特許 6693654 生体防御用組成物及びその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6693654

(24)【登録日】2020年4月20日

(45)【発行日】2020年5月13日

(54)【発明の名称】生体防御用組成物及びその用途

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/08 20190101AFI20200427BHJP

   A61K 38/10 20060101ALI20200427BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20200427BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20200427BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20200427BHJP

   A61K 8/64 20060101ALI20200427BHJP

   A61Q 17/00 20060101ALI20200427BHJP

   A23L 33/18 20160101ALI20200427BHJP

   A23K 10/00 20160101ALI20200427BHJP

   A23K 20/147 20160101ALI20200427BHJP

【ＦＩ】

   A61K38/08ZNA

   A61K38/10

   A61P31/04

   A61P29/00

   A61P17/02

   A61K8/64

   A61Q17/00

   A23L33/18

   A23K10/00

   A23K20/147

【請求項の数】2

【全頁数】31

(21)【出願番号】特願2016-34926(P2016-34926)

(22)【出願日】2016年2月25日

(65)【公開番号】特開2017-149692(P2017-149692A)

(43)【公開日】2017年8月31日

【審査請求日】2019年1月25日

(73)【特許権者】

【識別番号】304027279

【氏名又は名称】国立大学法人 新潟大学

(74)【代理人】

【識別番号】100077012

【弁理士】

【氏名又は名称】岩谷 龍

(72)【発明者】

【氏名】谷口 正之

(72)【発明者】

【氏名】落合 秋人

(72)【発明者】

【氏名】築野 卓夫

(72)【発明者】

【氏名】山中 崇

【審査官】 高橋 樹理

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１３−０６０４１８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１４−０４３４４２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 日本生物工学会大会講演要旨集，２０１４年，Vol.66th，p.168，2P-245

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３８／０８

Ａ２３Ｋ １０／００

Ａ２３Ｋ ２０／１４７

Ａ２３Ｌ ３３／１８

Ａ６１Ｋ ８／６４

Ａ６１Ｋ ３８／１０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１３〜２４のいずれかで示されるアミノ酸配列からなり、抗菌活性、抗炎症活性及び創傷治癒活性からなる群より選択される１以上の活性を有するペプチドを含有する生体防御用組成物。

【請求項2】

請求項１に記載の生体防御用組成物を含有する飲食品、飲食品添加物、医薬品、医薬部外品、化粧品又は飼料。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生体防御用組成物及びこれを含有する飲食品、飲食品添加物、医薬品、医薬部外品、化粧品及び飼料に関する。

【背景技術】

【0002】

人は、加齢とともに発音、咀嚼、嚥下、唾液分泌などの口腔機能が低下する。なかでも唾液分泌が低下すると、歯周病や口内炎、齲蝕（虫歯）、口臭といった口腔疾患が増大する。また、皮膚の疾患や傷害によって皮膚のバリア機能や保湿機能が低下する。更に、乳幼児や高齢者の免疫機能は低いため、病原菌に感染しやすい。これらの機能の低下は、国民の健康の維持と増進にとって重大な課題である。

【0003】

これまで、口腔ケア用品等に添加される抗菌成分又は殺菌成分としては、エタノール等の有機溶剤や抗生物質などが提案されている（例えば、特許文献１参照）。しかしながら、前記有機溶剤を用いた口腔ケア用品は、体質的に受け入れられないという問題、乳幼児には使用できないという問題があり、前記抗生物質を用いた口腔ケア用品では、長期間使用により耐性菌が出現するという問題がある。

【0004】

一方、動物、植物、昆虫、微生物等の様々な生物には、外界からの病原微生物の侵入に対して自己防御するための自己生体防御機構が本来備っており、多糖分解酵素や溶菌酵素などのタンパク質やアミノ酸が約１０個〜約５０個程度からなる抗菌ペプチドを生物自らが産生している。これらの抗菌成分は、前記抗生物質と比較して広範囲な抗菌活性を有し、耐性菌を生じさせにくいという特性を有することから、口腔用抗菌剤としての利用が期待されている。

【0005】

生物由来の抗菌剤として、例えば、イネ由来の抗菌タンパク質であるオリザシスタチンが知られている。しかしながら、オリザシスタチンは、歯周病原因菌（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ等）のジンジパインを阻害することが知られているものの、その菌体に対して直接抗菌活性を示すものではない。
イネゲノム中にはディフェンシンなど既知の抗菌タンパク質のホモログが存在するが、イネの生体防御に対する寄与は不明である。

【0006】

特定のタンパク質又はその一部からなるフラグメントが感染防御作用、生体防御作用等を有することが報告されている（例えば、特許文献１、２等）。

【0007】

しかしながら、未だ、植物由来であって、優れた生体防御作用を有する組成物の開発が望まれているのが現状である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】特開２０１３−６０４１６号公報

【特許文献2】特開２０１４−２３７６２６号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明は、優れた生体防御作用を有する新規な組成物を提供することを課題とする。本発明における組成物は、溶血活性を有しないため、安全に使用することができる。

【課題を解決するための手段】

【0010】

前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
〔１〕米糠タンパク質酵素加水分解物を含有する生体防御用組成物。
〔２〕米糠タンパク質酵素加水分解物が、分子量１０００〜３０００であり、等電点が１０以上のペプチドを含有する前記〔１〕に記載の生体防御用組成物。
〔３〕米糠タンパク質酵素加水分解物が、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列を含み、アミノ酸残基数が６００以下であり、生体防御作用を有するタンパク質又はペプチドを含有する前記〔１〕又は〔２〕に記載の生体防御用組成物。
（Ａ）配列番号１〜２４のいずれかで示されるアミノ酸配列
（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列において１個〜数個のアミノ酸の保存的置換又は欠失を有するアミノ酸配列
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列において少なくとも４つの連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列
〔４〕酵素がペプシン、トリプシン、キモトリプシン及びパパインからなる群より選択される１以上である前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の生体防御用組成物。
〔５〕以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列を含み、アミノ酸残基数が６００以下であり、生体防御作用を有するタンパク質又はペプチドを含有する生体防御用組成物。
（Ａ）配列番号１〜２４のいずれかで示されるアミノ酸配列
（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列において１個〜数個のアミノ酸の保存的置換又は欠失を有するアミノ酸配列
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列において少なくとも４つの連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列
〔６〕生体防御が抗菌、抗炎症及び創傷治癒からなる群より選択される１以上である前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の生体防御用組成物。
〔７〕前記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の生体防御用組成物を含有する飲食品、飲食品添加物、医薬品、医薬部外品、化粧品又は飼料。

