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特許6685934複数の癌抗原に特異的に結合する三重特異性結合分子及びその使用方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6685934
(24)【登録日】2020年4月3日
(45)【発行日】2020年4月22日
(54)【発明の名称】複数の癌抗原に特異的に結合する三重特異性結合分子及びその使用方法
(51)【国際特許分類】
C07K 16/46 20060101AFI20200413BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20200413BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20200413BHJP
C07K 16/32 20060101ALI20200413BHJP
C07K 16/34 20060101ALI20200413BHJP
C07K 16/24 20060101ALI20200413BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20200413BHJP
A61P 13/00 20060101ALI20200413BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20200413BHJP
A61P 13/10 20060101ALI20200413BHJP
A61P 19/00 20060101ALI20200413BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20200413BHJP
A61P 15/00 20060101ALI20200413BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20200413BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20200413BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20200413BHJP
A61P 1/18 20060101ALI20200413BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20200413BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20200413BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20200413BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20200413BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20200413BHJP
A61P 5/00 20060101ALI20200413BHJP
A61P 13/08 20060101ALI20200413BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20200413BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20200413BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20200413BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20200413BHJP
【ＦＩ】
C07K16/46
C07K16/30ZNA
C07K16/28
C07K16/32
C07K16/34
C07K16/24
A61P35/00
A61P13/00
A61P21/00
A61P13/10
A61P19/00
A61P25/00
A61P15/00
A61P9/10
A61P1/04
A61P1/16
A61P1/18
A61P13/12
A61P35/02
A61P35/04
A61P11/00
A61P17/00
A61P5/00
A61P13/08
A61K39/395 T
!C12N15/62 Z
!C12N15/13
!C12P21/08
【請求項の数】25
【全頁数】167
(21)【出願番号】特願2016-569969(P2016-569969)
(86)(22)【出願日】2015年5月29日
(65)【公表番号】特表2017-519743(P2017-519743A)
(43)【公表日】2017年7月20日
(86)【国際出願番号】US2015033081
(87)【国際公開番号】WO2015184207
(87)【国際公開日】20151203
【審査請求日】2018年5月22日
(31)【優先権主張番号】62/008,229
(32)【優先日】2014年6月5日
(33)【優先権主張国】US
(31)【優先権主張番号】62/107,824
(32)【優先日】2015年1月26日
(33)【優先権主張国】US
(31)【優先権主張番号】62/004,571
(32)【優先日】2014年5月29日
(33)【優先権主張国】US
(73)【特許権者】
【識別番号】504438727
【氏名又は名称】マクロジェニクス，インコーポレーテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100123858
【弁理士】
【氏名又は名称】磯田 志郎
(72)【発明者】
【氏名】ボンビニ エツィオ
(72)【発明者】
【氏名】ムーア ポール エー．
(72)【発明者】
【氏名】リー ジョナサン シー．
(72)【発明者】
【氏名】ジョンソン レスリー エス．
(72)【発明者】
【氏名】シャー カルパナ
【審査官】
池上 京子
(56)【参考文献】
【文献】
特表２０１２−５２８０９２（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特表２００９−５２６８２３（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特表２００７−５３５９１５（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特表２０１３−５４０６９６（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ０７Ｋ １６／００−１６／４６
Ｃ１２Ｎ １／００−１／３８
Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
３つの異なるエピトープに免疫特異的に結合できる三重特異性結合分子であって、
（Ｉ）共有結合的に複合体化した４つの異なるポリペプチド鎖；
（ＩＩ）第１の抗原上に存在するエピトープＩに免疫特異的に結合できる抗原結合ドメインＩ、第２の抗原上に存在するエピトープＩＩに免疫特異的に結合できる抗原結合ドメインＩＩ、及び第３の抗原上に存在するエピトープＩＩＩに免疫特異的に結合できる抗原結合ドメインＩＩＩ；並びに
（ＩＩＩ）Ｆｃドメイン
を含み、
（Ａ）前記エピトープＩ、前記エピトープＩＩ又は前記エピトープＩＩＩのうちの１つは、エフェクタ細胞抗原のエピトープであり、
前記エピトープＩ、前記エピトープＩＩ又は前記エピトープＩＩＩのうちの第２のものは、第１の癌抗原のエピトープであり、
前記エピトープＩ、前記エピトープＩＩ又は前記エピトープＩＩＩのうちの第３のものは、第２の癌抗原のエピトープであり；
（Ｂ）第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ＶＬIドメイン）‐（リンカー１）‐（ＶＨIIドメイン）‐（リンカー２）‐（ヘテロ二量体促進ドメイン）‐（リンカー３）‐（ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン）；又は
（ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン）‐（リンカー４）‐（ＶＬIドメイン）‐（リンカー１）‐（ＶＨIIドメイン）‐（リンカー２）‐（ヘテロ二量体促進ドメイン）；又は
（システイン含有ドメイン）‐（ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン）‐（リンカー４）‐（ＶＬIドメイン）‐（リンカー１）‐（ＶＨIIドメイン）‐（リンカー２）‐（ヘテロ二量体促進ドメイン）
を含み；
（Ｃ）第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ＶＬIIドメイン）‐（リンカー１）‐（ＶＨIドメイン）‐（リンカー２）‐（ヘテロ二量体促進ドメイン）
を含み；
（Ｄ）第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ＶＨIIIドメイン）‐（システイン含有ドメイン）‐（ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン）
を含み；
（Ｅ）第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ＶＬIIIドメイン）‐（システイン含有ドメイン）
を含み；
（Ｆ）前記ＶＬIドメインは、前記エピトープＩに結合できる免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインであり、前記ＶＨIドメインは、前記エピトープＩに結合できる免疫グロブリンの重鎖可変ドメインであり、前記ＶＬIIドメインは、前記エピトープＩＩに結合できる免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインであり、前記ＶＨIIドメインは、前記エピトープＩＩに結合できる免疫グロブリンの重鎖可変ドメインであり、前記ＶＬIIIドメインは、前記エピトープＩＩＩに結合できる免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインであり、前記ＶＨIIIドメインは、前記エピトープＩＩＩに結合できる免疫グロブリンの重鎖可変ドメインであり；
（Ｇ）前記ＶＬIドメイン及び前記ＶＨIドメインは、連結して前記抗原結合ドメインＩを形成し、前記ＶＬIIドメイン及び前記ＶＨIIドメインは、連結して前記抗原結合ドメインＩＩを形成し、前記ＶＬIIIドメイン及び前記ＶＨIIIドメインは、連結して前記抗原結合ドメインＩＩＩを形成し、前記第１のポリペプチド鎖の前記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン及び前記第３のポリペプチド鎖の前記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、連結して前記Ｆｃドメインを形成する、三重特異性結合分子。
（Ｉ）共有結合的に複合体化した４つの異なるポリペプチド鎖；
（ＩＩ）第１の抗原上に存在するエピトープＩに免疫特異的に結合できる抗原結合ドメインＩ、第２の抗原上に存在するエピトープＩＩに免疫特異的に結合できる抗原結合ドメインＩＩ、及び第３の抗原上に存在するエピトープＩＩＩに免疫特異的に結合できる抗原結合ドメインＩＩＩ；並びに
（ＩＩＩ）Ｆｃドメイン
を含み、
（Ａ）前記エピトープＩ、前記エピトープＩＩ又は前記エピトープＩＩＩのうちの１つは、エフェクタ細胞抗原のエピトープであり、
前記エピトープＩ、前記エピトープＩＩ又は前記エピトープＩＩＩのうちの第２のものは、第１の癌抗原のエピトープであり、
前記エピトープＩ、前記エピトープＩＩ又は前記エピトープＩＩＩのうちの第３のものは、第２の癌抗原のエピトープであり；
（Ｂ）第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ＶＬIドメイン）‐（リンカー１）‐（ＶＨIIドメイン）‐（リンカー２）‐（ヘテロ二量体促進ドメイン）‐（リンカー３）‐（ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン）；又は
（ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン）‐（リンカー４）‐（ＶＬIドメイン）‐（リンカー１）‐（ＶＨIIドメイン）‐（リンカー２）‐（ヘテロ二量体促進ドメイン）；又は
（システイン含有ドメイン）‐（ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン）‐（リンカー４）‐（ＶＬIドメイン）‐（リンカー１）‐（ＶＨIIドメイン）‐（リンカー２）‐（ヘテロ二量体促進ドメイン）
を含み；
（Ｃ）第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ＶＬIIドメイン）‐（リンカー１）‐（ＶＨIドメイン）‐（リンカー２）‐（ヘテロ二量体促進ドメイン）
を含み；
（Ｄ）第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ＶＨIIIドメイン）‐（システイン含有ドメイン）‐（ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン）
を含み；
（Ｅ）第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ＶＬIIIドメイン）‐（システイン含有ドメイン）
を含み；
（Ｆ）前記ＶＬIドメインは、前記エピトープＩに結合できる免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインであり、前記ＶＨIドメインは、前記エピトープＩに結合できる免疫グロブリンの重鎖可変ドメインであり、前記ＶＬIIドメインは、前記エピトープＩＩに結合できる免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインであり、前記ＶＨIIドメインは、前記エピトープＩＩに結合できる免疫グロブリンの重鎖可変ドメインであり、前記ＶＬIIIドメインは、前記エピトープＩＩＩに結合できる免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインであり、前記ＶＨIIIドメインは、前記エピトープＩＩＩに結合できる免疫グロブリンの重鎖可変ドメインであり；
（Ｇ）前記ＶＬIドメイン及び前記ＶＨIドメインは、連結して前記抗原結合ドメインＩを形成し、前記ＶＬIIドメイン及び前記ＶＨIIドメインは、連結して前記抗原結合ドメインＩＩを形成し、前記ＶＬIIIドメイン及び前記ＶＨIIIドメインは、連結して前記抗原結合ドメインＩＩＩを形成し、前記第１のポリペプチド鎖の前記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン及び前記第３のポリペプチド鎖の前記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、連結して前記Ｆｃドメインを形成する、三重特異性結合分子。
【請求項2】
前記第３のポリペプチド鎖は、ＣＨ１ドメインを含み、前記第４のポリペプチド鎖はＣＬドメインを任意に含む、請求項１に記載の三重特異性結合分子。
【請求項3】
（ｉ）前記第１のポリペプチド鎖及び前記第２のポリペプチド鎖は互いに共有結合し；
（ｉｉ）前記第１のポリペプチド鎖及び前記第３のポリペプチド鎖は互いに共有結合し；並びに
（ｉｉｉ）前記第３のポリペプチド鎖及び前記第４のポリペプチド鎖は互いに共有結合する、請求項１又は２に記載の三重特異性結合分子。
（ｉｉ）前記第１のポリペプチド鎖及び前記第３のポリペプチド鎖は互いに共有結合し；並びに
（ｉｉｉ）前記第３のポリペプチド鎖及び前記第４のポリペプチド鎖は互いに共有結合する、請求項１又は２に記載の三重特異性結合分子。
【請求項4】
３つの異なるエピトープに免疫特異的に結合できる三重特異性結合分子であって、
（Ｉ）共有結合的に複合体化した３つの異なるポリペプチド鎖；
（ＩＩ）第１の抗原上に存在するエピトープＩに免疫特異的に結合できる抗原結合ドメインＩ、第２の抗原上に存在するエピトープＩＩに免疫特異的に結合できる抗原結合ドメインＩＩ、及び第３の抗原上に存在するエピトープＩＩＩに免疫特異的に結合できる抗原結合ドメインＩＩＩ；並びに
（ＩＩＩ）Ｆｃドメイン
を含み、
（Ａ）前記エピトープＩ、前記エピトープＩＩ又は前記エピトープＩＩＩのうちの１つは、エフェクタ細胞抗原のエピトープであり、
前記エピトープＩ、前記エピトープＩＩ又は前記エピトープＩＩＩのうちの第２のものは、第１の癌抗原のエピトープであり、
前記エピトープＩ、前記エピトープＩＩ又は前記エピトープＩＩＩのうちの第３のものは、第２の癌抗原のエピトープであり；
（Ｂ）第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ＶＬIドメイン）‐（リンカー１）‐（ＶＨIIドメイン）‐（リンカー２）‐（ヘテロ二量体促進ドメイン）‐（リンカー３）‐（ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン）；又は
（ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン）‐（リンカー４）‐（ＶＬIドメイン）‐（リンカー１）‐（ＶＨIIドメイン）‐（リンカー２）‐（ヘテロ二量体促進ドメイン）；又は
（システイン含有ドメイン）‐（ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン）‐（リンカー４）‐（ＶＬIドメイン）‐（リンカー１）‐（ＶＨIIドメイン）‐（リンカー２）‐（ヘテロ二量体促進ドメイン）
を含み；
（Ｃ）第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ＶＬIIドメイン）‐（リンカー１）‐（ＶＨIドメイン）‐（リンカー２）‐（ヘテロ二量体促進ドメイン）
を含み；
（Ｄ）第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ＶＬIIIドメイン）‐（フレキシブルリンカー）‐（ＶＨIIIドメイン）‐（システイン含有ドメイン）‐（ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン）；又は
（システイン含有ドメイン１）‐（ＶＬIIIドメイン）‐（フレキシブルリンカー）‐（ＶＨIIIドメイン）‐（システイン含有ドメイン２）‐（ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン）
を含み；
（Ｅ）前記ＶＬIドメインは、エピトープＩに結合できる免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインであり、前記ＶＨIドメインは、エピトープＩに結合できる免疫グロブリンの重鎖可変ドメインであり、前記ＶＬIIドメインは、エピトープＩＩに結合できる免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインであり、前記ＶＨIIドメインは、エピトープＩＩに結合できる免疫グロブリンの重鎖可変ドメインであり、前記ＶＬIIIドメインは、エピトープＩＩＩに結合できる免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインであり、前記ＶＨIIIドメインは、エピトープＩＩＩに結合できる免疫グロブリンの重鎖可変ドメインであり；並びに
（Ｆ）前記ＶＬIドメイン及び前記ＶＨIドメインは、連結して前記抗原結合ドメインＩを形成し、前記ＶＬIIドメイン及び前記ＶＨIIドメインは、連結して前記抗原結合ドメインＩＩを形成し、前記ＶＬIIIドメイン及び前記ＶＨIIIドメインは、連結して前記抗原結合ドメインＩＩＩを形成し、前記第１のポリペプチド鎖の前記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン及び前記第３のポリペプチド鎖の前記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、連結して前記Ｆｃドメインを形成する、三重特異性結合分子。
（Ｉ）共有結合的に複合体化した３つの異なるポリペプチド鎖；
（ＩＩ）第１の抗原上に存在するエピトープＩに免疫特異的に結合できる抗原結合ドメインＩ、第２の抗原上に存在するエピトープＩＩに免疫特異的に結合できる抗原結合ドメインＩＩ、及び第３の抗原上に存在するエピトープＩＩＩに免疫特異的に結合できる抗原結合ドメインＩＩＩ；並びに
（ＩＩＩ）Ｆｃドメイン
を含み、
（Ａ）前記エピトープＩ、前記エピトープＩＩ又は前記エピトープＩＩＩのうちの１つは、エフェクタ細胞抗原のエピトープであり、
前記エピトープＩ、前記エピトープＩＩ又は前記エピトープＩＩＩのうちの第２のものは、第１の癌抗原のエピトープであり、
前記エピトープＩ、前記エピトープＩＩ又は前記エピトープＩＩＩのうちの第３のものは、第２の癌抗原のエピトープであり；
（Ｂ）第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ＶＬIドメイン）‐（リンカー１）‐（ＶＨIIドメイン）‐（リンカー２）‐（ヘテロ二量体促進ドメイン）‐（リンカー３）‐（ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン）；又は
（ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン）‐（リンカー４）‐（ＶＬIドメイン）‐（リンカー１）‐（ＶＨIIドメイン）‐（リンカー２）‐（ヘテロ二量体促進ドメイン）；又は
（システイン含有ドメイン）‐（ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン）‐（リンカー４）‐（ＶＬIドメイン）‐（リンカー１）‐（ＶＨIIドメイン）‐（リンカー２）‐（ヘテロ二量体促進ドメイン）
を含み；
（Ｃ）第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ＶＬIIドメイン）‐（リンカー１）‐（ＶＨIドメイン）‐（リンカー２）‐（ヘテロ二量体促進ドメイン）
を含み；
（Ｄ）第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ＶＬIIIドメイン）‐（フレキシブルリンカー）‐（ＶＨIIIドメイン）‐（システイン含有ドメイン）‐（ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン）；又は
（システイン含有ドメイン１）‐（ＶＬIIIドメイン）‐（フレキシブルリンカー）‐（ＶＨIIIドメイン）‐（システイン含有ドメイン２）‐（ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン）
を含み；
（Ｅ）前記ＶＬIドメインは、エピトープＩに結合できる免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインであり、前記ＶＨIドメインは、エピトープＩに結合できる免疫グロブリンの重鎖可変ドメインであり、前記ＶＬIIドメインは、エピトープＩＩに結合できる免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインであり、前記ＶＨIIドメインは、エピトープＩＩに結合できる免疫グロブリンの重鎖可変ドメインであり、前記ＶＬIIIドメインは、エピトープＩＩＩに結合できる免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインであり、前記ＶＨIIIドメインは、エピトープＩＩＩに結合できる免疫グロブリンの重鎖可変ドメインであり；並びに
（Ｆ）前記ＶＬIドメイン及び前記ＶＨIドメインは、連結して前記抗原結合ドメインＩを形成し、前記ＶＬIIドメイン及び前記ＶＨIIドメインは、連結して前記抗原結合ドメインＩＩを形成し、前記ＶＬIIIドメイン及び前記ＶＨIIIドメインは、連結して前記抗原結合ドメインＩＩＩを形成し、前記第１のポリペプチド鎖の前記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン及び前記第３のポリペプチド鎖の前記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、連結して前記Ｆｃドメインを形成する、三重特異性結合分子。
【請求項5】
前記第３のポリペプチド鎖はＣＬドメインを含み、前記第３のポリペプチド鎖はＣＨ１ドメインを任意に含む、請求項４に記載の三重特異性結合分子。
【請求項6】
前記第１のポリペプチド鎖の前記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインはノブ担持ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインであり、前記第３のポリペプチド鎖の前記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインはホール担持ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインであるか；又は
前記第３のポリペプチド鎖の前記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインはノブ担持ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインであり、前記第１のポリペプチド鎖の前記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインはホール担持ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の三重特異性結合分子。
前記第３のポリペプチド鎖の前記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインはノブ担持ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインであり、前記第１のポリペプチド鎖の前記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインはホール担持ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の三重特異性結合分子。
【請求項7】
前記ノブ担持ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは配列番号５２の配列を含み、及び前記ホール担持ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは配列番号５３の配列を含む、請求項６に記載の三重特異性結合分子。
【請求項8】
前記第１のポリペプチド鎖及び前記第３のポリペプチド鎖の前記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインが、配列番号１の配列に対する少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、前記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインの連結から形成される前記Ｆｃドメインが、変化したＦｃγＲ仲介エフェクタ機能を呈する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の三重特異性結合分子。
【請求項9】
前記第１のポリペプチド鎖及び前記第３のポリペプチド鎖の前記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインが、
（Ａ）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ３９６Ｌからなる群から選択される１つの置換を含むか；又は
（Ｂ）（１）Ｆ２４３Ｌ及びＰ３９６Ｌ；
（２）Ｆ２４３Ｌ及びＲ２９２Ｐ；並びに
（３）Ｒ２９２Ｐ及びＶ３０５Ｉ；
からなる群から選択される２つの置換を含むか；又は
（Ｃ）（１）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＹ３００Ｌ；
（２）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＶ３０５Ｉ；
（３）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＰ３９６Ｌ；並びに
（４）Ｒ２９２Ｐ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ３９６Ｌ；
からなる群から選択される３つの置換を含むか；又は
（Ｄ）（１）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ及びＰ３９６Ｌ；並びに
（２）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ３９６Ｌ；
からなる群から選択される４つの置換を含むか；又は
（Ε）（１）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ３９６Ｌ；並びに（２）Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ及びＰ３９６Ｌ；
からなる群から選択される５つの置換を含む、請求項８に記載の三重特異性結合分子。
（Ａ）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ３９６Ｌからなる群から選択される１つの置換を含むか；又は
（Ｂ）（１）Ｆ２４３Ｌ及びＰ３９６Ｌ；
（２）Ｆ２４３Ｌ及びＲ２９２Ｐ；並びに
（３）Ｒ２９２Ｐ及びＶ３０５Ｉ；
からなる群から選択される２つの置換を含むか；又は
（Ｃ）（１）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＹ３００Ｌ；
（２）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＶ３０５Ｉ；
（３）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＰ３９６Ｌ；並びに
（４）Ｒ２９２Ｐ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ３９６Ｌ；
からなる群から選択される３つの置換を含むか；又は
（Ｄ）（１）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ及びＰ３９６Ｌ；並びに
（２）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ３９６Ｌ；
からなる群から選択される４つの置換を含むか；又は
（Ε）（１）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ３９６Ｌ；並びに（２）Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ及びＰ３９６Ｌ；
からなる群から選択される５つの置換を含む、請求項８に記載の三重特異性結合分子。
【請求項10】
前記第１のポリペプチド鎖上の前記ヘテロ二量体促進ドメインがＥコイルドメインであり、前記第２のポリペプチド鎖上の前記ヘテロ二量体促進ドメインがＫコイルドメインであるか；又は
前記第１のポリペプチド鎖上の前記ヘテロ二量体促進ドメインがＫコイルドメインであり、前記第２のポリペプチド鎖上の前記ヘテロ二量体促進ドメインがＥコイルドメインである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の三重特異性結合分子。
前記第１のポリペプチド鎖上の前記ヘテロ二量体促進ドメインがＫコイルドメインであり、前記第２のポリペプチド鎖上の前記ヘテロ二量体促進ドメインがＥコイルドメインである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の三重特異性結合分子。
【請求項11】
前記リンカー２はシステイン残基を含むか、又は
前記リンカー２に隣接する前記Ｅコイルドメイン及び前記Ｋコイルドメインはそれぞれシステイン残基を含むか、又は
前記リンカー２はシステイン残基を含み、かつ前記リンカー２に隣接する前記Ｅコイルドメイン又は前記Ｋコイルドメインはシステイン残基を含む、請求項１０に記載の三重特異性結合分子。
前記リンカー２に隣接する前記Ｅコイルドメイン及び前記Ｋコイルドメインはそれぞれシステイン残基を含むか、又は
前記リンカー２はシステイン残基を含み、かつ前記リンカー２に隣接する前記Ｅコイルドメイン又は前記Ｋコイルドメインはシステイン残基を含む、請求項１０に記載の三重特異性結合分子。
【請求項12】
前記リンカー１は配列番号３３の配列を含むか；
前記リンカー２は配列番号３４若しくは４７の配列を含むか；
前記リンカー３は配列番号４６、４７、４８、４９、５０、５１、１５２の配列、若しくはＧＣＧ若しくはＧＧＧを含むか；
前記リンカー４は配列番号５０若しくは１５２の配列を含むか；
前記Ｅコイルドメインは配列番号３９若しくは４１の配列を独立して含み、かつ前記Ｋコイルドメインは配列番号４０若しくは４２の配列を独立して含むか；
前記システイン含有ドメインは配列番号３４、３６、３８若しくは４８の配列を独立して含むか；又は
前述の組み合わせである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の三重特異性結合分子。
前記リンカー２は配列番号３４若しくは４７の配列を含むか；
前記リンカー３は配列番号４６、４７、４８、４９、５０、５１、１５２の配列、若しくはＧＣＧ若しくはＧＧＧを含むか；
前記リンカー４は配列番号５０若しくは１５２の配列を含むか；
前記Ｅコイルドメインは配列番号３９若しくは４１の配列を独立して含み、かつ前記Ｋコイルドメインは配列番号４０若しくは４２の配列を独立して含むか；
前記システイン含有ドメインは配列番号３４、３６、３８若しくは４８の配列を独立して含むか；又は
前述の組み合わせである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の三重特異性結合分子。
【請求項13】
前記リンカー２が配列番号４７の配列を含む場合に、配列番号４１の前記Ｅコイルドメイン若しくは配列番号４２の前記Ｋコイルドメインが前記リンカー２に隣接するか；
前記リンカー２が配列番号３４の配列を含む場合に、配列番号３９の前記Ｅコイルドメイン若しくは配列番号４０の前記Ｋコイルドメインが前記リンカー２に隣接するか；又は
前記リンカー２が配列番号３４の配列を含む場合に、配列番号４１の前記Ｅコイルドメイン若しくは配列番号４２の前記Ｋコイルドメインが前記リンカー２に隣接する、請求項１２に記載の三重特異性結合分子。
前記リンカー２が配列番号３４の配列を含む場合に、配列番号３９の前記Ｅコイルドメイン若しくは配列番号４０の前記Ｋコイルドメインが前記リンカー２に隣接するか；又は
前記リンカー２が配列番号３４の配列を含む場合に、配列番号４１の前記Ｅコイルドメイン若しくは配列番号４２の前記Ｋコイルドメインが前記リンカー２に隣接する、請求項１２に記載の三重特異性結合分子。
【請求項14】
前記ＣＨ１ドメインは配列番号２０７若しくは２０８の配列を含み、かつ前記ＣＬドメインは配列番号２１０若しくは２１１の配列を含む、請求項２又は５に記載の三重特異性結合分子。
【請求項15】
（Ａ）前記エピトープＩ、前記エピトープＩＩ及び前記エピトープＩＩＩはそれぞれ、前記第１の癌抗原のエピトープ、前記第２の癌抗原のエピトープ及び前記エフェクタ細胞抗原のエピトープであるか；
（Ｂ）前記エピトープＩ、前記エピトープＩＩ及び前記エピトープＩＩＩはそれぞれ、前記第１の癌抗原のエピトープ、前記エフェクタ細胞抗原のエピトープ及び前記第２の癌抗原のエピトープであるか；
（Ｃ）前記エピトープＩ、前記エピトープＩＩ及び前記エピトープＩＩＩはそれぞれ、前記第２の癌抗原のエピトープ、前記第１の癌抗原のエピトープ及び前記エフェクタ細胞抗原のエピトープであるか；
（Ｄ）前記エピトープＩ、前記エピトープＩＩ及び前記エピトープＩＩＩはそれぞれ、前記第２の癌抗原のエピトープ、前記エフェクタ細胞抗原のエピトープ及び前記第１の癌抗原のエピトープであるか；
（Ｅ）前記エピトープＩ、前記エピトープＩＩ及び前記エピトープＩＩＩはそれぞれ、前記エフェクタ細胞抗原のエピトープ、前記第１の癌抗原のエピトープ及び前記第２の癌抗原のエピトープであるか；又は
（Ｆ）前記エピトープＩ、前記エピトープＩＩ及び前記エピトープＩＩＩはそれぞれ、前記エフェクタ細胞抗原のエピトープ、前記第２の癌抗原のエピトープ及び前記第１の癌抗原のエピトープである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の三重特異性結合分子。
（Ｂ）前記エピトープＩ、前記エピトープＩＩ及び前記エピトープＩＩＩはそれぞれ、前記第１の癌抗原のエピトープ、前記エフェクタ細胞抗原のエピトープ及び前記第２の癌抗原のエピトープであるか；
（Ｃ）前記エピトープＩ、前記エピトープＩＩ及び前記エピトープＩＩＩはそれぞれ、前記第２の癌抗原のエピトープ、前記第１の癌抗原のエピトープ及び前記エフェクタ細胞抗原のエピトープであるか；
（Ｄ）前記エピトープＩ、前記エピトープＩＩ及び前記エピトープＩＩＩはそれぞれ、前記第２の癌抗原のエピトープ、前記エフェクタ細胞抗原のエピトープ及び前記第１の癌抗原のエピトープであるか；
（Ｅ）前記エピトープＩ、前記エピトープＩＩ及び前記エピトープＩＩＩはそれぞれ、前記エフェクタ細胞抗原のエピトープ、前記第１の癌抗原のエピトープ及び前記第２の癌抗原のエピトープであるか；又は
（Ｆ）前記エピトープＩ、前記エピトープＩＩ及び前記エピトープＩＩＩはそれぞれ、前記エフェクタ細胞抗原のエピトープ、前記第２の癌抗原のエピトープ及び前記第１の癌抗原のエピトープである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の三重特異性結合分子。
【請求項16】
前記エフェクタ細胞抗原は：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ６４、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、又はＮＫＧ２Ｄ受容体である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の三重特異性結合分子。
【請求項17】
（Ａ）エフェクタ細胞抗原の前記エピトープは、抗体Ｌｏ‐ＣＤ２ａによって認識されるＣＤ２エピトープであるか；
（Ｂ）エフェクタ細胞抗原の前記エピトープは、抗体ＯＫＴ３、Ｍ２９１、ＹＴＨ１２．５、抗ＣＤ３ ｍＡｂ １若しくは抗ＣＤ３ ｍＡｂ ２によって認識されるＣＤ３エピトープであるか；
（Ｃ）エフェクタ細胞抗原の前記エピトープは、抗体３Ｇ８若しくはＡ９によって認識されるＣＤ１６エピトープであるか；
（Ｄ）エフェクタ細胞抗原の前記エピトープは、抗体ＭＤ１３４２、ＭＥＤＩ‐５５１、ブリナツモマブ若しくはＨＤ３７によって認識されるＣＤ１９エピトープであるか；
（Ｅ）エフェクタ細胞抗原の前記エピトープは、抗体リツキシマブ、イブリツモマブ、オアツムマブ及びトシツモマブによって認識されるＣＤ２０エピトープであるか；
（Ｆ）エフェクタ細胞抗原の前記エピトープは、抗体エプラツズマブによって認識されるＣＤ２２エピトープであるか；
（Ｇ）エフェクタ細胞抗原の前記エピトープは、抗体ＣＤ３２Ｂ ｍＡｂ １によって認識されるＣＤ３２Ｂエピトープであるか；
（Ｈ）エフェクタ細胞抗原の前記エピトープは、抗体ＣＤ６４ ｍＡｂ １によって認識されるＣＤ６４エピトープであるか；
（Ｉ）エフェクタ細胞抗原の前記エピトープは、抗体ＣＤ７９ ｍＡｂ １によって認識されるＢＣＲ／ＣＤ７９エピトープであるか；
（Ｊ）エフェクタ細胞抗原の前記エピトープは、抗体ＢＭＡ０３１によって認識されるＴＣＲエピトープであるか；
（Ｋ）エフェクタ細胞抗原の前記エピトープは、抗体ＫＹＫ‐２．０によって認識されるＮＫＧ２Ｄ受容体エピトープであるか；又は
（Ｌ）前記エピトープＩ、前記エピトープＩＩ若しくは前記エピトープＩＩＩのうちの１つは、エフェクタ細胞抗原のエピトープであり、前記エピトープに免疫特異的に結合できる抗原結合ドメインは：
配列番号１０２及び１０３；配列番号１０４及び１０８；配列番号１０４及び１１２；配列番号１１４及び１１５；配列番号１１６及び１１７；配列番号１１８及び１１９；配列番号１２０及び１２１；配列番号１２２及び１２３；配列番号１２４及び１２５；配列番号１２６及び１２７；配列番号１２８及び１２９；配列番号１３０及び１３１；配列番号１３２及び１３３；配列番号１３４及び１３５；若しくは配列番号１３６及び１３７の６つのＣＤＲを含むか；又は
配列番号１０２の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１０３の重鎖可変ドメイン；配列番号１０４の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１０８の重鎖可変ドメイン；配列番号１０４の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１１２の重鎖可変ドメイン；配列番号１１４の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１１５の重鎖可変ドメイン；配列番号１１６の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１１７の重鎖可変ドメイン；配列番号１１８の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１１９の重鎖可変ドメイン；配列番号１２０の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１２１の重鎖可変ドメイン；配列番号１２２の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１２３の重鎖可変ドメイン；配列番号１２４の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１２５の重鎖可変ドメイン；配列番号１２６の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１２７の重鎖可変ドメイン；配列番号１２８の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１２９の重鎖可変ドメイン；配列番号１３０の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１３１の重鎖可変ドメイン；配列番号１３２の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１３３の重鎖可変ドメイン；配列番号１３４の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１３５の重鎖可変ドメイン；若しくは配列番号１３６の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１３７の重鎖可変ドメインを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の三重特異性結合分子。
（Ｂ）エフェクタ細胞抗原の前記エピトープは、抗体ＯＫＴ３、Ｍ２９１、ＹＴＨ１２．５、抗ＣＤ３ ｍＡｂ １若しくは抗ＣＤ３ ｍＡｂ ２によって認識されるＣＤ３エピトープであるか；
（Ｃ）エフェクタ細胞抗原の前記エピトープは、抗体３Ｇ８若しくはＡ９によって認識されるＣＤ１６エピトープであるか；
（Ｄ）エフェクタ細胞抗原の前記エピトープは、抗体ＭＤ１３４２、ＭＥＤＩ‐５５１、ブリナツモマブ若しくはＨＤ３７によって認識されるＣＤ１９エピトープであるか；
（Ｅ）エフェクタ細胞抗原の前記エピトープは、抗体リツキシマブ、イブリツモマブ、オアツムマブ及びトシツモマブによって認識されるＣＤ２０エピトープであるか；
（Ｆ）エフェクタ細胞抗原の前記エピトープは、抗体エプラツズマブによって認識されるＣＤ２２エピトープであるか；
（Ｇ）エフェクタ細胞抗原の前記エピトープは、抗体ＣＤ３２Ｂ ｍＡｂ １によって認識されるＣＤ３２Ｂエピトープであるか；
（Ｈ）エフェクタ細胞抗原の前記エピトープは、抗体ＣＤ６４ ｍＡｂ １によって認識されるＣＤ６４エピトープであるか；
（Ｉ）エフェクタ細胞抗原の前記エピトープは、抗体ＣＤ７９ ｍＡｂ １によって認識されるＢＣＲ／ＣＤ７９エピトープであるか；
（Ｊ）エフェクタ細胞抗原の前記エピトープは、抗体ＢＭＡ０３１によって認識されるＴＣＲエピトープであるか；
（Ｋ）エフェクタ細胞抗原の前記エピトープは、抗体ＫＹＫ‐２．０によって認識されるＮＫＧ２Ｄ受容体エピトープであるか；又は
（Ｌ）前記エピトープＩ、前記エピトープＩＩ若しくは前記エピトープＩＩＩのうちの１つは、エフェクタ細胞抗原のエピトープであり、前記エピトープに免疫特異的に結合できる抗原結合ドメインは：
配列番号１０２及び１０３；配列番号１０４及び１０８；配列番号１０４及び１１２；配列番号１１４及び１１５；配列番号１１６及び１１７；配列番号１１８及び１１９；配列番号１２０及び１２１；配列番号１２２及び１２３；配列番号１２４及び１２５；配列番号１２６及び１２７；配列番号１２８及び１２９；配列番号１３０及び１３１；配列番号１３２及び１３３；配列番号１３４及び１３５；若しくは配列番号１３６及び１３７の６つのＣＤＲを含むか；又は
配列番号１０２の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１０３の重鎖可変ドメイン；配列番号１０４の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１０８の重鎖可変ドメイン；配列番号１０４の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１１２の重鎖可変ドメイン；配列番号１１４の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１１５の重鎖可変ドメイン；配列番号１１６の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１１７の重鎖可変ドメイン；配列番号１１８の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１１９の重鎖可変ドメイン；配列番号１２０の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１２１の重鎖可変ドメイン；配列番号１２２の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１２３の重鎖可変ドメイン；配列番号１２４の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１２５の重鎖可変ドメイン；配列番号１２６の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１２７の重鎖可変ドメイン；配列番号１２８の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１２９の重鎖可変ドメイン；配列番号１３０の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１３１の重鎖可変ドメイン；配列番号１３２の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１３３の重鎖可変ドメイン；配列番号１３４の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１３５の重鎖可変ドメイン；若しくは配列番号１３６の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１３７の重鎖可変ドメインを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の三重特異性結合分子。
【請求項18】
前記第１の癌抗原及び第２の癌抗原は：結腸癌抗原１９．９；胃癌ムチン；抗原４．２；糖タンパク質Ａ３３（ｇｐＡ３３）；ＡＤＡＭ‐９；胃癌抗原ＡＨ６；ＡＬＣＡＭ；悪性ヒトリンパ球抗原ＡＰＯ‐１；癌抗原Ｂ１；Ｂ７‐Ｈ３；β‐カテニン；血液型ＡＬｅb／Ｌｅy；バーキットリンパ腫抗原‐３８．１３；結腸腺癌抗原Ｃ１４；卵巣癌抗原ＣＡ１２５；カルボキシペプチダーゼＭ；ＣＤ５；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２２；ＣＤ２３；ＣＤ２５；ＣＤ２７；ＣＤ２８；ＣＤ３０；ＣＤ３３；ＣＤ３６；ＣＤ４５；ＣＤ４６；ＣＤ５２；ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ；ＣＤ１０３；ＣＤ３１７；ＣＤＫ４；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；ＣＥＡＣＡＭ５；ＣＥＡＣＡＭ６；ＣＯ１７‐１Ａ；ＣＯ‐４３（血液型Ｌｅb）；ＣＯ-５１４（血液型Ｌｅa）；ＣＴＡ‐１；ＣＴＬＡ４；サイトケラチン８；抗原Ｄ１．１；抗原Ｄ1５６‐２２；ＤＲ５；Ｅ1シリーズ（血液型Ｂ）；ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）；エフリン受容体Ａ２（ＥｐｈＡ２）；ＥｒｂＢ１；ＥｒｂＢ３；ＥｒｂＢ４；ＧＡＧＥ‐１；ＧＡＧＥ‐２；ＧＤ２／ＧＤ３／ＧＭ２；肺腺癌抗原Ｆ３；抗原ＦＣ１０．２；Ｇ４９；ガングリオシドＧＤ２；ガングリオシドＧＤ３；ガングリオシドＧＭ２；ガングリオシドＧＭ３；ＧD2；ＧD3；ＧＩＣＡ１９‐９；ＧM2；ｇｐ１００；ヒト白血病Ｔ細胞抗原Ｇｐ３７；メラノーマ抗原ｇｐ７５；ｇｐＡ３３；ＨＥＲ２抗原（ｐ１８５HER2）；ヒト乳脂肪小球抗原（ＨＭＦＧ）；ヒトパピローマウイルス‐Ｅ６／ヒトパピローマウイルス‐Ｅ７；高分子量メラノーマ抗原（ＨＭＷ‐ＭＡＡ）；Ｉ抗原（分化抗原）Ｉ（Ｍａ）；インテグリンアルファ‐Ｖ‐ベータ‐６インテグリンβ６（ＩＴＧＢ６）；インターロイキン‐１３；受容体α２（ＩＬ１３Ｒα２）；ＪＡＭ‐３；ＫＩＤ３；ＫＩＤ３１；ＫＳ１／４汎癌腫抗原；ヒト肺癌抗原Ｌ６及びＬ２０；ＬＥＡ；ＬＵＣＡ‐２；Ｍ１：２２：２５：８；Ｍ１８；Ｍ３９；ＭＡＧＥ‐１；ＭＡＧＥ‐３；ＭＡＲＴ；ＭＵＣ‐１；ＭＵＭ‐１；Ｍｙｌ；Ｎ‐アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ；ネオ糖タンパク質；ＮＳ‐１０；ＯＦＡ‐１；ＯＦＡ‐２；オンコスタチンＭ；ｐ１５；メラノーマ関連抗原ｐ９７；多型性上皮ムチン（ＰＥＭ）；多型性上皮ムチン抗原（ＰＥＭＡ）；ＰＩＰＡ；前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；前立腺酸性リン酸塩；Ｒ24；ＲＯＲ１；スフィンゴ脂質；ＳＳＥＡ‐１；ＳＳＥＡ‐３；ＳＳＥＡ‐４；ｓＴｎ；Ｔ細胞受容体誘導ペプチド；Ｔ5Ａ7；ＴＡＧ‐７２；ＴＬ５（血液型Ａ）；ＴＮＦ‐α受容体；ＴＮＦ‐β受容体；ＴＮＦ‐γ受容体；ＴＲＡ‐１‐８５（血液型Ｈ）；トランスフェリン受容体；腫瘍特異的移植抗原（ＴＳＴＡ）；癌胎児性抗原‐アルファ‐フェトプロテイン（ＡＦＰ）；ＶＥＧＦ；ＶＥＧＦＲ、ＶＥＰ８；ＶＥＰ９；ＶＩＭ‐Ｄ５；並びにＹヘプタン、Ｌｅyから独立して選択される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の三重特異性結合分子。
【請求項19】
前記エピトープＩ、前記エピトープＩＩ又は前記エピトープＩＩＩのうちの１つは癌抗原のエピトープであり、前記エピトープに免疫特異的に結合できる前記抗原結合ドメインは：
配列番号３及び８；配列番号１３及び１８；配列番号２３及び３１；配列番号２５及び３１；配列番号２７及び３１；配列番号２９及び３１；配列番号５４及び５８；配列番号６２及び６６；配列番号７０及び７４；配列番号７８及び８２；配列番号８６及び９０；配列番号９４及び９８；配列番号１５３及び１５８；配列番号１６３及び１６７；配列番号１７２及び１７７；配列番号１８１及び１８６；配列番号１９１及び１９２；配列番号１９３及び１９４；配列番号１９５及び１９６；配列番号１９７及び１９８；配列番号１９９及び２００；配列番号２０１及び２０２；配列番号２０３及び２０４；配列番号２０５及び２０６；配列番号３０２及び３０３；配列番号３０４及び３０５；配列番号３０６及び３０７；配列番号３０８及び３０９；配列番号３１０及び３１１；配列番号３１２及び３１３；配列番号３１４及び３１５；若しくは配列番号３２１及び３２２の６つのＣＤＲを含むか；又は
配列番号３の軽鎖可変ドメイン及び配列番号８の重鎖可変ドメイン；配列番号１３の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１８の重鎖可変ドメイン；配列番号２３の軽鎖可変ドメイン及び配列番号３１の重鎖可変ドメイン；配列番号２５の軽鎖可変ドメイン及び配列番号３１の重鎖可変ドメイン；配列番号２７の軽鎖可変ドメイン及び配列番号３１の重鎖可変ドメイン；配列番号２９の軽鎖可変ドメイン及び配列番号３１の重鎖可変ドメイン；配列番号５４の軽鎖可変ドメイン及び配列番号５８の重鎖可変ドメイン；配列番号６２の軽鎖可変ドメイン及び配列番号６６の重鎖可変ドメイン；配列番号７０の軽鎖可変ドメイン及び配列番号７４の重鎖可変ドメイン；配列番号７８の軽鎖可変ドメイン及び配列番号８２の重鎖可変ドメイン；配列番号８６の軽鎖可変ドメイン及び配列番号９０の重鎖可変ドメイン；配列番号９４の軽鎖可変ドメイン及び配列番号９８の重鎖可変ドメイン；配列番号１５３の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１５８の重鎖可変ドメイン；配列番号１６３の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１６７の重鎖可変ドメイン；配列番号１７２の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１７７の重鎖可変ドメイン；配列番号１８１の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１８６の重鎖可変ドメイン；配列番号１９１の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１９２の重鎖可変ドメイン；配列番号１９３の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１９４の重鎖可変ドメイン；配列番号１９５の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１９６の重鎖可変ドメイン；配列番号１９７の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１９８の重鎖可変ドメイン；配列番号１９９の軽鎖可変ドメイン及び配列番号２００の重鎖可変ドメイン；配列番号２０１の軽鎖可変ドメイン及び配列番号２０２の重鎖可変ドメイン；配列番号２０３の軽鎖可変ドメイン及び配列番号２０４の重鎖可変ドメイン；配列番号２０５の軽鎖可変ドメイン及び配列番号２０６の重鎖可変ドメイン；配列番号３０２の軽鎖可変ドメイン及び配列番号３０３の重鎖可変ドメイン；配列番号３０４の軽鎖可変ドメイン及び配列番号３０５の重鎖可変ドメイン；配列番号３０６の軽鎖可変ドメイン及び配列番号３０７の重鎖可変ドメイン；配列番号３０８の軽鎖可変ドメイン及び配列番号３０９の重鎖可変ドメイン；配列番号３１０の軽鎖可変ドメイン及び配列番号３１１の重鎖可変ドメイン；配列番号３１２の軽鎖可変ドメイン及び配列番号３１３の重鎖可変ドメイン；配列番号３１４の軽鎖可変ドメイン及び配列番号３１５の重鎖可変ドメイン；若しくは配列番号３２１の軽鎖可変ドメイン及び配列番号３２２の重鎖可変ドメインを含む、請求項１８に記載の三重特異性結合分子。
配列番号３及び８；配列番号１３及び１８；配列番号２３及び３１；配列番号２５及び３１；配列番号２７及び３１；配列番号２９及び３１；配列番号５４及び５８；配列番号６２及び６６；配列番号７０及び７４；配列番号７８及び８２；配列番号８６及び９０；配列番号９４及び９８；配列番号１５３及び１５８；配列番号１６３及び１６７；配列番号１７２及び１７７；配列番号１８１及び１８６；配列番号１９１及び１９２；配列番号１９３及び１９４；配列番号１９５及び１９６；配列番号１９７及び１９８；配列番号１９９及び２００；配列番号２０１及び２０２；配列番号２０３及び２０４；配列番号２０５及び２０６；配列番号３０２及び３０３；配列番号３０４及び３０５；配列番号３０６及び３０７；配列番号３０８及び３０９；配列番号３１０及び３１１；配列番号３１２及び３１３；配列番号３１４及び３１５；若しくは配列番号３２１及び３２２の６つのＣＤＲを含むか；又は
配列番号３の軽鎖可変ドメイン及び配列番号８の重鎖可変ドメイン；配列番号１３の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１８の重鎖可変ドメイン；配列番号２３の軽鎖可変ドメイン及び配列番号３１の重鎖可変ドメイン；配列番号２５の軽鎖可変ドメイン及び配列番号３１の重鎖可変ドメイン；配列番号２７の軽鎖可変ドメイン及び配列番号３１の重鎖可変ドメイン；配列番号２９の軽鎖可変ドメイン及び配列番号３１の重鎖可変ドメイン；配列番号５４の軽鎖可変ドメイン及び配列番号５８の重鎖可変ドメイン；配列番号６２の軽鎖可変ドメイン及び配列番号６６の重鎖可変ドメイン；配列番号７０の軽鎖可変ドメイン及び配列番号７４の重鎖可変ドメイン；配列番号７８の軽鎖可変ドメイン及び配列番号８２の重鎖可変ドメイン；配列番号８６の軽鎖可変ドメイン及び配列番号９０の重鎖可変ドメイン；配列番号９４の軽鎖可変ドメイン及び配列番号９８の重鎖可変ドメイン；配列番号１５３の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１５８の重鎖可変ドメイン；配列番号１６３の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１６７の重鎖可変ドメイン；配列番号１７２の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１７７の重鎖可変ドメイン；配列番号１８１の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１８６の重鎖可変ドメイン；配列番号１９１の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１９２の重鎖可変ドメイン；配列番号１９３の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１９４の重鎖可変ドメイン；配列番号１９５の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１９６の重鎖可変ドメイン；配列番号１９７の軽鎖可変ドメイン及び配列番号１９８の重鎖可変ドメイン；配列番号１９９の軽鎖可変ドメイン及び配列番号２００の重鎖可変ドメイン；配列番号２０１の軽鎖可変ドメイン及び配列番号２０２の重鎖可変ドメイン；配列番号２０３の軽鎖可変ドメイン及び配列番号２０４の重鎖可変ドメイン；配列番号２０５の軽鎖可変ドメイン及び配列番号２０６の重鎖可変ドメイン；配列番号３０２の軽鎖可変ドメイン及び配列番号３０３の重鎖可変ドメイン；配列番号３０４の軽鎖可変ドメイン及び配列番号３０５の重鎖可変ドメイン；配列番号３０６の軽鎖可変ドメイン及び配列番号３０７の重鎖可変ドメイン；配列番号３０８の軽鎖可変ドメイン及び配列番号３０９の重鎖可変ドメイン；配列番号３１０の軽鎖可変ドメイン及び配列番号３１１の重鎖可変ドメイン；配列番号３１２の軽鎖可変ドメイン及び配列番号３１３の重鎖可変ドメイン；配列番号３１４の軽鎖可変ドメイン及び配列番号３１５の重鎖可変ドメイン；若しくは配列番号３２１の軽鎖可変ドメイン及び配列番号３２２の重鎖可変ドメインを含む、請求項１８に記載の三重特異性結合分子。
【請求項20】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の三重特異性結合分子のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチドを含む、核酸組成物。
【請求項21】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の三重特異性結合分子と、薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤又は希釈剤とを含む、医薬組成物。
【請求項22】
薬剤として使用するための、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の三重特異性結合分子、又は請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項23】
癌の治療に使用するための、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の三重特異性結合分子、又は請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項24】
前記癌は、以下の細胞：副腎腫瘍；ＡＩＤＳ関連癌；胞巣状軟部肉腫；星状細胞腫瘍；膀胱癌；骨癌；脳及び脊髄の癌；転移性脳腫瘍；乳癌；頸動脈球腫瘍；子宮頸癌；軟骨肉腫；脊索腫；嫌色素性腎細胞癌；明細胞癌；大腸癌；結腸直腸癌；皮膚の良性線維性組織球腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；ユーイング腫瘍；骨外性粘液型軟骨肉腫；骨性線維形成不全症；線維性骨異形成；胆嚢又は胆管癌；消化器癌；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；肝細胞癌；膵島細胞腫瘍；カポジ肉腫；腎癌；白血病；脂肪腫／良性脂肪腫；脂肪肉腫／悪性脂肪腫；肝癌；リンパ腫；肺癌；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；神経内分泌腫瘍；卵巣癌；膵臓癌；甲状腺乳頭癌；副甲状腺腫瘍；小児癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；前立腺癌；後部ブドウ膜黒色腫；希少な血液学的障害；腎転移性癌；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肉腫；皮膚癌；軟組織肉腫；扁平上皮癌；胃癌；滑膜肉腫；精巣癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺転移癌；又は子宮癌の癌細胞の存在を特徴とする、請求項２３に記載の三重特異性結合分子又は医薬組成物。
【請求項25】
前記癌は：結腸直腸癌；肝細胞癌；神経膠腫；腎癌；乳癌；多発性骨髄腫；膀胱癌；神経芽細胞腫；肉腫；非ホジキンリンパ腫；非小細胞肺癌；卵巣癌；膵臓癌；直腸癌；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；急性Ｂリンパ芽球性白血病（Ｂ‐ＡＬＬ）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；有毛細胞白血病（ＨＣＬ）；芽形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）；非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；マントル細胞白血病（ＭＣＬ）；小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）；ホジキンリンパ腫；全身性肥満細胞症；又はバーキットリンパ腫である、請求項２３又は２４に記載の三重特異性結合分子又は医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【0001】
本出願は、米国特許出願第６２／１０７，８２４号（２０１５年１月２６日出願）米国特許出願第６２／００８，２２９号（２０１４年６月５日出願；係属）、及び米国特許出願第６２／００４，５７１号（２０１４年５月２９日出願；係属）に対する優先権を主張するものであり、上述の特許出願はそれぞれ、参照によりその全体が本出願に援用される。
【0002】
配列表の参照本出願は、連邦規則法典第３７巻第１．８２１節以下による１つ又は複数の配列表を含み、これらの配列表は、コンピュータ可読媒体（ファイル名：１３０１＿０１１９ＰＣＴ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、２０１５年５月１８日作成、サイズ：４１６，４０８バイト）において開示されており、上記ファイルは、参照によりその全体が本出願に援用される。
【技術分野】
【0003】
本発明は、３つの結合ドメインを有し、従って３つのエピトープへの協調的結合を仲介できる多重鎖ポリペプチド分子である、三重特異性結合分子に関する。上記三重特異性結合分子は好ましくは、上記三重特異性結合分子を：（１）第１の癌抗原のエピトープ、（２）第２の癌抗原のエピトープ、及び（３）免疫系エフェクタ細胞の表面上で発現する分子のエピトープに免疫特異的に結合できるようにし、これによって、癌抗原を発現する細胞に対して免疫系エフェクタ細胞を局在化でき、これにより、上記癌細胞の殺滅を促進する、結合ドメインを有することを特徴とする。
【背景技術】
【0004】
Ｉ．哺乳類免疫系哺乳類免疫系は、例えば創傷、感染及び新生物を含む多様な状態に対する防御として機能する。ヒト及び他の哺乳類が病原体、外来物質及び癌抗原に対する免疫応答を発現する効率は、２つの特徴：抗原認識に対する免疫応答の優れた特異性、及び同一の抗原による再活性化に対するより迅速かつより活発な応答を可能とする免疫記憶に基づくものである（非特許文献１、２）。
【0005】
哺乳類免疫系は、２つの別個の、ただし相互に関連した系：細胞免疫系及び体液免疫系によって仲介される。一般に、体液系は、上記系が身体にとって外来物であると認識する産物と化合してこれを中和する能力を有する、可溶性産物（抗体又は免疫グロブリン）によって仲介される。対照的に、細胞免疫系は、多様な治療的役割を果たす「Ｔ細胞」と呼ばれる特定の細胞の可動化を伴う。Ｔ細胞は、胸腺に由来し、組織、リンパ系及び循環器系の間を循環するリンパ球である。外来構造（抗原）の存在及び認識に応答して、Ｔ細胞は「活性化され（ａｃｔｉｖａｔｅｄ）」た状態となり、免疫応答を開始する。多くの例では、これらの外来抗原は、新生物又は感染の結果として宿主細胞上に発現する。Ｔ細胞自体は抗体を分泌しないが、Ｔ細胞は通常、第２の分類のリンパ球であるＢ細胞（これは骨髄に由来する）による抗体分泌のために必要である。重要なことに、Ｔ細胞は、卓越した免疫学的特異性を示すことによって、抗原を互いに識別できる。２つのタイプのＴ細胞、「Ｔヘルパー細胞」及び「細胞毒性Ｔ細胞」が特に関係する。
【0006】
Ｔヘルパー細胞は、糖タンパク質ＣＤ４の発現を特徴とする（即ちＴヘルパー細胞は「ＣＤ４+」である）。ＣＤ４+Ｔ細胞は、殆どの哺乳類免疫及び自己免疫応答の必須のオーガナイザである（非特許文献３）。ＣＤ４+Ｔ細胞の活性化は、抗原：抗原提示細胞（例えばＢ細胞、マクロファージ又は樹状細胞）の表面上に配列された主要な組織適合性クラスＩＩ（ＭＨＣ ＩＩ）分子複合体と、ナイーブＣＤ４+Ｔ細胞の表面上に配列された２つの分子の複合体、即ちＴ細胞受容体（「ＴＣＲ」）及びＣＤ３細胞表面受容体リガンドとの間の共刺激性相互作用によって仲介されることが分かっている。活性化されたＴヘルパー細胞は、標的細胞への炎症応答を仲介できるＴｈ１細胞を増殖させることができる。
【0007】
細胞毒性Ｔ細胞は、ＣＤ８の発現を特徴とする（即ち細胞毒性Ｔ細胞は、ＣＤ３+と同様に「ＣＤ８＋」である）。ＣＤ８+Ｔ細胞の活性化は、抗原：標的細胞の表面上に配列された主要な組織適合性クラスＩ（ＭＨＣ Ｉ）分子複合体と、ＣＤ８+Ｔ細胞の表面上に配列されたＣＤ８及びＴ細胞受容体の複合体との間の共刺激性相互作用によって仲介されることが分かっている。特定の免疫系のみによって発現するＭＨＣ ＩＩ分子とは異なり、ＭＨＣ Ｉ分子は極めて広範に発現する。従って細胞毒性Ｔ細胞は、広範な細胞タイプに結合できる。活性化された細胞毒性Ｔ細胞は、細胞毒であるパーフォリン、グランザイム、及びグラニュライシンの放出によって、細胞殺滅を仲介する。パーフォリンの作用により、グランザイムは標的細胞の細胞質に入り、グランザイムのセリンプロテアーゼ機能によって、最終的に標的細胞のアポトーシス（プログラムされた細胞死）につながる一連のシステインであるカスパーゼカスケードをトリガする。
【0008】
Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」）は、共有結合したα及びβ鎖のヘテロ二量体（「ＴＣＲαβ」）である。これらの鎖は、長さがアミノ酸２５９個（α）及び２９６個（β）のクラスＩ膜ポリペプチドである。ＣＤ３分子は、５つの別個のポリペプチド鎖（ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２つのＣＤ３ε鎖及び２つのゼータ鎖）からなるＴ細胞共受容体である。個々のポリペプチド鎖は連結して、３つの二量体の複合体（εγ、εδ、ζζ）を形成する（非特許文献４、５、６、７、８）。ＣＤ３複合体はＴＣＲと連結して、Ｔリンパ球中で活性化信号を生成する。ＣＤ３の不在下では、ＴＣＲは適切に集合せず、分解してしまう（非特許文献９）。ＣＤ３は、全ての成熟したＴ細胞に結合した状態で見られ、他の細胞タイプには実質的に見られない（非特許文献１０、１１、１２参照）。
【0009】
（Ｔ細胞受容体Ｔ３ゼータ鎖又はＣＤ２４７としても知られる）ＣＤ３ζ鎖を伴うＴＣＲとＣＤ３との複合体は、ＴＣＲ複合体を含む（非特許文献１３、４）。上記複合体は、多数（１０個）の免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有するため、特に重要である。
【0010】
Ｔ細胞活性化には２つの相互作用が必要である（非特許文献１４、１５）。第１の相互作用では、細胞は、これがナイーブＴリンパ球のＴ細胞受容体（「ＴＣＲ」）に結合できるように、上記細胞の主要な組織適合性複合体に結合した関連する標的抗原を示さなければならない。第２の相互作用では、上記細胞のリガンドは、Ｔリンパ球の共受容体に結合しなければならない（非特許文献３、１６）。これら両方の刺激性信号を受けたＴ細胞は次にサイトカイン（インターロイキン‐２、インターロイキン‐１２等）に応答する。ＴＣＲの会合中にこれら両方の共刺激性信号が存在しない場合、Ｔ細胞は機能的非応答状態となり、これはクローン麻痺と呼ばれる（非特許文献１７）。病理的状態では、Ｔ細胞は、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、多発性硬化症といった様々な器官特異性自己免疫疾患において主要な役割を果たす（非特許文献３）。
【0011】
Ｔ細胞が適応免疫応答を達成するようにＴ細胞を活性化するために、２つの信号が必要であることにより、系内のＴ細胞が認識可能な場所にある抗原提示細胞上に存在し得る自己抗原に対する応答を回避するための機構が提供されると考えられる。Ｔ細胞とある細胞の接触が、２つの必要な信号のうちの一方の生成しかもたらさない場合、Ｔ細胞は活性化されず、適応免疫応答は発生しない。
【0012】
ＩＩ．抗体及び他のエピトープ結合分子Ａ．抗体
「抗体」は、当該免疫グロブリン分子の可変ドメインに位置する少なくとも１つの抗原認識部位によって、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等の標的に特異的に結合できる、免疫グロブリン分子である。本明細書において使用される場合、この用語は、完全なポリクローナル又はモノクローナル抗体、ラクダ化抗体、一本鎖抗体、並びに（例えば本発明の抗体に対する抗Ｉｄ及び抗抗Ｉｄ抗体を含む）抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体だけでなく、その突然変異体、自然に発生する変異体、必要な特異性の抗原認識部位を有する抗体部分を備える融合タンパク質、ヒト化抗体及びキメラ抗体、並びに必要な特異性の抗原認識部位を備える免疫グロブリン分子の他のいずれの修飾構成を包含する。本出願全体を通して、抗体の軽鎖及び重鎖のアミノ酸残基の番号付与は、非特許文献１８中のもののようなＥＵインデックスに従ったものである。本明細書において使用される場合、「抗体の抗原結合性断片」は、少なくとも１つの抗原認識部位を有する抗体の一部分である。本明細書において使用される場合、この用語は、断片（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2Ｆｖ）、ジスルフィド結合二重特異性Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、細胞内抗体、及び単鎖分子（例えばｓｃＦｖ）を包含する。特に抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性の断片、即ち抗原結合部位を含有する分子を含む。免疫グロブリン分子は、いずれのタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスのものとすることができる。
【0013】
天然抗体（ＩｇＧ抗体等）は、２つの重鎖と複合体化した２つの軽鎖からなる。各軽鎖は、可変ドメイン（ＶＬ）及び定常ドメイン（ＣＬ）を含有する。各重鎖は、可変ドメイン（ＶＨ）、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）、並びにＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に位置するヒンジドメインを含有する。従って、自然に発生する免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）の基本構造単位は、通常は約１５０，０００Ｄａの糖タンパク質として発現される、軽鎖及び２つの重鎖を有する三量体である。各鎖のアミノ末端（「Ｎ」）部分は、抗原認識に主要な役割を果たす約１００〜１１０個の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端（「Ｃ」）部分は定常領域を画定し、軽鎖は単一の定常ドメインを有し、重鎖は通常３つの定常ドメイン及び１つのヒンジ領域を有する。従って、ＩｇＧ分子の軽鎖の構造はｎ‐ＶＬ‐ＣＬ‐ｃであり、ＩｇＧ重鎖の構造はｎ‐ＶＨ‐ＣＨ１‐Ｈ‐ＣＨ２‐ＣＨ３‐ｃである（ここでＨはヒンジ領域であり、ｎ及びｃはそれぞれ、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端を表す）。
【0014】
完全な未修飾抗体（例えばＩｇＧ抗体）の、抗原のエピトープに結合する能力は、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖上の可変ドメイン（即ちそれぞれＶＬドメイン及びＶＨドメイン）の存在に左右される。抗体軽鎖と抗体重鎖との相互作用、特にそのＶＬドメインとＶＨドメインとの相互作用は、抗体のエピトープ結合部位のうちの１つを形成する。ＩｇＧ分子の可変領域は、エピトープと接触した残基を含有する複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）、及びフレームワークセグメント（ＦＲ）と呼ばれる非ＣＤＲセグメントからなり、上記フレームワークセグメントは、一般にＣＤＲループの構造を維持してＣＤＲの位置を決定することにより、このような接触を可能とする（ただし特定のフレームワーク残基も抗原に接触し得る）。従って、ＶＬ及びＶＨドメインは、構造ｎ‐ＦＲ１‐ＣＤＲ１‐ＦＲ２‐ＣＤＲ２‐ＦＲ３‐ＣＤＲ３‐ＦＲ４‐ｃを有する。抗体軽鎖の第１、第２及び第３のＣＤＲである（又は第１、第２及び第３のＣＤＲとして機能し得る）ポリペプチドは、本明細書ではそれぞれＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン、及びＣＤＲL３ドメインと呼ばれる。同様に、抗体重鎖の第１、第２及び第３のＣＤＲである（又は第１、第２及び第３のＣＤＲとして機能し得る）ポリペプチドは、本明細書ではそれぞれＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン、及びＣＤＲH３ドメインと呼ばれる。よって、ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン、ＣＤＲL３ドメイン、ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン、及びＣＤＲH３ドメインという用語は、あるタンパク質に組み込まれた場合に、当該タンパク質が、軽鎖及び重鎖若しくはダイアボディ若しくは単鎖結合分子（例えばｓｃＦｖ、ＢｉＴｅ等）を有する抗体であるか、又は別のタイプのタンパク質であるかにかかわらず、当該タンパク質を、特定のエピトープに結合できるようにする、ポリペプチドを対象としている。このような抗体とは対照的に、ｓｃＦｖ構造は、単一ポリペプチド鎖が含有する抗体のＶＬ及びＶＨドメインを備え、これらのドメインは、２つのドメインの機能性エピトープ結合部位への自己集合を可能とするのに十分な長さのフレキシブルリンカーによって隔てられる。ＶＬ及びＶＨドメインの自己集合が、不十分な長さ（約１２個未満のアミノ酸残基）のリンカーによって不可能となる場合、ｓｃＦｖ構造のうちの２つが互いに相互作用して、２価分子を形成でき、この２価分子において一方の鎖のＶＬが他方の鎖のＶＨと連結する（非特許文献１９において概説されている）。
【0015】
抗体は、診断学におけるその公知の使用法に加えて、治療剤として有用であることが示されている。この数十年、抗体の治療的潜在能力に対する関心が再び高まっており、抗体は、生命工学由来の薬剤の筆頭となるクラスの１つとなっている（非特許文献２０）。２００近くの抗体系薬剤が使用認可済み、又は開発中である。
【0016】
用語「モノクローナル抗体」は均質な抗体の集団を指し、上記モノクローナル抗体は、抗原の選択的結合に関わる（自然に発生する又は自然に発生しない）アミノ酸から構成される。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一のエピトープ（又は抗原部位）に対して指向性を有する。用語「モノクローナル抗体」は、完全なモノクローナル抗体及び完全長モノクローナル抗体だけでなく、これらの断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）2、Ｆｖ等）、単鎖（ｓｃＦｖ）、その突然変異体、抗体部分を備える融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、及び必要な特異性及び抗原への結合能力を有する抗原認識部位を備える免疫グロブリン分子の他のいずれの修飾構成を包含する。抗原の源又は抗原を作製する方法（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組み換え発現、遺伝子導入動物等による）に関して、限定は意図されていない。この用語は、免疫グロブリン全体、及び「抗体」の定義において上述した断片等を含む。モノクローナル抗体の作製方法は当該技術分野において公知である。採用してよい１つの方法は、非特許文献２１の方法又はその修正例である。典型的には、モノクローナル抗体はマウス、ラット又はウサギにおいて発現する。上記抗体は、動物を、所望のエピトープを含有する免疫原性量の細胞、細胞抽出物又はタンパク製剤で免疫化することによって産生される。免疫原は、一次細胞、培養された細胞株、癌細胞、タンパク質、ペプチド、核酸又は組織とすることができるが、これらに限定されない。免疫化に使用してよい細胞は、これらを免疫原として使用するよりもある期間（例えば少なくとも２４時間）だけ前に、培養してよい。細胞は単独で、又はＲｉｂｉ等の非変性アジュバントと組み合わせて、免疫原として使用してよい（非特許文献２２参照）。
【0017】
一般に細胞は、免疫原として使用される際、完全な状態、及び好ましくは生存できる状態に維持しなければならない。完全な細胞は、破裂した細胞よりも、免疫性を与えられた動物が抗原をより良好に検出できるようにすることができる。変性又は強いアジュバント、例えばフロイントアジュバントの使用は、細胞を破裂させる場合があり、従って推奨されない。免疫原は、２週間に１回若しくは１週間に１回等、周期的な間隔で複数回投与してよく、又は動物中（例えば組織組み換え中）に生存能力を維持できるように投与してよい。あるいは、所望の病原性エピトープに対する免疫特異性を有する既存のモノクローナル抗体及び他の同等の抗体は、当該技術分野で公知のいずれの手段によって、組み換え配列及び産生できる。一実施形態では、このような抗体を配列し、続いてポリヌクレオチド配列を発現又は繁殖のためのベクターにクローン化する。関心対象の抗体をエンコードする配列は、宿主細胞中のベクター中に保持され、続いて上記宿主細胞を、将来使用するために膨張させて冷凍できる。このような抗体のポリヌクレオチド配列は、キメラ抗体、ヒト化抗体若しくはイヌ化抗体を生成するため、又は抗体の親和性若しくは他の特徴を改善するための、遺伝子操作のために使用してよい。用語「ヒト化」抗体は、キメラ分子であって、一般に組み換え技術を用いて調製され、非ヒト種からの免疫グロブリンに由来する抗原結合部位と、残りの、ヒト免疫グロブリンの構造及び／又は配列に基づく分子の免疫グロブリン構造とを有する、キメラ分子を指す。このような抗体の可変ドメインのポリヌクレオチド配列は、上記誘導体を生成するため及び上記抗体の親和性又は他の特徴を改善するための遺伝子操作のために使用できる。抗体をヒト化する際の一般原理は、抗体の抗原結合部分の塩基配列を保持しながら、抗体の非ヒト残部をヒト抗体配列と交換するステップを伴う。モノクローナル抗体をヒト化するためには、４つの一般的なステップが存在する。上記ステップは以下の通りである：（１）開始抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインのヌクレオチド及び予測されるアミノ酸配列を決定するステップ；（２）ヒト化抗体又はイヌ化抗体を設計するステップ、即ちヒト化又はイヌ化プロセス中に使用する抗体フレームワーク領域を決定するステップ；（３）実際のヒト化又はイヌ化法／技術；並びに（４）ヒト化抗体のトランスフェクション及び発現。例えば特許文献１、２、３、４を参照。
【0018】
このような抗体のエピトープ結合ドメインは、定常ドメインに融合した完全な可変ドメイン、又は可変ドメイン内の適切なフレームワーク領域上に移植された相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを備えてよい。抗原結合部位は野生型であってよく、又は１つ若しくは複数のアミノ酸置換によって修飾されてよい。これにより、ヒト個体の免疫原としての不変領域が削減されるが、外来の可変領域に対する免疫応答の可能性は残る（非特許文献２３）。別のアプローチは、ヒト由来不変領域を提供することだけでなく、可変領域を修飾して、ヒト型に可能な限り近くなるように再成形することに焦点を当てている。重鎖及び軽鎖両方の可変領域は、問題となる抗原に応答して変化して結合能力を決定する、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）が隣接する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を内包することが知られており、上記フレームワーク領域は、ある所与の種において相対的に保存され、またＣＤＲのための足場を提供するものと推定される。ある特定の抗原に対して非ヒト抗体を調製する際、非ヒト抗体由来のＣＤＲを、修飾されるヒト抗体内に存在するＦＲに移植することによって、可変領域を「再成形」又は「ヒト化」できる。様々な抗体に対するこのアプローチの適用は、非特許文献２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３によって報告されている。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は全てのＣＤＲ配列を保存する（例えば、マウス抗体からの６つのＣＤＲ全てを含有するヒト化マウス抗体）。他の実施形態では、ヒト化抗体は、オリジナルの抗体に対して配列が異なる改変された１つ又は複数のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つ）を有する。
【0019】
非ヒト免疫グロブリン由来の抗原結合部位を備える多数の「ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）」抗体分子が説明されており、これらは、げっ歯類又は修飾げっ歯類Ｖ領域と、ヒト定常ドメインに融合した、これらに関連する相補性決定領域（ＣＤＲ）とを有するキメラ抗体を含む（例えば非特許文献３４、３５、３６を参照）。他の参照文献は、適切なヒト抗体定常ドメインと融合する前にヒト支持性フレームワーク領域（ＦＲ）にグラフと重合される、げっ歯類ＣＤＲについて説明している（例えば、非特許文献２５、２６、３７を参照）。別の参照文献は、組み換えによってベニアリングされたげっ歯類フレームワーク領域によって支持されたげっ歯類ＣＤＲについて説明している。例えば特許文献５を参照。これらの「ヒト化」分子は、ヒトレシピエントのこれらの部分の治療的応用の期間及び効果を制限する、げっ歯類抗ヒト抗体分子に対する望ましくない免疫学的応答を最小化するよう設計される。抗体をヒト化するために利用してよい他の方法は、非特許文献３８並びに特許文献６、７、８及び３によって開示されている。
【0020】
Ｂ．二重特異性抗体、多重特異性ダイアボディ及びＤＡＲＴ（商標）ダイアボディ天然の抗体は、１つのエピトープ種のみと結合できる（即ち「単一特異性」である）が、これらは当該種の複数の複製にも結合できる（即ち２価性又は多価性を呈することができる）。幅広い組み換え二重特異性抗体フォーマットが開発されており（例えば９、１０、１１、１２、１３、１４、１５参照）、その殆どは、抗体コア（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭ）を当該抗体コアに対する若しくは当該抗体コア内の更なる結合タンパク質（例えばｓｃＦｖ、ＶＬＶＨ等）に融合させるため、又は複数の抗体部分を、若しくは（例えば２つのＦａｂ断片若しくはｓｃＦｖ）を、ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン若しくは代替となるポリペプチド等のヘテロ二量体化促進ドメインに融合させるために、リンカーペプチドを使用する（特許文献１６、１７、１８、１９）。典型的には、このようなアプローチは妥協及びトレードオフを伴う。例えば特許文献２０、２１、２２は、リンカーの使用によって、治療的設定に問題が生じる場合があることを開示しており、２つ以上の抗原に結合できるように、ＣＬ及びＣＨ１ドメインがそれぞれの自然位置から切り替わり、かつＶＬ及びＶＨドメインが多様化されている、三重特異性抗体を教示している（特許文献２３、２４）。従って、これらの文書に開示されている分子は、結合特異性を、追加の抗原種に結合できる能力と交換している。特許文献２５、２６は、ＣＨ２ドメインを修飾して、結合ドメインを備える融合タンパク付加物を含有させるステップを開示している。この文書は、ＣＨ２が、エフェクタ機能の仲介において最低限の役割しか果たさないらしいことを記載している。特許文献２７、２８、２９は、Ｆｃドメインが追加のＶＬ及びＶＨドメインで置換されて、３価結合分子を形成している、組み換え抗体を開示している。特許文献３０、３１は、個々の鎖がｓｃＦｖドメインを含有する組み換えダイアボディを開示している。特許文献３２は、単一のポリペプチド鎖として合成された後、タンパク質分解に供されることによってヘテロ二量体構造が得られる、多価ｆａｂ分子を開示している。従って、これらの文書に開示されている分子は、エフェクタ機能を仲介する能力の全て又はある程度を、追加の抗原種に結合できる能力と交換している。特許文献３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１は、追加の結合ドメイン又は官能基を抗体又は抗体部分に付加するステップ（例えば抗体の軽鎖にダイアボディを付加するステップ、又は抗体の軽鎖及び重鎖に追加のＶＬ及びＶＨドメインを付加するステップ、又は異種融合タンパク質を互いに対して付加するステップ若しくは複数のＦａｂドメインを互いに対して連鎖させるステップ）を開示している。従って、これらの文書に開示されている分子は、ナイーブ抗体構造を、追加の抗原種に結合できる能力と交換している。
【0021】
本技術分野は更に、２つ以上の異なるエピトープ種と結合できる（即ち２価性又は多価性に加えて二重特異性又は多重特異性を呈することができる）という点でこのような天然抗体とは異なるダイアボディを産生できる可能性に注目している（例えば非特許文献３９、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．による特許文献４２、Ｍｅｒｔｅｎｓ ｅｔ ａｌ．による特許文献４３、非特許文献４０、４１、Ｍｅｒｔｅｎｓ ｅｔ ａｌ．による特許文献４４、非特許文献４２、４３、４４、４５、４６参照）。
【0022】
ダイアボディの設計は、単鎖可変ドメイン断片（ｓｃＦｖ）の構造に基づく。このような分子は、軽鎖及び／又は重鎖可変ドメインを、短い連鎖ペプチドを介して互いに連結することによって作製される。非特許文献４７は、一方の可変ドメインのカルボキシ末端と他方の可変ドメインのアミノ末端との間の約３．５ｎｍを埋める連結ペプチドの例を記載している。他の配列のリンカーも設計及び使用されている（非特許文献４７）。リンカーは、薬剤の付着又は剛性支持体の付着といった追加の機能のために修飾できる。単鎖変異体は、組み換えによって又は合成によって産生できる。ｓｃＦｖの合成産生に関しては、自動化されたシンセサイザを使用できる。ｓｃＦｖの組み換え産生に関しては、ｓｃＦｖをエンコードするポリヌクレオチドを含有する好適なプラスミドを、酵母、植物、昆虫若しくは哺乳類細胞等の真核細胞又は大腸菌等の原核細胞である好適な宿主細胞に導入できる。関心対象のｓｃＦｖをエンコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーション等の従来の操作によって作製できる。得られたｓｃＦｖは、当該技術分野で公知の標準的なタンパク質精製技術を用いて単離できる。
【0023】
特許文献４５、４６は、ＥｒｂＢ２に対して免疫特異的なｓｃＦｖ分子に関する。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（「ＢｉＴＥ」）、あるタイプのｓｃＦｖ分子が記載されている（特許文献４７、；非特許文献４８、４９）。このような分子は、２つの抗原結合ドメインを有する単一のポリペプチド鎖分子からなり、上記２つの抗原結合ドメインは、一方がＣＤ３エピトープに免疫特異的に結合し、もう一方が標的細胞の表面上に存在する抗原に免疫特異的に結合する。
【0024】
非単一特異性ダイアボディの提供は、異なるエピトープを発現する複数の細胞を共連結（ｃｏ‐ｌｉｇａｔｅ）して共存させることができる能力という有意な利点を提供する。従って２価ダイアボディは、療法及び免疫診断を含む広範な用途を有する。２価性は、様々な用途におけるダイアボディの設計及び加工の大幅な柔軟性を可能とし、これにより、多量体抗原の結合活性の上昇、異なる複数の抗原の架橋、及び両標的抗原の存在に基づく特定の細胞タイプに対する指向性標的化を提供する。当該技術分野において公知のダイアボディ分子は、（〜５０ｋＤａ以下の小さいサイズのダイアボディに関して）その高い結合価、低い解離率及び循環からの迅速な排除により、腫瘍撮像の分野での特定の使用も示している（非特許文献５０）。特に重要なのは、異なる細胞の共連結、例えば細胞毒性Ｔ細胞と腫瘍細胞との架橋である（非特許文献５１、非特許文献５２）。
【0025】
ダイアボディエピトープ結合ドメインは、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４等のいずれの免疫エフェクタ細胞の表面決定基を指向してよく、これらはＴリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は他の単核細胞上に発現する。多くの研究において、エフェクタ細胞決定基（例えばＦｃγ受容体（ＦｃγＲ））に対するダイアボディ結合は、エフェクタ細胞を活性化させることも発見された（非特許文献５２、非特許文献５３、特許文献４８、４９、５０、５１、５２）。通常、エフェクタ細胞の活性化は、抗原に結合した抗体がＦｃ‐ＦｃγＲ相互作用によってエフェクタ細胞に結合することによってトリガされる。従ってこれに関して、ダイアボディ分子は、（例えば当該技術分野において公知の、又は本出願において例示されるいずれのエフェクタ機能アッセイ（例えばＡＤＣＣアッセイ）において分析されるように）Ｆｃドメインを備えるかどうかとは独立して、Ｉｇのような機能性を呈し得る。腫瘍とエフェクタ細胞とを架橋することによって、ダイアボディはエフェクタ細胞を腫瘍細胞近傍にもたらすだけでなく、効果的な腫瘍の殺滅をもたらす（例えば非特許文献５４参照）。
【0026】
例えば特許文献５３は、２つの抗体をタンパク質分解によって切断してＦ（ａｂ’）2断片を得、このような断片を、分子間ジスルフィド結合の形成を防止するための条件下で還元した後、上記断片を混合して二重特異性抗体を産生することによる、二重特異性抗体の産生に関する。特許文献５４、５５、５６、３６、５７、５８、５９は、三重特異性抗体であって、Ｔ細胞と腫瘍細胞上の他の抗原とに同時に結合でき、また二重特異性抗体のＦｃ部分を介してこのような受容体を有する細胞のＦｃ受容体に結合できる、三重特異性抗体の産生に関する。特許文献５８、５９、６０は、Ｔ細胞及び他の抗原に同時に結合できる三重特異性抗体の産生に関する。特許文献６１は、アミロイドβオリゴマーに対する結合要素及び膜貫通タンパク質テレンスファリンに対する結合要素に対して特異的な二重特異性コンジュゲートを開示している。特許文献６２は、１つ（又は２つ）の腫瘍抗原及びエフェクタ細胞抗原（ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４等）に特異的に結合する、二重特異性及び三重特異性単鎖Ｆｖ分子に関する。
【0027】
特許文献６３、６４は、ＭＨＣ結合ペプチドが結合されている又はされていないヒトの主要な組織適合性複合体結合ドメインを備える、抗体誘導体を開示している。特許文献６５は、オンレート（標的分子に結合する速度）及びオフレート（標的分子を放出する速度）が、他のこのような標的分子への結合に比べてある標的に対して優先的に結合できるよう、異なっている、多重特異性結合分子に関する。三重特異性分子は、例えば抗ＣＤ３又は抗ＣＤ２８抗体である１価の第１の部分、及び標的疾患細胞又は免疫細胞上の１つ又は複数の標的リガンドに結合する２価免疫機能実行部分を備える第２の部分を有する分子である。
【0028】
特許文献６６、６７は、２つの抗体の重鎖から形成される二重特異性抗体に関し、上記２つの抗体のうちの一方は、その重鎖内へと加工された結節を有し、上記２つの抗体のうちのもう一方は、その重鎖内へと加工された相補的キャビティを有する。このような相補的な「ノブ（ｋｎｏｂ）」及び「ホール（ｈｏｌｅ）」の存在は、同一の抗体の２つの重鎖を含有する単一特異性ホモ抗体に対して、（このような抗体それぞれの１つの重鎖を有する）二重特異性ヘテロ抗体を優先的に形成するために教示される。ＣＤ３及び腫瘍細胞抗原に対して免疫特異的なものを含む様々な二重特異性ヘテロ抗体が提案されている。また、ＣＤ３、ＣＤ８及びＣＤ３７に対して免疫特異的なもの（Ｔ細胞増殖の調節に関わるＢ細胞上に主に発現する膜貫通タンパク質）を含む様々な三重特異性ヘテロ抗体も提案されている（非特許文献５５）が、その産生のための機構及びその構造に関する開示は提供されていない。
【0029】
