ１９特異のｓｃＦｖＦｃ−ＣＤ３ζＣＤ２８ ＣＡＲ及びｈｕＥＧＦＲｔベクターは、そのＵ３領域が、ＣＭＶプロモーターで置き換えられた領域のハイブリッド５′ＬＴＲ及びそのシス作用制御配列が、Ｕ３領域から完全に取り除かれた領域の３′ＬＴＲを含む。その結果、プロウイルスが産生され及び染色体に組み込まれる場合、５′及び３′の両ＬＴＲは不活性化される。当該ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ１９特異のマウスＩｇＧ１ｍＡｂ（ＦＭＣ６３）、Ｆｃ及びヒトＩｇＧ４重鎖のヒンジ領域、ヒトＣＤ２８膜貫通領域、及びＣＤ３ζ及びＣＤ２８の細胞質ドメインから誘導されたヒトＧＭＣＳＦＲα鎖リーダー配列、ＶＬ及びＶＨ配列を含む。このコンストラクトは、そのＣＭＶプロモーターが、ヒトＥＦ−１αプロモーターと交換された領域の改変ｐＨＩＶ７にクローンされた（図２９Ａ）。当該ベクターは、Ｔ２Ａエレメントの使用を介して、ＣＤ１９ ＣＡＲとｈｕＥＧＦＲｔの約１対１の発現を可能にする。次に、ＣＤ１９特異のｓｃＦｖ−４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ ＣＡＲフラグメントが、ＩｇＧ１マウスのモノクローナル抗体（ＦＭＣ６３）、ヒトＩｇＧ４ヒンジ及びヒトＣＤ２８膜貫通領域そしてヒトＣＤ３ζの細胞質テールを伴う４−１ＢＢ共刺激エレメントから誘導された、ＣＤ１９特異のｓｃＦｖの表面発現を指示するために、ヒトＧＭＣＳＦ受容体α鎖シグナル伝達配列のＮ末端リーダーペプチドをコードする（図２９Ｂ）。再び当該ベクターは、Ｔ２Ａエレメントの使用を介して、ＣＤ１９ ＣＡＲとｈｕＥＧＦＲｔの約１対１の発現を可能にする。

【0166】

ｈｕＥＧＦＲｔの発現は、形質導入効率の容易な実験を可能にする第二細胞表面マーカーに対して与えられる。ビオチン化アービタックスは、細胞表面に発現したｈｕＥＧＦＲｔに結合し及びフローサイトメトリーでの解析に対応して蛍光色素で標識化できる。さらに、それはアービタックスの治療を伴う臨床場面において、自滅遺伝子として利用可能である。ＣＡＲの場所において、ｅＧＦＰを伴う類似のベクターが、産生された。

【0167】

実施例２。ノッチを介した、ＣＢ ＨＳＰＣの体外増殖は、臨床的に検証された、良受容性の細胞療法産生物であり、ＨＬＡ適合無しでいつでもその効用を与えることができ、そしてＨＣＴ及び集中化学療法の両場面において、一時的な骨髄生着を提供する。既成の増殖ユニットを、８５を超える対象者に点滴したが、ＤＭＳＯに起因するアレルギー反応の一例を除いて、重篤な有害事象は指摘されなかった。さらに、ＨＣＴ場面における１８０日を超えた及び化学療法場面における点滴後１４日での永続的な生着は、無かった。

