特許 6692101 形質転換ミミズの作成方法及び組み換えタンパク質の生産方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6692101

(24)【登録日】2020年4月16日

(45)【発行日】2020年5月13日

(54)【発明の名称】形質転換ミミズの作成方法及び組み換えタンパク質の生産方法

(51)【国際特許分類】

   A01K 67/033 20060101AFI20200427BHJP

   C12N 15/87 20060101ALI20200427BHJP

   C12N 15/89 20060101ALI20200427BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20200427BHJP

【ＦＩ】

   A01K67/033 501

   C12N15/87 Z

   C12N15/89 Z

   C12P21/02 C

【請求項の数】4

【全頁数】8

(21)【出願番号】特願2018-225522(P2018-225522)

(22)【出願日】2018年11月30日

(62)【分割の表示】特願2014-212692(P2014-212692)の分割

【原出願日】2014年10月17日

(65)【公開番号】特開2019-50827(P2019-50827A)

(43)【公開日】2019年4月4日

【審査請求日】2018年12月17日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 平成２６年９月３日 国立大学法人長岡技術科学大学マルチメディアシステムセンターで開催された「平成２６年度 生物機能工学専攻・修士論文中間審査会」において公開

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 平成２６年１０月９日 独立行政法人国立高等専門学校機構長岡工業高等専門学校１号館３階廊下および共有スペース，４４１講義室で開催された「平成２６年度卒業研究 中間発表」において公開

(73)【特許権者】

【識別番号】504237050

【氏名又は名称】独立行政法人国立高等専門学校機構

(74)【代理人】

【識別番号】100091373

【弁理士】

【氏名又は名称】吉井 剛

(74)【代理人】

【識別番号】100097065

【弁理士】

【氏名又は名称】吉井 雅栄

(72)【発明者】

【氏名】赤澤 真一

【審査官】 西 賢二

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１２−５３２６０４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０９−０４７２３３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−１４７３９９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 農林水産省 蚕糸・昆虫農業技術研究所 生体情報部 代謝調節研究室 ほか，顕微注射技術を用いた無脊椎動物の形質操作法の確立，平成１１年度 科学技術振興調整費による重点基礎研究成果集，２０００年，pp. 236-237

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ａ０１Ｋ ６７／００−６７／０４

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ツリミミズ科（Lumbricidae）に属するミミズを長さ方向途中で切断するか若しくは切り込みを入れ、このミミズに麻酔処理を施し、前記麻酔が作用している状態で前記切断若しくは前記切り込みによって生成される再生切断面に目的遺伝子が発現するように構築した発現ベクターを注入し電気穿孔法を用いてこの発現ベクターを細胞内若しくはゲノム内に導入して前記ミミズを形質転換させることを特徴とする形質転換ミミズの作成方法。

【請求項2】

請求項１記載の形質転換ミミズの作成方法において、前記発現ベクターをマイクロインジェクション法により注入することを特徴とする形質転換ミミズの作成方法。

【請求項3】

食用に供されるツリミミズ科（Lumbricidae）に属するミミズを長さ方向途中で切断するか若しくは切り込みを入れ、このミミズに麻酔処理を施し、前記麻酔が作用している状態で前記切断若しくは前記切り込みによって生成される再生切断面に目的遺伝子が発現するように構築した発現ベクターをマイクロインジェクション法により注入し電気穿孔法を用いてこの発現ベクターを細胞内若しくはゲノム内に導入して前記ミミズを形質転換させることを特徴とする形質転換ミミズの作成方法。

【請求項4】

請求項１〜３いずれか１項に記載の形質転換ミミズの作成方法を用いて所定の組み換えタンパク質を生産することを特徴とする組み換えタンパク質の生産方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、形質転換ミミズの作成方法及び組み換えタンパク質の生産方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