【発明の効果】

【0011】

本発明によれば、優れた生体防御作用を有する新規な組成物及びその用途（飲食品、飲食品添加物、医薬品、医薬部外品、化粧品又は飼料等）を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】図１は、ペプシンを用いた米糠タンパク質の加水分解物の等電点電気泳動による分画を示す。

【図2】図２は、トリプシンとキモトリプシンの等質量混合物を用いた米糠タンパク質の加水分解物の等電点電気泳動による分画を示す。

【図3】図３はペプシンを用いて米糠タンパク質を加水分解したサンプルを等電点電気泳動によって分画したフラクションのPorphyromonas gingivalisに対する抗菌活性を示すグラフである。

【図4】図４は、ペプシンを用いて米糠タンパク質を加水分解したサンプルを等電点電気泳動によって分画したフラクションのStreptococcus mutansに対する抗菌活性を示すグラフである。

【図5】図５は、ペプシンを用いて米糠タンパク質を加水分解したサンプルを等電点電気泳動によって分画したフラクションのPropionibacterium acnesに対する抗菌活性を示すグラフである。

【図6】図６は、ペプシンを用いて米糠タンパク質を加水分解したサンプルを等電点電気泳動によって分画したフラクションのCandida albicansに対する抗菌活性を示すグラフである。

【図7】図７は、トリプシンとキモトリプシンの等質量混合物を用いて米糠タンパク質を加水分解したサンプルを等電点電気泳動によって分画したフラクションのPorphyromonas gingivalisに対する抗菌活性を示すグラフである。

【図8】図８は、トリプシンとキモトリプシンの等質量混合物を用いて米糠タンパク質を加水分解したサンプルを等電点電気泳動によって分画したフラクションのStreptococcus mutansに対する抗菌活性を示すグラフである。

【図9】図９は、トリプシンとキモトリプシンの等質量混合物を用いて米糠タンパク質を加水分解したサンプルを等電点電気泳動によって分画したフラクションのPropionibacterium acnesに対する抗菌活性を示すグラフである。

【図10】図１０は、トリプシンとキモトリプシンの等質量混合物を用いて米糠タンパク質を加水分解したサンプルを等電点電気泳動によって分画したフラクションのCandida albicansに対する抗菌活性を示すグラフである。

【図11】図１１は、合成ペプチドの管腔形成促進活性を示すグラフである。

【図12】図１２は、合成ペプチドの管腔形成促進活性を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本発明は、米糠タンパク質酵素加水分解物を含有する生体防御用組成物を提供する。

【0014】

〔米糠タンパク質酵素加水分解物〕
米糠タンパク質酵素加水分解物は、米糠タンパク質を酵素により加水分解することにより得られる。
原料となる米糠は、玄米を精米することにより得ることができる。米糠は、白米部分の含量が少ないことが好ましい。好ましくは精米歩合が８５％以上の精米により得られる米糠であり、より好ましくは精米歩合が９０％以上の精米により得られる米糠であり、さらに好ましくは精米歩合が９５％以上の精米により得られる米糠である。また、米糠には脱脂米糠が含まれ、米糠から米油を抽出した残渣である脱脂米糠は、本発明において米糠抽出物の原料として好適に用いることができる。
酵素として例えば、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン等が挙げられる。用いる酵素に応じた至適ｐＨ及び至適温度で米糠タンパク質を加水分解することが好ましい。米糠タンパク質酵素加水分解物は、分子量が例えば１０００〜３０００であってもよく、１０００〜２０００であってもよく、２０００〜３０００であってもよく、１５００〜２５００であってもよい。米糠タンパク質酵素加水分解物は、ｐＨ７における実効電荷が正であることが好ましく、＋１〜５であることがより好ましい。米糠タンパク質酵素加水分解物は、等電点が例えば１０以上であることが好ましく、１０．５以上であることがより好ましい。

【0015】

〔タンパク質又はペプチド〕
米糠タンパク質酵素加水分解物は、例えば、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列を含み、アミノ酸残基数が６００以下であり、生体防御作用を有するタンパク質又はペプチド（以下、本発明におけるタンパク質又はペプチドともいう）を通常含有していている。
（Ａ）配列番号１〜２４のいずれかで示されるアミノ酸配列
（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列において１個〜数個のアミノ酸の保存的置換又は欠失を有するアミノ酸配列
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列において少なくとも４つの連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列

【0016】

以下に、配列番号１〜２４を示す。なお、配列番号１〜１２の横の括弧書きにおいて「アメリカの国立生物工学情報センター(National Center for Biotechnology Information, NCBI）に登録されているタンパク質の遺伝子番号(Gene Identity)とタンパク質名」を示す。

【0017】

【0018】

【0019】

【0020】

【0021】

【0022】

【0023】

【0024】

【0025】

【0026】

【0027】

【0028】

【0029】

本発明におけるタンパク質又はペプチドのアミノ酸の個数の下限値は、４個であり、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個であってもよい。本発明におけるタンパク質又はペプチドのアミノ酸の個数の上限値は、６００個であり、５５０個、５００個、４５０個、４００個、３５０個、３００個、２５０個、２００個、１５０個、１００個、５０個、３０個、２０個であってもよい。

【0030】

本発明において「１個〜数個のアミノ酸の保存的置換又は欠失を有する」の「数個」とは、例えば１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個等である。

【0031】

本発明において「アミノ酸の保存的置換」とは、以下の表１の各群内におけるアミノ酸間の置換をいう。この中で、好ましいアミノ酸の保存的置換としては、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、グリシンとアラニンとの間での置換等が挙げられる。

【0032】

【表1】

【0033】

本発明におけるタンパク質又はペプチドは、誘導体であってもよい。誘導体は、特定のアミノ酸配列で示されるタンパク質又はペプチドのＣ末端が、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ⁻）、アミド（−ＣＯＮＨ_２）又はエステル（−ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。エステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ_１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ_３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ_６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ_１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ_１−２アルキル基などのＣ_７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが挙げられる。アミド体としては、アミド、Ｃ_１−６アルキル基の１つ又は２つで置換されたアミド、フェニル基で置換されたＣ_１−６のアルキル基の１つ又は２つで置換されたアミド、アミド基の窒素原子を含んで５から７員環のアザシクロアルカンを形成するアミド等が挙げられる。
本発明のタンパク質又はペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基又はカルボキシレートを有している場合、それらの基がアミド化又はエステル化されているものも本発明のタンパク質又はペプチドに含まれる。本発明のタンパク質又はペプチドがＮ末端以外にアミノ基を有している場合、そのアミノ基がアミド化されているものも本発明のタンパク質又はペプチドに含まれる。