【0168】

方法。臍帯血／胎盤血液ユニットを、出産時にヒトから採取した。採取した血液は、凝固を防ぐため抗凝血剤と混合し及び貯蔵した。計画された増殖培養の開始前に、組織培養容器を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、２．５ μｇ／ｍｌのＤｅｌｔａ１^{ｅｘｔ−ｌｇＧ}及び５ μｇ／ｍｌのＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）（遺伝子組み換えのヒトフィブロネクチン・フラグメント）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）と共に、４℃で一晩または３７℃で最小２時間の第一被覆を行った。次いでフラスコをＰＢＳで洗浄し及び次いでＰＢＳ−２％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）でブロックした。新鮮な臍帯血ユニットから、赤血球を分離し及び自動ＭＡＣＳ（登録商標）細胞分離システム（ｔｈｅ ａｕｔｏＭＡＣＳ（登録商標） Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ，Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＣＤ３４^＋細胞の選別を実施した。濃縮後、サンプル中のＣＤ３４^＋細胞のパーセンテージは、濃縮前のサンプル中のＣＤ３４^＋細胞のパーセンテージに比べて相対的に増加した。この濃縮ＣＤ３４^＋細胞の断片を、ｒｈＩＬ−３（１０ ｎｇ／ｍｌ）、ｒｈＩＬ−６（５０ ｎｇ／ｍｌ）、ｒｈＴＰＯ （５０ ｎｇ／ｍｌ）、ｒｈＦｌｔ−３Ｌ（５０ ｎｇ／ｍｌ）、ｒｈＳＣＦ（５０ ｎｇ／ｍｌ）で補ったＳＴＥＭＳＰＡＮ^ＴＭ無血清増殖培地（ＳＴＥＭＳＰＡＮ^ＴＭ Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ）から成る、最終培地中で再懸濁した。

【0169】

ＣＤ１９特異のｓｃＦｖＦｃ：ＣＤ２８：ζキメラ抗原受容体及び選択的自滅コンストラクトｈｕＥＧＦＲｔの共増殖を指示するＳＩＮレンチウイルスベクターを、その３日目または４日目に、レンチウイルス上清（ＭＯＩ ３）及び４ μｇ／ｍｌのプロタミン硫酸塩と共に、８００ｘｇを３２℃で４５分間の遠心分離を介して、ノッチ増殖ＣＢ幹細胞に形質導入した。また、そのＳＩＮレンチウイルスベクターは、４−１ＢＢの共刺激をコードした（当該図の概説を参照）。潜在的なシグナル伝達能力を有するＨＳＰＣ上のＣＡＲの発現を考慮して、抗原刺激を与えるために、７日目に、放射線照射ＬＣＬを１対１の比率で培養に加えた。

【0170】

当該増殖培養の最終段階で、ＮＫ細胞及び好中球は、依然として未熟である。溶菌能力の完全評価のため、培養法を、成熟度を高めるように工夫した。ＮＫ細胞のために、当該培養を、ヒト血清、５０ Ｕ／ｍＬのＩＬ−２及び５００ ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５で補われるＲＰＭＩ培地、またはヒト血清、Ｌ−グルタミン、５０ Ｕ／ｍＬのＩＬ−２及び５００ ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５で補われるＲＰＭＩ培地に交換した。

【0171】

ＮＯＤ／ＳＣＩＤ ＩＬ２Ｒ ｎｕｌｌ（ＮＯＧ）マウスモデルを、増殖ＣＢ細胞の生着を評価するために使用した。亜致死照射の後に、マウスに、増殖ＣＢ細胞を確実に生着させることができる。形質導入された増殖ＣＢ細胞での生着を判断するために、ＮＯＧマウスを、線形加速器により３２５ｃＧｙの線量で照射し及びＤｅｌｔａ−１^{ｅｘｔ−ＩｇＧ}上で培養された１０，０００から３０，０００細胞数のＣＤ３４^＋ＣＢ細胞から産生された産物を、尾静脈注射を介して注入した。

【0172】

結果。形質導入効率は、１０から＞５０％の範囲であり及びＣＤ３４＋及びＣＤ３４−間では、一般に等しい形質導入であった。コピー数分析は、検証された定量リアルタイムＰＣＲ解析による判定として、１−４コピー／細胞の間に在ることを示したので、これは臨床的遺伝子治療の細胞産物に対するＦＤＡの要件に則している。

【0173】

ノッチリガンド上で培養されたＣＤ３４＋ＣＢ細胞は、様々な細胞型を含んでおり、それらは、免疫表現型検査に基づき特定できる。ＣＤ１９ ＣＡＲレンチウイルスで形質導入された培養を、同じ臍帯血ユニットからの非形質導入培養と比較したが、その採取時点でのまたはＣＤ３４倍増殖及びＴＮＣ倍増殖を含む培養における細胞の全体的な増殖においての、最終免疫表現型検査による顕著な差異は検出されなかった。

【0174】

導入遺伝子の発現は、１４日目の最終培養の表現型には影響を与えず、及び導入遺伝子の発現は、全ての細胞のサブセットに見られ及びその培養期間にわたり相対的に安定して表れた。