特許文献６８は、介在するＣＨ２‐ＣＨ３ドメインによって分離された２つのダイアボディ構造をそれぞれ備える２つのポリペプチドを備える、二重特異性４価結合分子に関する。上記文書はまた、４つのポリペプチド鎖からなる４価結合分子にも関し、上記４つのポリペプチドのうちの２つは、２つの抗原に関する可変軽鎖及び可変重鎖ドメインを含有し、残りの２つは抗原及び末端ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに関する相補的な可変重鎖及び可変軽鎖ドメインを含有する。二重特異性４価結合分子は、その各ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインの連結によって形成される。この４つのポリペプチド鎖がある構造では、「軽（ｌｉｇｈｔ）」鎖は、重鎖と共有結合せず、従って不安定性につながる（非特許文献４１参照）。この文書は、二重特異性を排除する（即ち分子が単一特異性となる）という犠牲を払って上述のような共有結合を提供するように鎖が変化した、第３の構造を開示する。ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６１、ケモカイン受容体、ＣＤ９５、ＣＣＲ５等に対する特異性を有する分子が開示されている。ＣＤ３及びＣＤ８の両方に結合できる二重特異性分子は開示されていない。
【0030】
しかしながら、上述の利点は顕著なコストにつながる。このような非単一特異性ダイアボディの形成は、２つ以上の別個の異なるポリペプチドの良好な集合を必要とする（即ち上記形成は、ダイアボディが、異なるポリペプチド鎖種のヘテロ二量体形成によって形成されることを必要とする）。この事実は、同一のポリペプチド鎖のホモ二量体形成によって形成される単一特異性ダイアボディとは対照的である。非単一特異性ダイアボディを形成するために少なくとも２つの異なるポリペプチド（即ち２つのポリペプチド種）を提供しなければならないため、及びこのようなポリペプチドのホモ二量体形成は不活性分子をもたらす（非特許文献４５）ため、このようなポリペプチドの産生は、同一種のポリペプチド間での共有結合を防止するような方法で達成しなければならない（非特許文献４５）。従って本技術分野は、このようなポリペプチドの非共有結合的連結を教示している（例えば非特許文献４２、４４、４５、４１参照）。
【0031】
しかしながら、本技術分野は、非共有結合的に連結したポリペプチドで構成される二重特異性ダイアボディが不安定であり、非機能性モノマーへと容易に分解することを認識している（例えば非特許文献４１参照）。
【0032】
この課題をものともせず、本技術分野は、ＤＡＲＴ（商標）と呼ばれる、安定した共有結合ヘテロ二量体性非単一特異性ダイアボディの開発に成功した（例えば特許文献６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、５２、５１、５０、非特許文献５６、５７、５８参照）。このようなダイアボディは、２つ以上の共有結合的に複合体化したポリペプチドを備え、１つ又は複数のシステイン残基を、ジスルフィド結合を形成でき、これによって２つのポリペプチド鎖を共有結合させる、採用したポリペプチド種それぞれの中へと加工するステップを伴う。例えば、このような構造のＣ末端へのシステイン残基の追加は、ポリペプチド鎖間のジスルフィド結合を可能とすることが分かっており、これは、２価分子の結合特性に干渉することなく、得られるヘテロ二量体を安定化させる。
【0033】
多数のＤＡＲＴ（商標）の実施形態が存在する。最も単純なＤＡＲＴ（商標）実施形態の２つのポリペプチドはそれぞれ３つのドメインを備える（図１）。第１のポリペプチドは：（ｉ）第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）の結合領域を備える、第１のドメイン；（ｉｉ）第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）の結合領域を備える、第２のドメイン；及び（ｉｉｉ）システイン残基（又はシステイン含有ドメイン）と、上記第２のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化を促進する役割を果たすヘテロ二量体化促進ドメインとを含有する第３のドメインを備える。第３のドメインのシステイン残基（又はシステイン含有ドメイン）は、ダイアボディの第２のポリペプチド鎖に対する第１のポリペプチド鎖の共有結合を促進する役割を果たす。第２のポリペプチドは：（ｉ）相補的な第１のドメイン（ＶＬ２含有ドメイン）；（ｉｉ）相補的な第２のドメイン（ＶＨ１含有ドメイン）；及び（ｉｉｉ）システイン残基（又はシステイン含有ドメイン）と、任意に、第１のポリペプチド鎖のヘテロ二量体化促進ドメインと複合体化して、第１のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化を促進する、相補的なヘテロ二量体化促進ドメインとを含有する第３のドメインを含有する。第２のポリペプチド鎖の第３のドメインのシステイン残基（又はシステイン含有ドメイン）は、ダイアボディの第１のポリペプチド鎖に対する第２のポリペプチド鎖の共有結合を促進する役割を果たす。このような分子は、安定かつ強力であり、２つ以上の抗原を同時に結合する能力を有する。これらは、標的抗原を発現する細胞の、標的転換Ｔ細胞仲介殺滅を促進できる。
【0034】
一実施形態では、第１及び第２のポリペプチドの第３のドメインはそれぞれ、システイン残基を含有し、このシステイン残基は、ジスルフィド結合を介してポリペプチドを一体に結合させる役割を果たす。上記ポリペプチドのうちの一方又は両方の第３のドメインは更に、ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインの配列を有してよく、これにより、ダイアボディポリペプチドの複合体化によって、細胞（Ｂリンパ球、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球及び肥満細胞等）のＦｃ受容体に結合できるＦｃドメインが形成される（図２Ａ〜２Ｂ）。
【0035】
このような分子の多数の変形例が記載されている（例えば特許文献６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、５２、５１、５０参照）。これらのＦｃ担持ＤＡＲＴは、３つのポリペプチド鎖を備えてよい（例えば図２Ｂ）。このようなダイアボディの第１のポリペプチド鎖は、３つのドメイン：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；並びに（ｉｉｉ）システイン残基（又はシステイン含有ドメイン）及びヘテロ二量体化促進ドメインを含有するドメインと、（ｉｖ）システイン残基（又はシステイン含有ドメイン）及びＣＨ２‐ＣＨ３ドメインとを含有する。このようなＤＡＲＴ（商標）の第２のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）システイン残基（又はシステイン含有ドメイン）と、第１のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化を促進するヘテロ二量体化促進ドメインとを含有するドメインを含有する。第２のポリペプチド鎖の第２のドメインのシステイン残基（又はシステイン含有ドメイン）は、ダイアボディの第１のポリペプチド鎖に対する第２のポリペプチド鎖の共有結合を促進する役割を果たす。このようなＤＡＲＴ（商標）の第３のポリペプチドは、システイン残基（又はシステイン含有ドメイン）及びＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを備える。従って、このようなＤＡＲＴ（商標）の第１及び第２のポリペプチド鎖は、１つに連結して、エピトープに結合可能なＶＬ１／ＶＨ１結合部位、及び第２のエピトープに結合可能なＶＬ２／ＶＨ２結合部位を形成する。第１及び第２のポリペプチドは、それぞれの第３のドメイン内のシステイン残基が関与するジスルフィド結合を介して、互いに結合される。特に、第１及び第３のポリペプチド鎖は互いと複合体化して、ジスルフィド結合によって安定化されたＦｃドメインを形成する。このようなダイアボディは、増強された強度を有する。このようなＦｃ担持ＤＡＲＴ（商標）は、２つの配向（表７）のうちのいずれを有してよい：
【0036】
【表1】
【0037】
Ｉｇ‐ＤＡＲＴ（商標）（図３Ａ〜３Ｂ）及びＦｃ‐ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディ（図３Ｃ）と呼ばれる、はるかに複雑なＤＡＲＴ（商標）が記載されている（特許文献５１）。Ｆｃ‐ＤＡＲＴ（商標）は４つのポリペプチド鎖を有する。このようなダイアボディの第１及び第３のポリペプチド鎖は、３つのドメイン：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。Ｆｃ‐ＤＡＲＴ（商標）の第２及び第４のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン；並びに（ｉｉｉ）Ｆｃ‐ＤＡＲＴ（商標）の第１のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進するドメインを含有する。第３及び第４、並びに第１及び第２のポリペプチド鎖は、同一であってよく、又は単一特異性、二重特異性若しくは四重特異性のいずれかである４価結合を可能とすることができるよう、異なっていてよい。このようなより複雑なＤＡＲＴ（商標）分子はまた、共有結合複合体を形成する機能を果たすシステイン含有ドメインも有する。Ｆｃ‐ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディは、ＣＨ１及びＣＬドメインを含有する。
【0038】
４価分子が望ましいもののＦｃは必要ない場合の用途のために、代替的な構成が当該技術分野において公知であり、これは、ＶＨ１、ＶＬ２、ＶＨ２、及びＶＬ２ドメインをそれぞれ有する２つの同一の鎖のホモ二量体化によって形成される「ＴａｎｄＡｂ」とも呼ばれる４価タンデム抗体を含むが、これに限定されない（例えば特許文献７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、３０、８６参照）。
【0039】
しかしながら、従来のあらゆる進歩にもかかわらず、癌又は他の疾患及び状態に罹患した患者に対して改善された治療的価値を提供できる組成物に対して、需要が存在し続けている。本発明はこの目標及び他の目標を対象としている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0040】
【特許文献1】米国特許第４，８１６，５６７号
【特許文献2】米国特許第５，８０７，７１５号
【特許文献3】米国特許第５，８６６，６９２号
【特許文献4】米国特許第６，３３１，４１５号
【特許文献5】欧州特許第５１９，５９６号
【特許文献6】米国特許第６，１８０，３７７号
【特許文献7】米国特許第６，０５４，２９７号
【特許文献8】米国特許第５，９９７，８６７号
【特許文献9】国際公開第２００８／００３１１６号
【特許文献10】国際公開第２００９／１３２８７６号
【特許文献11】国際公開第２００８／００３１０３号
【特許文献12】国際公開第２００７／１４６９６８号
【特許文献13】国際公開第２００９／０１８３８６号
【特許文献14】国際公開第２０１２／００９５４４号
【特許文献15】国際公開第２０１３／０７０５６５号
【特許文献16】国際公開第２００５／０７０９６６号
【特許文献17】国際公開第２００６／１０７７８６Ａ号
【特許文献18】国際公開第２００６／１０７６１７Ａ号
【特許文献19】国際公開第２００７／０４６８９３号
【特許文献20】国際公開第２０１３／１７４８７３号
【特許文献21】国際公開第２０１１／１３３８８６号
【特許文献22】国際公開第２０１０／１３６１７２号
【特許文献23】国際公開第２００８／０２７２３６号
【特許文献24】国際公開第２０１０／１０８１２７号
【特許文献25】国際公開第２０１３／１６３４２７号
【特許文献26】国際公開第２０１３／１１９９０３号
【特許文献27】国際公開第２０１０／０２８７９７号
【特許文献28】国際公開第２０１００２８７９６号
【特許文献29】国際公開第２０１０／０２８７９５号
【特許文献30】国際公開第２００３／０２５０１８号
【特許文献31】国際公開第２００３０１２０６９号
【特許文献32】国際公開第２０１３／００６５４４号
【特許文献33】国際公開第２０１４／０２２５４０号
【特許文献34】国際公開第２０１３／００３６５２号
【特許文献35】国際公開第２０１２／１６２５８３号
【特許文献36】国際公開第２０１２／１５６４３０号
【特許文献37】国際公開第２０１１／０８６０９１号
【特許文献38】国際公開第２００７／０７５２７０号
【特許文献39】国際公開第１９９８／００２４６３号
【特許文献40】国際公開第１９９２／０２２５８３号
【特許文献41】国際公開第１９９１／００３４９３号
【特許文献42】米国公開特許第２００４／００５８４００号（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．）；
【特許文献43】米国公開特許第２００４／０２２０３８８号（Ｍｅｒｔｅｎｓ ｅｔ ａｌ．）；
【特許文献44】国際公開第０２／０２７８１号（Ｍｅｒｔｅｎｓ ｅｔ ａｌ）；
【特許文献45】米国特許第７，５８５，９５２号
【特許文献46】米国公開特許第２０１０‐０１７３９７８号
【特許文献47】国際公開第０５／０６１５４７号
【特許文献48】国際公開第２００６／１１３６６５号
【特許文献49】国際公開第２００８／１５７３７９号
【特許文献50】国際公開第２０１０／０８０５３８号
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【特許文献64】国際公開第１９９８／００６７４９号
【特許文献65】国際公開第０２／０７２１４１号
【特許文献66】米国特許第７，６９５，９３６号
【特許文献67】米国公開特許第２００７／０１９６３６３号
【特許文献68】国際公開第２０１２‐１６２５６１号
【特許文献69】米国公開特許第２０１３‐０２９５１２１号
【特許文献70】米国公開特許第２０１０‐０１７４０５３号
【特許文献71】米国公開特許第２００９‐００６０９１０号
【特許文献72】欧州特許第２７１４０７９号
【特許文献73】欧州特許第２６０１２１６号
【特許文献74】欧州特許第２３７６１０９号
【特許文献75】欧州特許第２１５８２２１号
【特許文献76】米国公開特許第２００５‐００７９１７０号
【特許文献77】米国公開特許第２００７‐００３１４３６号
【特許文献78】米国公開特許第２０１０‐００９９８５３号
【特許文献79】米国公開特許第２０１１‐０２０６６７号
【特許文献80】米国公開特許第２０１３‐０１８９２６３号
【特許文献81】欧州特許第１０７８００４号
【特許文献82】欧州特許第２３７１８６６号
【特許文献83】欧州特許第２３６１９３６号
【特許文献84】欧州特許第１２９３５１４号
【特許文献85】国際公開第１９９９／０５７１５０号
【特許文献86】国際公開第２０１３／０１３７００号
【0041】
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【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0042】
本発明は三重特異性結合分子に関し、これは、３つの結合ドメインを有することにより、３つのエピトープに対する協調的結合を仲介できる、多重鎖ポリペプチド分子である。上記三重特異性結合分子は好ましくは、上記三重特異性結合分子を：（１）第１の癌抗原のエピトープ、（２）第２の癌抗原のエピトープ、及び（３）免疫系エフェクタ細胞の表面上で発現する分子のエピトープに免疫特異的に結合できるようにし、これによって、癌抗原を発現する細胞に対して免疫系エフェクタ細胞を局在化でき、これにより、上記癌細胞の殺滅を促進する、結合ドメインを有することを特徴とする。詳細には、本発明は、３つの異なるエピトープに免疫特異的に結合できる三重特異性結合分子に関し、上記エピトープは、エピトープＩ、エピトープＩＩ及びエピトープＩＩＩであり、これら３つのエピトープのうちの２つは、１つ又は複数の癌抗原のエピトープであり、上記エピトープのうちの第３のものは、エフェクタ細胞抗原のエピトープである。
【0043】
本発明は特に、上記分子が、共有結合的に複合体化した４つの異なるポリペプチド鎖を含み、また：（Ｉ）第１の抗原上に存在するエピトープＩに免疫特異的に結合できる抗原結合ドメインＩ、及び第２の抗原上に存在するエピトープＩＩに免疫特異的に結合できる抗原結合ドメインＩＩ（ここで上記抗原結合ドメインＩ及び上記抗原結合ドメインＩＩはいずれもダイアボディタイプ結合ドメインである）；
（ＩＩ）第３の抗原上に存在するエピトープＩＩＩに免疫特異的に結合できる抗原結合ドメインＩＩＩ；並びに
（ＩＩＩ）２つのＣＨ２‐ＣＨ３ドメインの互いに対する複合体化によって形成された、Ｆｃドメイン
を含み、エピトープＩ、エピトープＩＩ又はエピトープＩＩＩのうちの１つは、エフェクタ細胞抗原のエピトープであり、エピトープＩ、エピトープＩＩ又はエピトープＩＩＩのうちの第２のものは、第１の癌抗原のエピトープであり、エピトープＩ、エピトープＩＩ又はエピトープＩＩＩのうちの第３のものは、第２の癌抗原のエピトープであり、結合分子の抗原結合ドメインＩ、ＩＩ及びＩＩＩは、エフェクタ細胞抗原を発現する免疫系エフェクタ細胞と、第１及び第２の癌抗原を発現する癌細胞との共有結合を仲介する、上述のような三重特異性結合分子の実施形態に関する。
【0044】
本発明は特に、上記Ｆｃドメインが、ある細胞の表面に配列されたＦｃ受容体に結合できる、上述のような三重特異性結合分子の実施形態に関する。
【0045】
本発明は更に、上記エフェクタ細胞抗原がエフェクタ細胞の表面に配列され、上記癌抗原が癌細胞の表面に配列され、上記免疫特異的結合が、上記エフェクタ細胞抗原及び上記癌抗原を共局在化することによって、上記癌細胞に対する上記エフェクタ細胞の活性化を促進するために十分なものである、上述のような三重特異性結合分子の実施形態に関する。
【0046】
本発明は更に、上記エフェクタ細胞抗原が：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ６４、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びＮＫＧ２Ｄ受容体からなる群から選択される、上述のような三重特異性結合分子の実施形態に関する。
【0047】
本発明は更に、上記第１及び第２の癌抗原が：結腸癌抗原１９．９；胃癌ムチン；抗原４．２；糖タンパク質Ａ３３（ｇｐＡ３３）；ＡＤＡＭ‐９；胃癌抗原ＡＨ６；ＡＬＣＡＭ；悪性ヒトリンパ球抗原ＡＰＯ‐１；癌抗原Ｂ１；Ｂ７‐Ｈ３；β‐カテニン；血液型ＡＬｅb／Ｌｅy；バーキットリンパ腫抗原‐３８．１３；結腸腺癌抗原Ｃ１４；卵巣癌抗原ＣＡ１２５；カルボキシペプチダーゼＭ；ＣＤ５；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２２；ＣＤ２３；ＣＤ２５；ＣＤ２７；ＣＤ３０ ；ＣＤ３３；ＣＤ３６；ＣＤ４５；ＣＤ４６；ＣＤ５２；ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ；ＣＤ１０３；ＣＤ３１７；ＣＤＫ４；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；ＣＥＡＣＡＭ５；ＣＥＡＣＡＭ６；ＣＯ１７‐１Ａ；ＣＯ‐４３（血液型Ｌｅb）；ＣＯ-５１４（血液型Ｌｅa）；ＣＴＡ‐１；ＣＴＬＡ４；サイトケラチン８；抗原Ｄ１．１；抗原Ｄ1５６‐２２；ＤＲ５；Ｅ1シリーズ（血液型Ｂ）；ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）；エフリン受容体Ａ２（ＥｐｈＡ２）；ＥｒｂＢ１；ＥｒｂＢ３；ＥｒｂＢ４；ＧＡＧＥ‐１；ＧＡＧＥ‐２；ＧＤ２／ＧＤ３／ＧＭ２；肺腺癌抗原Ｆ３；抗原ＦＣ１０．２；Ｇ４９；ガングリオシドＧＤ２；ガングリオシドＧＤ３；ガングリオシドＧＭ２；ガングリオシドＧＭ３；ＧD2；ＧD3；ＧＩＣＡ１９‐９；ＧM2；ｇｐ１００；ヒト白血病Ｔ細胞抗原Ｇｐ３７；メラノーマ抗原ｇｐ７５；ｇｐＡ３３；ＨＥＲ２抗原（ｐ１８５HER2）；ヒト乳脂肪小球抗原（ＨＭＦＧ）；ヒトパピローマウイルス‐Ｅ６／ヒトパピローマウイルス‐Ｅ７；高分子量メラノーマ抗原（ＨＭＷ‐ＭＡＡ）；Ｉ抗原（分化抗原）Ｉ（Ｍａ）；インテグリンアルファ‐Ｖ‐ベータ‐６インテグリンβ６（ＩＴＧＢ６）；インターロイキン‐１３；受容体α２（ＩＬ１３Ｒα２）；ＪＡＭ‐３；ＫＩＤ３；ＫＩＤ３１；ＫＳ１／４汎癌腫抗原；ヒト肺癌抗原Ｌ６及びＬ２０；ＬＥＡ；ＬＵＣＡ‐２；Ｍ１：２２：２５：８；Ｍ１８；Ｍ３９；ＭＡＧＥ‐１；ＭＡＧＥ‐３；ＭＡＲＴ；ＭＵＣ‐１；ＭＵＭ‐１；Ｍｙｌ；Ｎ‐アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ；ネオ糖タンパク質；ＮＳ‐１０；ＯＦＡ‐１；ＯＦＡ‐２；オンコスタチンＭ；ｐ１５；メラノーマ関連抗原ｐ９７；多型性上皮ムチン（ＰＥＭ）；多型性上皮ムチン抗原（ＰＥＭＡ）；ＰＩＰＡ；前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；前立腺酸性リン酸塩；Ｒ24；ＲＯＲ１；スフィンゴ脂質；ＳＳＥＡ‐１；ＳＳＥＡ‐３；ＳＳＥＡ‐４；ｓＴｎ；Ｔ細胞受容体誘導ペプチド；Ｔ5Ａ7；ＴＡＧ‐７２；ＴＬ５（血液型Ａ）；ＴＮＦ‐α受容体；ＴＮＦ‐β受容体；ＴＮＦ‐γ受容体；ＴＲＡ‐１‐８５（血液型Ｈ）；トランスフェリン受容体；腫瘍特異的移植抗原（ＴＳＴＡ）；癌胎児性抗原‐アルファ‐フェトプロテイン（ＡＦＰ）；ＶＥＧＦ；ＶＥＧＦＲ、ＶＥＰ８；ＶＥＰ９；ＶＩＭ‐Ｄ５；並びにＹヘプタン、Ｌｅyからなる群から独立して選択される、上述のような三重特異性結合分子の実施形態に関する。
【0048】
本発明は更に、上記第１及び第２の癌抗原が：ＣＤ２、ＣＤ３１７、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＤＲ５、ＥｐｈＡ２、ｇｐＡ３３、Ｈｅｒ２、Ｂ７‐Ｈ３；ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦＲからなる群から選択される、上述のような三重特異性結合分子の実施形態に関する。
【0049】
本発明は更に、上記非ダイアボディタイプ結合ドメインＩＩＩが、エピトープＩＩＩに免疫特異的に結合できるＦａｂタイプ結合ドメイン（ＶＬIII／ＶＨIII）を備え、上記分子が：（Ａ）第１のポリペプチド鎖であって、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（１）３つのエピトープのうちの第１のものに結合できる免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬI）；
（２）３つのエピトープのうちの第２のものに結合できる免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨII）；
（３）ヘテロ二量体促進ドメイン；並びに
（４）ＩｇＧのＣＨ２及びＣＨ３ドメイン
を備える、第１のポリペプチド鎖；
（Ｂ）第２のポリペプチド鎖であって、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（１）３つのエピトープのうちの第２のものに結合できる免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬII）；
（２）３つのエピトープのうちの第１のものに結合できる免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨI）；及び
（３）相補的ヘテロ二量体促進ドメイン
を備える、第２のポリペプチド鎖；
（Ｃ）第３のポリペプチド鎖であって、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（１）３つのエピトープのうちの第３のものに結合できる免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨIII）；並びに
（２）ＩｇＧのＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン及びＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン
を備える、第３のポリペプチド鎖；並びに
（Ｄ）第４のポリペプチド鎖であって、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（１）３つのエピトープのうちの第３のものに結合できる免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬIII）；及び
（２）軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）
を備える、第４のポリペプチド鎖
を備え、
（ｉ）上記ＶＬI及びＶＨIドメインは連結して、上記第１のエピトープに結合できるドメインを形成し；
（ｉｉ）上記ＶＬII及びＶＨIIドメインは連結して、上記第２のエピトープに結合できるドメインを形成し；
（ｉｉｉ）上記ＶＬIII及びＶＨIIIドメインは連結して、上記第３のエピトープに結合できるドメインを形成し；
（ｉｖ）上記第１のポリペプチド鎖の上記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインと、上記第３のポリペプチド鎖の上記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインとは、連結してＦｃドメインを形成し；
（ｖ）上記第１及び第２のポリペプチド鎖は互いに共有結合し；
（ｖｉ）上記第１及び第３のポリペプチド鎖は互いに共有結合し；
（ｖｉｉ）上記第３及び第４のポリペプチド鎖は互いに共有結合する、上述のような三重特異性結合分子の実施形態に関する。
【0050】
本発明は更に：（Ａ）上記ヘテロ二量体促進ドメインがＥコイルであり、上記相補的ヘテロ二量体促進ドメインがＫコイルである；又は
（Ｂ）上記ヘテロ二量体促進ドメインがＫコイルであり、上記相補的ヘテロ二量体促進ドメインがＥコイルである、上述のような三重特異性結合分子の実施形態に関する。
【0051】
本発明は更に：（Ａ）上記第１及び第３のポリペプチド鎖の上記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインがそれぞれ、配列番号１の配列を有し、これにより、これらの連結から形成されるＦｃドメインが、正常なＦｃγＲ仲介エフェクタ機能を呈する；又は
（Ｂ）上記第１及び第３のポリペプチド鎖の上記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインが、配列番号１の配列に対する少なくとも１つのアミノ酸置換を備え、これにより、これらの連結から形成されるＦｃドメインが、変化したＦｃγＲ仲介エフェクタ機能を呈する、上述のような三重特異性結合分子の実施形態に関する。
【0052】
本発明は更に、上記少なくとも１つのアミノ酸置換が：Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ３９６Ｌからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を備え、上記番号付与が、ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスのものである、上述のような三重特異性結合分子の実施形態に関する。
【0053】
本発明は更に、上記少なくとも１つのアミノ酸置換が：（Ａ）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ３９６Ｌからなる群から選択される、少なくとも１つの置換；
（Ｂ）（１）Ｆ２４３Ｌ及びＰ３９６Ｌ；
（２）Ｆ２４３Ｌ及びＲ２９２Ｐ；並びに
（３）Ｒ２９２Ｐ及びＶ３０５Ｉ
からなる群から選択される、少なくとも２つの置換；
（Ｃ）（１）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＹ３００Ｌ；
（２）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＶ３０５Ｉ；
（３）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＰ３９６Ｌ；並びに
（４）Ｒ２９２Ｐ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ３９６Ｌ
からなる群から選択される、少なくとも３つの置換；
（Ｄ）（１）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ及びＰ３９６Ｌ；並びに
（２）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ３９６Ｌ
からなる群から選択される、少なくとも４つの置換；又は
（Ｅ）（１）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ３９６Ｌ；並びに
（２）Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ及びＰ３９６Ｌ
からなる群から選択される、少なくとも５つの置換
を含む、上述のような三重特異性結合分子の実施形態に関する。
【0054】
本発明は更に、上記第１及び第３のポリペプチド鎖の上記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインが互いに異なっており、また配列番号５２及び配列番号５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、上述のような三重特異性結合分子の実施形態に関する。
【0055】
本発明は更に：（Ａ）上記エピトープＩ、エピトープＩＩ及びエピトープＩＩＩはそれぞれ、第１の癌抗原のエピトープ、第２の癌抗原のエピトープ及びエフェクタ細胞抗原のエピトープであり；
（Ｂ）上記エピトープＩ、エピトープＩＩ及びエピトープＩＩＩはそれぞれ、第１の癌抗原のエピトープ、エフェクタ細胞抗原のエピトープ及び第２の癌抗原のエピトープであり；
（Ｃ）上記エピトープＩ、エピトープＩＩ及びエピトープＩＩＩはそれぞれ、第２の癌抗原のエピトープ、第１の癌抗原のエピトープ及びエフェクタ細胞抗原のエピトープであり；
（Ｄ）上記エピトープＩ、エピトープＩＩ及びエピトープＩＩＩはそれぞれ、第２の癌抗原のエピトープ、エフェクタ細胞抗原のエピトープ及び第１の癌抗原のエピトープであり；
（Ｅ）上記エピトープＩ、エピトープＩＩ及びエピトープＩＩＩはそれぞれ、エフェクタ細胞抗原のエピトープ、第１の癌抗原のエピトープ及び第２の癌抗原のエピトープであり；並びに
（Ｆ）上記エピトープＩ、エピトープＩＩ及びエピトープＩＩＩはそれぞれ、エフェクタ細胞抗原のエピトープ、第２の癌抗原のエピトープ及び第１の癌抗原のエピトープである、上述のような三重特異性結合分子の実施形態に関する。
【0056】
本発明は更に：（Ａ）エフェクタ細胞抗原の上記エピトープは、抗体Ｌｏ‐ＣＤ２ａによって認識されるＣＤ２エピトープであり；
（Ｂ）エフェクタ細胞抗原の上記エピトープは、抗体ＯＫＴ３、Ｍ２９１、ＹＴＨ１２．５、抗ＣＤ３ ｍＡｂ １若しくは抗ＣＤ３ ｍＡｂ ２によって認識されるＣＤ３エピトープであり；
（Ｃ）エフェクタ細胞抗原の上記エピトープは、抗体３Ｇ８若しくはＡ９によって認識されるＣＤ１６エピトープであり；
（Ｄ）エフェクタ細胞抗原の上記エピトープは、抗体ＭＤ１３４２、ＭＥＤＩ‐５５１、ブリナツモマブ若しくはＨＤ３７によって認識されるＣＤ１９エピトープであり；
（Ｅ）エフェクタ細胞抗原の上記エピトープは、抗体リツキシマブ、イブリツモマブ、オアツムマブ及びトシツモマブによって認識されるＣＤ２０エピトープであり；
（Ｆ）エフェクタ細胞抗原の上記エピトープは、抗体エプラツズマブによって認識されるＣＤ２２エピトープであり；
（Ｇ）エフェクタ細胞抗原の上記エピトープは、抗体ＣＤ３２Ｂ ｍＡｂ １によって認識されるＣＤ３２Ｂエピトープであり；
（Ｈ）エフェクタ細胞抗原の上記エピトープは、抗体ＣＤ６４ ｍＡｂ １によって認識されるＣＤ６４エピトープであり；
（Ｉ）エフェクタ細胞抗原の上記エピトープは、抗体ＣＤ７９ ｍＡｂ １によって認識されるＢＣＲ／ＣＤ７９エピトープであり；
（Ｊ）エフェクタ細胞抗原の上記エピトープは、抗体ＢＭＡ０３１によって認識されるＴＣＲエピトープであり；又は
（Ｋ）エフェクタ細胞抗原の上記エピトープは、抗体ＫＹＫ‐２．０によって認識されるＮＫＧ２Ｄ受容体エピトープである、上述のような三重特異性結合分子の実施形態に関する。
【0057】
本発明は更に、上述の三重特異性結合分子のいずれと、薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤又は希釈剤とを含む医薬組成物に関する。
【0058】
本発明は更に、三重特異性結合分子が癌の治療に使用される、上述の医薬組成物又はいずれの上述の三重特異性結合分子の実施形態に関する。
【0059】
本発明は更に、上述の医薬組成物又は上述の三重特異性結合分子の実施形態に関し、ここで上記癌は、以下の細胞：副腎腫瘍；ＡＩＤＳ関連癌；胞巣状軟部肉腫；星状細胞腫瘍；膀胱癌；骨癌；脳及び脊髄の癌；転移性脳腫瘍；乳癌；頸動脈球腫瘍；子宮頸癌；軟骨肉腫；脊索腫；嫌色素性腎細胞癌；明細胞癌；大腸癌；結腸直腸癌；皮膚の良性線維性組織球腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；ユーイング腫瘍；骨外性粘液型軟骨肉腫；骨性線維形成不全症；線維性骨異形成；胆嚢又は胆管癌；消化器癌；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；肝細胞癌；膵島細胞腫瘍；カポジ肉腫；腎癌；白血病；脂肪腫／良性脂肪腫；脂肪肉腫／悪性脂肪腫；肝癌；リンパ腫；肺癌；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；神経内分泌腫瘍；卵巣癌；膵臓癌；甲状腺乳頭癌；副甲状腺腫瘍；小児癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；前立腺癌；後部ブドウ膜黒色腫；希少な血液学的障害；腎転移性癌；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肉腫；皮膚癌；軟組織肉腫；扁平上皮癌；胃癌；滑膜肉腫；精巣癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺転移癌；並びに子宮癌からなる群から選択された癌細胞の存在を特徴とする。
【0060】
本発明は更に、上述の医薬組成物又は上述の三重特異性結合分子の実施形態に関し、ここで上記癌は：結腸直腸癌；肝細胞癌；神経膠腫；腎癌；乳癌；多発性骨髄腫；膀胱癌；神経芽細胞腫；肉腫；非ホジキンリンパ腫；非小細胞肺癌；卵巣癌；膵臓癌又は直腸癌である。
【0061】
本発明は更に、上述の医薬組成物又は上述の三重特異性結合分子の実施形態に関し、ここで上記癌は：急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；；急性Ｂリンパ芽球性白血病（Ｂ‐ＡＬＬ）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；有毛細胞白血病（ＨＣＬ）；芽形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）；マントル細胞白血病（ＭＣＬ）及び小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）を含む非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；ホジキンリンパ腫；全身性肥満細胞症；又はバーキットリンパ腫である。
【図面の簡単な説明】
【0062】
【図1】図１Ａ〜１Ｂは、ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディのドメインの模式図である。図１Ａは、基本的なＤＡＲＴ（商標）ダイアボディのドメインの模式図である。図１Ｂは、ヘテロ二量体促進ドメインをそれぞれ有する２つのポリペプチド鎖からなる共有結合ダイアボディの概略図を提供する。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同じように影を付けて示されている。
【図2】図２Ａ〜２Ｂは、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインをそれぞれ有する（図２Ａ）、又は一方のみがＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有することによって、連結した鎖が、自然に発生するＦｃドメインの全体若しくは一部を含むＦｃドメインを形成する（図２Ｂ）、２つのポリペプチド鎖からなる共有結合ダイアボディの概略図を提供する。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同じように影を付けて示されている。
【図3】図３Ａ〜３Ｃは、２ペアのポリペプチド鎖からなる４価ダイアボディの概略図を提供する。これらのペアは異なっているため、一方がＤＲ５のエピトープであり、他方がエフェクタ細胞の表面上に存在する分子のエピトープである２つのエピトープそれぞれに関して２価性である、二重特異性分子が得られる。各ペアの１つのポリペプチドはＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有することにより、連結した鎖が、自然に発生するＦｃドメインの全体若しくは一部を含むＦｃドメインを形成する。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同じように影を付けて示されている。（同じように影を付けて示されている）エピトープの１つのペアのみが、ＤＲ５に結合できる。図３ＡはＩｇダイアボディを示す。図３Ｂは、Eコイル及びＫコイルヘテロ二量体促進ドメインを含有するＩｇダイアボディを示す。図３Ｃは、抗体ＣＨ１及びＣＬドメインを含有するＦｃ‐ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディを示す。「ＶＬ１」及び「ＶＨ１」という表記法はそれぞれ、「第１の」エピトープに結合する可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインを表す。同様に「ＶＬ２」及び「ＶＨ２」という表記法はそれぞれ、「第２の」エピトープに結合する可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインを表す。
【図4】図４Ａ〜４Ｇは、本発明の好ましい三重特異性結合分子のドメインの模式図を提供する。これらの図は、本発明の好ましい三重特異性結合分子の実施形態のドメインの順序及び配向を概略的に図示する。図４Ａ、４Ｂ及び４Ｇは、上記三重特異性結合分子が４つのポリペプチド鎖で構成される実施形態を示す。図４Ｃ、４Ｄ、４Ｅ及び４Ｆは、上記結合分子が３つのポリペプチド鎖で構成される実施形態を示す。上記分子は、ヒンジ及び／若しくはＣＬドメインを有してよく（図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｅ）、又は代替的なリンカーペプチドを含有してよい（図４Ｄ、４Ｆ、４Ｇ）。
【図5】図５Ａ〜５Ｅは、エフェクタ細胞結合ドメインが、ダイアボディタイプ結合ドメイン又はＦａｂタイプ結合ドメインではなく、エフェクタ細胞受容体タイプ結合ドメインで構成される、本発明の三重特異性結合分子の代替実施形態のドメインの模式図を提供する。図５Ａ及び５Ｂは、上記三重特異性結合分子が４つのポリペプチド鎖で構成される実施形態を示す。図５Ｃ及び図５Ｅは、上記結合分子が３つのポリペプチド鎖で構成される実施形態を示す。図５Ｄは、上記結合分子が５つのポリペプチド鎖で構成される実施形態を示す。上記分子は、ヒンジ及び／若しくはＣＬドメインを有してよく、又は代替的なリンカーペプチドを含有してよい。
【図7】図７、パネルＡ〜Ｈは、ヒトＤＲ５（パネルＡ〜Ｄ）及びカニクイザルＤＲ５（パネルＥ〜Ｈ）に関する、ＤＲ５ ｍＡｂ １（パネルＡ及びＥ）、ＤＲ５ ｍＡｂ ２（パネルＢ及びＦ）、ＤＲ５ ｍＡｂ ３（パネルＣ及びＧ）並びにＤＲ５ ｍＡｂ ４（パネルＤ及びＨ）の結合のキネティクスを示す。
【図8】図８は、ＤＲ５ ｍＡｂ １及びＤＲ５ ｍＡｂ ２の、予想外の優越性を示す。優越性は、ＤＲ５ ｍＡｂ １、ＤＲ５ ｍＡｂ ２、ＤＲ５ ｍＡｂ ３又はＤＲ５ ｍＡｂ ４のＶＬ及びＶＨドメインを有するＤＲ５ｘＣＤ３ダイアボディの、Ａ５４９ヒト肺胞基底上皮腺癌腫瘍細胞の細胞毒性を仲介する能力を比較することによって評価した。
【図9】図９Ａ〜９Ｃは、本発明の三重特異性結合分子の２つの癌抗原結合ドメインが両方とも標的細胞に結合できる場合に達成される、標的細胞結合の相乗的増強を実証する。図９Ａは、三重特異性分子：ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １；ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘｇｐＡ３３ ｍＡｂ １；及びｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １を、ＥｐｈＡ２発現ＣＨＯ細胞の存在下でインキュベートした場合に得られる結合を示す。図９Ｂは、上記三重特異性分子を、ＤＲ５発現ＣＨＯ細胞の存在下でインキュベートした場合に得られる結合を示す。図９Ｃは、上記三重特異性分子を、ＥｐｈＡ２及びＤＲ５を発現するもののｇｐＡ３３を発現しないＤＵ１４５ヒト前立腺細胞の存在下でインキュベートした場合に得られる結合を示す。
【図10】図１０Ａ〜１０Ｃは、本発明の三重特異性結合分子の２つの癌抗原結合ドメインが両方とも標的細胞に結合できる場合に弱化する、標的細胞の細胞毒性の相乗的増強を実証する。図１０Ａは、三重特異性分子：ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １；ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘｇｐＡ３３ ｍＡｂ １；及びｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １を、ＥｐｈＡ２発現ＣＨＯ細胞及び細胞毒性リンパ球の存在下でインキュベートした場合に得られるパーセント細胞毒性を示す。図１０Ｂは、上記三重特異性分子を、ＤＲ５発現ＣＨＯ細胞及び細胞毒性リンパ球の存在下でインキュベートした場合に得られるパーセント細胞毒性を示す。図１０Ｃは、上記三重特異性分子を、ＤＵ１４５ヒト前立腺細胞及び細胞毒性リンパ球の存在下でインキュベートした場合に得られる細胞毒性を示す。ＤＵ１４５細胞は、ＥｐｈＡ２及びＤＲ５を発現するもののｇｐＡ３３を発現しない。細胞毒性は、細胞溶解時のルシフェラーゼの放出によって引き起こされる発光の増加によって測定した。
【発明を実施するための形態】
【0063】
本発明は三重特異性結合分子に関し、これは、３つの結合ドメインを有することにより、３つのエピトープに対する協調的結合を仲介できる、多重鎖ポリペプチド分子である。上記三重特異性結合分子は好ましくは、上記三重特異性結合分子を：（１）第１の癌抗原のエピトープ、（２）第２の癌抗原のエピトープ、及び（３）免疫系エフェクタ細胞の表面上で発現する分子のエピトープに免疫特異的に結合できるようにし、これによって、癌抗原を発現する細胞に対して免疫系エフェクタ細胞を局在化でき、これにより、上記癌細胞の殺滅を促進する、結合ドメインを有することを特徴とする。
【0064】
本発明の三重特異性結合分子は、上述の抗体、例えばＤＲ５ ｍＡｂ １又はＤＲ５ ｍＡｂ ２のヒト化、キメラ又はイヌ化誘導体のエピトープ結合ドメインを含んでよい。
【0065】
Ｉ．一般的な技術及び一般的な定義本発明の実践は、そうでないことが示されていない限り、当該技術の範囲内の分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来技術を採用する。このような技術は：MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Third Edition (Sambrook et al. Eds., 2001) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY; OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS: METHODS AND APPLICATIONS (Methods in Molecular Biology), Herdewijn, P., Ed., Humana Press, Totowa, NJ; OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (Gait, M.J., Ed., 1984); METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Humana Press, Totowa, NJ; CELL BIOLOGY: A LABORATORY NOTEBOOK (Cellis, J.E., Ed., 1998) Academic Press, New York, NY; ANIMAL CELL CULTURE (Freshney, R.I., Ed., 1987); INTRODUCTION TO CELL AND TISSUE CULTURE (Mather, J.P. and Roberts, P.E., Eds., 1998) Plenum Press, New York, NY; CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES (Doyle, A. et al, Eds., 1993-8) John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.) New York, NY; WEIR' S HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY (Herzenberg, L.A. et al. Eds. 1997) Wiley-Blackwell Publishers, New York, NY; GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (Miller, J.M. et al. Eds., 1987) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, F.M. et al, Eds., 1987) Greene Pub. Associates, New York, NY; PCR: THE POLYMERASE CHAIN REACTION, (Mullis, K. et al, Eds., 1994) Birkhauser, Boston MA; CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (Coligan, J.E. et al, eds., 1991) John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (John Wiley and Sons, 1999) Hoboken, NJ; IMMUNOBIOLOGY 7 (Janeway, C.A. et al 2007) Garland Science, London, UK; Antibodies (P. Finch, 1997) Stride Publications, Devoran, UK; ANTIBODIES: A PRACTICAL APPROACH (D. Catty., ed., 1989) Oxford University Press, USA, New York NY); MONOCLONAL ANTIBODIES: A PRACTICAL APPROACH (Shepherd, P. et al Eds., 2000) Oxford University Press, USA, New York NY; USING ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL (Harlow, E. et al Eds., 1998) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; THE ANTIBODIES (Zanetti, M. et al Eds. 1995) Harwood Academic Publishers, London, UK); 及びDEVITA, HELLMAN, AND ROSENBERG'S CANCER: PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY, EIGHTH EDITION, DeVita, V. et al Eds. 2008, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA等の文献に十分に説明されている。
【0066】
ＩＩ．本発明の好ましい三重特異性結合分子Ａ．結合能力
本発明の好ましい三重特異性結合分子は、３つの異なるエピトープに協調的かつ同時に結合できる。本発明の好ましい三重特異性結合分子は：
（Ｉ）第１の抗原上に存在する「エピトープＩ」に免疫特異的に結合できる「結合ドメインＩ」及び第２の抗原上に存在する「エピトープＩＩ」に免疫特異的に結合できる「結合ドメインＩＩ」。ここで上記結合ドメインＩ及び上記結合ドメインＩＩは共に「ダイアボディタイプ結合ドメイン」である；
（ＩＩ）第３の抗原上に存在する「エピトープＩＩＩ」に免疫特異的に結合できる「結合ドメインＩＩＩ」；並びに
（ＩＩＩ）２つのＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを互いに複合体化することによって形成される、Ｆｃドメインを備え、
ここで、
（Ａ）エピトープＩ、エピトープＩＩ又はエピトープＩＩＩのうちの１つは、第１の「癌抗原」癌抗原であり；
（Ｂ）エピトープＩ、エピトープＩＩ又はエピトープＩＩＩのうちの第２のものは第２の癌抗原であり；
（Ｃ）エピトープＩ、エピトープＩＩ又はエピトープＩＩＩのうちの第３のものは免疫系エフェクタ細胞の表面上で発現する分子のエピトープ（「エフェクタ細胞抗原」）であり；
ここで、結合分子の結合ドメインＩ、ＩＩ及びＩＩＩは、免疫系エフェクタ細胞の協調的結合、並びに第１及び第２の癌抗原の両方を発現する細胞を仲介し、これによってこのような細胞を共局在化できる。
【0067】
ダイアボディエピトープ結合ドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３７、ＣＤ４０、及びＣＤ７４といったＢ細胞の表面決定子も対象としてよい（Moore, P.A. et al. (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma,” Blood 117(17):4542-4551; Cheson, B.D. et al. (2008) “Monoclonal Antibody Therapy For B-Cell Non-Hodgkin’s Lymphoma,” N. Engl. J. Med. 359(6):613-626; Castillo, J. et al. (2008) “Newer monoclonal antibodies for hematological malignancies,” Exp. Hematol. 36(7):755-768）。多数の研究において、エフェクタ細胞決定子、例えばＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）に結合するダイアボディもまた、エフェクタ細胞を活性化することが分かった（Holliger et al. (1996) “Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bi-specific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305; Holliger et al. (1999) “Carcinoembryonic Antigen (CEA)-Specific T-Cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bi-specific Diabodies And B7 x Anti-CEA Bi-specific Fusion Proteins,” Cancer Res. 59:2909-2916; 国際公開第２００６／１１３６６５号；国際公開第２００８／１５７３７９号；国際公開第２０１０／０８０５３８号；国際公開第２０１２／０１８６８号；国際公開第２０１２／１６２０６８号）。通常、エフェクタ細胞活性化は、抗原結合抗体に対する、Ｆｃ‐ＦｃγＲ相互作用を介したエフェクタ細胞の結合によってトリガされる。従ってこれに関して、ダイアボディ分子は、これらがＦｃドメインを備えるかどうかにかかわらず、（例えば当該技術分野において公知の、又は本明細書で例示された（例えばＡＤＣＣアッセイ）、いずれのエフェクタ機能アッセイにおいてアッセイされるような）Ｉｇ様機能性を示し得る。腫瘍とエフェクタ細胞とを架橋させることにより、上記ダイアボディは、腫瘍細胞の近傍にエフェクタ細胞をもたらすだけでなく、効果的な腫瘍殺滅をもたらす（例えば Cao et al. (2003) “Bi-specific Antibody Conjugates In Therapeutics,” Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-197を参照）。
【0068】
このような三重特異性結合分子が特に好ましいものの、本発明は更に、３つの結合特異性を有する分子の産生に十分な結合ドメインのいずれの組み合わせを備える三重特異性結合分子を、具体的に考察し、上記３つの結合特異性のうちの２つは癌抗原を指向する結合特異性であり、１つはエフェクタ細胞抗原を指向する結合特異性である。従って例えば本発明は：３つのＦａｂタイプ結合ドメインを備える三重特異性結合分子；（例えば２つの異なる軽鎖と２つの異なる重鎖とを複合体化することによって形成される）１つの２価の二重特異性抗体ドメイン及び１つのＦａｂタイプ結合ドメインを備える三重特異性結合分子；（例えば４つの異なる軽鎖と２つの異なる重鎖とを複合体化することによって形成される）２つの２価の二重特異性抗体ドメインを備えるものの、抗体ドメインのうちの一方は不活性となっている三重特異性結合分子等を考察する。
【0069】
用語「ポリペプチド」、「ポリペプチド鎖」、及び「ペプチド」は本明細書において相互交換可能に使用され、いずれの長さ特にアミノ酸残基３個、５個、１０個、２０個又は２５個超の長さのアミノ酸のポリマーを指すが、そのうち２つの、より好ましくは全てのアミノ酸残基は、アミド（ペプチド）結合（‐ＮＨ‐Ｃ（Ｏ）‐）を介して連結している。しかしながら、ポリマーは直鎖又は分岐であってよく、修飾アミノ酸を含んでよく、非アミノ酸によって中断されていてよい。これらの用語はまた、自然に、又は例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、若しくは標識化成分との複合体形成といった他のいずれの操作若しくは修飾の介入によって修飾された、アミノ酸ポリマーも包含する。またこの定義には、例えばアミノ酸の１つ又は複数の類似体（例えば非天然アミノ酸等を含む）及び当該技術分野で公知の他の修飾を含むポリペプチドも含まれる。本発明のポリペプチドは単鎖として、又は複合体化した複数の鎖として発生し得る。
【0070】
「ダイアボディタイプ結合ドメイン」は、ダイアボディ及び特にＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディのエピトープ結合ドメインである。用語「ダイアボディ」及び「ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディ」については上述されており、これらは、好ましくは共有結合的相互作用によって互いに複合体化して、同一の又は異なるエピトープを認識してよい少なくとも２つのエピトープ結合部位を形成する、少なくともとも２つのポリペプチド鎖を備える分子を指す。ダイアボディ又はＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディのポリペプチド鎖のうちの２つはそれぞれ、免疫グロブリン軽鎖可変領域及び免疫グロブリン重鎖可変領域を備えるが、これらの領域は、相互作用してエピトープ結合部位を形成することはない（即ちこれらの領域は相互に「相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」ではない）。寧ろ、ダイアボディ又はＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディの鎖のうちの一方（例えば第１のもの）の免疫グロブリン重鎖可変領域は、異なる（例えば第２の）ダイアボディ又はＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディのポリペプチド鎖の免疫グロブリン軽鎖可変領域と相互作用して、エピトープ結合部位を形成する。同様に、ダイアボディ又はＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディのポリペプチド鎖のうちの一方（例えば第１のもの）の免疫グロブリン軽鎖可変領域は、異なる（例えば第２の）ダイアボディ又はＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディのポリペプチド鎖の免疫グロブリン重鎖可変領域と相互作用して、エピトープ結合部位を形成する。ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディ分子は、特許文献６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、５２、５１、５０、４８、４９、及び非特許文献５６、５７、５８に開示されている。
【0071】
結合ドメインＩＩＩは好ましくは「非ダイアボディタイプ」結合ドメインであり、これは、結合ドメインＩＩＩがダイアボディタイプ結合ドメインの構造を有しないことを示すことを意図したものである。好ましくは、結合ドメインＩＩＩは、Ｆａｂタイプ結合ドメイン又はエフェクタ細胞受容体タイプ結合ドメインである、非ダイアボディタイプ結合ドメインである。従って、図４Ａ〜４Ｇに例示される一実施形態では、上記結合ドメインＩＩＩはＦａｂタイプ結合ドメインである。図５Ａ〜５Ｅは、結合ドメインＩＩＩがエフェクタ細胞受容体タイプ結合ドメインである実施形態を例示している。本明細書において使用される場合、用語「Ｆａｂタイプ結合ドメイン」は、免疫グロブリン軽鎖のＶＬドメインと免疫グロブリン重鎖の相補的なＶＨドメインとの相互作用によって形成された、エピトープ結合ドメインを指す。Ｆａｂタイプ結合ドメインは、Ｆａｂタイプ結合ドメインを形成する２つのポリペプチド鎖が単一のエピトープ結合ドメインしか備えない一方で、ダイアボディタイプ結合ドメインを形成する２つのポリペプチド鎖が少なくとも２つのエピトープ結合ドメインを備えるという点で、ダイアボディタイプ結合ドメインとは異なる。従って本明細書において使用される場合、Ｆａｂタイプ結合ドメインは、ダイアボディタイプ結合ドメインとは区別される。結合ドメインがＦａｂタイプ結合ドメイン又はダイアボディタイプ結合ドメインである場合、上記結合ドメインは、同一のポリペプチド鎖上に位置しても異なるポリペプチド鎖上に位置してもよいＶＬドメイン及びＶＨドメインからなる。上記ＶＬ及びＶＨドメインの選択は、上記ドメインがエピトープ結合ドメインを形成するように調整される。本明細書において使用される場合、用語「エフェクタ細胞受容体タイプ結合ドメイン」は、Ｔ細胞受容体アルファ鎖の可変ドメインと、Ｔ細胞受容体ベータ鎖の可変ドメインとの相互作用によって形成される、エピトープ結合ドメインを指す。このような受容体は、ＭＨＣのコンテクストにおいて発現されるペプチドを認識し、従って細胞内エピトープを認識できる。
【0072】
よって、本発明の三重特異性結合分子は、２価抗体の二量体化から産生されるもの等の４価結合分子とは区別され、好ましくは４つではなく３つの結合ドメインを有する。以下において議論するように、本発明の三重特異性分子は、更なる結合ドメイン（アルブミン結合ドメイン、ＦｃγＲ結合ドメイン等）を有してよい。このような追加の結合ドメインは、本発明の三重特異性結合分子の３つの結合ドメインのうちの１つとして考慮又は計数されることを意図したものではない。
【0073】
本明細書において使用される場合、ポリペプチド（例えばあるダイアボディポリペプチドを別のものに対して、免疫グロブリン軽鎖を免疫グロブリン重鎖に対して、あるＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを別のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに対して等）に関する用語「連結（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）」又は「連結する（ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ）」は、ポリペプチドの非共有結合を表すことを意図したものである。用語「複合体（ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）」又は「複合体化する（ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇ）」は、ポリペプチドの共有結合を表すことを意図したものである。
【0074】
本明細書において使用される場合、本発明の結合分子の結合ドメインは、その結合ドメインのうちの少なくとも２つ、好ましくはその結合ドメインのうちの全てが、それぞれの認識されたエピトープ又は結合リガンドに同時に結合できる場合、「協調的結合（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ ｂｉｎｄｉｎｇ）」を仲介する、と言い表される。このような結合は同時であってよい。しかしながら、本発明の一態様は、このような結合ドメインがその認識されたエピトープに結合する「オン」及び／又は「オフ」速度を修正するステップに関する。本明細書において使用される場合、結合の「オン速度（ｏｎ ｒａｔｅ）」は、このような結合ドメインがエピトープを認識して、認識されたエピトープへの結合を開始する際の親和性の尺度である。対照的に、結合の「オフ速度（ｏｆｆ ｒａｔｅ）」は結合ドメイン：エピトープ複合体の安定性の度合いの尺度である。結合の「オン」及び／又は「オフ」速度は、結合ドメインのＣＤＲのアミノ酸配列を変化させることによって修正できる。以下において議論するように、いずれのＣＤＲ修飾とは独立して、本発明の分子の協調的結合の程度は、その結合ドメインの構成を、ある特定の結合ドメイン（即ちＶＬｘ／ＶＨｘドメイン）が結合ドメインＩＩＩとして又は結合ドメインＩＩＩに対する内部若しくは外部ダイアボディタイプ結合ドメイン（以下において詳細に議論する）として存在するように変化させることによって、変調できる。
【0075】
本発明の結合分子の結合ドメインのオン及びオフ速度は、当該技術分野において公知の方法によって、例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）分析によって、容易に測定できる（Jason-Moller, L. et al. (2006) "Overview Of Biacore Systems And Their Applications " Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 19:Unit 19.13; Swanson, S.J. (2005) "Characterization Of An Immune Response " Dev. Biol. (Basel). 122:95-101; Buijs, J. et al. (2005) "SPR-MS In Functional Proteomics," Brief Funct. Genomic Proteomic. 4(l):39-47; Karlsson, R. et al. (2004) "SPR For Molecular Interaction Analysis: A Review Of Emerging Application Areas," J. Mol. Recognit. 17(3): 151 -161 ; Van Regenmortel, M.H. (2003) "Improving The Quality Of BIACORE-Based Affinity Measurements ," Dev. Biol. (Basel) 112: 141-151; Malmqvist, M. (1999) "BIACORE: An Affinity Biosensor System For Characterization Of Biomolecular Interactions " Biochem. Soc. Trans. 27(2):335-340; Malmqvist, M. et al. (1997) "Biomolecular Interaction Analysis: Affinity Biosensor Technologies For Functional Analysis Of Proteins," Curr. Opin. Chem. Biol. l(3):378-383; Fivash, M. et al. (1998) "Biacore For Macromolecular Interaction," Curr. Opin. Biotechnol. 9(1):97-101; Malmborg, A.C. et al. (1995) "Biacore As A Tool In Antibody Engineering," J. Immunol. Methods. 183(1):7-13）。本発明の結合分子の結合ドメインのオン及びオフ速度は、このような結合ドメインをエンコードする核酸分子のランダム又は指向性突然変異誘発と、それに続く、回収した核酸分子の、このような変化した結合キネティクスを示す突然変異タンパク質をエンコードする能力に関する通常のスクリーニングとによって、容易に変化させることができる。
【0076】
本発明の三重特異性結合分子の結合ドメインは、エピトープに、「免疫特異的な」様式で結合する。本明細書において使用される場合、抗体、ダイアボディ又は他のエピトープ結合分子は、代替的なエピトープに比べて、より頻繁に、より迅速に、より長期間、及び／又はより高い親和性で当該エピトープと反応又は連結する場合、別の分子のある領域（即ちエピトープ）に「免疫特異的に」結合する、と言い表される。例えば、あるウイルスエピトープに免疫特異的に結合する抗体は、他のウイルスエピトープ又は非ウイルスエピトープに免疫特異的に結合するよりも、より高い親和性、結合活性で、より容易に、及び／又はより長い期間、当該ウイルスエピトープに結合する抗体である。この定義を読めば、例えば第１の標的に免疫特異的に結合する抗体（又は部分若しくはエピトープ）は、第２の標的に特異的又は優先的に結合してもしなくてもよいことも理解される。従って「特異的結合（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、排他的結合を必ずしも必要としない（ただし含むことはできる）。一般に、ただし必ずしもそうではないが、結合に関する言及は「特異的」結合を意味する。２つの分子は、これらの結合が、これら２つの分子それぞれのリガンドに受容体が結合する特異性を呈する場合に、「生理学的に特異的な（ｐｈｙｓｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）」様式で互いに結合できると言い表される。
【0077】
抗体の機能性は、２つの別個の異なる抗原 (若しくは同一の抗原の異なるエピトープ)に同時に結合できる多重特異性抗体ベースの分子を生成することにより、並びに／又は同一のエピトープ及び／若しくは抗原に関してより高い価（即ち３つ以上の結合部位）を有する抗体ベースの分子を生成することにより、増強できる。
【0078】
従って、本発明の好ましい結合分子は、その最も単純な実施形態において、少なくとも三重特異性である。重要なことに、このような分子は、抗原に結合できる少なくとも３つの「部位」：結合ドメインＩＩＩから最も離れて位置している「外部」ダイアボディタイプ結合ドメイン、結合ドメインＩＩＩに最も近接して位置している「内部」ダイアボディタイプ結合ドメイン、及び結合ドメインＩＩＩ自体を有する。このようなドメインの位置はそれぞれ、部位Ａ、部位Ｂ及び部位Ｃとして表される（図４Ａ〜４Ｇ、図５Ａ〜５Ｅ）。
【0079】
本発明の三重特異性結合分子は、３つの結合ドメインを備えることにより、３つの異なるエピトープに共有結合できる。上記分子の結合ドメインのうちの２つは、「癌抗原」のエピトープに結合でき、これにより上記分子は、２つの異なる癌抗原に結合できる。上記分子の第３の結合ドメインは、免疫系エフェクタ細胞の表面上で発現する分子（即ち「エフェクタ細胞抗原」）のエピトープに結合できる。従って本発明の三重特異性結合分子は、２つの癌抗原を発現する癌細胞、及びエフェクタ細胞抗原を発現する免疫系エフェクタ細胞に対する、協調的かつ同時の結合を仲介できる。本発明の三重特異性結合分子が認識するエピトープは、連続又は不連続（例えば立体配座）であってよい。
【0080】
本発明の三重特異結合分子の癌抗原結合ドメインが結合する第１及び第２の癌抗原は、癌細胞の表面に特徴的に存在するいずれの分子から選択してよい。本発明の一態様は、「低発現癌抗原」（即ち、癌細胞上において、単一特異性結合分子が効果的な癌治療を提供できるようにするためには低過ぎるレベルで発現し得る、癌抗原）を標的化する能力に関する。上述のような単一特異性結合分子とは対照的に、本発明の三重特異性結合分子は、１つではなく２つの癌抗原を標的化することにより、相乗的かつ協調的に増強された結合活性を示し、これは低い結合親和性を補償でき、従って低発現癌抗原を特徴とする癌でさえも標的化するために有利に使用できる。本発明の第２の態様は、「低特異性癌抗原」（即ち、癌細胞上で発現するのに加えて正常な細胞上で発現し得る、癌抗原）を標的化する能力に関する。本発明の三重特異性結合分子は、２つの癌抗原に対する相乗的かつ協調的に増強された結合活性により、低特異性癌抗原に対してさえも、比較的高い結合活性を示し、従ってこのような癌抗原を特徴とする癌の治療のための手段を提供する。よって本発明の三重特異性結合分子を使用して、標的癌抗原のうちの一方又は両方が、それ自体では上述のような治療を提供するにあたって効果的でない状況においてさえ、抗癌治療を与えることができる。
【0081】
例えば、ＣＤ３２Ｂ（ＦｃγＲＩＩＢ受容体）は、単球、マクロファージ、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、好中球、肥満細胞及び血小板を含む造血細胞上で幅広く発現する。ＩｇＧ Ｆｃドメインに結合すると、ＣＤ３２Ｂは宿主免疫系を阻害することによって、進行中の免疫応答を抑制する。このような阻害は、宿主が炎症応答から回復するのを補助するにあたって望ましいものの、癌又は感染症疾患を罹患した宿主の免疫不全を悪化させる役割を果たす。ＣＤ３２Ｂに結合してＩｇＧ Ｆｃ分子の結合をブロックする抗体は、上述のような阻害の防止に役立ち、従って、癌及び感染症疾患の治療における補助分子としての用途を有する（Veri, M.C. et al. (2007) “Monoclonal Antibodies Capable Of Discriminating The Human Inhibitory Fcgamma‐Receptor IIB (CD32B) From The Activating Fcgamma‐Receptor IIA (CD32A): Biochemical, Biological And Functional Characterization,” Immunology 121(3):392‐404）。残念なことに、ＣＤ３２Ｂは、肝類洞内皮細胞（「ＬＳＥ細胞」）上でも発現する（Shahani, T. et al. (2014) “Human Liver Sinusoidal Endothelial Cells But Not Hepatocytes Contain Factor VIII,” J. Thromb. Haemost. 12(1):36‐42; Geraud, C. et al. (2013) “Endothelial Transdifferentiation In Hepatocellular Carcinoma: Loss Of Stabilin‐2 Expression In Peri‐Tumourous Liver Correlates With Increased Survival,” Liver Int. 33(9):1428‐1440; Takabe, Y. et al. (2012) “Immunomagnetic Exclusion Of E‐Cadherin‐Positive Hepatoblasts In Fetal Mouse Liver Cell Cultures Impairs Morphogenesis And Gene Expression Of Sinusoidal Endothelial Cells,” J. Anat. 221(3):229‐239）。従って、ＣＤ３２Ｂに結合する抗体は、ＬＳＥ細胞を攻撃する。しかしながら、ＣＤ３２Ｂと、ＬＳＥ細胞上で発現しない抗原（即ち第１及び第２の癌抗原）、又は上記細胞が低レベルで発現する抗原（即ち１つ若しくは複数の低発現癌抗原）、又は癌細胞及び上記ＬＳＥ細胞上において低い特異性で発現する抗原（即ち１つ若しくは複数の低特異性癌抗原）とに結合する、本発明の三重特異性結合分子を形成することによって、本発明は、ＣＤ３２Ｂに仲介免疫系阻害を抑制するために使用される組成物及び方法を提供する。
【0082】
Ｂ．例示的な癌抗原結合ドメイン好適な癌抗原の例としては：結腸癌、胃癌ムチンにおいて確認される１９．９；４．２； Ａ３３（結腸直腸癌抗原；Almqvist, Y. 2006, Nucl Med Biol. Nov;33(8):991-998）；ＡＤＡＭ‐９（米国公開特許第２００６／０１７２３５０号；国際公開第０６／０８４０７５号）；胃癌において確認されるＡＨ６；ＡＬＣＡＭ（国際公開第０３／０９３４４３号）；ＡＰＯ‐１（悪性ヒトリンパ球抗原）(Trauth et al.(1989) “Monoclonal Antibody-Mediated Tumor Regression By Induction Of Apoptosis,” Science245:301-304);Ｂｌ（Egloff, A.M. et al. 2006, Cancer Res. 66(l):6-9）；ＢＡＧＥ（Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84）；Ｂ７‐Ｈ３；ベータ‐カテニン（Prange W. et al. 2003 J Pathol. 201(2):250-9）；結腸腺癌において確認される血液型ＡＬｅb／ＡＬｅy；結腸腺癌において確認されるバーキットリンパ腫抗原‐３８．１３、Ｃ１４；ＣＡ１２５（卵巣癌抗原）（Bast, R.C. Jr. et al. 2005 Int J Gynecol Cancer 15 Suppl 3:274-81; Yu et al.(1991) “Coexpression Of Different Antigenic Markers On Moieties That Bear CA 125 Determinants,” Cancer Res.51(2):468-475）；カルボキシペプチダーゼＭ（米国公開特許第２００６／０１６６２９１号）；ＣＤ５（Calin, G.A. et al. 2006 Semin Oncol. 33(2): 167-73）；ＣＤ１９（Ghetie et al. (1994) “Anti-CD19 Inhibits The Growth Of Human B-Cell Tumor Lines In Vitro And Of Daudi Cells In SCID Mice By Inducing Cell Cycle Arrest,” Blood 83:1329-1336; Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4): 139-48）；ＣＤ２０（Thomas, D.A. et al. 2006 Hematol Oncol Clin North Am. 20(5): 1125-36）；ＣＤ２２（Kreitman, R.J. 2006 AAPS J. 18;8(3):E532-51）；ＣＤ２３（Rosati, S. et al. 2005 Curr Top Microbiol Immunol. 5;294:91-107）；ＣＤ２５（Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4): 139-48）；ＣＤ２７（Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9): 1234-40）；ＣＤ２８（Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9): 1234-40）；ＣＤ３３（Sgouros et al.(1993) “Modeling And Dosimetry Of Monoclonal Antibody M195 (Anti-CD33) In Acute Myelogenous Leukemia,” J. Nucl. 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(1993) “Effect Of Monoclonal Antibody 17-1A And GM-CSF In Patients With Advanced Colorectal Carcinoma - Long-Lasting, Complete Remissions Can Be Induced,” Int. J. Cancer53:751-758）；ＣＯ‐４３（血液型Ｌｅb）；腺癌において確認されるＣＯ‐５１４（血液型Ｌｅa）；ＣＴＡ‐１：ＣＴＬＡ‐４（Peggs, K.S. et al. 2006 Curr Opin Immunol. 18(2):206-13）；サイトケラチン８（国際公開第０３／０２４１９１号）；Ｄｌ．ｌ；Ｄ1５６‐２２；ＤＲ５（Abdulghani, J. et al. (2010) "TRAIL Receptor Signaling And Therapeutics," Expert Opin. Ther. Targets 14(10): 1091-1108; Andera, L. (2009) "Signaling Activated By The Death Receptors Of The TNFR Family," Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech. Repub. 153(3): 173-180; Carlo-Stella, C. et al. (2007) "Targeting TRAIL Agonistic Receptors for Cancer Therapy," Clin, Cancer 13(8):2313-2317; Chaudhari, B.R. et al. 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(1990) "The Melanoma Antigen Gp75 Is The Human Homologue Of The Mouse B (Brown) Locus Gene Product, " J. Exp. Med. 171(4): 1375-1380）；ｇｐＡ３３；ＨＥＲ２抗原（ｐ１８５HER2）（Kumar, Pal S et al. 2006 Semin Oncol. 33(4):386-91）；ヒトＢリンパ腫抗原ＣＤ２０（Reff et al. (1994) "Depletion Of B Cells In Vivo By A Chimeric Mouse Human Monoclonal Antibody To CD20, " Blood 83:435-445）；ヒト乳脂肪小球抗原；ヒトパピローマウイルスＥ６／ヒトパピローマウイルスＥ７（DiMaio, D. et al. 2006 Adv Virus Res. 66: 125-59；ＨＭＷ‐ＭＡＡ（高分子量黒色腫抗原）（Natali et al. (1987) "Immunohistochemical Detection Of Antigen In Human Primary And Metastatic Melanomas By The Monoclonal Antibody 140.240 And Its Possible Prognostic Significance, " Cancer 59:55-63；Mittelman et al. (1990) "Active Specific Immunotherapy In Patients With Melanoma. A Clinical Trial With Mouse Antiidiotypic Monoclonal Antibodies Elicited With Syngeneic Anti-High-Molecular-Weight-Melanoma-Associated Antigen Monoclonal Antibodies, " J. Clin. Invest. 86:2136-2144）；胃腺癌中に見つかるＩ（Ｍａ）等のＩ抗原（分化抗原）（Feizi (1985) "Demonstration By Monoclonal Antibodies That Carbohydrate Structures Of Glycoproteins And Glycolipids Are Onco-Developmental Antigens, " Nature 314:53-57）；インテグリンα‐Ｖ‐ベータ‐６（国際公開第０３／０８７３４０号）；ＪＡＭ‐３（国際公開第０６／０８４０７８号）；ＫＩＤ３（国際公開第０５／０２８４９８号）；ＫＩＤ３１（国際公開第０６／０７６５８４号）；ＫＳ１／４汎癌抗原（Perez et al. (1989) "Isolation And Characterization Of A cDNA Encoding The Ksl/4 Epithelial Carcinoma Marker, " J. Immunol. 142:3662-3667；Moller et al. (1991) "Bispecific-Monoclonal-Antibody-Directed Lysis Of Ovarian Carcinoma Cells By Activated Human T Lymphocytes, " Cancer Immunol. Immunother. 33(4):210-216；Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123: 157-80）； Ｌ６及びＬ２０（ヒト肺癌抗原）（Hellstrom et al. (1986) "Monoclonal Mouse Antibodies Raised Against Human Lung Carcinoma, " Cancer Res. 46:3917-3923）；ＬＥＡ；ＬＵＣＡ‐２（米国公開特許第２００６／０１７２３４９号；国際公開第０６／０８３８５２号）；Ｍｌ：２２：２５：８；Ｍ１８；Ｍ３９；ＭＡＧＥ（ＭＡＧＥ‐１；ＭＡＧＥ‐３）（Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84）；ＭＡＲＴ（Kounalakis, N. et al. 2005 Curr Oncol Rep. 7(5):377-82）；ＭＵＣ‐１（Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46）；ＭＵＭ‐１（Castelli, C. et al. 2000 J Cell Physiol. 182(3):323-31）；Ｎ‐アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Dennis, J.W. 1999 Biochim Biophys Acta. 6;1473(l):21-34）；ネオ糖タンパク質；腺癌において確認されるＮＳ‐１０；ＯＦＡ‐１；ＯＦＡ‐２；オンコスタチンＭ（オンコスタチン受容体ベータ）（米国特許第７，５７２，８９６号；国際公開第０６／０８４０９２号）；ｐｌ５（Gil, J. et al. 2006 Nat Rev Mol Cell Biol. 7(9):667-77）；ｐ９７（黒色腫関連抗原）（Estin et al. (1989) “Transfected Mouse Melanoma Lines That Express Various Levels Of Human Melanoma-Associated Antigen p97,” J. Natl. Cancer Instit.81(6):445-454）；ＰＥＭ（多型性上皮ムチン）（Hilkens et al. (1992) “Cell Membrane-Associated Mucins And Their Adhesion-Modulating Property,” Trends in Biochem. Sci. 17:359-363）；ＰＥＭＡ（多型性上皮ムチン抗原)；ＰＩＰＡ（米国特許第７，４０５，０６１号；国際公開第０４／０４３２３９号）；ＰＳＡ（前立腺特異性抗原）（Henttu et al. (1989) “cDNA Coding For The Entire Human Prostate Specific Antigen Shows High Homologies To The Human Tissue Kallikrein Genes,” Biochem. Biophys. Res. Comm.10(2):903-910; Israeli et al.(1993) “Molecular Cloning Of A Complementary DNA Encoding A Prostate-Specific Membrane Antigen,” Cancer Res.53:227-230; Cracco, C.M. et al. 2005 Minerva Urol Nefrol. 57(4):301-11）；ＰＳＭＡ（前立腺特異性膜抗原）（Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123: 157-180）；前立腺酸性ホスファターゼ（Tailor et al. (1990) "Nucleotide Sequence Of Human Prostatic Acid Phosphatase Determined From A Full-Length cDNA Clone, " Nucl. Acids Res. 18(16):4928）；黒色腫において確認されるＲ24；ＲＯＲ１（米国特許第５，８４３，７４９号）；スフィンゴ脂質；ＳＳＥＡ‐１；ＳＳＥＡ‐３；ＳＳＥＡ‐４；ｓＴｎ（Holmberg, L.A. 2001 Ex
pert Opin Biol Ther. 1(5):881-91）；皮膚Ｔ細胞リンパ腫からのＴ細胞受容体由来ペプチド（Edelson (1998) "Cutaneous T-Cell Lymphoma: A Model For Selective Immunotherapy, " Cancer J Sci Am. 4:62-71を参照）；骨髄細胞において確認されるＴ5Ａ7；ＴＡＧ‐７２（Yokota et al. (1992) "Rapid Tumor Penetration Of A Single-Chain Fv And Comparison With Other Immunoglobulin Forms, " Cancer Res. 52:3402-3408）；ＴＬ５（血液型Ａ）；ＴＮＦ受容体（ＴＮＦ‐α受容体、ＴＮＦ‐β受容体；ＴＮＦ‐γ受容体）（van Horssen, R. et al. 2006 Oncologist. 11(4):397-408；Gardnerova, M. et al. 2000 Curr Drug Targets. l(4):327-64）；ＴＲＡ‐１‐８５（血液型Ｈ）；トランスフェリン受容体（米国特許第７，５７２，８９５号；国際公開第０５／１２１１７９号）；ＤＮＡ腫瘍ウイルスのＴ抗原及びＲＮＡ腫瘍ウイルスのエンベロープを含む抗原ウイルス誘発型腫瘍抗原や、結腸、膀胱腫瘍胎児抗原のＣＥＡといった癌胎児抗原‐アルファ‐フェトプロテイン等の、胚性癌細胞において確認されるＴＳＴＡ腫瘍特異性移植抗原（Hellstrom et al. (1985) "Monoclonal Antibodies To Cell Surface Antigens Shared By Chemically Induced Mouse Bladder Carcinomas, " Cancer. Res. 45 :2210-2188）；ＶＥＧＦ受容体（O’Dwyer. P.J. 2006 Oncologist. 11(9):992-998）；ＶＥＰ８；ＶＥＰ９；ＶＩＭ‐Ｄ５；並びに胚性癌細胞において確認されるＹヘプタン、Ｌｅyが挙げられる。
【0083】
１．Ｃａｍｐａｔｈ‐１（ＣＤ５２）結合ドメイン（アレムツズマブ）ヒト化抗ＣＤ５２抗体「アレムツズマブ」のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２０５）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQNID KYLNWYQQKP GKAPKLLIYN
TNNLQTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYYCLQ HISRPRTFGQ
GTKVEIKR
【0084】
ヒト化抗ＣＤ５２抗体「アレムツズマブ」のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２０６）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：QVQLQESGPG LVRPSQTLSL TCTVSGFTFT DFYMNWVRQP PGRGLEWIGF
IRDKAKGYTT EYNPSVKGRV TMLVDTSKNQ FSLRLSSVTA ADTAVYYCAR
EGHTAAPFDYWGQGSLVTVS S
【0085】
２．ＣＤ３１７（ＢＭＳＴ２）結合ドメインＣＤ３１７（骨髄間質細胞抗原２；ＢＭＳＴとしても知られる）は、乳房、肺、腎臓、子宮内膜及び皮膚から単離された様々な癌細胞上で過剰発現する（Kawai, S. et al. (2008) “Interferon‐α enhances CD317 expression and the antitumor activity of anti‐CD317 monoclonal antibody in renal cell carcinoma xenograft models,” Cancer Science 99(12):2461‐2466; Cai, D. et al. (2009) “Up‐Regulation Of Bone Marrow Stromal Protein 2 (BST2) In Breast Cancer With Bone Metastasis,” BMC Cancer 9:102, pp. 1‐10; Wang, W. et al. (2009) HM1.24 (CD317) Is A Novel Target Against Lung Cancer For Immunotherapy Using Anti‐HM1.24 Antibody,” Cancer Immunology, Immunotherapy 58(6):967‐976; Wang, W. et al. (2009) “Chimeric And Humanized Anti‐HM1.24 Antibodies Mediate Antibody‐Dependent Cellular Cytotoxicity Against Lung Cancer Cells. Lung Cancer,” 63(1):23‐31; Sayeed, A. et al. (2013) “Aberrant Regulation Of The BST2 (Tetherin) Promoter Enhances Cell Proliferation And Apoptosis Evasion In High Grade Breast Cancer Cells,” PLoS ONE 8(6)e67191, pp. 1‐10; Yi, E.H. et al. (2013) “BST‐2 Is A Potential Activator Of Invasion And Migration In Tamoxifen‐Resistant Breast Cancer Cells,” Biochem. Biophys. Res. Commun. 435(4):685‐690; Staudinger, M. (2014) “The Novel Immunotoxin HM1.24‐ETA' Induces Apoptosis In Multiple Myeloma Cells,” Blood Cancer J. 13;4:e219, pp. 1‐11）。ＣＤ３１７に免疫特異的に結合する抗体は市販されている（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＬＬＣ；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ， Ｉｎｃ．；ＦＥＲＭ ＢＰ‐５６４４及びＦＥＲＭ ＢＰ‐５６４６としての抗体ＨＭ１．２４の重鎖及び軽鎖の寄託に言及した米国特許第８，８３４，８７６号も参照；米国特許第８，３９４，３７４号も参照）。抗ＣＤ３１７抗体「ＨＭ１．２４」のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号３０２）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKKASQDV NTAVAWYQQK PGQSPKLLIY
SASNRYTGVP DRITGSGSGT DFTFTISSVQ AEDLALTTCQ QHYSTPFTFG
SGTKLEIK
【0086】
抗ＣＤ３１７抗体「ＨＭ１．２４」のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号３０３）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：QVQLQQSGAE LARPGASVKL SCKASGYTFT PYWMQWVKQR PGQGLEWIGS
IFPGDGDTRY SQKFKGKATL TADKSSSTAY MQLSILAFED SAVYYCARGL
RRGGYYFDYW GQGTTLTVSS
【0087】
３．ＣＥＡＣＡＭ５‐及びＣＥＡＣＡＭ６‐結合ドメイン癌胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）及び６（ＣＥＡＣＡＭ６）は、甲状腺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、肝細胞癌、胃癌、肺癌、頭頸部癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮体癌、乳癌、造血癌、白血病及び卵巣癌（国際公開第２０１１／０３４６６０号）、並びに特に、結腸直腸癌、胃腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬ）、乳癌、甲状腺癌、胃癌、卵巣癌及び子宮癌腫（Zheng, C. et al. (2011) “A Novel Anti‐CEACAM5 Monoclonal Antibody, CC4, Suppresses Colorectal Tumor Growth and Enhances NK Cells‐Mediated Tumor Immunity,” PLoS One 6(6):e21146, pp. 1‐11）を含む様々なタイプの癌に関連していることが分かっている。
【0088】
ＣＥＡＣＡＭ５は、胃腸癌、結腸直腸癌及び膵臓癌の９０％、非小細胞肺癌細胞の７０％並びに乳癌の５０％において過剰発現することが分かっている（Thompson, J.A. et al. (1991) “Carcinoembryonic Antigen Gene Family: Molecular Biology And Clinical Perspectives,” J. Clin. Lab. Anal. 5:344‐366）。
