特許 6686896 ナノ炭素化合物結合ペプチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6686896

(24)【登録日】2020年4月6日

(45)【発行日】2020年4月22日

(54)【発明の名称】ナノ炭素化合物結合ペプチド

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20200413BHJP

   C07K 7/08 20060101ALI20200413BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20200413BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20200413BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20200413BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20200413BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20200413BHJP

   B82Y 5/00 20110101ALI20200413BHJP

   B82Y 30/00 20110101ALI20200413BHJP

   B82Y 40/00 20110101ALI20200413BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/09 ZZNA

   C07K7/08

   C07K19/00

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   B82Y5/00

   B82Y30/00

   B82Y40/00

【請求項の数】16

【全頁数】28

(21)【出願番号】特願2016-560260(P2016-560260)

(86)(22)【出願日】2015年11月18日

(86)【国際出願番号】JP2015082366

(87)【国際公開番号】WO2016080430

(87)【国際公開日】20160526

【審査請求日】2018年9月28日

(31)【優先権主張番号】特願2014-234393(P2014-234393)

(32)【優先日】2014年11月19日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000000066

【氏名又は名称】味の素株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110002147

【氏名又は名称】特許業務法人酒井国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】井之上 一平

(72)【発明者】

【氏名】横田 康介

(72)【発明者】

【氏名】安枝 寿

【審査官】 植原 克典

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１２／０８６６４７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００６／０６８２５０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００４−１２１１５４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 WANG Siqun et al.，Peptides with selective affinity for carbon nanotubes，nature materials，２００３年 ２月１６日，vol.2，pp.196-200

【文献】 SU Zhengding et al.，Conformational Selectivity of Peptides for Single-Walled Carbon Nanotubes，The Journal of Physical Chemistry B Letters，２００６年 ９月１１日，vol.110，pp.23623-23627

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／０９

Ｂ８２Ｙ ５／００

Ｂ８２Ｙ ３０／００

Ｂ８２Ｙ ４０／００

Ｃ０７Ｋ ７／００

Ｃ０７Ｋ １４／１９５

Ｃ０７Ｋ １９／００

Ｃ１２Ｎ １／００

Ｃ１２Ｎ ５／１０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＰＤＢ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下からなる群より選ばれるペプチド：
１）ＫＶＷＤＬＲＭＰＨＩＶＴ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むペプチド；
２）ＡＬＳＳＨＹＩＭＫＳＨＫ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むペプチド。

【請求項2】

請求項１記載のペプチドとタンパク質との融合タンパク質であって、
前記ペプチドがタンパク質のＮ末端またはＣ末端に付加された、融合タンパク質。

【請求項3】

（ｉ）ポリペプチド部分、ならびに（ｉｉ）標的物質に結合し得るペプチド部分および（ｉｉｉ）請求項１記載のペプチドの部分を含む、融合タンパク質。

【請求項4】

ポリペプチド部分が、内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分である、請求項３記載の融合タンパク質。

【請求項5】

内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分がＤｐｓである、請求項４記載の融合タンパク質。

【請求項6】

標的物質が、金属材料、シリコン材料または炭素材料である、請求項３〜５のいずれか一項記載の融合タンパク質。

【請求項7】

請求項１記載のペプチド、または請求項２〜６のいずれか一項記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。

【請求項8】

請求項７記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。

【請求項9】

請求項７記載のポリヌクレオチドを含む発現単位を含む宿主細胞。

【請求項10】

融合タンパク質の多量体であって、
内腔を有し、
融合タンパク質が、内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分、ならびに標的物質に結合し得るペプチド部分および請求項１記載のペプチドの部分を含む、多量体。

【請求項11】

内腔中に物質を含む、請求項１０記載の多量体。

【請求項12】

請求項１記載のペプチド、請求項２〜６のいずれか一項記載の融合タンパク質、または請求項１０または１１記載の多量体と、ナノ炭素化合物とを接触させることを含む、ペプチド、タンパク質または多量体とナノ炭素化合物との吸着方法。

【請求項13】

請求項３〜６のいずれか一項記載の融合タンパク質、または請求項１０または１１記載の多量体を用いて、ナノ炭素化合物と標的物質とを接着させることを含む、ナノ炭素化合物および標的物質を含む複合体の製造方法。

【請求項14】

ナノ炭素化合物および標的物質を含む複合体が、標的物質で被膜されたカーボンナノチューブである、請求項１３記載の方法。

【請求項15】

請求項３〜６のいずれか一項記載の融合タンパク質、または請求項１０または１１記載の多量体を介して接着された、ナノ炭素化合物および標的物質を含む複合体。

【請求項16】

以下（１）（２）を含む、多孔質構造体の製造方法：
（１）請求項１０または１１記載の多量体を用いて、ナノ炭素化合物、標的物質および前記多量体を含む複合体を作製すること；および
（２）得られた複合体から前記多量体を除去して、ナノ炭素化合物および標的物質から構成される多孔質構造体を得ること。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ナノ炭素化合物結合ペプチド、融合タンパク質およびその多量体などに関する。

【背景技術】

【0002】

生体材料および無機材料または有機材料の複合体を作製し、その複合体を半導体メモリや太陽電池などの高性能な電子デバイスやインプラントやバイオセンサーなどの医療材料へと応用することを目的として、無機材料または有機材料に対して結合し得るペプチドが、ファージを用いたスクリーニングにより開発されている（特許文献１および２、非特許文献１１）。すなわち、標的となる材料に結合する能力を有するペプチドを得るために、様々な配列のアミノ酸配列からなるペプチドを提示した１０^９から１０^１０種類のファージライブラリを、標的となる材料でコーティングされた試験管表面や粒子などと緩衝液中で混合することで結合させる。その試験管や粒子を、低濃度の界面活性剤を含む緩衝液で洗浄することで、標的への結合力の弱いペプチドを提示したファージを洗い流す。その後、酸や高濃度の界面活性剤を含む緩衝液で標的物質を洗浄することで、標的物質へ結合していたファージを剥離、回収する。そのファージが提示しているペプチド配列を特定することで、標的物質への結合力を持つペプチドを得る。このような手法を用いて無機物や炭素材料に結合する能力を有するペプチドとして、例えば、酸化チタン（特許文献３ならびに非特許文献１）、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）やカーボンナノホン（ＣＮＨ）（特許文献４および５、非特許文献２ならびに非特許文献３）、金（非特許文献４）、酸化亜鉛（非特許文献５）、ならびに硫化亜鉛および硫化カドミウム（非特許文献６）などを認識するペプチドが取得されている。

【0003】

炭素結晶構造であるＣＮＴやＣＮＨなどのナノ黒鉛構造物は、その電気特性や構造から他のナノ材料との複合体を構築することで電子材料や触媒、光材料および医療技術などへの応用が期待されている。ナノ黒鉛構造物を金属化合物被膜する技術として酸処理や高分子材料処理が知られている（非特許文献７）。例えば、酸処理されたＣＮＴの周囲を酸化ニオブで被膜することで、酸化ニオブ表面に提示されたプラチナの酸化還元触媒活性が向上することが示されていた（非特許文献８）。また、生体高分子を用いる方法としてＣＮＴ結合ペプチドと酸化チタン結合ペプチドが融合したカゴ状タンパク質やウイルスを用いてカーボンナノチューブを酸化チタンなどの酸化物でコーティングし、ナノ複合材料を合成する技術（非特許文献９および１０）が報告されており、それらの方法で合成されたナノ複合体は共に太陽電池電極材として利用されていた。しかし、今まで報告されているＣＮＴ結合ペプチドは、結合力が十分でなかったり、ＣＮＴの種類によって結合力が変化してしまったりすることから改良が求められていた。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】米国特許第５８６６３６３号

【特許文献2】米国特許第５４０３４８４号

【特許文献3】国際公開第２００５／０１００３１号

【特許文献4】国際公開第２００６／０６８２５０号

【特許文献5】特開２００４−１２１１５４号公報

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｋ．Ｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００５，ｖｏｌ．２１．ｐ．３０９０．

【非特許文献2】Ｚ．Ｓｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ． Ｂ． ２００６，ｖｏｌ．１１０， ｐ．２３６２３．

【非特許文献3】Ｓ．Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．，２００３，ｖｏｌ．２，ｐ．１９６．

【非特許文献4】Ｓ．Ｂｒｏｗｎ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９７，ｖｏｌ．１５．ｐ．２６９．

【非特許文献5】Ｍ．Ｕｍｅｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，２００５，ｖｏｌ．１７．ｐ．２５７１．

【非特許文献6】Ｃ．Ｅ．Ｆｌｙｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．，２００３，ｖｏｌ．１３．ｐ．２４１４．

【非特許文献7】Ｄ． Ｅｄｅｒ， Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． ２０１０， ｖｏｌ．１１０， ｐ．１３４８．

【非特許文献8】Ｋ．Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＲＳＣ Ａｄｖ．， ２０１４，ｖｏｌ．４，ｐ．９７０１．

【非特許文献9】Ｘ． Ｄａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ． Ｎａｎｏｔｅｃｈ． ２０１１， ｖｏｌ． ６， ｐ．３７７．

【非特許文献10】Ｉ．Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１１，ｖｏｌ．４７，ｐ．１２６４９．

【非特許文献11】Ｋ．Ｓｈｉｂａ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１０，ｖｏｌ．２１，ｐ．４１２．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

生体分子材料の持つ自己組織化能力や無機物認識能力の両方を活用することで、機能性を持つ構造や無機材料と有機材料を組み合わせた複合材料を構築できる。しかしながら、そのような機能性材料の合成に利用できるペプチドの種類は少なく、既に知られているペプチドの性能も十分でないものが多い。例えば、多様な用途への応用が期待されるカーボンナノチューブ等のナノ炭素化合物に結合するペプチドの性能は十分でなかった。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは、鋭意検討した結果、ナノ炭素化合物に強く結合するペプチドを見出すことなどに成功し、もって本発明を完成するに至った。