【0175】

抗体への暴露が、その培養に不都合な影響を引き起こすかどうかを判定するために、当該細胞培養をＣＤ１９＋ＬＣＬに暴露する追加実験を行った。７日目に、当該培養に放射線照射ＬＣＬを１対１の比率で追加したことによる不都合は起きなかったし、及び形質導入された及び形質導入されなかった両培養において、事実、増殖及び生存力が高められた。当該ＬＣＬは、ＣＡＲ＋数の増加を示さず、抗原が未熟細胞を発現しているＣＡＲの増殖を高めないことを示唆している。さらに、当該導入遺伝子は、最終産物の全ての形質細胞のサブセットに等しく検出された。これらの結果のグラフ描写に対しては、図３０Ａ、３０Ｂ、３１、３２及び３３を参照のこと。

【0176】

当該ＣＤ１９ ＣＡＲの発現を介しＣＤ１９に遭遇することによるエフェクター機能の導入は、当該改変ＣＢ ＨＳＰＣ細胞の究極の抗ガン活性（例えば、抗白血病）にとって重要である。差異化した培養条件は、ＮＫ細胞の増加をもたらした（図３４）。ＣＤ５６＋細胞の断片を整理して、Ｋ５６２及びＬＣＬの標的細胞を伴うＣＲＡに使用した。予想通り、形質導入されない及び形質導入された両細胞は、Ｋ５６２を殺傷することができ、及び、ＬＣＬもまた両者に死滅させられたが、当該ＣＡＲの発現を通して、ＬＣＬの溶菌が非常に高められた。より特定には、当該ＣＤ１９−ＣＡＲ発現のＮＫ細胞は、両者がＫ５６２標的を等しく死滅させたのに反して（７５％対８０％）、非形質導入ＮＫ細胞と比べて細胞障害活性を高めた（５０％対３０％）。図３５を参照。

【0177】

増殖ＣＢ細胞を移植された当該ＮＯＧモデルは、移植後、約４−５週目に始まる、多数のＣＤ１９＋細胞の増殖を招いた。形質導入された細胞の早期生着への影響は無なかったがしかし、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現している細胞を移植されたマウスにおけるＣＤ１９生着は、非形質導入細胞と比べて大幅な減少があり、そのＣＤ１９細胞数は、抗ＣＤ１９活性を示している生着細胞の＞２０％であった。ＮＫ細胞数は、高いエフェクター機能を与えるために、開始３週目から週３回の照射及び皮下注射による、ＮＳ０−ＩＬ１５分泌細胞の使用により増加した。この影響で、生体内におけるＣＤ５６＋細胞の量が高められた。図３６及び３７を参照。

【0178】

このデータは、ＣＤ１９特異のＣＡＲを発現するための、固定化されたＤｅｌｔａ^{１ｅｘｔ−ＩｇＧ}の存在下の培養中での増殖ＣＢ細胞の形質導入は、当該マウスモデルにおけるその増殖に、または再生能力においても、定性的及び定量的な検出可能な効果をもたらさないことを示す。これらの結果は、移植片対がん効果（例えば、白血病）を臍帯血移植に遺伝子改変的に持ち込む方法が、有望であると示している。さらに、ＣＢ ＨＳＰＣを増殖するユニバーサルドナーへのＣＤ１９ ＣＡＲの形質導入は、治療に対する臨床的な必要性を伴う、例えば、再発した者または永続的ＭＲＤを有する者などの対象者の特定に従い、即効性（例えば、投与前の免疫的な適合が要求されない）を与えるために、抗ＣＤ１９産物の点滴が可能である。培養全体または生体内生着能力への影響無しで、ノッチリガンド上に増殖したＣＤ３４＋臍帯血細胞は、同時に抗ＣＤ１９活性を遺伝子的に組み入れる一方で、信頼性の高い形質導入を示した。増殖臍帯血細胞は、既存の、非ＨＬＡ一致の細胞療法として、すでに臨床的に使用されているので、本明細書に記述の実施例は、たとえ手に入れるのが不可能な患者が免疫療法を受けることを及び自己Ｔ細胞産物を遺伝子組み換え的に得ることを可能にする、さらなるいつでも使える細胞療法としての使用を示す。

