特許 6688057 グラム染色用後染色試液及びグラム染色方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6688057

(24)【登録日】2020年4月7日

(45)【発行日】2020年4月28日

(54)【発明の名称】グラム染色用後染色試液及びグラム染色方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/04 20060101AFI20200421BHJP

   G01N 33/48 20060101ALI20200421BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/04

   G01N33/48 P

【請求項の数】6

【全頁数】10

(21)【出願番号】特願2015-234776(P2015-234776)

(22)【出願日】2015年12月1日

(65)【公開番号】特開2017-99328(P2017-99328A)

(43)【公開日】2017年6月8日

【審査請求日】2018年10月5日

(73)【特許権者】

【識別番号】000226862

【氏名又は名称】日水製薬株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100077562

【弁理士】

【氏名又は名称】高野 登志雄

(74)【代理人】

【識別番号】100096736

【弁理士】

【氏名又は名称】中嶋 俊夫

(74)【代理人】

【識別番号】100117156

【弁理士】

【氏名又は名称】村田 正樹

(74)【代理人】

【識別番号】100111028

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 博人

(72)【発明者】

【氏名】下郷 晶子

(72)【発明者】

【氏名】菓子田 充明

【審査官】 池上 京子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１５−５１６１４９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００３−１６９６９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 欧州特許第００７３６１０４（ＥＰ，Ｂ１）

【文献】 特表２０１３−５４０１０４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１４−１３２０３９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１２−２４１０１３（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／００−１／７０

Ｇ０１Ｎ ３３／００−３３／９８

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（Ａ）塩基性フクシン ０．００５〜０．２質量％、（Ｂ）炭素数１〜５のアルコール
５〜４０質量％、及び（Ｃ）ｐＨを４．５〜７．５にする緩衝剤を含有するグラム染色
用後染色試液。

【請求項2】

（Ｃ）緩衝剤が、ｐＨを５．０〜７．３にする緩衝剤である請求項１記載のグラム染色用後染色試液。

【請求項3】

さらに、（Ｄ）キレート剤を含有する請求項１又は２記載のグラム染色用後染色試液。

【請求項4】

（Ｄ）キレート剤が、アミノポリカルボン酸、芳香族又は脂肪族カルボン酸、ホスホン酸及びヒドロキシカルボン酸から選ばれるキレート剤である請求項３記載のグラム染色用後染色試液。

【請求項5】

（１）試料をクリスタルバイオレット又はビクトリアブルーを含有する前染色試液で処理する工程、（２）ヨウ素又はピクリン酸を含有する媒染試液で処理する工程、（３）極性有機溶媒を含有する脱色試液で処理する工程、並びに（４）請求項１〜４のいずれか１項記載のグラム染色用後染色試液で処理する工程、を含むことを特徴とするグラム染色方法。

【請求項6】

工程（１）と工程（２）の間に、炭酸塩水溶液又は炭酸水素塩水溶液で処理する工程を含む請求項５記載のグラム染色方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、グラム染色方法及びこの方法に用いる後染色試液に関する。

【背景技術】

【0002】

グラム染色法は、細菌を色素によって染め分ける方法の一つであり、細菌分類学の基礎になる重要な染色法である。細菌は、グラム染色によって２種類（グラム陽性、グラム陰性）に大別できる。
染色性の違いは細菌壁の構造の違いによる。グラム陽性菌とグラム陰性菌の間に見られる細胞壁の大きな違いは、この両者が生物学的に大きく違うことを反映しており、グラム染色は細菌の分類上、重要な手法といえる。