【0089】
過剰発現した癌胎児性抗原関連細胞接着分子６（ＣＥＡＣＡＭ６）は、甲状腺髄様癌、結腸直腸癌、膵臓癌、肝細胞癌、胃癌、肺癌、頭頸部癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮体癌、乳癌、造血癌、白血病及び卵巣癌を含む多様なヒト癌の侵襲及び転位において重要な役割を果たす（国際公開第２０１１／０３４６６０号；Deng, X. et al. (2014) “Expression Profiling Of CEACAM6 Associated With The Tumorigenesis And Progression In Gastric Adenocarcinoma,” Genet. Mol. Res. 13(3):7686‐7697; Cameron, S. et al. (2012) “Focal Overexpression Of CEACAM6 Contributes To Enhanced Tumourigenesis In Head And Neck Cancer Via Suppression Of Apoptosis,” Mol. Cancer 11:74, pp. 1‐11; Chapin, C. et al. (2012) “Distribution And Surfactant Association Of Carcinoembryonic Cell Adhesion Molecule 6 In Human Lung,” Amer. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 302(2):L216‐L25; Riley, C.J. et al. (2009) “Design And Activity Of A Murine And Humanized Anti‐CEACAM6 Single‐Chain Variable Fragment In The Treatment Of Pancreatic Cancer,” Cancer Res. 69(5):1933‐1940; Lewis‐Wambi, J.S. et al. (2008) “Overexpression Of CEACAM6 Promotes Migration And Invasion Of Oestrogen‐Deprived Breast Cancer Cells,” Eur. J. Cancer 44(12):1770‐1779; Blumenthal, R.D. et al. (2007) “Expression Patterns Of CEACAM5 And CEACAM6 In Primary And Metastatic Cancers,” BMC Cancer. 7:2, pp. 1‐15）。ＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６に免疫特異的に結合する抗体は市販されている（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．， Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＬＬＣ；Ａｂｎｏｖａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。ヒト化抗ＣＥＡＣＡＭ５／抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体１６Ｃ３（欧州特許第２５８５４７６号）のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号３０４）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCGASENIY GALNWYQRKP GKSPKLLIWG
ASNLADGMPS RFSGSGSGRQ YTLTISSLQP EDVATYYCQN VLSSPYTFGG
GTKLEIK
【0090】
ヒト化抗ＣＥＡＣＡＭ５／抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体１６Ｃ３（欧州特許第２５８５４７６号）のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号３０５）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：QVQLQQSGPE VVRPGVSVKI SCKGSGYTFT DYAMHWVKQS HAKSLEWIGL
ISTYSGDTKY NQNFKGKATM TVDKSASTAY MELSSLRSED TAVYYCARGD
YSGSRYWFAYWGQGTLVTVS S
【0091】
ヒト化抗ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６抗体ｈＭＮ１５（国際公開第２０１１／０３４６６０号）のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号３０６）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：DIQLTQSPSS LSASVGDRVT MTCSASSRVS YIHWYQQKPG KAPKRWIYGT
STLASGVPAR FSGSGSGTDF TFTISSLQPE DIATYYCQQW SYNPPTFGQG
TKVEIKR
【0092】
ヒト化抗ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６抗体ｈＭＮ１５（国際公開第２０１１／０３４６６０号）のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号３０７）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCSSSGFALT DYYMSWVRQA PGKGLEWLGF
IANKANGHTT DYSPSVKGRF TISRDNSKNT LFLQMDSLRP EDTGVYFCAR
DMGIRWNFDVWGQGTPVTVS S
【0093】
４．ＤＲ５結合ドメインＤＲ５は、本発明の好ましい癌抗原である。本発明の好ましい抗ヒトＤＲ５結合分子は、マウス抗ヒトＤＲ５モノクローナル抗体「ＤＲ５ ｍＡｂ １」及び／又は「ＤＲ５ ｍＡｂ ２」のＶＬ及び／又はＶＨドメインを有し、より好ましくは、上記抗ヒトＤＲ５モノクローナル抗体のＶＬドメインのＣＤＲのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを有する。あるいは、いずれの抗ヒトＤＲ５モノクローナル抗体、特にドロジツマブ（本明細書では「ＤＲ５ ｍＡｂ ３」と称する）、コナツムマブ（本明細書では「ＤＲ５ ｍＡｂ ４」と称する）、チガツズマブ（本明細書では「ＤＲ５ ｍＡｂ ５」と称する）、ＬＢＹ１３５‐１（本明細書では「ＤＲ５ ｍＡｂ ６」と称する）、ＬＢＹ１３５‐２（本明細書では「ＤＲ５ ｍＡｂ ７」と称する）及びＫＭＴＲ２（本明細書では「ＤＲ５ ｍＡｂ ８」と称する）を採用してよい。
【0094】
ａ．抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５ ｍＡｂ １ＤＲ５は、広範な癌（例えば結腸直腸癌、肝細胞癌、神経膠腫、腎臓癌、乳癌、多発性骨髄腫、膀胱癌、神経芽細胞腫、肉腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、膵臓癌及び直腸癌）の治療において潜在的に利用できる。ヒトＤＲ５前駆体（ＮＣＢＩ配列ＮＰ＿００３８３３．４）のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２）：
MEQRGQNAPA ASGARKRHGP GPREARGARP GLRVPKTLVL VVAAVLLLVS
AESALITQQD LAPQQRVAPQ QKRSSPSEGL CPPGHHISED GRDCISCKYG
QDYSTHWNDL LFCLRCTRCD SGEVELSPCT TTRNTVCQCE EGTFREEDSP
EMCRKCRTGC PRGMVKVGDC TPWSDIECVH KESGTKHSGE APAVEETVTS
SPGTPASPCS LSGIIIGVTV AAVVLIVAVF VCKSLLWKKV LPYLKGICSG
GGGDPERVDR SSQRPGAEDN VLNEIVSILQ PTQVPEQEME VQEPAEPTGV
NMLSPGESEH LLEPAEAERS QRRRLLVPAN EGDPTETLRQ CFDDFADLVP
FDSWEPLMRK LGLMDNEIKV AKAEAAGHRD TLYTMLIKWV NKTGRDASVH
TLLDALETLG ERLAKQKIED HLLSSGKFMY LEGNADSAMS
【0095】
ＤＲ５ ｍＡｂ １ のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号３）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS SSGYSYMHWY QQKPGQPPKV
LIFLSSNLDS GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEDGDAATY YCQHSRDLPP
TFGGGTKLEI K
ＤＲ５ ｍＡｂ １のＣＤＲL１（配列番号４）：RASKSVSSSGYSYMH
ＤＲ５ ｍＡｂ １のＣＤＲL２（配列番号５）：LSSNLDS
ＤＲ５ ｍＡｂ １のＣＤＲL３（配列番号６）：QHSRDLPPT
【0096】
ＤＲ５ ｍＡｂ １のＶＬドメインは好ましくは、以下に示す配列を有するポリヌクレオチド（配列番号７）によってエンコードされる（ＣＤＲをエンコードするポリヌクレオチドは、下線部を付して示す）：gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctcgggca
gagggccacc atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt tcctctggct
atagttatat gcactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaagtc
ctcatctttc tttcatccaa cctagattct ggggtccctg ccaggttcag
tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg
atggggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga tcttcctccg
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa
【0097】
ＤＲ５ ｍＡｂ １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号８）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）。Ｃ末端アミノ酸をアラニンで置換することにより、このＶＨドメインのサブクローニングを促進してよい：EVKFLESGGG LVQPGGSLKL SCVASGFDFS RYWMSWVRQA PGKGLEWIGE
INPDSNTINY TPSLKDKFII SRDNAKNTLY LQMTKVRSED TALYYCTRRA
YYGNPAWFAY WGQGTLVTVSS
ＤＲ５ ｍＡｂ １のＣＤＲH１（配列番号９）：GFDFSRYWMS
ＤＲ５ ｍＡｂ １のＣＤＲH２（配列番号１０）：EINPDSNTINYTPSLKD
ＤＲ５ ｍＡｂ １のＣＤＲH３（配列番号１１）：RAYYGNPAWFAY
【0098】
ＤＲ５ ｍＡｂ １のＶＨドメインは好ましくは、以下に示す配列を有するポリヌクレオチド（配列番号１２）によってエンコードされる（ＣＤＲをエンコードするポリヌクレオチドは、下線部を付して示す）：gaggtgaagt ttctcgagtc tggaggtggc ctggtgcagc ctggaggatc
cctgaaactc tcctgtgtag cctcaggatt cgattttagt agatactgga
tgagttgggt ccggcaggct ccagggaaag ggctagaatg gattggagaa
attaatccag atagcaatac gataaactat acgccatctc taaaggataa
attcatcatc tccagagaca acgccaaaaa tacgctgtat ctgcaaatga
ccaaagtgag atctgaggac acagcccttt attattgtac aagaagggcc
tactatggta acccggcctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt
cactgtctct tcc
【0099】
ｂ．抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５ ｍＡｂ ２（１）マウス抗ヒト抗体ＤＲ５ ｍＡｂ ２
ＤＲ５ ｍＡｂ ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１３）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GQSPKLLIYW
ASTRHTGVPD RFTGSGSGTD YTLTIKSVQA EDLTLYYCQQ HYITPWTFGG
GTKLEIK
ＤＲ５ ｍＡｂ ２のＣＤＲL１（配列番号１４）：KASQDVNTAVA
ＤＲ５ ｍＡｂ ２のＣＤＲL２（配列番号１５）：WASTRHT
ＤＲ５ ｍＡｂ ２のＣＤＲL３（配列番号１６）：QQHYITPWT
【0100】
ＤＲ５ ｍＡｂ ２のＶＬドメインは好ましくは、以下に示す配列を有するポリヌクレオチド（配列番号１７）によってエンコードされる（ＣＤＲをエンコードするポリヌクレオチドは、下線部を付して示す）：gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccactt cagtaggaga
cagggtcagc atcacctgca aggccagtca ggatgtgaat actgctgtag
cctggtatca acaaaaacca gggcaatctc ctaaactact gatttactgg
gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc
tgggacagat tatacactca ccatcaaaag tgtgcaggct gaagacctga
cactttatta ctgtcagcaa cactatatca ctccgtggac gttcggtgga
ggcaccaagc tggaaatcaaa
【0101】
ＤＲ５ ｍＡｂ ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１８）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：KVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCKASGYTFT EYILHWVKQK SGQGLEWIGW
FYPGNNNIKY NEKFKDKATL TADKSSSTVY MELSRLTSED SAVYFCARHE
QGPGYFDYWG QGTTLTVSS
ＤＲ５ ｍＡｂ ２のＣＤＲH１（配列番号１９）：GYTFTEYILH
ＤＲ５ ｍＡｂ ２のＣＤＲH２（配列番号２０）：WFYPGNNNIKYNEKFKD
ＤＲ５ ｍＡｂ ２のＣＤＲH３（配列番号２１）：HEQGPGYFDY
【0102】
ＤＲ５ ｍＡｂ ２のＶＨドメインは好ましくは、以下に示す配列を有するポリヌクレオチド（配列番号２２）によってエンコードされる（ＣＤＲをエンコードするポリヌクレオチドは、下線部を付して示す）：aaggtccagc tgcagcagtc tggagctgaa ctggtgaaac ccggggcatc
agtgaagctg tcctgcaagg cttctgggta caccttcact gagtatattt
tacactgggt aaagcagaag tctggacagg gtcttgagtg gattgggtgg
ttttatcctg gaaataataa tataaagtac aatgagaaat tcaaggacaa
ggccacactg actgcggaca aatcctccag cacagtctat atggaactta
gtagattgac atctgaagac tctgcggtct atttctgtgc aagacacgaa
caaggaccag gttactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt
ctcctcc
【0103】
（２）ヒト化ＤＲ５ ｍＡｂ ２（「ｈＤＲ５ ｍＡｂ ２」）上述のマウス抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５ ｍＡｂ ２をヒト化することによって、ヒトレシピエントへの投与の際の抗原性を低減するための、抗ヒトＤＲ５抗体のヒト化能力を実証した。上記ヒト化により、本明細書において「ｈＤＲ５ ｍＡｂ ２ ＶＬ‐２」、「ｈＤＲ５ ｍＡｂ ２ ＶＬ‐３」、「ｈＤＲ５ ｍＡｂ ２ ＶＬ‐４」及び「ｈＤＲ５ ｍＡｂ ２ ＶＬ‐５」と称される４つのヒト化ＶＬドメイン、並びに本明細書において「ｈＤＲ５ ｍＡｂ ２ ＶＨ‐２」と称される１つのヒト化ＶＨドメインが得られた。いずれの上記ヒト化ＶＬドメインを上記ヒト化ＶＨドメインとペアリングしてよい。従って、上記ヒト化ＶＨドメインとペアリングされた上記ヒト化ＶＬドメインのうちの１つを備えるいずれの抗体は、一般的に「ｈＤＲ５ ｍＡｂ ２」と呼ばれ、ヒト化ＶＬ／ＶＨドメインの特定の組み合わせは、ＶＬドメインを参照することによって呼称される。
【0104】
ｈＤＲ５ ｍＡｂ ２ ＶＬ‐２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２３）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYW
ASTRHTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQQ HYITPWTFGG
GTKLEIK
【0105】
ｈＤＲ５ ｍＡｂ ２ ＶＬ‐２は好ましくは、以下に示す配列を有するポリヌクレオチド（配列番号２４）によってエンコードされる：gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga
ccgcgtgact attacttgta aagcttctca ggatgtcaac accgccgtgg
cttggtacca gcagaagccc ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg
gccagcactc ggcacaccgg agtcccatct aggttctctg gcagtggatc
agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagccc gaggatgtgg
ctacttacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg
ggcacaaaac tggaaatcaa a
【0106】
ｈＤＲ５ ｍＡｂ ２ ＶＬ‐３のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２５）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYW
ASTRHTGVPD RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQQ HYITPWTFGG
GTKLEIK
【0107】
ｈＤＲ５ ｍＡｂ ２ ＶＬ‐３は好ましくは、以下に示す配列を有するポリヌクレオチド（配列番号２６）によってエンコードされる：gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga
ccgcgtgact attacttgtc gggcttctca ggatgtcaac accgccgtgg
cttggtacca gcagaagccc ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg
gccagcactc ggcacaccgg agtcccagat aggttctctg gcagtggatc
agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagccc gaggatgtgg
ctacttacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg
ggcacaaaac tggaaatcaa a
【0108】
ｈＤＲ５ ｍＡｂ ２ ＶＬ‐４のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２７）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYW ASTRHTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ HYITPWTFGG GTKLEIK
【0109】
ｈＤＲ５ ｍＡｂ ２ ＶＬ‐４は好ましくは、以下に示す配列を有するポリヌクレオチド（配列番号２８）によってエンコードされる：gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga
ccgcgtgact attacttgtc gggcttctca ggatgtcaac accgccgtgg
cttggtacca gcagaagccc ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg
gccagcactc ggcacaccgg agtcccatct aggttctctg gcagtggatc
agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagcca gaggatatcg
ctacatacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg
ggcacaaaac tggaaatcaa a
【0110】
ｈＤＲ５ ｍＡｂ ２ ＶＬ‐５のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２９）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYW ASTRHTGVPD RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ HYITPWTFGG GTKLEIK
【0111】
ｈＤＲ５ ｍＡｂ ２ ＶＬ‐５は好ましくは、以下に示す配列を有するポリヌクレオチド（配列番号３０）によってエンコードされる：gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga
ccgcgtgact attacttgtc gggcttctca ggatgtcaac accgccgtgg
cttggtacca gcagaagccc ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg
gccagcactc ggcacaccgg agtcccagat aggttctctg gcagtggatc
agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagccc gaggatatcg
ctacttacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg
ggcacaaaac tggaaatcaa a
【0112】
ｈＤＲ５ ｍＡｂ ２ ＶＨ‐２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号３１）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT EYILHWVRQA PGQGLEWMGW
FYPGNNNIKY NEKFKDRVTI TADKSTSTVY MELSSLRSED TAVYYCARHE
QGPGYFDYWG QGTLVTVSS
【0113】
ｈＤＲ５ ｍＡｂ ２ ＶＨ‐２は好ましくは、以下に示す配列を有するポリヌクレオチド（配列番号３２）によってエンコードされる：caggtccagc tggtgcagag tggggcagag gtgaaaaagc caggggcatc
agtgaaagtg tcttgtaaag catcaggtta tacatttact gagtacatcc
tgcactgggt gcgacaggca ccaggacagg gactggaatg gatggggtgg
ttctaccctg gcaacaacaa cattaagtac aacgagaagt ttaaagaccg
ggtgaccatc acagcggata agtctaccag tacagtctat atggagctga
gctccctgag aagcgaagac accgccgtct actattgcgc tcgccacgaa
cagggtccag gttactttga ttattggggg cagggaactc tggtcacagt
cagctcc
【0114】
ｈＤＲ５ ｍＡｂ ２ ＶＬ‐３、ｈＤＲ５ ｍＡｂ ２ ＶＬ‐４及びｈＤＲ５ ｍＡｂ ＶＬ‐５のＶＬドメインのＣＤＲ１は、アミノ酸配列：RASQDVNTAVA（配列番号３２０）を有する。
【0115】
ｃ．ドロジツマブ（「ＤＲ５ ｍＡｂ ３」）ドロジツマブ（「ＤＲ５ ｍＡｂ ３」）のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号５４）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：
SELTQDPAVS VALGQTVRIT CSGDSLRSYY ASWYQQKPG QAPVLVIYGA
NNRPSGIPDR FSGSSSGNTA SLTITGAQAE DEADYYCNSA DSSGNHVVFG
GGTKLTVLG
ＤＲ５ ｍＡｂ ３のＣＤＲL１（配列番号５５）：SGDSLRSYYAS
ＤＲ５ ｍＡｂ ３のＣＤＲL２（配列番号５６）：GANNRPS
ＤＲ５ ｍＡｂ ３のＣＤＲL３（配列番号５７）：NSADSSGNHVV
【0116】
ドロジツマブ（「ＤＲ５ ｍＡｂ ３」）のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号５８）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：EVQLVQSGGG VERPGGSLRL SCAASGFTFD DYAMSWVRQA PGKGLEWVSG
INWQGGSTGY ADSVKGRVTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAKIL
GAGRGWYFDY WGKGTTVTVS S
ＤＲ５ ｍＡｂ ３のＣＤＲH１（配列番号５９）：GFTFDDYAMS
ＤＲ５ ｍＡｂ ３のＣＤＲH２（配列番号６０）：INWQGGSTGYADSVKG
ＤＲ５ ｍＡｂ ３のＣＤＲH３（配列番号６１）：ILGAGRGWYFDY
【0117】
ｄ．コナツムマブ（「ＤＲ５ ｍＡｂ ４」）コナツムマブ（「ＤＲ５ ｍＡｂ ４」）のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号６２）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：
EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQGIS RSYLAWYQQK PGQAPSLLIY
GASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QFGSSPWTFG
QGTKVEIK
ＤＲ５ ｍＡｂ ４のＣＤＲL１（配列番号６３）：RASQGISRSYLA
ＤＲ５ ｍＡｂ ４のＣＤＲL２（配列番号６４）：GASSRAT
ＤＲ５ ｍＡｂ ４のＣＤＲL３（配列番号６５）：QQFGSSPWT
【0118】
コナツムマブ（「ＤＲ５ ｍＡｂ ４」）のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号６６）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：QVQLQESGPG LVKPSQTLSL TCTVSGGSIS SGDYFWSWIR QLPGKGLEWI
GHIHNSGTTY YNPSLKSRVT ISVDTSKKQF SLRLSSVTAA DTAVYYCARD
RGGDYYYGMD VWGQGTTVTV SS
ＤＲ５ ｍＡｂ ４のＣＤＲH１（配列番号６７）：GGSISSGDYFWS
ＤＲ５ ｍＡｂ ４のＣＤＲH２（配列番号６８）：HIHNSGTTYYNPSLKS
ＤＲ５ ｍＡｂ ４のＣＤＲH３（配列番号６９）：DRGGDYYYGMDV
【0119】
ｅ．チガツズマブ（「ＤＲ５ ｍＡｂ ５」）チガツズマブ（「ＤＲ５ ｍＡｂ ５」）のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号７０）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVG TAVAWYQQKP GKAPKLLIYW
ASTRHTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSSYRTFGQG
TKVEIK
ＤＲ５ ｍＡｂ ５のＣＤＲL１（配列番号７１）：KASQDVGTAVA
ＤＲ５ ｍＡｂ ５のＣＤＲL２（配列番号７２）：WASTRHT
ＤＲ５ ｍＡｂ ５のＣＤＲL３（配列番号７３）：QQYSSYRT
【0120】
チガツズマブ（「ＤＲ５ ｍＡｂ ５」）のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号７４）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYVMSWVRQA PGKGLEWVAT
ISSGGSYTYY PDSVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARRG
DSMITTDYWG QGTLVTVSS
ＤＲ５ ｍＡｂ ５のＣＤＲH１（配列番号７５）：GFTFSSYVMS
ＤＲ５ ｍＡｂ ５のＣＤＲH２（配列番号７６）：TISSGGSYTYYPDSVKG
ＤＲ５ ｍＡｂ ５のＣＤＲH３（配列番号７７）：RGDSMITTDY
【0121】
ｆ．ＬＢＹ１３５‐１（「ＤＲ５ ｍＡｂ ６」）ＬＢＹ１３５‐１（「ＤＲ５ ｍＡｂ ６」）のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号７８）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：
DIAMTQSHKF MSTLVGDRVS ITCKASQDVN TAIAWYQQKP GQSPKLLIYW
ASTRHTGVPD RFYGSGSGTD YTLTISSMEA EDAATYYCQQ WSSNPLTFGA
GTKLELKRA
ＤＲ５ ｍＡｂ ６のＣＤＲL１（配列番号７９）：QDVNTAIA
ＤＲ５ ｍＡｂ ６のＣＤＲL２（配列番号８０）：WASTRHT
ＤＲ５ ｍＡｂ ６のＣＤＲL３（配列番号８１）：QQWSSNPLT
【0122】
ＬＢＹ１３５‐１（「ＤＲ５ ｍＡｂ ６」）のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号８２）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：KVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCKASGYTFT DYTIHWVKQR SGQGLEWIGW
FYPGGGYIKY NEKFKDRATL TADKSSNTVY MELSRLTSEG SAVYFCARHE
EGIYFDYWGQ GTTLTVSS
ＤＲ５ ｍＡｂ ６のＣＤＲH１（配列番号８３）：GYTFTDYTIH
ＤＲ５ ｍＡｂ ６のＣＤＲH２（配列番号８４）：WFYPGGGYIKYNEKFKD
ＤＲ５ ｍＡｂ ６のＣＤＲH３（配列番号８５）：HEEGIYFDY
【0123】
ｇ．ＬＢＹ１３５‐２（「ＤＲ５ ｍＡｂ ７」）ＬＢＹ１３５‐２（「ＤＲ５ ｍＡｂ ７」）のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号８６）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAIAWYQQKP GQSPKLLIYW
ASTRHTGVPD RFTGSGSGTD YTLTISSVQA EDLALYYCQQ HYTTPFTFGS
GTKL
ＤＲ５ ｍＡｂ ７のＣＤＲL１（配列番号８７）：KASQDVNTAIA
ＤＲ５ ｍＡｂ ７のＣＤＲL２（配列番号８８）：WASTRHT
ＤＲ５ ｍＡｂ ７のＣＤＲL３（配列番号８９）：QQHYTTPFT
【0124】
ＬＢＹ１３５‐２（「ＤＲ５ ｍＡｂ ７」）のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号９０）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：KVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCKASGYTFT DYTIHWVKQR SGQGLEWIGW
FYPGGGYIKY NEKFKDRATL TADKSSNTVY MELSRLTSED SAVYFCARHE
EGIYFDYWGQ GTTLTVSS
ＤＲ５ ｍＡｂ ７のＣＤＲH１（配列番号９１）：GYTFTDYTIH
ＤＲ５ ｍＡｂ ７のＣＤＲH２（配列番号９２）：WFYPGGGYIKYNEKFKD
ＤＲ５ ｍＡｂ ７のＣＤＲH３（配列番号９３）：HEEGIYFDY
【0125】
ｈ．ＫＭＴＲ２（「ＤＲ５ ｍＡｂ ８」）ＫＭＴＲ２（「ＤＲ５ ｍＡｂ ８」）のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号９４）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD
ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPLTFGG
GTKVEIKR
ＤＲ５ ｍＡｂ ８のＣＤＲL１（配列番号９５）：RASQSVSSYLA
ＤＲ５ ｍＡｂ ８のＣＤＲL２（配列番号９６）：DASNRAT
ＤＲ５ ｍＡｂ ８のＣＤＲL３（配列番号９７）：QQRSNWPLT
【0126】
ＫＭＴＲ２（「ＤＲ５ ｍＡｂ ８」）のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号９８）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：QVQLVQSGAE MKKPGASVKV SCKTSGYTFT NYKINWVRQA PGQGLEWMGW
MNPDTDSTGY PQKFQGRVTM TRNTSISTAY MELSSLRSED TAVYYCARSY
GSGSYYRDYY YGMDVWGQGT TVTVSS
ＤＲ５ ｍＡｂ ８のＣＤＲH１（配列番号９９）：GYTFTNYKIN
ＤＲ５ ｍＡｂ ８のＣＤＲH２（配列番号１００）：WMNPDTDSTGYPQKFQG
ＤＲ５ ｍＡｂ ８のＣＤＲH３（配列番号１０１）：SYGSGSYYRDYYYGMDV
【0127】
５．ＥｐｈＡ２結合ドメイン受容体チロシンキナーゼ、エフリンタイプＡ受容体２（ＥｐｈＡ２）は、本発明の好ましい癌抗原である。ＥｐｈＡ２は通常、成体の上皮組織の細胞間接触部位に発現するが、最近の研究により、ＥｐｈＡ２が様々なタイプの上皮癌においても、転移性病変において観察される最も高いレベルのＥｐｈＡ２発現で過剰発現することが分かった。高発現レベルのＥｐｈＡ２は、前立腺癌、乳癌、非小細胞肺癌及び黒色腫を含む、広範な癌及び多数の腫瘍細胞株において確認されている（Xu, J. et al. (2014) “High Epha2 Protein Expression In Renal Cell Carcinoma Is Associated With A Poor Disease Outcome,” Oncol. Lett. Aug 2014; 8(2): 687‐692; Miao, B. et al. (2014) “EphA2 is a Mediator of Vemurafenib Resistance and a Novel Therapeutic Target in Melanoma,” Cancer Discov. pii: CD‐14‐0295）。ＥｐｈＡ２は単なる癌のマーカーとは思われないが、多数のヒト癌において持続的に過剰発現し、機能的に変化するようである（Chen, P. et al. (2014) “Epha2 Enhances The Proliferation And Invasion Ability Of Lncap Prostate Cancer Cells,” Oncol. Lett. 8(1):41‐46）。
【0128】
本発明は特に、癌抗原としてのＥｐｈＡ２の選択、及び本発明の三重特異性結合分子の癌抗原結合ドメインを提供するための抗ＥｐｈＡ２抗体の使用について考える。例示的な抗ＥｐｈＡ２抗体としては、「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １」、「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２」及び「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３」が挙げられる。
【0129】
ａ．ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １好ましい抗ヒトＥｐｈＡ２抗体（「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １」）のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１５３）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：
DIQMTQTTSS LSASLGDRIT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY
TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GYTLYTFGGG
TKLEIK
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １のＣＤＲL１（配列番号１５４）：RASQDISNYLN
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １のＣＤＲL２（配列番号１５５）：YTSRLHS
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １のＣＤＲL３（配列番号１５６）：QQGYTLYT
【0130】
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １のＶＬドメインは好ましくは、以下に示す配列を有するポリヌクレオチド（配列番号１５７）によってエンコードされる（ＣＤＲをエンコードするポリヌクレオチドは、下線部を付して示す）：gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga
cagaatcacc atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa
actggtatca gcagaaacca gatggaactg ttaaactcct gatctactac
acatcaagat tacactcagg agtcccatca aggttcagtg gcagtgggtc
tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa gaagatattg
ccacttactt ttgccaacag ggttatacgc tgtacacgtt cggagggggg
accaagctgg aaataaaa
【0131】
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１５８）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：QVQLKESGPG LVAPSQSLSI TCTVSGFSLS RYSVHWVRQP PGKGLEWLGM
IWGGGSTDYN SALKSRLSIS KDNSKSQVFL KMNSLQTDDT AMYYCARKHG
NYYTMDYWGQ GTSVTVSS
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １のＣＤＲH１（配列番号１５９）：GFSLSRYSVH
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １のＣＤＲH２（配列番号１６０）：MIWGGGSTDYNSALKS
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １のＣＤＲH３（配列番号１６１）：KHGNYYTMDY
【0132】
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １のＶＨドメインは好ましくは、以下に示す配列を有するポリヌクレオチド（配列番号１６２）によってエンコードされる（ＣＤＲをエンコードするポリヌクレオチドは、下線部を付して示す）：caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcac cctcacagag
cctgtccatc acatgcactg tctctgggtt ctcattatcc agatatagtg
tacactgggt tcgccagcct ccaggaaagg gtctggagtg gctgggaatg
atatggggtg gtggaagcac agactataat tcagctctca aatccagact
gagtatcagc aaggacaact ccaagagcca agttttctta aaaatgaaca
gtctgcaaac tgatgacaca gccatgtact actgtgccag aaaacatggt
aactactata ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc
ctcc
【0133】
ｂ．ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２第２の好ましい抗ヒトＥｐｈＡ２抗体（「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２」）のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１６３）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：
DVVMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSSGNTYLHW YLQKPGQSPK
LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP
TFGSGTKLEI K
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２のＣＤＲL１（配列番号１６４）：RSSQSLVHSSGNTYLH
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２のＣＤＲL２（配列番号１６５）：KVSNRFS
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２のＣＤＲL３（配列番号１６６）：SQSTHVPT
【0134】
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２のＶＬドメインは好ましくは、以下に示す配列を有するポリヌクレオチド（配列番号３１８）によってエンコードされる（ＣＤＲをエンコードするポリヌクレオチドは、下線部を付して示す）：gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga
tcaagcctcc atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtagtg
gaaacaccta tttacattgg tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag
ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt tctggggtcc cagacaggtt
cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc agcagagtgg
aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccc
acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aaa
【0135】
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１６７）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGFTFT NYGMNWVKQA PGKGLKWMGW
INTYIGEPTY ADDFKGRFVF SLETSASTAY LQINNLKNED MATYFCAREL
GPYYFDYWGQ GTTLTVSS
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２のＣＤＲH１（配列番号１６８）：GFTFTNYGMN
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２のＣＤＲH２（配列番号１６９）：WINTYIGEPTYADDFKG
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２のＣＤＲH３（配列番号１７０）：ELGPYYFDY
【0136】
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２のＶＨドメインは好ましくは、以下に示す配列を有するポリヌクレオチド（配列番号１７１）によってエンコードされる（ＣＤＲをエンコードするポリヌクレオチドは、下線部を付して示す）：cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac
agtcaagatc tcctgcaagg cttctgggtt taccttcaca aactatggaa
tgaactgggt gaagcaggct ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg
ataaacacct atattggaga gccgacatat gctgatgact tcaagggacg
gtttgtcttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat ttgcagatca
acaacctcaa aaatgaggac atggccacat atttctgtgc aagagaactg
ggaccatact actttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc
ctcc
【0137】
ｃ．ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３更に好ましい抗ヒト ＥｐｈＡ２抗体（「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３」）のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１７２）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：
DIVLTQSHRS MSTSVGDRVN ITCKASQDVT TAVAWYQQKP GQSPKLLIFW
ASTRHAGVPD RFTGSGSGTD FTLTISSVQA GDLALYYCQQ HYSTPYTFGG
GTKLEIK
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３のＣＤＲL１（配列番号１７３）：KASQDVTTAVA
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３のＣＤＲL２（配列番号１７４）：WASTRHA
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３のＣＤＲL３（配列番号１７５）：QQHYSTPYT
【0138】
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３のＶＬドメインは好ましくは、以下に示す配列を有するポリヌクレオチド（配列番号１７６）によってエンコードされる（ＣＤＲをエンコードするポリヌクレオチドは、下線部を付して示す）：gacattgtgc tgacccagtc tcacagatcc atgtccacat cagtaggaga
cagggtcaac atcacctgca aggccagtca ggatgtgact actgctgtag
cctggtatca acaaaaacca gggcaatctc ctaaattact gattttctgg
gcatccaccc ggcacgctgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc
tgggacagat tttactctca ccatcagcag tgtgcaggct ggagacctgg
cactttatta ctgtcaacaa cattatagca caccgtacac attcggaggg
gggaccaagc tggaaataaa a
【0139】
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１７７）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：EVQLVESGGG SVKPGGSLKL SCAASGFTFT DHYMYWVRQT PEKRLEWVAT
ISDGGSFTSY PDSVKGRFTI SRDIAKNNLY LQMSSLKSED TAMYYCTRDE
SDRPFPYWGQ GTLVTVSS
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３のＣＤＲH１（配列番号１７８）：GFTFTDHYMY
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３のＣＤＲH２（配列番号１７９）：TISDGGSFTSYPDSVKG
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３のＣＤＲH３（配列番号１８０）：DESDRPFPY
【0140】
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３のＶＨドメインは好ましくは、以下に示す配列を有するポリヌクレオチド（配列番号３１９）によってエンコードされる（ＣＤＲをエンコードするポリヌクレオチドは、下線部を付して示す）：gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcagtgaagc ctggagggtc
cctgaaactc tcctgtgcag cctctggatt cactttcact gaccattaca
tgtattgggt tcgccagact ccggaaaaga ggctggagtg ggtcgcaacc
attagtgatg gcggtagttt cacctcctat ccagacagtg tgaaggggcg
attcaccatc tccagagaca ttgccaagaa caacctgtac ctccaaatga
gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtac aagagatgag
agcgataggc cgtttcctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc
ctcc
【0141】
６．ｇｐＡ３３結合ドメインｇｐＡ３３もまた、本発明の好ましい癌抗原である。結腸直腸癌は、西洋における最も一般的な悪性腫瘍であり、癌による死亡の主要な原因である（Silverberg, E. et al. (1989) “Cancer Statistics, 1989,” CA Cancer J Clin. 39(1):3‐20）。結腸癌に関する潜在的に有用なある標的は、４３ｋＤ膜貫通糖タンパク質Ａ３３（ｇｐＡ３３）であり、これは全ての結腸直腸癌の＞９５％において発現する（Heath, J.K. et al. (1997) “The Human A33 Antigen Is A Transmembrane Glycoprotein And A Novel Member Of The Immunoglobulin Superfamily,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 94(2):469‐474; Ritter, G. et al. (1997) “Characterization Of Posttranslational Modifications Of Human A33 Antigen, A Novel Palmitoylated Surface Glycoprotein Of Human Gastrointestinal Epithelium,” Biochem. Biophys. Res. Commun. 236(3):682‐686; Wong, N.A. et al. (2006) “EpCAM and gpA33 Are Markers Of Barrett's Metaplasia,” J. Clin. Pathol. 59(3):260‐263）。ｇｐＡ３３は初め、ヒト膵癌由来細胞株ＡＳＰＣ１に対するモノクローナルマウス抗体の上昇によって発見された。
【0142】
本発明は特に、癌抗原としてのｇｐＡ３３の選択、及び本発明の三重特異性結合分子の癌抗原結合ドメインを提供するための抗ｇｐＡ３３抗体の使用について考える。例示的な抗ｇｐＡ３３抗体は「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」である。
【0143】
好ましい抗ヒトｇｐＡ３３抗体（「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」）のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１８１）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT
SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG
TKLEIK
ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＣＤＲL１（配列番号１８２）：SARSSISFMY
ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＣＤＲL２（配列番号１８３）：DTSNLAS
ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＣＤＲL３（配列番号１８４）：QQWSSYPLT
【0144】
ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＶＬドメインは好ましくは、以下に示す配列を有するポリヌクレオチド（配列番号１８５）によってエンコードされる（ＣＤＲをエンコードするポリヌクレオチドは、下線部を付して示す）：gacattcagc tgactcagtc cccctctttt ctgtccgcat ccgtcggaga
tcgagtgact attacttgct ctgctaggtc ctcaatcagc ttcatgtact
ggtatcagca gaagcccggc aaagcaccta agctgctgat ctacgacaca
agcaacctgg cctccggggt gccatctcgg ttctctggca gtgggtcagg
aactgagttt accctgacaa ttagctccct ggaggctgaa gatgccgcta
cctactattg ccagcagtgg agcagctatc ctctgacctt cggacagggg
actaaactgg aaatcaag
【0145】
ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１８６）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GSWMNWVRQA PGQGLEWIGR
IYPGDGETNY NGKFKDRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARIY
GNNVYFDVWG QGTTVTVSS
ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＣＤＲH１（配列番号１８７）：GYTFTGSWMN
ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＣＤＲH２（配列番号１８８）：RIYPGDGETNYNGKFKD
ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＣＤＲH３（配列番号１８９）：IYGNNVYFDV
【0146】
ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＶＨドメインは好ましくは、以下に示す配列を有するポリヌクレオチド（配列番号１９０）によってエンコードされる（ＣＤＲをエンコードするポリヌクレオチドは、下線部を付して示す）：caggtccagc tggtccagag cggggccgaa gtcaaaaaac ccggagcaag
cgtgaaggtc tcctgcaaag catcaggcta tacatttaca ggcagctgga
tgaactgggt gaggcaggct ccaggacagg gactggagtg gatcgggcgc
atctaccctg gagacggcga aactaactat aatggaaagt tcaaagaccg
agtgaccatc acagccgata agtctactag taccgcctac atggagctga
gctccctgcg gtctgaagat accgccgtct actattgcgc tagaatttac
ggaaacaatg tctattttga cgtgtggggg cagggaacaa ctgtgactgt
ctcctcc
【0147】
７．Ｈｅｒ２結合ドメイン本発明はまた特に、癌抗原としてのＨｅｒ２の選択、及び本発明の三重特異性結合分子の癌抗原結合ドメインを提供するための抗Ｈｅｒ２抗体の使用について考える。例示的な抗Ｈｅｒ２抗体としては「Ｈｅｒ２ ｍＡｂ １」及びトラスツズマブが挙げられる。
【0148】
ａ．Ｈｅｒ２ ｍＡｂ １抗Ｈｅｒ２抗体「Ｈｅｒ２ ｍＡｂ １」のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１９１）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS
ASFLESGVPS RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYTTPPTFGQ
GTKVEIKRT
【0149】
抗Ｈｅｒ２抗体「Ｈｅｒ２ ｍＡｂ １」のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１９２）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：QVQLQQSGPE LVKPGASLKL SCTASGFNIK DTYIHWVKQR PEQGLEWIGR
IYPTNGYTRY DPKFQDKATI TADTSSNTAY LQVSRLTSED TAVYYCSRWG
GDGFYAMDYW GQGASVTVSS
【0150】
ｂ．トラスツズマブヒト化抗Ｈｅｒ２抗体「トラスツズマブ」のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１９３）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS
ASFLYSGVPS RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYTTPPTFGQ
GTKVEIKR
【0151】
ヒト化抗Ｈｅｒ２抗体「トラスツズマブ」のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１９４）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIHWVRQA PGKGLEWVAR
IYPTNGYTRY ADSVKGRFTI SADTSKNTAY LQMNSLRAED TAVYYCSRWG
GDGFYAMDYW GQGTLVTVSS
【0152】
８．Ｂ７‐Ｈ３結合ドメインヒトＢ７‐Ｈ３は、神経芽腫細胞上での発現に加えて、多様な他の癌細胞（例えば胃、卵巣及び非小細胞肺癌）上で発現することも知られている。Ｂ７‐Ｈ３タンパク質発現は腫瘍細胞株において免疫組織学的に検出されている（Chapoval, A. et al. (2001) “B7‐H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN‐γ Production,” Nature Immunol. 2:269-274; Saatian, B. et al. (2004) “Expression Of Genes For B7‐H3 And Other T Cell Ligands By Nasal Epithelial Cells During Differentiation And Activation,” Amer. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 287:L217-L225; Castriconi et al. (2004) “Identification Of 4Ig‐B7‐H3 As A Neuroblastoma‐Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell‐Mediated Lysis,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 101(34):12640‐12645); Sun, M. et al. (2002) “Characterization of Mouse and Human B7‐H3 Genes,” J. Immunol. 168:6294‐6297）。ｍＲＮＡ発現は、心臓、腎臓、精巣、肺、肝臓、膵臓、前立腺、大腸、骨芽細胞で発見されている（Collins, M. et al. (2005) “The B7 Family Of Immune‐Regulatory Ligands,” Genome Biol. 6:223.1‐223.7）。タンパク質レベルにおいて、Ｂ７‐Ｈ３はヒト肝臓、肺、膀胱、精巣、前立腺、乳房、胎盤、リンパ器官に見られる（Hofmeyer, K. et al. (2008) “The Contrasting Role Of B7‐H3,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277‐10278）。
【0153】
本発明はまた特に、癌抗原としてのＢ７‐Ｈ３の選択、及び本発明の三重特異性結合分子の癌抗原結合ドメインを提供するための抗Ｂ７‐Ｈ３抗体の使用について考える。例示的な抗Ｂ７‐Ｈ３抗体としては「Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ １」、「Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２」及び「Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ３」が挙げられる。
【0154】
ａ．Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ １抗Ｂ７‐Ｈ３抗体「Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ １」のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１９５）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：
DIAMTQSQKF MSTSVGDRVS VTCKASQNVD TNVAWYQQKP GQSPKALIYS
ASYRYSGVPD RFTGSGSGTD FTLTINNVQS EDLAEYFCQQ YNNYPFTFGS
GTKLEIK
【0155】
抗Ｂ７‐Ｈ３抗体「Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ １」のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１９６）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：DVQLVESGGG LVQPGGSRKL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PEKGLEWVAY
ISSDSSAIYY ADTVKGRFTI SRDNPKNTLF LQMTSLRSED TAMYYCGRGR
ENIYYGSRLD YWGQGTTLTV SS
【0156】
ｂ．Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２抗Ｂ７‐Ｈ３抗体「Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２」のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１９７）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：
DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY
TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTIDNLEQ EDIATYFCQQ GNTLPPTFGG
GTKLEIK
【0157】
抗Ｂ７‐Ｈ３抗体「Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２」のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１９８）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：QVQLQQSGAE LARPGASVKL SCKASGYTFT SYWMQWVKQR PGQGLEWIGT
IYPGDGDTRY TQKFKGKATL TADKSSSTAY MQLSSLASED SAVYYCARRG
IPRLWYFDVW GAGTTVTVSS
【0158】
ｃ．Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ３抗Ｂ７‐Ｈ３抗体「Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ３」のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１９９）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：
DIQMTQSPAS LSVSVGETVT ITCRASESIY SYLAWYQQKQ GKSPQLLVYN
TKTLPEGVPS RFSGSGSGTQ FSLKINSLQP EDFGRYYCQH HYGTPPWTFG
GGTNLEIK
【0159】
抗Ｂ７‐Ｈ３抗体「Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ３」のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２００）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：EVQQVESGGD LVKPGGSLKL SCAASGFTFS SYGMSWVRQT PDKRLEWVAT
INSGGSNTYY PDSLKGRFTI SRDNAKNTLY LQMRSLKSED TAMYYCARHD
GGAMDYWGQG TSVTVSS
【0160】
９．ＥＧＦ受容体結合ドメイン（セツキシマブ）キメラ抗ＥＧＦＲ抗体「セツキシマブ」のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２０１）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：
DILLTQSPVI LSVSPGERVS FSCRASQSIG TNIHWYQQRT NGSPRLLIKY
ASESISGIPS RFSGSGSGTD FTLSINSVES EDIADYYCQQ NNNWPTTFGA
GTKLELKR
【0161】
キメラ抗ＥＧＦＲ抗体「セツキシマブ」のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２０２）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：QVQLKQSGPG LVQPSQSLSI TCTVSGFSLT NYGVHWVRQS PGKGLEWLGV
IWSGGNTDYN TPFTSRLSIN KDNSKSQVFF KMNSLQSNDT AIYYCARALT
YYDYEFAYWG QGTLVTVSA
【0162】
パニツムマブ（例えばベクティビックス（登録商標）、Ａｍｇｅｎ）は、本発明に従って使用できる、代替的なＥＧＦ受容体結合抗体である。
【0163】
１０．ＶＥＧＦ結合ドメイン（ベバシツマブ）ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体「ベバシツマブ」のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２０３）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF
TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ
GTKVEIKR
【0164】
ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体「ベバシツマブ」のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２０４）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW
INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYP
HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSS
【0165】
１１．５Ｔ４結合ドメイン癌胎児性タンパク質５Ｔ４は、腎臓癌、結腸癌、前立腺癌、肺癌を含む多くの癌腫の細胞膜上、及び急性リンパ芽球性白血病において発現する、腫瘍関連タンパク質である（Boghaert, E.R. et al. (2008) “The Oncofetal Protein, 5T4, Is A Suitable Target For Antibody‐Guided Anti‐Cancer Chemotherapy With Calicheamicin,” Int. J. Oncol. 32(1):221‐234; Eisen, T. et al. (2014) “Naptumomab Estafenatox: Targeted Immunotherapy with a Novel Immunotoxin,” Curr. Oncol. Rep. 16:370, pp. 1‐6を参照）。例示的な抗５Ｔ４抗体（「５Ｔ４ ｍＡｂ １」）の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号３０８）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS NYLAWFQQKP GKAPKSLIYR
ANRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCLQ YDDFPWTFGQ
GTKLEIK
【0166】
上記例示的な抗５Ｔ４抗体の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号３０９）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SFWMHWVRQA PGQGLEWMGR
IDPNRGGTEY NEKAKSRVTM TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAGGN
PYYPMDYWGQ GTTVTVSS
【0167】
第２の例示的な抗５Ｔ４抗体（「５Ｔ４ ｍＡｂ ２」）の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号３１０）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：DVLMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSIV YSNGNTYLEW YLQKPGQSPK
LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCFQGSHVP
FTFGSGTKLE IK
【0168】
上記第２の例示的な抗５Ｔ４抗体の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号３１１）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：QVQLQQPGAE LVKPGASVKM SCKASGYTFT SYWITWVKQR PGQGLEWIGD
IYPGSGRANY NEKFKSKATL TVDTSSSTAY MQLSSLTSED SAVYNCARYG
PLFTTVVDPN SYAMDYWGQG TSVTVSS
【0169】
１２．ＩＬ１３Ｒα２結合ドメインインターロイキン‐１３受容体α２（ＩＬ１３Ｒα２）は、グリア芽腫、結腸直腸癌、子宮頸癌、膵臓癌、多発性黒色腫、骨肉腫、白血病、リンパ腫、前立腺癌及び肺癌を含む多様な癌において過剰発現する（国際公開第２００８／１４６９１１号）、Brown, C.E. et al. (2013) “Glioma IL13Rα2 Is Associated With Mesenchymal Signature Gene Expression And Poor Patient Prognosis,” PLoS One. 18;8(10):e77769; Barderas, R. et al. (2012) “High Expression Of IL‐13 Receptor Α2 In Colorectal Cancer Is Associated With Invasion, Liver Metastasis, And Poor Prognosis,” Cancer Res. 72(11):2780‐2790; Kasaian, M.T. et al. (2011) “IL‐13 Antibodies Influence IL‐13 Clearance In Humans By Modulating Scavenger Activity Of IL‐13Rα2,” J. Immunol. 187(1):561‐569; Bozinov, O. et al. (2010) “Decreasing Expression Of The Interleukin‐13 Receptor IL‐13Ralpha2 In Treated Recurrent Malignant Gliomas,” Neurol. Med. Chir. (Tokyo) 50(8):617‐621; Fujisawa, T. et al. (2009) “A novel role of interleukin‐13 receptor alpha2 in pancreatic cancer invasion and metastasis,” Cancer Res. 69(22):8678‐8685)。ＩＬ１３Ｒα２に免疫特異的に結合する抗体は市販されている(Abnova Corporation, Biorbyt, LifeSpan BioSciences, United States Biologicals;国際公開第２００８／１４６９１１号も参照)。例示的な抗ＩＬ１３Ｒα２抗体（「ｈｕ０８」、国際公開第２０１４／０７２８８８号）の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号３２１）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVG TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS
ASYRSTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQH HYSAPWTFGG
GTKVEIK
【0170】
上記例示的な抗ＩＬ１３Ｒα２抗体（「ｈｕ０８」、国際公開第２０１４／０７２８８８号）の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号３２２）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RNGMSWVRQA PGKGLEWVAT
VSSGGSYIYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARQG
TTALATRFFD VWGQGTLVTV SS
【0171】
１３．インテグリンベータ６結合ドメインインテグリンβ６（ＩＴＧＢ６）は、上皮細胞の表面のみに発現するインテグリンのサブタイプであり、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）タンパク質の受容体である。ＩＴＧＢ６発現は、（結腸癌、前立腺癌、腎臓癌等の）腫瘍組織に特異的に発現する（Liang, B. et al. (2014) “Integrinβ6‐targeted Immunoliposomes Mediate Tumor Specific Drug Delivery and Enhance Therapeutic Efficacy in Colon Carcinoma,” Clin. Cancer Res. Dec 30. pii: clincanres.1194.2014）。ITGB６に免疫特異的に結合するモノクローナル抗体は市販されている(例えば MAB2075Z clone R6G9,EMD Millipore; Weinacker, A. et al. (1994) “Role Of The Integrin Alpha V Beta 6 In Cell Attachment To Fibronectin. Heterologous Expression Of Intact And Secreted Forms Of The Receptor,” J. Biol. Chem. 269:6940‐6948も参照)。抗ＩＴＧＢ６モノクローナル抗体３Ｇ９及び８Ｇ６並びにその変異体は、国際公開第０３／１０００３３号及び国際公開第２００７／００８７１２号に開示されている。
【0172】
例示的なヒト化抗ＩＴＧＢ６抗体（抗体３Ｇ９由来、国際公開第２００７／００８７１２号）の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号３１２）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCSASSSVS SSYLYWYQQK PGQAPRLLIY
STSNLASGIP ARFSGSGSGT GFTLTISSLE PEDFAVYYCH QWSTYPPTFG
GGTKVEIK
【0173】
上記例示的なヒト化抗ＩＴＧＢ６抗体（抗体３Ｇ９由来、国際公開第２００７／００８７１２号）の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号３１３）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYWMSWVRQA PGKGLEWVAS
ISSGGRMYYP FTVKGRFTIS RDNAKNSLYL QMNSLRAEDT AVYYCARGSI
YDGYYVFPYW GQGTLVTVSS
【0174】
例示的な抗ＩＴＧＢ６抗体（抗体８Ｇ６由来、国際公開第２００７／００８７１２号）の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号３１４）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS TSSYSYMYWY QQKPGQAPRL
LIYYASNLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YCQHNWEIPF
TFGGGTKVEI K
【0175】
上記例示的な抗ＩＴＧＢ６抗体（抗体８Ｇ６由来、国際公開第２００７／００８７１２号）の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号３１５）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQGLEWMGVISTYY
GNTNYNQKFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGGLRRGDRPSLQ
YAMDYWGQGTLVTVSS
【0176】
１４．更なる抗癌抗原結合ドメイン本発明に従って使用できる更なる抗癌抗原抗体としては、以下の市販の抗体が挙げられる： ＣＤ３０に結合するブレンツキシマブ（例えばＡｄｃｅｔｒｉｓ（登録商標））；ＣＤ３３に結合するゲムツズマブ（例えばＭｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）；及びＣＴＬＡ‐４に結合するイピリムマブ（例えばＹｅｒｖｏｙ（登録商標））。
【0177】
Ｃ．例示的なエフェクタ細胞結合ドメイン免疫系エフェクタ細胞に結合できる抗体を用いて、本発明の三重特異性結合分子のエフェクタ細胞結合ドメインを提供できる。特に好適なのは、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ６４、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びＮＫＧ２Ｄ受容体に結合する抗体である。
【0178】
１．ＣＤ２結合ドメインＣＤ２は、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面上に確認される細胞接着分子である。ＣＤ２は、恐らくＮＫ細胞ナノチューブ形成のプロモータとして、ＮＫ細胞の細胞毒性を増強させる（Mace, E.M. et al. (2014) “Cell Biological Steps And Checkpoints In Accessing NK Cell Cytotoxicity,” Immunol. Cell. Biol. 92(3):245‐255; Comerci, C.J. et al. (2012) “CD2 Promotes Human Natural Killer Cell Membrane Nanotube Formation,” PLoS One 7(10):e47664:1‐12）。抗ＣＤ２抗体（Ｌｏ‐ＣＤ２ａ；ＡＴＣＣ受入番号：１１４２３）のＶＬドメインのアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１０２）（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：
DVVLTQTPPT LLATIGQSVS ISCRSSQSLL HSSGNTYLNW LLQRTGQSPQ
PLIYLVSKLE SGVPNRFSGS GSGTDFTLKI SGVEAEDLGV YYCMQFTHYP
YTFGAGTKLE LK
【0179】
抗ＣＤ２抗体（Ｌｏ‐ＣＤ２ａ；ＡＴＣＣ受入番号：１１４２３）のＶＨドメインのアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１０３）（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：EVQLQQSGPE LQRPGASVKL SCKASGYIFT EYYMYWVKQR PKQGLELVGR
IDPEDGSIDY VEKFKKKATL TADTSSNTAY MQLSSLTSED TATYFCARGK
FNYRFAYWGQ GTLVTVSS
【0180】
２．ＣＤ３結合ドメインある好ましい実施形態では、本発明の三重特異性結合分子が結合する第２のエピトープは、ＣＤ３のエピトープである。ＣＤ３は、４つの別個の鎖からなるＴ細胞共受容体である(Wucherpfennig, K.W. et al. (2010) “Structural Biology Of The T‐Cell Receptor: Insights Into Receptor Assembly, Ligand Recognition, And Initiation Of Signaling,” Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2(4):a005140; pages 1‐14)。哺乳類では、上記複合体ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖及び２つのＣＤ３ε鎖を含有する。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）として公知である分子と連結して、Ｔリンパ球の活性化信号を生成する。ＣＤ３が存在しない場合、ＴＣＲは適切に集合せず、劣化する（Thomas, S. et al. (2010) “Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T‐Cell Receptor Gene Transfer,” Immunology 129(2):170-177）。ＣＤ３は、全ての成熟Ｔ細胞の膜に結合し、実質的に他の細胞タイプには結合しない（Janeway, C.A. et al. (2005) In: Immunobiology: The Immune System In Health And Disease,” 6th ed. Garland Science Publishing, NY, pp. 214‐ 216; Sun, Z. J. et al. (2001) “Mechanisms Contributing To T Cell Receptor Signaling And Assembly Revealed By The Solution Structure Of An Ectodomain Fragment Of The CD3ε:γ Heterodimer,” Cell 105(7):913‐923; Kuhns, M.S. et al. (2006) “Deconstructing The Form And Function Of The TCR/CD3 Complex,” Immunity. 2006 Feb;24(2):133‐139を参照）。
【0181】
以下で議論するように、本発明を説明するために、二重特異性抗ヒトＣＤ３ｘ抗ヒトＤＲ５結合分子を産生した。このような構成のために使用される抗ヒトＣＤ３抗体を、本明細書では「ＣＤ３ ｍＡｂ ２」と称する。ＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１０４）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG
ＣＤ３ ｍＡｂ ２のＣＤＲL１（配列番号１０５）：RSSTGAVTTSNYAN
ＣＤ３ ｍＡｂ ２のＣＤＲL２（配列番号１０６）：GTNKRAP
ＣＤ３ ｍＡｂ ２のＣＤＲL３（配列番号１０７）：ALWYSNLWV
【0182】
ＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１０８）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR
IRSKYNNYAT YYADSVKDRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR
HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS
ＣＤ３ ｍＡｂ ２のＣＤＲH１（配列番号１０９）：TYAMN
ＣＤ３ ｍＡｂ ２のＣＤＲH２（配列番号１１０）：RIRSKYNNYATYYADSVKD
ＣＤ３ ｍＡｂ ２のＣＤＲH３（配列番号１１１）：HGNFGNSYVSWFAY
【0183】
上記ＣＤ３構成のうちのいくつかにおいて、ＣＤ３ ｍＡｂ ２に関して変異型ＶＨドメインを採用した。上記変異型ＶＨドメインは、Ｄ６５Ｇ置換を有し、従って以下に示すアミノ酸配列（配列番号１１２）を有する（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR
IRSKYNNYAT YYADSVKGRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR
HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS
【0184】
上記置換により、ＣＤＲH２がアミノ酸配列（配列番号１１３）RIRSKYNNYATYYADSVKGを有するようになる。置換された位置（Ｄ６５Ｇ）は二重線を付して示す。
【0185】
ここで使用される第２の抗ＣＤ３抗体は、抗体ムロモナブ‐ＣＤ３「ＯＫＴ３」（Xu et al. (2000) “In Vitro Characterization Of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies,” Cell. Immunol. 200:16‐26); Norman, D.J. (1995) “Mechanisms Of Action And Overview Of OKT3,” Ther. Drug Monit. 17(6):615‐620; Canafax, D.M. et al. (1987) “Monoclonal Antilymphocyte Antibody (OKT3) Treatment Of Acute Renal Allograft Rejection,” Pharmacotherapy 7(4):121‐124; Swinnen, L.J. et al. (1993) “OKT3 Monoclonal Antibodies Induce Interleukin‐6 And Interleukin‐10: A Possible Cause Of Lymphoproliferative Disorders Associated With Transplantation,” Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 2(4):670‐678）である。ＯＫＴ３のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１１４）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：QIVLTQSPAI MSASPGEKVT MTCSASSSVS YMNWYQQKSG TSPKRWIYDT
SKLASGVPAH FRGSGSGTSY SLTISGMEAE DAATYYCQQW SSNPFTFGSG
TKLEINR
【0186】
ＯＫＴ３（配列番号１１５）のＶＨドメインのアミノ酸配列を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：QVQLQQSGAE LARPGASVKM SCKASGYTFT RYTMHWVKQR PGQGLEWIGY
INPSRGYTNY NQKFKDKATL TTDKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARYY
DDHYCLDYWG QGTTLTVSS
【0187】
３．ＣＤ１６結合ドメインＣＤ１６は、ＦｃγＲＩＩＩＡ受容体である。ＣＤ１６は、好中球、好酸球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及び凝集しているがモノマーではないヒトＩｇＧに結合する組織マクロファージによって発現される（Peltz, G.A. et al. (1989) “Human Fc Gamma RIII: Cloning, Expression, And Identification Of The Chromosomal Locus Of Two Fc Receptors For IgG,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86(3):1013‐1017; Bachanova, V. et al. (2014) “NK Cells In Therapy Of Cancer,” Crit. Rev. Oncog. 19(1‐2):133‐141; Miller, J.S. (2013) “Therapeutic Applications: Natural Killer Cells In The Clinic,” Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2013:247‐253; Youinou, P. et al. (2002) “Pathogenic Effects Of Anti‐Fc Gamma Receptor IIIB (CD16) On Polymorphonuclear Neutrophils In Non‐Organ‐Specific Autoimmune Diseases,” Autoimmun Rev. 1(1‐2):13‐19; Peipp, M. et al. (2002) “Bi‐specific Antibodies Targeting Cancer Cells,” Biochem. Soc. Trans. 30(4):507‐511）。
