特許 6688551 三重特異性結合タンパク質と使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6688551

(24)【登録日】2020年4月8日

(45)【発行日】2020年4月28日

(54)【発明の名称】三重特異性結合タンパク質と使用方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20200421BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20200421BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20200421BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20200421BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20200421BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20200421BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20200421BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20200421BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20200421BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20200421BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20200421BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20200421BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20200421BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20200421BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20200421BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20200421BHJP

   A61P 33/00 20060101ALI20200421BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20200421BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20200421BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20200421BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20200421BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20200421BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20200421BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20200421BHJP

   A61K 38/10 20060101ALI20200421BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20200421BHJP

   C07K 16/18 20060101ALN20200421BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20200421BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/46

   C12N15/62 ZZNA

   C07K19/00

   C12N15/63 Z

   C12N15/13

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   A61P35/00

   A61P29/00

   A61P37/02

   A61P37/06

   A61P31/00

   A61P31/12

   A61P37/08

   A61P33/00

   A61P43/00 121

   A61K45/00

   A61K48/00

   A61K31/7088

   A61K35/76

   A61K35/12

   A61K39/395 N

   A61K38/10

   !C07K16/28

   !C07K16/18

   !C12P21/08

【請求項の数】12

【全頁数】45

(21)【出願番号】特願2018-512836(P2018-512836)

(86)(22)【出願日】2016年5月20日

(65)【公表番号】特表2018-517431(P2018-517431A)

(43)【公表日】2018年7月5日

(86)【国際出願番号】US2016033644

(87)【国際公開番号】WO2016187594

(87)【国際公開日】20161124

【審査請求日】2019年5月17日

(31)【優先権主張番号】62/165,153

(32)【優先日】2015年5月21日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/165,833

(32)【優先日】2015年5月22日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/305,088

(32)【優先日】2016年3月8日

(33)【優先権主張国】US

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】517403846

【氏名又は名称】ハープーン セラピューティクス，インク．

(74)【代理人】

【識別番号】100082072

【弁理士】

【氏名又は名称】清原 義博

(72)【発明者】

【氏名】ボイエルレ，パトリック

(72)【発明者】

【氏名】イブニン，ルーク

(72)【発明者】

【氏名】ゲノ，ジャンマリー

(72)【発明者】

【氏名】ラマクリシュナン，ヴァニタ

(72)【発明者】

【氏名】ウェシェ，ホルガ―

【審査官】 上村 直子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１４／１５１９１０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００５−５０１５１７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１４−５１４３１４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００７−５３５９１５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Drug Discovery Today，２０１５年，Vol.20, No.5，p.588-594，Available online 7 March 2015

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １６／００−１６／４６

Ｃ０７Ｋ １９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

三重特異性抗原結合タンパク質であって、
ここで、前記三重特異性抗原結合タンパク質は、
（ａ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む第１のドメイン（Ａ）；
（ｂ）ヒト血清アルブミンと結合する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む第２のドメイン（Ｂ）；および、
（ｃ）ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２、またはＭＳＬＮである標的腫瘍抗原に特異的に結合するｓｄＡｂを含む第３のドメイン（Ｃ）を含み、
ここで、ドメインは、Ｈ_２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨの順序で、あるいはリンカーＬ１とＬ２によって、結合され、前記三重特異性抗原結合タンパク質は約６０ｋＤａ未満である、三重特異性抗原結合タンパク質。

【請求項2】

第１のドメインは、ムロモナブ−ＣＤ３（ＯＫＴ３）、オテリキシズマブ（ＴＲＸ４）、テプリズマブ（ＭＧＡ０３１）、ビジリズマブ（Ｎｕｖｉｏｎ）、ＳＰ３４、Ｘ３５、ＶＩＴ３、ＢＭＡ０３０（ＢＷ２６４／５６）、ＣＬＢ−Ｔ３／３、ＣＲＩＳ７、ＹＴＨ１２．５、Ｆ１１１−４０９、ＣＬＢ−Ｔ３．４．２、ＴＲ−６６、ＷＴ３２、ＳＰｖ−Ｔ３ｂ、１１Ｄ８、ＸＩＩＩ−１４１、ＸＩＩＩ−４６、ＸＩＩＩ−８７、１２Ｆ６、Ｔ３／ＲＷ２−８Ｃ８、Ｔ３／ＲＷ２−４Ｂ６、ＯＫＴ３Ｄ、Ｍ−Ｔ３０１、ＳＭＣ２、Ｆ１０１．０１、ＵＣＨＴ−１、およびＷＴ−３１からなる群から選択された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項１に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。

【請求項3】

第１のドメインはヒト化またはヒトである、請求項１に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。

【請求項4】

リンカーＬ１とＬ２は各々、（ＧＳ）_ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）、（ＧＧＳ）_ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０）、（ＧＧＧＳ）_ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）、（ＧＧＳＧ）_ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２）、（ＧＧＳＧＧ）_ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３）、あるいは、（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４）から独立して選択され、ここで、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、あるいは１０である、請求項１に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。

【請求項5】

リンカーＬ１とＬ２は、各々独立して（ＧＧＧＧＳ）_４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５）または（ＧＧＧＧＳ）_３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６）である、請求項１に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。

【請求項6】

（ｉ）請求項１の三重特異性抗原結合タンパク質、および、（ｉｉ）薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。

【請求項7】

第１のドメインはＣＤ３ε（イプシロン）に特異的である、請求項１に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。

【請求項8】

第１のドメインはカニクイザルのＣＤ３との交差反応性を有する、請求項１に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。

【請求項9】

第３のドメインはＥＧＦＲに特異的に結合する、請求項１に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。

【請求項10】

第３のドメインはＰＳＭＡに特異的に結合する、請求項１に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。

【請求項11】

第３のドメインはＨＥＲ２に特異的に結合する、請求項１に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。

【請求項12】

第３のドメインはＭＳＬＮに特異的に結合する、請求項１に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

＜相互参照＞
本出願は、２０１６年３月８日に出願された米国仮特許出願６２／３０５，０８８号；２０１５年５月２２日に出願された米国仮特許出願６２／１６５，８３３号；および、２０１５年５月２１日に出願された米国仮特許出願６２／１６５，１５３号の利益を主張し、文献はすべて参照により全体として本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によって本明細書に組み込まれる配列表を含んでいる。２０１６年５月１７日に作成された上記のＡＳＣＩＩコピーは、４７５１７＿７０１＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、１２８，５１６バイトのサイズである。

【背景技術】

【0003】

個々の細胞あるいは特定細胞型の選択的な破壊は、様々な臨床設定においてしばしば望まれることである。例えば、腫瘍細胞を特異的に破壊しつつ、健康な細胞と組織を無傷のまま損傷を与えずに残すことが癌治療の主要な目的である。そのような１つの方法は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞あるいは細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）などの免疫エフェクター細胞に、腫瘍細胞を攻撃および破壊させるために、腫瘍に対する免疫反応を引き起こすことによるものである。

【発明の概要】

【0004】

三重特異性抗原結合タンパク質、その医薬組成物、同様に、そのような三重特異性抗原結合タンパク質を作るための核酸、組換え発現ベクター、および宿主細胞、ならびに、疾患、障害、あるいは疾病の処置のための使用の方法が本明細書で提供される。１つの態様において、三重特異性抗原結合タンパク質が本明細書に記載され、前記タンパク質は（ａ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１のドメイン（Ａ）；（ｂ）半減期拡張ドメインである第２のドメイン（Ｂ）；および、（ｃ）標的抗原に特異的に結合する第３のドメイン（Ｃ）を含み、ここで、ドメインは、リンカーＬ１とＬ２によって、Ｈ_２Ｎ−（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、Ｈ_２Ｎ−（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨ、Ｈ_２Ｎ−（Ｂ）−（Ａ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、Ｈ_２Ｎ−（Ｂ）−（Ｃ）−（Ａ）−ＣＯＯＨ、Ｈ_２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨ、あるいは、Ｈ_２Ｎ−（Ｃ）−（Ａ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨの順序で結合される。

【0005】

さらにある態様では、三重特異性抗原結合タンパク質が本明細書で提供され、ここで、前記タンパク質は、（ａ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１のドメイン（Ａ）；（ｂ）半減期拡張ドメインである第２のドメイン（Ｂ）；および、（ｃ）標的抗原に特異的に結合する第３のドメイン（Ｃ）を含み、ここで、ドメインは、リンカーＬ１とＬ２によって、Ｈ_２Ｎ−（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨ、Ｈ_２Ｎ−（Ｂ）−（Ａ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、Ｈ_２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨの順序で結合される。

【0006】

さらに、ある態様では、三重特異性抗原結合タンパク質が本明細書で提供され、ここで、前記タンパク質は、（ａ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１のドメイン（Ａ）；（ｂ）半減期拡張ドメインである第２のドメイン（Ｂ）；および、（ｃ）標的抗原に特異的に結合する第３のドメイン（Ｃ）を含み、ここで、ドメインは、リンカーＬ１とＬ２によって、Ｈ_２Ｎ−（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、Ｈ_２Ｎ−（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨ、Ｈ_２Ｎ−（Ｂ）−（Ａ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、Ｈ_２Ｎ−（Ｂ）−（Ｃ）−（Ａ）−ＣＯＯＨ、Ｈ_２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨ、またはＨ_２Ｎ−（Ｃ）−（Ａ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨの順序で結合し、および、第１のドメインは、１００ｎＭを超えるＫ_ＤでヒトＣＤ３に結合する。

【0007】

さらに、ある態様では、三重特異性抗原結合タンパク質が本明細書で提供され、ここで、前記タンパク質は、（ａ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１のドメイン（Ａ）；（ｂ）半減期拡張ドメインである第２のドメイン（Ｂ）；および、（ｃ）標的抗原に特異的に結合する第３のドメイン（Ｃ）を含み、ここで、ドメインは、リンカーＬ１とＬ２によって、Ｈ_２Ｎ−（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、Ｈ_２Ｎ−（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨ、Ｈ_２Ｎ−（Ｂ）−（Ａ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、Ｈ_２Ｎ−（Ｂ）−（Ｃ）−（Ａ）−ＣＯＯＨ、Ｈ_２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨ、またはＨ_２Ｎ−（Ｃ）−（Ａ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨの順序で結合し、および、タンパク質は５５ＫＤａ未満の分子量を有する。

【0008】

さらに、ある態様では、三重特異性抗原結合タンパク質が本明細書で提供され、ここで、前記タンパク質は、（ａ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１のドメイン（Ａ）；（ｂ）半減期拡張ドメインである第２のドメイン（Ｂ）；および、（ｃ）標的抗原に特異的に結合する第３のドメイン（ｃ）を含み、ここで、ドメインは、リンカーＬ１とＬ２によって、Ｈ_２Ｎ−（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、Ｈ_２Ｎ−（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨ、Ｈ_２Ｎ−（Ｂ）−（Ａ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、Ｈ_２Ｎ−（Ｂ）−（Ｃ）−（Ａ）−ＣＯＯＨ、Ｈ_２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨ、またはＨ_２Ｎ−（Ｃ）−（Ａ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨの順序で結合し、および、Ｂは、血清アルブミンに結合する単一ドメイン抗体を含む。

【0009】

三重特異性抗原結合タンパク質の様々な実施形態も本明細書で提供され、単独で、または組み合わせて、本明細書に記載される任意の態様について企図される。いくつかの実施形態において、第１のドメインは、各々がヒトＣＤ３に特異的に結合することができる、可変軽鎖と可変重鎖を含む。いくつかの実施形態において、可変軽鎖はλ（ラムダ）軽鎖である。いくつかの実施形態において、可変軽鎖はκ（カッパ）軽鎖である。いくつかの実施形態において、第１のドメインはヒトＣＤ３に特異的な単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態において、第１のドメインはＣＤ３ε（イプシロン）に特異的である。いくつかの実施形態において、第１のドメインはＣＤ３δ（デルタ）に特異的である。いくつかの実施形態において、第１のドメインはＣＤ３γ（ガンマ）に特異的である。いくつかの実施形態において、第１のドメインは、ムロモナブ−ＣＤ３（ＯＫＴ３）、オテリキシズマブ（ＴＲＸ４）、テプリズマブ（ＭＧＡ０３１）、ビジリズマブ（Ｎｕｖｉｏｎ）、ＳＰ３４、Ｘ３５、ＶＩＴ３、ＢＭＡ０３０（ＢＷ２６４／５６）、ＣＬＢ−Ｔ３／３、ＣＲＩＳ７、ＹＴＨ１２．５、Ｆ１１１−４０９、ＣＬＢ−Ｔ３．４．２、ＴＲ−６６、ＷＴ３２、ＳＰｖ−Ｔ３ｂ、１１Ｄ８、ＸＩＩＩ−１４１、ＸＩＩＩ−４６、ＸＩＩＩ−８７、１２Ｆ６、Ｔ３／ＲＷ２−８Ｃ８、Ｔ３／ＲＷ２−４Ｂ６、ＯＫＴ３Ｄ、Ｍ−Ｔ３０１、ＳＭＣ２、Ｆ１０１．０１、ＵＣＨＴ−１、およびＷＴ−３１からなる群から選択された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。いくつかの実施形態において、第１のドメインはヒト化されるか、あるいはヒトである。いくつかの実施形態において、第１のドメインは、ＣＤ３発現細胞上でＣＤ３に対して１０００ｎＭ以下のＫ_Ｄ結合を有する。いくつかの実施形態において、第１のドメインは、ＣＤ３発現細胞上でＣＤ３に対して１００ｎＭ以下のＫ_Ｄ結合を有する。いくつかの実施形態において、第１のドメインは、ＣＤ３発現細胞上でＣＤ３に対して１０ｎＭ以下のＫ_Ｄ結合を有する。いくつかの実施形態において、第１のドメインはカニクイザルのＣＤ３との交差反応性を有する。いくつかの実施形態において、第１のドメインは、本明細書で提供されるアミノ酸配列を含む。