【0179】

示されるように、特に明示が無い限り、本開示の実践に、当技術分野におけるウイルス学、微生物学、分子生物学、及び遺伝子組換えＤＮＡ技術の従来の方法を取り入れることができる。そのような技術は、文献に完全に解説されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ ＆ ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，ｖｏｌ．Ｉ ＆ ＩＩ（Ｐ．Ｔｉｊｅｓｓｅｎ，ｅｄ．）、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｖｏｌ．Ｉ ＆ ＩＩ（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ及びＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ｅｄｓ．）を参照のこと。各々に記載の、同じ目的に対する教示内容を本明細書に援用し、参照として組み込む。

【0180】

当業者には理解されることだが、本明細書に開示される各実施形態は、その特別に示される要素、ステップ、含有物または組成物を含み、それらから本質的に成りまたはそれらから成ることができる。「含む（ｉｎｌｕｄｅｓ）」または「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）、〜から本質的に成るまたは〜から成る」を意味する。移行用語「含有（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、包含することを意味し、しかし非限定的に、及びたとえ多量であっても、非特定の要素、ステップ、含有物、または組成物の包含を可能にする。移行フレーズ「〜から成る」は、特定されない任意の要素、ステップ、含有物、または組成物を除外する。移行フレーズ「〜から本質的に成る」は、特定の要素、ステップ、含有物、または組成物に対して、及びその実施形態に物質的に影響しないそれらに対して、その実施形態の範囲を限定する。物質的影響は、（ｉ）対象者において抗がん効果を創出するための細胞投与の有効性に、統計的に有意な減少、及び／または（ｉｉ）対象者の免疫系を増殖させるための細胞投与の有効性に、統計的に有意な減少をもたらす可能性がある。

【0181】

特に明示しない限り、含有物の量、分子量、反応条件などの特徴を表し、及び本明細書と請求項にこれ以降に使用される全ての数字は、用語「約」により全ての例示において変更されると理解される。したがって、その反対に明示しない限り、本明細書及び添付の請求項に記載の数値パラメーターは、本発明により得られると考えられる望ましい特徴に応じて変動してよい、近似値である。少なくとも、当該請求項の範囲への均等論の適用を制限する試みとしてではなく、各数値パラメーターは少なくとも、報告された有効桁数に照らして及び通常の丸めのテクニックの適用によって解釈するべきである。さらなる明瞭さが必要な場合、用語「約」は、表明された数値または数値の範囲との組み合わせで使用される際に、当業者が、それに属すると合理的にみなす意味を有する、すなわち、表明された数値または数値の範囲に比べ、表明値の±２０％の範囲内で、表明値の±１９％の範囲内で、表明値の±１８％の範囲内で、表明値の±１７％の範囲内で、表明値の±１６％の範囲内で、表明値の±１５％の範囲内で、表明値の±１４％の範囲内で、表明値の±１３％の範囲内で、表明値の±１２％の範囲内で、表明値の±１１％の範囲内で、表明値の±１０％の範囲内で、表明値の±９％の範囲内で、表明値の±８％の範囲内で、表明値の±７％の範囲内で、表明値の±６％の範囲内で、表明値の±５％の範囲内で、表明値の±４％の範囲内で、表明値の±３％の範囲内で、表明値の±２％の範囲内で、または表明値の±１％の範囲内で、幾分多いかまたは少ないことを示す。

【0182】

本発明の広い範囲に定められている数値の範囲及びパラメーターは、近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に定められる数値は、可能な限り正確に報告される。しかしながら、任意の数値は、本質的に、それらの各々の試験測定に見出される標準偏差から必然的に生じるある誤差を含む。

【0183】

本発明を記述する文脈において（特に以下の請求項の文脈において）使用する、用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」及び類似の指示語は、本明細書で特に明示が無い限りまたは文脈で明確に否定しないかぎり、単数と複数の両方を含んでいると解釈する。本明細書の値の範囲の記述は、その範囲内に含まれる個別の各値を指す、速記法としての役割を果たすことだけを意図している。本明細書で特に明示が無い限り、個別の値は、それが、個別のここに記述されたかのように、本明細書に組み込まれる。本明細書に記述される全ての方法は、本明細書で特に明示が無い限りまたは文脈で明確に否定しないかぎり、任意の適切な順序で実施できる。任意の及び全ての例示、または本明細書で与えられる例示的な用語（例えば、「などの」）使用は、本発明をより良く照らし出すことのみを意図しており及び請求以外の本発明の範囲に限定をもたらすものではない。本明細書中の言語は、本発明の実践に不可欠な任意の非請求要素を示している、と解釈すべきではない。

