特許 6695360 （Ｒ）−および（Ｓ）−１−（３−（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニル）フェノキシル−４−ニトロフェニル）−１−エチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（エチレン）ホスホルアミデート、組成物ならびにその使用方法および製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6695360

(24)【登録日】2020年4月23日

(45)【発行日】2020年5月20日

(54)【発明の名称】（Ｒ）−および（Ｓ）−１−（３−（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニル）フェノキシル−４−ニトロフェニル）−１−エチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（エチレン）ホスホルアミデート、組成物ならびにその使用方法および製造方法

(51)【国際特許分類】

   C07F 9/24 20060101AFI20200511BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20200511BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20200511BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20200511BHJP

   A61K 31/675 20060101ALI20200511BHJP

【ＦＩ】

   C07F9/24 FCSP

   A61P43/00 105

   A61P35/00

   A61P35/02

   A61K31/675

【請求項の数】16

【全頁数】46

(21)【出願番号】特願2017-563179(P2017-563179)

(86)(22)【出願日】2016年11月15日

(65)【公表番号】特表2018-517710(P2018-517710A)

(43)【公表日】2018年7月5日

(86)【国際出願番号】US2016062114

(87)【国際公開番号】WO2017087428

(87)【国際公開日】20170526

【審査請求日】2017年12月5日

(31)【優先権主張番号】62/255,905

(32)【優先日】2015年11月16日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/324,259

(32)【優先日】2016年4月18日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】517319271

【氏名又は名称】アセンタウィッツ ファーマシューティカルズ リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100088694

【弁理士】

【氏名又は名称】弟子丸 健

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100084663

【弁理士】

【氏名又は名称】箱田 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100093300

【弁理士】

【氏名又は名称】浅井 賢治

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(72)【発明者】

【氏名】デュアン ジャン−シン

(72)【発明者】

【氏名】ツァオ イェユ

(72)【発明者】

【氏名】ツァイ シャオホン

(72)【発明者】

【氏名】ジャオ ハイロン

(72)【発明者】

【氏名】マ ジン ユアン

(72)【発明者】

【氏名】マテウッチ マーク

【審査官】 伊藤 佑一

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５０２７４３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００４／０２１４７９８（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｆ

Ａ６１Ｐ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

化合物（Ｒ）−１−（３−（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニル）フェノキシル−４−ニトロフェニル）−１−エチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（エチレン）ホスホルアミデート：

【化1】

I
またはその同位体変種、溶媒和物もしくは水和物。

【請求項2】

化合物（Ｓ）−１−（３−（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニル）フェノキシル−４−ニトロフェニル）−１−エチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（エチレン）ホスホルアミデート：

【化2】

II
またはその同位体変種、またはその薬学的に許容される溶媒和物もしくは水和物。

【請求項3】

８０％以上の鏡像体過剰率を有する、請求項１または２に記載の化合物。

【請求項4】

９０％以上の鏡像体過剰率を有する、請求項３に記載の化合物。

【請求項5】

９５％以上の鏡像体過剰率を有する、請求項４に記載の化合物。

【請求項6】

実質的に純粋である請求項１または２に記載の化合物を含む混合物。

【請求項7】

請求項１または２に記載の化合物を含む混合物であって、前記化合物の純度が少なくとも５０％である、混合物。

【請求項8】

前記化合物の純度が少なくとも９０％である、請求項７に記載の混合物。

【請求項9】

請求項１または２に記載の化合物を含む、医薬組成物。

【請求項10】

請求項１または２に記載の化合物を含む、対象において増殖性疾患の１つまたは複数の症状を処置する、または改善するための医薬組成物であって、
前記疾患が、肝臓がん、肝細胞癌（ＨＣＣ）、非小細胞肺がん、黒色腫、前立腺がん、乳がん、白血病、食道がん、腎臓がん、胃がん、結腸がん、脳腫瘍、膀胱がん、子宮頸がん、卵巣がん、頭頸部がん、子宮内膜がん、すい臓がん、肉腫がん、および直腸がんを含むがんである、医薬組成物。

【請求項11】

請求項１または２に記載の化合物を含む、細胞の増殖を阻害するための医薬組成物。

【請求項12】

細胞ががん細胞である、請求項１１に記載の医薬組成物。

【請求項13】

式Ｉ

【化3】

I
の化合物を製造する方法であって：
式ＩＩ

【化4】

II
の化合物をＰＯＣｌ₃およびＨ₂ＮＣＨ₂ＣＨ₂Ｌ²またはその塩と接触させて式ＩＩＩ

【化5】

III
（式中、Ｌ¹およびＬ²は独立して脱離基である）
の化合物を用意するステップと、
式ＩＩＩの化合物を式Ｉの化合物に変換させるステップとを含む、
方法。

【請求項14】

請求項１の化合物のラセミ体または請求項１の前記化合物の任意の鏡像体過剰率を有する混合物の鏡像異性体のうちの１つに分割する方法であって、以下のステップを含む方法：
ａ）請求項１の化合物を光学的分割プロセスに供するステップであって、
１−（３−（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニル）フェノキシル−４−ニトロフェニル）−１−エチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（エチレン）ホスホルアミデートのラセミ体または鏡像異性的に濃縮されている混合物が、その２つの鏡像異性体である（Ｓ）−１−（３−（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニル）フェノキシル−４−ニトロフェニル）−１−エチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（エチレン）ホスホルアミデートと（Ｒ）−１−（３−（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニル）フェノキシル−４−ニトロフェニル）−１−エチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（エチレン）ホスホルアミデートとに、固定相および移動相を備えるキラルクロマトグラフィーによって分離され、前記固定相が、官能化多糖が共有結合されたシリカゲルを備え、かつ前記移動相がアルコールおよび別の溶媒を含んでいる、
ステップ。

【請求項15】

前記アルコールがメタノールである、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記別の溶媒がＣＯ₂である、請求項１４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、治療剤として適切な、化合物１−（３−（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニル）フェノキシル−４−ニトロフェニル）−１−エチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（エチレン）ホスホルアミデートの光学活性体、そのような化合物の医薬組成物、およびがんを処置する方法、ならびに、化合物（Ｒ，Ｓ）−１−（３−（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニル）フェノキシル−４−ニトロフェニル）−１−エチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（エチレン）ホスホルアミデートのラセミ混合物の、鏡像異性体の１つからそれらを分割する方法、もしくは鏡像異性体の１つに濃縮する方法、または光学的に純粋な（Ｒ）および（Ｓ）−１−（３−（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニル）フェノキシル−４−ニトロフェニル）−１−エチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（エチレン）ホスホルアミデートを立体選択的に合成する方法を、提供する。

【背景技術】

【0002】

がんは、ヒトの罹患率および死亡率の主たる原因の１つである。正常細胞を損傷することなくまたは死滅させることなくがん細胞を死滅させることは困難であるため、がんの処置は難題である。がん処置中の正常細胞の損傷または死滅は、患者において有害な副作用の原因であり、がん患者に投与される抗がん薬の量を制限する可能性がある。
アルド−ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（ＡＫＲ１Ｃ３）は、ヒトにおいて、ＡＫＲ１Ｃ３遺伝子によりコードされている酵素である。この遺伝子は、４０種類以上の既知の酵素およびタンパク質からなるアルド／ケト還元酵素スーパーファミリーの一つのメンバーをコードしている。これらの酵素は、補因子としてＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨを利用することによって、アルデヒドおよびケトンのこれらの相応するアルコールへの変換を触媒する。
多くのがん細胞が正常細胞と比べてＡＫＲ１Ｃ３還元酵素を過剰発現している（例えば、Cancer Res. 2010; 70:1573-1584; Cancer Res. 2010; 66: 2815-2825を参照されたい）。ＰＲ１０４

【化1】

PR 104
は、ＡＫＲ１Ｃ３に対する弱い基質であることが示され、治験にて試験された。この化合物はまた低酸素状態中でも活性化され得るので、選択的なＡＫＲ１Ｃ３活性化プロドラッグではない。ＰＲ１０４は治験では無効であった。
したがって、がん患者を処置するための選択的ＡＫＲ１Ｃ３還元酵素活性化プロドラッグを含めて、がん患者を処置するのに適した化合物が依然として必要である。本発明は、この必要性を満たす。

【発明の概要】

【0003】

一態様では、本明細書では、式ＩａおよびＩｂ：

【化2】

Ia;および

【化3】

Ib
の化合物またはそれらの同位体変種、溶媒和物もしくは水和物が提供される。
本明細書で提供される化合物にはそれぞれの鏡像異性体ならびに鏡像異性体の濃縮混合物が含まれる。
別の態様では、本明細書では、本明細書で提供される化合物と少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物が提供される。別の態様では、本明細書では、本明細書で提供される医薬組成物の単位用量が提供される。

【0004】

別の態様では、本明細書では、患者においてがんを処置する方法であって、本明細書で提供される化合物のまたは薬学的に許容される組成物の治療有効量を患者に投与するステップが含まれる方法が提供される。一実施形態では、がんは、ＡＫＲ１Ｃ３還元酵素のレベルが高いかまたはそのようながんにおいて通常より高いものである。一実施形態では、がんは肝臓がん、具体的には肝細胞癌（ＨＣＣ）である。一実施形態では、がんは非小細胞肺がんまたは黒色腫である。一実施形態では、がんは前立腺がんである。一実施形態では、がんは乳がんである。一実施形態では、がんは白血病である。一実施形態では、がんは食道がんである。一実施形態では、がんは、腎臓がん、胃がん、結腸がん、脳がん、膀胱がん、子宮頸がん、卵巣がん、頭頸部がん、子宮内膜がん、すい臓がん、肉腫、または直腸がんである。さらなる一態様では、本発明の方法は、ＡＫＲ１Ｃ３抗体を使用する方法によりがんのＡＫＲ１Ｃ３還元酵素レベルを決定するステップと、前記レベルが所定値に等しいかまたはそれより高い場合、本明細書で提供される化合物または薬学的に許容される組成物の治療有効量を前記患者に投与するステップとを含む。一態様では、本発明の方法は、投与するステップの前に、患者から分離した試料中の腫瘍内ＡＫＲ１Ｃ３還元酵素レベルを決定するステップと、そのレベルが所定レベルに等しいかまたはそれより高い場合、治療のために患者を選択するステップとを含む。一部の実施形態では、そのレベルが前記所定値を超えていないかまたはそれ未満である場合、本明細書で提供される化合物または薬学的に許容される組成物の投与を含む処置以外のがん処置の治療有効量が投与される。本明細書で提供される化合物および組成物の治療有効量、投与の適切なモードを決定する方法については、当業者であれば、本開示を読むことによって、および当業者に既知の他の方法に基づいて、明白となるであろう。ＡＫＲ１Ｃ３レベルについては、当業者に周知されている慣用的方法に従って測定される。