【0008】

すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下からなる群より選ばれるペプチド：
１）ＫＶＷＤＬＲＭＰＨＩＶＴ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むペプチド；
２）ＡＬＳＳＨＹＩＭＫＳＨＫ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むペプチド；
３）ＫＶＷＰＮＭＦＡＮＥＮＩ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むペプチド；
４）ＨＴＬＳＳＨＹＭＲＧＧＨ（配列番号４）のアミノ酸配列を含むペプチド；
５）ＫＶＭＰＰＮＨＭＴＨＷＡ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むペプチド；
６）ＫＩＷＳＶＰＱＬＬＨＹＴ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むペプチド；
７）ＫＩＷＤＬＷＫＳＥＧＡＷ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むペプチド；ならびに
８）配列番号１〜７のアミノ酸配列のいずれか一つのアミノ酸配列において１個または２個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、ナノ炭素化合物結合活性を有する、ペプチド。
〔２〕〔１〕のペプチドとタンパク質との融合タンパク質であって、
前記ペプチドがタンパク質のＮ末端またはＣ末端に付加された、融合タンパク質。
〔３〕（ｉ）ポリペプチド部分、ならびに（ｉｉ）標的物質に結合し得るペプチド部分および（ｉｉｉ）〔１〕のペプチドの部分を含む、融合タンパク質。
〔４〕ポリペプチド部分が、内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分である、〔３〕の融合タンパク質。
〔５〕内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分がＤｐｓである、〔４〕の融合タンパク質。
〔６〕標的物質が、金属材料、シリコン材料または炭素材料である、〔３〕〜〔５〕のいずれかの融合タンパク質。
〔７〕〔１〕のペプチド、または〔２〕〜〔６〕のいずれかの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔８〕〔７〕のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
〔９〕〔７〕のポリヌクレオチドを含む発現単位を含む宿主細胞。
〔１０〕融合タンパク質の多量体であって、
内腔を有し、
融合タンパク質が、内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分、ならびに標的物質に結合し得るペプチド部分および〔１〕のペプチドの部分を含む、多量体。
〔１１〕内腔中に物質を含む、〔１０〕の多量体。
〔１２〕〔１〕のペプチド、〔２〕〜〔６〕のいずれかの融合タンパク質、または〔１０〕または〔１１〕の多量体と、ナノ炭素化合物とを接触させることを含む、ペプチド、タンパク質または多量体とナノ炭素化合物との吸着方法。
〔１３〕〔３〕〜〔６〕のいずれかの融合タンパク質、または〔１０〕または〔１１〕の多量体を用いて、ナノ炭素化合物と標的物質とを接着させることを含む、ナノ炭素化合物および標的物質を含む複合体の製造方法。
〔１４〕ナノ炭素化合物および標的物質を含む複合体が、標的物質で被膜されたカーボンナノチューブである、〔１３〕の方法。
〔１５〕〔３〕〜〔６〕のいずれかの融合タンパク質、または〔１０〕または〔１１〕の多量体を介して接着された、ナノ炭素化合物および標的物質を含む複合体。
〔１６〕以下（１）（２）を含む、多孔質構造体の製造方法：
（１）〔１０〕または〔１１〕の多量体を用いて、ナノ炭素化合物、標的物質および前記多量体を含む複合体を作製すること；および
（２）得られた複合体から前記多量体を除去して、ナノ炭素化合物および標的物質から構成される多孔質構造体を得ること。

【発明の効果】

【0009】

本発明のペプチドは、例えば、ナノ炭素化合物の結合剤として、タンパク質の精製用タグとして、または本発明の融合タンパク質、多量体または複合体の作製に有用である。
本発明の融合タンパク質、多量体または複合体は、例えば、電気特性および／または触媒活性の向上した新規デバイスの作製、ならびに医療、バイオ研究分野等の分野に有用である。例えば、バイオマーカーや酸化物半導体に結合し得るペプチド部分およびナノ炭素化合物に結合し得るペプチド部分を含む融合タンパク質の使用により、蓄電池、水素発生装置、燃料電池、太陽電池、半導体、センサーなどの提供が可能になる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】図１は、各ＣＮＴ結合ペプチドを提示したファージのＣＮＴ認識能力を示す図である。

【図2】図２は、各ＣＮＴ結合ペプチドを提示したカゴ状タンパク質のＴＥＭ像を示す図である。

【図3】図３は、ＣＮＴペプチドを提示したＤｐｓとＣＮＴとの複合体の透過型電子顕微鏡像を示す図である。透過型電子顕微鏡像は、サンプルを３％ＴＰＡ染色して撮影された。

【図4A】図４Ａは、多孔質構造体の概略的な平面図である。

【図4B】図４Ｂは、図４ＡのＩＢ−ＩＢ一点鎖線で示される位置で切断した多孔質構造体の切断端面を示す概略的な図（１）である。

【図4C】図４Ｃは、図４Ｂと同様の位置で切断した多孔質構造体の切断端面を示す概略的な図（２）である。

【発明を実施するための形態】

【0011】

（ペプチド）
本発明は、ペプチドを提供する。本発明のペプチドは、例えば、生物学的手法により作製することができ、また、有機化学的方法により合成することができる。本発明のペプチドは、単離および／または精製されていてもよい。本発明のペプチドは、人工ペプチドであり得る。

【0012】

本発明のペプチドは、以下からなる群より選ばれるペプチドであってもよい：
１）ＫＶＷＤＬＲＭＰＨＩＶＴ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むペプチド；
２）ＡＬＳＳＨＹＩＭＫＳＨＫ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むペプチド；
３）ＫＶＷＰＮＭＦＡＮＥＮＩ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むペプチド；
４）ＨＴＬＳＳＨＹＭＲＧＧＨ（配列番号４）のアミノ酸配列を含むペプチド；
５）ＫＶＭＰＰＮＨＭＴＨＷＡ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むペプチド；
６）ＫＩＷＳＶＰＱＬＬＨＹＴ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むペプチド；
７）ＫＩＷＤＬＷＫＳＥＧＡＷ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むペプチド；ならびに
８）配列番号１〜７のアミノ酸配列のいずれか一つのアミノ酸配列において１個または２個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、ナノ炭素化合物結合活性を有する、ペプチド。

【0013】

本発明では、ナノ炭素化合物結合活性とは、ナノ炭素化合物に結合する能力をいう。本発明では、ナノ炭素化合物とは、炭素原子とその結合からできた六角形格子構造からなるナノサイズの炭素化合物をいう。ナノ炭素化合物としては、例えば、カーボンナノチューブ、グラフェン、ナノダイヤモンド、およびフラーレンが挙げられる。本発明では、カーボンナノチューブが好ましい。カーボンナノチューブとしては、例えば、単層カーボンナノチューブ、および複層カーボンナノチューブが挙げられる。ナノ炭素化合物結合活性の程度は、ナノ炭素化合物に結合する能力を保持する限り特に限定されないが、例えば、元のアミノ酸配列からなるペプチドのナノ炭素化合物結合活性の約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上または同等以上であってもよい。ナノ炭素化合物結合活性の程度は、例えば、実施例２に記載されるように、ファージパニングにおいてｐｆｕ値を指標として評価することができる。

【0014】

上述した８）のペプチドにおいて、置換、付加または挿入されるアミノ酸残基は、天然タンパク質を構成する通常のＬ−α−アミノ酸である。このようなアミノ酸残基としては、例えば、Ｌ−アラニン（Ａ）、Ｌ−アスパラギン（Ｎ）、Ｌ−システイン（Ｃ）、Ｌ−グルタミン（Ｑ）、Ｌ−イソロイシン（Ｉ）、Ｌ−ロイシン（Ｌ）、Ｌ−メチオニン（Ｍ）、Ｌ−フェニルアラニン（Ｆ）、Ｌ−プロリン（Ｐ）、Ｌ−セリン（Ｓ）、Ｌ−スレオニン（Ｔ）、Ｌ−トリプトファン（Ｗ）、Ｌ−チロシン（Ｙ）、Ｌ−バリン（Ｖ）、Ｌ−アスパラギン酸（Ｄ）、Ｌ−グルタミン酸（Ｅ）、Ｌ−アルギニン（Ｒ）、Ｌ−ヒスチジン（Ｈ）、Ｌ−リジン（Ｋ）、およびグリシン（Ｇ）が挙げられる。

【0015】

アミノ酸残基が置換により変異される場合、アミノ酸残基の置換は、保存的置換であってもよい。本明細書中で用いられる場合、用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有する塩基性アミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有する酸性アミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、中性側鎖を有する中性アミノ酸〔例、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、および非極性側鎖を有するアミノ酸（例、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）〕、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。

【0016】

本発明のペプチドは、例えば、ナノ炭素化合物結合剤として、タンパク質の精製用タグとして、ならびに本発明の融合タンパク質、多量体または複合体の作製に有用である。

【0017】

（融合タンパク質）
本発明はまた、本発明のペプチドとタンパク質との融合タンパク質を提供する。本発明において、用語「タンパク質」は、ポリペプチドと同義の表現であり、用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は交換可能に使用される。本発明のペプチドと融合されるタンパク質としては、任意のタンパク質を用いることができ、例えば、精製が意図されるタンパク質、多量体を形成し得るタンパク質（例、内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質）が挙げられる。タンパク質に対する本発明のペプチドの融合は、タンパク質のＮ末端またはＣ末端のいずれか一方または双方で行われる。本発明のペプチドは、ファージパニングにより得られたペプチドである。ファージパニングは、外来ＤＮＡをファージのコートタンパク質をコードする遺伝子中に挿入し、その外来ＤＮＡの産物をコートタンパク質との融合タンパク質としてファージ粒子表面に提示させる方法である。したがって、このような手法により取得された本発明のペプチドは、タンパク質と融合された状態において、その機能を発揮できることが実証されている。

【0018】

一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、（ｉ）ポリペプチド部分、ならびに（ｉｉ）標的物質に結合し得るペプチド部分、および（ｉｉｉ）本発明のペプチドの部分を含んでいてもよい。ポリペプチド部分は、上述した用語「タンパク質」と同義である。

【0019】

好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、（ｉ’）内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分、ならびに（ｉｉ）標的物質に結合し得るペプチド部分、および（ｉｉｉ）本発明のペプチドの部分を含んでいてもよい。

【0020】

用語「内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分」とは、内部に空間を有する多量体を、ポリペプチド部分の会合によって、形成する能力を有するポリペプチド部分をいう。このようなポリペプチド部分としては、幾つかのタンパク質が知られている。例えば、このようなポリペプチド部分としては、内腔を有する２４量体を形成し得るフェリチン、および内腔を有する多量体を形成し得るフェリチン様タンパク質が挙げられる。内腔を有する多量体を形成し得るフェリチン様タンパク質としては、例えば、内腔を有する１２量体を形成し得るＤｐｓ（ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｓｔａｒｖｅｄ ｃｅｌｌｓ）が挙げられる。Ｄｐｓは、分子量約１８ｋＤａの単量体単位からなる１２量体を形成することにより、約５ｎｍの直径の内腔を有する外径９ｎｍからなるかご状構造を形成し、この内腔中に、鉄分子を酸化鉄ナノ粒子として貯蔵できる。さらに、フェリチンでは、鉄以外にも、ベリリウム、ガリウム、マンガン、リン、ウラン、鉛、コバルト、ニッケル、クロムなどの金属の酸化物、また、セレン化カドミウム、硫化亜鉛、硫化鉄、硫化カドミウムなどの半導体・磁性体などのナノ粒子を人工的に貯蔵させられることが示されており、半導体材料工学分野や医療分野での応用研究が盛んにおこなわれている（Ｉ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２０１０，ｖｏｌ．１８００，ｐ．８４６．）。内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分は、微生物、植物および動物等の任意の生物に由来する、天然に生じるタンパク質であっても、または天然に生じるタンパク質の変異体であってもよい。以下、内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分を、単にポリペプチド部分と称する場合がある。内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分としては、そのＮ末端部およびＣ末端部が多量体の表面に露出し得るものが好ましい。