【0010】

いくつかの実施形態において、第２のドメインはヒト血清アルブミンと結合する。いくつかの実施形態において、第２のドメインはｓｃＦｖ、可変重鎖ドメイン（ＶＨ）、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）、単一ドメイン抗体、ペプチド、リガンド、あるいは小分子を含む。いくつかの実施形態において、第２のドメインはｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態において、第２のドメインはＶＨドメインを含む。いくつかの実施形態において、第２のドメインはＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態において、第２のドメインは単一ドメイン抗体を含む。いくつかの実施形態において、第２のドメインはペプチドを含む。いくつかの実施形態において、第２のドメインはリガンドを含む。いくつかの実施形態において、第２のドメインは小分子実体を含む。

【0011】

いくつかの実施形態において、第３のドメインは、標的抗原に特異的に結合するｓｃＦｖ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、非Ｉｇドメイン、リガンド、ノッチン、あるいは小分子実体を含む。いくつかの実施形態において、第３のドメインは細胞表面分子に特異的である。いくつかの実施形態において、第３のドメインは腫瘍抗原に特異的である。

【0012】

いくつかの実施形態において、リンカーＬ１とＬ２はペプチドリンカーである。いくつかの実施形態において、リンカーＬ１とＬ２は独立して約２０以下のアミノ酸残基からなる。いくつかの実施形態において、リンカーＬ１とＬ２は各々、（ＧＳ）_ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）、（ＧＧＳ）_ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０）、（ＧＧＧＳ）_ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）、（ＧＧＳＧ）_ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５２）、（ＧＧＳＧＧ）_ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３）、あるいは、（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４）から独立して選択され、ここで、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、あるいは１０である。いくつかの実施形態において、リンカーＬ１とＬ２は、各々独立して（ＧＧＧＧＳ）_４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５）または（ＧＧＧＧＳ）_３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６）である。いくつかの実施形態において、リンカーＬ１とＬ２は化学的リンカーである。

【0013】

いくつかの実施形態において、第１のドメインはタンパク質のＮ末端にある。いくつかの実施形態において、第２のドメインはタンパク質のＮ末端にある。いくつかの実施形態において、第３のドメインはタンパク質のＮ末端にある。いくつかの実施形態において、第１のドメインはタンパク質のＣ末端にある。いくつかの実施形態において、第２のドメインはタンパク質のＣ末端にある。いくつかの実施形態において、第３のドメインはタンパク質のＣ末端にある。

【0014】

いくつかの実施形態において、タンパク質は約８０ＫＤａ未満である。いくつかの実施形態において、タンパク質は約５０〜約７５ＫＤａである。いくつかの実施形態において、タンパク質は約５０ＫＤａ未満である。いくつかの実施形態において、タンパク質は約４０ＫＤａ未満である。いくつかの実施形態において、タンパク質は約２０〜約４０ＫＤａである。いくつかの実施形態において、タンパク質は少なくとも約５０時間の消失半減期を有する。いくつかの実施形態において、タンパク質は少なくとも約１００時間の消失半減期を有する。いくつかの実施形態において、タンパク質は、同じ標的抗原へのＩｇＧと比較して、組織への浸透性を増加させた。

【0015】

さらに、別の態様において、上記の実施形態のいずれか１つに係る三重特異性抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドも本明細書で提供される。別の態様では、記載されたポリヌクレオチドを含むベクターが本明細書で提供される。別の態様において、記載されたベクターで形質転換された宿主細胞が本明細書で提供される。

【0016】

さらに別の態様において、上記の実施形態のいずれかの三重特異性抗原結合タンパク質、上記の実施形態のいずれかの三重特異性抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、記載されたポリヌクレオチドを含むベクター、あるいは上記の実施形態のいずれかのベクターで形質転換された宿主細胞、および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物が本明細書で提供される。

【0017】

さらに、本明細書に記載される態様と実施形態のいずれかに係る三重特異性抗原結合タンパク質の産生のプロセスも本明細書で提供され、上記プロセスは、タンパク質の発現を可能にする条件下で本明細書に記載される任意の三重特異性抗原結合タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターで形質転換されたかトランスフェクトされた宿主を培養する工程と、培養物から生成されたタンパク質を回収および精製する工程とを含む。

【0018】

さらに、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的疾患、自己免疫性疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫性反応、移植片対宿主疾患、あるいは宿主対移植片疾患の処置改善のための方法も本明細書に記載され、該方法は、そのような処置または改善を必要とする被験体に上記の実施形態のいずれかの三重特異性抗原結合タンパク質を投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、被験体はヒトである。いくつかの実施形態において、方法はさらに、本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質と組み合わせて薬剤を投与する工程を含む。

【0019】

＜参照による組み込み＞
本明細書で言及される全ての出版物、特許、および特許出願は、あたかも個々の出版物、特許、または特許出願が引用によって組み込まれるよう具体的かつ個別に示されるかのような同程度まで引用により本明細書に組み込まれる。

【図面の簡単な説明】

【0020】

本発明の新規な特徴は、特に添付の請求項で説明されている。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が用いられる実施形態を説明する以下の詳細な説明と、以下の添付図面とを引用することによって得られるであろう。

【図1】典型的な三重特異性抗原結合タンパク質の略図であり、タンパク質は抗ＣＤ３ε単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）と抗ＨＳＡ可変重鎖領域を含む不変のコアエレメントと、ＶＨ、ｓｃＦｖ、非Ｉｇ結合剤、あるいはリガンドであり得る可変標的結合ドメインとを有する。

【図2】最適な組織への浸透のために構築された追加の典型的な三重特異性抗原結合タンパク質の略図である。図２の左は、そのすべてのドメインのための単一ドメイン抗体フラグメントを含む典型的な三重特異性抗原結合タンパク質である。図２の真ん中は、標的抗原に結合するノッチンを含む典型的な三重特異性抗原結合タンパク質である。図２の右は、標的抗原に結合する天然のリガンドを含む典型的な三重特異性抗原結合タンパク質である。

【図3】三重特異性抗原結合タンパク質に小分子実体結合剤を結合させる概略図である。三重特異性抗原結合タンパク質はその標的抗原結合ドメインとしてソルターゼ認識配列を含む。ソルターゼとグリシンが結合した小分子結合剤でタンパク質をインキュベートする際、ソルターゼは認識部位上に小分子結合剤を連結するか、抱合する。図はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０として「ＬＰＥＴＧＧ」を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７として「ＬＰＥＴＧ」を開示する。

【図4】これらの三重特異性の抗原結合分子の３つのドメインを配置することができる、６つの様々な方法の概略図である。

【図5】ＢｉＴＥ分子（Ｌｕｔｔｅｒｂｕｅｓｅ ｅｔ ａｌ． ２００７． ＰＮＡＳ １０７： １２６０５−１２６１０からのＥＧＦＲ標的化ＢｉＴＥとＰＳＭＡ標的化ＢｉＴＥパソツキシズマブ（ｐａｓｏｔｕｘｉｚｕｍａｂ））の能力を、腫瘍細胞を死滅させるように初代ヒトＴ細胞を誘発する三重特異性分子を含むＥＧＦＲおよびＰＳＭＡ標的化ＶＨドメインの能力と比較する。

【図6】ＥＧＦＲ標的化ＶＨドメインを含む三重特異性分子の６つの起こり得る構成がすべて、ヒト腫瘍細胞株ＮＣＩ−１５６３を死滅させるようにＴ細胞を誘発することができることを示す。実験は、陽性対照としてＥＧＦＲ標的化ＢｉＴＥを用いて、ヒト血清アルブミンがない状態（左側）とある状態（右側）で行われた。

【図7】ヒト腫瘍細胞株２２Ｒｖ１を死滅させるようにＴ細胞を誘発するためにＰＳＭＡ標的化ＶＨドメインを含む三重特異性分子の５つの起こり得る構成の能力を評価する。実験は、陽性対照としてＰＳＭＡ標的化ＢｉＴＥを用いて、ヒト血清アルブミンがない状態（左側）とある状態（右側）で行われた。さらに、ＰＳＭＡ標的化ｓｃＦｖを備えたＰＳＭＡ標的化三重特異性分子の活性が示されている。

【図8】三重特異性分子が、抗ＣＤ３ε単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）と抗ＨＳＡ可変重鎖領域を含む不変のコアエレメントと、ｓｃＦｖでありうる可変標的結合ドメインとからなり得ることを示す。

【図9】腫瘍標的化のための抗体に由来するドメインとは対照的に、ｆｙｎｏｍｅｒを使用する三重特異性分子が腫瘍細胞を死滅させるようにＴ細胞を誘発することができるということを実証する。

【図10】ＥＧＦＲ標的化三重特異性分子がヒトＣａＰａｎ２腫瘍細胞を死滅させるようにＴ細胞に再指示すると（パネルＡ）、Ｔ細胞は活性化され、三重特異性の投与量に依存した方法でサイトカインＴＮＦ−α（パネルＢ）とＩＦＮγ（パネルＣ）を産生することを示す。

【図11】ＰＳＭＡ標的化三重特異性分子がヒト２２Ｒｖ１腫瘍細胞（パネルＡ）を死滅させるようにＴ細胞に再指示すると、Ｔ細胞は活性化され、三重特異性の投与量に依存した方法でサイトカインＴＮＦ−α（パネルＢ）とＩＦＮγ（パネルＣ）を産生することを示す。

【図12】ＭＳＬＮ標的化三重特異性分子が従来の抗体よりも速くマトリゲルを介して移動することができることを示す。

【図13】ビオチンＣＤ３εとビオチン−ＨＳＡ上でのファージ滴定を示す。

【発明を実施するための形態】

【0021】

三重特異性抗原結合タンパク質、その医薬組成物、同様にそのような三重特異性抗原結合タンパク質を作るための核酸、組換え発現ベクター、および宿主細胞が本明細書で提供される。さらに、疾患、疾病、および障害の予防および／または処置において、開示された三重特異性抗原結合タンパク質を使用する方法も提供される。三重特異性抗原結合タンパク質は、ＣＤ３同様に標的抗原に、およびドメイン結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの半減期拡張ドメインに特異的に結合することができる。図１は、三重特異性抗原結合タンパク質の１つの非限定的な例を描く。

【0022】

１つの態様において、三重特異性抗原結合タンパク質は、ＣＤ３に特異的に結合するドメイン（Ａ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に特異的に結合するドメイン（Ｂ）、および標的抗原に特異的に結合するドメイン（Ｃ）を含む。三重特異性抗原結合タンパク質中の３つのドメインは任意の順序で配置される。したがって、三重特異性抗原結合タンパク質のドメイン順序は以下のとおり企図される：
Ｈ_２Ｎ−（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、
Ｈ_２Ｎ−（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨ、
Ｈ_２Ｎ−（Ｂ）−（Ａ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、
Ｈ_２Ｎ−（Ｂ）−（Ｃ）−（Ａ）−ＣＯＯＨ、
Ｈ_２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨ、または
Ｈ_２Ｎ−（Ｃ）−（Ａ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨ。

【0023】

いくつかの実施形態において、三重特異性抗原結合タンパク質は、Ｈ_２Ｎ−（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨのドメイン順序を有する。いくつかの実施形態において、三重特異性抗原結合タンパク質は、Ｈ_２Ｎ−（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨのドメイン順序を有する。いくつかの実施形態において、三重特異性抗原結合タンパク質は、Ｈ_２Ｎ−（Ｂ）−（Ａ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨのドメイン順序を有する。いくつかの実施形態において、三重特異性抗原結合タンパク質は、Ｈ_２Ｎ−（Ｂ）−（Ｃ）−（Ａ）−ＣＯＯＨのドメイン順序を有する。いくつかの実施形態において、三重特異性抗原結合タンパク質は、Ｈ_２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨのドメイン順序を有する。いくつかの実施形態において、三重特異性抗原結合タンパク質は、Ｈ_２Ｎ−（Ｃ）−（Ａ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨのドメイン順序を有する。