【0184】

本明細書に開示される本発明の代替可能な要素または実施形態のグループは、制約として解釈されるべきではない。各グループ要員は、本明細書に見出されるそのグループの別の要員または別の要素を、参照し及び個別に請求しまたはそれらとの任意の組み合わせであってよい。グループの１つ以上の要員が、利便性及び／または特許性の理由により、そのグループに含まれても、または削除されても良い、と予想される。そのような任意の包含または削除が起きる場合、本明細書は、添付された請求項において使用される全てのマーカッシュグループの書面による記述を満たすように改定されたとして、そのグループを含むとみなされる。

【0185】

本発明の特定の実施形態は、本発明の実践に対して、発明者が知りえる最高の様式を含んで、記述されている。もちろん、実施形態に記述された内容の変更は、これまでの記述を読む当業者には明らかであろう。当発明者は、熟練者が、そのような変更を適切に取り入れることを期待し、及び当発明者は、特に本明細書に記述された以外のことが実践されることを、本発明に意図している。したがって、本発明は、適用される法律の範囲内で、ここに添付される請求項において繰り返される主題の全ての変更内容及び同等内容を含む。さらに、全ての可能な変更内容における、上述された要素の任意の組み合わせは、本明細書で特に明示が無い限りまたは文脈で明確に否定しないかぎり、本発明に含まれる。

【0186】

さらに、本明細書を通して、多数の参照が、書籍、雑誌記事、論文、特許、印刷出版物などから得られている（正確には「参照欄」）。上述の参照の各々は、それらの教示内容に対応して、本明細書に参照として個別に組み入れられる。

【0187】

最後に、本明細書に記述される本発明の実施形態は、本発明の原理の実例となることを理解されよう。取り入れられて良いその他の変更は、本発明の範囲内である。したがって、例示よって、非限定的に、本発明の別の構成が、本明細書の教示に従って利用されて良い。したがって、本発明は、厳密に示され及び記述された内容に制約されない。

【0188】

本明細書に示される詳細は、例示的な方法により及び本発明のみの好ましい実施形態の例示的な討議目的のためであり、及び最も有用でありそして本発明の原理及び多様な実施形態の概念的側面を容易に理解できる記述と考えるものを提供するために、示している。これに関連して、本発明の基本的理解に対して必要なより詳細内容において、本発明の構造の細部を示す試みは無く、当業者に本発明の複数の形態がどのようなものであるかを明らかにする図面及び／または例示に取り入れられた記述は、実践で具体化されて良い。

【0189】

本開示に使用される定義及び説明は、以下の例示を明確に及びあいまいさを残さずに変更するか、またはその意味の適用が、任意の構成を無意味にまたは本質的に無意味にする場合でない限り、任意の将来の構成を制約することを意味し及び意図している。当該用語の構成が、その用語を無意味にまたは本質的に無意味にする場合、当該定義は、Ｗｅｂｓｔｅｒ‘ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、またはｔｈｅ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｄ．Ａｎｔｈｏｎｙ Ｓｍｉｔｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，２００４）などの、当業者に知られる辞典から取り入れられるべきである。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9-1】

【図9-2】

【図9-3】

【図9-4】

【図10】

【図11-1】

【図11-2】

【図11-3】

【図11-4】

【図12】

【図13-1】

【図13-2】

【図13-3】

【図13-4】

【図14】

【図15-1】

【図15-2】

【図15-3】

【図15-4】

【図16】

【図17-1】

【図17-2】

【図17-3】

【図17-4】

【図18】

【図19-1】

【図19-2】

【図19-3】

【図19-4】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24-1】

【図24-2】

【図25】

【図26A】

【図26B】

【図27A】

【図27B】

【図28】

【図29A】

【図29B】

【図30A】

【図30B】

【図31-1】

【図31-2】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]