【0003】

グラム染色方法としては、試料をクリスタルバイオレットで処理して染色し（前染色処理：この段階ではグラム陽性、グラム陰性ともに紫色に染まる）、次いでヨウ素で処理し（媒染処理）、さらにエタノール溶液で脱色し、最後にサフラニン液やフクシン液で処理（後染色処理）する方法（Ｈｕｃｋｅｒの変法）が広く知られている。この方法ではグラム陽性菌は濃紫色、グラム陰性菌は、赤色に染色される。この方法は、嫌気性菌、Campylobacter spp. Helicobacter spp.などで染色性が弱く判定が困難である。
これらの染色が困難な菌を染色法を向上させる手段として、クリスタルバイオレット処理後に５％炭酸水素ナトリウムを添加する方法が開発された（バーミーの変法）。しかし、この方法では、染色のステップが多くなる、炭酸水素ナトリウムは長期保存で効果が低下するため頻回調製が必要である、染色液と炭酸水素ナトリウムの混合液は短期間に化学変化を起こして沈殿するので混合できない等の問題がある。

【0004】

一方、最初の染色用色素としてビクトリアブルーを用い、媒染試薬としてピクリン酸−エタノール液を用いる方法（西岡の方法）も開発された。しかし、この方法では、Helicobacter spp.などで染色性が悪く、後染色の染色性が弱いという問題があった。

【0005】

さらに、試料に陰イオン界面活性剤を添加し、メチレンブルーを添加した後クロロホルムで抽出し、クロロホルム相の着色の有無を観察する方法（特許文献１）、前染色試液としてクリスタルバイオレットと陰イオン界面活性剤を用する方法（特許文献２）が報告されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開平７−３１３１９２号公報

【特許文献2】特開２００３−１６９６９４号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

しかしながら、特許文献１及び２の方法によっても、フクシンによる染色性が弱いため、Helicobacter spp.などの一部の菌についての判定は困難であるという問題は解決されていない。
従って、本発明の課題は、フクシンによる後染色性を増強し、Helicobacter spp.などの菌も良好に染色できる新たなグラム染色法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

そこで本発明者は、従来、ほとんど着目されていなかった後染色処理について種々検討してきたところ、後染色試液として、塩基性フクシン、低級アルコールに加えて、ｐＨを
４．５〜７．５にする塩基を含有する試液を用いれば、後染色性が顕著に向上し、Helicobacter spp.などの菌も良好に染色できることを見出した。また、これにキレート剤を加えれば、後染色試液の長期保存安定性も向上することを見出し、本発明を完成した。

【0009】

すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔６〕を提供するものである。

【0010】

〔１〕（Ａ）塩基性フクシン、（Ｂ）低級アルコール、及び（Ｃ）ｐＨを４．５〜７．５にする塩基を含有するグラム染色用後染色試液。
〔２〕さらに、（Ｄ）キレート剤を含有する〔１〕記載のグラム染色用後染色試液。
〔３〕成分（Ａ）が、塩基性フクシンである〔１〕又は〔２〕記載のグラム染色用後染色試液。
〔４〕（Ｄ）キレート剤が、アミノポリカルボン酸、芳香族又は脂肪族カルボン酸、ホスホン酸及びヒドロキシカルボン酸から選ばれるキレート剤である〔２〕又は〔３〕記載のグラム染色用後染色試液。
〔５〕（１）試料をクリスタルバイオレット又はビクトリアブルーを含有する前染色試液で処理する工程、（２）ヨウ素又はピクリン酸を含有する媒染試液で処理する工程、（３）極性有機溶媒を含有する脱色試液で処理する工程、並びに（４）〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のグラム染色用後染色試液で処理する工程、を含むことを特徴とするグラム染色方法。
〔６〕工程（１）と工程（２）の間に、炭酸塩水溶液又は炭酸水素塩水溶液で処理する工程を含む〔５〕記載のグラム染色方法。

【発明の効果】

【0011】

本発明の後染色試液を用いれば、従来染色性が弱く、検出が困難であったHelicobacter
spp.などの菌も明確に染色できるため、広範囲のグラム陽性菌とグラム陰性菌との分割が可能である。また、キレート剤を含有する本発明の後染色剤は、長期保存しても沈殿等が生じることがなく、キット試薬として特に有用である。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】実施例１による染色結果を示す。