【0024】

本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質は随意に、表６あるいは表７に記載される配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：１−４８）を有するポリペプチド、およびその部分配列を含む。いくつかの実施形態において、三重特異性抗原結合タンパク質は、表６あるいは表７に記載される配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：１−４８）に対して少なくとも７０％−９５％あるいはそれ以上の相同性を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、三重特異性抗原結合タンパク質は、表６あるいは表７に記載される配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−４８）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、あるいはそれ以上の相同性を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、三重特異性抗原結合タンパク質は、表６あるいは表７に記載される配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：１−４８）の少なくとも一部を含む配列を有する。いくつかの実施形態において、三重特異性抗原結合タンパク質は、表６あるいは表７に記載される配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：１−４８）の１つ以上を含むポリペプチドを含む。

【0025】

本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質は、細胞毒性Ｔ細胞を補充することにより標的抗原を発現する細胞の特異的な標的化を可能にすることを目的としている。これは、単独の抗原に向けられた完全長の抗体を使用し、細胞毒性Ｔ細胞を直接補充することができないＡＤＣＣ（抗体依存性細胞毒性）と比較して、有効性を改善する。対照的に、これらの細胞で特異的に発現されたＣＤ３分子を結合することにより、三重特異性抗原結合タンパク質は、非常に特異的なやり方で細胞毒性Ｔ細胞を、標的抗原を発現する細胞と架橋することができ、それによって、Ｔ細胞の細胞毒性の可能性を標的細胞へ向けることができる。本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質は、ＴＣＲの一部を形成する、表面発現されたＣＤ３タンパク質に結合することによって細胞毒性Ｔ細胞と結合する。特定の細胞の表面上で発現されたＣＤ３および標的抗原への複数の三重特異性抗原結合タンパク質の同時の結合は、Ｔ細胞活性化を引き起こされ、細胞を発現する特定の標的抗原のその後の溶解を媒介する。したがって、三重特異性抗原結合タンパク質は強力で、特異的で、かつ効率的な標的細胞の死滅を表示するように企図される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質は、病原性の細胞（例えば、腫瘍細胞、ウイルス感染あるいは細菌感染細胞、自己反応性Ｔ細胞など）を除去するために、細胞毒性Ｔ細胞による標的細胞の死滅を刺激する。そのような実施形態のいくつかでは、細胞は選択的に除去され、それによって、毒性の副作用の可能性が減少する。他の実施形態では、同じポリペプチドを使用して、自己免疫性疾患におけるＢあるいはＴリンパ球などの治療効果のための内因性の細胞、あるいは幹細胞移植のための造血幹細胞（ＨＳＣ）の排除を増強することができる。

【0026】

本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質はさらに、従来のモノクローナル抗体とより小さな二重特異性分子を上回る利点を与える。一般に、組換えタンパク質医薬品の有効性は、タンパク質自体の内因性の薬物動態学に極度に依存する。こうした利点の一つは、本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質が、ＨＳＡに特異的なドメインなどの半減期拡張ドメインを持っていることにより、薬物動態学的消失半減期を延長させたことである。この点で、本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質は、いくつかの実施形態では、約２、３、約５、約７、約１０、あるいは約１４日の延長された血清消失半減期を有する。このことは、消失半減期が比較的非常に短いＢｉＴＥまたはＤＡＲＴの分子などの他の結合タンパク質にとは対照的である。例えば、ＢｉＴＥのＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ融合分子は、消失半減期が短いため持続点滴（静脈内）による薬物送達を必要とする。三重特異性抗原結合タンパク質のより長い内因性の半減時間はこの問題を解決し、それによって、低用量の医薬製剤、定期的な投与の減少、および／または新規な医薬組成物などの治療可能性を増加させる。

【0027】

さらに本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質はさらに、組織への浸透と組織への分布を強化するための最適なサイズを有する。サイズが大きければ、標的組織中でのタンパク質の浸透あるいは分布が制限されるか妨げられる。本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質は、組織への浸透と分布を増強する小さなサイズを有することによりこれを回避する。これに応じて、本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質は、いくつかの実施形態では、約５０Ｋ_Ｄ−約８０Ｋ_Ｄ、約５０Ｋ_Ｄ−約７５Ｋ_Ｄ、約５０Ｋ_Ｄ−約７０Ｋ_Ｄ、あるいは約５０Ｋ_Ｄ−約６５Ｋ_Ｄのサイズを有する。したがって、三重特異性抗原結合タンパク質のサイズは、約１５０Ｋ_ＤであるＩｇＧ抗体よりも、および、約５５Ｋ_Ｄであるが延長された半減期ではなく、ゆえに腎臓ですぐに除去されるＢｉＴＥとＤＡＲＴ二重特異性抗体分子よりも、有利である。

【0028】

さらなる実施形態では、本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質は、増強された組織への浸透と分布に最適なサイズを有する。これらの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質はできるだけ小さくなるように構築され、その一方で、その標的に対する特異性を保持する。これに応じて、これらの実施形態では、本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質は、約２０Ｋ_Ｄ−約４０Ｋ_Ｄ、約２５Ｋ_Ｄ−約３５Ｋ_Ｄ、−約４０Ｋ_Ｄ、−約４５Ｋ_Ｄ、−約５０Ｋ_Ｄ、−約５５Ｋ_Ｄ、−約６０Ｋ_Ｄ、−約６５Ｋ_Ｄのサイズを有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質は、約５０Ｋ_Ｄ、４９Ｋ_Ｄ、４８Ｋ_Ｄ、４７Ｋ_Ｄ、４６Ｋ_Ｄ、４５Ｋ_Ｄ、４４Ｋ_Ｄ、４３Ｋ_Ｄ、４２Ｋ_Ｄ、４１Ｋ_Ｄ、４０Ｋ_Ｄ、約３９Ｋ_Ｄ、約３８Ｋ_Ｄ、約３７Ｋ_Ｄ、約３６Ｋ_Ｄ、約３５Ｋ_Ｄ、約３４Ｋ_Ｄ、約３３Ｋ_Ｄ、約３２Ｋ_Ｄ、約３１Ｋ_Ｄ、約３０Ｋ_Ｄ、約２９Ｋ_Ｄ、約２８Ｋ_Ｄ、約２７Ｋ_Ｄ、約２６Ｋ_Ｄ、約２５Ｋ_Ｄ、約２４Ｋ_Ｄ、約２３Ｋ_Ｄ、約２２Ｋ_Ｄ、約２１Ｋ_Ｄ、または約２０Ｋ_Ｄのサイズを有する。小さなサイズに対する典型的な手法は、ドメインの各々について単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）フラグメントを使用することによる。例えば、特定の三重特異性抗原結合タンパク質は、標的抗原のために抗ＣＤ３ ｓｄＡｂ、抗ＨＳＡ ｓｄＡｂ、およびｓｄＡｂを有する。これは、４０Ｋ_Ｄ未満で典型的な三重特異性抗原結合タンパク質のサイズを減少させる。したがって、いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質のドメインはすべて単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）フラグメントである。他の実施形態では、本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質は、ＨＳＡおよび／または標的抗原のための小分子実体（ＳＭＥ）結合剤を含む。ＳＭＥ結合剤は、平均して約５００〜２０００Ｄａのサイズの小分子であり、ソルターゼ連結反応あるいは共役などの既知の方法によって三重特異性抗原結合タンパク質に結合される。これらの例では、三重特異性抗原結合タンパク質のドメインの１つは、ソルターゼ認識配列、例えば、ＬＰＥＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５７）である。ソルターゼ認識配列を備えた三重特異性抗原結合タンパク質にＳＭＥ結合剤を結合させるために、タンパク質はソルターゼとＳＭＥ結合剤でインキュベートされ、それによってソルターゼがＳＭＥ結合剤を認識配列に結合させる。既知のＳＭＥ結合剤は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に結合するＭＩＰ−１０７２とＭＩＰ−１０９５を含む。さらに他の実施形態において、本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質の標的抗原に結合するドメインは、標的抗原に結合するためのノッチンペプチドを含む。ノッチンはシステインノット足場を備えたジスルフィド安定したペプチドであり、約３．５Ｋ_Ｄの平均サイズを有する。ノッチンは、フィブロネクチンとＶＥＧＦ受容体などの特定の腫瘍分子への結合について企図されてきた。さらなる実施形態において、本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質の標的抗原に結合するドメインは、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ）などの天然の受容体リガンドを含む。

【0029】

本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質の別の特徴は、それらがドメインの柔軟な結合を備えた単一のポリペプチドの設計であるということである。これにより、三重特異性抗原結合タンパク質の容易な産生と製造が可能になる。なぜなら、この抗原結合タンパク質はベクターに容易に組み入れられる単一のｃＤＮＡ分子によってコード可能であるからである。さらに、本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質が単量体の単一のポリペプチド鎖であるので、鎖の対形成の問題がなく、二量化のための要件もない。本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質は、Ｆｃγ免疫グロブリンドメインを備えた二重特異性のタンパク質などの他の報告されている分子とは異なり、凝集する傾向が低下している。

【0030】

本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質では、ドメインは内部リンカーＬ１とＬ２によって結合され、ここで、Ｌ１は、三重特異性抗原結合タンパク質の第１と第２のドメインに結合し、Ｌ２は三重特異性抗原結合タンパク質の第２と第３のドメインに結合する。リンカーＬ１とＬ２は最適化された長さおよび／またはアミノ酸組成物を有する。いくつかの実施形態において、リンカーＬ１とＬ２は同じ長さとアミノ酸組成物を有する。他の実施形態では、Ｌ１とＬ２は異なる。ある実施形態では、内部リンカーＬ１および／またはＬ２は「短い」、つまり、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、あるいは１２のアミノ酸残基からなる。したがって、ある例では、内部リンカーは約１２以下のアミノ酸残基からなる。０のアミノ酸残基の場合、内部リンカーはペプチド結合である。ある実施形態では、内部リンカーＬ１および／またはＬ２は「長い」、つまり、１５、２０、あるいは２５のアミノ酸残基からなる。いくつかの実施形態において、これらの内部リンカーは約３から約１５まで、例えば、８、９、あるいは１０の連続したアミノ酸残基からなる。内部リンカーＬ１とＬ２のアミノ酸組成物に関して、ペプチドは、三重特異性抗原結合タンパク質に対して柔軟性を与える特性とともに選択され、結合ドメインに干渉せず、同様にプロテアーゼからの切断に抵抗しない。例えば、グリシンとセリンの残基は一般にプロテアーゼ抵抗性を与える。三重特異性抗原結合タンパク質中のドメインの結合に適切な内部リンカーの例としては、限定されないが、（ＧＳ）_ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）、（ＧＧＳ）_ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０）、（ＧＧＧＳ）_ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）、（ＧＧＳＧ）_ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２）、（ＧＧＳＧＧ）_ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３）、あるいは、（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４）が挙げられ、ここで、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、あるいは１０である。１つの実施形態では、内部リンカーＬ１および／またはＬ２は、（ＧＧＧＧＳ）_４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５）、あるいは（ＧＧＧＧＳ）_３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６）である。

【0031】

ＣＤ３結合ドメイン
Ｔ細胞の応答の特異性は、ＴＣＲによって抗原（主要組織適合複合体、ＭＨＣの文脈で表示された）の認識によって媒介される。ＴＣＲの一部として、ＣＤ３は、細胞表面に存在する、ＣＤ３γ（ガンマ）鎖、ＣＤ３δ（デルタ）鎖、および２つのＣＤ３ε（イプシロン）鎖を含むタンパク質複合体である。完全なＴＣＲを含むために、ＣＤ３は、ＣＤ３ζ（ゼータ）と同様に、ＴＣＲのα（アルファ）とβ（ベータ）鎖と一緒に会合する。固定された抗ＣＤ３抗体によるなどしてＴ細胞上にＣＤ３をクラスター形成することで、Ｔ細胞受容体の結合に似ているがそのクローンに典型的な特異性とは無関係のＴ細胞活性化を引き起こす。

【0032】

１つの態様において、本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質は、ＣＤ３に特異的に結合するドメインを含む。１つの態様において、本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質は、ヒトＣＤ３に特異的に結合するドメインを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質は、ＣＤ３γに特異的に結合するドメインを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質は、ＣＤ３δに特異的に結合するドメインを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質は、ＣＤ３εに特異的に結合するドメインを含む。