【0188】
抗ＣＤ１６抗体３Ｇ８の可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１１６）（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：DTVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD FDGDSFMNWY QQKPGQPPKL
LIYTTSNLES GIPARFSASG SGTDFTLNIH PVEEEDTATY YCQQSNEDPY
TFGGGTKLEI K
【0189】
抗ＣＤ１６抗体３Ｇ８の可変重鎖ドメインのアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１１７）（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：QVTLKESGPG ILQPSQTLSL TCSFSGFSLR TSGMGVGWIR QPSGKGLEWL
AHIWWDDDKR YNPALKSRLT ISKDTSSNQV FLKIASVDTA DTATYYCAQI
NPAWFAYWGQ GTLVTVSA
【0190】
抗ＣＤ１６抗体Ａ９の可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１１８）（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：DIQAVVTQES ALTTSPGETV TLTCRSNTGT VTTSNYANWV QEKPDHLFTG
LIGHTNNRAP GVPARFSGSL IGDKAALTIT GAQTEDEAIY FCALWYNNHW
VFGGGTKLTVL
【0191】
抗ＣＤ１６抗体Ａ９の可変重鎖ドメインのアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１１９）（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：QVQLQQSGAE LVRPGTSVKI SCKASGYTFT NYWLGWVKQR PGHGLEWIGD
IYPGGGYTNY NEKFKGKATV TADTSSRTAY VQVRSLTSED SAVYFCARSA
SWYFDVWGAR TTVTVSS
【0192】
４．ＣＤ１９結合ドメインＣＤ１９抗原は、免疫グロブリンＩｇスーパーファミリーに属するＩ型膜貫通糖タンパク質である。ＣＤ１９は、濾胞性樹状細胞及びＢ細胞上で発現する。これは、Ｂ細胞発現全体を通して発現するものの、未成熟Ｂ細胞に比べて成熟Ｂ細胞では３倍高い発現を示す、ｐａｎ Ｂ細胞マーカーと考えられる（Raufi A. et al. (2013) “Targeting CD19 In B‐Cell Lymphoma: Emerging Role Of SAR3419,” Cancer Manag. Res. 5:225‐233）。多くのCD19 抗体が説明されている(例えばMD1342, MEDI‐551等)( Mei, H.E. et al. (2012) “Rationale Of Anti‐CD19 Immunotherapy: An Option To Target Autoreactive Plasma Cells In Autoimmunity,” Arthritis Res. Ther. 14(Suppl 5):S1:1‐16)。抗ＣＤ１９結合分子「ブリナツモマブ」が、欧州特許第２１８６５２７号に開示されている。
【0193】
好ましい抗ＣＤ１９抗体（ＨＤ３７）のＶＬドメインのアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１２０）（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：DILITQSPKS MSMSVGERVT LTCKASENVV TYVSWYQQKP EQSPKLLIYG
ASNRYTGVPD RFTGSGSATD FTLTISSVQA EDLADYHCGQ GYSYPYTFGG
GTKLEIKR
【0194】
抗ＣＤ１９抗体ＨＤ３７のＶＨドメインのアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１２１）（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：QVQLQQSGAE LVRPGSSVKI SCKASGYAFS SYWMNWVKQR PGQGLEWIGQ
IWPGDGDTNY NGKFKGKATL TADESSSTAY MQLSSLASED SAVYFCARRE
TTTVGRYYYA MDYWGQGTSV TVSS
【0195】
５．ＣＤ２０結合ドメインＣＤ２０は、成熟Ｂ細胞上及びＢ細胞非ホジキンリンパ腫において発現するものの、初期Ｂ細胞前駆体又は後期成熟形質細胞上では発現しない、Ｂ細胞特異性分化抗原である（Maloney, D.G. (2012) “Anti‐CD20 Antibody Therapy for B‐Cell Lymphomas,” N. Engl. J. Med. 366:2008‐2016）。リツキシマブは、例示的な抗ヒトＣＤ２０抗体である。キメラ抗ＣＤ２０抗体（リツキシマブ）のＶＬドメインのアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１２２）（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：
QIVLSQSPAI LSASPGEKVT MTCRASSSVS YIHWFQQKPG SSPKPWIYAT
SNLASGVPVR FSGSGSGTSY SLTISRVEAE DAATYYCQQW TSNPPTFGGG
TKLEIKR
【0196】
抗ＣＤ２０抗体（リツキシマブ）のＶＨドメインのアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１２３）（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：QVQLQQPGAE LVKPGASVKM SCKASGYTFT SYNMHWVKQT PGRGLEWIGA
IYPGNGDTSY NQKFKGKATL TADKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARST
YYGGDWYFNVWGAGTTVTVS A
【0197】
本発明に従って使用できる代替的な抗ＣＤ２０抗体としては、以下の市販の抗体が挙げられる：イブリツモマブ（例えばＺｅｖａｌｉｎ（登録商標）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）；オファツムマブ（例えばＡｒｚｅｒｒａ（登録商標）、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅＧｌａｘｏ）；及びトシツモマブ（例えばＢｅｘｘａｒ（登録商標）、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）。
【0198】
６．ＣＤ２２結合ドメインＣＤ２２は、成熟Ｂ細胞の表面において確認され、またある程度の未成熟Ｂ細胞においても程度は低いものの確認される、糖結合性膜貫通タンパク質である（国際公開第２０１１／０３２６３３号; Poe, J.C. et al. (2012) “CD22 And Siglec‐G In B Cell Function And Tolerance,” Trends Immunol. 33(8):413‐420; Chen, W.C. et al. (2012) “Targeting B Lymphoma With Nanoparticles Bearing Glycan Ligands Of CD22,” Leuk. Lymphoma 53(2):208‐210; Walker, J.A. (2008) “CD22: An Inhibitory Enigma,” Immunology 123(3):314‐325; Coleman, M. et al. (2003) “Epratuzumab: Targeting B‐Cell Malignancies Through CD22,” Clin. Cancer Res. 9(10 Pt 2):3991S‐3994S）。
【0199】
抗ＣＤ２２抗体（エプラツズマブ）のＶＬドメインのアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１２４）（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：DIQLTQSPSS LSASVGDRVT MSCKSSQSVL YSANHKNYLAWYQQKPGKAP
KLLIYWASTR ESGVPSRFSG SGSGTDFTFT ISSLQPEDIA TYYCHQYLSS
WTFGGGTKVQ IKR
【0200】
抗ＣＤ２２抗体（エプラツズマブ）のＶＨドメインのアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１２５）（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYTFT SYWLHWVRQA PGQGLEWIGY
INPRNDYTEY NQNFKDKATI TADESTNTAY MELSSLRSED TAFYFCARRD
ITTFYWGQGT TVTVSS
【0201】
７．ＣＤ３２Ｂ結合ドメインヒトＣＤ３２Ｂに結合する抗体のＶＬドメインに関する好ましい配列は、ＣＤ３２Ｂ ｍＡｂ １（配列番号１２６）である（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：
DIQMTQSPSS LLAALGERVS LTCRASQEIS GYLSWLQQKP DGTIKRLIYA
ASTLDSGVPK RFSGSESGSD YSLTISSLES EDFADYYCLQ YFSYPLTFGA
GTKLELK
【0202】
ヒトＣＤ３２Ｂに結合する抗体のＶＨドメインに関する好ましい配列は、以下の通りである（配列番号１２７）（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）： EVKLEESGGG LVQPGGSMKL SCEASGFTFS DAWMDWVRQS PEKGLEWVAE
IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDSKSS VYLQMNSLRA EDTGIYYCGA
LGLDYWGQGT TLTVSS
【0203】
８．ＣＤ６４結合ドメインＣＤ６４はＦｃγＲＩ受容体であり、単球／マクロファージ、樹状細胞及び活性化された顆粒球上に発現する。上記発現は、ＩＦＮ‐γ刺激によって上方制御できる。ＣＤ６４は、ＩｇＧ免疫複合体に結合する。ＣＤ６４は、抗原捕捉、ＩｇＧ／抗原複合体の食作用、及び抗体依存性細胞傷害性において作用する（国際公開第２００６／００２４３８号）。
【0204】
ヒトＣＤ６４に結合する抗体のＶＬドメインに関する好ましい配列は、ＣＤ６４ ｍＡｂ １（配列番号１２８）である（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD
ASSRATGIPA RFGGSGSGGT DFTLTISSLE PEDFAVYYCQ LRSNWPPYTF
GQGTKLEIK
【0205】
ヒトＣＤ６４に結合する抗体のＶＨドメインに関する好ましい配列は、以下の通りである（配列番号１２９）（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFIFS GYGMHWVRQA PGKGLEWVTV
IWYDGSNKYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDT
GDRFFDYWGQ GTLVTVSS
【0206】
９．ＢＣＲ／ＣＤ７９結合ドメインＢＣＲは膜免疫グロブリンで構成され、これはＣＤ７９のα及びβサブユニット（それぞれ「ＣＤ７９ａ」及び「ＣＤ７９ｂ」）と非共有結合的に連結してＢＣＲ複合体を形成する。ＣＤ７９ａ及びＣＤ７９ｂは、シグナル伝達に必要な、保存された免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（「ＩＴＡＭ」）を含むシグナル伝達サブユニットである（Dylke, J. et al. (2007) “Role Of The Extracellular And Transmembrane Domain Of Ig‐Alpha/Beta In Assembly Of The B Cell Antigen Receptor (BCR),” Immunol. Lett. 112(1):47‐57; Cambier, J.C. (1995) “New Nomenclature For The Reth Motif (or ARH1/TAM/ARAM/YXXL),” Immunol. Today 16:110）。多価抗原によるＢＣＲ複合体の凝集は、ＣＤ７９ａ及びＣＤ７９ｂ ＩＴＡＭのトランスリン酸化並びに受容体関連キナーゼの活性化によって開始される（DeFranco, A.L. (1997) “The Complexity Of Signaling Pathways Activated By The BCR,” Curr. Opin. Immunol. 9:296‐308; Kurosaki, T. (1997) “Molecular Mechanisms In B Cell Antigen Receptor Signaling,” Curr. Opin. Immunol. 9:309‐318; Kim, K.M. et al. (1993) “Signalling Function Of The B‐Cell Antigen Receptors,” Immun. Rev. 132:125‐146）。リン酸化されたＩＴＡＭは、ＰＩ3Ｋ、ＰＬＣ‐γ、及びＲａｓ／ＭＡＰＫ経路のメンバーといった更なるエフェクタを補充する。これらのシグナル伝達イベントは、Ｂ細胞増殖と、後続のＴヘルパー（「Ｔh」）細胞との相互作用のためにＢ細胞を準備するために必要な活性化マーカー（ＭＨＣＩＩ及びＣＤ８６等）の発現の増大との両方の要因となる。
【0207】
ヒトＢ細胞受容体（ＣＤ７９）に結合する抗体のＶＬドメインに関する好ましい配列は、ＣＤ７９ ｍＡｂ １（配列番号１３０）である（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：DVVMTQTPLT LSVNIGQPAS ISCKSSQSLL DTDGKTYLNW LLQRPQGSPN
RLIYLVSKLD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGI YYCWQGTHFP
LTFGAGTKLE LK
【0208】
ヒトＢ細胞受容体（ＣＤ７９）に結合する抗体のＶＨドメインに関する好ましい配列は、以下の通りである（配列番号１３１）（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：QVQLQQPGAE LVRPGASVKL SCKASGYTFT SYWMNWVKQR PGQGLEWIGM
VDPSDSETHY NQMFKDKATL TVDKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARAM
GYWGQGTSVT VSS
【0209】
１０．Ｔ細胞受容体結合ドメイン代替実施形態では、本発明の三重特異性結合分子が結合する第２のエピトープは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のエピトープである。Ｔ細胞受容体は、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞によって自然に発現され、これらの細胞が、抗原提示細胞のクラスＩ又はクラスＩＩＭＨＣタンパク質が結合して提示する抗原ペプチドを認識できるようにする。ａＴＣＲによるｐＭＨＣ（ペプチド-ＭＨＣ）複合体の認識により、サイトカインの産生及び抗原提示細胞の溶解につながる細胞免疫応答の伝播が開始される（例えばArmstrong, K.M. et al. (2008) “Conformational Changes And Flexibility In T‐Cell Receptor Recognition Of Peptide-MHC Complexes,” Biochem. J. 415(Pt 2):183-196; Willemsen, R. (2008) “Selection Of Human Antibody Fragments Directed Against Tumor T‐Cell Epitopes For Adoptive T‐Cell Therapy,” Cytometry A. 73(11):1093‐1099; Beier, K.C. et al. (2007) “Master Switches Of T‐Cell Activation And Differentiation,” Eur. Respir. J. 29:804‐812; Mallone, R. et al. (2005) “Targeting T Lymphocytes For Immune Monitoring And Intervention In Autoimmune Diabetes,” Am. J. Ther. 12(6):534-550を参照）。ＣＤ３は、ＴＣＲに結合する受容体である（Thomas, S. et al. (2010) “Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T‐Cell Receptor Gene Transfer,” Immunology 129(2):170‐177; Guy, C.S. et al. (2009) “Organization Of Proximal Signal Initiation At The TCR:CD3 Complex,” Immunol. Rev. 232(1):7‐21; St. Clair, E.W. (Epub 2009 Oct 12) “Novel Targeted Therapies For Autoimmunity,” Curr. Opin. Immunol. 21(6):648‐657; Baeuerle, P.A. et al. (Epub 2009 Jun 9) “Bi‐specific T‐Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy,” Cancer Res. 69(12):4941‐4944; Smith‐Garvin, J.E. et al. (2009) “T Cell Activation,” Annu. Rev. Immunol. 27:591‐619; Renders, L. et al. (2003) “Engineered CD3 Antibodies For Immunosuppression,” Clin. Exp. Immunol. 133(3):307‐309）。
【0210】
Ｔ細胞受容体に特異的に結合する抗体としては、抗ＴＣＲ抗体ＢＭＡ０３１が挙げられる（欧州特許第０４０３１５６号; Kurrle, R. et al. (1989) “BMA 031 - A TCR‐Specific Monoclonal Antibody For Clinical Application,” Transplant Proc. 21(1 Pt 1):1017‐1019; Nashan, B. et al. (1987) “Fine Specificity Of A Panel Of Antibodies Against The TCR/CD3 Complex,” Transplant Proc. 19(5):4270‐4272; Shearman, C.W. et al. (1991) “Construction, Expression, And Biologic Activity Of Murine/Human Chimeric Antibodies With Specificity For The Human α/β T Cell,” J. Immunol. 146(3):928‐935; Shearman, C.W. et al. (1991) “Construction, Expression And Characterization of Humanized Antibodies Directed Against The Human α/β T Cell Receptor,” J. Immunol. 147(12):4366‐4373）。
【0211】
抗ＴＣＲ抗体ＢＭＡ０３１のＶＬドメインのアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１３２）（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCSATSSVS YMHWYQQKPG KAPKRWIYDT
SKLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYCQQW SSNPLTFGQG
TKLEIK
【0212】
抗ＴＣＲ抗体ＢＭＡ０３１のＶＨドメインのアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１３３）（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYKFT SYVMHWVRQA PGQGLEWIGY
INPYNDVTKY NEKFKGRVTI TADKSTSTAY LQMNSLRSED TAVHYCARGS
YYDYDGFVYW GQGTLVTVSS
【0213】
１１．ＮＫＧ２Ｄ受容体結合ドメイン代替実施形態では、本発明の三重特異性結合分子が結合する第２のエピトープは、ＮＫＧ２Ｄ受容体のエピトープである。ＮＫＧ２Ｄ受容体は、全てのヒト（及び他の哺乳類）のナチュラルキラー細胞上（Bauer, S. et al. (1999) “Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D, A Receptor For Stress‐Inducible MICA,” Science 285(5428):727‐729; Jamieson, A.M. et al. (2002) “The Role Of The NKG2D ImmunoRreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing,” Immunity 17(1):19‐29）並びに全てのＣＤ８+Ｔ細胞上（Groh, V. et al. (2001) “Costimulation Of CD8αβ T Cells By NKG2D Via Engagement By MIC Induced On Virus‐Infected Cells,” Nat. Immunol. 2(3):255‐260; Jamieson, A.M. et al. (2002) “The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing,” Immunity 17(1):19‐29）で発現する。このような結合リガンド、及び特に正常な細胞上で発現しないものとしては、組織適合性６０（Ｈ６０）分子、レチノイン酸初期誘導性遺伝子‐１（ＲＡＥ‐１）の産物、及びマウスＵＬ１６結合タンパク質様転写物１（ＭＵＬＴ１）が挙げられる（Raulet D.H. (2003) “Roles Of The NKG2D Immunoreceptor And Its Ligands,” Nature Rev. Immunol. 3:781‐790; Coudert, J.D. et al. (2005) “Altered NKG2D Function In NK Cells Induced By Chronic Exposure To Altered NKG2D Ligand‐Expressing Tumor Cells,” Blood 106:1711‐1717）。ＮＫＧ２Ｄ受容体に特異的に結合する抗体としては、ＫＹＫ‐２．０が挙げられる(Kwong, KY et al. (2008) “Generation, Affinity Maturation, And Characterization Of A Human Anti‐Human NKG2D Monoclonal Antibody With Dual Antagonistic And Agonistic Activity,” J. Mol. Biol. 384:1143‐1156; 及びＰＣＴ／ＵＳ０９／５４９１１）。
【0214】
抗ＮＫＧ２Ｄ抗体ＫＹＫ‐１．０のＶＬドメインのアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１３４）（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：QPVLTQPSSV SVAPGETARI PCGGDDIETK SVHWYQQKPG QAPVLVIYDD
DDRPSGIPER FFGSNSGNTA TLSISRVEAG DEADYYCQVW DDNNDEWVFG
GGTQLTVL
【0215】
抗ＮＫＧ２Ｄ抗体ＫＹＫ‐１．０のＶＨドメインのアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１３５）（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：EVQLVESGGG VVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQA PGKGLEWVAF
IRYDGSNKYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTKY LQMNSLRAED TAVYYCAKDR
FGYYLDYWGQ GTLVTVSS
【0216】
抗ＮＫＧ２Ｄ抗体ＫＹＫ‐２．０のＶＬドメインのアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１３６）（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：QSALTQPASV SGSPGQSITI SCSGSSSNIG NNAVNWYQQL PGKAPKLLIY
YDDLLPSGVS DRFSGSKSGT SAFLAISGLQ SEDEADYYCAAWDDSLNGPV
FGGGTKLTVL
【0217】
抗ＮＫＧ２Ｄ抗体ＫＹＫ‐２．０のＶＨドメインのアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１３７）（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：QVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQA PGKGLEWVAF
IRYDGSNKYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKDR
GLGDGTYFDYWGQGTTVTVS S
【0218】
Ｄ．好ましい本発明の三重特異性結合分子１．好ましいＦｃドメイン
２つの重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、相互作用してＦｃドメインを形成し、これは細胞Ｆｃ受容体（ＦｃγＲ）によって認識されるドメインである。本明細書において使用される場合、用語「Ｆｃドメイン（Ｆｃ ｄｏｍａｉｎ）」は、ＩｇＧ重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。例示的なヒトＩｇＧ１のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１）：
|CH2→
APELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT
231 240 250 260 270 280
←CH2│CH3→
KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA K GQPREPQVY
290 300 310 320 330 340
TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK
350 360 370 380 390 400
←CH3|
LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK
410 420 430 440
【0219】
本明細書全体を通して、ＩｇＧ重鎖の番号付与は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991)中のもののようなＥＵインデックスの番号付与であり、上記文献は参照により、本出願に明示的に援用される。「Ｋａｂａｔ中のもののようなＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の番号付与を表す。免疫グロブリンの成熟重鎖及び軽鎖の可変領域からのアミノ酸は、鎖中のアミノ酸の位置によって表される。Ｋａｂａｔは、抗体に関する多数のアミノ酸配列を記載し、各サブグループに関するアミノ酸コンセンサス配列を識別し、また各アミノ酸に残基番号を割り当てている。Ｋａｂａｔの番号付与スキームは、保存されたアミノ酸を参照して、問題となる抗体を、Ｋａｂａｔ中のコンセンサス配列のうちの１つと整列させることによって、Ｋａｂａｔの概要に含まれていない抗体にまで拡張可能である。残基番号を割り当てるための上記方法は、当該技術分野において標準的なものとなっており、キメラ又はヒト化変異体を含む異なる抗体中の同等の位置のアミノ酸を容易に識別する。例えば、ヒト抗体軽鎖の５０位のアミノ酸は、マウス抗体軽鎖の５０位のアミノ酸と同等の位置を占有する。
【0220】
境界がわずかに変化する場合があるものの、ヒトＩｇＧ ＦｃドメインのＣＨ２ドメインは通常、Ｋａｂａｔの番号付与システムに従うと、ヒトＩｇＧのアミノ酸２３１〜アミノ酸３４１まで延在する。ヒトＩｇＧのＣＨ３ドメインは通常、Ｋａｂａｔの番号付与システムに従うと、ヒトＩｇＧのアミノ酸３４２〜４４７まで延在する。「ヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）」又は「ヒンジドメイン（ｈｉｎｇｅ ｄｏｍａｉｎ）」は一般に、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６〜Ｐｒｏ２３０まで伸長するものとして定義される。
【0221】
多型は、抗体定常領域内の多数の異なる位置（例えばＫａｂａｔに記載されているようなＥＵインデックスによる番号付与で２７０位、２７２位、３１２位、３１５位、３５６位及び３５８位を含むがこれらに限定されないＦｃ位置）において観察されており、従って、本発明の配列と従来技術の配列との間に僅かな差異が存在し得る。ヒト免疫グロブリンの多型形態は、十分に特性決定されている。現在、１８個のＧｍアロタイプが公知である：Ｇ１ｍ（１，２，３，１７）又はＧ１ｍ（ａ，ｘ，ｆ，ｚ）、Ｇ２ｍ（２３）又はＧ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（５，６，１０，１１，１３，１４，１５，１６，２１，２４，２６，２７，２８）又はＧ３ｍ（ｂ１，ｃ３，ｂ３，ｂ０，ｂ３，ｂ４，ｓ，ｔ，ｇ１，ｃ５，ｕ，ｖ，ｇ５）（Lefranc, et al., The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Pergamon, Oxford, pp. 43‐78 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199‐211）。特に、本発明の抗体が、いずれの免疫グロブリン遺伝子のいずれのアロタイプ、アイソアロタイプ又はハプロタイプを組み込むことができ、本明細書中で提供される配列のアロタイプ、アイソアロタイプ又はハプロタイプに限定されないと考えられる。
【0222】
活性化信号及び阻害信号は、Ｆｃ受容体（ＦｃγＲ）ＦｃドメインへのＦｃ受容体（ＦｃγＲ）の結紮に続いて、Ｆｃ受容体（ＦｃγＲ）を通して伝達される。これらの全く異なる機能は、異なる受容体アイソフォーム間の構造的差異に起因する。免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）又は免疫受容体チロシン系阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）と呼ばれる細胞質シグナリングドメイン内の２つの別個のドメインは、異なる応答の原因となる。これらの構造に対する異なる細胞質酵素の補充は、ＦｃγＲ仲介細胞応答の結果を決定づける。ＩＴＡＭ含有ＦｃγＲ複合体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡを含み、その一方でＩＴＩＭ含有複合体はＦｃγＲＩＩＢしか含まない。ヒト好中球は、ＦｃγＲＩＩＡ遺伝子を発現する。免疫複合体又は特異性抗体架橋によるＦｃγＲＩＩＡのクラスタリングは、ＩＴＡＭを、ＩＴＡＭリン酸化を促進する受容体関連キナーゼと凝集させる役割を果たす。ＩＴＡＭリン酸化は、Ｓｙｋキナーゼのドッキング部位として役立ち、その活性化は、下流基質（例えばＰＩ3Ｋ）の活性化をもたらす。細胞活性化は、炎症促進性メディエータの放出につながる。ＦｃγＲＩＩＢ遺伝子は、Ｂリンパ球上で発現し、その細胞外ドメインはＦｃγＲＩＩＡと９６％同一であり、またＩｇＧ複合体に、区別できない様式で結合する。ＦｃγＲＩＩＢの細胞質ドメイン中のＩＴＩＭの存在は、ＦｃγＲの上述の阻害型サブクラスを定義する。最近、この阻害の分子的基礎が確率された。活性化ＦｃγＲと共同結紮すると、ＦｃγＲＩＩＢ中のＩＴＩＭはリン酸化され、ポリリン酸イノシトール５’‐ホスファターゼ（ＳＨＩＰ）のＳＨ２ドメインを誘引し、これは、ＩＴＡＭ含有ＦｃγＲ仲介チロシンキナーゼ活性化の結果として放出されたホスホイノシトールを加水分解し、その結果、細胞内Ｃａ++の流入を防止する。従って、ＦｃγＲＩＩＢの架橋は、ＦｃγＲ結紮に対する活性化応答を弱め、細胞応答性を阻害する。このようにして、Ｂ細胞活性化、Ｂ細胞増殖及び抗体分泌が中断される。
【0223】
本発明の結合分子のＦｃドメインは、完全Ｆｃドメイン（例えば完全ＩｇＧ Ｆｃドメイン）であってよく、又は完全Ｆｃドメインの断片でしかなくてもよい。本発明の二重特異性１価ＦｃダイアボディのＦｃドメインは、１つ又は複数のＦｃ受容体（例えば１つ又は複数のＦｃγＲ）に結合できる能力を有してよく、より好ましくは、上記Ｆｃドメインは、（野生型Ｆｃドメインが示す結合に比べて）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）若しくはＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合の変化を引き起こし、又は上記Ｆｃドメインの、１つ若しくは複数の阻害性受容体に結合する能力を有意に低減する。よって、本発明のＦｃドメイン含有ダイアボディのＦｃドメインは、完全ＦｃドメインのＣＨ２ドメインのうちのある程度若しくは全体及び／若しくはＣＨ３ドメインのうちのある程度若しくは全体を含んでよく、又は（例えば完全ＦｃドメインのＣＨ２若しくはＣＨ３ドメインに対する１つ若しくは複数の挿入及び／若しくは１つ若しくは複数の欠失を含んでよい）変異型ＣＨ２及び／若しくは変異型ＣＨ３配列を備えてよい。このようなＦｃドメインは、非Ｆｃポリペプチド部分を備えてよく、又は自然に発生しない完全Ｆｃドメインの部分を備えてよく、又はＣＨ２及び／若しくはＣＨ３ドメインの自然に発生しない配向を備えてよい（例えば２つのＣＨ２ドメイン若しくは２つのＣＨ３ドメイン、若しくはＮ末端からＣ末端への方向において、ＣＨ３ドメインと、これが連結したＣＨ２ドメイン、等）。
【0224】
変化したエフェクタ機能として表されるＦｃドメイン修飾には当該技術分野において公知であり、活性化型受容体に対する結合を増大させる修飾（例えばＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ））、及び阻害型受容体に対する結合を低下させる修飾（例えばＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ））が含まれる（例えばStavenhagen, J.B. et al. (2007) “Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors,” Cancer Res. 57(18):8882-8890を参照）。
【0225】
特に、本発明のＦｃドメイン含有ダイアボディのポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに関して、（野生型Ｆｃドメイン（配列番号１）が示す結合と比べて）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）又はＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合が低下した（又は結合を実質的に示さない）ことが好ましい。このような変化した結合を仲介できるＦｃ変異及び突然変異形態については上述されている。ある好ましい実施形態では、このようなダイアボディの第１及び／又は第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、置換：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ３９６Ｌのうちのいずれの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又は７つを含む。ＣＤ３２Ｂに対する結合が低下し、及び／又はＣＤ１６Ａに対する結合が増大した、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインの例示的な変異体は、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ又はＰ２９６Ｌ置換を含有する。これらのアミノ酸置換は、いずれの組み合わせでヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインに存在してよい。一実施形態では、上記ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン変異体は、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＹ３００Ｌ置換を含有する。別の実施形態では、上記ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン変異体は、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ２９６Ｌ置換を含有する。一実施形態では、このようなダイアボディの第１及び／又は第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、置換：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ｑのうちのいずれの１つ、２つ又は３つを含む。別の実施形態では、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン変異体は、Ｎ２９７Ｑ置換、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換、又はＤ２６５Ａ置換を含有する。というのは、これらの突然変異がＦｃＲ結合を消失させるためである。あるいは、（野生型ＩｇＧＩＦｃドメイン（配列番号１）が示す結合と比べて）本来的にＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）への結合が低下している（若しくは結合を実質的に示さない）、及び／又はエフェクタ機能が低下している（若しくはエフェクタ機能を実質的に示さない）ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを利用する。ある具体的実施形態では、本発明のＦｃドメイン含有ダイアボディは、ＩｇＧ２ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインを備える。ＩｇＧ４ Ｆｃドメインを利用する場合、本発明はまた、鎖交換の発生を低減するための、非特許文献１８に記載されているようなＥＵインデックスによって番号付与されたＳ２２８Ｐ等の、安定化突然変異の導入を包含する（Lu et al., (2008) “The Effect Of A Point Mutation On The Stability Of Igg4 As Monitored By Analytical Ultracentrifugation,” J Pharmaceutical Sciences 97:960‐969）当該技術分野で公知の他の安定化突然変異を、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインに導入してもよい（Peters, P et al., (2012) “Engineering an Improved IgG4 Molecule with Reduced Disulfide Bond Heterogeneity and Increased Fab Domain Thermal Stability,” J. Biol. Chem., 287:24525‐24533;；国際公開第２００８／１４５１４２号）。Ｎ２９７Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＤ２６５Ａ置換はエフェクタ機能を消失させるため、エフェクタ機能が望まれる状況においては、これらの置換を採用しないことが好ましい。
【0226】
このようなポリペプチド鎖のＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインは配列が同一である必要はなく、有利には、これら２つのポリペプチド間の複合体化を促進するために修飾される。例えば、ＣＨ２又はＣＨ３ドメインにアミノ酸置換（好ましくは「ノブ（ｋｎｏｂ）」を形成する嵩高な側鎖基、例えばトリプトファンを含むアミノ酸による置換）を導入して、立体障害により、同様に突然変異させたドメインとの相互作用を防止し、上記変化させたドメインを、相補的な又は適応した突然変異（例えばグリシンによる置換）を施されたドメイン、即ち「ホール（ｈｏｌｅ）」とペアにすることができる。このような一連の突然変異は、三重特異性結合分子のポリペプチドのうちのいずれの２つに施すことができる。ホモ二量体化を抑えてヘテロ二量体化を促進するためのタンパク質加工の方法は、特に免疫グロブリン様分子の加工に関して当該技術分野で公知であり、本明細書に包含される（例えばRidgway et al. (1996) “‘Knobs-Into-Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,” Protein Engr. 9:617-621; Atwell et al. (1997) “Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,” J. Mol. Biol. 270: 26-35；及びXie et al. (2005) “A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis,” J. Immunol. Methods 296:95-101を参照（これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される））。好ましくは、「ノブ」は第１のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン内に加工され、「ホール」は他のＣＨ２‐ＣＨ３含有ポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに加工される。このようにして、「ノブ」は、第１のポリペプチド鎖がそのＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインによってホモ二量体化するのを防止する役に立つ。ＣＨ２‐ＣＨ３「ホール担持」ポリペプチド鎖は、ＣＨ２‐ＣＨ３「ノブ担持」ポリペプチド鎖とヘテロ二量体化し、またそれ自体とホモ二量体化する。好ましいノブは、天然ＩｇＧ Ｆｃドメインを修飾して修飾基Ｔ３６６Ｗを含有させることによって生成される。好ましいホールは、天然ＩｇＧ Ｆｃドメインを修飾して修飾基Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含有させることによって生成される。最終的な三重特異性結合分子から「ホール担持」ポリペプチド鎖ホモ二量体を精製するのを補助するために、「ホール担持」ＦｃドメインのＣＨ２及びＣＨ３ドメインのタンパク質Ａ結合部位を、４３５位におけるアミノ酸置換（Ｈ４３５Ｒ）によって突然変異させることが好ましい。従って「ホール担持」Ｆｃドメインホモ二量体はタンパク質Ａに結合せず、その一方で、所望の三重特異性結合分子は、第１のポリペプチド鎖上のタンパク質Ａ結合部位を介してタンパク質Ａに結合する能力を有したままとなる。
【0227】
本発明のＦｃドメイン含有ダイアボディの第１のポリペプチド鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましい配列は、「ノブ担持」配列（配列番号５２）：APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LSLSPGK
を有する。
【0228】
２つのポリペプチド鎖を有する本発明のＦｃドメイン含有ダイアボディの第２のポリペプチド鎖（又は３つのポリペプチド鎖を有するＦｃドメイン含有ダイアボディの第３のポリペプチド鎖）のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましい配列は、「ホール担持」配列（配列番号５３）：APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNRYTQKS LSLSPGK
を有する。
【0229】
上述のように、配列番号５２及び配列番号５３のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、アラニンによる２３４位の置換及びアラニンによる２３５位の置換を含み、従って、（野生型Ｆｃドメイン（配列番号１）が示す結合と比べて）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）又はＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合が低下した（又は結合を実質的に示さない）Ｆｃドメインを形成する。
【0230】
第１のポリペプチド鎖が、配列番号５２のもの等の「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３配列を有することが好ましい。しかしながら、理解されるように、第１のポリペプチド鎖中に「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（例えば配列番号５３）を採用でき、この場合「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（例えば配列番号５２）は、２つのポリペプチド鎖を有する本発明のＦｃドメイン含有ダイアボディの第２のポリペプチド鎖（又は３つのポリペプチド鎖を有するＦｃドメイン含有ダイアボディの第３のポリペプチド鎖）中に採用される。
【0231】
１．好ましい第１のポリペプチド鎖本発明の好ましい結合分子の第１のポリペプチド鎖は、エピトープＩに結合できる可変軽鎖ドメイン（ＶＬI）、エピトープＩＩに結合できる可変重鎖ドメイン（ＶＨII）、ヘテロ二量体促進ドメイン及びＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを備える。
【0232】
第１のポリペプチドの可変軽鎖及び可変重鎖ドメインは、異なるエピトープに向かって配向されているため、これらは、エピトープＩ又はエピトープＩＩに結合できる結合ドメインを形成するために一体に連結できない。第１のポリペプチドの可変軽鎖及び可変重鎖ドメインは、これらのドメインの連結を実質的に防止するために、十分に短い介在リンカーペプチドによって互いから分離されている。「リンカー１」と呼ばれる例示的なリンカーは、配列（配列番号３３）：GGGSGGGGを有する。
【0233】
第１のポリペプチドの可変重鎖ドメイン、及び上記ポリペプチドのヘテロ二量体促進ドメインは好ましくは、１、２、３、又は４つ以上のシステイン残基を含有する介在リンカーペプチドによって、互いから分離されている。好ましいシステイン含有スペーサペプチド（「リンカー２」）は、配列番号３４：GGCGGGの配列を有する。
【0234】
ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを本発明の分子のポリペプチド鎖に連結するために採用できるリンカーとしては：ASTKG（配列番号４７）、DKTHTCPPCP（配列番号４８）、LEPKSS（配列番号４９）及びAPSSSPME（配列番号５０）、APSSS（配列番号１５２）並びにGGG又はGCGが挙げられる。クローニングを容易にするために、GGG又はGCGの代わりに配列番号４９を用いてよい。更に、代替的なリンカー（LEPKSSDKTHTCPPCP；配列番号５１）を形成するために、配列番号４９の直後に配列番号４７を続けてよい。
【0235】
第１のポリペプチドのヘテロ二量体促進ドメイン及び第２のポリペプチドのヘテロ二量体促進ドメインは、協調的に選択される。これらのドメインは互いに異なっており、第１及び第２のポリペプチド鎖の連結を促進するために互いに連結するよう設計される。例えば上記ヘテロ二量体促進ドメインのうちの一方は、ｐＨ７において負電荷を有するように加工され、その一方で上記２つのポリペプチド鎖のうちのもう一方は、ｐＨ７において正電荷を有するように加工される。このような荷電ドメインの存在は、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の連結を促進し、従ってヘテロ二量体化を促進する。第１及び第２のポリペプチド鎖に対して採用されるドメインが、これらの鎖の間のヘテロ二量体を促進できるように異なっている限り、どの鎖にどのヘテロ二量体促進ドメインが提供されるかは重要ではない。
【0236】
ヘテロ二量体促進ドメインは、ＩｇＧ ＣＬ及びＣＨ１ドメインであってよく、又はヒトＩｇＧのヒンジドメインに由来するアミノ酸配列GVEPKSC（配列番号３５）若しくはVEPKSC（配列番号３６）であってよく、またＣＬドメインの代わりに、ヒトカッパ軽鎖のＣ末端６アミノ酸、GFNRGEC（配列番号３７）又はFNRGEC（配列番号３８）を採用してよい。
【0237】
しかしながらより好ましくは、上述のようなダイアボディのヘテロ二量体促進ドメインは、少なくとも６つ、少なくとも７つ又は少なくとも８つの帯電アミノ酸残基を含む、反対の極の１つ、２つ、３つ又は４つのタンデム反復コイルドメインから形成される（Apostolovic, B. et al. (2008) “pH‐Sensitivity of the E3/K3 Heterodimeric Coiled Coil,” Biomacromolecules 9:3173-3180; Arndt, K.M. et al. (2001) “Helix‐stabilized Fv (hsFv) Antibody Fragments: Substituting the Constant Domains of a Fab Fragment for a Heterodimeric Coiled‐coil Domain,” J. Molec. Biol. 312:221‐228; Arndt, K.M. et al. (2002) “Comparison of In Vivo Selection and Rational Design of Heterodimeric Coiled Coils,” Structure 10:1235‐1248; Boucher, C. et al. (2010) “Protein Detection By Western Blot Via Coiled-Coil Interactions,” Analytical Biochemistry 399:138‐140; Cachia, P.J. et al. (2004) “Synthetic Peptide Vaccine Development: Measurement Of Polyclonal Antibody Affinity And Cross‐Reactivity Using A New Peptide Capture And Release System For Surface Plasmon Resonance Spectroscopy,” J. Mol. Recognit. 17:540‐557; De Crescenzo, G.D. et al. (2003) “Real‐Time Monitoring of the Interactions of Two‐Stranded de novo Designed Coiled‐Coils: Effect of Chain Length on the Kinetic and Thermodynamic Constants of Binding,” Biochemistry 42:1754‐1763; Fernandez‐Rodriquez, J. et al. (2012) “Induced Heterodimerization And Purification Of Two Target Proteins By A Synthetic Coiled‐Coil Tag,” Protein Science 21:511‐519; Ghosh, T.S. et al. (2009) “End‐To‐End And End‐To‐Middle Interhelical Interactions: New Classes Of Interacting Helix Pairs In Protein Structures,” Acta Crystallographica D65:1032‐1041; Grigoryan, G. et al. (2008) “Structural Specificity In Coiled‐Coil Interactions,” Curr. Opin. Struc. Biol. 18:477‐483; Litowski, J.R. et al. (2002) “Designing Heterodimeric Two‐Stranded α‐Helical Coiled‐Coils: The Effects Of Hydrophobicity And α‐Helical Propensity On Protein Folding, Stability, And Specificity,” J. Biol. Chem. 277:37272‐37279; Steinkruger, J.D. et al. (2012) “The d′‐‐d‐‐d′ Vertical Triad is Less Discriminating Than the a′‐‐a‐‐a′ Vertical Triad in the Antiparallel Coiled‐coil Dimer Motif,” J. Amer. Chem. Soc. 134(5): 2626-2633; Straussman, R. et al. (2007) “Kinking the Coiled Coil - Negatively Charged Residues at the Coiled‐coil Interface,” J. Molec. Biol. 366:1232‐1242; Tripet, B. et al. (2002) “Kinetic Analysis of the Interactions between Troponin C and the C‐terminal Troponin I Regulatory Region and Validation of a New Peptide Delivery/Capture System used for Surface Plasmon Resonance,” J. Molec. Biol. 323:345-362; Woolfson, D.N. (2005) “The Design Of Coiled‐Coil Structures And Assemblies,” Adv. Prot. Chem. 70:79‐112; Zeng, Y. et al. (2008) “A Ligand‐Pseudoreceptor System Based On de novo Designed Peptides For The Generation Of Adenoviral Vectors With Altered Tropism,” J. Gene Med. 10:355‐367）。
【0238】
このような反復コイルドメインは、完全な反復であってよく、又は置換を有してよい。例えば、第１のポリペプチド鎖のヘテロ二量体促進ドメインは、８つの負帯電アミノ酸残基のシーケンスを含んでよく、第２のポリペプチド鎖のヘテロ二量体促進ドメインは、８つの負帯電アミノ酸残基のシーケンスを含んでよい。反対の極のコイルを他方のポリペプチド鎖に対して使用する場合、第１又は第２のポリペプチド鎖にどのコイルを設けるかは重要ではない。正帯電アミノ酸は、リジン、アルギニン、ヒスチジン等であってよく、及び／又は負帯電アミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸等であってよい。正帯電アミノ酸は好ましくはリジンであり、及び／又は負帯電アミノ酸は好ましくはグルタミン酸である。（このようなドメインはホモ二量体化を阻害し、これによってヘテロ二量体化を促進するため）単一のヘテロ二量体促進ドメインしか採用できないが、本発明のダイアボディの第１及び第２のポリペプチド鎖両方が、ヘテロ二量体促進ドメインを含有することが好ましい。
【0239】
ある好ましい実施形態では、ヘテロ二量体促進ドメインのうちの一方は、４つのタンデム「Ｅコイル」螺旋形ドメイン（配列番号３９：EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK）を備え、そのグルタミン酸残基はｐＨ７において負電荷を形成し、その一方で、ヘテロ二量体促進ドメインのうちのもう一方は、４つのタンデム「Ｋコイル」ドメイン（配列番号４０：KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE）を備え、そのリジン残基はｐＨ７において正電荷を形成する。このような帯電ドメインの存在は、第１及び第２のポリペプチド間の連結を促進し、ヘテロ二量体化を助長する。特に好ましいのは、配列番号３９の４つのタンデム「Ｅコイル」螺旋形ドメインのうちの１つが、システイン残基EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号４１）を含有するように修飾された、ヘテロ二量体促進ドメインである。同様に、特に好ましいのは、配列番号４０の４つのタンデム「Ｋコイル」螺旋形ドメインのうちの１つが、システイン残基KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号４２）を含有するように修飾された、ヘテロ二量体促進ドメインである。
【0240】
国際公開第２０１２／０１８６８７号に開示されているように、ダイアボディのインビボ薬物動態特性を改善するために、ダイアボディを、ダイアボディの末端のうちの１つ又は複数に血清結合タンパク質のポリペプチド部分を含有するように修飾してよい。最も好ましくは、このような血清結合タンパク質のポリペプチド部分は、ダイアボディのＣ末端に配置されることになる。アルブミンは、血漿中に最も豊富なタンパク質であり、ヒトにおいて１９日の半減期を有する。アルブミンは複数の小さな分子結合部位を有し、これによりアルブミンは他のタンパク質に非共有結合して血清半減期を延長できる。連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）は、安定した３重螺旋束を形成する４６個のアミノ酸残基からなり、広範なアルブミン結合特異性を有する（Johansson, M.U. et al. (2002) “Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules,” J. Biol. Chem. 277(10):8114‐8120）。従って、ダイアボディのインビボ薬物動態特性を改善するための、血清結合タンパク質の特に好ましいポリペプチド部分は、連鎖球菌タンパク質Ｇからのアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）、及びより好ましくは、連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）（配列番号４３）：LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIDNAKS AEGVKALIDE ILAALPである。
【0241】
国際公開第２０１２／１６２０６８号（参照により本出願に援用される）に開示されているように、配列番号４３の「脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）」変異体は、ＭＨＣクラスＩＩ結合を減衰させる又は除去する能力を有する。組み合わせ突然変異の結果に基づき、以下の置換の組み合わせが、上述のような脱免疫化アルブミン‐結合ドメインを形成するための好ましい置換であると考えられる：６６Ｓ／７０Ｓ＋７１Ａ；６６Ｓ／７０Ｓ＋７９Ａ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｓ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｄ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｅ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｓ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｄ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｅ。修飾Ｌ６４Ａ、Ｉ６５Ａ及びＤ７９Ａ又は修飾Ｎ６６Ｓ、Ｔ７０Ｓ及びＤ７９Ａを有する変異型ＡＢＤ。アミノ酸配列：LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNA64A65NNAKT VEGVKALIA79E ILAALP（配列番号４４）、
又はアミノ酸配列：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIS66NAKS70 VEGVKALIA79E ILAALP（配列番号４５）
を有する変異型脱免疫化ＡＢＤは、上述のような脱免疫化アルブミン‐結合ドメインが、ＭＨＣクラスＩＩ結合の減衰を提供しながら、実質的に野生型の結合を呈するため、特に好ましい。従って、アルブミン結合ドメインを有する上述のようなダイアボディの第１のポリペプチド鎖は、好ましくは上記ポリペプチド鎖のＥコイル（又はＫコイル）ドメインのＣ末端に位置決めされることによって、上記Ｅコイル（又はＫコイル）ドメインと上記アルブミン結合ドメイン（これは好ましくは脱免疫化アルブミン結合ドメインである）との間に介在する、第３のリンカー（リンカー３）を含有する。上記リンカー３に関して好ましい配列は、配列番号４６：GGGSである。
【0242】
従って要約すると、本発明の好ましい三重特異性結合分子の好ましい第１のポリペプチド鎖は、以下のドメイン及びリンカーを備える：（ＶＬIドメイン）‐（リンカー１）‐（ＶＨIIドメイン）‐（リンカー２）‐（Ｅコイルヘテロ二量体促進ドメイン）‐（リンカー３）‐（ノブ担持ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン）。
【0243】
３．代替的な第１のポリペプチド鎖一実施形態では、上述のドメインの配向は、Ｎ末端からＣ末端への方向である。しかしながら本発明はその変形例も考察し、ここでは第１のポリペプチド鎖のドメインの配向は：ＮＨ2‐（ノブ担持ＣＨ３‐ＣＨ２ドメイン）‐（ＶＬIドメイン）‐（リンカー１）‐（ＶＨIIドメイン）‐（リンカー２）‐（Ｅコイルヘテロ二量体促進ドメイン）となる。好ましくは、上記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインへのＮ末端にシステイン含有ドメインが存在する。例示的なペプチドの配列は（配列番号４８）：DKTHTCPPCPである。この実施形態において好ましくは、ＣＨ３ドメインは、アミノ酸配列（配列番号１５２）：APSSS、及びより好ましくはアミノ酸配列（配列番号５０）APSSSPMEを有するもの等の介在ペプチドリンカー（リンカー４）によって、ＶＬIドメインから分離されている。
【0244】
４．好ましい第２のポリペプチド鎖上述のような好ましい三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、エピトープＩＩに結合できる可変軽鎖ドメイン（ＶＬII）、エピトープＩに結合できる可変重鎖ドメイン（ＶＨI）、及びヘテロ二量体促進ドメインを備える。
【0245】
第２のポリペプチドの可変軽鎖及び可変重鎖ドメインは、異なるエピトープに向かって配向されているため、これらは、エピトープＩ又はエピトープＩＩに結合できる結合ドメインを形成するために一体に連結できない。第２のポリペプチドの可変軽鎖及び可変重鎖ドメインは、これらのドメインの連結を実質的に防止するために、十分に短い介在リンカーペプチドによって互いから分離されている。配列（配列番号３３）：GGGSGGGGを有する「リンカー１」が、この目的のための例示的なリンカーである。
【0246】
第１のポリペプチド鎖の場合と同様に、第２のポリペプチドの可変重鎖ドメイン、及び上記ポリペプチドのヘテロ二量体促進ドメインは好ましくは、１、２、３、又は４つ以上のシステイン残基を含有する介在リンカーペプチドによって、互いから分離されている。（「リンカー２」）は、配列番号３４：GGCGGGを有する「リンカー２」が、この目的のための例示的なリンカーである。このようなシステイン残基は、第１のポリペプチドの重鎖ドメインと、上記ポリペプチドのヘテロ二量体促進ドメインとを分離する、システイン含有スペーサペプチド中のシステイン残基と、ジスルフィド結合を形成できる。従って、本発明の結合分子の第１及び第２のポリペプチドは、互いに対して共有結合する。
【0247】
上述のように、第２のポリペプチド鎖のヘテロ二量体促進ドメインは、第１のポリペプチド鎖のヘテロ二量体促進ドメインと協調するように選択される。従って好ましい実施形態では、第１のポリペプチド鎖のヘテロ二量体促進ドメインは「Ｋコイル」ドメイン（配列番号４０）又は「Ｅコイル」ドメイン（配列番号３９）である。第１のポリペプチド鎖においてシステイン含有Ｅコイル（配列番号４１）が採用される場合、好ましくは第２のポリペプチド鎖においてシステイン含有Ｋコイル（配列番号４２）が採用される。反対に、第１のポリペプチド鎖においてシステイン含有Ｋコイル（配列番号４２）が採用される場合、好ましくは第２のポリペプチド鎖においてシステイン含有Ｅコイル（配列番号４１）が採用される。第１のポリペプチド鎖は好ましくは「Ｅコイル」ドメインを有するため、第２のポリペプチド鎖は好ましくは「Ｋコイル」ドメインを含有する。
【0248】
第１及び第２のポリペプチド鎖はダイアボディのポリペプチド鎖であるため、これらは一体に連結して、エピトープＩを認識してこれに免疫特異的に結合するドメインＩ結合ドメイン（ＶＬA／ＶＨA）、及びエピトープＩＩを認識してこれに免疫特異的に結合するドメインＩＩ結合ドメイン（ＶＬB／ＶＨB）を形成できる。
【0249】
従って要約すると、本発明の好ましい結合分子の好ましい第２のポリペプチド鎖は、以下のドメイン及びリンカーを備える：（ＶＬIIドメイン）‐（リンカー１）‐（ＶＨIドメイン）‐（リンカー２）‐（Ｋコイルヘテロ二量体促進ドメイン）。
【0250】
５．好ましい第３のポリペプチド鎖本発明の好ましい結合分子の第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、結合ドメイン、任意のＣＨ１‐ヒンジドメイン、及びＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドである。本発明の好ましい結合分子の第３のポリペプチド鎖の結合ドメインは、エピトープＩＩＩに結合できる可変重鎖ドメイン（ＶＨIII）であってよく、この場合、（以下において議論される）本発明の好ましい結合分子の第４のポリペプチド鎖は、エピトープＩＩＩに結合できる可変軽鎖ドメイン（ＶＬIII）を備えるポリペプチドであり、これにより上記結合ドメインが、エピトープＩＩＩを有する抗原に免疫特異的に結合できる。あるいは、本発明の好ましい結合分子の第３のポリペプチド鎖の結合ドメインは、エフェクタ細胞受容体タイプ結合ドメインを備えてよく、この場合、（以下において議論される）本発明の好ましい結合分子の第４のポリペプチド鎖は、相補的なＴ細胞受容体タイプ結合ドメインを備えるポリペプチドであり、これにより、２つのポリペプチド鎖の相互作用が、エフェクタ細胞の表面上に存在する分子に生理学的に特異的に結合できる結合ドメインを形成する。第３のポリペプチド鎖は、自然に発生する抗体から単離できる。あるいは第３のポリペプチド鎖は、組み換えによって構成してよい。例示的なＣＨ１ドメインは、アミノ酸配列（配列番号２０７）：
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKV
を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインである。
【0251】
配列番号２０７のヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインの変異体は、以下の通りである（配列番号２０８）：ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRV
【0252】
例示的なヒンジドメインは、アミノ酸配列（配列番号２０９）：EPKSCDKTHTCPPCPを有するヒトＩｇＧ１ヒンジドメインである。認識されるように、上記例示的なヒンジドメインは、鎖間共有結合に関与し得る複数のシステイン残基を備える（Elkabetz et al. (2005) “Cysteines In CHI Underlie Retention Of Unassembled Ig Heavy Chains,”J. Biol. Chem. 280: 14402-14412）。
【0253】
野生型ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを採用してよいが、上述のように、第１のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインとのヘテロ二量体化を促進する修飾されたＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを採用することが好ましい。
【0254】
従って好ましくは、第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、第１のポリペプチドにおいて採用される「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５２）に対してアミノ酸配列が相補的である「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインである。上述のように、「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは好ましくは、タンパク質Ａ結合部位を除去するための、位置４３５（Ｈ４３５Ｒ）における置換を含むべきである。第３のポリペプチドに関するＨ４３５Ｒ置換を有する「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、配列番号５３である。
【0255】
認識されるように、「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（例えば配列番号５２）を第３のポリペプチド鎖において採用してよく、この場合、「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（例えば配列番号５３）が、第１のポリペプチド鎖において採用されることになる。
【0256】
本発明の好ましい三重特異性結合分子の第３（及び第４）のポリペプチド鎖がそれぞれ、エフェクタ細胞受容体タイプ結合ドメインのポリペプチド鎖を備える実施形態では、このようなエフェクタ細胞受容体タイプ結合ドメインを産生するための方法は公知である（例えば米国公開特許第２０１２／０２９４８７４Ａ１号）。
【0257】
従って要約すると、本発明の好ましい結合分子の第３のポリペプチド鎖は、以下のドメイン及びリンカーを備える：（ＶＨIIIドメイン）‐（任意のヒンジドメイン）‐（「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン）、又は（Ｔ細胞受容体タイプ結合ドメイン；その第１又は第２のポリペプチド）‐（任意のヒンジドメイン）‐（「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン）。
【0258】
６．好ましい第４のポリペプチド鎖本発明の好ましい三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖は、エフェクタ細胞受容体タイプ結合ドメインのポリペプチド（ここで第３及び第４のポリペプチドは、エフェクタ細胞の表面上に見られる受容体のためのリガンドを形成する）、又はより好ましくは、エピトープＩＩＩに免疫特異的に結合する、若しくは第３のポリペプチド鎖の結合ドメインに対して相補的な、上述の抗体の軽鎖である。
【0259】
従って、第３及び第４のポリペプチドがＦａｂタイプ結合ドメインを形成する場合、このような第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、エピトープＩＩＩに結合できる可変軽鎖ドメイン（ＶＬIII）、並びに第３のポリペプチド鎖との共有結合を促進するためのドメイン、又は結合ドメイン、及び第３のポリペプチド鎖との共有結合を促進するための上述のようなドメインを備える。このようなドメインは、ＣＬドメイン、又は（配列番号３８）FNRGECといったそのシステイン含有部分、又は（（配列番号３４）GGCGGGを有する）リンカー２等のリンカーであってよい。このようなリンカー２とジスルフィド結合を形成する例示的なシステイン含有ペプチドは、アミノ酸配列VEPKSC（配列番号３６）又はヒンジドメインを備える。
【0260】
第４のポリペプチド鎖は、自然に発生する抗体から単離できる。あるいは第３のポリペプチド鎖は、組み換えによって構成してよい。好ましいＣＬドメインは、アミノ酸配列（配列番号２１０）：RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG
NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK
SFNRGEC
を有するヒトＩｇＧ１ ＣＬカッパドメインである。
【0261】
あるいは、例示的なＣＬドメインは、アミノ酸配列（配列番号２１１）：QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA
GVETTPSKQS NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP
TECS
を有するヒトＩｇＧ１ ＣＬラムダ２ドメインである。
【0262】
理解されるように、第４のポリペプチド鎖のＣＬドメイン又は他のシステイン含有ドメインは、システイン残基を備える。上記システイン残基は、第３のポリペプチド鎖のＣＨ１含有ドメインと共有結合でき、それによって本発明の結合分子の第３及び第４のポリペプチド鎖を互いに対して共有結合的に複合体化できる。よって第３及び第４のポリペプチド鎖は、互いに対して共有結合する。
【0263】
更に、第１のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのシステイン残基は、第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのシステイン残基とジスルフィド結合を形成できる。よって第１及び第３のポリペプチド鎖は、互いに対して共有結合する。
【0264】
従来の免疫機能では、抗体‐抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用は、抗体依存性細胞毒性、肥満細胞脱顆粒及び食作用等のエフェクタ機能から、リンパ球増殖及び抗体分泌を制御するもの等の免疫調節性信号にまで及ぶ、広範な応答をもたらす。これらの相互作用は全て、抗体又は免疫複合体のＦｃドメインの、造血細胞上の特殊化された細胞表面受容体への結合によって開始される。抗体及び免疫複合体によってトリガされる細胞応答の多様性は、３つのＦｃ受容体：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の構造不均質性によって得られる。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は活性化（即ち免疫系増強）受容体であり；ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）は阻害性（即ち免疫系減衰）受容体である。例示的なＩｇＧ１ Ｆｃドメインのアミノ酸配列（配列番号１）は既上に提示されている。
【0265】
Ｆｃドメインの修飾は通常、表現型の変化、例えば血清半減期の変化、安定性の変化、細胞酵素に対する感受性の変化又はエフェクタ機能の変化につながる。本発明の抗体をエフェクタ機能に関して修飾して、例えば癌の治療における抗体の有効性を増強することが望ましい場合がある。例えば、作用機序が、標的抗原を担持する細胞の殺滅ではなく遮断又は拮抗作用を伴う抗体の場合といった、特定の場合においては、エフェクタ機能の低減又は削減が望ましい。エフェクタ機能の上昇は、ＦｃγＲが低いレベルで発現する腫瘍及び外来細胞、例えばＦｃγＲＩＩＢのレベルが低い腫瘍特異性Ｂ細胞（例えば非ホジキンリンパ腫、ＣＬＬ及びバーキットリンパ腫）といった、望ましくない細胞を対象とする場合に一般に望ましい。上記実施形態では、エフェクタ機能活性が与えられた又は変更された本発明の分子は、エフェクタ機能活性の効率の増強が望ましい疾患、障害又は感染の治療及び／又は予防のために有用である。
【0266】
特定の実施形態では、本発明の三重特異性結合分子は、野生型Ｆｃドメイン（配列番号１）のアミノ酸の配列に対する１つ又は複数の修飾（例えば置換、欠失又は挿入）を有するＦｃドメインを備え、上記修飾は、上記Ｆｃドメインの、従って本発明の分子の、１つ又は複数のＦｃγＲ受容体に対する親和性及び結合活性を低下させる。他の実施形態では、本発明の分子は、野生型Ｆｃドメインのアミノ酸に対する１つ又は複数の修飾を有するＦｃドメインを備え、上記修飾は、上記Ｆｃドメインの、従って本発明の分子の、１つ又は複数のＦｃγＲ受容体に対する親和性及び結合活性を上昇させる。他の実施形態では、上記分子は変異型Ｆｃドメインを含み、ここで上記変異型は、Ｆｃドメインを含まない、又は野生型Ｆｃドメインを含む分子に対して、ＡＤＣＣ活性の上昇、及び／又はＦｃγＲＩＩＡへの結合の増大を与える、又は仲介する。代替実施形態では、上記分子は変異型Ｆｃドメインを含み、ここで上記変異型は、ドメインを含まない、又は野生型Ｆｃドメインを含む分子に対して、ＡＤＣＣ活性（若しくは他のエフェクタ機能）の低下、及び／又はＦｃγＲＩＩＢへの結合の増大を与える、又は仲介する。いくつかの実施形態では、本発明は、変異型Ｆｃドメインを含む三重特異性結合分子を包含し、上記変異型Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインを含む同等の分子と比べて、いずれのＦｃγＲに対する検出可能な結合を示さない。他の実施形態では、本発明は、変異型Ｆｃドメインを含む三重特異性結合分子を包含し、上記変異型Ｆｃドメインは、単一のＦｃγＲ、好ましくはＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、又はＦｃγＲＩＩＩＡのうちの１つにしか結合しない。このような上昇した親和性及び／又は結合活性は好ましくは、当該細胞内において（修飾されたＦｃドメインを有しない）親分子の結合活性が検出できない場合に低いレベルのＦｃγＲを発現する細胞における、又は３００００〜２００００分子／細胞の密度、２００００〜１００００分子／細胞の密度、１００００〜５０００分子／細胞の密度、５０００〜１０００分子／細胞の密度、１０００〜２００分子／細胞の密度、若しくは２００分子／細胞以下（ただし少なくとも１０、５０、１００若しくは１５０分子／細胞）の密度で非ＦｃγＲ受容体標的抗原を発現する細胞において、検出可能なＦｃγＲへの結合又はＦｃγＲ関連活性の程度をインビトロで測定することによって評価される。
【0267】
本発明の三重特異性結合分子は、活性化及び／又は阻害性Ｆｃγ受容体に対する親和性が変化し得る。一実施形態では、上記三重特異性結合分子は、野生型Ｆｃドメインを有する同等の分子と比べて、ＦｃγＲＩＩＢに対する親和性が上昇し、かつＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＡに対する親和性が低下した、変異型Ｆｃドメインを含む。別の実施形態では、本発明の三重特異性結合分子は、野生型Ｆｃドメインを有する同等の分子と比べて、ＦｃγＲＩＩＢに対する親和性が低下し、かつＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＡに対する親和性が上昇した、変異型Ｆｃドメインを含む。更に別の実施形態では、本発明の三重特異性結合分子は、野生型Ｆｃドメインを有する同等の分子と比べて、ＦｃγＲＩＩＢに対する親和性が低下し、かつＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＡに対する親和性が低下した、変異型Ｆｃドメインを含む。また更に別の実施形態では、本発明の三重特異性結合分子は、野生型Ｆｃドメインを有する同等の分子と比べて、ＦｃγＲＩＩＢに対する親和性が変化せず、かつＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＡに対する親和性が低下（又は上昇）した、変異型Ｆｃドメインを含む。
【0268】
特定の実施形態では、本発明の三重特異性結合分子は、免疫グロブリンが増強されたエフェクタ機能、例えば抗体依存性細胞仲介細胞毒性を有するように、ＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＡに対する親和性が変化した変異型Ｆｃドメインを含む。エフェクタ細胞機能の非限定的な例としては、抗体依存性細胞仲介細胞毒性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用、食作用、オプソニン作用、オプソニン食作用、細胞結合、ロゼット形成、Ｃ１ｑ結合、及び相補性決定細胞仲介細胞毒性が挙げられる。
【0269】
ある好ましい実施形態では、親和性又はエフェクタ機能の変化は、野生型Ｆｃドメインを含む同等の分子に対して少なくとも２倍、好ましくは少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、又は少なくとも１００倍である。本発明の他の実施形態では、変異型Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインを含む分子に対して少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２２５％、又は２５０％高い親和性で、１つ又は複数のＦｃＲに免疫特異的に結合する。このような測定は、インビボ又はインビトロアッセイとすることができ、好ましい実施形態では、ＥＬＩＳＡ又は表面プラズモン共鳴アッセイ等のインビトロアッセイである。
【0270】
様々な実施形態において、本発明の三重特異性結合分子は、変異型Ｆｃドメインを含み、上記変異型は、ＦｃγＲ受容体の少なくとも１つの活性を刺激するか、又はＦｃγＲ受容体の少なくとも１つの活性に拮抗する。好ましい実施形態では、上記分子は、ＦｃγＲＩＩＢの１つ又は複数の活性、例えば、Ｂ細胞受容体‐仲介型シグナリング、Ｂ細胞の活性化、Ｂ細胞増殖、抗体産生、Ｂ細胞の細胞内カルシウム流入、細胞周期進行、ＦｃεＲＩシグナリングのＦｃγＲＩＩＢ‐仲介型阻害、ＦｃγＲＩＩＢのリン酸化、ＳＨＩＰ動員、ＳＨＩＰリン酸化及びＳｈｃとの連結、又はＦｃγＲＩＩＢシグナル伝達経路中の１つ若しくは複数の下流分子の活性（例えばＭＡＰキナーゼ、ＪＮＫ、ｐ３８若しくはＡｋｔ）に拮抗する変異体を含む。別の実施形態では、本発明の三重特異性結合分子は、ＦｃεＲＩの１つ又は複数の活性、例えば肥満細胞活性化、カルシウム可動化、脱顆粒、サイトカイン産生又はセロトニン放出を刺激する変異体を含む。
【0271】
特定の実施形態では、上記分子は、２つ以上のＩｇＧアイソタイプ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）からのＦｃドメイン含有領域を含む。上記様々なＩｇＧアイソタイプは、例えばFlesch, and Neppert (1999) J. Clin. Lab. Anal. 14: 141-156; Chappel et al. (1993) J. Biol. Chem. 33:25124-25131; Chappel et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:9036-9040; 又はBruggemann et al. (1987) J. Exp. Med 166: 1351-1361に記載されているような、そのヒンジ及び／又はドメインのアミノ酸配列の違いにより、血清半減期、補体結合、ＦｃγＲ結合親和性及びエフェクタ機能活性（例えばＡＤＣＣ、ＣＤＣ等）を含む様々な物理的及び機能的特性を呈する。このタイプの変異型Ｆｃドメインを、単独で、又はアミノ酸修飾と組み合わせて使用して、Ｆｃ仲介型エフェクタ機能及び／又は結合活性に影響を及ぼすことができる。組み合わせにおいて、アミノ酸修飾及びＩｇＧヒンジ／Ｆｃドメインは、同様の機能性（例えばＦｃγＲＩＩＡに対する親和性の上昇）を示すことができ、また相加的に、又はより好ましくは相乗的に作用して、野生型Ｆｃドメインを含む本発明の分子と比べて、本発明の分子のエフェクタ機能性を修飾できる。他の実施形態では、アミノ酸修飾及びＩｇＧ Ｆｃドメインは反対の機能性（例えばそれぞれＦｃγＲＩＩＡに対する親和性の上昇及び低下）を示すことができ、また、同一のアイソタイプの、Ｆｃドメインを含まない又は野生型Ｆｃドメインを含む本発明の分子と比べて、本発明の分子の特異的機能性を選択的に調節又は低下させるよう作用できる。
【0272】
好ましい具体的実施形態では、本発明の三重特異性結合分子は、変異型Ｆｃドメインを含み、上記変異型Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインに対する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、これにより、上記変異体Ｆｃドメインが、Sondermann et al. (2000) Nature 406:267-73に開示されているもののようなＦｃ‐ＦｃＲ相互作用の結晶学的及び構造的分析に基づいて、ＦｃγＲと直接接触する位置において置換を有しない場合に上記分子のＦｃＲに対する親和性が変化する。ＦｃγＲと直接接触するＦｃドメイン内の位置の例は、アミノ酸残基２３４‐２３９（ヒンジ領域）、アミノ酸残基２６５‐２６９（Ｂ／Ｃループ）、アミノ酸残基２９７‐２９９（Ｃ’／Ｅループ）及びアミノ酸残基３２７‐３３２（Ｆ／Ｇループ）である。いくつかの実施形態では、本発明の分子は、構造的及び結晶学的分析に基づいてＦｃγＲと直接接触しない、例えばＦｃ‐ＦｃγＲ結合部位内にない、少なくとも１つの残基の修飾を含む、変異型Ｆｃドメインを含む。
【0273】
変異型Ｆｃドメインは当該技術分野において公知であり、例えばＮＫ依存性又はマクロファージ依存性アッセイにおいて機能的にアッセイされるような、Ｆｃドメイン（若しくはその一部）を備える本発明の分子が呈するエフェクタ機能を付与又は改変するために、いずれの公知のＦｃ変異体を本発明において使用してよい。例えば、変化したエフェクタ機能として識別されるＦｃドメイン変異体は、抗体工学技術の分野において開示されており、開示されているいずれの好適な変異体を、本発明の分子において使用してよい。
【0274】
特定の実施形態では、本発明の三重特異性結合分子は、１つ又は複数の部位において１つ又は複数のアミノ酸修飾を有する変異型Ｆｃドメインを含み、上記１つ又は複数の修飾は、変異型Ｆｃドメインの、阻害型ＦｃγＲ（ＦｃγＲＩＩＢ等）に対する親和性に対する活性化ＦｃγＲ（ＦｃγＲＩＩＡ又はＦｃγＲＩＩＩＡ等）に対する親和性の比率を、（野生型Ｆｃドメインに対して）変化させる：【数1】
【0275】
（野生型Ｆｃドメインに対して）Ｆｃ変異体の親和性の比率が１を超える変異型Ｆｃドメインを有する本発明の三重特異性結合分子が特に好ましい。このような分子は、例えば癌又は感染症といった、ＦｃγＲが仲介するエフェクタ細胞機能（例えばＡＤＣＣ）の効率の増強が望まれる疾患、障害、若しくは感染の治療的若しくは予防的処置、又はその症状の寛解を提供するにあたって特定の用途を有する。対照的に、親和性の比率が１未満であるＦｃ変異体は、エフェクタ細胞機能の効率の低下を仲介する。表１は、例示的な単一、二重、三重、四重及び五重突然変異を、その親和性の比率が１を超えるか１未満であるかによって列挙している。
【0276】
【表2】
【0277】
ある具体的な実施形態では、変異型Ｆｃドメインにおいて、２３５、２４０、２４１、２４３、２４４、２４７、２６２、２６３、２６９、２９８、３２８、又は３３０位のうちのいずれかにおけるいずれかのアミノ酸修飾（例えば置換）、及び好ましくは以下の残基のうちの１つ又は複数：Ａ２４０、Ｉ２４０、Ｌ２４１、Ｌ２４３、Ｈ２４４、Ｎ２９８、Ｉ３２８又はＶ３３０。異なる具体的な実施形態では、変異型Ｆｃドメインにおいて、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８３、２８５、２８６、２８９、２９２、２９３、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８又は４３９位のうちのいずれかにおけるいずれかのアミノ酸修飾（例えば置換）、好ましくは以下の残基のうちの１つ又は複数：Ｈ２８０、Ｑ２８０、Ｙ２８０、Ｇ２９０、Ｓ２９０、Ｔ２９０、Ｙ２９０、Ｎ２９４、Ｋ２９５、Ｐ２９６、Ｄ２９８、Ｎ２９８、Ｐ２９８、Ｖ２９８、Ｉ３００又はＬ３００。
【0278】
ある好ましい実施形態では、変化した親和性でＦｃγＲに結合する変異型Ｆｃドメインにおいて、２５５、２５６、２５８、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３００、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３２０、３２２、３２６、３２９、３３０、３３２、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３３９、３４０、３５９、３６０、３７３、３７６、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８又は４３９位のうちのいずれかにおけるいずれかのアミノ酸修飾（例えば置換）。好ましくは、上記変異型Ｆｃドメインは、以下の残基のうちのいずれか１つを有する：Ａ２５６、Ｎ２６８、Ｑ２７２、Ｄ２８６、Ｑ２８６、Ｓ２８６、Ａ２９０、Ｓ２９０、Ａ２９８、Ｍ３０１、Ａ３１２、Ｅ３２０、Ｍ３２０、Ｑ３２０、Ｒ３２０、Ｅ３２２、Ａ３２６、Ｄ３２６、Ｅ３２６、Ｎ３２６、Ｓ３２６、Ｋ３３０、Ｔ３３９、Ａ３３３、Ａ３３４、Ｅ３３４、Ｈ３３４、Ｌ３３４、Ｍ３３４、Ｑ３３４、Ｖ３３４、Ｋ３３５、Ｑ３３５、Ａ３５９、Ａ３６０又はＡ４３０。
【0279】
異なる実施形態では、低下した親和性で（そのＦｃドメインを介して）ＦｃγＲに結合する変異型Ｆｃドメインにおいて、２５２、２５４、２６５、２６８、２６９、２７０、２７８、２８９、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３００、３０１、３０３、３２２、３２４、３２７、３２９、３３３、３３５、３３８、３４０、３７３、３７６、３８２、３８８、３８９、４１４、４１６、４１９、４３４、４３５、４３７、４３８、又は４３９位のうちのいずれかにおけるいずれかのアミノ酸修飾（例えば置換）。
【0280】
異なる実施形態では、増強された親和性で（そのＦｃドメインを介して）ＦｃγＲに結合する変異型Ｆｃドメインにおいて、２８０、２８３、２８５、２８６、２９０、２９４、２９５、２９８、３００、３０１、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３３１、３３３、３３４、３３７、３４０、３６０、３７８、３９８、又は４３０位のうちのいずれかにおけるいずれかのアミノ酸修飾（例えば置換）。異なる実施形態では、増強された親和性でＦｃγＲＩＩＡに結合する変異型Ｆｃドメインにおいて、以下の残基のうちのいずれか１つ：Ａ２５５、Ａ２５６、Ａ２５８、Ａ２６７、Ａ２６８、Ｎ２６８、Ａ２７２、Ｑ２７２、Ａ２７６、Ａ２８０、Ａ２８３、Ａ２８５、Ａ２８６、Ｄ２８６、Ｑ２８６、Ｓ２８６、Ａ２９０、Ｓ２９０、Ｍ３０１、Ｅ３２０、Ｍ３２０、Ｑ３２０、Ｒ３２０、Ｅ３２２、Ａ３２６、Ｄ３２６、Ｅ３２６、Ｓ３２６、Ｋ３３０、Ａ３３１、Ｑ３３５、Ａ３３７又はＡ４３０。
【0281】
好ましい変異体は、２２８、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２７１、２７３、２７５、２８１、２８４、２９１、２９６、２９７、２９８、２９９、３０２、３０４、３０５、３１３、３２３、３２５、３２６、３２８、３３０又は３３２位のうちのいずれかにおける１つ又は複数の修飾を含む。
【0282】
特に好ましい変異体は、群Ａ〜ＡＩから選択された１つ又は複数の修飾を含む：
【0283】
【表3】
【0284】
更に特に好ましい変異体は、群１〜１０５から選択された１つ又は複数の修飾を含む:
【0285】
【表4】
【0286】
一実施形態では、本発明の多価ＤＲ５結合分子は、Ｆｃドメインにおいて少なくとも１つの修飾を有する変異型Ｆｃドメインを含む。特定の実施形態では、上記変異型Ｆｃドメインは、Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、及びＰ３９６Ｌからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含み、ここで上記番号付与は、非特許文献１８におけるＥＵインデックスの番号付与である。
【0287】
ある具体的実施形態では、変異型Ｆｃドメインは以下を含む：（Ａ）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、及びＰ３９６Ｌからなる群から選択される、少なくとも１つの置換；