【図2】比較例１による染色結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本発明のグラム染色用後染色試液は、（Ａ）塩基性フクシン、（Ｂ）低級アルコール、及び（Ｃ）ｐＨを４．５〜７．５にする塩基を含有する。

【0014】

（Ａ）塩基性フクシンは、細胞核の染色用色素である。塩基性フクシンは、フクシンを含有する染色色素であり、通常ローズアニリン、バラローズアニリン、ニューフクシン、マゼンタ２など混合物が使用される。また、石炭酸フクシン液の希釈液であるパイフェル液も使用できる。

【0015】

後染色試液中の塩基性フクシン濃度は、染色性の点から０．００５〜０．２質量％が好ましく、０．００５〜０．１質量％がより好ましく、０．０２〜０．０４質量％がさらに好ましい。

【0016】

（Ｂ）低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等の炭素数１〜５のアルコールが挙げられるが、エタノールがより好ましい。低級アルコールは、染色性を高めるために使用されるものであり、後染色試液中の濃度は染色性の点から、１〜４０質量％が好ましく、５〜３０質量％がより好ましく、１０〜２０質量％がさらに好ましい。

【0017】

（Ｃ）ｐＨを４．５〜７．５にする塩基は、後染色試液のｐＨを４．５〜７．５に調整する塩基である。後染色試液のｐＨが４．５未満の場合には、染色性が十分でない。例えば、塩基性フクシン及び低級アルコール含有水溶液のｐＨは４．２程度であり、染色性が十分でない。また、後染色試液のｐＨが７．５を超えると、後染色試液の安定性が十分でなく、沈殿が生じる。より好ましい緩衝剤のｐＨは４．５〜７．５であり、さらに好ましくは５．０〜７．３であり、さらに好ましくは６．０〜７．０である。

【0018】

ｐＨを４．５〜７．５にする塩基としては、水酸化ナトリウム等のアルカリでもよいが、ｐＨを安定させる点からｐＨを４．５〜７．５にする緩衝剤が好ましい。当該緩衝剤としては、Ｂｉｓ（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）等のグッド緩衝剤、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等が挙げられ、中でもＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＭＥＳ、ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＰＢＳ等が好ましい。これらは１種又は２種以上を用いることができる。

【0019】

本発明の後染色試液には、さらに長期保存安定性を向上させる目的で（Ｄ）キレート剤を含有させることができる。キレート剤の添加により、４ヶ月以上の長期間沈殿等が生じることがない。
キレート剤としては、金属イオンをキレートする能力を有する化合物であればよく、例えばアミノポリカルボン酸、芳香族又は脂肪族カルボン酸、アミノ酸、エーテルポリカルボン酸、ホスホン酸、ヒドロキシカルボン酸、リン酸系等が挙げられる。このうち、アミノポリカルボン酸、芳香族又は脂肪族カルボン酸、ホスホン酸、ヒドロキシカルボン酸がより好ましい。

【0020】

アミノポリカルボン酸としては、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、シクロヘキサンジアミンテトラ酢酸（ＣＤＴＡ）、ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）、イミノジ酢酸（ＩＤＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノジ酢酸（ＨＩＭＤＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミントリ酢酸（ＥＤＴＡ−ＯＨ）及びグリコールエーテルジアミンテトラ酢酸（ＧＥＤＴＡ）又はこれらの塩が挙げられる。
芳香族又は脂肪族カルボン酸としては、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタール酸、アジピン酸、イタコン酸、アコニット酸、ピルビン酸、サリチル酸、アセチルサリチル酸、ヒドロキシ安息香酸、アミノ安息香酸、フタル酸、トリメリット酸、没食子酸、及びこれらの塩が挙げられる。
ホスホン酸としては、イミジノホスホン酸、アルキルジホスホン酸、１−ヒドロキシエタン−１，１−ジホスホン酸、及びこれらの塩が挙げられる。ヒドロキシカルボン酸としてはクエン酸、グルコン酸、酒石酸及びこれらの塩が挙げられる。

