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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6692028
(24)【登録日】2020年4月16日
(45)【発行日】2020年5月13日
(54)【発明の名称】幹細胞の品質管理方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6844 20180101AFI20200427BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20200427BHJP
C12Q 1/04 20060101ALI20200427BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20200427BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6844 Z
C12N5/10ZNA
C12Q1/04
!C12N15/09 Z
【請求項の数】5
【全頁数】34
(21)【出願番号】特願2016-554145(P2016-554145)
(86)(22)【出願日】2015年10月16日
(86)【国際出願番号】JP2015079370
(87)【国際公開番号】WO2016060264
(87)【国際公開日】20160421
【審査請求日】2018年10月9日
(31)【優先権主張番号】特願2014-213137(P2014-213137)
(32)【優先日】2014年10月17日
(33)【優先権主張国】JP
(31)【優先権主張番号】特願2015-101662(P2015-101662)
(32)【優先日】2015年5月19日
(33)【優先権主張国】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】390037327
【氏名又は名称】積水メディカル株式会社
(73)【特許権者】
【識別番号】304023994
【氏名又は名称】国立大学法人山梨大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】與谷 卓也
(72)【発明者】
【氏名】太平 博暁
(72)【発明者】
【氏名】根本 有理子
(72)【発明者】
【氏名】砂村 栄一郎
(72)【発明者】
【氏名】久保田 健夫
(72)【発明者】
【氏名】三宅 邦夫
(72)【発明者】
【氏名】武居 美沙
【審査官】
堂畑 厚志
(56)【参考文献】
【文献】
特表２０１４−５００７０８（ＪＰ，Ａ）
【文献】
米国特許出願公開第２０１３／０２９５５６９（ＵＳ，Ａ１）
【文献】
米国特許出願公開第２０１２／０１５７３３９（ＵＳ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２０１４／１３６９３０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２００９／０５７８３１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
PAN, C. et al.，SNL fibroblast feeder layers support derivation and maintenance of human induced pluripotent stem cells，Journal of Genetics and Genomics，２０１０年，vol. 37，p. 241-248
【文献】
NISHINO, K. et al.，DNA Methylation Dynamics in Human Induced Pluripotent Stem Cells over Time，PLoS Genetics，２０１１年 ５月２６日，vol. 7, Iss. 5，e1002085
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｑ
Ｃ１２Ｎ
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
人工多能性幹細胞の品質管理方法であって、該方法は、以下：
初期化処理された細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理すること；
該亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、脱メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅すること；
得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得ること；および、
該初期化処理された細胞またはその培養物から得た検出シグナルのピークの保持時間が、対照の検出シグナルのピークの保持時間よりも延長している場合に、該初期化処理された細胞を人工多能性幹細胞であると判定すること、
ここで、該対照の検出シグナルは、初期化処理されていない細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理した後、該プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅し、得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけて得られた検出シグナルである、
を含み、
該脱メチル化遺伝子は、ＳＬＣ２２Ａ３およびＯｃｔ３／４からなる群より選ばれる少なくとも１つであり、
該脱メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットは、以下：
該脱メチル化遺伝子がＳＬＣ２２Ａ３の場合、配列番号１３からなるプライマーと配列番号１４からなるプライマーとのセット；
該脱メチル化遺伝子がＯｃｔ３／４の場合、配列番号１５からなるプライマーと配列番号１６からなるプライマーとのセット、
である、方法。
初期化処理された細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理すること；
該亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、脱メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅すること；
得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得ること；および、
該初期化処理された細胞またはその培養物から得た検出シグナルのピークの保持時間が、対照の検出シグナルのピークの保持時間よりも延長している場合に、該初期化処理された細胞を人工多能性幹細胞であると判定すること、
ここで、該対照の検出シグナルは、初期化処理されていない細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理した後、該プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅し、得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけて得られた検出シグナルである、
を含み、
該脱メチル化遺伝子は、ＳＬＣ２２Ａ３およびＯｃｔ３／４からなる群より選ばれる少なくとも１つであり、
該脱メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットは、以下：
該脱メチル化遺伝子がＳＬＣ２２Ａ３の場合、配列番号１３からなるプライマーと配列番号１４からなるプライマーとのセット；
該脱メチル化遺伝子がＯｃｔ３／４の場合、配列番号１５からなるプライマーと配列番号１６からなるプライマーとのセット、
である、方法。
【請求項2】
人工多能性幹細胞の品質管理方法であって、該方法は、以下：
初期化処理された細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理すること；
該亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅すること；
得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得ること；および、
該初期化処理された細胞またはその培養物から得た検出シグナルのピークの保持時間が、対照の検出シグナルのピークの保持時間よりも短縮している場合に、該初期化処理された細胞を人工多能性幹細胞であると判定すること、
ここで、該対照の検出シグナルは、初期化処理されていない細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理した後、該プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅し、得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけて得られた検出シグナルである、
を含み、
該メチル化遺伝子は、ＳＰ１００およびＵＢＥ１Ｌからなる群より選ばれる少なくとも１つであり、
該メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットは、以下：
該メチル化遺伝子がＳＰ１００の場合、配列番号１７からなるプライマーと配列番号１０からなるプライマーとのセット；
該メチル化遺伝子がＵＢＥ１Ｌの場合、配列番号１８からなるプライマーと配列番号１９からなるプライマーとのセット、
である、方法。
初期化処理された細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理すること；
該亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅すること；
得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得ること；および、
該初期化処理された細胞またはその培養物から得た検出シグナルのピークの保持時間が、対照の検出シグナルのピークの保持時間よりも短縮している場合に、該初期化処理された細胞を人工多能性幹細胞であると判定すること、
ここで、該対照の検出シグナルは、初期化処理されていない細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理した後、該プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅し、得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけて得られた検出シグナルである、
を含み、
該メチル化遺伝子は、ＳＰ１００およびＵＢＥ１Ｌからなる群より選ばれる少なくとも１つであり、
該メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットは、以下：
該メチル化遺伝子がＳＰ１００の場合、配列番号１７からなるプライマーと配列番号１０からなるプライマーとのセット；
該メチル化遺伝子がＵＢＥ１Ｌの場合、配列番号１８からなるプライマーと配列番号１９からなるプライマーとのセット、
である、方法。
【請求項3】
人工多能性幹細胞の品質管理方法であって、該方法は、以下：
（１−１）初期化処理された細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理すること；
（１−２）初期化処理されていない細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理すること；
（２−１）工程（１−１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、脱メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅すること；
（２−２）工程（１−１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅すること；
（２−３）工程（１−２）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、脱メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅すること；
（２−４）工程（１−２）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅すること；
（３−１）工程（２−１）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得ること；
（３−２）工程（２−２）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得ること；
（３−３）工程（２−３）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得ること；
（３−４）工程（２−４）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得ること；
（４）工程（３−１）で得られた検出シグナルのピークの保持時間が、工程（３−３）で得られた検出シグナルのピークの保持時間よりも延長しており、かつ工程（３−２）で得られた検出シグナルのピークの保持時間が、工程（３−４）で得られた検出シグナルのピークの保持時間よりも短縮している場合に、該初期化処理された細胞を人工多能性幹細胞であると判定すること、
を含み、
該脱メチル化遺伝子は、ＳＬＣ２２Ａ３およびＯｃｔ３／４からなる群より選ばれる少なくとも１つであり、
該脱メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットは、以下：
該脱メチル化遺伝子がＳＬＣ２２Ａ３の場合、配列番号１３からなるプライマーと配列番号１４からなるプライマーとのセット；
該脱メチル化遺伝子がＯｃｔ３／４の場合、配列番号１５からなるプライマーと配列番号１６からなるプライマーとのセット、
であり、
該メチル化遺伝子は、ＳＰ１００およびＵＢＥ１Ｌからなる群より選ばれる少なくとも１つであり、
該メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットは、以下：
該メチル化遺伝子がＳＰ１００の場合、配列番号１７からなるプライマーと配列番号１０からなるプライマーとのセット；
該メチル化遺伝子がＵＢＥ１Ｌの場合、配列番号１８からなるプライマーと配列番号１９からなるプライマーとのセット、
である、方法。
（１−１）初期化処理された細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理すること；
（１−２）初期化処理されていない細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理すること；
（２−１）工程（１−１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、脱メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅すること；
（２−２）工程（１−１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅すること；
（２−３）工程（１−２）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、脱メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅すること；
（２−４）工程（１−２）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅すること；
（３−１）工程（２−１）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得ること；
（３−２）工程（２−２）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得ること；