【0034】

誘導体には、Ｎ末端のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ_２−６アルカノイル基などのＣ_１−６アシル基など）で保護されているもの、Ｎ末端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ_２−６アルカノイル基などのＣ_１−６アシル基など）で保護されているものも含まれる。

【0035】

本発明のタンパク質又はペプチドの誘導体を構成するアミノ酸は、側鎖が任意の置換基で修飾されていてもよい。置換基は特に限定されないが、例えば、フッ素原子、塩素原子、シアノ基、水酸基、ニトロ基、アルキル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アミノ基、リン酸基などが挙げられる。また、側鎖の置換基は、保護基で保護されていてもよい。
本発明におけるタンパク質又はペプチドは、元のタンパク質又はペプチドの特性が保持される限り、Ｄ−アミノ酸を含んでもよく、非天然アミノ酸を含んでもよい。また、本発明におけるタンパク質又はペプチドは、元のタンパク質又はペプチドの特性が保持される限り、タンパク質又はペプチドに他の物質を連結してもよい。タンパク質又はペプチドに連結可能な他の物質としては、例えば、他のタンパク質又はペプチド、脂質、糖又は糖鎖、アセチル基、天然又は合成のポリマー等が挙げられる。また、本発明におけるタンパク質又はペプチドは、元のタンパク質又はペプチドの特性が保持される限り、タンパク質又はペプチドに、糖鎖付加、側鎖酸化、リン酸化等の修飾を行ってもよい。
これらの技術は従来充分に確立されていて、本発明においてもそれらに従ってよい。また、本発明における保護基は保護される基の反応性を封止するものであればどのようなものであってもよく、本発明のタンパク質又はペプチドは保護基を有したまま生体に投与してもよい。

【0036】

本発明のタンパク質又はペプチドは塩を形成していてもよく、その塩としては、生理学的に許容される塩が好ましい。生理学的に許容される塩としては、例えば、塩酸、硫酸、燐酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、シュウ酸、リンゴ酸、クエン酸、オレイン酸、パルミチン酸などの酸との塩；ナトリウム、カリウム、カルシウムなどのアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の、又はアルミニウムの水酸化物又は炭酸塩との塩；トリエチルアミン、ベンジルアミン、ジエタノールアミン、ｔ−ブチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、アルギニンなどの有機塩基との塩などが挙げられる。

【0037】

本発明におけるタンパク質又はペプチドは、米糠タンパク質を加水分解することによって製造されるのみならず、公知の一般的なタンパク質又はペプチド合成のプロトコールに従って、固相合成法（Ｆｍｏｃ法、Ｂｏｃ法）又は液相合成法によっても製造され得る。また、本発明におけるタンパク質又はペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを導入した形質転換体を用いて製造することもできる。また、本発明のタンパク質又はペプチドを一部に含むタンパク質又はペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを導入した形質転換体を用いてタンパク質又はペプチドを取得し、これを適当なプロテアーゼやペプチダーゼ等のタンパク質加水分解酵素で切断することによって製造することもできる。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いる方法により製造することもできる。
すなわち、本発明は以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列を含み、アミノ酸残基数が６００以下であり、生体防御作用を有するタンパク質又はペプチドを含有する生体防御用組成物も包含する。
（Ａ）配列番号１〜２４のいずれかで示されるアミノ酸配列
（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列において１個〜数個のアミノ酸の保存的置換又は欠失を有するアミノ酸配列
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列において少なくとも４つの連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列
当該タンパク質又はペプチドについての説明としては、上記本発明の米糠タンパク質酵素加水分解物を含有する生体防御用組成物におけるタンパク質又はペプチドと同意義であってよい。

【0038】

〔生体防御作用〕
本発明において、生体防御とは特に限定されないが、例えば抗菌、抗炎症及び創傷治癒等が挙げられる。抗菌活性を有することは、例えばＰ． ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ＡＴＣＣ ３３２７７等のグラム陰性細菌、Ｓ． ｍｕｔａｎｓ ＪＣＭ ５７０５、Ｐ． ａｃｎｅｓ ＪＣＭ ６４７３等のグラム陽性細菌、Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓ ＮＢＲＣ １３８５等の真菌等の培養培地にサンプルを添加し、生菌に由来するアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を定量し、コントロール群のそれと比較することにより得られる菌増殖阻害率（％）を算出することにより確認することができる。本発明において、上記菌のいずれか１以上の菌の増殖阻害率が１０％以上であることが好ましく、２０％以上であることがより好ましく、３０％以上であることがより好ましく、４０％以上であることがより好ましく、５０％以上であることがより好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましい。

【0039】

抗炎症作用を有することは、例えば「エンドスペシーＥＳ−５０Ｍセット」（生化学工業株式会社製）及び「エンドトキシン標準品ＣＳＥ−Ｌセット」（生化学工業株式会社製）等を用いて、サンプルのエンドトキシン中和活性を評価し、コントロール群のそれと比較することにより得られるエンドトキシン中和活性（％）を算出することにより確認することができる。本発明において、エンドトキシン中和活性（％）が１％以上であることが好ましく、１０％以上であることが好ましく、２０％以上であることがより好ましく、３０％以上であることがより好ましく、４０％以上であることがより好ましく、５０％以上であることがより好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上であることが特に好ましい。

【0040】

創傷治癒作用を有することは、例えばＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈血管内皮細胞、倉敷紡績株式会社製、ＫＥ−４１０９）等の細胞に、サンプルを添加し、形成された管腔構造をした細胞の長さの合計値を測定し、コントロール群のそれと比較することにより得られる管腔形成促進活性（％）を算出することにより確認することができる。本発明において、管腔形成促進活性（％）が１０１％以上であることが好ましく、１０３％以上であることが好ましく、１１０％以上であることがより好ましく、１２０％以上であることがより好ましく、１２５％以上であることがより好ましく、１３０％以上であることがより好ましく、１３５％以上であることがさらに好ましく、１４０％以上であることが特に好ましい。