（Ｂ）（１）Ｆ２４３Ｌ及びＰ３９６Ｌ；
（２）Ｆ２４３Ｌ及びＲ２９２Ｐ；並びに
（３）Ｒ２９２Ｐ及びＶ３０５Ｉ；
からなる群から選択される、少なくとも２つの置換；
（Ｃ）（１）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＹ３００Ｌ；
（２）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＶ３０５Ｉ；
（３）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＰ３９６Ｌ；並びに
（４）Ｒ２９２Ｐ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ３９６Ｌ；
からなる群から選択される、少なくとも３つの置換；
（Ｄ）（１）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ及びＰ３９６Ｌ；並びに
（２）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ３９６Ｌ；
からなる群から選択される、少なくとも４つの置換；又は
（Ｅ）（１）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ３９６Ｌ；並びに
（２）Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ及びＰ３９６Ｌ
からなる群から選択される、少なくとも５つの置換。
【0288】
別の具体的実施形態では、変異型Ｆｃドメインは、以下の置換を含む：（Ａ）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、及びＹ３００Ｌ；
（Ｂ）Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、及びＰ３９６Ｌ；又は
（Ｃ）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、及びＰ３９６Ｌ。
【0289】
他の実施形態では、本発明は：Jefferis, B.J. et al. (2002) Interaction Sites On Human IgG-Fc For FcgammaR: Current Models," Immunol. Lett. 82:57-65; Presta, L.G. et al. (2002) "Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function " Biochem. Soc. Trans. 30:487-90; Idusogie, E.E. et al. (2001) "Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Complement," J. Immunol. 166:2571-75; Shields, R.L. et al. (2001) "High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgGl For Fc Gamma RI, Fc Gamma RII, Fc Gamma RIII, And FcRn And Design Of IgGl Variants With Improved Binding To The Fc gamma R " J. Biol. Chem. 276:6591-6604; Idusogie, E.E. et al. (2000) "Mapping Of The Clq Binding Site On Rituxan, A Chimeric Antibody With A Human IgG Fc," J. Immunol. 164:4178-84; Reddy, M.P. et al. (2000) "Elimination Of Fc Receptor-Dependent Effector Functions Of A Modified IgG4 Monoclonal Antibody To Human CD4 " J. Immunol. 164: 1925-1933; Xu, D. et al. (2000) "In Vitro Characterization of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies " Cell. Immunol. 200: 16-26; Armour, K.L. et al. (1999) "Recombinant human IgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Triggering Activities " Eur. J. Immunol. 29:2613-24; Jefferis, R. et al. (1996) "Modulation Of Fc(Gamma)R And Human Complement Activation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions " Immunol. Lett. 54: 101-04; Lund, J. et al. (1996) "Multiple Interactions Of IgG With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And Human Fc Gamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains " J. Immunol. 157:4963-4969; Hutchins et al. (1995) "Improved Biodistribution, Tumor Targeting, And Reduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant Of Campath-IH," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 92: 11980-84; Jefferis, R. et al. (1995) "Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors: The Role Of Glycosylation," Immunol. Lett. 44: 111-17; Lund, J. et al. (1995) "Oligosaccharide-Protein Interactions In IgG Can Modulate Recognition By Fc Gamma Receptors " FASEB J. 9: 115-19; Alegre, M . et al. (1994) "A Non-Activating "Humanized" Anti-CD3 Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties In Vivo," Transplantation 57: 1537-1543; Lund et al. (1992) "Multiple Binding Sites On The CH2 Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma RII," Mol. Immunol. 29:53-59; Lund et al. (1991) "Human Fc Gamma RI And Fc Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG," J. Immunol. 147:2657-2662; Duncan, A.R. et al. (1988) "Localization Of The Binding Site For The Human High-Affinity Fc Receptor On IgG," Nature 332:563-564；米国特許第５，６２４，８２１号；米国特許第５，８８５，５７３号；米国特許第６，１９４，５５１号；米国特許第７，２７６，５８６号；及び米国特許第７，３１７，０９１号；並びに国際公開第００／４２０７２号及び国際公開第９９／５８５７２号に開示されているもの等の、公知のいずれのＦｃ変異体の使用を包含する。
【0290】
いくつかの実施形態では、本発明の分子は更に、１つ又は複数のグリコシル化部位を備えてよく、これにより、１つ又は複数の炭水化物部分は上記分子に共有結合によって付着する。好ましくは、Ｆｃドメインに１つ若しくは複数のグリコシル化部位及び／又は１つ若しくは複数の修飾を有する、本発明の分子は、親抗体と比べて、増強された抗体仲介性エフェクタ機能、例えば増強されたＡＤＣＣ活性を与える、又は有する。いくつかの実施形態では、本発明は更に、抗体の炭水化物部分と直接的又は間接的に相互作用することが分かっている、２４１、２４３、２４４、２４５、２４５、２４９、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６５、２９６、２９９、及び３０１位のアミノ酸を含むがこれらに限定されないアミノ酸の１つ又は複数の修飾を含む、分子を含む。抗体の炭水化物部分と直接的又は間接的に相互作用するアミノ酸は当該技術分野において公知であり、例えばJefferis et al. (1995) Immunology Letters, 44: 111-7（この文献は参照によりその全体が本出願に援用される）を参照されたい。
【0291】
別の実施形態では、本発明は、好ましくは当該分子の機能性、例えば標的分子又はＦｃγＲへの結合活性を変化させることなく、１つ又は複数のグリコシル化部位を、当該分子の１つ又は複数の部位に導入することによって修飾された、分子を包含する。グリコシル化部位は、本発明の分子の可変及び／又は定常領域に導入してよい。本明細書において使用される場合、「グリコシル化部位（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）」は、オリゴ糖（即ち一体に連結した２つ以上の単糖を含有する炭水化物）が特異的に共有結合によって付着する、抗体中のいずれの具体的なアミノ酸配列を含む。オリゴ糖側鎖は典型的には、Ｎ結合又はＯ結合を介して抗体のバックボーンに連結する。Ｎ結合グリコシル化は、アスパラギン残基の側鎖へのオリゴ糖部分の付着を表す。Ｏ結合グリコシル化は、例えばセリン、トレオニンといったヒドロキシアミノ酸へのオリゴ糖部分の付着を表す。本発明の分子は、Ｎ結合及びＯ結合グリコシル化部位を含む、１つ又は複数のグリコシル化部位を備えてよい。当該技術分野において公知のＮ結合又はＯ結合グリコシル化のためのいずれのグリコシル化部位を、本発明に従って使用してよい。本発明の方法に従って使用できる例示的なＮ結合グリコシル化部位は、アミノ酸配列：Ａｓｎ‐Ｘ‐Ｔｈｒ／Ｓｅｒであり、ここでＸはいずれのアミノ酸であってよく、Ｔｈｒ／Ｓｅｒはトレオニン又はセリンを示す。このような１つ又は複数の部位は、本発明が関与する技術分野において公知の方法を用いて、本発明の分子に導入してよい（例えばIN VITRO MUTAGENESIS, RECOMBINANT DNA: A SHORT COURSE, J. D. Watson, et al. W.H. Freeman and Company, New York, 1983, chapter 8, pp. 106-116（その全体は参照によって本出願に援用される）を参照のこと）。グリコシル化部位を本発明の分子に導入するための例示的な方法は：分子のアミノ酸配列を修飾するか若しくは突然変異させて、所望のＡｓｎ‐Ｘ‐Ｔｈｒ／Ｓｅｒ配列を得るステップを含んでよい。
【0292】
いくつかの実施形態では、本発明は、グリコシル化部位を追加又は欠失することによって、本発明の分子の炭水化物含量を改変する方法を包含する。抗体（及び抗体ドメインを含む分子）の炭水化物含量を改変する方法は、当該技術分野において公知であり、本発明に包含される。例えば米国特許第６，２１８，１４９号；欧州特許第０３５９０９６Ｂ１号；米国特許出願第２００２／００２８４８６号；国際公開第０３／０３５８３５号；米国特許出願第２００３／０１１５６１４号；米国特許第６，２１８，１４９号；米国特許第６，４７２，５１１号（これらの全体は参照によって本出願に援用される）を参照されたい。他の実施形態では、本発明は、当該分子の１つ又は複数の内因性炭水化物部分を欠失することによって、本発明の分子の炭水化物含量を改変する方法を包含する。ある具体的実施形態では、本発明は、２９７位に隣接する位置を修飾することによって、抗体のＦｃドメインのグリコシル化部位をシフトするステップを包含する。ある具体的実施形態では、本発明は２９６位を修飾することによって、２９７位ではなく２９６位をグリコシル化するステップを包含する。
【0293】
エフェクタ機能はまた、Ｆｃドメインに１つ又は複数のシステイン残基を導入することによって、この領域における鎖間ジスルフィド結合を可能とし、その結果として吸収能力が改善され得る、並びに／又は補体仲介型細胞殺滅及びＡＤＣＣが増大し得るホモ二量体抗体を生成することにより、修飾できる（Caron, P.C. et al. (1992) "Engineered Humanized Dimeric Forms Of IgG Are More Effective Antibodies J. Exp. Med. 176: 1191-1195; Shopes, B. (1992) "A Genetically Engineered Human IgG Mutant With Enhanced Cytolytic Activity," J. Immunol. 148(9):2918-2922）。抗腫瘍活性が増強されたホモ二量体抗体はまた、Wolff, E.A. et al. (1993) "Monoclonal Antibody Homodimers: Enhanced Antitumor Activity In Nude Mice," Cancer Research 53:2560-2565に記載されているようなヘテロ二機能性クロスリンカーを用いて調製できる。あるいは、二重Ｆｃドメインを有し、それによって補体溶解及びＡＤＣＣ能力が増強され得る抗体を加工できる（Stevenson, G.T. et al. (1989) "A Chimeric Antibody With Dual Fc Domains (bisFabFc) Prepared By Manipulations At The IgG Hinge " Anti-Cancer Drug Design 3:219-230）。
【0294】
ＩＩＩ．例示的な三重特異性結合分子Ｆ．ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １
４つのポリペプチド鎖からなる例示的な三重特異性結合分子を構成した。上記三重特異性結合分子は、ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＶＬ及びＶＨドメイン、抗体ＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＬ及びＶＨドメイン、並びにＤＲ５ ｍＡｂ １のＶＬ及びＶＨドメインを備え、従って「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １」と称した。この三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２１２）：
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT
SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG
TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSTYAMNW
VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV KGRFTISRDD SKNSLYLQMN
SLKTEDTAVY YCVRHGNFGN SYVSWFAYWG QGTLVTVSSG GCGGGEVAAL
EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP
PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE
QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR
EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT
PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS
PGK
【0295】
配列番号２１２では、アミノ酸残基１〜１０６は、ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１８１）に対応し、残基１０７〜１１４は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１５〜２３９は、Ｄ６５Ｇ置換を有するＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１１２）に対応し、残基２４０〜２４５は、GGCGGGリンカー（配列番号３４）に対応し、残基２４６〜２７３は、Ｅコイルドメイン（配列番号３９）に対応し、残基２７４〜２７６はリンカーGGGであり、残基２７７〜２８６はリンカーDKTHTCPPCP（配列番号４８）であり、残基２８７〜５０３は「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５２）である。
【0296】
配列番号２１２をエンコードするポリヌクレオチドは、配列番号２１３：gacattcagc tgactcagtc cccctctttt ctgtccgcat ccgtcggaga
tcgagtgact attacttgct ctgctaggtc ctcaatcagc ttcatgtact
ggtatcagca gaagcccggc aaagcaccta agctgctgat ctacgacaca
agcaacctgg cctccggggt gccatctcgg ttctctggca gtgggtcagg
aactgagttt accctgacaa ttagctccct ggaggctgaa gatgccgcta
cctactattg ccagcagtgg agcagctatc ctctgacctt cggacagggg
actaaactgg aaatcaaggg tggaggatcc ggcggcggag gcgaggtgca
gctggtggag tctgggggag gcttggtcca gcctggaggg tccctgagac
tctcctgtgc agcctctgga ttcaccttca gcacatacgc tatgaattgg
gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag tgggttggaa ggatcaggtc
caagtacaac aattatgcaa cctactatgc cgactctgtg aagggtagat
tcaccatctc aagagatgat tcaaagaact cactgtatct gcaaatgaac
agcctgaaaa ccgaggacac ggccgtgtat tactgtgtga gacacggtaa
cttcggcaat tcttacgtgt cttggtttgc ttattgggga caggggacac
tggtgactgt gtcttccgga ggatgtggcg gtggagaagt ggccgcactg
gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag gtcgctgcac ttgaaaagga
ggtcgcagcc ctggagaaag gcggcgggga caaaactcac acatgcccac
cgtgcccagc acctgaagcc gcggggggac cgtcagtctt cctcttcccc
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg
cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt
acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag
cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca
ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc
tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa
ccaggtcagc ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg
ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg
cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac
cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga
tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct
ccgggtaaa
である。
【0297】
ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２１４）：QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTGS
WMNWVRQAPG QGLEWIGRIY PGDGETNYNG KFKDRVTITA DKSTSTAYME
LSSLRSEDTA VYYCARIYGN NVYFDVWGQG TTVTVSSGGC GGGKVAALKE
KVAALKEKVA ALKEKVAALK E
【0298】
配列番号２１４では、アミノ酸残基１〜１１０は、ＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１０４）に対応し、残基１１１〜１１８は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１９〜２３７は、ｇｐＡ３３ ｍＡｂ１のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１８６）に対応し、残基２３８〜２４３は、リンカーGGCGGG（配列番号３４）に対応し、残基２４４〜２７１はＫコイルドメイン（配列番号４０）である。
【0299】
配列番号２１４をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２１５）：caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac
tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact
acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc
gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag
tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg
acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc
gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg
tggacaggtc cagctggtcc agagcggggc cgaagtcaaa aaacccggag
caagcgtgaa ggtctcctgc aaagcatcag gctatacatt tacaggcagc
tggatgaact gggtgaggca ggctccagga cagggactgg agtggatcgg
gcgcatctac cctggagacg gcgaaactaa ctataatgga aagttcaaag
accgagtgac catcacagcc gataagtcta ctagtaccgc ctacatggag
ctgagctccc tgcggtctga agataccgcc gtctactatt gcgctagaat
ttacggaaac aatgtctatt ttgacgtgtg ggggcaggga acaactgtga
ctgtctcctc cggaggatgt ggcggtggaa aagtggccgc actgaaggag
aaagttgctg ctttgaaaga gaaggtcgcc gcacttaagg aaaaggtcgc
agccctgaaa gag
【0300】
ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２１６）：EVKFLESGGG LVQPGGSLKL SCVASGFDFS RYWMSWVRQA PGKGLEWIGE
INPDSNTINY TPSLKDKFII SRDNAKNTLY LQMTKVRSED TALYYCTRRA
YYGNPAWFAY WGQGTLVTVS SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV
KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ
TYICNVNHKP SNTKVDKRVE PKSCDKTHTC PPCPAPEAAG GPSVFLFPPK
PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY
NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP
QVYTLPPSRE EMTKNQVSLS CAVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP
VLDSDGSFFL VSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNRY TQKSLSLSPG
K
【0301】
配列番号２１６では、アミノ酸残基１〜１２１は、ＤＲ５ ｍＡｂ １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号８）に対応し、残基１２２〜２１９は、修飾ＣＨ１ドメイン（配列番号２０８）に対応し、残基２２０〜２３４は、リンカー（配列番号２０９）に対応し、残基２３５〜４５１は、「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５３）に対応する。
【0302】
配列番号２１６をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２１７）：gaggtgaagt ttctcgagtc tggaggtggc ctggtgcagc ctggaggatc
cctgaaactc tcctgtgtag cctcaggatt cgattttagt agatactgga
tgagttgggt ccggcaggct ccagggaaag ggctagaatg gattggagaa
attaatccag atagcaatac gataaactat acgccatctc taaaggataa
attcatcatc tccagagaca acgccaaaaa tacgctgtat ctgcaaatga
ccaaagtgag atctgaggac acagcccttt attattgtac aagaagggcc
tactatggta acccggcctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt
cactgtctct tccgcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac
cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc
aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct
gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct
actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa
gagagttgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc
cagcacctga agccgcgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa
cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt
ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg
acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg
gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag
cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca
caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt
cagcctgagt tgcgcagtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg
agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc gtcagcaagc tcaccgtgga
caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg
aggctctgca caaccgctac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt
aaa
【0303】
ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １の第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２１８）：DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS SSGYSYMHWY QQKPGQPPKV
LIFLSSNLDS GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEDGDAATY YCQHSRDLPP
TFGGGTKLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV
QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV
THQGLSSPVT KSFNRGEC
【0304】
配列番号２１８では、アミノ酸残基１〜１１１は、ＤＲ５ ｍＡｂ １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号３）に対応し、残基１１２〜２１８は、ＣＬ Ｋａｐｐａドメイン（配列番号２１０）に対応する。
【0305】
配列番号２１８をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２１９）：gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctcgggca
gagggccacc atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt tcctctggct
atagttatat gcactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaagtc
ctcatctttc tttcatccaa cctagattct ggggtccctg ccaggttcag
tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg
atggggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga tcttcctccg
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgtacgg tggctgcacc
atcggtcttc atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg
cctctgttgt gtgcctgctg aataacttct atcccagaga ggccaaagta
cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc aggagagtgt
cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc agcaccctga
cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc
acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga
gtgt
【0306】
Ｇ．ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ ２４つのポリペプチド鎖からなる第２の例示的な三重特異性結合分子を構成した。上記三重特異性結合分子は、ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＶＬ及びＶＨドメイン、抗体ＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＬ及びＶＨドメイン、並びにＤＲ５ ｍＡｂ ２のＶＬ及びＶＨドメインを備え、従って「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ ２」と称した。この三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２２０）：
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT
SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG
TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSTYAMNW
VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV KGRFTISRDD SKNSLYLQMN
SLKTEDTAVY YCVRHGNFGN SYVSWFAYWG QGTLVTVSSG GCGGGEVAAL
EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP
PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE
QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR
EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT
PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS
PGK
【0307】
配列番号２２０では、アミノ酸残基１〜１０６は、ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１８１）に対応し、残基１０７〜１１４は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１５〜２３９は、Ｄ６５Ｇ置換を有するＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１１２）に対応し、残基２４０〜２４５は、GGCGGGリンカー（配列番号３４）に対応し、残基２４６〜２７３は、Ｅコイルドメイン（配列番号３９）に対応し、残基２７４〜２７６はリンカーGGGであり、残基２７７〜２８６はリンカーDKTHTCPPCP（配列番号４８）であり、残基２８７〜５０３は「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５２）である。
【0308】
配列番号２２０をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２２１）：gacattcagc tgactcagtc cccctctttt ctgtccgcat ccgtcggaga
tcgagtgact attacttgct ctgctaggtc ctcaatcagc ttcatgtact
ggtatcagca gaagcccggc aaagcaccta agctgctgat ctacgacaca
agcaacctgg cctccggggt gccatctcgg ttctctggca gtgggtcagg
aactgagttt accctgacaa ttagctccct ggaggctgaa gatgccgcta
cctactattg ccagcagtgg agcagctatc ctctgacctt cggacagggg
actaaactgg aaatcaaggg tggaggatcc ggcggcggag gcgaggtgca
gctggtggag tctgggggag gcttggtcca gcctggaggg tccctgagac
tctcctgtgc agcctctgga ttcaccttca gcacatacgc tatgaattgg
gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag tgggttggaa ggatcaggtc
caagtacaac aattatgcaa cctactatgc cgactctgtg aagggtagat
tcaccatctc aagagatgat tcaaagaact cactgtatct gcaaatgaac
agcctgaaaa ccgaggacac ggccgtgtat tactgtgtga gacacggtaa
cttcggcaat tcttacgtgt cttggtttgc ttattgggga caggggacac
tggtgactgt gtcttccgga ggatgtggcg gtggagaagt ggccgcactg
gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag gtcgctgcac ttgaaaagga
ggtcgcagcc ctggagaaag gcggcgggga caaaactcac acatgcccac
cgtgcccagc acctgaagcc gcggggggac cgtcagtctt cctcttcccc
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg
cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt
acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag
cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca
ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc
tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa
ccaggtcagc ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg
ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg
cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac
cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga
tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct
ccgggtaaa
【0309】
ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ ２の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２２２）：QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTGS
WMNWVRQAPG QGLEWIGRIY PGDGETNYNG KFKDRVTITA DKSTSTAYME
LSSLRSEDTA VYYCARIYGN NVYFDVWGQG TTVTVSSGGC GGGKVAALKE
KVAALKEKVA ALKEKVAALK E
【0310】
配列番号２２２では、アミノ酸残基１〜１１０は、ＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１０４）に対応し、残基１１１〜１１８は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１９〜２３７は、ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１８６）に対応し、残基２３８〜２４３は、リンカーGGCGGG（配列番号３４）に対応し、残基２４４〜２７１はＫコイルドメイン（配列番号４０）である。
【0311】
配列番号２２２をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２２３）：caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac
tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact
acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc
gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag
tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg
acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc
gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg
tggacaggtc cagctggtcc agagcggggc cgaagtcaaa aaacccggag
caagcgtgaa ggtctcctgc aaagcatcag gctatacatt tacaggcagc
tggatgaact gggtgaggca ggctccagga cagggactgg agtggatcgg
gcgcatctac cctggagacg gcgaaactaa ctataatgga aagttcaaag
accgagtgac catcacagcc gataagtcta ctagtaccgc ctacatggag
ctgagctccc tgcggtctga agataccgcc gtctactatt gcgctagaat
ttacggaaac aatgtctatt ttgacgtgtg ggggcaggga acaactgtga
ctgtctcctc cggaggatgt ggcggtggaa aagtggccgc actgaaggag
aaagttgctg ctttgaaaga gaaggtcgcc gcacttaagg aaaaggtcgc
agccctgaaa gag
【0312】
ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ ２の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２２４）：KVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCKASGYTFT EYILHWVKQK SGQGLEWIGW
FYPGNNNIKY NEKFKDKATL TADKSSSTVY MELSRLTSED SAVYFCARHE
QGPGYFDYWG QGTTLTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD
YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY
ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK
DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS
TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV
YTLPPSREEM TKNQVSLSCA VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL
DSDGSFFLVS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNRYTQ KSLSLSPGK
【0313】
配列番号２２４では、アミノ酸残基１〜１１９は、ＤＲ５ ｍＡｂ ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１８）に対応し、残基１２０〜２１７は、修飾ＣＨ１ドメイン（配列番号２０８）に対応し、残基２１８〜２３２は、リンカー（配列番号２０９）に対応し、残基２３３〜４４９は「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５３）に対応する。
【0314】
配列番号２２４をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２２５）：aaggtccagc tgcagcagtc tggagctgaa ctggtgaaac ccggggcatc
agtgaagctg tcctgcaagg cttctgggta caccttcact gagtatattt
tacactgggt aaagcagaag tctggacagg gtcttgagtg gattgggtgg
ttttatcctg gaaataataa tataaagtac aatgagaaat tcaaggacaa
ggccacactg actgcggaca aatcctccag cacagtctat atggaactta
gtagattgac atctgaagac tctgcggtct atttctgtgc aagacacgaa
caaggaccag gttactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt
ctcctccgcc tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct
ccaagagcac ctctgggggc acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac
tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg aactcaggcg ccctgaccag
cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga ctctactccc
tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt
tgagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac
ctgaagccgc ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag
gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga
cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg
tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa
tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca
tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg
tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg accaagaacc aggtcagcct
gagttgcgca gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg
agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg
gactccgacg gctccttctt cctcgtcagc aagctcaccg tggacaagag
caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc
tgcacaaccg ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa
【0315】
ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２xＤＲ５ ｍＡｂ ２の第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２２６）：DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GQSPKLLIYW
ASTRHTGVPD RFTGSGSGTD YTLTIKSVQA EDLTLYYCQQ HYITPWTFGG
GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV
DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG
LSSPVTKSFN RGEC
【0316】
配列番号２２６では、アミノ酸残基１〜１０７は、ＤＲ５ ｍＡｂ ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１３）に対応し、残基１０８〜２１４は、ＣＬ Ｋａｐｐａドメイン（配列番号２１０）に対応する。
【0317】
配列番号２２６をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２２７）：gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccactt cagtaggaga
cagggtcagc atcacctgca aggccagtca ggatgtgaat actgctgtag
cctggtatca acaaaaacca gggcaatctc ctaaactact gatttactgg
gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc
tgggacagat tatacactca ccatcaaaag tgtgcaggct gaagacctga
cactttatta ctgtcagcaa cactatatca ctccgtggac gttcggtgga
ggcaccaagc tggaaatcaa acgtacggtg gctgcaccat cggtcttcat
cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt
gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg
gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca cagagcagga
cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg ctgagcaaag
cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt
【0318】
Ｈ．ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １４つのポリペプチド鎖からなる、更なる例示的な三重特異性結合分子を構成した。上記三重特異性結合分子は、ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １のＶＬ及びＶＨドメイン、抗体ＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＬ及びＶＨドメイン、並びにＤＲ５ ｍＡｂ １のＶＬ及びＶＨドメインを備え、従って「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １」と称した。この三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２２８）：
DIQMTQTTSS LSASLGDRIT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY
TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GYTLYTFGGG
TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSTYAMNW
VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV KGRFTISRDD SKNSLYLQMN
SLKTEDTAVY YCVRHGNFGN SYVSWFAYWG QGTLVTVSSG GCGGGEVAAL
EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP
PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE
QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR
EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT
PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS
PGK
【0319】
配列番号２２８では、アミノ酸残基１〜１０６は、ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１５３）に対応し、残基１０７〜１１４は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１５〜２３９は、Ｄ６５Ｇ置換を有するＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１１２）に対応し、残基２４０〜２４５は、GGCGGGリンカー（配列番号３４）に対応し、残基２４６〜２７３は、Ｅコイルドメイン（配列番号３９）に対応し、残基２７４〜２７６はリンカーGGGであり、残基２７７〜２８６はリンカーDKTHTCPPCP（配列番号４８）であり、残基２８７〜５０３は「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５２）である。
【0320】
配列番号２２８をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２２９）：gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga
cagaatcacc atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa
actggtatca gcagaaacca gatggaactg ttaaactcct gatctactac
acatcaagat tacactcagg agtcccatca aggttcagtg gcagtgggtc
tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa gaagatattg
ccacttactt ttgccaacag ggttatacgc tgtacacgtt cggagggggg
accaagctgg aaataaaagg tggaggatcc ggcggcggag gcgaggtgca
gctggtggag tctgggggag gcttggtcca gcctggaggg tccctgagac
tctcctgtgc agcctctgga ttcaccttca gcacatacgc tatgaattgg
gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag tgggttggaa ggatcaggtc
caagtacaac aattatgcaa cctactatgc cgactctgtg aagggtagat
tcaccatctc aagagatgat tcaaagaact cactgtatct gcaaatgaac
agcctgaaaa ccgaggacac ggccgtgtat tactgtgtga gacacggtaa
cttcggcaat tcttacgtgt cttggtttgc ttattgggga caggggacac
tggtgactgt gtcttccgga ggatgtggcg gtggagaagt ggccgcactg
gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag gtcgctgcac ttgaaaagga
ggtcgcagcc ctggagaaag gcggcgggga caaaactcac acatgcccac
cgtgcccagc acctgaagcc gcggggggac cgtcagtctt cctcttcccc
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg
cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt
acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag
cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca
ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc
tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa
ccaggtcagc ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg
ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg
cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac
cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga
tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct
ccgggtaa
【0321】
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２３０）：QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLKESGPGLV APSQSLSITC TVSGFSLSRY
SVHWVRQPPG KGLEWLGMIW GGGSTDYNSA LKSRLSISKD NSKSQVFLKM
NSLQTDDTAM YYCARKHGNY YTMDYWGQGT SVTVSSGGCG GGKVAALKEK
VAALKEKVAA LKEKVAALKE
【0322】
配列番号２３０では、アミノ酸残基１〜１１０は、ＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１０４）に対応し、残基１１１〜１１８は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１９〜２３６は、ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１５８）に対応し、残基２３７〜２４２は、リンカーGGCGGG（配列番号３４）に対応し、残基２４３〜２７０はＫコイルドメイン（配列番号４０）である。
【0323】
配列番号２３０をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２３１）：caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac
tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact
acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc
gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag
tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg
acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc
gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg
tggacaggtg cagctgaagg agtcaggacc tggcctggtg gcaccctcac
agagcctgtc catcacatgc actgtctctg ggttctcatt atccagatat
agtgtacact gggttcgcca gcctccagga aagggtctgg agtggctggg
aatgatatgg ggtggtggaa gcacagacta taattcagct ctcaaatcca
gactgagtat cagcaaggac aactccaaga gccaagtttt cttaaaaatg
aacagtctgc aaactgatga cacagccatg tactactgtg ccagaaaaca
tggtaactac tatactatgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg
tctcctccgg aggatgtggc ggtggaaaag tggccgcact gaaggagaaa
gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca cttaaggaaa aggtcgcagc
cctgaaagag
【0324】
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２３２）：EVKFLESGGG LVQPGGSLKL SCVASGFDFS RYWMSWVRQA PGKGLEWIGE
INPDSNTINY TPSLKDKFII SRDNAKNTLY LQMTKVRSED TALYYCTRRA
YYGNPAWFAY WGQGTLVTVS SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV
KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ
TYICNVNHKP SNTKVDKRVE PKSCDKTHTC PPCPAPEAAG GPSVFLFPPK
PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY
NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP
QVYTLPPSRE EMTKNQVSLS CAVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP
VLDSDGSFFL VSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNRY TQKSLSLSPG
K
【0325】
配列番号２３２では、アミノ酸残基１〜１２１は、ＤＲ５ ｍＡｂ １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号８）に対応し、残基１２２〜２１９は、修飾ＣＨ１ドメイン（配列番号２０８）に対応し、残基２２０〜２３４は、リンカー（配列番号２０９）に対応し、残基２３５〜４５１は、「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５３）に対応する。
【0326】
配列番号２３２をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２３３）：gaggtgaagt ttctcgagtc tggaggtggc ctggtgcagc ctggaggatc
cctgaaactc tcctgtgtag cctcaggatt cgattttagt agatactgga
tgagttgggt ccggcaggct ccagggaaag ggctagaatg gattggagaa
attaatccag atagcaatac gataaactat acgccatctc taaaggataa
attcatcatc tccagagaca acgccaaaaa tacgctgtat ctgcaaatga
ccaaagtgag atctgaggac acagcccttt attattgtac aagaagggcc
tactatggta acccggcctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt
cactgtctct tccgcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac
cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc
aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct
gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct
actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa
gagagttgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc
cagcacctga agccgcgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa
cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt
ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg
acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg
gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag
cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca
caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt
cagcctgagt tgcgcagtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg
agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc gtcagcaagc tcaccgtgga
caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg
aggctctgca caaccgctac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt
aaa
【0327】
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １の第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２３４）：DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS SSGYSYMHWY QQKPGQPPKV
LIFLSSNLDS GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEDGDAATY YCQHSRDLPP
TFGGGTKLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV
QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV
THQGLSSPVT KSFNRGEC
【0328】
配列番号２３４では、アミノ酸残基１〜１１１は、ＤＲ５ ｍＡｂ １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号３）に対応し、残基１１２〜２１８は、ＣＬ Ｋａｐｐａドメイン（配列番号２１０）に対応する。
【0329】
配列番号２３４をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２３５）：gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctcgggca
gagggccacc atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt tcctctggct
atagttatat gcactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaagtc
ctcatctttc tttcatccaa cctagattct ggggtccctg ccaggttcag
tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg
atggggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga tcttcctccg
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgtacgg tggctgcacc
atcggtcttc atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg
cctctgttgt gtgcctgctg aataacttct atcccagaga ggccaaagta
cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc aggagagtgt
cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc agcaccctga
cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc
acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga
gtgt
【0330】
Ｉ．ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２xＣＤ３ ｍＡｂ ２xＤＲ５ ｍＡｂ １４つのポリペプチド鎖からなる、更なる例示的な三重特異性結合分子を構成した。上記三重特異性結合分子は、ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２のＶＬ及びＶＨドメイン、抗体ＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＬ及びＶＨドメイン、並びにＤＲ５ ｍＡｂ １のＶＬ及びＶＨドメインを備え、従って「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２xＣＤ３ ｍＡｂ ２xＤＲ５ ｍＡｂ １」と称した。この三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２３６）：
DVVMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSSGNTYLHW YLQKPGQSPK
LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP
TFGSGTKLEI KGGGSGGGGE VQLVESGGGL VQPGGSLRLS CAASGFTFST
YAMNWVRQAP GKGLEWVGRI RSKYNNYATY YADSVKGRFT ISRDDSKNSL
YLQMNSLKTE DTAVYYCVRH GNFGNSYVSW FAYWGQGTLV TVSSGGCGGG
EVAALEKEVA ALEKEVAALE KEVAALEKGG GDKTHTCPPC PAPEAAGGPS
VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT
KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA
KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLWCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN
NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK
SLSLSPGK
【0331】
配列番号２３６では、アミノ酸残基１〜１１１は、ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１６３）に対応し、残基１１２〜１１９は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１２０〜２４４は、Ｄ６５Ｇ置換を有するＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１１２）に対応し、残基２４５〜２５０は、GGCGGGリンカー（配列番号３４）に対応し、残基２５１〜２７８は、Ｅコイルドメイン（配列番号３９）に対応し、残基２７９〜２８１はリンカーGGGであり、残基２８２〜２９１はリンカーDKTHTCPPCP（配列番号４８）であり、残基２９２〜５０８は「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５２）である。
【0332】
配列番号２３６をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２３７）：gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga
tcaagcctcc atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtagtg
gaaacaccta tttacattgg tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag
ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt tctggggtcc cagacaggtt
cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc agcagagtgg
aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccc
acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aaaggtggag gatccggcgg
cggaggcgag gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtccagcctg
gagggtccct gagactctcc tgtgcagcct ctggattcac cttcagcaca
tacgctatga attgggtccg ccaggctcca gggaaggggc tggagtgggt
tggaaggatc aggtccaagt acaacaatta tgcaacctac tatgccgact
ctgtgaaggg tagattcacc atctcaagag atgattcaaa gaactcactg
tatctgcaaa tgaacagcct gaaaaccgag gacacggccg tgtattactg
tgtgagacac ggtaacttcg gcaattctta cgtgtcttgg tttgcttatt
ggggacaggg gacactggtg actgtgtctt ccggaggatg tggcggtgga
gaagtggccg cactggagaa agaggttgct gctttggaga aggaggtcgc
tgcacttgaa aaggaggtcg cagccctgga gaaaggcggc ggggacaaaa
ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagccgcggg gggaccgtca
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac
ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg
tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca
aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct
caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg
tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga
ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgtg gtgcctggtc aaaggcttct
atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac
aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct
ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct
tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag
agcctctccc tgtctccggg taaa
【0333】
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２xＣＤ３ ｍＡｂ ２xＤＲ５ ｍＡｂ １の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２３８）：QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG GGGSGGGGQI QLVQSGPELK KPGETVKISC KASGFTFTNY
GMNWVKQAPG KGLKWMGWIN TYIGEPTYAD DFKGRFVFSL ETSASTAYLQ
INNLKNEDMA TYFCARELGP YYFDYWGQGT TLTVSSGGCG GGKVAALKEK
VAALKEKVAA LKEKVAALKE
【0334】
配列番号２３８では、アミノ酸残基１〜１１０は、ＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１０４）に対応し、残基１１１〜１１８は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１９〜２３６は、ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１６７）に対応し、残基２３７〜２４２は、リンカーGGCGGG（配列番号３４）に対応し、残基２４３〜２７０はＫコイルドメイン（配列番号４０）である。
【0335】
配列番号２３８をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２３９）：caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac
tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact
acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc
gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag
tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg
acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc
gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg
tggacagatc cagttggtgc agtctggacc tgagctgaag aagcctggag
agacagtcaa gatctcctgc aaggcttctg ggtttacctt cacaaactat
ggaatgaact gggtgaagca ggctccagga aagggtttaa agtggatggg
ctggataaac acctatattg gagagccgac atatgctgat gacttcaagg
gacggtttgt cttctctttg gaaacctctg ccagcactgc ctatttgcag
atcaacaacc tcaaaaatga ggacatggcc acatatttct gtgcaagaga
actgggacca tactactttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag
tctcctccgg aggatgtggc ggtggaaaag tggccgcact gaaggagaaa
gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca cttaaggaaa aggtcgcagc
cctgaaagag
【0336】
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２xＣＤ３ ｍＡｂ ２xＤＲ５ ｍＡｂ １の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２４０）：EVKFLESGGG LVQPGGSLKL SCVASGFDFS RYWMSWVRQA PGKGLEWIGE
INPDSNTINY TPSLKDKFII SRDNAKNTLY LQMTKVRSED TALYYCTRRA
YYGNPAWFAY WGQGTLVTVS SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV
KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ
TYICNVNHKP SNTKVDKRVE PKSCDKTHTC PPCPAPEAAG GPSVFLFPPK
PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY
NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP
QVYTLPPSRE EMTKNQVSLS CAVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP
VLDSDGSFFL VSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNRY TQKSLSLSPG
K
【0337】
配列番号２４０では、アミノ酸残基１〜１２１は、ＤＲ５ ｍＡｂ １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号８）に対応し、残基１２２〜２１９は、修飾ＣＨ１ドメイン（配列番号２０８）に対応し、残基２２０〜２３４は、リンカー（配列番号２０９）に対応し、残基２３５〜４５１は、「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５３）に対応する。
【0338】
配列番号２４０をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２４１）：gaggtgaagt ttctcgagtc tggaggtggc ctggtgcagc ctggaggatc
cctgaaactc tcctgtgtag cctcaggatt cgattttagt agatactgga
tgagttgggt ccggcaggct ccagggaaag ggctagaatg gattggagaa
attaatccag atagcaatac gataaactat acgccatctc taaaggataa
attcatcatc tccagagaca acgccaaaaa tacgctgtat ctgcaaatga
ccaaagtgag atctgaggac acagcccttt attattgtac aagaagggcc
tactatggta acccggcctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt
cactgtctct tccgcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac
cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc
aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct
gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct
actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa
gagagttgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc
cagcacctga agccgcgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa
cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt
ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg
acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg
gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag
cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca
caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt
cagcctgagt tgcgcagtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg
agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc gtcagcaagc tcaccgtgga
caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg
aggctctgca caaccgctac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt
aaa
【0339】
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２xＣＤ３ ｍＡｂ ２xＤＲ５ ｍＡｂ １の第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２４２）：DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS SSGYSYMHWY QQKPGQPPKV
LIFLSSNLDS GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEDGDAATY YCQHSRDLPP
TFGGGTKLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV
QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV
THQGLSSPVT KSFNRGEC
【0340】
配列番号２４２では、アミノ酸残基１〜１１１は、ＤＲ５ ｍＡｂ １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号３）に対応し、残基１１２〜２１８は、ＣＬ Ｋａｐｐａドメイン（配列番号２１０）に対応する。
【0341】
配列番号２４２をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２４３）：gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctcgggca
gagggccacc atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt tcctctggct
atagttatat gcactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaagtc
ctcatctttc tttcatccaa cctagattct ggggtccctg ccaggttcag
tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg
atggggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga tcttcctccg
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgtacgg tggctgcacc
atcggtcttc atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg
cctctgttgt gtgcctgctg aataacttct atcccagaga ggccaaagta
cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc aggagagtgt
cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc agcaccctga
cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc
acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga
gtgt
【0342】
Ｊ．ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３xＣＤ３ ｍＡｂ ２xＤＲ５ ｍＡｂ １４つのポリペプチド鎖からなる、更なる例示的な三重特異性結合分子を構成した。上記三重特異性結合分子は、ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３のＶＬ及びＶＨドメイン、抗体ＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＬ及びＶＨドメイン、並びにＤＲ５ ｍＡｂ １のＶＬ及びＶＨドメインを備え、従って「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３xＣＤ３ ｍＡｂ ２xＤＲ５ ｍＡｂ １」と称した。この三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２４４）：
DIVLTQSHRS MSTSVGDRVN ITCKASQDVT TAVAWYQQKP GQSPKLLIFW
ASTRHAGVPD RFTGSGSGTD FTLTISSVQA GDLALYYCQQ HYSTPYTFGG
GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN
WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKGRFTISRD DSKNSLYLQM
NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS GGCGGGEVAA
LEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEKGGGDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF
PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE
EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP
REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT
TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL
SPGK
【0343】
配列番号２４４では、アミノ酸残基１〜１０７は、ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１７２）に対応し、残基１０８〜１１５は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１６〜２４０は、Ｄ６５Ｇ置換を有するＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１１２）に対応し、残基２４１〜２４６は、GGCGGGリンカー（配列番号３４）に対応し、残基２４７〜２７４は、Ｅコイルドメイン（配列番号３９）に対応し、残基２７５〜２７７はリンカーGGGであり、残基２７８〜２８７はリンカーDKTHTCPPCP（配列番号４８）であり、残基２８８〜５０４は「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５２）である。
【0344】
配列番号２４４をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２４５）：gacattgtgc tgacccagtc tcacagatcc atgtccacat cagtaggaga
cagggtcaac atcacctgca aggccagtca ggatgtgact actgctgtag
cctggtatca acaaaaacca gggcaatctc ctaaattact gattttctgg