【図面の簡単な説明】

【0005】

【図1A】図１は、１−（３−（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニル）フェノキシル−４−ニトロフェニル）−１−エチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（エチレン）ホスホルアミデートの２つの鏡像異性体の分割に関するＬＣクロマトグラムを示す図である。クロマトグラムは、ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＯＺ―Ｈ ６×２５０ｍｍ、６５／３５ＣＯ₂／メタノールで溶出する５μｍ（Ｄａｉｃｅｌ）キラルカラム上でのキラル高速液体クロマトグラフィーによる。

【図1B】図１は、１−（３−（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニル）フェノキシル−４−ニトロフェニル）−１−エチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（エチレン）ホスホルアミデートの２つの鏡像異性体の分割に関するＬＣクロマトグラムを示す図である。クロマトグラムは、ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＯＺ―Ｈ ６×２５０ｍｍ、６５／３５ＣＯ₂／メタノールで溶出する５μｍ（Ｄａｉｃｅｌ）キラルカラム上でのキラル高速液体クロマトグラフィーによる。

【図1C】図１は、１−（３−（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニル）フェノキシル−４−ニトロフェニル）−１−エチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（エチレン）ホスホルアミデートの２つの鏡像異性体の分割に関するＬＣクロマトグラムを示す図である。クロマトグラムは、ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＯＺ―Ｈ ６×２５０ｍｍ、６５／３５ＣＯ₂／メタノールで溶出する５μｍ（Ｄａｉｃｅｌ）キラルカラム上でのキラル高速液体クロマトグラフィーによる。

【図2】プロゲストロンと比較した、アルドケト還元酵素ＡＫＲ１Ｃ３によるＴＨ２８７０の活性化を示す図である。

【図3】肝臓がん細胞株におけるＡＫＲ１Ｃ３発現を示す図である。

【図4】前立腺がん細胞株におけるＡＫＲ１Ｃ３発現を示す図である。

【図5】各群における平均体重を示す図である。

【図6】各群における腫瘍量の典型的な蛍光像を示す図である。

【図7】各群における腫瘍発育曲線を示す図である。

【図8】各群における腫瘍量の蛍光像を示す図である。

【図9】様々な群における平均腫瘍質量を示す図である。

【図10】様々な群における体重変化を示す図である。

【図11】末梢血における腫瘍量発育曲線を示す図である。

【図12】様々な群における終了点での血液、脾臓および骨髄のヒトＣＤ４５抗体陽性のパーセントを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0006】

定義
以下の定義は、読み手を補助するために提供する。特に規定のない限り、本明細書で使用する技術、表記法および他の科学用語もしくは医学用語または用語法は全て、化学技術分野および医学技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味を有するものとする。一部の場合において、一般的に理解されている意味を有する用語を、明瞭性および／または参照容易性のために本明細書において定義する。そのような定義を本明細書に含めることは、当該技術分野で一般的に理解されている用語の定義を超えて実質的に異なることを示すものと、解釈されるべきでない。

【0007】

全ての数値指定、例えば、それぞれの範囲を含めて、ｐＨ、温度、時間、濃度、および質量は、適宜、０．１、１．０、または１０．０の増分だけ（＋）または（−）に一般的には変化し得る近似値である。全ての数値指定は、用語「約」が先行しているものとして理解することができる。本明細書に記載の試薬は、例示的なものであり、そのようなものの均等物は当該技術分野で知られている。
「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、本文中に明示していない限り、複数の指示対象物を包含する。したがって、例えば、化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）に対する言及は、１つまたは複数の化合物または少なくとも１つの化合物を示す。したがって、用語「１つ（ａ）」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数」、および「少なくとも１つ」は、本明細書において互換可能に使用される。

【0008】

用語「約」または「およそ」とは、通常の当業者によって決定される特定の値の許容し得る誤差を意味し、これは、その値がどのように測定されるかまたは決定されるかに一部依存する。ある特定の実施形態では、用語「約」または「およそ」とは、標準偏差が１、２、３または４以内を意味する。ある特定の実施形態では、用語「約」または「およそ」とは、所定の値または範囲の５０％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％または０．０５％以内を意味する。
本明細書で使用する、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、組成物および方法が、列挙された要素を含むが他のものを除かないことを意味することを意図する。組成物および方法を定義するために使用される場合の「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」とは、組成物または方法に対して任意の本質的な重要なもののその他の要素を除くことを意味するものとする。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」とは、特許請求された組成物および特許請求された実質的な方法のステップについて、その他の成分の微量要素を超えるものを除くことを意味するものとする。これらの移行用語のそれぞれによって定義された実施形態は、本発明の範囲内である。したがって、方法および組成物はさらなるステップおよびさらなる成分を含む場合もあり（含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ））、あるいは、重要ではないステップおよび組成物を含む場合もあり（から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ））、あるいは、記載された方法のステップまたは組成物のみを意図する場合もある（からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ））、ものとする。
「脱離基」とは、当業者に周知されている求核置換条件下で置換し得る部分をいう。脱離基としては、限定されないがハロおよび−ＯＳＯ₂−Ｒ²⁰があるが、Ｒ²⁰は置換されたアルキル、アリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、またはヘテロアリールでもよい。
薬物を患者に「投与すること」または「投与」（およびこの語句の文法的等価物）は、医療専門家による患者への投与の場合もありもしくは自己投与の場合もある直接投与、
および／または薬物を処方する行為の場合もある間接投与、をいう。例えば、患者に薬物の自己投与を指示する医師、および／または患者に薬物の処方箋を給する医師は、薬物を患者に投与しているとする。

【0009】

「がん」とは、白血病、リンパ腫、がん腫、ならびに浸潤によって局所的におよび転移によって全身に広がることがあり得る、無制限に増殖する可能性のある、固形腫瘍を含めてその他の悪性腫瘍をいう。がんの例としては、それらに限定されないが、副腎、骨、脳、乳房、気管支、結腸および／または直腸、胆嚢、頭頸部、腎臓、喉頭、肝臓、肺、神経組織、膵臓、前立腺、副甲状腺、皮膚、胃、ならびに甲状腺のがんが挙げられる。がんのある特定の他の例としては、急性および慢性のリンパ球性および顆粒球性の腫瘍、腺癌、腺腫、基底細胞癌、子宮頚部形成異常および上皮内癌、ユーイング肉腫、類表皮癌、巨細胞腫瘍、多形性神経膠芽腫、ヘアリーセル腫瘍、腸の神経節細胞腫、過形成性角膜神経腫瘍、膵島細胞癌、カポジ肉腫、平滑筋腫、白血病、リンパ腫、悪性カルチノイド、悪性黒色腫、悪性高カルシウム血症、マルファン症候群様体質腫瘍、髄様癌、転移性皮膚癌、粘膜神経腫、骨髄腫、菌状息肉腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、骨原性および他の肉腫、卵巣腫瘍、褐色細胞腫、真性赤血球増加症、原発性脳腫瘍、小細胞肺腫瘍、潰瘍形成性および乳頭型両方の扁平上皮細胞癌、過形成、精上皮腫、軟部組織肉腫、網膜芽腫、横紋筋肉腫、腎細胞腫、局所皮膚病変、細網肉腫（ｖｅｔｉｃｕｌｕｍ ｃｅｌｌ ｓａｒｃｏｍａ）、ならびにウィルムス腫瘍が挙げられる。

【0010】

用語「接触させること（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」または「接触させる（ｃｏｎｔａｃｔ）」とは、そのような接触の結果として、生理学的および／または化学的効果が生じるように、治療剤と細胞もしくは組織を一緒にすることをいう。接触させることは、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで行うことができる。一実施形態では、治療剤を、細胞培養（インビトロ）で細胞と接触させ、治療剤の細胞におよぼす効果を決定する。別の実施形態では、治療剤を細胞または組織と接触させることには、接触させるべき細胞または組織を有する対象に治療剤を投与することが含まれる。

【0011】

用語「光学的に活性な」および「鏡像異性的に活性な」とは、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９１％以上、約９２％以上、約９３％以上、約９４％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上、約９９．５％以上、約９９．８％以上、または約９９．９％以上の鏡像体過剰率を有する分子の集団をいう。ある特定の実施形態では、光学的に活性なまたは鏡像異性的に活性な化合物の鏡像体過剰率は、約９０％以上、約９５％以上、約９８％以上、または約９９％以上である。

【0012】

光学的に活性のある化合物について説明する際に、接頭語ＲとＳは、そのキラル中心を中心にして分子の絶対立体配置を表示するのに使用される。（＋）および（−）は、化合物の旋光度、すなわち、偏光面が、光学的に活性な化合物よって回転している方向を表示するのに使用する。接頭語（−）は、化合物が左旋性であること、すなわち、化合物が、偏光面を左または反時計回りに回転させることを示す。接頭語（＋）は、化合物が右旋性であること、すなわち、化合物が、偏光面を右または時計回りに回転させることを示す。しかしながら、旋光性の記号（＋）および（−）は、分子の絶対立体配置ＲおよびＳに関係しない。

【0013】

用語「光学的に純粋」および「鏡像異性的に純粋」とは、約８０％以上、約９０％以上、約９１％以上、約９２％以上、約９３％以上、約９４％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上、約９９．５％以上、約９９．８％以上、または約９９．９％以上の鏡像体過剰率（ｅｅ）を有する分子の集団をいう。ある特定の実施形態では、光学的に純粋なまたは鏡像異性的に純粋な化合物に関する鏡像体過剰率は、約９０％以上、約９５％以上、約９８％以上、または約９９％以上である。化合物の鏡像体過剰率は、それらに限定されないが、光学的に活性な固定相を使用するカイロオプティカル（ｃｈｉｒｏｐｔｉｃａｌ）クロマトグラフィー（ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、および薄層クロマトグラフィー）、同位体希釈、電気泳動、熱量測定、旋光分析、キラル誘導体によるＮＭＲ分割法、およびキラル溶媒和剤またはキラルシフト試薬によるＮＭＲ法を含めて、通常の当業者により使用される任意の標準方法により決定することができる。

【0014】

用語「実質的に純粋」および「実質的に均一」とは、それらに限定されないが、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、および質量分析（ＭＳ）を含めて、通常の当業者により使用される標準の分析方法により決定した場合、容易に検出可能な不純物は含まれていないと思えるように十分に均一であること；あるいは、さらなる精製によって、物質の物理的特性、化学的特性、生物学的特性、ならびに／または薬理学特性が、例えば酵素活性および生物活性が、検出可能なほどに変更することがないほどに、十分に純粋であることを意味する。ある特定の実施形態では、「実質的に純粋」または「実質的に均一」とは、標準の分析方法により決定した場合、分子の少なくとも約５０質量％、少なくとも約７０質量％、少なくとも約８０質量％、少なくとも約９０質量％、少なくとも約９５質量％、少なくとも約９８質量％、少なくとも約９９質量％、または少なくとも約９９．５質量％が、化合物の単一の立体異性体である分子の集団をいう。