【0041】

本発明の組成物は、溶血活性を有しないため、安全に使用することができる。溶血活性を有しないことは、例えば赤血球に、サンプルを添加し、４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、下記式より溶血活性（％）を算出することにより確認することができる。本発明において、溶血活性（％）が１０％以下であることが好ましく、８％以下であることが好ましく、７％以下であることがより好ましく、６％以下であることがより好ましく、５％以下であることがより好ましく、４％以下であることがさらに好ましく、３％以下であることが特に好ましい。
溶血活性（％）＝（Ａ_Ｓ−Ａ_０）×１００／（Ａ_Ｔ−Ａ_０）
（Ａ_０は無添加のときの吸光度、Ａ_sは各サンプルを添加したときの吸光度、及びＡ_Ｔは０．１質量％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加したときの吸光度をそれぞれ示す。）

【0042】

〔飲食品、飲食品添加物、医薬品、医薬部外品、化粧品又は飼料〕
本発明の飲食品、飲食品添加物、医薬品、医薬部外品、化粧品又は飼料は、前記生体防御用組成物を含有する。

【0043】

前記飲食品としては、特に制限はなく、例えば、各種の清涼飲料水、果汁飲料、和洋菓子、乳製品その他の畜産加工品、果実加工品、野菜加工品、穀物の加工品、水産加工品、調味料、ビタミンなどを主成分としたいわゆる各種の健康食品など数多くの飲食品が挙げられる。本発明の飲食品は、生体防御用飲食品として好適である。
飲食品には、健康食品、機能性食品、虫歯予防等を目的とする特定保健用食品、病者用食品、サプリメントが含まれる。飲食品の形態は特に限定されない。例えば茶飲料、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料、そば、うどん、中華麺、即席麺等の麺類、飴、のど保護、口臭除去、清涼感付与等の機能性を有するキャンディー、虫歯予防、口臭除去、清涼感、眠気防止等の機能性を有するガム、チョコレート、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子、パン等の菓子およびパン類、かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品、加工乳、発酵乳等の乳製品、サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂および油脂加工食品、ソース、たれ等の調味料、カレー、シチュー、丼、お粥、雑炊等のレトルトパウチ食品、アイスクリーム、シャーベット、かき氷等の冷菓などを挙げることができる。サプリメントは、例えば錠剤、顆粒剤、散剤、ドリンク剤等の形態で提供することができる。飲食品添加物の形態は特に限定されないが、例えば、液状、ペースト状、粉末状、フレーク状、顆粒状等が挙げられる。本発明の飲食品添加物は、一般的な飲食品添加物の製造方法に従って製造することができる。
一般的に例えば、体重約６０ｋｇのヒトにおいては、本発明におけるタンパク質又はペプチドを１日当たり約０.０１〜１０００ｍｇ、好ましくは約０．１〜１００ｍｇ、より好ましくは約０．５〜５０ｍｇ摂取してもよい。

【0044】

前記医薬品又は医薬部外品としては、特に制限はないが、歯周病治療剤、殺菌塗布剤、薬用のどスプレー、トローチ、薬用のど飴、口内炎治療剤、薬用トローチ、洗口液、歯磨き粉（歯周病予防用歯磨き粉、口臭予防用歯磨き粉等）、洗口液（マウスウォッシュ、デンタルリンス等）、義歯洗浄剤、絆創膏、ニキビの治療及び／又は予防剤、日和見感染症の予防及び／又は治療剤等が好適に挙げられる。

【0045】

本発明の医薬又は医薬部外品は、本発明におけるタンパク質又はペプチドを含有成分とし、医薬製剤の製造法として公知の方法（例えば、日本薬局方に記載の方法等）に従って、薬学的に許容される担体または添加剤を適宜配合して製剤化することができる。製剤としては、例えば錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠、舌下錠、口腔内崩壊錠、バッカル錠等を含む）、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤、マイクロカプセル剤を含む）、トローチ剤、シロップ剤、液剤、乳剤、懸濁剤、放出制御製剤（例、速放性製剤、徐放性製剤、徐放性マイクロカプセル剤）、エアゾール剤、フィルム剤（例、口腔内崩壊フィルム、口腔粘膜貼付フィルム）、注射剤（例、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤）、点滴剤、経皮吸収型製剤、軟膏剤、ローション剤、貼付剤、坐剤（例、肛門坐剤、膣坐剤）、ペレット、経鼻剤、経肺剤（吸入剤）、点眼剤等の経口剤または非経口剤が挙げられる。担体または添加剤の配合割合については、医薬又は医薬部外品の分野において通常採用されている範囲に基づいて適宜設定すればよい。配合できる担体または添加剤は特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、その他の水性溶媒、水性または油性基剤等の各種担体、賦形剤、結合剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、吸収促進剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、香料等の各種添加剤が挙げられる。

【0046】

錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は通常の製剤業務（例えば有効成分を注射用水、天然植物油等の溶媒に溶解または懸濁させる等）に従って調製することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０^ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。

【0047】

このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
本発明の医薬は、剤型、投与方法、担体等により異なるが、本発明におけるタンパク質又はペプチドを製剤全量に対して通常０．０１〜１００％（ｗ／ｗ）、好ましくは０．１〜９５％（ｗ／ｗ）の割合で添加することにより、常法に従って製造することができる。
投与量は、投与対象、症状、投与ルートなどにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、体重約６０ｋｇのヒトにおいては、１日当たり約０.０１〜１０００ｍｇ、好ましくは約０．１〜１００ｍｇ、より好ましくは約０．５〜５０ｍｇである。１日当たりの総投与量は、単一投与量であっても分割投与量であってもよい。本発明の医薬又は医薬部外品は、他の有効成分（例えば、オリザスタチン等の生体防御剤として公知の有効成分等）を含有していてもよい。

【0048】

前記化粧品としては、例えば、洗顔料、クレンジング、化粧水、乳液、美容液、スポットケア、モイスチャー、マッサージパック、メイクアップベース、ファンデーション、フェイスパウダー、ボディクリーム、ボディローション、ボディマッサージケアクリーム、サンタン、サンスクリーン、バスプロダクツ、ボディシャンプー、リップクリーム、散布−、リンス、コンディショナー、リンスインシャンプー、インバストリートメント、アウトバストリートメント、エアゾール製品、消臭剤、芳香剤、脱臭剤、入浴剤、アンチエイジング剤、アクネ対応製品、ホワイトニング剤などを挙げることができる。本発明の化粧品は、本発明におけるタンパク質又はペプチド以外に化粧品として一般に使用されている成分、例えば、界面活性剤、保湿剤、動植物由来油脂、シリコーン類、高級アルコール、低級アルコール、動植物由来抽出エキス、紫外線吸収剤、消炎剤、金属封鎖剤、ビタミン類、酸化防止剤、増粘剤、防腐剤、殺菌剤、ｐＨ調整剤、着色剤、各種香料などを目的に応じて適宜配合することができる。