（３−３）工程（２−３）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得ること；
（３−４）工程（２−４）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得ること；
（４）工程（３−１）で得られた検出シグナルのピークの保持時間が、工程（３−３）で得られた検出シグナルのピークの保持時間よりも延長しており、かつ工程（３−２）で得られた検出シグナルのピークの保持時間が、工程（３−４）で得られた検出シグナルのピークの保持時間よりも短縮している場合に、該初期化処理された細胞を人工多能性幹細胞であると判定すること、
を含み、
該脱メチル化遺伝子は、ＳＬＣ２２Ａ３およびＯｃｔ３／４からなる群より選ばれる少なくとも１つであり、
該脱メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットは、以下：
該脱メチル化遺伝子がＳＬＣ２２Ａ３の場合、配列番号１３からなるプライマーと配列番号１４からなるプライマーとのセット；
該脱メチル化遺伝子がＯｃｔ３／４の場合、配列番号１５からなるプライマーと配列番号１６からなるプライマーとのセット、
であり、
該メチル化遺伝子は、ＳＰ１００およびＵＢＥ１Ｌからなる群より選ばれる少なくとも１つであり、
該メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットは、以下：
該メチル化遺伝子がＳＰ１００の場合、配列番号１７からなるプライマーと配列番号１０からなるプライマーとのセット；
該メチル化遺伝子がＵＢＥ１Ｌの場合、配列番号１８からなるプライマーと配列番号１９からなるプライマーとのセット、
である、方法。
【請求項4】
人工多能性幹細胞の品質管理方法であって、該方法は、以下：
（１−１）初期化処理された細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理すること；
（１−２）人工多能性幹細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理すること；
（２−１）工程（１−１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、脱メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセット、および／またはメチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅すること；
（２−２）工程（１−２）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、脱メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセット、および／またはメチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅すること；
（３−１）工程（２−１）得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得ること；
（３−２）工程（２−２）得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得ること；
（４）工程（３−１）で得られた検出シグナルと工程（３−２）で得られた検出シグナルとの間でピークの保持時間に差異がない場合に、該初期化処理された細胞を人工多能性幹細胞であると判定すること、
を含み、
該脱メチル化遺伝子は、ＳＬＣ２２Ａ３およびＯｃｔ３／４からなる群より選ばれる少なくとも１つであり、
該脱メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットは、以下：
該脱メチル化遺伝子がＳＬＣ２２Ａ３の場合、配列番号１３からなるプライマーと配列番号１４からなるプライマーとのセット；
該脱メチル化遺伝子がＯｃｔ３／４の場合、配列番号１５からなるプライマーと配列番号１６からなるプライマーとのセット、
であり、
該メチル化遺伝子は、ＳＰ１００およびＵＢＥ１Ｌからなる群より選ばれる少なくとも１つであり、
該メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットは、以下：
該メチル化遺伝子がＳＰ１００の場合、配列番号１７からなるプライマーと配列番号１０からなるプライマーとのセット；
該メチル化遺伝子がＵＢＥ１Ｌの場合、配列番号１８からなるプライマーと配列番号１９からなるプライマーとのセット、
である、方法。
（１−１）初期化処理された細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理すること；
（１−２）人工多能性幹細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理すること；
（２−１）工程（１−１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、脱メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセット、および／またはメチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅すること；
（２−２）工程（１−２）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、脱メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセット、および／またはメチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅すること；
（３−１）工程（２−１）得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得ること；
（３−２）工程（２−２）得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得ること；
（４）工程（３−１）で得られた検出シグナルと工程（３−２）で得られた検出シグナルとの間でピークの保持時間に差異がない場合に、該初期化処理された細胞を人工多能性幹細胞であると判定すること、
を含み、
該脱メチル化遺伝子は、ＳＬＣ２２Ａ３およびＯｃｔ３／４からなる群より選ばれる少なくとも１つであり、
該脱メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットは、以下：
該脱メチル化遺伝子がＳＬＣ２２Ａ３の場合、配列番号１３からなるプライマーと配列番号１４からなるプライマーとのセット；
該脱メチル化遺伝子がＯｃｔ３／４の場合、配列番号１５からなるプライマーと配列番号１６からなるプライマーとのセット、
であり、
該メチル化遺伝子は、ＳＰ１００およびＵＢＥ１Ｌからなる群より選ばれる少なくとも１つであり、
該メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットは、以下：
該メチル化遺伝子がＳＰ１００の場合、配列番号１７からなるプライマーと配列番号１０からなるプライマーとのセット；
該メチル化遺伝子がＵＢＥ１Ｌの場合、配列番号１８からなるプライマーと配列番号１９からなるプライマーとのセット、
である、方法。
【請求項5】
前記初期化処理された細胞が、初期化処理された皮膚線維芽細胞である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、メチル化ＤＮＡの検出を利用した幹細胞の品質管理方法に関する。より具体的には、分化した細胞に初期化処理を施したのち、初期化処理を施した細胞に由来する細胞から抽出されたＤＮＡのメチル化状態を解析し、遺伝子レベルで前記細胞の初期化の成否を判定する方法に関する。【背景技術】
【0002】
多能性幹細胞は、生体の様々な組織に分化可能な能力（分化万能性）を有することから、創薬スクリーニング、疾患メカニズム研究、および再生医療材料への応用が研究されている。特に、細胞から誘導される人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；以下、ｉＰＳ細胞ともいう）は、倫理上の問題がないため、再生医療材料として有望である。【0003】
幹細胞を識別する方法としては、顕微鏡観察による形態学的識別方法、細胞表面マーカーを抗体により染色する方法、アルカリホスファターゼ活性等の酵素活性を利用して細胞を色素染色する方法、等が知られている。特許文献１には、培養された細胞の平坦度を顕微鏡により解析することにより、多能性幹細胞の分化の度合いを判別する方法が開示されている。【0004】
多能性幹細胞を継代培養すると、細胞の性質は徐々に変化するとされている。細胞の性質変化としては、例えば、分化誘導操作に対する分化傾向の変化、細胞増殖速度の変化、癌化に対する耐性の変化等が例示できる。これらの継代培養に伴う細胞の性質変化は、細胞の形態学的な変化が認められないまま生じる場合があることが知られている。したがって、従来の幹細胞識別方法では、細胞の性質変化を検出できないことがある。【0005】
上記の継代培養に伴う細胞の性質変化は、遺伝子のエピジェネティックな変化、特にＤＮＡのメチル化修飾状態の変化に起因するとされている。ＤＮＡのメチル化修飾状態、またはその発現プロファイルを指標に幹細胞を評価する方法が提案されている。例えば、特許文献２には、各細胞に特徴的な非コードＲＮＡプロファイルを参照プロファイルと比較解析することにより、細胞の多能性などの特性を評価する方法が開示されている。特許文献３には、未分化細胞に特異的な糖鎖に結合するプローブを用いることにより、未分化状態の幹細胞のみを選択的に染色し、幹細胞の分化状態を評価する方法が開示されている。特許文献４には、被験幹細胞から抽出された染色体ＤＮＡについて、メチル化シトシンとヒドロキシメチル化シトシンを検出して基準幹細胞と比較することにより、そのメチル化および脱メチル化パターンを解析し、該パターンを幹細胞の継代または分化のステージと関連付ける、幹細胞の識別方法が開示されている。【0006】
一方、既に確立されたＤＮＡのメチル化状態の解析方法として、亜硫酸水素塩（重亜硫酸塩、バイサルファイト、ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）反応を利用した方法がある。この方法は、メチル化ＤＮＡの解析に最も汎用されている方法である。一本鎖ＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理すると、シトシンはスルホン化、加水脱アミノ化、脱スルホン化を経て、ウラシルに変換される。一方、メチル化されたシトシンは、最初に起こるスルホン化の反応速度が極めて遅いため、実際に行われる亜硫酸水素塩処理の反応時間の中ではメチル化シトシンのままである。従って、亜硫酸水素塩処理をしたＤＮＡを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行うと、メチル化シトシンはシトシンのままであるが、非メチル化シトシンは、ウラシルからチミンに置き換わって増幅される。このＰＣＲ増幅産物の配列中に生じるシトシンとチミンという塩基の違いを利用してメチル化状態を解析する。これを基本原理として汎用されている方法が、特許文献５、非特許文献１に記載のＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ法（メチル化特異的ＰＣＲ解析法）、および非特許文献２、３に記載のバイサルファイトシークエンス法である。【0007】
メチル化特異的ＰＣＲ解析法は、ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理後にメチル化配列特異的プライマーと非メチル化配列特異的プライマーを用いたＰＣＲ増幅、アガロースゲル電気泳動を順に行い、両プライマーによる増幅産物の有無により対象領域のＤＮＡメチル化状態を判定する方法である。特別な装置なしにメチル化ＤＮＡの定量的な解析ができるという点で、現在でも広く使用されるメチル化ＤＮＡ解析方法であるが、解析に電気泳動法を利用する点で手間と時間がかかるという課題があった。【0008】
バイサルファイトシークエンス法は、ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理後にメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡに共通のプライマーを用いたＰＣＲ増幅し、得られたＰＣＲ産物をＴＯＰＯ−ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）などにクローニングした後、シークエンシングによりメチル化の有無を検出するものである。増幅した領域内の全てのＣｐＧ配列のメチル化の状態が分かるという利点があるが、解析に労力を要するので、多数の検体の解析には向いていない場合もある。また、例えばヘミメチル化ＤＮＡや対立遺伝子でＤＮＡメチル状態が異なる遺伝子等のＤＮＡメチル化率をバイサルファイトシークエンス法を用いて解析する場合において、ＤＮＡメチル化率を精度良く算出するためには、多数のクローンをシークエンスする必要がある。すなわち、バイサルファイトシークエンス法を用いてＤＮＡのメチル化状態の変化を解析する場合には、多数の検体を解析しなければならず、非常に多くの時間と労力を必要とするという課題があった。【0009】
イオン交換クロマトグラフィーは、核酸、タンパク質、多糖類といった生体高分子を簡便かつ短時間に精度良く分離分析できる方法として、生化学や医学等の分野において汎用されている。例えば、核酸のＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーを用いて分離する場合、一般的には核酸分子中に含まれるリン酸のマイナス電荷を利用して分離するアニオン交換クロマトグラフィーが用いられる。カチオン性の官能基をイオン交換基として有するカラム充填剤が充填されたアニオン交換クロマトグラフィー用カラムは既に市販され、各種研究分野で使用されている。【0010】
さらに、カチオン性の官能基として強カチオン性基および弱カチオン性基の両方を有するカラム充填剤を充填したカラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーにより、２０ｍｅｒの非メチル化合成オリゴヌクレオチド間における一塩基の相違を分離分析できること、及びＤＮＡのメチル化率の違いにより亜硫酸水素塩処理後のＰＣＲ増幅産物を分離分析できることが報告されている（特許文献６及び７）。【先行技術文献】
【特許文献】
【0011】
【特許文献1】国際公開公報第２０１４／０４１９３５号パンフレット
【特許文献2】国際公開公報第２０１２／０２５７０９号パンフレット
【特許文献3】国際公開公報第２０１３／１２８９１４号パンフレット
【特許文献4】国際公開公報第２０１４／１１２６５５号パンフレット
【特許文献5】米国特許第５７８６１４６号公報
【特許文献6】国際公開公報第２０１２／１０８５１６号パンフレット
【特許文献7】国際公開公報第２０１４／１３６９３０号パンフレット
【非特許文献】
【0012】
【非特許文献1】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，ｐｐ．９８２１−９８２６（１９９６）
【非特許文献2】Ｃｌａｒｋ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２，ｐｐ．２９９０−２９９７（１９９４）
【非特許文献3】新遺伝子工学ハンドブック改訂第４版（村松正實・山本雅編），羊土社，ｐｐ．９９−１０６，２００３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
ｉＰＳ細胞の品質を評価する方法は、前述の通り、ｍｉＲＮＡ解析、細胞表面マーカーの検出、細胞形態の画像解析、エピゲノム解析等が知られている。しかしながら、ｉＰＳ細胞のエピジェネティックな変化、特にＤＮＡのメチル化状態の変化を、迅速、簡便、かつハイスループットに評価する方法は実現されていない。【0014】
本発明は、ｉＰＳ細胞の品質を、遺伝子レベルで迅速、簡便、かつハイスループットに解析する方法の提供を目的とする。【課題を解決するための手段】