【0021】

内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分は、そのＮ末端部およびＣ末端部を多量体構造の表面に露出するものであっても露出しないものであってもよいが、そのＮ末端部およびＣ末端部を多量体構造の表面に露出しているものが好ましい。

【0022】

好ましくは、内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分は、Ｄｐｓである。本発明で用いられる用語「Ｄｐｓ（ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｓｔａｒｖｅｄ ｃｅｌｌｓ）」とは、上述したような、内腔を有する１２量体を形成し得るタンパク質をいう。用語「Ｄｐｓ」には、天然に生じるＤｐｓまたはその変異体が含まれる。天然に生じるＤｐｓの変異体としては、天然に生じるＤｐｓと同様に、１２量体を形成したときに、そのＮ末端部およびＣ末端部が１２量体の表面に露出し得るものが好ましい。なお、Ｄｐｓは、それが由来する細菌の種類によってはＮａｐＡ、バクテリオフェリチン、Ｄｌｐ、ＭｒｇＡまたはＤｐｓ様タンパク質と称呼される場合があり、また、Ｄｐｓには、ＤｐｓＡ、ＤｐｓＢ、Ｄｐｓ１、Ｄｐｓ２等のサブタイプが知られている（Ｔ．Ｈａｉｋａｒａｉｎｅｎ ａｎｄ Ａ．Ｃ．Ｐａｐａｇｅｏｒｇｉｏｎ， Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，２０１０ ｖｏｌ．６７，ｐ．３４１を参照）。したがって、本発明では、用語「Ｄｐｓ」は、これらの別名で称呼されるタンパク質も含むものとする。Ｄｐｓは、当該技術分野において周知である（例、国際公開第２０１２／０８６６４７号、国際公開第２０１３／０２２０５１号等を参照）。

【0023】

Ｄｐｓが由来し得る微生物としては、Ｄｐｓを産生する微生物である限り特に限定されないが、例えば、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属、エスケリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）属、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、サーモシネココッカス（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属、およびデイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ならびにコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌が挙げられる。
リステリア属に属する細菌としては、例えば、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）が挙げられる。スタフィロコッカス属に属する細菌としては、例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ Ａｕｒｅｕｓ）が挙げられる。バチルス属に属する細菌としては、例えば、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が挙げられる。ストレプトコッカス属に属する細菌としては、例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）が挙げられる。ビブリオ属に属する細菌としては、例えば、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）が挙げられる。エスケリシア属に属する細菌としては、例えば、エスケリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が挙げられる。ブルセラ属に属する細菌としては、例えば、ブルセラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ Ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）が挙げられる。ボレリア属に属する細菌としては、例えば、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ Ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）が挙げられる。マイコバクテリウム属に属する細菌としては、例えば、マイコバクテリウム・スメグマティス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）が挙げられる。カンピロバクター属に属する細菌としては、例えば、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）が挙げられる。サーモシネココッカス属に属する細菌としては、例えば、サーモシネココッカス・エロンガタス（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ Ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）が挙げられる。デイノコッカス属に属する細菌としては、例えば、デイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ Ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）が挙げられる。パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する細菌としては、例えば、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）が挙げられる。コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）が挙げられる。
好ましくは、Ｄｐｓは、リステリア・イノキュアまたはエスケリシア・コリ、あるいはコリネバクテリウム・グルタミカムに由来するＤｐｓであり得る。

【0024】

用語「標的物質に結合し得るペプチド部分」とは、任意の標的物質に対して親和性を有するペプチドを有し、かつ当該標的物質に対して結合できる部分をいう。標的物質に対して親和性を有する種々のペプチドが知られているので、本発明では、このようなペプチドを有する部分を、上記ペプチド部分として用いることができる。標的物質に結合し得るペプチド部分は、任意の標的物質に対して親和性を有する１個のペプチドのみを有していてもよいし、あるいは任意の標的物質に対して親和性を有する同種または異種の複数（例、２個、３個、４個、５個または６個等の数個）のペプチドを有していてもよい。例えば、標的物質に結合し得るペプチド部分が、任意の標的物質に対して親和性を有する異種の複数のペプチドを有する場合、当該ペプチド部分としては、カーボンナノ材料と結合し得るＰ１ペプチドと、チタン材料またはシリコン材料に結合し得るＲ５ペプチドとの融合ペプチドであるＰ１Ｒ５ペプチドを用いることができる（例、Ｍ．Ｊ．Ｐｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．，２００６，ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，ｐ．４０−４４を参照）。標的物質に結合し得るペプチド部分が上記のような複数のペプチドを有する場合、複数のペプチドは、当該ペプチド部分中に任意の順序で融合され得る。融合は、アミド結合を介して達成され得る。融合は、直接的なアミド結合、あるいは１個のアミノ酸残基（例、メチオニン）または数個（例えば２〜５０個、好ましくは２〜３０個、より好ましくは２〜２０個、さらにより好ましくは２〜１５個または２〜１０個、最も好ましくは２、３、４または５個）のアミノ酸残基からなるペプチド（ペプチドリンカー）が介在したアミド結合により達成され得る。種々のペプチドリンカーが知られているので、本発明でも、このようなペプチドリンカーを使用することができる。

【0025】

標的物質としては、例えば、無機材料および有機材料、あるいは導体材料、半導体材料および磁性体材料が挙げられる。具体的には、このような標的物質としては、金属材料、シリコン材料、低分子化合物（例、ポルフィリン等の生体物質、放射性物質、蛍光物質、色素、薬物）、ポリマー（例、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリエチレンオキシドまたはポリ（Ｌ−乳酸）等の疎水性有機ポリマーまたは伝導性ポリマー）、タンパク質（例、オリゴペプチドまたはポリペプチド）、核酸（例、ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド）、糖質（例、モノサッカリド、オリゴサッカリドまたはポリサッカリド）、脂質が挙げられる。

【0026】

金属材料としては、例えば、金属および金属化合物が挙げられる。金属としては、例えば、チタン、クロム、亜鉛、鉛、マンガン、カルシウム、銅、カルシウム、ゲルマニウム、アルミニウム、ガリウム、カドミウム、鉄、コバルト、金、銀、プラチナ、パラジウム、ハフニウム、テルルが挙げられる。金属化合物としては、例えば、金属の酸化物、硫化物、炭酸化物、砒化物、塩化物、フッ化物およびヨウ化物、ならびに金属間化合物が挙げられる。金属の酸化物としては、種々の酸化物が挙げられる。より具体的には、金属化合物としては、上述したようなチタンの酸化物、酸化クロム、酸化亜鉛、酸化鉛、酸化マンガン、ゼオライト、炭酸カルシウム、酸化銅、酸化マンガンカルシウム、酸化ゲルマニウム、酸化アルミニウム、酸化ハフニウム、チタンジルコン酸鉛、砒化ガリウム、硫化亜鉛、硫化鉛、硫化カドミウム、白金鉄、白金コバルト、カドミウムテルルが挙げられる。

【0027】

シリコン材料としては、例えば、シリコンまたはシリコン化合物が挙げられる。シリコン化合物としては、例えば、シリコンの酸化物（例、一酸化ケイ素（ＳｉＯ）、二酸化ケイ素（ＳｉＯ₂））、炭化ケイ素（ＳｉＣ）、シラン（ＳｉＨ_４）、シリコーンゴムが挙げられる。

【0028】

標的物質に結合し得るペプチド部分は、上述したような標的物質に対して親和性を有する限り特に限定されない。標的物質に対して親和性を有する種々のペプチドが知られており、また、開発されている。例えば、生体材料および無機材料または有機材料の複合体を作製することを目的として、無機材料または有機材料に対して結合し得るペプチドが、ファージを用いたスクリーニング等の手法により開発されている。このような手法により開発されたペプチドとしては、例えば、チタン（例、チタンの酸化物）ならびに銀（Ｋ．Ｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００４，ｖｏｌ．２１，ｐ．３０９０．、国際公開第２００５／０１００３１号）、金（Ｓ．Ｂｒｏｗｎ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９７，ｖｏｌ．１５．ｐ．２６９．）、酸化亜鉛（Ｋ．Ｋｊａｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０００，ｖｏｌ．６６．ｐ．１０．、Ｕｍｅｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，１７，２５７１−２５７５（２００５））、酸化ゲルマニウム（Ｍ．Ｂ．Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００４，ｖｏｌ．１５．ｐ．１７７６．）、硫化亜鉛および硫化カドミウム（Ｃ．Ｅ．Ｆｌｙｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．，２００３，ｖｏｌ．１３．ｐ．２４１４．）等の金属材料に結合し得るペプチド；シリコンおよびシリコンの酸化物（Ｈ．Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．，２００６，ｖｏｌ．７８，，ｐ．４８７２、Ｍ．Ｊ．Ｐｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．，２００６，ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，ｐ．４０−４４、Ｋ．Ｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００４，ｖｏｌ．２１，ｐ．３０９０．、国際公開第２００５／０１００３１号）等のシリコン材料に結合し得るペプチド；カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、カーボンナノホン（ＣＮＨ）等の炭素材料に結合し得るペプチド（Ｓ．Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．，２００３，ｖｏｌ．２，ｐ．１９６．および特開２００４−１２１１５４号公報）；ならびに疎水性有機ポリマー等のポリマーに結合し得るペプチド（特開２００８−１３３１９４号公報）が挙げられる。したがって、本発明でも、標的物質に結合し得るペプチド部分として、このようなペプチドを使用することができる。

【0029】

なお、金属に結合し得るペプチドは、金属の析出（ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）作用を有し得ること、および金属化合物に結合し得るペプチドは、金属化合物の析出活性を有し得ることが知られている（Ｋ．Ｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００４，ｖｏｌ．２１，ｐ．３０９０．、Ｍ．Ｕｍｅｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，２００５，ｖｏｌ．１７，ｐ．２５７１．）。したがって、標的物質に結合し得るペプチド部分として、金属材料（金属または金属化合物）に結合し得るペプチドを用いる場合、金属材料に結合し得るペプチドは、このような析出活性を有し得る。

【0030】

ポリペプチド部分およびペプチド部分の融合は、アミド結合を介して達成され得る。融合は、直接的なアミド結合、あるいは１個のアミノ酸残基（例、メチオニン）または数個（例えば２〜５０個、好ましくは２〜３０個、より好ましくは２〜２０個、さらにより好ましくは２〜１５個または２〜１０個、最も好ましくは２、３、４または５個）のアミノ酸残基からなるペプチド（ペプチドリンカー）が介在したアミド結合により達成され得る。種々のペプチドリンカーが知られているので、本発明でも、このようなペプチドリンカーを使用することができる。