【実施例】

【0049】

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【0050】

〔実施例１：米糠タンパク質酵素加水分解物の調製と精製およびペプチドの同定〕
１．米糠タンパク質由来ペプチドの調製
ビーカーに3.00 gの米糠タンパク質（Tsuno-RBP^TM 55、築野食品工業株式会社）を秤量し、60 mLの超純水を加え、ホモジナイザーPOLYTRON（KINEMATICA）を用いて懸濁液を均質化した。次に、Spectra/Por（登録商標） Dialysis Membrane, MWCO: 6,000-8,000 Da (132655: Spectrum Laboratories, Inc.) を用いて均質化した懸濁液を一晩の間透析を行うことによって、低分子成分を除去した。その後、透析した懸濁液を三角フラスコに取り出し、トリプシン（T0303-1G：Sigma-Aldlich）とキモトリプシン（C4129-1G：Sigma-Aldrich）の等質量混合物，ペプシン（P7012-1G：Sigma-Aldlich），又はパパイン（164-00172：和光純薬工業）を米糠タンパク質との重量比が2%(w/w)となるように加えた。得られた懸濁液の温度を、トリプシンとキモトリプシンの等質量混合物は37℃，ペプシンは37℃，又はパパインは50℃になるように恒温槽を用いて調節し、3〜6時間加水分解反応を行った。反応終了後、反応を停止させるため、90 ℃にて10分間の熱処理を行い、プロテアーゼを失活させた。ただし、ペプシンを用いた場合には加熱による失活操作を行わずに、5M NaOHを添加しpHを上昇させることによって失活させた。プロテアーゼを失活させた後、懸濁液を遠心分離用チューブに分注し、10,000 ×g、4 ℃の条件にて30分間遠心分離を行った。遠心分離によって得られた上澄液は、Spectra/Por（登録商標） Dialysis Membrane, MWCO: 500〜1,000 (131096, Spectrum Laboratories, Inc.) を用いて、再度透析を行うことによって、遊離アミノ酸などの低分子成分を除去した。この透析液をアシストチューブに回収し、−80℃で凍結した後、凍結乾燥機（FDU-2100 、EYELA) を用いて凍結乾燥を行った。

【0051】

２．等電点電気泳動による米糠タンパク質由来ペプチドの分画
前記のようにして調製した200 mgの米糠タンパク質の酵素加水分解物を、分取用等電点電気泳動装置（Rotofor（登録商標） 170-2950、Bio-Rad)を用いて20のフラクションに分画した。すなわち、200 mgの加水分解物を50 mLの超純水に溶解して、サンプル溶液とした。分離は12Wにて150分間行った。電気泳動泳動が終了した後、各フラクションを回収し、pHを測定した後、−80 ℃において凍結し、凍結乾燥機を用いて凍結乾燥し、回収された重量を測定した。

【0052】

３．逆相クロマトグラフィーによる米糠タンパク質由来ペプチドの精製
逆相クロマトグラフィーは、ポンプ(LC-10ATvp：島津製作所)、オンラインデガッサー(DGU-12A：島津製作所)、カラムオーブン(CTO-10Avp：島津製作所)、検出器(SPD- 10AVvp：島津製作所)、フラクションコレクター(FRC-10A：島津製作所)、システムコントローラー(SCL-10Avp：島津製作所)を連結した高速液体クロマトグラフィー装置を使用した。クロマトグラフィー操作とデータ解析にはソフトウェア（LabSolutions、島津製作所)を用いた。分離カラムはCAPCELL PAK C-18（カラム：直径10mm×長さ150 mm、粒子径 5 μm, SHISEIDO: 90603）およびInertsil WP300 C8（カラム：直径10×長さ150 mm, 粒子径5 μm, GL Science Inc.: 5020-85735）を用いた。溶出液はアセトニトリル（カタログ番号：1.00030.4000、メルク株式会社）、トリフルオロ酢酸（34833-92: ナカライテスク）および超純水を使用し、調製した。溶出液Aとして0.1 %(v/v) トリフルオロ酢酸、及び溶出液Bとして0.1 %(v/v) トリフルオロ酢酸を含む 80 % (v/v)アセトニトリルを用いた。
溶出液Bの濃度を、初期濃度0 %(v/v)から毎分1 %(v/v)の速度で直線的に高めて、70分後に70 %(v/v)となるように、さらに70〜90分の間は100 %(v/v)となるようにタイムプログラムを設定し、溶出した。流速は2.0 mL/minとして、溶出開始7分後から30秒ごとに溶出液を分取し、波長210 nmにおける吸光度を測定し、ピークを検出した。各ピーク画分は、−80 ℃において凍結し、凍結乾燥機（FDU-2100 、EYELA) を用いて凍結乾燥した。
各ピークのフラクションを再度、同じ分離カラムを用いて、精製し、単一ピークを得た。

【0053】

４．マトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析計（MALDI-TOF/MS）を用いた米糠タンパク質酵素加水分解物（ペプチド）の同定
ペプチドの質量（MS）解析を行うために、マトリックスとしてα-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid [HCCA]（#201344: Bruker Daltonics社）、キャリブレーション試薬としてPeptide calibration standard II（#222570: Bruker Daltonics社）を使用した。500 μLの TA溶液（100 %(v/v)アセトニトリル：0.1 % (v/v)トリフルオロ酢酸 = 1：2 [v/v]の割合で混合した緩衝液）にHCCAを耳かき１杯程度混ぜた後、10分間の超音波処理によって溶解させ、HCCA飽和溶液（マトリックス溶液）を調製した。調製したマトリックス溶液を9,000 ×gにて10分間遠心分離し、MS用サンプルチューブ(Eppendorf)内において、2 mL の80 % (v/v)アセトニトリルで溶解した1 μLのサンプル溶液と4 μLのマトリックス溶液の上澄液を混合した。調製した5 μLのマトリックス混合サンプルのうち1 μLを質量分析専用プレート（MTP 384 target plate ground steel T F; Bruker Daltonics社）にスポットし、乾燥するまで静置した。また、分子量のキャリブレーションのため、キャリブレーション試薬をサンプルと同様に調製して、スポットした。
スポットしたサンプルおよびキャリブレーション試薬が乾燥した後、Auto Flex-III（登録商標）(Bruker Daltonics社) を用いてMALDI-TOF/MSおよびMS/MS解析を行った。MS- Rangeはm/z 800〜43,000の範囲で調節し、検出器の電位は1300〜1800 Vとして走査した。得られたMS又はMS/MSのスペクトルは、処理ソフトflexAnalysis（登録商標）(Bruker Daltonics社)およびbiotools（登録商標）(Bruker Daltonics社)を用いてデータを処理した後、解析ソフトMascot search（登録商標）(Matrix Science Ltd.)を用いて、NCBIのデータベース (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/fasta.shtml，2015年1月27日付) と照合し、候補ペプチドの検索を行った。このとき、サンプルの消化酵素として特定の酵素を選択しない“none”を選択して検索した。表２は、酵素としてペプシンを用いた場合の米糠タンパク質加水分解物（ペプチド）を示す。表３は、酵素として、トリプシンとキモトリプシンの等質量混合物を用いた場合の米糠タンパク質加水分解物（ペプチド）を示す。