遺伝子工学を利用した組み換えタンパク質の生産は、微生物、特に大腸菌を中心に行われているが、動物由来の組み換えタンパク質の生産に関しては、糖鎖修飾等のため微生物で発現させ、活性有る状態で取得することは困難であり、そのため、従来は、培養細胞やヤギ等の高等動物（哺乳動物）の遺伝子組み換え家畜を用いて活性体の生産が試みられている。

【0003】

しかしながら、これらの手法は、煩雑であるうえに微生物を用いた場合に比べコスト高であるという問題があり、また、組み換えタンパク質を効率良く生産回収するには、体内で生産した組み換えタンパク質を液体で細胞外へ分泌させそれを回収するのが最も効率が良いと考えられるが、微生物以外で分泌回収システムを構築することは非常に困難であるため、安価で簡便な組み換えタンパク質の生産方法の提案が望まれていた。

【0004】

このような状況の中、近年、特許文献１に示すような、ミミズを用いた組み換えタンパク質の生産方法が提案されている。

【0005】

この特許文献１では、ミミズの生殖巣を含む前半部を切断した後、再生を誘導して再生芽細胞を形成させ、再生初期にミミズの再生芽細胞部位に組み換え遺伝子発現ベクターを注入して形質転換されたミミズを作成し、この形質転換ミミズが生産する組み換えタンパク質をミミズ破砕液と共に回収することで、簡便に組み換えタンパク質が得ることが示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特表２０１２−５３２６０４号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

しかしながら、実際にはベクターを生殖巣に直接注入する操作は、非常に難しく熟練を要する操作であり、誰もが容易にできるものではなかった。

【0008】

また、組み換えタンパク質回収時にミミズを死滅させてしまうため、連続的に効率良く組み換えタンパク質を生産・回収することができなかった。

【0009】

本発明は、上述のような従来技術の問題に鑑みなされたものであり、極めて容易に組み換えタンパク質を生産することができる形質転換ミミズの作成方法及び組み換えタンパク質の生産方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

添付図面を参照して本発明の要旨を説明する。

【0011】

ツリミミズ科（Lumbricidae）に属するミミズを長さ方向途中で切断するか若しくは切り込みを入れ、このミミズに麻酔処理を施し、前記麻酔が作用している状態で前記切断若しくは前記切り込みによって生成される再生切断面に目的遺伝子が発現するように構築した発現ベクターを注入し電気穿孔法を用いてこの発現ベクターを細胞内若しくはゲノム内に導入して前記ミミズを形質転換させることを特徴とする形質転換ミミズの作成方法に係るものである。

【0012】

また、請求項１記載の形質転換ミミズの作成方法において、前記発現ベクターをマイクロインジェクション法により注入することを特徴とする形質転換ミミズの作成方法に係るものである。

【0013】

また、食用に供されるツリミミズ科（Lumbricidae）に属するミミズを長さ方向途中で切断するか若しくは切り込みを入れ、このミミズに麻酔処理を施し、前記麻酔が作用している状態で前記切断若しくは前記切り込みによって生成される再生切断面に目的遺伝子が発現するように構築した発現ベクターをマイクロインジェクション法により注入し電気穿孔法を用いてこの発現ベクターを細胞内若しくはゲノム内に導入して前記ミミズを形質転換させることを特徴とする形質転換ミミズの作成方法に係るものである。

【0014】

また、請求項１〜３いずれか１項に記載の形質転換ミミズの作成方法を用いて所定の組み換えタンパク質を生産することを特徴とする組み換えタンパク質の生産方法に係るものである。

【発明の効果】

【0015】

本発明は上述のようにしたから、極めて容易に目的遺伝子を発現する形質転換ミミズを作成することができ、この形質転換ミミズを用いて容易に組み換えタンパク質を効率良く得る（生産する）ことができる画期的な形質転換ミミズの作成方法及び組み換えタンパク質の生産方法となる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】実施例１におけるルシフェラーゼ活性測定結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0017】