【0033】

さらなる実施形態において、本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質は、ＴＣＲに特異的に結合するドメインを含む。ある例では、本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質は、ＴＣＲのα鎖を特異的に結合するドメインを含む。ある例では、本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質は、ＴＣＲのβ鎖を特異的に結合するドメインを含む。

【0034】

ある実施形態において、本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、ヒトＣＤ３との有力なＣＤ３結合親和性を呈するだけではなく、それぞれのカニクイザルＣＤ３タンパク質との優れた交差反応性も示す。例によっては、三重特異性抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、カニクイザルからのＣＤ３に交差反応性である。ある例において、ＣＤ３に関するヒト：カニクイザルのＫ_Ｄ比率は５−０．２の間である。

【0035】

いくつかの実施形態において、三重特異性抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体からのドメインを含むＣＤ３に結合するあらゆるドメインであり得る。例によっては、三重特異性抗原結合タンパク質が最終的に使用される同じ種に由来することがＣＤ３結合ドメインにとっては有益である。例えば、ヒトで使用するためには、抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメインからのヒトまたはヒト化残基を含めることが、三重特異性抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインには有益なことがある。

【0036】

したがって、１つの態様では、抗原結合ドメインは、ヒト化抗体またはヒト抗体または抗体フラグメント、あるいはマウスの抗体または抗体フラグメントを含む。１つの実施形態では、ヒト化またはヒト抗ＣＤ３結合ドメインは、本明細書に記載されるヒト化またはヒト抗ＣＤ３結合ドメインの１つ以上（例えば、３つすべて）の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）、および軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）、および／または、本明細書に記載されるヒト化またはヒト抗ＣＤ３結合ドメインの１つ以上（例えば、３つすべて）の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）、および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）、例えば１つ以上、例えば、３つすべてのＬＣ ＣＤＲと、１つ以上、例えば、３つすべてのＨＣ ＣＤＲを含む。

【0037】

いくつかの実施形態において、ヒト化またはヒト抗ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３に特異的なヒト化またはヒト軽鎖可変領域を含み、ＣＤ３に特異的な軽鎖可変領域はヒト軽鎖フレームワーク領域中のヒトあるいはヒト以外の軽鎖ＣＤＲを含む。ある例では、軽鎖フレームワーク領域はλ（ラムダ）軽鎖フレームワークである。他の例では、軽鎖フレームワーク領域はκ（カッパ）軽鎖フレームワークである。

【0038】

いくつかの実施形態において、ヒト化またはヒト抗ＣＤ３結合ドメインはＣＤ３に特異的なヒト化またはヒト重鎖可変領域を含み、ＣＤ３に特異的な重鎖可変領域はヒト重鎖フレームワーク領域のヒトまたはヒト以外の重鎖ＣＤＲを含む。

【0039】

ある例において、重鎖および／または軽鎖の相補性決定領域は、例えば、ムロモナブ−ＣＤ３（ＯＫＴ３）、オテリキシズマブ（ＴＲＸ４）、テプリズマブ（ＭＧＡ０３１）、ビジリズマブ（Ｎｕｖｉｏｎ）、ＳＰ３４、またはＸ３５−３、ＶＩＴ３、ＢＭＡ０３０（ＢＷ２６４／５６）、ＣＬＢ−Ｔ３／３、ＣＲＩＳ７、ＹＴＨ１２．５、Ｆ１１１−４０９、ＣＬＢ−Ｔ３．４．２、ＴＲ−６６、ＷＴ３２、ＳＰｖ−Ｔ３ｂ、１１Ｄ８、ＸＩＩＩ−１４１、ＸＩＩＩ−４６、ＸＩＩＩ−８７、１２Ｆ６、Ｔ３／ＲＷ２−８Ｃ８、Ｔ３／ＲＷ２−４Ｂ６、ＯＫＴ３Ｄ、Ｍ−Ｔ３０１、ＳＭＣ２、Ｆ１０１．０１、ＵＣＨＴ−１、およびＷＴ−３１などの既知の抗ＣＤ３抗体に由来する。

【0040】

１つの実施形態では、抗ＣＤ３結合ドメインは、本明細書で提供されるアミノ酸配列の軽鎖と重鎖を含む単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。本明細書で使用されるように、「単鎖可変フラグメント」あるいは「ｓｃＦｖ」とは、軽鎖の可変領域を含む抗体フラグメントと、重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体フラグメントを指し、軽鎖と重鎖の可変領域は、短い柔軟なポリペプチドリンカーによって連続的に結合され、単一のポリペプチド鎖として発現可能であり、およびｓｃＦｖはそれが由来する無傷の抗体の特異性を保持する。実施形態では、抗ＣＤ３結合ドメインは以下を含む：本明細書で提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、あるいは３つの修飾（例えば置換）を有するが、せいぜい３０、２０、あるいは１０の修飾（例えば置換）を有するアミノ酸配列、あるいは本明細書で提供されるアミノ酸配列に９５−９９％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域；および／または、本明細書で提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、あるいは３つの修飾（例えば置換）を有するが、せいぜい３０、２０、あるいは１０の修飾（例えば置換）を有するアミノ酸配列、あるいは本明細書で提供されるアミノ酸配列に９５−９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域。１つの実施形態では、ヒト化またはヒト抗ＣＤ３結合ドメインはｓｃＦｖであり、本明細書に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、ｓｃＦｖリンカーによって本明細書に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に結合される。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域と重鎖可変領域は、例えば、以下の配向のいずれかであり得る：軽鎖可変領域−ｓｃＦｖリンカー−重鎖可変領域、あるいは重鎖可変領域−ｓｃＦｖリンカー−軽鎖可変領域。

【0041】

いくつかの例では、ＣＤ３に結合するｓｃＦｖｓは既知の方法によって調製される。例えば、ｓｃＦｖ分子は、柔軟なポリペプチドリンカーを使用して、ＶＨとＶＬの領域を一緒に結合することにより、生成可能である。ｓｃＦｖ分子は、最適化された長さおよび／またはアミノ酸組成物を備えるｓｃＦｖリンカー（例えばＳｅｒ−Ｇｌｙリンカー）を含む。これに応じて、いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖリンカーの長さは、ＣＤ３結合部位を形成するために、ＶＨまたはＶＬのドメインが他の可変ドメインと分子間で結合することができるような長さである。ある実施形態において、こうしたｓｃＦｖリンカーは「短い」、つまり、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１あるいは１２のアミノ酸残基からなる。したがって、ある例では、ｓｃＦｖリンカーは約１２以下のアミノ酸残基からなる。０のアミノ酸残基の場合、ｓｃＦｖリンカーはペプチド結合である。いくつかの実施形態において、これらのｓｃＦｖリンカーは約３から約１５、例えば８、９、あるいは１０の連続的なアミノ酸残基からなる。ｓｃＦｖリンカーのアミノ酸組成物に関して、柔軟性を与え、可変ドメインに干渉せず、同様に、機能的なＣＤ３結合部位を形成するために２つの可変ドメインを接合する鎖間フォールディングを許可しないペプチドが選択される。例えば、グリシンとセリンの残基を含むｓｃＦｖリンカーは一般にプロテアーゼ抵抗性を与える。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖ中のリンカーはグリシンとセリンの残基を含む。ｓｃＦｖリンカーのアミノ酸配列は、例えば、ＣＤ３結合とｓｃＦｖの産生収率を改善するファージディスプレー方法によって最適化可能である。ｓｃＦｖ中の可変軽鎖ドメインと可変重鎖ドメインを結合するのに適切なペプチドｓｃＦｖリンカーの例としては、限定されないが、（ＧＳ）_ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）、（ＧＧＳ）_ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０）、（ＧＧＧＳ）_ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）、（ＧＧＳＧ）_ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２）、（ＧＧＳＧＧ）_ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３）、あるいは、（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４）が挙げられ、ここで、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、あるいは１０である。１つの実施形態では、ｓｃＦｖリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）_４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５）、あるいは （ＧＧＧＧＳ）_３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６）であり得る。リンカー長さの変動は活性を保持あるいは増強し、活性研究で優れた有効性をもたらすこともある。

【0042】

いくつかの実施形態において、三重特異性抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、１０００ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、あるいは０．５ｎＭ以下のＫ_ＤのＣＤ３発現細胞上のＣＤ３に対する親和性を有する。いくつかの実施形態において、三重特異性抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、１０００ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、あるいは０．５ｎＭ以下のＫ_Ｄの、ＣＤ３ε、γ、あるいはδに対する親和性を有する。さらなる実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインはＣＤ３に対する低い親和性（つまり、約１００ｎＭ以上）を有する。

【0043】

ＣＤ３に結合するための親和性は、例えば、三重特異性抗原結合タンパク質自体、又は、アッセイプレート上で被覆される；微生物細胞表面上で表示される；溶液中にあるＣＤ３に結合するそのＣＤ３結合ドメインの能力により、判定され得る。三重特異性抗原結合タンパク質自体の結合活性、又は、ＣＤ３に対する本開示のそのＣＤ３結合ドメインは、ビーズ、基質、細胞などへの、リガンド（例えばＣＤ３）、三重特異性抗原結合タンパク質自体、又はそのＣＤ３結合ドメインの固定により、分析され得る。適切な緩衝液中に薬剤が加えられ、結合パートナーは与えられた温度で一定の期間にわたりインキュベートされる。洗浄により結合されない物質を取り除いた後、結合したタンパク質を、例えば、ＳＤＳ、高ｐＨを持つ緩衝液で放出し、且つ、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により分析することができる。

【0044】

半減期延長ドメイン
本明細書では、抗原結合ドメインの半減期を延ばすドメインが考慮される。そのようなドメインは、限定されないがＨＳＡ結合ドメイン、Ｆｃドメイン、小分子、及び当該技術分野で既知の他の半減期延長ドメインを含むと考慮される。

【0045】

ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（分子質量〜６７ｋＤａ）は、血漿中で最も大量のタンパク質であり、約５０ｍｇ／ｍｌ（６００μＭ）で存在し、ヒトにおいて約２０日の半減期を有している。ＨＳＡは、血漿ｐＨを維持するように役立ち、膠質の血圧に寄与し、多くの代謝物質及び脂肪酸の担体として機能し、そして血漿の主要な薬物輸送タンパク質として役立つ。

【0046】

アルブミンとの非共有結合性会合は、短命のタンパク質の消失半減期を延ばす。例えば、Ｆａｂフラグメントに対するアルブミン結合ドメインの組換え型融合は、Ｆａｂフラグメントだけの投与と比較すると、マウスとウサギそれぞれへの静脈内投与時に、２５倍及び５８倍のインビボの除去、並びに２６倍及び３７倍の半減期延長を結果としてもたらした。別の例において、アルブミンとの会合を促進するためにインスリンが脂肪酸でアシル化されると、ウサギ又はブタに皮下注射した時に、遅延性の効果が観察された。総じて、このような研究は、アルブミン結合と遅延性作用との連係を実証する。

【0047】

１つの態様において、本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質は、半減期延長ドメイン（例えばＨＳＡに特異的に結合するドメイン）を含む。幾つかの実施形態において、三重特異性抗原結合タンパク質のＨＳＡ結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体由来のドメインを含むがこれらに限定されない、ＨＳＡに結合する任意のドメインであり得る。幾つかの実施形態において、ＨＳＡ結合ドメインは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、例えば重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及びラクダ由来の単一ドメイン抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）、ペプチド、リガンド、又はＨＳＡには特異的な小分子実体である。特定の実施形態において、ＨＳＡ結合ドメインは単一ドメイン抗体である。他の実施形態において、ＨＳＡ結合ドメインはペプチドである。幾つかの実施形態において、ＨＳＡ結合ドメインは小分子である。三重特異性抗原結合タンパク質のＨＳＡ結合ドメインはかなり小さく、幾つかの実施形態においてわずか２５ｋＤ、わずか２０ｋＤ、わずか１５ｋＤ、又はわずか１０ｋＤであることが考慮される。特定の例において、ＨＳＡ結合は、ペプチド又は小分子の実体である場合に、５ｋＤ以下である。

【0048】

三重特異性抗原結合タンパク質の半減期延長ドメインは、三重特異性抗原結合タンパク質自体の変更された薬力学と薬物動態を提供する。上記のように、半減期延長ドメインは消失半減期を延ばす。半減期延長ドメインはまた、三重特異性抗原結合タンパク質の組織分布、浸透、及び拡散の変化を含む、薬物動態学的特性を変更する。幾つかの実施形態において、半減期延長ドメインは、半減期延長ドメインの無いタンパク質と比較して、組織（腫瘍を含む）の標的化、組織分布、組織浸透、組織内の拡散の改善、及び効果の増強を提供する。１つの実施形態において、治療方法は、減少量の三重特異性抗原結合蛋白を効果的且つ効率的に利用して、その結果非腫瘍細胞細胞毒性の減少などの副作用の減少をもたらす。