gcatccaccc ggcacgctgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc
tgggacagat tttactctca ccatcagcag tgtgcaggct ggagacctgg
cactttatta ctgtcaacaa cattatagca caccgtacac attcggaggg
gggaccaagc tggaaataaa aggtggagga tccggcggcg gaggcgaggt
gcagctggtg gagtctgggg gaggcttggt ccagcctgga gggtccctga
gactctcctg tgcagcctct ggattcacct tcagcacata cgctatgaat
tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg gagtgggttg gaaggatcag
gtccaagtac aacaattatg caacctacta tgccgactct gtgaagggta
gattcaccat ctcaagagat gattcaaaga actcactgta tctgcaaatg
aacagcctga aaaccgagga cacggccgtg tattactgtg tgagacacgg
taacttcggc aattcttacg tgtcttggtt tgcttattgg ggacagggga
cactggtgac tgtgtcttcc ggaggatgtg gcggtggaga agtggccgca
ctggagaaag aggttgctgc tttggagaag gaggtcgctg cacttgaaaa
ggaggtcgca gccctggaga aaggcggcgg ggacaaaact cacacatgcc
caccgtgccc agcacctgaa gccgcggggg gaccgtcagt cttcctcttc
cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac
atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact
ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag
gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca
ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag
ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc
cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa
gaaccaggtc agcctgtggt gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca
tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc
acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct
caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg
tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg
tctccgggta aa
【0345】
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３xＣＤ３ ｍＡｂ ２xＤＲ５ ｍＡｂ １の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２４６）：QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG GGGSGGGGEV QLVESGGGSV KPGGSLKLSC AASGFTFTDH
YMYWVRQTPE KRLEWVATIS DGGSFTSYPD SVKGRFTISR DIAKNNLYLQ
MSSLKSEDTA MYYCTRDESD RPFPYWGQGT LVTVSSGGCG GGKVAALKEK
VAALKEKVAA LKEKVAALKE
【0346】
配列番号２４６では、アミノ酸残基１〜１１０は、ＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１０４）に対応し、残基１１１〜１１８は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１９〜２３６は、ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１７７）に対応し、残基２３７〜２４２は、リンカーGGCGGG（配列番号３４）に対応し、残基２４３〜２７０はＫコイルドメイン（配列番号４０）である。
【0347】
配列番号２４６をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２４７）：caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac
tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact
acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc
gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag
tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg
acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc
gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg
tggagaagtg cagctggtgg agtctggggg aggctcagtg aagcctggag
ggtccctgaa actctcctgt gcagcctctg gattcacttt cactgaccat
tacatgtatt gggttcgcca gactccggaa aagaggctgg agtgggtcgc
aaccattagt gatggcggta gtttcacctc ctatccagac agtgtgaagg
ggcgattcac catctccaga gacattgcca agaacaacct gtacctccaa
atgagcagtc tgaagtctga ggacacagcc atgtattact gtacaagaga
tgagagcgat aggccgtttc cttactgggg ccaagggact ctggtcactg
tctcctccgg aggatgtggc ggtggaaaag tggccgcact gaaggagaaa
gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca cttaaggaaa aggtcgcagc
cctgaaagag
【0348】
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３xＣＤ３ ｍＡｂ ２xＤＲ５ ｍＡｂ １の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２４８）：EVKFLESGGG LVQPGGSLKL SCVASGFDFS RYWMSWVRQA PGKGLEWIGE
INPDSNTINY TPSLKDKFII SRDNAKNTLY LQMTKVRSED TALYYCTRRA
YYGNPAWFAY WGQGTLVTVS SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV
KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ
TYICNVNHKP SNTKVDKRVE PKSCDKTHTC PPCPAPEAAG GPSVFLFPPK
PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY
NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP
QVYTLPPSRE EMTKNQVSLS CAVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP
VLDSDGSFFL VSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNRY TQKSLSLSPG
K
【0349】
配列番号２４８では、アミノ酸残基１〜１２１は、ＤＲ５ ｍＡｂ １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号８）に対応し、残基１２２〜２１９は、修飾ＣＨ１ドメイン（配列番号２０８）に対応し、残基２２０〜２３４は、リンカー（配列番号２０９）に対応し、残基２３５〜４５１は、「ホール担持」ＣＨ２〜ＣＨ３ドメイン（配列番号５３）に対応する。
【0350】
配列番号２４８をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２４９）：gaggtgaagt ttctcgagtc tggaggtggc ctggtgcagc ctggaggatc
cctgaaactc tcctgtgtag cctcaggatt cgattttagt agatactgga
tgagttgggt ccggcaggct ccagggaaag ggctagaatg gattggagaa
attaatccag atagcaatac gataaactat acgccatctc taaaggataa
attcatcatc tccagagaca acgccaaaaa tacgctgtat ctgcaaatga
ccaaagtgag atctgaggac acagcccttt attattgtac aagaagggcc
tactatggta acccggcctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt
cactgtctct tccgcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac
cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc
aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct
gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct
actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa
gagagttgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc
cagcacctga agccgcgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa
cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt
ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg
acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg
gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag
cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca
caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt
cagcctgagt tgcgcagtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg
agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc gtcagcaagc tcaccgtgga
caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg
aggctctgca caaccgctac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt
aaa
【0351】
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３xＣＤ３ ｍＡｂ ２xＤＲ５ ｍＡｂ １の第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２５０）：DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS SSGYSYMHWY QQKPGQPPKV
LIFLSSNLDS GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEDGDAATY YCQHSRDLPP
TFGGGTKLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV
QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV
THQGLSSPVT KSFNRGEC
【0352】
配列番号２５０では、アミノ酸残基１〜１１１は、ＤＲ５ ｍＡｂ １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号３）に対応し、残基１１２〜２１８は、ＣＬ Ｋａｐｐａドメイン（配列番号２１０）に対応する。
【0353】
配列番号２５０をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２５１）：gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctcgggca
gagggccacc atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt tcctctggct
atagttatat gcactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaagtc
ctcatctttc tttcatccaa cctagattct ggggtccctg ccaggttcag
tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg
atggggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga tcttcctccg
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgtacgg tggctgcacc
atcggtcttc atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg
cctctgttgt gtgcctgctg aataacttct atcccagaga ggccaaagta
cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc aggagagtgt
cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc agcaccctga
cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc
acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga
gtgt
【0354】
上述の例示的な三重特異性結合分子は、各結合ドメインに関して３つの軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ及び３つの重鎖（ＶＨ）ＣＤＲを備えるが、本発明は：（１）いずれの上述の結合ドメインのＶＬドメインのＣＤＲのうちの少なくとも１つ；
（２）いずれの上述の結合ドメインのＶＬドメインのＣＤＲのうちの少なくとも２つ；
（３）いずれの上述の結合ドメインのＶＬドメインの３つのＣＤＲ；
（４）いずれの上述の結合ドメインのＶＨドメインのＣＤＲのうちの少なくとも１つ；
（５）いずれの上述の結合ドメインのＶＨドメインのＣＤＲのうちの少なくとも２つ；
（６）いずれの上述の結合ドメインのＶＨドメインの３つのＣＤＲ；
（７）いずれの上述の結合ドメインのＶＬドメインのＣＤＲのうちの少なくとも１つ、及び当該結合ドメインのＶＨドメインのＣＤＲのうちの少なくとも１つ；
（８）いずれの上述の結合ドメインのＶＬドメインのＣＤＲのうちの少なくとも２つ、及び当該結合ドメインのＶＨドメインのＣＤＲのうちの少なくとも２つ；
（９）いずれの上述の結合ドメインのＶＬドメインの３つのＣＤＲ、及び当該結合ドメインのＶＨドメインの３つのＣＤＲ；
（１０）いずれの上述の結合ドメインのＶＬドメイン；
（１１）いずれの上述の結合ドメインのＶＨドメイン；又は
（１２）いずれの上述の結合ドメインのＶＬ及びＶＨドメイン
を有する三重特異性結合分子も含むことが理解されるだろう。
【0355】
Ｋ．ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １xＣＤ３ ｍＡｂ ２xＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＶＬ及びＶＨドメイン、抗体ＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＬ及びＶＨドメイン、並びにＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １のＶＬ及びＶＨドメインを備える、４つのポリペプチド鎖からなる三重特異性結合分子を構成した。従って上記三重特異性結合分子は「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １xＣＤ３ ｍＡｂ ２xＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １」と称した。この三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２５２）：
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT
SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG
TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSTYAMNW
VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV KGRFTISRDD SKNSLYLQMN
SLKTEDTAVY YCVRHGNFGN SYVSWFAYWG QGTLVTVSSG GCGGGEVAAL
EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP
PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE
QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR
EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT
PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS
PGK
【0356】
配列番号２５２では、アミノ酸残基１〜１０６は、ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１８１）に対応し、残基１０７〜１１４は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１５〜２３９は、Ｄ６５Ｇ置換を有するＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１１２）に対応し、残基２４０〜２４５は、GGCGGGリンカー（配列番号３４）に対応し、残基２４６〜２７３は、Ｅコイルドメイン（配列番号３９）に対応し、残基２７４〜２７６はリンカーGGGであり、残基２７７〜２８６はリンカーDKTHTCPPCP（配列番号４８）であり、残基２８７〜５０３は「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５２）である。
【0357】
配列番号２５２をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２５３）：gacattcagc tgactcagtc cccctctttt ctgtccgcat ccgtcggaga
tcgagtgact attacttgct ctgctaggtc ctcaatcagc ttcatgtact
ggtatcagca gaagcccggc aaagcaccta agctgctgat ctacgacaca
agcaacctgg cctccggggt gccatctcgg ttctctggca gtgggtcagg
aactgagttt accctgacaa ttagctccct ggaggctgaa gatgccgcta
cctactattg ccagcagtgg agcagctatc ctctgacctt cggacagggg
actaaactgg aaatcaaggg tggaggatcc ggcggcggag gcgaggtgca
gctggtggag tctgggggag gcttggtcca gcctggaggg tccctgagac
tctcctgtgc agcctctgga ttcaccttca gcacatacgc tatgaattgg
gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag tgggttggaa ggatcaggtc
caagtacaac aattatgcaa cctactatgc cgactctgtg aagggtagat
tcaccatctc aagagatgat tcaaagaact cactgtatct gcaaatgaac
agcctgaaaa ccgaggacac ggccgtgtat tactgtgtga gacacggtaa
cttcggcaat tcttacgtgt cttggtttgc ttattgggga caggggacac
tggtgactgt gtcttccgga ggatgtggcg gtggagaagt ggccgcactg
gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag gtcgctgcac ttgaaaagga
ggtcgcagcc ctggagaaag gcggcgggga caaaactcac acatgcccac
cgtgcccagc acctgaagcc gcggggggac cgtcagtctt cctcttcccc
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg
cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt
acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag
cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca
ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc
tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa
ccaggtcagc ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg
ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg
cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac
cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga
tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct
ccgggtaaa
【0358】
ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １xＣＤ３ ｍＡｂ ２xＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２５４）：QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTGS
WMNWVRQAPG QGLEWIGRIY PGDGETNYNG KFKDRVTITA DKSTSTAYME
LSSLRSEDTA VYYCARIYGN NVYFDVWGQG TTVTVSSGGC GGGKVAALKE
KVAALKEKVA ALKEKVAALK E
【0359】
配列番号２５４では、アミノ酸残基１〜１１０は、ＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１０４）に対応し、残基１１１〜１１８は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１９〜２３７は、ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１８６）に対応し、残基２３８〜２４３は、リンカーGGCGGG（配列番号３４）に対応し、残基２４４〜２７１はＫコイルドメイン（配列番号４０）である。
【0360】
配列番号２５４をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２５５）：caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac
tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact
acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc
gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag
tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg
acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc
gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg
tggacaggtc cagctggtcc agagcggggc cgaagtcaaa aaacccggag
caagcgtgaa ggtctcctgc aaagcatcag gctatacatt tacaggcagc
tggatgaact gggtgaggca ggctccagga cagggactgg agtggatcgg
gcgcatctac cctggagacg gcgaaactaa ctataatgga aagttcaaag
accgagtgac catcacagcc gataagtcta ctagtaccgc ctacatggag
ctgagctccc tgcggtctga agataccgcc gtctactatt gcgctagaat
ttacggaaac aatgtctatt ttgacgtgtg ggggcaggga acaactgtga
ctgtctcctc cggaggatgt ggcggtggaa aagtggccgc actgaaggag
aaagttgctg ctttgaaaga gaaggtcgcc gcacttaagg aaaaggtcgc
agccctgaaa gag
【0361】
ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １xＣＤ３ ｍＡｂ ２xＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２５６）：QVQLKESGPG LVAPSQSLSI TCTVSGFSLS RYSVHWVRQP PGKGLEWLGM
IWGGGSTDYN SALKSRLSIS KDNSKSQVFL KMNSLQTDDT AMYYCARKHG
NYYTMDYWGQ GTSVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY
FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI
CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD
TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK
【0362】
配列番号２５６では、アミノ酸残基１〜１１８は、ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１５８）に対応し、残基１１９〜２１６は、修飾ＣＨ１ドメイン（配列番号２０８）に対応し、残基２１７〜２３１は、リンカー（配列番号２０９）に対応し、残基２３２〜４４８は、「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５３）に対応する。
【0363】
配列番号２５６をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２５７）：caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcac cctcacagag
cctgtccatc acatgcactg tctctgggtt ctcattatcc agatatagtg
tacactgggt tcgccagcct ccaggaaagg gtctggagtg gctgggaatg
atatggggtg gtggaagcac agactataat tcagctctca aatccagact
gagtatcagc aaggacaact ccaagagcca agttttctta aaaatgaaca
gtctgcaaac tgatgacaca gccatgtact actgtgccag aaaacatggt
aactactata ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc
ctccgcctcc accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca
agagcacctc tgggggcaca gcggccctgg gctgcctggt caaggactac
ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg
cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca
gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga
gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg
aagccgcggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac
accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt
gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg
aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg
caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg
agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac
accctgcccc catcccggga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgag
ttgcgcagtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga
gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac
tccgacggct ccttcttcct cgtcagcaag ctcaccgtgg acaagagcag
gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc
acaaccgcta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaa
【0364】
ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １xＣＤ３ ｍＡｂ ２xＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １の第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２５８）：DIQMTQTTSS LSASLGDRIT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY
TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GYTLYTFGGG
TKLEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD
NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL
SSPVTKSFNR GEC
【0365】
配列番号２５８では、アミノ酸残基１〜１０６は、ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１５３）に対応し、残基１０７〜２１３は、ＣＬ Ｋａｐｐａドメイン（配列番号２１０）に対応する。
【0366】
配列番号２５８をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２５９）：gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga
cagaatcacc atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa
actggtatca gcagaaacca gatggaactg ttaaactcct gatctactac
acatcaagat tacactcagg agtcccatca aggttcagtg gcagtgggtc
tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa gaagatattg
ccacttactt ttgccaacag ggttatacgc tgtacacgtt cggagggggg
accaagctgg aaataaaacg tacggtggct gcaccatcgg tcttcatctt
cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc
tgctgaataa cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat
aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag
caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag
actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg
agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgt
【0367】
Ｌ．ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １xＣＤ３ ｍＡｂ ２xＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＶＬ及びＶＨドメイン、抗体ＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＬ及びＶＨドメイン、並びにＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２のＶＬ及びＶＨドメインを備える、４つのポリペプチド鎖からなる三重特異性結合分子を構成した。従って上記三重特異性結合分子は、「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １xＣＤ３ ｍＡｂ ２xＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２」と称した。この三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２６０）：
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT
SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG
TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSTYAMNW
VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV KGRFTISRDD SKNSLYLQMN
SLKTEDTAVY YCVRHGNFGN SYVSWFAYWG QGTLVTVSSG GCGGGEVAAL
EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP
PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE
QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR
EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT
PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS
PGK
【0368】
配列番号２６０では、アミノ酸残基１〜１０６は、ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１８１）に対応し、残基１０７〜１１４は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１５〜２３９は、Ｄ６５Ｇ置換を有するＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１１２）に対応し、残基２４０〜２４５は、GGCGGGリンカー（配列番号３４）に対応し、残基２４６〜２７３は、Ｅコイルドメイン（配列番号３９）に対応し、残基２７４〜２７６はリンカーGGGであり、残基２７７〜２８６はリンカーDKTHTCPPCP（配列番号４８）であり、残基２８７〜５０３は「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５２）である。
【0369】
配列番号２６０をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２６１）：gacattcagc tgactcagtc cccctctttt ctgtccgcat ccgtcggaga
tcgagtgact attacttgct ctgctaggtc ctcaatcagc ttcatgtact
ggtatcagca gaagcccggc aaagcaccta agctgctgat ctacgacaca
agcaacctgg cctccggggt gccatctcgg ttctctggca gtgggtcagg
aactgagttt accctgacaa ttagctccct ggaggctgaa gatgccgcta
cctactattg ccagcagtgg agcagctatc ctctgacctt cggacagggg
actaaactgg aaatcaaggg tggaggatcc ggcggcggag gcgaggtgca
gctggtggag tctgggggag gcttggtcca gcctggaggg tccctgagac
tctcctgtgc agcctctgga ttcaccttca gcacatacgc tatgaattgg
gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag tgggttggaa ggatcaggtc
caagtacaac aattatgcaa cctactatgc cgactctgtg aagggtagat
tcaccatctc aagagatgat tcaaagaact cactgtatct gcaaatgaac
agcctgaaaa ccgaggacac ggccgtgtat tactgtgtga gacacggtaa
cttcggcaat tcttacgtgt cttggtttgc ttattgggga caggggacac
tggtgactgt gtcttccgga ggatgtggcg gtggagaagt ggccgcactg
gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag gtcgctgcac ttgaaaagga
ggtcgcagcc ctggagaaag gcggcgggga caaaactcac acatgcccac
cgtgcccagc acctgaagcc gcggggggac cgtcagtctt cctcttcccc
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg
cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt
acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag
cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca
ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc
tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa
ccaggtcagc ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg
ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg
cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac
cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga
tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct
ccgggtaaa
【0370】
ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １xＣＤ３ ｍＡｂ ２xＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２６２）：QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTGS
WMNWVRQAPG QGLEWIGRIY PGDGETNYNG KFKDRVTITA DKSTSTAYME
LSSLRSEDTA VYYCARIYGN NVYFDVWGQG TTVTVSSGGC GGGKVAALKE
KVAALKEKVA ALKEKVAALK E
【0371】
配列番号２６２では、アミノ酸残基１〜１１０は、ＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１０４）に対応し、残基１１１〜１１８は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１９〜２３７は、ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１８６）に対応し、残基２３８〜２４３は、リンカーGGCGGG（配列番号３４）に対応し、残基２４４〜２７１はＫコイルドメイン（配列番号４０）である。
【0372】
配列番号２６２をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２６３）：caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac
tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact
acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc
gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag
tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg
acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc
gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg
tggacaggtc cagctggtcc agagcggggc cgaagtcaaa aaacccggag
caagcgtgaa ggtctcctgc aaagcatcag gctatacatt tacaggcagc
tggatgaact gggtgaggca ggctccagga cagggactgg agtggatcgg
gcgcatctac cctggagacg gcgaaactaa ctataatgga aagttcaaag
accgagtgac catcacagcc gataagtcta ctagtaccgc ctacatggag
ctgagctccc tgcggtctga agataccgcc gtctactatt gcgctagaat
ttacggaaac aatgtctatt ttgacgtgtg ggggcaggga acaactgtga
ctgtctcctc cggaggatgt ggcggtggaa aagtggccgc actgaaggag
aaagttgctg ctttgaaaga gaaggtcgcc gcacttaagg aaaaggtcgc
agccctgaaa gag
【0373】
ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １xＣＤ３ ｍＡｂ ２xＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２６４）：QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGFTFT NYGMNWVKQA PGKGLKWMGW
INTYIGEPTY ADDFKGRFVF SLETSASTAY LQINNLKNED MATYFCAREL
GPYYFDYWGQ GTTLTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY
FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI
CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD
TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK
【0374】
配列番号２６４では、アミノ酸残基１〜１１８は、ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１６７）に対応し、残基１１９〜２１６は、修飾ＣＨ１ドメイン（配列番号２０８）に対応し、残基２１７〜２３１は、リンカー（配列番号２０９）に対応し、残基２３２〜４４８は、「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５３）に対応する。
【0375】
配列番号２６４をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２６５）：cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac
agtcaagatc tcctgcaagg cttctgggtt taccttcaca aactatggaa
tgaactgggt gaagcaggct ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg
ataaacacct atattggaga gccgacatat gctgatgact tcaagggacg
gtttgtcttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat ttgcagatca
acaacctcaa aaatgaggac atggccacat atttctgtgc aagagaactg
ggaccatact actttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc
ctccgcctcc accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca
agagcacctc tgggggcaca gcggccctgg gctgcctggt caaggactac
ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg
cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca
gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga
gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg
aagccgcggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac
accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt
gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg
aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg
caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg
agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac
accctgcccc catcccggga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgag
ttgcgcagtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga
gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac
tccgacggct ccttcttcct cgtcagcaag ctcaccgtgg acaagagcag
gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc
acaaccgcta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaa
【0376】
ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １xＣＤ３ ｍＡｂ ２xＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２ の第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２６６）：DVVMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSSGNTYLHW YLQKPGQSPK
LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP
TFGSGTKLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV
QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV
THQGLSSPVT KSFNRGEC
【0377】
配列番号２６６では、アミノ酸残基１〜１１１は、ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１６３）に対応し、残基１１２〜２１８は、ＣＬ Ｋａｐｐａドメイン（配列番号２１０）に対応する。
【0378】
配列番号２６６をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２６７）：gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga
tcaagcctcc atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtagtg
gaaacaccta tttacattgg tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag
ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt tctggggtcc cagacaggtt
cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc agcagagtgg
aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccc
acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aaacgtacgg tggctgcacc
atcggtcttc atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg
cctctgttgt gtgcctgctg aataacttct atcccagaga ggccaaagta
cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc aggagagtgt
cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc agcaccctga
cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc
acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga
gtgt
【0379】
Ｍ．ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １xＣＤ３ ｍＡｂ ２xＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＶＬ及びＶＨドメイン、抗体ＣＤ３ ｍＡｂ ２ のＶＬ及びＶＨドメイン、並びにＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３のＶＬ及びＶＨドメインを備える、４つのポリペプチド鎖からなる三重特異性結合分子を構成した。従って上記三重特異性結合分子は「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １xＣＤ３ ｍＡｂ ２xＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３」と称した。この三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２６８）：
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT
SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG
TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSTYAMNW
VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV KGRFTISRDD SKNSLYLQMN
SLKTEDTAVY YCVRHGNFGN SYVSWFAYWG QGTLVTVSSG GCGGGEVAAL
EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP
PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE
QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR
EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT
PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS
PGK
【0380】
配列番号２６８では、アミノ酸残基１〜１０６は、ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１８１）に対応し、残基１０７〜１１４は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１５〜２３９は、Ｄ６５Ｇ置換を有するＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１１２）に対応し、残基２４０〜２４５は、GGCGGGリンカー（配列番号３４）に対応し、残基２４６〜２７３は、Ｅコイルドメイン（配列番号３９）に対応し、残基２７４〜２７６はリンカーGGGであり、残基２７７〜２８６はリンカーDKTHTCPPCP（配列番号４８）であり、残基２８７〜５０３は「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５２）である。
【0381】
配列番号２６８をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２６９）：gacattcagc tgactcagtc cccctctttt ctgtccgcat ccgtcggaga
tcgagtgact attacttgct ctgctaggtc ctcaatcagc ttcatgtact
ggtatcagca gaagcccggc aaagcaccta agctgctgat ctacgacaca
agcaacctgg cctccggggt gccatctcgg ttctctggca gtgggtcagg
aactgagttt accctgacaa ttagctccct ggaggctgaa gatgccgcta
cctactattg ccagcagtgg agcagctatc ctctgacctt cggacagggg
actaaactgg aaatcaaggg tggaggatcc ggcggcggag gcgaggtgca
gctggtggag tctgggggag gcttggtcca gcctggaggg tccctgagac
tctcctgtgc agcctctgga ttcaccttca gcacatacgc tatgaattgg
gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag tgggttggaa ggatcaggtc
caagtacaac aattatgcaa cctactatgc cgactctgtg aagggtagat
tcaccatctc aagagatgat tcaaagaact cactgtatct gcaaatgaac
agcctgaaaa ccgaggacac ggccgtgtat tactgtgtga gacacggtaa
cttcggcaat tcttacgtgt cttggtttgc ttattgggga caggggacac
tggtgactgt gtcttccgga ggatgtggcg gtggagaagt ggccgcactg
gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag gtcgctgcac ttgaaaagga
ggtcgcagcc ctggagaaag gcggcgggga caaaactcac acatgcccac
cgtgcccagc acctgaagcc gcggggggac cgtcagtctt cctcttcccc
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg
cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt
acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag
cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca
ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc
tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa
ccaggtcagc ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg
ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg
cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac
cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga
tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct
ccgggtaaa
【0382】
ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １xＣＤ３ ｍＡｂ ２xＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２７０）：QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTGS
WMNWVRQAPG QGLEWIGRIY PGDGETNYNG KFKDRVTITA DKSTSTAYME
LSSLRSEDTA VYYCARIYGN NVYFDVWGQG TTVTVSSGGC GGGKVAALKE
KVAALKEKVA ALKEKVAALK E
【0383】
配列番号２７０では、アミノ酸残基１〜１１０は、ＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１０４）に対応し、残基１１１〜１１８は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１９〜２３７は、ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１８６）に対応し、残基２３８〜２４３は、リンカーGGCGGG（配列番号３４）に対応し、残基２４４〜２７１はＫコイルドメイン（配列番号４０）である。
【0384】
配列番号２７０をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２７１）：caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac
tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact
acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc
gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag
tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg
acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc
gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg
tggacaggtc cagctggtcc agagcggggc cgaagtcaaa aaacccggag
caagcgtgaa ggtctcctgc aaagcatcag gctatacatt tacaggcagc
tggatgaact gggtgaggca ggctccagga cagggactgg agtggatcgg
gcgcatctac cctggagacg gcgaaactaa ctataatgga aagttcaaag
accgagtgac catcacagcc gataagtcta ctagtaccgc ctacatggag
ctgagctccc tgcggtctga agataccgcc gtctactatt gcgctagaat
ttacggaaac aatgtctatt ttgacgtgtg ggggcaggga acaactgtga
ctgtctcctc cggaggatgt ggcggtggaa aagtggccgc actgaaggag
aaagttgctg ctttgaaaga gaaggtcgcc gcacttaagg aaaaggtcgc
agccctgaaa gag
【0385】
ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １xＣＤ３ ｍＡｂ ２xＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２７２）：EVQLVESGGG SVKPGGSLKL SCAASGFTFT DHYMYWVRQT PEKRLEWVAT
ISDGGSFTSY PDSVKGRFTI SRDIAKNNLY LQMSSLKSED TAMYYCTRDE
SDRPFPYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY
FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI
CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD
TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK
【0386】
配列番号２７２では、アミノ酸残基１〜１１８は、ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１７７）に対応し、残基１１９〜２１６は、修飾ＣＨ１ドメイン（配列番号２０８）に対応し、残基２１７〜２３１は、リンカー（配列番号２０９）に対応し、残基２３２〜４４８は、「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５３）に対応する。
【0387】
配列番号２７２をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２７３）：gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcagtgaagc ctggagggtc
cctgaaactc tcctgtgcag cctctggatt cactttcact gaccattaca
tgtattgggt tcgccagact ccggaaaaga ggctggagtg ggtcgcaacc
attagtgatg gcggtagttt cacctcctat ccagacagtg tgaaggggcg
attcaccatc tccagagaca ttgccaagaa caacctgtac ctccaaatga
gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtac aagagatgag
agcgataggc cgtttcctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc
ctccgcctcc accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca
agagcacctc tgggggcaca gcggccctgg gctgcctggt caaggactac
ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg
cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca
gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga
gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg
aagccgcggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac
accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt
gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg
aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg
caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg
agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac
accctgcccc catcccggga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgag
ttgcgcagtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga
gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac
tccgacggct ccttcttcct cgtcagcaag ctcaccgtgg acaagagcag
gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc
acaaccgcta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaa
【0388】
ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １xＣＤ３ ｍＡｂ ２xＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３の第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２７４）：DIVLTQSHRS MSTSVGDRVN ITCKASQDVT TAVAWYQQKP GQSPKLLIFW
ASTRHAGVPD RFTGSGSGTD FTLTISSVQA GDLALYYCQQ HYSTPYTFGG
GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV
DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG
LSSPVTKSFN RGEC
【0389】
配列番号２７４では、アミノ酸残基１〜１０７は、ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１７２）に対応し、残基１０８〜２１４は、ＣＬ Ｋａｐｐａドメイン（配列番号２１０）に対応する。
【0390】
配列番号２７４をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２７５）：gacattgtgc tgacccagtc tcacagatcc atgtccacat cagtaggaga
cagggtcaac atcacctgca aggccagtca ggatgtgact actgctgtag
cctggtatca acaaaaacca gggcaatctc ctaaattact gattttctgg
gcatccaccc ggcacgctgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc
tgggacagat tttactctca ccatcagcag tgtgcaggct ggagacctgg
cactttatta ctgtcaacaa cattatagca caccgtacac attcggaggg
gggaccaagc tggaaataaa acgtacggtg gctgcaccat cggtcttcat
cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt
gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg
gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca cagagcagga
cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg ctgagcaaag
cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt
【0391】
Ｎ．ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １xＣＤ３ ｍＡｂ ２xｇｐＡ３３ ｍＡｂ １代替的なＥｐｈＡ２／ＣＤ３／ｇｐＡ３３三重特異性結合分子を構成した。上記分子は４つのポリペプチド鎖からなり、ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １のＶＬ及びＶＨドメイン、抗体ＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＬ及びＶＨドメイン、並びにｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＶＬ及びＶＨドメインを備える。上記分子は「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １xＣＤ３ ｍＡｂ ２xｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」と称した。この三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２７６）：
DIQMTQTTSS LSASLGDRIT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY
TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GYTLYTFGGG
TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSTYAMNW
VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV KGRFTISRDD SKNSLYLQMN
SLKTEDTAVY YCVRHGNFGN SYVSWFAYWG QGTLVTVSSG GCGGGEVAAL
EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP
PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE
QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR
EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT
PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS
PGK
【0392】
配列番号２７６では、アミノ酸残基１〜１０６は、ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１５３）に対応し、残基１０７〜１１４は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１５〜２３９は、Ｄ６５Ｇ置換を有するＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１１２）に対応し、残基２４０〜２４５は、GGCGGGリンカー（配列番号３４）に対応し、残基２４６〜２７３は、Ｅコイルドメイン（配列番号３９）に対応し、残基２７４〜２７６はリンカーGGGであり、残基２７７〜２８６はリンカーDKTHTCPPCP（配列番号４８）であり、残基２８７〜５０３は「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５２）である。
【0393】
配列番号２７６をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２７７）：gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga
cagaatcacc atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa
actggtatca gcagaaacca gatggaactg ttaaactcct gatctactac
acatcaagat tacactcagg agtcccatca aggttcagtg gcagtgggtc
tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa gaagatattg
ccacttactt ttgccaacag ggttatacgc tgtacacgtt cggagggggg
accaagctgg aaataaaagg tggaggatcc ggcggcggag gcgaggtgca
gctggtggag tctgggggag gcttggtcca gcctggaggg tccctgagac
tctcctgtgc agcctctgga ttcaccttca gcacatacgc tatgaattgg
gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag tgggttggaa ggatcaggtc
caagtacaac aattatgcaa cctactatgc cgactctgtg aagggtagat
tcaccatctc aagagatgat tcaaagaact cactgtatct gcaaatgaac
agcctgaaaa ccgaggacac ggccgtgtat tactgtgtga gacacggtaa
cttcggcaat tcttacgtgt cttggtttgc ttattgggga caggggacac
tggtgactgt gtcttccgga ggatgtggcg gtggagaagt ggccgcactg
gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag gtcgctgcac ttgaaaagga
ggtcgcagcc ctggagaaag gcggcgggga caaaactcac acatgcccac
cgtgcccagc acctgaagcc gcggggggac cgtcagtctt cctcttcccc
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg
cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt
acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag
cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca
ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc
tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa
ccaggtcagc ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg
ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg
cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac
cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga
tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct
ccgggtaaa
【0394】
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １xＣＤ３ ｍＡｂ ２xｇｐＡ３３ ｍＡｂ １の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２７８）：QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLKESGPGLV APSQSLSITC TVSGFSLSRY
SVHWVRQPPG KGLEWLGMIW GGGSTDYNSA LKSRLSISKD NSKSQVFLKM
NSLQTDDTAM YYCARKHGNY YTMDYWGQGT SVTVSSGGCG GGKVAALKEK
VAALKEKVAA LKEKVAALKE
【0395】
配列番号２７８では、アミノ酸残基１〜１１０は、ＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１０４）に対応し、残基１１１〜１１８は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１９〜２３６は、ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１５８）に対応し、残基２３７〜２４２は、リンカーGGCGGG（配列番号３４）に対応し、残基２４３〜２７０はＫコイルドメイン（配列番号４０）である。
【0396】
配列番号２７８をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２７９）：caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac
tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact
acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc
gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag
tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg
acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc
gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg
tggacaggtg cagctgaagg agtcaggacc tggcctggtg gcaccctcac
agagcctgtc catcacatgc actgtctctg ggttctcatt atccagatat
agtgtacact gggttcgcca gcctccagga aagggtctgg agtggctggg
aatgatatgg ggtggtggaa gcacagacta taattcagct ctcaaatcca
gactgagtat cagcaaggac aactccaaga gccaagtttt cttaaaaatg
aacagtctgc aaactgatga cacagccatg tactactgtg ccagaaaaca
tggtaactac tatactatgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg
tctcctccgg aggatgtggc ggtggaaaag tggccgcact gaaggagaaa
gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca cttaaggaaa aggtcgcagc
cctgaaagag
【0397】
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘｇｐＡ３３ ｍＡｂ １の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２８０）：QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GSWMNWVRQA PGQGLEWIGR
IYPGDGETNY NGKFKDRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARIY
GNNVYFDVWG QGTTVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD
YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY
ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK
DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS
TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV
YTLPPSREEM TKNQVSLSCA VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL
DSDGSFFLVS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNRYTQ KSLSLSPGK
【0398】
配列番号２８０では、アミノ酸残基１〜１１９は、ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１８６）に対応し、残基１２０〜２１７は、修飾ＣＨ１ドメイン（配列番号２０８）に対応し、残基２１８〜２３２は、リンカー（配列番号２０９）に対応し、残基２３３〜４４９は、「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５３）に対応する。
【0399】
配列番号２８０をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２８１）：caggtccagc tggtccagag cggggccgaa gtcaaaaaac ccggagcaag
cgtgaaggtc tcctgcaaag catcaggcta tacatttaca ggcagctgga
tgaactgggt gaggcaggct ccaggacagg gactggagtg gatcgggcgc
atctaccctg gagacggcga aactaactat aatggaaagt tcaaagaccg
agtgaccatc acagccgata agtctactag taccgcctac atggagctga
gctccctgcg gtctgaagat accgccgtct actattgcgc tagaatttac
ggaaacaatg tctattttga cgtgtggggg cagggaacaa ctgtgactgt
ctcctccgcc tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct
ccaagagcac ctctgggggc acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac
tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg aactcaggcg ccctgaccag
cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga ctctactccc
tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt
tgagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac
ctgaagccgc ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag
gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga
cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg
tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa
tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca
tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg
tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg accaagaacc aggtcagcct
gagttgcgca gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg
agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg
gactccgacg gctccttctt cctcgtcagc aagctcaccg tggacaagag
caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc
tgcacaaccg ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa
【0400】
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘｇｐＡ３３ ｍＡｂ １の第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２８２）：DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT
SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG
TKLEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD
NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL
SSPVTKSFNR GEC
【0401】
配列番号２８２では、アミノ酸残基１〜１０６は、ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１８１）に対応し、残基１０７〜２１３は、ＣＬ Ｋａｐｐａドメイン（配列番号２１０）に対応する。
【0402】
配列番号２８２をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２８３）：gacattcagc tgactcagtc cccctctttt ctgtccgcat ccgtcggaga
tcgagtgact attacttgct ctgctaggtc ctcaatcagc ttcatgtact
ggtatcagca gaagcccggc aaagcaccta agctgctgat ctacgacaca
agcaacctgg cctccggggt gccatctcgg ttctctggca gtgggtcagg
aactgagttt accctgacaa ttagctccct ggaggctgaa gatgccgcta
cctactattg ccagcagtgg agcagctatc ctctgacctt cggacagggg
actaaactgg aaatcaagcg tacggtggct gcaccatcgg tcttcatctt
cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc
tgctgaataa cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat
aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag
caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag
actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg
agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgt
【0403】
Ｏ．ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘｇｐＡ３３ ｍＡｂ １第２の代替的なＥｐｈＡ２／ＣＤ３／ｇｐＡ３３三重特異性結合分子を構成した。上記分子は４つのポリペプチド鎖からなり、ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２のＶＬ及びＶＨドメイン、抗体ＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＬ及びＶＨドメイン、並びにｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＶＬ及びＶＨドメインを備える。上記分子は「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」と称した。この三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２８４）：
DVVMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSSGNTYLHW YLQKPGQSPK
LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP
TFGSGTKLEI KGGGSGGGGE VQLVESGGGL VQPGGSLRLS CAASGFTFST
YAMNWVRQAP GKGLEWVGRI RSKYNNYATY YADSVKGRFT ISRDDSKNSL
YLQMNSLKTE DTAVYYCVRH GNFGNSYVSW FAYWGQGTLV TVSSGGCGGG