【0031】

本発明の融合タンパク質において、ポリペプチド部分、ならびに標的物質に結合し得るペプチド部分、および本発明のペプチドの部分が融合する順序は、特に限定されず、１）ポリペプチド部分のＮ末端部およびＣ末端部がそれぞれ標的物質に結合し得るペプチド部分、および本発明のペプチドの部分のＣ末端部およびＮ末端部またはＮ末端部およびＣ末端部と融合していてもよいし、あるいは２）ポリペプチド部分のＮ末端部が標的物質に結合し得るペプチド部分のＣ末端部と融合し、かつ当該標的物質に結合し得るペプチド部分のＮ末端部が本発明のペプチドの部分のＣ末端部とさらに融合していてもよく、または３）ポリペプチド部分のＣ末端部が標的物質に結合し得るペプチド部分のＮ末端部と融合し、かつ当該標的物質に結合し得るペプチド部分のＣ末端部が本発明のペプチドの部分のＮ末端部とさらに融合していてもよい。例えば、ポリペプチド部分としてフェリチンを用いる場合、フェリチンはそのＮ末端部が多量体の表面上に露出され、そのＣ末端部は表面上に露出しないことから、好ましくは、フェリチンは、上記２）の順序で融合される。一方、ポリペプチド部分としてＤｐｓを用いる場合、ＤｐｓはＮ末端部およびＣ末端部の両方が多量体の表面上に露出し得ることから、Ｄｐｓは、上記１）〜３）のいずれかの順序で融合され得る。

【0032】

好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ポリペプチド部分のＮ末端側およびＣ末端側またはＣ末端側およびＮ末端側にそれぞれ標的物質に結合し得るペプチド部分、および本発明のペプチドの部分（それぞれ、１個または複数）を有し得る。

【0033】

ポリペプチド部分のＮ末端側に融合されたペプチド部分は、翻訳開始コドンによりコードされるメチオニン、またはメチオニンをＮ末端に含む部分を、そのＮ末端側に有するように設計され得る。このような設計により、本発明の融合タンパク質の翻訳が促進され得る。メチオニンをＮ末端に含むペプチド部分は、数個（例えば２〜５０個、好ましくは２〜３０個、より好ましくは２〜２０個、さらにより好ましくは２〜１５個または２〜１０個、最も好ましくは２、３、４または５個）のアミノ酸残基からなるペプチドであり得る。

【0034】

好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、標的物質に結合し得るペプチド部分、および本発明のペプチドの部分が異なる標的物質に結合し得る。標的物質に結合し得るペプチド部分が結合する標的物質としては、例えば、無機材料および有機材料が挙げられる。より具体的には、このような標的物質としては、例えば、金属材料、シリコン材料が挙げられる。

【0035】

金属材料に結合し得るペプチド部分としては、例えば、亜鉛または亜鉛化合物（例、酸化亜鉛）等の亜鉛材料に結合し得るペプチド部分が挙げられる。亜鉛材料に結合し得るペプチド部分としては、例えば、国際公開第２０１２／０８６６４７号およびＵｍｅｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，１７，２５７１−２５７５（２００５）に開示されるペプチドが挙げられる。

【0036】

シリコン材料に結合し得るペプチド部分としては、シリコンまたはシリコン化合物（例、シリコンの酸化物）に結合し得るペプチド部分が好ましい。このようなペプチド部分としては、例えば、国際公開第２０１２／０８６６４７号、国際公開第２００６／１２６５９５号、およびＭ．Ｊ．Ｐｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．，２００６，ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，ｐ．４０−４４に開示されるペプチドが挙げられる。

【0037】

（ポリヌクレオチド）
本発明は、本発明のペプチド、または本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、ＤＮＡであることが好ましい。

【0038】

好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、それが導入されるべき宿主細胞のコドン使用頻度に適合するようにコドンが変更されていてもよい。ある遺伝子を異種宿主細胞（例、微生物）で発現させる場合、コドン使用頻度の相違により、対応するｔＲＮＡ分子種が十分に供給されず、翻訳効率の低下および／または不正確な翻訳（例、翻訳の停止）が生じることがある。例えば、エシェリヒア・コリでは、表１に示される低頻度コドンが知られている。

【0039】

【表1】

【0040】

したがって、本発明では、後述するような宿主細胞（例、微生物）のコドン使用頻度に適合するポリヌクレオチドを利用することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、アルギニン残基、グリシン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、およびプロリン残基からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸残基をコードするコドンが変更されたものであってもよい。より具体的には、本発明のポリヌクレオチドは、低頻度コドン（例、ＡＧＧ、ＡＧＡ、ＣＧＧ、ＣＧＡ、ＧＧＡ、ＡＵＡ、ＣＵＡ、およびＣＣＣ）からなる群より選ばれる１種以上のコドンが変更されたものであってもよい。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、以下からなる群より選ばれる１種以上（例、１種、２種、３種、４種、または５種）のコドンの変更を含んでいてもよい：
ｉ）Ａｒｇをコードする４種のコドン（ＡＧＧ、ＡＧＡ、ＣＧＧ、およびＣＧＡ）からなる群より選ばれる少なくとも１種のコドンの、Ａｒｇをコードする別のコドン（ＣＧＵ、またはＣＧＣ）への変更；
ｉｉ）Ｇｌｙをコードする１種のコドン（ＧＧＡ）の、別のコドン（ＧＧＧ、ＧＧＵ、またはＧＧＣ）への変更；
ｉｉｉ）Ｉｌｅをコードする１種のコドン（ＡＵＡ）の、別のコドン（ＡＵＵ、またはＡＵＣ）への変更；
ｉｖ）Ｌｅｕをコードする１種のコドン（ＣＵＡ）の、別のコドン（ＵＵＧ、ＵＵＡ、ＣＵＧ、ＣＵＵ、またはＣＵＣ）への変更；ならびに
ｖ）Ｐｒｏをコードする１種のコドン（ＣＣＣ）の、別のコドン（ＣＣＧ、ＣＣＡ、またはＣＣＵ）への変更。
本発明のポリヌクレオチドがＲＮＡの場合、上記のとおりヌクレオチド残基「Ｕ」が利用されるべきであるが、本発明のポリヌクレオチドがＤＮＡの場合、ヌクレオチド残基「Ｕ」の代わりに「Ｔ」が利用されるべきである。

【0041】

低頻度コドンの同定は、当該分野で既知の技術を利用することにより、任意の宿主細胞の種類およびゲノム配列情報に基づいて容易に行うことができる。したがって、本発明のポリヌクレオチドは、低頻度コドンの非低頻度コドン（例、高頻度コドン）への変更を含むものであってもよい。また、低頻度コドンのみならず、生産菌株のゲノムＧＣ含量への適合性などの要素を考慮してポリヌクレオチドを設計する方法が知られているので（Ａｌａｎ Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ： ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ＤＮＡ ｓｅｇｍｅｎｔｓ， ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ２００６ Ｊｕｎ ６；７：２８５．）、このような方法を利用してもよい。このように、本発明のポリヌクレオチドは、それが導入され得る任意の宿主細胞（例、後述するような微生物）の種類に応じて適宜作製できる。

【0042】

（発現ベクター）
本発明は、発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターは、本発明のペプチド、または本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または本発明のポリヌクレオチドを含む。

【0043】

本発明の発現ベクターは、上記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含んでいてもよい。プロモーターとしては、例えば、任意の生物（例、微生物、動物、昆虫、および植物）由来プロモーター、ウイルス由来プロモーター、ならびに人工合成プロモーターが挙げられる。プロモーターとしてはまた、異種タンパク質生産に汎用されるプロモーターを用いてもよい。このようなプロモーターとしては、例えば、ＰｈｏＡプロモーター、ＰｈｏＣプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ＳＰ６プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、コールドショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーターが挙げられる。

【0044】

本発明の発現ベクターはまた、上記ポリヌクレオチドの下流にターミネーターをさらに含んでいてもよい。このようなターミネーターとしては、例えば、Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネーター、エシェリヒア・コリｔｒｐＡ遺伝子のターミネーターが挙げられる。

【0045】

本発明の発現ベクターはまた、開始コドンの上流にリボゾーム結合部位（例、シャイン・ダルガノ配列）をさらに含んでいてもよい。

【0046】

本発明の発現ベクターはまた、薬剤耐性遺伝子をコードするポリヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する耐性遺伝子が挙げられる。

【0047】

本発明の発現ベクターはまた、宿主細胞に導入された場合に、宿主細胞のゲノムとの相同組換えを可能にする１以上の領域をさらに含んでいてもよい。例えば、本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含む発現単位が一対の相同領域（例、宿主ゲノム中の特定配列に対して相同なホモロジーアーム、ｌｏｘＰ、ＦＲＴ）間に位置するように設計されてもよい。発現単位とは、発現されるべき所定のポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーター（例、同種プロモーター、異種プロモーター）を含む、当該ポリヌクレオチドの転写、ひいては当該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの産生を可能にする単位をいう。発現単位は、上述したようなターミネーター、リボゾーム結合部位、および薬剤耐性遺伝子等のエレメントをさらに含んでいてもよい。

【0048】

本発明の発現ベクターとしては、例えば、宿主においてタンパク質を発現させる細胞系ベクター、およびタンパク質翻訳系を利用する無細胞系ベクターが挙げられる。発現ベクターはまた、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクター、または人工染色体であってもよい。組込み型ベクターは、その全体が宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。あるいは、組込み型ベクターは、その一部（例、上述の発現単位）のみが宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。発現ベクターはさらに、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであってもよい。
細胞系ベクターとしては、宿主に適した公知の発現ベクターが用いられる。このようなベクターとしては、例えば、ｐＵＣ（例、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８）、ｐＳＴＶ、ｐＢＲ（例、ｐＢＲ３２２）、ｐＨＳＧ（例、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８）、ＲＳＦ（例、ＲＳＦ１０１０）、ｐＡＣＹＣ（例、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４）、ｐＭＷ（例、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８）、ｐＱＥ（例、ｐＱＥ３０）、およびその誘導体が挙げられる。
無細胞系ベクターとしては、例えば、Ｔ７またはＴ３プロモーターを有する発現ベクター、ＳＰ６プロモーター等を有するｐＥＵ系プラスミド等の小麦無細胞タンパク質合成用ベクター等が挙げられる。

【0049】

本発明の発現ベクターはまた、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびマルチクローニング部位、ならびに上述したエレメントを含む、タンパク質精製用ベクターであってもよい。この場合、所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチドをマルチクローニング部位に挿入することにより、所望のタンパク質が、本発明のペプチドとの融合タンパク質として発現される。したがって、本発明のペプチドとの親和性を有するナノ炭素化合物を利用することにより、所望のタンパク質を精製することができる。マルチクローニング部位は、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して５’末端側または３’末端側のいずれに存在していてもよい。

【0050】

（形質転換体）
本発明の形質転換体は、本発明のペプチド、または本発明の融合タンパク質を産生できる、または本発明のポリヌクレオチドを発現してペプチドまたは融合タンパク質を産生できる宿主細胞である。具体的には、本発明の形質転換体は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現単位を含む宿主細胞である。本発明のポリヌクレオチドを含む発現単位を含む宿主細胞としては、例えば、本発明の発現ベクターが細胞質中に導入された宿主細胞、本発明の発現ベクターの全体がゲノムに挿入された宿主細胞、および本発明の発現ベクター中の発現単位がそのゲノムに挿入された宿主細胞が挙げられる。宿主細胞は、本発明のタンパク質を発現できる限り特に限定されない。宿主細胞としては、例えば、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、および微生物が挙げられるが、微生物が好ましい。微生物としては、例えば、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）に属する細菌等の細菌、および真菌が挙げられる。細菌は、グラム陽性菌であってもグラム陰性菌であってもよい。