【0054】

【表2】

上記表においてSequence欄の右端のアルファベットは、そのペプチドが同じタンパク質から得られたことを示す（Protein sourceの欄を参照）。

【0055】

【表3】

上記表においてSequence欄の右端のアルファベットは、そのペプチドが同じタンパク質から得られたことを示す（Protein sourceの欄を参照）。

【0056】

〔実施例２：抗菌活性〕
１．抗菌試験
等電点電気泳動によって分画した各フラクション又は表２と表３に示すフラクションに含まれる同定したペプチドを培地に添加し、表４に示す被験菌を培養した。

【0057】

【表4】

【0058】

Ｐ． ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ＡＴＣＣ ３３２７７は、変法ＧＡＭ培地（１Ｌ中、ペプトン５．０ｇ、ダイズペプトン３．０ｇ、プロテオーゼペプトン５．０ｇ、消化血清末１０．０ｇ、酵母エキス末２．５ｇ、肉エキス末２．２ｇ、肝臓エキス末１．２ｇ、ブドウ糖０．５ｇ、溶性デンプン５．０ｇ、Ｌ−トリプトファン０．２ｇ、Ｌ−システイン塩酸塩０．３ｇ、チオグリコール酸ナトリウム０．３ｇ、Ｌ−アルギニン１．０ｇ、ビタミンＫ１０．００５ｇ、ヘミン０．０１ｇ、リン酸二水素カリウム２．５ｇ、塩化ナトリウム３．０ｇ、ｐＨ７．３）を用いて絶対嫌気条件下、３７℃で４８時間静置培養した。
Ｓ． ｍｕｔａｎｓ ＪＣＭ ５７０５は、ＢＨＩ培地（１Ｌ中、豚脳エキス末４．０ｇ、豚ハートエキス末４．０ｇ、ペプトン１７．５ｇ、ブドウ糖２．０ｇ、塩化ナトリウム５．０ｇ、リン酸水素二ナトリウム２．５ｇ、ｐＨ７．２）を用いて、通性嫌気条件下、３７℃で６時間静置培養した。
Ｐ． ａｃｎｅｓ ＪＣＭ ６４７３は、ＧＡＭ培地（１Ｌ中、ペプトン１０．０ｇ、ダイズペプトン３．０ｇ、プロテオーゼペプトン１０．０ｇ、消化血清末１３．５ｇ、酵母エキス５．０ｇ、肉エキス２．２ｇ、肝臓エキス１．２ｇ、ブドウ糖３．０ｇ、リン酸二水素カリウム２．５ｇ、塩化ナトリウム３．０ｇ、溶性デンプン５．０ｇ、Ｌ−システイン塩酸塩０．３ｇ、チオグリコール酸ナトリウム０．３ｇ、ｐＨ７．１）を用いて、通性嫌気条件下、３７℃で２４時間静置培養した。
Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓ ＮＢＲＣ １３８５の培地は、ＹＭ培地（１Ｌ中、グルコース１０．０ｇ、ペプトン５．０ｇ、酵母エキス３．０ｇ、麦芽エキス１．０ｇ、ｐＨ６．２）を用いて、通性嫌気条件下、２５℃で２４時間静置培養した。
被験菌に対する抗菌活性試験は、以下の手順で行った。被験菌の培養に用いたものと同じ培地に、８０μＬの各被験菌の培養液を播種した後、所定の温度に設定したインキュベーターに入れて所定の時間培養した。その後、新たな培地に植え継いで、さらに所定の時間培養した。得られた前培養液を段階希釈することでＯＤ_６５０＝５．０×１０^−５の菌液を調製した。
次に、リザーバーを用意して、各レーンに３００μＬの１．３３倍濃度の培地、１００μＬの各ペプチド溶液（等電点電気泳動によって分画した各フラクションの濃度は3ｍｇ／ｍＬに調節した。また化学合成したペプチドの濃度は、300μＭ又は500μＭに調節した。）、１００μＬの前記菌液を添加してよく混合した。
コントロールとブランクには、ペプチド溶液の代わりに同量の滅菌水を添加し、更にブランクには菌液の代わりに１倍濃度の各培地を同量添加した。ペプチド溶液を添加したもの、コントロール及びブランクのそれぞれを９６ウェル培養プレート（＃３５９５、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）のウェルに１００μＬずつ分注し、前記各被験菌の培養条件と同じ条件で培養を行った。

【0059】

２．抗菌活性の評価方法
各ペプチドの抗菌活性は、生菌に由来するＡＴＰを定量することによって評価した。
生菌に由来するＡＴＰの定量は、ＢａｃＴｉｔｅｒ・Ｇｌｏ（登録商標）Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いたルシフェリン−ルシフェラーゼ発光法により行った。以下のように微生物からＡＴＰを抽出し、ＡＴＰ量に応じた発光強度から微生物量を測定した。
具体的には、まず、培養プレートの各ウェルに分注した１００μＬ被験菌培養液に対して１０μＬのルシフェールＡＴＰ消去試薬（キッコーマン株式会社製）を添加し、１０分間撹拌することによって生菌体外に存在するＡＴＰを分解消去させてサンプルとした。
次に、あらかじめ９６穴プレート（ＯｐｔｉＰｌａｔｅ−９６、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）の各ウェルに分注した５０μＬのＡＴＰ発光試薬に対して、前記サンプルを５０μＬ添加した。各ウェルの生菌に由来するＡＴＰ発光強度（発光波長５６０ｎｍ）を、マイクロプレートリーダー１４２０（Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ａｒｖｏ（登録商標）ＭＸ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用い、Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ Ｕｎｉｔ （ＲＬＵ）として測定した。１サンプルについて３回測定を行い、測定は、各菌の対数増殖初期において行った。抗菌活性は、抗菌成分を含まないコントロールのＲＬＵを１００％とし、それぞれの濃度のおけるＲＬＵを求め、増殖阻害率を算出した。