【0015】

用語「同位体変種」とは、そのような化合物を構成する原子のうち１個または複数において、天然ではない割合の同位体を含有する化合物をいう。ある特定の実施形態では、化合物の「同位体変種」は、それらに限定されないが、水素（¹Ｈ）、重水素（²Ｈ）、トリチウム（³Ｈ）、炭素−１１（¹¹Ｃ）、炭素−１２（¹²Ｃ）、炭素−１３（¹³Ｃ）、炭素−１４（¹⁴Ｃ）、窒素−１３（¹³Ｎ）、窒素−１４（¹⁴Ｎ）、窒素−１５（¹⁵Ｎ）、酸素−１４（¹⁴Ｏ）、酸素−１５（¹⁵Ｏ）、酸素−１６（¹⁶Ｏ）、酸素−１７（¹⁷Ｏ）、酸素−１８（¹⁸Ｏ）、フッ素−１７（¹⁷Ｆ）、フッ素−１８（¹⁸Ｆ）、リン−３１（³¹Ｐ）、リン−３２（³²Ｐ）、リン−３３（³³Ｐ）、イオウ−３２（³²Ｓ）、イオウ−３３（³³Ｓ）、イオウ−３４（³⁴Ｓ）、イオウ−３５（³⁵Ｓ）、イオウ−３６（³⁶Ｓ）、塩素−３５（³⁵Ｃｌ）、塩素−３６（³⁶Ｃｌ）、塩素−３７（³⁷Ｃｌ）、臭素−７９（⁷⁹Ｂｒ）、臭素−８１（⁸¹Ｂｒ）、ヨウ素−１２３（¹²³Ｉ）、ヨウ素−１２５（¹²⁵Ｉ）、ヨウ素−１２７（¹²⁷Ｉ）、ヨウ素−１２９（¹²⁹Ｉ）、およびヨウ素−１３１（¹³¹Ｉ）を含めて、天然でない割合の１個または複数の同位体を含有する。ある特定の実施形態では、化合物の「同位体変種」は安定した形態、すなわち非放射性である。ある特定の実施形態では、化合物の「同位体変種」は、それらに限定されないが、水素（¹Ｈ）、重水素（²Ｈ）、炭素−１２（¹²Ｃ）、炭素−１３（¹³Ｃ）、窒素−１４（¹⁴Ｎ）、窒素−１５（¹⁵Ｎ）、酸素−１６（¹⁶Ｏ）、酸素−１７（¹⁷Ｏ）、酸素−１８（¹⁸Ｏ）、フッ素−１７（¹⁷Ｆ）、リン−３１（³¹Ｐ）、イオウ−３２（³²Ｓ）、イオウ−３３（³³Ｓ）、イオウ−３４（³⁴Ｓ）、イオウ−３６（³⁶Ｓ）、塩素−３５（³⁵Ｃｌ）、塩素−３７（³⁷Ｃｌ）、臭素−７９（⁷⁹Ｂｒ）、臭素−８１（⁸¹Ｂｒ）、およびヨウ素−１２７（¹²⁷Ｉ）を含めて、天然でない割合の１個または複数の同位体を含有する。ある特定の実施形態では、化合物の「同位体変種」は不安定な形態、すなわち放射性である。ある特定の実施形態では、化合物の「同位体変種」は、それらに限定されないが、トリチウム（³Ｈ）、炭素−１１（¹¹Ｃ）、炭素−１４（¹⁴Ｃ）、窒素−１３（¹³Ｎ）、酸素−１４（¹⁴Ｏ）、酸素−１５（¹⁵Ｏ）、フッ素−１８（¹⁸Ｆ）、リン−３２（³²Ｐ）、リン−３３（³³Ｐ）、イオウ−３５（³⁵Ｓ）、塩素−３６（³⁶Ｃｌ）、ヨウ素−１２３（¹²³Ｉ）、ヨウ素−１２５（¹²⁵Ｉ）、ヨウ素−１２９（¹²⁹Ｉ）、およびヨウ素−１３１（¹³¹Ｉ）を含めて、天然でない割合の１個または複数の同位体を含有する。本明細書で提供される化合物において、当業者の判断に従い実現可能である場合は、任意の水素は例えば²Ｈとすることができ、または、任意の炭素は例として¹³Ｃとすることができ、または任意の窒素は例として¹⁵Ｎとすることができ、および任意の酸素は¹⁸Ｏとすることができることが理解されるであろう。ある特定の実施形態では、化合物の「同位体変種」は、天然でない割合の重水素を含有する。

【0016】

語句「その同位体変種；または、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグ」とは、語句「そこで言及された化合物の同位体変種；または、そこで言及された化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグ、またはそこで言及された化合物の同位体変種」と同じ意味を有する。
「患者」および「対象」は、がんの処置を必要とする哺乳動物をいうために互換的に使用されている。一般的に、患者とはヒトである。一般的に、患者とは、がんと診断されたヒトである。ある特定の実施形態では、「患者」または「対象」とは、薬物および治療薬のスクリーニング、特性確認および評価に使用される、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、マウスまたはラットなどの非ヒト哺乳動物を指す場合もある。

【0017】

用語「薬学的に許容される担体」、「薬学的に許容される賦形剤」、「生理学的に許容される担体」、または「生理学的に許容される賦形剤」とは、液体のもしくは固体の充填剤、希釈剤、溶媒、または封入材料などの、薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクルを指す。一実施形態では、各構成成分は、医薬製剤の他の成分と相容性であるという意味において、また合理的な利益／危険比で釣り合って、度を超えた毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性、または他の問題もしくは合併症なしで、ヒトおよび動物の組織または臓器との接触に使用するのに適するという意味において、「薬学的に許容される」とする。Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed.; Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, Pa., 2005; Handbook of Pharmaceutical Excipients, 6th ed.; Rowe et al., Eds.; The Pharmaceutical Press and the American Pharmaceutical Association: 2009; Handbook of Pharmaceutical Additives, 3rd ed.; Ash and Ash Eds.; Gower Publishing Company: 2007; and Pharmaceutical Preformulation and Formulation, 2nd ed.; Gibson Ed.; CRC Press LLC: Boca Raton, Fla., 2009を参照されたい。

【0018】

「プロドラッグ」とは、投与されると、少なくとも１つの性質に関して生物学的に活性なまたはより活性な化合物（または薬物）に代謝されるかまたは本来なら変換される化合物をいう。プロドラッグは、当該薬物と比べて、それを活性が低いかまたは不活性とするような様式で、その薬物に対して、化学的に修飾されているが、この化学修飾とは、プロドラッグが投与された後、代謝的または他の生物学的プロセスによって対応する薬物が生成されるようなものである。プロドラッグは、活性薬物と比べて、改変された代謝安定性もしくは輸送特性、少ない副作用もしくは低毒性、または改善された風味を有し得る（例えば、参照により本明細書に組み込まれる参考文献Nogrady, 1985, Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, New York, pages 388-392を参照されたい）。プロドラッグは、相応する薬物以外の反応体を使用して合成することができる。
「固形腫瘍」とは、それらに限定されないが、骨、脳、肝臓、肺、リンパ節、膵臓、前立腺、皮膚および軟組織（肉腫）における転移性の腫瘍を含む固形腫瘍をいう。

【0019】

用語“溶媒和物”とは、溶質の、例えば本明細書で提供される化合物の、１個または複数の分子と、化学量論的量または非化学量論的量で存在する溶媒の１個または複数の分子とにより形成される複合体または凝集体をいう。好適な溶媒としては、それらに限定されないが、水、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、および酢酸がある。ある特定の実施形態では、溶媒は薬学的に許容し得る。一実施形態では、この複合体または凝集体は、結晶形態である。別の実施形態では、この複合体または凝集体は、非晶質形態である。溶媒が水である場合、溶媒和物は水和物である。水和物の例としては、それらに限定されないが、半水和物、一水和物、二水和物、三水和物、四水和物、および五水和物である。
薬物の「治療有効量」とは、がんに罹患している患者に投与した場合、意図される治療効果を、例えば、患者におけるがんの１または複数の症状の緩和、改善、軽減または消失を、有する薬物の量をいう。治療効果は、必ずしも１回の用量の投与で生じるものではなく、一連の用量を投与してからのみに生じる場合もある。したがって、治療有効量は、１回または複数の投与によって投与してもよい。

【0020】

病状または患者「を処置すること」、「の処置」、または「の治療」とは、臨床結果を含めて有益なまたは所望の結果を得るために取るステップをいう。本発明では、有益なまたは所望の臨床結果としては、それらに限定されないが、がんの１つまたは複数の症状の緩和もしくは改善；疾患の程度の減弱；疾患進行の遅延もしくは遅滞；疾患状態の改善、軽減もしくは安定化；または他の有益な結果が挙げられる。がんの処置は、場合によっては、部分奏効または疾患の安定をもたらし得る。
「腫瘍細胞」とは、適切な任意種の、例えばマウス、イヌ、ネコ、ウマまたはヒトなどの哺乳動物の、腫瘍細胞をさす。

【0021】

記述的実施形態
本明細書では、式ＩａおよびＩｂ：

【化4】

Ia;および

【化5】

Ib
の化合物またはそれらの同位体変種、溶媒和物もしくは水和物が提供される。

【0022】

別の態様では、本明細書では、式Ｉ：

【化6】

I
の化合物を製造する方法であって：
式ＩＩ

【化7】

II
の化合物をＰＯＣｌ₃およびＨ₂ＮＣＨ₂ＣＨ₂Ｌ^2・、またはその塩、と接触させて式ＩＩＩ

【化8】

III
の化合物を用意するステップを含む方法が提供され、
ここで、Ｌ¹およびＬ²は独立して脱離基であり、次いで
式ＩＩＩの化合物を取って、式Ｉの化合物を提供する。

【0023】

本明細書で提供される化合物を合成するためのある特定の方法が本明細書では提供されている。本明細書で提供されるこれらの化合物およびその他の化合物を合成するための他の方法は、当業者に周知されている合成法の適用とそれにおける試薬および反応物の置換とに基づけば、当業者には明白であろう。例えば、Hay et al., J. Med. Chem. 2003, 46, 2456-2466 and Hu et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 21 (2011) 3986-3991を参照されたい。本明細書で提供される化合物の調製に有用な出発材料は、市販されているか、または慣用的方法に従って調製することができる。反応は不活性溶媒中で通常は行われ、必要であれば加熱する。当業者であれば、ある特定の反応には保護基の使用が必要であろうことを、容易に理解するであろう。保護基については当業者に周知されており、例えば、Greene's Protective Groups in Organic Synthesis. Peter G. M. Wuts and Theodora W. Greene, 4th Edition or a later edition, John Wiley & Sons, Inc., 2007に記載されてある。反応生成物は、結晶化、析出、蒸留、および／またはクロマトグラフィーなどの慣用法に従って分離することができる。化合物または中間体の純度については、¹Ｈ−ＮＭＲ、ＨＰＬＣ、ＴＬＣ等などの周知されている方法を使用して確認することができる。

【0024】

別の実施形態では、本発明は式Ｉの化合物を光学的に分割する方法に関する。本発明の式ＩａおよびＩｂの化合物の薬学的重要性からみて、効果的な工業プロセスを使用して式Ｉの化合物を、とりわけ良好な収率でおよび卓越した化学的および鏡像異性的純度で、分割することは必要不可欠である。