【0051】

グラム陽性細菌としては、例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、およびコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）等のコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌が挙げられる。

【0052】

グラム陰性細菌としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｔｉｓ）等のパントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌、およびエンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）等のエンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌等が挙げられる。

【0053】

真菌としては、サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等のサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属真菌、およびシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）等のシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属真菌が挙げられる。

【0054】

発現単位は、宿主細胞に対して同種であっても異種であってもよいが、好ましくは異種発現単位である。用語「異種発現単位」とは、発現単位が宿主細胞に対して異種であることを意味する。したがって、本発明では、発現単位を構成する少なくとも１つのエレメントが宿主細胞に対して異種である。宿主細胞に対して異種である、発現単位を構成するエレメントとしては、例えば、上述したエレメントが挙げられる。好ましくは、異種発現単位を構成する、本発明のペプチド、または本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、もしくはプロモーターの一方、または双方が、宿主細胞に対して異種である。

【0055】

発現単位の宿主細胞への導入（形質転換）は、例えば、発現ベクターを利用した従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、カルシウム処理された菌体を用いるコンピテント細胞法や、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、プラスミドベクター以外にもファージベクターを用いて、菌体内に感染させ導入する方法によってもよい。

【0056】

本発明のペプチド、または本発明の融合タンパク質は、本発明の形質転換体またはその培養培地から精製されてもよい。本発明の形質転換体は、ソニケーション、リゾチーム処理等の処理により、破砕されてもよい。精製方法としては、例えば、塩析法、および各種クロマトグラフィーを用いた方法が挙げられる。ナノ炭素化合物を用いたアフィニティーカラムにより、本発明のペプチド、または本発明の融合タンパク質を精製することができる。その他、イオン交換クロマトグラフィーやゲルろ過クロマトグラフィー等の方法を適宜組み合わせて精製することにより、本発明のペプチド、または本発明の融合タンパク質の純度を高めることができる。

【0057】

（多量体）
本発明はまた、融合タンパク質の多量体を提供する。本発明の多量体は、内腔を有し得る。本発明の多量体を構成する融合タンパク質は、上述したとおりである。本発明の多量体は、本発明の融合タンパク質を発現させることで、自律的に形成され得る。本発明の多量体を構成する単量体単位の数は、本発明の融合タンパク質におけるポリペプチド部分の種類により決定され得る。好ましくは、本発明の多量体は、内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分としてＤｐｓを有し得ることから、１２量体であり得る。本発明の多量体は、例えば、本発明のペプチド、または本発明の融合タンパク質について上述したのと同様に、本発明の形質転換体またはその培養培地から精製することができる。

【0058】

本発明の多量体は、単量体単位として、単一の融合タンパク質から構成されるホモ多量体であってもよいが、異なる複数の種類（例、２種、３種、４種、５種または６種）の融合タンパク質から構成されるヘテロ多量体であってもよい。本発明の多量体では、多量体形成の観点から、多量体を構成する融合タンパク質中のポリペプチド部分は単一のポリペプチド部分であることが好ましいが、標的物質に結合し得るペプチド部分、および本発明のペプチドの部分は、多量体を構成する融合タンパク質間で異なるものであってもよい。異なる複数の種類の融合タンパク質から構成される多量体は、例えば、異なる種類の融合タンパク質を発現する複数のベクター、または異なる種類の融合タンパク質を発現する単一のベクター（例、ポリシストロニックｍＲＮＡを発現し得るベクター）を、単一の宿主細胞に導入し、次いで、異なる種類の融合タンパク質を単一の宿主細胞中で発現させることにより、得ることができる。このような多量体はまた、単一の融合タンパク質から構成される第１の単量体と、単一の融合タンパク質（第１の多量体を構成する融合タンパク質とは異なる）から構成される第２の単量体とを、同一の媒体（例、緩衝液）中で共存させ、放置することにより、得ることができる。融合タンパク質の単量体は、例えば、本発明の多量体を、低ｐＨの緩衝液下に放置することにより調製することができる。詳細については、例えば、Ｂ．Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，ｖｏｌ．２１，ｐ．４４５６０２を参照のこと。

【0059】

本発明の多量体は、内腔中に物質を含んでいてもよい。物質は、錯体または粒子（例、ナノ粒子、磁性粒子）のような形態で、本発明の多量体中に内包されていてもよい。当業者は、本発明の多量体の内腔のサイズ、および本発明の多量体における物質の取り込みに関与し得る領域（例、Ｃ末端の領域：Ｒ．Ｍ．Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｖｏｌ．１２６，ｐ．１３２８２を参照）中のアミノ酸残基の電荷特性等を考慮することにより、本発明の多量体に内包され得る物質を適切に選択できる。例えば、ポリペプチド部分としてＤｐｓを有する本発明の多量体の場合、Ｄｐｓは、４０〜６０ｎｍ^３（直径 約５ｎｍ）の程度の内腔を有する。したがって、このような多量体に内包され得る物質のサイズは、例えば６０ｎｍ^３以下、好ましくは４０ｎｍ^３以下、より好ましくは２０ｎｍ^３以下、さらにより好ましくは１０ｎｍ^３以下、最も好ましくは５ｎｍ^３以下であり得る。また、多量体における物質の取り込みに関与し得る領域中の電荷特性（例、正または負に荷電し得る側鎖を有するアミノ酸残基の種類および数）を変化させることにより、多量体の内腔中への物質の取り込みをより促進できることが報告されているので（例、Ｒ．Ｍ．Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｖｏｌ．１２６，ｐ．１３２８２を参照）、本発明においても、電荷特性が変化された領域を有する融合タンパク質の多量体を用いることができる。本発明の多量体に内包され得る物質としては、例えば、上述した標的物質と同様の無機材料が挙げられる。具体的には、本発明の多量体に内包され得る物質としては、上述したような金属材料やシリコン材料が挙げられる。より具体的には、このような物質としては、酸化鉄、ニッケル、コバルト、マンガン、リン、ウラン、ベリリウム、アルミニウム、硫化カドミウム、セレン化カドミウム、パラジウム、クロム、銅、銀、ガドリウム錯体、白金コバルト、酸化シリコン、酸化コバルト、酸化インジウム、白金、金、硫化金、セレン化亜鉛、カドミウムセレンが挙げられる。

【0060】

本発明の多量体の内腔中への物質の内包は、周知の方法により行うことができ、例えば、フェリチンまたはＤｐｓ等のフェリチン様タンパク質の多量体の内腔中への物質の内包方法（例、Ｉ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．，ｌｅｔｔ．，２００５．ｖｏｌ．３３，ｐ．１１５８を参照）と同様にして行うことができる。具体的には、ＨＥＰＥＳ緩衝液等の緩衝液中に、本発明の多量体（または本発明の融合タンパク質）および内包されるべき物質を共存させ、次いで適切な温度（例、０〜３７℃）で放置することにより、本発明の多量体の内腔中に物質を内包させることができる。

【0061】

本発明の多量体は、内腔中に物質を含む場合、異なる複数の種類（例、２種、３種、４種、５種または６種）の物質を含む、異なる複数の種類の多量体のセットとして提供されてもよい。例えば、本発明の多量体が２種の物質を含む２種の多量体のセットとして提供される場合、このようなセットは、各々別々に調製された、第１の物質を内包する第１の多量体と、第２の物質（第１の物質とは異なる）を内包する第２の多量体とを、組み合せることにより、得ることができる。上述したような融合タンパク質の多様なパターンと、内包物質の多様なパターンとを適宜組み合せることにより、非常に多様性に富む本発明の多量体を得ることができる。多量体についてはまた、国際公開第２０１２／０８６６４７号を参照することができる。

【0062】

（吸着方法）
本発明は、本発明のペプチド、本発明の融合タンパク質、または本発明の多量体と、ナノ炭素化合物とを接触させることを含む、ペプチド、タンパク質または多量体とナノ炭素化合物との吸着方法を提供する。

【0063】

本発明の吸着方法は、適切な水溶液（例、緩衝液）中で行うことができる。本発明のペプチドは、ナノ炭素化合物と強く結合することができる。本発明の融合タンパク質、および本発明の多量体もまた、本発明のペプチドを有するので、ナノ炭素化合物と強く結合することができる。したがって、本発明のペプチド、本発明の融合タンパク質、または本発明の多量体、およびナノ炭素化合物を用いることで、本発明の吸着方法を良好に行うことができる。ナノ炭素化合物としては、例えば、上述したものが挙げられる。

【0064】

本発明の吸着方法は、本発明のペプチド、本発明の融合タンパク質、または本発明の多量体をカラム等の支持体に固定して用いることにより、ナノ炭素化合物の精製に利用することができる。本発明の吸着方法はまた、ナノ炭素化合物をカラム等の支持体に固定して用いることにより、本発明のペプチド、本発明の融合タンパク質、または本発明の多量体の精製に利用することができる。本発明の吸着方法が、このような精製に用いられる場合、吸着物を支持体から遊離させる必要がある。この場合、遊離溶液中の塩濃度の変更、遊離剤としての本発明のペプチドまたはナノ炭素化合物の利用などにより、吸着物を支持体から遊離させることができる。

【0065】

（ナノ炭素化合物および標的物質を含む複合体およびその製造方法）
本発明はまた、本発明の融合タンパク質、または本発明の多量体を用いて、ナノ炭素化合物と標的物質とを接着させることを含む、ナノ炭素化合物および標的物質を含む複合体の製造方法を提供する。

【0066】

ナノ炭素化合物および標的物質を含む複合体の本発明の製造方法は、適切な水溶液（例、緩衝液）中で行うことができる。本発明の融合タンパク質、または本発明の多量体は、このような方法に用いられる場合、ナノ炭素化合物に結合し得る本発明のペプチドに加えて、標的物質に結合し得るペプチド部分を有する。これにより、本発明の融合タンパク質、または本発明の多量体がリンカーとして作用し、ナノ炭素化合物と標的物質とを接着することができる。したがって、ナノ炭素化合物および標的物質を含む複合体として、標的物質で被膜されたナノ炭素化合物を得ることができる。ナノ炭素化合物および標的物質としては、例えば、上述した材料が挙げられる。

【0067】

また、標的物質に結合し得るペプチド部分として、析出可能な標的物質に結合し得るペプチドを利用し、かつ、析出可能な標的物質が溶解された水溶液（例、緩衝液）を用いて、ナノ炭素化合物の表面に標的物質を析出させることで、標的物質で被膜されたナノ炭素化合物を得ることもできる。