【0021】

後染色試液中のキレート剤の濃度は、長期保存安定性の点から、０．０１ｍＭ〜１００ｍＭが好ましく、０．０５ｍＭ〜１０ｍＭがより好ましく、０．１ｍＭ〜１ｍＭがさらに好ましい。

【0022】

後染色試液には、上記成分の他、水が含まれていてもよい。

【0023】

本発明の後染色試液を用いれば、従来染色性の良くなかったHelicobacter spp.等の菌も良好に染色できる。本発明の後染色試液を用いるグラム染色方法としては、（１）試料をクリスタルバイオレット又はビクトリアブルーを含有する前染色試液で処理する工程、（２）ヨウ素又はピクリン酸を含有する媒染試液で処理する工程、（３）極性有機溶媒を含有する脱色試液で処理する工程、並びに（４）前記本発明の後染色試液で処理する工程、を含むことを特徴とするグラム染色方法が挙げられる。
以下、各工程（１）〜（４）毎に説明する。

【0024】

工程（１）に用いられる試料は、被検細菌を含む試料である。試料は、例えばスライドガラス上に臨床検体や分離菌株を薄く均一に塗抹し、自然乾燥させた後、火炎固定またはメタノール固定した塗抹標本である。

【0025】

クリスタルバイオレット又はビクトリアブルーを含む前染色試液としては、クリスタルバイオレット又はビクトリアブルーを含有する水溶液が好ましい。クリスタルバイオレットは、前染色試液中に０．０５〜２質量％含有するのが好ましく、０．２〜０．６質量％含有するのがより好ましい。またビクトリアブルーは、前染色試液中に０．１〜０．２質量％含有するのが好ましい。

【0026】

前染色試液中には、さらに陰イオン界面活性剤、低級アルコール、緩衝剤等が含まれていてもよい。陰イオン界面活性剤としては、アミノ酸系陰イオン界面活性剤、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩等が挙げられる。低級アルコールとしては、エタノールが挙げられる。

【0027】

試料の前染色試液による処理は、例えば試料に前処理試液を添加し、室温で３０秒〜１分間反応させればよい。処理後、試料は水で洗浄する。

【0028】

工程（１）の終了後に、試料を、炭酸塩水溶液又は炭酸水素塩水溶液で処理するのが、染色性を向上させる点から好ましい。用いられる炭酸塩としては、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等が挙げられる。また、炭酸水素塩としては、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等が挙げられる。炭酸塩水溶液又は炭酸水素塩水溶液の濃度は、１〜１０質量％が好ましく、２〜８質量％がより好ましく、３〜７質量％がさらに好ましい。
炭酸塩水溶液又は炭酸水素塩水溶液による処理は、試料に、室温でこれらの水溶液を滴下すればよい。

【0029】

工程（２）は、ヨウ素又はピクリン酸を含有する媒染試液で処理する工程である。
ヨウ素を含有する媒染試液としては、ヨウ素−ヨウ化カリウム水溶液、ヨウ素−水酸化ナトリウム水溶液等が挙げられる。媒染試液中のヨウ素濃度は、０．１〜０．３質量％が好ましく、０．１５〜０．２５質量％がより好ましい。
ピクリン酸を含有する媒染試液としては、ピクリン酸−エタノール液等が挙げられる。媒染試液中のピクリン酸濃度は、１〜２質量％が好まししい。

【0030】

工程（２）は、例えば、試料に媒染試液を添加し、室温で３０秒〜１分間反応させればよい。反応後は、試料を水で洗浄する。

【0031】

工程（３）は、試料を極性有機溶媒を含有する脱色試液で処理する工程である。
極性有機溶媒としては、アルコール、ケトン、これらの混合溶媒が挙げられる。アルコールとしては、炭素数１〜４のアルコール、例えばエタノール、プロパノール、イソプロパノール等が挙げられる。ケトンとしては、アセトン、メチルエチルケトン等が挙げられる。混合溶媒としてはエタノール−アセトン混合溶液が挙げられる。また、エタノールやアセトンの溶液は、８０％以上の水溶液であってもよい。