【0025】

出願人は、式Ｉ
の化合物を光学的に分割する方法を開発したが、この方法によって、収率と化学的および鏡像異性的純度とに関して良好な特性を備える式ＩａおよびＩｂの化合物を得ることが可能である。本発明の方法により、生産性が高く収率が卓越しているとともに使用する溶媒を節減して、卓越した鏡像異性体過剰率で式Ｉの化合物のいずれかの鏡像異性体を得ることが可能である。より詳細には、本発明は、式Ｉ

【化9】

I
の化合物を光学的に分割して、絶対立体配置（Ｒ）および（Ｓ）の、それぞれ式（Ｉａ）および（Ｉｂ）

【化10】

Ia;および

【化11】

Ib
の式Ｉの化合物の鏡像異性体を得る方法に関し：
ここで、式Ｉの化合物のラセミ混合物または鏡像異性的に濃縮されている混合物がその２つの鏡像異性体、式（Ｉａ）の（Ｒ）−１−（３−（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニル）フェノキシル−４−ニトロフェニル）−１−エチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（エチレン）ホスホルアミデートと式（Ｉｂ）の（Ｓ）−１−（３−（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニル）フェノキシル−４−ニトロフェニル）−１−エチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（エチレン）ホスホルアミデートとに、キラルクロマトグラフィーによって分離される。
光学的分割とは、ラセミ混合物のうちの２つの鏡像異性体またはこれら２つの鏡像異性体の任意の混合物のうちの２つの鏡像異性体を分離することを意味すると理解される。
ラセミ混合物とは、５５：４５から４５：５５の比にある、好ましくは５０：５０の比にある２つの鏡像異性体の混合物を意味すると理解される。
鏡像異性的に濃縮されている混合物とは、５５：４５と９０：１０との間で変動する比にある鏡像異性体の内の１つのより多くを有意に含有する２つの鏡像異性体の混合物を意味すると理解される。
キラルクロマトグラフィーとは、キラル固定相と溶媒または溶媒およびガスの混合物で構成される移動相とによって、ある混合物の鏡像異性体の分離を可能とする装置を意味すると理解される。
本発明の実施形態の１つにおいては、キラルクロマトグラフィーに使用する固定相は官能化多糖で含浸されたシリカゲルを備えている。

【0026】

一実施形態でキラルクロマトグラフィーに使用する移動相はアルコールおよび有機ガスの混合物を含む。キラルクロマトグラフィーに使用し得るアルコールのうちには、何ら制限を意味するものではないが、イソプロパノール、エタノールおよびメタノールを記載することができる。一実施形態では、キラルクロマトグラフィーに使用するアルコールはメタノールである。
キラルクロマトグラフィーに使用し得る有機ガスのうちには、何ら制限を意味するものではないが、高圧で使用することができる有機ガスを記載することができる。使用するのに好ましい有機ガスはＣＯ₂である。一実施形態では、キラルクロマトグラフィーに使用する移動相はメタノールおよびＣＯ₂の混合物を含む。本発明の一実施形態では、キラルクロマトグラフィーに使用する移動相は、５０：５０から２：９８に変動する比でメタノールおよびＣＯ₂の混合物を含む。

【0027】

本発明の一実施形態では、キラルクロマトグラフィーに使用する移動相は再利用される。本発明の一実施形態では、キラルクロマトグラフィーは１５℃以上から４０℃以下までの温度にて実施される。本発明の実施形態の一つでは、光学的分割は式（Ｉ）の１：１のラセミ混合物で実施される。本発明の実施形態の一つにおいては、１−（３−（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニル）フェノキシル−４−ニトロフェニル）−１−エチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（エチレン）ホスホルアミデートの（Ｒ）−鏡像異性体が使用される。本発明の実施形態の一つでは、１−（３−（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニル）フェノキシル−４−ニトロフェニル）−１−エチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（エチレン）ホスホルアミデートの（Ｓ）−鏡像異性体が使用される。
本発明の一実施形態においては、連続マルチカラム分離プロセスが使用される。

【0028】

本発明の別の実施形態においては、疑似移動床クロマトグラフィー法が使用される。疑似移動床クロマトグラフィーとは、移動相の移動と反対の方向に固定相の移動をシミュレートするのを可能にする、連続的クロマトグラフィー法を意味すると解される。このような方法を使用すると、従来のクロマトグラフィーの手法によって分離するのが困難であるかまたは不可能である化合物を分離することが可能となる。キラル固定相を用いる場合、そのような方法は、鏡像異性体の分離にとりわけ役立つ。疑似移動床クロマトグラフィーを使用すると、不連続的クロマトグラフィー法と比較して、使用される固定相および移動相の量を節減しつつ、高い生産性で鏡像異性体混合物を連続的に分割することを実施することが可能となる。

【0029】

使用される略字のリスト
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＴＥＡ：トリエチルアミン
ＲＴ：室温
ＩＰＭ．：イソホスホルアミドマスタード
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＤＩＡＤ：アゾジカルボン酸ジイソプロピル
以下に、本発明を実施例で説明する。

【実施例】

【0030】

（例１）
化合物ＴＨ２８７０の調製。

【化12】

化合物２〜６を以下に記載の通り合成した。
ａ．化合物３の合成：
化合物１（３ｇ、１６．２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３滴）とともにＳＯＣｌ₂（１０ｍＬ）中で３時間還流し、次いで真空中でＳＯＣｌ₂を除去した。残留物をトルエン（５ｍＬ）で希釈し、さらなる精製をせずに以下のステップで使用した。

【0031】

ＭｇＣｌ₂（９３０ｍｇ、９．８ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（４．７ｍＬ、３３．４ｍｍｏｌ）およびマロン酸ジメチル（１．９ｍＬ、１６．６ｍｍｏｌ）の混合物をＲＴにて１．５時間攪拌し、その後化合物２の上記トルエン溶液を添加した。結果として得られる混合物をＲＴにて１．５時間再度攪拌し、次いで濃ＨＣｌ（４ｍＬ）を添加し、５分間攪拌した。混合物をＥｔＯＡｃで抽出し（３０ｍＬ×３）、脱水し（Ｎａ₂ＳＯ₄）、ろ過し、減圧中で濃縮した。残留物に６ＮＨＣｌ（３０ｍＬ）を添加し、混合物を一晩還流した。混合物をＥｔＯＡｃで抽出し（３０ｍＬ×３）、脱水し（Ｎａ₂ＳＯ₄）、ろ過し、減圧中で濃縮した。残留物をＦＣＣ（シリカゲル、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して、淡黄色固形物として化合物３を得た（１．９ｇ、収率６３％）。
¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ: 8.16 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.86 (t, d = 9.2 Hz, 2H), 2.68 (s, 3H) ppm.

【0032】

ｂ．化合物４の合成
ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）中に化合物３（１．９ｇ、１０．４ｍｍｏｌ）を含む混合物にＮａＢＨ₄（４１８ｍｇ、１１ｍｍｏｌ）を小分けして−１０℃にて添加した。混合物を−１０℃と０℃との間で、２０分間攪拌し、ＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮＨ₄Ｃｌ水溶液で洗浄し、食塩水で洗浄し、脱水した（Ｎａ₂ＳＯ₄）。ろ過し、減圧中で濃縮した。残留物をＦＣＣ（シリカゲル、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して、淡黄色油状物として化合物４を得た（１．４４ｇ、収率７５％）。
¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ: 8.06 (t, J = 8.4 Hz, 1H), 7.35 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 7.30 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 5.01-4.99 (m, 1H), 1.52 (d, J = 6.4 Hz, 3H) ppm.

【0033】

ｃ．化合物５の合成
ＴＨＦ（６０ｍＬ）中に、化合物４（１．４４ｇ、７．７８ｍｍｏｌ）、Ｂｒ−ＩＰＭ（２．８８ｇ、９．３４ｍｍｏｌ）、ＰＰｈ₃（３．０６ｇ、１１．６７ｍｍｏｌ）を含む混合物にＤＩＡＤ（２．３４ｇ、１１．６７ｍｍｏｌ）を０℃にて添加した。混合物を０℃にて１．５時間攪拌し、減圧中で濃縮し、ＦＣＣ（シリカゲル、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して、淡黄色油状物として化合物５を得た（１．０ｇ、収率２７％）。
¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ: 8.09 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 8.31 (dd, J = 2.4, 13.6 Hz, 2H), 5.52-5.60 (m, 1H), 3.54-3.19 (m, 8H), 1.63 (d, J = 6.4 Hz, 3H) ppm.

【0034】

ｄ．化合物６の合成
ＴＨＦ（５０ｍＬ）中に、化合物５（１ｇ、２．１ｍｍｏｌ）およびＡｇ₂Ｏ（３ｇ）を含む混合物を６５℃にて３時間攪拌した。ろ過し、減圧中で濃縮した。残留物をＦＣＣ（シリカゲル、アセトン／ヘキサン）により精製して、黄色固形物として化合物６を得た（０．６ｇ、収率９０％）。
¹HNMR (CDCl₃, 400 MHz) δ: 8.08 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.36 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 7.31(d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.70-5.67 (m, 1H), 2.25-2.08 (m, 8H), 1.64 (d, J = 6.4 Hz, 3H)ppm.
ｅ．化合物７の調製

【化13】

【0035】

化合物７−２の調製
Ａｃ₂Ｏ（５６２ｍＬ、１．５ｅｑ）をピリジン（７００ｍＬ）中に化合物７−１（１５０ｇ、１．０８ｍｏｌ）を含む溶液に０℃にて滴下添加し、ｒ．ｔ．にて６時間攪拌した。蒸発させ、氷水中に注ぎ、ろ過し、ろ過物を脱水して白色固形物として化合物７−２を得た（１５０ｇ、収率７４％）。
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ ppm 8.00~7.98 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 8.03(s, 1H), 7.83(s, 1H), 7.51~7.47 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.36~7.34 (dd, J = 8.0 Hz 1.2 Hz, 1H), 2.34 (s, 3H).
化合物７−３の調製
ＤＣＭ（１５００ｍＬ）中に化合物７−２（１５０ｇ、８３３ｍｍｏｌ）を含む溶液に、ＤＭＦ（１５ｍＬ）を添加し、０℃に冷却し、その後にオキサイルクロリド（ｏｘａｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（２２５ｍＬ、２．５０ｍｏｌ）を添加し、ｒ．ｔ．にて４時間攪拌した。蒸発させ、残留物をＤＣＭ（１０００ｍＬ）に溶解させ、０℃に冷却し、その後にＴＨＦ（９００ｍＬ、１．８ｍｏｌ）中のジメチルアミン２Ｍ溶液を添加し、ｒ．ｔ．にて２０時間攪拌した。Ｈ₂Ｏ（１５００ｍＬ）でクエンチし、ＤＣＭで抽出し（２０００ｍＬ×３）、蒸発させて薄い黄色の液体として粗化合物７−３（１３７ｇ、収率８０％）を得た。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ ppm 7.43~7.39 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.29~7.28(d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.17~7.13 (m, 2H), 3.00(s, 6H), 2.32(s, 3H).