【0068】

本発明はまた、本発明の融合タンパク質、または本発明の多量体を介して接着された、ナノ炭素化合物および標的物質を含む複合体を提供する。本発明の複合体は、上記方法により製造することができる。本発明の複合体は、好ましくは、上述したような標的物質で被膜されたナノ炭素化合物（被膜が、本発明の融合タンパク質、または本発明の多量体を介してなされたもの）である。

【0069】

一実施形態では、上述の方法により製造され得る本発明の複合体は、標的物質で被覆されたナノ炭素化合物である。好ましくは、このような複合体は、標的物質で被覆されたカーボンナノチューブである。より好ましくは、このような複合体は、金属材料またはシリコン材料で被膜されたカーボンナノチューブである。このような複合体が半導体材料として利用される場合、カーボンナノチューブは、好ましくは単層カーボンナノチューブである。このような複合体が導体材料として用いられる場合、カーボンナノチューブは、単層カーボンナノチューブまたは複層カーボンナノチューブのいずれであってもよい。金属材料としては、上述したような金属および金属化合物が挙げられるが、金属化合物が好ましく、金属の酸化物（例、酸化チタン、酸化亜鉛）がより好ましい。シリコン材料としては、上述したようなシリコンまたはシリコン化合物が挙げられるが、シリコン化合物が好ましく、シリコンの酸化物がより好ましい。したがって、上記複合体の製造に用いられる、本発明の融合タンパク質、または本発明の多量体は、好ましくは、このような標的物質に結合し得るペプチド部分を有する。

【0070】

本発明の複合体は、導体または半導体、あるいは光触媒活性または電気特性等に優れたデバイスおよび材料等の開発に有用である。例えば、本発明の複合体は、光電変換素子（例、色素増感太陽電池等の太陽電池）、水素発生素子、半導体メモリ素子の作製における材料または構成要素として、有用である。

【0071】

（多孔質構造体の製造方法）
本発明はまた、以下（１）（２）を含む、多孔質構造体の製造方法を提供する：
（１）本発明の多量体を用いて、ナノ炭素化合物、標的物質および本発明の多量体を含む複合体を作製すること；および
（２）得られた複合体から本発明の多量体を除去して、ナノ炭素化合物および標的物質から構成される多孔質構造体を得ること。

【0072】

工程（１）は、適切な水溶液（例、緩衝液）中で行うことができる。本発明の多量体は、このような方法に用いられる場合、ナノ炭素化合物に結合し得る本発明のペプチドに加えて、析出可能な標的物質に結合し得るペプチド部分を有する。これにより、ナノ炭素化合物に結合した本発明の多量体における、標的物質に結合し得るペプチド部分の周辺で標的物質が析出し、ナノ炭素化合物が標的物質で覆われた凝集体（凝集体中、本発明の多量体がナノ炭素化合物の周囲に散在する）が得られる。したがって、このような凝集体を、ナノ炭素化合物、標的物質および本発明の多量体を含む複合体として得ることができる。標的物質としては、析出可能な標的物質が好ましい。本発明の多量体は、内腔中に物質を有していても有していなくてもよいが、内腔中に物質を有することが好ましい。

【0073】

一実施形態では、上述の方法により作製され得る、ナノ炭素化合物、標的物質および本発明の多量体を含む複合体は、ナノ炭素化合物が標的物質で覆われた凝集体（凝集体中、本発明の多量体がナノ炭素化合物の周囲に散在する）である。好ましくは、このような複合体は、カーボンナノチューブが標的物質で覆われた凝集体（凝集体中、本発明の多量体がカーボンナノチューブの周囲に散在する）である。より好ましくは、このような複合体は、カーボンナノチューブが金属材料またはシリコン材料で覆われた凝集体（凝集体中、本発明の多量体がカーボンナノチューブの周囲に散在する）である。このような複合体が半導体材料として利用される場合、カーボンナノチューブは、好ましくは単層カーボンナノチューブである。このような複合体が導体材料として用いられる場合、カーボンナノチューブは、単層カーボンナノチューブまたは複層カーボンナノチューブのいずれであってもよい。金属材料としては、上述したような金属および金属化合物が挙げられるが、金属化合物が好ましく、金属の酸化物（例、酸化チタン、酸化亜鉛）がより好ましい。シリコン材料としては、上述したようなシリコンまたはシリコン化合物が挙げられるが、シリコン化合物が好ましく、シリコンの酸化物がより好ましい。したがって、上記複合体の作製に用いられる、本発明の多量体は、好ましくは、このような標的物質に結合し得るペプチド部分を有する。

【0074】

工程（２）は、工程（１）で得られた複合体から本発明の多量体を除去することにより、行うことができる。本発明の多量体の除去は、本発明の多量体を分解できる任意の処理により行われる。このような処理としては、例えば、焼成、酸処理、およびアルカリ処理が挙げられる。焼成は、例えば、大気下又は不活性ガス雰囲気下、５０℃〜８００℃程度、１０秒間〜１２時間程度の条件で行うことができる。複合体の焼成は、単一の温度で１回又は温度を変化させて２回以上行うこともできる。このような除去により、ナノ炭素化合物またはカーボンナノチューブの周囲が標的物質で覆われた凝集体（凝集体中、本発明の多量体が存在していた箇所に空孔部が形成される）が得られる。したがって、このような凝集体を、ナノ炭素化合物またはカーボンナノチューブおよび標的物質から構成される多孔質構造体として得ることができる。

【0075】

以下、多孔質構造体の製造方法の理解を促すため、図４Ａ〜Ｃに示される模式図に基づいて、上述の方法により得られる多孔質構造体を説明する。なお、図４Ａ〜Ｃに示される多孔質構造体１０は、あくまで模式的なものである。例えば、タンパク質を消滅し得る温度条件下で本発明の複合体を焼成することにより、本発明の多量体が存在していた部位に第１の空孔部３２が形成された多孔質構造体１０を得ることができる（図４Ａ、図４Ｂ）。第２の空孔部は、標的物質３０の析出過程および／または焼成過程において生じ得る空孔部を示している。本発明の複合体を構成する多量体の内腔中に物質（例、金属粒子３６）が内包されていた場合には、第１の空孔部３２中に物質（例、金属粒子３６）を残存させることができる（図４Ｃ）。本発明の多量体の内腔中に物質（例、金属粒子３６）が内包されており、かつ当該物質を溶融させた場合には、第１の空孔部３２の内側に当該物質からなる皮膜（例、金属皮膜３６ａ）を形成することができる（図４Ｃ）。このような多孔質構造体およびその製造方法については、例えば、国際公開第２０１３／０２２０５１号、国際公開第２０１２／０８６６４７号を参照することができる。このように作製された多孔質構造体は、導体または半導体、あるいは光触媒活性または電気特性等に優れたデバイスおよび素材等の開発に有用である。例えば、多孔質構造体は、光電変換素子（例、色素増感太陽電池等の太陽電池）、水素発生素子、半導体メモリ素子の作製における材料または構成要素として、有用である。

【実施例】

【0076】

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0077】

実施例１：カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）結合ペプチドのスクリーニング
ＣＮＴ結合ペプチドのスクリーニングはＰｈ．Ｄ．^ＴＭ−１２ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．、米国）を用いた。すなわち、複層カーボンナノチューブ（ＭＷＮＴ）が懸濁され０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ。以下、ＴＢＳ−Ｔと呼ぶ）２００μｌにＭ１３ファージライブラリ溶液（１μｌあたり１０^１０個のＭ１３ファージを含む。各ファージは１２個のアミノ酸からなるランダムなペプチド配列を提示する）１０μｌを添加し、４℃で１時間撹拌することで、ＭＷＮＴにファージを吸着させた。これを５００００ｒｐｍで１０分間遠心分離することで、上清に含まれるＭＷＮＴに吸着しなかったファージを除去し、ＭＷＮＴとファージを含む沈殿物を得た。その沈殿物を、ＴＢＳ−Ｔにより洗浄し、再び遠心により非吸着ファージを除去することでファージ／ＭＷＮＴ複合体を取得した。同様の洗浄操作を、Ｔｗｅｅｎ−２０の濃度を増加させながら繰り返すことで、ＭＷＮＴに強く吸着するファージを選択した。５回目の洗浄操作の後、ファージ／ＭＷＮＴ複合体を０．２Ｍ ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）に懸濁することでファージとＭＷＮＴを解離させ、５００００ｒｐｍで１０分間遠心分離することで両者を分離した。取得されたファージ懸濁液は１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）で中和し、４℃で保存した。以上の操作を１回のパニング操作とし、取得したファージを増幅して次のパニング操作に供した。合計５回のパニング操作を実施し、ＭＷＮＴに対する吸着能を持つファージを選択した。取得されたファージを単離し、その塩基配列を解読することで提示しているペプチドの配列を特定した。洗浄に用いたＴＢＳ−ＴのＴｗｅｅｎ２０濃度は１回目のスクリーニングでは０．２％（ｖ／ｖ）から０．５％（ｖ／ｖ）まで、２回目は０．３％（ｖ／ｖ）から１％（ｖ／ｖ）まで、３回目は０．５％（ｖ／ｖ）から３％（ｖ／ｖ）まで、４回目は０．７（ｖ／ｖ）％から５％（ｖ／ｖ）まで、５回目は３％（ｖ／ｖ）から１０％（ｖ／ｖ）まで増加させた。

【0078】

尚、ファージの単離、力価測定、ファージＤＮＡの回収およびファージの増幅はＰｈ．Ｄ．^ＴＭ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓに付属したプロトコールに従った（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｐｈ．Ｄ．^ＴＭ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ）。
ファージの単離や力価測定を行うために、このファージ溶液をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９に感染させプラークを形成させた。具体的には、濁度０．１まで、３７℃で培養されたＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９に、適当に希釈されたファージ液を０．０１ｍｌ加えた。その溶液を溶解させたＴＯＰ Ａｇａｒ（Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ １０．０ｇ／ｌ、Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５．０ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ５．０ｇ／ｌ、ａｇａｒｏｓｅ ７．０ｇ／ｌ）３ｍｌに加え、ＬＢ／ＩＴＰＧ／Ｘｇａｌ寒天培地にまき３７℃で一晩放置した。その後、形成された青色プラークに含まれるファージからＤＮＡを回収し、配列を決定すると共に、１ｍｌ ＬＢ培地（Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ １．０ｇ／ｌ、Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ０．５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ０．５ｇ／ｌ）を加え、ＴＯＰ Ａｇａｒごと全プラークを削り取って１５ｍｌ遠沈管に回収した。その懸濁液を５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することで、ファージが含まれる上清を回収した。

【0079】

ファージＤＮＡを回収するために、ＪＭ１０９が播種されたＬＢ培地１ｍｌに爪楊枝を用いてファージの青色プラークからファージを播種した。３７℃で５時間培養した後、ヨウ素溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、４Ｍ ＮａＩ）を用いてＤＮＡを回収し、配列（５’−ＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−３’）を用いてペプチドライブラリーをコードする塩基配列を解読した。