好適と考える本発明の実施形態を、図面に基づいて本発明の作用を示して簡単に説明する。

【0018】

本発明は、まず、ミミズに発現ベクターを注入する。この注入方法に関しては、特に限定するものではなく、例えばマイクロシリンジやマイクロインジェクター等の注入器具を用い、ミミズの環帯と尾部とに各々注入したり、ミミズを所定部位で切断し、この切断面付近に注入する等の方法がある。

【0019】

続いて、この注入した発現ベクターを、細胞内若しくはゲノムに導入してミミズを形質転換させる。本発明では、電気穿孔法を用い、細胞に微小な孔を穿設し、この孔から発現ベクターを導入する方法を用いる。

【0020】

具体的には、例えばエレクトロポレーターを用い、処理条件を、電圧５〜１００Ｖ（好ましくは１０〜４０Ｖ、より好ましくは２８Ｖ）、処理時間５〜３００ｍｓｅｃ（好ましくは１０〜１２０ｍｓｅｃ、より好ましくは６０ｍｓｅｃ）、パルス１〜２０回／秒（好ましくはパルス３〜１０回／秒、より好ましくは６回／秒）に設定して行う。

【0021】

この電気穿孔法を用いて細胞内に発現ベクターを導入した後、所定の温湿度で管理された環境下で所定期間飼育することで目的遺伝子が発現する形質転換ミミズを得ることができ、この形質転換ミミズを用いることで所定の組み換えタンパク質を得ることができる。

【0022】

尚、本発明において、形質転換させるミミズは、特に限定するものは無く全てのミミズを用いることが可能であるが、例えばツリミミズ科のシマミミズやアンドレイミミズやアカミミズは、体長５〜１０ｃｍと適度な大きさでタンパク質生産能力にも優れ、また、日本で多く養殖されていて容易に入手できると共に非常に安価であるため、これらを用いると特に良い。

【0023】

また、例えば電気穿孔法を施す前にミミズに麻酔処理を施すと良く、この麻酔処理を施すことによって、電気穿孔法を行なう際にミミズが暴れず、スムーズに処理を行なうことができる。

【実施例】

【0024】

本発明の具体的な実施例について説明する。

【0025】

本実施例は、発現ベクターを細胞内若しくはゲノムに導入することで組み換えタンパク質を分泌生産するミミズを得、このミミズを用いて所定の組み換えタンパク質を得ることができるシステムに関するものである。

【0026】

以下、本実施例について詳細に説明する。

【0027】

［形質転換ミミズの作成］
本実施例では、形質転換させるミミズに、シマミミズ（Eisenia fetida）を用い、具体的には、２４〜４８時間絶食させたものを用いる。

【0028】

より具体的には、本実施例では、重金属を含まない飼料で食用として飼育したミミズ（詳細には特許第５５０５７５０号に記載の方法で飼育したミミズ）を用いた。

【0029】

尚、採用するミミズは上記に限らず、例えば同じツリミミズ科に属するアンドレイミミズ（Eisenia andrei）やアカミミズ（Lumbricus rubellus）でも良い。

【0030】

本実施例では、このシマミミズを尾部から約１ｃｍのところで切断し、この切断した尾部を滅菌水で湿らせたウエスを敷いた容器内に入れ、人工気象器で所定の温湿度環境下のもと、具体的には、温度１５〜３０℃（本実施例では２１℃に設定）、湿度５０〜９０％（本実施例では７０％に設定）の環境下のもと、４〜４８時間（本実施例では２４時間）飼育した。

【0031】

本実施例では、この所定環境で飼育したミミズを３％エタノール溶液（液温４℃）中に１０分程度放置してこのミミズに麻酔処理を施し、この麻酔が作用した状態で発現ベクターを注入した。

【0032】

具体的には、従来法であるマイクロインジェクション法を用いて、切断したミミズの尾部の再生切断面付近に、ルシフェラーゼ発現ベクター（pGL4.50）を注入した。

【0033】

続いて、電気穿孔法を用いて、この注入したルシフェラーゼ発現ベクターをミミズの細胞内（若しくはベクター）に導入した。

【0034】

具体的には、エレクトロポレーター（BTX社製 BTX45-2007 GEMINI X2 System）を用いて、電圧：２８Ｖ、処理時間：６０ｍｓｅｃ、パルス：６回／秒の条件でミミズに電気ショックを与え、ルシフェラーゼ発現ベクターをミミズに導入した。