【0049】

更に、半減期延長ドメインの結合親和性は、特定の三重特異性抗原結合蛋白の特異的な消失半減期を標的とするように選択され得る。故に、幾つかの実施形態において、半減期拡張ドメインには高度な結合親和性がある。他の実施形態では、半減期拡張ドメインには中位の結合親和性がある。また他の実施形態において、半減期拡張ドメインには低い又は最低限の（ｍａｒｇｉｎａｌ）結合親和性がある。典型的な結合親和性は、１０ｎＭ以下（高）、１０ｎＭと１００ｎＭの間（中）、及び１００ｎＭ超（低）でのＫＤ濃度を含む。上記のように、ＨＳＡに対する結合親和性は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）など既知の方法により判定される。

【0050】

標的抗原結合ドメイン
記載されたＣＤ３及び半減期拡張ドメインに加えて、本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質は、標的抗原に結合するドメインも含む。標的抗原は、疾患、障害、又は疾病に関与し及び／又は関連する。特に、標的抗原は、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫障害、自己免疫疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生性反応、移植片対宿主疾患、又は宿主対移植片疾患に関連する。幾つかの実施形態において、標的抗原は、腫瘍細胞上で発現される腫瘍抗原である。代替的に、幾つかの実施形態において、標的抗原は、ウイルス又は細菌などの病原体に関連する。

【0051】

幾つかの実施形態において、標的抗原は、タンパク質、脂質、又は多糖類などの細胞表面分子である。幾つかの実施形態において、標的抗原は、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、損傷を受けた赤血球、動脈プラーク細胞、又は繊維症組織細胞である。

【0052】

本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質の設計は、標的抗原に対する結合ドメインが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体由来のドメインを含むがこれらに限定されない、任意のタイプの結合ドメインになり得るという点で、標的抗原に対する結合ドメインを可撓性にすることを可能にする。幾つかの実施形態において、標的抗原に対する結合ドメインは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、例えば重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及びラクダ由来の単一ドメイン抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）である。他の実施形態において、標的抗原に対する結合ドメインは、非Ｉｇ結合ドメイン、即ち、抗体模倣体、例えばアンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ）、アフィリン（ａｆｆｉｌｉｎｓ）、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）分子、アフィマー（ａｆｆｉｍｅｒｓ）、アフィチン（ａｆｆｉｔｉｎｓ）、アルファボディ（ａｌｐｈａｂｏｄｉｅｓ）、アビマー（ａｖｉｍｅｒｓ）、ＤＡＲＰｉｎｓ、フィノマー、クニッツ（ｋｕｎｉｔｚ）ドメインペプチド、及びモノボディ（ｍｏｎｏｂｏｄｉｅｓ）である。更なる実施形態において、標的抗原に対する結合ドメインは、標的抗原に結合するか、又はそれに会合するリガンド又はペプチドである。また更なる実施形態において、標的抗原に対する結合ドメインはノッチンである。また更なる実施形態において、標的抗原に対する結合ドメインは小分子実体である。

【0053】

三重特異性タンパク質の修飾
本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質は、（ｉ）アミノ酸が遺伝子コードによりコードされたものでないアミノ酸残基で置換され、（ｉｉ）成熟ポリペプチドがポリエチレングリコールなどの別の化合物と融合され、又は（ｉｉｉ）付加的なアミノ酸が、リーダー配列又は分泌配列、或いはタンパク質の精製のための配列などのタンパク質に融合される、誘導体又はアナログを包含する。

【0054】

典型的な修飾は、限定されないが、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合の架橋の組成、シスチンの形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解性の加工、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、アルギニル化（ａｒｇｉｎｙｌａｔｉｏｎ）などのアミノ酸のタンパク質への転移ＲＮＡ媒介性の付加、及びユビキチン化を含む。

【0055】

修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、及びアミノ末端又はカルボキシル末端を含む、本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質のあらゆる場所で行われる。三重特異性抗原結合タンパク質の修飾に有用な特定の一般的なペプチド修飾は、グリコシル化、脂質付着、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化、共有結合性修飾によるポリペプチド中のアミノ基又はカルボキシル基、或いはその両方の遮断、及びＡＤＰ−リボシル化を含む。

【0056】

三重特異性抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
幾つかの実施形態において、本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子も提供される。幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチド分子は、ＤＮＡ構築物として提供される。他の実施形態において、ポリヌクレオチド分子は、メッセンジャーＲＮＡ転写物として提供される。

【0057】

ポリヌクレオチド分子は、ペプチドリンカーにより分離され、或いは他の実施形態においてペプチド結合により直接結合される３つの結合ドメインをコードする遺伝子を、適切なプロモーター、及び随意に適切な転写ターミネーターに動作可能に結合された１つの遺伝子構築物に組み合わせること、及び、例えばＣＨＯ細胞などの細菌又は他の適切な発現系においてそれを発現させることなどによる、既知の方法によって構築される。標的抗原結合ドメインが小分子である実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＣＤ３結合ドメインと半減期延長ドメインをコードする遺伝子を含んでいる。半減期延長ドメインが小分子である実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＣＤ３と標的抗原に結合するドメインをコードする遺伝子を含んでいる。利用されたベクター系と宿主に依存して、構成プロモータ及び誘導プロモータを含む、適切な転写要素及び翻訳要素の任意の数が、使用され得る。プロモータは、それぞれの宿主細胞におけるポリヌクレオチドの発現を誘導するように選択される。

【0058】

幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、更なる実施形態を表わすベクター、好ましくは発現ベクターに挿入される。この組換えベクターは、既知の方法に従って構築され得る。特に対象のベクターは、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、ｖｉｒｉｉ（例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルスなど）、及びコスミドを含む。

【0059】

様々な発現ベクター／宿主系は、記載された三重特異性抗原結合タンパク質のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み且つ発現させるために利用され得る。Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のための発現ベクターの例は、ｐＳＫＫ（Ｌｅ Ｇａｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ． （２００４） ２８５（１）：１１１−２７）、又は、哺乳動物細胞の発現についてはｐｃＤＮＡ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。

【0060】

故に、本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質は、幾つかの実施形態において、上述のようなタンパク質をコードするベクターを宿主細胞に導入することにより、及び、タンパク質ドメインが発現され、分離され、及び随意に更に精製される条件下で、前記宿主細胞を培養することにより、生成される。

【0061】

医薬組成物
幾つかの実施形態において、本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質、三重特異性抗原結合タンパク質のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター又はこのベクターにより形質転換される宿主細胞、及び少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物も提供される。用語「薬学的に許容可能な担体」は、限定されないが、成分の生物活性の有効性に干渉せず、且つ投与される患者に有毒ではない、任意の担体を含む。適切な医薬担体の例は当該技術分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルジョン、例えば油／水のエマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、無菌液などを含む。そのような担体は、従来の方法により製剤され得、適切な用量で被験体に投与され得る。好ましくは、組成物は無菌性である。このような組成物はまた、防腐剤、乳化剤、及び分散剤などのアジュバントも含み得る。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤の包含により確保され得る。

【0062】

医薬組成物の幾つかの実施形態において、本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質は、ナノ粒子に封入される。幾つかの実施形態において、ナノ粒子は、フラーレン、液晶、リポソーム、量子ドット、超常磁性微粒子、デンドリマー、又はナノロッドである。医薬組成物の他の実施形態において、三重特異性抗原結合タンパク質はリポソームに結合される。幾つかの例において、三重特異性抗原結合タンパク質は、リポソームの表面に抱合される。幾つかの例において、三重特異性抗原結合タンパク質は、リポソームのシェル内に封入される。幾つかの例において、リポソームはカチオン性リポソームである。

【0063】

本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質は、薬物として使用のために熟考される。投与は、異なる方法、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、又は皮内の投与により達成される。幾つかの実施形態において、投与経路は、治療の種類、及び医薬組成物に含まれる化合物の種類に依存する。投与レジメンは、主治医及び他の臨床学的因子により決定される。１人の患者のための投与量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、性別、投与される特定の化合物、投与の時間と経路、治療の種類、健康状態、及び同時に投与される他の薬物を含む多くの要因に依存する。「有効な量」は、疾患の経過と重症度に影響を及ぼし、それによりそのような病状の減少又は寛解を引き起こすのに十分な量の活性成分を指し、既知の方法を用いて決定され得る。

【0064】

処置方法
また本明細書には、幾つかの実施形態において、本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質の投与を含む、必要とする個体の免疫系を刺激する方法及び使用も提供される。幾つかの例において、本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質の投与は、標的抗原を発現する細胞の方へと細胞毒性を誘導及び／又は維持する。幾つかの例において、標的抗原を発現する細胞は、癌細胞又は腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、自己反応性Ｔ又はＢ細胞、損傷した赤血球細胞、動脈プラーク、又は繊維症組織である。

【0065】

また本明細書には、本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質を個体に投与する工程を含む、標的抗原に関連した疾患、障害、又は条件の処置の方法及び使用も提供される。標的抗原に関連する疾患、障害、又は疾病は、限定されないが、ウイルス感染、細菌感染、自己免疫疾患、移植拒絶反応、アテローム性動脈硬化症、又は線維症を含む。他の実施形態において、標的抗原に関連する疾患、障害、又は疾病は、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫障害、自己免疫疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生性反応、移植片対宿主疾患、又は宿主対移植片疾患である。１つの実施形態において、標的抗原に関連する疾患、障害、又は疾病は、癌である。１つの例において、癌は血液癌である。別の例において、癌は固形腫瘍癌である。

【0066】

本明細書で使用されるように、幾つかの実施形態において、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、又は「処置された（ｔｒｅａｔｅｄ）」は、治療的処置を指し、その目的は、望まれない生理的疾病、障害、又は疾患を遅くする（和らげる）こと、又は有益或いは所望の臨床結果を得ることである。本明細書に記載される目的のために、有益な又は所望の臨床結果は、限定されないが、症状の緩和；疾病、障害、又は疾患の範囲の減少；疾病、障害、又は疾患の状態の安定化（即ち、悪化しない）；疾病、障害、又は疾患の発症又は進行の遅延；疾病、障害、又は病状の改善；及び、疾病、障害、又は疾患の検知可能又は検知不能にかかわらない寛解（部分的又は総合的の何れか）、或いは増大又は改善を含む。処置は、過剰なレベルの副作用がない、臨床的に著しい反応を誘発することを含む。処置は、処置を受けない場合に予期される生存率と比較して、生存率を延ばすことも含む。他の実施形態において、「処置」、「処置すること」、「処置された」は、予防的な手段を指し、その目的は、例えば疾患にかかった人（例えば、乳癌などの疾患の遺伝マーカーを運ぶ個体）における、望まれない生理的疾病、障害、又は疾患の発症を遅らせること、又はそれらの重症度を減らすことである。

【0067】

本明細書に記載される方法の幾つかの実施形態において、三重特異性抗原結合タンパク質は、特定の疾患、障害、又は疾病の処置のための薬剤と組み合わせて投与される。薬剤は、限定されないが、抗体を含む治療薬、小分子（例えば化学療法剤）、ホルモン（ステロイド、ペプチドなど）、放射線治療薬（γ線、Ｘ線、及び／又は、放射性同位体、マイクロ波、ＵＶ放射などの配向された送達）、遺伝子治療薬（例えばアンチセンス、レトロウイルスの治療など）、及び他の免疫療法薬を含む。幾つかの実施形態において、三重特異性抗原結合タンパク質は、下痢止め剤、抗催吐薬、鎮痛薬、オピオイド、及び／又は非ステロイド性抗炎症剤と組み合わせて投与される。幾つかの実施形態において、三重特異性抗原結合タンパク質は、手術の前、間、或いは後に投与される。