【0080】

その全プラークから回収されたファージ液に含まれるファージを増幅するために、ファージ液をＪＭ１０９が播種されたＬＢ培地２０ｍｌに加え、３７℃で５時間培養した。培養後、５０ｍｌ遠沈管に回収し、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を回収した。この溶液１８ｍｌにＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液（２０容量％ ＰＥＧ８０００、２．５Ｍ ＮａＣｌ）３ｍｌを加え、４℃で一晩静置した。放置後、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、沈殿を回収した。この沈殿をＴＢＴ０１緩衝液０．７ｍｌに懸濁した後、ＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液を０．３ｍｌ加え、４℃で１時間静置した。その後、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、沈殿をＴＢＳＡ（５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）１ｍｌに懸濁した。その後１００００ｒｐｍで１分間遠心分離し、ファージが含まれる上清を回収し、これを増幅されたファージ溶液として目的ファージのスクリーニングやファージの力価評価などに用いた。

【0081】

５回のパニングサイクル終了後、７つのＣＮＴ結合ペプチドＤＭ６（ＫＶＷＤＬＲＭＰＨＩＶＴ（配列番号１））、ＤＭ１１（ＡＬＳＳＨＹＩＭＫＳＨＫ（配列番号２））、ＤＭ８（ＫＶＷＰＮＭＦＡＮＥＮＩ（配列番号３））、ＤＭ１０（ＨＴＬＳＳＨＹＭＲＧＧＨ（配列番号４））、ＤＭ７（ＫＶＭＰＰＮＨＭＴＨＷＡ（配列番号５））、ＤＭ４（ＫＩＷＳＶＰＱＬＬＨＹＴ（配列番号６））、ＤＭ５（ＫＩＷＤＬＷＫＳＥＧＡＷ（配列番号７））を提示したファージを取得することができた。

【0082】

実施例２：ＣＮＴ結合ペプチドのＣＮＴへの結合能力評価
取得されたＣＮＴ結合ペプチドのＣＮＴへの結合能力を評価すべく、各ＣＮＴ結合ペプチドを提示したファージとＣＮＴを混合し、ＣＮＴに吸着したファージの量をｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）にて測定した。

【0083】

はじめに対照サンプルとなる既知のＣＮＴ結合ペプチドを提示したファージとして、Ｂ１ペプチド（ＨＷＫＨＰＷＧＡＷＤＴＬ（配列番号１５）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．，２００３，ｖｏｌ．２，ｐ．１９６．）を提示したファージを作製した。ファージライブラリーに含まれるＭ１３ファージのＤＮＡを鋳型として、５’−ＧＣＧｃｇｇｃｃｇＡＡＡＣＴＧＴＴＧＡＡＡＧＴＴＧ−３’（配列番号８）と、５’−ＧＣＧｃｇｇｃｃｇＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＡＧＡＧＴＧＴＣＣＣＡＴＧＣＡＣＣＣＣＡＴＧＧＡＴＧＣＴＴＣＣＡＧＴＧＡＧＡＧＴＧＡＧＡＡＴＡＧＡＡＡＧＧ−３’（配列番号９）を用いてＰＣＲを行った（小文字斜体は制限酵素ＥａｇＩの認識配列、１９〜５４位のヌクレオチド残基で表される塩基配列は、Ｂ１ペプチドをコードする）。得られた各ＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）で精製し、制限酵素ＤｐｎＩとＥａｇＩで消化した。制限酵素で消化されたＰＣＲ産物を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）を用いてセルフライゲーションさせた。そのＤＮＡを、形質転換能を持たせたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（タカラバイオ、日本）に導入し、これをＬＢＸＩプレート（１０ｇ／ｌ Ｂａｃｔｏ−ｔｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／ｌ Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／ｌ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＩＰＴＧ、４０ｍｇ／ｌ Ｘ−ｇａｌ、１５ｇ／ｌ ａｇａｒ）で培養し、青白判定を行うことで溶原菌を取得した。取得された溶原菌からファージを増幅し、以下の実験に用いた。

【0084】

ファージパニングによって得られたＣＮＴ結合ペプチド候補（Ｍ４からＭ１１と命名）およびＣＮＴへの吸着性が知られているＢ１ペプチドをそれぞれ提示したＭ１３ファージについて、ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）を指標としたＣＮＴ吸着能の評価をそれぞれ行った。すなわち、ＣＮＴ懸濁液５０μｌを４５０μｌのＴＢＳ−Ｔ（３％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０）で希釈した。ＣＮＴ希釈液に取得された各ファージ１０^１１個を添加し、４℃で１時間撹拌することで、ファージをＣＮＴに吸着させた。これを５００００ｒｐｍで１０分間遠心分離することでＣＮＴに吸着していない非吸着ファージを除去した。取得された沈殿物を、ＴＢＳ−Ｔ（３％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ−２０）により洗浄し、再び遠心により非吸着ファージを分離することでファージ／ＣＮＴ複合体を取得した。洗浄操作を計５回行った後、ファージ／ＣＮＴ複合体を０．２Ｍ ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）に懸濁することでファージとＣＮＴに解離させ、超遠心により両者を分離した。取得されたファージ懸濁液は１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）で中和した。取得したファージは適当に希釈し、ＪＭ１０９と共に溶解させたＴＯＰ Ａｇａｒ（Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ １０．０ｇ／ｌ、Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５．０ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ５．０ｇ／ｌ、ａｇａｒｏｓｅ ７．０ｇ／ｌ）３ｍｌに加え、ＬＢ／ＩＴＰＧ／Ｘｇａｌ寒天培地にまき３７℃で一晩放置することでプラークを形成させた。形成されたプラークの数を計測することで、単位溶液あたりのｐｆｕを求めた。

【0085】

その結果、今回取得されたファージは、いずれも高いＣＮＴ結合能力を示し、特にＭ６とＭ１１ペプチドを提示したファージはＢ１ペプチドを提示したファージと比較して４倍高いｐｆｕの値を示した。すなわち、今回得られたこれらのペプチドはＣＮＴ吸着能を持ち、従来のＣＮＴ結合ペプチドＢ１よりもその吸着力は強いことが示唆された（図１）。

【0086】

実施例３：ＣＮＴ結合ペプチドを提示したカゴ状タンパク質の構築
ＣＮＴ結合ペプチド（ＤＭ６，ＤＭ８，ＤＭ１０，あるいはＤＭ１１）がＣ末端に融合されたＬｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａの金属内包性カゴ状タンパク質Ｄｐｓ（それぞれＤｐｓ−ＤＭ６，Ｄｐｓ−ＤＭ８，Ｄｐｓ−ＤＭ１０，あるいはＤｐｓ−ＤＭ１１と呼ぶ）を下記の手順により構築した。Ｄｐｓは１２量体からなるタンパク質超分子であり、今回各サブユニットにＣＮＴ結合ペプチドを遺伝的に融合させることで高いＣＮＴ認識能力をもち、ナノ材料の創生に利用できる機能性タンパク質の構築が期待できた。

【0087】

はじめに、Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａのＤｐｓ遺伝子が搭載されたｐＥＴ２０（Ｋ．Ｉｗａｈｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．ｌｅｔｔ．，２００７，ｖｏｌ．１９，ｐ．３１０５を参照）を鋳型ＤＮＡとして、５’−ｔｔｔＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧ−３’（配列番号１０）と以下のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして組み合わせてＰＣＲを実施した。Ｄｐｓ−ＤＭ６構築には５’−ｔｔｔＧＧＡＴＣＣｔｔａＡＧＴＣＡＣＡＡＴＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＣＴＣＡＧＡＴＣＣＣＡＣＡＣＣＴＴｔｔｃｔａａｔｇｇａｇｃｔｔｔｔｃｃａａｇ−３’（配列番号１１）、Ｄｐｓ−ＤＭ８構築には５’−ｔｔｔＧＧＡＴＣＣｔｔａＡＡＴＡＴＴＣＴＣＡＴＴＡＧＣＡＡＡＣＡＴＡＴＴＡＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＴｔｔｃｔａａｔｇｇａｇｃｔｔｔｔｃｃａａｇ−３’（配列番号１２）。Ｄｐｓ−ＤＭ１０構築には５’−ｔｔｔＧＧＡＴＣＣｔｔａＡＴＧＣＣＣＣＣＣＣＣＧＣＡＴＡＴＡＡＴＧＡＧＡＡＣＴＡＡＧＡＧＴＡＴＧｔｔｃｔａａｔｇｇａｇｃｔｔｔｔｃｃａａｇ−３’（配列番号１３）。Ｄｐｓ−ＤＭ１１構築には５’−ｔｔｔＧＧＡＴＣＣｔｔａＣＴＴＡＴＧＣＧＡＣＴＴＣＡＴＡＡＴＡＴＡＡＴＧＡＧＡＡＧＡＡＡＧＣＧＣｔｔｃｔａａｔｇｇａｇｃｔｔｔｔｃｃａａｇ−３’（配列番号１４）をそれぞれ使用した。

【0088】

得られた各ＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）で精製し、制限酵素ＤｐｎＩとＢａｍＨＩで消化した。制限酵素で消化されたＰＣＲ産物を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）を用いてセルフライゲーションさせた。セルフライゲーションされたＰＣＲ産物をＥＣＯＳ^ＴＭ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（ニッポンジーン社、日本）に形質転換し、Ｃ末端にＣＮＴ結合ペプチドが融合されたＤｐｓをコードする遺伝子が搭載された発現プラスミド（ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−ＤＭ６、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−ＤＭ８、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−ＤＭ１０、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−ＤＭ１１）を保持したＢＬ２１（ＤＥ３）を構築した。その形質転換株からＷｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）を使って各ベクターを精製し、搭載された変異Ｄｐｓ遺伝子配列を確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、各変異Ｄｐｓの発現を確認でき、タンパク質発現用株を得ることができた。

【0089】

実施例４：ＣＮＴ結合ペプチドを提示したカゴ状タンパク質の精製
発現プラスミド（ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−ＤＭ６、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−ＤＭ８、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−ＤＭ１０、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−ＤＭ１１）のいずれかを保持したＢＬ２１（ＤＥ３）を５０ｍＬのＬＢ培地（１００ｍｇ／Ｌ アンピシリンを含む）にて３７℃で振とう培養した。培養開始２４時間後、得られた菌体を遠心分離（６０００ｒｐｍ、５分間）により回収し、５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０） １０ｍＬで懸濁した。次に、その懸濁液にＩｎｓｏｎａｔｏｒ２０１Ｍ（ＫＵＢＯＴＡ社、日本）を使い超音波パルス（１３０Ｗ）を５分間与えることで、菌体を破砕した。その溶液を６０００ｒｐｍで５分間、遠心分離し、上清画分を回収した。回収された溶液を６０℃で２０分間加熱し、加熱後は速やかに氷上で冷却した。冷却された溶液を６５００ｒｐｍで５分間、遠心分離し、再度、上清を回収（約１０ｍＬ）した。その溶液をディスクフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ ＧＰ ０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＵＳＡ）で粗い粒子を除去し、タンパク質粗抽出液を得た。