EVAALEKEVA ALEKEVAALE KEVAALEKGG GDKTHTCPPC PAPEAAGGPS
VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT
KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA
KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLWCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN
NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK
SLSLSPGK
【0404】
配列番号２８４では、アミノ酸残基１〜１１１は、ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１６３）に対応し、残基１１２〜１１９は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１２０〜２４４は、Ｄ６５Ｇ置換を有するＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１１２）に対応し、残基２４５〜２５０は、GGCGGGリンカー（配列番号３４）に対応し、残基２５１〜２７８は、Ｅコイルドメイン（配列番号３９）に対応し、残基２７９〜２８１はリンカーGGGであり、残基２８２〜２９１はリンカーDKTHTCPPCP（配列番号４８）であり、残基２９２〜５０８は「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５２）である。
【0405】
配列番号２８４をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２８５）：gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga
tcaagcctcc atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtagtg
gaaacaccta tttacattgg tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag
ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt tctggggtcc cagacaggtt
cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc agcagagtgg
aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccc
acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aaaggtggag gatccggcgg
cggaggcgag gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtccagcctg
gagggtccct gagactctcc tgtgcagcct ctggattcac cttcagcaca
tacgctatga attgggtccg ccaggctcca gggaaggggc tggagtgggt
tggaaggatc aggtccaagt acaacaatta tgcaacctac tatgccgact
ctgtgaaggg tagattcacc atctcaagag atgattcaaa gaactcactg
tatctgcaaa tgaacagcct gaaaaccgag gacacggccg tgtattactg
tgtgagacac ggtaacttcg gcaattctta cgtgtcttgg tttgcttatt
ggggacaggg gacactggtg actgtgtctt ccggaggatg tggcggtgga
gaagtggccg cactggagaa agaggttgct gctttggaga aggaggtcgc
tgcacttgaa aaggaggtcg cagccctgga gaaaggcggc ggggacaaaa
ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagccgcggg gggaccgtca
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac
ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg
tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca
aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct
caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg
tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga
ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgtg gtgcctggtc aaaggcttct
atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac
aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct
ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct
tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag
agcctctccc tgtctccggg taaa
【0406】
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘｇｐＡ３３ ｍＡｂ １の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２８６）：QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG GGGSGGGGQI QLVQSGPELK KPGETVKISC KASGFTFTNY
GMNWVKQAPG KGLKWMGWIN TYIGEPTYAD DFKGRFVFSL ETSASTAYLQ
INNLKNEDMA TYFCARELGP YYFDYWGQGT TLTVSSGGCG GGKVAALKEK
VAALKEKVAA LKEKVAALKE
【0407】
配列番号２８６では、アミノ酸残基１〜１１０は、ＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１０４）に対応し、残基１１１〜１１８は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１９〜２３６は、ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１６７）に対応し、残基２３７〜２４２は、リンカーGGCGGG（配列番号３４）に対応し、残基２４３〜２７０はＫコイルドメイン（配列番号４０）である。
【0408】
配列番号２８６をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２８７）：caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac
tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact
acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc
gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag
tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg
acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc
gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg
tggacagatc cagttggtgc agtctggacc tgagctgaag aagcctggag
agacagtcaa gatctcctgc aaggcttctg ggtttacctt cacaaactat
ggaatgaact gggtgaagca ggctccagga aagggtttaa agtggatggg
ctggataaac acctatattg gagagccgac atatgctgat gacttcaagg
gacggtttgt cttctctttg gaaacctctg ccagcactgc ctatttgcag
atcaacaacc tcaaaaatga ggacatggcc acatatttct gtgcaagaga
actgggacca tactactttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag
tctcctccgg aggatgtggc ggtggaaaag tggccgcact gaaggagaaa
gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca cttaaggaaa aggtcgcagc
cctgaaagag
【0409】
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘｇｐＡ３３ ｍＡｂ １の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２８８）：QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GSWMNWVRQA PGQGLEWIGR
IYPGDGETNY NGKFKDRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARIY
GNNVYFDVWG QGTTVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD
YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY
ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK
DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS
TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV
YTLPPSREEM TKNQVSLSCA VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL
DSDGSFFLVS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNRYTQ KSLSLSPGK
【0410】
配列番号２８８では、アミノ酸残基１〜１１９は、ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１８６）に対応し、残基１２０〜２１７は、修飾ＣＨ１ドメイン（配列番号２０８）に対応し、残基２１８〜２３２は、リンカー（配列番号２０９）に対応し、残基２３３〜４４９は、「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５３）に対応する。
【0411】
配列番号２８８をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２８９）：caggtccagc tggtccagag cggggccgaa gtcaaaaaac ccggagcaag
cgtgaaggtc tcctgcaaag catcaggcta tacatttaca ggcagctgga
tgaactgggt gaggcaggct ccaggacagg gactggagtg gatcgggcgc
atctaccctg gagacggcga aactaactat aatggaaagt tcaaagaccg
agtgaccatc acagccgata agtctactag taccgcctac atggagctga
gctccctgcg gtctgaagat accgccgtct actattgcgc tagaatttac
ggaaacaatg tctattttga cgtgtggggg cagggaacaa ctgtgactgt
ctcctccgcc tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct
ccaagagcac ctctgggggc acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac
tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg aactcaggcg ccctgaccag
cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga ctctactccc
tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt
tgagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac
ctgaagccgc ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag
gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga
cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg
tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa
tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca
tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg
tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg accaagaacc aggtcagcct
gagttgcgca gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg
agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg
gactccgacg gctccttctt cctcgtcagc aagctcaccg tggacaagag
caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc
tgcacaaccg ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa
【0412】
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘｇｐＡ３３ ｍＡｂ １の第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２９０）：DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT
SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG
TKLEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD
NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL
SSPVTKSFNR GEC
【0413】
配列番号２９０では、アミノ酸残基１〜１０６は、ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１８１）に対応し、残基１０７〜２１３は、ＣＬ Ｋａｐｐａドメイン（配列番号２１０）に対応する。
【0414】
配列番号２９０をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２９１）：gacattcagc tgactcagtc cccctctttt ctgtccgcat ccgtcggaga
tcgagtgact attacttgct ctgctaggtc ctcaatcagc ttcatgtact
ggtatcagca gaagcccggc aaagcaccta agctgctgat ctacgacaca
agcaacctgg cctccggggt gccatctcgg ttctctggca gtgggtcagg
aactgagttt accctgacaa ttagctccct ggaggctgaa gatgccgcta
cctactattg ccagcagtgg agcagctatc ctctgacctt cggacagggg
actaaactgg aaatcaagcg tacggtggct gcaccatcgg tcttcatctt
cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc
tgctgaataa cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat
aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag
caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag
actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg
agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgt
【0415】
Ｐ．ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘｇｐＡ３３ ｍＡｂ １第３の代替的なＥｐｈＡ２／ＣＤ３／ｇｐＡ３３三重特異性結合分子を構成した。上記分子は４つのポリペプチド鎖からなり、ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３のＶＬ及びＶＨドメイン、抗体ＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＬ及びＶＨドメイン、並びにｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＶＬ及びＶＨドメインを備える。上記分子は「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」と称した。この三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２９２）：
DIVLTQSHRS MSTSVGDRVN ITCKASQDVT TAVAWYQQKP GQSPKLLIFW
ASTRHAGVPD RFTGSGSGTD FTLTISSVQA GDLALYYCQQ HYSTPYTFGG
GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN
WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKGRFTISRD DSKNSLYLQM
NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS GGCGGGEVAA
LEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEKGGGDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF
PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE
EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP
REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT
TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL
SPGK
【0416】
配列番号２９２では、アミノ酸残基１〜１０７は、ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１７２）に対応し、残基１０８〜１１５は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１６〜２４０は、Ｄ６５Ｇ置換を有するＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１１２）に対応し、残基２４１〜２４６は、GGCGGGリンカー（配列番号３４）に対応し、残基２４７〜２７４は、Ｅコイルドメイン（配列番号３９）に対応し、残基２７５〜２７７はリンカーGGGであり、残基２７８〜２８７はリンカーDKTHTCPPCP（配列番号４８）であり、残基２８８〜５０４は「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５２）である。
【0417】
配列番号２９２をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２９３）：gacattgtgc tgacccagtc tcacagatcc atgtccacat cagtaggaga
cagggtcaac atcacctgca aggccagtca ggatgtgact actgctgtag
cctggtatca acaaaaacca gggcaatctc ctaaattact gattttctgg
gcatccaccc ggcacgctgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc
tgggacagat tttactctca ccatcagcag tgtgcaggct ggagacctgg
cactttatta ctgtcaacaa cattatagca caccgtacac attcggaggg
gggaccaagc tggaaataaa aggtggagga tccggcggcg gaggcgaggt
gcagctggtg gagtctgggg gaggcttggt ccagcctgga gggtccctga
gactctcctg tgcagcctct ggattcacct tcagcacata cgctatgaat
tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg gagtgggttg gaaggatcag
gtccaagtac aacaattatg caacctacta tgccgactct gtgaagggta
gattcaccat ctcaagagat gattcaaaga actcactgta tctgcaaatg
aacagcctga aaaccgagga cacggccgtg tattactgtg tgagacacgg
taacttcggc aattcttacg tgtcttggtt tgcttattgg ggacagggga
cactggtgac tgtgtcttcc ggaggatgtg gcggtggaga agtggccgca
ctggagaaag aggttgctgc tttggagaag gaggtcgctg cacttgaaaa
ggaggtcgca gccctggaga aaggcggcgg ggacaaaact cacacatgcc
caccgtgccc agcacctgaa gccgcggggg gaccgtcagt cttcctcttc
cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac
atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact
ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag
gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca
ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag
ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc
cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa
gaaccaggtc agcctgtggt gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca
tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc
acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct
caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg
tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg
tctccgggta aa
【0418】
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘｇｐＡ３３ ｍＡｂ １の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２９４）：QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG GGGSGGGGEV QLVESGGGSV KPGGSLKLSC AASGFTFTDH
YMYWVRQTPE KRLEWVATIS DGGSFTSYPD SVKGRFTISR DIAKNNLYLQ
MSSLKSEDTA MYYCTRDESD RPFPYWGQGT LVTVSSGGCG GGKVAALKEK
VAALKEKVAA LKEKVAALKE
【0419】
配列番号２９４では、アミノ酸残基１〜１１０は、ＣＤ３ ｍＡｂ ３のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１０４）に対応し、残基１１１〜１１８は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１９〜２３６は、ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１７７）に対応し、残基２３７〜２４２は、リンカーGGCGGG（配列番号３４）に対応し、残基２４３〜２７０はＫコイルドメイン（配列番号４０）である。
【0420】
配列番号２９４をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２９５）：caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac
tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact
acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc
gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag
tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg
acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc
gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg
tggagaagtg cagctggtgg agtctggggg aggctcagtg aagcctggag
ggtccctgaa actctcctgt gcagcctctg gattcacttt cactgaccat
tacatgtatt gggttcgcca gactccggaa aagaggctgg agtgggtcgc
aaccattagt gatggcggta gtttcacctc ctatccagac agtgtgaagg
ggcgattcac catctccaga gacattgcca agaacaacct gtacctccaa
atgagcagtc tgaagtctga ggacacagcc atgtattact gtacaagaga
tgagagcgat aggccgtttc cttactgggg ccaagggact ctggtcactg
tctcctccgg aggatgtggc ggtggaaaag tggccgcact gaaggagaaa
gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca cttaaggaaa aggtcgcagc
cctgaaagag
【0421】
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘｇｐＡ３３ ｍＡｂ １の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２９６）：QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GSWMNWVRQA PGQGLEWIGR
IYPGDGETNY NGKFKDRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARIY
GNNVYFDVWG QGTTVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD
YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY
ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK
DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS
TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV
YTLPPSREEM TKNQVSLSCA VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL
DSDGSFFLVS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNRYTQ KSLSLSPGK
【0422】
配列番号２９６では、アミノ酸残基１〜１１９は、ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１８６）に対応し、残基１２０〜２１７は、修飾ＣＨ１ドメイン（配列番号２０８）に対応し、残基２１８〜２３２は、リンカー（配列番号２０９）に対応し、残基２３３〜４４９は、「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５３）に対応する。
【0423】
配列番号２９６をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２９７）：caggtccagc tggtccagag cggggccgaa gtcaaaaaac ccggagcaag
cgtgaaggtc tcctgcaaag catcaggcta tacatttaca ggcagctgga
tgaactgggt gaggcaggct ccaggacagg gactggagtg gatcgggcgc
atctaccctg gagacggcga aactaactat aatggaaagt tcaaagaccg
agtgaccatc acagccgata agtctactag taccgcctac atggagctga
gctccctgcg gtctgaagat accgccgtct actattgcgc tagaatttac
ggaaacaatg tctattttga cgtgtggggg cagggaacaa ctgtgactgt
ctcctccgcc tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct
ccaagagcac ctctgggggc acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac
tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg aactcaggcg ccctgaccag
cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga ctctactccc
tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt
tgagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac
ctgaagccgc ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag
gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga
cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg
tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa
tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca
tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg
tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg accaagaacc aggtcagcct
gagttgcgca gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg
agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg
gactccgacg gctccttctt cctcgtcagc aagctcaccg tggacaagag
caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc
tgcacaaccg ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa
【0424】
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘｇｐＡ３３ ｍＡｂ １の第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号２９８）：DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT
SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG
TKLEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD
NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL
SSPVTKSFNR GEC
【0425】
配列番号２９８では、アミノ酸残基１〜１０６は、ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１８１）に対応し、残基１０７〜２１３は、ＣＬ Ｋａｐｐａドメイン（配列番号２１０）に対応する。
【0426】
配列番号２９８をエンコードするポリヌクレオチドは、以下の通りである（配列番号２９９）：gacattcagc tgactcagtc cccctctttt ctgtccgcat ccgtcggaga
tcgagtgact attacttgct ctgctaggtc ctcaatcagc ttcatgtact
ggtatcagca gaagcccggc aaagcaccta agctgctgat ctacgacaca
agcaacctgg cctccggggt gccatctcgg ttctctggca gtgggtcagg
aactgagttt accctgacaa ttagctccct ggaggctgaa gatgccgcta
cctactattg ccagcagtgg agcagctatc ctctgacctt cggacagggg
actaaactgg aaatcaagcg tacggtggct gcaccatcgg tcttcatctt
cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc
tgctgaataa cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat
aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag
caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag
actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg
agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgt
【0427】
ＩＶ．基準抗体及びダイアボディ本発明の三重特異性結合分子の特性決定を支援するために、以下の基準ダイアボディを構成した。
【0428】
Ｑ．ＤＲ５ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ダイアボディ抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５ ｍＡｂ １のＶＬ及びＶＨドメイン並びにＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＬ及びＶＨドメインを有する、２つのポリペプチド鎖からなる例示的な二重特異性ダイアボディを構成した。上記ダイアボディは「ＤＲ５ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ダイアボディ」と称した。このダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１４０）：
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS SSGYSYMHWY QQKPGQPPKV
LIFLSSNLDS GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEDGDAATY YCQHSRDLPP
TFGGGTKLEI KGGGSGGGGE VQLVESGGGL VQPGGSLRLS CAASGFTFST
YAMNWVRQAP GKGLEWVGRI RSKYNNYATY YADSVKGRFT ISRDDSKNSL
YLQMNSLKTE DTAVYYCVRH GNFGNSYVSW FAYWGQGTLV TVSSASTKGE
VAACEKEVAA LEKEVAALEK EVAALEK
【0429】
配列番号１４０では、アミノ酸残基１〜１１１は、ＤＲ５ ｍＡｂ １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号３）に対応し、残基１１２〜１１９は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１２０〜２４４は、Ｄ６５Ｇ置換を有するＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１１２）に対応し、残基２４５〜２４９は、ASTKGリンカー（配列番号４７）残基２５０〜２７７は、システイン含有Ｅコイルドメイン（配列番号４１）に対応する。配列番号１４０をエンコードするポリヌクレオチドは、配列番号１４１：gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctcgggca
gagggccacc atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt tcctctggct
atagttatat gcactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaagtc
ctcatctttc tttcatccaa cctagattct ggggtccctg ccaggttcag
tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg
atggggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga tcttcctccg
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaaggaggcg gatccggcgg
cggaggcgag gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtccagcctg
gagggtccct gagactctcc tgtgcagcct ctggattcac cttcagcaca
tacgctatga attgggtccg ccaggctcca gggaaggggc tggagtgggt
tggaaggatc aggtccaagt acaacaatta tgcaacctac tatgccgact
ctgtgaaggg tagattcacc atctcaagag atgattcaaa gaactcactg
tatctgcaaa tgaacagcct gaaaaccgag gacacggccg tgtattactg
tgtgagacac ggtaacttcg gcaattctta cgtgtcttgg tttgcttatt
ggggacaggg gacactggtg actgtgtctt ccgcctccac caagggcgaa
gtggccgcat gtgagaaaga ggttgctgct ttggagaagg aggtcgctgc
acttgaaaag gaggtcgcag ccctggagaa a
である。
【0430】
上記ＤＲ５ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ダイアボディの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１４２）：QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG GGGSGGGGEV KFLESGGGLV QPGGSLKLSC VASGFDFSRY
WMSWVRQAPG KGLEWIGEIN PDSNTINYTP SLKDKFIISR DNAKNTLYLQ
MTKVRSEDTA LYYCTRRAYY GNPAWFAYWG QGTLVTVSAA STKGKVAACK
EKVAALKEKV AALKEKVAAL KE
【0431】
配列番号１４２では、アミノ酸残基１〜１１０は、ＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１０４）に対応し、残基１１１〜１１８は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１９〜２３９は、（配列番号８のＣ末端セリン残基をアラニン残基で置換した以外は）ＤＲ５ ｍＡｂ １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号８）に対応し、残基２４０〜２４４は、ASTKGリンカー（配列番号４７）に対応し、残基２４５〜２７２は、システイン含有Ｋコイルドメイン（配列番号４２）に対応する。配列番号１４２をエンコードするポリヌクレオチドは、配列番号１４３：caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac
tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact
acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc
gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag
tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg
acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc
gggggtggca caaaactgac tgtgctggga ggtggtggat ccggcggcgg
aggcgaggtg aagtttctcg agtctggagg tggcctggtg cagcctggag
gatccctgaa actctcctgt gtagcctcag gattcgattt tagtagatac
tggatgagtt gggtccggca ggctccaggg aaagggctag aatggattgg
agaaattaat ccagatagca atacgataaa ctatacgcca tctctaaagg
ataaattcat catctccaga gacaacgcca aaaatacgct gtatctgcaa
atgaccaaag tgagatctga ggacacagcc ctttattatt gtacaagaag
ggcctactat ggtaacccgg cctggtttgc ttactggggc caagggactc
tggtcactgt ctctgcagcc tccaccaagg gcaaagtggc cgcatgtaag
gagaaagttg ctgctttgaa agagaaggtc gccgcactta aggaaaaggt
cgcagccctg aaagag
である。
【0432】
Ｒ．ＤＲ５ ｍＡｂ ２ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ダイアボディ抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５ ｍＡｂ ２のＶＬ及びＶＨドメイン、並びにＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＬ及びＶＨドメインを有する、２つのポリペプチド鎖からなる例示的な二重特異性ダイアボディを構成した。上記ダイアボディは「ＤＲ５ ｍＡｂ ２ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ダイアボディ」と称した。このダイアボディの、第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである：（配列番号１４４）
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GQSPKLLIYW
ASTRHTGVPD RFTGSGSGTD YTLTIKSVQA EDLTLYYCQQ HYITPWTFGG
GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN
WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKGRFTISRD DSKNSLYLQM
NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS ASTKGEVAAC
EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEK
【0433】
配列番号１４４では、アミノ酸残基１〜１０７は、ＤＲ５ ｍＡｂ ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１３）に対応し、残基１０８〜１１５は、介在スペーサペプチド（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１６〜２４０は、Ｄ６５Ｇ置換を有するＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１１２）に対応し、残基２４１〜２４５は、ASTKGリンカー（配列番号４７）に対応し、残基２４６〜２７３は、システイン含有Ｅコイルドメイン（配列番号４１）に対応する。配列番号１４４をエンコードするポリヌクレオチドは、配列番号１４５：gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccactt cagtaggaga
cagggtcagc atcacctgca aggccagtca ggatgtgaat actgctgtag
cctggtatca acaaaaacca gggcaatctc ctaaactact gatttactgg
gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc
tgggacagat tatacactca ccatcaaaag tgtgcaggct gaagacctga
cactttatta ctgtcagcaa cactatatca ctccgtggac gttcggtgga
ggcaccaagc tggaaatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggcgaggt
gcagctggtg gagtctgggg gaggcttggt ccagcctgga gggtccctga
gactctcctg tgcagcctct ggattcacct tcagcacata cgctatgaat
tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg gagtgggttg gaaggatcag
gtccaagtac aacaattatg caacctacta tgccgactct gtgaagggta
gattcaccat ctcaagagat gattcaaaga actcactgta tctgcaaatg
aacagcctga aaaccgagga cacggccgtg tattactgtg tgagacacgg
taacttcggc aattcttacg tgtcttggtt tgcttattgg ggacagggga
cactggtgac tgtgtcttcc gcctccacca agggcgaagt ggccgcatgt
gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag gtcgctgcac ttgaaaagga
ggtcgcagcc ctggagaaa
である。
【0434】
ＤＲ５ ｍＡｂ ２ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ダイアボディの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１４６）：QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG GGGSGGGGKV QLQQSGAELV KPGASVKLSC KASGYTFTEY
ILHWVKQKSG QGLEWIGWFY PGNNNIKYNE KFKDKATLTA DKSSSTVYME
LSRLTSEDSA VYFCARHEQG PGYFDYWGQG TTLTVSSAST KGKVAACKEK
VAALKEKVAA LKEKVAALKE
【0435】
配列番号１４６では、アミノ酸残基１〜１１０は、ＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１０４）に対応し、残基１１１〜１１８は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１９〜２３７は、ＤＲ５ ｍＡｂ ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１８）に対応し、残基２３８〜２４２は、ASTKGリンカー（配列番号４７）に対応し、残基２４３〜２７０は、システイン含有Ｋコイルドメイン（配列番号４２）に対応する。配列番号１４６をエンコードするポリヌクレオチドは、配列番号１４７：caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac
tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact
acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc
gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag
tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg
acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc
gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggcgg
aggcaaggtc cagctgcagc agtctggagc tgaactggtg aaacccgggg
catcagtgaa gctgtcctgc aaggcttctg ggtacacctt cactgagtat
attttacact gggtaaagca gaagtctgga cagggtcttg agtggattgg
gtggttttat cctggaaata ataatataaa gtacaatgag aaattcaagg
acaaggccac actgactgcg gacaaatcct ccagcacagt ctatatggaa
cttagtagat tgacatctga agactctgcg gtctatttct gtgcaagaca
cgaacaagga ccaggttact ttgactactg gggccaaggc accactctca
cagtctcctc cgcctccacc aagggcaaag tggccgcatg taaggagaaa
gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca cttaaggaaa aggtcgcagc
cctgaaagag
である。
【0436】
Ｓ．ＤＲ５ ｍＡｂ ３ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ダイアボディ抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５ ｍＡｂ ３のＶＬ及びＶＨドメイン、並びにＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＬ及びＶＨドメインを有する、２つのポリペプチド鎖からなる例示的な二重特異性ダイアボディを構成した。上記ダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列（配列番号１４８）（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：
SELTQDPAVS VALGQTVRIT CSGDSLRSYY ASWYQQKPGQ APVLVIYGAN
NRPSGIPDRF SGSSSGNTAS LTITGAQAED EADYYCNSAD SSGNHVVFGG
GTKLTVLGGG GSGGGGEVQL VESGGGLVQP GGSLRLSCAA SGFTFSTYAM
NWVRQAPGKG LEWVGRIRSK YNNYATYYAD SVKGRFTISR DDSKNSLYLQ
MNSLKTEDTA VYYCVRHGNF GNSYVSWFAYWGQGTLVTVS SASTKGEVAA
CEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEK
を有していた。
【0437】
配列番号１４８では、アミノ酸残基１〜１０８は、ＤＲ５ ｍＡｂ ３のＶＬドメイン（配列番号５４）に対応し、残基１０９〜１１６は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１７〜２４１は、Ｄ６５Ｇ置換を有するＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１１２）に対応し、残基２４２〜２４６は、ASTKGリンカー（配列番号４７）に対応し、残基２４７〜２７５は、システイン含有Ｋコイルドメイン（配列番号４２）に対応する。
【0438】
上記ダイアボディの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列（配列番号１４９）（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG GGGSGGGGEV QLVQSGGGVE RPGGSLRLSC AASGFTFDDY
AMSWVRQAPG KGLEWVSGIN WQGGSTGYAD SVKGRVTISR DNAKNSLYLQ
MNSLRAEDTA VYYCAKILGA GRGWYFDYWG KGTTVTVSSA STKGKVAACK
EKVAALKEKV AALKEKVAAL KE
を有していた。
【0439】
配列番号１４９では、アミノ酸残基１〜１１０は、ＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＬドメイン（配列番号１０４）に対応し、残基１１１〜１１８は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１９〜２３９は、ＤＲ５ ｍＡｂ ３のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号５８）に対応し、残基２４０〜２４４は、ASTKGリンカー（配列番号４７）に対応し、残基２４５〜２７２は、システイン含有Ｋコイルドメイン（配列番号４２）に対応する。
【0440】
Ｔ．ＤＲ５ ｍＡｂ ４ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ダイアボディ抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５ ｍＡｂ ４のＶＬ及びＶＨドメイン、並びにＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＬ及びＶＨドメインを有する、２つのポリペプチド鎖からなる例示的な二重特異性ダイアボディを構成した。上記ダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列（配列番号１５０）（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：
EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQGIS RSYLAWYQQK PGQAPSLLIY
GASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QFGSSPWTFG
QGTKVEIKGG GSGGGGEVQL VESGGGLVQP GGSLRLSCAA SGFTFSTYAM
NWVRQAPGKG LEWVGRIRSK YNNYATYYAD SVKGRFTISR DDSKNSLYLQ
MNSLKTEDTA VYYCVRHGNF GNSYVSWFAY WGQGTLVTVS SASTKGEVAA
CEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEK
を有していた。
【0441】
配列番号１５０では、アミノ酸残基１〜１０８は、ＤＲ５ ｍＡｂ ４のＶＬドメイン（配列番号６２）に対応し、残基１０９〜１１６は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１７〜２４１は、Ｄ６５Ｇ置換を有するＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１１２）に対応し、残基２４２〜２４６は、ASTKGリンカー（配列番号４７）に対応し、残基２４７〜２７５は、システイン含有Ｅコイルドメイン（配列番号４１）に対応する。
【0442】
上記ダイアボディの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列（配列番号１５１）（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLQESGPGLV KPSQTLSLTC TVSGGSISSG
DYFWSWIRQL PGKGLEWIGH IHNSGTTYYN PSLKSRVTIS VDTSKKQFSL
RLSSVTAADT AVYYCARDRG GDYYYGMDVW GQGTTVTVSS ASTKGKVAAC
KEKVAALKEK VAALKEKVAA LKE
を有していた。
【0443】
配列番号１５１では、アミノ酸残基１〜１１０は、ＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＬドメイン（配列番号１０４）に対応し、残基１１１〜１１８は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１９〜２４０は、ＤＲ５ ｍＡｂ ４のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号６６）に対応し、残基２４１〜２４５は、ASTKGリンカー（配列番号４７）に対応し、残基２４６〜２７３は、システイン含有Ｋコイルドメイン（配列番号４２）に対応する。
【0444】
Ｕ．基準ｇｐＡ３３ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ダイアボディ本発明の二重特異性三重特異性結合分子を更に例示するために、ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １及びＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＬ及びＶＨドメインを用いて、２つのポリペプチド鎖からなるダイアボディを構成した。上記ダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列（配列番号３１６）（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT
SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG
TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSTYAMNW
VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV KGRFTISRDD SKNSLYLQMN
SLKTEDTAVY YCVRHGNFGN SYVSWFAYWG QGTLVTVSSA STKGEVAACE
KEVAALEKEV AALEKEVAAL EK
を有していた。
【0445】
配列番号３１６では、アミノ酸残基１〜１０６は、ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＶＬドメイン（配列番号１８１）に対応し、残基１０７〜１１４は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１５〜２３９は、Ｄ６５Ｇ置換を有するＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１１２）に対応し、残基２４０〜２４４は、ASTKGリンカー（配列番号４７）に対応し、残基２４５〜２７２は、システイン含有Ｅコイルドメイン（配列番号４１）に対応する。
【0446】
上記ダイアボディの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列（配列番号３１７）（ＣＤＲ残基は下線を付して示す）：QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTGS
WMNWVRQAPG QGLEWIGRIY PGDGETNYNG KFKDRVTITA DKSTSTAYME
LSSLRSEDTA VYYCARIYGN NVYFDVWGQG TTVTVSSAST KGKVAACKEK
VAALKEKVAA LKEKVAALKE
を有していた。
【0447】
配列番号３１７では、アミノ酸残基１〜１１０は、ＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＬドメイン（配列番号１０４）に対応し、残基１１１〜１１８は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１９〜２３７は、ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１８６）に対応し、残基２３８〜２４２は、ASTKGリンカー（配列番号４７）に対応し、残基２４３〜２７０は、システイン含有Ｋコイルドメイン（配列番号４２）に対応する。
【0448】
Ｖ．基準抗フルオレセイン抗体抗フルオレセイン抗体４‐４‐２０（Gruber, M. et al. (1994) “Efficient Tumor Cell Lysis Mediated By A Bi‐specific Single Chain Antibody Expressed In Escherichia coli,” J. Immunol. 152(11):5368‐5374; Bedzyk, W.D. et al. (1989) “Comparison Of Variable Region Primary Structures Within An Anti‐Fluorescein Idiotype Family,” J. Biol. Chem. 264(3): 1565‐1569）を、対照ダイアボディとして使用した。上記抗フルオレセイン抗体４‐４‐２０の可変軽鎖及び可変重鎖ドメインのアミノ酸配列は、以下の通りである：
【0449】
上記抗フルオレセイン抗体４‐４‐２０の可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列（配列番号１３８）（ＣＤＲ残基には下線を付す）：DVVMTQTPFS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSNGNTYLRW YLQKPGQSPK
VLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP
WTFGGGTKLE IK
【0450】
上記抗フルオレセイン抗体４‐４‐２０の可変重鎖ドメインのアミノ酸配列（配列番号１３９）（ＣＤＲ残基には下線を付す）：EVKLDETGGG LVQPGRPMKL SCVASGFTFS DYWMNWVRQS PEKGLEWVAQ
IRNKPYNYET YYSDSVKGRF TISRDDSKSS VYLQMNNLRV EDMGIYYCTG
SYYGMDYWGQ GTSVTVSS
【0451】
Ｖ．製造方法本発明の三重特異性結合分子は、当該技術分野において公知の方法によって、例えば合成又は組み換えにより、ＤＲ５に対して免疫特異的な抗体のポリヌクレオチド及び／又は配列、所望の癌抗原、並びに所望のエフェクタ細胞から生成できる。このようなペプチドアゴニスト、アンタゴニスト及びモジュレータを製造する１つの方法は、ポリペプチドの化学合成と、これに続く、天然立体配座、即ち正しいジスルフィド結合を得るために適切な酸化条件下での処理とを伴う。これは、当業者に公知の方法論を用いて達成できる（例えばKelley, R. F. et al. (1990) In: Genetic Engineering Principles and Methods, Setlow, J.K. Ed., Plenum Press, N.Y., vol. 12, pp 1‐19; Stewart, J.M et al. (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, ILを参照；米国特許第４，１０５，６０３号；米国特許第３，９７２，８５９号；米国特許第３，８４２，０６７号；及び米国特許第３，８６２，９２５号も参照）。
【0452】
本発明のポリペプチドは、固相ペプチド合成を用いて便利に調製できる（Merrifield, B. (1986) “Solid Phase Synthesis,” Science 232(4748):341‐347; Houghten, R.A. (1985) “General Method For The Rapid Solid‐Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen‐Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15): 5131‐5135; Ganesan, A. (2006) “Solid‐Phase Synthesis In The Twenty‐First Century,” Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3‐10）。
【0453】
更に別の代替例では、所望の抗ＤＲ５抗体、抗癌抗原抗体又は抗エフェクタ細胞抗体のＣＤＲのうちの１つ又は複数を有する好適な抗体を、特定のヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するよう加工された市販のマウスを用いて得ることができる。ヒト化又はヒト抗体の生成のために、より望ましい（例えば完全なヒト抗体）又はよりロバストな免疫応答を生成するよう設計された遺伝子組み換え動物も使用してよい。このような技術の例は、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．，フレモント、ＣＡ）並びにＨＵＭＡｂ‐Ｍｏｕｓｅ（登録商標）及びＴＣ ＭＯＵＳＥ（商標）（いずれもＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．，プリンストン、ＮＪ）である。
【0454】
ある代替案では、当該技術分野において公知の方法を用いて、抗体を組み換えによって作製し、発現させてよい。抗体は、まず宿主動物から作製された抗体を単離し、遺伝子配列を取得し、上記遺伝子配列を使用して宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞）内で抗体を組み換え発現させることによって作製できる。採用できる別の方法は、植物（例えばタバコ）又はトランスジェニックミルク中で抗体配列を発現させることである。植物又はミルク中で抗体を組み換え発現させるための好適な方法は、開示されている（例えばPeeters et al. (2001) "Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants," Vaccine 19:2756; Lonberg, N. et al. (1995) "Human Antibodies From Transgenic Mice," Int. Rev. Immunol 13:65-93; and Pollock et a/.(1999) "Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies," J. Immunol Methods 231 : 147-157を参照）。例えばキメラ、ヒト化、単鎖等の抗体の誘導体を作製するための好適な方法は、当該技術分野において公知である。別の代替案では、抗体はファージディスプレイ技術によって、組み換えによって作製できる（例えば米国特許第５，５６５，３３２号；米国特許第５，５８０，７１７号；米国特許第５，７３３，７４３号；米国特許第６，２６５，１５０号；及びWinter, G. et al. (1994) "Making Antibodies By Phage Display Technology," Annu. Rev. Immunol. 12.433-455を参照）。
【0455】
関心対象の抗体又はタンパク質は、エドマン分解による配列決定に供してよく、これは当業者には公知である。質量分析又はエドマン分解から生成されるペプチド情報を用いて、関心対象のタンパク質をクローニングするために使用されるプローブ又はプライマを設計できる。
【0456】
関心対象のタンパク質クローニングの代替的な方法は、１つ又は複数のＣＤＲを有する関心対象の抗体又はタンパク質を発現する細胞に関して、精製したＤＲ５及び／又は所望の癌抗原及び／又は所望のエフェクタ細胞の表面上で発現する分子（若しくはいずれのこのような分子の部分）を用いて「パンニング（ｐａｎｎｎｉｎｇ）」することにより、ＤＲ５又は上記所望の癌抗原又はエフェクタ細胞分子に結合できるようにすることによるものである。「パンニング」手順は、ＤＲ５を発現する組織又は細胞からｃＤＮＡライブラリを取得し、上記ｃＤＮＡを第２の細胞タイプにおいて過剰発現させ、上述のような分子（例えば新規の抗ＤＲ５抗体に関するパンニングの場合にはＤＲ５ ｍＡｂ １又はＤＲ５ ｍＡｂ ２等）に結合できる公知の抗体の存在又は不在下での、ＤＲ５への特異的結合に関して、第２の細胞タイプのトランスフェクト細胞をスクリーニングすることによって、実施してよい。「パンニング」による、細胞表面タンパク質に関する哺乳類遺伝子コーディングのクローニングにおいて使用される方法の詳細な説明は、従来技術中に見ることができる（例えばAruffo, A. et al. (1987) "Molecular Cloning Of A CD28 cDNA By A High-Efficiency COS Cell Expression System " Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:8573-8577 and Stephan, J. et al. (1999) "Selective Cloning Of Cell Surface Proteins Involved In Organ Development: Epithelial Glycoprotein Is Involved In Normal Epithelial Differentiation " Endocrinol. 140:5841-5854を参照）。
【0457】
関心対象のポリヌクレオチドを含有するベクターは：電気穿孔；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ‐デキストラン又は他の物質を使用したトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；及び感染（例えばベクターがワクシニアウイルス等の感染性因子である場合）を含む多数の適切な手段のうちのいずれによって、宿主細胞に導入できる。ベクター又はポリヌクレオチドの導入の選択は、宿主細胞の特徴に左右される場合が多い。
【0458】
関心対象の抗体、ポリペプチド、又はタンパク質をエンコードする遺伝子を単離する目的で、異種ＤＮＡを過剰発現できるいずれの宿主細胞を使用できる。好適な哺乳類宿主細胞の非限定的な例としては、ＣＯＳ、ＨｅＬａ及びＣＨＯ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、宿主細胞は、対応する関心対象の内因性抗体又はタンパク質（これらが宿主細胞中に存在する場合）より５倍高い、より好ましくは１０倍高い、より好ましくは２０倍高い、より好ましくは５０倍高い、より好ましくは、１００倍高いレベルのｃＤＮＡを発現する。ＤＲ５への特異的結合に関する宿主細胞のスクリーニングは好ましくは、イムノアッセイ又はＦＡＣＳによって実行される。関心対象の抗体又はタンパク質を過剰発現する細胞を識別できる。
【0459】
本発明は、本発明の抗体のアミノ酸配列を備えるポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドは、当該技術分野において公知の手順で産生できる。上記ポリペプチドは、抗体のタンパク質分解若しくは他の分解によって、上述のような組み換え法（即ち単一若しくは融合ポリペプチド）によって、又は化学的合成によって産生できる。上記抗体のポリペプチド、特にアミノ酸最高約５０個分の比較的短いポリペプチドは、化学的合成によって便利に作製される。化学的合成方法は当該技術分野において公知であり、市販されている。例えば抗ＤＲ５ポリペプチドは、固相法を採用した自動ポリペプチド合成器によって産生してよい。
【0460】
本発明は、いずれの上述のような抗体（又は上記抗体の、場合によってＤＲ５、癌抗原若しくはエフェクタ細胞に結合するいずれのポリペプチド断片）、並びに上記分子のアゴニスト、アンタゴニスト及びモジュレータ（上記分子の特性に有意な影響を及ぼさない、機能的に同等の抗体及び融合ポリペプチド、並びに活性が増強した又は低下した変異体を含む）に対する、いずれの修飾を含んでよい。ポリペプチドの修飾は、当該技術分野において慣用的に実践されており、本明細書で詳細に説明する必要はない。修飾されたポリペプチドの例としては、アミノ酸残基の保存的置換を有するポリペプチド、機能的活性を大きく劣化するように変化させない１つ若しくは複数の欠失若しくは追加、又は化学的類似体の使用が挙げられる。互いを保存的に置換できるアミノ酸残基としては：グリシン／アラニン；セリン／トレオニン；バリン／イソロイシン／ロイシン；アスパラギン／グルタミン；アスパラギン酸／グルタミン酸；リジン／アルギニン；及びフェニルアラニン／チロシンが挙げられるが、これらに限定されない。これらのポリペプチドとしては、グリコシル化及び非グリコシル化ポリペプチド、並びに例えば異なる複数の糖によるグリコシル化、アセチル化及びリン酸化といった、その他の変換後修飾を有するポリペプチドも挙げられる。好ましくは、アミノ酸置換は保存的であり、即ち置換されたアミノ酸は、オリジナルのアミノ酸と同様の化学的特性を有する。このような保存的置換は当該技術分野において公知であり、その例は上述されている。アミノ酸修飾は、１つ又は複数のアミノ酸を変化させるか又は修飾することから、可変ドメイン等の領域の完全な再設計にまで及んでよい。可変ドメインの変化は、結合親和性及び／又は特異性を変化させる。他の修飾方法としては、酵素的手段、酸化的置換及びキレート化を含むがこれらに限定されない、当該技術分野において公知の連結技術の使用が挙げられる。修飾は例えば、イムノアッセイのための標識の付与、例えばラジオイムノアッセイのための放射性部分の付与等のために使用できる。修飾されたポリペプチドは、当該技術分野において確立された手順を用いて作製され、また当該技術分野において公知の標準的なアッセイを用いてスクリーニングできる。
【0461】
本発明はまた、本発明のポリペプチドの１つ又は複数を備える融合タンパク質も包含する。一実施形態では、軽鎖、重鎖又は軽鎖及び重鎖の両方を備える、融合ポリペプチドが提供される。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、異種免疫グロブリン定常領域を含有する。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、公的に寄託されたハイブリドーマから産生された抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含有する。本発明の目的のために、抗体融合タンパク質は、（場合によって）ＤＲ５、癌抗原又はエフェクタ細胞、及びネイティブ分子内では上記抗体融合タンパク質が付着しない別のアミノ酸配列、例えば別の領域からの異種配列又は同種配列に特異的に結合する、１つ又は複数のポリペプチドドメインを含有する。
【0462】
ＶＩ．本発明の三重特異性結合分子の使用本発明の三重特異性結合分子は、癌に対する一般的な治療を提供する。このような分子で治療できる癌としては、以下の細胞：副腎腫瘍；ＡＩＤＳ関連癌；胞巣状軟部肉腫；星状細胞腫瘍；膀胱癌；骨癌；脳及び脊髄の癌；転移性脳腫瘍；乳癌；頸動脈球腫瘍；子宮頸癌；軟骨肉腫；脊索腫；嫌色素性腎細胞癌；明細胞癌；大腸癌；結腸直腸癌；皮膚の良性線維性組織球腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；ユーイング腫瘍；骨外性粘液型軟骨肉腫；骨性線維形成不全症；線維性骨異形成；胆嚢又は胆管癌；消化器癌；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；肝細胞癌；膵島細胞腫瘍；カポジ肉腫；腎癌；白血病；脂肪腫／良性脂肪腫；脂肪肉腫／悪性脂肪腫；肝癌；リンパ腫；肺癌；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；神経内分泌腫瘍；卵巣癌；膵臓癌；甲状腺乳頭癌；副甲状腺腫瘍；小児癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；前立腺癌；後部ブドウ膜黒色腫；希少な血液学的障害；腎転移性癌；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肉腫；皮膚癌；軟組織肉腫；扁平上皮癌；胃癌；滑膜肉腫；精巣癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺転移癌；及び子宮癌からなる群から選択される癌細胞の存在を特徴とする癌が挙げられる。本発明の三重特異性結合分子は、結腸直腸癌、肝細胞癌、神経膠腫、腎臓癌、乳癌、多発性骨髄腫、膀胱癌、神経芽細胞腫；肉腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、膵臓癌及び直腸癌の治療に使用できる。
【0463】
本発明の三重特異性結合分子は、標的腫瘍の細胞の特徴となる癌抗原を指向する抗体によって提供される癌治療を、上記腫瘍細胞の表面に配列されたＤＲ５分子に更に結合することによって増強する。本発明の有用性は特に、癌抗原の密度が低い状況、又は抗癌抗原抗体の結合キネティクスが、臨床的に十分な治療応答を促進するには準最適である（若しくは不十分である）場合に見られる。これらの場合において、本発明の分子の、癌抗原及び腫瘍細胞のＤＲ５の両方に結合する能力は、臨床的に十分な治療応答を促進するために十分な、（結合活性によって）増強された結合を提供する。更に、免疫系エフェクタ細胞の表面上の分子に結合できる結合ドメインも有することにより、本発明の三重特異性結合分子は、腫瘍細胞に対して上記免疫系細胞を共局在化でき、これによって、標的転換殺滅により、腫瘍細胞に対する細胞毒性応答を促進できる。
【0464】
表２に示すように、癌抗原結合ドメインの特定の組み合わせを有する本発明の三重特異性結合分子は、特定の癌の治療において好ましい有用性を有する。
【0465】
【表5】
【0466】
治療におけるその有用性に加えて、本発明の三重特異性結合分子は、検出可能な標識を付与でき、癌の診断又は腫瘍及び腫瘍細胞の撮像において使用できる。
【0467】
本発明の組成物は、医薬組成物の製造に使用できるバルク薬剤組成物（例えば不純又は非滅菌組成物）、及び単位剤形の調製に使用できる医薬組成物（即ち被験体又は患者への投与に好適な組成物）を含む。これらの組成物は、予防的又は治療的有効量の本発明の三重特異性結合分子、又はこのような作用剤と薬学的に許容可能なキャリアとの組み合わせを含む。好ましくは、本発明の組成物は、予防的又は治療的有効量の本発明の三重特異性結合分子のうちの1つ又は複数と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む。本発明は特に、三重特異性結合分子が：（１）ＤＲ５ ｍＡｂ １抗体；
（２）ＤＲ５ ｍＡｂ ２抗体；
（３）ＤＲ５ ｍＡｂ ３抗体；
（４）ＤＲ５ ｍＡｂ ４抗体；
（５）ＤＲ５ ｍＡｂ ５抗体；
（６）ＤＲ５ ｍＡｂ ６抗体；
（７）ＤＲ５ ｍＡｂ ７抗体；又は
（８）ＤＲ５ ｍＡｂ ８抗体
（又はいずれのこれらの抗体のヒト化誘導体）を有する、上記医薬組成物を包含する。
【0468】
本発明は更に、三重特異性結合分子が以下のような癌抗原ドメインを有する、上述のような医薬組成物を特に包含する：（Ａ）ＥｐｈＡ２のエピトープに結合する；特に上記三重特異性結合分子は、ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １、ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２若しくはＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３、若しくはそのヒト化若しくはキメラ変異体の癌抗原結合ドメインを有する；又は
（Ｂ）ｇｐＡ３３のエピトープに結合する；特に上記三重特異性結合分子は、ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １、若しくはそのヒト化若しくはキメラ変異体の癌抗原結合ドメインを有する；又は
（Ｃ）Ｈｅｒ２のエピトープに結合する；特に上記三重特異性結合分子は、Ｈｅｒ２ ｍＡｂ １若しくはトラスツズマブ、若しくはそのヒト化若しくはキメラ変異体の癌抗原結合ドメインを有する；又は
（Ｄ）Ｂ７‐Ｈ３のエピトープに結合する；特に上記三重特異性結合分子は、Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ １、Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２若しくはＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ３、若しくはそのヒト化若しくはキメラ変異体の癌抗原結合ドメインを有する。
【0469】
本発明は更に、上記三重特異性結合分子が、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１７、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ６４、ＢＣＲ／ＣＤ７９、Ｔ細胞受容体又はＮＫＧ２Ｄ受容体に結合するエフェクタ細胞結合ドメインを有する、上述のような医薬組成物を特に包含する。本発明は更に、上記三重特異性結合分子が、抗体：Ｌｏ‐ＣＤ２ａ、ＣＤ３ ｍＡｂ ２、ＯＫＴ３、３Ｇ８、Ａ９、ＨＤ３７、リツキシマブ、エプラツズマブ、ＣＤ３２Ｂ ｍＡｂ １、ＣＤ６４ ｍＡｂ １、ＣＤ７９ ｍＡｂ １、ＢＭＡ０３１、ＫＹＫ‐１．０、又はＫＹＫ‐２．０に結合するエフェクタ細胞結合ドメインを有する、上述のような医薬組成物を特に包含する。
【0470】
具体的には、本発明は三重特異性結合分子、上記結合分子を含む医薬組成物、及び上記三重特異性結合分子の使用を考えるものであり、ここで：（１）ＤＲ５結合ドメインは、いずれの抗ＤＲ５抗体のＤＲ５結合ドメインであり；
（２）癌結合ドメインは、本明細書で開示された癌抗原のうちのいずれであり；
（３）エフェクタ細胞結合ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１７、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ６４、ＢＣＲ／ＣＤ７９、Ｔ細胞受容体又はＮＫＧ２Ｄ受容体のうちのいずれに結合する。
【0471】
更に具体的には、本発明は三重特異性結合分子、上記結合分子を含む医薬組成物、及び上記三重特異性結合分子の使用を考えるものであり、ここで：（１）ＤＲ５結合ドメインは、いずれの抗ＤＲ５抗体のＤＲ５結合ドメインであり；
（２）癌結合ドメインは：ＥｐｈＡ１、ｇｐＡ３３、Ｈｅｒ２又はＢ７‐Ｈ３のうちのいずれであり；
（３）エフェクタ細胞結合ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１７、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ６４、ＢＣＲ／ＣＤ７９、Ｔ細胞受容体又はＮＫＧ２Ｄ受容体のうちのいずれに結合する。
【0472】
本発明は特に、各上記三重特異性結合分子、並びに上記結合分子を含む医薬組成物、及び上記三重特異性結合分子の使用を考えるものであり、ここで：（１）ＤＲ５結合ドメインは：ＤＲ５ ｍＡｂ １抗体、ＤＲ５ ｍＡｂ ２抗体、ＤＲ５ ｍＡｂ ３抗体、ＤＲ５ ｍＡｂ ４抗体、ＤＲ５ ｍＡｂ ５抗体、ＤＲ５ ｍＡｂ ６抗体、ＤＲ５ ｍＡｂ ７抗体、又はＤＲ５ ｍＡｂ ８抗体のうちのいずれのＤＲ５結合ドメインであり；
（２）癌抗原結合ドメインは：ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １、ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２、ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３、ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １、Ｈｅｒ２ ｍＡｂ １、トラスツズマブ、Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ １、Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２、又はＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ３のうちのいずれの結合ドメインであり；
（３）エフェクタ細胞結合ドメインは：Ｌｏ‐ＣＤ２ａ、ＣＤ３ ｍＡｂ ２、ＯＫＴ３、３Ｇ８、Ａ９、ＨＤ３７、リツキシマブ、エプラツズマブ、ＣＤ３２Ｂ ｍＡｂ １、ＣＤ６４ ｍＡｂ １、ＣＤ７９ ｍＡｂ １、ＢＭＡ０３１、ＫＹＫ‐１．０、又はＫＹＫ‐２．０のうちのいずれの結合ドメインである。
８個の抗ＤＲ５結合ドメイン抗体、９個の抗癌抗原結合ドメイン抗体及び１４個の抗エフェクタ細胞結合ドメイン抗体が挙げられているため、上述のような具体的考察は、これらの結合ドメインの、（８ｘ９ｘ１４＝）１００８通りの組み合わせ全てを包含する。
【0473】
本発明はまた、特定の癌抗原に対して特異的である第２の治療用抗体（例えば腫瘍特異性モノクローナル抗体）、及び薬学的に許容可能なキャリアを更に含む、上記医薬組成物も包含する。
【0474】
ある具体的実施形態では、用語「薬学的に許容可能な（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」は、動物、より詳細にはヒトにおける使用に関して、連邦規制当局若しくは州政府によって承認されている、又は米国薬局方若しくは他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。用語「キャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）」は、希釈剤、アジュバント（例えばフロイントアジュバント（完全及び不完全））、賦形剤、又は治療薬の投与に用いられるビヒクルを指す。これらの薬学的キャリアは、水及び石油、動物油、植物油若しくは合成油を含む油（例えば落花生油、大豆油、鉱物油、胡麻油等）等の、無菌液体とすることができる。医薬組成物を静脈投与する場合、水が好ましいキャリアである。特に注射用溶液のための液体キャリアとして、食塩水、並びに水性デキストロース及びグリセロール溶液も採用できる。好適な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。必要な場合は、上記組成物は、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含有することもできる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳液、錠剤、ピル、カプセル、粉体、徐放性製剤等の形態を取ることができる。
【0475】
一般に、本発明の組成物の成分は、例えば活性作用剤の量を示すアンプル又はサシェ等の気密性コンテナ中の凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として、別個に、又は単位剤形にまとめて混合された状態で供給される。組成物を点滴によって投与する場合、組成物は、滅菌された薬学的グレードの水又は食塩水を内包する点滴ボトルを用いて吐出できる。組成物を注射によって投与する場合、投与前に成分を混合できるように、注射用無菌水又は食塩水のアンプルを提供できる。
【0476】
本発明の組成物は、中性又は塩形態として処方できる。薬学的に許容可能な塩としては：塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等由来の陰イオンを有して形成されるもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２‐メチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等由来の陽イオンを有して形成されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【0477】
本発明はまた、本発明の三重特異性結合分子（及びより好ましくは、既に議論又は例示された三重特異性結合分子のうちのいずれ）で充填された１つ又は複数のコンテナを備える、医薬パック又はキットも提供する。更に、疾患の治療に有用な１つ又は複数の他の予防剤又は治療剤も、上記医薬パック又はキットに含めることができる。本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分のうちの１つ又は複数で充填された１つ又は複数のコンテナを備える、医薬パック又はキットも提供する。任意に、このような１つ又は複数のコンテナは、医薬製品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知と関連するものとすることができ、上記通知は、ヒトへの投与のための製造、使用又は販売の機関による承認を反映したものである。
【0478】
本発明は、上述の方法において使用できるキットを提供する。キットは、本発明の三重特異性結合分子のいずれを含むことができる。このキットは更に、癌の治療に有用な１つ若しくは複数の他の予防剤及び／若しくは治療剤を、１つ若しくは複数のコンテナ内に含むことができ；並びに／又はこのキットは更に、癌に関連する１つ若しくは複数の癌抗原に結合する１つ若しくは複数の細胞毒性抗体を含むことができる。特定の実施形態では、他の予防剤又は治療剤は、化学療法剤である。他の実施形態では、予防剤又は治療剤は生物学的治療剤又はホルモン療法剤である。
【0479】
ＶＩＩＩ．投与方法本発明の組成物は、有効量の本発明の融合タンパク質若しくはコンジュゲート分子又は本発明の融合タンパク質若しくはコンジュゲート分子を含む医薬組成物を被験体に投与することによる、疾患、障害又は感染症に関連する１つ又は複数の症状の治療、予防及び改善のために提供できる。好ましい態様では、上記組成物は実質的に精製される（即ち上記組成物の効果を制限する、又は望ましくない副作用を生成する物質を実質的に含まない）。ある具体的実施形態では、被験体は動物、好ましくは非霊長類（例えばウシ属、ウマ科、ネコ科、イヌ科、齧歯類等）又は霊長類（例えばカニクイザル等のサル、ヒト等）といった哺乳類である。ある好ましい実施形態では、被験体はヒトである。
【0480】
例えば抗体又は融合タンパク質を発現できるリポソーム、微粒子マイクロカプセル、組み換え細胞内へのカプセル化；受容体媒介性エンドサイトーシス（例えばWu et al. (1987) “Receptor‐Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System,” J. Biol. Chem. 262:4429‐4432を参照）；レトロウイルス又は他のベクターの一部としての核酸の構築等、様々な送達系が公知であり、本発明の組成物の投与に使用できる。