【0068】

＜特定の定義＞
本明細書で使用されるように、「消失半減期」は、ＧｏｏｄｍａｎとＧｉｌｌｍａｎのＴｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２１−２５ （Ａｌｆｒｅｄ Ｇｏｏｄｍａｎ Ｇｉｌｍａｎ， Ｌｏｕｉｓ Ｓ． Ｇｏｏｄｍａｎ， ａｎｄ Ａｌｆｒｅｄ Ｇｉｌｍａｎ， ｅｄｓ．， ６ｔｈ ｅｄ． １９８０）に記載されるように、その通常の意味で使用される。簡潔に、この用語は、薬物消失の時間経過の定量的測度を包含することを意味している。薬物濃度は通常、消失プロセスの飽和に必要なものに匹敵しないため、大抵の薬剤の消失は急激的なものである（即ち、一次速度論に従う）。急激なプロセスの速度は、時間の単位当たりの分数変化率を表すその速度定数ｋにより、又は、処理の５０％の完了に必要な時間であるその半減期ｔ_１／２によって表され得る。これらの２つの定数の単位は、それぞれ時間^−１（ｔｉｍｅ^−１）及び時間（ｔｉｍｅ）である。一次反応速度定数及び反応の半減期は単純に関連づけられ（ｋ×ｔ_１／２＝０．６９３）、適宜交換され得る。一次消失キネティクスは、薬物の一定の画分が時間単位ごとに消失されることを命令するため、薬物濃度対時間の対数のプロットは、初期分布段階後（即ち、薬物吸収と分布が完了した後）の全ての時間で直線状である。薬物消失の半減期は、そのようなグラフから正確に判定され得る。

【実施例】

【0069】

実施例１：ＣＤ２０に対する典型的な三重特異性抗原結合タンパク質の構築
ｓｃＦｖ ＣＤ３結合ドメインの生成
ヒトＣＤ３ε鎖の正準配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｐ０７７６６である。ヒトＣＤ３γ鎖の正準配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｐ０９６９３である。ヒトＣＤ３δ鎖の正準配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｐ０４３２３４である。ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、又はＣＤ３δに対する抗体を、親和性成熟などの既知の技術を介して生成する。マウス抗ＣＤ３抗体を出発物質として使用する場合、マウス抗ＣＤ３抗体のヒト化は臨床設定に望ましいものであり、ここでマウスに特異的な残基は、本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質の処置を受ける被験体においてヒト−抗−マウス抗原（ＨＡＭＡ）応答を誘発し得る。ヒト化は、ＣＤＲ領域及び／又はフレームワーク領域への他の修飾を随意に含む、適切なヒト生殖系列アクセプター・フレームワーク上にマウス抗ＣＤ３抗体からＣＤＲ領域を移植することにより、達成される。本明細書で提供されるように、抗体及び抗体フラグメントの残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ （Ｋａｂａｔ Ｅ． Ａ． ｅｔ ａｌ， １９９１； Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ， １９８７）に従っている。

【0070】

それ故、ヒト又はヒト化抗ＣＤ３抗体を使用して、三重特異性抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインのためのｓｃＦｖ配列を生成する。ヒト又はヒト化のＶＬ及びＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列を獲得し、構成物のコドンを随意に、ホモサピエンス由来の細胞における発現のために最適化する。ＶＬとＶＨのドメインがｓｃＦｖに現われる順番を変更し（即ち、ＶＬ−ＶＨ、又はＶＨ−ＶＬの配向）、「Ｇ４Ｓ」（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８）又は「Ｇ_４Ｓ」（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８）のサブユニット（Ｇ_４Ｓ）_３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６）の３つのコピーが可変ドメインに結合して、ｓｃＦｖドメインを作成する。抗ＣＤ３ ｓｃＦｖプラスミド構築物は、任意のＦｌａｇ、Ｈｉｓ、又は他の親和性タグを持つことができ、ＨＥＫ２９３、又は他の適切なヒト或いは哺乳動物の細胞株へと電気穿孔され、精製される。検証アッセイは、ＦＡＣＳによる結合解析、Ｐｒｏｔｅｏｎを使用する動力学解析、及びＣＤ３発現細胞の染色を含む。

【0071】

ｓｃＦｖ ＣＤ２０結合ドメインの生成
ＣＤ２０は、Ｂリンパ球上に存在する細胞表面タンパク質の１つである。ＣＤ２０抗原は、正常及び悪性のプレＢリンパ球及び成熟Ｂリンパ球に見出され、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の９０％以上においてそれらを含んでいる。抗原は、造血幹細胞、活性化Ｂリンパ球（形質細胞）、及び正常組織には存在しない。そのため、マウス由来の大半の抗体の一部が記載された：１Ｆ５、２Ｂ８／Ｃ２Ｂ８、２Ｈ７、及び１Ｈ４。

【0072】

ＣＤ２０に対するｓｃＦｖ結合ドメインを、ＣＤ３に対するｓｃＦｖ結合ドメインの生成のための上記方法と同様に生成する。

【0073】

三重特異性抗原結合タンパク質をコードするＤＮＡ発現構築物のクローン化
抗ＣＤ３ ｓｃＦｖドメインを使用して、抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖドメインとＨＳＡ結合ドメイン（例えば、ペプチド又はＶＨドメイン）と組み合わせて三重特異性抗原結合タンパク質を構築し、ドメインを図１に示されるように組み立てる。ＣＨＯ細胞における三重特異性抗原結合タンパク質の発現のために、全てのタンパク質ドメインのコード配列を、哺乳動物発現ベクター系へとクローン化する。簡潔に、ペプチドリンカーＬ１及びＬ２と共に、ＣＤ３結合ドメイン、ＨＳＡ結合ドメイン、及びＣＤ２０結合ドメインをコードする遺伝子配列を別々に合成し、サブクローン化する。その後、結果として生じる構成物を、「ＣＤ２０結合ドメイン−Ｌ１−ＣＤ３結合ドメイン−Ｌ２−ＨＳＡ結合ドメイン」の順で共にライゲートして、最終的な構成物を得る。タンパク質の分泌及び精製をそれぞれ促進するために、Ｎ末端シグナルペプチド及びＣ末端ヘキサヒスチジン（６ｘＨｉｓ）−タグのコード配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９）を含むように、全ての発現構築物を設計する。

【0074】

安定してトランスフェクトされたＣＨＯ細胞における三重特異性抗原結合タンパク質の発現
ＣＨＯ細胞発現系（Ｆｌｐ−Ｉｎ（登録商標）， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＣＨＯ−Ｋ１チャイニーズハムスター卵巣細胞の誘導体（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−６１）（Ｋａｏ ａｎｄ Ｐｕｃｋ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９６８； ６０（４）：１２７５−８１）を使用する。Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより提供される標準の細胞培養プロトコルに従って、付着細胞を二次培養する。

【0075】

懸濁液中の成長に対する適応のために、細胞を組織培養フラスコから引き離し、無血清培地に配する。懸濁液に適応した細胞を、１０％のＤＭＳＯを含む培地に凍結保存する。

【0076】

分泌された三重特異性抗原結合タンパク質を安定して発現させる、組換え型ＣＨＯ細胞株を、懸濁液に適応した細胞のトランスフェクションにより生成する。抗菌性のヒグロマイシンＢでの選択中、生細胞密度を週に２回測定し、細胞を遠心分離し、０．１×１０^６生細胞／ｍＬの最大密度で新鮮な選択培地の中で再懸濁する。三重特異性抗原結合タンパク質を安定して発現させる細胞プールを選択の２−３週後に回収し、その時点で細胞は振盪フラスコの標準培地に移される。組換え型分泌タンパク質の発現を、タンパク質のゲル電気泳動又はフローサイトメトリーの実行により確認する。安定した細胞プールを、ＤＭＳＯ含有培地に凍結保存する。

【0077】

三重特異性抗原結合タンパク質を、細胞培養上清への分泌により安定してトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株の１０日間の流加回分培養において生成する。典型的に＞７５％の培養物の生存率で、細胞培養上清を１０日後に採取した。サンプルを一日おきに生成培養物から集め、細胞密度と生存率を評価する。採取の当日、更なる使用の前に、細胞培養上清を遠心分離と真空濾過により取り除く。

【0078】

細胞培養上清におけるタンパク質発現の力価及び生成物の保全性をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。

【0079】

三重特異性抗原結合タンパク質の精製
三重特異性抗原結合タンパク質から、２工程の手順でＣＨＯ細胞培養上清を精製する。構築物を、第１工程で親和性クロマトグラフィーにさらし、第２工程でＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００の上で分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）にさらす。サンプルを緩衝液交換し、限外濾過により濃縮することで＞１ｍｇ／ｍＬの典型的な濃度とする。最終サンプルの純度及び均質性（典型的に＞９０％）を、還元条件及び非還元条件下でのＳＤＳ ＰＡＧＥ、次いで抗ＨＳＡ又は抗イディオタイプ抗体を使用する免疫ブロット法、同様に分析ＳＥＣ、それぞれによって評価した。精製されたタンパク質を、使用するまで−８０℃でアリコートとして保存した。

【0080】

実施例２：フローサイトメトリーによる抗原親和性の判定
実施例１の三重特異性抗原結合タンパク質を、ヒトＣＤ３^＋とＣＤ２０^＋細胞及びカニクイザルＣＤ３^＋とＣＤ２０^＋細胞に対するそれらの結合親和性について試験する。

【0081】

ＣＤ３^＋及びＣＤ２０^＋細胞を、実施例１の三重特異性抗原結合タンパク質の１００μＬの連続希釈でインキュベートする。ＦＡＣＳ緩衝液での３回の洗浄後、細胞を、氷の上で４５分間、同じ緩衝液の中、１０μｇ／ｍＬのマウスモノクローナル抗イディオタイプ抗体０．１ｍＬでインキュベートする。２回目の洗浄サイクルの後、細胞を、以前と同じ条件下で１５μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体０．１ｍＬでインキュベートする。対照として、細胞を、抗Ｈｉｓ ＩｇＧ、その後、三重特異性抗原結合タンパク質が無いＦＩＴＣ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体でインキュベートする。その後、細胞を再び洗浄し、死細胞を除外するために２μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含有する０．２ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁した。１×１０^４の生細胞の蛍光を、ＭＸＰソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｋｒｅｆｅｌｄ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用するＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ ＦＣ５００ ＭＰＬフローサイトメーター、又は、Ｉｎｃｙｔｅソフトウェア（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーターを用いて測定する。細胞サンプルの平均蛍光強度を、ＣＸＰソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｋｒｅｆｅｌｄ， Ｇｅｒｍａｎｙ）又はＩｎｃｙｔｅソフトウェア（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して計算する。第二・第三の試薬単独で染色した細胞の蛍光強度値を控除した後、この値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ｖｅｒｓｉｏｎ ６．００ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ， ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡ）の１サイト結合（双曲線）の方程式でのＫＤ値の計算に使用する。

【0082】

ＣＤ３結合親和性と交差反応性、ＣＤ３^＋Ｊｕｒｋａｔ細胞とカニクイザルＣＤ３^＋ＨＳＣ−Ｆ細胞株（ＪＣＲＢ，ｃａｔ．：ＪＣＲＢ１１６４）上での滴定及びフローサイトメトリー実験において評価する。ＣＤ２０ｎｏ結合と交差反応性を、ヒトＣＤ２０^＋腫瘍細胞株上で評価する。交差反応性のＫＤ比率を、組換え型ヒト抗原又は組換え型カニクイザル抗原を発現させるＣＨＯ細胞株上で判定されたＫＤ値を使用して、計算する。

【0083】

実施例３：細胞毒性アッセイ
実施例１の三重特異性抗原結合タンパク質を、ＣＤ２０^＋標的細胞へのＴ細胞依存性の細胞毒性の媒介に対して、インビトロで評価する。

【0084】

蛍光標識化ＣＤ２０^＋ＲＥＣ−１細胞（マントル細胞リンパ腫細胞株、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−３００４）を、実施例１の三重特異性抗原結合タンパク質の存在下で、エフェクター細胞として無作為なドナー又はＣＢ１５ Ｔ細胞（標準化されたＴ細胞株）の分離されたＰＢＭＣで、インキュベートする。３７℃で４時間のインキュベーションの後、湿らされたインキュベーターにおいて、標的細胞から上清への蛍光色素の放出を分光蛍光計中で判定する。実施例１の三重特異性抗原結合タンパク質無しでインキュベートされた標的細胞、及び、インキュベーションの終わりにサポニンの添加により完全に溶解された標的細胞は、負及び正の対照としてそれぞれ役立つ。

【0085】

測定された残る標的生細胞に基づき、特定の細胞溶解のパーセンテージを、以下の式に従い計算する：［１−（生きた標的_{（サンプル）}の数／生きた標的_{（自発性）}の数）］×１００％。Ｓ字状の用量応答曲線とＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを使用して非線形回帰／４つのパラメータのロジスティックフィットにより計算する。与えられた抗体濃度について得られた溶解値を使用して、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて４つのパラメータのロジスティックフィット分析によりＳ字状の用量応答曲線を計算する。