【0015】
本発明者らは、初期化処理した細胞からのＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理した後、ＰＣＲで増幅して得たＰＣＲ増幅産物を、イオン交換クロマトグラフィーによって分離した結果、該イオン交換クロマトグラフィーで得られるシグナルのピークの保持時間が、初期化されたｉＰＳ細胞と非初期化体細胞との間で異なることを見出した。上記ＰＣＲ増幅とイオン交換クロマトグラフィーを用いた方法により、細胞の初期化に伴うＤＮＡメチル化の変化を検出することができる。【0016】
さらに、上記ＰＣＲ増幅とイオン交換クロマトグラフィーを用いた方法は、細胞の初期化の成否；多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞、胚性幹細胞など）の未分化状態が維持されているか否か；および、多能性幹細胞から分化させた体細胞の培養物に未分化の細胞が混入しているか否か、などの判定を可能にする。【0017】
したがって、本発明は以下を提供する。〔１〕人工多能性幹細胞の品質管理方法であって：
初期化処理された細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理すること；
該亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、脱メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅すること；
得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得ること；および、
該初期化処理された細胞またはその培養物から得た検出シグナルのピークの保持時間が、対照の検出シグナルのピークの保持時間よりも延長している場合に、該初期化処理された細胞を人工多能性幹細胞であると判定すること、
ここで、該対照の検出シグナルは、初期化処理されていない細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理した後、該プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅し、得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけて得られた検出シグナルである、
を含む、方法。
〔２〕人工多能性幹細胞の品質管理方法であって：
初期化処理された細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理すること；
該亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅すること；
得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得ること；および、
該初期化処理された細胞またはその培養物から得た検出シグナルのピークの保持時間が、対照の検出シグナルのピークの保持時間よりも短縮している場合に、該初期化処理された細胞を人工多能性幹細胞であると判定すること、
ここで、該対照の検出シグナルは、初期化処理されていない細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理した後、該プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅し、得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけて得られた検出シグナルである、
を含む、方法。
〔３〕人工多能性幹細胞の品質管理方法であって：
（１−１）初期化処理された細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理すること；
（１−２）初期化処理されていない細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理すること；
（２−１）工程（１−１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、脱メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅すること；
（２−２）工程（１−１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅すること；
（２−３）工程（１−２）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、脱メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅すること；
（２−４）工程（１−２）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅すること；
（３−１）工程（２−１）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得ること；
（３−２）工程（２−２）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得ること；
（３−３）工程（２−３）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得ること；
（３−４）工程（２−４）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得ること；
（４）工程（３−１）で得られた検出シグナルのピークの保持時間が、工程（３−３）で得られた検出シグナルのピークの保持時間よりも延長しており、かつ工程（３−２）で得られた検出シグナルのピークの保持時間が、工程（３−４）で得られた検出シグナルのピークの保持時間よりも短縮している場合に、該初期化処理された細胞を人工多能性幹細胞であると判定すること、
を含む、方法。
〔４〕人工多能性幹細胞の品質管理方法であって：
（１−１）初期化処理された細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理すること；
（１−２）人工多能性幹細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理すること；
（２−１）工程（１−１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、脱メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセット、および／またはメチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅すること；
（２−２）工程（１−２）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、脱メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセット、および／またはメチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅すること；
（３−１）工程（２−１）得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得ること；
（３−２）工程（２−２）得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得ること；
（４）工程（３−１）で得られた検出シグナルと工程（３−２）で得られた検出シグナルとの間でピークの保持時間に差異がない場合に、該初期化処理された細胞を人工多能性幹細胞であると判定すること、
を含む、方法。
〔５〕上記脱メチル化遺伝子が、ＮＡＮＯＧ、Ｏｃｔ３／４、ＲＡＢ２５、ＳＡＬＬ４、およびＳＬＣ２２Ａ３からなる群より選ばれる少なくとも１つである、〔１〕、〔３〕又は〔４〕記載の方法。
〔６〕上記メチル化遺伝子が、ＳＰ１００およびＵＢＥ１Ｌからなる群より選ばれる少なくとも１つである、〔２〕、〔３〕又は〔４〕記載の方法。
〔７〕上記脱メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットが、配列番号１と２からなるプライマー、配列番号３と４からなるプライマー、配列番号５と６からなるプライマー、配列番号７と８からなるプライマー、配列番号１３と１４からなるプライマー、または配列番号１５と１６からなるプライマーのセットである、〔１〕、〔３〕又は〔４〕記載の方法。
〔８〕上記メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットが、配列番号９と１０からなるプライマー、配列番号１７と１０からなるプライマー、配列番号１１と１２からなるプライマー、または配列番号１８と１９からなるプライマーのセットである、〔２〕、〔３〕又は〔４〕記載の方法。
〔９〕上記初期化処理された細胞が、初期化処理された皮膚線維芽細胞である、〔１〕〜〔８〕のいずれか１項記載の方法。
【発明の効果】
【0018】
本発明は、細胞から抽出されたＤＮＡのメチル化状態を測定することにより、迅速、簡便、かつハイスループットでの多能性幹細胞の品質評価を可能にする。本発明によれば、皮膚線維芽細胞等の分化した体細胞からｉＰＳ細胞への初期化誘導によりｉＰＳ細胞が樹立されたか否か、樹立した幹細胞の多能性、または分化誘導した細胞の分化状態などを、遺伝子レベルで判定することができる。本発明は、染色体ＤＮＡのメチル化状態の差異を検出することにより、従来の形態観察や未分化マーカーの発現解析だけでは評価することができない、細胞のエピジェネティックな状態を解析するものである。【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】ｉＰＳ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞のＮＡＮＯＧ遺伝子領域におけるＰＣＲ増幅産物のＨＰＬＣクロマトグラム。
【図2】ｉＰＳ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞のＯｃｔ３／４遺伝子領域におけるＰＣＲ増幅産物のＨＰＬＣクロマトグラム。
【図3】ｉＰＳ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞のＲＡＢ２５遺伝子領域におけるＰＣＲ増幅産物のＨＰＬＣクロマトグラム。
【図4】ｉＰＳ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞のＳＡＬＬ４遺伝子領域におけるＰＣＲ増幅産物のＨＰＬＣクロマトグラム。
【図5】ｉＰＳ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞のＳＰ１００遺伝子領域におけるＰＣＲ増幅産物のＨＰＬＣクロマトグラム。
【図6】ｉＰＳ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞のＵＢＥ１Ｌ遺伝子領域におけるＰＣＲ増幅産物のＨＰＬＣクロマトグラム。
【図7】ｉＰＳ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞のＳＬＣ２２Ａ３遺伝子領域におけるＰＣＲ増幅産物のＨＰＬＣクロマトグラム。
【図8】ｉＰＳ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞のＯｃｔ３／４遺伝子領域における、異なるプライマーによるＰＣＲ増幅産物のＨＰＬＣクロマトグラム。
【図9】バイサルファイトシークエンス法によるＮＡＮＯＧ、Ｏｃｔ３／４、ＲＡＢ２５、ＳＡＬＬ４遺伝子領域のＣｐＧサイトのメチル化解析結果を示す図。黒丸：メチル化ＣｐＧサイト、白丸：非メチル化ＣｐＧサイト、各集団の下の数値はメチル化率（％）を表す。
【図10】バイサルファイトシークエンス法によるＳＰ１００、ＵＢＥ１Ｌ遺伝子領域のＣｐＧサイトのメチル化解析結果を示す図。黒丸：メチル化ＣｐＧサイト、白丸：非メチル化ＣｐＧサイト、各集団の下の数値はメチル化率（％）を表す。
【発明を実施するための形態】
【0020】
本明細書において、「幹細胞」とは、自己以外の特殊化（「成熟」と言い換えてもよい）した細胞に分化し得る能力（分化能）と、細胞分裂を経ても自己と同じ性質を持つ細胞を生み出す能力（自己複製能）とを併せ持つ細胞を意味する。幹細胞には、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ＥＳ細胞）のような多能性の高い幹細胞、成体幹細胞のようなより多能性の低い幹細胞などが含まれる。幹細胞の培養方法としては、培養容器内での接着細胞培養法が一般的に用いられるが、これに限定されない。【0021】
本明細書において、「多能性」とは、三胚葉：内胚葉、中胚葉、または外胚葉のいずれかに分化する能力を意味する。本明細書において、「多能性細胞」は、三胚葉のいずれかに属する細胞に分化することが可能な細胞を意味し、全能性細胞の直接の子孫、胚性幹細胞、成体幹細胞、および人工多能性幹細胞が例示される。【0022】
本明細書において、「未分化状態」とは、幹細胞の特徴である分化能と自己複製能を併せ持つ状態を意味する。ただし、親細胞と娘細胞とで分化能に変化が生じるなど、細胞の性質が変わる場合は、娘細胞は分化したものとする。「未分化状態を維持するための処理」とは、分化能と自己複製能を喪失しないように維持するための処理であって、特に限定されないが、例えば幹細胞培養培地中へのｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）やＬＩＦ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ）の添加などの処理が含まれる。【0023】
本明細書において、「人工多能性幹細胞」とは、元来体細胞であって、多能性誘導処理によって三胚葉からなるあらゆる性質をもった細胞に分化し得る能力（多能性）と、自己複製能とを併せ持つに至った細胞を意味する。人工多能性幹細胞は、一般にｉＰＳ細胞と称される。また「初期化処理」（「多能性誘導処理」についても同義）は多能性と自己複製能を付与するための処理であって、例えばＳｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃの４遺伝子を導入する等の処理が例示できるが、これらに限定されない。【0024】
本明細書において、「分化」とは、幹細胞のような比較的未分化な細胞が変化し、特殊化することをいい、「分化細胞」とは当該特殊化した細胞を意味する。「分化」は、全能性細胞からより多能性の低い幹細胞への分化から、最終分化細胞への分化まで、様々な段階を含む。「分化細胞」としては、生体の体細胞、幹細胞を分化誘導して組織特異的に分化させた細胞などが挙げられる。「分化誘導」とは、幹細胞のような比較的未分化な細胞を特殊化させることをいう。分化誘導のための方法としては、ＢＭＰ（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ）およびＷｎｔ等の成長因子の細胞培地中への添加、レチノイン酸等の分化誘導因子の細胞培地中への添加、またはＭｙｏＤ等の遺伝子導入等が例示できるが、これらに限定されない。【0025】
本明細書において「初期化」（リプログラミング；ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）とは、多能性誘導と同義に使用され、ＤＮＡメチル化などのエピジェネティックな標識を消去および再構成し、ある細胞の分化状態を未分化な状態にすることを意味する。例えば、細胞の初期化の例としては、分化多能性を持たない細胞から多能性幹細胞を誘導することが挙げられる。また本明細書において「脱分化」とは、ある細胞をより未熟な状態にすることを意味する。脱分化とは、ある細胞が分化して来た最初または途上の状態に戻すことであってもよく、自身が属する胚葉型以外の細胞を生成できない細胞から、他の胚葉の細胞にも分化できる状態になることであってもよい。脱分化には、例えば三胚葉分化能を持たない細胞が、三胚葉分化能を獲得することが含まれる。また脱分化には、多能性幹細胞の生成が含まれる。初期化、または脱分化する方法（初期化処理または脱分化処理）としては、どのような方法であってもよく、例えば国際公開公報第２０１１／０１６５８８号に記載の方法等、公知の方法が適用できる。【0026】