【0036】

化合物７の調製
ＭｅＯＨ（１０００ｍＬ）中に化合物７−３（１３７ｇ、６６１ｍｍｏｌ）を含む溶液に、Ｋ₂ＣＯ₃（２７６ｇ、２ｍｏｌ）を添加し、ｒ．ｔ．にて５時間攪拌した。ろ過し、ろ液を蒸発させた。残留物を水（１０００ｍＬ）に溶解させ、４ＮＨＣｌでｐＨ６．０に酸性化し、ろ過し、ろ過物を脱水して白色固形物として化合物７を得た（６０ｇ、収率５５％）。
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ ppm 8.25 (s, 1H), 7.19~7.15(d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.96~6.95 (t, J = 2.0 Hz, 1H), 6.84~6.81 (s, 2H), 3.11(s, 3H), 2.96(s, 3H).

【0037】

ｆ．ＴＨ２８７０の合成
ＤＭＦ（６０ｍＬ）中に化合物７を含む混合物にＮａＨ（６０％、０．５０８ｇ、１２．７ｍｍｏｌ）を小分けして０℃にて添加した。混合物を０℃にて５時間攪拌した後、化合物６（２ｇ、６．３５ｍｍｏｌ）を添加し、次いで０℃にて２．５時間攪拌した。混合物をＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）で希釈し、食塩水で洗浄し（５０ｍＬ×３）、Ｎａ₂ＳＯ₄で脱水し、ろ過し、減圧中で濃縮し、ＦＣＣ（シリカゲル、アセトン／ヘキサン）により精製して、黄色油状物としてＴＨ２８７０を得た。

【0038】

ＴＨ２８７０の最終精製：
上記のＴＨ２８７０を半分取ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム、アセトニトリル／水）により精製した。合わせた採取物を減圧中で濃縮して最終生成物として淡黄色油状物を得た。アセトニトリルを蒸発に共沸剤として添加して水を取り除いた。
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ ppm 7.98~7.96(d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.43~7.39(m, 1H), 7.27~7.21(m, 2H), 7.10~7.06(m, 3H), 5.62~5.55(m, 1H), 3.09(s, 3H), 2.97(s, 3H), 2.19~2.00(m, 8H), 1.58~1.57(d, J = 6.4 Hz, 3H). MS: m/z 460.8[M+1]+. PLC: 254 nm: 94.8%.

【0039】

（例２）
化合物ＴＨ２８７０の代替調製。

【化14】

ａ．化合物３の調製
化合物１（２００ｇ、１．０８ｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍｌ）とともにＳＯＣｌ₂（７００ｍＬ）中で３時間還流し、次いで真空中でＳＯＣｌ₂を除去した。残留物をトルエン（４００ｍＬ）で希釈し、さらなる精製をせずに以下のステップで使用した。

【0040】

ＭｇＣｌ₂（１０３ｇ、１．０８ｍｏｌ）、ＴＥＡ（５００ｍＬ、３．６０ｍｏｌ）およびマロン酸ジメチル（１４５ｇ、１．１ｍｏｌ）の混合物をＲＴにて１．５時間攪拌した後、化合物２の上記トルエン溶液を滴下添加した。結果として得られる混合物をＲＴにて１．５時間再度攪拌した。Ｈ₂Ｏ（２Ｌ）で洗浄し、ＥｔＯＡｃで抽出し（２Ｌ×５）、蒸発させ、ＰＨ６．０まで４ＮＨＣｌを添加し、５分間攪拌した。混合物をＥｔＯＡｃで抽出し（２Ｌ×５）、蒸発させた。
残留物に６ＮＨＣｌ（１５００ｍＬ）を添加し、混合物を一晩還流した。
混合物をＥｔＯＡｃで抽出し（２Ｌ×５）、濃縮し、シリカゲルカラム（石油エーテル：ＥｔＯＡｃ＝２０：１）で精製して黄色固形物として化合物３を得た（８０ｇ、収率４１％）。

【0041】

ｂ．化合物４の調製
ＭｅＯＨ（２Ｌ）中に化合物３（１５０ｇ、８２４ｍｏｌ）を含む混合物にＮａＢＨ₄（３１．２ｇ、８２４ｍｍｏｌ）を小分けして−１０℃にて添加した。混合物を−１０℃と０℃との間で、２０分間攪拌し、ＥｔＯＡｃ（５Ｌ）で希釈し、飽和ＮＨ₄Ｃｌ水溶液で洗浄し、食塩水で洗浄し、脱水し（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濃縮した。残留物をシリカゲルカラム（石油エーテル：ＥｔＯＡｃ＝５：１）により精製して黄色油状物として化合物４を得た（９０ｇ、収率６０％）。

【0042】

ｃ．化合物５の調製
ＤＣＭ（２０ｍｌ）中にＰＯＣｌ₃（２ｍｌ、２１．６ｍｍｏｌ）を含む溶液に化合物４（２ｇ、１０．８ｍｍｏｌ）を添加し、次いでＤＣＭ（１０ｍｌ）中のＴＥＡ（３．６ｍｌ、２７ｍｍｏｌ）を−４０℃にてＮ₂中で添加し、−４０℃にて５時間攪拌した。次いで、２−ブロモエチルアミン臭化水素酸塩（１７．６ｇ、８６．８ｍｍｏｌ）を添加し、ＤＣＭ（４０ｍｌ）中のＴＥＡ（１２ｍｌ、８６．８ｍｍｏｌ）を上記溶液に−４０℃にてゆっくりと添加し、０．５時間攪拌した。Ｋ₂ＣＯ₃（１０％、１０．４ｇ、１００ｍｌ）を添加し、ｒ．ｔ．にて５分間攪拌した。ＤＣＭで抽出し（３００ｍｌ×３）、蒸発させ、シリカゲルカラム（ＥｔＯＡｃ）により精製して黄色油状物として化合物５を得た（２．３ｇ、収率４３％）。

【0043】

ｄ．化合物６の調製
ＴＨＦ（４０ｍＬ）中に、化合物５（４ｇ、８．４２ｍｍｏｌ）およびＡｇ₂Ｏ（５．８５ｇ、２５．２６ｍｍｏｌ）を含む混合物を６５℃にて３時間攪拌し、ろ過し、濃縮した。残留物をシリカゲルカラム（ＥｔＯＡｃ）により精製して黄色油状物として化合物６を得た（２．３ｇ、収率８７％）。

【0044】

ｅ．化合物ＴＨ２８７０の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中に化合物７（１．８１ｇ、１０．９５ｍｍｏｌ）を含む溶液にＮａＨ（６０％、４３８ｍｇ、１０９５ｍｍｏｌ）を０℃にて添加し、１０分間攪拌し、次いでＤＭＦ（１０ｍＬ）中の化合物６（２．３、７．３ｍｍｏｌ）を添加し、０℃にて３０分間攪拌した。
Ｈ₂Ｏでクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出し（１００ｍＬ×５）、水で洗浄し（１５０ｍｌ）、食塩水で洗浄し、蒸発させ、シリカゲルカラム（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝４０：１）により精製して黄色油状物として化合物ＴＨ２８７０を得た（２．３ｇ、収率６９％）。

【0045】

（例３）
分取用キラルクロマトグラフィーによるＴＨ２８７０の鏡像異性体の分離
式（Ｉ）の化合物９８３ｍｇをメタノール３６ｍＬに溶解し、カラム温度３５〜４０℃にて流速３．０ｍｌ／分およびバックプレッシャー１２０Ｂａｒで、ＳＦＣ−８０ Ｍｅｔｈｏｄ Ｓｔａｔｉｏｎ（Ｔｈａｒ社、Ｗａｔｅｒｓ社）においてＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＯＺ−Ｈ ４．６×２５０ｍｍ、５μｍ（Ｄａｉｃｅｌ社）に１ｍＬを注入し、ＣＯ₂／メタノール（６５〜６０／３５〜４０）の混合物においてこの流速で溶出する。式（Ｉａ）の鏡像異性体（立体配置（Ｒ））は収率８６．５％でおよび鏡像異性的純度１００％で得られる。式（Ｉｂ）の鏡像異性体（立体配置（Ｓ））は収率８３．８％でおよび鏡像異性的純度１００％で得られる。ＬＣＭＳによるキラル分離後の、ＴＨ２８７０鏡像異性体１（ＴＨ３４２３）およびＴＨ２８７０鏡像異性体２（ＴＨ３４２４またはＡＳＴ１０６）の純度チェックが図１に示されている。
ＴＨ３４２３および３４２４のキラル合成

【化15】

【0046】

化合物２
化合物１（６５ｇ）をＤＭＦ（２．５ｍＬ）とともにＳＯＣｌ₂（１５０ｍＬ）中で５時間還流して清澄な溶液を得、次いで真空中でＳＯＣｌ₂を除去した。残留物をトルエン（３０ｍＬ）で希釈し、溶媒を再度除去した。残留物をさらなる精製をせずに以下のステップで使用した。
化合物３
ＭｇＣｌ₂（２１．０ｇ、２２１ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（１００．０ｍＬ、７１７ｍｍｏｌ）およびマロン酸ジメチル（４１．０ｍＬ、３５９ｍｍｏｌ）の混合物を機械的攪拌によりＲＴにて２時間攪拌し、その後ＴＨＦ（８０ｍＬ）中の化合物２を添加した。結果として得られる混合物をＲＴにて４時間攪拌し、その後濃ＨＣｌ（９０ｍＬ）を添加し、３０分間攪拌した。混合物をＥｔＯＡｃで抽出し（３００ｍＬ×３）、減圧中で濃縮した。残留物に６ＮＨＣｌ（３００ｍＬ）を添加し、混合物を一晩還流した。混合物をＥｔＯＡｃで抽出し（３００ｍＬ×３）、有機層をＮａＨＣＯ₃（ａｑ．）で洗浄し、脱水し（Ｎａ₂ＳＯ₄）、ろ過し、減圧中で濃縮した。残留物をＡｃＯＥｔ／Ｈｅｘ＝１／３（Ｖ／Ｖ）から再結晶化させて、淡黄色固形物として化合物３を得た（４６ｇ）。¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ: 8.16 (d, 1H), 7.86 (t, 2H), 2.68 (s, 3H)

【0047】

化合物５
アルゴン中で、ＢＨ_3.ＴＨＦ（１Ｍ、１１ｍＬ）を、１Ｍトルエン中に化合物４を含む溶液（３ｍＬ、３ｍｍｏｌ）に０℃にて添加した。この溶液を３０分間攪拌し、次いで−４０℃に冷却した。ＴＨＦ（４０ｍＬ）中に化合物３（１．８３ｇ、１０ｍｍｏｌ）を含む溶液を−４０℃にて４時間の間ゆっくりと添加した。この系を−４０℃にて２時間攪拌した（ＴＬＣはＳＭが消失したことを示した）。ＭｅＯＨ（２０ｍｌ）を溶液周辺に−４０℃にて添加し、この溶液を３０分間攪拌した。溶媒をｒｔにて除去した後、残留物を（Ｈｅｘ／ＡｃＯＥｔ＝３／１（Ｖ／Ｖ））カラムにより精製して化合物５を得た（１．６ｇ）。
¹HNMR (CDCl₃, 400 MHz) δ: 8.05 (t, 1H), 7.34 (d, 1H), 7.27 (d, 1H), 4.99 (m, 1H), 1.51 (d, 3H).