【0035】

その後、温度１５〜３０℃（本実施例では２１℃）、湿度５０〜９０％（本実施例では７０％）に設定した人工気象器にミミズを入れ、２４〜７２時間（本実施例では６８時間）飼育し、この飼育したミミズを形質転換ミミズとして得た。

【0036】

［ルシフェラーゼ活性測定］
本実施例では、上述のようにして作成した形質転換ミミズが、実際にルシフェラーゼ発現ベクターが導入され、形質転換されたかどうかを確認するため、ルシフェラーゼ活性測定を行なった。尚、本実施例では、上述の条件で作成したミミズの他に、電気穿孔法における電圧条件を１４Ｖに設定して作成したミミズ（１４Ｖ条件ミミズ）と、組み換えタンパク質（ルシフェラーゼ）が発現しない空ベクターを注入し、上記形質転換ミミズの作成方法を同様の処理を行ったミミズ（コントロールミミズ）とを比較対象として用意し、これらも合わせてルシフェラーゼ活性測定を行なった。

【0037】

ルシフェラーゼ活性測定は、具体的には、形質転換させた断片及び比較対象の断片の各々の重量を測定した後、各断片を細胞溶解液（Luciferase Assay System,プロメガ社製）、ビーズを含むスクリューキャップチューブに添加し、これを細胞破砕装置にセットして、４２００回転、２０秒の処理条件で５回、破砕処理を行った後、遠心し上清液を取得し、この上清液にルシフェリン（Luciferase Assay System,プロメガ社製）を添加し、ルミノメーター（GloMax-Multi detection System,プロメガ社製）を用いて発光を測定した。

【0038】

その結果、図１に示すように、本実施例で示した方法（電気穿孔法における電圧条件が２８Ｖ）で形質転換を行なったミミズだけに、時間と共に発光強度が減少して行く傾向が見られ、これより、ルシフェラーゼ発現ベクターが導入され形質転換され組み換えタンパク質が発現していることが確認できた。

【0039】

このように、本実施例に示した形質転換ミミズの作成方法により、熟練者でなくても極めて容易に形質転換ミミズを作成することができ、この形質転換ミミズを用いれば、極めて容易に組み換えタンパク質を得ることができる。

【0040】

尚、本実施例では、尾部から約１ｃｍのところで切断し、この切断したミミズの尾部の再生切断面付近に、発現ベクター（ルシフェラーゼ発現ベクター）を注入したが、例えば完全に切断せず、カッター等で切込みを入れ、この切込みに発現ベクターを注入しても良いし、或いは切断処理を行わず、非切断状態のミミズの所定部位（例えば尾部や環帯付近）に発現ベクターを注入しても良い。

【0041】

［組み換えタンパク質の取得方法］
本実施例に示した形質転換ミミズの作成方法で作成した形質転換ミミズが生産する組み換えタンパク質の取得方法について、以下に説明する。

【0042】

ミミズがタンパク質あるいはペプチドを分泌生産することは従来知られている。従って、この形質転換ミミズからも所定の組み換えタンパク質が分泌生産されていると言える。

【0043】

従って、本実施例では、この形質転換ミミズが分泌する体腔液を回収することで、組み換えタンパク質を取得した。

【0044】

具体的には、先ず、形質転換ミミズを水洗いして体表の汚物等を除去し、その後、ミミズを死滅させない程度の濃度に調整した有機溶媒（例えばエタノール）または、酸若しくはアルカリを少量滴下し、体腔液を分泌させ、この分泌した体腔液を回収した。