本明細書において、「体細胞」とは、生殖細胞、例えば、卵子、精子など、そのＤＮＡを次世代に直接伝達する細胞以外の細胞を意味する。体細胞には、例えば、成体幹細胞等の多能性を残した細胞、および皮膚線維芽細胞等の最終分化した細胞が含まれる。通常、体細胞の多能性は限定されているか、または体細胞は全く多能性を有しない。本明細書で使用される体細胞は、天然に存在するもの、遺伝的に変更されたもの、またはそれらの培養物であってもよい。【0027】
本明細書において、「脱メチル化遺伝子」とは、そのＣｐＧサイトのＤＮＡが、初期化処理を施す前の体細胞においてはメチル化されているのに対し、初期化処理を施して作製したｉＰＳ細胞においてはメチル化されていない遺伝子を意味する。一方、本明細書において、「メチル化遺伝子」とは、そのＣｐＧサイトのＤＮＡが、初期化処理を施す前の体細胞においてはメチル化されていないのに対し、初期化処理を施して作製したｉＰＳ細胞においてはメチル化されている遺伝子を意味する。例えば、脱メチル化遺伝子としては、ＮＡＮＯＧ、Ｏｃｔ３／４、ＲＡＢ２５、ＳＡＬＬ４、およびＳＬＣ２２Ａ３が例示でき、メチル化遺伝子としては、ＧＢＰ３、ＳＰ１００、ＬＹＳＴ、ＵＢＥ１Ｌが例示できる。【0028】
ＮＡＮＯＧ遺伝子はＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿０７９１４１で特定されるタンパク質（ｈｏｍｅｏｂｏｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ＮＡＮＯＧ ｉｓｏｆｏｒｍ １）をコードする遺伝子である。Ｏｃｔ３／４遺伝子はＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿００２６９２で特定されるタンパク質（Ｏｃｔａｍｅｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ３；Ｏｃｔａｍｅｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４；ＰＯＵ ｄｏｍａｉｎ、ｃｌａｓｓ ５、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １）をコードする遺伝子である。ＲＡＢ２５遺伝子はＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿０６５１２０で特定されるタンパク質（ｒａｓ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ−２５）をコードする遺伝子である。ＳＡＬＬ４遺伝子はＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿０６５１６９で特定されるタンパク質（ｓａｌ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４）をコードする遺伝子である。ＧＢＰ３遺伝子はＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿０６０７５４で特定されるタンパク質（ｇｕａｎｙｌａｔｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ３）をコードする遺伝子である。ＳＰ１００遺伝子はＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿００１０７３８６０またはＮＰ＿００３１０４で特定されるタンパク質（ｎｕｃｌｅａｒ ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ Ｓｐ−１００）をコードする遺伝子である。ＬＹＳＴ遺伝子はＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＡＡＩ４４７０３で特定されるタンパク質（ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ、ＣＨＳ１）をコードする遺伝子である。ＵＢＥ１Ｌ遺伝子はＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＡＡＧ４９５５７で特定されるタンパク質（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ Ｅ１−ｌｉｋｅ）をコードする遺伝子である。ＳＬＣ２２Ａ３遺伝子はＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿０６８８１２で特定されるタンパク質（Ｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ ｆａｍｉｌｙ ２２ ｍｅｍｂｅｒ ３）をコードする遺伝子である。【0029】
本明細書において、「ＤＮＡメチル化」とは、ＤＮＡにおいて、シトシンの５位の炭素がメチル化されることを意味する。また本明細書において、ＤＮＡの「メチル化を検出する」とは、検出の対象とするＤＮＡにおけるメチル化ＤＮＡの存在の有無もしくは存在量、存在量の比、または当該ＤＮＡのメチル化率を測定することを意味する。本明細書において、「ＤＮＡメチル化率」とは、検出の対象とするＤＮＡにおいてＣｐＧサイトのシトシンがメチル化されている割合を意味し、例えば、検出の対象とする特定のＤＮＡのＣｐＧアイランドにおける、全シトシン数（メチル化シトシンおよび非メチル化シトシン）に対するメチル化シトシン数の比率にて表すことができる。【0030】
本明細書において、「ＣｐＧサイト」とは、ＤＮＡ中でシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）との間がホスホジエステル結合（ｐ）している部位のことを意味する。また本明細書において、「ＣｐＧ領域（またはＣｐＧアイランド）」とは、ホスホジエステル結合（ｐ）を介したシトシン（Ｃ）−グアニン（Ｇ）の２塩基配列（すなわちＣｐＧサイト）が高頻度で出現する領域をいう。ＣｐＧアイランドは、遺伝子上流のプロモーター領域に存在することが多い。本明細書において、「（ある）遺伝子のＣｐＧ領域」とは、好ましくは、当該遺伝子のコード領域またはそれに近い領域に存在するＣｐＧ領域を意味し、または「（ある）遺伝子のＣｐＧサイト」とは、好ましくは、当該遺伝子のコード領域またはそれに近い領域に存在するＣｐＧサイト、より好ましくは上記ＣｐＧ領域に含まれるＣｐＧサイトを意味する。また好ましくは、「（ある）遺伝子のＣｐＧサイトまたはＣｐＧ領域」とは、当該遺伝子のプロモーターおよびその周辺領域に存在するＣｐＧサイトまたはＣｐＧ領域を意味する。本明細書において、「（ある）遺伝子のプロモーターおよびその周辺領域」とは、プロモーター領域とその下流に隣接するｅｘｏｎ領域および当該ｅｘｏｎ領域に隣接するイントロン領域を意味する。特定の遺伝子のＣｐＧサイトまたはＣｐＧ領域は、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法、パイロシークエンシング等の方法に基づいて同定することができる。【0031】
本発明においては、被験細胞の脱メチル化遺伝子またはメチル化遺伝子におけるＤＮＡメチル化を指標に、被験細胞が多能性幹細胞であるか否かを判定する。脱メチル化遺伝子のＤＮＡの脱メチル化およびメチル化遺伝子のＤＮＡのメチル化は、いずれも該被験細胞が初期化されたこと、すなわち該被験細胞が多能性幹細胞であることを意味する。【0032】
本発明において、ＤＮＡメチル化の検出は、目的ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理、ＰＣＲ増幅、およびイオン交換クロマトグラフィー分析を用いた方法により行われる。当該イオン交換クロマトグラフィーでの検出シグナルのピークの高さや保持時間を指標に、目的ＤＮＡがメチル化しているか否かを判定することができる。検出シグナルのピークの保持時間は、ＤＮＡメチル化率と関係する；すなわち、保持時間の延長は、ＤＮＡメチル化率の低下を表し、反対に保持時間の短縮は、ＤＮＡのメチル化率の上昇を表す。一方、検出シグナルにおいてメチル化率の高いＤＮＡに由来するピークが高ければ、メチル化ＤＮＡの存在比率が高いことを表す。【0033】
好ましくは、当該被験細胞群からの検出シグナルは、対照細胞群からの検出シグナルと比較される。対照細胞群としては、陰性対照としては、最終分化した成体組織細胞、初期化処理されていない体細胞などが挙げられ、陽性対照としては、多能性の幹細胞、樹立された人工多能性幹細胞などが挙げられる。被験細胞群からの検出シグナルが対照細胞群からの検出シグナルと異なるパターンを有していれば、被験細胞群の目的ＤＮＡは、対照細胞群と比べて脱メチル化またはメチル化したと判定される。一方で、被験細胞群からの検出シグナルが対照細胞群からの検出シグナルと同等のパターンを有していれば、被験細胞群と対照細胞群のＤＮＡメチル化状態は同等であると判定される。【0034】
したがって一実施形態において、本発明は、以下を含む人工多能性幹細胞の品質管理方法を提供する：初期化処理された細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理すること；
該亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、脱メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅すること；
得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得ること；および、
該初期化処理された細胞またはその培養物から得た検出シグナルのピークの保持時間が、対照の検出シグナルのピークの保持時間よりも延長している場合に、該初期化処理された細胞を人工多能性幹細胞であると判定すること、
ここで、該対照の検出シグナルは、初期化処理されていない細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理した後、該プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅し、得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけて得られた検出シグナルである。
【0035】
別の一実施形態において、本発明は、以下を含む人工多能性幹細胞の品質管理方法を提供する：初期化処理された細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理すること；
該亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅すること；
得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得ること；および、
該初期化処理された細胞またはその培養物から得た検出シグナルのピークの保持時間が、対照の検出シグナルのピークの保持時間よりも短縮している場合に、該初期化処理された細胞を人工多能性幹細胞であると判定すること、
ここで、該対照の検出シグナルは、初期化処理されていない細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理した後、該プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅し、得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけて得られた検出シグナルである。
【0036】
さらなる実施形態において、本発明は、以下を含む人工多能性幹細胞の品質管理方法を提供する：（１）初期化処理された細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡ、ならびに初期化処理されていない細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理すること；
（２）工程（１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理された各ＤＮＡを、脱メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットを用いてそれぞれＰＣＲ増幅すること；
（３）工程（２）で得られた各ＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得ること；
（４）工程（３）で得られた初期化処理された細胞またはその培養物から得た検出シグナルのピークの保持時間が、初期化処理されていない細胞またはその培養物から得た検出シグナルのピークの保持時間よりも延長している場合に、該初期化処理された細胞を人工多能性幹細胞であると判定すること。
【0037】
さらなる実施形態において、本発明は、以下を含む人工多能性幹細胞の品質管理方法を提供する：（１'）初期化処理された細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡ、ならびに初期化処理されていない細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理すること；
（２'）工程（１'）で得られた亜硫酸水素塩によって処理された各ＤＮＡを、メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットを用いてそれぞれＰＣＲ増幅すること；
（３'）工程（２'）で得られた各ＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得ること；
（４'）工程（３'）で得られた初期化処理された細胞またはその培養物から得た検出シグナルのピークの保持時間が、初期化処理されていない細胞またはその培養物から得た検出シグナルのピークの保持時間よりも短縮している場合に、該初期化処理された細胞を人工多能性幹細胞であると判定すること。
【0038】
さらに別の一実施形態において、本発明は、以下を含む人工多能性幹細胞の品質管理方法を提供する：（１''−１）初期化処理された細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理すること；
（１''−２）初期化処理されていない細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理すること；
（２''−１）工程（１''−１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、脱メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅すること；
（２''−２）工程（１''−１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅すること；
（２''−３）工程（１''−２）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、脱メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅すること；
（２''−４）工程（１''−２）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅すること；
（３''−１）工程（２''−１）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得ること；
（３''−２）工程（２''−２）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得ること；
（３''−３）工程（２''−３）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得ること；
（３''−４）工程（２''−４）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得ること；