【0086】

実施例４：三重特異性抗原結合タンパク質の薬物動態
実施例１の三重特異性抗原結合タンパク質を、動物研究において半減期消失について評価する。

【0087】

三重特異性抗原結合タンパク質を、０．５ｍｇ／ｋｇのボーラス注射としてカニクイザルの筋肉内に投与する。別のカニクイザル群は、ＣＤ３及びＣＤ２０に対する結合ドメインを持つがＨＳＡ結合を欠いている、同等のサイズのタンパク質を受ける。第３及び第４の群は、ＣＤ３とＨＳＡの結合ドメインを持つタンパク質、及びＣＤ２０とＨＳＡの結合ドメインを持つタンパク質それぞれを受け、共に、三重特異性抗原結合タンパク質と同等のサイズである。試験群はそれぞれ５匹のサルから成る。血清サンプルを示された時点で得て、連続希釈し、タンパク質の濃度を、ＣＤ３及び／又はＣＤ２０に対する結合ＥＬＩＳＡを使用して判定する。

【0088】

被験物質の血漿濃度を使用して薬物動態解析を行う。各被験物質に関する群平均血漿データは、投薬後の時間（ｔｉｍｅ ｐｏｓｔ−ｄｏｓｉｎｇ）に対してプロットされた時、多指数のプロファイルに一致する。データは、分布及び消失の段階のために、ボーラス入力及び一次反応速度定数を伴う標準の２つの区画モデルにより適合される。静脈内投与のデータの最良適合に関する一般的な方程式は、次のとおりである：ｃ（ｔ）＝Ａｅ^−αｔ＋Ｂｅ^−βｔ、ここで、ｃ（ｔ）は時間ｔでの血漿濃度であり、ＡとＢはＹ軸上の切片であり、αとβは、それぞれ分布及び消失の段階の明白な一次反応速度定数である。α−段階は、クリアランスの初期段階であり、動物の全ての細胞外液へのタンパク質の分布を反映するが、減衰曲線の第２又はβ−段階部分は真性血漿の除去を表わす。そのような方程式に適合する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ａ＝Ｄ／Ｖ（α−ｋ２１）／（α−β）、Ｂ＝Ｄ／Ｖ（β−ｋ２１）／（α−β）、及びαとβ（α＞βについて）は、Ｖ＝分布容積、ｋ１０＝排出速度、ｋ１２＝区画１から区画２への移送速度、ｋ２１＝区画２から区画１への移送速度、及びＤ＝投与量の推定されたパラメータを用いる、二次方程式：ｒ^２＋（ｋ１２＋ｋ２１＋ｋ１０）ｒ＋ｋ２１ｋ１０＝０のルートである。

【0089】

データ分析：濃度対時間のプロファイルのグラフを、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ （ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（商標） Ｖ． ３．０９ Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ １９８６−１９９７． Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ． Ｒｅａｄｉｎｇ， Ｐａ．）を使用して作成した。報告可能なものより少ない（ＬＴＲ）ものとして報告された値は、ＰＫ分析には含まれず、図表で表わされない。薬物動態パラメータを、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標） Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｖ． ３．１ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（商標） Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ １９９８−１９９９． Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ． Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， Ｃａｌｉｆ．）を使用したコンパートメント解析により判定する。Ｒｉｔｓｃｈｅｌ Ｗ Ａ ａｎｄ Ｋｅａｒｎｓ Ｇ Ｌ， １９９９， ＩＮ： Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃに記載されるように、薬物動態パラメータを計算する。

【0090】

実施例１の三重特異性抗原結合タンパク質は、ＨＳＡ結合ドメインを欠くタンパク質と比較して、消失半減期の増加など、薬物動態パラメータを改善したことが予測される。

【0091】

実施例５：異種移植腫瘍モデル
実施例１の三重特異性抗原結合タンパク質を、異種移植モデルにおいて評価する。

【0092】

メスの免疫不全ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスを亜致死的に照射し（２Ｇｙ）、４×１０^６のＲａｍｏｓ ＲＡ１細胞を右背部の速腹部へと皮下に播種させた。腫瘍が１００〜２００ｍｍ^３に到達したら、動物を３つの処置群に割り当てる。群２と３（各々８匹の動物）に、１．５×１０^７の活性化ヒトＴ細胞を腹腔内注射する。３日後、続いて群３の動物を、実施例１の５０μｇの三重特異性抗原結合タンパク質の合計９回の静脈内投与で処置する（ｑｄｘ９ｄ）。群１と２をビヒクルのみで処置する。体重と腫瘍容積を３０日間測定する。

【0093】

実施例１の三重特異性抗原結合タンパク質で処置した動物は、それぞれのビヒクルで処置した対照群に比べて、腫瘍増殖を統計的に著しく遅延させたことが、予測される。

【0094】

実施例６：Ｂ細胞リンパ腫患者に対する実施例１の三重特異性抗原結合タンパク質の投与のための、概念実証の臨床試験プロトコル
これは、Ｂ細胞リンパ腫の処置として、実施例１の三重特異性抗原結合タンパク質を研究するための第Ｉ／ＩＩ相の臨床試験である。

【0095】

研究目的：

【0096】

第１：実施例１の三重特異性抗原結合タンパク質の最大耐用量

【0097】

第２：実施例１の三重特異性抗原結合タンパク質のインビトロでの応答が臨床応答に関連するかどうかを判定すること

【0098】

第Ｉ相

【0099】

最大耐用量（ＭＴＤ）を、試験の第Ｉ相セクションにおいて判定する。
１．１ 最大耐用量（ＭＴＤ）を、試験の第Ｉ相セクションにおいて判定する。
１．２ 適格基準を満たす患者を、実施例１の三重特異性抗原結合タンパク質に対する試験に参加させる。
１．３ 目標は、参加者において重度又は手に余る副作用無しに、安全に投与され得る実施例１の三重特異性抗原結合タンパク質の最高用量を識別することである。与えられた用量は、以前の研究に登録された参加者の数、及び用量にどれくらい十分な耐性があったかに依存する。全ての参加者が同じ用量を受けるとは限らない。

【0100】

第ＩＩ相
２．１ 次の第ＩＩ相セクションをＭＴＤにおいて処理し、その目標は、実施例１の三重特異性抗原結合タンパク質による治療が、少なくとも２０％の応答率を結果としてもたらすかどうかを判定することである。
第ＩＩ相の第１の目的−−−実施例１の三重特異性抗原結合タンパク質の治療により、少なくとも２０％の患者が臨床応答（芽細胞応答、微細な応答、部分応答、又は完全応答）を達成したかどうかを判定すること

【0101】

適格性：
２００１〜２００７年の、現行のＷｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎに従い、組織学的に確認され新たに診断された、活動的なＢ細胞リンパ腫
疾患の任意のステージ。
Ｒ−ＣＨＯＰ又はＲ−ＣＨＯＰ様のレジメン（＋／−移植）による処置。
年齢≧１８歳
カルノフスキーパフォーマンスステータス≧５０％又はＥＣＯＧパフォーマンスステータス０−２
平均余命≧６週

【0102】

実施例７：三重特異性抗原結合分子の結合および細胞毒性活性を評価する方法
＜タンパク質産生＞
三重特異性分子の配列を、リーダー配列が先行し、６ｘヒスチジンタグ（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ Ｔａｇ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９）が後続して、哺乳動物発現ベクターｐＣＤＮＡ ３．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へとクローン化した。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａ１４５２７）を、Ｅｘｐｉ２９３培地中の０．２−８ｘ１ｅ６細胞／ｍｌでＯｐｔｉｍｕｍ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆｌａｓｋｓ （Ｔｈｏｍｓｏｎ）において懸濁液中で維持した。精製されたプラスミドＤＮＡを、Ｅｘｐｉ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａ１４６３５）プロトコルに従って、Ｅｘｐｉ２９３細胞へトランスフェクトし、トランスフェクション後４−６日間維持した。調整培地を、親和性および脱塩のクロマトグラフィーによって部分的に精製した。続いて、三重特異性タンパク質を、イオン交換によって磨き、または代替的に、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａの遠心濾過ユニット（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００のサイズ排除培地（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、賦形剤を含有している中性緩衝液中に溶解した。フラクションプール（Ｆｒａｃｔｉｏｎ ｐｏｏｌｉｎｇ）および最終的な純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび分析的なＳＥＣによって評価した。

【0103】

＜親和性測定＞
すべての結合ドメイン分子の親和性を、Ｏｃｔｅｔの機器を使用して、バイオレイヤー干渉法によって測定した。

【0104】

ＰＳＭＡ親和性を、１２０秒間ヒトＰＳＭＡ−Ｆｃタンパク質（１００ｎＭ）を抗ヒトＩｇＧ Ｆｃバイオセンサー上に充填することによって測定し、続いて、６０秒のベースラインで測定し、その後、１８０秒間三重特異性分子の希釈系列でセンサー先端部をインキュベートすることによって会合を測定し、続いて、５０秒間解離した。ＥＧＦＲおよびＣＤ３の親和性を、１２０秒間、それぞれ（１００ｎＭ）、ヒトＥＧＦＲ−Ｆｃタンパク質またはヒトＣＤ３−Ｆｌａｇ−Ｆｃタンパク質を抗ヒトＩｇＧ Ｆｃバイオセンサー上へと充填することによって測定し、続いて、６０秒のベースラインで測定し、その後、１８０秒間三重特異性分子の希釈系列でセンサー先端部をインキュベートすることによって会合を測定し、続いて、３００秒間解離した。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対する親和性を、ビオチン化アルブミンをストレプトアビジンバイオセンサー上へと充填することによって測定し、その後、ＣＤ３親和性測定と同じ動態パラメーターに従って測定した。すべての工程を、リン酸緩衝食塩水における０．２５％のカゼイン中で３０℃で実行した。

【0105】

＜細胞毒性アッセイ＞
腫瘍細胞を死滅させるようにＴ細胞に指向する、三重特異性分子を含むＴ細胞エンゲージャー（ｅｎｇａｇｅｒｓ）の能力を測定するために、ヒトＴ細胞依存性細胞毒性（ＴＤＣＣ）アッセイが使用される（Ｎａｚａｒｉａｎ ｅｔ ａｌ． ２０１５． Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ． ２０：５１９−２７）。このアッセイにおいて、Ｔ細胞および標的癌細胞株の細胞は、３８４ウェルのプレートにおいて１０：１の比率で一緒に混合され、様々な量のＴ細胞エンゲージャーが加えられる。４８時間後、Ｔ細胞は洗浄され、Ｔ細胞によって死滅されなかったプレート標的細胞に結合されたままにされる。残りの生細胞を定量化するために、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）が使用される。

【0106】

＜サイトカインアッセイ＞
Ｔ細胞が標的細胞の存在下で三重特異性分子によって活性化されるという証拠を得るために、ＴＮＦアルファおよびインターフェロンガンマのためのＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）が使用される。このアッセイに関しては、初代ヒトＴ細胞およびヒト腫瘍細胞が、細胞毒性アッセイ下で記載されるような試験分子の存在下でインキュベートされる。インキュベーションの４８時間後、アッセイ上清の２マイクロリットルの分割量が、製造業者の指示に従って分析される。

【0107】

＜拡散アッセイ＞
マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（７５μＬ）の層を、２４ウェルのトランスウエル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）のインサート（０．４μｍ）に加え、その後、ＰＢＳを、上部および下部のチャンバーに加え（それぞれ、１００μＬおよび１０２５μＬ）、４℃で一晩平衡化した。１００ｐｍｏｌのＩｇＧまたはＦａｂ（ヤギ抗ヒトＦｃ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）三重特異性分子を、上部チャンバーに加え、下部チャンバーへの各分子の拡散を、各分子に特異的なＥＬＩＳＡによって経時的に定量化した。ＩｇＧおよびＦａｂを、ＥＬＩＳＡプレート上で固定されたロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）によって捕捉し、ホースラディッシュペルオキシダーゼが抱合したロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）およびＴＭＢ開発で検出した。三重特異性分子を、ＥＬＩＳＡプレート上で固定されたヒト血清アルブミン（Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって捕捉し、ホースラディッシュペルオキシダーゼが抱合した抗Ｈｉｓ抗体（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）およびＴＭＢ開発で検出した。

【0108】

各時間点での相対的拡散を、次のように計算した：（時間＝ｔでの下部チャンバーにおける濃度）／（時間＝ｔでの上部チャンバーにおける濃度）

【0109】

ＩｇＧ分子とＦａｂまたは三重特異性分子との間の拡散の統計的有意差を、独立ｔ検定を使用して特定した。

【0110】

実施例８：ＥＧＦＲ標的化三重特異性分子のための親和性測定
ＥＧＦＲ標的化分子における３つの結合ドメインの親和性を、Ｏｃｔｅｔの機器を使用してバイオレイヤー干渉法によって測定し、表１に要約する。