【0045】

より具体的には、先ず、対象の形質転換ミミズを２６時間絶食させ、その後純水で洗浄して体表の汚物を除去した後、表面の水分を除去した。

【0046】

続いて、１５ｍｌファルコンチューブに２５ｍＭ ＮａＣｌ含有５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌを加え、この中に準備した形質転換ミミズ５匹を加え、撹拌混合（２０ｓｅｃ）して粘液を除去した後、ファルコンチューブから取り出し、水洗し、再び、表面の水分を除去した。

【0047】

続いて、この形質転換ミミズを、１５ｍｌファルコンチューブに入れ、０．１Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）５．０μｌを加えた後、再度、ファルコンチューブから形質転換ミミズを取り出し、遠心分離処理（４℃、６０００回転、１５分）し、この処理後の上清液をエッペンチューブに取り、この上清液を遠心分離処理（４℃、１４０００回転、１０分）し、更にこの処理後の上清液をエッペンチューブに取り、再度遠心分離処理（４℃、１４０００回転、５分）し、この遠心分離処理にて得られた上清液を分泌液として回収し、組み換えタンパク質を得た。

【0048】

尚、０．１Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）５．０μｌを加えた後、ファルコンチューブから取り出した形質転換ミミズは、水洗いすることで死滅することなく再び活動を始めることを確認した。即ち、上記方法で分泌液を回収することで、形質転換ミミズを死滅させることなく連続的に分泌液を回収することができることとなる。

【0049】

また、体腔液を分泌させる方法に関しては、上述した方法以外に、例えばミミズに熱風やインキュベータを用いてミミズが死滅しない程度の熱刺激（０℃〜４℃程度の低温刺激や３０℃〜４０℃程度の中温刺激）を付与したり、太陽光に曝して紫外線を照射する刺激を付与したり、白熱灯等を用いて強光を照射する刺激を付与したり、ミミズが死滅しない薬物（例えば重層）による刺激を付与したり、或いはこれらの刺激を含む他の刺激を付与して、体腔液を分泌させても良く、本実施例に限られるものではない。

【0050】

また、本実施例は、形質転換させるミミズに、食用ミミズを採用したから、上述のように分泌液と共に組み換えタンパク質を回収する方法以外に、形質転換ミミズそのものを摂取することで、組み換えタンパク質を摂取することも可能である。

【0051】

上述した本実施例の作用・効果について以下に説明する。

【0052】

本実施例は、形質転換させるミミズに、ツリミミズ科のシマミミズを採用するから、安価で入手し易く、低コスト化が実現可能となる。

【0053】

また、本実施例は、ミミズを形質転換させる際に、電気穿孔法を用いて注入した発現ベクターを細胞内若しくはゲノムに導入するから、熟練者でなくても極めて容易に発現ベクターを細胞内に導入でき、ミミズを形質転換させることができる。

【0054】

しかも、本実施例は、このミミズに電気穿孔法を施す前に、ミミズに麻酔処理を施し、麻酔が効いている状態で電気穿孔法を行なうので、ミミズが暴れず、作業がし易い。

【0055】

また、本実施例は、組み換えタンパク質を分泌回収する際、形質転換ミミズを死滅させないので、分泌液の連続回収が可能となり効率的な組み換えタンパク質の分泌回収システムの構築が可能となる。

【0056】

更に、本実施例は、このミミズに食用ミミズを採用するから、組み換えタンパク質の取得が分泌液による回収取得に限らず、分泌回収することなく、そのまま形質転換ミミズを摂取することで組み換えタンパク質を摂取することも可能となり、分泌回収の手間が省ける。

【0057】

また、分泌液を回収する場合も、ミミズを死滅させることなく回収できるから、組み換えタンパク質を連続的に生産・回収することができる。

【0058】

以上、本実施例においては、シマミミズ等にルシフェラーゼ発現ベクターを導入することで蛍由来発光酵素の主成分となる発光タンパク質を生産するミミズが得られ、これにより、蛍由来発光酵素の主成分となる発光タンパク質を簡易に且つ効率良く得ることが可能となる。

【0059】

尚、本発明は、本実施例に限られるものではなく、各構成要件の具体的構成は適宜設計し得るものである。

【図1】