【0032】

工程（３）は、試料に極性有機溶媒を添加し、室温で３０秒〜１分間反応させればよい。反応後は、水で洗浄する。

【0033】

工程（４）は、試料を前記本発明の後染色試液で処理する工程である。工程（４）は、例えば、試料に後染色試液を添加し、室温で３０秒〜１分間反応させればよい。反応後は、水で洗浄する。

【0034】

本発明のグラム染色方法によれば、従来染色性の弱かったHelicobacter spp.、
Campylobacter spp.、Legionella spp.、Haemophilus spp.、嫌気性菌等の菌も明確に染色できる。

【実施例】

【0035】

実施例１及び比較例１
（１）試料の調製
グラム染色で難染色性菌といわれるHelicobacter pylori（純培養菌）１菌株を用いてスライドガラスに塗抹し、自然乾燥させた後、火炎固定した塗抹標本を試料とした。

【0036】

（２）試液の調製
（前染色試液）
フェイバーＧ「ニッスイ」染色液Ａ（０．２％ビクトリアブルー溶液）（日水製薬製品）を用いた。

【0037】

（媒染、脱色試液）
フェイバーＧ「ニッスイ」脱色液（２％ピクリン酸エタノール溶液）（日水製薬製品）を用いた。

【0038】

（後染色試液）
表１に示す試液を用いた。

【0039】

【表1】

【0040】

比較例として、フェイバーＧ「ニッスイ」脱色液Ｂ（０．０４％フクシン溶液）（日水製薬製品）を用いた。

【0041】

（３）染色処理
１）前染色試液を試料上に満載し、１分間染色後、流水で穏やかに水洗浄した。
２）媒染、脱色試液を試料上に満載し、１分間反応後、流水で穏やかに水洗浄した。
３）後染色試液を試料上に満載し、１分間染色後、流水で穏やかに水洗浄した。
４）試料を自然乾燥後、１０００倍の倍率で、鏡検した。

【0042】

（４）結果
染色結果を図１〜図２に示す。

【0043】

図１〜図２から明らかなように、グラム染色で難染色性菌といわれるHelicobacter pyloriの染色像において、実施例１は、比較例１に比べて、赤く鮮明に染色されており、
Helicobacter pyloriの示す、特徴的ならせん状の形態が明瞭に確認できた。

【0044】

実施例２（後染色試液のｐＨ）
実施例１の後染色試液において、ｐＨ調整剤（ＨＥＰＥＳ）を変更した以外は、同様の操作により、Helicobacter pyloriのグラム染色を行った。その結果を表２に示す。

【0045】

【表2】

【0046】

表２より、後染色試液のｐＨを４．５〜７．５の範囲とすることにより染色性が向上した。

【0047】

また、ｐＨ４．５〜７．５にした場合でも緩衝剤を用いた場合はｐＨが安定し、安定した染色性が得られる。
さらに、キレート剤の添加により、後染色試液が４ヶ月安定であり、沈殿等が発生しなかった。

【0048】

実施例３（後染色試液のフクシン濃度）
実施例１の後染色試液において、フクシン濃度を変化させて、Helicobacter pyloriの染色性を検討した。その結果、表３に示すようにフクシン濃度は０．００５〜０．２質量％の範囲で染色性が良好であった。

【0049】

【表3】

【0050】

実施例４（後染色試液のアルコール濃度）
実施例１の後染色試液において、エタノール濃度を変化させて、Helicobacter pyloriの染色性を検討した。その結果、表４に示すように、エタノール濃度１０〜４０質量％で良好な染色性が得られた。

【0051】

【表4】

【0052】

実施例５（後染色試液のキレート剤の種類及び含有量）
実施例１の後染色試液において、キレート剤の種類及び濃度を変化させて、Helicobacter pyloriの染色性を検討した。その結果、表５に示すようにキレート剤の種類によらず、良好な染色性が得られた。

【0053】

【表5】

【図1】

【図2】