【0090】

続いて、そのタンパク質粗抽出液をそのタンパク質溶液からイオン交換クロマトグラフィーを用いて、目的タンパク質画分を精製した。すなわち、そのタンパク質粗抽出液を５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＬｏａｒｄ ２６／１０ Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ＵＳＡ）に注入した。そして、流速２．０ｍｌ／分、０ｍＭから５００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で塩濃度勾配をかけることで、分離精製を行い、各蛋白質に相当する画分を回収した。その後、限外ろ過膜（ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０、１０，０００ ＭＷＣＯ ＰＥＳ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＡＧ）を用いて濃縮し、タンパク質溶液の溶媒を水あるいは５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に置換した。溶液中のタンパク質濃度はＬｏｗｒｙ法により決定した。

【0091】

実施例５：ＣＮＴ結合ペプチドを提示したカゴ状タンパク質の形状評価
各ＣＮＴ結合ペプチドが、カゴ状タンパク質の多量体を形作る自己組織化能力を阻害しないことを確かめるために、各ＣＮＴ結合ペプチドを提示したカゴ状タンパク質をＴＥＭ解析した。３％リンタングステン酸（ＰＴＡ）染色されたサンプルをＴＥＭ解析した。

【0092】

その結果、Ｄｐｓ−ＤＭ６，Ｄｐｓ−ＤＭ８，Ｄｐｓ−ＤＭ１０，およびＤｐｓ−ＤＭ１１は、直径９ｎｍのカゴ状をしており、ＣＮＴ結合ペプチドが融合されたＤｐｓサブユニットは自己組織化し、１２量体を形成していることが示唆された（図２）。Ｄｐｓでは各サブユニットのＣ末端は１２量体の外部表面に提示されている。今回、各ＣＮＴ結合ペプチドはＤｐｓサブユニットのＣ末端に融合されているため、各ペプチドはカゴ状タンパク質の表面に提示されており、遊離ＣＮＴと作用できることが期待できる。

【0093】

実施例６：ＣＮＴ結合ペプチドを提示したカゴ状タンパク質と単層ＣＮＴの複合体形成（１）
ＣＮＴペプチドを提示したＤｐｓとしてＤｐｓ−ＤＭ６あるいはＤｐｓ−ＤＭ８と単層ＣＮＴとを含むリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．０）、０．６ｍｇ／ｍＬのＣＮＴペプチドを提示したＤｐｓ、０．２ｍｇ／ｍＬ ＣＮＴを各々終濃度で含む）を調製した。調製された溶液に、Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ４５０（Ｂｒａｎｓｏｎ社、ＵＳＡ）を用いて氷上で、３秒間隔で１秒間の超音波パルス処理（２００Ｗ、Ｄｕｔｙ ２０％）を合計５分間行った。超音波パルス処理されたＣＮＴペプチドを提示したＤｐｓ−ＣＮＴ混合溶液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分間）して、多数のＣＤＴ多量体がＣＮＴに結合したＣＮＴ／ＣＮＴペプチドを提示したＤｐｓ複合体を得た。結果を図３に示す。

【0094】

結果として、ＣＮＴペプチドを提示したＤｐｓとＣＮＴとの複合体（ＣＮＴ／ＣＮＴペプチドを提示したＤｐｓ複合体）が得られていることが確認できた。

【0095】

実施例７：比較実験に向けた既知ＣＮＴ結合ペプチドを提示したカゴ状タンパク質の構築
今回取得されたＣＮＴ結合ペプチドと既知のＣＮＴ結合ペプチドの性能を比較すべく、複層ＣＮＴ結合ペプチド（ＨＷＫＨＰＷＧＡＷＤＴＬ（配列番号１５）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．２００３，ｖｏｌ．２，１９６）、ＵＷ−１（ＬＬＡＤＴＴＨＨＲＰＷＴ（配列番号１６）、Ｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ，２００６，ｖｏｌ．１１０，ｐ．２３６２３）、ＵＷ−４（ＣＧＩＨＰＷＴＫＣ（配列番号１７）、Ｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ，２００６，ｖｏｌ．１１０，ｐ．２３６２３）がＣ末端に融合されたＬｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａの金属内包性カゴ状タンパク質Ｄｐｓ（それぞれＤＣ２，ＤＣ３，あるいはＤＣ４と呼ぶ）を下記の手順により構築した。

【0096】

はじめに、Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａのＤｐｓ遺伝子が搭載されたｐＥＴ２０（Ｋ．Ｉｗａｈｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．ｌｅｔｔ．，２００７，ｖｏｌ．１９，ｐ．３１０５を参照）を鋳型ＤＮＡとして、５’−ｔｔｔＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧ−３’（配列番号１０）と以下のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして組み合わせてＰＣＲを実施した。ＤＣ２構築には５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＣＣＣＡＴＧＣＡＣＣＣＣＡＴＧＧＡＴＧＴＴＴＣＣＡＡＴＧＴＴＣＴＡＡＴＧＧＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＧ−３’（配列番号１８）、ＤＣ３構築には５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＧＴＣＣＡＴＧＧＡＣＧＡＴＧＡＴＧＴＧＴＴＧＴＡＴＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＴＣＴＡＡＴＧＧＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＧ−３’（配列番号１９）、ＤＣ４構築には５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＣＡＴＴＴＴＧＴＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＡＴＡＣＣＡＣＡＴＴＣＴＡＡＴＧＧＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＧ−３’（配列番号２０）をそれぞれ使用した。

【0097】

得られた各ＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）で精製し、制限酵素ＤｐｎＩとＢａｍＨＩで消化した。制限酵素で消化されたＰＣＲ産物を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）を用いてセルフライゲーションさせた。セルフライゲーションされたＰＣＲ産物をＥＣＯＳ^ＴＭ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（ニッポンジーン社、日本）に形質転換し、Ｃ末端にＣＮＴ結合ペプチドが融合されたＤｐｓをコードする遺伝子が搭載された発現プラスミド（ｐＥＴ２０−ＤＣ２、ｐＥＴ２０−ＤＣ３、ｐＥＴ２０−ＤＣ４）を保持したＢＬ２１（ＤＥ３）を構築した。その形質転換株からＷｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）を使って各ベクターを精製し、搭載された変異Ｄｐｓ遺伝子配列を確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、各変異Ｄｐｓの発現を確認したところ、タンパク質発現用株を得ることができた。

【0098】

実施例８：ＣＮＴ結合ペプチドを提示したカゴ状タンパク質の精製
発現プラスミド（ｐＥＴ２０−ＤＣ２、ｐＥＴ２０−ＤＣ３、あるいはｐＥＴ２０−ＤＣ４）のいずれかを保持したＢＬ２１（ＤＥ３）を５０ｍＬのＬＢ培地（１００ｍｇ／Ｌ アンピシリンを含む）にて３７℃で振とう培養した。培養開始２４時間後、得られた菌体を遠心分離（６０００ｒｐｍ、５分間）により回収し、５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０） １０ｍＬで懸濁した。次に、その懸濁液にＩｎｓｏｎａｔｏｒ２０１Ｍ（ＫＵＢＯＴＡ社、日本）を使い超音波パルス（１３０Ｗ）を５分間与えることで、菌体を破砕した。その溶液を６０００ｒｐｍで５分間、遠心分離し、上清画分を回収した。回収された溶液を６０℃で２０分間加熱し、加熱後は速やかに氷上で冷却した。冷却された溶液を６５００ｒｐｍで５分間、遠心分離し、再度、上清を回収（約１０ｍＬ）した。その溶液をディスクフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ ＧＰ ０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＵＳＡ）で粗い粒子を除去し、タンパク質粗抽出液を得た。

【0099】

続いて、そのタンパク質粗抽出液をそのタンパク質溶液からイオン交換クロマトグラフィーを用いて、目的タンパク質画分を精製した。すなわち、そのタンパク質粗抽出液を５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＬｏａｒｄ ２６／１０ Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ＵＳＡ）に注入した。そして、流速２．０ｍｌ／分、０ｍＭから５００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で塩濃度勾配をかけることで、分離精製を行い、各蛋白質に相当する画分を回収した。その後、限外ろ過膜（ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０、１０，０００ ＭＷＣＯ ＰＥＳ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＡＧ）を用いて濃縮し、タンパク質溶液の溶媒を水あるいは５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に置換した。溶液中のタンパク質濃度はＬｏｗｒｙ法により決定した。

【0100】

その結果、ＤＣ３とＤＣ４は可溶画分に分取することはできた。しかし、ＤＣ２のタンパク質発現は確認できたものの、多くは不溶画分に分画され、透過型電子顕微鏡ではカゴ状を形成しておらず、複層ＣＮＴ結合ペプチド（ＨＷＫＨＰＷＧＡＷＤＴＬ（配列番号１５））の提示がＤｐｓのカゴ状形成を阻害し、タンパク質の正常な立体構造形成を阻害する可能性が示唆された。

【0101】

実施例９：ＣＮＴ結合ペプチドを提示したカゴ状タンパク質とＣＮＴの複合体形成（２）
ＣＮＴペプチドを提示したＤｐｓとしてＤｐｓ−ＤＭ６、Ｄｐｓ−ＤＭ８、ＤＣ３あるいはＤＣ４とＣＮＴとを含むリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．０）、０．６ｍｇ／ｍＬのＣＮＴペプチドを提示したＤｐｓ、０．２ｍｇ／ｍＬ ＣＮＴを各々終濃度で含む）を調製した。調製された溶液に、Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ４５０（Ｂｒａｎｓｏｎ社、ＵＳＡ）を用いて氷上で、３秒間隔で１秒間の超音波パルス処理（２００Ｗ、Ｄｕｔｙ ２０％）を合計５分間行った。超音波パルス処理されたＣＮＴペプチドを提示したＤｐｓ−ＣＮＴ混合溶液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分間）して、透過型電子顕微鏡にて吸着を確認した。今回ＣＮＴサンプルとして、シグマアルドリッチ社（米国）から販売されている単層ＣＮＴ（製品番号６９８６９５）、単層ＣＮＴ（製品番号７７３７３５）、あるいはＫＨ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（韓国）から販売されている単層ＣＮＴを各々用いた。

【0102】

結果として、ＤＭ６やＤＭ８を提示したＤｐｓはいずれのＣＮＴとも複合体を形成したが、ＤＣ３やＤＣ４は一部のＣＮＴとしか複合体を形成できなった（表２）。表中の○はタンパク質発現及びＣＮＴへの吸着が確認されたサンプル、×はタンパク質発現又はＣＮＴへの吸着のいずれかが確認されなかったサンプルを示す。このことは、今回取得されたペプチドが従来のペプチドは吸着できないＣＮＴへも吸着できることを示す。

【0103】

【表2】

【符号の説明】

【0104】

１０ 多孔質構造体
２０ カーボンナノチューブ
３０ 標的物質
３２ 第１の空孔部
３４ 第２の空孔部
３６ 金属粒子
３６ａ 金属皮膜
３８ 第３の空孔部

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]