（４''）工程（３''−１）で得られた検出シグナルのピークの保持時間が、工程（３''−３）で得られた検出シグナルのピークの保持時間よりも延長しており、かつ工程（３''−２）で得られた検出シグナルのピークの保持時間が、工程（３''−４）で得られた検出シグナルのピークの保持時間よりも短縮している場合に、該初期化処理された細胞を人工多能性幹細胞であると判定すること。
【0039】
さらなる実施形態において、本発明は、以下を含む人工多能性幹細胞の品質管理方法を提供する：（１'''）初期化処理された細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡ、ならびに初期化処理されていない細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理すること；
（２'''−１）工程（１'''）で得られた亜硫酸水素塩によって処理された各ＤＮＡを、脱メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットを用いて、それぞれＰＣＲ増幅すること；
（２'''−２）工程（１'''）で得られた亜硫酸水素塩によって処理された各ＤＮＡを、メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットを用いてそれぞれＰＣＲ増幅すること；
（３'''−１）工程（２'''−１）で得られた各ＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得ること；
（３'''−２）工程（２'''−２）で得られた各ＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得ること；
（４'''）工程（３'''−１）で得られた検出シグナルにおいて、初期化処理された細胞またはその培養物から得たシグナルのピークの保持時間が、初期化処理されていない細胞またはその培養物から得たシグナルのピークの保持時間よりも延長しており、かつ
工程（３'''−２）で得られた検出シグナルにおいて、初期化処理された細胞から得たシグナルのピークの保持時間が、初期化処理されていない細胞から得たシグナルのピークの保持時間よりも短縮している場合に、
該初期化処理された細胞を人工多能性幹細胞であると判定すること。
【0040】
なお別の一実施形態において、本発明は、以下を含む人工多能性幹細胞の品質管理方法を提供する：（１''''−１）初期化処理された細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理すること；
（１''''−２）人工多能性幹細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理すること；
（２''''−１）工程（１''''−１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、脱メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセット、および／またはメチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅すること；
（２''''−２）工程（１''''−２）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、脱メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセット、および／またはメチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅すること；
（３''''−１）工程（２''''−１）得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得ること；
（３''''−２）工程（２''''−２）得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得ること；
（４''''）工程（３''''−１）で得られた検出シグナルと工程（３''''−２）で得られた検出シグナルとの間でピークの保持時間に差異がない場合に、該初期化処理された細胞を人工多能性幹細胞であると判定すること。
【0041】
さらなる実施形態において、本発明は、以下を含む人工多能性幹細胞の品質管理方法を提供する：（１'''''）初期化処理された細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡ、ならびに人工多能性幹細胞またはその培養物から調製されたゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理すること；
（２'''''）工程（１'''''）で得られた亜硫酸水素塩によって処理された各ＤＮＡを、脱メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセット、および／またはメチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットを用いて、それぞれＰＣＲ増幅すること；
（３'''''）工程（２'''''）で得られた各ＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得ること；
（４'''''）工程（３'''''）で得られた初期化処理された細胞またはその培養物から得た検出シグナルと人工多能性幹細胞またはその培養物から得た検出シグナルとの間でピークの保持時間に差異がない場合に、該初期化処理された細胞を人工多能性幹細胞であると判定すること。
【0042】
なお別の実施形態においては、上記初期化処理されていない細胞を対照として用いる方法と、上記人工多能性幹細胞を対照として用いる方法とを組み合わせて、上記初期化処理された細胞が人工多能性幹細胞であるか否かを判定してもよい。【0043】
本発明の方法において被験対象となる「初期化処理された細胞」としては、初期化処理を施された有核の細胞が好ましく、より好ましくは、初期化処理を施された組織細胞、例えば初期化処理を施された皮膚線維芽細胞、初期化処理を施された末梢血細胞などが挙げられる。初期化処理としては、細胞の初期化を誘導することができる処理であれば特に限定されないが、例えば、ｉＰＳ細胞の作製手順（例えば、特許第５４６７２２３号公報を参照することができるが、これに限定されない）に従って遺伝子導入することが挙げられる。【0044】
本発明の方法において対照となる、「初期化処理されていない細胞」としては、上記初期化処理された細胞と同じ種類の細胞であって、初期化処理が施されていないものが使用され得る。また、本発明の方法において対照となる、「人工多能性幹細胞」としては、樹立された人工多能性幹細胞株由来の細胞、初期化が確認された人工多能性幹細胞などが使用され得る。【0045】
本発明に用いられる幹細胞、分化細胞などの「細胞」のソースとなる生物としては、ヒトに限定されず、ヒト以外の哺乳動物、例えば、サル、類人猿、イヌ、マウス、ラット、ブタ、ヤギ、モルモット、さらには鳥類、魚類等が挙げられる。【0046】
上記「細胞」および「細胞の培養物」からゲノムＤＮＡを調製する方法としては、特に制限はなく、公知の手法を適宜選択して用いることができる。ＤＮＡを調製する公知の方法としては、フェノールクロロホルム法、または市販のＤＮＡ抽出キット、例えば後述するＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）や、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）、Ｃｌｅａｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＮｅｘＴｅｃ社製）、ＡｑｕａＰｕｒｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）、ＺＲ Ｐｌａｎｔ／Ｓｅｅｄ ＤＮＡ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）、ｐｒｅｐＧＥＭ（ＺｙＧＥＭ社製）、ＢｕｃｃａｌＱｕｉｃｋ（ＴｒｉｍＧｅｎ社製）などを用いるＤＮＡ抽出方法等が挙げられる。【0047】
本発明の方法においては、抽出したゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する。ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理の方法としては、特に制限はなく、公知の手法を適宜選択して用いることができる。亜硫酸水素塩処理のための公知の方法としては、例えば、後述するＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＺＹＭＯ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）や、ＥｐｉＴｅｃｔ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｋｉｔ（４８）（Ｑｉａｇｅｎ社製）、ＭｅｔｈｙｌＥａｓｙ（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｐｔｙ社製）、Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ＣｐＧ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＣｐＧｅｎｏｍｅ Ｔｕｒｂｏ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＭＥＲＣＫ ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）などの市販のキットを用いる方法が挙げられる。【0048】
次いで、亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、ＰＣＲによって増幅する。ＰＣＲ増幅の方法としては特に制限はなく、増幅対象のＤＮＡの配列、長さ、量などに応じて、公知の手法を適宜選択して用いることができる。【0049】
上記ＰＣＲでは、脱メチル化遺伝子およびメチル化遺伝子のいずれか一方または両方の遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅する。好ましくは、脱メチル化遺伝子としては、ＮＡＮＯＧ、Ｏｃｔ３／４、ＲＡＢ２５、ＳＡＬＬ４、およびＳＬＣ２２Ａ３からなる群より選択される１つ以上の遺伝子が挙げられ、メチル化遺伝子としては、ＳＰ１００、およびＵＢＥ１Ｌからなる群より選択される１つ以上の遺伝子が挙げられる。より好ましくは、クロマトグラフィーによる検出シグナルの保持時間差が大きく、ピーク形状が良好であるＲＡＢ２５遺伝子、ＳＡＬＬ４遺伝子、およびＳＬＣ２２Ａ３遺伝子からなる群より選択される１つ以上が選択される。なお、「ピーク形状が良好である」とは、一般的に、ピークがおおよそ対称であり、ピークのリーディングおよびテーリングが認められず、ピークにショルダーがなく、ピークが鋭いこと等を示す。【0050】
ＰＣＲ増幅産物の鎖長は、ＰＣＲの増幅時間の短縮、ならびにイオン交換クロマトグラフィーでの分析時間の短縮や分離性能の維持等の要素を勘案して適宜選択することができる。例えば、ＣｐＧサイトが多いＤＮＡの亜硫酸水素塩物を鋳型に用いる場合のＰＣＲ増幅産物の鎖長は、１０００ｂｐ以下が好ましく、７００ｂｐ以下がより好ましく、５００ｂｐ以下がさらに好ましい。一方、ＣｐＧサイトが少ないＤＮＡの亜硫酸水素塩物を鋳型に用いる場合のＰＣＲ増幅産物の鎖長は、好ましくは１０００ｂｐ、より好ましくは７００ｂｐ、さらに好ましくは５００ｂｐを上限とし、ＰＣＲにおける非特異的ハイブリダイズを避けられる１５ｍｅｒ付近のプライマーを使用する場合のＰＣＲ増幅産物の鎖長である３０〜４０ｂｐが下限となる。本発明で使用される脱メチル化遺伝子またはメチル化遺伝子領域においては、ＰＣＲ増幅産物の鎖長は、例えば１００〜５００ｂｐが好ましく、２５０〜４５０ｂｐがより好ましい。一方で、ＰＣＲ増幅産物中におけるＣｐＧサイトに相当する領域の含有率がリッチになるようにプライマーを設計するのが好ましい。例えば、ＣｐＧサイトのシトシンに由来する塩基の数が、ＰＣＲ増幅産物の塩基数（鎖長）に対して２％以上含まれるのが好ましく、５％以上含まれるのがより好ましい。一方で、本発明の方法においては、ＰＣＲ増幅産物に初期化処理の前後でメチル化状態が変化するＣｐＧサイトのシトシンに由来する塩基が最低３個、好ましくは３〜１５個含まれていれば、後述するイオン交換クロマトグラフィー分析によりＤＮＡメチル化率の変化を検出することができる。【0051】
本発明の方法で使用される、脱メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットの好ましい例としては、表１に記載のプライマーセットが挙げられる。また本発明の方法で使用される、メチル化遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットの好ましい例としては、表２に記載のプライマーセットが挙げられる。【0052】
【表1】
【0053】
【表2】
【0054】
続いて、得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかける。本発明で行われるイオン交換クロマトグラフィーは、アニオン交換クロマトグラフィーが好適である。本発明で行われるイオン交換クロマトグラフィーに用いるカラムの充填剤としては、表面に強カチオン性基を有する基材粒子であれば特に限定されないが、特許文献６に示される充填剤表面に強カチオン性基と弱カチオン性基の両方を有する基材粒子が好ましい。【0055】
本明細書において、上記強カチオン性基とは、ｐＨが１から１４の広い範囲で解離するカチオン性基を意味する。すなわち、上記強カチオン性基は、水溶液のｐＨに影響を受けず解離した（カチオン化した）状態を保つことが可能である。【0056】
上記強カチオン性基としては、４級アンモニウム基が挙げられる。具体的には例えば、トリメチルアンモニウム基、トリエチルアンモニウム基、ジメチルエチルアンモニウム基等のトリアルキルアンモニウム基等が挙げられる。また、上記強カチオン性基のカウンターイオンとしては、例えば、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン等のハロゲン化物イオンが挙げられる。【0057】
上記基材粒子の表面に導入される上記強カチオン性基量は、特に限定されないが、充填剤の乾燥重量あたりの好ましい下限は１μｅｑ／ｇ、好ましい上限は５００μｅｑ／ｇである。上記強カチオン性基量が１μｅｑ／ｇ未満であると、保持力が弱く分離性能が悪くなることがある。上記強カチオン性基量が５００μｅｑ／ｇを超えると、保持力が強くなり過ぎてＰＣＲ増幅産物を容易に溶出させることができず、分析時間が長くなりすぎる等の問題が生じることがある。【0058】
本明細書において、上記弱カチオン性基とは、ｐＫａが８以上のカチオン性基を意味する。すなわち、上記弱カチオン性基は、水溶液のｐＨによる影響を受け、解離状態が変化する。すなわち、ｐＨが８より高くなると、上記弱カチオン性基のプロトンは解離し、プラスの電荷を持たない割合が増える。逆にｐＨが８より低くなると、上記弱カチオン性基はプロトン化し、プラスの電荷を持つ割合が増える。【0059】
上記弱カチオン性基としては、例えば、３級アミノ基、２級アミノ基、１級アミノ基等が挙げられる。なかでも、３級アミノ基であることが望ましい。【0060】
上記基材粒子の表面に導入される上記弱カチオン性基量は、特に限定されないが、充填剤の乾燥重量あたりの好ましい下限は０．５μｅｑ／ｇ、好ましい上限は５００μｅｑ／ｇである。上記弱カチオン性基量が０．５μｅｑ／ｇ未満であると、少なすぎて分離性能が向上しないことがある。上記弱カチオン性基量が５００μｅｑ／ｇを超えると、強カチオン性基と同様保持力が強くなり過ぎてＰＣＲ増幅産物を容易に溶出させることができず、分析時間が長くなりすぎる等の問題が生じることがある。【0061】
上記基材粒子表面の強カチオン性基または弱カチオン性基量は、アミノ基に含まれる窒素原子を定量することにより測定することができる。窒素を定量する方法として例えばケルダール法が挙げられる。後述の実施例に記載の充填剤の場合には、まず、重合後に強カチオン性基に含まれる窒素を定量し、次いで、弱カチオン性基を導入した後の強カチオン性基と弱カチオン性基に含まれる窒素を定量することにより、後から導入した弱カチオン性基量を算出することができる。このように定量することにより、充填剤を調製する際に、強カチオン性基量および弱カチオン性基量を上記範囲内に調整することができる。【0062】