【0481】
本発明の分子を投与する方法としては：非経口投与（例えば皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下）；硬膜外；並びに粘膜（例えば鼻腔内及び経口経路）が挙げられるがこれらに限定されない。ある具体的実施形態では、本発明の三重特異性結合分子は、筋肉内、静脈内又は皮下投与される。組成物は、いずれの便利な経路によって、例えば点滴又はボーラス注射によって、上皮又は粘膜皮膚層（例えば口腔粘膜、直腸及び腸粘膜等）を通した吸収によって投与してよく、他の生物学的活性作用剤と共に投与してよい。投与は全身性又は局所性とすることができる。更に、例えば吸入器又は噴霧器の使用及びエアロゾル化剤を用いた処方により、肺投与を採用することもできる。例えば米国特許第６，０１９，９６８号；米国特許第５，９８５，３２０号；米国特許第５，９８５，３０９号；米国特許第５，９３４，２７２号；米国特許第５，８７４，０６４号；米国特許第５，８５５，９１３号；米国特許第５，２９０，５４０号；米国特許第４，８８０，０７８号；国際公開第９２／１９２４４号；国際公開第９７／３２５７２号；国際公開第９７／４４０１３号；国際公開第９８／３１３４６号；国際公開第９９／６６９０３を参照（これらはそれぞれ、参照により本出願に援用される）。
【0482】
本発明はまた、本発明の三重特異性結合分子を、この分子の量を示すアンプル又はサシェ等の気密性コンテナ内に包装することも提供する。一実施形態では、上記分子は、気密性コンテナ内の滅菌凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として供給され、例えば水又は食塩水を用いて、被験体への投与に適切な濃度へと再構成できる。好ましくは、本発明の三重特異性結合分子は、少なくとも５μｇ、より好ましくは少なくとも１０μｇ、少なくとも１５μｇ、少なくとも２５μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも１００μｇ又は少なくとも２００μｇの単位剤形で、気密性コンテナ内の滅菌凍結乾燥粉末として供給される。
【0483】
凍結乾燥された本発明の配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディは、その元々のコンテナ内において２〜８℃で保管するべきであり、またこの分子は、再構成後１２時間以内、好ましくは６時間以内、５時間以内、３時間以内又は１時間以内に投与するべきである。ある代替実施形態では、本発明の配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディは、この分子、融合タンパク質又はコンジュゲート分子の量及び濃度を示す気密性コンテナ内に、液体形態で供給される。好ましくは、本発明の配列最適化ＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディの液体形態は、少なくとも１μｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも２．５μｇ／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも５０μｇ／ｍｌ又は少なくとも１００μｇ／ｍｌの濃度でこの分子が存在する気密性コンテナ内に供給される。
【0484】
障害に関連する１つ又は複数の症状の治療、予防及び改善に効果的な本発明の組成物の量は、標準的な臨床技術によって決定できる。処方において採用するべき正確な用量は、投与経路及び状態の重篤度にも左右され、施術者の判断及び各患者の状況に従って決定するべきである。効果的な用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から得られた用量‐応答曲線から外挿できる。
【0485】
本発明が包含する三重特異性結合分子単価ダイアボディに関して、患者に投与される用量は好ましくは、レシピエント被験者の体重（ｋｇ）に基づいて決定される。投与される用量は典型的には、少なくとも約０．３ｎｇ／ｋｇ／日〜約０．９ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１ｎｇ／ｋｇ／日〜約３ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約３ｎｇ／ｋｇ／日〜約９ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１０ｎｇ／ｋｇ／日〜約３０ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約３０ｎｇ／ｋｇ／日〜約９０ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１００ｎｇ／ｋｇ／日〜約３００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約２００ｎｇ／ｋｇ／日〜約６００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約３００ｎｇ／ｋｇ／日〜約９００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約４００ｎｇ／ｋｇ／日〜約８００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約５００ｎｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約６００ｎｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約７００ｎｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約８００ｎｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約９００ｎｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｎｇ／ｋｇ／日、又は少なくとも約１，０００ｎｇ／ｋｇ／日である。
【0486】
別の実施形態では、患者は、上述のような予防的又は治療的有効量の本発明の三重特異性結合分子の１回又は複数回の用量を含む治療レジメンを投与され、この治療レジメンは、２日、３日、４日、５日、６日又は７日に亘って投与される。特定の実施形態では、治療レジメンは、予防的又は治療的有効量の本発明の三重特異性結合分子の用量を断続的に投与する（例えば所定の週の１日目、２日目、３日目及び４日目に投与し、同一の週の５日目、６日目及び７日目には、予防的又は治療的有効量の本発明が包含する三重特異性結合分子の用量を投与しない）ことを含む。
【0487】
特に包含されるのは、上で議論されたＤＲ５結合ドメイン、癌抗原結合ドメイン及びエフェクタ細胞結合ドメインの具体的な組み合わせのいずれを含む、上述のような三重特異性結合分子の、同一週の５日目、６日目及び７日目における投与である。典型的には、１、２、３、４、５つ又はそれを超える治療のコースが存在する。各コースは、同一のレジメン又は異なるレジメンであってよい。
【0488】
別の実施形態では、投与される用量は、上記三重特異性結合分子の１日の予防的又は治療的有効量に到達するまで、１つ又は複数のレジメンの最初の１／４、最初の半分又は最初の２／３若しくは３／４に亘って（例えば４コース治療の第１、第２又は第３のレジメンに亘って）漸増する。表３は、典型的な治療コースに関する、上述の異なる投薬レジメンの５つの例を提供する。
【0489】
【表6】
【0490】
本発明の三重特異性結合分子の投与の用量及び頻度は、例えば脂質化等の改質によって分子の取り込み及び組織貫通を増強することによって低減又は偏向できる。
【0491】
患者に投与される本発明の三重特異性結合分子の投薬量は、単一作用剤による治療としての使用のために計算してよい。あるいは、上記分子は他の治療用組成物と併用され、患者に投与される投薬量は、上記分子を単一作用剤による治療として使用する場合よりも小さくなる。
【0492】
本発明の医薬組成物は、治療が必要な領域に局所的に投与してよく、これは、以下に限定されるものではないが、例えば局所的点滴によって、注射によって、又はインプラントを用いて達成してよく、上記インプラントは多孔性、非多孔性又はゼラチン材料性であり、シラスティック膜等の膜又は繊維を含む。好ましくは、本発明の分子を投与する際、この分子が吸収されない材料を使用するよう注意しなければならない。
【0493】
本発明の組成物は、小嚢、特にリポソーム中で送達できる（Langer (1990) “New Methods Of Drug Delivery,” Science249:1527-1533); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp.353-365(1989); Lopez-Berestein,同上、pp.317-327参照）。
【0494】
本発明の組成物は、放出制御系又は徐放系中で送達できる。１つ又は複数の本発明の三重特異性結合分子を含む徐放性処方を製造するために、当業者に公知のいずれの技術を使用できる。例えば：米国特許第４，５２６，９３８号；国際公開第９１／０５５４８号；国際公開第９６／２０６９８号；Ning et al.(1996) “Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel,” Radiotherapy & Oncology39:179-189;Song et al.(1995) “Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions,” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397;Cleek et al.(1997) “Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,” Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854;及びLam et al. (1997) “Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery,” Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760を参照（これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される）。一実施形態では、放出制御系においてポンプを使用してよい（Langer, supra; Sefton,(1987)“Implantable Pumps,” CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240;Buchwald et al.(1980)“Long-Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis,” Surgery 88:507-516;及びSaudek et al.(1989)“A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery,” N. Engl. J. Med.321:574-579参照）。別の実施形態では、分子の放出制御を達成するためにポリマー材料を使用できる（例えばMedical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984);Levy et al.(1985)“Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate,” Science228:190-192;During et al.(1989)“Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: In Vivo Characterization,” Ann. Neurol. 25:351-356;Howard et al.(1989)“Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits,” J. Neurosurg. 7(1):105-112)；米国特許第５，６７９，３７７号；米国特許第５，９１６，５９７号；米国特許第５，９１２，０１５号；米国特許第５，９８９，４６３号；米国特許第５，１２８，３２６号；国際公開第９９／１５１５４号；及び国際公開第９９／２０２５３号参照）。徐放性処方において使用されるポリマーの例としては、ポリ（2‐ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン‐コ‐酢酸ビニル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物類、ポリ（Ｎ‐ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド類（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド‐コ‐グリコリド）類（ＰＬＧＡ）及びポリオルトエステル類が挙げられるが、これらに限定されない。放出制御系は、治療標的（例えば肺）の近傍に配置でき、従って全身用量の一部しか必要としない（例えばGoodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol.2, pp.115-138(1984)参照）。放出制御インプラントとして有用なポリマー組成物は、Dunn et al.に従って使用できる（米国特許第５，９４５，１５５号参照）。この特定の方法は、ポリマー系からの生物活性材料のインサイチュ放出制御の治療効果に基づく。埋入は一般に、治療的処置を必要とする患者の身体内のいずれの部位において実施できる。非ポリマー徐放系を使用でき、この場合、被験体の身体内の非ポリマーインプラントを、薬剤送達系として使用する。身体内への埋入後、インプラントの有機溶媒が組成物から周辺の組織液中へと放散、分散又は浸出し、非ポリマー材料は徐々に凝集又は沈殿して、固体の微小細孔性マトリクスを形成する（米国特許第５，８８８，５３３号参照）。
【0495】
放出制御系については、Langer(1990,“New Methods Of Drug Delivery,” Science249:1527-1533)による報告中で議論されている。１つ又は複数の本発明の治療剤を含む徐放性処方を製造するために、当業者に公知のいずれの技術を使用できる。例えば：米国特許第４，５２６，９３８号；国際公開第９１／０５５４８号及び第９６／２０６９８号；Ning et al.(1996)“Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel,” Radiotherapy & Oncology39:179-189;Song et al.(1995)“Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions,” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology50:372-397;Cleek et al.(1997)“Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,” Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854;並びにLam et al.(1997)“Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery,” Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760参照（これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【0496】
本発明の組成物が、本発明の三重特異性結合分子をエンコードする核酸である場合、この核酸は、この核酸がエンコードする三重特異性結合分子の発現を促進するために、この核酸を適切な核酸発現ベクターの一部として構築して、例えばレトロウイルスベクターの使用によって（米国特許第４，９８０，２８６号参照）、又は直接注射によって、又は微粒子衝撃（例えば遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用によって、又は脂質若しくは細胞表面受容体若しくは遺伝子導入剤を用いてコーティングすることによって、又は細胞核に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドと連鎖させて上記核酸を投与すること（例えばJoliot et al.(1991)“Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis,” Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.)88:1864-1868を参照）等によって、上記核酸を投与することにより、インビボ投与できる。あるいは核酸を細胞内に導入して、相同遺伝子組み換えによる発現のためのホスト細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる。
【0497】
治療的又は予防的有効量の本発明の三重特異性結合分子を用いた被験体の治療は、単回治療を含むことができ、又は好ましくは一連の複数回の治療を含むことができる。ある好ましい例では、被験体は、上述のようなダイアボディを用いて、約１〜１０週間、好ましくは２〜８週間、より好ましくは約３〜７週間、更に好ましくは約４、５又は６週間に亘って週１回処置される。本発明の医薬組成物は、１日１回、１日２回又は１日３回投与できる。あるいはこの医薬組成物は、１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回、１ヶ月に１回、６週間に１回、２ヶ月に１回、１年に２回又は１年に１回投与できる。治療に使用される上記分子の有効な用量設定は、特定の治療の期間に亘って増減させてよいことも理解されるだろう。
【実施例】
【0498】
ここまで本発明を概説してきたが、以下の実施例を参照することにより、本発明は更に容易に理解されるだろう。これらの実施例は例示として提供されており、そうでないことが明記されていない限り本発明を制限することを意図したものではない。本開示の範囲から逸脱することなく、材料及び方法の両方に対して多数の修正を実施できることは、当業者には明らかであろう。
【0499】
Ｗ．実施例１：抗ヒトＤＲ５モノクローナル抗体ＤＲ５ ｍＡｂ １及びＤＲ５ ｍＡｂ ２の特性決定ヒトＤＲ５に免疫特異的に結合できるものとして２つのモノクローナル抗体を単離し、呼称「ＤＲ５ ｍＡｂ １」及び「ＤＲ５ ｍＡｂ ２」を与えた。上述のように、これらの抗体のＣＤＲは異なっていることが分かった。抗体が異なるＤＲ５エピトープに結合するかどうかを決定するために、ヒトＤＲ５‐Ｆｃ融合タンパク質を調製し、不動化された表面にコーティングした。ＤＲ５ ｍＡｂ １（１μｇ／ｍＬ）をビオチン化し、対照ＩｇＧ又はＤＲ５ ｍＡｂ ２（１０μｇ／ｍＬ）を用いてインキュベートし、ＩｇＧ又はＤＲ５ ｍＡｂ ２抗体の、（ヒトＤＲ５‐Ｆｃ融合タンパク質との）結合に関してＤＲ５ ｍＡｂ １と競合する能力を、不動化されたビオチン化抗体の量を測定することによって評価した。更に、ＩｇＧ又はＤＲ５ ｍＡｂ １抗体の、結合に関してビオチン化ＤＲ５ ｍＡｂ ２と競合する能力を評価した。この実験の結果を表４に示す。
【0500】
【表7】
【0501】
この実験の結果は、過剰量の非ビオチン化抗体が存在する場合であっても、ビオチン化抗体がＤＲ５タンパク質に結合できることを示す。従ってこの結果は、ＤＲ５ ｍＡｂ １及びＤＲ５ ｍＡｂ ２がＤＲ５の異なるエピトープに結合することを示す。
【0502】
ＤＲ５ ｍＡｂ １及びＤＲ ｍＡｂ ２抗体の更なる特性決定のために、ＤＲ５ ｍＡｂ １及びＤＲ ｍＡｂ ２抗体の、ＤＲ５とＴＲＡＩＬリガンドとの間の結合をブロックする能力を評価した。従って、ビオチン化ＤＲ５ ｍＡｂ １、ビオチン化ＤＲ５ ｍＡｂ ２又はビオチン化ＤＲ５‐Ｆｃ融合タンパク質（それぞれ２μｇ／ｍＬ）を、緩衝液又はヒスチジンタグ付与ＴＲＡＩＬ（２０μｇ／ｍＬ）の存在下で、不動化されたＤＲ５‐Ｆｃ融合タンパク質（１μｇ／ｍＬ）を用いて別個にインキュベートした。不動化されたビオチン化抗体の量を評価した。この実験の結果を表５に示す。
【0503】
【表8】
【0504】
その結果は、不動化されたＤＲ５‐Ｆｃに結合するＤＲ５ ｍＡｂ １又はＤＲ５ ｍＡｂ ２の量が、ヒスチジンタグ付与ＴＲＡＩＬの存在によって影響されないことを示し、従ってＤＲ５ ｍＡｂ １及びＤＲ５ ｍＡｂ ２のいずれも、ＤＲ５のＴＲＡＩＬリガンド結合部位をブロックしないことを示す。更に、いずれの抗体も、ヒスチジンタグ付与ＴＲＡＩＬリガンドに結合できなかった。
【0505】
Ｘ．実施例２：抗ヒトＤＲ５モノクローナル抗体ＤＲ５ ｍＡｂ １及びＤＲ５ ｍＡｂ ２の種特異性抗ヒトＤＲ５モノクローナル抗体ＤＲ５ ｍＡｂ １及びＤＲ５ ｍＡｂ ２の種特異性を評価するために、上記抗体の、ヒトＤＲ５に結合する能力を、上記抗体の、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＲ５に結合する能力と比較した。この実験の結果を表６に示す。その結果は、これらの抗体がいずれもカニクイザルＤＲ５に結合できるものの、それぞれヒトＤＲ５に対してより高い結合親和性を示すことを示す。
【0506】
図７に示すように、Ｂｉａｃｏｒｅ分析を用いて結合キネティクスを調査した。二重特異性ＤＲ５ｘＣＤ３ダイアボディを、Ｈｉｓ‐タグ付与ＤＲ５を用いてインキュベートし、Ｂｉａｃｏｒｅ分析によって結合キネティクスを決定した。採用したダイアボディは、ＤＲ５ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２（図７、パネルＡ及びＥ）、ＤＲ５ ｍＡｂ ２ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２（図７、パネルＢ及びＦ）、ＤＲ５ ｍＡｂ ３ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２（図７、パネルＣ及びＧ）、並びにＤＲ５ ｍＡｂ ４ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２（図７、パネルＤ及びＨ）であった。図７、パネルＡ〜Ｄは、ヒトＤＲ５に関する結果を示す。図７、パネルＥ〜Ｈは、カニクイザルＤＲ５に関する結果を示す。算出されたｋａ、ｋｄ及びＫＤを表６に示す。
【0507】
【表9】
【0508】
その結果は、ＤＲ５ ｍＡｂ １及びＤＲ５ ｍＡｂ ２が、基準抗体ＤＲ５ ｍＡｂ ３及びＤＲ５ ｍＡｂ ４に対して変化した結合キネティクスを示すことを実証している。
【0509】
Ｙ．実施例３：ＤＲ５ ｍＡｂ １及びＤＲ５ ｍＡｂ ２の予想外の優越性本発明ＤＲ５結合分子ＤＲ５ ｍＡｂ １及びＤＲ５ ｍＡｂ ２の、細胞毒性を仲介する能力を、基準抗ＤＲ５抗体：ＤＲ５ ｍＡｂ ３及びＤＲ５ ｍＡｂ ４の能力と比較した。このような比較を実施するために、これらの抗体のＶＬ及びＶＨドメイン並びにＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＬ及びＶＨドメインを含有する二重特異性ＤＲ５ｘＣＤ３ダイアボディを調製した。調製したダイアボディは：ＤＲ５ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２；ＤＲ５ ｍＡｂ ２ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２；ＤＲ５ ｍＡｂ ３ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２；及びＤＲ５ ｍＡｂ ４ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２であった。
【0510】
抗フルオレセイン抗体４‐４‐２０のＶＬ及びＶＨドメイン（それぞれ配列番号１３８及び１３９）並びにＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＬ及びＶＨドメイン（それぞれ配列番号１０２及び１０８）を含有する、採用した対照ダイアボディは、抗フルオレセインｘ抗ＣＤ３対照ダイアボディ「４‐４‐２０ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２」と称した。上記ダイアボディは、２つのポリペプチド鎖からなっていた。上記ダイアボディの第１のポリペプチド鎖は、アミノ酸配列（配列番号３００）（ＣＤＲは下線を付して示す）：DVVMTQTPFS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSNGNTYLRW YLQKPGQSPK
VLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP
WTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFN
TYAMNWVRQA PGKGLEWVAR IRSKYNNYAT YYADSVKDRF TISRDDSKNS
LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSSGGCGG
GEVAALEKEV AALEKEVAAL EKEVAALEK
を有した。
【0511】
配列番号３００では、アミノ酸残基１〜１１２は、抗フルオレセイン抗体４‐４‐２０のＶＬドメイン（配列番号１３８）に対応し、残基１１３〜１２０は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１２１〜２４５は、ＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＨドメイン（配列番号１０８）に対応し、残基２４６〜２５１は、システイン含有スペーサペプチド（GGCGGG）（配列番号３４）であり、残基２５２〜２８０は、Ｅコイルドメイン（配列番号３９）に対応する。
【0512】
上記ダイアボディの第２のポリペプチド鎖は、アミノ酸配列（配列番号３０１）（ＣＤＲは下線を付して示す）：QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG GGGSGGGGEV KLDETGGGLV QPGRPMKLSC VASGFTFSDY
WMNWVRQSPE KGLEWVAQIR NKPYNYETYY SDSVKGRFTI SRDDSKSSVY
LQMNNLRVED MGIYYCTGSY YGMDYWGQGT SVTVSSGGCG GGKVAALKEK
VAALKEKVAA LKEKVAALKE
を有した。
【0513】
配列番号３０１では、アミノ酸残基１〜１１０は、ＣＤ３ ｍＡｂ ２のＶＬドメイン（配列番号１０４）に対応し、残基１１１〜１１８は、GGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１９〜２３６は、抗フルオレセイン抗体４‐４‐２０のＶＨドメイン（配列番号１３９）に対応し、残基２３７〜２４２は、システイン含有スペーサペプチド（GGCGGG）（配列番号３４）であり、残基２４３〜２７０は、Ｋコイルドメイン（配列番号４０）に対応する。
【0514】
標的腫瘍細胞を、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びＡ５４９ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞の存在下で、エフェクタ：標的細胞の比率２０：１において、これらのダイアボディのうちの一方を用いて、又は対照ダイアボディ（４‐４‐２０ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２）を用いて２４時間インキュベートした。損傷した細胞による、媒体への乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を測定することにより、パーセント細胞毒性を決定した。
【0515】
この調査の結果を図８に示す。ＳＫＭＥＳヒト肺癌細胞、ＤＵ１４５ヒト前立腺癌細胞、Ａ３７５ヒト悪性黒色腫細胞、ＳＫＢＲ３ヒトＨＥＲ２過剰発現乳癌細胞、及びＪＩＭＴヒト乳癌細胞を用いて、同様の結果が得られた。この結果は、ＤＲ５ ｍＡｂ １及びＤＲ５ ｍＡｂ ２のＶＬ及びＶＨドメインが、細胞毒性の誘発において、基準ＤＲ５ ｍＡｂよりも予想外に強力であることを示す。
【0516】
Ｚ．実施例４：三重特異性結合分子は、標的細胞への協調的かつ同時の結合を仲介する本発明の三重特異性結合分子の、標的細胞に結合する能力を調査した。採用した三重特異性結合分子は：ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １；ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘｇｐＡ３３ ｍＡｂ １；及びｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １であった。図９Ａに示すように、ＥｐｈＡ２癌抗原結合ドメインを備える三重特異性結合分子は、ＥｐｈＡ２発現ＣＨＯ標的細胞に結合できることが分かった。図９Ｂに示すように、ＤＲ５癌抗原結合ドメインを備える三重特異性結合分子は、ＤＲ５発現ＣＨＯ標的細胞に結合できることが分かった。図９Ｃに示すように、ＥｐｈＡ２癌抗原結合又はＤＲ５癌結合ドメインを備える三重特異性結合分子は、ＤＵ１４５細胞に結合できることが分かった。ＤＵ１４５細胞は、ＥｐｈＡ２及びＤＲ５の両方を発現するもののｇｐＡ３３を発現しない、ヒト前立腺細胞株である。上述の基準ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ダイアボディを対照として使用した。
【0517】
重要なことに、データは、本発明の三重特異性結合分子のこれら２つの癌抗原結合ドメインがいずれも標的細胞に結合できる場合、このような二重の結合が、標的結合の相乗的（例えば５〜２５倍の）増強に関連することを示している。
【0518】
ＡＡ．実施例５：三重特異性結合分子は、結合した標的細胞の細胞毒性を仲介する本発明の三重特異性結合分子の、細胞毒性リンパ球の存在下において、結合した標的細胞の細胞毒性を仲介する能力を調査した。採用した三重特異性分子は：ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １；ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘｇｐＡ３３ ｍＡｂ １；及びｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １であった。上述の基準ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ダイアボディ及び４‐４‐２０ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ダイアボディを対照として使用した。
【0519】
図１０Ａに示すように、ＥｐｈＡ２癌抗原結合ドメインを備える、従ってＥｐｈＡ２発現ＣＨＯ細胞に結合できる三重特異性結合分子は、細胞毒性リンパ球の存在下において、上記細胞の細胞毒性を仲介できた。図１０Ｂに示すように、ＤＲ５癌抗原結合ドメインを備える、従ってＤＲ５発現ＣＨＯ細胞に結合できた三重特異性結合分子は、細胞毒性リンパ球の存在下において、ＤＲ５発現ＣＨＯ標的細胞の細胞毒性を仲介できることが分かった。
【0520】
図１０Ｃに示すように、ＥｐｈＡ２癌抗原結合又はＤＲ５癌結合ドメインを備える、従ってＤＵ１４５細胞に結合できる三重特異性結合分子は、細胞毒性リンパ球の存在下において、上記細胞の細胞毒性を仲介できた。重要なことに、データは、本発明の三重特異性結合分子のこれら２つの癌抗原結合ドメインがいずれも標的細胞に結合できる場合、このような二重の結合が、標的結合の相乗的増強に関連することを示している。従って、ＥｐｈＡ２及びＤＲ５の両方に結合できるＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １は、（このような分子はｇｐＡ３３を有しないため）ＤＵ１４６細胞のＥｐｈＡ２又はＤＲ５分子にしか結合できないＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘｇｐＡ３３ ｍＡｂ １又はｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １よりも、大幅に高い細胞毒性を仲介した。
【0521】
これに関して、ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １の概ねＥＣ５０において、ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘｇｐＡ３３ ｍＡｂ １又はｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １に関して、細胞毒性リンパ球応答は見られない。ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １の概ねＥＣ９０において、ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘｇｐＡ３３ ｍＡｂ １はＥＣ１５しか示さず、またｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １は細胞毒性リンパ球応答を全く示さない。
【0522】
本明細書において言及されている全ての公刊物及び特許は、個々の公刊物又は特許出願それぞれの全体が参照により本明細書に援用されていることが具体的かつ独立に指示されている場合と同程度に、参照により本明細書に援用されている。本発明をその具体的実施形態に関して説明したが、更なる修正形態が可能であり、本出願は、本発明が属する分野の公知の方法又は慣例の範囲内であるような、及びこれまでに挙げた必須の特徴に適用できるような、本開示からの逸脱を含む、本発明の原理に概ね従う本発明のいずれの変形、使用又は改変を包含することを意図していることを理解されたい。
【配列表フリーテキスト】
【0523】
配列表の数字見出し＜２２３＞の記載は以下のとおりである。配列番号１：ヒト野生型ＩｇＧＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン
配列番号２：ヒトＤＲ５前駆体（ＮＣＢＩ配列ＮＰ＿００３８３３．４）
配列番号３：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（「ＤＲ５ ｍＡｂ １」）の軽鎖可変ドメイン
配列番号４：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（「ＤＲ５ ｍＡｂ １」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ１
配列番号５：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（「ＤＲ５ ｍＡｂ １」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ２
配列番号６：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（「ＤＲ５ ｍＡｂ １」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ３
配列番号７：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（「ＤＲ５ ｍＡｂ １））の軽鎖可変ドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号８：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（「ＤＲ５ ｍＡｂ １」）の重鎖可変ドメイン
配列番号９：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（「ＤＲ５ ｍＡｂ １」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ１
配列番号１０：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（「ＤＲ５ ｍＡｂ １」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ２
配列番号１１：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（「ＤＲ５ ｍＡｂ １」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ３
配列番号１２：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（「ＤＲ５ ｍＡｂ １」）の重鎖可変ドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１３：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（「ＤＲ５ ｍＡｂ ２」）の軽鎖可変ドメイン
配列番号１４：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（「ＤＲ５ ｍＡｂ ２」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ１
配列番号１５：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（「ＤＲ５ ｍＡｂ ２」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ２
配列番号１６：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（「ＤＲ５ ｍＡｂ ２」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ３
配列番号１７：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（「ＤＲ５ ｍＡｂ ２」）の軽鎖可変ドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１８：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（「ＤＲ５ ｍＡｂ ２」）の重鎖可変ドメイン
配列番号１９：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（「ＤＲ５ ｍＡｂ ２」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ１
配列番号２０：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（「ＤＲ５ ｍＡｂ ２」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ２
配列番号２１：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（「ＤＲ５ ｍＡｂ ２」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ３
配列番号２２：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（「ＤＲ５ ｍＡｂ ２」）の重鎖可変ドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２３：ヒト化抗ヒトＤＲ５抗体（「ｈＤＲ５ ｍＡｂ ２ ＶＬ‐２」）の軽鎖可変ドメイン
配列番号２４：ヒト化抗ヒトＤＲ５抗体（「ｈＤＲ５ ｍＡｂ ２ ＶＬ‐２」）の軽鎖可変ドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２５：ヒト化抗ヒトＤＲ５抗体（「ｈＤＲ５ ｍＡｂ ２ ＶＬ‐３」）の軽鎖可変ドメイン
配列番号２６：ヒト化抗ヒトＤＲ５抗体（「ｈＤＲ５ ｍＡｂ ２ ＶＬ‐３」）の軽鎖可変ドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２７：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（「ＤＲ５ ｍＡｂ ４」）の軽鎖可変ドメイン
配列番号２８：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（「ＤＲ５ ｍＡｂ ４」）の軽鎖可変ドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２９：ヒト化抗ヒトＤＲ５抗体（「ｈＤＲ５ ｍＡｂ ２ ＶＬ‐５」）の軽鎖可変ドメイン
配列番号３０：ヒト化抗ヒトＤＲ５抗体（「ｈＤＲ５ ｍＡｂ ２ ＶＬ‐５」）の軽鎖可変ドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号３１：ヒト化抗ヒトＤＲ５抗体（「ｈＤＲ５ ｍＡｂ ２ ＶＨ‐２」）の重鎖可変ドメイン
配列番号３２：ヒト化抗ヒトＤＲ５抗体（「ｈＤＲ５ ｍＡｂ ２ ＶＨ‐２」）の重鎖可変ドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号３３：リンカー１
配列番号３４：システイン含有スペーサペプチド（「リンカー２」）
配列番号３５：ヒトＩｇＧのヒンジドメインのシステイン含有ペプチド変異体
配列番号３６：ヒトＩｇＧのヒンジドメインのシステイン含有ペプチド変異体
配列番号３７：ヒトＩｇＧのＣＬドメインのシステイン含有ペプチド変異体
配列番号３８：ヒトＩｇＧのＣＬドメインのシステイン含有ペプチド変異体
配列番号３９：ヘテロ二量体促進「Ｅコイル」ドメイン
配列番号４０：ヘテロ二量体促進「Ｋコイル」ドメイン
配列番号４１：システイン含有ヘテロ二量体促進「Ｅコイル」ドメイン
配列番号４２：システイン含有ヘテロ二量体促進「Ｋコイル」ドメイン
配列番号４３：連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）
配列番号４４：連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）の脱免疫化変異体
配列番号４５：連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）の脱免疫化変異体
配列番号４６：ペプチドリンカー（「リンカー３」）
配列番号４７：ペプチドリンカー
配列番号４８：ペプチドリンカー
配列番号４９：ペプチドリンカー
配列番号５０：ペプチドリンカー
配列番号５１：ペプチドリンカー
配列番号５２：「ノブ担持」変異型ヒトＩｇＧ Ｆｃドメイン
配列番号５３：「ホール担持」変異型ヒトＩｇＧ Ｆｃドメイン
配列番号５４：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（ドロジツマブ；「ＤＲ５ ｍＡｂ ３」）の軽鎖可変ドメイン
配列番号５５：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（ドロジツマブ；「ＤＲ５ ｍＡｂ ３」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ１
配列番号５６：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（ドロジツマブ；「ＤＲ５ ｍＡｂ ３」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ２
配列番号５７：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（ドロジツマブ；「ＤＲ５ ｍＡｂ ３」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ３
配列番号５８：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（ドロジツマブ；「ＤＲ５ ｍＡｂ ３」）の重鎖可変ドメイン
配列番号５９：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（ドロジツマブ；「ＤＲ５ ｍＡｂ ３」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ１
配列番号６０：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（ドロジツマブ；「ＤＲ５ ｍＡｂ ３」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ２
配列番号６１：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（ドロジツマブ；「ＤＲ５ ｍＡｂ ３」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ３
配列番号６２：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（コナツムマブ；「ＤＲ５ ｍＡｂ ４」）の軽鎖可変ドメイン
配列番号６３：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（コナツムマブ；「ＤＲ５ ｍＡｂ ４」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ１
配列番号６４：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（コナツムマブ；「ＤＲ５ ｍＡｂ ４」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ２
配列番号６５：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（コナツムマブ；「ＤＲ５ ｍＡｂ ４」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ３
配列番号６６：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（コナツムマブ；「ＤＲ５ ｍＡｂ ４」）の重鎖可変ドメイン
配列番号６７：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（コナツムマブ；「ＤＲ５ ｍＡｂ ４」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ１
配列番号６８：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（コナツムマブ；「ＤＲ５ ｍＡｂ ４」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ２
配列番号６９：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（コナツムマブ；「ＤＲ５ ｍＡｂ ４」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ３
配列番号７０：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（チガツズマブ；「ＤＲ５ ｍＡｂ ５」）の軽鎖可変ドメイン
配列番号７１：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（チガツズマブ；「ＤＲ５ ｍＡｂ ５」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ１
配列番号７２：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（チガツズマブ；「ＤＲ５ ｍＡｂ ５」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ２
配列番号７３：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（チガツズマブ；「ＤＲ５ ｍＡｂ ５」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ３
配列番号７４：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（チガツズマブ；「ＤＲ５ ｍＡｂ ５」）の重鎖可変ドメイン
配列番号７５：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（チガツズマブ；「ＤＲ５ ｍＡｂ ５」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ１
配列番号７６：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（チガツズマブ；「ＤＲ５ ｍＡｂ ５」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ２
配列番号７７：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（チガツズマブ；「ＤＲ５ ｍＡｂ ５」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ３
配列番号７８：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（ＬＢＹ１３５‐１；「ＤＲ５ ｍＡｂ ６」）の軽鎖可変ドメイン
配列番号７９：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（ＬＢＹ１３５‐１；「ＤＲ５ ｍＡｂ ６」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ１
配列番号８０：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（ＬＢＹ１３５‐１；「ＤＲ５ ｍＡｂ ６」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ２
配列番号８１：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（ＬＢＹ１３５‐１；「ＤＲ５ ｍＡｂ ６」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ３
配列番号８２：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（ＬＢＹ１３５‐１；「ＤＲ５ ｍＡｂ ６」）の重鎖可変ドメイン
配列番号８３：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（ＬＢＹ１３５‐１；「ＤＲ５ ｍＡｂ ６」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ１
配列番号８４：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（ＬＢＹ１３５‐１；「ＤＲ５ ｍＡｂ ６」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ２
配列番号８５：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（ＬＢＹ１３５‐１；「ＤＲ５ ｍＡｂ ６」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ３
配列番号８６：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（ＬＢＹ１３５‐２；「ＤＲ５ ｍＡｂ ７」）の軽鎖可変ドメイン
配列番号８７：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（ＬＢＹ１３５‐２；「ＤＲ５ ｍＡｂ ７」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ１
配列番号８８：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（ＬＢＹ１３５‐２；「ＤＲ５ ｍＡｂ ７」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ２
配列番号８９：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（ＬＢＹ１３５‐２；「ＤＲ５ ｍＡｂ ７」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ３
配列番号９０：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（ＬＢＹ１３５‐２；「ＤＲ５ ｍＡｂ ７」）の重鎖可変ドメイン
配列番号９１：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（ＬＢＹ１３５‐２；「ＤＲ５ ｍＡｂ ７」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ１
配列番号９２：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（ＬＢＹ１３５‐２；「ＤＲ５ ｍＡｂ ７」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ２
配列番号９３：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（ＬＢＹ１３５‐２；「ＤＲ５ ｍＡｂ ７」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ３
配列番号９４：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（ＫＭＴＲ２；「ＤＲ５ ｍＡｂ ８」）の軽鎖可変ドメイン
配列番号９５：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（ＫＭＴＲ２；「ＤＲ５ ｍＡｂ ８」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ１
配列番号９６：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（ＫＭＴＲ２；「ＤＲ５ ｍＡｂ ８」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ２
配列番号９７：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（ＫＭＴＲ２；「ＤＲ５ ｍＡｂ ８」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ３
配列番号９８：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（ＫＭＴＲ２；「ＤＲ５ ｍＡｂ ８」）の重鎖可変ドメイン
配列番号９９：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（ＫＭＴＲ２；「ＤＲ５ ｍＡｂ ８」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ１
配列番号１００：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（ＫＭＴＲ２；「ＤＲ５ ｍＡｂ ８」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ２
配列番号１０１：マウス抗ヒトＤＲ５抗体（ＫＭＴＲ２；「ＤＲ５ ｍＡｂ ８」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ３
配列番号１０２：マウス抗ヒトＣＤ２抗体（Ｌｏ‐ＣＤ２Ａ ｍＡｂ）の軽鎖可変ドメイン
配列番号１０３：マウス抗ヒトＣＤ２抗体（Ｌｏ‐ＣＤ２Ａ ｍＡｂ）の重鎖可変ドメイン
配列番号１０４：マウス抗ヒトＣＤ３抗体（「ＣＤ３ ｍＡｂ ２」）の軽鎖可変ドメイン
配列番号１０５：マウス抗ヒトＣＤ３抗体（「ＣＤ３ ｍＡｂ ２」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ１
配列番号１０６：マウス抗ヒトＣＤ３抗体（「ＣＤ３ ｍＡｂ ２」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ２
配列番号１０７：マウス抗ヒトＣＤ３抗体（「ＣＤ３ ｍＡｂ ２」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ３
配列番号１０８：マウス抗ヒトＣＤ３抗体（「ＣＤ３ ｍＡｂ ２」）の重鎖可変ドメイン
配列番号１０９：マウス抗ヒトＣＤ３抗体（「ＣＤ３ ｍＡｂ ２」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ１
配列番号１１０：マウス抗ヒトＣＤ３抗体（「ＣＤ３ ｍＡｂ ２」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ２
配列番号１１１：マウス抗ヒトＣＤ３抗体（「ＣＤ３ ｍＡｂ ２」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ３
配列番号１１２：Ｄ６５Ｇ（Ｋａｂａｔ番号付与；配列番号１０８の配列中のＤ６８Ｇ）を含むマウス抗ヒトＣＤ３抗体（「ＣＤ３ ｍＡｂ ２」）の変異型重鎖可変ドメイン
配列番号１１３：Ｄ６５Ｇ（Ｋａｂａｔ番号付与；配列番号１０８の配列中のＤ６８Ｇ）を含むマウス抗ヒトＣＤ３抗体（「ＣＤ３ ｍＡｂ ２」）の変異型重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ２
配列番号１１４：マウス抗ヒトＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）の軽鎖可変ドメイン
配列番号１１５：マウス抗ヒトＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）の重鎖可変ドメイン
配列番号１１６：マウス抗ヒトＣＤ１６抗体（３Ｇ８）の軽鎖可変ドメイン
配列番号１１７：マウス抗ヒトＣＤ１６抗体（３Ｇ８）の重鎖可変ドメイン
配列番号１１８：マウス抗ヒトＣＤ１６抗体（Ａ９）の軽鎖可変ドメイン
配列番号１１９：マウス抗ヒトＣＤ１６抗体（Ａ９）の重鎖可変ドメイン
配列番号１２０：マウス抗ヒトＣＤ１９抗体（ＨＤ３７）の軽鎖可変ドメイン
配列番号１２１：マウス抗ヒトＣＤ１９抗体（ＨＤ３７）の重鎖可変ドメイン
配列番号１２２：キメラ抗ヒトＣＤ２０抗体（リツキシマブ）の軽鎖可変ドメイン
配列番号１２３：キメラ抗ヒトＣＤ２０抗体（リツキシマブ）の重鎖可変ドメイン
配列番号１２４：マウス抗ヒトＣＤ２２抗体（エプラツズマブ）の軽鎖可変ドメイン
配列番号１２５：マウス抗ヒトＣＤ２２抗体（エプラツズマブ）の重鎖可変ドメイン
配列番号１２６：マウス抗ヒトＣＤ３２Ｂ抗体（「ＣＤ３２Ｂ ｍＡｂ １」）の軽鎖可変ドメイン
配列番号１２７：マウス抗ヒトＣＤ３２Ｂ抗体（「ＣＤ３２Ｂ ｍＡｂ １」）の重鎖可変ドメイン
配列番号１２８：マウス抗ヒトＣＤ６４抗体（「ＣＤ６４ ｍＡｂ １」）の軽鎖可変ドメイン
配列番号１２９：マウス抗ヒトＣＤ６４抗体（「ＣＤ６４ ｍＡｂ １」）の重鎖可変ドメイン
配列番号１３０：マウス抗ヒトＣＤ７９抗体（「ＣＤ７９ ｍＡｂ １」）の軽鎖可変ドメイン
配列番号１３１：マウス抗ヒトＣＤ７９抗体（「ＣＤ７９ ｍＡｂ １」）の重鎖可変ドメイン
配列番号１３２：マウス抗ヒトＴＣＲ抗体（ＢＭＡ０３１）の軽鎖可変ドメイン
配列番号１３３：マウス抗ヒトＴＣＲ抗体（ＢＭＡ０３１）の重鎖可変ドメイン
配列番号１３４：マウス抗ヒトＮＫＧ２Ｄ抗体（ＫＹＫ‐１．０）の軽鎖可変ドメイン
配列番号１３５：マウス抗ヒトＮＫＧ２Ｄ抗体（ＫＹＫ‐１．０）の重鎖可変ドメイン
配列番号１３６：マウス抗ヒトＮＫＧ２Ｄ抗体（ＫＹＫ‐２．０）の軽鎖可変ドメイン
配列番号１３７：マウス抗ヒトＮＫＧ２Ｄ抗体（ＫＹＫ‐２．０）の重鎖可変ドメイン
配列番号１３８：マウス抗フルオレセイン抗体４‐４‐２０の軽鎖可変ドメイン
配列番号１３９：マウス抗フルオレセイン抗体４‐４‐２０の重鎖可変ドメイン
配列番号１４０：「ＤＲ５ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２」ダイアボディの第１のポリペプチド鎖
配列番号１４１：「ＤＲ５ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２」ダイアボディの第１のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１４２：「ＤＲ５ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２」ダイアボディの第２のポリペプチド鎖
配列番号１４３：「ＤＲ５ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２」ダイアボディの第２のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１４４：「ＤＲ５ ｍＡｂ ２ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２」ダイアボディの第１のポリペプチド鎖
配列番号１４５：「ＤＲ５ ｍＡｂ ２ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２」ダイアボディの第１のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１４６：「ＤＲ５ ｍＡｂ ２ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２」ダイアボディの第２のポリペプチド鎖
配列番号１４７：「ＤＲ５ ｍＡｂ ２ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２」ダイアボディの第２のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１４８：「ＤＲ５ ｍＡｂ ３ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２」ダイアボディの第１のポリペプチド鎖
配列番号１４９：「ＤＲ５ ｍＡｂ ３ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２」ダイアボディの第２のポリペプチド鎖
配列番号１５０：「ＤＲ５ ｍＡｂ ４ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２」ダイアボディの第１のポリペプチド鎖
配列番号１５１：「ＤＲ５ ｍＡｂ ４ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２」ダイアボディの第２のポリペプチド鎖
配列番号１５２：リンカー
配列番号１５３：マウス抗ヒトＥｐｈＡ２抗体（「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １」）の軽鎖可変ドメイン
配列番号１５４：マウス抗ヒトＥｐｈＡ２抗体（「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ１
配列番号１５５：マウス抗ヒトＥｐｈＡ２抗体（「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ２
配列番号１５６：マウス抗ヒトＥｐｈＡ２抗体（「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ３
配列番号１５７：マウス抗ヒトＥｐｈＡ２抗体（「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ１をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１５８：マウス抗ヒトＥｐｈＡ２抗体（「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １」）の重鎖可変ドメイン
配列番号１５９：マウス抗ヒトＥｐｈＡ２抗体（「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ１
配列番号１６０：マウス抗ヒトＥｐｈＡ２抗体（「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ２
配列番号１６１：マウス抗ヒトＥｐｈＡ２抗体（「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ３
配列番号１６２：マウス抗ヒトＥｐｈＡ２抗体（「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １」）の重鎖可変ドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１６３：マウス抗ヒトＥｐｈＡ２抗体（「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２」）の軽鎖可変ドメイン
配列番号１６４：マウス抗ヒトＥｐｈＡ２抗体（「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ１
配列番号１６５：マウス抗ヒトＥｐｈＡ２抗体（「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ２
配列番号１６６：マウス抗ヒトＥｐｈＡ２抗体（「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ３
配列番号１６７：マウス抗ヒトＥｐｈＡ２抗体（「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２」）の重鎖可変ドメイン
配列番号１６８：マウス抗ヒトＥｐｈＡ２抗体（「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ１
配列番号１６９：マウス抗ヒトＥｐｈＡ２抗体（「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ２
配列番号１７０：マウス抗ヒトＥｐｈＡ２抗体（「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ３
配列番号１７１：マウス抗ヒトＥｐｈＡ２抗体（「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２」）の重鎖可変ドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１７２：マウス抗ヒトＥｐｈＡ２抗体（「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３」）の軽鎖可変ドメイン
配列番号１７３：マウス抗ヒトＥｐｈＡ２抗体（「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ１
配列番号１７４：マウス抗ヒトＥｐｈＡ２抗体（「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ２
配列番号１７５：マウス抗ヒトＥｐｈＡ２抗体（「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ３
配列番号１７６：マウス抗ヒトＥｐｈＡ２抗体（「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３」）の軽鎖可変ドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１７７：マウス抗ヒトＥｐｈＡ２抗体（「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３」）の重鎖可変ドメイン
配列番号１７８：マウス抗ヒトＥｐｈＡ２抗体（「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ１
配列番号１７９：マウス抗ヒトＥｐｈＡ２抗体（「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ２
配列番号１８０：マウス抗ヒトＥｐｈＡ２抗体（「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ３
配列番号１８１：マウス抗ヒトｇｐＡ３３抗体（「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」）の軽鎖可変ドメイン
配列番号１８２：マウス抗ヒトｇｐＡ３３抗体（「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ１
配列番号１８３：マウス抗ヒトｇｐＡ３３抗体（「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ２
配列番号１８４：マウス抗ヒトｇｐＡ３３抗体（「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」）の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ３
配列番号１８５：マウス抗ヒトｇｐＡ３３抗体（「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」）の軽鎖可変ドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１８６：マウス抗ヒトｇｐＡ３３抗体（「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」）の重鎖可変ドメイン
配列番号１８７：マウス抗ヒトｇｐＡ３３抗体（「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ１
配列番号１８８：マウス抗ヒトｇｐＡ３３抗体（「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ２
配列番号１８９：マウス抗ヒトｇｐＡ３３抗体（「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」）の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ３
配列番号１９０：マウス抗ヒトｇｐＡ３３抗体（「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」）の重鎖可変ドメインをエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１９１：マウス抗ヒトＨｅｒ２抗体（「Ｈｅｒ２ ｍＡｂ １」）の軽鎖可変ドメイン
配列番号１９２：マウス抗ヒトＨｅｒ２抗体（「Ｈｅｒ２ ｍＡｂ １」）の重鎖可変ドメイン
配列番号１９３：マウス抗ヒトＨｅｒ２抗体（「トラスツズマブ」）の軽鎖可変ドメイン
配列番号１９４：マウス抗ヒトＨｅｒ２抗体（「トラスツズマブ」）の重鎖可変ドメイン
配列番号１９５：マウス抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体（「Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ １」）の軽鎖可変ドメイン
配列番号１９６：マウス抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体（「Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ １」）の重鎖可変ドメイン
配列番号１９７：マウス抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体（「Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２」）の軽鎖可変ドメイン
配列番号１９８：マウス抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体（「Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２」）の重鎖可変ドメイン
配列番号１９９：マウス抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体（「Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ３」）の軽鎖可変ドメイン
配列番号２００：マウス抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体（「Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ３」）の重鎖可変ドメイン
配列番号２０１：キメラ抗ヒトＥＧＦＲ抗体（セツキシマブ）の軽鎖可変ドメイン
配列番号２０２：キメラ抗ヒトＥＧＦＲ抗体（セツキシマブ）の重鎖可変ドメイン
配列番号２０３：ヒト化抗ヒトＶＥＧＦ抗体（ベバシツマブ）の軽鎖可変ドメイン
配列番号２０４：ヒト化抗ヒトＶＥＧＦ抗体（ベバシツマブ）の重鎖可変ドメイン
配列番号２０５：ヒト化抗ＣＤ５２抗体（アレムツズマブ）の軽鎖可変ドメイン
配列番号２０６：ヒト化抗ＣＤ５２抗体（アレムツズマブ）の重鎖可変ドメイン
配列番号２０７：ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメイン
配列番号２０８：変異型ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメイン
配列番号２０９：ヒトＩｇＧ１ヒンジドメイン
配列番号２１０：ヒトＩｇＧ１ ＣＬカッパドメイン
配列番号２１１：ヒトＩｇＧ１ ＣＬラムダ２ドメイン
配列番号２１２：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖
配列番号２１３：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２１４：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖
配列番号２１５：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２１６：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖
配列番号２１７：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２１８：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖
配列番号２１９：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２２０：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ ２」三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖
配列番号２２１：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ ２」三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２２２：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ ２」三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖
配列番号２２３：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ ２」三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２２４：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ ２」三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖
配列番号２２５：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ ２」三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２２６：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ ２」三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖
配列番号２２７：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ ２」三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２２８：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖
配列番号２２９：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２３０：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖
配列番号２３１：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２３２：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖
配列番号２３３：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２３４：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖
配列番号２３５：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２３６：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖
配列番号２３７：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２３８：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖
配列番号２３９：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２４０：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖
配列番号２４１：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２４２：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖
配列番号２４３：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２４４：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖
配列番号２４５：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２４６：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖
配列番号２４７：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２４８：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖
配列番号２４９：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２５０：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖
配列番号２５１：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＤＲ５ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２５２：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖
配列番号２５３：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２５４：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖
配列番号２５５：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２５６：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖
配列番号２５７：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２５８：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖
配列番号２５９：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２６０：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２」三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖
配列番号２６１：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２」三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２６２：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２」三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖
配列番号２６３：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２」三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２６４：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２」三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖
配列番号２６５：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２」三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２６６：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２」三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖
配列番号２６７：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２」三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２６８：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３」三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖
配列番号２６９：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３」三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２７０：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３」三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖
配列番号２７１：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３」三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２７２：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３」三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖
配列番号２７３：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３」三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２７４：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３」三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖
配列番号２７５：「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２ｘＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３」三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２７６：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １xＣＤ３ ｍＡｂ ２xｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖
配列番号２７７：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １xＣＤ３ ｍＡｂ ２xｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２７８：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １xＣＤ３ ｍＡｂ ２xｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖
配列番号２７９：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １xＣＤ３ ｍＡｂ ２xｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２８０：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １xＣＤ３ ｍＡｂ ２xｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖
配列番号２８１：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １xＣＤ３ ｍＡｂ ２xｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２８２：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １xＣＤ３ ｍＡｂ ２xｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖
配列番号２８３：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １xＣＤ３ ｍＡｂ ２xｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２８４：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２xＣＤ３ ｍＡｂ ２xｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖
配列番号２８５：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２xＣＤ３ ｍＡｂ ２xｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２８６：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２xＣＤ３ ｍＡｂ ２xｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖
配列番号２８７：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２xＣＤ３ ｍＡｂ ２xｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２８８：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２xＣＤ３ ｍＡｂ ２xｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖
配列番号２８９：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２xＣＤ３ ｍＡｂ ２xｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２９０：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２xＣＤ３ ｍＡｂ ２xｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖
配列番号２９１：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２xＣＤ３ ｍＡｂ ２xｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２９２：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３xＣＤ３ ｍＡｂ ２xｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖
配列番号２９３：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３xＣＤ３ ｍＡｂ ２xｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２９４：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３xＣＤ３ ｍＡｂ ２xｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖
配列番号２９５：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３xＣＤ３ ｍＡｂ ２xｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２９６：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３xＣＤ３ ｍＡｂ ２xｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖
配列番号２９７：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３xＣＤ３ ｍＡｂ ２xｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２９８：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３xＣＤ３ ｍＡｂ ２xｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖
配列番号２９９：「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３xＣＤ３ ｍＡｂ ２xｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号３００：「４‐４‐２０ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２」ダイアボディの第１のポリペプチド鎖
配列番号３０１：「４‐４‐２０ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２」ダイアボディの第２のポリペプチド鎖
配列番号３０２：マウス抗ヒトＣＤ３１７抗体（「ＨＭ１．２４ ｍＡｂ １」）の軽鎖可変ドメイン
配列番号３０３：マウス抗ヒトＣＤ３１７抗体（「ＨＭ１．２４ ｍＡｂ １」）の重鎖可変ドメイン
配列番号３０４：ヒト化抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６抗体（１６Ｃ３；欧州特許第２５８５４７６号）の軽鎖可変ドメイン
配列番号３０５：ヒト化抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６抗体（１６Ｃ３；欧州特許第２５８５４７６号）の重鎖可変ドメイン
配列番号３０６：ヒト化抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６抗体（ｈＭＮ１５；国際公開第２０１１／０３４６６０号）の軽鎖可変ドメイン
配列番号３０７：ヒト化抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６抗体（ｈＭＮ１５；国際公開第２０１１／０３４６６０号）の重鎖可変ドメイン
配列番号３０８：マウス抗ヒト５Ｔ４抗体（「５Ｔ４ ｍＡｂ １」）の軽鎖可変ドメイン
配列番号３０９：マウス抗ヒト５Ｔ４抗体（「５Ｔ４ ｍＡｂ １」）の重鎖可変ドメイン
配列番号３１０：マウス抗ヒト５Ｔ４抗体（「５Ｔ４ ｍＡｂ ２」）の軽鎖可変ドメイン
配列番号３１１：マウス抗ヒト５Ｔ４抗体（「５Ｔ４ ｍＡｂ ２」）の重鎖可変ドメイン
配列番号３１２：ヒト化抗ヒトＩＴＧＢ６抗体（抗体３Ｇ９由来、国際公開第２００７／００８７１２号）の軽鎖可変ドメイン
配列番号３１３：ヒト化抗ヒトＩＴＧＢ６抗体（抗体３Ｇ９由来、国際公開第２００７／００８７１２号）の重鎖可変ドメイン
配列番号３１４：ヒト化抗ヒトＩＴＧＢ６抗体（抗体８Ｇ６由来、国際公開第２００７／００８７１２号）の軽鎖可変ドメイン
配列番号３１５：ヒト化抗ヒトＩＴＧＢ６抗体（抗体８Ｇ６由来、国際公開第２００７／００８７１２号）の重鎖可変ドメイン
配列番号３１６：「ｇｐＡ３３ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２」ダイアボディの第１のポリペプチド鎖
配列番号３１７：「ｇｐＡ３３ｘＣＤ３ ｍＡｂ ２」ダイアボディの第２のポリペプチド鎖
配列番号３１８：マウス抗ヒトＥｐｈＡ２抗体（「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２」）の軽鎖可変ドメイン（配列番号１６３）をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号３１９：マウス抗ヒトＥｐｈＡ２抗体（「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３」）の重鎖可変ドメイン（配列番号１７７）をエンコードするポリヌクレオチド
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図4G】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]