【0048】

化合物６
ＤＣＭ（１０ｍｌ）中にＰＯＣｌ₃（１．６ｍＬ、１７．２５ｍｍｏｌ）を含む溶液に化合物５（１．６ｇ、８．６５ｍｍｏｌ）をアルゴン中−４０℃にて添加し、次いでＤＣＭ１０ｍＬ中のＴＥＡ（２．９ｍｌ、２２．９ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を−４０℃にて６時間攪拌し、次いで、２−ブロモエチルアミン臭化水素酸塩（１４．２ｇ、６９．３ｍｍｏｌ）を添加し、ＤＣＭ（１０ｍｌ）中のＴＥＡ（９．６ｍＬ）を滴下添加した。反応混合物を−４０℃からｒｔまで一晩攪拌した。Ｋ₂ＣＯ₃（水８０ｍＬ中に８．３ｇ）を添加し、混合物を５分間攪拌した。混合物をＤＣＭで抽出し、Ｎａ₂ＳＯ₄で脱水した。ろ過し、濃縮し次いでシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー、Ａｃｅｔｏｎｅ／Ｈｅｘａｎｅ＝０〜１００％で溶出して、黄色油状物として化合物６を得た（２．６８ｇ、収率：６５％）。
¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ: 8.08 (t, 1H), 7.32 (d, 1H), 7.29 (d, 1H), 5.56 (m, 1H), 3.34-3.56 (m, 2H), 3.32-3.42 (m, 4H), 3.08-3.26 (m, 4H), 1.62 (d, 3H). 31PNMR:14.44.

【0049】

代替的に、ＴＨ３４２４は以下の手順により合成することもできる：
トルエン（１１ｍｌ／ｇ）を４つの首付きガラスボトルに窒素中で加えた。攪拌を開始して、ＰＯＣｌ₃を窒素中容器１に添加した（１．０２５ｅｑ）。容器１の内容物を−２〜２℃に冷却した。化合物１の溶液を添加し（１．０ｅｑ）、トルエン（１１ｍｌ／ｇ）中のＴＥＡ（１．４３５ｅｑ）を−２〜２℃にて滴下添加した。容器１の内容物を−２〜２℃にて１〜２時間攪拌した。内容物を、情報用にＨＰＬＣ分析向けにサンプル採取した。２−ブロモエチルアミン臭化水素酸塩（３ｅｑ）を容器１に添加した。ＴＥＡ（６ｅｑ）を−２〜２℃にて容器１に滴下添加した。容器１の内容物を０℃〜ＲＴにて一晩攪拌した。内容物を、ＨＰＬＣ分析向けにサンプル採取した。後処理手順については次の通りとした：Ｈ₂Ｏ（１９ｍｌ／ｇ）を容器１に添加し、５〜１０分間攪拌した。混合物をＥＡ（１９ｍｌ／ｇ）で３回抽出した。有機相をＮａ₂ＳＯ₄で脱水し、ろ過した。母液を４０〜５０℃にて濃縮した。粗生成物をシリカゲルのクロマトグラフィーで精製して精製生成物を得た。

【0050】

代替的に、ＴＨ３４２４は以下の手順により合成することもできる：
トルエン（１１ｍｌ／ｇ）を４つの首付きガラスボトルに窒素中で加えた。攪拌を開始して、化合物１（１．０ｅｑ）およびＴＥＡ（１．４３５ｅｑ）を窒素中容器１に添加した。容器１の内容物を−２〜２℃に冷却した。ＰＯＣｌ₃（１．０２５ｅｑ）を容器１に窒素中−２〜２℃にて滴下添加した。容器１の内容物を−２〜２℃にて１〜２時間攪拌した。内容物を、情報用にＨＰＬＣ分析向けにサンプル採取した。２−ブロモエチルアミン臭化水素酸塩（３ｅｑ）を容器１に添加した。ＴＥＡ（６ｅｑ）を−２〜２℃にて容器１に滴下添加した。容器１の内容物を０℃〜ＲＴにて一晩攪拌した。内容物を、ＨＰＬＣ分析向けにサンプル採取した。後処理手順については上と同じとした。

【0051】

代替的に、ＴＨ３４２４は以下の手順により合成することもできる：
ＤＣＭ（２．２ｍｌ／ｇ）およびＰＯＣｌ₃（１．９１ｅｑ）を４つの首付きガラスボトルに窒素中で加えた。攪拌を開始して、容器１の内容物を窒素中−３５〜−４０℃に冷却した。化合物１（１．０ｅｑ）／ＤＣＭ（４．５ｇ／ｍｌ）の溶液を容器１に窒素中−３５〜−４０℃にて滴下添加した。ＴＥＡ（４．０ｅｑ）／ＤＣＭ（４．５ｇ／ｍｌ）の溶液を容器１に窒素中−３５〜−４０℃にて滴下添加した。容器１の内容物を−３５〜−４０℃にて４〜６時間攪拌した。内容物を、情報用にＨＰＬＣ分析向けにサンプル採取した。２−ブロモエチルアミン臭化水素酸塩（８ｅｑ）を容器１に−３０〜−４０℃にて添加した。ＴＥＡ（１２ｅｑ）を容器１に−３０〜−４０℃にて滴下添加した。容器１の内容物を−３０〜−４０℃にて１〜２時間攪拌した。内容物を、ＨＰＬＣ分析向けにサンプル採取した。後処理手順：Ｈ₂Ｏ（１５ｍｌ／ｇ）を容器１に添加し、５〜１０分間攪拌した。水性相をＤＣＭ（１２．５ｍｌ／ｇ）で１回抽出した。有機相をＮａ₂ＳＯ₄で脱水し、ろ過した。ろ液を２０〜３０℃にて濃縮した。粗生成物をクロマトグラフィーで精製して精製生成物を得た。
化合物７
ＴＨＦ（３０ｍＬ）中に、化合物６（２．６８ｇ）、Ａｇ₂Ｏ（３．９２ｇ）を含む混合物を５５℃にて一晩攪拌した。真空中で溶媒を除去した後、残留物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより分離して化合物７の軽液体（light liquid）１．０ｇを得た。
¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ: 8.05 (t, 1H), 7.34 (d, 1H), 7.29 (d, 1H), 5.66 (m, 1H), 2.02-2.24 (m, 8H), 1.61 (d, 3H). 31PNMR:31.55.

【0052】

ＴＨ３４２４（ＴＨ２８７０ 鏡像異性体２）
ＤＭＦ（８ｍＬ）中に化合物７（１．０ｇ）、化合物８（７８５ｍｇ）、Ｋ₂ＣＯ₃（８８０ｍｇ）を含む混合物をｒｔにて一晩攪拌した。混合物を水で希釈し、ＤＣＭで抽出し、Ｎａ₂ＳＯ₄で脱水した。ろ過し、濃縮し、次いでフラッシュクロマトグラフィーで黄色油状物として化合物９を得た（１．１ｇ）。
¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ: 7.97 (d, 1H), 7.41 (t, 1H), 718-7.27 (m, 4H), 7.02-7.12 (m, 3H), 5.59 (m, 1H), 3.08 (s, 3H), 2.97 (s, 3H), 2.01-2.21 (m, 8H), 1.66 (d, 3H). 31P NMR: 31.27.
化合物１１
化合物５と同一手順。化合物３の代わりに化合物８を使用した。収率：５０％
¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ: 8.05 (t, 1H), 7.34 (dd, 1H), 7.27 (d, 1H), 4.99 (m, 1H), 1.51 (d, 3H).
化合物１２
化合物６と同一手順（収率：３５％）。
¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ: 8.08 (t, 1H), 7.32 (d, 1H), 7.29 (d, 1H), 5.56 (m, 1H), 3.34-3.56 (m, 2H), 3.32-3.42 (m, 4H), 3.08-3.26 (m, 4H), 1.62 (d, 3H). ³¹PNMR:14.47.

【0053】

化合物１３
化合物７と同一手順（収率：３６％）。¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ: 8.06 (t, 1H), 7.34 (d, 1H), 7.30 (d, 1H), 5.67 (m, 1H), 2.02-2.25 (m, 8H), 1.62 (d, 3H). ³¹PNMR:31.56.
ＴＨ３４２３（ＴＨ２８７０ 鏡像異性体１）
化合物９と同一手順（収率：６８％）。¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ: 7.97 (d, 1H), 7.41 (t, 1H), 718-7.27 (m, 4H), 7.02-7.12 (m, 3H), 5.59 (m, 1H), 3.08 (s, 3H), 2.97 (s, 3H), 2.01-2.21 (m, 8H), 1.66 (d, 3H). ³¹P NMR: 31.25.

【0054】

（例４）
インビトロでのヒト腫瘍細胞株の細胞毒性アッセイ
Ｈ４６０非細胞肺がんのヒト腫瘍細胞株に関するインビトロ増殖データが、化合物の表において上に報告されている。ＩＣ₅₀値がマイクロモルで報告されているが、これは、種々の濃度で化合物による２時間の曝露を行い、続いて洗浄ステップを行いかつ新鮮な培地の添加を行い、続いて、増殖および細胞バイアビリティ染色行い、かつコントロールのみで処理した培地との比較を行うことの結果である。

【0055】

具体的には、対数増殖期細胞を９６ウェルプレートにウエル当たり４×１０³細胞の密度で播種し、試験化合物を添加する前にＣＯ₂５％、空気９５％、および相対湿度１００％で３７℃にて２４時間インキュベートした。化合物は、所望の最終試験濃度の２００倍で１００％ＤＭＳＯ中で可溶化した。薬剤添加時に、化合物は完全培地で所望の最終濃度の４倍にさらに希釈した。特定濃度にある化合物の一定分量５０μｌを１５０μｌの培地をすでに含有するマイクロタイターウェルに加えて、報告されている薬物の最終濃度とした。薬物を加えた後、プレートをＣＯ₂５％、空気９５％、および相対湿度１００％で、３７℃にてさらに２時間インキュベートし、次いで薬物を洗浄除去し、新鮮な培地を加え、プレートをＣＯ₂５％、空気９５％、および相対湿度１００％で、３７℃にてさらに７０時間インキュベートした。このインキュベーション終了後に、生細胞をＡｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイを使用して定量した。５０％増殖阻害（ＩＣ₅₀）が得られた薬物濃度をＰｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｉｒｖｉｎｅ社、ＣＡ）を使用して算出し、その結果を表に列記した。
Ｈ４６０肺がん細胞に対するその抗増殖有効性も下に表にまとめる。