上記基材粒子としては、例えば、重合性単量体等を用いて得られる合成高分子微粒子、シリカ系等の無機微粒子等を用いることができるが、合成有機高分子からなる疎水性架橋重合体粒子であることが望ましい。【0063】
上記疎水性架橋重合体は、少なくとも１種の疎水性架橋性単量体と少なくとも１種の反応性官能基を有する単量体を共重合して得られる疎水性架橋重合体、少なくとも１種の疎水性架橋性単量体と少なくとも１種の反応性官能基を有する単量体と少なくとも１種の疎水性非架橋性単量体とを共重合して得られる疎水性架橋重合体のいずれであってもよい。【0064】
上記疎水性架橋性単量体としては、単量体１分子中にビニル基を２個以上有するものであれば特に限定されず、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート等のジ（メタ）アクリル酸エステル、トリメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート等のトリ（メタ）アクリル酸エステル若しくはテトラ（メタ）アクリル酸エステル、またはジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、ジビニルナフタレン等の芳香族系化合物が挙げられる。なお、本明細書において上記（メタ）アクリレートとは、アクリレートまたはメタクリレートを意味し、（メタ）アクリルとは、アクリルまたはメタクリルを意味する。【0065】
上記反応性官能基を有する単量体としては、グリシジル（メタ）アクリレート、イソシアネートエチル（メタ）アクリレート等が挙げられる。【0066】
上記疎水性非架橋性単量体としては、疎水性の性質を有する非架橋性の重合性有機単量体であれば特に限定されず、例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ｔ−ブチル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステルや、スチレン、メチルスチレン等のスチレン系単量体が挙げられる。【0067】
上記疎水性架橋重合体が、上記疎水性架橋性単量体と上記反応性官能基を有する単量体とを共重合して得られるものである場合、上記疎水性架橋重合体における上記疎水性架橋性単量体に由来するセグメントの含有割合の好ましい下限は１０重量％、より好ましい下限は２０重量％である。【0068】
本発明で用いるイオン交換クロマトグラフィー用充填剤は、上記基材粒子の表面に、上記強カチオン性基と上記弱カチオン性基とを有する重合体層を有するものであることが好ましい。また、上記強カチオン性基と上記弱カチオン性基とを有する重合体において、上記強カチオン性基と上記弱カチオン性基とはそれぞれ独立した単量体に由来するものであることが好ましい。具体的には、本発明で用いるイオン交換クロマトグラフィー用充填剤は、上記疎水性架橋重合体粒子と、上記疎水性架橋重合体粒子の表面に共重合された強カチオン性基を有する親水性重合体の層とからなる被覆重合体粒子の表面に、弱カチオン性基が導入されたものであることが好適である。【0069】
上記強カチオン性基を有する親水性重合体は、強カチオン性基を有する親水性単量体から構成されるものであり、１種以上の強カチオン性基を有する親水性単量体に由来するセグメントを含有すればよい。すなわち、上記強カチオン性基を有する親水性重合体を製造する方法としては、強カチオン性基を有する親水性単量体を単独で重合させる方法、２種以上の強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合させる方法、強カチオン性基を有する親水性単量体と強カチオン性基を有しない親水性単量体を共重合させる方法等が挙げられる。【0070】
上記強カチオン性基を有する親水性単量体としては、４級アンモニウム基を有するものであることが好ましい。具体的には例えば、メタクリル酸エチルトリエチルアンモニウムクロリド、メタクリル酸エチルジメチルエチルアンモニウムクロリド、メタクリル酸エチルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、アクリル酸エチルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、アクリル酸エチルトリエチルアンモニウムクロリド、アクリル酸エチルジメチルエチルアンモニウムクロリド、アクリルアミドエチルトリメチルアンモニウムクロリド、アクリルアミドエチルトリエチルアンモニウムクロリド、アクリルアミドエチルジメチルエチルアンモニウムクロリド等が挙げられる。【0071】
上記被覆重合体粒子の表面に上記弱カチオン性基を導入する方法としては、公知の方法を用いることができる。具体的には例えば、上記弱カチオン性基として３級アミノ基を導入する方法としては、グリシジル基を有する単量体に由来するセグメントを有する疎水性架橋重合体からなる疎水性架橋重合体粒子の表面において上記強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合し、次いでグリシジル基に３級アミノ基を有する試薬を反応させる方法；イソシアネート基を有する単量体に由来するセグメントを有する疎水性架橋重合体からなる疎水性架橋重合体粒子の表面において上記強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合し、次いで、イソシアネート基に３級アミノ基を有する試薬を反応させる方法；上記疎水性架橋重合体粒子の表面において上記強カチオン性基を有する親水性単量体と３級アミノ基を有する単量体とを共重合する方法；３級アミノ基を有するシランカップリング剤を用いて上記強カチオン性基を有する親水性重合体の層を有する被覆重合体粒子の表面に３級アミノ基を導入する方法；カルボキシ基を有する単量体に由来するセグメントを有する疎水性架橋重合体からなる疎水性架橋重合体粒子の表面において上記強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合し、次いで、カルボキシ基と３級アミノ基を有する試薬とを、カルボジイミドを用いて縮合させる方法；エステル結合を有する単量体に由来するセグメントを有する疎水性架橋重合体からなる疎水性架橋重合体粒子の表面において上記強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合し、エステル結合部を加水分解した後、次いで、加水分解によって生成したカルボキシ基と３級アミノ基を有する試薬とを、カルボジイミドを用いて縮合させる方法等が挙げられる。なかでも、グリシジル基を有する単量体に由来するセグメントを有する疎水性架橋重合体からなる疎水性架橋重合体粒子の表面において上記強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合し、次いで、グリシジル基に３級アミノ基を有する試薬を反応させる方法や、イソシアネート基を有する単量体に由来するセグメントを有する疎水性架橋重合体からなる疎水性架橋重合体粒子の表面において上記強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合し、次いで、イソシアネート基に３級アミノ基を有する試薬を反応させる方法が好ましい。【0072】
グリシジル基やイソシアネート基等の反応性官能基に反応させる上記３級アミノ基を有する試薬としては、３級アミノ基と、反応性官能基に反応可能な官能基を有する試薬であれば、特に限定されない。上記反応性官能基に反応可能な官能基としては、例えば、１級アミノ基、水酸基等が挙げられる。なかでも、末端に１級アミノ基を有している基が好ましい。当該官能基を有する具体的な試薬としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノプロピルエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノペンチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジブチルアミノプロピルアミン等が挙げられる。【0073】
上記強カチオン性基、好ましくは４級アンモニウム塩と、上記弱カチオン性基、好ましくは３級アミノ基との相対的な位置関係は、上記強カチオン性基が上記弱カチオン性基よりも基材粒子の表面から遠い位置、即ち外側にあることが好ましい。例えば、上記弱カチオン性基は基材粒子表面から３０Å以内にあり、上記強カチオン性基は基材粒子表面から３００Å以内で、かつ、弱カチオン性基よりも外側にあることが好ましい。【0074】
本発明で用いるイオン交換クロマトグラフィー用充填剤に使用される上記基材粒子の平均粒子径は、特に限定されないが、好ましい下限は０．１μｍ、好ましい上限は２０μｍである。上記平均粒子径が０．１μｍ未満であると、カラム内が高圧になりすぎて分離不良を起こすことがある。上記平均粒子径が２０μｍを超えると、カラム内のデッドボリュームが大きくなりすぎて分離不良を起こすことがある。なお、本明細書において上記平均粒子径は体積平均粒子径を示し、粒度分布測定装置（ＡｃｃｕＳｉｚｅｒ７８０／Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製など）を用いて測定することができる。【0075】
本発明で行われるイオン交換クロマトグラフィーに用いる溶離液の組成としては、公知の条件を用いることができる。【0076】
上記溶離液に用いる緩衝液としては、公知の塩化合物を含む緩衝液類や有機溶媒類を用いることが好ましく、具体的には例えば、トリス塩酸緩衝液、トリスとＥＤＴＡからなるＴＥ緩衝液、トリスとホウ酸とＥＤＴＡからなるＴＢＡ緩衝液等が挙げられる。【0077】
上記溶離液のｐＨは特に限定されないが、好ましい下限は５、好ましい上限は１０である。この範囲に設定することで、上記弱カチオン性基も効果的にイオン交換基（アニオン交換基）として働くと考えられる。上記溶離液のｐＨのより好ましい下限は６、より好ましい上限は９である。【0078】
上記溶離液に含まれる塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム等のハロゲン化物とアルカリ金属とからなる塩；塩化カルシウム、臭化カルシウム、塩化マグネシウム、臭化マグネシウム等のハロゲン化物とアルカリ土類金属とからなる塩；過塩素酸ナトリウム、過塩素酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の無機酸塩、等を用いることができる。また、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、コハク酸ナトリウム、コハク酸カリウム等の有機酸塩を用いることもできる。上記塩は、いずれか単独または組み合わせて使用され得る。【0079】
上記溶離液の塩濃度としては、分析条件に合わせ適宜調整すればよいが、好ましい下限は１０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は２０００ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましい下限は１００ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましい上限は１５００ｍｍｏｌ／Ｌである。【0080】
さらに、本発明で用いるイオン交換クロマトグラフィーに使用される溶離液には、分離性能をさらに高めるためにアンチカオトロピックイオンが含まれている。アンチカオトロピックイオンは、カオロトピックイオンとは逆の性質を有し、水和構造を安定化させる働きがある。そのため、充填剤と核酸分子との間の疎水性相互作用を強める効果がある。本発明で用いるイオン交換クロマトグラフィーの主たる相互作用は静電的相互作用であるが、加えて、疎水性相互作用の働きも利用することにより分離性能が高まる。【0081】
上記溶離液に含まれるアンチカオトロピックイオンとしては、リン酸イオン（ＰＯ43-）、硫酸イオン（ＳＯ42-）、アンモニウムイオン（ＮＨ4+）、カリウムイオン（Ｋ+）、ナトリウムイオン（Ｎａ+）などが挙げられる。これらのイオンの組合せの中でも、硫酸イオンおよびアンモニウムイオンが好適に用いられる。上記アンチカオトロピックイオンは、いずれか単独または組み合わせて使用され得る。なお、上述のアンチカオトロピックイオンの一部には、上記溶離液に含まれる塩や緩衝液の成分が含まれる。このような成分を使用する場合、溶離液に含まれる塩としての性質または緩衝能と、アンチカオトロピックイオンとしての性質の両方を具備するので、本発明には好適である。【0082】
本発明で用いるイオン交換クロマトグラフィー用溶離液におけるアンチカオトロピックイオンの分析時の濃度は、分析対象物に合わせて適宜調整すればよいが、アンチカオトロピック塩として２０００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが望ましい。具体的には、アンチカオトロピック塩の濃度を０〜２０００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲でグラジエント溶出させる方法を挙げることができる。従って、分析開始時のアンチカオトロピック塩の濃度は０ｍｍｏｌ／Ｌである必要はなく、また、分析終了時のアンチカオトロピック塩の濃度も２０００ｍｍｏｌ／Ｌである必要はない。上記グラジエント溶出の方法は、低圧グラジエント法であっても高圧グラジエント法であってもよいが、高圧グラジエント法による精密な濃度調整を行いながら溶出させる方法が好ましい。【0083】
上記アンチカオトロピックイオンは、溶出に用いる溶離液のうちの１種のみに添加してもよいが、複数種の溶離液に添加してもよい。また上記アンチカオトロピックイオンは、充填剤とＰＣＲ増幅産物との間の疎水性相互作用を強める効果または緩衝能と、ＰＣＲ増幅産物をカラムから溶出させる効果の両方の役割を備えていても良い。【0084】
本発明で行われるイオン交換クロマトグラフィーでＰＣＲ増幅産物を分析する際のカラム温度は、好ましくは３０℃以上であり、より好ましくは４０℃以上であり、さらに好ましくは４５℃以上である。イオン交換クロマトグラフィーのカラム温度が３０℃未満であると充填剤とＰＣＲ増幅産物との間の疎水性相互作用が弱くなり、所望の分離効果を得ることが難しくなる。イオン交換クロマトグラフィーのカラム温度が４５℃未満である場合、メチル化ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物（メチル化ＤＮＡサンプル）と非メチル化ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物（非メチル化ＤＮＡサンプル）との保持時間の差が小さい。さらに、カラム温度が５５℃以上、好ましくは６０℃以上では、メチル化ＤＮＡサンプルと非メチル化ＤＮＡサンプルの間の保持時間の差がさらに広がり、かつそれぞれのピークもより明瞭になるので、より精度のよいＤＮＡのメチル化の検出が可能になる。【0085】
さらに、イオン交換クロマトグラフィーのカラム温度が高くなると、メチル化ＤＮＡサンプルと非メチル化ＤＮＡサンプルとが明瞭に分離されるので、サンプルＤＮＡ中のメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡの存在比率に従って両者の保持時間のピーク面積またはピーク高さに差異が生じやすくなる。したがって、カラム温度を高くすれば、メチル化ＤＮＡサンプルと非メチル化ＤＮＡサンプルの間の保持時間のピークの面積または高さに基づいて、サンプルＤＮＡ中のメチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡそれぞれの存在量や存在比率を測定することがより容易になる。【0086】