【0060】

３．同定したペプチドの化学合成とその抗菌活性の測定
各フラクションに含まれる同定したペプチドのうち、１２種類のペプチド（配列番号１３〜２４）を化学合成した。各ペプチドは、ペプチド合成装置（ＰＳＳＭ−８、株式会社島津製作所製）を用いて合成し、カラム（Ｃａｄｅｎｚａ ＣＤ−Ｃ１８、インタクト株式会社製）を装着したＨＰＬＣ（１０Ａ ｓｙｓｔｅｍ、株式会社島津製作所製）にて以下の精製条件で精製した。これらのペプチドの抗菌活性を上記と同じ方法で測定した。
＜精製条件＞
・溶媒Ａ：０．１％(w/v)トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル
・溶媒Ｂ：０．１％(w/v)トリフルオロ酢酸を含む水
・流速：１．０ ｍＬ／分間
・波長：２２０ ｎｍ
・インジェクション容量：２０μＬ
・グラジエント条件：０．０１分間（溶媒Ａ １０体積％、溶媒Ｂ ９０体積％）→２５．０分間（溶媒Ａ ３５体積％、溶媒Ｂ ６５体積％）→２５．１分間（溶媒Ａ １００体積％、溶媒Ｂ ０体積％）→３０分間（停止）

【0061】

〔実施例３：合成ペプチドのエンドトキシン中和活性の測定〕
「エンドスペシーＥＳ−５０Ｍセット」（生化学工業株式会社製）及び「エンドトキシン標準品ＣＳＥ−Ｌセット」（生化学工業株式会社製）を用いてエンドトキシン中和活性を評価した。
１２種類の合成ペプチド（配列番号１３〜２４）を用いた。９６ウェルプレート（＃３５９５ マルチプルウェルプレート（平底）、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）の各ウェルにエンドトキシン標準品（０．１０ＥＵ／ｍＬ）２５μＬ及びペプチド溶液（最終濃度１μＭ及び１０μＭ）を加えて、３７℃にて３０分間又は３５分間振盪しながらインキュベーションした。次に、５０μＬの前記セットに含まれていたＬＡＬ試薬を各ウェルに添加し、３７℃で１０分間振盪しながらインキュベーションした。その後、マイクロプレートリーダー（２０３０ Ａｒｖｏ Ｘ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いて、波長４０５ｎｍの吸光度を測定した。ペプチド溶液の代わりに蒸留水（エンドトキシンフリー）を添加したものをコントロールとし、コントロール（０μＭ）の吸光度を１００％とした時の相対値をエンドトキシン中和活性とした。

【0062】

〔実施例４：合成ペプチドの創傷治癒活性の測定〕
合成ペプチドの創傷治癒作用を、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈血管内皮細胞、倉敷紡績株式会社製、ＫＥ−４１０９）の管腔形成促進作用に基づいて評価した。
９６穴プレート（＃３５９５， Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を用いて、ＨＵＶＥＣを３〜４日間コンフルエントになるまで培養した後、ＨＥＰＥＳ緩衝液（倉敷紡績株式会社製、ＨＫ−３３２０）を用いて洗浄し、不純物を取り除いた。次に、トリプシン／ＥＤＴＡ（倉敷紡績株式会社製、ＨＫ−３１２０）で３分間処理し、剥がれてきたＨＵＶＥＣを回収し、トリプシン中和液（倉敷紡績株式会社製、ＨＫ−３２２０）に添加した。この細胞懸濁液を８００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上澄み液を除去し、ＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２（倉敷紡績株式会社製、ＫＥ−２１５０Ｓ）を加えて細胞濃度を２．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した。得られた細胞懸濁液と各ペプチドとを１：１(v/v)の割合で混合した。
本実験では、ヒト由来の創傷治癒作用を有する生体防御ペプチドとして知られているＬＬ−３７（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ：ペプチド配列番号２５／株式会社ペプチド研究所製、４４４５−ｓ）をポジティブコントロールとして用いて、合成ペプチドの管腔形成促進作用を評価した。なお、ＬＬ−３７がヒト由来の創傷治癒作用を有する生体防御ペプチドであることは、例えば、１） Ｍ． Ｃａｒｒｅｔｅｒｏ， Ｍ． Ｊ． Ｅｓｃａｍｅｚ， Ｍ． Ｇａｒｃiａ， Ｂ． Ｄｕａｒｔｅ， Ａ． Ｈｏｌｇｕｉｎ， Ｌ． Ｒｅｔａｍｏｓａ， Ｊ． Ｌ． Ｊｏｒｃａｎｏ， Ｍ． ｄｅｌ Ｒｉｏ， ａｎｄ Ｆ． Ｌａｒｃｈｅｒ： Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ ＬＬ−３７． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ， （２００８） Ｖｏｌ．１２８， ｐｐ．２３３−２３６．、２） Ｒ． Ｒａｍｏｓ， Ｊ． Ｐ． Ｓｉｌｖａ， Ａ． Ｃ． Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ， Ｒ Ｃｏｓｔａ， Ｌ． Ｇｕａｒｄａｏ， Ｆ． Ｓｃｈｍｉｔｔ， Ｒ． Ｓｏａｒｅｓ， Ｍ． Ｖｉｌａｎｏｖａ， Ｌ． Ｄｏｍｉｎｇｕｅｓ， ａｎｄ Ｍ． Ｇａｍａ： Ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ＬＬ３７． Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， （２０１１） Ｖｏｌ．３２， ｐｐ．１４６９−１４７６．などに記載されている。

【0063】

マトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｅｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、３５４２３４）は常温では固まり、４℃で液体状態になるため、はじめに４０μＬのマトリゲルを氷上で９６穴プレート（＃３５９５， Ｃｏｒｉｎｉｇ社製）に添加した。添加したマトリゲルを３７℃で３０分間インキュベートした後、予め準備しておいた細胞懸濁液と各ペプチド、又はＬＬ−３７との混合液（１００μＬ）を添加し、１５時間培養した。
マトリゲル内でＨＵＶＥＣが形成した管腔構造を、顕微鏡を用いて４０倍の倍率で観察し、写真撮影を行った。また、得られた画像から３００×４００ｐｉｘｅｌの範囲を抽出し、形成された管腔構造をした細胞の長さの合計値を測定し、各ペプチドの創傷治癒作用を評価した。