【化16】

上のＨ４６０データは、わずか２時間の曝露に対して、種々の化合物について低ナノモ
ルに低下したレベルにて阻害があるという、実質的な抗腫瘍効果を実証している。

【0056】

（例５）
アルドケト還元酵素、ＡＫＲ１Ｃ３によるＴＨ２８７０の活性化
組換えヒトＡＫＲ１Ｃ３を、ＮＡＤＰＨ２ｍＭを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４（３７℃）中で２５μｇ／ｍＬに希釈した。３０％メタノール／７０％水中のＴＨ２８７０またはプロゲストロン（陽性対照）を、最終濃度５μＭの濃度にて反応混合物に添加し、３７℃にて１２０分間インキュベートした。最大１２０分まで種々の時間にて、反応混合物５０μＬを取り、内部標準としてプロプラノロールを含むアセトニトリル２００μＬを添加し、ボルテックス混合し、１０分間遠心分離した。結果として得られる上清（５μＬ）を、ＴＨ２８７０およびプロゲストロンの残留％を定量するためにＬＣ／ＭＳ／ＭＳに注入した。これらの化合物については２回繰り返しで試験した。

【0057】

ＡＫＲ１Ｃ３の存在下でＴＨ２８７０は急速に消失するが、既知の物質プロゲストロンは緩慢に低下することが、図２のデータによって実証されている。ＮＡＤＰＨを含むが酵素は含まないバッファー対照では、いずれかの化合物を有する中で反応は見られなかった（データは示されていない）。

【0058】

（例６）
インビトロでのヒト腫瘍細胞株の細胞毒性アッセイ
ＴＨ２８７０、ＴＨ３４２３およびＴＨ３４２４についてはまた、次の材料および手順を使用して様々ながん細胞株において試験した。１０＊セルライセートバッファー（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｃａｔ．Ｎｏ．９８０３）；哺乳動物組織用のプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ社、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ８３４０）；セリン／スレオニンホスファターゼおよびアルカリホスファターゼのＬ−アイソザイム用のホスファターゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ社、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ００４４）；チロシンタンパク質ホスファターゼ、酸およびアルカリホスファターゼ用のホスファターゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ社、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ５７２６）；ＢＣＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ社、Ｃａｔ．Ｎｏ．２３２２５）；１次抗体、マウスモノクローナルＡＫＲ１Ｃ３抗体（ｃｌｏｎｅ ＮＰ６．Ｇ６．Ａ６；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）；１次抗体、α−チューブリン（クローンＢ−５−１−２；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）；２次抗体、ヤギ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ複合体（Ａ４４１６；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。細胞は良好な条件で２世代継代し、消化した。適当数の細胞を６ｃｍ細胞培養皿に接種し、３７℃、ＣＯ₂５％にて一晩インキュベートした。細胞が８０％密度までに増殖したとき、培養皿をインキュベーターから取り出した。培地を吸引し、氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、残留ＰＢＳを除去した。適当量の氷冷１＊セルライセートを添加し、氷上で１０分間インキュベートした。セルライセートを氷で冷やした微量遠心管に移し、４℃、１２，０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離した。上清を別の微量遠心管に移した。セルライセートを１０＊セルライセートで希釈し、哺乳動物組織用のプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ社、＃Ｐ８３４０）、セリン／スレオニンホスファターゼおよびアルカリホスファターゼのＬ−アイソザイム用のホスファターゼインヒビターカクテル、チロシンタンパク質ホスファターゼ、酸およびアルカリホスファターゼ用のホスファターゼインヒビターカクテルを添加した。タンパク質定量用のＢＣＡタンパク質定量キットを１＊セルライセートとともに使用して、セルライセートを同一濃度に希釈した。相応する試料を５＊ＳＤＳ−ローディングバッファーへ添加し、８５℃まで１０分間加熱し、手短に遠心分離した。試料は−２０℃に保存するかまたはタンパク質電気泳動に直接使用した。これら試料は標準的な実施法に従って電気泳動を行い、メンブレンに転写し、製造元の指示に従って１次抗体を、次いで２次抗体を適用した。Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外レーザーイメージングシステムを使用してシグナルをスキャンした。

【0059】

結果については下の図３および図４に示され、以下の表に列記されている。

【表1】

【0060】

（例７）
インビボでのヒト腫瘍異種移植片モデルおよび抗腫瘍活性
非小細胞肺Ｈ４６０モデル、非小細胞肺Ａ５４９モデル、および黒色腫Ａ３７５モデルを利用する３種類のヒト異種移植片抗腫瘍モデルを使用して、本明細書で提供される化合物の有効性を実証した。

【0061】

特定病原体未感染であるホモ接合体のメスヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を使用した。マウスは食餌および飲料水自由摂取とし、マイクロアイソレータケージ（ｍｉｃｒｏｉｓｏｌａｔｏｒ ｃａｇｅ）に収容した。実験時には、４〜６週齢の動物をマイクロチップ（Ｌｏｃｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＭＤ、米国）にて特定した。動物試験の全てがＴｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ社における動物実験委員会によって承認されたものである。
全ての細胞株はアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、米国）を起源とした。細胞は１０％ウシ胎児血清を含む推奨培地で培養し、ＣＯ₂５％の加湿環境下３７℃にて維持した。

【0062】

細胞をマトリゲル（Ｈ４６０中３０％）と混合し、マウス毎に０．２ｍｌを動物の脇腹領域に皮下移植した。腫瘍サイズが１００〜１５０ｍｍ³に達したとき、マウスを１０匹マウス／群で実験群とビヒクル群とに無作為化し、処置を開始した（１日目）。試験化合物をＤ５Ｗにおいて５％ＤＭＳＯ中に製剤化した。全ての化合物は、１サイクルとしてＱＤ×５／週（５日オン、２日オフ）を、計２サイクルの間、ＩＰにより投与した。腫瘍の増殖および体重を週２回測定した。腫瘍体積を（長さ×幅²）／２として算出した。薬物有効性は、腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）および腫瘍増殖遅延（ＴＧＤ）として評価した。ＴＧＩは（１−ΔＴ／ΔＣ）×１００として規定し、ここでΔＴ／ΔＣは、処置群のおよび対照群の平均（群内の変動が比較的大きかった場合、中間）腫瘍体積の変化の割合を示した。ＴＧＤは、処置された腫瘍が、対照群と比べて、５００ｍｍ³に達する追加の日数として算出した。個々の腫瘍サイズが２０００ｍｍ³超に達した場合または群の平均腫瘍体積が１０００ｍｍ³を超えた場合、動物は殺処分した。データは平均±ＳＥＭとして表されている。Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較試験による一元配置分析（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４）または両側スチューデントのｔ検定を使用して解析した。Ｐレベル＜０．０５を統計的に有意とみなした。

【0063】

（例８）
インビボ有効性の結果：
本試験では、Ａ３７５黒色腫ヒト腫瘍異種移植片モデルを用い、本明細書で提供される化合物をチオテパおよび認可されている抗黒色腫薬アブラキサンと比較した。抗腫瘍効果および投与の安全性が下に図表で示されている。Ｍｐｋとはｍｇ／ｋｇである。

【表2】

総合すれば、これらの試験は、標準化学療法に対して、３種の異なる腫瘍細胞株において有意な抗腫瘍有効性を実証している。

【0064】

（例９）
ヒト肝臓がんのマウスモデルにおけるＴＨ３４２４
雌の無胸腺ヌードマウス（６週齢）を本試験で使用した。動物はＢｅｉｊｉｎｇ ＨＦＫ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃｏ．，Ｌｔｄ社から購入し、照射またはオートクレーブにより殺菌したケージ、食料、および寝床を使用して、高性能微粒子エアフィルター（ＨＥＰＡ）によりフィルター処理した環境に維持した。試験には計３２匹のヌードマウスを使用した。ＨｅｐＧ２―ＧＦＰヒト肝細胞癌細胞（ＡｎｔｉＣａｎｃｅｒ、Ｉｎｃ．社、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）をＦＢＳ１０％を含むＲＰＭＩ―１６４０（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．社）とインキュベートした。細胞は、３７℃およびＣＯ₂５％／空気９５％の雰囲気に維持されているウォータージャケットＣＯ₂インキュベーター（Ｆｏｒｍａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で増殖させた。細胞バイアビリティはトリパンブルー排除分析により決定した。５匹の雌無胸腺ヌードマウスは単回用量５×１０⁶ ＨｅｐＧ２−ＧＦＰ細胞を皮下注射した。腫瘍のサイズが１ｃｍ³に達したとき腫瘍を採取し、次いで腫瘍組織１ｍｍ³の小断片に切断した。４０匹の雌ヌードマウスは、皮下腫瘍モデルであるＨｅｐＧ２−ＧＦＰヒト肝細胞癌に由来する腫瘍断片の単一ピースを同所性に移植した。腫瘍組織は、各マウスの肝臓の右葉にＳＯＩ（外科的同所移植）により同所的に移植した。要約すると、麻酔下で１ｃｍの上腹部切開を行った。肝臓の右葉を露出させ、肝臓表面の一部を鋏で機械的に傷つけた。次いで、腫瘍断片のピースを肝臓組織内に固定し、肝臓を腹腔内に戻し、最終的に腹壁を閉じた。マウスは特定病原体未感染状態でラミナーフローキャビネットで飼育した。

【0065】

処置については、移植腫瘍が平均サイズほぼ１ｍｍ²に達したとき、腫瘍移植してから３日後に開始した。担癌である３２匹のマウスをそれぞれ８匹マウスの４実験群に無作為に分けた。ケージ当たり４匹のマウスであるその群毎に、各ケージを明瞭にマーキングした。各マウスが識別のため耳標を有した。試験設計は下の表に示してある。

【表3】

【0066】

試験期間の間、実験マウスの全てを、死亡および罹病の徴候について日毎にチェックした。動物は腫瘍を移植して３８日後まで観察した。試験期間中週２回マウスの体重を計測した。ＦｌｕｏｒＶｉｖｏ画像化システム、Ｍｏｄｅｌ ３００／Ｍａｇ（ＩＮＤＥＣ社、ＣＡ、米国）を使用して、試験期間中週２回腫瘍の増殖および進行の画像を得た。全ての実験動物は、腫瘍移植して３８日後にペントバルビタールナトリウムの過剰用量を注射して安楽死させた。画像向けに肝臓を露出させ、その後に腫瘍を取り出し、電子天秤（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＢＳ １２４Ｓ、ドイツ）にて秤量した。腫瘍組織はさらなる分析用にホルマリン中に保存した。様々な群の体重および腫瘍量に関する比較をα＝０．０５（両側）でスチューデントのｔ検定を使用して解析した。試験薬剤の静注後、マウスは横たわることなく、自立活動の低下を有することはなかった。実験動物は概して良好な状態にあった。各群の体重変化が図５および下の表に示してある。