【0111】

ＥＧＦＲ結合ドメインが分子のＮ末端で位置付けられる三重特異性分子は、中央またはＣ末端位置においてＥＧＦＲ結合ドメインを含有していた三重特異性分子と比較して、ＥＧＦＲに対する著しくより高い親和性を示した。同様に、Ｎ末端でアルブミン結合ドメインを含有している三重特異性分子も、中間またはＣ末端位置においてアルブミンを含有している三重特異性分子よりＨＳＡに対するより高い親和性を示した。対照的に、すべての三重特異性分子は、三重特異性分子内の結合ドメインの位置とは無関係に、ヒトＣＤ３に対する非常に類似した親和性を示した。

【0112】

実施例９：ＰＳＭＡ標的化三重特異性分子のための親和性測定
ＰＳＭＡ標的化分子における３つの結合ドメインの親和性を、Ｏｃｔｅｔの機器を使用してバイオレイヤー干渉法によって測定し、表２に要約する。

【0113】

Ｎ末端でアルブミン結合ドメインを含有している三重特異性分子は、中間またはＣ末端位置においてアルブミン結合ドメインを含有している三重特異性分子よりＨＳＡに対する高い親和性を有した。対照的に、ＣＤ３結合ドメインの位置は、その標的に対する親和性に影響を与えなかった。同様に、ＰＳＭＡ結合ドメインの位置は、親和性に対する影響をほとんど与えず、すべての三重特異性分子が、互いに３倍以内のヒトＰＳＭＡに対する親和性を有していた。

【0114】

実施例１０：三重特異性分子を用いる細胞毒性アッセイ
三重特異性分子を、Ｔ細胞依存性細胞毒性（ＴＤＣＣ）アッセイにおいて、腫瘍標的依存的な方法でヒト腫瘍細胞を死滅させるように初代ヒトＴ細胞を誘導する、それらの能力に関して試験した。

【0115】

ＥＧＦＲまたはＰＳＭＡに対する単一ドメイン抗体由来の腫瘍標的化ドメインを含有している三重特異性分子は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）に匹敵する方法で強力な細胞死滅を誘導することができる（図５を参照）。

【0116】

単一ドメイン抗ＥＧＦＲ抗体を有する６つのＥＧＦＲ標的化三重特異性分子（図４を参照）および抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖを含有している三重特異性分子を、ＮＣＩ−１５６３ヒト肺腺癌細胞株を使用してＴＤＣＣアッセイにおいて試験した。比較のために、各アッセイにＥＧＦＲ ＢｉＴＥを含めた（Ｌｕｔｔｅｒｂｕｅｓｅ ｅｔ ａｌ． ２００７． ＰＮＡＳ １０７： １２６０５−１２６１０）。すべての７つのＥＦＧＲ標的化三重特異性分子の構成が、ＥＧＦＲ ＢｉＴＥに類似した効力で、標的細胞を有効に死滅させる（表３および４、および図６および８における代表的なデータを参照）ことが実証された。三重特異性分子のＴＤＣＣ活性に対するアルブミン結合の影響を評価するために、ＴＤＣＣアッセイをまた、１５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンの付加とともに実行した。予測通り、アルブミン結合ドメインを欠く、ＥＧＦＲ ＢｉＴＥの効力は、アルブミンの存在下または不存在下で類似していた。三重特異性分子の効力はアルブミンの存在下で低減したが、低減の程度は分子の構成に依存していた。その効力がアルブミンの存在下で最小に低減した構成は、ＥＧＦＲ−ｓｃＦｖ：Ｃ：ＡおよびＥ：Ａ：Ｃ（抗ＥＧＦＲ−ｓｃＦｖ：抗ＣＤ３Ｅ−ｓｃＦｖ：抗ＡＬＢ−ｓｄＡｂおよび抗ＥＧＦＲ−ｓｄＡｂ：抗ＡＬＢ−ｓｄＡｂ：抗ＣＤ３Ｅ−ｓｃＦｖ）であった。

【0117】

ＥＧＦＲ標的化三重特異性分子の結果が、すべての三重特異性分子に当てはまり得ることを実証するために、単一ドメイン抗ＰＳＭＡ抗体を有する５つのＰＳＭＡ標的化三重特異性分子および抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖを含有している三重特異性分子を、２２Ｒｖ１のヒト前立腺癌上皮細胞株を使用してＴＤＣＣアッセイにおいて試験した。比較のために、アッセイにＰＳＭＡ ＢｉＴＥ（パソツキシズマブ）を含めた。代表的な結果は、表５および図７中に見られる。ＰＳＭＡ標的化三重特異性分子のほとんどは、Ａ：Ｃ：Ｐ構成（抗ＰＳＭＡ−ｓｄＡｂ：抗ＣＤ３Ｅ−ｓｃＦｖ：抗ＡＬＢ−ｓｄＡｂ）を有する三重特異性分子を除いて、ＴＤＣＣアッセイにおいてＰＳＭＡ ＢｉＴＥに類似した活性を有していた。これらの三重特異性分子をまた、三重特異性分子のＴＤＣＣ活性に対するアルブミン結合の影響を評価するために、１５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを含むＴＤＣＣアッセイにおいて試験した。予測通り、アルブミン結合ドメインを欠く、ＰＳＭＡ ＢｉＴＥの効力は、アルブミンの存在下または不存在下で類似していた。三重特異性分子の効力はアルブミンの存在下で低減したが、低減の程度は分子の構成に依存していた。その効力がアルブミンの存在下で最小に低減した構成は、Ｐ：Ａ：Ｃ（抗ＰＳＭＡ−ｓｄＡｂ：抗ＡＬＢ−ｓｄＡｂ：抗ＣＤ３Ｅ−ｓｃＦｖ）であった。

【0118】

本明細書に記載される三重特異性分子は、標的腫瘍細胞に対する様々なモダリティを利用することができる。図５、６および７は、ｓｄＡｂ由来の腫瘍標的化ドメインを有する三重特異性分子を示し、図７および８は、ｓｃＦｖ由来の腫瘍結合ドメインを有する三重特異性分子が等しく好適に作用することができることを示している。図９は、腫瘍標的化ドメインが、ｓｄＡｂｓおよびｓｃＦｖｓのような抗体に由来する構築物に限定されないことを実証しているが、非免疫グロブリンドメインも作用することができる。
本実施例では、ヒト卵巣癌細胞を死滅させるように、静止するヒトＴ細胞に再指向するために、Ｈｅｒ２に特異的な７ｋＤａのｆｙｎｏｍｅｒが使用される。

【0119】

実施例１１：三重特異性分子を用いるサイトカイン産生アッセイ
本明細書で試験された三重特異性分子が、Ｔ細胞を活性化し、腫瘍細胞を死滅させるようにこれらのＴ細胞に再指向したことを示すために、サイトカインＴＮＦαおよびＩＦＮγの産生を、Ｔ細胞が活性化されるとこれらのサイトカインを産生するため、Ｔ細胞の細胞死滅活性と平行して測定した。

【0120】

図１０および１１に示されるように、４つの試験されたＥＧＦＲおよびＰＳＭＡ標的化三重特異性分子は、それらの細胞死滅活性に類似した効力を有して、ＴＮＦαおよびインターフェロンγの産生を刺激した。これらのデータは、三重特異性分子が、標的細胞に結合するときにＴ細胞を活性化するという記述と一致している。

【0121】

実施例１２：拡散アッセイ
本明細書で分析された三重特異性分子は、従来のＩｇＧ分子より小さく、したがって、モノクローナル抗体より速く拡散し、より好適に組織に浸透することが予期される。この特性を評価するために、マトリゲルによる拡散／移動アッセイを開発した。この目的のために、トランスウエルのアッセイプレートを、多くの組織中で見られる複合細胞外環境に類似しているゼラチン様タンパク質の混合物である、マトリゲルでコーティングした。三重特異性分子、全長ＩｇＧまたはＦａｂフラグメントを、上部チャンバーに加えた。８時間および１２時間後、下部チャンバーを、マトリックスを通って移動することができる巨大分子の量に関して評価した。図１２に示されるように、三重特異性分子は、全長ＩｇＧ分子よりはるかに速い速度で両方の時間点で移動した。

【0122】

実施例１３：ヒトＣＤ３εに対する様々な親和性を有する抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ変異体の特定
＜親の抗ＣＤ３εファージの特徴づけ＞
親の抗ＣＤ３εは、ビオチン−ＣＤ３εに対する優れた結合およびビオチン−ＨＳＡに対する低い結合を示した（図１３）。

【0123】

＜抗ＣＤ３ε ｓｃＦｖファージライブラリー＞
重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、および軽鎖ＣＤＲ３ドメインのための単一の置換ライブラリーを提供した。残基は、変異原性によって一度に一つずつ変えられた。

【0124】

＜クローンの選択および結合親和性の判定＞
単一の置換ライブラリーを、ビオチン化ｈｕＣＤ３εに結合させ、洗浄し、溶出し、カウントした。ビオチン化ｃｙｎｏＣＤ３を、ラウンド１の選択標的として使用し、２つの独立したライブラリー（〜２ｘ選択）からの組み合わせのファージ結合後４時間洗浄した。ビオチン化ｈｕ−ＣＤ３を、ラウンド２の選択標的として使用し、両方のライブラリー（＜２ｘ選択）の結合後３時間洗浄した。第２ラウンドの選択からのＰＣＲｅｄインサートを、ｐｃＤＮＡ３．４ Ｈｉｓ６発現ベクターへとサブクローン化した。１８０のクローンを選択し、ＤＮＡを、精製し、配列決定し、Ｅｘｐｉ２９３へとトランスフェクトした。ヒトＣＤ３εに対する親和性の範囲を有する１６のクローンのパネルを、より正確なＫｄ判定のために選択した（表６）。

【0125】

表１は、３つの標的抗原に対するＥＧＦＲ標的化単一ドメイン抗体を含有している三重特異性分子の親和性を要約する。表の略語に対するキー：Ｅ＝抗ＥＧＦＲ単一ドメイン抗体、Ｃ＝抗ＣＤ３Ｅ ｓｃＦｖ、Ａ＝抗アルブミン単一ドメイン抗体。

【0126】

【表1】

【0127】

表２は、３つの標的抗原に対するＰＳＭＡ標的化単一ドメイン抗体を含有している三重特異性分子の親和性を要約する。表の略語に対するキー：Ｐ＝抗ＰＳＭＡ単一ドメイン抗体、Ｃ＝抗ＣＤ３Ｅ ｓｃＦｖ、Ａ＝抗アルブミン単一ドメイン抗体。

【0128】

【表2】

【0129】

表３は、細胞死滅アッセイにおけるＥＧＦＲ標的化単一ドメイン抗体を含有している三重特異性分子の効力を要約する。ＥＣ５０値はモル濃度として示される。表の略語に対するキー：Ｅ＝抗ＥＧＦＲ単一ドメイン抗体、Ｃ＝抗ＣＤ３Ｅ ｓｃＦｖ、Ａ＝抗アルブミン単一ドメイン抗体。

【0130】

【表3】

【0131】

表４は、細胞死滅アッセイにおけるＥＧＦＲ標的化ｓｃＦｖ抗体を含有している三重特異性分子およびＢｉＴＥ分子の効力を要約する。ＥＣ５０値はモル濃度として示される。表の略語に対するキー：Ｅ＝抗ＥＧＦＲ単一ドメイン抗体、Ｃ＝抗ＣＤ３Ｅ ｓｃＦｖ、Ａ＝抗アルブミン単一ドメイン抗体。

【0132】

【表4】

【0133】

表５は、細胞死滅アッセイにおけるＰＳＭＡ標的化単一ドメイン抗体を含有している三重特異性分子の効力を要約する。ＥＣ５０値はモル濃度として示される。表の略語に対するキー：Ｐ＝抗ＰＳＭＡ単一ドメイン抗体、Ｃ＝抗ＣＤ３Ｅ ｓｃＦｖ、Ａ＝抗アルブミン単一ドメイン抗体。

【0134】

【表5】

【0135】

表６は、ＣＤ３ｅ ｓｃＦｖファージライブラリーの結合親和性を要約する。

【0136】

【表6】

【0137】

【表7-1】

【0138】

【表7-2】

【0139】

【表7-3】

【0140】

【表7-4】

【0141】

【表7-5】

【0142】

【表7-6】

【0143】

【表7-7】

【0144】

【表8-1】

【0145】

【表8-2】

【0146】

【表8-3】

【0147】

【表8-4】

【0148】

本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され記載されているが、そのような実施形態が例示目的のみで提供されることは当業者にとって明白となる。多くの変更、変化および置換が、本発明から逸脱することなく当業者に想到される。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が、本発明の実施において利用され得ることを理解されたい。以下の請求項は本発明の範囲を定義するものであり、これらの請求項の範囲内の方法および構造並びにそれらの同等物が、それによって包含されるものであることが意図されている。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]