【0064】

〔実施例５：合成ペプチドの溶血活性の測定〕
緬羊脱繊維無菌血液（０１０２−１、株式会社日本バイオテスト研究所製、以下「赤血球」とも称する）を用いて、前記ペプチドの溶血活性を試験した。
マイクロチューブ中にて、４０μｌの赤血球を９６０μｌの生理的食塩を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ： ｐＨ ７．２）に４体積％になるように懸濁して懸濁液とした。前記懸濁液を５，０００ｒｐｍにて、５分間遠心分離した後、上清液を除き、新たに９６０μＬのＰＢＳを加えて赤血球を再懸濁した。この操作を３回繰り返した後、得られた赤血球をサンプルとして用いた。任意の濃度に希釈された１２種類のペプチド（配列番号１３〜２４）溶液、又は０．１質量％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（５９５−１３１３５、和光純薬工業株式会社製）を９６穴プレート（＃３５９５、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）の各ウェルに５０μｌずつ分注した。次に、４体積％の赤血球懸濁液を各ウェルに５０μＬずつ分注した後、３７℃にて１時間インキュベーションした。その後、４，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行った。遠心分離によって得られた５０μＬの上清液を、あらかじめ５０μＬのＰＢＳ又は水を分注しておいたウェルに添加した。マイクロプレートリーダー（２０３０ ＡｒｖｏＴＭ Ｘ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いて、各ウェルの４０５ｎｍにおける吸光を測定した。前記ペプチドを添加しないときの吸光度を０％、及び前記ペプチドの代わりに０．１質量％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加したときの吸光度を１００％として、次の式を用いて溶血活性を評価した。
溶血活性（％）＝（Ａ_{ｐｅｐｔｉｄｅ}−Ａ_０）×１００／（Ａ_{ＴｒｉｔｏｎＸ−１００}−Ａ_０）
ここで、Ａ_０は無添加のときの吸光度、Ａ_{ｐｅｐｔｉｄｅ}は各ペプチドを添加したときの吸光度、及びＡ_{ＴｒｉｔｏｎＸ−１００}は０．１質量％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加したときの吸光度をそれぞれ示す。

【0065】

結果を図３〜１２及び表５に示した。なお、表５中、「Ｎ．Ｄ．」は、「検出されなかった」ことを示し、「−」は、「測定していない」または「測定しなかった」ことを示す。
＜抗菌活性＞

【0066】

フラクション（図３〜１０）
図３〜６から明らかなように、ペプシンを用いた米糠タンパク質加水分解物（フラクション）は、等電点が高いフラクションに抗菌活性を検出した。すなわち、Ｎｏ．１８〜２０のフラクションはＰ． ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ＡＴＣＣ ３３２７７とＰ． ａｃｎｅｓ ＪＣＭ ６４７３に対して強い抗菌活性を示した。また、Ｎｏ．２０のフラクションは、グラム陽性菌のＳ． ｍｕｔａｎｓ ＪＣＭ ５７０５、及び日和見感染真菌のＣ． ａｌｂｉｃａｎｓ ＮＢＲＣ １３８５に対しても、強い抗菌活性を示した。
一方、図７〜１０から明らかなように、トリプシンとキモトリプシンの等質量混合物を用いた米糠タンパク質加水分解物（フラクション）は、等電点が高いＮｏ．２０のフラクションはＰ． ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ＡＴＣＣ ３３２７７とＰ． ａｃｎｅｓ ＪＣＭ ６４７３に対して強い抗菌活性を示した。
合成ペプチド（表５）
表５から明らかなように、いずれのペプチドもＰ． ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ＡＴＣＣ ３３２７７に対して抗菌活性を示した。また、配列番号１６のペプチドは、グラム陽性菌のＳ． ｍｕｔａｎｓ ＪＣＭ ５７０５、及びＰ． ａｃｎｅｓ ＪＣＭ ６４７３、並びに真菌のＣ． ａｌｂｉｃａｎｓ ＮＢＲＣ １３８５に対して、すべて抗菌活性を示した。
前記配列番号２０のペプチドは、特に代表的な歯周病であるＰ． ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ＡＴＣＣ ３３２７７、ニキビ原因菌であるＰ． ａｃｎｅｓ ＪＣＭ ６４７３、及び日和見感染真菌のＣ． ａｌｂｉｃａｎｓ ＮＢＲＣ １３８５に対して抗菌活性を示した。

【0067】

＜抗炎症作用＞
表５から明らかなように、配列番号１３,１４,１５,１６,１７,１８,１９,２０,２１,２４の１０種類のペプチドは濃度依存的にエンドトキシンを中和することが示された。特に、配列番号１５、１６、２０の中和活性は、ポリミキシンＢ（Ｐ１００４−１、Ｓｉｇｍａ社製；医療用の抗菌薬であり、0.1μＭにおいて約50％の中和活性を示す。）と同等であった。

【0068】

＜損傷治癒作用＞
各ペプチド及びＬＬ−３７のＨＵＶＥＣに対する管腔形成促進作用を図１１及び１２に示した。また、ペプチドを添加したときの細胞の長さのペプチドを添加していないコントロ-ルの細胞長さに対する割合を表５にまとめた。図１１及び１２並びに表５から明らかなように、１２種類のうち８種類のペプチド（配列番号１３、１４、１６、１７、１８、１９、２２及び２４）は、ＬＬ−３７と同じ濃度範囲において管腔形成促進作用を示し、その作用は濃度に依存していた。また、顕微鏡観察した結果から、１0 μＭのペプチドを添加したときに、１0 μＭのＬＬ−３７を添加したときと同じように、無添加の場合に比べて細胞の増殖が促進され、管腔構造をした細胞の長さが増加していることがわかった。したがって、８種類のペプチド（配列番号１３、１４、１６、１７、１８、１９、２２及び２４）は、ＬＬ−３７と同じようにＨＵＶＥＣの管腔形成促進作用を有することから、創傷治癒作用があることがわかった。

【0069】

＜溶血活性＞
強い抗菌活性を有するが、同時に強い溶血活性を持つハチ毒中の抗菌ペプチドであるＭｅｌｉｔｔｉｎ（５１１−９７５３１、Ｓｅｒｖａ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ社製）は、１０μＭにおいても９４％の溶血活性を示した。一方、前記ペプチドは、表５から明らかなように、５００μＭの濃度においてほとんど溶血活性を示さなかった。したがって、前記ペプチドは、抗菌活性、抗炎症活性、及び創傷治癒作用を示す濃度範囲において、溶血活性を示さないことが確認された。

【0070】

【表5】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]