【表4】

【0067】

図５および上の表に示すように、試験の３５日目に、各群のマウスの平均体重は２１％〜４１％増加した。ＴＨ２８７０−２群と陰性対照群との間に統計学的な有意差はなかった。このことにより、低用量または高用量のＴＨ２８７０−２の腹腔内投与により実験マウスに対する明白な急性毒性は存在しなかったことが、示唆された。しかし、ソラフェニブ処置群において、平均体重は陰性対照群の平均体重より統計学的に有意に低かった。試験用量でのソラフェニブの投与によって実験マウスにある程度の毒性が存在することが示唆された。

【0068】

各群における腫瘍進行
様々な群の同所性ＨｅｐＧ２−ＧＦＰ肝細胞癌の進行をリアルタイム撮像によりモニターした。画像は週２回得た。Ｐｏｗｅｒ Ｓｔａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＩＮＤＥＣ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ＣＡ、米国）を使用して解析した、各群の試験終了時点の典型的な腫瘍画像および腫瘍蛍光シグナルからもたらされた腫瘍発育曲線が、それぞれ、図６および図７に示されている。

【表5】

図６、図７および上の表に示すように、陽性対照群の平均腫瘍サイズは陰性対照群の平均腫瘍サイズより約３９％小さいが、この２つの対照群間では統計学的有意差はなかった（Ｐ＝０．０５７７）。

【0069】

ＴＨ３４２４（２．５ｍｇ／ｋｇ）群およびＴＨ３４２４（５ｍｇ／ｋｇ）群において、蛍光画像読取領域の平均は、陰性対照群のその平均より著しく有意に小さく、強力な阻害効果および明白な用量−効果関係を示した。それらのうち、蛍光画像読取領域は、ＴＨ３４２４（５ｍｇ／ｋｇ）群では０であった。この群では、投与を処置の３サイクル後に停止させた；腫瘍蛍光画像読取は実験の終了まで依然として０であった。しかし、ＴＨ３４２４（２．５ｍｇ／ｋｇ）群では、処置の３サイクル後に１週の間薬物投与を停止し、次いで別途３サイクルの処置を再スタートした。３５日目の蛍光画像読取領域の平均は、１．２±１．１であり、これは陰性対照群のその平均のほぼ８％であり、処置して４９日後では、陰性対照群のその平均の２．０±２．２（およそ８％）であった。試験終了時での全ての腫瘍が図８に示されてあり、実験群のそれぞれにおける腫瘍質量の平均値が図９に示されている。

【表6】

図８、図９および上の表に示すように、陽性対照群の平均腫瘍質量は陰性対照群の平均腫瘍質量より小さく（Ｐ＝０．０１５９）、これにより、陽性対照の薬物（ソラフェニブ）が同所性ＨｅｐＧ２−ＧＦＰヒト肝細胞癌のマウスモデルに対して、試験用量で阻害効果を有することが示された。

【0070】

ＴＨ３４２４（２．５ｍｇ／ｋｇ）およびＴＨ３４２４（５ｍｇ／ｋｇ）の群の平均腫瘍質量は、それぞれ、０．００８１ｇおよび０ｇであった。全てが陰性対照群の平均腫瘍質量よりも統計学的に有意に小さかった。これらのうち、平均質量は高用量群で０ｇであるとともに、低用量群ではわずか０．００８１±０．００８８ｇであり、これは陰性対照群の平均腫瘍質量の、それぞれ、０％および５．２％であった。これにより、ＴＨ３４２４が同所性ＨｅｐＧ２−ＧＦＰヒト肝細胞癌のマウスモデルに対して、試験用量で非常に強力な阻害効果を有するとともに明瞭な用量−効果関係を示すことも、示唆された。

【0071】

腫瘍ＩＲは式：
ＩＲ（％）＝（１−処置群（ｔ）／対照群（ｃ））×１００
に従って最終平均腫瘍質量に基づいて算出した：
各処置群に対するＩＲ：
ＩＲ（％）＝（１−ＰＣ／ＮＣ）×１００＝（１−０．０６３７／０．１５４３）×１００≒５８．７％
ＩＲ（％）＝（１−ＴＨ２８７０−２ ＬＴ／ＮＣ）×１００＝（１−０．００８１／０．１５４３）×１００≒９４．８％
ＩＲ（％）＝（１−ＴＨ２８７０−２ ＨＴ／ＮＣ）×１００＝（１−０．００００／０．１５４３）×１００≒１００％
注記：
ＮＣは陰性対照群を表す
ＰＣは陽性対照群を表す

【0072】

ソラフェニブ処置群における腫瘍阻害率は５８．７％であり（Ｐ＝０．０１５９対対照群）、同所性ＨｅｐＧ２−ＧＦＰヒト肝細胞癌のマウスモデルに対して、試験用量で強力な阻害効果を示した。しかし、この群では、実験マウスの平均体重は陰性対照群の平均体重より統計学的に有意に小さかった。試験用量でのソラフェニブの投与によって実験マウスにある程度の毒性が存在することが示唆された。ＴＨ３４２４（２．５ｍｇ／ｋｇ）およびＴＨ３４２４（５ｍｇ／ｋｇ）の腫瘍阻害率は、それぞれ、９４．８％および１００％であり、同所性ＨｅｐＧ２−ＧＦＰヒト肝細胞癌のマウスモデルに対して、非常に強力な腫瘍阻害効果および明瞭な用量−効果関係を示した。試験用量のＴＨ３４２４では、実験マウスに対する明瞭な毒性は存在しなかった。

【0073】

（例１０）
Ｔ細胞白血病の動物モデルにおけるＴＨ３４２３
白血病細胞をおよそ１５０×１０６個のＡＬ７４７３細胞をＬＮ２（約２〜３バイアル）から解凍することによりかつこれを３７℃ウォーターバスに速やかに置くことにより、調製した。細胞の全てを、予め加温した完全培地４０ｍｌを有する５０ｍｌファルコンチューブの中に移した。細胞を１２００ｒｐｍにて５分間遠心分離した。細胞を４０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０で再懸濁させた。次いで細胞をカウントした。細胞を１２００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、氷冷ＰＢＳで２百万個細胞毎ＰＢＳ１００μｌに再懸濁させた。上で調製した２×１０６個の細胞を含む生理食塩水１００μｌを使用して各マウスにＩＶにより注射した。試料をＦＡＣＳチューブに移し、全ての試料についてヒトＣＤ４５ ＦＩＴＣと同位体とを相応するチューブに添加し、細胞を氷上３０分間暗所でインキュベートすることにより、実験期間中週１回血液についてＦＡＣＳ分析を行った。赤血球溶解バッファー２ｍｌを各チューブに加え、別途３０分間氷上で暗所でインキュベートした。全ての試料についてこのプロセス中数回ボルテックス混合を行い、試料を１５００ｒｐｍで４℃にて５分間遠心分離した。上清を捨て、各チューブに氷冷洗浄バッファー２ｍｌを加えた。試料を１５００ｒｐｍで４℃にて５分間遠心分離し、これらのステップを繰り返した。ＦＡＣＳ収集のため、細胞を洗浄バッファー／ＰＢＳ１５０μｌに再懸濁させた。試料は、Ｃｅｌｌ ＱｕｅｓｔまたはＦｌｏｗｊｏを使用することによってＢＤ Ｃａｌｉｂｕｒで分析し、結果をＰｒｉｓｍ ５．０を使用することによって解析した。

【0074】

群前の細胞接種を行って２６、３３、４２日後にＦＡＣＳ用の血液試料を採取した。群前の試料採取の後、試験を終えるまでＦＡＣＳを週１回行った（細胞を接種して５０日、５７日、６４日後）。細胞接種後５７日目に、各マウスについて血漿試料１０μｌを採取し、各群（群１：＃７、＃４３、＃５２；群２：＃１１、＃１５、＃２３；群３：＃５、＃９、＃４８；群４：＃２５、＃２８、＃３６）から３つの血液塗布標本を採取した。サンプルリストについては下にまとめてある。

【表7】

【0075】

マウスの体重変化の結果が図１０に示してある。細胞接種後４３日目に処置を始めて以降、処置の間に検出されるヒトＣＤ４５抗体ＦＡＣＳ向けに末梢血を週１回採取した。マウスは、それぞれ、細胞接種して４３日後、５０日後、５７日後および６４日後（群１および群２のみに投与）に投与された。グループ化後の腫瘍量発育曲線が図１１に示されている。各群の末梢血におけるヒトＣＤ４５＋白血病細胞の百分率は疾患が進行するにつれ上昇し、百分率曲線は、群２を除いて、初回投与を行って７日後に低下した（Ｐ＞０．０５）。第２回の投与後、処置群（群２〜４）はビヒクル群（群１）より有意に低かった（Ｐ＜０．００１）。全てのマウス（計４群、各群において１０匹のマウス）は第４回の投与を行って６日後に殺処分した。検出されるヒトＣＤ４５ ＦＡＣＳ用に全てのマウスの血液、脾臓および骨髄を採取した。各群の３匹のマウスの脾臓および骨をＦＦＰＥ用に採取した。終了点での詳細なデータおよび試料リストが付属書の１０．３にまとめられている。試験終了点でのマウスの末梢血、脾臓および骨髄の腫瘍量が図１２に示されている。群１の末梢血、脾臓および骨髄とそれぞれ比較して、群２の骨髄がわずかな有意差を示したこと（Ｐ＜０．０５）を除いて、全ての処置群（群２〜４）が有意差を示した（Ｐ＜０．０１）。

【0076】

（例１０）
非ナイーブサルにおける薬物動態および急性毒性試験
３０分点滴静注で、非ナイーブサル（２ｍｇ／ｋｇでの各化合物毎に１匹の雄および１匹の雌）において、ＴＨ３４２３およびＴＨ３４２４について試験し、ＴＫサンプリングを１日目および１５日目、点滴開始後０．２５、０．５、０．７５、１および２時間とした。血清化学検査および血液学的検査：投薬前（１日目）、５日目、８日目（投薬前）、１５日目（投薬前）、２２日目および２８日目。臨床観察：試験中毎日、計３５日。摂餌量：試験中毎日、計３５日。体重計測：５週の間週２回。

【0077】

ＴＫパラメーターが以下の表に列記されている：

【表8】

【0078】

血清化学検査が以下の表に示されている：

【表9-1】

【表9-2】

【表9-3】

血液学的検査データが以下の表に示されている：

【表10-1】

【表10-2】

【表10-3】

体重変化が下の表に列記されている：

【表11】

【0079】

本発明は、ある特定の態様、実施形態および任意選択である特徴により具体的に開示されてきたが、当業者であればそのような態様、実施形態および任意選択である特徴の改変、改善および変更を講じることができること、ならびにそのような改変、改善および変更が、本開示の範囲内にあるとみなされることが理解されるべきである。

【0080】

本発明について、本明細書において広範に、かつ一般的に説明してきた。一般的な開示の中に含まれる、より狭い種および亜属の分類のそれぞれも、本発明の一部を形成するものである。また、本発明の特徴または態様がマーカッシュ群の表現で記載されている場合、本発明はまた、マーカッシュ群の任意の個々の構成要素または構成要素の下位集団の表現で記載されていることが、当業者であれば理解されよう。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】