一方、イオン交換クロマトグラフィーのカラム温度が９０℃以上になると、ＰＣＲ増幅産物中の核酸分子の二本鎖が乖離するため分析上好ましくない。さらに、カラム温度が１００℃以上になると、溶離液の沸騰が生じる恐れがあるため分析上好ましくない。したがって、本発明で行われるイオン交換クロマトグラフィーでＰＣＲ増幅産物を分析する際のカラム温度は、３０℃以上９０℃未満であればよく、好ましくは４０℃以上９０℃未満であり、より好ましくは４５℃以上９０℃未満であり、さらに好ましくは５５℃以上９０℃未満であり、さらにより好ましくは５５℃以上８５℃以下であり、なお好ましくは６０℃以上８５℃以下である。【0087】
上記イオン交換クロマトグラフィーカラムへの試料注入量は、特に限定されずカラムのイオン交換容量および試料濃度に応じて適宜調整すればよい。流速は０．１ｍＬ／ｍｉｎから３．０ｍＬ／ｍｉｎが好ましく、０．５ｍＬ／ｍｉｎから１．５ｍＬ／ｍｉｎがより好ましい。流速が遅くなると分離の向上が期待できるが、遅くなりすぎると分析に長時間を要したり、ピークのブロード化による分離性能の低下を招く恐れがある。逆に流速が早くなると分析時間の短縮という面においてはメリットがあるが、ピークが圧縮されるため分離性能の低下を招く。よって、カラムの性能によって適宜調整されるパラメータではあるが、上記流速の範囲に設定することが望ましい。各サンプルの保持時間は、各サンプルについて予備実験を行うことによって予め決定することができる。送液方法はリニアグラジエント溶出法やステップワイズ溶出法など公知の送液方法を用いることができるが、本発明における送液方法としてはリニアグラジエント溶出法が好ましい。グラジエント（勾配）の大きさは溶出に用いる溶離液を０％から１００％の範囲で、カラムの分離性能および分析対象物（ここではＰＣＲ増幅産物）の特性に合わせ適宜調整すればよい。【0088】
本発明においては、上述した手順で亜硫酸水素塩処理したＤＮＡのＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけることによって、細胞から調製したゲノムＤＮＡにおけるＤＮＡメチル化を検出する。【0089】
ＤＮＡを亜硫酸水素塩処理した場合、当該ＤＮＡ中の非メチル化シトシンはウラシルに変換されるが、メチル化シトシンはシトシンのままである。亜硫酸水素塩処理したＤＮＡをＰＣＲ増幅すると、非メチル化シトシン由来のウラシルは、さらにチミンに置き換わるため、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの間で、シトシンとチミンの存在比率に差が生じる。したがって、ＰＣＲ増幅産物中のＤＮＡは、もとになるＤＮＡのメチル化率に応じた異なる配列を有する。上記ＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけると、当該増幅産物中に含まれるＤＮＡの塩基配列に応じて、異なるシグナルを示すクロマトグラムが得られる。したがって、サンプルＤＮＡのイオン交換クロマトグラフィーで得られた検出シグナルに基づいて、ＤＮＡのメチル化を検出することができる。【0090】
すなわち、細胞から抽出したＤＮＡがメチル化しているほど、上記ＰＣＲ増幅産物から得られた検出シグナルのピークの保持時間は短くなり、逆にメチル化の程度が低ければ、検出シグナルのピークの保持時間は長くなる。また、各検出シグナルのピークの高さは、該ピークに相当するメチル化率を有するＤＮＡの存在比率が高いことを表す。【0091】
例えば、皮膚線維芽細胞等の分化細胞に初期化処理を施しｉＰＳ細胞を作製する場合において、初期化が正常に行われると、脱メチル化遺伝子領域のＣｐＧ領域のメチル化シトシンが脱メチル化される。すなわち、脱メチル化遺伝子領域のメチル化率は、初期化処理を施していない該分化細胞よりｉＰＳ細胞のほうが低値となる。そのため、脱メチル化遺伝子についてのクロマトグラフィー分析においては、該分化細胞由来の検出シグナルのピークがｉＰＳ細胞由来の検出シグナルのピークよりも早い保持時間に検出される。【0092】
一方、該分化細胞の初期化が正常に行われると、メチル化遺伝子領域のＣｐＧ領域の非メチル化シトシンはメチル化される。すなわち、メチル化遺伝子領域のメチル化率は、初期化処理を施していない該分化細胞よりｉＰＳ細胞のほうが高値となる。そのため、メチル化遺伝子についてのクロマトグラフィー分析においては、ｉＰＳ細胞由来の検出シグナルのピークが該分化細胞由来の検出シグナルのピークよりも早い保持時間に検出される。【0093】
本発明の方法において、クロマトグラフィーによる検出シグナルのピークの有無を判定する方法としては、既存のデータ処理ソフトウェア、例えばＬＣｓｏｌｕｔｉｏｎ（島津製作所）、ＧＲＡＭＳ/ＡＩ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、ＩｇｏｒＰｒｏ（ＷａｖｅＭｅｔｒｉｃｓ社）などを用いたピーク検出が挙げられる。ＬＣｓｏｌｕｔｉｏｎを用いたピークの有無の判定方法を例示すると、具体的には、まずピークを検出させたい保持時間の区間を指定する。次に、ノイズなど不要なピークを除去するために、各種パラメータを設定する。例えば、パラメータ「ＷＩＤＴＨ」を不要なピークの半値幅よりも大きくする、パラメータ「ＳＬＯＰＥ」を不要なピークの立ち上り傾斜より大きくする、パラメータ「ＤＲＩＦＴ」の設定を変えることにより分離度の低いピークを垂直分割するかベースライン分割するか選択する、などが挙げられる。パラメータの値は、分析条件、選択した遺伝子マーカーの種類、検体の量などにより、異なるクロマトグラムが得られるため、クロマトグラムに応じて適切な値を設定すればよい。【0094】
クロマトグラフィーにより得られた検出シグナルのピークの保持時間の差異の有無は、前記データ処理ソフトウェアにより得られたそれぞれの検出シグナルのピークトップの保持時間を比較することによって判定する。２つの検出シグナルの間での保持時間の差が、好ましくは２秒以上ある場合、より好ましくは５秒以上ある場合、該２つのシグナルの保持時間には差異があると判断される。一方、２つの検出シグナルの間での保持時間の差が、好ましくは２秒未満、より好ましくは１秒未満である場合、該２つのシグナルの保持時間には差異がないと判断される。【0095】
クロマトグラフィーにより得られた検出シグナルのピークの保持時間は、ＰＣＲ増幅産物、クロマトグラフィーの条件などに依存して変動し得る。したがって、対照細胞からのクロマトグラフィーによる検出シグナルは、被験細胞から検出シグナルを取得する毎に新たに取得することが好ましいが、別途所定の条件下で取得して、これを対照データとして保存しておき、必要に応じて参照してもよい。【0096】
本発明の方法においては、各遺伝子領域ごとに、初期化処理を施した被験細胞に由来する細胞の検出シグナルのピークの保持時間を、ｉＰＳ細胞（陽性対照）、ヒト皮膚線維芽細胞等の分化細胞（陰性対照）、あるいはその両方の検出シグナルのピークの保持時間と比較する。保持時間が被験細胞と陰性対照との間で異なれば、被験細胞は、分化細胞よりも脱メチル化遺伝子領域のＤＮＡが脱メチル化されている、またはメチル化遺伝子領域のＤＮＡがメチル化されている、つまり、被験細胞は初期化されたｉＰＳ細胞である。あるいは、保持時間が被験細胞と陽性対照との間で差異がなければ、被験細胞は、ｉＰＳ細胞と同様に、脱メチル化遺伝子領域のＤＮＡが脱メチル化されている、またはメチル化遺伝子領域のＤＮＡがメチル化されている、つまり、被験細胞は初期化されたｉＰＳ細胞である。したがって、本発明の方法により細胞の初期化（ｉＰＳ細胞作製）の成否を判定することができる。【0097】
さらに、上記本発明の方法は、細胞の初期化の成否だけでなく、樹立されたｉＰＳ細胞がその多能性を維持しているか否かの判定にも適用することができる。例えば、樹立されたｉＰＳ細胞株の継代培養物の細胞を被験対象として、上記と同様の手順でイオン交換クロマトグラフィーによる検出シグナルを取得し、該検出シグナルのピークの保持時間を対照と比較する。対照との保持時間の差異の有無に基づいて、被験対象細胞における脱メチル化遺伝子領域のＤＮＡの脱メチル化またはメチル化遺伝子領域のＤＮＡのメチル化が維持されているか否か、すなわち被験対象細胞が分化することなく多能性を維持しているか否か、を判定することができる。【0098】
したがって、上記本発明の方法により、ｉＰＳ細胞の品質管理が可能になる。【0099】
さらに、本発明のｉＰＳ細胞の品質管理方法は、従来のｉＰＳ細胞の識別法と組み合わせて実施することができる。従来のｉＰＳ細胞の識別法としては、ＮＡＮＯＧ、Ｏｃｔ３／４等に結合したレポーターの活性（ピューロマイシン耐性、ＧＦＰ陽性など）による確認、目視によるＥＳ細胞様コロニーの形成の確認などが挙げられ、より正確な方法としては、アルカリホスファターゼ染色、各種ＥＳ細胞特異的遺伝子の発現解析、および細胞をマウスに移植してのテラトーマ形成の確認試験が挙げられる。好ましくは、これらの従来の方法は、本発明の方法の後に、二次評価のために行われる。【0100】
さらなる実施形態において、本発明の方法は、以下に応用できる：ｉＰＳ細胞以外の幹細胞（例えば、ＥＳ細胞、成体幹細胞など）の継代培養物において、細胞の多能性が維持されているか否かの判定；
幹細胞の継代培養物への分化細胞の混入の検出；
分化細胞培養物への未分化細胞の混入（例えば、多能性幹細胞から分化誘導した体細胞の培養物への未分化細胞の混入）の検出。
【0101】
ｉＰＳ細胞以外の幹細胞について多能性を判定する場合は、上記本発明の方法において、被験対象である初期化処理された細胞の培養物を、ＥＳ細胞、成体幹細胞（神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞等）などの幹細胞の継代培養物に置き換え、かつ、対照を分化細胞（陰性対照）、同じ種類の幹細胞で多能性が確認されているもの（陽性対照）などに置き換えて、上記と同様の工程を行い、被験対象細胞が幹細胞であるか否かを判定する。あるいは、対照とする細胞は、継代をしていない初代培養細胞または継代の回数が少なく、初代培養細胞の性質が引き継がれている継代培養物の細胞であってもよい。【0102】
幹細胞の継代培養物への分化細胞の混入を検出する場合は、上記本発明の方法において、被験対象である初期化処理された細胞の培養物を、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、成体幹細胞などの幹細胞の継代培養物に置き換え、かつ、対照を分化細胞（陰性対照）、同じ種類の幹細胞で多能性が確認されているもの（陽性対照）などに置き換えて、上記と同様の工程を行い、被験対象細胞に分化した細胞が混入していないか否かを判定する。【0103】
分化細胞培養物への未分化細胞の混入を検出する場合は、上記本発明の方法において、被験対象である初期化処理された細胞の培養物を、分化細胞培養物に置き換え、かつ対照を幹細胞（陰性対照）、分化細胞（陽性対照）などに置き換えて、上記と同様の工程を行い、被験対象細胞が分化細胞であるか否かを判定する。【0104】
従来、形態観察によりｉＰＳ細胞を識別する場合、後述するｉＰＳ細胞の調製において、培養２１日目〜３０日目にコロニーが目視できるまで識別に時間を要していた。一方、本発明によれば、フィーダー細胞上へ初期化処理を施した細胞を播種する培養７日目以降であれば、コロニーの形成を待たず、上記と同様の工程を行い、被験対象細胞が幹細胞であるか否かを判定することができる。【0105】
また、バイサルファイトシークエンス法によりｉＰＳ細胞のＤＮＡメチル化状態を解析する場合、バイサルファイト変換後の対象の遺伝子領域をＰＣＲ増幅し、さらにクローニングし、その後シークエンシングするという多くの工程が必要とされる。さらに、クローニングの前に、目的のＰＣＲ増幅産物が得られたか否かを電気泳動により確認することが望ましい。一方、本発明によれば、ＰＣＲ増幅産物を直接クロマトグラフィー分析に供するためクローニングの工程が不要であり、さらにＰＣＲ増幅の成否もクロマトグラフィーの検出シグナルのピーク強度によって確認できる。そのため、本発明によれば、バイサルファイトシークエンス法よりも少ない工程でＤＮＡメチル化状態を解析することができる。【0106】
さらに、ヘミメチル化ＤＮＡや対立遺伝子でＤＮＡメチル状態が異なる遺伝子のＤＮＡメチル化状態を精度良く解析する場合、バイサルファイトシークエンス法では多くのクローンを解析する必要がある。一方で、本発明によるクロマトグラフィー分析では、ＤＮＡのヘミメチル化や対立遺伝子間でのＤＮＡメチル状態の違いは、検出シグナルのピークの二峰化として検出されることから、検体数が少ない場合でも精度良くＤＮＡメチル化状態を解析することができる。【実施例】
【0107】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【0108】
参考例１ 細胞の調製〔ヒトｉＰＳ細胞の調製〕
ヒトｉＰＳ細胞は、京都大学ｉＰＳ細胞研究所が公開しているプロトコール「エピソーマルベクターを用いたヒトｉＰＳ細胞樹立方法」を元に作成した。
初期化に用いるプラスミドとして、ｐＣＸＬＥ−ｈＯｃｔ４−ｓｈｐ５３、ｐＣＸＬＥ−ｈＳＫ、ｐＣＸＬＥ−ｈＵＬの３種類のプラスミドを用いた。
実験には３４歳日本人女性の皮膚より樹立したヒト皮膚線維芽細胞（細胞番号：ＪＣＲＢ０５４１，細胞名：ＴＩＧ−１１１）を用いた。前記線維芽細胞の培養液は、ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）にＦｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を１０％加えたもの（１０％ＦＢＳ培地）を使用した。前記線維芽細胞は、１００ｍｍ培養ディッシュで３７℃、５％ＣＯ2の条件で培養し、維持した。プラスミドの導入は以下の手順で実施した。まず１００ｍｍ培養ディッシュにコンフルエントになった線維芽細胞の培地上清を吸引除去し、ＰＢＳ１０ｍＬを加えて細胞を洗浄した。ＰＢＳを吸引除去し、０．２５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ/１ｍＭ ＥＤＴＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)をディッシュあたり１ｍＬ加え、ディッシュを３７℃で３分間インキュベートした。細胞が浮き上がったら１０％ＦＢＳ培地４ｍＬを加えて懸濁し、細胞６×１０5を１５ｍＬ遠心チューブに回収した。ＰＢＳを加えて総量を１０ｍＬにした後、２００×ｇで５分間遠心し、上清を除去した。プラスミド溶液は、ｐＣＸＬＥ−ｈＯｃｔ４−ｓｈｐ５３、ｐＣＸＬＥ−ｈＳＫ、ｐＣＸＬＥ−ｈＵＬ各１μｇ（トータル３μｇ）を、Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて調製した。前記プラスミド溶液に細胞を懸濁し、前記細胞懸濁液をＮｅｏｎ１００μＬチップで吸い上げ、遺伝子導入装置Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にセットした。ＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒｔｉｏｎはＶｏｌｔａｇｅ：１６５０Ｖ、Ｗｉｄｔｈ：１０ｍｓ、Ｐｕｌｓｅ Ｎｕｍｂｅｒ：３の条件で行い、細胞へプラスミドを導入した。
導入後の細胞は、予め１０％ＦＢＳ培地３ｍＬを分注し３７℃、５％ＣＯ2の条件でインキュベートしておいた６ｗｅｌｌ培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ）へすばやく播種した。翌日（培養２日目）に培地上清を吸引除去し、１０％ＦＢＳ培地２ｍＬを添加し、培地を交換した。以降、２日間に１回の頻度で、培地を交換した。
培養７日目にフィーダー細胞上へ継代した。培地を吸引除去し、ＰＢＳ２ｍＬを加えて細胞を洗浄した。ＰＢＳを吸引除去し、０．２５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ/１ｍＭ ＥＤＴＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)を１ｗｅｌｌあたり０．３ｍＬ加え、３７℃で３分間インキュベートした。細胞が浮き上がったら１０％ＦＢＳ培地２ｍＬを加えてピペッティングにより懸濁した。１×１０4／ｍＬとなるよう１０％ＦＢＳ培地を添加して調整し、細胞懸濁液１０ｍＬを予めフィーダー細胞を播種しておいた１００ｍｍディッシュに播種した。フィーダー細胞としては、マイトマイシンＣ処理をしたＳＮＬ７６／７を使用した。
培養８日目に、培地をヒトｉＰＳ細胞用培地に交換した。ヒトｉＰＳ細胞用培地は、１μｇ／μＬ ｂＦＧＦ溶液２．５μＬ（Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ）をＰｒｉｍａｔｅ ＥＳ培地（Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ）５００ｍＬに添加して調製した。以降、２日間に１回の頻度で培地を交換した。
【0109】
ｉＰＳ細胞コロニーの単離は、培養２１日目から３０日目の間に行った。コロニーが成長し、目視で確認できるようになった後、分化が始まる前にコロニーを採取した。コロニーの大きさは約２ｍｍ以下のものを採取の対象とした。採取したコロニーを移すために、９６ウェルプレートに１ウェルあたりヒトｉＰＳ細胞用培地２００μＬを分注した。１０μＬ用ピペット等の小容量のピペットを用い、実体顕微鏡下でコロニーをはがした。採取したコロニーを９６ウェルプレートに移し、ピペッティングによってコロニーが小塊（ただし、シングルセルの手前の状態）となるまで崩した。２４ウェルプレートにマイトマイシンＣ処理をしたＳＮＬフィーダー細胞を準備しておき、その上に前記小塊となるまで崩したコロニーを播種した。ヒトｉＰＳ細胞用培地３００μＬを前記２４ウェルプレートに添加し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターで８０％〜９０％コンフルエントとなるまで培養した。【0110】
ｉＰＳ細胞の継代は、末盛らの方法に則って行った（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．４８：１１４９−１１５４，２００４）。【0111】
〔ヒト皮膚線維芽細胞の調製〕初期化前の対照細胞として、ヒト皮膚線維芽細胞（細胞番号：ＪＣＲＢ０５４１，細胞名：ＴＩＧ−１１１）を使用した。該ヒト皮膚線維芽細胞は、独立行政法人 医薬基盤研究所 ＪＣＲＢ細胞バンクより購入した。該線維芽細胞の培養液は、１０％ＦＢＳ培地を使用した。該線維芽細胞は、１００ｍｍ培養ディッシュで３７℃、５％ＣＯ2の条件で培養し、維持した。
【0112】
参考例２ 位相差顕微鏡を用いたｉＰＳ細胞の選別位相差顕微鏡を用いた細胞の形態観察により、ｉＰＳ細胞の選別を行った。細胞の分化の程度を、以下の３つの段階に分類した。コンパクトな球形で辺縁がクリアである状態のコロニーを最も未分化な段階のコロニー、厚さが減少し球形が少し崩れ始めた段階のコロニーを中程度の分化の段階であるコロニー、まとまりのある形状が崩れ平坦になったコロニーを最も分化したコロニーとした。最も分化したコロニーは、ピペットチップでくりぬき除外した。最も未分化な段階におけるコロニーをｉＰＳ細胞として選別し、解析に用いた。これらの細胞の選別は、目視によって行った。
【0113】
参考例３ アニオン交換カラムの調製攪拌機付き反応器中の３重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液２０００ｍＬに、テトラエチレングリコールジメタアクリレート（新中村化学工業社製）２００ｇ、トリエチレングリコールジメタアクリレート（新中村化学工業社製）１００ｇ、グリシジルメタクリレート（和光純薬工業社製）１００ｇおよび過酸化ベンゾイル（キシダ化学社製）１．０ｇの混合物を添加した。攪拌しながら加熱し、窒素雰囲気下にて８０℃で１時間重合した。次に、強カチオン性基を有する親水性単量体として、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド（和光純薬工業社製）１００ｇをイオン交換水に溶解した。これを同じ反応器に添加して、同様にして、攪拌しながら窒素雰囲気下にて８０℃で２時間重合した。得られた重合組成物を水およびアセトンで洗浄することにより、４級アンモニウム基を有する親水性重合体の層を表面に有する被覆重合体粒子を得た。得られた被覆重合体粒子について、粒度分布測定装置（ＡｃｃｕＳｉｚｅｒ７８０／Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて測定したところ、平均粒子径は１０μｍであった。
【0114】
得られた被覆重合体粒子１０ｇをイオン交換水１００ｍＬに分散させ、反応前スラリーを準備した。次いで、このスラリーを撹拌しながら、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミン（和光純薬工業社製）を１０ｍＬ加え、７０℃で４時間反応させた。反応終了後、遠心分離機（日立製作所社製、「Ｈｉｍａｃ ＣＲ２０Ｇ」）を用いて上澄みを除去し、イオン交換水で洗浄した。洗浄後、遠心分離機を用いて上澄みを除去した。このイオン交換水による洗浄を更に４回繰り返し、基材粒子の表面に４級アンモニウム基と３級アミノ基とを有するイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を得た。【0115】
上記イオン交換クロマトグラフィー用充填剤を液体クロマトグラフィーシステムのステンレス製カラム（カラムサイズ：内径４．６ｍｍ×長さ２０ｍｍ）に充填した。【0116】
参考例４ ＨＰＬＣ分析下記実施例において、ＰＣＲ増幅産物のイオン交換クロマトグラフィー分析は、参考例３で準備したアニオン交換カラムを用いて、以下の条件で行った。
システム：ＬＣ−２０Ａシリーズ（島津製作所社製）
溶離液：溶離液Ａ ２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
溶離液Ｂ ２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
＋１ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム
分析時間：１５分
溶出法：以下のグラジエント条件により溶離液Ｂの混合比率を直線的に増加させた。
０分（溶離液Ｂ４０％）→１０分（溶離液Ｂ１００％）
検体：後述する実施例１〜３で得られたＰＣＲ増幅産物
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：２６０ｎｍ
試料注入量：５μＬ
カラム温度：７０℃
【0117】
実施例１ ＨＰＬＣによるＮＡＮＯＧ遺伝子領域におけるＤＮＡメチル化状態の判定を用いたヒトｉＰＳ細胞とヒト皮膚線維芽細胞の判別〔ゲノムＤＮＡの抽出および亜硫酸水素塩処理〕
脱メチル化遺伝子の１つであるＮＡＮＯＧのプロモーター領域について、ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化を解析するため、測定試料を調製した。
先ず、上述のＣｐＧサイトを含むＣｐＧアイランドに対し、Ｍｅｔｈｙｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ソフトウェア（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてプライマーを設計した。
【0118】
参考例１で調製したｉＰＳ細胞（４株）および皮膚線維芽細胞（ＴＩＧ−１１１）から、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、製造者の指示説明書に従ってＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを、ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＺＹＭＯ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて亜硫酸水素塩処理した。【0119】
〔ＰＣＲ〕処理したＤＮＡを鋳型として用いて、ＮＡＮＯＧ遺伝子のプロモーター領域を含む３３６ｂｐ領域をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲプライマーは、プライマーセット１（配列番号１および２）を用いた。各プライマーの配列を表３に示す。ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡ ２５ｎｇ、１×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ2＋ｐｌｕｓ）（ＴａＫａＲａ ＢＩＯ社製）、２００μｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ、１．２５Ｕ ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ ＨＳ（ＴａＫａＲａ ＢＩＯ社製）、ならびに０．２μｍｏｌ／Ｌ ｆｏｒｗａｒｄおよびｒｅｖｅｒｓｅプライマー、を含んだ５０μＬの反応液で行った。ポリメラーゼは９５℃で１０分間活性化した。ＤＮＡは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製Ｖｅｒｉｔｉサーマルサイクラーにより、９４℃３０秒、５５℃３０秒および７２℃３０秒の３８サイクル、次いで最後に７２℃７分間の伸長という条件で増幅した。ＰＣＲ終了後、予めｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅを添加した２％アガロースゲルに、反応液５μＬにｌｏａｄｉｎｇ ｄｙｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ １μＬを混ぜた後アプライして電気泳動し、ＰＣＲ増幅産物を観察して目的のＰＣＲ増幅産物が得られたことを確認した。
【0120】
【表3】
【0121】
〔ＨＰＬＣ法による多能性幹細胞および皮膚線維芽細胞のＤＮＡメチル化解析〕上記で調製したｉＰＳ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞から得たＰＣＲ増幅産物を、それぞれ参考例４の手順でＨＰＬＣ分析にかけた。得られたＨＰＬＣクロマトグラムを図１に示す。なお図１のクロマトグラムは、ピーク高さが同じになるように調整されている。図１に示されるように、ｉＰＳ細胞からの検出シグナルのピークの保持時間の方がヒト皮膚線維芽細胞の検出シグナルのピークの保持時間より遅かった。これは、ＰＣＲ増幅した遺伝子領域において、ヒト皮膚線維芽細胞においてはメチル化されていたＣｐＧサイトが、ｉＰＳ細胞においては脱メチル化されたことを示している。この結果は、ＮＡＮＯＧが脱メチル化遺伝子であるという知見と一致することから、本発明の方法に従ってクロマトグラムのピークの保持時間を測定することで、ｉＰＳ細胞を識別可能であることが示された。また、異なるｉＰＳ細胞株間においても、実質的に同一の保持時間に検出シグナルが得られており、再現性良くｉＰＳ細胞を識別できることが示された。
【0122】
実施例２ ＨＰＬＣ法によるＤＮＡメチル化状態の判定を用いたヒトｉＰＳ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞の判別参考例１で調製したｉＰＳ細胞株およびヒト皮膚線維芽細胞（ＴＩＧ−１１１）のそれぞれから、実施例１と同様の手順でゲノムＤＮＡを抽出し、亜硫酸水素塩処理し、ＰＣＲ、およびＨＰＬＣにかけた。ＰＣＲでは、Ｏｃｔ３／４、ＲＡＢ２５、ＳＡＬＬ４、ＳＰ１００、およびＵＢＥ１Ｌの各遺伝子のＣｐＧ領域を増幅した。ＰＣＲプライマーは、プライマーセット２〜６（配列番号３〜１２）を用いた。各プライマーの配列およびプロダクトサイズを表４に示す。
【0123】
各遺伝子領域（プライマーセット２〜６によるＰＣＲ産物）について得られたＨＰＬＣクロマトグラムを図２〜６に示す。Ｏｃｔ３／４（プライマーセット２）を図２に、ＲＡＢ２５（プライマーセット３）を図３に、ＳＡＬＬ４（プライマーセット４）を図４に、ＳＰ１００（プライマーセット５）を図５に、ＵＢＥ１Ｌ（プライマーセット６）を図６に示す。なお、各図のクロマトグラムは、ピーク高さが同じになるように調整されている。【0124】
実施例３ ＨＰＬＣ法によるＤＮＡメチル化状態の判定を用いたヒトｉＰＳ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞の判別参考例１と同様の手順で調製したｉＰＳ細胞株およびヒト皮膚線維芽細胞（ＴＩＧ−１１１）のそれぞれから、実施例１と同様の手順でゲノムＤＮＡを抽出し、亜硫酸水素塩処理し、ＰＣＲ、およびＨＰＬＣにかけた。ＰＣＲ用のプライマーとしては、ＳＬＣ２２Ａ３、Ｏｃｔ３／４、ＳＰ１００、およびＵＢＥ１Ｌの各遺伝子のＣｐＧ領域を増幅するためのプライマーとして、それぞれプライマーセット７〜１０（配列番号１３〜１９）を設計した。ＰＣＲでは、ポリメラーゼは９５℃で４分間活性化し、ＤＮＡは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製Ｖｅｒｉｔｉサーマルサイクラーにより、９５℃３０秒、５５℃３０秒および７２℃６０秒の４０サイクル、次いで最後に７２℃７分間の伸長という条件で増幅した。アニーリング温度は、検討の上増幅効率が高く、かつ非特異な増幅が起こりにくい温度に最適化した。本解析に用いたプライマーの配列およびプロダクトサイズを表４に示す。
【0125】
ＳＬＣ２２Ａ３およびＯｃｔ３／４の各遺伝子領域（それぞれプライマーセット７および８によるＰＣＲ産物）について得られたＨＰＬＣクロマトグラムを図７〜８に示す。なお、各図のクロマトグラムは、ピーク高さが同じになるように調整されている。【0126】
【表4】
【0127】
脱メチル化遺伝子に分類される遺伝子、すなわちＯｃｔ３／４、ＲＡＢ２５、ＳＡＬＬ４、およびＳＬＣ２２Ａ３においては、図２〜４、７および８に示されるように、ｉＰＳ細胞からの検出シグナルのピークの保持時間の方が、ヒト皮膚線維芽細胞の検出シグナルピークの保持時間より遅かった。この結果は、本発明の方法により、ｉＰＳ細胞における様々な脱メチル化遺伝子領域の脱メチル化を検出できたことを示している。一方、メチル化遺伝子に分類される遺伝子、すなわちＳＰ１００およびＵＢＥ１Ｌにおいては、図５および６に示されるように、ｉＰＳ細胞の検出シグナルのピークの保持時間の方が、ヒト皮膚線維芽細胞の検出シグナルピークの保持時間より早かった。この結果は、本発明の方法により、ｉＰＳ細胞における様々なメチル化遺伝子領域のメチル化を検出できたことを示している。これらの結果から、本発明の方法に従って、メチル化遺伝子または脱メチル化遺伝子について、クロマトグラムのピークの保持時間を測定することで、ｉＰＳ細胞を識別可能であることが示された。
【0128】
比較例１ バイサルファイトシークエンス法によるヒトｉＰＳ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞のＤＮＡメチル化解析【0129】
実施例１および実施例２で調製した各ＰＣＲ増幅産物をクローニングし、バイサルファイトシークエンス法を用いて、各遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧサイトのメチル化状態を解析した。ＰＣＲ増幅産物を、バイオダイナミクス社製ＴＡクローニングキットを使用し、クローニング、形質転換し、２０個〜２４個のコロニーを回収した。各コロニーからプラスミドを抽出し、Ｍ１３ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒを用いてシークエンシングし亜硫酸水素塩処理後のＤＮＡ配列を決定した。メチル化状態を確認するため、ＱＵＭＡ（ｈｔｔｐ：//ｑｕｍａ.ｃｄｂ.ｒｉｋｅｎ.ｊｐ/）を用いて解析した。
【0130】
解析結果を図９および１０に示す。ＨＰＬＣ法を用いた本発明の方法とバイサルファイトシークエンス法とで、メチル化状態の判定結果は一致した。しかし、バイサルファイトシークエンス法によりＤＮＡのメチル化状態の変化を解析する場合には、ＰＣＲ増幅の後、増幅産物をクローニングし、さらにクローニングで得られた多数の検体を１つずつシークエンシング等により解析しなければならず、非常に多くの時間と労力を必要とする。一方、本発明の方法によれば、ＰＣＲ増幅産物を直接ＨＰＬＣ分析に供するので、クローニングの工程が不要であり、測定例数も少なくて済む。実際、バイサルファイトシークエンス法が１遺伝子領域につき解析に数日程度かかるのに対し、本発明の方法は、１遺伝子領域につき約１０分で解析結果が得られる。したがって、本発明の方法によれば、迅速かつ容易に、かつハイスループットで、ｉＰＳ細胞の識別が可能である。【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]